アンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法
本発明は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換えにより改変された宿主にアンチトロンビンＩＩＩをコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物を生成蓄積させ、該培養物から該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することを特徴とする、アンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法。
【請求項２】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた宿主細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項８】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースー３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１０】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項１１】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項１０に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項１０に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１３】
形質転換体がＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８４、ＦＥＲＭ−１００８８またはＦＥＲＭ ＢＰ−１００８９である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｇ）胚性幹細胞；
（ｈ）受精卵細胞；
（ｉ）植物細胞；
（ｊ）酵母。
【請求項１５】
アンチトロンビンＩＩＩ組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有し、かつＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
アンチトロンビンＩＩＩが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードするポリペプチドである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ） 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ） 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
アンチトロンビンＩＩＩが、哺乳動物由来である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、アンチトロンビンＩＩＩ組成物。
【請求項２３】
請求項２２記載のアンチトロンビンＩＩＩ組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項２４】
医薬が、血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、予防薬又は治療薬である、請求項２３に記載の医薬。
【請求項１】
遺伝子組換えにより改変された宿主にアンチトロンビンＩＩＩをコードするＤＮＡを導入して得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンＩＩＩ分子からなる組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンＩＩＩ組成物を生成蓄積させ、該培養物から該アンチトロンビンＩＩＩ組成物を採取することを特徴とする、アンチトロンビンＩＩＩ組成物の製造方法。
【請求項２】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた宿主細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（Ｆｘ）からなる群から選ばれる酵素である、請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（Ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項８】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースー３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１０】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項１１】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項１０に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項１０に記載の製造方法。
（ａ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｄ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｅ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１３】
形質転換体がＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００８４、ＦＥＲＭ−１００８８またはＦＥＲＭ ＢＰ−１００８９である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）からなる群から選ばれる細胞である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｇ）胚性幹細胞；
（ｈ）受精卵細胞；
（ｉ）植物細胞；
（ｊ）酵母。
【請求項１５】
アンチトロンビンＩＩＩ組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖を有し、かつＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
アンチトロンビンＩＩＩが、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
アンチトロンビンＩＩＩが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードするポリペプチドである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ） 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ） 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
アンチトロンビンＩＩＩが、哺乳動物由来である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、アンチトロンビンＩＩＩ組成物。
【請求項２３】
請求項２２記載のアンチトロンビンＩＩＩ組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項２４】
医薬が、血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、予防薬又は治療薬である、請求項２３に記載の医薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５５６３
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【発行日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４６７４（Ｐ２００５−５１４６７４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５３２４
【国際出願日】平成１６年１０月８日（２００４．１０．８）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【発行日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５３２４
【国際出願日】平成１６年１０月８日（２００４．１０．８）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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