イヌ（ｃａｎｉｎｅ）Ｌ−ＰＢＥ配列
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥと称される、従来知られていなかったポリペプチドをコードするｃＤＮＡ；該遺伝子にコードされるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチド；該ポリペプチドに対する抗体；および前記すべてを作成しそして用いる方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）Ｌ−ＰＢＥポリペプチドを含む単離ポリペプチド、および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、毒性化合物または分子の指標となる代謝反応のための化合物および療法剤をスクリーニングするアッセイも提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ペルオキシソームは、古典的なＬ−ヒドロキシ特異的ペルオキシソーム増殖因子誘導性ベータ酸化系を含有する。ヒト・ペルオキシソームのエノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ：３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ二機能性酵素（Ｌ−ＰＢＥ）は、Ｈｏｅｆｌｅｒら（１）によって最初に同定された。ｃＤＮＡ配列は、３，７７９ヌクレオチドに渡り、２，１６９ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する。
【０００３】
Ｑｉらは、ノックアウトマウスを生成することによって、Ｌ−ＰＢＥの機能を検討した（２）。突然変異体マウスは生存可能であり、そして繁殖性であり、そして検出可能な著しい表現型上の欠陥を示さなかった。Ｌ−ＰＢＥノックアウトマウスは、ペルオキシソーム増殖因子に曝露されると、同様に処置された野生型マウスと比較して、ペルオキシソーム増殖反応が認識可能に鈍化していたことを除き、ＰＰＡＲαに制御される肝臓ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの増加を示した。ペルオキシソーム増殖反応のこの鈍化は、Ｌ−ＰＢＥノックアウトマウス肝臓中にＬ−ＰＢＥタンパク質が存在しなかったことに起因すると考えられる。
【０００４】
Ｗａｔｋｉｎｓらは、新生児副腎白質ジストロフィー（ＮＡＬＤ）の臨床的特徴を持つ男性乳児において、ペルオキシソーム機能を評価した（３）。ペルオキシソームのベータ−酸化酵素のイムノブロット研究によって、死後の肝臓試料において、Ｌ−ＰＢＥ（エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）が欠損していることが示された。Ｗａｎｄｅｒｓらもまた、ペルオキシソーム二機能性酵素欠損を記載しており、これはＮＡＬＤのものより、より重度の表現型と関連しているようである（４）。
【０００５】
イヌは、薬剤の毒性学を研究するための重要な種であるため、イヌＬ−ＰＢＥ遺伝子に特異的な核酸プローブおよびイヌＬ−ＰＢＥタンパク質に特異的な抗体は、推定上の毒性化合物に対する代謝反応を示す手段として、産業毒性学において、大きな価値を有する。本発明はこの必要性に対処する。
【０００６】
参考文献
【０００７】
【化１】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
本発明は、上に同定される必要性に対処し、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質をコードする単離核酸分子、該単離核酸分子を取り込んだ構築物および組換え宿主細胞；該単離核酸分子によってコードされるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチド；イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに対する抗体を提供する。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、単離イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを提供する。配列番号２のポリペプチドは、いくつかのポリペプチド種を生じる、特定のタンパク質分解プロセシング事象にさらされることも可能であると理解される。
【００１０】
さらに、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのエピトープを含む断片を提供する。「特異的なエピトープ」によって、以下に詳細に定義するように、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体によって認識可能であるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの部分を意味する。別の態様は、配列番号２に示す完全アミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含む。
【００１１】
イヌＬ−ＰＢＥのコードｃＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列を以下に複製し、そしてまた、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示す。
【００１２】
【化２】
【００１３】
配列番号１および配列番号２は、特定のイヌ・ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供するが、本発明は、その範囲内に他のイヌ・アレル変異体を含むことが意図される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド（例えば一本鎖または二本鎖のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせ）を提供する。こうしたポリヌクレオチドは、細胞において、該酵素を組換え的に発現するのに有用であり、そしてまた、該酵素の発現を検出するのにも有用である（例えばノーザン・ハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを用いる）。こうしたポリヌクレオチドはまた、培養細胞もしくは組織において、または動物において、イヌＬ−ＰＢＥの発現を抑制するアンチセンスおよび他の分子を設計するため、療法目的のため、あるいは異常なイヌＬ−ＰＢＥ発現に特徴付けられる疾患のモデルを提供するために、有用である。本発明のポリヌクレオチドの定義から明確に排除されるのは、ポリヌクレオチドが元来得られた天然宿主細胞由来の完全単離染色体である。配列番号１に示すポリヌクレオチドは、天然存在イヌＬ−ＰＢＥ配列に対応する。普遍的遺伝暗号の周知の縮重のため、やはり配列番号２のイヌＬ−ＰＢＥをコードする多くの他の配列が存在することが認識されるであろう。別の態様において、本発明は、配列番号１に示す配列以外の縮重イヌＬ−ＰＢＥコード配列のすべてに関する。
【００１５】
本発明はまた、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、以下のハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に示すヌクレオチド配列または該配列に相補的な非コード鎖に特異的にハイブリダイズする、前記単離ポリヌクレオチドも提供する：
（ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃１６時間のハイブリダイゼーション；および
（ｂ）０．１％ＳＳＣ、１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃３０分間２回の洗浄。
【００１６】
本発明の１つのポリヌクレオチドは、イヌＬ−ＰＢＥコードＤＮＡ配列を含む配列番号１に示す配列、またはそのユニークな断片を含む。
関連する態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。こうしたベクターは、例えば宿主細胞において、ポリヌクレオチドを増幅し、有用な量を生じるのに有用である。他の態様において、ベクターは発現ベクターであり、該ベクター中で、本発明のポリヌクレオチドが、発現調節配列を含むポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されている。こうしたベクターは、本発明のポリペプチドの組換え体産生に有用である。
【００１７】
別の関連する態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで（安定にまたは一過性に）形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。上述のように、こうした宿主細胞は、該ポリヌクレオチドを増幅するのに有用であり、そしてまた、該ポリヌクレオチドがコードする、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたはその断片を発現するのにも有用である。
【００１８】
さらに別の関連する態様において、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド（またはその断片）を産生する方法であって、栄養培地中で本発明の宿主細胞を増殖させ、そして細胞または培地から該ポリペプチドまたはその変異体を単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のイヌＬ−ＰＢＥに特異的な抗体を提供する。抗体特異性を以下により詳細に記載する。しかし、文献に先に記載されたポリペプチドから生成可能であり、そしてイヌＬ−ＰＢＥと偶然に交差反応する（例えば両ポリペプチド中に類似のエピトープが偶然存在するため）ことが可能な抗体は、「交差反応性」抗体と見なされることを強調しなければならない。こうした交差反応性抗体は、イヌＬ−ＰＢＥに「特異的」な抗体ではない。抗体がイヌＬ−ＰＢＥに特異的であるか、または別の既知の酵素と交差反応性であるかの決定は、ウェスタンブロッティングアッセイまたは文献で周知のいくつかの他のアッセイを用いて行われる。イヌＬ−ＰＢＥを発現する細胞を同定するため、そしてまた、イヌＬ−ＰＢＥ活性を調節するため、イヌＬ−ＰＢＥの活性部位に特異的に結合する抗体は、特に有用であるが、もちろん、他のエピトープに結合する抗体もまた、本発明の一部であることが意図される。
【００２０】
１つの変型において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。こうした抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の側面と意図される。
別の変型において、本発明は、ポリクローナル抗体を含む細胞不含組成物を提供し、ここで少なくとも１つの抗体は、イヌＬ−ＰＢＥに特異的な本発明の抗体である。動物から単離される抗血清が典型的な組成物であり、水または別の希釈剤、賦形剤、もしくはキャリアーに再懸濁されている抗血清の抗体分画を含む組成物も典型的である。
【００２１】
本発明はまた、本発明の抗体を用いる方法も提供する。例えば、本発明は、細胞抽出物内に存在するイヌＬ−ＰＢＥの量を決定する方法であって、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させる工程を含む、前記方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドの量を決定する方法であって：配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含む核酸分子と試料を、１以上の特異的ハイブリダイゼーション複合体形成のための条件下で接触させることを含む、前記方法も提供し、ここで該断片は、配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００２３】
本発明はまた、イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：試験剤で処置したイヌ由来の核酸を含有する試料を提供し；そして前記試料中の配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含むポリヌクレオチドの量を決定することを含む、前記方法も提供し、ここで未処置のイヌ由来のポリヌクレオチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリヌクレオチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる。
【００２４】
１つの態様において、決定はハイブリダイゼーションを介して達成される。ハイブリダイゼーションは、核酸分子と試料核酸分子を、核酸分子および試料核酸分子間でハイブリダイゼーション複合体を形成するのに有効な条件下で接触させ；そしてハイブリダイゼーション複合体の存在または非存在を検出することを含む方法によって達成されることも可能である。１つの側面において、配列番号１若しくはその断片、又は配列番号１の相補体は、固体支持体アレイまたは他の固体支持体上の複数の核酸とともに存在することも可能である。
【００２５】
本発明はさらに、試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの量を決定する方法であって：
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させる
ことを含む、前記方法を提供する。所望によって、Ｌ−ＰＢＥポリペプチドまたは抗体は、固体支持体に付着していることも可能である。
【００２６】
本発明はまた、イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：試験剤で処置したイヌ由来の試料を提供し；そして前記試料中の配列番号２を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープを含む該ポリペプチドの断片の量を決定することを含む、前記方法も提供し、ここで未処置のイヌ由来のポリペプチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリペプチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
配列表の簡単な説明
配列番号１――イヌＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２――イヌＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
配列番号３〜１０――クローニング用プライマーおよび配列決定用プライマー
配列番号１１ ヒトＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２ ヒトＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
配列番号１３ マウスＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１４ マウスＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
配列番号１５ ラットＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１６ ラットＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
【００２８】
発明の詳細な説明
一般的な定義
本明細書において、これ以降、「ポリヌクレオチド」は、一般的に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであることも可能な、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドいずれかを指す。「ポリヌクレオチド」には、限定なしに、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であることも可能なＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡ両方を含む三重鎖領域を指す。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通でない塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに多様な修飾を行うことも可能であり；したがって、「ポリヌクレオチド」は、天然に典型的に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的修飾型とともに、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型も含む。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される、比較的短いポリヌクレオチドも含む。
【００２９】
本明細書において、これ以降、「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質いずれかを指す。「ポリペプチド」は、一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般的にタンパク質と称される、より長い鎖両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含有することも可能である。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるか、または当該技術分野に周知の化学的修飾技術によるか、いずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。こうした修飾は、基本的な教科書、そしてより詳細なモノグラフ、さらに、膨大な研究文献によく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどこに存在することも可能である。同種の修飾が、既定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じ度合いで、または異なる度合いで存在することも可能であることが認識されるであろう。また、既定のポリペプチドが多くの種類の修飾を含有することも可能である。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝していることも可能であるし、そして分枝を伴い、または伴わずに、環状であることも可能である。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じることも可能であるし、または合成法によって作成されることも可能である。修飾または修飾型には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡが仲介するタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ―Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， 第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク， １９９３；Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−１２ページ， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ中， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒら， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎら， “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８４２を参照されたい）。
【００３０】
「合成」は、本明細書において、そして当該技術分野に理解されるように、酵素的方法と対照的に、純粋に化学的方法によって産生されるポリヌクレオチドを指す。したがって、「完全に」合成されたＤＮＡ配列は、完全に化学的手段によって産生され、そして「部分的に」合成されたＤＮＡは、生じるＤＮＡのある部分のみが化学的手段によって産生されたものを含む。
【００３１】
本明細書において、これ以降、「単離された」は、人の手によって天然状態から改変されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、その元来の環境から変化しているかまたは取り除かれているか、あるいはその両方である。例えば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、天然状態で共存する物質から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、該用語を本明細書で使用する際、「単離されて」いる。「単離された」は、本明細書において、そして当該技術分野に理解されるように、「単離」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドいずれを指すのであっても、該ポリペプチドまたは核酸が通常見られる元来の細胞環境から分離されたことを意味するように解釈される。したがって、本明細書において、一例として、本発明のポリヌクレオチドで構築したトランスジェニック動物または組換え細胞株は、「単離」核酸を利用する。
【００３２】
本明細書において、用語「イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド」は、イヌＬ−ＰＢＥ遺伝子がコードするタンパク質を意味し、保存的変化または非保存的変化を含有するアレル変異体を含む。１つのイヌＬ−ＰＢＥタンパク質配列を配列番号２として開示する。
【００３３】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを、組換え細胞または生物によって産生することも可能であるし、天然組織または細胞株から実質的に精製することも可能であるし、あるいは化学的または酵素的に合成することも可能である。したがって、用語「イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド」は、グリコシル化型、部分的グリコシル化型、または非グリコシル化型のタンパク質とともに、リン酸化型、部分的リン酸化型、非リン酸化型、硫酸化型、部分的硫酸化型、または非硫酸化型のタンパク質を含むことが意図される。該用語にはまた、アレル変異体、生物学的に活性であるタンパク質分解断片または他の断片を含む、ＰＳ２アミノ酸配列の他の機能的同等物、並びにイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの生理学的および病的タンパク質分解切断産物が含まれる。
【００３４】
本明細書において、用語「試験剤」は、同定可能な化学薬品または分子いずれかを意味し、これには、限定されるわけではないが、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が含まれる。こうした試験剤は、天然または合成であることも可能である。
【００３５】
本明細書において、用語「接触」は、直接または間接的いずれかで、化合物を本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと物理的に近接させて、合わせることを意味する。該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、いかなる数の緩衝剤、塩、溶液などの中に存在することも可能である。接触には、例えば、イオンチャネルポリペプチドもしくはその断片、またはイオンチャネルもしくはその断片をコードする核酸分子いずれかを含有する、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、または遺伝子チップ等のマイクロアレイに化合物を入れることが含まれる。
【００３６】
本発明の核酸
本発明は、本明細書において、イヌＬ−ＰＢＥと称されるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド（例えば、センス鎖および相補的アンチセンス鎖両方の、一本鎖および二本鎖両方のＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物、そのスプライス変異体を含む）を提供する。本発明のＤＮＡポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および全体または部分が化学的に合成されているＤＮＡが含まれる。
【００３７】
本発明のゲノムＤＮＡは、本発明のポリペプチドのタンパク質コード領域を含み、そしてまたそのアレル変異体を含むことも意図される。多くの遺伝子に関して、ゲノムＤＮＡがＲＮＡ転写物に転写され、これが１以上のスプライシング事象を経て、転写物のイントロン（すなわち非コード領域）が除去されるか、または「スプライシング−アウト」されることが広く理解されている。選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）機構によってスプライシングされることも可能であり、そしてしたがって異なるＲＮＡ配列の除去にさらされることも可能であるが、なおイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物は、当該技術分野において、スプライス変異体と称され、本発明に含まれる。したがって、本発明に含まれるスプライス変異体は、同一の元来のゲノムＤＮＡ配列にコードされるが、別個のｍＲＮＡ転写物から生じる。アレル変異体は、野生型遺伝子配列の修飾型であり、修飾は、染色体分離中の組換えから、または遺伝子突然変異を生じさせる条件への曝露から生じる。アレル変異体は、野生型遺伝子同様、天然存在配列である（ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作から生じる非天然存在変異体とは対照的である）。
【００３８】
本発明はまた、イヌＬ−ＰＢＥをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写を通じて得られるｃＤＮＡも含む（慣用的には、相補鎖の第二の鎖合成が続き、二本鎖ＤＮＡを提供する）。
【００３９】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を配列番号１に示す。当業者は、本発明のＤＮＡが二本鎖分子を含み、例えば、ＤＮＡのワトソン−クリック塩基対形成規則にしたがって配列番号１の配列から推定可能な配列を有する相補分子（「非コード鎖」または「相補体」）を伴う、配列番号１に示す配列を有する分子を含むことを容易に認識するであろう。本発明にやはり意図されるのは、普遍的遺伝暗号の周知の縮重のため、配列番号１のポリヌクレオチドと配列が異なる、配列番号２のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドである。
【００４０】
当該技術分野に周知であるように、遺伝暗号の縮重のため、前述の配列番号１のポリペプチドにコードされるのと同一のポリペプチドをコードすることが可能な、多くの他のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子がある。したがって、本発明は、発現に際して、配列番号２のポリペプチドをコードする、他のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意図する。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするアミノ酸残基配列が同定されたら、そして各特定のアミノ酸残基をコードするすべての３つ組コドンを知っていれば、こうしたコードＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列をすべて記載することが可能である。したがって、特定のアミノ酸に関して、単純にコドン中の変化によって特徴付けられる、本明細書に具体的に開示するもの以外のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子が、本発明の範囲内である。
【００４１】
アミノ酸およびそれを表す略語、記号およびコドンの表を、以下の表１に示す。
表１
【００４２】
【表１】
【００４３】
当該技術分野に周知であるように、コドンは、ｍＲＮＡおよびその対応するｃＤＮＡ分子において、ヌクレオチドの３つ組配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子に存在する場合、塩基ウラシル（Ｕ）によって特徴付けられるが、ＤＮＡに存在する場合、塩基チミジン（Ｔ）によって特徴付けられる。ポリヌクレオチド内の同一アミノ酸残基のコドンにおける単純な変化は、コードされるポリペプチドの配列または構造を変化させないであろう。句が、特定の３ヌクレオチド配列が特定のアミノ酸いずれかを「コードする」ことを述べる場合、一般の当業者は、上の表が問題の特定のヌクレオチドを同定する手段を提供するのを認識するであろうことが明らかである。例として、特定の３ヌクレオチド配列が、スレオニンをコードする場合、上の表は、ありうる３つ組配列がＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＣＣおよびＡＣＵ（ＤＮＡの場合ＡＣＴ）であることを開示する。
【００４４】
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥ ＤＮＡの種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）、好ましくは哺乳動物相同体をさらに含む。種相同体は、ときに「オルソログ」と称され、本発明の配列番号１と、少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を共有する。本発明のポリヌクレオチドに関する配列「相同性」パーセントは、本明細書において、配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、配列番号１に示すイヌＬ−ＰＢＥ配列のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチド塩基の割合として定義される。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２−４８９（１９８１））のアルゴリズムを用いる、Ｇａｐプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８、Ｕｎｉｘ用、遺伝学コンピュータグループ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などの、この目的に一般的に使用されるコンピュータプログラムいずれかを用いて、２つの配列を比較することによって、天然および変異体イヌＬ−ＰＢＥ配列間の配列の割合を決定することもまた可能である。
【００４５】
本発明に提供されるポリヌクレオチド配列情報は、当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される技術によって、コードされるポリペプチドの大規模発現を可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、サザン・ハイブリダイゼーションおよび／またはノーザン・ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む周知の技術によって、ヒト・アレル変異体および種相同体などの、関連するイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定および単離も可能にする。関連するポリヌクレオチドの例には、アレル変異体を含むヒトおよび非ヒトゲノム配列、並びに、イヌＬ−ＰＢＥに相同なポリペプチド、およびイヌＬ−ＰＢＥの１以上の生物学的、免疫学的、および／または物理的特性を共有する、構造的に関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。イヌＬ−ＰＢＥ ＤＮＡの配列を知ることで、サザン・ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のイヌＬ−ＰＢＥ発現調節制御配列をコードするゲノムＤＮＡ配列の同定もまた可能になる。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞がイヌＬ−ＰＢＥを発現する能力を検出するか、またはイヌＬ−ＰＢＥ発現レベルを測定する、ハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、単数または複数の疾患状態の根底にあるイヌＬ−ＰＢＥ遺伝子座における遺伝子改変（単数または複数）を同定するのに有用な診断法の基礎となることも可能であり、こうした情報は、診断にも、そして療法戦略の選択にも有用である。
【００４６】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチドの本明細書における開示は、一般の当業者が、全長ポリヌクレオチドのすべてのありうる断片を入手するのを容易に可能にする。したがって、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１２から２５６２（この間の１つ１つの整数値を含む）の連続ヌクレオチドを含む、イヌＬ−ＰＢＥコードポリヌクレオチドの断片を提供する。本発明のポリヌクレオチド（断片を含む）は、しばしば、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチド配列にユニークな配列を含み、そしてしたがって、非常にストリンジェントな条件下、または中程度にストリンジェントな条件下で、イヌＬ−ＰＢＥ（またはその断片）をコードするポリヌクレオチドにのみ（すなわち「特異的に」）ハイブリダイズするであろう。本発明のゲノム配列のポリヌクレオチド断片は、コード領域にユニークな配列だけでなく、イントロン、制御領域、および／または他の非翻訳配列に由来する全長配列の断片も含む。本発明のポリヌクレオチドにユニークな配列は、他の既知のポリヌクレオチドへの配列比較を通じて認識可能であり、そして当該技術分野で日常的に利用される並列プログラム、例えば公共の配列データベースで入手可能なものの使用を通じて同定可能である。こうした配列はまた、ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片の数を決定するサザン・ハイブリダイゼーション解析からも認識可能である。本発明のポリヌクレオチドは、放射能標識、蛍光標識、および酵素標識を含めて、その検出を可能にする方式で標識されることも可能である。
【００４７】
断片ポリヌクレオチドは、全長または他の断片イヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドの検出用のプローブとして特に有用である。１以上の断片ポリヌクレオチドは、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いられるか、またはイヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチド配列における変動を検出するのに用いられる、キットに含まれることも可能である。
【００４８】
本発明はまた、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするＤＮＡであって、配列番号１のポリヌクレオチドの非コード鎖または相補体に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下でハイブリダイズする、前記ＤＮＡもまた含む。
【００４９】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの概念は、以下の「本発明のアッセイ」を詳述する項で論じる。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
イヌＬ−ＰＢＥのクローニング
ＰＣＲのプライマーを設計するため、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州）を用いて、ヒト、ラットおよびマウスＬ−ＰＢＥの各遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を並列した。各遺伝子について３つのプライマーセットを選択した。その中で、２つのセットは、それぞれ、ヒトおよびラットのオルソログの開始配列領域および停止配列領域に対応し；残りのセットは、ヒト、ラットおよびマウスのオルソログ間の保存される配列領域にしたがって設計された。プライマーは、一般的に、長さ３０ヌクレオチドである。
【００５１】
ヒトＰＳＤデータベース（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｉｎｃ．）およびＮＣＢＩ ＥＳＴデータベース検索を通じて（相同ＥＳＴがクローニングされた組織を同定することによって）、選択したクローニング候補遺伝子の組織発現パターンを同定した。５つの組織、肝臓、腎臓、結腸、脾臓および肺が、選択した１２の遺伝子すべてを含むことが同定された。
【００５２】
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）を用いて、イヌ肝臓試料からＲＮＡを調製した。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するため、総体積１２．５μｌ中、０．５μｇのＲＮＡを５．７７μｌの３２．５μＭランダム六量体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）および２．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰと混合した。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、そして氷上で冷却した。２μｌのＲＮアーゼ不含水、５μｌの５ｘ第一鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）、０．５μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２．５μｌの４０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）および２．５μｌの２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を含有する１２．５μｌのマスター混合物を添加した。最終反応混合物を２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、そして７０℃で１５分間、連続してインキュベーションした。合成したｃＤＮＡを２０倍に希釈し（最終濃度ほぼ１ｎｇ／μｌ）、そしてＰＣＲ反応のテンプレートとして直接使用するために、−２０℃フリーザーで保存した。
【００５３】
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速増幅）反応から適応させた条件を用いた修飾ＰＣＲ反応を用いて、イヌ遺伝子または遺伝子断片をクローニングした。５０μｌのＰＣＲ反応について、５μｌの逆転写ｃＤＮＡ、５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）、５０ｘｄＮＴＰ混合物の１μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ、最終濃度各０．２ｍＭ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）、各２０μＭの１μｌの５’プライマーおよび３’プライマーであった。用いたプライマー配列は：
【００５４】
【化３】
【００５５】
であった。１μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｔａｑポリメラーゼ（５０ｘ）および３６μｌのＰＣＲ水（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を混合した。混合物を９４℃で１分間インキュベーションし、そして９４℃１５秒間そして次いで７２℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで７０℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで６８℃４分間が２５周期のタッチダウンＰＣＲプロトコルを実行した。ＰＣＲ反応の第一周期からクローニングされたのではない遺伝子に関しては、よりストリンジェントでないＰＣＲ条件は、９４℃１５秒間そして次いで６８℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで６５℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで６２℃４分間が２５周期である。製造者の使用説明書にしたがって、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上、ＤＮＡ７５００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州）を用いて、ＰＣＲ断片の長さおよび濃度を調べる。
【００５６】
ＤＮＡ調製および配列決定
蛍光に基づくＡＢＩ３７７配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＰＥ／ＡＢＤ、カリフォルニア州フォスターシティ）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｒｅａｄｙ Ｄｙｅ−Ｄｅｏｘｙ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒキットとＴａｑ ＦＳＴＭポリメラーゼを以下のプライマー：
【００５７】
【化４】
【００５８】
とともに用いて、ＰＣＲ産物を配列決定した。
各ＡＢＩ周期配列決定反応は、約０．５μｇのプラスミドＤＮＡを含有する。９８℃１分間の最初の変性、次いで５０周期の：９８℃３０秒間の変性、５０℃３０秒間のアニーリング、および６０℃４分間の伸長を用いて、周期配列決定を行う。温度周期および時間は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーによって調節される。ＣｅｎｔｒｉｆｌｅｘＴＭゲルろ過カートリッジ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、伸長産物を単離する。各反応産物をピペットによってカラム上に装填し、これを次いで１５００ｘｇ、室温で４分間、スウィンギングバケット遠心分離装置（ＳｏｒｖａｌｌモデルＲＴ６０００Ｂ卓上遠心分離装置）中で遠心分離する。カラムで精製した試料を、真空下で約４０分間乾燥させ、そして次いで、５μｌのＤＮＡ装填溶液（８３％脱イオン化ホルムアミド、８．３ｍＭ ＥＤＴＡ、および１．６ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン）に溶解する。次いで試料を９０℃に３分間加熱し、そしてＡＢＩ３７７配列決定装置による配列解析のため、ゲル試料ウェルに装填する。ＡＢＩ３７７ファイルをＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）プログラムにインポートすることによって、配列解析を行った。一般的に、７００ｂｐの配列読み取りが得られた。ＤＮＡ鎖両方から配列情報を得ることによって、そして配列決定のあいまいさがすべて取り除かれるまで、異なる位置のプライマーを用いて、困難な領域を再配列決定することによって、潜在的な配列エラーを最小限にした。配列番号１は、産物の配列に相当する。
【００５９】
ヒト遺伝子オルソログと配列決定データを並列し、そして配列追跡データにしたがって、手動で管理した（ｃｕｒａｔｅｄ）。第一周期の配列決定後、完全には終了していないクローニング遺伝子または遺伝子断片に関しては、全プロジェクトが完了するまで、管理配列データに基づいて、さらなる配列決定プライマーを注文した。イヌ・コード配列は、それぞれ、ヒト、ラットおよびマウス相同体に８６％、７５％および７６％同一であるタンパク質をコードする。イヌＤＮＡコード配列は、ヒト、ラットおよびマウス・コードＤＮＡ配列に、それぞれ、８８％、７８．４％、７８．８％同一である（比較は、ヒトｍＲＮＡに関してはＧｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００１９６６、マウスｍＲＮＡに関してはＢＣ０１６８９９、そしてラットｍＲＮＡに関してはＮＭ＿１３３６０６に、そしてヒトタンパク質に関してはＮＰ＿００１９５７、マウスタンパク質に関してはＡＡＨ１６８９９、そしてラットタンパク質に関してはＮＰ＿５９８２９０に基づいた）。新規発見イヌ配列と他の３つの相同体の並列を図１および２に示す。
【００６０】
配列番号１の配列を得るこの方法は例示であり、そして配列番号１を開示することによって、当業者には、配列番号１の全配列を得る多数の方法が提供されることを認識しなければならない。例えば、配列番号１に開示する配列からプローブを生成し、そしてイヌｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、そしてそれによって配列番号１全体またはそのゲノム同等物を得ることが可能であろう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）。やはり例として、当業者は、配列番号１に開示する配列が与えられれば、それに次いで、配列番号１に代表される全配列を得るためのＰＣＲ増幅に適したプライマーを生成可能であることを直ちに認識するであろう（例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ監修， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８９；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍ．Ａ． Ｉｎｎｉｓ， Ｄａｖｉｄ Ｈ． Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｊｏｈｎ Ｊ． Ｓｎｉｎｓｋｙ， およびＴｈｏｍａｓ Ｊ． Ｗｈｉｔｅ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨークを参照されたい）。
【００６１】
本発明の宿主細胞およびベクター
本発明のポリヌクレオチドを取り込んだプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターなどの自律複製組換え発現構築物もまた提供する。イヌＬ−ＰＢＥコードポリヌクレオチドが、内因性または外因性発現調節ＤＮＡ配列および転写ターミネーターに、機能可能であるように連結されている発現構築物もまた、提供する。発現調節ＤＮＡ配列には、プロモーター、エンハンサー、およびオペレーターが含まれ、そして一般的に、発現構築物を利用しようとする発現系に基づいて選択される。プロモーターおよびエンハンサー配列は、一般的に、遺伝子発現を増加させる能力に関して選択され、一方、オペレーター配列は、一般的に、遺伝子発現を制御する能力に関して選択される。本発明の発現構築物は、構築物を所持する宿主細胞の同定を可能にする１以上の選択可能マーカーをコードする配列も含むことも可能である。発現構築物はまた、宿主細胞における相同組換えを容易にし、そして好ましくは促進する配列も含むことも可能である。本発明の構築物はまた、宿主細胞における複製に必要な配列も含む。
【００６２】
発現構築物は、好ましくは、コードされるタンパク質の産生のために利用されるが、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチド配列を単純に増幅するために利用することもまた可能である。
【００６３】
本発明の別の側面にしたがって、コードされるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現を可能にする方式で、本発明のポリヌクレオチド（または本発明のベクター）を含む、原核細胞および真核細胞を含む、宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチドを、環状プラスミドの一部として、または単離タンパク質コード領域を含む直鎖ＤＮＡとして、あるいはウイルスベクターとして、宿主細胞に導入することも可能である。当該技術分野で周知であり、そして日常的に実施されている、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法には、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核注入、またはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞およびプロトプラストなどのキャリアーとの融合が含まれる。本発明の発現系には、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物、および哺乳動物細胞系が含まれる。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、およびより高次の真核細胞が含まれる。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現に用いられるのに適した原核宿主には、限定されるわけではないが、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌とともに、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍａｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーが含まれる。
【００６４】
本発明の単離核酸分子は、好ましくは、原核細胞での発現用に設計されたベクターよりも、真核細胞での発現用に設計されたベクターにクローニングされる。より高次の真核生物から得られる遺伝子の発現には、ときに真核細胞が好ましく、これはこれらのタンパク質の合成、プロセシング、および分泌のシグナルが、真核細胞では通常認識されるが、原核宿主では、しばしば、認識されないためである（Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １６−４９ページ， １９９２）。イヌＬ−ＰＢＥの場合、Ｎ−連結グリコシル化のための２つのコンセンサス配列があり、そしてプロテインキナーゼＣリン酸化およびＯ−グリコシル化のための、翻訳後修飾の他の部位が予測可能である。真核宿主には、限定されるわけではないが、以下の：昆虫細胞、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト２９３細胞、およびネズミ３Ｔ３線維芽細胞が含まれることも可能である。
【００６５】
原核宿主で使用する発現ベクターは、一般的に、１以上の表現型的選択可能マーカー遺伝子を含む。こうした遺伝子は、一般的に、例えば抗生物質耐性を与えるか、または栄養要求必要条件を供給するタンパク質をコードする。非常に多様なこうしたベクターが商業的供給源から容易に入手可能である。例には、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、メリーランド州ベセスダ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれる。
【００６６】
イヌＬ−ＰＢＥはまた、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、およびクルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含む属由来の酵母宿主細胞で発現されることも可能である。酵母宿主には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。酵母ベクターはしばしば、２ミクロン酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと称する）もまた、使用可能である。酵母ベクターの上述の特徴に加えて、シャトルベクターはまた、大腸菌における複製および選択のための配列も含むであろう。イヌＬ−ＰＢＥをコードするヌクレオチド配列の５’端に酵母因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことによって、酵母宿主で発現されるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの直接分泌を達成することも可能である。
【００６７】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現には、昆虫宿主細胞培養系もまた、使用可能である。別の態様において、バキュロウイルス発現系を用いて、本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを発現する。昆虫細胞において異種タンパク質を発現するためのバキュロウイルス系の使用に関するさらなる情報は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に概説されている。
【００６８】
別の態様において、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを哺乳動物宿主細胞で発現させる。適切な哺乳動物細胞株の限定されない例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒト２９３細胞が含まれる。
【００６９】
本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現に適した発現ベクターの選択は、もちろん、使用しようとする特定の宿主細胞に応じ、そして一般の当業者の技術の範囲内である。適切な発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用する発現ベクターには、ウイルスゲノム由来の転写調節配列および翻訳調節配列が含まれることも可能である。本発明で使用可能な、一般的に用いられるプロモーター配列および修飾因子配列には、限定されるわけではないが、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のものが含まれる。哺乳動物発現ベクターを構築する方法は、例えばＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０（１９８３））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５（１９８６））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４））；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；およびＷＯ ９１／１８９８２に開示される。
【００７０】
（実施例２）
真核宿主細胞におけるイヌＬ−ＰＢＥの発現
イヌＬ−ＰＢＥタンパク質を産生するため、適切な発現ベクターを用い、標準的遺伝子操作技術を用いて、適切な宿主細胞中で、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドを発現させる。例えば、実施例１に記載するイヌＬ−ＰＢＥコード配列を商業的発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にサブクローニングし、そしてトランスフェクション試薬ｆｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品挿入物に提供されるトランスフェクションプロトコルを用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションする。ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞を含む、他の真核細胞株もまた、適切である。１００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）の存在下での増殖によって、イヌＬ−ＰＢＥを安定に発現している細胞を選択する。所望により、標準的クロマトグラフィー技術を用いて、細胞からイヌＬ−ＰＢＥを単離する。精製を容易にするため、イヌＬ−ＰＢＥアミノ酸配列の部分に対応する１以上の合成ペプチド配列に対して抗血清を作成することも可能であり、そしてこの抗血清を用いて、イヌＬ−ＰＢＥをアフィニティー精製する。イヌＬ−ＰＢＥをタグ配列（例えばポリヒスチジン、赤血球凝集素、ＦＬＡＧ）とインフレームで発現させて、精製を容易にすることもまた可能である。
【００７１】
本発明の宿主細胞は、イヌＬ−ＰＢＥと特異的に免疫反応性である抗体の発展のための、免疫原の価値ある供給源である。本発明の宿主細胞はまた、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの大規模産生の方法においても有用であり、ここで細胞を適切な培地中で増殖させ、そして当該技術分野に知られる精製法、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除ろ過、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ等を含む慣用的クロマトグラフィー法によって、細胞から、または細胞を増殖させた培地から、望ましいポリペプチド産物を単離する。さらに他の精製法には、特異的結合パートナーまたは剤に認識される特異的タグ、標識、またはキレート部分を有する融合タンパク質として、望ましいタンパク質を発現し、そして単離するものが含まれる。単離されたタンパク質を切断して、望ましいタンパク質を得ることも可能であるし、または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）融合タンパク質としてそのままにしておくことも可能である。融合構成要素の切断は、切断プロセスの結果として、さらなるアミノ酸残基を有する望ましいタンパク質の型を生じることも可能である。
【００７２】
イヌＬ−ＰＢＥ ＤＮＡ配列を知ることで、内因性イヌＬ−ＰＢＥの発現を可能にするか、または増加させるように、細胞を修飾することが可能になる。天然存在イヌＬ−ＰＢＥプロモーターと異種プロモーターのすべてまたは一部を交換して、細胞がより高いレベルでイヌＬ−ＰＢＥを発現するようにすることによって、細胞を修飾して（例えば相同組換えによって）、発現増加を提供することも可能である。内因性イヌＬ−ＰＢＥコード配列に機能可能であるように連結される方式で、異種プロモーターを挿入する［例えばＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９４／１２６５０号、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９２／２０８０８号、およびＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９１／０９９５５号を参照されたい］。異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えばａｄａ、ｄｈｆｒ、並びにカルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼをコードする多機能ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡを、異種プロモーターＤＮＡとともに挿入可能であることもまた、意図される。イヌＬ−ＰＢＥコード配列に連結した場合、標準的選択法によってマーカーＤＮＡを増幅すると、細胞において、イヌＬ−ＰＢＥコード配列が同時に増幅される。
【００７３】
本発明に提供するＤＮＡ配列情報はまた、例えば相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２（１９８９）］を通じて、機能するイヌＬ−ＰＢＥを発現不能な動物またはイヌＬ−ＰＢＥの変異体を発現する動物の発展も可能にする。こうした動物（特にラット、ウサギ、およびマウスなどの実験小動物）は、イヌＬ−ＰＢＥのｉｎ ｖｉｖｏ活性およびイヌＬ−ＰＢＥの調節因子を研究するモデルとして有用である。
【００７４】
本発明によりやはり利用可能になるのは、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドを認識し、そして該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチドである。全長および断片のアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。本発明の断片アンチセンス分子には、（ｉ）イヌＬ−ＰＢＥを特異的に認識し、そしてこれにハイブリダイズするもの（イヌＬ−ＰＢＥをコードするＤＮＡと他の既知の分子をコードするＤＮＡの配列比較によって決定されるようなもの）が含まれる。イヌＬ−ＰＢＥがコードするポリヌクレオチドにユニークな配列の同定は、公的に利用可能な配列データベースいずれかの使用を通じて、そして／または商業的に入手可能な配列比較プログラムの使用を通じて、推定可能である。全ゲノムにおける選択された配列のユニークさは、ハイブリダイゼーション解析によってさらに検証可能である。望ましい配列を同定した後、制限消化を通じて単離するか、または当該技術分野に周知の多様なポリメラーゼ連鎖反応技術いずれかを用いて増幅することも可能である。アンチセンスポリヌクレオチドは、イヌＬ−ＰＢＥ ｍＲＮＡを発現する細胞によるイヌＬ−ＰＢＥの発現を制御するのに特に適している。
【００７５】
イヌＬ−ＰＢＥ発現調節配列またはイヌＬ−ＰＢＥ ＲＮＡに特異的に結合可能なアンチセンス核酸（好ましくは１０〜２０塩基対オリゴヌクレオチド）を（例えばウイルスベクター、またはリポソームなどのコロイド性分散系によって）細胞に導入する。アンチセンス核酸は、細胞において、イヌＬ−ＰＢＥ標的ヌクレオチド配列に結合し、そして標的配列の転写または翻訳を妨げる。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート・アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による療法的使用に明確に意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、５’端で、ポリ−Ｌ−リジン、トランスフェリン、ポリリジン、またはコレステロール部分によってさらに修飾することも可能である。転写レベルまたは翻訳レベルいずれかでのイヌＬ−ＰＢＥ発現の抑制は、異常なイヌＬ−ＰＢＥ発現に特徴付けられる疾患の細胞モデルまたは動物モデルを生成するために、あるいは療法様式として、有用である。
【００７６】
本明細書に解説されるイヌＬ−ＰＢＥ配列は、天然細胞および動物、並びにイヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされた細胞における、イヌＬ−ＰＢＥ発現を調節する新規転写因子の設計を容易にする。例えば、ジンクフィンガードメインを介してＤＮＡに結合する、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質は、異なる標的配列の認識につながる構造変化を受けやすいことが示されてきている。これらの人工的ジンクフィンガータンパク質は、高い親和性定数および低い解離定数の特異的標的部位を認識し、そして遺伝子発現を調節する遺伝子スイッチとして作用することが可能である。本発明の特定のイヌＬ−ＰＢＥ標的配列を知ることで、構造に基づくモデリングおよびファージディスプレーライブラリーのスクリーニングの組み合わせなどの、既知の方法を用いて、標的配列に特異的なジンクフィンガータンパク質の操作が容易になる［Ｓｅｇａｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２７５８−２７６３；Ｌｉｕら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：５５２５−３０；ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７−６１；Ｃｈｏｏら（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：５２５−３２］。各ジンクフィンガードメインは、通常、３以上の塩基対を認識する。一般的に、１８塩基対の認識配列は、既知のゲノムいずれにおいても、該配列をユニークにするのに十分な長さであるため、ジンクフィンガーの６つのタンデムリピートからなるジンクフィンガータンパク質は、特定の配列に対する特異性を確実にすると予期されるであろう［Ｓｅｇａｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２７５８−２７６３］。イヌＬ−ＰＢＥ配列に基づいて設計した、人工的なジンクフィンガーリピートを、活性化ドメインまたは抑制ドメインに融合させて、イヌＬ−ＰＢＥ発現を促進するかまたは抑制する［Ｌｉｕら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：５５２５−３０］。あるいは、ジンクフィンガーペプチドおよびＴＡＴＡボックス結合因子（ＴＢＰ）間のリンカー領域の長さを多様にしながら、ジンクフィンガードメインをＴＢＰに融合させて、転写活性化因子またはリプレッサーいずれかを生成することも可能である［Ｋｉｍら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：３６１６−３６２０］。こうしたタンパク質、および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、天然細胞、動物およびヒト；および／またはイヌＬ−ＰＢＥコード配列でトランスフェクションされた細胞両方のｉｎ ｖｉｖｏでのイヌＬ−ＰＢＥ発現を調節するのに有用性を有する。転写因子を発現する構築物をトランスフェクションすること（遺伝子療法）によって、または該タンパク質を導入することによって、新規転写因子を標的細胞に搬送することも可能である。ＲＮＡ配列に結合するように、操作ジンクフィンガータンパク質を設計して、アンチセンスまたは触媒ＲＮＡ法の代替法として療法において使用することもまた可能である［ＭｃＣｏｌｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９５２１−６；Ｗｕら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：３４４−３４８］。本発明は、（天然の、または形質転換された）細胞において、イヌＬ−ＰＢＥ発現を調節するのに有用な、本発明の遺伝子配列に基づく転写因子とともに、カスタマイズしたジンクフィンガータンパク質などの設計法を意図し、細胞の遺伝的相補体にはこれらの配列が含まれる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドにコードされる単離イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドも提供する。
【００７７】
本発明のポリペプチド
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に例示されるような本発明のアミノ酸配列は、いくつかの興味深い特徴を有する。
【００７８】
本発明はまた、配列番号２に示すポリペプチドに、少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または相同性を有するポリペプチドも含む。配列番号２のポリペプチドに関するアミノ酸配列「同一性」パーセントは、本明細書において、両配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、イヌＬ−ＰＢＥ配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。配列番号２のポリペプチドに関するアミノ酸配列「相同性」パーセントは、本明細書において、配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、そしてまたいかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なして、イヌＬ−ＰＢＥ配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。１つの側面において、相同性パーセントは、長さ１００アミノ酸中、４つのギャップを導入して並列を最大にすることが可能である際には、２つの配列のうち、より小さい配列の、比較しようとする配列中の同一アミノ酸残基と並列する、アミノ酸残基の割合として計算される［本明細書に援用されるＤａｙｈｏｆｆ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中， Ｖｏｌ．５ ｐ．１２４， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ワシントンＤ．Ｃ．（１９７２）］。
【００７９】
本発明のポリペプチドは、天然細胞供給源から単離されることも可能であるし、または化学的に合成されることも可能であるが、好ましくは、本発明の宿主細胞を伴う組換え法によって産生される。哺乳動物宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を与えるために必要である可能性があるような、こうした翻訳後修飾（例えばグリコシル化、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、脂質化、およびリン酸化）が提供されると予期される。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのグリコシル化型および非グリコシル化型が含まれる。
【００８０】
上述のような真核宿主および原核宿主における過剰発現は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの単離を容易にする。したがって、本発明には、配列番号２に示すような単離イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド、並びに変異体、および保存的アミノ酸置換が含まれ、標識化ポリペプチドおよびタグ化ポリペプチドが含まれる。本発明には、「標識された」イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドが含まれる。用語「標識された」は、本明細書において、酵素（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ルシフェラーゼ）、および放射標識（例えば１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、および３５Ｓ）を含む適切な検出可能基いずれかを、標識しようとする化合物にコンジュゲート化するか、または共有結合することを指す。タンパク質、ペプチド、および抗体を含む、多様な化合物を標識する技術が周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ｂ， １０３（１９７４）；Ｓｙｖａｎｅｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４， ３７６２（１９７３）；ＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３， ５２９（１９７３）を参照されたい。用語、標識された、はまた、以下に論じるように、アミノ酸タグに共有結合したポリペプチドも含むことも可能である。
【００８１】
さらに、本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを、間接的に標識することも可能である。これは、部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）をポリペプチドに共有的に付加し、そしてそれに続いて、付加された部分への特異的結合を示す標識または標識化合物に、付加された部分をカップリングすることを伴う。間接的な標識の可能性には、ペプチドをビオチン化し、それに続いて、上記標識基の１つにカップリングしたアビジンに結合させることが含まれる。別の例は、ポリヒスチジン・タグを含むイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドと、ヒスチジン・タグに特異的な放射標識抗体をインキュベーションすることであろう。抗体がタグにかなりの親和性を有するため、ポリペプチドに対する放射能抗体の結合が、正味の効果である。
【００８２】
本発明はまた、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質の変異体（または類似体）も含む。１つの例において、１以上のアミノ酸残基がイヌＬ−ＰＢＥアミノ酸配列に付加されている、挿入変異体を提供する。挿入は、タンパク質のいずれかの末端または両方の末端に位置することも可能であるし、あるいはイヌＬ−ＰＢＥタンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置することも可能である。いずれかの末端または両方の末端にさらなる残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれることも可能である。挿入変異体には、イヌＬ−ＰＢＥ酸配列、またはその生物学的活性断片に、１以上のアミノ酸残基が付加されているイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドが含まれる。
【００８３】
したがって、挿入変異体はまた、イヌＬ−ＰＢＥのアミノ末端および／またはカルボキシ末端が別のポリペプチドに融合している融合タンパク質を含むことも可能である。多様なタグ・ポリペプチドおよびその対応する抗体が当該技術分野に周知である。例には、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグ・ポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ、並びに該タグに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６（１９８５）］；並びに単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が含まれる。他のタグ・ポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４（１９９２）］；アルファ−チューブリン・エピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７（１９９０）］が含まれる。さらに、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素タンパク質でタグ化することも可能である。
【００８４】
別の側面において、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド中の１以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの一方の末端または両方の末端で、あるいはイヌＬ−ＰＢＥアミノ酸配列内の１以上の残基の除去を伴って、達成されることも可能である。したがって、欠失変異体には、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのすべての断片が含まれる。
【００８５】
本発明はまた、断片が生物学的活性（例えばリガンド結合活性またはＤＮＡ結合活性および／または他の生物学的活性）を維持する、配列番号２に示す配列のポリペプチド断片も示す。配列番号２の少なくとも１０から８５３（この間の１つ１つの整数値を含む）の連続アミノ酸を含む断片が本発明に含まれる。当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される方法いずれかによって、望ましい生物学的特性を有する本発明の断片を調製することも可能である。
【００８６】
本発明にはまた、残基が別の類似の特性を持つ別の残基で置換される、保存的アミノ酸置換によって、参照配列とは異なる、前述のポリペプチドの変異体も含まれる。変異体ポリペプチドには、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって導入されているものが含まれる。アミノ酸は、物理的特性、並びに二次および三次タンパク質構造への寄与にしたがって、分類可能である。保存的置換は、当該技術分野において、１つのアミノ酸に対して、類似の特性を有する別のアミノ酸配列を置換するものと認識される。典型的な保存的置換を、すぐ下の表２に示す（ＷＯ ９７／０９４３３、１０ページ、１９９７年３月１３日公表（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７、９／６／９６出願）から）。
【００８７】
表２
保存的置換Ｉ
【００８８】
【表２】
【００８９】
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表３に示すように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５）， ｐｐ．７１−７７］に記載されるように分類可能である。
【００９０】
表３
保存的置換ＩＩ
【００９１】
【表３】
【００９２】
さらに別の代替物として、典型的な保存的置換をすぐ下の表４に示す。
表４
保存的置換ＩＩＩ
【００９３】
【表４】
【００９４】
一般的に、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドは、主に細胞内に見られることが予期され、細胞内物質は、当業者に知られる標準的技術いずれかを用いて、宿主細胞から抽出可能である。例えば、宿主細胞を溶解して、ホモジナイズ、および／または超音波処理、その後の遠心分離によって、細胞質の内容物を遊離させることも可能である。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離後、主に上清に見られ、そして以下の方法のいずれかによる限定されない例によって、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを単離することも可能である。
【００９５】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを部分的にまたは完全に単離することが好ましい状況において、当業者に周知の標準法を用いて、精製を達成することも可能である。こうした方法には、限定されるわけではないが、電気泳動による分離、その後、電気溶出、多様な種類のクロマトグラフィー（免疫アフィニティー、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高圧液体クロマトグラフィーが含まれる。いくつかの場合、完全に精製するため、これらの方法の１より多くを用いることが好ましい可能性もある。
【００９６】
多様な技術を用いて、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの精製を達成することも可能である。ポリペプチドが、そのカルボキシル末端またはアミノ末端いずれかに、ヘキサヒスチジン（イヌＬ−ＰＢＥ／ヘキサＨｉｓ）、またはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）などの他の小ペプチドなどのタグを含有するように合成されている場合、カラムマトリックスがタグに高い親和性を有するか、またはポリペプチドに直接、高い親和性を有する（すなわち、イヌＬ−ＰＢＥを特異的に認識するモノクローナル抗体）アフィニティーカラムに、溶液を通過させることによって、１工程プロセスで本質的に精製可能である。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性でニッケルに結合し、したがってニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ＴＭニッケルカラムなど）をイヌＬ−ＰＢＥ／ポリＨｉｓの精製に用いることも可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， セクション１０．１１．８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク［１９９３］を参照されたい）。
【００９７】
精製を容易にする標識またはタグなしに、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを調製する場合であっても、本発明のイヌＬ−ＰＢＥを免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製することも可能である。これを達成するためには、当該技術分野に周知の手段によって、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を調製しなければならない。本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたはエピトープを所持する断片、類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）または細胞を、動物、好ましくは非ヒトに、日常的プロトコルを用いて投与することによって、本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに対して生成された抗体を得ることも可能である。モノクローナル抗体を調製するには、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する、当該技術分野に知られる技術いずれを使用することも可能である。例には、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら， ７７−９６ページ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ中， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．（１９８５）のものなどの多様な技術が含まれる。
【００９８】
付着するタグなしにイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを調製する場合、そして抗体がまったく入手可能でない場合、他の周知の精製法が使用可能である。こうした方法には、限定なしに、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。いくつかの場合、２以上のこれらの技術を組み合わせて、純度増加を達成することも可能である。代表的な精製スキームを以下に詳述する。
【００９９】
天然イヌＬ−ＰＢＥの阻害特性を示し、そしてより高いレベルで発現される変異体、および恒常的に活性であるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを提供する変異体は、本発明のアッセイにおいて特に有用であり、そしてまた、異常なイヌＬ−ＰＢＥ発現活性によって特徴付けられる疾患の細胞モデルまたは動物モデルにおいても有用である。
【０１００】
本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を所持するポリペプチドを含むことが意図されることを理解しなければならない。例えば、修飾は、共有性であることも可能であるし、そして例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、および無機部分との化学結合が含まれる。
【０１０１】
本発明にやはり含まれるのは、イヌＬ−ＰＢＥまたはその断片に特異的な抗体（例えばモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体）である。本発明の抗体には、本明細書に完全に援用される、ＷＯ９３／１１２３６、１９９３年６月２０日公表に記載される方法にしたがって産生され、そして同定されたヒト抗体が含まれる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む抗体断片もまた本発明に提供される。用語「特異的」は、本発明の抗体を記載するのに使用する場合、本発明の抗体の可変領域が、もっぱらイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを認識し、そしてこれに結合する（すなわち、イヌＬ−ＰＢＥおよび他の既知のポリペプチド間に局所配列同一性、相同性、または類似性が存在しうるにもかかわらず、結合親和性が測定可能に異なるため、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをこうした他のポリペプチドから区別可能である）ことを示す。特異的抗体がまた、抗体の可変領域外の配列、そして特に分子の定常領域との相互作用を通じて、他のタンパク質（例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ、またはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用可能であることが理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイが当該技術分野において周知であり、そして日常的に実施される。こうしたアッセイの包括的議論に関しては、Ｈａｒｌｏｗら（監修）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）， 第６章を参照されたい。本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの断片を認識し、そしてこれに結合する抗体もまた含まれるが、該抗体が、何よりもまず、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的であることが条件である。当該技術分野において周知であり、そして日常的に実施される方法いずれかを用いて、本発明の抗体を産生することも可能である。当該技術分野に知られる方法いずれかによって、非ヒト抗体をヒト化することも可能である。１つの方法では、非ヒトＣＤＲをヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入する。次いで、抗体フレームワークにさらなる変化を導入して、アフィニティーまたは免疫原性を調節することも可能である。
【０１０２】
本発明の抗体は、イヌＬ−ＰＢＥを検出するかまたは定量化する診断目的に有用であるとともに、イヌＬ−ＰＢＥを精製するのにも有用である。本明細書に記載する目的いずれかのための、本発明の抗体を含むキットもまた、含まれる。一般的に、本発明のキットにはまた、抗体が免疫特異的である対照抗原も含まれる。
【０１０３】
（実施例３）
イヌＬ−ＰＢＥに対する抗体の生成
標準的技術を使用して、イヌＬ−ＰＢＥ酵素に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成し、そして「ヒト化」変異体を含む、その有用な抗原結合断片または変異体を生成する。こうしたプロトコルは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗら（監修）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；および以下に引用する他の文書に見出すことも可能である。１つの態様において、組換えイヌＬ−ＰＢＥポリペプチド（またはこうしたポリペプチドを含有する細胞もしくは細胞膜）を抗原として用いて、抗体を生成する。別の態様において、イヌＬ−ＰＢＥの免疫原部分に対応するアミノ酸配列（例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多いアミノ酸）を有する１以上のペプチドを抗原として用いる。小さい合成ペプチドを用いて、タンパク質エピトープを模倣するため、親水性、表面配向性で、そして柔軟である配列を選択することが重要である。これは、生理学的溶液中に見られる天然存在タンパク質の大部分は、表面に親水性残基を有し、そして疎水性残基は包埋されているためである。抗体は、一般的に、天然存在タンパク質の表面上のエピトープに結合する。いくつかの既知のエピトープは、高い度合いの移動度を有する。タンパク質のＮ末端およびＣ末端は、荷電基、すなわちＮＨ３＋およびＣＯＯ−を含有するため、一般的に表面配向性である。これらは、末端に位置するため、しばしば、高い度合いの移動度も有する。これらの末端は、３つの特性すべてを所持するため、しばしば、合成候補として選択される。イヌＬ−ＰＢＥの表面残基に対応するペプチド、特に親水性部分が意図される。やはり意図されるのは、イヌＬ−ＰＢＥのアミノ末端およびカルボキシ末端に位置するペプチドである。
【０１０４】
当業者は、既定のタンパク質配列内の各アミノ酸残基に、親水性、表面アクセス可能性、および柔軟性の値を割り当てるために、アルゴリズムが開発されていることを認識する。各残基に抗原性指数を割り当てて、特定の配列内の残基がどの程度抗原性であるか、指標を与えるため、やはりアルゴリズムが開発されている。ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８３ ２０（４）：ｐ．４８３−９， ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８１， ７８（６）ｐ．３８２４−８。しかし、天然抗原に結合するのに有用な抗ペプチド抗体を生成するには、親水性セグメントが広く選択されてきている。しかし抗体とは異なり、Ｔ細胞受容体は、切断およびアンフォールディング後のタンパク質抗原の比較的小さいセグメントを認識する。Ｔ細胞抗原性部位もまた、予測コンピュータモデルによって対処されてきている。Ｍａｒｇａｌｉｔ， Ｈ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８７ １３８（７）：２２１３−２９ページ。
【０１０５】
エピトープの予測に有用なコンピュータプログラムが商業的に入手可能である。例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、英国オックスフォード）およびＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）（ＤＮＡＳｔａｒ Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ５３７１５）。ペプチド抗原を選択し、そして合成したら、抗原をアジュバントと混合するか、またはハプテンに連結して、抗体産生を増加することも可能である。
【０１０６】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
１つの典型的なプロトコルとして、モノクローナル抗体を生成するため、組換えイヌＬ−ＰＢＥまたはその合成断片を用いて、マウスを免疫する（またはポリクローナル抗体の場合は、ウサギなどのより大きい哺乳動物）。抗原性を増加させるため、製造者の推奨にしたがって、ペプチドをキーホール・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｙｍｐｅｔ）ヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）にコンジュゲート化する。最初の注射では、抗原をフロイントの完全アジュバントで乳化し、そして皮下注射する。２〜３週間間隔で、イヌＬ−ＰＢＥ抗原のさらなるアリコットをフロイントの不完全アジュバントで乳化し、そして皮下注射する。最後の追加免疫注射前に、免疫したマウスから血清試料を採取し、そしてウェスタンブロットによってアッセイして、イヌＬ−ＰＢＥと免疫反応する抗体の存在を確認する。免疫した動物由来の血清をポリクローナル抗血清として用いるか、またはイヌＬ−ＰＢＥを認識するポリクローナル抗体を単離するのに用いる。あるいは、モノクローナル抗体を生成するため、マウスを屠殺して、そして脾臓を取り除く。
【０１０７】
モノクローナル抗体を生成するため、脾臓を１０ｍｌ血清不含ＲＰＭＩ１６４０に入れ、そして２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ、カナダ）を補った血清不含ＲＰＭＩ１６４０中で脾臓をすりつぶすことによって、単細胞懸濁物を形成する。細胞懸濁物をろ過し、そして遠心分離によって洗浄し、そして血清不含ＲＰＭＩに再懸濁する。３匹の未処置（ｎａｉｖｅ）Ｂａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を同様の方式で調製し、そしてフィーダー層として使用する。融合前に３日間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ユタ州ローガン）を補ったＲＰＭＩ中、対数期に維持した、ＮＳ−１骨髄腫細胞もまた、遠心分離し、そして洗浄する。
【０１０８】
ハイブリドーマ融合体を産生するため、免疫したマウス由来の脾臓細胞をＮＳ−１細胞と合わせて、そして遠心分離し、そして上清を吸引する。試験管を軽く叩くことによって、細胞ペレットを外し、そして２ｍｌの３７℃ ＰＥＧ１５００（７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０中５０％）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を攪拌しながらペレットに入れ、その後、血清不含ＲＰＭＩを添加する。その後、細胞を遠心分離し、そして１５％ＦＢＳ、１００μＭヒポキサンチンナトリウム、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌ ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５ｘ１０６胸腺細胞／ｍｌを含有するＲＰＭＩに再懸濁し、そして１０のＣｏｒｎｉｎｇ平底９６ウェル組織培養プレートに蒔く（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）。
【０１０９】
融合後、第２日、第４日および第６日、１００μｌの培地を融合プレートのウェルから取り除き、そして新鮮な培地と交換する。第８日、イヌＬ−ＰＢＥに結合するマウスＩｇＧの存在に関して試験するＥＬＩＳＡによって融合体をスクリーニングする。抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体を産生するモノクローナル培養物が得られるまで、希釈によって、選択された融合体ウェルをさらにクローニングする。
【０１１０】
ファージディスプレー由来のイヌＬ−ＰＢＥに向けられる抗体
すべて本明細書に援用される、Ａｕｊａｍｅら， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ８（４）：１５５−１６８（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， ＴＩＢＴＥＣＨ， １５：６２−７０（１９９７）；およびＲａｄｅｒら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：５０３−５０８（１９９７）に記載されるものなどのファージディスプレー技術によって、イヌＬ−ＰＢＥ抗体を生成する。例えば、Ｆａｂ断片の形の、または連結された一本鎖Ｆｖ断片の形の抗体可変領域を、繊維状ファージの小コートタンパク質ｐＩＩＩのアミノ末端に融合させる。融合タンパク質の発現および成熟ファージコートへのその取り込みによって、表面上に抗体を提示し、そして抗体をコードする遺伝物質を含有する、ファージ粒子が生じる。こうした構築物を含むファージライブラリーを細菌中で発現させ、そして抗原−プローブとして、標識イヌＬ−ＰＢＥまたは固定イヌＬ−ＰＢＥを用いて、イヌＬ−ＰＢＥに特異的なファージ抗体をパニング（スクリーニング）する。
【０１１１】
トランスジェニックマウス由来のイヌＬ−ＰＢＥに向けられる抗体
ＢｒｕｇｇｅｍａｎｎおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １７（８）：３９１−９７（１９９６）、並びにＢｒｕｇｇｅｍａｎｎおよびＴａｕｓｓｉｇ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：４５５−５８（１９９７）に本質的に記載されるように、トランスジェニックマウスにおいて、イヌＬ−ＰＢＥ抗体を生成する。生殖系列配置中、ヒトＶ遺伝子セグメントを所持し、そしてそのリンパ組織でこれらの導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを、慣用的免疫プロトコルを用いて、イヌＬ−ＰＢＥ組成物で免疫する。慣用的プロトコルを用い、免疫したマウス由来のＢ細胞を用いてハイブリドーマを生成し、そしてスクリーニングして、抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体を分泌するハイブリドーマを同定する（例えば上述のとおり）。
【０１１２】
本発明のアッセイ
本発明は、イヌにおいて、試験剤の影響を検出するかまたは診断する方法を提供する。既定の時間経過に渡って、好ましくは亜慢性用量（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ ｄｏｓｅ）の、１以上の既知のまたは推定上の毒性化合物で、イヌを処置する。次いで、Ｌ−ＰＢＥを発現する組織試料を得る。こうした処置した生物学的試料から得たイヌＬ−ＰＢＥ遺伝子発現のレベルを、未処置の生物学的試料から得た遺伝子発現パターンと比較して、化合物に反応して、イヌＬ−ＰＢＥを上方制御するかまたは下方制御する化合物を同定することも可能である。試料は、試料核酸分子またはタンパク質を含み、そしてＬ−ＰＢＥを発現する体性組織いずれか（脳、腎臓、肝臓など）、培養細胞、生検、または他の組織調製物から得た、いかなる試料であることも可能である。
【０１１３】
発現レベルを、産生されるメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質のレベルいずれかまたは両方で評価することも可能である。
【０１１４】
核酸に基づくアッセイ
イヌＬ−ＰＢＥを生じる核酸は、溶液中または固体支持体上にあることも可能である。いくつかの態様において、これらをマイクロアレイ中の単独のアレイ要素として、または他のアレイ要素分子と組み合わせたアレイ要素として、使用することも可能である。こうしたマイクロアレイは、毒性であることが知られるかまたは推定される試験剤と関連して、ハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現パターンを検出し、そして性質決定するのに特に有用である。しかし、アレイは、膜に基づくハイブリダイゼーション系、または溶液ハイブリダイゼーションアッセイであっても、または実際、特異的ハイブリダイゼーションを決定可能な方法いずれによっても置き換えることも可能であることが認識される。次いで、こうした遺伝子発現パターンを比較のために用いて、やはり毒性学的反応を誘発する他の化合物を同定することも可能である。
【０１１５】
核酸に基づく方法は、一般的に、試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの単離、およびそれに続く、配列番号１由来の特異的プライマーを用いたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅を必要とする。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当業者に周知のいくつかの方法いずれにしたがって、試料から単離することも可能である。例えば、核酸精製法が、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， パートＩ． Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク州ニューヨークに記載される。１つの好ましい態様において、ＴＲＩＺＯＬ総ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて総ＲＮＡを単離し、そしてオリゴｄ（Ｔ）カラムクロマトグラフィーまたはガラスビーズを用いて、ｍＲＮＡを単離する。試料核酸分子を増幅する場合、試料核酸分子を増幅し、そして低存在量転写物を含めて、元来の試料の相対存在量を維持することが望ましい。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで増幅することも可能である（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ米国特許第５，５１４，５４５号を参照されたい）。
【０１１６】
増幅法および標識法が、試料中の核酸分子の真の分布を変化させなかったことを確実にするため、試料内に対照を含むこともまた、好適である。この目的のため、相補アレイ化核酸分子へのハイブリダイゼーションに際して検出可能であることがあらかじめ決定された、ある量の対照核酸分子が試料に混入され（ｓｐｉｋｅｄ）、そして核酸分子の組成物には、対照アレイ化核酸分子と特異的にハイブリダイズする参照核酸分子が含まれる。ハイブリダイゼーションおよびプロセシング後、得られるハイブリダイゼーションシグナルは、試料に添加された対照アレイ化核酸分子の量を正確に反映しなければならない。
【０１１７】
ハイブリダイゼーション前に、試料核酸分子を断片にすることが望ましい可能性もある。断片化は、二次構造、および試料中の他の試料核酸分子または非相補的核酸分子への交差ハイブリダイゼーションを最小限にすることによって、ハイブリダイゼーションを改善する。断片化は、機械的手段または化学的手段によって実行可能である。
【０１１８】
標識
試料核酸分子を１以上の標識部分で標識して、ハイブリダイズしたアレイ化／試料核酸分子複合体の検出を可能にすることも可能である。標識部分は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、生体電子工学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、視覚的手段または化学的手段によって検出することも可能な組成物を含むことも可能である。標識部分には、（３２）Ｐ、（３３）Ｐまたは（３５）Ｓなどの放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素などの分光マーカー、磁気標識、連結酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子伝達供与体および受容体等が含まれる。好ましい蛍光マーカーには、Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション
配列番号１およびその断片の核酸分子配列を、多様な目的のため、多様なハイブリダイゼーション技術で用いることも可能である。配列番号１から、ハイブリダイゼーションプローブを設計するか、または得ることも可能である。こうしたプローブを、非常に特異的な領域から、または保存されたモチーフから作成し、そしてＬ−ＰＢＥメッセージ、アレル変異体、または関連配列を定量化するプロトコルで用いることも可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることも可能であり、そして配列番号１の配列から、または哺乳動物遺伝子のプロモーター、エンハンサー、およびイントロンを含むゲノム配列から得ることも可能である。標識ヌクレオチドの存在下、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、またはＰＣＲ増幅を用いて、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを産生することも可能である。核酸配列を含有するベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識核酸分子を添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡプローブを産生することも可能である。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって提供されるものなどの商業的に入手可能なキットを用いて、これらの方法を行うことも可能である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブのＧ＋Ｃ含量、塩濃度、および温度によって、決定される。特に、塩濃度を減少させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって、ストリンジェンシーを増加させることも可能である。膜に基づく、いくつかのハイブリダイゼーションに用いる溶液においては、ホルムアミドなどの有機溶媒を添加すると、反応がより低い温度で起こることが可能になる。１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５ｘＳＳＣ、６０℃などの緩衝液を用いて、低ストリンジェンシーでハイブリダイゼーションを行って、いくつかのミスマッチを含有するヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にすることも可能である。続いて、０．１％ＳＤＳを含む０．２ｘＳＳＣなどの緩衝液を、４５℃（中程度のストリンジェンシー）または６８℃（高ストリンジェンシー）いずれかで用いて、より高いストリンジェンシーで洗浄を行う。高ストリンジェンシーでは、核酸配列がほぼ完全に相補的である箇所でのみ、ハイブリダイゼーション複合体が安定であり続けるであろう。膜に基づく、いくつかのハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％または最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げることも可能であるし、そしてザルコシルまたはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの他の界面活性剤およびサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング剤の使用によって、バックグラウンドシグナルを減少させることも可能である。ハイブリダイゼーションのための構成要素および条件の選択は、当業者に周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ（上記）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビューに概説されている。
【０１２０】
典型的な高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション、そして０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃３０分間２回の洗浄。Ａｕｓｕｂｅｌら（監修）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）， ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０に記載されるように、温度および緩衝剤、または塩濃度の変動を通じて、同等のストリンジェンシーの条件を達成可能であることが、当該技術分野において理解される。ハイブリダイゼーション条件の修飾を、経験的に決定することも可能であるし、またはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対形成の割合に基づいて、正確に計算することも可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）， ｐｐ．９．４７〜９．５１に記載されるように、ハイブリダイゼーション条件を計算することも可能である。
【０１２１】
試料に既知の量で添加した特異性対照試料核酸分子に対する、特異性対照核酸分子のハイブリダイゼーションを比較することによって、ハイブリダイゼーション特異性を評価することも可能である。特異性対照アレイ化核酸分子は、対応するアレイ化核酸分子と比較して、１以上の配列ミスマッチを有することも可能である。この方式で、相補的アレイ化核酸分子のみが試料核酸分子にハイブリダイズするのか、またはミスマッチハイブリッド二重鎖が形成されるのかを決定することも可能である。
【０１２２】
絶対的または示差的ハイブリダイゼーション形式で、ハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。絶対的ハイブリダイゼーション形式では、１つの試料由来の核酸分子を、マイクロアレイ形式で分子にハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイゼーション複合体形成後に検出されるシグナルが、試料中の核酸分子レベルに相関する。示差的ハイブリダイゼーション形式では、２つの生物学的試料中の遺伝子セットの示差的発現を解析する。示差的ハイブリダイゼーションでは、両方の生物学的試料から核酸分子を調製し、そして異なる標識部分で標識する。２つの標識核酸分子の混合物を、マイクロアレイに添加する。次いで、２つの異なる標識からの発光を個々に検出可能である条件下で、マイクロアレイを調べる。両方の生物学的試料由来の実質的に同等の数の核酸分子にハイブリダイズする、マイクロアレイ中の分子は、区別可能な組み合わされた蛍光を生じる（ＳｈａｌｏｎらＰＣＴ公報ＷＯ９５／３５５０５）。好ましい態様において、標識は、Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォアなどの、区別可能な発光スペクトルを持つ蛍光マーカーである。
【０１２３】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズしていない核酸分子を取り除き、そしてハイブリダイズ可能なアレイ要素および核酸分子間の複合体形成を検出する。複合体形成を検出する方法は当業者に周知である。好ましい態様において、核酸分子を蛍光標識で標識し、そして複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定を蛍光顕微鏡、好ましくは共焦点蛍光顕微鏡によって達成する。
【０１２４】
示差的ハイブリダイゼーション実験において、２以上の異なる生物学的試料由来の核酸分子を、異なる発光波長を持つ２以上の異なる蛍光標識で標識する。特定の波長を検出する異なる光電子増倍管セットを用いて、蛍光シグナルを別個に検出する。２以上の試料中の核酸分子の相対的存在量／発現レベルを得る。
【０１２５】
典型的には、同様の試験条件下で、１より多いマイクロアレイを用いる場合、マイクロアレイ蛍光強度を規準化して、ハイブリダイゼーション強度の変動を考慮に入れることも可能である。好ましい態様において、各マイクロアレイ上に含有される内部規準化対照由来の強度を用いて、個々のアレイ化試料核酸分子複合体ハイブリダイゼーション強度を規準化する。
【０１２６】
ポリペプチドに基づくアッセイ
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを検出し、そして定量化するための方法および試薬を提供する。これらの方法には、電気泳動、質量分析、クロマトグラフィー法などの解析的生化学的方法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどの多様な免疫学的方法、アフィニティー捕捉質量分析、生物学的活性、および以下に記載し、そして本開示を再検討した際に当業者には明らかである他のアッセイが含まれる。
【０１２７】
イムノアッセイ
本発明はまた、１以上の抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体試薬を使用して、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを検出する方法（すなわちイムノアッセイ）も提供する。本明細書において、イムノアッセイは、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する抗体（本明細書に広く定義されるとおりであり、そして具体的には断片、キメラおよび他の結合剤が含まれる）を利用するアッセイである。
【０１２８】
本発明の実施に適した、いくつかのよく確立された免疫学的結合アッセイ形式が知られる（例えば米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照されたい）。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｓａｉ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク（１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７版， Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ監修（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記［例えば第１４章］、並びにＡｕｓｕｂｅｌら、上記［例えば第１１章］を参照されたい。典型的には、免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、解析物に特異的に結合し、そしてしばしば解析物を固相に固定する、「捕捉剤」を利用する。１つの態様において、捕捉剤は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたは下位配列に特異的に結合する部分、例えば抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体である。
【０１２９】
通常、アッセイしようとするイヌＬ−ＰＢＥ遺伝子産物を直接検出するか、または検出可能標識を用いて、間接的に検出する。アッセイで用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイに用いる単数または複数の抗体の特異的結合に有意に干渉しない限り、通常、本発明の決定的な側面ではない。標識は、捕捉剤（例えば抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体）に共有的に付着していることも可能であるし、またはイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的に結合する別の抗体などの第三の部分に付着していることも可能である。
【０１３０】
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを検出する競合的および非競合的イムノアッセイの方法および試薬を提供する。非競合的イムノアッセイは、捕捉された解析物（この場合、イヌＬ−ＰＢＥ）の量を直接測定するアッセイである。１つのこうしたアッセイは、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質上の２つの干渉しないエピトープに反応性であるモノクローナル抗体を利用する、モノクローナル抗体に基づく２部位イムノアッセイである。背景情報に関しては、例えばＭａｄｄｏｘら， １９８３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １５８：１２１１を参照されたい。１つの「サンドイッチ」アッセイにおいて、捕捉剤（例えば抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体）を固体支持体に直接結合させて、固定する。次いで、これらの固定された抗体が、試験試料中に存在するいかなるイヌＬ−ＰＢＥタンパク質も捕捉する。次いで、こうして固定されたイヌＬ−ＰＢＥを、すなわち標識を所持する第二のイヌＬ−ＰＢＥ抗体に結合させることによって、標識することも可能である。あるいは、第二のイヌＬ−ＰＢＥ抗体は標識を欠いているが、第二の抗体が得られた種の抗体に特異的な、標識された第三の抗体に結合されていることも可能である。あるいは、第二の抗体をビオチンなどの検出可能部分で修飾し、これに酵素標識ストレプトアビジンなどの、第三の標識分子が特異的に結合することも可能である。
【０１３１】
競合的アッセイにおいて、試料中に存在するイヌＬ−ＰＢＥタンパク質によって、捕捉剤（例えばイヌＬ−ＰＢＥ抗体）から置換された（または競合により離れた（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ａｗａｙ））、添加された（外因性）イヌＬ−ＰＢＥの量を測定することによって、試料に存在するイヌＬ−ＰＢＥタンパク質の量を間接的に測定する。ハプテン阻害アッセイは、競合アッセイの別の例である。このアッセイにおいて、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質を固体支持体上に固定する。既知の量のイヌＬ−ＰＢＥ抗体を試料に添加し、そして次いで、試料を固定イヌＬ−ＰＢＥタンパク質と接触させる。この場合、固定イヌＬ−ＰＢＥタンパク質に結合した抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体の量は、試料に存在するイヌＬ−ＰＢＥタンパク質の量に反比例する。抗体の固定された割合または溶液中に残存する抗体の割合いずれかを検出することによって、固定された抗体の量を検出することも可能である。この側面において、抗体が標識されている場合、検出は直接であることも可能であるし、または上述のように抗体に特異的に結合する分子に標識が結合している場合、間接的であることも可能である。
【０１３２】
抗体に基づく他のアッセイ形式
本発明はまた、イムノブロット（ウェスタンブロット）形式を用いることによって、試料中のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの存在を検出し、そして定量化するための試薬および方法も提供する。別のイムノアッセイは、いわゆる「側方流動クロマトグラフィー」である。側方流動クロマトグラフィーの非競合型では、試料は、例えばキャピラリー作動によって、支持体を横切って移動し、そして可動標識抗体と出会い、該抗体が解析物に結合してコンジュゲートを形成する。次いで、コンジュゲートが支持体を横切り、そして固体された第二の抗体と出会い、この抗体が解析物と結合する。したがって、標識抗体を検出することによって、固定された解析物が検出される。側方流動クロマトグラフィーの競合型では、解析物の標識型が、キャリアーを横切って移動し、そして固定された抗体との結合に関して、非標識解析物と競合する。試料中により多量の解析物があれば、標識解析物による結合はより少なくなり、そしてしたがって、シグナルはより弱くなる。例えばＭａｙら、米国特許第５，６２２，８７１号およびＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ、米国特許第５，５９１，６４５号を参照されたい。
【０１３３】
アッセイに応じて、抗原、標的抗体、または抗カテプシンＳ抗体を含む、多様な構成要素を、固体表面または支持体（例えば担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、膜、またはろ紙）に結合させることも可能である。多様な固体表面に生体分子を固定する多くの方法が当該技術分野に知られる。例えば、固体表面は、膜（例えばニトロセルロース）、マイクロタイタープレート（例えばＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、ディップスティック（例えばガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス等）、微量遠心分離試験管、またはガラスもしくはプラスチックビーズであることも可能である。望ましい構成要素を共有結合させることも可能であるし、または非特異的結合を介して、非共有的に付着させることも可能である。
【０１３４】
天然および合成両方の、非常に多様な有機ポリマーおよび無機ポリマーを、固体表面の材料として使用することも可能である。実例となるポリマーには、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン類、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース等が含まれる。使用可能な他の物質には、紙、ガラス、セラミックス、金属、メタロイド、半導体物質、セメント等が含まれる。さらに、タンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドなどの、ゲルを形成する物質もまた、使用可能である。いくつかの水性相を形成するポリマー、例えばデキストラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤、例えばリン脂質、長鎖（１２〜２４の炭素原子）アルキルアンモニウム塩等もまた適切である。固体表面が多孔である場合、系の性質に応じて、多様な孔サイズを使用することも可能である。
【０１３５】
質量分析
分子の質量（ｍａｓｓ）は、しばしば、分子の同定因子として使用することも可能である。したがって、質量分析法を用いて、タンパク質解析物を同定することも可能である。質量分析装置は、イオン化解析物が飛行管を通過して、そしてイオン検出装置に検出されるのに必要な時間を測定することによって、質量を測定可能である。タンパク質のための質量分析の１つの方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（「ＭＡＬＤＩ」）である。ＭＡＬＤＩにおいて、レーザーの波長のエネルギーを吸収するエネルギー吸収マトリックス物質と解析物を混合し、そしてプローブ表面に置く。マトリックスをレーザーで打つと、解析物がプローブ表面から脱離し、イオン化され、そしてイオン検出装置に検出される。例えばＨｉｌｌｅｎｋａｍｐら、米国特許第５，１１８，９３７号を参照されたい。
【０１３６】
タンパク質のための質量分析の他の方法が、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ、米国特許第５，７１９，０６０号に記載される。１つのこうした方法は、アフィニティー捕捉のための増進表面（「ＳＥＡＣ」）と称され、この方法において、解析物に特異的にまたは非特異的に結合する固相アフィニティー試薬、例えば抗体または金属イオンを用いて、解析物を試料中の他の物質から分離する。次いで、捕捉された解析物を、例えばレーザーエネルギーによって固相から脱離し、イオン化し、そして検出装置によって検出する。
【０１３７】
本発明のさらなる特徴および変型は、詳細な説明を含めた本出願全体から、当業者に明らかであろうし、そしてこうした特徴はすべて、本発明の側面と意図される。同様に、本明細書に記載する本発明の特徴を再度組み合わせて、特徴の組み合わせが、本発明の側面または態様として、具体的に上述されているかいないかにかかわりなく、やはり本発明の側面であることも意図されるさらなる態様にすることも可能である。また、本発明に決定的であると本明細書に記載した限定のみが、限定として見なされるべきであり；決定的であると本明細書に記載されていない、限定されない本発明の変型は、本発明の側面であると意図される。
【０１３８】
前述の説明および実施例に特に記載されるものとは別の方式で、本発明を実施可能であることが明らかであろう。
上記の解説を考慮すると、本発明の多くの修飾および変型が可能であり、そしてしたがって、これらは本発明の側面内にある。
【０１３９】
本明細書に引用したすべての刊行物のすべての開示は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ】イヌ（配列番号１）、ヒト（配列番号１１）、マウス（配列番号１３）およびラット（配列番号１５）Ｌ−ＰＢＥポリペプチド配列の並列。
【図１Ｂ】イヌ（配列番号１）、ヒト（配列番号１１）、マウス（配列番号１３）およびラット（配列番号１５）Ｌ−ＰＢＥポリペプチド配列の並列。
【図２Ａ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【図２Ｂ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【図２Ｃ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【図２Ｄ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）Ｌ−ＰＢＥポリペプチドを含む単離ポリペプチド、および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、毒性化合物または分子の指標となる代謝反応のための化合物および療法剤をスクリーニングするアッセイも提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ペルオキシソームは、古典的なＬ−ヒドロキシ特異的ペルオキシソーム増殖因子誘導性ベータ酸化系を含有する。ヒト・ペルオキシソームのエノイル−ＣｏＡ−ヒドラターゼ：３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ二機能性酵素（Ｌ−ＰＢＥ）は、Ｈｏｅｆｌｅｒら（１）によって最初に同定された。ｃＤＮＡ配列は、３，７７９ヌクレオチドに渡り、２，１６９ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する。
【０００３】
Ｑｉらは、ノックアウトマウスを生成することによって、Ｌ−ＰＢＥの機能を検討した（２）。突然変異体マウスは生存可能であり、そして繁殖性であり、そして検出可能な著しい表現型上の欠陥を示さなかった。Ｌ−ＰＢＥノックアウトマウスは、ペルオキシソーム増殖因子に曝露されると、同様に処置された野生型マウスと比較して、ペルオキシソーム増殖反応が認識可能に鈍化していたことを除き、ＰＰＡＲαに制御される肝臓ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの増加を示した。ペルオキシソーム増殖反応のこの鈍化は、Ｌ−ＰＢＥノックアウトマウス肝臓中にＬ−ＰＢＥタンパク質が存在しなかったことに起因すると考えられる。
【０００４】
Ｗａｔｋｉｎｓらは、新生児副腎白質ジストロフィー（ＮＡＬＤ）の臨床的特徴を持つ男性乳児において、ペルオキシソーム機能を評価した（３）。ペルオキシソームのベータ−酸化酵素のイムノブロット研究によって、死後の肝臓試料において、Ｌ−ＰＢＥ（エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）が欠損していることが示された。Ｗａｎｄｅｒｓらもまた、ペルオキシソーム二機能性酵素欠損を記載しており、これはＮＡＬＤのものより、より重度の表現型と関連しているようである（４）。
【０００５】
イヌは、薬剤の毒性学を研究するための重要な種であるため、イヌＬ−ＰＢＥ遺伝子に特異的な核酸プローブおよびイヌＬ−ＰＢＥタンパク質に特異的な抗体は、推定上の毒性化合物に対する代謝反応を示す手段として、産業毒性学において、大きな価値を有する。本発明はこの必要性に対処する。
【０００６】
参考文献
【０００７】
【化１】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
本発明は、上に同定される必要性に対処し、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質をコードする単離核酸分子、該単離核酸分子を取り込んだ構築物および組換え宿主細胞；該単離核酸分子によってコードされるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチド；イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに対する抗体を提供する。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、単離イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを提供する。配列番号２のポリペプチドは、いくつかのポリペプチド種を生じる、特定のタンパク質分解プロセシング事象にさらされることも可能であると理解される。
【００１０】
さらに、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのエピトープを含む断片を提供する。「特異的なエピトープ」によって、以下に詳細に定義するように、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体によって認識可能であるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの部分を意味する。別の態様は、配列番号２に示す完全アミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含む。
【００１１】
イヌＬ−ＰＢＥのコードｃＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列を以下に複製し、そしてまた、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示す。
【００１２】
【化２】
【００１３】
配列番号１および配列番号２は、特定のイヌ・ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供するが、本発明は、その範囲内に他のイヌ・アレル変異体を含むことが意図される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド（例えば一本鎖または二本鎖のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせ）を提供する。こうしたポリヌクレオチドは、細胞において、該酵素を組換え的に発現するのに有用であり、そしてまた、該酵素の発現を検出するのにも有用である（例えばノーザン・ハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを用いる）。こうしたポリヌクレオチドはまた、培養細胞もしくは組織において、または動物において、イヌＬ−ＰＢＥの発現を抑制するアンチセンスおよび他の分子を設計するため、療法目的のため、あるいは異常なイヌＬ−ＰＢＥ発現に特徴付けられる疾患のモデルを提供するために、有用である。本発明のポリヌクレオチドの定義から明確に排除されるのは、ポリヌクレオチドが元来得られた天然宿主細胞由来の完全単離染色体である。配列番号１に示すポリヌクレオチドは、天然存在イヌＬ−ＰＢＥ配列に対応する。普遍的遺伝暗号の周知の縮重のため、やはり配列番号２のイヌＬ−ＰＢＥをコードする多くの他の配列が存在することが認識されるであろう。別の態様において、本発明は、配列番号１に示す配列以外の縮重イヌＬ−ＰＢＥコード配列のすべてに関する。
【００１５】
本発明はまた、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、以下のハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に示すヌクレオチド配列または該配列に相補的な非コード鎖に特異的にハイブリダイズする、前記単離ポリヌクレオチドも提供する：
（ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃１６時間のハイブリダイゼーション；および
（ｂ）０．１％ＳＳＣ、１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃３０分間２回の洗浄。
【００１６】
本発明の１つのポリヌクレオチドは、イヌＬ−ＰＢＥコードＤＮＡ配列を含む配列番号１に示す配列、またはそのユニークな断片を含む。
関連する態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。こうしたベクターは、例えば宿主細胞において、ポリヌクレオチドを増幅し、有用な量を生じるのに有用である。他の態様において、ベクターは発現ベクターであり、該ベクター中で、本発明のポリヌクレオチドが、発現調節配列を含むポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されている。こうしたベクターは、本発明のポリペプチドの組換え体産生に有用である。
【００１７】
別の関連する態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで（安定にまたは一過性に）形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。上述のように、こうした宿主細胞は、該ポリヌクレオチドを増幅するのに有用であり、そしてまた、該ポリヌクレオチドがコードする、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたはその断片を発現するのにも有用である。
【００１８】
さらに別の関連する態様において、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド（またはその断片）を産生する方法であって、栄養培地中で本発明の宿主細胞を増殖させ、そして細胞または培地から該ポリペプチドまたはその変異体を単離する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のイヌＬ−ＰＢＥに特異的な抗体を提供する。抗体特異性を以下により詳細に記載する。しかし、文献に先に記載されたポリペプチドから生成可能であり、そしてイヌＬ−ＰＢＥと偶然に交差反応する（例えば両ポリペプチド中に類似のエピトープが偶然存在するため）ことが可能な抗体は、「交差反応性」抗体と見なされることを強調しなければならない。こうした交差反応性抗体は、イヌＬ−ＰＢＥに「特異的」な抗体ではない。抗体がイヌＬ−ＰＢＥに特異的であるか、または別の既知の酵素と交差反応性であるかの決定は、ウェスタンブロッティングアッセイまたは文献で周知のいくつかの他のアッセイを用いて行われる。イヌＬ−ＰＢＥを発現する細胞を同定するため、そしてまた、イヌＬ−ＰＢＥ活性を調節するため、イヌＬ−ＰＢＥの活性部位に特異的に結合する抗体は、特に有用であるが、もちろん、他のエピトープに結合する抗体もまた、本発明の一部であることが意図される。
【００２０】
１つの変型において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。こうした抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の側面と意図される。
別の変型において、本発明は、ポリクローナル抗体を含む細胞不含組成物を提供し、ここで少なくとも１つの抗体は、イヌＬ−ＰＢＥに特異的な本発明の抗体である。動物から単離される抗血清が典型的な組成物であり、水または別の希釈剤、賦形剤、もしくはキャリアーに再懸濁されている抗血清の抗体分画を含む組成物も典型的である。
【００２１】
本発明はまた、本発明の抗体を用いる方法も提供する。例えば、本発明は、細胞抽出物内に存在するイヌＬ−ＰＢＥの量を決定する方法であって、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させる工程を含む、前記方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドの量を決定する方法であって：配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含む核酸分子と試料を、１以上の特異的ハイブリダイゼーション複合体形成のための条件下で接触させることを含む、前記方法も提供し、ここで該断片は、配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００２３】
本発明はまた、イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：試験剤で処置したイヌ由来の核酸を含有する試料を提供し；そして前記試料中の配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含むポリヌクレオチドの量を決定することを含む、前記方法も提供し、ここで未処置のイヌ由来のポリヌクレオチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリヌクレオチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる。
【００２４】
１つの態様において、決定はハイブリダイゼーションを介して達成される。ハイブリダイゼーションは、核酸分子と試料核酸分子を、核酸分子および試料核酸分子間でハイブリダイゼーション複合体を形成するのに有効な条件下で接触させ；そしてハイブリダイゼーション複合体の存在または非存在を検出することを含む方法によって達成されることも可能である。１つの側面において、配列番号１若しくはその断片、又は配列番号１の相補体は、固体支持体アレイまたは他の固体支持体上の複数の核酸とともに存在することも可能である。
【００２５】
本発明はさらに、試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの量を決定する方法であって：
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させる
ことを含む、前記方法を提供する。所望によって、Ｌ−ＰＢＥポリペプチドまたは抗体は、固体支持体に付着していることも可能である。
【００２６】
本発明はまた、イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：試験剤で処置したイヌ由来の試料を提供し；そして前記試料中の配列番号２を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープを含む該ポリペプチドの断片の量を決定することを含む、前記方法も提供し、ここで未処置のイヌ由来のポリペプチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリペプチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
配列表の簡単な説明
配列番号１――イヌＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号２――イヌＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
配列番号３〜１０――クローニング用プライマーおよび配列決定用プライマー
配列番号１１ ヒトＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１２ ヒトＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
配列番号１３ マウスＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１４ マウスＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
配列番号１５ ラットＬ−ＰＢＥをコードするｃＤＮＡ配列
配列番号１６ ラットＬ−ＰＢＥの予測されるアミノ酸配列
【００２８】
発明の詳細な説明
一般的な定義
本明細書において、これ以降、「ポリヌクレオチド」は、一般的に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであることも可能な、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドいずれかを指す。「ポリヌクレオチド」には、限定なしに、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であることも可能なＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡ両方を含む三重鎖領域を指す。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通でない塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに多様な修飾を行うことも可能であり；したがって、「ポリヌクレオチド」は、天然に典型的に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的修飾型とともに、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型も含む。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される、比較的短いポリヌクレオチドも含む。
【００２９】
本明細書において、これ以降、「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質いずれかを指す。「ポリペプチド」は、一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般的にタンパク質と称される、より長い鎖両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含有することも可能である。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるか、または当該技術分野に周知の化学的修飾技術によるか、いずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。こうした修飾は、基本的な教科書、そしてより詳細なモノグラフ、さらに、膨大な研究文献によく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどこに存在することも可能である。同種の修飾が、既定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じ度合いで、または異なる度合いで存在することも可能であることが認識されるであろう。また、既定のポリペプチドが多くの種類の修飾を含有することも可能である。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝していることも可能であるし、そして分枝を伴い、または伴わずに、環状であることも可能である。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じることも可能であるし、または合成法によって作成されることも可能である。修飾または修飾型には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡが仲介するタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ―Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， 第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク， １９９３；Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−１２ページ， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ中， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒら， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎら， “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８４２を参照されたい）。
【００３０】
「合成」は、本明細書において、そして当該技術分野に理解されるように、酵素的方法と対照的に、純粋に化学的方法によって産生されるポリヌクレオチドを指す。したがって、「完全に」合成されたＤＮＡ配列は、完全に化学的手段によって産生され、そして「部分的に」合成されたＤＮＡは、生じるＤＮＡのある部分のみが化学的手段によって産生されたものを含む。
【００３１】
本明細書において、これ以降、「単離された」は、人の手によって天然状態から改変されたことを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、その元来の環境から変化しているかまたは取り除かれているか、あるいはその両方である。例えば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、天然状態で共存する物質から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、該用語を本明細書で使用する際、「単離されて」いる。「単離された」は、本明細書において、そして当該技術分野に理解されるように、「単離」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドいずれを指すのであっても、該ポリペプチドまたは核酸が通常見られる元来の細胞環境から分離されたことを意味するように解釈される。したがって、本明細書において、一例として、本発明のポリヌクレオチドで構築したトランスジェニック動物または組換え細胞株は、「単離」核酸を利用する。
【００３２】
本明細書において、用語「イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド」は、イヌＬ−ＰＢＥ遺伝子がコードするタンパク質を意味し、保存的変化または非保存的変化を含有するアレル変異体を含む。１つのイヌＬ−ＰＢＥタンパク質配列を配列番号２として開示する。
【００３３】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを、組換え細胞または生物によって産生することも可能であるし、天然組織または細胞株から実質的に精製することも可能であるし、あるいは化学的または酵素的に合成することも可能である。したがって、用語「イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド」は、グリコシル化型、部分的グリコシル化型、または非グリコシル化型のタンパク質とともに、リン酸化型、部分的リン酸化型、非リン酸化型、硫酸化型、部分的硫酸化型、または非硫酸化型のタンパク質を含むことが意図される。該用語にはまた、アレル変異体、生物学的に活性であるタンパク質分解断片または他の断片を含む、ＰＳ２アミノ酸配列の他の機能的同等物、並びにイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの生理学的および病的タンパク質分解切断産物が含まれる。
【００３４】
本明細書において、用語「試験剤」は、同定可能な化学薬品または分子いずれかを意味し、これには、限定されるわけではないが、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が含まれる。こうした試験剤は、天然または合成であることも可能である。
【００３５】
本明細書において、用語「接触」は、直接または間接的いずれかで、化合物を本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと物理的に近接させて、合わせることを意味する。該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、いかなる数の緩衝剤、塩、溶液などの中に存在することも可能である。接触には、例えば、イオンチャネルポリペプチドもしくはその断片、またはイオンチャネルもしくはその断片をコードする核酸分子いずれかを含有する、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、または遺伝子チップ等のマイクロアレイに化合物を入れることが含まれる。
【００３６】
本発明の核酸
本発明は、本明細書において、イヌＬ−ＰＢＥと称されるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド（例えば、センス鎖および相補的アンチセンス鎖両方の、一本鎖および二本鎖両方のＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物、そのスプライス変異体を含む）を提供する。本発明のＤＮＡポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および全体または部分が化学的に合成されているＤＮＡが含まれる。
【００３７】
本発明のゲノムＤＮＡは、本発明のポリペプチドのタンパク質コード領域を含み、そしてまたそのアレル変異体を含むことも意図される。多くの遺伝子に関して、ゲノムＤＮＡがＲＮＡ転写物に転写され、これが１以上のスプライシング事象を経て、転写物のイントロン（すなわち非コード領域）が除去されるか、または「スプライシング−アウト」されることが広く理解されている。選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）機構によってスプライシングされることも可能であり、そしてしたがって異なるＲＮＡ配列の除去にさらされることも可能であるが、なおイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物は、当該技術分野において、スプライス変異体と称され、本発明に含まれる。したがって、本発明に含まれるスプライス変異体は、同一の元来のゲノムＤＮＡ配列にコードされるが、別個のｍＲＮＡ転写物から生じる。アレル変異体は、野生型遺伝子配列の修飾型であり、修飾は、染色体分離中の組換えから、または遺伝子突然変異を生じさせる条件への曝露から生じる。アレル変異体は、野生型遺伝子同様、天然存在配列である（ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作から生じる非天然存在変異体とは対照的である）。
【００３８】
本発明はまた、イヌＬ−ＰＢＥをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写を通じて得られるｃＤＮＡも含む（慣用的には、相補鎖の第二の鎖合成が続き、二本鎖ＤＮＡを提供する）。
【００３９】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を配列番号１に示す。当業者は、本発明のＤＮＡが二本鎖分子を含み、例えば、ＤＮＡのワトソン−クリック塩基対形成規則にしたがって配列番号１の配列から推定可能な配列を有する相補分子（「非コード鎖」または「相補体」）を伴う、配列番号１に示す配列を有する分子を含むことを容易に認識するであろう。本発明にやはり意図されるのは、普遍的遺伝暗号の周知の縮重のため、配列番号１のポリヌクレオチドと配列が異なる、配列番号２のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドである。
【００４０】
当該技術分野に周知であるように、遺伝暗号の縮重のため、前述の配列番号１のポリペプチドにコードされるのと同一のポリペプチドをコードすることが可能な、多くの他のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子がある。したがって、本発明は、発現に際して、配列番号２のポリペプチドをコードする、他のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意図する。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするアミノ酸残基配列が同定されたら、そして各特定のアミノ酸残基をコードするすべての３つ組コドンを知っていれば、こうしたコードＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列をすべて記載することが可能である。したがって、特定のアミノ酸に関して、単純にコドン中の変化によって特徴付けられる、本明細書に具体的に開示するもの以外のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子が、本発明の範囲内である。
【００４１】
アミノ酸およびそれを表す略語、記号およびコドンの表を、以下の表１に示す。
表１
【００４２】
【表１】
【００４３】
当該技術分野に周知であるように、コドンは、ｍＲＮＡおよびその対応するｃＤＮＡ分子において、ヌクレオチドの３つ組配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子に存在する場合、塩基ウラシル（Ｕ）によって特徴付けられるが、ＤＮＡに存在する場合、塩基チミジン（Ｔ）によって特徴付けられる。ポリヌクレオチド内の同一アミノ酸残基のコドンにおける単純な変化は、コードされるポリペプチドの配列または構造を変化させないであろう。句が、特定の３ヌクレオチド配列が特定のアミノ酸いずれかを「コードする」ことを述べる場合、一般の当業者は、上の表が問題の特定のヌクレオチドを同定する手段を提供するのを認識するであろうことが明らかである。例として、特定の３ヌクレオチド配列が、スレオニンをコードする場合、上の表は、ありうる３つ組配列がＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＣＣおよびＡＣＵ（ＤＮＡの場合ＡＣＴ）であることを開示する。
【００４４】
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥ ＤＮＡの種相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）、好ましくは哺乳動物相同体をさらに含む。種相同体は、ときに「オルソログ」と称され、本発明の配列番号１と、少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を共有する。本発明のポリヌクレオチドに関する配列「相同性」パーセントは、本明細書において、配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、配列番号１に示すイヌＬ−ＰＢＥ配列のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチド塩基の割合として定義される。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２−４８９（１９８１））のアルゴリズムを用いる、Ｇａｐプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８、Ｕｎｉｘ用、遺伝学コンピュータグループ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などの、この目的に一般的に使用されるコンピュータプログラムいずれかを用いて、２つの配列を比較することによって、天然および変異体イヌＬ−ＰＢＥ配列間の配列の割合を決定することもまた可能である。
【００４５】
本発明に提供されるポリヌクレオチド配列情報は、当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される技術によって、コードされるポリペプチドの大規模発現を可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、サザン・ハイブリダイゼーションおよび／またはノーザン・ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む周知の技術によって、ヒト・アレル変異体および種相同体などの、関連するイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定および単離も可能にする。関連するポリヌクレオチドの例には、アレル変異体を含むヒトおよび非ヒトゲノム配列、並びに、イヌＬ−ＰＢＥに相同なポリペプチド、およびイヌＬ−ＰＢＥの１以上の生物学的、免疫学的、および／または物理的特性を共有する、構造的に関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。イヌＬ−ＰＢＥ ＤＮＡの配列を知ることで、サザン・ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のイヌＬ−ＰＢＥ発現調節制御配列をコードするゲノムＤＮＡ配列の同定もまた可能になる。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞がイヌＬ−ＰＢＥを発現する能力を検出するか、またはイヌＬ−ＰＢＥ発現レベルを測定する、ハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、単数または複数の疾患状態の根底にあるイヌＬ−ＰＢＥ遺伝子座における遺伝子改変（単数または複数）を同定するのに有用な診断法の基礎となることも可能であり、こうした情報は、診断にも、そして療法戦略の選択にも有用である。
【００４６】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチドの本明細書における開示は、一般の当業者が、全長ポリヌクレオチドのすべてのありうる断片を入手するのを容易に可能にする。したがって、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１２から２５６２（この間の１つ１つの整数値を含む）の連続ヌクレオチドを含む、イヌＬ−ＰＢＥコードポリヌクレオチドの断片を提供する。本発明のポリヌクレオチド（断片を含む）は、しばしば、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチド配列にユニークな配列を含み、そしてしたがって、非常にストリンジェントな条件下、または中程度にストリンジェントな条件下で、イヌＬ−ＰＢＥ（またはその断片）をコードするポリヌクレオチドにのみ（すなわち「特異的に」）ハイブリダイズするであろう。本発明のゲノム配列のポリヌクレオチド断片は、コード領域にユニークな配列だけでなく、イントロン、制御領域、および／または他の非翻訳配列に由来する全長配列の断片も含む。本発明のポリヌクレオチドにユニークな配列は、他の既知のポリヌクレオチドへの配列比較を通じて認識可能であり、そして当該技術分野で日常的に利用される並列プログラム、例えば公共の配列データベースで入手可能なものの使用を通じて同定可能である。こうした配列はまた、ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片の数を決定するサザン・ハイブリダイゼーション解析からも認識可能である。本発明のポリヌクレオチドは、放射能標識、蛍光標識、および酵素標識を含めて、その検出を可能にする方式で標識されることも可能である。
【００４７】
断片ポリヌクレオチドは、全長または他の断片イヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドの検出用のプローブとして特に有用である。１以上の断片ポリヌクレオチドは、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いられるか、またはイヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチド配列における変動を検出するのに用いられる、キットに含まれることも可能である。
【００４８】
本発明はまた、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをコードするＤＮＡであって、配列番号１のポリヌクレオチドの非コード鎖または相補体に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下でハイブリダイズする、前記ＤＮＡもまた含む。
【００４９】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの概念は、以下の「本発明のアッセイ」を詳述する項で論じる。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
イヌＬ−ＰＢＥのクローニング
ＰＣＲのプライマーを設計するため、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州）を用いて、ヒト、ラットおよびマウスＬ−ＰＢＥの各遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を並列した。各遺伝子について３つのプライマーセットを選択した。その中で、２つのセットは、それぞれ、ヒトおよびラットのオルソログの開始配列領域および停止配列領域に対応し；残りのセットは、ヒト、ラットおよびマウスのオルソログ間の保存される配列領域にしたがって設計された。プライマーは、一般的に、長さ３０ヌクレオチドである。
【００５１】
ヒトＰＳＤデータベース（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｉｎｃ．）およびＮＣＢＩ ＥＳＴデータベース検索を通じて（相同ＥＳＴがクローニングされた組織を同定することによって）、選択したクローニング候補遺伝子の組織発現パターンを同定した。５つの組織、肝臓、腎臓、結腸、脾臓および肺が、選択した１２の遺伝子すべてを含むことが同定された。
【００５２】
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）を用いて、イヌ肝臓試料からＲＮＡを調製した。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するため、総体積１２．５μｌ中、０．５μｇのＲＮＡを５．７７μｌの３２．５μＭランダム六量体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）および２．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰと混合した。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、そして氷上で冷却した。２μｌのＲＮアーゼ不含水、５μｌの５ｘ第一鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）、０．５μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２．５μｌの４０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）および２．５μｌの２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を含有する１２．５μｌのマスター混合物を添加した。最終反応混合物を２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、そして７０℃で１５分間、連続してインキュベーションした。合成したｃＤＮＡを２０倍に希釈し（最終濃度ほぼ１ｎｇ／μｌ）、そしてＰＣＲ反応のテンプレートとして直接使用するために、−２０℃フリーザーで保存した。
【００５３】
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速増幅）反応から適応させた条件を用いた修飾ＰＣＲ反応を用いて、イヌ遺伝子または遺伝子断片をクローニングした。５０μｌのＰＣＲ反応について、５μｌの逆転写ｃＤＮＡ、５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）、５０ｘｄＮＴＰ混合物の１μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ、最終濃度各０．２ｍＭ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）、各２０μＭの１μｌの５’プライマーおよび３’プライマーであった。用いたプライマー配列は：
【００５４】
【化３】
【００５５】
であった。１μｌのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｔａｑポリメラーゼ（５０ｘ）および３６μｌのＰＣＲ水（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を混合した。混合物を９４℃で１分間インキュベーションし、そして９４℃１５秒間そして次いで７２℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで７０℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで６８℃４分間が２５周期のタッチダウンＰＣＲプロトコルを実行した。ＰＣＲ反応の第一周期からクローニングされたのではない遺伝子に関しては、よりストリンジェントでないＰＣＲ条件は、９４℃１５秒間そして次いで６８℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで６５℃４分間が５周期、９４℃１５秒間そして次いで６２℃４分間が２５周期である。製造者の使用説明書にしたがって、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上、ＤＮＡ７５００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州）を用いて、ＰＣＲ断片の長さおよび濃度を調べる。
【００５６】
ＤＮＡ調製および配列決定
蛍光に基づくＡＢＩ３７７配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＰＥ／ＡＢＤ、カリフォルニア州フォスターシティ）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｒｅａｄｙ Ｄｙｅ−Ｄｅｏｘｙ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒキットとＴａｑ ＦＳＴＭポリメラーゼを以下のプライマー：
【００５７】
【化４】
【００５８】
とともに用いて、ＰＣＲ産物を配列決定した。
各ＡＢＩ周期配列決定反応は、約０．５μｇのプラスミドＤＮＡを含有する。９８℃１分間の最初の変性、次いで５０周期の：９８℃３０秒間の変性、５０℃３０秒間のアニーリング、および６０℃４分間の伸長を用いて、周期配列決定を行う。温度周期および時間は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーによって調節される。ＣｅｎｔｒｉｆｌｅｘＴＭゲルろ過カートリッジ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、伸長産物を単離する。各反応産物をピペットによってカラム上に装填し、これを次いで１５００ｘｇ、室温で４分間、スウィンギングバケット遠心分離装置（ＳｏｒｖａｌｌモデルＲＴ６０００Ｂ卓上遠心分離装置）中で遠心分離する。カラムで精製した試料を、真空下で約４０分間乾燥させ、そして次いで、５μｌのＤＮＡ装填溶液（８３％脱イオン化ホルムアミド、８．３ｍＭ ＥＤＴＡ、および１．６ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン）に溶解する。次いで試料を９０℃に３分間加熱し、そしてＡＢＩ３７７配列決定装置による配列解析のため、ゲル試料ウェルに装填する。ＡＢＩ３７７ファイルをＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）プログラムにインポートすることによって、配列解析を行った。一般的に、７００ｂｐの配列読み取りが得られた。ＤＮＡ鎖両方から配列情報を得ることによって、そして配列決定のあいまいさがすべて取り除かれるまで、異なる位置のプライマーを用いて、困難な領域を再配列決定することによって、潜在的な配列エラーを最小限にした。配列番号１は、産物の配列に相当する。
【００５９】
ヒト遺伝子オルソログと配列決定データを並列し、そして配列追跡データにしたがって、手動で管理した（ｃｕｒａｔｅｄ）。第一周期の配列決定後、完全には終了していないクローニング遺伝子または遺伝子断片に関しては、全プロジェクトが完了するまで、管理配列データに基づいて、さらなる配列決定プライマーを注文した。イヌ・コード配列は、それぞれ、ヒト、ラットおよびマウス相同体に８６％、７５％および７６％同一であるタンパク質をコードする。イヌＤＮＡコード配列は、ヒト、ラットおよびマウス・コードＤＮＡ配列に、それぞれ、８８％、７８．４％、７８．８％同一である（比較は、ヒトｍＲＮＡに関してはＧｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００１９６６、マウスｍＲＮＡに関してはＢＣ０１６８９９、そしてラットｍＲＮＡに関してはＮＭ＿１３３６０６に、そしてヒトタンパク質に関してはＮＰ＿００１９５７、マウスタンパク質に関してはＡＡＨ１６８９９、そしてラットタンパク質に関してはＮＰ＿５９８２９０に基づいた）。新規発見イヌ配列と他の３つの相同体の並列を図１および２に示す。
【００６０】
配列番号１の配列を得るこの方法は例示であり、そして配列番号１を開示することによって、当業者には、配列番号１の全配列を得る多数の方法が提供されることを認識しなければならない。例えば、配列番号１に開示する配列からプローブを生成し、そしてイヌｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、そしてそれによって配列番号１全体またはそのゲノム同等物を得ることが可能であろう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）。やはり例として、当業者は、配列番号１に開示する配列が与えられれば、それに次いで、配列番号１に代表される全配列を得るためのＰＣＲ増幅に適したプライマーを生成可能であることを直ちに認識するであろう（例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ監修， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８９；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍ．Ａ． Ｉｎｎｉｓ， Ｄａｖｉｄ Ｈ． Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｊｏｈｎ Ｊ． Ｓｎｉｎｓｋｙ， およびＴｈｏｍａｓ Ｊ． Ｗｈｉｔｅ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨークを参照されたい）。
【００６１】
本発明の宿主細胞およびベクター
本発明のポリヌクレオチドを取り込んだプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターなどの自律複製組換え発現構築物もまた提供する。イヌＬ−ＰＢＥコードポリヌクレオチドが、内因性または外因性発現調節ＤＮＡ配列および転写ターミネーターに、機能可能であるように連結されている発現構築物もまた、提供する。発現調節ＤＮＡ配列には、プロモーター、エンハンサー、およびオペレーターが含まれ、そして一般的に、発現構築物を利用しようとする発現系に基づいて選択される。プロモーターおよびエンハンサー配列は、一般的に、遺伝子発現を増加させる能力に関して選択され、一方、オペレーター配列は、一般的に、遺伝子発現を制御する能力に関して選択される。本発明の発現構築物は、構築物を所持する宿主細胞の同定を可能にする１以上の選択可能マーカーをコードする配列も含むことも可能である。発現構築物はまた、宿主細胞における相同組換えを容易にし、そして好ましくは促進する配列も含むことも可能である。本発明の構築物はまた、宿主細胞における複製に必要な配列も含む。
【００６２】
発現構築物は、好ましくは、コードされるタンパク質の産生のために利用されるが、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチド配列を単純に増幅するために利用することもまた可能である。
【００６３】
本発明の別の側面にしたがって、コードされるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現を可能にする方式で、本発明のポリヌクレオチド（または本発明のベクター）を含む、原核細胞および真核細胞を含む、宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチドを、環状プラスミドの一部として、または単離タンパク質コード領域を含む直鎖ＤＮＡとして、あるいはウイルスベクターとして、宿主細胞に導入することも可能である。当該技術分野で周知であり、そして日常的に実施されている、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法には、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核注入、またはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞およびプロトプラストなどのキャリアーとの融合が含まれる。本発明の発現系には、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物、および哺乳動物細胞系が含まれる。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、およびより高次の真核細胞が含まれる。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現に用いられるのに適した原核宿主には、限定されるわけではないが、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌とともに、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍａｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーが含まれる。
【００６４】
本発明の単離核酸分子は、好ましくは、原核細胞での発現用に設計されたベクターよりも、真核細胞での発現用に設計されたベクターにクローニングされる。より高次の真核生物から得られる遺伝子の発現には、ときに真核細胞が好ましく、これはこれらのタンパク質の合成、プロセシング、および分泌のシグナルが、真核細胞では通常認識されるが、原核宿主では、しばしば、認識されないためである（Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １６−４９ページ， １９９２）。イヌＬ−ＰＢＥの場合、Ｎ−連結グリコシル化のための２つのコンセンサス配列があり、そしてプロテインキナーゼＣリン酸化およびＯ−グリコシル化のための、翻訳後修飾の他の部位が予測可能である。真核宿主には、限定されるわけではないが、以下の：昆虫細胞、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト２９３細胞、およびネズミ３Ｔ３線維芽細胞が含まれることも可能である。
【００６５】
原核宿主で使用する発現ベクターは、一般的に、１以上の表現型的選択可能マーカー遺伝子を含む。こうした遺伝子は、一般的に、例えば抗生物質耐性を与えるか、または栄養要求必要条件を供給するタンパク質をコードする。非常に多様なこうしたベクターが商業的供給源から容易に入手可能である。例には、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、メリーランド州ベセスダ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれる。
【００６６】
イヌＬ−ＰＢＥはまた、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、およびクルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含む属由来の酵母宿主細胞で発現されることも可能である。酵母宿主には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．パストリス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。酵母ベクターはしばしば、２ミクロン酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと称する）もまた、使用可能である。酵母ベクターの上述の特徴に加えて、シャトルベクターはまた、大腸菌における複製および選択のための配列も含むであろう。イヌＬ−ＰＢＥをコードするヌクレオチド配列の５’端に酵母因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことによって、酵母宿主で発現されるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの直接分泌を達成することも可能である。
【００６７】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現には、昆虫宿主細胞培養系もまた、使用可能である。別の態様において、バキュロウイルス発現系を用いて、本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを発現する。昆虫細胞において異種タンパク質を発現するためのバキュロウイルス系の使用に関するさらなる情報は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に概説されている。
【００６８】
別の態様において、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを哺乳動物宿主細胞で発現させる。適切な哺乳動物細胞株の限定されない例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒト２９３細胞が含まれる。
【００６９】
本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの発現に適した発現ベクターの選択は、もちろん、使用しようとする特定の宿主細胞に応じ、そして一般の当業者の技術の範囲内である。適切な発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用する発現ベクターには、ウイルスゲノム由来の転写調節配列および翻訳調節配列が含まれることも可能である。本発明で使用可能な、一般的に用いられるプロモーター配列および修飾因子配列には、限定されるわけではないが、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のものが含まれる。哺乳動物発現ベクターを構築する方法は、例えばＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０（１９８３））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５（１９８６））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４））；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；およびＷＯ ９１／１８９８２に開示される。
【００７０】
（実施例２）
真核宿主細胞におけるイヌＬ−ＰＢＥの発現
イヌＬ−ＰＢＥタンパク質を産生するため、適切な発現ベクターを用い、標準的遺伝子操作技術を用いて、適切な宿主細胞中で、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドを発現させる。例えば、実施例１に記載するイヌＬ−ＰＢＥコード配列を商業的発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にサブクローニングし、そしてトランスフェクション試薬ｆｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品挿入物に提供されるトランスフェクションプロトコルを用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションする。ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞を含む、他の真核細胞株もまた、適切である。１００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）の存在下での増殖によって、イヌＬ−ＰＢＥを安定に発現している細胞を選択する。所望により、標準的クロマトグラフィー技術を用いて、細胞からイヌＬ−ＰＢＥを単離する。精製を容易にするため、イヌＬ−ＰＢＥアミノ酸配列の部分に対応する１以上の合成ペプチド配列に対して抗血清を作成することも可能であり、そしてこの抗血清を用いて、イヌＬ−ＰＢＥをアフィニティー精製する。イヌＬ−ＰＢＥをタグ配列（例えばポリヒスチジン、赤血球凝集素、ＦＬＡＧ）とインフレームで発現させて、精製を容易にすることもまた可能である。
【００７１】
本発明の宿主細胞は、イヌＬ−ＰＢＥと特異的に免疫反応性である抗体の発展のための、免疫原の価値ある供給源である。本発明の宿主細胞はまた、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの大規模産生の方法においても有用であり、ここで細胞を適切な培地中で増殖させ、そして当該技術分野に知られる精製法、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除ろ過、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ等を含む慣用的クロマトグラフィー法によって、細胞から、または細胞を増殖させた培地から、望ましいポリペプチド産物を単離する。さらに他の精製法には、特異的結合パートナーまたは剤に認識される特異的タグ、標識、またはキレート部分を有する融合タンパク質として、望ましいタンパク質を発現し、そして単離するものが含まれる。単離されたタンパク質を切断して、望ましいタンパク質を得ることも可能であるし、または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）融合タンパク質としてそのままにしておくことも可能である。融合構成要素の切断は、切断プロセスの結果として、さらなるアミノ酸残基を有する望ましいタンパク質の型を生じることも可能である。
【００７２】
イヌＬ−ＰＢＥ ＤＮＡ配列を知ることで、内因性イヌＬ−ＰＢＥの発現を可能にするか、または増加させるように、細胞を修飾することが可能になる。天然存在イヌＬ−ＰＢＥプロモーターと異種プロモーターのすべてまたは一部を交換して、細胞がより高いレベルでイヌＬ−ＰＢＥを発現するようにすることによって、細胞を修飾して（例えば相同組換えによって）、発現増加を提供することも可能である。内因性イヌＬ−ＰＢＥコード配列に機能可能であるように連結される方式で、異種プロモーターを挿入する［例えばＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９４／１２６５０号、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９２／２０８０８号、およびＰＣＴ国際公報第ＷＯ ９１／０９９５５号を参照されたい］。異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えばａｄａ、ｄｈｆｒ、並びにカルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼをコードする多機能ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡを、異種プロモーターＤＮＡとともに挿入可能であることもまた、意図される。イヌＬ−ＰＢＥコード配列に連結した場合、標準的選択法によってマーカーＤＮＡを増幅すると、細胞において、イヌＬ−ＰＢＥコード配列が同時に増幅される。
【００７３】
本発明に提供するＤＮＡ配列情報はまた、例えば相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２（１９８９）］を通じて、機能するイヌＬ−ＰＢＥを発現不能な動物またはイヌＬ−ＰＢＥの変異体を発現する動物の発展も可能にする。こうした動物（特にラット、ウサギ、およびマウスなどの実験小動物）は、イヌＬ−ＰＢＥのｉｎ ｖｉｖｏ活性およびイヌＬ−ＰＢＥの調節因子を研究するモデルとして有用である。
【００７４】
本発明によりやはり利用可能になるのは、イヌＬ−ＰＢＥをコードするポリヌクレオチドを認識し、そして該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチドである。全長および断片のアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。本発明の断片アンチセンス分子には、（ｉ）イヌＬ−ＰＢＥを特異的に認識し、そしてこれにハイブリダイズするもの（イヌＬ−ＰＢＥをコードするＤＮＡと他の既知の分子をコードするＤＮＡの配列比較によって決定されるようなもの）が含まれる。イヌＬ−ＰＢＥがコードするポリヌクレオチドにユニークな配列の同定は、公的に利用可能な配列データベースいずれかの使用を通じて、そして／または商業的に入手可能な配列比較プログラムの使用を通じて、推定可能である。全ゲノムにおける選択された配列のユニークさは、ハイブリダイゼーション解析によってさらに検証可能である。望ましい配列を同定した後、制限消化を通じて単離するか、または当該技術分野に周知の多様なポリメラーゼ連鎖反応技術いずれかを用いて増幅することも可能である。アンチセンスポリヌクレオチドは、イヌＬ−ＰＢＥ ｍＲＮＡを発現する細胞によるイヌＬ−ＰＢＥの発現を制御するのに特に適している。
【００７５】
イヌＬ−ＰＢＥ発現調節配列またはイヌＬ−ＰＢＥ ＲＮＡに特異的に結合可能なアンチセンス核酸（好ましくは１０〜２０塩基対オリゴヌクレオチド）を（例えばウイルスベクター、またはリポソームなどのコロイド性分散系によって）細胞に導入する。アンチセンス核酸は、細胞において、イヌＬ−ＰＢＥ標的ヌクレオチド配列に結合し、そして標的配列の転写または翻訳を妨げる。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート・アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による療法的使用に明確に意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、５’端で、ポリ−Ｌ−リジン、トランスフェリン、ポリリジン、またはコレステロール部分によってさらに修飾することも可能である。転写レベルまたは翻訳レベルいずれかでのイヌＬ−ＰＢＥ発現の抑制は、異常なイヌＬ−ＰＢＥ発現に特徴付けられる疾患の細胞モデルまたは動物モデルを生成するために、あるいは療法様式として、有用である。
【００７６】
本明細書に解説されるイヌＬ−ＰＢＥ配列は、天然細胞および動物、並びにイヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされた細胞における、イヌＬ−ＰＢＥ発現を調節する新規転写因子の設計を容易にする。例えば、ジンクフィンガードメインを介してＤＮＡに結合する、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質は、異なる標的配列の認識につながる構造変化を受けやすいことが示されてきている。これらの人工的ジンクフィンガータンパク質は、高い親和性定数および低い解離定数の特異的標的部位を認識し、そして遺伝子発現を調節する遺伝子スイッチとして作用することが可能である。本発明の特定のイヌＬ−ＰＢＥ標的配列を知ることで、構造に基づくモデリングおよびファージディスプレーライブラリーのスクリーニングの組み合わせなどの、既知の方法を用いて、標的配列に特異的なジンクフィンガータンパク質の操作が容易になる［Ｓｅｇａｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２７５８−２７６３；Ｌｉｕら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：５５２５−３０；ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７−６１；Ｃｈｏｏら（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：５２５−３２］。各ジンクフィンガードメインは、通常、３以上の塩基対を認識する。一般的に、１８塩基対の認識配列は、既知のゲノムいずれにおいても、該配列をユニークにするのに十分な長さであるため、ジンクフィンガーの６つのタンデムリピートからなるジンクフィンガータンパク質は、特定の配列に対する特異性を確実にすると予期されるであろう［Ｓｅｇａｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２７５８−２７６３］。イヌＬ−ＰＢＥ配列に基づいて設計した、人工的なジンクフィンガーリピートを、活性化ドメインまたは抑制ドメインに融合させて、イヌＬ−ＰＢＥ発現を促進するかまたは抑制する［Ｌｉｕら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：５５２５−３０］。あるいは、ジンクフィンガーペプチドおよびＴＡＴＡボックス結合因子（ＴＢＰ）間のリンカー領域の長さを多様にしながら、ジンクフィンガードメインをＴＢＰに融合させて、転写活性化因子またはリプレッサーいずれかを生成することも可能である［Ｋｉｍら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：３６１６−３６２０］。こうしたタンパク質、および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、天然細胞、動物およびヒト；および／またはイヌＬ−ＰＢＥコード配列でトランスフェクションされた細胞両方のｉｎ ｖｉｖｏでのイヌＬ−ＰＢＥ発現を調節するのに有用性を有する。転写因子を発現する構築物をトランスフェクションすること（遺伝子療法）によって、または該タンパク質を導入することによって、新規転写因子を標的細胞に搬送することも可能である。ＲＮＡ配列に結合するように、操作ジンクフィンガータンパク質を設計して、アンチセンスまたは触媒ＲＮＡ法の代替法として療法において使用することもまた可能である［ＭｃＣｏｌｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９５２１−６；Ｗｕら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：３４４−３４８］。本発明は、（天然の、または形質転換された）細胞において、イヌＬ−ＰＢＥ発現を調節するのに有用な、本発明の遺伝子配列に基づく転写因子とともに、カスタマイズしたジンクフィンガータンパク質などの設計法を意図し、細胞の遺伝的相補体にはこれらの配列が含まれる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドにコードされる単離イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドも提供する。
【００７７】
本発明のポリペプチド
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に例示されるような本発明のアミノ酸配列は、いくつかの興味深い特徴を有する。
【００７８】
本発明はまた、配列番号２に示すポリペプチドに、少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性および／または相同性を有するポリペプチドも含む。配列番号２のポリペプチドに関するアミノ酸配列「同一性」パーセントは、本明細書において、両配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、イヌＬ−ＰＢＥ配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。配列番号２のポリペプチドに関するアミノ酸配列「相同性」パーセントは、本明細書において、配列を並列させ、そして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、そしてまたいかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なして、イヌＬ−ＰＢＥ配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。１つの側面において、相同性パーセントは、長さ１００アミノ酸中、４つのギャップを導入して並列を最大にすることが可能である際には、２つの配列のうち、より小さい配列の、比較しようとする配列中の同一アミノ酸残基と並列する、アミノ酸残基の割合として計算される［本明細書に援用されるＤａｙｈｏｆｆ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中， Ｖｏｌ．５ ｐ．１２４， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ワシントンＤ．Ｃ．（１９７２）］。
【００７９】
本発明のポリペプチドは、天然細胞供給源から単離されることも可能であるし、または化学的に合成されることも可能であるが、好ましくは、本発明の宿主細胞を伴う組換え法によって産生される。哺乳動物宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を与えるために必要である可能性があるような、こうした翻訳後修飾（例えばグリコシル化、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、脂質化、およびリン酸化）が提供されると予期される。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのグリコシル化型および非グリコシル化型が含まれる。
【００８０】
上述のような真核宿主および原核宿主における過剰発現は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの単離を容易にする。したがって、本発明には、配列番号２に示すような単離イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド、並びに変異体、および保存的アミノ酸置換が含まれ、標識化ポリペプチドおよびタグ化ポリペプチドが含まれる。本発明には、「標識された」イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドが含まれる。用語「標識された」は、本明細書において、酵素（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ルシフェラーゼ）、および放射標識（例えば１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、および３５Ｓ）を含む適切な検出可能基いずれかを、標識しようとする化合物にコンジュゲート化するか、または共有結合することを指す。タンパク質、ペプチド、および抗体を含む、多様な化合物を標識する技術が周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ｂ， １０３（１９７４）；Ｓｙｖａｎｅｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４， ３７６２（１９７３）；ＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３， ５２９（１９７３）を参照されたい。用語、標識された、はまた、以下に論じるように、アミノ酸タグに共有結合したポリペプチドも含むことも可能である。
【００８１】
さらに、本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを、間接的に標識することも可能である。これは、部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）をポリペプチドに共有的に付加し、そしてそれに続いて、付加された部分への特異的結合を示す標識または標識化合物に、付加された部分をカップリングすることを伴う。間接的な標識の可能性には、ペプチドをビオチン化し、それに続いて、上記標識基の１つにカップリングしたアビジンに結合させることが含まれる。別の例は、ポリヒスチジン・タグを含むイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドと、ヒスチジン・タグに特異的な放射標識抗体をインキュベーションすることであろう。抗体がタグにかなりの親和性を有するため、ポリペプチドに対する放射能抗体の結合が、正味の効果である。
【００８２】
本発明はまた、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質の変異体（または類似体）も含む。１つの例において、１以上のアミノ酸残基がイヌＬ−ＰＢＥアミノ酸配列に付加されている、挿入変異体を提供する。挿入は、タンパク質のいずれかの末端または両方の末端に位置することも可能であるし、あるいはイヌＬ−ＰＢＥタンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置することも可能である。いずれかの末端または両方の末端にさらなる残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれることも可能である。挿入変異体には、イヌＬ−ＰＢＥ酸配列、またはその生物学的活性断片に、１以上のアミノ酸残基が付加されているイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドが含まれる。
【００８３】
したがって、挿入変異体はまた、イヌＬ−ＰＢＥのアミノ末端および／またはカルボキシ末端が別のポリペプチドに融合している融合タンパク質を含むことも可能である。多様なタグ・ポリペプチドおよびその対応する抗体が当該技術分野に周知である。例には、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグ・ポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ、並びに該タグに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６（１９８５）］；並びに単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が含まれる。他のタグ・ポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４（１９９２）］；アルファ−チューブリン・エピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７（１９９０）］が含まれる。さらに、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素タンパク質でタグ化することも可能である。
【００８４】
別の側面において、本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチド中の１以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの一方の末端または両方の末端で、あるいはイヌＬ−ＰＢＥアミノ酸配列内の１以上の残基の除去を伴って、達成されることも可能である。したがって、欠失変異体には、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドのすべての断片が含まれる。
【００８５】
本発明はまた、断片が生物学的活性（例えばリガンド結合活性またはＤＮＡ結合活性および／または他の生物学的活性）を維持する、配列番号２に示す配列のポリペプチド断片も示す。配列番号２の少なくとも１０から８５３（この間の１つ１つの整数値を含む）の連続アミノ酸を含む断片が本発明に含まれる。当該技術分野に周知であり、そして日常的に実施される方法いずれかによって、望ましい生物学的特性を有する本発明の断片を調製することも可能である。
【００８６】
本発明にはまた、残基が別の類似の特性を持つ別の残基で置換される、保存的アミノ酸置換によって、参照配列とは異なる、前述のポリペプチドの変異体も含まれる。変異体ポリペプチドには、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって導入されているものが含まれる。アミノ酸は、物理的特性、並びに二次および三次タンパク質構造への寄与にしたがって、分類可能である。保存的置換は、当該技術分野において、１つのアミノ酸に対して、類似の特性を有する別のアミノ酸配列を置換するものと認識される。典型的な保存的置換を、すぐ下の表２に示す（ＷＯ ９７／０９４３３、１０ページ、１９９７年３月１３日公表（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７、９／６／９６出願）から）。
【００８７】
表２
保存的置換Ｉ
【００８８】
【表２】
【００８９】
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表３に示すように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５）， ｐｐ．７１−７７］に記載されるように分類可能である。
【００９０】
表３
保存的置換ＩＩ
【００９１】
【表３】
【００９２】
さらに別の代替物として、典型的な保存的置換をすぐ下の表４に示す。
表４
保存的置換ＩＩＩ
【００９３】
【表４】
【００９４】
一般的に、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドは、主に細胞内に見られることが予期され、細胞内物質は、当業者に知られる標準的技術いずれかを用いて、宿主細胞から抽出可能である。例えば、宿主細胞を溶解して、ホモジナイズ、および／または超音波処理、その後の遠心分離によって、細胞質の内容物を遊離させることも可能である。イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離後、主に上清に見られ、そして以下の方法のいずれかによる限定されない例によって、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを単離することも可能である。
【００９５】
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを部分的にまたは完全に単離することが好ましい状況において、当業者に周知の標準法を用いて、精製を達成することも可能である。こうした方法には、限定されるわけではないが、電気泳動による分離、その後、電気溶出、多様な種類のクロマトグラフィー（免疫アフィニティー、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高圧液体クロマトグラフィーが含まれる。いくつかの場合、完全に精製するため、これらの方法の１より多くを用いることが好ましい可能性もある。
【００９６】
多様な技術を用いて、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの精製を達成することも可能である。ポリペプチドが、そのカルボキシル末端またはアミノ末端いずれかに、ヘキサヒスチジン（イヌＬ−ＰＢＥ／ヘキサＨｉｓ）、またはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）などの他の小ペプチドなどのタグを含有するように合成されている場合、カラムマトリックスがタグに高い親和性を有するか、またはポリペプチドに直接、高い親和性を有する（すなわち、イヌＬ−ＰＢＥを特異的に認識するモノクローナル抗体）アフィニティーカラムに、溶液を通過させることによって、１工程プロセスで本質的に精製可能である。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性でニッケルに結合し、したがってニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ＴＭニッケルカラムなど）をイヌＬ−ＰＢＥ／ポリＨｉｓの精製に用いることも可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， セクション１０．１１．８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク［１９９３］を参照されたい）。
【００９７】
精製を容易にする標識またはタグなしに、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを調製する場合であっても、本発明のイヌＬ−ＰＢＥを免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製することも可能である。これを達成するためには、当該技術分野に周知の手段によって、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を調製しなければならない。本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたはエピトープを所持する断片、類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）または細胞を、動物、好ましくは非ヒトに、日常的プロトコルを用いて投与することによって、本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに対して生成された抗体を得ることも可能である。モノクローナル抗体を調製するには、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する、当該技術分野に知られる技術いずれを使用することも可能である。例には、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら， ７７−９６ページ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ中， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．（１９８５）のものなどの多様な技術が含まれる。
【００９８】
付着するタグなしにイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを調製する場合、そして抗体がまったく入手可能でない場合、他の周知の精製法が使用可能である。こうした方法には、限定なしに、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。いくつかの場合、２以上のこれらの技術を組み合わせて、純度増加を達成することも可能である。代表的な精製スキームを以下に詳述する。
【００９９】
天然イヌＬ−ＰＢＥの阻害特性を示し、そしてより高いレベルで発現される変異体、および恒常的に活性であるイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを提供する変異体は、本発明のアッセイにおいて特に有用であり、そしてまた、異常なイヌＬ−ＰＢＥ発現活性によって特徴付けられる疾患の細胞モデルまたは動物モデルにおいても有用である。
【０１００】
本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を所持するポリペプチドを含むことが意図されることを理解しなければならない。例えば、修飾は、共有性であることも可能であるし、そして例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、および無機部分との化学結合が含まれる。
【０１０１】
本発明にやはり含まれるのは、イヌＬ−ＰＢＥまたはその断片に特異的な抗体（例えばモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体）である。本発明の抗体には、本明細書に完全に援用される、ＷＯ９３／１１２３６、１９９３年６月２０日公表に記載される方法にしたがって産生され、そして同定されたヒト抗体が含まれる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む抗体断片もまた本発明に提供される。用語「特異的」は、本発明の抗体を記載するのに使用する場合、本発明の抗体の可変領域が、もっぱらイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを認識し、そしてこれに結合する（すなわち、イヌＬ−ＰＢＥおよび他の既知のポリペプチド間に局所配列同一性、相同性、または類似性が存在しうるにもかかわらず、結合親和性が測定可能に異なるため、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドをこうした他のポリペプチドから区別可能である）ことを示す。特異的抗体がまた、抗体の可変領域外の配列、そして特に分子の定常領域との相互作用を通じて、他のタンパク質（例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ、またはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用可能であることが理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイが当該技術分野において周知であり、そして日常的に実施される。こうしたアッセイの包括的議論に関しては、Ｈａｒｌｏｗら（監修）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）， 第６章を参照されたい。本発明のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの断片を認識し、そしてこれに結合する抗体もまた含まれるが、該抗体が、何よりもまず、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的であることが条件である。当該技術分野において周知であり、そして日常的に実施される方法いずれかを用いて、本発明の抗体を産生することも可能である。当該技術分野に知られる方法いずれかによって、非ヒト抗体をヒト化することも可能である。１つの方法では、非ヒトＣＤＲをヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入する。次いで、抗体フレームワークにさらなる変化を導入して、アフィニティーまたは免疫原性を調節することも可能である。
【０１０２】
本発明の抗体は、イヌＬ−ＰＢＥを検出するかまたは定量化する診断目的に有用であるとともに、イヌＬ−ＰＢＥを精製するのにも有用である。本明細書に記載する目的いずれかのための、本発明の抗体を含むキットもまた、含まれる。一般的に、本発明のキットにはまた、抗体が免疫特異的である対照抗原も含まれる。
【０１０３】
（実施例３）
イヌＬ−ＰＢＥに対する抗体の生成
標準的技術を使用して、イヌＬ−ＰＢＥ酵素に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成し、そして「ヒト化」変異体を含む、その有用な抗原結合断片または変異体を生成する。こうしたプロトコルは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗら（監修）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；および以下に引用する他の文書に見出すことも可能である。１つの態様において、組換えイヌＬ−ＰＢＥポリペプチド（またはこうしたポリペプチドを含有する細胞もしくは細胞膜）を抗原として用いて、抗体を生成する。別の態様において、イヌＬ−ＰＢＥの免疫原部分に対応するアミノ酸配列（例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多いアミノ酸）を有する１以上のペプチドを抗原として用いる。小さい合成ペプチドを用いて、タンパク質エピトープを模倣するため、親水性、表面配向性で、そして柔軟である配列を選択することが重要である。これは、生理学的溶液中に見られる天然存在タンパク質の大部分は、表面に親水性残基を有し、そして疎水性残基は包埋されているためである。抗体は、一般的に、天然存在タンパク質の表面上のエピトープに結合する。いくつかの既知のエピトープは、高い度合いの移動度を有する。タンパク質のＮ末端およびＣ末端は、荷電基、すなわちＮＨ３＋およびＣＯＯ−を含有するため、一般的に表面配向性である。これらは、末端に位置するため、しばしば、高い度合いの移動度も有する。これらの末端は、３つの特性すべてを所持するため、しばしば、合成候補として選択される。イヌＬ−ＰＢＥの表面残基に対応するペプチド、特に親水性部分が意図される。やはり意図されるのは、イヌＬ−ＰＢＥのアミノ末端およびカルボキシ末端に位置するペプチドである。
【０１０４】
当業者は、既定のタンパク質配列内の各アミノ酸残基に、親水性、表面アクセス可能性、および柔軟性の値を割り当てるために、アルゴリズムが開発されていることを認識する。各残基に抗原性指数を割り当てて、特定の配列内の残基がどの程度抗原性であるか、指標を与えるため、やはりアルゴリズムが開発されている。ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８３ ２０（４）：ｐ．４８３−９， ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８１， ７８（６）ｐ．３８２４−８。しかし、天然抗原に結合するのに有用な抗ペプチド抗体を生成するには、親水性セグメントが広く選択されてきている。しかし抗体とは異なり、Ｔ細胞受容体は、切断およびアンフォールディング後のタンパク質抗原の比較的小さいセグメントを認識する。Ｔ細胞抗原性部位もまた、予測コンピュータモデルによって対処されてきている。Ｍａｒｇａｌｉｔ， Ｈ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８７ １３８（７）：２２１３−２９ページ。
【０１０５】
エピトープの予測に有用なコンピュータプログラムが商業的に入手可能である。例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、英国オックスフォード）およびＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）（ＤＮＡＳｔａｒ Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ５３７１５）。ペプチド抗原を選択し、そして合成したら、抗原をアジュバントと混合するか、またはハプテンに連結して、抗体産生を増加することも可能である。
【０１０６】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
１つの典型的なプロトコルとして、モノクローナル抗体を生成するため、組換えイヌＬ−ＰＢＥまたはその合成断片を用いて、マウスを免疫する（またはポリクローナル抗体の場合は、ウサギなどのより大きい哺乳動物）。抗原性を増加させるため、製造者の推奨にしたがって、ペプチドをキーホール・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｙｍｐｅｔ）ヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）にコンジュゲート化する。最初の注射では、抗原をフロイントの完全アジュバントで乳化し、そして皮下注射する。２〜３週間間隔で、イヌＬ−ＰＢＥ抗原のさらなるアリコットをフロイントの不完全アジュバントで乳化し、そして皮下注射する。最後の追加免疫注射前に、免疫したマウスから血清試料を採取し、そしてウェスタンブロットによってアッセイして、イヌＬ−ＰＢＥと免疫反応する抗体の存在を確認する。免疫した動物由来の血清をポリクローナル抗血清として用いるか、またはイヌＬ−ＰＢＥを認識するポリクローナル抗体を単離するのに用いる。あるいは、モノクローナル抗体を生成するため、マウスを屠殺して、そして脾臓を取り除く。
【０１０７】
モノクローナル抗体を生成するため、脾臓を１０ｍｌ血清不含ＲＰＭＩ１６４０に入れ、そして２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ、カナダ）を補った血清不含ＲＰＭＩ１６４０中で脾臓をすりつぶすことによって、単細胞懸濁物を形成する。細胞懸濁物をろ過し、そして遠心分離によって洗浄し、そして血清不含ＲＰＭＩに再懸濁する。３匹の未処置（ｎａｉｖｅ）Ｂａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を同様の方式で調製し、そしてフィーダー層として使用する。融合前に３日間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、ユタ州ローガン）を補ったＲＰＭＩ中、対数期に維持した、ＮＳ−１骨髄腫細胞もまた、遠心分離し、そして洗浄する。
【０１０８】
ハイブリドーマ融合体を産生するため、免疫したマウス由来の脾臓細胞をＮＳ−１細胞と合わせて、そして遠心分離し、そして上清を吸引する。試験管を軽く叩くことによって、細胞ペレットを外し、そして２ｍｌの３７℃ ＰＥＧ１５００（７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０中５０％）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を攪拌しながらペレットに入れ、その後、血清不含ＲＰＭＩを添加する。その後、細胞を遠心分離し、そして１５％ＦＢＳ、１００μＭヒポキサンチンナトリウム、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌ ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５ｘ１０６胸腺細胞／ｍｌを含有するＲＰＭＩに再懸濁し、そして１０のＣｏｒｎｉｎｇ平底９６ウェル組織培養プレートに蒔く（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）。
【０１０９】
融合後、第２日、第４日および第６日、１００μｌの培地を融合プレートのウェルから取り除き、そして新鮮な培地と交換する。第８日、イヌＬ−ＰＢＥに結合するマウスＩｇＧの存在に関して試験するＥＬＩＳＡによって融合体をスクリーニングする。抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体を産生するモノクローナル培養物が得られるまで、希釈によって、選択された融合体ウェルをさらにクローニングする。
【０１１０】
ファージディスプレー由来のイヌＬ−ＰＢＥに向けられる抗体
すべて本明細書に援用される、Ａｕｊａｍｅら， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ８（４）：１５５−１６８（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， ＴＩＢＴＥＣＨ， １５：６２−７０（１９９７）；およびＲａｄｅｒら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：５０３−５０８（１９９７）に記載されるものなどのファージディスプレー技術によって、イヌＬ−ＰＢＥ抗体を生成する。例えば、Ｆａｂ断片の形の、または連結された一本鎖Ｆｖ断片の形の抗体可変領域を、繊維状ファージの小コートタンパク質ｐＩＩＩのアミノ末端に融合させる。融合タンパク質の発現および成熟ファージコートへのその取り込みによって、表面上に抗体を提示し、そして抗体をコードする遺伝物質を含有する、ファージ粒子が生じる。こうした構築物を含むファージライブラリーを細菌中で発現させ、そして抗原−プローブとして、標識イヌＬ−ＰＢＥまたは固定イヌＬ−ＰＢＥを用いて、イヌＬ−ＰＢＥに特異的なファージ抗体をパニング（スクリーニング）する。
【０１１１】
トランスジェニックマウス由来のイヌＬ−ＰＢＥに向けられる抗体
ＢｒｕｇｇｅｍａｎｎおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １７（８）：３９１−９７（１９９６）、並びにＢｒｕｇｇｅｍａｎｎおよびＴａｕｓｓｉｇ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：４５５−５８（１９９７）に本質的に記載されるように、トランスジェニックマウスにおいて、イヌＬ−ＰＢＥ抗体を生成する。生殖系列配置中、ヒトＶ遺伝子セグメントを所持し、そしてそのリンパ組織でこれらの導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを、慣用的免疫プロトコルを用いて、イヌＬ−ＰＢＥ組成物で免疫する。慣用的プロトコルを用い、免疫したマウス由来のＢ細胞を用いてハイブリドーマを生成し、そしてスクリーニングして、抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体を分泌するハイブリドーマを同定する（例えば上述のとおり）。
【０１１２】
本発明のアッセイ
本発明は、イヌにおいて、試験剤の影響を検出するかまたは診断する方法を提供する。既定の時間経過に渡って、好ましくは亜慢性用量（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ ｄｏｓｅ）の、１以上の既知のまたは推定上の毒性化合物で、イヌを処置する。次いで、Ｌ−ＰＢＥを発現する組織試料を得る。こうした処置した生物学的試料から得たイヌＬ−ＰＢＥ遺伝子発現のレベルを、未処置の生物学的試料から得た遺伝子発現パターンと比較して、化合物に反応して、イヌＬ−ＰＢＥを上方制御するかまたは下方制御する化合物を同定することも可能である。試料は、試料核酸分子またはタンパク質を含み、そしてＬ−ＰＢＥを発現する体性組織いずれか（脳、腎臓、肝臓など）、培養細胞、生検、または他の組織調製物から得た、いかなる試料であることも可能である。
【０１１３】
発現レベルを、産生されるメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質のレベルいずれかまたは両方で評価することも可能である。
【０１１４】
核酸に基づくアッセイ
イヌＬ−ＰＢＥを生じる核酸は、溶液中または固体支持体上にあることも可能である。いくつかの態様において、これらをマイクロアレイ中の単独のアレイ要素として、または他のアレイ要素分子と組み合わせたアレイ要素として、使用することも可能である。こうしたマイクロアレイは、毒性であることが知られるかまたは推定される試験剤と関連して、ハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現パターンを検出し、そして性質決定するのに特に有用である。しかし、アレイは、膜に基づくハイブリダイゼーション系、または溶液ハイブリダイゼーションアッセイであっても、または実際、特異的ハイブリダイゼーションを決定可能な方法いずれによっても置き換えることも可能であることが認識される。次いで、こうした遺伝子発現パターンを比較のために用いて、やはり毒性学的反応を誘発する他の化合物を同定することも可能である。
【０１１５】
核酸に基づく方法は、一般的に、試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの単離、およびそれに続く、配列番号１由来の特異的プライマーを用いたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅を必要とする。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当業者に周知のいくつかの方法いずれにしたがって、試料から単離することも可能である。例えば、核酸精製法が、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， パートＩ． Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク州ニューヨークに記載される。１つの好ましい態様において、ＴＲＩＺＯＬ総ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて総ＲＮＡを単離し、そしてオリゴｄ（Ｔ）カラムクロマトグラフィーまたはガラスビーズを用いて、ｍＲＮＡを単離する。試料核酸分子を増幅する場合、試料核酸分子を増幅し、そして低存在量転写物を含めて、元来の試料の相対存在量を維持することが望ましい。ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで増幅することも可能である（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ米国特許第５，５１４，５４５号を参照されたい）。
【０１１６】
増幅法および標識法が、試料中の核酸分子の真の分布を変化させなかったことを確実にするため、試料内に対照を含むこともまた、好適である。この目的のため、相補アレイ化核酸分子へのハイブリダイゼーションに際して検出可能であることがあらかじめ決定された、ある量の対照核酸分子が試料に混入され（ｓｐｉｋｅｄ）、そして核酸分子の組成物には、対照アレイ化核酸分子と特異的にハイブリダイズする参照核酸分子が含まれる。ハイブリダイゼーションおよびプロセシング後、得られるハイブリダイゼーションシグナルは、試料に添加された対照アレイ化核酸分子の量を正確に反映しなければならない。
【０１１７】
ハイブリダイゼーション前に、試料核酸分子を断片にすることが望ましい可能性もある。断片化は、二次構造、および試料中の他の試料核酸分子または非相補的核酸分子への交差ハイブリダイゼーションを最小限にすることによって、ハイブリダイゼーションを改善する。断片化は、機械的手段または化学的手段によって実行可能である。
【０１１８】
標識
試料核酸分子を１以上の標識部分で標識して、ハイブリダイズしたアレイ化／試料核酸分子複合体の検出を可能にすることも可能である。標識部分は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、生体電子工学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、視覚的手段または化学的手段によって検出することも可能な組成物を含むことも可能である。標識部分には、（３２）Ｐ、（３３）Ｐまたは（３５）Ｓなどの放射性同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素などの分光マーカー、磁気標識、連結酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子伝達供与体および受容体等が含まれる。好ましい蛍光マーカーには、Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション
配列番号１およびその断片の核酸分子配列を、多様な目的のため、多様なハイブリダイゼーション技術で用いることも可能である。配列番号１から、ハイブリダイゼーションプローブを設計するか、または得ることも可能である。こうしたプローブを、非常に特異的な領域から、または保存されたモチーフから作成し、そしてＬ−ＰＢＥメッセージ、アレル変異体、または関連配列を定量化するプロトコルで用いることも可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることも可能であり、そして配列番号１の配列から、または哺乳動物遺伝子のプロモーター、エンハンサー、およびイントロンを含むゲノム配列から得ることも可能である。標識ヌクレオチドの存在下、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、またはＰＣＲ増幅を用いて、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを産生することも可能である。核酸配列を含有するベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼおよび標識核酸分子を添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡプローブを産生することも可能である。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって提供されるものなどの商業的に入手可能なキットを用いて、これらの方法を行うことも可能である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブのＧ＋Ｃ含量、塩濃度、および温度によって、決定される。特に、塩濃度を減少させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって、ストリンジェンシーを増加させることも可能である。膜に基づく、いくつかのハイブリダイゼーションに用いる溶液においては、ホルムアミドなどの有機溶媒を添加すると、反応がより低い温度で起こることが可能になる。１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む５ｘＳＳＣ、６０℃などの緩衝液を用いて、低ストリンジェンシーでハイブリダイゼーションを行って、いくつかのミスマッチを含有するヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にすることも可能である。続いて、０．１％ＳＤＳを含む０．２ｘＳＳＣなどの緩衝液を、４５℃（中程度のストリンジェンシー）または６８℃（高ストリンジェンシー）いずれかで用いて、より高いストリンジェンシーで洗浄を行う。高ストリンジェンシーでは、核酸配列がほぼ完全に相補的である箇所でのみ、ハイブリダイゼーション複合体が安定であり続けるであろう。膜に基づく、いくつかのハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％または最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げることも可能であるし、そしてザルコシルまたはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの他の界面活性剤およびサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング剤の使用によって、バックグラウンドシグナルを減少させることも可能である。ハイブリダイゼーションのための構成要素および条件の選択は、当業者に周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ（上記）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビューに概説されている。
【０１２０】
典型的な高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション、そして０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃３０分間２回の洗浄。Ａｕｓｕｂｅｌら（監修）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）， ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０に記載されるように、温度および緩衝剤、または塩濃度の変動を通じて、同等のストリンジェンシーの条件を達成可能であることが、当該技術分野において理解される。ハイブリダイゼーション条件の修飾を、経験的に決定することも可能であるし、またはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対形成の割合に基づいて、正確に計算することも可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）， ｐｐ．９．４７〜９．５１に記載されるように、ハイブリダイゼーション条件を計算することも可能である。
【０１２１】
試料に既知の量で添加した特異性対照試料核酸分子に対する、特異性対照核酸分子のハイブリダイゼーションを比較することによって、ハイブリダイゼーション特異性を評価することも可能である。特異性対照アレイ化核酸分子は、対応するアレイ化核酸分子と比較して、１以上の配列ミスマッチを有することも可能である。この方式で、相補的アレイ化核酸分子のみが試料核酸分子にハイブリダイズするのか、またはミスマッチハイブリッド二重鎖が形成されるのかを決定することも可能である。
【０１２２】
絶対的または示差的ハイブリダイゼーション形式で、ハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。絶対的ハイブリダイゼーション形式では、１つの試料由来の核酸分子を、マイクロアレイ形式で分子にハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイゼーション複合体形成後に検出されるシグナルが、試料中の核酸分子レベルに相関する。示差的ハイブリダイゼーション形式では、２つの生物学的試料中の遺伝子セットの示差的発現を解析する。示差的ハイブリダイゼーションでは、両方の生物学的試料から核酸分子を調製し、そして異なる標識部分で標識する。２つの標識核酸分子の混合物を、マイクロアレイに添加する。次いで、２つの異なる標識からの発光を個々に検出可能である条件下で、マイクロアレイを調べる。両方の生物学的試料由来の実質的に同等の数の核酸分子にハイブリダイズする、マイクロアレイ中の分子は、区別可能な組み合わされた蛍光を生じる（ＳｈａｌｏｎらＰＣＴ公報ＷＯ９５／３５５０５）。好ましい態様において、標識は、Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォアなどの、区別可能な発光スペクトルを持つ蛍光マーカーである。
【０１２３】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズしていない核酸分子を取り除き、そしてハイブリダイズ可能なアレイ要素および核酸分子間の複合体形成を検出する。複合体形成を検出する方法は当業者に周知である。好ましい態様において、核酸分子を蛍光標識で標識し、そして複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定を蛍光顕微鏡、好ましくは共焦点蛍光顕微鏡によって達成する。
【０１２４】
示差的ハイブリダイゼーション実験において、２以上の異なる生物学的試料由来の核酸分子を、異なる発光波長を持つ２以上の異なる蛍光標識で標識する。特定の波長を検出する異なる光電子増倍管セットを用いて、蛍光シグナルを別個に検出する。２以上の試料中の核酸分子の相対的存在量／発現レベルを得る。
【０１２５】
典型的には、同様の試験条件下で、１より多いマイクロアレイを用いる場合、マイクロアレイ蛍光強度を規準化して、ハイブリダイゼーション強度の変動を考慮に入れることも可能である。好ましい態様において、各マイクロアレイ上に含有される内部規準化対照由来の強度を用いて、個々のアレイ化試料核酸分子複合体ハイブリダイゼーション強度を規準化する。
【０１２６】
ポリペプチドに基づくアッセイ
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを検出し、そして定量化するための方法および試薬を提供する。これらの方法には、電気泳動、質量分析、クロマトグラフィー法などの解析的生化学的方法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどの多様な免疫学的方法、アフィニティー捕捉質量分析、生物学的活性、および以下に記載し、そして本開示を再検討した際に当業者には明らかである他のアッセイが含まれる。
【０１２７】
イムノアッセイ
本発明はまた、１以上の抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体試薬を使用して、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを検出する方法（すなわちイムノアッセイ）も提供する。本明細書において、イムノアッセイは、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する抗体（本明細書に広く定義されるとおりであり、そして具体的には断片、キメラおよび他の結合剤が含まれる）を利用するアッセイである。
【０１２８】
本発明の実施に適した、いくつかのよく確立された免疫学的結合アッセイ形式が知られる（例えば米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照されたい）。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｓａｉ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク（１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７版， Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ監修（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記［例えば第１４章］、並びにＡｕｓｕｂｅｌら、上記［例えば第１１章］を参照されたい。典型的には、免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、解析物に特異的に結合し、そしてしばしば解析物を固相に固定する、「捕捉剤」を利用する。１つの態様において、捕捉剤は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドまたは下位配列に特異的に結合する部分、例えば抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体である。
【０１２９】
通常、アッセイしようとするイヌＬ−ＰＢＥ遺伝子産物を直接検出するか、または検出可能標識を用いて、間接的に検出する。アッセイで用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイに用いる単数または複数の抗体の特異的結合に有意に干渉しない限り、通常、本発明の決定的な側面ではない。標識は、捕捉剤（例えば抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体）に共有的に付着していることも可能であるし、またはイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的に結合する別の抗体などの第三の部分に付着していることも可能である。
【０１３０】
本発明は、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドを検出する競合的および非競合的イムノアッセイの方法および試薬を提供する。非競合的イムノアッセイは、捕捉された解析物（この場合、イヌＬ−ＰＢＥ）の量を直接測定するアッセイである。１つのこうしたアッセイは、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質上の２つの干渉しないエピトープに反応性であるモノクローナル抗体を利用する、モノクローナル抗体に基づく２部位イムノアッセイである。背景情報に関しては、例えばＭａｄｄｏｘら， １９８３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １５８：１２１１を参照されたい。１つの「サンドイッチ」アッセイにおいて、捕捉剤（例えば抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体）を固体支持体に直接結合させて、固定する。次いで、これらの固定された抗体が、試験試料中に存在するいかなるイヌＬ−ＰＢＥタンパク質も捕捉する。次いで、こうして固定されたイヌＬ−ＰＢＥを、すなわち標識を所持する第二のイヌＬ−ＰＢＥ抗体に結合させることによって、標識することも可能である。あるいは、第二のイヌＬ−ＰＢＥ抗体は標識を欠いているが、第二の抗体が得られた種の抗体に特異的な、標識された第三の抗体に結合されていることも可能である。あるいは、第二の抗体をビオチンなどの検出可能部分で修飾し、これに酵素標識ストレプトアビジンなどの、第三の標識分子が特異的に結合することも可能である。
【０１３１】
競合的アッセイにおいて、試料中に存在するイヌＬ−ＰＢＥタンパク質によって、捕捉剤（例えばイヌＬ−ＰＢＥ抗体）から置換された（または競合により離れた（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ａｗａｙ））、添加された（外因性）イヌＬ−ＰＢＥの量を測定することによって、試料に存在するイヌＬ−ＰＢＥタンパク質の量を間接的に測定する。ハプテン阻害アッセイは、競合アッセイの別の例である。このアッセイにおいて、イヌＬ−ＰＢＥタンパク質を固体支持体上に固定する。既知の量のイヌＬ−ＰＢＥ抗体を試料に添加し、そして次いで、試料を固定イヌＬ−ＰＢＥタンパク質と接触させる。この場合、固定イヌＬ−ＰＢＥタンパク質に結合した抗イヌＬ−ＰＢＥ抗体の量は、試料に存在するイヌＬ−ＰＢＥタンパク質の量に反比例する。抗体の固定された割合または溶液中に残存する抗体の割合いずれかを検出することによって、固定された抗体の量を検出することも可能である。この側面において、抗体が標識されている場合、検出は直接であることも可能であるし、または上述のように抗体に特異的に結合する分子に標識が結合している場合、間接的であることも可能である。
【０１３２】
抗体に基づく他のアッセイ形式
本発明はまた、イムノブロット（ウェスタンブロット）形式を用いることによって、試料中のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの存在を検出し、そして定量化するための試薬および方法も提供する。別のイムノアッセイは、いわゆる「側方流動クロマトグラフィー」である。側方流動クロマトグラフィーの非競合型では、試料は、例えばキャピラリー作動によって、支持体を横切って移動し、そして可動標識抗体と出会い、該抗体が解析物に結合してコンジュゲートを形成する。次いで、コンジュゲートが支持体を横切り、そして固体された第二の抗体と出会い、この抗体が解析物と結合する。したがって、標識抗体を検出することによって、固定された解析物が検出される。側方流動クロマトグラフィーの競合型では、解析物の標識型が、キャリアーを横切って移動し、そして固定された抗体との結合に関して、非標識解析物と競合する。試料中により多量の解析物があれば、標識解析物による結合はより少なくなり、そしてしたがって、シグナルはより弱くなる。例えばＭａｙら、米国特許第５，６２２，８７１号およびＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ、米国特許第５，５９１，６４５号を参照されたい。
【０１３３】
アッセイに応じて、抗原、標的抗体、または抗カテプシンＳ抗体を含む、多様な構成要素を、固体表面または支持体（例えば担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、膜、またはろ紙）に結合させることも可能である。多様な固体表面に生体分子を固定する多くの方法が当該技術分野に知られる。例えば、固体表面は、膜（例えばニトロセルロース）、マイクロタイタープレート（例えばＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、ディップスティック（例えばガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス等）、微量遠心分離試験管、またはガラスもしくはプラスチックビーズであることも可能である。望ましい構成要素を共有結合させることも可能であるし、または非特異的結合を介して、非共有的に付着させることも可能である。
【０１３４】
天然および合成両方の、非常に多様な有機ポリマーおよび無機ポリマーを、固体表面の材料として使用することも可能である。実例となるポリマーには、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン類、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース等が含まれる。使用可能な他の物質には、紙、ガラス、セラミックス、金属、メタロイド、半導体物質、セメント等が含まれる。さらに、タンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドなどの、ゲルを形成する物質もまた、使用可能である。いくつかの水性相を形成するポリマー、例えばデキストラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤、例えばリン脂質、長鎖（１２〜２４の炭素原子）アルキルアンモニウム塩等もまた適切である。固体表面が多孔である場合、系の性質に応じて、多様な孔サイズを使用することも可能である。
【０１３５】
質量分析
分子の質量（ｍａｓｓ）は、しばしば、分子の同定因子として使用することも可能である。したがって、質量分析法を用いて、タンパク質解析物を同定することも可能である。質量分析装置は、イオン化解析物が飛行管を通過して、そしてイオン検出装置に検出されるのに必要な時間を測定することによって、質量を測定可能である。タンパク質のための質量分析の１つの方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（「ＭＡＬＤＩ」）である。ＭＡＬＤＩにおいて、レーザーの波長のエネルギーを吸収するエネルギー吸収マトリックス物質と解析物を混合し、そしてプローブ表面に置く。マトリックスをレーザーで打つと、解析物がプローブ表面から脱離し、イオン化され、そしてイオン検出装置に検出される。例えばＨｉｌｌｅｎｋａｍｐら、米国特許第５，１１８，９３７号を参照されたい。
【０１３６】
タンパク質のための質量分析の他の方法が、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ、米国特許第５，７１９，０６０号に記載される。１つのこうした方法は、アフィニティー捕捉のための増進表面（「ＳＥＡＣ」）と称され、この方法において、解析物に特異的にまたは非特異的に結合する固相アフィニティー試薬、例えば抗体または金属イオンを用いて、解析物を試料中の他の物質から分離する。次いで、捕捉された解析物を、例えばレーザーエネルギーによって固相から脱離し、イオン化し、そして検出装置によって検出する。
【０１３７】
本発明のさらなる特徴および変型は、詳細な説明を含めた本出願全体から、当業者に明らかであろうし、そしてこうした特徴はすべて、本発明の側面と意図される。同様に、本明細書に記載する本発明の特徴を再度組み合わせて、特徴の組み合わせが、本発明の側面または態様として、具体的に上述されているかいないかにかかわりなく、やはり本発明の側面であることも意図されるさらなる態様にすることも可能である。また、本発明に決定的であると本明細書に記載した限定のみが、限定として見なされるべきであり；決定的であると本明細書に記載されていない、限定されない本発明の変型は、本発明の側面であると意図される。
【０１３８】
前述の説明および実施例に特に記載されるものとは別の方式で、本発明を実施可能であることが明らかであろう。
上記の解説を考慮すると、本発明の多くの修飾および変型が可能であり、そしてしたがって、これらは本発明の側面内にある。
【０１３９】
本明細書に引用したすべての刊行物のすべての開示は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ】イヌ（配列番号１）、ヒト（配列番号１１）、マウス（配列番号１３）およびラット（配列番号１５）Ｌ−ＰＢＥポリペプチド配列の並列。
【図１Ｂ】イヌ（配列番号１）、ヒト（配列番号１１）、マウス（配列番号１３）およびラット（配列番号１５）Ｌ−ＰＢＥポリペプチド配列の並列。
【図２Ａ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【図２Ｂ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【図２Ｃ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【図２Ｄ】イヌ（配列番号２）、ヒト（配列番号１２）、マウス（配列番号１４）およびラット（配列番号１６）Ｌ−ＰＢＥポリヌクレオチド配列の並列。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が配列番号２を含む単離イヌ（ｃａｎｉｎｅ）Ｌ−ＰＢＥポリペプチド、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープを含む該ポリペプチドの断片。
【請求項２】
請求項１のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項３】
配列番号１、または配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むその断片、もしくはその相補的な非コード鎖を含む、単離ポリヌクレオチドであって、前記断片が、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５に示す配列のいかなる部分とも、そしてその相補鎖とも、少なくとも１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むという規定付きの前記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
核酸が一本鎖である、請求項３の核酸。
【請求項５】
配列番号１の相補体の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含む、請求項３の単離核酸。
【請求項６】
固体支持体に付着した核酸分子のアレイであって、請求項３のポリヌクレオチドを含む前記アレイ。
【請求項７】
配列番号２に少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、そしてＬ−ＰＢＥ活性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２のポリペプチドをコードする、請求項７の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
イヌ由来の試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドの量を決定する方法であって：
配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含む核酸分子と試料を、１以上の特異的ハイブリダイゼーション複合体形成のための条件下で接触させる、ここで該断片は、配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである
ことを含む、前記方法。
【請求項１０】
イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：
ａ）試験剤で処置したイヌ由来の核酸を含有する試料を提供し；そして
ｂ）前記試料中の配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含むポリヌクレオチドの量を決定する、ここで未処置のイヌ由来のポリヌクレオチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリヌクレオチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
決定がハイブリダイゼーションを介して達成される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ハイブリダイゼーションが：
ａ）配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含む核酸分子と試料を、１以上の特異的ハイブリダイゼーション複合体形成のための条件下で接触させ、ここで該断片は、配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである；そして
ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する、ここで未処置のイヌ由来の核酸分子から形成されるハイブリダイゼーション複合体の量と比較した際の、処置したイヌ由来の核酸分子から形成されるハイブリダイゼーション複合体の量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる
ことによって達成される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの量を決定する方法であって：
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：
ａ）試験剤で処置したイヌ由来の試料を提供し；そして
ｂ）前記試料中の配列番号２を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープを含む該ポリペプチドの断片の量を決定する、ここで未処置のイヌ由来のポリペプチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリペプチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
決定が、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させることによって達成される、請求項１４の方法。
【請求項１】
アミノ酸配列が配列番号２を含む単離イヌ（ｃａｎｉｎｅ）Ｌ−ＰＢＥポリペプチド、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープを含む該ポリペプチドの断片。
【請求項２】
請求項１のイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項３】
配列番号１、または配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むその断片、もしくはその相補的な非コード鎖を含む、単離ポリヌクレオチドであって、前記断片が、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５に示す配列のいかなる部分とも、そしてその相補鎖とも、少なくとも１ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含むという規定付きの前記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
核酸が一本鎖である、請求項３の核酸。
【請求項５】
配列番号１の相補体の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含む、請求項３の単離核酸。
【請求項６】
固体支持体に付着した核酸分子のアレイであって、請求項３のポリヌクレオチドを含む前記アレイ。
【請求項７】
配列番号２に少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、そしてＬ−ＰＢＥ活性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２のポリペプチドをコードする、請求項７の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
イヌ由来の試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリヌクレオチドの量を決定する方法であって：
配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含む核酸分子と試料を、１以上の特異的ハイブリダイゼーション複合体形成のための条件下で接触させる、ここで該断片は、配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである
ことを含む、前記方法。
【請求項１０】
イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：
ａ）試験剤で処置したイヌ由来の核酸を含有する試料を提供し；そして
ｂ）前記試料中の配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含むポリヌクレオチドの量を決定する、ここで未処置のイヌ由来のポリヌクレオチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリヌクレオチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
決定がハイブリダイゼーションを介して達成される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ハイブリダイゼーションが：
ａ）配列番号１若しくはその断片、又はそれらの相補体を含む核酸分子と試料を、１以上の特異的ハイブリダイゼーション複合体形成のための条件下で接触させ、ここで該断片は、配列番号１の少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである；そして
ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する、ここで未処置のイヌ由来の核酸分子から形成されるハイブリダイゼーション複合体の量と比較した際の、処置したイヌ由来の核酸分子から形成されるハイブリダイゼーション複合体の量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる
ことによって達成される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
試料内に存在するイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドの量を決定する方法であって：
イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
イヌにおいて、試験剤に対する代謝反応を測定する方法であって：
ａ）試験剤で処置したイヌ由来の試料を提供し；そして
ｂ）前記試料中の配列番号２を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープを含む該ポリペプチドの断片の量を決定する、ここで未処置のイヌ由来のポリペプチドの量と比較した際の、処置したイヌ由来のポリペプチドの量の変化が、試験剤に対する代謝反応の指標となる
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
決定が、イヌＬ−ＰＢＥポリペプチドとイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに特異的な抗体を、抗体がイヌＬ−ＰＢＥポリペプチドに結合する条件下で接触させることによって達成される、請求項１４の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【公表番号】特表２００６−５１２０７６（Ｐ２００６−５１２０７６Ａ）
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６３５１８（Ｐ２００４−５６３５１８）
【出願日】平成１５年１２月１９日（２００３．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００６２８０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９３８
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０４３９６３７９）ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー (130)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月１９日（２００３．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００６２８０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９３８
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０４３９６３７９）ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー (130)
【Ｆターム（参考）】
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