ウイルス感染症の予防・治療
【課題】急性及び慢性のウイルス感染症、あるいは癌の新規免疫療法およびそのための薬剤の提供。
【解決手段】生体にとって望ましくない異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有してなる、該異常細胞の除去剤、急性及び慢性ウイルス感染症、癌などの予防・治療剤。上記細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを含む異常細胞の除去方法。
【解決手段】生体にとって望ましくない異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有してなる、該異常細胞の除去剤、急性及び慢性ウイルス感染症、癌などの予防・治療剤。上記細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを含む異常細胞の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含む新規な異常細胞の除去剤、このような細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを含む異常細胞の除去方法に関する。より具体的には、本発明は、ウイルス感染細胞や癌細胞等の異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を利用する、急性及び慢性のウイルス感染症や癌の予防・治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染に対する宿主防御は、２つの異なる免疫応答のセット（自然免疫及び獲得免疫）によって媒介される。自然免疫系の最初の防御ラインである樹状細胞（ＤＣ）は、パターン認識レセプターであるＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を使用し、このレセプターは、種々の病原体成分（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び多糖を含む）と相互作用する。ＤＣはサイトカインを迅速に分泌して、他の自然免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び獲得免疫細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞）の応答を誘発する。両方の免疫系の成分が、病原体からの宿主の有効な保護のために必要である。自然免疫の欠如は病原体の迅速な複製を導き、感染後数日以内に死をもたらす。対照的に、獲得免疫系の非存在下では病原体は獲得免疫監視から逃れ、ヒト免疫不全患者において報告されているように、慢性及び再発の感染に対して宿主を感受性にする。
【０００３】
持続感染を引き起こすウイルスの多くは、細胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識を回避するために宿主細胞でのＭＨＣクラスＩ抗原の発現を抑制する。しかし、ＮＫ細胞はＭＨＣクラスＩ抗原を認識する抑制レセプターを用いて該抗原を発現している細胞を自己とみなし、非発現細胞を非自己と認識して傷害するので、そのようなウイルス感染細胞はＮＫ細胞の抑制レセプターに認識されなくなり、該細胞により傷害される。ＮＫ細胞はまた、細胞外領域において抑制レセプターと非常に高い相同性を示すものの、該レセプターと相反する機能を有する活性化レセプターを有している。活性化レセプターは、ウイルス感染細胞上で特異的に発現するリガンドを認識して非自己とみなし、ＮＫ細胞のキラー活性を促進する。しかしながら、多くの活性化レセプターのリガンドは不明であり、その機能は明らかになっていないものが多い。
【０００４】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、免疫無防備宿主（例えば臓器移植患者）における主要な日和見感染病原体である。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）感染は、宿主−病原体相互作用及びその免疫を研究するための有用なモデルを提供する（非特許文献１、２）。最近、ＭＣＭＶ感染細胞の認識に関わるＮＫ細胞レセプター及びそのリガンドのペアとして、ＭＣＭＶ耐性マウス株において見出されたＬｙ４９Ｈ活性化レセプター及びＭＣＭＶゲノムにコードされるＭＨＣクラスＩ様ホールドタンパク質ｍ１５７が同定された（非特許文献３、４）。二次構造をもとにした立体構造上の相同性検索によると、ｍ１５７はＣＤ１やＨ−２Ｍ３等の非古典的ＭＨＣクラスＩ分子と相同性を示す。
【０００５】
ＮＫ細胞の活性化は活性化レセプターの状態のみによって決定されるのではなく、抑制レセプターのシグナルと活性化レセプターのシグナルとの間のバランスによって決定され、このことは、「missing-self」仮説によって支持される（非特許文献５）。興味深いことに、ｍ１５７は、ＭＣＭＶ感受性マウス株１２９／Ｊにおいて、抑制レセプターであるＬｙ４９Ｉ１２９に結合することが示されている（非特許文献３）。一方、ＭＣＭＶ耐性のＣ５７ＢＬ／６マウスのＬｙ４９ＩＢ６は宿主クラスＩ分子を認識するにもかかわらず、ｍ１５７を認識しない。
【０００６】
Ｌｙ４９Ｉは、マウスの原型的な抑制レセプターであるＬｙ４９Ａと同様に、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs(ITIM)）を含む。対照的に、Ｌｙ４９Ｈは、その細胞質ドメイン中にシグナル伝達モチーフを有さない。その代わりに、Ｌｙ４９Ｈは、その表面発現及びＬｙ４９Ｈ膜貫通ドメイン中の正に荷電した残基を介して、免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（immuno-receptor tyrosine-based activation motifs(ITAM)）を含むシグナル伝達アダプター分子ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰ（非特許文献６、７）と会合する。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体中のＣＤ３ζと同様に、ＤＡＰ１２は、リガンド認識に際し、Ｓｙｋ又はＺａｐ７０のようなＳｙｋキナーゼファミリーのメンバーをそのＩＴＡＭへとリクルートする。
【０００７】
リガンド同定のために、マウスＴ細胞株において発現させた、オーファンＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインとＣＤ３ζの細胞質ドメインとのキメラレセプターのレパートリーが以前に使用されている（非特許文献８、９）。この系によれば、レセプターの本来の性質（抑制であるか活性化であるか）にかかわらず、リガンドを認識するとＮＦＡＴ結合プロモーターの制御下でｌａｃＺ発現を誘導するので、リガンド発現細胞を検出することができる（非特許文献９）。
【非特許文献１】Tortorella, D., B.E. Gewurz, M.H. Furman, D.J. Schust, and H.L. Ploegh. 2000. Viral subversion of the immune system. Annu Rev Immunol 18:861-926.
【非特許文献２】Webb, J.R., S.H. Lee, and S.M. Vidal. 2002. Genetic control of innate immune responses against cytomegalovirus: MCMV meets its match. Genes Immun 3:250-262.
【非特許文献３】Arase, H., and L.L. Lanier. 2004. Specific recognition of virus-infected cells by paired NK receptors. Rev Med Virol 14:83-93.
【非特許文献４】Smith, H.R., J.W. Heusel, I.K. Mehta, S. Kim, B.G. Dorner, O.V. Naidenko, K. Iizuka, H. Furukawa, D.L. Beckman, J.T. Pingel, A.A. Scalzo, D.H. Fremont, and W.M. Yokoyama. 2002. Recognition of a virus-encoded ligand by a natural killer cell activation receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 99:8826-8831.
【非特許文献５】Lanier, L.L. 2005. NK cell recognition. Annu Rev Immunol 23:225-274.
【非特許文献６】Bakker, A.B., R.M. Hoek, A. Cerwenka, B. Blom, L. Lucian, T. McNeil, R. Murray, L.H. Phillips, J.D. Sedgwick, and L.L. Lanier. 2000. DAP12-deficient mice fail to develop autoimmunity due to impaired antigen priming. Immunity 13:345-353.
【非特許文献７】Tomasello, E., P.-O. Desmoulins, K. Chemin, S. Guia, H. Cremer, J. Ortaldo, P. Love, D. Kaiserlian, and E. Vivier. 2000. Combined natural killer cell and dendritic cell functional deficiency in KARAP/DAP12 loss-of-function mutant mice. Immunity 13:355-364.
【非特許文献８】Furukawa, H., K. Iizuka, J. Poursine-Laurent, N. Shastri, and W.M. Yokoyama. 2002. A ligand for the murine NK activation receptor Ly-49D: activation of tolerized NK cells from beta(2)-microglobulin-deficient mice. Journal of Immunology 169:126-136.
【非特許文献９】Iizuka, K., O.V. Naidenko, B.F. Plougastel, D.H. Fremont, and W.M. Yokoyama. 2003. Genetically linked C-type lectin-related ligands for the NKRP1 family of natural killer cell receptors. Nat Immunol 4:801-807.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、急性期のみならず慢性のウイルス感染症の予防・治療にも有用な新規免疫療法およびそのための薬剤を提供することである。また、本発明の別の目的は、癌の新規免疫療法およびそのための薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ウイルス感染細胞や癌細胞等の異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現させた細胞傷害性Ｔ細胞を用いることにより、標的異常細胞上の該リガンドを認識して当該細胞を殺傷し得ることを見出した。すなわち、本発明者は、Ｌｙ４９Ｈレセプターの細胞外ドメインとＣＤ３ζの細胞質ドメインとを含むキメラレセプターをコードする核酸を細胞傷害性Ｔ細胞中に導入し、これをＭＣＭＶ感受性マウス株に投与したところ、該マウスが急性相のＭＣＭＶ感染による死亡から逃れ、さらに獲得免疫による長期保護が確立されたことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである：
［１］ 生体にとって望ましくない異常細胞の除去剤であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有してなる剤。
［２］ ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、上記［１］に記載の剤。
［３］ 異常細胞がウイルス感染細胞である、上記［１］又は［２］に記載の剤。
［４］ ウイルスがサイトメガロウイルスである、上記［３］に記載の剤。
［５］ サイトメガロウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、上記［４］に記載の剤。
［６］ ＮＫ細胞レセプターがヒト由来である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の剤。
［７］ ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、上記［６］に記載の剤。
［８］ サイトメガロウイルスがマウスサイトメガロウイルスである、上記［４］に記載の剤。
［９］ ＮＫ細胞レセプターがマウス由来である、上記［１］〜［５］及び［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］ ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、上記［９］に記載の剤。
［１１］ ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈである、上記［１０］に記載の剤。
［１２］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の剤。
［１３］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、上記［１２］に記載の剤。
［１４］ キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の剤。
［１５］ 急性ウイルス感染症の予防・治療用である、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の剤。
［１６］ 慢性ウイルス感染症の予防・治療用である、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の剤。
［１７］ 生体にとって望ましくない異常細胞の除去方法であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の有効量を、該異常細胞を有する生体に投与することを含む方法。
［１８］
（ａ）ウイルス感染ヒト細胞で特異的に発現するリガンドを認識するヒトＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプタータンパク質。
［１９］ ウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、上記［１８］に記載のタンパク質。
［２０］ ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、上記［１８］又は［１９］に記載のタンパク質。
［２１］ ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、上記［１８］〜［２０］のいずれかに記載のタンパク質。
［２２］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載のタンパク質。
［２３］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、上記［２２］に記載のタンパク質。
［２４］ 前記キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、上記［１８］〜［２３］のいずれかに記載のタンパク質。
［２５］ 上記［１８］〜［２４］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
［２６］ 上記［２５］記載の核酸を含む、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞で機能し得る発現ベクター。
［２７］ 上記［２６］記載の発現ベクターでトランスフェクトされたヒト細胞傷害性Ｔ細胞。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞は、ＮＫ細胞レセプターを利用した迅速な免疫応答により急性ウイルス感染症に対する予防・治療効果を発揮するだけでなく、Ｔ細胞による免疫監視により慢性のウイルス感染症に対しても予防・治療効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体にとって望ましくない異常細胞の除去剤（以下、単に「本発明の異常細胞除去剤」ともいう）を提供する。「生体にとって望ましくない異常細胞」は、任意の疾患の病原となり得る細胞であって、正常細胞が全くあるいはほとんど発現していない分子を細胞表面に特異的に、あるいは高発現する細胞であれば、特に制限はないが、好ましくは、ウイルス感染細胞（例えば、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス等に感染した細胞）、癌細胞など、より好ましくはウイルス感染細胞、いっそう好ましくはＣＭＶ感染細胞、特に好ましくはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）もしくはＭＣＭＶ感染細胞である。本発明の異常細胞除去剤は、細胞傷害性Ｔ細胞が異常細胞を傷害して除去することにより、該異常細胞を病原とする疾患の予防・治療に有用である（本明細書中で「予防・治療」とは、「予防及び／又は治療」を意味する）。したがって、異常細胞がウイルス感染細胞の場合、本発明の異常細胞除去剤はウイルス感染症の予防・治療剤として用いることができ、異常細胞が癌細胞の場合、本発明の異常細胞除去剤は癌の予防・治療剤として用いることができる。
【００１３】
本発明の異常細胞除去剤は、（ａ）異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有する。
【００１４】
ＮＫ細胞は、自然免疫系（innate immune system）の細胞傷害性細胞であり、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などを殺傷する（ＭＨＣ非拘束）。ＮＫ細胞は、構造的に類似した２つのタイプのレセプター：「ＮＫ活性化レセプター（本明細書中で、単に「活性化レセプター」ともいう）」及び「ＮＫ抑制レセプター（本明細書中で、単に「抑制レセプター」ともいう）」をその表面に発現し、異常細胞を自己の細胞から識別している。活性化レセプターは、膜貫通領域に存在する正荷電のアミノ酸残基を介して、膜貫通領域に負荷電のアミノ酸残基を有するシグナル伝達アダプター分子と会合する。シグナル伝達アダプター分子はＩＴＡＭ配列［Y-x-x-L-xもしくはY-x-x-x-L］（ここで、ｘは任意のアミノ酸である）を有し、ＳｙｋやＺａｐ７０などのキナーゼ群をリクルートすることにより、活性化シグナルを伝達する。一方、抑制レセプターは細胞質ドメインにＩＴＩＭ配列［(I/V/L/S) -x-Y-x-x- (L/V)］（ここで、ｘは任意のアミノ酸である）を有し、ＳＨＰ−１などのホスファターゼ群をリクルートすることにより、活性化レセプターからのシグナルを遮断する。ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、これらのレセプターからのシグナルのバランスによって制御される。
【００１５】
ＮＫ細胞で発現するＮＫ細胞レセプターの遺伝子は、主としてＬＲＣ（Leukocyte Receptor Complex；ヒト１９番染色体、マウス７番染色体上）及びＮＫＣ（NK receptor Complex；ヒト１２番染色体、マウス６番染色体上）の２つの遺伝子座にクラスターを形成して存在する。ペア型（活性化／抑制）レセプターとしては、例えば、ヒトＬＲＣにコードされるＫＩＲ（Killer cell Immunoglobulin-like Receptor；ＫＩＲ２ＤＳ、３ＤＳが活性化レセプター、ＫＩＲ２ＤＬ、３ＤＬが抑制レセプター）、ヒト及びマウスで共通にＮＫＣにコードされるＮＫＧ２（ＮＫＧ２Ｃ、Ｄ、Ｅが活性化レセプター、ＮＫＧ２Ａが抑制レセプター；ＮＫＧ２Ａ、Ｃ、ＥはＣＤ９４とヘテロダイマーを形成し、ＮＫＧ２Ｄはホモダイマーを形成する）及びＮＫＲＰ１（ＮＫＲＰ１Ａ、Ｃ、Ｆが活性化レセプター、ＮＫＲＰ１Ｄが抑制レセプター）、マウスＮＫＣにコードされるＬｙ４９（Ｌｙ４９Ｄ、Ｈが活性化レセプター、Ｌｙ４９Ａ、Ｃ、Ｉが抑制レセプター）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のキメラレセプターに使用されるＮＫ細胞レセプターは、異常細胞（例えば、ウイルス感染細胞、癌細胞など）の細胞表面上に特異的に発現する分子（リガンド）を認識するものであれば、活性化レセプターであっても抑制レセプターであってもよい。活性化レセプターの多くはリガンド未知のオーファンレセプターであるが、異常細胞で発現するいずれかの分子をリガンドとして認識してＮＫ細胞のキラー活性を促進するので、本発明のキメラレセプターに好ましく使用することができる。一方、抑制レセプターは、本来的には宿主クラスＩ分子を認識するが、ウイルスはＮＫ細胞による攻撃を回避するために、抑制レセプターに認識され得るＭＨＣクラスＩ様分子を獲得したものがあるので（例えば、ＣＭＶのｍ１５７は抑制レセプターＬｙ４９Ｉ１２９に認識される）、そのような抑制レセプターもまた、本発明において使用することができる。
尚、ここで「異常細胞で特異的に発現する」とは、特定の異常細胞のみで発現し、他の細胞（特に正常細胞）で全く発現しないことを意味する他、特定の異常細胞での発現頻度及び／又は発現レベルに比べて、他の細胞での発現頻度及び／又は発現レベルが無視し得る程度に低い場合をも含む意味で用いられる。
【００１６】
本発明のキメラレセプターに用いられるＮＫ細胞レセプターは、好ましくは活性化レセプターである。活性化レセプターは、標的異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するものであれば特に制限はなく、例えば、標的異常細胞がヒト細胞の場合、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ等から、また、標的異常細胞がマウス細胞の場合は、Ｌｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ等から、異常細胞の種類に応じて適宜選択される。例えば、ヒトＮＫＧ２ＤはＭＩＣやＵＬＢＰ等、マウスＮＫＧ２ＤはＲＡＥ−１、Ｈ６０、Ｍｕｌｔ−１等のウイルス感染や細胞癌化により誘導されるクラスＩ様分子を認識する。また、ＭＣＭＶ感染細胞で特異的に発現するｍ１５７を認識する活性化レセプターとしては、Ｌｙ４９Ｈが挙げられる。
【００１７】
ＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインは、上記した種々のＮＫ細胞レセプターの細胞外領域のうち、標的異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するのに必要な部分を含むものであれば、特に制限されず、例えば、細胞外領域全体であってよい。例えば、ヒトＮＫ細胞活性化レセプターについては、GenBank Accession No. NP_002249として登録されているＮＫＲＰ１Ａのアミノ酸配列の細胞外領域、ＮＫＲＰ１Ｃの細胞外領域、ＮＫＲＰ１Ｆの細胞外領域、GenBank Accession No. NP_055327として登録されているＫＩＲ２ＤＳのアミノ酸配列の細胞外領域、GenBank Accession No. AAB95317として登録されているＫＩＲ３ＤＳのアミノ酸配列の細胞外領域、GenBank Accession No. NP_002251として登録されているＮＫＧ２Ｃのアミノ酸配列の細胞外領域、ＮＫＧ２Ｄの細胞外領域、ＮＫＧ２Ｅの細胞外領域が、それぞれ細胞外領域として挙げられる。また、マウスＮＫ細胞活性化レセプターについては、GenBank Accession No. AAR03586として登録されているＬｙ４９Ｈのアミノ酸配列の細胞外領域が挙げられる。
【００１８】
「ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子」は、その細胞質ドメインに上記ＩＴＡＭ配列を含み、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するシグナルを伝達して標的細胞の殺傷をもたらす分子である限り、特に限定されないが、例えば、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰ、ＦｃＲγ等の、膜貫通領域に負に荷電したアミノ酸残基を有し活性化レセプターと会合することが知られているアダプタータンパク質などが含まれる。より好ましくはＣＤ３ζである。
【００１９】
本発明のキメラレセプターは、上記シグナル伝達アダプター分子の全体を含んでもよいし、Ｔ細胞のキラー活性を活性化するシグナルを伝達し得る限りその一部のみを含んでいてもよい。「ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の一部」としては、例えば、ＩＴＡＭ配列を含む細胞質領域の一部、細胞質領域全体、さらに膜貫通領域を含んだ部分などが挙げられる。より具体的には、ヒトＣＤ３ζの細胞質領域、GenBank Accession No. AAD09436として登録されているヒトＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰのアミノ酸配列の細胞質領域、ヒトＦｃＲγの細胞質領域などが挙げられる。マウスＣＤ３ζの細胞質領域もまた挙げられる。
【００２０】
本発明のキメラレセプターを構成する上記タンパク質には、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、当該タンパク質に対応する他生物種のタンパク質が例示でき、これらは、既に同定された遺伝子の塩基配列から同定することができる。また変異体には、天然に存在する対立遺伝子変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加又は挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、野生型タンパク質と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％相同なタンパク質を挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含される。本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００２１】
本発明のキメラレセプターは、１回膜貫通型レセプターであり、細胞傷害性Ｔ細胞上で異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメイン部分を細胞表面に提示し、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子部分を細胞質中に含む。該キメラレセプターの膜貫通領域は、ＮＫ細胞レセプターの膜貫通領域の全部もしくは一部及び／又はシグナル伝達アダプター分子の膜貫通領域の全部もしくは一部であってもよいし、他の膜タンパク質の膜貫通領域や人為的にデザインされたアミノ酸配列を用いてもよい。ＮＫ細胞活性化レセプター及びシグナル伝達アダプター分子の膜貫通領域は、それぞれ陽性および陰性荷電のアミノ酸残基を有し、Ｔ細胞に内在のシグナル伝達アダプター分子や他の内在性タンパク質と不都合な相互作用を生じるおそれがあるので、他の膜タンパク質の膜貫通領域、好ましくは、用いられる活性化レセプターに対応する抑制レセプターの膜貫通領域をキメラレセプター中に含めることが好ましい。
【００２２】
本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞は、該レセプターをコードする核酸を適当なプロモーターの制御下においた発現ベクターで、細胞傷害性Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより調製することができる。本発明のキメラレセプターをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。好ましくは、本発明のキメラレセプターをコードする核酸は二本鎖ＤＮＡである。キメラレセプターをコードするＤＮＡは、例えば、該キメラレセプターを構成するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインを含む領域、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の該配列を含む領域（例えば、細胞質領域）、および必要に応じて他の膜タンパク質の膜貫通領域を含む領域をコードするｃＤＮＡを、それらを発現している哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウスなどのＮＫ細胞、Ｔ細胞など）もしくはそれらの細胞が存在する組織（例えば、脾臓、リンパ節、リンパ液、血液など）より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction（ＲＴ−ＰＣＲ）法によって直接増幅することにより調製した後、通常の遺伝子工学的手法を用いて、それらを直接もしくは適当なリンカーを介して連結することによって製造することができるが、これに限定されない。
【００２３】
例えば、ヒトＮＫ細胞活性化レセプターであるＮＫＲＰ１Ａの細胞外領域は、GenBank Accession No. NM_002258として登録されている塩基配列情報に基づいて、該塩基配列中の細胞外領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。同様に、ＮＫＲＰ１Ｃの細胞外領域コード領域、ＮＫＲＰ１Ｆの細胞外領域コード領域、GenBank Accession No. NM_014512として登録されているＫＩＲ２ＤＳ塩基配列中の細胞外領域コード領域、GenBank Accession No. AF022044として登録されているＫＩＲ３ＤＳ塩基配列中の細胞外領域コード領域、GenBank Accession No. NM_002260として登録されているＮＫＧ２Ｃの塩基配列中の細胞外領域コード領域、ＮＫＧ２Ｄの細胞外領域コード領域、ＮＫＧ２Ｅの細胞外領域コード領域を、各遺伝子の塩基配列情報に基づいて作製したプライマーペアを用いて増幅することにより、各タンパク質の細胞外領域を調製することができる。また、マウスＮＫ細胞活性化レセプターであるＬｙ４９Ｈの細胞外領域は、GenBank Accession No. AY338977として登録されている塩基配列情報に基づいて、該塩基配列中の細胞外領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。
【００２４】
例えば、ヒトシグナル伝達アダプター分子であるＣＤ３ζの細胞質領域は、細胞質領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。同様に、GenBank Accession No. AF019562として登録されているヒトＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰの塩基配列中の細胞質領域コード領域、ヒトＦｃＲγの細胞質領域コード領域を、各遺伝子の塩基配列情報に基づいて作製したプライマーペアを用いて増幅することにより調製することができる。また、マウスＣＤ３ζの細胞質領域は、細胞質領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。
【００２５】
さらに、キメラレセプターの膜貫通領域として、活性化レセプターに対応する抑制レセプターの膜貫通領域を用いる場合、例えば、用いられるＮＫ細胞活性化レセプターがＫＩＲ２ＤＳであれば、対応するＫＩＲ２ＤＬの膜貫通領域は、GenBank Accession No. NM_014218として塩基配列情報に基づいて、膜貫通領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。
【００２６】
ここで使用するプライマーペアは、各増幅断片の末端に、増幅断片同士および増幅断片とベクターとを連結するのを容易にするために、適当な制限酵素認識サイトを導入するようにデザインすることもできる。
【００２７】
本発明のキメラレセプターをコードする核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、本発明のキメラレセプターを構成するドメインをコードする目的の断片を調製し、該断片を連結し、適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより作製することができる。
【００２８】
発現ベクターの骨格は、例えば、プラスミド又はウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルスなどのウイルス由来ベクター）であり得る。発現ベクターとして、例えば、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＭＥ１８Ｓなどが使用され得る。発現ベクターとしては、目的遺伝子が選択マーカー又はレポーターと共に同一ｍＲＮＡから発現される、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターが好ましい。ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターとしては、例えば、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Kitamuraら、Int. J. Hematol., 67, 351-9 (1998)）、及びClontech社により市販されているベクターなどが挙げられる。
【００２９】
発現ベクターで使用されるプロモーターは、細胞傷害性Ｔ細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター、ＬＣＫ近位プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーターなどの哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、プロモーターとして、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得る。
【００３０】
発現ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー又はレポーター遺伝子、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを含み得る。
【００３１】
選択マーカー及びレポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【００３２】
該発現ベクターの導入宿主となる細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞表面の自己のＭＨＣクラスＩ分子を非自己抗原と共に認識して標的細胞を殺傷する（ＭＨＣ拘束）、獲得免疫系（adaptive immune system）において機能する細胞である。このＴ細胞はＣＤ８陽性であるので、ＣＤ８ Ｔ細胞ともいう。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＴＣＲ（T cell Receptor）を介してリガンドに結合すると、ＴＣＲ複合体中のＣＤ３ζのＩＴＡＭ配列を介して活性化シグナルを伝達し、標的細胞を殺傷する。
【００３３】
本発明において使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、任意の動物種由来のものであり得る。このような動物種としては、ヒト、ヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類やウサギなどの実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明においてはヒト及びマウスの細胞傷害性Ｔ細胞が好ましく、臨床応用の観点から、ヒトの細胞傷害性Ｔ細胞がより好ましい。
【００３４】
細胞傷害性Ｔ細胞の遺伝子型は特に限定されないが、異常細胞を除去すべき投与対象の動物と同種同系、同種異系又は異種異系であり、好ましくは同種同系又は同種異系である。投与時の拒絶反応を回避するために、この細胞傷害性Ｔ細胞は、投与対象と同種同系であることが好ましく、投与対象由来（即ち、自家細胞）であることが最も好ましい。例えば、臓器移植患者などの場合、免疫抑制剤投与前に予め該患者から細胞傷害性Ｔ細胞を採取しておき、これに本発明のキメラレセプターを導入し、臓器移植後に該キメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を該患者に戻すなどの態様が、好ましく例示される。
【００３５】
本発明において使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、自体公知の方法によって、上記動物種の組織（例えば、脾臓、リンパ節、リンパ液、血液など）から単離及び／又は精製することが可能である。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法などにより単離することができる。
【００３６】
本発明において使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、上記動物種より採取された細胞（例えば、初代培養細胞）又は細胞株であり得る。この細胞傷害性Ｔ細胞はポリクローナルであり得る。細胞株は既存の細胞株又は新たに作製される細胞株であり得る。細胞株は自体公知の方法により作製できる。
【００３７】
発現ベクターをＴ細胞に導入（形質導入）する方法は、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、ウイルス感染などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
発現ベクターが導入されたＴ細胞は、上記選択マーカー及びレポーター遺伝子などを利用して、セルソーターなどにより選択することができる。例えば、ＧＦＰの発現に基づいてフローサイトメーターによってソートすることができる。
【００３９】
選択されたＴ細胞の培養は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製した培地中で行うことができる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。培養培地は、例えば、血清（例えば、ＦＣＳ）、血清代替物（例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ））、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含むことができる。培養温度、ＣＯ２濃度などの他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。培地のｐＨは通常約６〜８であり、培養時間は通常４〜１４日間、好ましくは６〜１４日間である。培養における細胞数、各種因子の濃度などのその他の条件は、自体公知の方法により適宜設定できる。
【００４０】
上記のようにして調製される本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「本発明の細胞傷害性Ｔ細胞」ともいう）は、該キメラレセプターの細胞外領域に存在するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインを用いて、異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識し、該キメラレセプターの細胞質領域に存在するシグナル伝達アダプター分子部分を介した活性化シグナルによって活性化され、該異常細胞を傷害するので、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、該キメラレセプターが認識し得るリガンドを発現する異常細胞の除去に有用である。したがって、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、該異常細胞を病原とする各種疾患の予防・治療に用いることができる。
本発明に従って予防・治療され得る疾患としては、ウイルス感染症、癌などが挙げられる。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染症の予防・治療に特に適している。具体的には、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞により予防・治療されるウイルス感染症としては、ＣＭＶ（例えば、ＨＣＭＶまたはＭＣＭＶなど）、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスなどの感染症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「急性ウイルス感染症（本明細書中で「急性相感染」ともいう）」とは、あるウイルスによる最初の感染によって引き起こされる疾患をいう。本明細書中で使用する場合、「慢性ウイルス感染症」は、慢性化したウイルス感染症及び再発のウイルス感染症を含み、最初に感染したウイルスが排除されないまま体内に残ること、同じウイルスの再感染などによって引き起こされる。急性ウイルス感染症に対して一次免疫応答が生じ、慢性ウイルス感染症に対して二次免疫応答が生じる。この二次免疫応答には免疫記憶応答が関与している。本明細書中で使用する場合、「長期」とは、免疫記憶の確立によってもたらされる、慢性ウイルス感染症からの保護などをいう。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、急性及び慢性の両方のウイルス感染症を予防・処置することができる。
【００４２】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、単独で、あるいは他の治療のための任意の有効成分との混合物として、薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体とともに製剤化することができる。
【００４３】
本発明の異常細胞除去剤は、通常は、注射剤、点滴剤などの剤型で提供される。本発明の異常細胞除去剤は、好ましくは、受容者の体液（血液など）と等張な滅菌水性担体中に、本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞が懸濁された懸濁液である。水性担体としては、生理食塩水、ＰＢＳなどを挙げることができる。これらの水性担体には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤などを添加することもできる。
【００４４】
本発明の剤中に含まれる、本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の濃度は、通常、約１×１０５〜１×１０１０個／ｍｌ、好ましくは約２×１０５〜１×１０９個／ｍｌの範囲であるが、特に限定されない。細胞濃度が低すぎると、投与に時間がかかるため患者への負担が増大し、細胞濃度が高すぎると、細胞同士が凝集してしまう可能性がある。
【００４５】
本発明の剤の投与量は、本発明のキメラレセプターの発現量、投与様式、疾患の種類、疾患の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の受容性、体重、年齢などによって異なるが、所望の免疫活性を達成するような細胞数が適宜投与され得、通常、１回の投与につき、本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の数として、通常１×１０６〜１×１０９個／ｍ２、好ましくは１×１０７〜１×１０９個／ｍ２の用量で投与される。これらの投与量は、前述の種々の条件により変動する。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するが、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【００４７】
材料及び方法
マウス及び細胞株：
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢ６マウスは、Charles River Japanから購入した。Ｂ６バックグラウンドを有するＲＡＧ−２欠損マウスは、Taconic（Hudson,NY）から購入した。６〜８週齢のマウスを実験に使用した。ＤＢＡ／２由来の肥満細胞株Ｐ８１５、Ｂ６由来の胸腺腫細胞株ＲＭＡ、Ｌｙ４９Ａに対するｍＡｂ（Ａ１）のためのハイブリドーマ及び北村敏雄博士（東京大学）によって提供されたレトロウイルスパッケージング細胞株ＰＬＡＴ−Ｅをin vitroで維持した。Ｌｙ４９Ｈに対するｍＡｂのための３Ｄ１０ハイブリドーマは、W.M. Yokoyama博士（Washington University,St.Louis）により提供された。
【００４８】
レトロウイルスベクター及び形質導入：
Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプター、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラレセプター及び細胞質欠失Ｌｙ４９Ａのコンストラクトを、以前に記載したように（非特許文献８）ＰＣＲによって生成した。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプター及び細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈのコンストラクトについて、Ｌｙ４９ＨのＣ末端細胞外ドメインを、それぞれＣＤ３ζの細胞質ドメインあり又はなしでＬｙ４９Ａの膜貫通ドメインと融合させて、別のシグナル伝達分子との相互作用を回避した。これらのコンストラクトをｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの第１シストロン中に挿入した。W．Yokoyamaにより提供されたｍ１５７のｃＤＮＡ及びＨ２ＤｄのｃＤＮＡを、それぞれｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター又はｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４ベクター中に挿入した（非特許文献８）。上記細胞株へのこれらｃＤＮＡの形質導入を、以前に記載された通りに実施した（非特許文献８）。ＧＦＰ又はｈＣＤ４ポジティブな標的細胞を、MoFlowフローサイトメーター（Cytomation）によってソートした。
【００４９】
キメラレセプターを発現するポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞の生成：
脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞を磁気ビーズ（Miltenyi Biotec,CA）によって精製した。ソートした細胞を、０日目に、２００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を含む培地中、５μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３ Ａｂ及び２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。細胞を１日目及び２日目に感染させた。細胞を３日目に洗浄し、２００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２と共にもう２４時間増殖させた。約５０〜６０％のＣＤ８ Ｔ細胞が４日目にＧＦＰポジティブであった。これらの細胞をin vivoのウイルス保護アッセイに使用した。in vitroの殺傷アッセイのために、Ｌｙ４９Ｈ又はＬｙ４９Ａの表面発現についてＧＦＰポジティブ細胞をソートすることによって、細胞を精製した。
【００５０】
マウスサイトメガロウイルスの調製及び感染：
Smith株のＭＣＭＶ（VR194）を、American Tissue Culture Collection（Manassas,VA）から得た。ストック溶液を、ＭＣＭＶに感染したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の唾液腺から、以前に記載されたとおりに公知技術に従って調製した。このＭＣＭＶストック懸濁物のウイルス濃度は、以前に報告されたとおりに公知技術に従ってサブコンフルエントの３Ｔ３／Ｓｗｉｓｓアルビノ細胞を使用してプラークアッセイによって決定したところ、２．０×１０７ＰＦＵ／ｍｌであった。マウスに、ウイルスストックの腹腔内注射によってウイルスを感染させた。
【００５１】
ウイルスｍ１５７のＰＣＲ増幅及び配列：
ゲノムＤＮＡを、一般に使用されている市販のキットを使用して抽出した。ウイルスｍ１５７遺伝子を、French et.al.（French, A.R., and W.M. Yokoyama. 2003. Natural killer cells and viral infections. Curr Opin Immunol 15:45-51.）に記載されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、ＴＡクローニング（Invitrogen）中にサブクローニングし、配列決定した。ｍ１５７配列のＰＣＲ分析のために、図４Ｂ中に示される実験における死にかけのマウスを屠殺し、唾液腺を使用した。
【００５２】
実施例１
ポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞上でのキメラレセプターの発現：
初代細胞におけるキメラレセプターの機能を試験するために、バイシストロン性レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｐＩＧ）中にＬｙ４９Ｈ細胞外ドメイン、Ｌｙ４９Ａ膜貫通ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質ドメインを挿入したＬｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターコンストラクト（Ｌｙ４９ＨＺ）を調製した。Ｌｙ４９Ｈ発現の困難性及び他のシグナル伝達分子との会合を回避するために、原型的な阻害レセプターＬｙ４９Ａ由来の膜貫通ドメインでその膜貫通ドメインを置換した。コントロールとして、Ｌｙ４９Ｈ細胞外ドメイン及びＬｙ４９Ａ膜貫通ドメインを有するがＣＤ３ζ細胞質ドメインを有さない、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈコンストラクト（Ｌｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌ）もまた調製した。レトロウイルスの系を使用して、これらのキメラレセプターをＭＣＭＶ感受性ＢＬＡＢ／ｃ株（Ｈ−２ｄハプロタイプ）由来のＣＤ８ Ｔ細胞中に形質導入した。形質導入後に約５０〜６０％のＧＦＰポジティブ細胞が得られ、これらのＧＦＰポジティブ細胞の殆どがＬｙ４９Ｈ特異的ｍＡｂによってポジティブに染色された。ＧＦＰポジティブ細胞をエフェクター細胞としてソートしたところ、それらのうち９０％より多くがＬｙ４９Ｈポジティブであった（図１Ａ）。標的細胞としてＤＢＡ２由来のＰ８１５（Ｈ−２ｄ）を準備した。Ｐ８１５中にｐＭＸ−ｍ１５７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（コントロールとして）を形質導入し、それぞれＰ８１５−ｍ１５７及びＰ８１５−vectorとした（図１Ｂ）。これらのエフェクター細胞及び標的細胞を使用して、in vitroの５１Ｃｒ放出アッセイを実施した。Ｌｙ４９ＨＺレセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｐ１８５−ｍ１５７を殺傷する能力を獲得したが、Ｌｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞はこの能力を獲得できなかった。このことは、ポジティブなシグナルが、Ｌｙ４９Ｈレセプターとｍ１５７との結合によって促進される他のシグナル伝達分子を介したものではなく、実際にキメラレセプターのＣＤ３ζ部分を介したものであることを示している（図１Ｃ）。形質導入したキメラレセプターの特異性のさらなる支持として、抗Ｌｙ４９Ｈ特異的ｍＡｂは、Ｐ１８５−ｍ１５７の殺傷をブロックしたが、コントロールＡｂはブロックしなかった（図１Ｃ及びデータ示さず）。特に、これらの形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞は、親Ｐ１８５細胞及びＰ１８５−vector形質導入コントロール細胞に対する寛容を維持した。これらのデータは、Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを形質導入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞がｍ１５７を特異的に認識して標的細胞を殺傷することを示す。
【００５３】
実施例２
ネイティブのレセプター機能の変換：
ｍ１５７タンパク質は、１２９／Ｊマウスにおいて発現されるＬｙ４９ファミリーのメンバーである阻害ＮＫ細胞レセプターＬｙ４９Ｉ１２９に結合することが示されている（Arase, H., E.S. Mocarski, A.E. Campbell, A.B. Hill, and L.L. Lanier. 2002. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors. Science296:1323-1326.）。Ｃ５７ＢＬ／６由来のＬｙ４９ＡＢ６（Ｌｙ４９Ａ）は、このファミリーメンバー中の原型的なＮＫ細胞阻害レセプターである。Ｌｙ４９ＡはＭＨＣクラスＩのＨ−２Ｄｄを認識し、その特異性は、マウスＮＫ細胞レセプターの中で最も特徴付けられている（Karlhofer, F.M., R.K. Ribaudo, and W.M. Yokoyama. 1992. MHC class I alloantigen specificity of Ly-49+ IL-2-activated natural killer cells. Nature 358:66-70.、Tormo, J., K. Natarajan, D.H. Margulies, and R.A. Mariuzza. 1999. Crystal structure of a lectin-like natural killer cell receptor bound to its MHC class I ligand. Nature402:623-631.）。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを用いてポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞の特異性を変化させたので、次に、in vitroの５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、Ｌｙ４９ＡとＣＤ３ζとのキメラレセプターを操作することによって初代ＣＤ８ Ｔ細胞においてネイティブのレセプター機能を変換できるか否かを試験した。Ｌｙ４９Ａの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとをＣＤ３ζ細胞質ドメインと融合させて作製したＬｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラレセプターコンストラクト（Ｌｙ４９ＡＺ）を調製した。コントロールとして、Ｌｙ４９Ａの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのみで作製した細胞質欠失Ｌｙ４９Ａ（Ｌｙ４９Ａｃｙｔｏ−ｄｅｌ）もまた調製した。標的細胞として、Ｃ５７ＢＬ６（Ｂ６）由来のＴ細胞株であるＲＭＡを準備した。ＲＭＡ中にＨ−２Ｄｄ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＩＲＥＳ−ＧＦＰ（形質導入コントロールとして）を形質導入し、それぞれ、ＲＭＡ−Ｈ−２Ｄｄ及びＲＭＡ−ＧＦＰとした。Ｌｙ４９Ａの内因性リガンドを発現しないＣ５７ＢＬ６マウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞中に、Ｌｙ４９Ａキメラレセプターを形質導入した（図２Ａ）。細胞質欠失Ｌｙ４９Ａレセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞はＲＭＡ−Ｈ２Ｄｄを殺傷することができなかった。一方で、Ｌｙ４９ＡＺレセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞はＲＭＡ−Ｈ２Ｄｄを有効に殺傷したが、ＲＭＡもＲＭＡ−ＧＦＰも殺傷しなかった（図２Ｂ）。さらに、ＲＭＡ−Ｈ２Ｄｄの殺傷は、Ｌｙ４９Ａ特異的ｍＡｂであるＡ１によってブロックされた（図２Ｃ）。これらのデータは、Ｌｙ４９ＡＺレセプターを形質導入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞がそのリガンドを特異的に認識して標的細胞を殺傷することを示す。合わせて考えると、これらのデータは、細胞質ＣＤ３ζと融合したＮＫ細胞レセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞が、そのレセプターのネイティブの性質（阻害又は活性化）に関わらず、ネイティブのＮＫ細胞レセプターの特異性を獲得して、標的細胞を殺傷できることを示す。
【００５４】
実施例３
Ｌｙ４９Ｈキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によってＭＣＭＶ感染からレスキューされたＢＡＬＢ／ｃマウス
Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを形質導入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞によって、ｍ１５７発現細胞のin vitroでの首尾よい殺傷がもたらされたので、本発明者は、これらの細胞がin vivoでＭＣＭＶ感染を制御する能力を評価した。Ｌｙ４９Ｈの発現を欠くＢＡＬＢ／ｃマウスはＭＣＭＶ感染に対して感受性であり、１×１０４ｐｆｕのＭＣＭＶでの接種後２週間以内に死亡した（図３Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞を準備し、Ｌｙ４９ＨＺ又はＬｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌのいずれかを含むレトロウイルスをこの細胞に形質導入した。ＭＣＭＶ感染の当日、Ｌｙ４９ＨＺレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞１×１０７を注入し、次いで、致死用量のＭＣＭＶをマウスに感染させた。細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈを発現するコントロールＣＤ８ Ｔ細胞を注入したマウス及び細胞を注入していないマウスは１０日以内に死亡したが、Ｌｙ４９ＨＺレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞を注入したマウスは致死用量のＭＣＭＶ感染の急性相を生存した（図３Ａ）。このことと一致して、予備研究（データ示さず）において、注入したキメラレセプター発現細胞の数と生存との間の正の相関が観察された。生存マウスは、最初の感染の１ヵ月後に健康なままであった。
【００５５】
実施例４
ウイルス感染の有効な制御は、自然免疫及び獲得免疫の両方を必要とする。従って、最初のチャレンジと同じウイルス用量のＭＣＭＶでマウスを再チャレンジすることによって、これらの生存したマウスが獲得免疫を発達させたか否かをさらに試験した。最初の感染の４０日後に、ＣＤ８ Ｔ細胞をさらに注入することなくマウスを再チャレンジし、生存を観察した。ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスは１０日以内に死亡したが、再チャレンジしたマウスは全て生存し、このことは、これらのマウスにおける有効な記憶応答の確立を示す（図３Ｂ）。記憶応答における注入されたＣＤ８ Ｔ細胞の寄与を評価するために、再チャレンジの１０日後に生存マウスの脾臓中のＣＤ８ Ｔ細胞を評価した。興味深いことに、ＣＤ８集団中にＧＦＰポジティブ細胞もＬｙ４９Ｈポジティブ細胞も検出されなかった（図３Ｃ）。再チャレンジの７日後に分析した脾細胞からは、ＧＦＰポジティブ細胞は観察されなかった（データ示さず）。
【００５６】
実施例５
ＲＡＧ−２欠損Ｂ６マウスの一過的なレスキュー：
上記実験において、移入した全てのＣＤ８ Ｔ細胞を、形質導入前にα−ＣＤ３ ｍＡｂ及びα−ＣＤ２８ ｍＡｂで刺激したところ、注入したＣＤ８ Ｔ細胞の約４０〜５０％はＧＦＰ発現についてネガティブであった。内因性Ｔ細胞又は注入されたＴ細胞のいずれが抗ＣＭＶ記憶応答に寄与しているかは明らかではなく、この記憶の形成が生存に如何に寄与したかも明らかではなかった。これらの問題点に取り組むため、Ｂ６ ＲＡＧ２欠損（Ｂ６−ＲＡＧ２）マウスを使用した。Ｂ６−ＲＡＧ２マウスはＴ細胞及びＢ細胞を欠くので、内因性Ｔ細胞からＣＭＶクリアランスに必要な獲得記憶応答を形成することができない。Ｌｙ４９ＨＺを形質導入した後に、Ｂ６マウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞をＢ６−ＲＡＧ２マウス中に移入した。Ｂ６−ＲＡＧ２マウスはＬｙ４９Ｈを発現するＮＫ細胞を有するのでＭＣＭＶに対して耐性であるため、より高い用量のＭＣＭＶ（マウス１匹当たり１×１０７ｐｆｕ）でチャレンジした。コントロールとして、ＣＤ８ Ｔ細胞中にＬｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌを形質導入し、これらをＲＡＧ２欠損Ｂ６マウス中に注入した。ＢＡＬＢ／ｃモデルと同様に、全てのＲＡＧ２欠損Ｂ６マウス、及びコントロールの細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈを発現するＣＤ８ Ｔ細胞を注入したＲＡＧ２欠損Ｂ６マウスの殆どは１０日以内に死亡したが、Ｌｙ４９ＨＺを発現するＣＤ８ Ｔ細胞を移入したＲＡＧ２欠損Ｂ６マウスは生存した（図４Ａ）。これらのデータは、急性相感染が、移入されたＣＤ８ Ｔ細胞によって実際に制御されたことを示す。第２の実験において、第１の実験と同じ短期生存パターンが観察された。しかし、感染の１ヵ月後、全ての生存マウスが死亡した（図４Ｂ）。これらのデータは、注入されたＣＤ８ Ｔ細胞自体が長期記憶を形成することができたわけではないことを示唆する。この遅延相の死亡の機構に取り組むために、死にかけのＲＡＧ２欠損Ｂ６マウス（ｎ＝１）から脾臓及び唾液腺を単離した。平均ウイルス力価は、脾臓、肝臓、唾液腺及び肺においてそれぞれ４．４×１０６、２．０×１０７、３．６×１０８及び５．７×１０７であり、このことは、遅延相の死亡がＭＣＭＶの再活性化に起因するものであることを示唆する。
【００５７】
本明細書において、致死用量のＭＣＭＶでチャレンジしたマウスをレスキューするための、首尾よい細胞免疫学的ストラテジーを記載してきた。内因性のＮＫ細胞が致死的なウイルスチャレンジからＢ６−ＲＡＧ−２マウスを保護できない条件において、ウイルスタンパク質に特異的なキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の注入により、この致死的なチャレンジが克服された。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によって生存したＢＡＬＢ／ｃマウスは、高用量のウイルス再チャレンジを明らかに制御し、このことは、記憶細胞の有効な増殖及び細胞傷害活性を示唆する。従って、本明細書中に提供されるデータは、キメラ活性化レセプター遺伝子を移入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞が、ＮＫ細胞の機能を模倣することによって、自然免疫応答の重要な役割を果たし得ることを示している。さらに、in vitroデータは、ネイティブの阻害レセプターが、その細胞質ドメインをＣＤ３ζの細胞質ドメインと交換することによって、初代ＣＤ８ Ｔ細胞において活性化レセプターに変換され得ることもまた示唆している。
【００５８】
ペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の生成が所望され、免疫無防備の移植患者において疾患を引き起こすいくつかのウイルスについて確立されている（Riddell, S.R., and P.D. Greenberg. 1995. Principles for adoptive T cell therapy of human viral diseases. Annual Review of Immunology 13:545-586.）。ヒト同種移植の設定において所定のＭＨＣ拘束様式であつらえたペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の生成は、リガンドの認識についてＭＨＣ拘束を必要とするが、ＣＤ３ζの細胞質ドメインを有するウイルスタンパク質特異的ＮＫ細胞キメラレセプターは、リガンドの認識についてＭＨＣ拘束を必要としない。ヒト及びマウスの両方において、末梢中の細胞の最初の割合が異なるので、多数のＴ細胞を得ることはＮＫ細胞よりも容易である。
移入されたＣＤ８ Ｔ細胞は急性相感染を有効に制御し、これは、有効な長期獲得免疫を導く。本明細書中のデータは、ＣＭＶ感染に対する獲得免疫応答が内因性Ｔ細胞によって媒介されることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞は、ＮＫ細胞によるＭＨＣ非拘束的なリガンド認識により、ウイルス感染症や癌などにおける異常細胞（即ち、ウイルス感染細胞や癌細胞）を認識してこれを傷害することができ、なおかつウイルス感染や癌からの長期的な保護をもたらし得るので、急性及び慢性のウイルス感染症、あるいは癌およびその再発を予防・治療するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によるｍ１５７ポジティブ標的細胞の特異的殺傷を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ８ Ｔ細胞に、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ又はＬｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターのいずれかを含むレトロウイルスを感染させた。細胞を、そのＧＦＰ発現によってエフェクター細胞としてソートした。ソートした細胞上のＣＤ８、ＧＦＰ及びＬｙ４９Ｈの発現が示される。
【図１Ｂ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によるｍ１５７ポジティブ標的細胞の特異的殺傷を示す図である。Ｐ８１５細胞に、ｍ１５７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ又はＩＲＥＳ−ＧＦＰのいずれかを形質導入し、そのＧＦＰ発現に基いてソートした。各形質導入体中のＧＦＰ発現が示される。
【図１Ｃ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によるｍ１５７ポジティブ標的細胞の特異的殺傷を示す図である。５１Ｃｒ放出アッセイを、ｍ１５７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現するＰ８１５細胞（丸）又はＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現するＰ８１５細胞（四角）を標的細胞として用い、Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（白抜き記号）又は細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（黒塗り記号）をエフェクター細胞として用いて実施した。Ｌｙ４９Ｈ Ａｂ（培養物上清の１／２０希釈）の存在下での細胞傷害活性を白抜きの三角で示した。４回の独立した実験からの代表的なデータが示される。別個の実験において、標的及びエフェクターの各組み合わせについて、コントロールｍＡｂの存在下では効果は観察されなかった（データ示さず）。
【図２Ａ】ＣＤ３ζキメラレセプターとの融合による、ネイティブの阻害レセプター機能の活性化レセプターへの変換を示す図である。Ｂ６ ＣＤ８ Ｔ細胞に、細胞質欠失Ｌｙ４９Ａ又はＬｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラレセプターのいずれかを含むレトロウイルスを感染させた。細胞を、そのＧＦＰ発現によってエフェクター細胞としてソートし、Ｌｙ４９Ａ表面発現について分析した。
【図２Ｂ】ＣＤ３ζキメラレセプターとの融合による、ネイティブの阻害レセプター機能の活性化レセプターへの変換を示す図である。ＲＭＡ細胞に、コントロールとしてのＩＲＥＳ−ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）又はＨ２Ｄｄ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４のいずれかを形質導入し、ｈＣＤ４発現によってソートした。これらの細胞のＨ−２Ｄｄ及びｈＣＤ４の発現を、細胞溶解アッセイの前に決定した。
【図２Ｃ】ＣＤ３ζキメラレセプターとの融合による、ネイティブの阻害レセプター機能の活性化レセプターへの変換を示す図である。５１Ｃｒ放出アッセイを、ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４を形質導入したＲＭＡ細胞（四角）又はＨ２Ｄｄ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４を形質導入したＲＭＡ細胞（丸及び三角）を標的細胞として用い、Ｌｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（白抜き記号）又は細胞質欠失Ｌｙ４９Ａを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（黒塗り記号）をエフェクター細胞として用いて実施した。Ｌｙ４９Ａ Ａｂ（培養物上清の１／２０希釈）の存在下での細胞傷害活性を三角で示す。３回の独立した実験からの代表的なデータが示される。別個の実験において、標的及びエフェクターの各組み合わせについて、アイソタイプが一致したコントロールｍＡｂの存在下では効果は観察されなかった（データ示さず）。
【図３Ａ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による致死的ＭＣＭＶ感染からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護、及び記憶応答の確立を示す図である。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラ（黒塗り三角）を発現するか、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ（白抜き三角）を発現するか、又は何も発現しない（黒塗り四角）５×１０６のＣＤ８ Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹）中に注射した。次いで、マウスにＭＣＭＶ（マウス１匹当たり１０４ＰＦＵ）を感染させ、生存についてモニタリングした。
【図３Ｂ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による致死的ＭＣＭＶ感染からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護、及び記憶応答の確立を示す図である。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によって最初のＭＣＭＶ感染から保護された１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（黒塗り三角）を、最初の感染の４０日後に、ＣＤ８ Ｔ細胞をさらに注入することなくＭＣＭＶで再チャレンジした。コントロールとして、ナイーブな未感染ＢＡＬＢ／ｃマウス（黒塗り四角）（１群当たり５匹のマウス）に、同量のウイルスを感染させた。２回の実験からの代表的なデータが示される。
【図３Ｃ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による致死的ＭＣＭＶ感染からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護、及び記憶応答の確立を示す図である。図３Ｂと同様に処理したマウス由来の脾細胞（黒塗り三角の群）を、再チャレンジの１０日後にＧＦＰポジティブなＣＤ８ Ｔ細胞の存在について分析した。３匹のマウスからの代表的なデータが示される。
【図４Ａ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による、致死的なＭＣＭＶ感染からの免疫不全マウスの保護を示す図である。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラ（黒塗り三角）を発現するか、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ（白抜き三角）を発現するか、又は何も発現しない（黒塗り四角）５×１０６のＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｂ６−ＲＡＧ２欠損マウス（１群当たり５匹）中に注射した。次いで、マウスにＭＣＭＶ（マウス１匹当たり１０７ＰＦＵ）を感染させ、生存についてモニタリングした。
【図４Ｂ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による、致死的なＭＣＭＶ感染からの免疫不全マウスの保護を示す図である。マウス（１群当たり５匹）を、図４Ａと同様に処理し、延長された期間にわたってモニタリングした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含む新規な異常細胞の除去剤、このような細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを含む異常細胞の除去方法に関する。より具体的には、本発明は、ウイルス感染細胞や癌細胞等の異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を利用する、急性及び慢性のウイルス感染症や癌の予防・治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染に対する宿主防御は、２つの異なる免疫応答のセット（自然免疫及び獲得免疫）によって媒介される。自然免疫系の最初の防御ラインである樹状細胞（ＤＣ）は、パターン認識レセプターであるＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を使用し、このレセプターは、種々の病原体成分（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び多糖を含む）と相互作用する。ＤＣはサイトカインを迅速に分泌して、他の自然免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び獲得免疫細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞）の応答を誘発する。両方の免疫系の成分が、病原体からの宿主の有効な保護のために必要である。自然免疫の欠如は病原体の迅速な複製を導き、感染後数日以内に死をもたらす。対照的に、獲得免疫系の非存在下では病原体は獲得免疫監視から逃れ、ヒト免疫不全患者において報告されているように、慢性及び再発の感染に対して宿主を感受性にする。
【０００３】
持続感染を引き起こすウイルスの多くは、細胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識を回避するために宿主細胞でのＭＨＣクラスＩ抗原の発現を抑制する。しかし、ＮＫ細胞はＭＨＣクラスＩ抗原を認識する抑制レセプターを用いて該抗原を発現している細胞を自己とみなし、非発現細胞を非自己と認識して傷害するので、そのようなウイルス感染細胞はＮＫ細胞の抑制レセプターに認識されなくなり、該細胞により傷害される。ＮＫ細胞はまた、細胞外領域において抑制レセプターと非常に高い相同性を示すものの、該レセプターと相反する機能を有する活性化レセプターを有している。活性化レセプターは、ウイルス感染細胞上で特異的に発現するリガンドを認識して非自己とみなし、ＮＫ細胞のキラー活性を促進する。しかしながら、多くの活性化レセプターのリガンドは不明であり、その機能は明らかになっていないものが多い。
【０００４】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、免疫無防備宿主（例えば臓器移植患者）における主要な日和見感染病原体である。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）感染は、宿主−病原体相互作用及びその免疫を研究するための有用なモデルを提供する（非特許文献１、２）。最近、ＭＣＭＶ感染細胞の認識に関わるＮＫ細胞レセプター及びそのリガンドのペアとして、ＭＣＭＶ耐性マウス株において見出されたＬｙ４９Ｈ活性化レセプター及びＭＣＭＶゲノムにコードされるＭＨＣクラスＩ様ホールドタンパク質ｍ１５７が同定された（非特許文献３、４）。二次構造をもとにした立体構造上の相同性検索によると、ｍ１５７はＣＤ１やＨ−２Ｍ３等の非古典的ＭＨＣクラスＩ分子と相同性を示す。
【０００５】
ＮＫ細胞の活性化は活性化レセプターの状態のみによって決定されるのではなく、抑制レセプターのシグナルと活性化レセプターのシグナルとの間のバランスによって決定され、このことは、「missing-self」仮説によって支持される（非特許文献５）。興味深いことに、ｍ１５７は、ＭＣＭＶ感受性マウス株１２９／Ｊにおいて、抑制レセプターであるＬｙ４９Ｉ１２９に結合することが示されている（非特許文献３）。一方、ＭＣＭＶ耐性のＣ５７ＢＬ／６マウスのＬｙ４９ＩＢ６は宿主クラスＩ分子を認識するにもかかわらず、ｍ１５７を認識しない。
【０００６】
Ｌｙ４９Ｉは、マウスの原型的な抑制レセプターであるＬｙ４９Ａと同様に、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs(ITIM)）を含む。対照的に、Ｌｙ４９Ｈは、その細胞質ドメイン中にシグナル伝達モチーフを有さない。その代わりに、Ｌｙ４９Ｈは、その表面発現及びＬｙ４９Ｈ膜貫通ドメイン中の正に荷電した残基を介して、免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（immuno-receptor tyrosine-based activation motifs(ITAM)）を含むシグナル伝達アダプター分子ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰ（非特許文献６、７）と会合する。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体中のＣＤ３ζと同様に、ＤＡＰ１２は、リガンド認識に際し、Ｓｙｋ又はＺａｐ７０のようなＳｙｋキナーゼファミリーのメンバーをそのＩＴＡＭへとリクルートする。
【０００７】
リガンド同定のために、マウスＴ細胞株において発現させた、オーファンＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインとＣＤ３ζの細胞質ドメインとのキメラレセプターのレパートリーが以前に使用されている（非特許文献８、９）。この系によれば、レセプターの本来の性質（抑制であるか活性化であるか）にかかわらず、リガンドを認識するとＮＦＡＴ結合プロモーターの制御下でｌａｃＺ発現を誘導するので、リガンド発現細胞を検出することができる（非特許文献９）。
【非特許文献１】Tortorella, D., B.E. Gewurz, M.H. Furman, D.J. Schust, and H.L. Ploegh. 2000. Viral subversion of the immune system. Annu Rev Immunol 18:861-926.
【非特許文献２】Webb, J.R., S.H. Lee, and S.M. Vidal. 2002. Genetic control of innate immune responses against cytomegalovirus: MCMV meets its match. Genes Immun 3:250-262.
【非特許文献３】Arase, H., and L.L. Lanier. 2004. Specific recognition of virus-infected cells by paired NK receptors. Rev Med Virol 14:83-93.
【非特許文献４】Smith, H.R., J.W. Heusel, I.K. Mehta, S. Kim, B.G. Dorner, O.V. Naidenko, K. Iizuka, H. Furukawa, D.L. Beckman, J.T. Pingel, A.A. Scalzo, D.H. Fremont, and W.M. Yokoyama. 2002. Recognition of a virus-encoded ligand by a natural killer cell activation receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 99:8826-8831.
【非特許文献５】Lanier, L.L. 2005. NK cell recognition. Annu Rev Immunol 23:225-274.
【非特許文献６】Bakker, A.B., R.M. Hoek, A. Cerwenka, B. Blom, L. Lucian, T. McNeil, R. Murray, L.H. Phillips, J.D. Sedgwick, and L.L. Lanier. 2000. DAP12-deficient mice fail to develop autoimmunity due to impaired antigen priming. Immunity 13:345-353.
【非特許文献７】Tomasello, E., P.-O. Desmoulins, K. Chemin, S. Guia, H. Cremer, J. Ortaldo, P. Love, D. Kaiserlian, and E. Vivier. 2000. Combined natural killer cell and dendritic cell functional deficiency in KARAP/DAP12 loss-of-function mutant mice. Immunity 13:355-364.
【非特許文献８】Furukawa, H., K. Iizuka, J. Poursine-Laurent, N. Shastri, and W.M. Yokoyama. 2002. A ligand for the murine NK activation receptor Ly-49D: activation of tolerized NK cells from beta(2)-microglobulin-deficient mice. Journal of Immunology 169:126-136.
【非特許文献９】Iizuka, K., O.V. Naidenko, B.F. Plougastel, D.H. Fremont, and W.M. Yokoyama. 2003. Genetically linked C-type lectin-related ligands for the NKRP1 family of natural killer cell receptors. Nat Immunol 4:801-807.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、急性期のみならず慢性のウイルス感染症の予防・治療にも有用な新規免疫療法およびそのための薬剤を提供することである。また、本発明の別の目的は、癌の新規免疫療法およびそのための薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ウイルス感染細胞や癌細胞等の異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現させた細胞傷害性Ｔ細胞を用いることにより、標的異常細胞上の該リガンドを認識して当該細胞を殺傷し得ることを見出した。すなわち、本発明者は、Ｌｙ４９Ｈレセプターの細胞外ドメインとＣＤ３ζの細胞質ドメインとを含むキメラレセプターをコードする核酸を細胞傷害性Ｔ細胞中に導入し、これをＭＣＭＶ感受性マウス株に投与したところ、該マウスが急性相のＭＣＭＶ感染による死亡から逃れ、さらに獲得免疫による長期保護が確立されたことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである：
［１］ 生体にとって望ましくない異常細胞の除去剤であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有してなる剤。
［２］ ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、上記［１］に記載の剤。
［３］ 異常細胞がウイルス感染細胞である、上記［１］又は［２］に記載の剤。
［４］ ウイルスがサイトメガロウイルスである、上記［３］に記載の剤。
［５］ サイトメガロウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、上記［４］に記載の剤。
［６］ ＮＫ細胞レセプターがヒト由来である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の剤。
［７］ ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、上記［６］に記載の剤。
［８］ サイトメガロウイルスがマウスサイトメガロウイルスである、上記［４］に記載の剤。
［９］ ＮＫ細胞レセプターがマウス由来である、上記［１］〜［５］及び［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］ ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、上記［９］に記載の剤。
［１１］ ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈである、上記［１０］に記載の剤。
［１２］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の剤。
［１３］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、上記［１２］に記載の剤。
［１４］ キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の剤。
［１５］ 急性ウイルス感染症の予防・治療用である、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の剤。
［１６］ 慢性ウイルス感染症の予防・治療用である、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の剤。
［１７］ 生体にとって望ましくない異常細胞の除去方法であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の有効量を、該異常細胞を有する生体に投与することを含む方法。
［１８］
（ａ）ウイルス感染ヒト細胞で特異的に発現するリガンドを認識するヒトＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプタータンパク質。
［１９］ ウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、上記［１８］に記載のタンパク質。
［２０］ ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、上記［１８］又は［１９］に記載のタンパク質。
［２１］ ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、上記［１８］〜［２０］のいずれかに記載のタンパク質。
［２２］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載のタンパク質。
［２３］ シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、上記［２２］に記載のタンパク質。
［２４］ 前記キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、上記［１８］〜［２３］のいずれかに記載のタンパク質。
［２５］ 上記［１８］〜［２４］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
［２６］ 上記［２５］記載の核酸を含む、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞で機能し得る発現ベクター。
［２７］ 上記［２６］記載の発現ベクターでトランスフェクトされたヒト細胞傷害性Ｔ細胞。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞は、ＮＫ細胞レセプターを利用した迅速な免疫応答により急性ウイルス感染症に対する予防・治療効果を発揮するだけでなく、Ｔ細胞による免疫監視により慢性のウイルス感染症に対しても予防・治療効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体にとって望ましくない異常細胞の除去剤（以下、単に「本発明の異常細胞除去剤」ともいう）を提供する。「生体にとって望ましくない異常細胞」は、任意の疾患の病原となり得る細胞であって、正常細胞が全くあるいはほとんど発現していない分子を細胞表面に特異的に、あるいは高発現する細胞であれば、特に制限はないが、好ましくは、ウイルス感染細胞（例えば、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス等に感染した細胞）、癌細胞など、より好ましくはウイルス感染細胞、いっそう好ましくはＣＭＶ感染細胞、特に好ましくはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）もしくはＭＣＭＶ感染細胞である。本発明の異常細胞除去剤は、細胞傷害性Ｔ細胞が異常細胞を傷害して除去することにより、該異常細胞を病原とする疾患の予防・治療に有用である（本明細書中で「予防・治療」とは、「予防及び／又は治療」を意味する）。したがって、異常細胞がウイルス感染細胞の場合、本発明の異常細胞除去剤はウイルス感染症の予防・治療剤として用いることができ、異常細胞が癌細胞の場合、本発明の異常細胞除去剤は癌の予防・治療剤として用いることができる。
【００１３】
本発明の異常細胞除去剤は、（ａ）異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部とを含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有する。
【００１４】
ＮＫ細胞は、自然免疫系（innate immune system）の細胞傷害性細胞であり、腫瘍細胞やウイルス感染細胞などを殺傷する（ＭＨＣ非拘束）。ＮＫ細胞は、構造的に類似した２つのタイプのレセプター：「ＮＫ活性化レセプター（本明細書中で、単に「活性化レセプター」ともいう）」及び「ＮＫ抑制レセプター（本明細書中で、単に「抑制レセプター」ともいう）」をその表面に発現し、異常細胞を自己の細胞から識別している。活性化レセプターは、膜貫通領域に存在する正荷電のアミノ酸残基を介して、膜貫通領域に負荷電のアミノ酸残基を有するシグナル伝達アダプター分子と会合する。シグナル伝達アダプター分子はＩＴＡＭ配列［Y-x-x-L-xもしくはY-x-x-x-L］（ここで、ｘは任意のアミノ酸である）を有し、ＳｙｋやＺａｐ７０などのキナーゼ群をリクルートすることにより、活性化シグナルを伝達する。一方、抑制レセプターは細胞質ドメインにＩＴＩＭ配列［(I/V/L/S) -x-Y-x-x- (L/V)］（ここで、ｘは任意のアミノ酸である）を有し、ＳＨＰ−１などのホスファターゼ群をリクルートすることにより、活性化レセプターからのシグナルを遮断する。ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、これらのレセプターからのシグナルのバランスによって制御される。
【００１５】
ＮＫ細胞で発現するＮＫ細胞レセプターの遺伝子は、主としてＬＲＣ（Leukocyte Receptor Complex；ヒト１９番染色体、マウス７番染色体上）及びＮＫＣ（NK receptor Complex；ヒト１２番染色体、マウス６番染色体上）の２つの遺伝子座にクラスターを形成して存在する。ペア型（活性化／抑制）レセプターとしては、例えば、ヒトＬＲＣにコードされるＫＩＲ（Killer cell Immunoglobulin-like Receptor；ＫＩＲ２ＤＳ、３ＤＳが活性化レセプター、ＫＩＲ２ＤＬ、３ＤＬが抑制レセプター）、ヒト及びマウスで共通にＮＫＣにコードされるＮＫＧ２（ＮＫＧ２Ｃ、Ｄ、Ｅが活性化レセプター、ＮＫＧ２Ａが抑制レセプター；ＮＫＧ２Ａ、Ｃ、ＥはＣＤ９４とヘテロダイマーを形成し、ＮＫＧ２Ｄはホモダイマーを形成する）及びＮＫＲＰ１（ＮＫＲＰ１Ａ、Ｃ、Ｆが活性化レセプター、ＮＫＲＰ１Ｄが抑制レセプター）、マウスＮＫＣにコードされるＬｙ４９（Ｌｙ４９Ｄ、Ｈが活性化レセプター、Ｌｙ４９Ａ、Ｃ、Ｉが抑制レセプター）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のキメラレセプターに使用されるＮＫ細胞レセプターは、異常細胞（例えば、ウイルス感染細胞、癌細胞など）の細胞表面上に特異的に発現する分子（リガンド）を認識するものであれば、活性化レセプターであっても抑制レセプターであってもよい。活性化レセプターの多くはリガンド未知のオーファンレセプターであるが、異常細胞で発現するいずれかの分子をリガンドとして認識してＮＫ細胞のキラー活性を促進するので、本発明のキメラレセプターに好ましく使用することができる。一方、抑制レセプターは、本来的には宿主クラスＩ分子を認識するが、ウイルスはＮＫ細胞による攻撃を回避するために、抑制レセプターに認識され得るＭＨＣクラスＩ様分子を獲得したものがあるので（例えば、ＣＭＶのｍ１５７は抑制レセプターＬｙ４９Ｉ１２９に認識される）、そのような抑制レセプターもまた、本発明において使用することができる。
尚、ここで「異常細胞で特異的に発現する」とは、特定の異常細胞のみで発現し、他の細胞（特に正常細胞）で全く発現しないことを意味する他、特定の異常細胞での発現頻度及び／又は発現レベルに比べて、他の細胞での発現頻度及び／又は発現レベルが無視し得る程度に低い場合をも含む意味で用いられる。
【００１６】
本発明のキメラレセプターに用いられるＮＫ細胞レセプターは、好ましくは活性化レセプターである。活性化レセプターは、標的異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するものであれば特に制限はなく、例えば、標的異常細胞がヒト細胞の場合、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ等から、また、標的異常細胞がマウス細胞の場合は、Ｌｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ等から、異常細胞の種類に応じて適宜選択される。例えば、ヒトＮＫＧ２ＤはＭＩＣやＵＬＢＰ等、マウスＮＫＧ２ＤはＲＡＥ−１、Ｈ６０、Ｍｕｌｔ−１等のウイルス感染や細胞癌化により誘導されるクラスＩ様分子を認識する。また、ＭＣＭＶ感染細胞で特異的に発現するｍ１５７を認識する活性化レセプターとしては、Ｌｙ４９Ｈが挙げられる。
【００１７】
ＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインは、上記した種々のＮＫ細胞レセプターの細胞外領域のうち、標的異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するのに必要な部分を含むものであれば、特に制限されず、例えば、細胞外領域全体であってよい。例えば、ヒトＮＫ細胞活性化レセプターについては、GenBank Accession No. NP_002249として登録されているＮＫＲＰ１Ａのアミノ酸配列の細胞外領域、ＮＫＲＰ１Ｃの細胞外領域、ＮＫＲＰ１Ｆの細胞外領域、GenBank Accession No. NP_055327として登録されているＫＩＲ２ＤＳのアミノ酸配列の細胞外領域、GenBank Accession No. AAB95317として登録されているＫＩＲ３ＤＳのアミノ酸配列の細胞外領域、GenBank Accession No. NP_002251として登録されているＮＫＧ２Ｃのアミノ酸配列の細胞外領域、ＮＫＧ２Ｄの細胞外領域、ＮＫＧ２Ｅの細胞外領域が、それぞれ細胞外領域として挙げられる。また、マウスＮＫ細胞活性化レセプターについては、GenBank Accession No. AAR03586として登録されているＬｙ４９Ｈのアミノ酸配列の細胞外領域が挙げられる。
【００１８】
「ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子」は、その細胞質ドメインに上記ＩＴＡＭ配列を含み、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するシグナルを伝達して標的細胞の殺傷をもたらす分子である限り、特に限定されないが、例えば、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰ、ＦｃＲγ等の、膜貫通領域に負に荷電したアミノ酸残基を有し活性化レセプターと会合することが知られているアダプタータンパク質などが含まれる。より好ましくはＣＤ３ζである。
【００１９】
本発明のキメラレセプターは、上記シグナル伝達アダプター分子の全体を含んでもよいし、Ｔ細胞のキラー活性を活性化するシグナルを伝達し得る限りその一部のみを含んでいてもよい。「ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の一部」としては、例えば、ＩＴＡＭ配列を含む細胞質領域の一部、細胞質領域全体、さらに膜貫通領域を含んだ部分などが挙げられる。より具体的には、ヒトＣＤ３ζの細胞質領域、GenBank Accession No. AAD09436として登録されているヒトＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰのアミノ酸配列の細胞質領域、ヒトＦｃＲγの細胞質領域などが挙げられる。マウスＣＤ３ζの細胞質領域もまた挙げられる。
【００２０】
本発明のキメラレセプターを構成する上記タンパク質には、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、当該タンパク質に対応する他生物種のタンパク質が例示でき、これらは、既に同定された遺伝子の塩基配列から同定することができる。また変異体には、天然に存在する対立遺伝子変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加又は挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、野生型タンパク質と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％相同なタンパク質を挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含される。本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００２１】
本発明のキメラレセプターは、１回膜貫通型レセプターであり、細胞傷害性Ｔ細胞上で異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメイン部分を細胞表面に提示し、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子部分を細胞質中に含む。該キメラレセプターの膜貫通領域は、ＮＫ細胞レセプターの膜貫通領域の全部もしくは一部及び／又はシグナル伝達アダプター分子の膜貫通領域の全部もしくは一部であってもよいし、他の膜タンパク質の膜貫通領域や人為的にデザインされたアミノ酸配列を用いてもよい。ＮＫ細胞活性化レセプター及びシグナル伝達アダプター分子の膜貫通領域は、それぞれ陽性および陰性荷電のアミノ酸残基を有し、Ｔ細胞に内在のシグナル伝達アダプター分子や他の内在性タンパク質と不都合な相互作用を生じるおそれがあるので、他の膜タンパク質の膜貫通領域、好ましくは、用いられる活性化レセプターに対応する抑制レセプターの膜貫通領域をキメラレセプター中に含めることが好ましい。
【００２２】
本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞は、該レセプターをコードする核酸を適当なプロモーターの制御下においた発現ベクターで、細胞傷害性Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより調製することができる。本発明のキメラレセプターをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。好ましくは、本発明のキメラレセプターをコードする核酸は二本鎖ＤＮＡである。キメラレセプターをコードするＤＮＡは、例えば、該キメラレセプターを構成するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインを含む領域、ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の該配列を含む領域（例えば、細胞質領域）、および必要に応じて他の膜タンパク質の膜貫通領域を含む領域をコードするｃＤＮＡを、それらを発現している哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウスなどのＮＫ細胞、Ｔ細胞など）もしくはそれらの細胞が存在する組織（例えば、脾臓、リンパ節、リンパ液、血液など）より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction（ＲＴ−ＰＣＲ）法によって直接増幅することにより調製した後、通常の遺伝子工学的手法を用いて、それらを直接もしくは適当なリンカーを介して連結することによって製造することができるが、これに限定されない。
【００２３】
例えば、ヒトＮＫ細胞活性化レセプターであるＮＫＲＰ１Ａの細胞外領域は、GenBank Accession No. NM_002258として登録されている塩基配列情報に基づいて、該塩基配列中の細胞外領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。同様に、ＮＫＲＰ１Ｃの細胞外領域コード領域、ＮＫＲＰ１Ｆの細胞外領域コード領域、GenBank Accession No. NM_014512として登録されているＫＩＲ２ＤＳ塩基配列中の細胞外領域コード領域、GenBank Accession No. AF022044として登録されているＫＩＲ３ＤＳ塩基配列中の細胞外領域コード領域、GenBank Accession No. NM_002260として登録されているＮＫＧ２Ｃの塩基配列中の細胞外領域コード領域、ＮＫＧ２Ｄの細胞外領域コード領域、ＮＫＧ２Ｅの細胞外領域コード領域を、各遺伝子の塩基配列情報に基づいて作製したプライマーペアを用いて増幅することにより、各タンパク質の細胞外領域を調製することができる。また、マウスＮＫ細胞活性化レセプターであるＬｙ４９Ｈの細胞外領域は、GenBank Accession No. AY338977として登録されている塩基配列情報に基づいて、該塩基配列中の細胞外領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。
【００２４】
例えば、ヒトシグナル伝達アダプター分子であるＣＤ３ζの細胞質領域は、細胞質領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。同様に、GenBank Accession No. AF019562として登録されているヒトＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰの塩基配列中の細胞質領域コード領域、ヒトＦｃＲγの細胞質領域コード領域を、各遺伝子の塩基配列情報に基づいて作製したプライマーペアを用いて増幅することにより調製することができる。また、マウスＣＤ３ζの細胞質領域は、細胞質領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。
【００２５】
さらに、キメラレセプターの膜貫通領域として、活性化レセプターに対応する抑制レセプターの膜貫通領域を用いる場合、例えば、用いられるＮＫ細胞活性化レセプターがＫＩＲ２ＤＳであれば、対応するＫＩＲ２ＤＬの膜貫通領域は、GenBank Accession No. NM_014218として塩基配列情報に基づいて、膜貫通領域コード領域を増幅し得るプライマーペアをデザインし、ＰＣＲを実施することにより調製することができる。
【００２６】
ここで使用するプライマーペアは、各増幅断片の末端に、増幅断片同士および増幅断片とベクターとを連結するのを容易にするために、適当な制限酵素認識サイトを導入するようにデザインすることもできる。
【００２７】
本発明のキメラレセプターをコードする核酸分子を含む発現ベクターは、例えば、本発明のキメラレセプターを構成するドメインをコードする目的の断片を調製し、該断片を連結し、適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより作製することができる。
【００２８】
発現ベクターの骨格は、例えば、プラスミド又はウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルスなどのウイルス由来ベクター）であり得る。発現ベクターとして、例えば、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＭＥ１８Ｓなどが使用され得る。発現ベクターとしては、目的遺伝子が選択マーカー又はレポーターと共に同一ｍＲＮＡから発現される、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターが好ましい。ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクターとしては、例えば、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Kitamuraら、Int. J. Hematol., 67, 351-9 (1998)）、及びClontech社により市販されているベクターなどが挙げられる。
【００２９】
発現ベクターで使用されるプロモーターは、細胞傷害性Ｔ細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター、ＬＣＫ近位プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーターなどの哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、プロモーターとして、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得る。
【００３０】
発現ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー又はレポーター遺伝子、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを含み得る。
【００３１】
選択マーカー及びレポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【００３２】
該発現ベクターの導入宿主となる細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞表面の自己のＭＨＣクラスＩ分子を非自己抗原と共に認識して標的細胞を殺傷する（ＭＨＣ拘束）、獲得免疫系（adaptive immune system）において機能する細胞である。このＴ細胞はＣＤ８陽性であるので、ＣＤ８ Ｔ細胞ともいう。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＴＣＲ（T cell Receptor）を介してリガンドに結合すると、ＴＣＲ複合体中のＣＤ３ζのＩＴＡＭ配列を介して活性化シグナルを伝達し、標的細胞を殺傷する。
【００３３】
本発明において使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、任意の動物種由来のものであり得る。このような動物種としては、ヒト、ヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類やウサギなどの実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明においてはヒト及びマウスの細胞傷害性Ｔ細胞が好ましく、臨床応用の観点から、ヒトの細胞傷害性Ｔ細胞がより好ましい。
【００３４】
細胞傷害性Ｔ細胞の遺伝子型は特に限定されないが、異常細胞を除去すべき投与対象の動物と同種同系、同種異系又は異種異系であり、好ましくは同種同系又は同種異系である。投与時の拒絶反応を回避するために、この細胞傷害性Ｔ細胞は、投与対象と同種同系であることが好ましく、投与対象由来（即ち、自家細胞）であることが最も好ましい。例えば、臓器移植患者などの場合、免疫抑制剤投与前に予め該患者から細胞傷害性Ｔ細胞を採取しておき、これに本発明のキメラレセプターを導入し、臓器移植後に該キメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を該患者に戻すなどの態様が、好ましく例示される。
【００３５】
本発明において使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、自体公知の方法によって、上記動物種の組織（例えば、脾臓、リンパ節、リンパ液、血液など）から単離及び／又は精製することが可能である。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法などにより単離することができる。
【００３６】
本発明において使用される細胞傷害性Ｔ細胞は、上記動物種より採取された細胞（例えば、初代培養細胞）又は細胞株であり得る。この細胞傷害性Ｔ細胞はポリクローナルであり得る。細胞株は既存の細胞株又は新たに作製される細胞株であり得る。細胞株は自体公知の方法により作製できる。
【００３７】
発現ベクターをＴ細胞に導入（形質導入）する方法は、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、ウイルス感染などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
発現ベクターが導入されたＴ細胞は、上記選択マーカー及びレポーター遺伝子などを利用して、セルソーターなどにより選択することができる。例えば、ＧＦＰの発現に基づいてフローサイトメーターによってソートすることができる。
【００３９】
選択されたＴ細胞の培養は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製した培地中で行うことができる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。培養培地は、例えば、血清（例えば、ＦＣＳ）、血清代替物（例えば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ））、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含むことができる。培養温度、ＣＯ２濃度などの他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。培地のｐＨは通常約６〜８であり、培養時間は通常４〜１４日間、好ましくは６〜１４日間である。培養における細胞数、各種因子の濃度などのその他の条件は、自体公知の方法により適宜設定できる。
【００４０】
上記のようにして調製される本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「本発明の細胞傷害性Ｔ細胞」ともいう）は、該キメラレセプターの細胞外領域に存在するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインを用いて、異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識し、該キメラレセプターの細胞質領域に存在するシグナル伝達アダプター分子部分を介した活性化シグナルによって活性化され、該異常細胞を傷害するので、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、該キメラレセプターが認識し得るリガンドを発現する異常細胞の除去に有用である。したがって、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、該異常細胞を病原とする各種疾患の予防・治療に用いることができる。
本発明に従って予防・治療され得る疾患としては、ウイルス感染症、癌などが挙げられる。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染症の予防・治療に特に適している。具体的には、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞により予防・治療されるウイルス感染症としては、ＣＭＶ（例えば、ＨＣＭＶまたはＭＣＭＶなど）、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスなどの感染症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「急性ウイルス感染症（本明細書中で「急性相感染」ともいう）」とは、あるウイルスによる最初の感染によって引き起こされる疾患をいう。本明細書中で使用する場合、「慢性ウイルス感染症」は、慢性化したウイルス感染症及び再発のウイルス感染症を含み、最初に感染したウイルスが排除されないまま体内に残ること、同じウイルスの再感染などによって引き起こされる。急性ウイルス感染症に対して一次免疫応答が生じ、慢性ウイルス感染症に対して二次免疫応答が生じる。この二次免疫応答には免疫記憶応答が関与している。本明細書中で使用する場合、「長期」とは、免疫記憶の確立によってもたらされる、慢性ウイルス感染症からの保護などをいう。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、急性及び慢性の両方のウイルス感染症を予防・処置することができる。
【００４２】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、単独で、あるいは他の治療のための任意の有効成分との混合物として、薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体とともに製剤化することができる。
【００４３】
本発明の異常細胞除去剤は、通常は、注射剤、点滴剤などの剤型で提供される。本発明の異常細胞除去剤は、好ましくは、受容者の体液（血液など）と等張な滅菌水性担体中に、本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞が懸濁された懸濁液である。水性担体としては、生理食塩水、ＰＢＳなどを挙げることができる。これらの水性担体には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤などを添加することもできる。
【００４４】
本発明の剤中に含まれる、本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の濃度は、通常、約１×１０５〜１×１０１０個／ｍｌ、好ましくは約２×１０５〜１×１０９個／ｍｌの範囲であるが、特に限定されない。細胞濃度が低すぎると、投与に時間がかかるため患者への負担が増大し、細胞濃度が高すぎると、細胞同士が凝集してしまう可能性がある。
【００４５】
本発明の剤の投与量は、本発明のキメラレセプターの発現量、投与様式、疾患の種類、疾患の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の受容性、体重、年齢などによって異なるが、所望の免疫活性を達成するような細胞数が適宜投与され得、通常、１回の投与につき、本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の数として、通常１×１０６〜１×１０９個／ｍ２、好ましくは１×１０７〜１×１０９個／ｍ２の用量で投与される。これらの投与量は、前述の種々の条件により変動する。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するが、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【００４７】
材料及び方法
マウス及び細胞株：
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢ６マウスは、Charles River Japanから購入した。Ｂ６バックグラウンドを有するＲＡＧ−２欠損マウスは、Taconic（Hudson,NY）から購入した。６〜８週齢のマウスを実験に使用した。ＤＢＡ／２由来の肥満細胞株Ｐ８１５、Ｂ６由来の胸腺腫細胞株ＲＭＡ、Ｌｙ４９Ａに対するｍＡｂ（Ａ１）のためのハイブリドーマ及び北村敏雄博士（東京大学）によって提供されたレトロウイルスパッケージング細胞株ＰＬＡＴ−Ｅをin vitroで維持した。Ｌｙ４９Ｈに対するｍＡｂのための３Ｄ１０ハイブリドーマは、W.M. Yokoyama博士（Washington University,St.Louis）により提供された。
【００４８】
レトロウイルスベクター及び形質導入：
Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプター、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラレセプター及び細胞質欠失Ｌｙ４９Ａのコンストラクトを、以前に記載したように（非特許文献８）ＰＣＲによって生成した。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプター及び細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈのコンストラクトについて、Ｌｙ４９ＨのＣ末端細胞外ドメインを、それぞれＣＤ３ζの細胞質ドメインあり又はなしでＬｙ４９Ａの膜貫通ドメインと融合させて、別のシグナル伝達分子との相互作用を回避した。これらのコンストラクトをｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの第１シストロン中に挿入した。W．Yokoyamaにより提供されたｍ１５７のｃＤＮＡ及びＨ２ＤｄのｃＤＮＡを、それぞれｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター又はｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４ベクター中に挿入した（非特許文献８）。上記細胞株へのこれらｃＤＮＡの形質導入を、以前に記載された通りに実施した（非特許文献８）。ＧＦＰ又はｈＣＤ４ポジティブな標的細胞を、MoFlowフローサイトメーター（Cytomation）によってソートした。
【００４９】
キメラレセプターを発現するポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞の生成：
脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞を磁気ビーズ（Miltenyi Biotec,CA）によって精製した。ソートした細胞を、０日目に、２００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を含む培地中、５μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３ Ａｂ及び２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。細胞を１日目及び２日目に感染させた。細胞を３日目に洗浄し、２００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２と共にもう２４時間増殖させた。約５０〜６０％のＣＤ８ Ｔ細胞が４日目にＧＦＰポジティブであった。これらの細胞をin vivoのウイルス保護アッセイに使用した。in vitroの殺傷アッセイのために、Ｌｙ４９Ｈ又はＬｙ４９Ａの表面発現についてＧＦＰポジティブ細胞をソートすることによって、細胞を精製した。
【００５０】
マウスサイトメガロウイルスの調製及び感染：
Smith株のＭＣＭＶ（VR194）を、American Tissue Culture Collection（Manassas,VA）から得た。ストック溶液を、ＭＣＭＶに感染したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の唾液腺から、以前に記載されたとおりに公知技術に従って調製した。このＭＣＭＶストック懸濁物のウイルス濃度は、以前に報告されたとおりに公知技術に従ってサブコンフルエントの３Ｔ３／Ｓｗｉｓｓアルビノ細胞を使用してプラークアッセイによって決定したところ、２．０×１０７ＰＦＵ／ｍｌであった。マウスに、ウイルスストックの腹腔内注射によってウイルスを感染させた。
【００５１】
ウイルスｍ１５７のＰＣＲ増幅及び配列：
ゲノムＤＮＡを、一般に使用されている市販のキットを使用して抽出した。ウイルスｍ１５７遺伝子を、French et.al.（French, A.R., and W.M. Yokoyama. 2003. Natural killer cells and viral infections. Curr Opin Immunol 15:45-51.）に記載されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、ＴＡクローニング（Invitrogen）中にサブクローニングし、配列決定した。ｍ１５７配列のＰＣＲ分析のために、図４Ｂ中に示される実験における死にかけのマウスを屠殺し、唾液腺を使用した。
【００５２】
実施例１
ポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞上でのキメラレセプターの発現：
初代細胞におけるキメラレセプターの機能を試験するために、バイシストロン性レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｐＩＧ）中にＬｙ４９Ｈ細胞外ドメイン、Ｌｙ４９Ａ膜貫通ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質ドメインを挿入したＬｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターコンストラクト（Ｌｙ４９ＨＺ）を調製した。Ｌｙ４９Ｈ発現の困難性及び他のシグナル伝達分子との会合を回避するために、原型的な阻害レセプターＬｙ４９Ａ由来の膜貫通ドメインでその膜貫通ドメインを置換した。コントロールとして、Ｌｙ４９Ｈ細胞外ドメイン及びＬｙ４９Ａ膜貫通ドメインを有するがＣＤ３ζ細胞質ドメインを有さない、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈコンストラクト（Ｌｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌ）もまた調製した。レトロウイルスの系を使用して、これらのキメラレセプターをＭＣＭＶ感受性ＢＬＡＢ／ｃ株（Ｈ−２ｄハプロタイプ）由来のＣＤ８ Ｔ細胞中に形質導入した。形質導入後に約５０〜６０％のＧＦＰポジティブ細胞が得られ、これらのＧＦＰポジティブ細胞の殆どがＬｙ４９Ｈ特異的ｍＡｂによってポジティブに染色された。ＧＦＰポジティブ細胞をエフェクター細胞としてソートしたところ、それらのうち９０％より多くがＬｙ４９Ｈポジティブであった（図１Ａ）。標的細胞としてＤＢＡ２由来のＰ８１５（Ｈ−２ｄ）を準備した。Ｐ８１５中にｐＭＸ−ｍ１５７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（コントロールとして）を形質導入し、それぞれＰ８１５−ｍ１５７及びＰ８１５−vectorとした（図１Ｂ）。これらのエフェクター細胞及び標的細胞を使用して、in vitroの５１Ｃｒ放出アッセイを実施した。Ｌｙ４９ＨＺレセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｐ１８５−ｍ１５７を殺傷する能力を獲得したが、Ｌｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞はこの能力を獲得できなかった。このことは、ポジティブなシグナルが、Ｌｙ４９Ｈレセプターとｍ１５７との結合によって促進される他のシグナル伝達分子を介したものではなく、実際にキメラレセプターのＣＤ３ζ部分を介したものであることを示している（図１Ｃ）。形質導入したキメラレセプターの特異性のさらなる支持として、抗Ｌｙ４９Ｈ特異的ｍＡｂは、Ｐ１８５−ｍ１５７の殺傷をブロックしたが、コントロールＡｂはブロックしなかった（図１Ｃ及びデータ示さず）。特に、これらの形質導入されたＣＤ８ Ｔ細胞は、親Ｐ１８５細胞及びＰ１８５−vector形質導入コントロール細胞に対する寛容を維持した。これらのデータは、Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを形質導入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞がｍ１５７を特異的に認識して標的細胞を殺傷することを示す。
【００５３】
実施例２
ネイティブのレセプター機能の変換：
ｍ１５７タンパク質は、１２９／Ｊマウスにおいて発現されるＬｙ４９ファミリーのメンバーである阻害ＮＫ細胞レセプターＬｙ４９Ｉ１２９に結合することが示されている（Arase, H., E.S. Mocarski, A.E. Campbell, A.B. Hill, and L.L. Lanier. 2002. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors. Science296:1323-1326.）。Ｃ５７ＢＬ／６由来のＬｙ４９ＡＢ６（Ｌｙ４９Ａ）は、このファミリーメンバー中の原型的なＮＫ細胞阻害レセプターである。Ｌｙ４９ＡはＭＨＣクラスＩのＨ−２Ｄｄを認識し、その特異性は、マウスＮＫ細胞レセプターの中で最も特徴付けられている（Karlhofer, F.M., R.K. Ribaudo, and W.M. Yokoyama. 1992. MHC class I alloantigen specificity of Ly-49+ IL-2-activated natural killer cells. Nature 358:66-70.、Tormo, J., K. Natarajan, D.H. Margulies, and R.A. Mariuzza. 1999. Crystal structure of a lectin-like natural killer cell receptor bound to its MHC class I ligand. Nature402:623-631.）。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを用いてポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞の特異性を変化させたので、次に、in vitroの５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、Ｌｙ４９ＡとＣＤ３ζとのキメラレセプターを操作することによって初代ＣＤ８ Ｔ細胞においてネイティブのレセプター機能を変換できるか否かを試験した。Ｌｙ４９Ａの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとをＣＤ３ζ細胞質ドメインと融合させて作製したＬｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラレセプターコンストラクト（Ｌｙ４９ＡＺ）を調製した。コントロールとして、Ｌｙ４９Ａの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのみで作製した細胞質欠失Ｌｙ４９Ａ（Ｌｙ４９Ａｃｙｔｏ−ｄｅｌ）もまた調製した。標的細胞として、Ｃ５７ＢＬ６（Ｂ６）由来のＴ細胞株であるＲＭＡを準備した。ＲＭＡ中にＨ−２Ｄｄ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＩＲＥＳ−ＧＦＰ（形質導入コントロールとして）を形質導入し、それぞれ、ＲＭＡ−Ｈ−２Ｄｄ及びＲＭＡ−ＧＦＰとした。Ｌｙ４９Ａの内因性リガンドを発現しないＣ５７ＢＬ６マウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞中に、Ｌｙ４９Ａキメラレセプターを形質導入した（図２Ａ）。細胞質欠失Ｌｙ４９Ａレセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞はＲＭＡ−Ｈ２Ｄｄを殺傷することができなかった。一方で、Ｌｙ４９ＡＺレセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞はＲＭＡ−Ｈ２Ｄｄを有効に殺傷したが、ＲＭＡもＲＭＡ−ＧＦＰも殺傷しなかった（図２Ｂ）。さらに、ＲＭＡ−Ｈ２Ｄｄの殺傷は、Ｌｙ４９Ａ特異的ｍＡｂであるＡ１によってブロックされた（図２Ｃ）。これらのデータは、Ｌｙ４９ＡＺレセプターを形質導入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞がそのリガンドを特異的に認識して標的細胞を殺傷することを示す。合わせて考えると、これらのデータは、細胞質ＣＤ３ζと融合したＮＫ細胞レセプターを形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞が、そのレセプターのネイティブの性質（阻害又は活性化）に関わらず、ネイティブのＮＫ細胞レセプターの特異性を獲得して、標的細胞を殺傷できることを示す。
【００５４】
実施例３
Ｌｙ４９Ｈキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によってＭＣＭＶ感染からレスキューされたＢＡＬＢ／ｃマウス
Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを形質導入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞によって、ｍ１５７発現細胞のin vitroでの首尾よい殺傷がもたらされたので、本発明者は、これらの細胞がin vivoでＭＣＭＶ感染を制御する能力を評価した。Ｌｙ４９Ｈの発現を欠くＢＡＬＢ／ｃマウスはＭＣＭＶ感染に対して感受性であり、１×１０４ｐｆｕのＭＣＭＶでの接種後２週間以内に死亡した（図３Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞を準備し、Ｌｙ４９ＨＺ又はＬｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌのいずれかを含むレトロウイルスをこの細胞に形質導入した。ＭＣＭＶ感染の当日、Ｌｙ４９ＨＺレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞１×１０７を注入し、次いで、致死用量のＭＣＭＶをマウスに感染させた。細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈを発現するコントロールＣＤ８ Ｔ細胞を注入したマウス及び細胞を注入していないマウスは１０日以内に死亡したが、Ｌｙ４９ＨＺレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞を注入したマウスは致死用量のＭＣＭＶ感染の急性相を生存した（図３Ａ）。このことと一致して、予備研究（データ示さず）において、注入したキメラレセプター発現細胞の数と生存との間の正の相関が観察された。生存マウスは、最初の感染の１ヵ月後に健康なままであった。
【００５５】
実施例４
ウイルス感染の有効な制御は、自然免疫及び獲得免疫の両方を必要とする。従って、最初のチャレンジと同じウイルス用量のＭＣＭＶでマウスを再チャレンジすることによって、これらの生存したマウスが獲得免疫を発達させたか否かをさらに試験した。最初の感染の４０日後に、ＣＤ８ Ｔ細胞をさらに注入することなくマウスを再チャレンジし、生存を観察した。ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスは１０日以内に死亡したが、再チャレンジしたマウスは全て生存し、このことは、これらのマウスにおける有効な記憶応答の確立を示す（図３Ｂ）。記憶応答における注入されたＣＤ８ Ｔ細胞の寄与を評価するために、再チャレンジの１０日後に生存マウスの脾臓中のＣＤ８ Ｔ細胞を評価した。興味深いことに、ＣＤ８集団中にＧＦＰポジティブ細胞もＬｙ４９Ｈポジティブ細胞も検出されなかった（図３Ｃ）。再チャレンジの７日後に分析した脾細胞からは、ＧＦＰポジティブ細胞は観察されなかった（データ示さず）。
【００５６】
実施例５
ＲＡＧ−２欠損Ｂ６マウスの一過的なレスキュー：
上記実験において、移入した全てのＣＤ８ Ｔ細胞を、形質導入前にα−ＣＤ３ ｍＡｂ及びα−ＣＤ２８ ｍＡｂで刺激したところ、注入したＣＤ８ Ｔ細胞の約４０〜５０％はＧＦＰ発現についてネガティブであった。内因性Ｔ細胞又は注入されたＴ細胞のいずれが抗ＣＭＶ記憶応答に寄与しているかは明らかではなく、この記憶の形成が生存に如何に寄与したかも明らかではなかった。これらの問題点に取り組むため、Ｂ６ ＲＡＧ２欠損（Ｂ６−ＲＡＧ２）マウスを使用した。Ｂ６−ＲＡＧ２マウスはＴ細胞及びＢ細胞を欠くので、内因性Ｔ細胞からＣＭＶクリアランスに必要な獲得記憶応答を形成することができない。Ｌｙ４９ＨＺを形質導入した後に、Ｂ６マウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞をＢ６−ＲＡＧ２マウス中に移入した。Ｂ６−ＲＡＧ２マウスはＬｙ４９Ｈを発現するＮＫ細胞を有するのでＭＣＭＶに対して耐性であるため、より高い用量のＭＣＭＶ（マウス１匹当たり１×１０７ｐｆｕ）でチャレンジした。コントロールとして、ＣＤ８ Ｔ細胞中にＬｙ４９Ｈｃｙｔｏ−ｄｅｌを形質導入し、これらをＲＡＧ２欠損Ｂ６マウス中に注入した。ＢＡＬＢ／ｃモデルと同様に、全てのＲＡＧ２欠損Ｂ６マウス、及びコントロールの細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈを発現するＣＤ８ Ｔ細胞を注入したＲＡＧ２欠損Ｂ６マウスの殆どは１０日以内に死亡したが、Ｌｙ４９ＨＺを発現するＣＤ８ Ｔ細胞を移入したＲＡＧ２欠損Ｂ６マウスは生存した（図４Ａ）。これらのデータは、急性相感染が、移入されたＣＤ８ Ｔ細胞によって実際に制御されたことを示す。第２の実験において、第１の実験と同じ短期生存パターンが観察された。しかし、感染の１ヵ月後、全ての生存マウスが死亡した（図４Ｂ）。これらのデータは、注入されたＣＤ８ Ｔ細胞自体が長期記憶を形成することができたわけではないことを示唆する。この遅延相の死亡の機構に取り組むために、死にかけのＲＡＧ２欠損Ｂ６マウス（ｎ＝１）から脾臓及び唾液腺を単離した。平均ウイルス力価は、脾臓、肝臓、唾液腺及び肺においてそれぞれ４．４×１０６、２．０×１０７、３．６×１０８及び５．７×１０７であり、このことは、遅延相の死亡がＭＣＭＶの再活性化に起因するものであることを示唆する。
【００５７】
本明細書において、致死用量のＭＣＭＶでチャレンジしたマウスをレスキューするための、首尾よい細胞免疫学的ストラテジーを記載してきた。内因性のＮＫ細胞が致死的なウイルスチャレンジからＢ６−ＲＡＧ−２マウスを保護できない条件において、ウイルスタンパク質に特異的なキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の注入により、この致死的なチャレンジが克服された。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によって生存したＢＡＬＢ／ｃマウスは、高用量のウイルス再チャレンジを明らかに制御し、このことは、記憶細胞の有効な増殖及び細胞傷害活性を示唆する。従って、本明細書中に提供されるデータは、キメラ活性化レセプター遺伝子を移入したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞が、ＮＫ細胞の機能を模倣することによって、自然免疫応答の重要な役割を果たし得ることを示している。さらに、in vitroデータは、ネイティブの阻害レセプターが、その細胞質ドメインをＣＤ３ζの細胞質ドメインと交換することによって、初代ＣＤ８ Ｔ細胞において活性化レセプターに変換され得ることもまた示唆している。
【００５８】
ペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の生成が所望され、免疫無防備の移植患者において疾患を引き起こすいくつかのウイルスについて確立されている（Riddell, S.R., and P.D. Greenberg. 1995. Principles for adoptive T cell therapy of human viral diseases. Annual Review of Immunology 13:545-586.）。ヒト同種移植の設定において所定のＭＨＣ拘束様式であつらえたペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の生成は、リガンドの認識についてＭＨＣ拘束を必要とするが、ＣＤ３ζの細胞質ドメインを有するウイルスタンパク質特異的ＮＫ細胞キメラレセプターは、リガンドの認識についてＭＨＣ拘束を必要としない。ヒト及びマウスの両方において、末梢中の細胞の最初の割合が異なるので、多数のＴ細胞を得ることはＮＫ細胞よりも容易である。
移入されたＣＤ８ Ｔ細胞は急性相感染を有効に制御し、これは、有効な長期獲得免疫を導く。本明細書中のデータは、ＣＭＶ感染に対する獲得免疫応答が内因性Ｔ細胞によって媒介されることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞は、ＮＫ細胞によるＭＨＣ非拘束的なリガンド認識により、ウイルス感染症や癌などにおける異常細胞（即ち、ウイルス感染細胞や癌細胞）を認識してこれを傷害することができ、なおかつウイルス感染や癌からの長期的な保護をもたらし得るので、急性及び慢性のウイルス感染症、あるいは癌およびその再発を予防・治療するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によるｍ１５７ポジティブ標的細胞の特異的殺傷を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ８ Ｔ細胞に、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ又はＬｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターのいずれかを含むレトロウイルスを感染させた。細胞を、そのＧＦＰ発現によってエフェクター細胞としてソートした。ソートした細胞上のＣＤ８、ＧＦＰ及びＬｙ４９Ｈの発現が示される。
【図１Ｂ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によるｍ１５７ポジティブ標的細胞の特異的殺傷を示す図である。Ｐ８１５細胞に、ｍ１５７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ又はＩＲＥＳ−ＧＦＰのいずれかを形質導入し、そのＧＦＰ発現に基いてソートした。各形質導入体中のＧＦＰ発現が示される。
【図１Ｃ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によるｍ１５７ポジティブ標的細胞の特異的殺傷を示す図である。５１Ｃｒ放出アッセイを、ｍ１５７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現するＰ８１５細胞（丸）又はＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現するＰ８１５細胞（四角）を標的細胞として用い、Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（白抜き記号）又は細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（黒塗り記号）をエフェクター細胞として用いて実施した。Ｌｙ４９Ｈ Ａｂ（培養物上清の１／２０希釈）の存在下での細胞傷害活性を白抜きの三角で示した。４回の独立した実験からの代表的なデータが示される。別個の実験において、標的及びエフェクターの各組み合わせについて、コントロールｍＡｂの存在下では効果は観察されなかった（データ示さず）。
【図２Ａ】ＣＤ３ζキメラレセプターとの融合による、ネイティブの阻害レセプター機能の活性化レセプターへの変換を示す図である。Ｂ６ ＣＤ８ Ｔ細胞に、細胞質欠失Ｌｙ４９Ａ又はＬｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラレセプターのいずれかを含むレトロウイルスを感染させた。細胞を、そのＧＦＰ発現によってエフェクター細胞としてソートし、Ｌｙ４９Ａ表面発現について分析した。
【図２Ｂ】ＣＤ３ζキメラレセプターとの融合による、ネイティブの阻害レセプター機能の活性化レセプターへの変換を示す図である。ＲＭＡ細胞に、コントロールとしてのＩＲＥＳ−ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）又はＨ２Ｄｄ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４のいずれかを形質導入し、ｈＣＤ４発現によってソートした。これらの細胞のＨ−２Ｄｄ及びｈＣＤ４の発現を、細胞溶解アッセイの前に決定した。
【図２Ｃ】ＣＤ３ζキメラレセプターとの融合による、ネイティブの阻害レセプター機能の活性化レセプターへの変換を示す図である。５１Ｃｒ放出アッセイを、ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４を形質導入したＲＭＡ細胞（四角）又はＨ２Ｄｄ−ＩＲＥＳ−ｈＣＤ４を形質導入したＲＭＡ細胞（丸及び三角）を標的細胞として用い、Ｌｙ４９Ａ−ＣＤ３ζキメラを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（白抜き記号）又は細胞質欠失Ｌｙ４９Ａを発現するＣＤ８ Ｔ細胞（黒塗り記号）をエフェクター細胞として用いて実施した。Ｌｙ４９Ａ Ａｂ（培養物上清の１／２０希釈）の存在下での細胞傷害活性を三角で示す。３回の独立した実験からの代表的なデータが示される。別個の実験において、標的及びエフェクターの各組み合わせについて、アイソタイプが一致したコントロールｍＡｂの存在下では効果は観察されなかった（データ示さず）。
【図３Ａ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による致死的ＭＣＭＶ感染からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護、及び記憶応答の確立を示す図である。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラ（黒塗り三角）を発現するか、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ（白抜き三角）を発現するか、又は何も発現しない（黒塗り四角）５×１０６のＣＤ８ Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹）中に注射した。次いで、マウスにＭＣＭＶ（マウス１匹当たり１０４ＰＦＵ）を感染させ、生存についてモニタリングした。
【図３Ｂ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による致死的ＭＣＭＶ感染からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護、及び記憶応答の確立を示す図である。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞によって最初のＭＣＭＶ感染から保護された１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（黒塗り三角）を、最初の感染の４０日後に、ＣＤ８ Ｔ細胞をさらに注入することなくＭＣＭＶで再チャレンジした。コントロールとして、ナイーブな未感染ＢＡＬＢ／ｃマウス（黒塗り四角）（１群当たり５匹のマウス）に、同量のウイルスを感染させた。２回の実験からの代表的なデータが示される。
【図３Ｃ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による致死的ＭＣＭＶ感染からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護、及び記憶応答の確立を示す図である。図３Ｂと同様に処理したマウス由来の脾細胞（黒塗り三角の群）を、再チャレンジの１０日後にＧＦＰポジティブなＣＤ８ Ｔ細胞の存在について分析した。３匹のマウスからの代表的なデータが示される。
【図４Ａ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による、致死的なＭＣＭＶ感染からの免疫不全マウスの保護を示す図である。Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラ（黒塗り三角）を発現するか、細胞質欠失Ｌｙ４９Ｈ（白抜き三角）を発現するか、又は何も発現しない（黒塗り四角）５×１０６のＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｂ６−ＲＡＧ２欠損マウス（１群当たり５匹）中に注射した。次いで、マウスにＭＣＭＶ（マウス１匹当たり１０７ＰＦＵ）を感染させ、生存についてモニタリングした。
【図４Ｂ】Ｌｙ４９Ｈ−ＣＤ３ζキメラレセプターを発現するＣＤ８ Ｔ細胞による、致死的なＭＣＭＶ感染からの免疫不全マウスの保護を示す図である。マウス（１群当たり５匹）を、図４Ａと同様に処理し、延長された期間にわたってモニタリングした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体にとって望ましくない異常細胞の除去剤であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有してなる剤。
【請求項２】
ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
異常細胞がウイルス感染細胞である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
ウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項３に記載の剤。
【請求項５】
サイトメガロウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、請求項４に記載の剤。
【請求項６】
ＮＫ細胞レセプターがヒト由来である、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、請求項６に記載の剤。
【請求項８】
サイトメガロウイルスがマウスサイトメガロウイルスである、請求項４に記載の剤。
【請求項９】
ＮＫ細胞レセプターがマウス由来である、請求項１〜５及び８のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、請求項９に記載の剤。
【請求項１１】
ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈである、請求項１０に記載の剤。
【請求項１２】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の剤。
【請求項１３】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１４】
キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、請求項１〜１３のいずれかに記載の剤。
【請求項１５】
急性ウイルス感染症の予防・治療用である、請求項１〜１４のいずれかに記載の剤。
【請求項１６】
慢性ウイルス感染症の予防・治療用である、請求項１〜１４のいずれかに記載の剤。
【請求項１７】
生体にとって望ましくない異常細胞の除去方法であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の有効量を、該異常細胞を有する生体に投与することを含む方法。
【請求項１８】
（ａ）ウイルス感染ヒト細胞で特異的に発現するリガンドを認識するヒトＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプタータンパク質。
【請求項１９】
ウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、請求項１８又は１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、請求項１８〜２０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２２】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、請求項１８〜２１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２３】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、請求項１８〜２３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２６】
請求項２５記載の核酸を含む、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞で機能し得る発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６記載の発現ベクターでトランスフェクトされたヒト細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１】
生体にとって望ましくない異常細胞の除去剤であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を含有してなる剤。
【請求項２】
ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
異常細胞がウイルス感染細胞である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
ウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項３に記載の剤。
【請求項５】
サイトメガロウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、請求項４に記載の剤。
【請求項６】
ＮＫ細胞レセプターがヒト由来である、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、請求項６に記載の剤。
【請求項８】
サイトメガロウイルスがマウスサイトメガロウイルスである、請求項４に記載の剤。
【請求項９】
ＮＫ細胞レセプターがマウス由来である、請求項１〜５及び８のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、請求項９に記載の剤。
【請求項１１】
ＮＫ細胞レセプターがＬｙ４９Ｈである、請求項１０に記載の剤。
【請求項１２】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の剤。
【請求項１３】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、請求項１２に記載の剤。
【請求項１４】
キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、請求項１〜１３のいずれかに記載の剤。
【請求項１５】
急性ウイルス感染症の予防・治療用である、請求項１〜１４のいずれかに記載の剤。
【請求項１６】
慢性ウイルス感染症の予防・治療用である、請求項１〜１４のいずれかに記載の剤。
【請求項１７】
生体にとって望ましくない異常細胞の除去方法であって、
（ａ）該異常細胞で特異的に発現するリガンドを認識するＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプターを発現する細胞傷害性Ｔ細胞の有効量を、該異常細胞を有する生体に投与することを含む方法。
【請求項１８】
（ａ）ウイルス感染ヒト細胞で特異的に発現するリガンドを認識するヒトＮＫ細胞レセプターの細胞外ドメインと、
（ｂ）ＩＴＡＭ配列を含むシグナル伝達アダプター分子の全部もしくは一部と、
を含むキメラレセプタータンパク質。
【請求項１９】
ウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＮＫ細胞レセプターが活性化レセプターである、請求項１８又は１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＮＫ細胞レセプターがＮＫＲＰ１Ａ、ＮＫＲＰ１Ｃ、ＮＫＲＰ１Ｆ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＳ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｅからなる群より選択される、請求項１８〜２０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２２】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２／ＫＡＲＡＰおよびＦｃＲγからなる群より選択される、請求項１８〜２１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２３】
シグナル伝達アダプター分子がＣＤ３ζである、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記キメラレセプターの膜貫通ドメインがＮＫ細胞活性化レセプター由来でない、請求項１８〜２３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２６】
請求項２５記載の核酸を含む、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞で機能し得る発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６記載の発現ベクターでトランスフェクトされたヒト細胞傷害性Ｔ細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公開番号】特開２００８−５７２２（Ｐ２００８−５７２２Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７７１９５（Ｐ２００６−１７７１９５）
【出願日】平成１８年６月２７日（２００６．６．２７）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２７日（２００６．６．２７）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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