アミノ酸の定量方法
【課題】短時間で高感度・高精度な測定が可能であるアミノ酸定量方法を提供することである。
【解決手段】所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
【解決手段】所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を用いたアミノ酸の定量方法に関する。特に本発明は、栄養要求性である乳酸菌を用い、かつ発光法を用いて比較的短時間でアミノ酸を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸分析は食品の品質管理や様々な疾病検出のマーカーとして用いられ、その迅速・簡便な定量法の開発は工業的・医療的見地から強く望まれている。これまでに知られているアミノ酸定量法としては、HPLCを用いた機器分析法や、定量用酵素を用いた酵素法と共に、乳酸菌を用いたバイオアッセイ法が挙げられる（非特許文献1）。
【０００３】
乳酸菌を用いたバイオアッセイ法では、測定対象のアミノ酸種に対し要求性を示す乳酸菌が用いられる。乳酸菌は発酵性であり、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸エステル、塩、核酸誘導体及びビタミンと共に供給されることを必要とする複雑な栄養要求性を有する。炭素供給源が添加された単純な無機物培地では乳酸菌は増殖することができない。測定対象のアミノ酸に対し要求性を示す乳酸菌株を、目的アミノ酸制限培地および検体の混合液中で静止期まで培養させると、目的アミノ酸の検体中含有量に比例した菌体増殖量が得られる。このような乳酸菌の増殖量に基づいてアミノ酸を定量することかできる。増殖量は、一般には濁度により測定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】アミノ酸・核酸集談会編『アミノ酸発酵』共立出版株式会社（1972）358-378頁
【非特許文献２】S. Guglielmetti et al.,International Journal of Food Microbiology 124 (2008) 285-290
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の乳酸菌の増殖量に基づく方法は、以下のような問題点を有する。
・静止期まで増殖させる必要があるため、測定には長時間（約16時間以上）の培養を要する
・菌の増殖量を濁度によって測定するため、感度・精度が悪い
・菌の増殖量に基づく定量法のため、増殖に影響を与えるような夾雑物質の影響を大きく受ける
【０００６】
そこで本発明が解決すべき課題、即ち本発明の目的は、測定対象のアミノ酸に対し要求性を示す乳酸菌を用いるアミノ酸の定量方法であって、乳酸菌の増殖量に基づく方法の有する上記３つの課題を解決することができる方法を提供することにある。換言すると、本発明の目的は、短時間で高感度・高精度な測定が可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために種々検討した結果、乳酸菌が増殖に伴って生成するATP生成量を計測することで、増殖量(濁度)に基づく方法に比べて短時間の培養で、高感度にアミノ酸の定量が可能であることを見出して本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
[1]
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
[2]
前記ATP濃度依存発光法は、ルシェラーゼ及びルシフェリンを用いる方法である、[1]記載の方法。
[3]
検体を混合した培地中での栄養要求性乳酸菌の培養は、２〜５時間行われる[1]または[2]に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
乳酸菌が増殖に伴ってATPを生成するが、ATPは、乳酸菌増殖の対数期において生成量が多く、従って、本発明においては、静止期まで培養することなく乳酸菌増殖に伴うアミノ酸の定量が可能である。さらに本発明では、ATP生成量は、例えば、ルシフェラーゼ等を用いる発光法にて定量できることから、高感度・高精度なアミノ酸の定量が可能である。
【００１０】
尚、非特許文献2には、乳酸菌に遺伝子導入したルシフェラーゼにより、乳酸菌が増殖に伴って生成するATPを定量することが記載されている。しかし、この文献には、外部から添加したルシフェラーゼにより乳酸菌が生成したATPを定量できることは記載されておらず、さらに乳酸菌のアミノ酸要求性を利用してアミノ酸定量を外部から添加したルシフェラーゼにより行うことも記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）完全合成培地における最初の６時間のインキュベートでのＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖。６６０ｎｍでの分光光度計を用いた従来法（●）又は照度計によってモニターした発光微量バイオアッセイからの発光シグナル（○）によって増殖を測定した。（ｂ）Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖に対するＬ−バリン濃度の効果。１（●）、２（○）、４（▲）、６（△）、８（■）、１０（□）、１５（◆）、２０（◇）、及び３０（＋）μｇでのＬ−バリンの様々な量を含むＬ−バリンについて合成培地にてＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)を評価した。増殖は発光微量バイオアッセイによってモニターした。
【図２】（ａ）合成培地における種々のＬ−バリン濃度でのＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖曲線。（ｂ）合成培地における様々なＬ−バリン濃度での発光シグナルとＬ−バリンの線形性反応。増殖は、０時間（＊）、１時間（●）、２時間（▲）、3時間（◆）及び４時間（■）での様々な間隔の時間で測定した。
【図３】発光シグナルと１８の標的アミノ酸の濃度との間の線形性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、検体中のアミノ酸の定量方法に関する。本発明の方法は、以下の工程(A)〜(D)を含む。
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)。
【００１３】
工程(A)
工程(A)は、所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程である。
【００１４】
本発明で用いる乳酸菌は、測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌である。
【００１５】
本発明において、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌」における「測定対象アミノ酸」とは、例えば、タンパク質構成アミノ酸であることができ、タンパク質構成アミノ酸とは、L-アラニン、L-プロリン、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-グルタミン、L-セリン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-メチオニン、L-グリシン、L-チロシン、L-アスパラギン、L-トリプトファン、L-システインを意味する。さらに、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性」とは、乳酸菌が、自ら体内で測定対象アミノ酸を合成できず、生育するためには培地から供給される必要がある性質を意味する。さらに、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌」とは、「測定対象アミノ酸」を包含するアミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌を意味する。測定対象アミノ酸は、1種類であることも複数種類であることもできる。
【００１６】
アミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌の例は、特に制限はされないが、以下の表に示すものを挙げることができる。表１には、乳酸菌の菌株名と栄養要求性を示すアミノ酸を記載する。さらに表２には、日本乳酸菌学会編・京都大学学術出版会・2010年『乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス』より引用したアミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌の例を示す。尚、表２の脚注にある「乳酸菌の科学と技術」は、乳酸菌研究集談会編・学会出版センター・1996年刊である。
【００１７】
【表１】
※：必須要求，＋：促進，−：要求性なし
§：ビタミンＢ6系を培地から除いた場合
Ａ：ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum) ATCC 8014
Ｂ：ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) ATCC 7469
Ｃ：ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum) ATCC 9338
Ｄ：エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae) ATCC 8043
Ｅ：ペディオコッカス・アシディラクチシ(Pediococcus acidilactici) ATCC 8042
Ｆ：ペディオコッカス・アシディラクチシ(Pediococcus acidilactici) ATCC 8081
Ｇ：ラクトバチルス・レイヒマンニ(Lactobacillus leichmannii)
尚、表１に記載された各乳酸菌のアミノ酸要求性において「※：必須要求」と標記されたアミノ酸については本発明の方法によりアミノ酸の定量が可能である。表１に記載された全ての乳酸菌は、少なくとも1つの「※：必須要求」と標記されたアミノ酸を有することから、いずれも本発明の方法によるアミノ酸の定量方法に使用できる。それに対して、「＋：促進」と標記されたアミノ酸については、「＋：促進」と標記されたアミノ酸の非存在時に、乳酸菌が示す挙動によって、本発明の方法によるアミノ酸の定量に使用できる場合とできない場合とがある。
(1)定量に使用可能な場合：
・生育するまで一定時間のラグが空いてから生育を始める場合
または
・生育は可能だが、生育速度はきわめて低い場合
(2)定量に使用不可能な場合（アミノ酸非存在時のバックグラウンドの発現が高くなる）：
・存在時に近い生育速度を示し、また生育開始までのラグがない場合
各乳酸菌が各「促進」アミノ酸非添加時に上記挙動のどれを示すかは、予備実験をすることで簡単に明らかにできる。
【００１８】
【表２】
【００１９】
本発明においては、乳酸菌が増殖する際に生成するATP量を、ATP濃度依存発光法を用いて定量する。ATP濃度依存発光法は、ATP濃度に依存した発光を呈する反応を利用した方法であればよく、例えば、ルシェラーゼ及びルシフェリンを用いる方法を挙げることができる。
【００２０】
ルシェラーゼはホタル由来のものが一般的であるが、ホタル以外に由来するルシェラーゼも用いることができる。ルシフェラーゼによる発光方法は、測定対象である乳酸菌の培養液に、ルシフェラーゼと発光反応に十分な濃度の基質ルシフェリン、Ｍｇ2+イオンなどを混合し、Ｏ2の存在下で反応させ、この反応によって生じる発光量を測定することで実施できる。十分量のルシフェラーゼ、ルシフェリン、Ｍｇ2+イオン、Ｏ2の存在下で反応させれば、共存するATP濃度に依存した発光量が得られる。工程(A)においては、所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、上記ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める。求められた相関関係は、例えば、検量線としておき、工程である。工程(D)において、発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める際に利用する。
【００２１】
本発明の方法において、ルシフェラーゼにより乳酸菌が生成したATP濃度測定が可能なATP濃度の下限は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の添加濃度により異なるが、例えば、０．０１ｍＭである。従って、この点を考慮して本発明に使用するルシフェラーゼの添加量は、乳酸菌の培養液に対して、十分に定量性を有する範囲で適宜決定することができる。
【００２２】
ルシフェリンは、ルシフェラーゼが作用するものであれば特に限定されないが、好ましくはＤ−ルシフェリンで、塩としてはカリウム塩、ナトリウム塩などである。天然物と化学合成品いずれであってもよいが、化学合成品の方がロット間のバラツキが少ないようである。さらに、Ｄ−ルシフェリン誘導体であってもよい。本発明で使用されるルシフェリンの濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであり、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜３ｍＭである。
【００２３】
本発明に使用するマグネシウムイオンは、マグネシウムイオンを含む化合物から提供され、このような化合物としては、硫酸マグネシウム、炭酸水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなどが挙げられる。マグネシウムイオンの濃度は、０．０１〜２５ｍＭであり、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは２〜７．５ｍＭである。
【００２４】
本発明ではさらに、発光反応を増強するため補酵素Ａを含むこともできる。補酵素Ａの好ましい濃度は０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ以上である。
【００２５】
本発明では、培地は、イオン強度やｐＨを維持するために、緩衝成分を含んでもよい。緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、グリシルグリシンなどが挙げられ、通常は２０〜１００ｍＭの使用が好ましい。好ましいｐＨ範囲は７．０〜８．５である。ｐＨ７．８〜８．０で最大発光を得ることができるが、ｐＨを７．８以下にすることによって発光持続性を高めることができる。本発明ではさらにルシフェラーゼの活性を増強するタンパク質性材料、例えば、ウシなどの哺乳類血清アルブミン、ラクトアルブミンなどを培地に存在させることもできる。
【００２６】
本発明の方法では、さらにサンプル中に存在して、ルシフェラーゼやＡＴＰなどに悪影響を及ぼす可能性のある金属含有プロテアーゼやホスファターゼの活性を抑制するため、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤などを含有させることができる。好ましい濃度としては１〜５ｍＭである。
【００２７】
さらに、本発明の方法では、ルシフェラーゼのタンパク質の安定性を保護する作用が考えられる還元剤を含んでもよい。還元剤としてはジチオトレイトールや２−メルカプトエタノールなどのスルフィドリル化合物が挙げられる。
【００２８】
ルシフェラーゼによりルシフェリンが酸化されて生成するオキシルシフェリンは560〜572nmに発光ピークを有し、この発光を常法により測定することができる。
【００２９】
工程(B)
工程(B)は、測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程である。
測定対象アミノ酸は、検体の種類と用いる乳酸菌組換体が有するアミノ酸要求性を考慮して決定される。本発明で用いる培地は、測定対象アミノ酸を含まないものであれば、如何なるものでもよい。即ち、培地としては、測定対象以外のアミノ酸は、乳酸菌組換体の生育に必要な種類及び量を含有し、アミノ酸以外の栄養成分についても含有するものである。
【００３０】
測定対象アミノ酸を含有しない培地は、測定対象アミノ酸を含有しないこと以外は、通常乳酸菌の培養に用いられる培地であることが適当であり、例えば、GYP培地を基本培地として挙げることができる。あるいは、MRS培地も用いることができる。但し、これらの培地に限定される意図ではなく、乳酸菌が生育を示す培地であればいずれの培地も使用することができる。
【００３１】
検体を混合した培地中での栄養要求性乳酸菌の培養は、例えば、10〜40℃の範囲の常温において、例えば、2〜5時間行われる。但し、耐熱性乳酸菌を使用する場合には上記温度より高い温度において培養することもできる。培養時間は、検体に含まれているアミノ酸の濃度、使用するルシフェラーゼ等の量や種類によって変化する発光量及び発光の検出器の感度等を考慮して適宜決定することができる。上記培養は、マイクロタイタープレートの各ウェル中で複数の検体について、並列に実施することができる。
【００３２】
工程(C)
工程(C)は、前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程である。所定の培養時間が経過した後に、培養液の発光量を測定する。発光量測定には、公知の分光光度計等を用いることができる。さらに、マイクロタイタープレート上で複数の検体を並列的に培養及び発光量測定には発光量測定器としては、ピーク波長を565nmに持つホタルルシフェラーゼの発光や、その変異型酵素、ピーク波長を630nmに持つ赤色発光ルシフェラーゼ（鉄道虫由来）の発光などを測定可能な、通常の発光測定装置（ルミノメータ）等を用いることができる。
【００３３】
工程(D)
工程(D)は前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程である。この工程は、コンピュータに予め上記相関関係に関するデータを入力しておき、発光量の測定結果をこのコンピュータに手動または自動で入力することで、検体中に含まれるアミノ酸量を求めることができる。
【００３４】
本発明のアミノ酸の定量方法が対象とする検体は、特に制限はない。本発明に用いる検体は、測定対象アミノ酸を含む可能性のある試料であれば、如何なるものでもよい。用いる乳酸菌組換体のタンパク質合成や細胞内へのアミノ酸取り込みを阻害する物質が含まれていなければ、用いる乳酸菌組換体の増殖を阻害・促進する物質が含まれていてもよい。例えば、食品サンプルや各種培地、血漿などの生体試料が例として挙げられる。定量可能なアミノ酸としては、例えば、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等を定量することができる。本発明の方法では、血清または血漿に含まれるグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの定量をすることか可能である。
【００３５】
本発明の方法は、前述のように、マイクロタイタープレート上の複数のウェル中で、異なるまたは同一の検体について、並列的に実施することができる。
予め測定対象アミノ酸を含有しない培地をウェルに格納したマイクロタイタープレートを準備し、ウェル中の培地に検体を添加し、次いで乳酸菌を添加して、所定期間培養する。培養後に、ルシフェラーゼ等の発光用試薬を培地に添加して、ルシフェラーゼによりルシフェリンを酸化させた後に発光量を測定する。
【００３６】
本発明は、上記方法に使用できるアミノ酸定量用キットも提供できる。このキットは、以下の(1)〜(3)を含むものである。
(1)測定対象アミノ酸を含有しない培地
(2)乳酸菌
(3)発光用試薬
【００３７】
(1)〜(3)のそれぞれについては、上記本発明の方法の説明で記載したものをそのまま利用できる。
【実施例】
【００３８】
実験区分
ペディオコッカス・アシディラクチシ(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の調製
０．５％酵母抽出物、１％ポリペプトン、１％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ６．０を含有する乳酸菌斜面寒天における穿刺培養によって、栄養要求体、Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)を３７℃にて培養し、４℃で保持し、毎月培地を新しくした。
全容積１リットルにて５ｇの酵母抽出物、１０ｇのポリペプトン、１０ｇのグルコース、５００ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、５００ｍｇのＫ2ＨＰＯ4、８００ｍｇのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、４０ｍｇのＦｅＳＯ4.７Ｈ2Ｏ、１６０ｍｇのＭｎＳＯ4．４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇのＫＣｌから成る１０ｍＬの乳酸菌培地に斜面培養から生物を移すことによって接種菌液を作製した。３７℃にて１２〜１６時間の培養の後、細胞培養物を３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、生理食塩水で２回洗浄した。細胞ペレットを生理食塩水に溶解し、希釈して６００ｎｍにて０．５〜０．６前後の光学密度を得た。
【００３９】
基本培地の調製
特に指示されない限り、ストック溶液はすべて蒸留水で調製した。アミノ酸溶液は、新しく調製しなければならないシステインを除いて−２０℃に保存することができるが、チロシン溶液は０．２ＮのＮａＯＨに溶解した。
【００４０】
基本培地は、１リットル中、２．２４ｍＭのＬ−アラニン、１．１５ｍＭのＬ−アルギニン、３．０１ｍＭのＬ−アスパラギン酸、０．５７ｍＭのＬ−システイン、３．４ｍＭのＬ−グルタミン酸、１．３３ｍＭのグリシン、０．６４ｍＭのＬ−ヒスチジン、１．５２ｍＭのＬ−イソロイシン、１．５２ｍＭのＬ−ロイシン、１．０９ｍＭのＬ−リジン−ＨＣｌ、１．３４ｍＭのＬ−メチオニン、１．２１ｍＭのＬ−フェニルアラニン、０．８７ｍＭのＬ−ポリン、０．９５ｍＭのＬ−セリン、１．６８ｍＭのＬ−スレオニン、０．４９ｍＭのＬ−トリプトファン、０．５５ｍＭのＬ−チロシン、１．７１ｍＭのＬ−バリン、２．９６μＭのチアミン、２．６６μＭのリボフラビン、４．８６μＭのピリドキシン、４．９１μＭのピリドキサル、２．１μＭのパントテン酸カルシウム、８．１２μＭのニコチン酸、１．４６μＭのｐ−アミノ安息香酸、０．０２μＭの葉酸、０．０４μＭのビオチン、２７．１５μＭの硫酸アデノシン、１０４．６８μＭのグアニン、８１．９μＭのウラシル、６５．７４μＭのキサンチン、０．１ｍＭのグルコース、５６．０９μＭのＮＨ4Ｃｌ、３．６７μＭのＫＨ2ＰＯ4、２．８７μＭのＫ2ＨＰＯ4、０．８１μＭのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．０４μＭのＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．０５μＭのＭｎＣｌ2．４Ｈ2Ｏ、０．１７μＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭの酢酸カリウムから成る。１２１℃、２０分間のオートクレーブによって培地を滅菌した。
【００４１】
基本培地について記載された組成に基づいて、標的アミノ酸を含まずに測定用の合成培地を調製した。一部のアミノ酸の測定については、非特許文献1の記載に従って培地の組成を以下に記載するように調整した。但し、本発明では、これらの変更条件以外の条件であっても、アミノ酸の定量は可能である。
【００４２】
Ｌ−アラニンの測定については、ニコチン酸を含まずに培地を調製した。Ｌ−グルタミンの測定用の合成培地は、Ｌ−アスパラギン酸濃度を１．５ｍＭまで下げた。Ｌ−ヒスチジンの測定については、ニコチン酸とピリドキシンを含まずに培地を調製した。Ｌ−イソロイシン用の培地では、Ｌ−ロイシンとＬ−バリンの濃度をそれぞれ０．３８ｍＭと０．８５ｍＭに下げた。Ｌ−フェニルアラニン測定用培地については、Ｌ−チロシン濃度を０．２７５ｍＭに変えた。Ｌ−セリンについては、ニコチン酸を含まずに培地を調製し、Ｌ−スレオニンの濃度を１．３４ｍＭに下げた。Ｌ−スレオニンについては、Ｌ−セリンの濃度を０．４７５ｍＭに変え、Ｌ−チロシンについては、Ｌ−フェニルアラニンを０．６１ｍＭに下げた。
【００４３】
アミノ酸標準液の調製
０〜２０μｇ／ｍＬの濃度でのアミノ酸標準液を蒸留水で調製し、１２１℃、２０分間のオートクレーブによって滅菌した。
【００４４】
微量バイオアッセイによるアミノ酸濃度の測定
９６穴培養プレートにて培養を行った。合成培地（０．５ｍＬ）と標準液又は試料（０．５ｍＬ）とをウエルに加え、混合した。接種に先立って培地を３７℃で３０分間インキュベートした。０時間にスターター（５％）を培地に接種した。プラスチックフィルムでプレートを覆い、３７℃にて４時間インキュベートした。
【００４５】
Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)からの発光を測定するために、分取した培養液（２５μＬ）を３重測定で３８４穴白色マイクロタイタープレート（Griener）に分注した。直ちに、ルシフェラーゼと基質Ｄ−ルシフェリンの混合物（Promega）２５μＬを細胞浮遊液に加えた。混合物を穏やかに混合し、室温にて５分間インキュベートし、照度計（TACAN）にて発光シグナルを測定した。
【００４６】
従来法と比較するために、培養物をさらに１２時間インキュベートし、分取した培養物（１００μＬ）をよく混合して９６穴プレートに移した。マイクロプレートリーダーによって６１０ｎｍでの光学密度を測定した。
ヒトの血漿又は血清においてＬ−アミノ酸を測定するために、試料を無菌生理食塩水で希釈して好適な濃度を得、上述のようにアッセイした。
【００４７】
超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）によるアミノ酸解析
プレカラムＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａＵＰＬＣ誘導体化キット（Waters Corp., Milford, USA）を用いたアミノ酸解析に基づいてＬ−アミノ酸の機器解析を行った。製造元の指示書に従って誘導体化を行った。誘導体化については、１０μＬの試料に７０μＬのＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａホウ酸緩衝液を加え、その後、２０μＬの試薬溶液を加えた。直ちに反応混合物を混合し、室温で１時間放置し、５５℃に１０分間加熱した。ＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａカラム（１．７μｍ、１０ｍｍ×２．１ｍｍ、ｉ．ｄ．，）とＡｃｑｕｉｔｙＦＬＲ検出器を備えたＷａｔｅｒＡｃｑｕｉｔｙＩＰＬＣシステム（Waters Corp., Milford, USA）にてＬＣ−蛍光解析を行った。ＴＵＶ検出器に対して波長２６０ｎｍを設定した。注入容積は１μＬであり、流速は０．７ｍＬ／分であり、カラム温度は６０℃を保持した。
【００４８】
移動相は、２つの溶離液：溶離液Ａ（ＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａ溶離液Ａ濃縮液（１０％ｖ／ｖ）とミリＡ水（９０％ｖ／ｖ）及び溶離液Ｂ（ＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａ溶離液Ｂ）から成った。溶出勾配特性は以下のとおりであった：０〜０．５４分、９９．９％Ａと０．１％Ｂ；５．７４分、８６．４％Ａと１３．６％Ｂ；７．７４分、６８．３％Ａと３１．７％Ｂ；８．０４分、１１．７％Ａと８８．３％Ｂ；８．０５〜８．６４分、１０％Ａと９０％Ｂ；８．７３〜９．５０分、９９．９％Ａと０．１％Ｂ。Ｌ−チロシンの保持時間は６．８３分だった。
【００４９】
ヒトの血清及び血漿の試料を用いて、発光微量バイオアッセイ(本発明)とＵＰＬＣ解析との間の相関を測定した。
【００５０】
結果
１．発光微量バイオアッセイ(本発明)と従来の微量バイオアッセイの比較
比較のために２つの方法によってＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖を測定した。完全合成培地にて、Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ)ｃｉのスターターを接種し、培養液を３７℃でインキュベートした。時間経過を追跡し、従来の光学密度法と新しい生物発光法によって増殖シグナルをモニターした。結果を図１ａに示す。従来の光学密度法によって判定された増殖は、接種後、５時間のインキュベートの後認められた。生物発光検出との比較では、１時間後、増殖は有意に認められ、そのシグナルはＬ−バリンの濃度に相当して有意に増大した（図１ｂ）。バリンの濃度が高くなればなるほど、Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の高い増殖率が助長された。生物発光法の検出感度は従来法より高く、時間もかからなかった。
【００５１】
２．検出範囲、培養時間、及び応答の線形性
検出範囲、最適な培養時間、及び標的アミノ酸の濃度と発光シグナルの間の反応線形性を検討した。様々なＬ−バリン濃度にて合成培地でＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)のスターターを培養し、発光シグナル（ＲＬＵ）を様々な時間間隔でモニターした。
図２に示すように、検出の一次線形性は、Ｌ−バリン濃度の限定された範囲における増殖曲線から得ることができた。２時間の培養で検出範囲は、２〜１０μｇのＬ−バリンの間であったが、培養時間が３〜４時間に増えると、感度の増大（０〜１０μｇのバリン）が認められた。０．９８２のＲ2を伴った、Ｌ−バリン濃度と発光シグナルの線形反応を得るには４時間を超える時間が必要であった。４時間のモニタリング時間を選択し、そのほかの１７アミノ酸の線形性評価に応用した。調べた１８アミノ酸の線形性を評価したが、図３に示すように、有意に高い線形性（Ｒ2＞０．９５７、システインについてはＲ2＝０．９２７）が明らかにされた。調べたアミノ酸はすべて４時間のインキュベート後大きな線形性を示した。冗漫な１２〜１６時間を必要とする従来法に比べて４時間のインキュベート時間は我々の系にとって有利であり、好適である。様々な標的アミノ酸の検出範囲は、２〜８０μＭで変化する。これらの濃度は、ヒトの血液、検体及びそのほかの生体試料におけるアミノ酸濃度を決定するのに十分な感度である。
【００５２】
生物発光微量バイオアッセイの臨床応用と妥当性
ヒトの血清及び血漿でグリシンを臨床的に決定するのに生物発光微量バイオアッセイを応用した。ＧｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１０で濾過することによってヒトの血清及び血漿の試料を脱タンパク化し、無菌密封チューブに保存し、さらに滅菌することなくアッセイに用いた。オートクレーブ（１２１℃にて１５分間）による滅菌は血漿組成物の析出を起こした。アッセイに対する滅菌の効果を検討するために、滅菌した（０．２μｍの濾過による）及び滅菌していない脱タンパク化血漿を用いた培養で検出されたＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖シグナルは有意ではないが異なっていた（データは示さず）。
【００５３】
さらに、ヒト血漿についての解析の精度（変動係数；ＣＶ）を評価した。以内試行の変動係数（ｎ＝９）は５．５〜８．９％の間であったが、以外試行の変動係数（ｎ＝３）は４．８〜５．０％であった（表３）。結果は、アッセイの許容できる精度範囲を示し、アッセイは臨床スクリーニングでの使用を考慮するのに十分である。我々のアッセイを超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）と比較することによってアッセイの信頼性を実行した。双方の方法によって血漿及び血清におけるグリシンの濃度を測定し、結果を表４に示した。発光微量バイオアッセイによるグリシンの回収は、ＵＰＬＣアッセイに比べて９１〜１０７％の間であった。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００５６】
アミノ酸についての本発明の生物発光微量バイオアッセイは、臨床用途、環境用途、食品、及び医薬品分野における特定のアミノ酸濃度の診断に有望なツールであると我々は結論付けている。フェニルケトン尿症又はガラクトース血症の判定に独立栄養細菌を用いるガスリー試験のような従来法、又は乳酸菌の増殖濁度によって標的アミノ酸を決定する従来法は、不正確であることが多く、有意に十分な解析時間を必要とする。本発明者らは、乳酸菌による微量バイオアッセイをホタルのルシフェラーゼシステムと組み合わせることによって新しい特定アミノ酸測定法を初めて提示しているが、それは、従来法の限界を減らすだけでなく、ほかの目的のための細菌を基にしたアッセイに新しい時代を開くものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を用いたアミノ酸の定量方法に関する。特に本発明は、栄養要求性である乳酸菌を用い、かつ発光法を用いて比較的短時間でアミノ酸を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸分析は食品の品質管理や様々な疾病検出のマーカーとして用いられ、その迅速・簡便な定量法の開発は工業的・医療的見地から強く望まれている。これまでに知られているアミノ酸定量法としては、HPLCを用いた機器分析法や、定量用酵素を用いた酵素法と共に、乳酸菌を用いたバイオアッセイ法が挙げられる（非特許文献1）。
【０００３】
乳酸菌を用いたバイオアッセイ法では、測定対象のアミノ酸種に対し要求性を示す乳酸菌が用いられる。乳酸菌は発酵性であり、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸エステル、塩、核酸誘導体及びビタミンと共に供給されることを必要とする複雑な栄養要求性を有する。炭素供給源が添加された単純な無機物培地では乳酸菌は増殖することができない。測定対象のアミノ酸に対し要求性を示す乳酸菌株を、目的アミノ酸制限培地および検体の混合液中で静止期まで培養させると、目的アミノ酸の検体中含有量に比例した菌体増殖量が得られる。このような乳酸菌の増殖量に基づいてアミノ酸を定量することかできる。増殖量は、一般には濁度により測定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】アミノ酸・核酸集談会編『アミノ酸発酵』共立出版株式会社（1972）358-378頁
【非特許文献２】S. Guglielmetti et al.,International Journal of Food Microbiology 124 (2008) 285-290
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の乳酸菌の増殖量に基づく方法は、以下のような問題点を有する。
・静止期まで増殖させる必要があるため、測定には長時間（約16時間以上）の培養を要する
・菌の増殖量を濁度によって測定するため、感度・精度が悪い
・菌の増殖量に基づく定量法のため、増殖に影響を与えるような夾雑物質の影響を大きく受ける
【０００６】
そこで本発明が解決すべき課題、即ち本発明の目的は、測定対象のアミノ酸に対し要求性を示す乳酸菌を用いるアミノ酸の定量方法であって、乳酸菌の増殖量に基づく方法の有する上記３つの課題を解決することができる方法を提供することにある。換言すると、本発明の目的は、短時間で高感度・高精度な測定が可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために種々検討した結果、乳酸菌が増殖に伴って生成するATP生成量を計測することで、増殖量(濁度)に基づく方法に比べて短時間の培養で、高感度にアミノ酸の定量が可能であることを見出して本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
[1]
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
[2]
前記ATP濃度依存発光法は、ルシェラーゼ及びルシフェリンを用いる方法である、[1]記載の方法。
[3]
検体を混合した培地中での栄養要求性乳酸菌の培養は、２〜５時間行われる[1]または[2]に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
乳酸菌が増殖に伴ってATPを生成するが、ATPは、乳酸菌増殖の対数期において生成量が多く、従って、本発明においては、静止期まで培養することなく乳酸菌増殖に伴うアミノ酸の定量が可能である。さらに本発明では、ATP生成量は、例えば、ルシフェラーゼ等を用いる発光法にて定量できることから、高感度・高精度なアミノ酸の定量が可能である。
【００１０】
尚、非特許文献2には、乳酸菌に遺伝子導入したルシフェラーゼにより、乳酸菌が増殖に伴って生成するATPを定量することが記載されている。しかし、この文献には、外部から添加したルシフェラーゼにより乳酸菌が生成したATPを定量できることは記載されておらず、さらに乳酸菌のアミノ酸要求性を利用してアミノ酸定量を外部から添加したルシフェラーゼにより行うことも記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）完全合成培地における最初の６時間のインキュベートでのＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖。６６０ｎｍでの分光光度計を用いた従来法（●）又は照度計によってモニターした発光微量バイオアッセイからの発光シグナル（○）によって増殖を測定した。（ｂ）Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖に対するＬ−バリン濃度の効果。１（●）、２（○）、４（▲）、６（△）、８（■）、１０（□）、１５（◆）、２０（◇）、及び３０（＋）μｇでのＬ−バリンの様々な量を含むＬ−バリンについて合成培地にてＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)を評価した。増殖は発光微量バイオアッセイによってモニターした。
【図２】（ａ）合成培地における種々のＬ−バリン濃度でのＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖曲線。（ｂ）合成培地における様々なＬ−バリン濃度での発光シグナルとＬ−バリンの線形性反応。増殖は、０時間（＊）、１時間（●）、２時間（▲）、3時間（◆）及び４時間（■）での様々な間隔の時間で測定した。
【図３】発光シグナルと１８の標的アミノ酸の濃度との間の線形性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、検体中のアミノ酸の定量方法に関する。本発明の方法は、以下の工程(A)〜(D)を含む。
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)。
【００１３】
工程(A)
工程(A)は、所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程である。
【００１４】
本発明で用いる乳酸菌は、測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌である。
【００１５】
本発明において、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌」における「測定対象アミノ酸」とは、例えば、タンパク質構成アミノ酸であることができ、タンパク質構成アミノ酸とは、L-アラニン、L-プロリン、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-グルタミン、L-セリン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-メチオニン、L-グリシン、L-チロシン、L-アスパラギン、L-トリプトファン、L-システインを意味する。さらに、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性」とは、乳酸菌が、自ら体内で測定対象アミノ酸を合成できず、生育するためには培地から供給される必要がある性質を意味する。さらに、「測定対象アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌」とは、「測定対象アミノ酸」を包含するアミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌を意味する。測定対象アミノ酸は、1種類であることも複数種類であることもできる。
【００１６】
アミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌の例は、特に制限はされないが、以下の表に示すものを挙げることができる。表１には、乳酸菌の菌株名と栄養要求性を示すアミノ酸を記載する。さらに表２には、日本乳酸菌学会編・京都大学学術出版会・2010年『乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス』より引用したアミノ酸に対して栄養要求性を有する乳酸菌の例を示す。尚、表２の脚注にある「乳酸菌の科学と技術」は、乳酸菌研究集談会編・学会出版センター・1996年刊である。
【００１７】
【表１】
※：必須要求，＋：促進，−：要求性なし
§：ビタミンＢ6系を培地から除いた場合
Ａ：ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum) ATCC 8014
Ｂ：ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus) ATCC 7469
Ｃ：ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum) ATCC 9338
Ｄ：エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae) ATCC 8043
Ｅ：ペディオコッカス・アシディラクチシ(Pediococcus acidilactici) ATCC 8042
Ｆ：ペディオコッカス・アシディラクチシ(Pediococcus acidilactici) ATCC 8081
Ｇ：ラクトバチルス・レイヒマンニ(Lactobacillus leichmannii)
尚、表１に記載された各乳酸菌のアミノ酸要求性において「※：必須要求」と標記されたアミノ酸については本発明の方法によりアミノ酸の定量が可能である。表１に記載された全ての乳酸菌は、少なくとも1つの「※：必須要求」と標記されたアミノ酸を有することから、いずれも本発明の方法によるアミノ酸の定量方法に使用できる。それに対して、「＋：促進」と標記されたアミノ酸については、「＋：促進」と標記されたアミノ酸の非存在時に、乳酸菌が示す挙動によって、本発明の方法によるアミノ酸の定量に使用できる場合とできない場合とがある。
(1)定量に使用可能な場合：
・生育するまで一定時間のラグが空いてから生育を始める場合
または
・生育は可能だが、生育速度はきわめて低い場合
(2)定量に使用不可能な場合（アミノ酸非存在時のバックグラウンドの発現が高くなる）：
・存在時に近い生育速度を示し、また生育開始までのラグがない場合
各乳酸菌が各「促進」アミノ酸非添加時に上記挙動のどれを示すかは、予備実験をすることで簡単に明らかにできる。
【００１８】
【表２】
【００１９】
本発明においては、乳酸菌が増殖する際に生成するATP量を、ATP濃度依存発光法を用いて定量する。ATP濃度依存発光法は、ATP濃度に依存した発光を呈する反応を利用した方法であればよく、例えば、ルシェラーゼ及びルシフェリンを用いる方法を挙げることができる。
【００２０】
ルシェラーゼはホタル由来のものが一般的であるが、ホタル以外に由来するルシェラーゼも用いることができる。ルシフェラーゼによる発光方法は、測定対象である乳酸菌の培養液に、ルシフェラーゼと発光反応に十分な濃度の基質ルシフェリン、Ｍｇ2+イオンなどを混合し、Ｏ2の存在下で反応させ、この反応によって生じる発光量を測定することで実施できる。十分量のルシフェラーゼ、ルシフェリン、Ｍｇ2+イオン、Ｏ2の存在下で反応させれば、共存するATP濃度に依存した発光量が得られる。工程(A)においては、所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、上記ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める。求められた相関関係は、例えば、検量線としておき、工程である。工程(D)において、発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める際に利用する。
【００２１】
本発明の方法において、ルシフェラーゼにより乳酸菌が生成したATP濃度測定が可能なATP濃度の下限は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の添加濃度により異なるが、例えば、０．０１ｍＭである。従って、この点を考慮して本発明に使用するルシフェラーゼの添加量は、乳酸菌の培養液に対して、十分に定量性を有する範囲で適宜決定することができる。
【００２２】
ルシフェリンは、ルシフェラーゼが作用するものであれば特に限定されないが、好ましくはＤ−ルシフェリンで、塩としてはカリウム塩、ナトリウム塩などである。天然物と化学合成品いずれであってもよいが、化学合成品の方がロット間のバラツキが少ないようである。さらに、Ｄ−ルシフェリン誘導体であってもよい。本発明で使用されるルシフェリンの濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであり、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜３ｍＭである。
【００２３】
本発明に使用するマグネシウムイオンは、マグネシウムイオンを含む化合物から提供され、このような化合物としては、硫酸マグネシウム、炭酸水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなどが挙げられる。マグネシウムイオンの濃度は、０．０１〜２５ｍＭであり、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは２〜７．５ｍＭである。
【００２４】
本発明ではさらに、発光反応を増強するため補酵素Ａを含むこともできる。補酵素Ａの好ましい濃度は０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ以上である。
【００２５】
本発明では、培地は、イオン強度やｐＨを維持するために、緩衝成分を含んでもよい。緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、グリシルグリシンなどが挙げられ、通常は２０〜１００ｍＭの使用が好ましい。好ましいｐＨ範囲は７．０〜８．５である。ｐＨ７．８〜８．０で最大発光を得ることができるが、ｐＨを７．８以下にすることによって発光持続性を高めることができる。本発明ではさらにルシフェラーゼの活性を増強するタンパク質性材料、例えば、ウシなどの哺乳類血清アルブミン、ラクトアルブミンなどを培地に存在させることもできる。
【００２６】
本発明の方法では、さらにサンプル中に存在して、ルシフェラーゼやＡＴＰなどに悪影響を及ぼす可能性のある金属含有プロテアーゼやホスファターゼの活性を抑制するため、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤などを含有させることができる。好ましい濃度としては１〜５ｍＭである。
【００２７】
さらに、本発明の方法では、ルシフェラーゼのタンパク質の安定性を保護する作用が考えられる還元剤を含んでもよい。還元剤としてはジチオトレイトールや２−メルカプトエタノールなどのスルフィドリル化合物が挙げられる。
【００２８】
ルシフェラーゼによりルシフェリンが酸化されて生成するオキシルシフェリンは560〜572nmに発光ピークを有し、この発光を常法により測定することができる。
【００２９】
工程(B)
工程(B)は、測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程である。
測定対象アミノ酸は、検体の種類と用いる乳酸菌組換体が有するアミノ酸要求性を考慮して決定される。本発明で用いる培地は、測定対象アミノ酸を含まないものであれば、如何なるものでもよい。即ち、培地としては、測定対象以外のアミノ酸は、乳酸菌組換体の生育に必要な種類及び量を含有し、アミノ酸以外の栄養成分についても含有するものである。
【００３０】
測定対象アミノ酸を含有しない培地は、測定対象アミノ酸を含有しないこと以外は、通常乳酸菌の培養に用いられる培地であることが適当であり、例えば、GYP培地を基本培地として挙げることができる。あるいは、MRS培地も用いることができる。但し、これらの培地に限定される意図ではなく、乳酸菌が生育を示す培地であればいずれの培地も使用することができる。
【００３１】
検体を混合した培地中での栄養要求性乳酸菌の培養は、例えば、10〜40℃の範囲の常温において、例えば、2〜5時間行われる。但し、耐熱性乳酸菌を使用する場合には上記温度より高い温度において培養することもできる。培養時間は、検体に含まれているアミノ酸の濃度、使用するルシフェラーゼ等の量や種類によって変化する発光量及び発光の検出器の感度等を考慮して適宜決定することができる。上記培養は、マイクロタイタープレートの各ウェル中で複数の検体について、並列に実施することができる。
【００３２】
工程(C)
工程(C)は、前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程である。所定の培養時間が経過した後に、培養液の発光量を測定する。発光量測定には、公知の分光光度計等を用いることができる。さらに、マイクロタイタープレート上で複数の検体を並列的に培養及び発光量測定には発光量測定器としては、ピーク波長を565nmに持つホタルルシフェラーゼの発光や、その変異型酵素、ピーク波長を630nmに持つ赤色発光ルシフェラーゼ（鉄道虫由来）の発光などを測定可能な、通常の発光測定装置（ルミノメータ）等を用いることができる。
【００３３】
工程(D)
工程(D)は前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程である。この工程は、コンピュータに予め上記相関関係に関するデータを入力しておき、発光量の測定結果をこのコンピュータに手動または自動で入力することで、検体中に含まれるアミノ酸量を求めることができる。
【００３４】
本発明のアミノ酸の定量方法が対象とする検体は、特に制限はない。本発明に用いる検体は、測定対象アミノ酸を含む可能性のある試料であれば、如何なるものでもよい。用いる乳酸菌組換体のタンパク質合成や細胞内へのアミノ酸取り込みを阻害する物質が含まれていなければ、用いる乳酸菌組換体の増殖を阻害・促進する物質が含まれていてもよい。例えば、食品サンプルや各種培地、血漿などの生体試料が例として挙げられる。定量可能なアミノ酸としては、例えば、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等を定量することができる。本発明の方法では、血清または血漿に含まれるグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの定量をすることか可能である。
【００３５】
本発明の方法は、前述のように、マイクロタイタープレート上の複数のウェル中で、異なるまたは同一の検体について、並列的に実施することができる。
予め測定対象アミノ酸を含有しない培地をウェルに格納したマイクロタイタープレートを準備し、ウェル中の培地に検体を添加し、次いで乳酸菌を添加して、所定期間培養する。培養後に、ルシフェラーゼ等の発光用試薬を培地に添加して、ルシフェラーゼによりルシフェリンを酸化させた後に発光量を測定する。
【００３６】
本発明は、上記方法に使用できるアミノ酸定量用キットも提供できる。このキットは、以下の(1)〜(3)を含むものである。
(1)測定対象アミノ酸を含有しない培地
(2)乳酸菌
(3)発光用試薬
【００３７】
(1)〜(3)のそれぞれについては、上記本発明の方法の説明で記載したものをそのまま利用できる。
【実施例】
【００３８】
実験区分
ペディオコッカス・アシディラクチシ(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の調製
０．５％酵母抽出物、１％ポリペプトン、１％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ６．０を含有する乳酸菌斜面寒天における穿刺培養によって、栄養要求体、Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)を３７℃にて培養し、４℃で保持し、毎月培地を新しくした。
全容積１リットルにて５ｇの酵母抽出物、１０ｇのポリペプトン、１０ｇのグルコース、５００ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、５００ｍｇのＫ2ＨＰＯ4、８００ｍｇのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、４０ｍｇのＦｅＳＯ4.７Ｈ2Ｏ、１６０ｍｇのＭｎＳＯ4．４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇのＫＣｌから成る１０ｍＬの乳酸菌培地に斜面培養から生物を移すことによって接種菌液を作製した。３７℃にて１２〜１６時間の培養の後、細胞培養物を３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、生理食塩水で２回洗浄した。細胞ペレットを生理食塩水に溶解し、希釈して６００ｎｍにて０．５〜０．６前後の光学密度を得た。
【００３９】
基本培地の調製
特に指示されない限り、ストック溶液はすべて蒸留水で調製した。アミノ酸溶液は、新しく調製しなければならないシステインを除いて−２０℃に保存することができるが、チロシン溶液は０．２ＮのＮａＯＨに溶解した。
【００４０】
基本培地は、１リットル中、２．２４ｍＭのＬ−アラニン、１．１５ｍＭのＬ−アルギニン、３．０１ｍＭのＬ−アスパラギン酸、０．５７ｍＭのＬ−システイン、３．４ｍＭのＬ−グルタミン酸、１．３３ｍＭのグリシン、０．６４ｍＭのＬ−ヒスチジン、１．５２ｍＭのＬ−イソロイシン、１．５２ｍＭのＬ−ロイシン、１．０９ｍＭのＬ−リジン−ＨＣｌ、１．３４ｍＭのＬ−メチオニン、１．２１ｍＭのＬ−フェニルアラニン、０．８７ｍＭのＬ−ポリン、０．９５ｍＭのＬ−セリン、１．６８ｍＭのＬ−スレオニン、０．４９ｍＭのＬ−トリプトファン、０．５５ｍＭのＬ−チロシン、１．７１ｍＭのＬ−バリン、２．９６μＭのチアミン、２．６６μＭのリボフラビン、４．８６μＭのピリドキシン、４．９１μＭのピリドキサル、２．１μＭのパントテン酸カルシウム、８．１２μＭのニコチン酸、１．４６μＭのｐ−アミノ安息香酸、０．０２μＭの葉酸、０．０４μＭのビオチン、２７．１５μＭの硫酸アデノシン、１０４．６８μＭのグアニン、８１．９μＭのウラシル、６５．７４μＭのキサンチン、０．１ｍＭのグルコース、５６．０９μＭのＮＨ4Ｃｌ、３．６７μＭのＫＨ2ＰＯ4、２．８７μＭのＫ2ＨＰＯ4、０．８１μＭのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．０４μＭのＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．０５μＭのＭｎＣｌ2．４Ｈ2Ｏ、０．１７μＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭの酢酸カリウムから成る。１２１℃、２０分間のオートクレーブによって培地を滅菌した。
【００４１】
基本培地について記載された組成に基づいて、標的アミノ酸を含まずに測定用の合成培地を調製した。一部のアミノ酸の測定については、非特許文献1の記載に従って培地の組成を以下に記載するように調整した。但し、本発明では、これらの変更条件以外の条件であっても、アミノ酸の定量は可能である。
【００４２】
Ｌ−アラニンの測定については、ニコチン酸を含まずに培地を調製した。Ｌ−グルタミンの測定用の合成培地は、Ｌ−アスパラギン酸濃度を１．５ｍＭまで下げた。Ｌ−ヒスチジンの測定については、ニコチン酸とピリドキシンを含まずに培地を調製した。Ｌ−イソロイシン用の培地では、Ｌ−ロイシンとＬ−バリンの濃度をそれぞれ０．３８ｍＭと０．８５ｍＭに下げた。Ｌ−フェニルアラニン測定用培地については、Ｌ−チロシン濃度を０．２７５ｍＭに変えた。Ｌ−セリンについては、ニコチン酸を含まずに培地を調製し、Ｌ−スレオニンの濃度を１．３４ｍＭに下げた。Ｌ−スレオニンについては、Ｌ−セリンの濃度を０．４７５ｍＭに変え、Ｌ−チロシンについては、Ｌ−フェニルアラニンを０．６１ｍＭに下げた。
【００４３】
アミノ酸標準液の調製
０〜２０μｇ／ｍＬの濃度でのアミノ酸標準液を蒸留水で調製し、１２１℃、２０分間のオートクレーブによって滅菌した。
【００４４】
微量バイオアッセイによるアミノ酸濃度の測定
９６穴培養プレートにて培養を行った。合成培地（０．５ｍＬ）と標準液又は試料（０．５ｍＬ）とをウエルに加え、混合した。接種に先立って培地を３７℃で３０分間インキュベートした。０時間にスターター（５％）を培地に接種した。プラスチックフィルムでプレートを覆い、３７℃にて４時間インキュベートした。
【００４５】
Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)からの発光を測定するために、分取した培養液（２５μＬ）を３重測定で３８４穴白色マイクロタイタープレート（Griener）に分注した。直ちに、ルシフェラーゼと基質Ｄ−ルシフェリンの混合物（Promega）２５μＬを細胞浮遊液に加えた。混合物を穏やかに混合し、室温にて５分間インキュベートし、照度計（TACAN）にて発光シグナルを測定した。
【００４６】
従来法と比較するために、培養物をさらに１２時間インキュベートし、分取した培養物（１００μＬ）をよく混合して９６穴プレートに移した。マイクロプレートリーダーによって６１０ｎｍでの光学密度を測定した。
ヒトの血漿又は血清においてＬ−アミノ酸を測定するために、試料を無菌生理食塩水で希釈して好適な濃度を得、上述のようにアッセイした。
【００４７】
超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）によるアミノ酸解析
プレカラムＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａＵＰＬＣ誘導体化キット（Waters Corp., Milford, USA）を用いたアミノ酸解析に基づいてＬ−アミノ酸の機器解析を行った。製造元の指示書に従って誘導体化を行った。誘導体化については、１０μＬの試料に７０μＬのＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａホウ酸緩衝液を加え、その後、２０μＬの試薬溶液を加えた。直ちに反応混合物を混合し、室温で１時間放置し、５５℃に１０分間加熱した。ＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａカラム（１．７μｍ、１０ｍｍ×２．１ｍｍ、ｉ．ｄ．，）とＡｃｑｕｉｔｙＦＬＲ検出器を備えたＷａｔｅｒＡｃｑｕｉｔｙＩＰＬＣシステム（Waters Corp., Milford, USA）にてＬＣ−蛍光解析を行った。ＴＵＶ検出器に対して波長２６０ｎｍを設定した。注入容積は１μＬであり、流速は０．７ｍＬ／分であり、カラム温度は６０℃を保持した。
【００４８】
移動相は、２つの溶離液：溶離液Ａ（ＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａ溶離液Ａ濃縮液（１０％ｖ／ｖ）とミリＡ水（９０％ｖ／ｖ）及び溶離液Ｂ（ＡｃｃＱ．ＴａｑＵｌｔｒａ溶離液Ｂ）から成った。溶出勾配特性は以下のとおりであった：０〜０．５４分、９９．９％Ａと０．１％Ｂ；５．７４分、８６．４％Ａと１３．６％Ｂ；７．７４分、６８．３％Ａと３１．７％Ｂ；８．０４分、１１．７％Ａと８８．３％Ｂ；８．０５〜８．６４分、１０％Ａと９０％Ｂ；８．７３〜９．５０分、９９．９％Ａと０．１％Ｂ。Ｌ−チロシンの保持時間は６．８３分だった。
【００４９】
ヒトの血清及び血漿の試料を用いて、発光微量バイオアッセイ(本発明)とＵＰＬＣ解析との間の相関を測定した。
【００５０】
結果
１．発光微量バイオアッセイ(本発明)と従来の微量バイオアッセイの比較
比較のために２つの方法によってＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖を測定した。完全合成培地にて、Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ)ｃｉのスターターを接種し、培養液を３７℃でインキュベートした。時間経過を追跡し、従来の光学密度法と新しい生物発光法によって増殖シグナルをモニターした。結果を図１ａに示す。従来の光学密度法によって判定された増殖は、接種後、５時間のインキュベートの後認められた。生物発光検出との比較では、１時間後、増殖は有意に認められ、そのシグナルはＬ−バリンの濃度に相当して有意に増大した（図１ｂ）。バリンの濃度が高くなればなるほど、Ｐ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の高い増殖率が助長された。生物発光法の検出感度は従来法より高く、時間もかからなかった。
【００５１】
２．検出範囲、培養時間、及び応答の線形性
検出範囲、最適な培養時間、及び標的アミノ酸の濃度と発光シグナルの間の反応線形性を検討した。様々なＬ−バリン濃度にて合成培地でＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)のスターターを培養し、発光シグナル（ＲＬＵ）を様々な時間間隔でモニターした。
図２に示すように、検出の一次線形性は、Ｌ−バリン濃度の限定された範囲における増殖曲線から得ることができた。２時間の培養で検出範囲は、２〜１０μｇのＬ−バリンの間であったが、培養時間が３〜４時間に増えると、感度の増大（０〜１０μｇのバリン）が認められた。０．９８２のＲ2を伴った、Ｌ−バリン濃度と発光シグナルの線形反応を得るには４時間を超える時間が必要であった。４時間のモニタリング時間を選択し、そのほかの１７アミノ酸の線形性評価に応用した。調べた１８アミノ酸の線形性を評価したが、図３に示すように、有意に高い線形性（Ｒ2＞０．９５７、システインについてはＲ2＝０．９２７）が明らかにされた。調べたアミノ酸はすべて４時間のインキュベート後大きな線形性を示した。冗漫な１２〜１６時間を必要とする従来法に比べて４時間のインキュベート時間は我々の系にとって有利であり、好適である。様々な標的アミノ酸の検出範囲は、２〜８０μＭで変化する。これらの濃度は、ヒトの血液、検体及びそのほかの生体試料におけるアミノ酸濃度を決定するのに十分な感度である。
【００５２】
生物発光微量バイオアッセイの臨床応用と妥当性
ヒトの血清及び血漿でグリシンを臨床的に決定するのに生物発光微量バイオアッセイを応用した。ＧｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１０で濾過することによってヒトの血清及び血漿の試料を脱タンパク化し、無菌密封チューブに保存し、さらに滅菌することなくアッセイに用いた。オートクレーブ（１２１℃にて１５分間）による滅菌は血漿組成物の析出を起こした。アッセイに対する滅菌の効果を検討するために、滅菌した（０．２μｍの濾過による）及び滅菌していない脱タンパク化血漿を用いた培養で検出されたＰ．アシディラクチシ(ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ)の増殖シグナルは有意ではないが異なっていた（データは示さず）。
【００５３】
さらに、ヒト血漿についての解析の精度（変動係数；ＣＶ）を評価した。以内試行の変動係数（ｎ＝９）は５．５〜８．９％の間であったが、以外試行の変動係数（ｎ＝３）は４．８〜５．０％であった（表３）。結果は、アッセイの許容できる精度範囲を示し、アッセイは臨床スクリーニングでの使用を考慮するのに十分である。我々のアッセイを超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）と比較することによってアッセイの信頼性を実行した。双方の方法によって血漿及び血清におけるグリシンの濃度を測定し、結果を表４に示した。発光微量バイオアッセイによるグリシンの回収は、ＵＰＬＣアッセイに比べて９１〜１０７％の間であった。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００５６】
アミノ酸についての本発明の生物発光微量バイオアッセイは、臨床用途、環境用途、食品、及び医薬品分野における特定のアミノ酸濃度の診断に有望なツールであると我々は結論付けている。フェニルケトン尿症又はガラクトース血症の判定に独立栄養細菌を用いるガスリー試験のような従来法、又は乳酸菌の増殖濁度によって標的アミノ酸を決定する従来法は、不正確であることが多く、有意に十分な解析時間を必要とする。本発明者らは、乳酸菌による微量バイオアッセイをホタルのルシフェラーゼシステムと組み合わせることによって新しい特定アミノ酸測定法を初めて提示しているが、それは、従来法の限界を減らすだけでなく、ほかの目的のための細菌を基にしたアッセイに新しい時代を開くものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
【請求項２】
前記ATP濃度依存発光法は、ルシェラーゼ及びルシフェリンを用いる方法である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
検体を混合した培地中での栄養要求性乳酸菌の培養は、２〜５時間行われる請求項1または2に記載の方法。
【請求項１】
所定濃度の測定対象アミノ酸を含有する培地において、ATP濃度依存発光法を用いて前記アミノ酸に対する栄養要求性を有する乳酸菌が生成する発光量と前記アミノ酸濃度との相関関係を求める工程(A)、
測定対象アミノ酸を含有しない培地に検体を混合し、得られた培地中で前記栄養要求性乳酸菌を培養する工程(B)、
前記ATP濃度依存発光法を用いて、培養後の培養液の発光量を測定する工程(C)、及び
前記相関関係に基づいて、前記発光法で得られた発光量から検体中に含まれるアミノ酸量を求める工程(D)
を含む検体中のアミノ酸の定量方法。
【請求項２】
前記ATP濃度依存発光法は、ルシェラーゼ及びルシフェリンを用いる方法である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
検体を混合した培地中での栄養要求性乳酸菌の培養は、２〜５時間行われる請求項1または2に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−７０６４０（Ｐ２０１３−７０６４０Ａ）
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１０６２８（Ｐ２０１１−２１０６２８）
【出願日】平成２３年９月２７日（２０１１．９．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１１年８月２５日 公益社団法人日本生物工学会発行の「第６３回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００２３６９２０）富山県 (197)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２７日（２０１１．９．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１１年８月２５日 公益社団法人日本生物工学会発行の「第６３回日本生物工学会大会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００２３６９２０）富山県 (197)
【Ｆターム（参考）】
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