サイクリックＧＭＰ解析方法
【課題】細胞本来の状態を正確に定量できるサイクリックＧＭＰ解析方法を提供する。
【解決手段】発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【解決手段】発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリックＧＭＰ解析方法および当該方法に使用されるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのホルモンや神経伝達物質はＧタンパク質共役型受容体に働き、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こしている。また、細胞活動の多様性は、細胞内のセカンドメッセンジャーの時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の細胞活動に関する細胞内情報伝達を解析するにあたって、セカンドメッセンジャーの時空間的な変化をリアルタイムに捉えることが必要である。
【０００３】
細胞内セカンドメッセンジャーの１つである環状グアノシン一リン酸（サイクリックＧＭＰ）は、生体内において各種生化学反応過程のシグナル伝達分子として作用している。これまでに、循環器系筋細胞の弛緩、網膜における光受容−伝達、上皮における電解質運搬、骨の成長、ニューロンの活性化等の様々な生理的プロセスがサイクリックＧＭＰによって制御されていることが明らかになっている。したがって、生細胞中でのサイクリックＧＭＰの合成、分解、局在等がわかれば、細胞および組織レベルでの循環器系、腎臓、網膜、嗅覚、中枢神経等の作用機構が解明されるだけでなく、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を調節する薬剤に関する知見を得ることが可能になると期待される。
【０００４】
従来、サイクリックＧＭＰの測定は、放射線ラベルした化合物を使用し、多数の細胞に対して行われている。また、近年、いくつかのサイクリックＧＭＰバイオセンサーが見出され、細胞レベルでのサイクリックＧＭＰの測定が可能になっている。
【０００５】
例えば、特許文献１および非特許文献１には、シアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）と黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）との蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用し、サイクリックＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）Ｉα遺伝子と蛍光タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子を用いてイメージングするサイクリックＧＭＰ解析方法が開示されている。具体的には、ＰＫＧＩα遺伝子配列の両端にＹＦＰおよびＣＦＰの配列を融合して細胞内で発現させている。通常の状態では、ＣＦＰを励起してもＦＲＥＴが起こらないためＹＦＰの蛍光は観察されない。一方、細胞内のサイクリックＧＭＰが増加するとＰＫＧＩαの立体構造が変化し、ＦＲＥＴが起こるためアクセプターであるＹＦＰの蛍光が観察される。このＦＲＥＴシグナルを観察することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化を観察できることが明らかにされている。
【０００６】
また、特許文献２には、ある種のＣＮＧチャネルおよびカルシウム感受性発光タンパク質を利用する、細胞内の環状ヌクレオチドであるサイクリックＧＭＰおよびサイクリックＡＭＰ濃度を定量解析する方法が開示されている。この方法では、細胞内に、環状ヌクレオチドにより活性化される特定のイオンチャネル（ＣＮＧチャネル）およびカルシウム感受性発光タンパク質を発現させている。このとき細胞内のサイクリックＧＭＰまたはサイクリックＡＭＰが増加すると、ＣＮＧチャネルが開口し、それによりカルシウムイオンが流入する。流入したカルシウムは、Ｆｕｒａ−２もしくはＦｌｏｕ−３等のカルシウム感受性発光インジケーター、またはエクオリンもしくはオベリンといったカルシウム感受性発光タンパク質により検出できることが明らかにされている。
【０００７】
また、非特許文献２には、青色発光タンパク質と緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）との発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用する、サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）のサイクリックＧＭＰ結合ドメイン遺伝子に発光タンパク質遺伝子および蛍光タンパク質遺伝子を融合して観察するサイクリックＧＭＰ解析方法が開示されている。ＰＤＥ５ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメイン遺伝子、青色発光タンパク質であるレニラルシフェラーゼ遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子を融合したタンパク質を発現させた細胞に対し、ルシフェラーゼの基質となるセレンテラジンを添加すると青色の発光が観察されている。この細胞において細胞内サイクリックＧＭＰが増加すると、サイクリックＧＭＰ結合ドメインの立体構造が変化してルシフェラーゼの発光からＥＧＦＰの蛍光へ発光−蛍光共鳴エネルギーシフト（ＢＲＥＴ）が起こり、ＥＧＦＰの蛍光が検出される。このＢＲＥＴシグナルを検出することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化を検出できることが明らかにされている。
【０００８】
また、特許文献３には、ヒトサイクリックＧＭＰ活性化プロテインキナーゼ由来Ｂドメイン（ＧＫＩ−Ｂ）またはヒトホスホジエステラーゼ２Ａ（ＰＤＥ２Ａ）のサイクリックＧＭＰ結合ドメインと円順列置換したホタルルシフェラーゼとを融合したタンパク質を利用して細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を定量解析する方法が開示されている。この方法では、ＧＫＩ−ＢまたはＰＤＥ２ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメイン遺伝子と円順列置換したホタルルシフェラーゼ遺伝子とを融合したタンパク質を発現させた細胞に、ルシフェラーゼの基質となるルシフェリンを添加し、細胞からの発光を計測している。細胞内のサイクリックＧＭＰが増加すると、サイクリックＧＭＰ結合ドメインの立体構造が変化してルシフェラーゼの発光が消失または増強する。この発光シグナルを検出することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化を検出できることが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３６４３５２０号公報
【特許文献２】特表２００６−５２０２０３号
【特許文献３】特表２００９−５３２０６３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｏｎｄａ Ａ， Ａｄａｍｓ ＳＲ， Ｓａｗｙｅｒ ＣＬ， Ｌｅｖ−Ｒａｍ Ｖ， Ｔｓｉｅｎ ＲＹ， Ｄｏｓｔｍａｎｎ ＷＲＧ． “Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ， ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ｖｏｌ．９８， ｎｏ．５， ｐｐ．２４３７−２４４２， ２００１
【非特許文献２】Ｂｉｓｗａｓ ＫＨ， Ｓｏｐｏｒｙ Ｓ， Ｖｉｓｗｅｓｗａｒｉａｈ ＳＳ． “Ｔｈｅ ＧＡＦ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃＧＭＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ， ｃＧＭＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ （ＰＤＥ５） ｉｓ ａ ｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ ａ ｓｉｎｋ ｆｏｒ ｃＧＭＰ．” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４７， ｐｐ．３５３４−３５４３， ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１または非特許文献１に開示されるようなＰＫＧ酵素を利用する方法では、レポーターのサイクリックＧＭＰ結合部位にＰＫＧの全長または酵素ドメインが含まれるため、レポーターがリン酸化酵素活性を有し、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすという問題があった。また、蛍光タンパク質を用いるため、その影響で細胞内に存在する不特定のタンパク質が励起され蛍光を生じ（自己蛍光）、シグナル／ノイズ比を下げるという問題があった。さらに、ダイナミックレンジが狭いことにより、利用可能な測定対象の範囲が狭いという問題があった。
【００１２】
特許文献２に開示されるようなＣＮＧチャネルおよびカルシウム感受性発光タンパク質を利用する方法では、２種類以上の遺伝子を同時に導入することが必要となり、細胞内への導入および発現効率が低いという問題があった。また、当該方法では、細胞内にカルシウムイオンが流入するため、細胞内の情報伝達に影響を及ぼし、細胞の本来の状態を測定できない可能性があるという問題があった。
【００１３】
非特許文献２に開示されるような発光タンパク質と蛍光タンパク質とのＢＲＥＴを用いる方法では、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定が行われるため、単一の細胞における測定は最適化されておらず又は不可能であり、利用可能な測定方法の範囲が狭いという問題があった。特に、ＢＲＥＴの変換効率が低くシグナルが小さくなるため、イメージングに使用できる程度のシグナル／ノイズ比が得られない。
【００１４】
特許文献３に開示されるような円順列置換ルシフェラーゼとＧＫＩ−ＢまたはＰＤＥ２ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメインとの融合タンパク質を用いる方法では、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定が行われるため、単一の細胞における測定は最適化されておらず又は不可能であり、利用可能な測定方法の範囲が狭いという問題があった。特に、当該融合タンパク質からの発光量が小さいため、イメージングに使用できる程度のシグナル／ノイズ比が得られない。
【００１５】
本発明は、上述のような従来技術が抱える数々の問題に鑑みてなされたものであり、細胞本来の状態を正確に定量できるサイクリックＧＭＰ解析方法を提供することを目的とする。特に、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてサイクリックＧＭＰ濃度の変化を再現性良く経時的に観察することができるサイクリックＧＭＰ解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施態様によれば、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法が提供される。
【００１７】
また、本発明の一実施態様に因れば、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞内のサイクリックＧＭＰに関する情報を正確且つ定量的に個々の細胞から得ることができ、その結果、個々の細胞において細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を再現性良く観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【図２】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図３】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図４】発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】スプリットルシフェラーゼアッセイ法を用いたｃＧＭＰの検出原理を示す図である。
【図６】種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質について、ルミノメーターによって測定した発光量を示すグラフ図である。
【図７】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激前の発光画像を示す図である。
【図８】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激５分後の発光画像を示す図である。
【図９】選択した細胞での８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激によるＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃの発光強度の経時変化を示した図である。
【図１０】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激前の発光画像を示す図である。
【図１１】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激５分後の発光画像を示す図である。
【図１２】選択した細胞での８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激によるＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃの発光強度の経時変化を示した図である。
【図１３】ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激前の発光画像を示す図である。
【図１４】ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激５分後の発光画像を示す図である。
【図１５】選択した細胞での８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激によるｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎの発光強度の経時変化を示した図である。
【図１６】種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の作製を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［方法］
以下に、本発明に係る方法について説明する。
本発明は、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法に関する。
【００２１】
簡潔には、本発明は、対象とする細胞にサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を導入し、発光基質を与えて発光を誘導し、その様子を撮像し、撮像した画像に基づいてｃＧＭＰ濃度を特定等する方法に関する。
【００２２】
本発明によれば、細胞内のサイクリックＧＭＰの状態を解析することができる。特に、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を定量的に測定することが可能である。また、測定はイメージングによって行うことができるため、細胞ごとに測定が可能であり、さらには細胞内の細胞小器官等の構造に絞って測定することもできる。さらに、一定間隔で同一の測定領域を測定することで、サイクリックＧＭＰ濃度の刺激に対する変化および時間的変化を解析することができる。細胞ごとに測定することで、細胞間の差異を解析することもできる。
【００２３】
細胞作製工程では、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞が作製される。サイクリックＧＭＰセンサータンパク質とは、発光酵素の２つのポリペプチド断片と、サイクリックＧＭＰに結合できるポリペプチド断片と、任意にその他のポリペプチド断片とが融合したタンパク質であって、サイクリックＧＭＰの存在に応じて当該発光酵素の活性が消失または回復するタンパク質である。サイクリックＧＭＰセンサータンパク質の詳細については後述する。対象となる細胞の種類に限定はなく、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞等を使用できる。動物細胞が使用される場合、特に哺乳細胞が使用され、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞が使用される。細胞は、生体組織の一部として培養された細胞集合体であってもよいし、生体組織が属している臓器等や生命個体の形態でもよい。細胞に対してサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を導入する方法に特別な限定はなく、既知の導入方法が使用できる。１つの方法は、当該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を細胞に導入し、その後細胞内で当該タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから当該タンパク質を発現させることができる。ベクターから発現させるのではなく、当該核酸がゲノムに組み込まれた細胞を作製した後、ゲノムから当該タンパク質を発現させることもできる。別の方法は、細胞外で精製した当該タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって当該タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、当該タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって当該タンパク質を細胞に取り込ませることができる。
【００２４】
添加工程では、細胞作製工程にて作製された細胞に対し発光基質が添加される。本発明に係る方法は発光酵素による発光反応を利用するが、この発光反応を生じさせるためには発光基質が必要となる。発光基質は使用する発光酵素に応じて選択される。発光基質の詳細は後述する。発光基質を添加する方法に特別限定はなく、適宜選択できる。例えば、培養液に添加することで、培養液を介して細胞に発光酵素を取り込ませることができる。また、マイクロインジェクション法によって、発光基質を細胞内に直接注入することもできる。発光基質の添加のタイミングも適宜選択できる。例えば、細胞へのサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の導入の前に、それと同時に、またはその後に発光基質を添加することができる。例えば、一連の操作を通して、細胞を取り扱うための培養液中に発光基質を含めておくことができる。または、マイクロインジェクションにて当該タンパク質および発光基質を同時に細胞に注入することができる。好ましくは、発光基質は測定の直前に添加される。発光基質の添加量に特別な限定はないが、好ましくは、発光酵素が発光反応を生じるために十分な量で添加される。
【００２５】
撮像工程では、発光反応が生じている細胞の画像が取得される。撮像は任意のタイミングで行うことができるが、好ましくは、基質添加から一定時間後に行われる。特に複数の測定を繰り返す場合、測定結果のばらつきを抑えるために、複数の測定を通じて同一のタイミングで撮像することが好ましい。撮像時間は条件に応じて最良の時間が適宜選択される。発光強度が小さい場合、撮像時間（顕微鏡を使用する場合、露出時間）は長くされ、逆に発光強度が大きすぎる場合、撮像時間は短くされる。例えば、５から１０秒間の露出時間とすることができる。撮像は、発光反応に係る波長の光のみを取得して行うこともできるが、それと同時に明視野画像または別の波長の光による画像を取得してもよい。例えば、細胞にサイクリックＧＭＰセンサータンパク質と同時にプローブ（例えば蛍光または発光タンパク質）を融合した特定のタンパク質を導入し、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質に由来する光と同時に、当該特定のタンパク質からの光を検出してもよい。なお、撮像に使用される装置については後述する。
【００２６】
解析工程では、取得された画像に基づいて、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度等の解析が行われる。解析は、コンピュータにて機能するソフトウェアを使用して、発光量を数値に変換してもよい。当該数値を利用して、スタンダードとの比の算出、試料間の比較等が適宜行われる。このような処理によって、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度が特定される。また、濃度の特定とは、詳細な数値の特定でなくとも、サイクリックＧＭＰが試料中に存在するか否かの特定、または設定した濃度範囲にあるかどうか等の大まかな特定であってもよい。なお、解析に使用される装置については後述する。
【００２７】
また、本発明は、撮像工程が発光画像を繰り返し撮像することを含む上記の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法に関する。当該方法では、一定の間隔で撮像を繰り返し、または特定の時間に撮像が行われる。このように経時的に撮像されることで、タイムラプスによる観察または動画による観察が可能となる。撮像の都度、発光基質を添加してもよい。当該方法によって、同一細胞における時空間的な測定ができる。すなわち、時間に応じた又は刺激に応じたサイクリックＧＭＰ濃度の変化を測定することができる。また、明視野画像を同時に取得することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化と細胞の形態変化等との関係を知ることが出来る。また、プローブを付したタンパク質を発現させ、当該プローブの様子を同時に観察することで、当該タンパク質とサイクリックＧＭＰとの関連性を知ることができる。
【００２８】
また、本発明は、撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、且つ解析工程が細胞ごとに行われる細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法に関する。当該方法では、一度の撮像において、複数の異なる細胞の画像が取得される。さらに、その後の解析が各々の細胞に対して行われる。撮像した１つの画像に含まれる複数の細胞について細胞ごとの解析を行うことが可能であり、または、撮像した複数の画像にそれぞれ含まれる複数の細胞について細胞ごとの解析を行うことが可能である。また、撮像を上述のような経時的な撮像にすることもできる。これらのような方法によって、個々の細胞におけるサイクリックＧＭＰ濃度変化を時空間的に解析できる。例えば、同一条件下におかれた細胞同士のサイクリックＧＭＰ濃度の比較に使用することができる。
【００２９】
［サイクリックＧＭＰセンサータンパク質］
次に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質について説明する。本発明は、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を利用する上記方法に関し、またサイクリックＧＭＰセンサータンパク質自体に関する。
【００３０】
本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、発光酵素のＮ末端側断片、発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含み、且つ、サイクリックＧＭＰ結合領域はＮ末端側断片とＣ末端側断片との間に配置されている。当該タンパク質は、サイクリックＧＭＰの存在に応じて当該発光酵素の活性が消失または回復する。
【００３１】
また、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質においては、サイクリックＧＭＰ結合領域をサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ由来のものとすることができる。これによって、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質はサイクリックＧＭＰ依存的に結合できる。
【００３２】
サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼとは、サイクリックＧＭＰのホスホジエステル結合を加水分解してＧＭＰを作り出す反応を促進する酵素である。この例として、ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）が存在する。サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼは、サイクリックＧＭＰと結合できる部位を２つ有しており、当該部位をサイクリックＧＭＰ結合領域として利用することができる。サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの由来となる生物種には、当該ホスホジエステラーゼがサイクリックＧＭＰ結合領域を有していれば特別限定はないが、哺乳類に由来する当該ホスホジエステラーゼ、特にヒトまたはマウスに由来する当該ホスホジエステラーゼが好ましい。
【００３３】
サイクリックＧＭＰ結合領域は、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ中の特定の領域であってよい。当該「特定の領域」のアミノ酸配列における開始位置は、１２１番目、１３１番目または１５５番目のアミノ酸であってよく、終了位置は、３０８番目、３２０番目、３３０番目、３４３番目、３５８番目、３６６番目または３８４番目のアミノ酸であってよい。
【００３４】
特に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質において、サイクリックＧＭＰ結合領域が、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａのアミノ酸番号１２１番目から３３０番目、１３１番目から３２０番目、１３１番目から３３０番目、１３１番目から３４３番目、または１３１番目から３５８番目のアミノ酸配列を含んでいてよい。これによって、哺乳類細胞においてルシフェラーゼ活性を高く保ちつつ、サイクリックＧＭＰ依存的に結合するという効果が得られる。
【００３５】
また、サイクリックＧＭＰ結合領域の長さに関して、そのアミノ酸残基の数を、１５０から２６０としてよい。さらに、アミノ酸残基の数を１９０から２３０としてよい。特に、アミノ酸残基の数は、１９０、２００、２１０、２１３または２２８であることが好ましい。
【００３６】
なお、サイクリックＧＭＰ結合領域としては、好ましくは配列番号２０、２４、２６、２７または２８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用できる。
【００３７】
配列番号１９には、マウス由来のサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）のアミノ酸配列が示される。また、配列番号２０から３０には、当該マウス由来ＰＤＥ５Ａのポリペプチド断片のアミノ酸配列が示されており、それぞれ順に、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ２、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ３、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ４、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ６、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１０およびＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１１と称されるポリペプチド断片のアミノ酸配列に対応する。
【００３８】
本願において、発光酵素とは発光を伴う反応を触媒する酵素を意味する。発光酵素としてはルシフェラーゼを使用できる。ルシフェラーゼとしては、ホタル由来のもの、ウミシイタケ由来のものおよびバクテリア由来のもの等を使用できるが、特にホタル由来ルシフェラーゼを使用することが好ましい。また、発光基質は発光酵素に応じて選択されるが、ルシフェラーゼを発光酵素として使用する場合、発光基質としてはルシフェリンを使用することができる。
【００３９】
サイクリックＧＭＰセンサータンパク質に含まれる発光酵素は、当該タンパク質において、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片として含まれている。「Ｎ末端側断片」とは、Ｃ末端から複数のアミノ酸が欠失した発光酵素の断片であって、発光酵素活性を失った断片を意味する。「Ｃ末端側断片」とは、Ｎ末端から複数のアミノ酸が欠失した発光酵素の断片であって、発光酵素活性を失った断片を意味する。Ｎ末端側断片とＣ末端側断片との間にサイクリックＧＭＰ結合領域が配置されており、その条件を満たせば、発光酵素のＮ末端側断片およびＣ末端側断片のサイクリックＧＭＰセンタータンパク質内における配置に限定はない。すなわち、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＮ末端側に発光酵素のＮ末端側断片が配置され、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＣ末端側に発光酵素のＣ末端側断片が配置されたものを使用できる（図５ａ）。または、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＮ末端側に発光酵素のＣ末端側断片が配置され、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＣ末端側に発光酵素のＮ末端側断片が配置されたものを使用できる（図５ｂ）。なお、後者のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質には「変異型」または「ｃｐ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｉｏｎ）」といった用語が付され、前者のものと適宜区別される。
【００４０】
サイクリックＧＭＰセンサータンパク質において、発光酵素の断片は、それぞれ単独では全長の配列を有していないため通常の環境下（例えばサイクリックＧＭＰが存在していない環境下）で活性が失われているが、特定の環境下（例えばサイクリックＧＭＰが存在する環境下）で活性を回復する。例えば、サイクリックＧＭＰ結合領域にサイクリックＧＭＰが結合し、サイクリックＧＭＰ結合領域の構造が変化する結果、離れていたＮ末端側断片とＣ末端側断片とが結合することで、本来の発光酵素の活性が回復する。この「結合」の態様に限定はなく、共有結合または非共有結合等の化学的結合であってもよいが、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とがルシフェラーゼの本来の機能を果たしうる程度に「接近」または「接触」している状態であることが好ましい。あるいは、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが「会合」する状態であってもよい。すなわち、当該表現において使用される「結合」という用語は、「接近」、「接触」または「会合」という意味を含む。
【００４１】
発光酵素が、その中のどの位置で分割されているかに限定はないが、発光酵素としてルシフェラーゼを使用する場合、Ｎ末端側断片はルシフェラーゼの１番目から４００番目のアミノ酸を含み、Ｃ末端側断片はルシフェラーゼの４０１番目から５５０番目のアミノ酸を含むことが好ましい。また、Ｎ末端側断片はルシフェラーゼの１番目から４１６番目のアミノ酸を含み、Ｃ末端側断片はルシフェラーゼの３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む場合のように、Ｎ末端側断片およびＣ末端側断片は、それらの一部の配列が重複していてもよい。
【００４２】
特に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質において、発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含むことが好ましい。これによって、発光酵素のＮ末断片とＣ末側断片とが再会合した時にだけ発光するので、シグナル／ノイズ比が大きいという効果が得られる。
【００４３】
さらに、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、配列番号３１、３５、３７、４８、３８または３９に示されるアミノ酸配列を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であってよい。これらの配列は、それぞれ、後述するサイクリックＧＭＰセンサータンパク質ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８＿ＣおよびＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９＿Ｃのアミノ酸配列である。
【００４４】
上述のとおり、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、サイクリックＧＭＰの存在に応じて、発光酵素の活性が消失または回復する。また、本発明に係る方法は、当該タンパク質のこのような特徴を利用する。従来の分子間のエネルギー共鳴（ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ等）を利用する技術では、エネルギー共鳴の効率の低さに起因して発光量が少なく、また、検出される波長の違いによってサイクリックＧＭＰの存在／非存在が解析される。これに対し、本発明では、ルシフェラーゼといった発光酵素による単純な反応を利用するため発光量は大きく、イメージングも可能となり、また、サイクリックＧＭＰの存在／非存在は発光の発生／非発生に対応するため、シグナル／ノイズ比の高い検出結果が得られる。
【００４５】
［核酸］
次に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む核酸に関して説明する。
【００４６】
当該核酸は、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む。特に、そのような遺伝子のＯＲＦ領域を含む。この遺伝子のコドンは、対象とする細胞における発現に最適化されていてよい。また、Ｋｏｚａｋ配列等、発現量を上昇させるための配列を含んでよく、または付与されていてよい。
【００４７】
また、本発明は上記核酸を含むベクターに関する。当該ベクターは、対象とする細胞における発現のための発現ベクターであってよい。発現ベクターである場合、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする遺伝子の配列のほかに、発現を制御するための配列、マーカー遺伝子の配列等、一般的な発現ベクターに含まれる配列を含んでよい。本発明に係る細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法の細胞作製工程において、当該発現ベクターを使用することができる。すなわち、当該発現ベクターを細胞に導入し、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を発現させて、サイクリックＧＭＰの検出に使用できる。
【００４８】
［装置］
次に、本発明に係るサイクリックＧＭＰ解析方法（特に撮像工程および解析工程）にて使用される発光観察システム１００について、図１から３を用いて説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。図２は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【００４９】
まず、図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
【００５０】
ここで、細胞１０２は、例えば、サイクリックＧＭＰ濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。また、サイクリックＧＭＰ濃度に依存して発光するタンパク質として、Ｎ末側発光酵素とＣ末側発光酵素との間にサイクリックＧＭＰ結合タンパク質を挿入した融合タンパク質の他に、例えば、特表２００９−５３２０６３号公報に開示されている融合タンパク質を用いてもよい。また、ここで、細胞１０２に、上記融合タンパク質が発現されるよう構成した、当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより、融合タンパク質が細胞１０２内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞１０２には、添加工程において、当該細胞外から所定の発光基質（例えばルシフェリンなど）および所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。
【００５１】
また、発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には、正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。
【００５２】
ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野画像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００５３】
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、細胞１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００５４】
図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００５５】
記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
【００５６】
また、制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。
【００５７】
また、発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。ここで、発光画像撮像指示部１１２ａは、発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する指示を行ってもよく、複数の異なる細胞１０２について同時に撮像を実行してもよい。なお、発光画像取得部１１２ｂは、撮像した発光画像および明視野画像を、クロック発生部１１４による時間情報とともに記憶部１１６に格納してもよい。
【００５８】
また、画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した発光画像に基づいて、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に基づいてサイクリックＧＭＰの濃度を解析する。ここで、画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂにより繰り返し撮像された複数の発光画像に基づいて、経時的なサイクリックＧＭＰ濃度の変動を測定してもよく、複数の異なる細胞１０２について同時に発光画像が撮像された場合に、複数の発光画像を細胞１０２ごとに照合してサイクリックＧＭＰの濃度を解析してもよい。
【００５９】
解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。より具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に基づくサイクリックＧＭＰ濃度の時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を作製し、それぞれの特性を調べた。具体的には、マウスのサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）由来のサイクリックＧＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼ由来の２つの断片とから成るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を作製し、各種環状ヌクレオチドに対する応答性を調べた。
【００６１】
（手順１）
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、ルシフェラーゼの各種断片を増幅した。図５ａに示すサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の作製のために、Ｎ末側発光酵素（ＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側発光酵素（ＣＬｕｃ）遺伝子を増幅した。また、図５ｂに示すサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の作製のために、Ｎ末側発光酵素（ｃｐＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側発光酵素（ｃｐＣＬｕｃ）遺伝子を増幅した。増幅のための合成オリゴＤＮＡは以下のものを使用した。
［ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＮＬｕｃ＿Ｆｗ （配列番号１）： ５’ − ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡ − ３’
ＮＬｕｃ＿Ｒｖ （配列番号２）： ５’ − ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ − ３’
［ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣＬｕｃ＿Ｆｗ （配列番号３）： ５’ − ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ − ３’
ＣＬｕｃ＿Ｒｖ （配列番号４）： ５’ − ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣ − ３’
［ｃｐＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号５）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号６）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣ−３’
［ｃｐＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号７）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣ−３’
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号８）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３’
【００６２】
また、ＰＣＲによって、ＰＤＥ５ＡのｃＧＭＰ結合ドメイン遺伝子を増幅した。増幅には以下のプライマーを組み合わせて用い、種々の遺伝子を取得した。
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿１＿Ｆｗ （配列番号９）： ５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿２＿Ｆｗ （配列番号１０）： ５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿３＿Ｆｗ （配列番号１１）： ５’− ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣＣＣＣＣ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿１＿Ｒｖ （配列番号１２）： ５’− ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＧＡＧ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿２＿Ｒｖ （配列番号１３）： ５’− ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿３＿Ｒｖ （配列番号１４）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿４＿Ｒｖ （配列番号１５）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿５＿Ｒｖ （配列番号１６）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿６＿Ｒｖ （配列番号１７）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿７＿Ｒｖ （配列番号１８）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣ −３’
【００６３】
（手順２）
ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型とするＰＣＲによって、Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＮＬｕｃ）、Ｃ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＬｕｃ）、変異型Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ｃｐＮＬｕｃ）および変異型Ｃ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ｃｐＣＬｕｃ）を、以下の表１に示されるプライマーを使用して増幅した。これらの遺伝子の、ルシフェラーゼ（ＧＬ４．１０）のアミノ酸配列中の対応する位置を表１に示す。
【００６４】
【表１】
（手順３）
サイクリックＧＭＰ結合領域として使用するために、マウスのサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）のｃＤＮＡを鋳型として種々の遺伝子をＰＣＲによって増幅した。図１６に、増幅した遺伝子の名称および使用したプライマーを示す。さらに、増幅した遺伝子の、ＰＤＥ５Ａのアミノ酸配列中の対応する位置、および当該遺伝子がコードする断片のアミノ酸残基の数を示す。なお、ＰＤＥ５ＡにはサイクリックＧＭＰ結合ドメインがＡとＢの２ヶ所存在するが、そのうちＡを含む領域を増幅した。
【００６５】
（手順４）
次のようにして、２種の原核生物発現用プラスミドを作製した。手順２にて取得したＮＬｕｃ遺伝子を原核生物発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ２Ｂ（インビトロジェン社製）内のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入した後、手順２にて取得したＣＬｕｃ遺伝子をＢｇｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、原核生物発現用プラスミド（ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿Ｃ）を作製した。また、手順２にて取得したｃｐＣＬｕｃ遺伝子を原核生物発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ２Ｂ内のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入した後、手順２にて取得したｃｐＮＬｕｃ遺伝子をＢｇｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、原核生物発現用プラスミド（ｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿Ｎ）を作製した。
【００６６】
（手順５）
次のようにして、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質の発現プラスミドを作製した。手順３にて増幅した１１種のＰＤＥ５Ａ由来の遺伝子を、手順４にて作製した２種の発現用プラスミドのＸｈｏＩ認識部位とＢｇｌＩＩ認識部位との間にそれぞれ挿入した。作製された２２種の発現用プラスミドの名称は、図１６の表中「得られるプラスミドの名称」の項目に示される。
【００６７】
（手順６）
各種サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を大腸菌で発現させ、さらに精製した。
【００６８】
手順５にて作製した各種発現プラスミドを、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームし、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（キアゲン社製）を用いて、キットのマニュアルに従ってサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を精製した。精製手順を簡略に説明すると、上記原核生物発現用プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、５ｍＬのＬＢ培地中に植菌した。一晩培養した後、遠心分離して集菌し、集菌した大腸菌を溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）５００μＬに再懸濁してリゾチームを添加し（１ｍｇ／ｍＬ）、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を、ボルテックスミキサー等を用いて静かに撹拌して溶解し、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離して上清を新しいチューブに移した。５０％ Ｎｉ−ＮＴＡレジン懸濁液 ５０μＬを添加し、４℃で６０分間静かに混合した。１５，０００ｘｇで１０秒間遠心分離してレジンを沈殿させ、レジンを洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０） ５００μＬで２回洗浄した。溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）５０μＬでタンパク質を２回溶出し、種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を得た。得られた２２種のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、図１６の表中「得られえるサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の名称」の項目に示される。
【００６９】
（手順７）
種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の特性を測定した。
【００７０】
手順６にて取得されたタンパク質の発光活性を、環状ヌクレオチドの非存在下、サイクリックＧＭＰ存在下、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ存在下またはサイクリックＡＭＰ存在下でそれぞれ測定した。測定方法を簡単に説明すると、上述のタンパク質溶液２０μＬに、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０μＬを加えた。そこへ、４ｍＭのサイクリックＧＭＰ、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはサイクリックＡＭＰ溶液を１μＬ加え（終濃度１００μＭ）、またネガティブコントロールにはＰＢＳを同量加えた。さらに、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）を４０μＬ加えて、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ ＪＮＲ−ＩＩ（アトー社製）を使用して発光量（５秒間の積算）を測定した。
【００７１】
（結果）
手順７による測定の結果を図６に示す。
サイクリックＧＭＰ存在下において、発光量が特に高かったのは、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５＿ＣおよびＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８＿Ｃであった。これらに準じて、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９＿ＣおよびＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎが一定の発光量を示した。
【００７２】
さらに、これらのタンパク質（ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９＿ＣおよびＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎ）では、環状ヌクレオチド非存在下（コントロール）における発光量と、サイクリックＧＭＰ存在下における発光量とで明確な差が示された。
【００７３】
［実施例２］
本発明に係る方法により、ＨＥＫ２９３細胞中のサイクリックＧＭＰ濃度の変動を測定した。
【００７４】
（手順１）
次のようにして、種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質についての動物細胞発現用プラスミドを作製した。
【００７５】
実施例１の手順５にて作製した原核細胞発現用プラスミドから、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする領域を切り出し、それを動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位との間に挿入した。具体的に使用した原核細胞発現用プラスミドは、ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、およびｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＧＡＦａ７＿Ｎの４種であり、これらに基づいて、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、およびｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＧＡＦａ７＿Ｎを作製した。
【００７６】
（手順２）
使用するＨＥＫ２９３細胞の培養は次のように行った。ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ社より入手し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、および、１ｘ Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。
【００７７】
（手順３）
次のようにして、ＨＥＫ２９３細胞に手順１で作製した動物細胞発現用プラスミドを導入した。細胞を直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに、２ｘ１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、それぞれの動物細胞発現用プラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００７８】
（手順４）
次のようにして、手順３で作製した細胞のタイムラプス撮影を行った。培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を添加して１時間静置し、発光顕微鏡ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００（オリンパス社製）にセットし、５秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は５〜１０秒間、ビニングは１ｘ１、ＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用い、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに取り込んだ。
【００７９】
（手順５）
タイムラプス撮影中のＨＥＫ２９３細胞に刺激を与えた。タイムラプス撮影開始から２分後、培養液に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（最終濃度 １００μＭ）を添加し、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
【００８０】
（手順６）
撮影した画像の発光強度の解析を行った。
手順４および５による一連のタイムラプス撮影によって得られた発光画像においてＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定した。指定したＲＯＩにおける発光強度の経時変化をグラフに表示した。
【００８１】
図７から９は、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃを発現させた細胞における測定結果である。図７には、刺激前における発光画像が示される。画像中１から４のＲＯＩが指定されている。一方、図８には、刺激後における、図７と同一の位置を撮影した発光画像が示される。図８においても、図７と同様にＲＯＩが指定されている。さらに、図９には、指定した各ＲＯＩの発光強度の経時変化がグラフとして示される。図７および８にて指定した１から４のＲＯＩは、図９のグラフ中の「ｃｅｌｌ１」から「ｃｅｌｌ４」にそれぞれ対応する。なお、発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。
【００８２】
一方、図１０から１２はＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃを発現させた細胞における測定結果であり、図１３から１５はｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎ発現させた細胞における測定結果である。図１０および１３には刺激前の発光画像が示され、図１１および１４には刺激後の発光画像が示され、図１２および１５には指定した各ＲＯＩの発光強度の経時変化のグラフが示される。
【００８３】
（結果）
８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは膜透過性サイクリックＧＭＰアナログであり、細胞培養液にこれを添加することで細胞内部のサイクリックＧＭＰが上昇することが予想される。ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ７＿ＣおよびｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＧＡＦａ７＿Ｎをそれぞれ利用する本発明に係る方法により、当該予想を反映した結果が得られた。すなわち、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加後、発光量が増大した。本発明によれば、そのような結果を単一の細胞にて確認することができた。また、個々の細胞における発光強度の変化を見ると、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激において細胞間の応答に大きなばらつきのあることがわかった（図９、図１２および図１５参照）。
【００８４】
これまでのサイクリックＧＭＰを介する細胞内情報伝達機構の研究から、サイクリックＧＭＰ濃度変化の細胞内分布あるいは時間経過が異なると、シグナルの意味が異なることが明らかにされている。従来のルミノメーターを用いた発光量変化の解析では、細胞集団全体の観測に留まり、個々の細胞の応答までは解析できなかった。しかし、本発明に係る方法（装置としてＬＶ−２００を使用する）では、生体内の変化を１細胞毎にリアルタイムに観察することができ、細胞内シグナルの働きを詳細に研究することができた。
【００８５】
以上、本実施例によれば、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてサイクリックＧＭＰ濃度の変化を再現性良く経時的に観察することができる。上述した実施例において使用するルシフェラーゼ遺伝子やルシフェリン等は、他の市販試薬であってもよいし、生物発光等を発生する生物から直接抽出等されたものであってもよい。
【００８６】
［その他の実施例］
上記実施例に示される実施の形態のほかに、本発明は、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施することができる。
【００８７】
例えば、上述した実施の形態においては、主に、互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素、および、ＰＤＥ５ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメインからなる融合タンパク質をサイクリックＧＭＰセンサータンパク質として使用するとしたが、これに限らず、特表２００９−５３２０６３号公報等に開示されているサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を用いてもよい。
【００８８】
また、上述した記載によれば、以下の要旨に表現されるポリペプチドの態様も本発明に包含される。
【００８９】
［ポリペプチド態様１］（機能：スプリットルシフェラーゼの相互作用）
発光酵素のＮ末端側断片、発光酵素のＣ末端側断片、および、サイクリックＧＭＰ結合タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記Ｎ末端側断片およびＣ末端側断片は非共有結合的に相互作用し、前記非共有結合的相互作用は調整可能であることを特徴とするポリペプチド。
［ポリペプチド態様２］（機能：サイクリックＧＭＰ結合タンパク質の作用）
前記サイクリックＧＭＰ結合タンパク質が前記非共有結合的相互作用を検出可能に変化させることを特徴とする前記態様１に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様３］（機能：外因性因子の作用）
前記非共有結合的相互作用は外因性因子の存在下で強化されること、を特徴とする前記態様１に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様４］（機能：サイクリックＧＭＰの作用）
前記外因性因子はサイクリックＧＭＰであること、を特徴とする前記態様２に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様５］（機能：発光）
前記態様３に記載のポリペプチドであって、前記非共有的相互作用により発光することを特徴とするポリペプチド。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上詳述に説明したように、本発明にかかるサイクリックＧＭＰ解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００９１】
１００ 発光観察システム
１０３ 容器（シャーレ）
１０４ ステージ
１０６ 発光画像撮像ユニット
１０６ａ 対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ ダイクロイックミラー
１０６ｃ ＣＣＤカメラ
１０６ｄ スプリットイメージユニット
１０６ｅ フィルターホイール
１０６ｆ 結像レンズ
１１０ 画像解析装置
１１２ 制御部
１１２ａ 発光画像撮像指示部
１１２ｂ 発光画像取得部
１１２ｃ 画像解析部
１１２ｄ 解析結果出力部
１１４ クロック発生部
１１６ 記憶部
１１８ 通信インターフェース部
１２０ 入出力インターフェース部
１２２ 入力装置
１２４ 出力装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリックＧＭＰ解析方法および当該方法に使用されるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのホルモンや神経伝達物質はＧタンパク質共役型受容体に働き、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こしている。また、細胞活動の多様性は、細胞内のセカンドメッセンジャーの時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の細胞活動に関する細胞内情報伝達を解析するにあたって、セカンドメッセンジャーの時空間的な変化をリアルタイムに捉えることが必要である。
【０００３】
細胞内セカンドメッセンジャーの１つである環状グアノシン一リン酸（サイクリックＧＭＰ）は、生体内において各種生化学反応過程のシグナル伝達分子として作用している。これまでに、循環器系筋細胞の弛緩、網膜における光受容−伝達、上皮における電解質運搬、骨の成長、ニューロンの活性化等の様々な生理的プロセスがサイクリックＧＭＰによって制御されていることが明らかになっている。したがって、生細胞中でのサイクリックＧＭＰの合成、分解、局在等がわかれば、細胞および組織レベルでの循環器系、腎臓、網膜、嗅覚、中枢神経等の作用機構が解明されるだけでなく、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を調節する薬剤に関する知見を得ることが可能になると期待される。
【０００４】
従来、サイクリックＧＭＰの測定は、放射線ラベルした化合物を使用し、多数の細胞に対して行われている。また、近年、いくつかのサイクリックＧＭＰバイオセンサーが見出され、細胞レベルでのサイクリックＧＭＰの測定が可能になっている。
【０００５】
例えば、特許文献１および非特許文献１には、シアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）と黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）との蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用し、サイクリックＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）Ｉα遺伝子と蛍光タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子を用いてイメージングするサイクリックＧＭＰ解析方法が開示されている。具体的には、ＰＫＧＩα遺伝子配列の両端にＹＦＰおよびＣＦＰの配列を融合して細胞内で発現させている。通常の状態では、ＣＦＰを励起してもＦＲＥＴが起こらないためＹＦＰの蛍光は観察されない。一方、細胞内のサイクリックＧＭＰが増加するとＰＫＧＩαの立体構造が変化し、ＦＲＥＴが起こるためアクセプターであるＹＦＰの蛍光が観察される。このＦＲＥＴシグナルを観察することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化を観察できることが明らかにされている。
【０００６】
また、特許文献２には、ある種のＣＮＧチャネルおよびカルシウム感受性発光タンパク質を利用する、細胞内の環状ヌクレオチドであるサイクリックＧＭＰおよびサイクリックＡＭＰ濃度を定量解析する方法が開示されている。この方法では、細胞内に、環状ヌクレオチドにより活性化される特定のイオンチャネル（ＣＮＧチャネル）およびカルシウム感受性発光タンパク質を発現させている。このとき細胞内のサイクリックＧＭＰまたはサイクリックＡＭＰが増加すると、ＣＮＧチャネルが開口し、それによりカルシウムイオンが流入する。流入したカルシウムは、Ｆｕｒａ−２もしくはＦｌｏｕ−３等のカルシウム感受性発光インジケーター、またはエクオリンもしくはオベリンといったカルシウム感受性発光タンパク質により検出できることが明らかにされている。
【０００７】
また、非特許文献２には、青色発光タンパク質と緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）との発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用する、サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）のサイクリックＧＭＰ結合ドメイン遺伝子に発光タンパク質遺伝子および蛍光タンパク質遺伝子を融合して観察するサイクリックＧＭＰ解析方法が開示されている。ＰＤＥ５ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメイン遺伝子、青色発光タンパク質であるレニラルシフェラーゼ遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子を融合したタンパク質を発現させた細胞に対し、ルシフェラーゼの基質となるセレンテラジンを添加すると青色の発光が観察されている。この細胞において細胞内サイクリックＧＭＰが増加すると、サイクリックＧＭＰ結合ドメインの立体構造が変化してルシフェラーゼの発光からＥＧＦＰの蛍光へ発光−蛍光共鳴エネルギーシフト（ＢＲＥＴ）が起こり、ＥＧＦＰの蛍光が検出される。このＢＲＥＴシグナルを検出することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化を検出できることが明らかにされている。
【０００８】
また、特許文献３には、ヒトサイクリックＧＭＰ活性化プロテインキナーゼ由来Ｂドメイン（ＧＫＩ−Ｂ）またはヒトホスホジエステラーゼ２Ａ（ＰＤＥ２Ａ）のサイクリックＧＭＰ結合ドメインと円順列置換したホタルルシフェラーゼとを融合したタンパク質を利用して細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を定量解析する方法が開示されている。この方法では、ＧＫＩ−ＢまたはＰＤＥ２ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメイン遺伝子と円順列置換したホタルルシフェラーゼ遺伝子とを融合したタンパク質を発現させた細胞に、ルシフェラーゼの基質となるルシフェリンを添加し、細胞からの発光を計測している。細胞内のサイクリックＧＭＰが増加すると、サイクリックＧＭＰ結合ドメインの立体構造が変化してルシフェラーゼの発光が消失または増強する。この発光シグナルを検出することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化を検出できることが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３６４３５２０号公報
【特許文献２】特表２００６−５２０２０３号
【特許文献３】特表２００９−５３２０６３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｏｎｄａ Ａ， Ａｄａｍｓ ＳＲ， Ｓａｗｙｅｒ ＣＬ， Ｌｅｖ−Ｒａｍ Ｖ， Ｔｓｉｅｎ ＲＹ， Ｄｏｓｔｍａｎｎ ＷＲＧ． “Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ， ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ｖｏｌ．９８， ｎｏ．５， ｐｐ．２４３７−２４４２， ２００１
【非特許文献２】Ｂｉｓｗａｓ ＫＨ， Ｓｏｐｏｒｙ Ｓ， Ｖｉｓｗｅｓｗａｒｉａｈ ＳＳ． “Ｔｈｅ ＧＡＦ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃＧＭＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ， ｃＧＭＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ （ＰＤＥ５） ｉｓ ａ ｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ ａ ｓｉｎｋ ｆｏｒ ｃＧＭＰ．” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４７， ｐｐ．３５３４−３５４３， ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１または非特許文献１に開示されるようなＰＫＧ酵素を利用する方法では、レポーターのサイクリックＧＭＰ結合部位にＰＫＧの全長または酵素ドメインが含まれるため、レポーターがリン酸化酵素活性を有し、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすという問題があった。また、蛍光タンパク質を用いるため、その影響で細胞内に存在する不特定のタンパク質が励起され蛍光を生じ（自己蛍光）、シグナル／ノイズ比を下げるという問題があった。さらに、ダイナミックレンジが狭いことにより、利用可能な測定対象の範囲が狭いという問題があった。
【００１２】
特許文献２に開示されるようなＣＮＧチャネルおよびカルシウム感受性発光タンパク質を利用する方法では、２種類以上の遺伝子を同時に導入することが必要となり、細胞内への導入および発現効率が低いという問題があった。また、当該方法では、細胞内にカルシウムイオンが流入するため、細胞内の情報伝達に影響を及ぼし、細胞の本来の状態を測定できない可能性があるという問題があった。
【００１３】
非特許文献２に開示されるような発光タンパク質と蛍光タンパク質とのＢＲＥＴを用いる方法では、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定が行われるため、単一の細胞における測定は最適化されておらず又は不可能であり、利用可能な測定方法の範囲が狭いという問題があった。特に、ＢＲＥＴの変換効率が低くシグナルが小さくなるため、イメージングに使用できる程度のシグナル／ノイズ比が得られない。
【００１４】
特許文献３に開示されるような円順列置換ルシフェラーゼとＧＫＩ−ＢまたはＰＤＥ２ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメインとの融合タンパク質を用いる方法では、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定が行われるため、単一の細胞における測定は最適化されておらず又は不可能であり、利用可能な測定方法の範囲が狭いという問題があった。特に、当該融合タンパク質からの発光量が小さいため、イメージングに使用できる程度のシグナル／ノイズ比が得られない。
【００１５】
本発明は、上述のような従来技術が抱える数々の問題に鑑みてなされたものであり、細胞本来の状態を正確に定量できるサイクリックＧＭＰ解析方法を提供することを目的とする。特に、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてサイクリックＧＭＰ濃度の変化を再現性良く経時的に観察することができるサイクリックＧＭＰ解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施態様によれば、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法が提供される。
【００１７】
また、本発明の一実施態様に因れば、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞内のサイクリックＧＭＰに関する情報を正確且つ定量的に個々の細胞から得ることができ、その結果、個々の細胞において細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を再現性良く観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【図２】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図３】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図４】発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】スプリットルシフェラーゼアッセイ法を用いたｃＧＭＰの検出原理を示す図である。
【図６】種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質について、ルミノメーターによって測定した発光量を示すグラフ図である。
【図７】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激前の発光画像を示す図である。
【図８】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激５分後の発光画像を示す図である。
【図９】選択した細胞での８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激によるＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃの発光強度の経時変化を示した図である。
【図１０】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激前の発光画像を示す図である。
【図１１】ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激５分後の発光画像を示す図である。
【図１２】選択した細胞での８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激によるＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃの発光強度の経時変化を示した図である。
【図１３】ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激前の発光画像を示す図である。
【図１４】ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激５分後の発光画像を示す図である。
【図１５】選択した細胞での８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激によるｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎの発光強度の経時変化を示した図である。
【図１６】種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の作製を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［方法］
以下に、本発明に係る方法について説明する。
本発明は、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法に関する。
【００２１】
簡潔には、本発明は、対象とする細胞にサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を導入し、発光基質を与えて発光を誘導し、その様子を撮像し、撮像した画像に基づいてｃＧＭＰ濃度を特定等する方法に関する。
【００２２】
本発明によれば、細胞内のサイクリックＧＭＰの状態を解析することができる。特に、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度を定量的に測定することが可能である。また、測定はイメージングによって行うことができるため、細胞ごとに測定が可能であり、さらには細胞内の細胞小器官等の構造に絞って測定することもできる。さらに、一定間隔で同一の測定領域を測定することで、サイクリックＧＭＰ濃度の刺激に対する変化および時間的変化を解析することができる。細胞ごとに測定することで、細胞間の差異を解析することもできる。
【００２３】
細胞作製工程では、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞が作製される。サイクリックＧＭＰセンサータンパク質とは、発光酵素の２つのポリペプチド断片と、サイクリックＧＭＰに結合できるポリペプチド断片と、任意にその他のポリペプチド断片とが融合したタンパク質であって、サイクリックＧＭＰの存在に応じて当該発光酵素の活性が消失または回復するタンパク質である。サイクリックＧＭＰセンサータンパク質の詳細については後述する。対象となる細胞の種類に限定はなく、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞等を使用できる。動物細胞が使用される場合、特に哺乳細胞が使用され、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞が使用される。細胞は、生体組織の一部として培養された細胞集合体であってもよいし、生体組織が属している臓器等や生命個体の形態でもよい。細胞に対してサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を導入する方法に特別な限定はなく、既知の導入方法が使用できる。１つの方法は、当該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を細胞に導入し、その後細胞内で当該タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから当該タンパク質を発現させることができる。ベクターから発現させるのではなく、当該核酸がゲノムに組み込まれた細胞を作製した後、ゲノムから当該タンパク質を発現させることもできる。別の方法は、細胞外で精製した当該タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって当該タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、当該タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって当該タンパク質を細胞に取り込ませることができる。
【００２４】
添加工程では、細胞作製工程にて作製された細胞に対し発光基質が添加される。本発明に係る方法は発光酵素による発光反応を利用するが、この発光反応を生じさせるためには発光基質が必要となる。発光基質は使用する発光酵素に応じて選択される。発光基質の詳細は後述する。発光基質を添加する方法に特別限定はなく、適宜選択できる。例えば、培養液に添加することで、培養液を介して細胞に発光酵素を取り込ませることができる。また、マイクロインジェクション法によって、発光基質を細胞内に直接注入することもできる。発光基質の添加のタイミングも適宜選択できる。例えば、細胞へのサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の導入の前に、それと同時に、またはその後に発光基質を添加することができる。例えば、一連の操作を通して、細胞を取り扱うための培養液中に発光基質を含めておくことができる。または、マイクロインジェクションにて当該タンパク質および発光基質を同時に細胞に注入することができる。好ましくは、発光基質は測定の直前に添加される。発光基質の添加量に特別な限定はないが、好ましくは、発光酵素が発光反応を生じるために十分な量で添加される。
【００２５】
撮像工程では、発光反応が生じている細胞の画像が取得される。撮像は任意のタイミングで行うことができるが、好ましくは、基質添加から一定時間後に行われる。特に複数の測定を繰り返す場合、測定結果のばらつきを抑えるために、複数の測定を通じて同一のタイミングで撮像することが好ましい。撮像時間は条件に応じて最良の時間が適宜選択される。発光強度が小さい場合、撮像時間（顕微鏡を使用する場合、露出時間）は長くされ、逆に発光強度が大きすぎる場合、撮像時間は短くされる。例えば、５から１０秒間の露出時間とすることができる。撮像は、発光反応に係る波長の光のみを取得して行うこともできるが、それと同時に明視野画像または別の波長の光による画像を取得してもよい。例えば、細胞にサイクリックＧＭＰセンサータンパク質と同時にプローブ（例えば蛍光または発光タンパク質）を融合した特定のタンパク質を導入し、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質に由来する光と同時に、当該特定のタンパク質からの光を検出してもよい。なお、撮像に使用される装置については後述する。
【００２６】
解析工程では、取得された画像に基づいて、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度等の解析が行われる。解析は、コンピュータにて機能するソフトウェアを使用して、発光量を数値に変換してもよい。当該数値を利用して、スタンダードとの比の算出、試料間の比較等が適宜行われる。このような処理によって、細胞内のサイクリックＧＭＰ濃度が特定される。また、濃度の特定とは、詳細な数値の特定でなくとも、サイクリックＧＭＰが試料中に存在するか否かの特定、または設定した濃度範囲にあるかどうか等の大まかな特定であってもよい。なお、解析に使用される装置については後述する。
【００２７】
また、本発明は、撮像工程が発光画像を繰り返し撮像することを含む上記の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法に関する。当該方法では、一定の間隔で撮像を繰り返し、または特定の時間に撮像が行われる。このように経時的に撮像されることで、タイムラプスによる観察または動画による観察が可能となる。撮像の都度、発光基質を添加してもよい。当該方法によって、同一細胞における時空間的な測定ができる。すなわち、時間に応じた又は刺激に応じたサイクリックＧＭＰ濃度の変化を測定することができる。また、明視野画像を同時に取得することで、サイクリックＧＭＰの濃度変化と細胞の形態変化等との関係を知ることが出来る。また、プローブを付したタンパク質を発現させ、当該プローブの様子を同時に観察することで、当該タンパク質とサイクリックＧＭＰとの関連性を知ることができる。
【００２８】
また、本発明は、撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、且つ解析工程が細胞ごとに行われる細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法に関する。当該方法では、一度の撮像において、複数の異なる細胞の画像が取得される。さらに、その後の解析が各々の細胞に対して行われる。撮像した１つの画像に含まれる複数の細胞について細胞ごとの解析を行うことが可能であり、または、撮像した複数の画像にそれぞれ含まれる複数の細胞について細胞ごとの解析を行うことが可能である。また、撮像を上述のような経時的な撮像にすることもできる。これらのような方法によって、個々の細胞におけるサイクリックＧＭＰ濃度変化を時空間的に解析できる。例えば、同一条件下におかれた細胞同士のサイクリックＧＭＰ濃度の比較に使用することができる。
【００２９】
［サイクリックＧＭＰセンサータンパク質］
次に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質について説明する。本発明は、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を利用する上記方法に関し、またサイクリックＧＭＰセンサータンパク質自体に関する。
【００３０】
本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、発光酵素のＮ末端側断片、発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含み、且つ、サイクリックＧＭＰ結合領域はＮ末端側断片とＣ末端側断片との間に配置されている。当該タンパク質は、サイクリックＧＭＰの存在に応じて当該発光酵素の活性が消失または回復する。
【００３１】
また、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質においては、サイクリックＧＭＰ結合領域をサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ由来のものとすることができる。これによって、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質はサイクリックＧＭＰ依存的に結合できる。
【００３２】
サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼとは、サイクリックＧＭＰのホスホジエステル結合を加水分解してＧＭＰを作り出す反応を促進する酵素である。この例として、ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）が存在する。サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼは、サイクリックＧＭＰと結合できる部位を２つ有しており、当該部位をサイクリックＧＭＰ結合領域として利用することができる。サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの由来となる生物種には、当該ホスホジエステラーゼがサイクリックＧＭＰ結合領域を有していれば特別限定はないが、哺乳類に由来する当該ホスホジエステラーゼ、特にヒトまたはマウスに由来する当該ホスホジエステラーゼが好ましい。
【００３３】
サイクリックＧＭＰ結合領域は、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ中の特定の領域であってよい。当該「特定の領域」のアミノ酸配列における開始位置は、１２１番目、１３１番目または１５５番目のアミノ酸であってよく、終了位置は、３０８番目、３２０番目、３３０番目、３４３番目、３５８番目、３６６番目または３８４番目のアミノ酸であってよい。
【００３４】
特に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質において、サイクリックＧＭＰ結合領域が、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａのアミノ酸番号１２１番目から３３０番目、１３１番目から３２０番目、１３１番目から３３０番目、１３１番目から３４３番目、または１３１番目から３５８番目のアミノ酸配列を含んでいてよい。これによって、哺乳類細胞においてルシフェラーゼ活性を高く保ちつつ、サイクリックＧＭＰ依存的に結合するという効果が得られる。
【００３５】
また、サイクリックＧＭＰ結合領域の長さに関して、そのアミノ酸残基の数を、１５０から２６０としてよい。さらに、アミノ酸残基の数を１９０から２３０としてよい。特に、アミノ酸残基の数は、１９０、２００、２１０、２１３または２２８であることが好ましい。
【００３６】
なお、サイクリックＧＭＰ結合領域としては、好ましくは配列番号２０、２４、２６、２７または２８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用できる。
【００３７】
配列番号１９には、マウス由来のサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）のアミノ酸配列が示される。また、配列番号２０から３０には、当該マウス由来ＰＤＥ５Ａのポリペプチド断片のアミノ酸配列が示されており、それぞれ順に、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ２、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ３、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ４、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ６、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９、ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１０およびＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１１と称されるポリペプチド断片のアミノ酸配列に対応する。
【００３８】
本願において、発光酵素とは発光を伴う反応を触媒する酵素を意味する。発光酵素としてはルシフェラーゼを使用できる。ルシフェラーゼとしては、ホタル由来のもの、ウミシイタケ由来のものおよびバクテリア由来のもの等を使用できるが、特にホタル由来ルシフェラーゼを使用することが好ましい。また、発光基質は発光酵素に応じて選択されるが、ルシフェラーゼを発光酵素として使用する場合、発光基質としてはルシフェリンを使用することができる。
【００３９】
サイクリックＧＭＰセンサータンパク質に含まれる発光酵素は、当該タンパク質において、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片として含まれている。「Ｎ末端側断片」とは、Ｃ末端から複数のアミノ酸が欠失した発光酵素の断片であって、発光酵素活性を失った断片を意味する。「Ｃ末端側断片」とは、Ｎ末端から複数のアミノ酸が欠失した発光酵素の断片であって、発光酵素活性を失った断片を意味する。Ｎ末端側断片とＣ末端側断片との間にサイクリックＧＭＰ結合領域が配置されており、その条件を満たせば、発光酵素のＮ末端側断片およびＣ末端側断片のサイクリックＧＭＰセンタータンパク質内における配置に限定はない。すなわち、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＮ末端側に発光酵素のＮ末端側断片が配置され、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＣ末端側に発光酵素のＣ末端側断片が配置されたものを使用できる（図５ａ）。または、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＮ末端側に発光酵素のＣ末端側断片が配置され、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質のＣ末端側に発光酵素のＮ末端側断片が配置されたものを使用できる（図５ｂ）。なお、後者のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質には「変異型」または「ｃｐ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｉｏｎ）」といった用語が付され、前者のものと適宜区別される。
【００４０】
サイクリックＧＭＰセンサータンパク質において、発光酵素の断片は、それぞれ単独では全長の配列を有していないため通常の環境下（例えばサイクリックＧＭＰが存在していない環境下）で活性が失われているが、特定の環境下（例えばサイクリックＧＭＰが存在する環境下）で活性を回復する。例えば、サイクリックＧＭＰ結合領域にサイクリックＧＭＰが結合し、サイクリックＧＭＰ結合領域の構造が変化する結果、離れていたＮ末端側断片とＣ末端側断片とが結合することで、本来の発光酵素の活性が回復する。この「結合」の態様に限定はなく、共有結合または非共有結合等の化学的結合であってもよいが、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とがルシフェラーゼの本来の機能を果たしうる程度に「接近」または「接触」している状態であることが好ましい。あるいは、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが「会合」する状態であってもよい。すなわち、当該表現において使用される「結合」という用語は、「接近」、「接触」または「会合」という意味を含む。
【００４１】
発光酵素が、その中のどの位置で分割されているかに限定はないが、発光酵素としてルシフェラーゼを使用する場合、Ｎ末端側断片はルシフェラーゼの１番目から４００番目のアミノ酸を含み、Ｃ末端側断片はルシフェラーゼの４０１番目から５５０番目のアミノ酸を含むことが好ましい。また、Ｎ末端側断片はルシフェラーゼの１番目から４１６番目のアミノ酸を含み、Ｃ末端側断片はルシフェラーゼの３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む場合のように、Ｎ末端側断片およびＣ末端側断片は、それらの一部の配列が重複していてもよい。
【００４２】
特に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質において、発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含むことが好ましい。これによって、発光酵素のＮ末断片とＣ末側断片とが再会合した時にだけ発光するので、シグナル／ノイズ比が大きいという効果が得られる。
【００４３】
さらに、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、配列番号３１、３５、３７、４８、３８または３９に示されるアミノ酸配列を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であってよい。これらの配列は、それぞれ、後述するサイクリックＧＭＰセンサータンパク質ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８＿ＣおよびＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９＿Ｃのアミノ酸配列である。
【００４４】
上述のとおり、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、サイクリックＧＭＰの存在に応じて、発光酵素の活性が消失または回復する。また、本発明に係る方法は、当該タンパク質のこのような特徴を利用する。従来の分子間のエネルギー共鳴（ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ等）を利用する技術では、エネルギー共鳴の効率の低さに起因して発光量が少なく、また、検出される波長の違いによってサイクリックＧＭＰの存在／非存在が解析される。これに対し、本発明では、ルシフェラーゼといった発光酵素による単純な反応を利用するため発光量は大きく、イメージングも可能となり、また、サイクリックＧＭＰの存在／非存在は発光の発生／非発生に対応するため、シグナル／ノイズ比の高い検出結果が得られる。
【００４５】
［核酸］
次に、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む核酸に関して説明する。
【００４６】
当該核酸は、本発明に係るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む。特に、そのような遺伝子のＯＲＦ領域を含む。この遺伝子のコドンは、対象とする細胞における発現に最適化されていてよい。また、Ｋｏｚａｋ配列等、発現量を上昇させるための配列を含んでよく、または付与されていてよい。
【００４７】
また、本発明は上記核酸を含むベクターに関する。当該ベクターは、対象とする細胞における発現のための発現ベクターであってよい。発現ベクターである場合、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする遺伝子の配列のほかに、発現を制御するための配列、マーカー遺伝子の配列等、一般的な発現ベクターに含まれる配列を含んでよい。本発明に係る細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法の細胞作製工程において、当該発現ベクターを使用することができる。すなわち、当該発現ベクターを細胞に導入し、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を発現させて、サイクリックＧＭＰの検出に使用できる。
【００４８】
［装置］
次に、本発明に係るサイクリックＧＭＰ解析方法（特に撮像工程および解析工程）にて使用される発光観察システム１００について、図１から３を用いて説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。図２は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【００４９】
まず、図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
【００５０】
ここで、細胞１０２は、例えば、サイクリックＧＭＰ濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。また、サイクリックＧＭＰ濃度に依存して発光するタンパク質として、Ｎ末側発光酵素とＣ末側発光酵素との間にサイクリックＧＭＰ結合タンパク質を挿入した融合タンパク質の他に、例えば、特表２００９−５３２０６３号公報に開示されている融合タンパク質を用いてもよい。また、ここで、細胞１０２に、上記融合タンパク質が発現されるよう構成した、当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより、融合タンパク質が細胞１０２内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞１０２には、添加工程において、当該細胞外から所定の発光基質（例えばルシフェリンなど）および所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。
【００５１】
また、発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には、正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。
【００５２】
ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野画像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００５３】
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、細胞１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００５４】
図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００５５】
記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
【００５６】
また、制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。
【００５７】
また、発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。ここで、発光画像撮像指示部１１２ａは、発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する指示を行ってもよく、複数の異なる細胞１０２について同時に撮像を実行してもよい。なお、発光画像取得部１１２ｂは、撮像した発光画像および明視野画像を、クロック発生部１１４による時間情報とともに記憶部１１６に格納してもよい。
【００５８】
また、画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した発光画像に基づいて、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に基づいてサイクリックＧＭＰの濃度を解析する。ここで、画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂにより繰り返し撮像された複数の発光画像に基づいて、経時的なサイクリックＧＭＰ濃度の変動を測定してもよく、複数の異なる細胞１０２について同時に発光画像が撮像された場合に、複数の発光画像を細胞１０２ごとに照合してサイクリックＧＭＰの濃度を解析してもよい。
【００５９】
解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。より具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に基づくサイクリックＧＭＰ濃度の時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を作製し、それぞれの特性を調べた。具体的には、マウスのサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）由来のサイクリックＧＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼ由来の２つの断片とから成るサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を作製し、各種環状ヌクレオチドに対する応答性を調べた。
【００６１】
（手順１）
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、ルシフェラーゼの各種断片を増幅した。図５ａに示すサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の作製のために、Ｎ末側発光酵素（ＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側発光酵素（ＣＬｕｃ）遺伝子を増幅した。また、図５ｂに示すサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の作製のために、Ｎ末側発光酵素（ｃｐＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側発光酵素（ｃｐＣＬｕｃ）遺伝子を増幅した。増幅のための合成オリゴＤＮＡは以下のものを使用した。
［ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＮＬｕｃ＿Ｆｗ （配列番号１）： ５’ − ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡ − ３’
ＮＬｕｃ＿Ｒｖ （配列番号２）： ５’ − ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ − ３’
［ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣＬｕｃ＿Ｆｗ （配列番号３）： ５’ − ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ − ３’
ＣＬｕｃ＿Ｒｖ （配列番号４）： ５’ − ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣ − ３’
［ｃｐＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号５）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号６）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣ−３’
［ｃｐＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号７）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣ−３’
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号８）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３’
【００６２】
また、ＰＣＲによって、ＰＤＥ５ＡのｃＧＭＰ結合ドメイン遺伝子を増幅した。増幅には以下のプライマーを組み合わせて用い、種々の遺伝子を取得した。
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿１＿Ｆｗ （配列番号９）： ５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿２＿Ｆｗ （配列番号１０）： ５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿３＿Ｆｗ （配列番号１１）： ５’− ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣＣＣＣＣ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿１＿Ｒｖ （配列番号１２）： ５’− ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＧＡＧ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿２＿Ｒｖ （配列番号１３）： ５’− ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿３＿Ｒｖ （配列番号１４）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿４＿Ｒｖ （配列番号１５）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿５＿Ｒｖ （配列番号１６）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＡ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿６＿Ｒｖ （配列番号１７）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴ −３’
ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ＿７＿Ｒｖ （配列番号１８）： ５’− ＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣ −３’
【００６３】
（手順２）
ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型とするＰＣＲによって、Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＮＬｕｃ）、Ｃ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＬｕｃ）、変異型Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ｃｐＮＬｕｃ）および変異型Ｃ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ｃｐＣＬｕｃ）を、以下の表１に示されるプライマーを使用して増幅した。これらの遺伝子の、ルシフェラーゼ（ＧＬ４．１０）のアミノ酸配列中の対応する位置を表１に示す。
【００６４】
【表１】
（手順３）
サイクリックＧＭＰ結合領域として使用するために、マウスのサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５Ａ）のｃＤＮＡを鋳型として種々の遺伝子をＰＣＲによって増幅した。図１６に、増幅した遺伝子の名称および使用したプライマーを示す。さらに、増幅した遺伝子の、ＰＤＥ５Ａのアミノ酸配列中の対応する位置、および当該遺伝子がコードする断片のアミノ酸残基の数を示す。なお、ＰＤＥ５ＡにはサイクリックＧＭＰ結合ドメインがＡとＢの２ヶ所存在するが、そのうちＡを含む領域を増幅した。
【００６５】
（手順４）
次のようにして、２種の原核生物発現用プラスミドを作製した。手順２にて取得したＮＬｕｃ遺伝子を原核生物発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ２Ｂ（インビトロジェン社製）内のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入した後、手順２にて取得したＣＬｕｃ遺伝子をＢｇｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、原核生物発現用プラスミド（ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿Ｃ）を作製した。また、手順２にて取得したｃｐＣＬｕｃ遺伝子を原核生物発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴ２Ｂ内のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入した後、手順２にて取得したｃｐＮＬｕｃ遺伝子をＢｇｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、原核生物発現用プラスミド（ｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿Ｎ）を作製した。
【００６６】
（手順５）
次のようにして、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質の発現プラスミドを作製した。手順３にて増幅した１１種のＰＤＥ５Ａ由来の遺伝子を、手順４にて作製した２種の発現用プラスミドのＸｈｏＩ認識部位とＢｇｌＩＩ認識部位との間にそれぞれ挿入した。作製された２２種の発現用プラスミドの名称は、図１６の表中「得られるプラスミドの名称」の項目に示される。
【００６７】
（手順６）
各種サイクリックＧＭＰセンサータンパク質を大腸菌で発現させ、さらに精製した。
【００６８】
手順５にて作製した各種発現プラスミドを、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームし、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（キアゲン社製）を用いて、キットのマニュアルに従ってサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を精製した。精製手順を簡略に説明すると、上記原核生物発現用プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームして、５ｍＬのＬＢ培地中に植菌した。一晩培養した後、遠心分離して集菌し、集菌した大腸菌を溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）５００μＬに再懸濁してリゾチームを添加し（１ｍｇ／ｍＬ）、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を、ボルテックスミキサー等を用いて静かに撹拌して溶解し、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離して上清を新しいチューブに移した。５０％ Ｎｉ−ＮＴＡレジン懸濁液 ５０μＬを添加し、４℃で６０分間静かに混合した。１５，０００ｘｇで１０秒間遠心分離してレジンを沈殿させ、レジンを洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０） ５００μＬで２回洗浄した。溶出バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）５０μＬでタンパク質を２回溶出し、種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を得た。得られた２２種のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質は、図１６の表中「得られえるサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の名称」の項目に示される。
【００６９】
（手順７）
種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質の特性を測定した。
【００７０】
手順６にて取得されたタンパク質の発光活性を、環状ヌクレオチドの非存在下、サイクリックＧＭＰ存在下、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ存在下またはサイクリックＡＭＰ存在下でそれぞれ測定した。測定方法を簡単に説明すると、上述のタンパク質溶液２０μＬに、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）２０μＬを加えた。そこへ、４ｍＭのサイクリックＧＭＰ、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはサイクリックＡＭＰ溶液を１μＬ加え（終濃度１００μＭ）、またネガティブコントロールにはＰＢＳを同量加えた。さらに、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）を４０μＬ加えて、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ ＪＮＲ−ＩＩ（アトー社製）を使用して発光量（５秒間の積算）を測定した。
【００７１】
（結果）
手順７による測定の結果を図６に示す。
サイクリックＧＭＰ存在下において、発光量が特に高かったのは、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５＿ＣおよびＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８＿Ｃであった。これらに準じて、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９＿ＣおよびＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎが一定の発光量を示した。
【００７２】
さらに、これらのタンパク質（ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ８＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ９＿ＣおよびＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎ）では、環状ヌクレオチド非存在下（コントロール）における発光量と、サイクリックＧＭＰ存在下における発光量とで明確な差が示された。
【００７３】
［実施例２］
本発明に係る方法により、ＨＥＫ２９３細胞中のサイクリックＧＭＰ濃度の変動を測定した。
【００７４】
（手順１）
次のようにして、種々のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質についての動物細胞発現用プラスミドを作製した。
【００７５】
実施例１の手順５にて作製した原核細胞発現用プラスミドから、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、サイクリックＧＭＰセンサータンパク質をコードする領域を切り出し、それを動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位との間に挿入した。具体的に使用した原核細胞発現用プラスミドは、ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ｐＲＳＥＴ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、およびｐＲＳＥＴ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＧＡＦａ７＿Ｎの４種であり、これらに基づいて、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ５＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ７＿Ｃ、およびｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＧＡＦａ７＿Ｎを作製した。
【００７６】
（手順２）
使用するＨＥＫ２９３細胞の培養は次のように行った。ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ社より入手し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、および、１ｘ Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。
【００７７】
（手順３）
次のようにして、ＨＥＫ２９３細胞に手順１で作製した動物細胞発現用プラスミドを導入した。細胞を直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに、２ｘ１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、それぞれの動物細胞発現用プラスミドを、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００７８】
（手順４）
次のようにして、手順３で作製した細胞のタイムラプス撮影を行った。培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を添加して１時間静置し、発光顕微鏡ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００（オリンパス社製）にセットし、５秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は５〜１０秒間、ビニングは１ｘ１、ＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用い、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに取り込んだ。
【００７９】
（手順５）
タイムラプス撮影中のＨＥＫ２９３細胞に刺激を与えた。タイムラプス撮影開始から２分後、培養液に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（最終濃度 １００μＭ）を添加し、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
【００８０】
（手順６）
撮影した画像の発光強度の解析を行った。
手順４および５による一連のタイムラプス撮影によって得られた発光画像においてＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定した。指定したＲＯＩにおける発光強度の経時変化をグラフに表示した。
【００８１】
図７から９は、ＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ１＿Ｃを発現させた細胞における測定結果である。図７には、刺激前における発光画像が示される。画像中１から４のＲＯＩが指定されている。一方、図８には、刺激後における、図７と同一の位置を撮影した発光画像が示される。図８においても、図７と同様にＲＯＩが指定されている。さらに、図９には、指定した各ＲＯＩの発光強度の経時変化がグラフとして示される。図７および８にて指定した１から４のＲＯＩは、図９のグラフ中の「ｃｅｌｌ１」から「ｃｅｌｌ４」にそれぞれ対応する。なお、発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。
【００８２】
一方、図１０から１２はＧＬ４＿Ｎ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｃを発現させた細胞における測定結果であり、図１３から１５はｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＰＤＥ５Ａ＿ＧＡＦａ７＿Ｎ発現させた細胞における測定結果である。図１０および１３には刺激前の発光画像が示され、図１１および１４には刺激後の発光画像が示され、図１２および１５には指定した各ＲＯＩの発光強度の経時変化のグラフが示される。
【００８３】
（結果）
８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは膜透過性サイクリックＧＭＰアナログであり、細胞培養液にこれを添加することで細胞内部のサイクリックＧＭＰが上昇することが予想される。ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ１＿Ｃ、ＧＬ４＿Ｎ＿ＧＡＦａ７＿ＣおよびｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＧＡＦａ７＿Ｎをそれぞれ利用する本発明に係る方法により、当該予想を反映した結果が得られた。すなわち、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加後、発光量が増大した。本発明によれば、そのような結果を単一の細胞にて確認することができた。また、個々の細胞における発光強度の変化を見ると、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激において細胞間の応答に大きなばらつきのあることがわかった（図９、図１２および図１５参照）。
【００８４】
これまでのサイクリックＧＭＰを介する細胞内情報伝達機構の研究から、サイクリックＧＭＰ濃度変化の細胞内分布あるいは時間経過が異なると、シグナルの意味が異なることが明らかにされている。従来のルミノメーターを用いた発光量変化の解析では、細胞集団全体の観測に留まり、個々の細胞の応答までは解析できなかった。しかし、本発明に係る方法（装置としてＬＶ−２００を使用する）では、生体内の変化を１細胞毎にリアルタイムに観察することができ、細胞内シグナルの働きを詳細に研究することができた。
【００８５】
以上、本実施例によれば、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてサイクリックＧＭＰ濃度の変化を再現性良く経時的に観察することができる。上述した実施例において使用するルシフェラーゼ遺伝子やルシフェリン等は、他の市販試薬であってもよいし、生物発光等を発生する生物から直接抽出等されたものであってもよい。
【００８６】
［その他の実施例］
上記実施例に示される実施の形態のほかに、本発明は、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施することができる。
【００８７】
例えば、上述した実施の形態においては、主に、互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素、および、ＰＤＥ５ＡのサイクリックＧＭＰ結合ドメインからなる融合タンパク質をサイクリックＧＭＰセンサータンパク質として使用するとしたが、これに限らず、特表２００９−５３２０６３号公報等に開示されているサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を用いてもよい。
【００８８】
また、上述した記載によれば、以下の要旨に表現されるポリペプチドの態様も本発明に包含される。
【００８９】
［ポリペプチド態様１］（機能：スプリットルシフェラーゼの相互作用）
発光酵素のＮ末端側断片、発光酵素のＣ末端側断片、および、サイクリックＧＭＰ結合タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記Ｎ末端側断片およびＣ末端側断片は非共有結合的に相互作用し、前記非共有結合的相互作用は調整可能であることを特徴とするポリペプチド。
［ポリペプチド態様２］（機能：サイクリックＧＭＰ結合タンパク質の作用）
前記サイクリックＧＭＰ結合タンパク質が前記非共有結合的相互作用を検出可能に変化させることを特徴とする前記態様１に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様３］（機能：外因性因子の作用）
前記非共有結合的相互作用は外因性因子の存在下で強化されること、を特徴とする前記態様１に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様４］（機能：サイクリックＧＭＰの作用）
前記外因性因子はサイクリックＧＭＰであること、を特徴とする前記態様２に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様５］（機能：発光）
前記態様３に記載のポリペプチドであって、前記非共有的相互作用により発光することを特徴とするポリペプチド。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上詳述に説明したように、本発明にかかるサイクリックＧＭＰ解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００９１】
１００ 発光観察システム
１０３ 容器（シャーレ）
１０４ ステージ
１０６ 発光画像撮像ユニット
１０６ａ 対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ ダイクロイックミラー
１０６ｃ ＣＣＤカメラ
１０６ｄ スプリットイメージユニット
１０６ｅ フィルターホイール
１０６ｆ 結像レンズ
１１０ 画像解析装置
１１２ 制御部
１１２ａ 発光画像撮像指示部
１１２ｂ 発光画像取得部
１１２ｃ 画像解析部
１１２ｄ 解析結果出力部
１１４ クロック発生部
１１６ 記憶部
１１８ 通信インターフェース部
１２０ 入出力インターフェース部
１２２ 入力装置
１２４ 出力装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、
前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程と
を含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項２】
前記サイクリックＧＭＰ結合領域がサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ由来である、請求項１に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項３】
前記サイクリックＧＭＰ結合領域が、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａのアミノ酸番号
１２１番目から３３０番目、
１３１番目から３２０番目、
１３１番目から３３０番目、
１３１番目から３４３番目、または
１３１番目から３５８番目
のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項４】
前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む
請求項１から３の何れか１項に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項５】
前記撮像工程が前記発光画像を繰り返し撮像することを含む、請求項１から４の何れか１項に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項６】
前記撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、
前記解析工程が前記細胞ごとに行われる、
請求項１から６の何れか１項に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項７】
発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項８】
前記サイクリックＧＭＰ結合領域が、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａのアミノ酸番号
１２１番目から３３０番目、
１３１番目から３２０番目、
１３１番目から３３０番目、
１３１番目から３４３番目、または
１３１番目から３５８番目
のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項９】
前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む
請求項７または８に記載のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項１０】
配列番号３１、３５、３７、４８、３８または３９に示されるアミノ酸配列を含む請求項７から９の何れか１項に記載のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項１】
発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、
前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックＧＭＰの濃度を解析する解析工程と
を含む細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項２】
前記サイクリックＧＭＰ結合領域がサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ由来である、請求項１に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項３】
前記サイクリックＧＭＰ結合領域が、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａのアミノ酸番号
１２１番目から３３０番目、
１３１番目から３２０番目、
１３１番目から３３０番目、
１３１番目から３４３番目、または
１３１番目から３５８番目
のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項４】
前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む
請求項１から３の何れか１項に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項５】
前記撮像工程が前記発光画像を繰り返し撮像することを含む、請求項１から４の何れか１項に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項６】
前記撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、
前記解析工程が前記細胞ごとに行われる、
請求項１から６の何れか１項に記載の細胞内サイクリックＧＭＰ解析方法。
【請求項７】
発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片およびサイクリックＧＭＰ結合領域を含むサイクリックＧＭＰセンサータンパク質であって、前記サイクリックＧＭＰ結合領域は前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片との間に配置されたサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項８】
前記サイクリックＧＭＰ結合領域が、マウスサイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５Ａのアミノ酸番号
１２１番目から３３０番目、
１３１番目から３２０番目、
１３１番目から３３０番目、
１３１番目から３４３番目、または
１３１番目から３５８番目
のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項９】
前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む
請求項７または８に記載のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【請求項１０】
配列番号３１、３５、３７、４８、３８または３９に示されるアミノ酸配列を含む請求項７から９の何れか１項に記載のサイクリックＧＭＰセンサータンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−１９５５４７（Ｐ２０１１−１９５５４７Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６６８９５（Ｐ２０１０−６６８９５）
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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