タンパク質を検出するための分析試薬
【課題】簡便、迅速かつ高感度なタンパク質の分析手段の提供。
【解決手段】タンパク質の分析に用いるための、一般式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基である。］により表わされる化合物あるいはその塩。
【解決手段】タンパク質の分析に用いるための、一般式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基である。］により表わされる化合物あるいはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を検出するための化合物およびそれを用いた試料中のタンパク質を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内のタンパク質を網羅的に調べて病気の状態や原因を探るプロテオーム研究の進展に伴って、癌マーカータンパク質のように疾患の目印となるタンパク質を決定しようとする研究が急速に加速している。とりわけ、タンパク質表面、タンパク質表面間の分子認識は、生命現象における共通の言語と考えられ、細胞外からの情報の多くは、細胞膜や細胞内部でのタンパク質表面を介した相互作用によって、増幅し伝達される。
【０００３】
近年、ＤＮＡチップ技術の向上により、ＲＮＡの発現を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析が盛んに行われている。しかしながら、このＲＮＡ発現プロファイルとタンパク質の発現プロファイルは必ずしも一致するわけでなく、その相関は５０％以下であると言われている（非特許文献１）。そこで、ＲＮＡの網羅的解析に加え、タンパク質の網羅的解析が重要視されている。近年、著しく発展している二次元電気泳動法や質量分析計、さらにはプロテインチップのようなゲノム解析に匹敵するハイスループット分析を駆使して、タンパク質の機能を明らかにする試みが盛んに行われている。今後は、その成果を医療や健康管理の現場で役立てるために、疾患のマーカーとなるタンパク質を、簡便かつ迅速に分析する技術の確立が必要とされている。
【０００４】
試料中のタンパク質を定量するための代表的な方法としては、（１）吸光光度法、（２）Ｂｉｕｒｅｔ試薬を用いるＢｉｕｒｅｔ法、（３）フェノール試薬とＢｉｕｒｅｔ法を組み合わせたＬｏｗｒｙ法、（４）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法などが挙げられる。また、特定のタンパク質を特異的に測定する方法として、（５）ＥＬＩＳＡ法が用いられている。これらの手法の特徴は以下に示すとおりである。
【０００５】
（１）吸光光度法：タンパク質中に含まれるチロシンおよびトリプトファンに起因する２８０ｎｍ付近での吸収を利用して、タンパク質濃度を算出する方法である。タンパク質の種類によって、チロシンおよびトリプトファンの含有量が異なるため、同じ濃度であっても２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０ｎｍ）は変動しうるので、通常、対照濃度（１ｍｇ／ｍＬなど）でのＡ２８０ｎｍを１．０として、試料中のタンパク質濃度を算出する。操作が簡便であり、かつ測定後に試料の回収が可能である。タンパク質の種類によりＡ２８０ｎｍが変動する。２８０ｎｍ付近の光を吸収しないタンパク質（例えば、コラーゲン、ゼラチン）については測定を行うことができない。紫外光を吸収する物質の混入により定量が妨害される。
【０００６】
（２）Ｂｉｕｒｅｔ法：アルカリ性条件下でタンパク質をＣｕ２＋溶液と反応させ、Ｃｕ２＋がポリペプチド鎖中の窒素原子と配位結合することにより呈する赤色を、５４０ｎｍにおける吸光度から測定することで、タンパク質濃度を算出する方法である。タンパク質の種類による発色率の違いが少ない。操作が簡単である。感度が低い。したがって低濃度試料の測定には使用することができない。
【０００７】
（３）Ｌｏｗｒｙ法：タンパク質をフェノール試薬（リンモリブデン酸とリンタングステン酸を酸性溶液に溶解させたもの）と反応させ、フェノール試薬がタンパク質中のチロシン、トリプトファンおよびシステインと反応することにより呈する青色を検出することで、タンパク質濃度を測定する方法である。ペプチド結合に由来する発色が強いため、Ｂｉｕｒｅｔ法よりもはるかに感度が高く、最も一般的に使用されている方法である。還元反応により呈色が起こるため、他の還元物質による干渉を受ける。操作が煩雑で測定までに時間がかかる。タンパク質の種類によって発色率が異なる。
【０００８】
（４）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法：酸性溶液中でＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０（トリフェニルメタン系青色色素）がタンパク質に結合することにより起こる色調変化（赤紫色から青色へ、極大吸収波長：４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフト）を利用して、タンパク質を定量する。混入物質による影響を受けにくい。操作が簡単である。タンパク質の種類によって発色率が異なる。界面活性剤の混入により発色が阻害される。
【０００９】
（５）ＥＬＩＳＡ法：特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を利用して、対象となるタンパク質の定量を行う免疫学的方法である。特定のタンパク質の濃度を測定することができる。測定に時間がかかる。
【００１０】
また、種々の化学物質の測定には、蛍光測定法が用いられている。蛍光測定法は、高感度であること、必要とされる試料が少量であること、大掛かりな装置や熟練した技術を必要としないこと、などの利点を有する。
【００１１】
蛍光測定法を利用したタンパク質定量については、これまでも報告されている。蛍光色素とタンパク質との直接的な結合を用いる方法としては、例えば、フルオレサミンを利用した方法（フルオレサミンが第１級アミンと結合すると、４９５ｎｍの強い蛍光を発する蛍光物質となることを利用する）、シアニン色素を用いる方法、アゾール誘導体を用いる方法などがある（特許文献１）。しかしながら、これらの方法では、タンパク質の種類によって検出率が異なること、検量線が直線とならないこと、色素同士の会合により測定誤差が生じること、ストークスシフトが小さいことなどの問題点がある。
【００１２】
また、タンパク質の分子量を測定することや、タンパク質を同定するための試料を調製するために用いられている電気泳動法に目を向けてみると、通常、電気泳動で分離されたタンパク質は、電気泳動前もしくは電気泳動後にタンパク質と相互作用を示す化合物を含んだ試薬を作用させ、目視もしくは専用の検出器にて検出できるようにする必要がある。
【００１３】
試料中のタンパク質を検出するために、タンパク質を染色する方法が従来的に用いられている。タンパク質を染色する方法としては、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色法、銀染色法、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染色法などが挙げられる。
【００１４】
これらの慣用の手法のうち、ＣＢＢ法は、簡便かつ迅速に行うことができるが、検出感度が低く（検出限界：５０〜１００ｎｇ）、タンパク質の種類によって検出感度が大きく異なるという問題を有する。銀染色法は、検出限界が１〜１０ｎｇであり高感度な方法であるが、定量性がなく、また銀を含む廃液の特別な処理が必要であるという欠点を有する。Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（インビトロジェン社）などの蛍光色素を用いる方法は、銀染色を上回る検出感度を示す場合があるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用する場合、担体に残存するＳＤＳの影響を受け易く、目的タンパク質が検出できない場合がある。また、バックグラウンドが比較的高いため、蛍光色素を用いてタンパク質を染色する前に固定処理を行い、且つ染色後に十分な時間の洗浄・脱色が必要である。このことから、迅速性がなく、同時に作業者に負担が大きいという問題がある。
【００１５】
上記の様々な手法に存在する様々な欠点を勘案すると、タンパク質を検出および／または測定するための新たな手法が必要であることが理解されよう。すなわち、当該分野においては、依然としてタンパク質を簡便、迅速かつ高感度に検出および／または測定することができる新規手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００６−２３４７７２号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】礒辺俊明、高橋信弘/編 「プロテオーム解析法」羊土社(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、簡便、迅速かつ高感度なタンパク質の分析を行うための新規手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、タンパク質の不存在下では顕著な蛍光を生じないが、これをタンパク質に作用させると、当該タンパク質との相互作用により複合体を形成して、それによって蛍光を生じる化合物を見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］ 下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物あるいはその塩。
【化１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、
Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基であり、ここでＲ７が３級アミノ基である場合、窒素原子は炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基、水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖などを有する。］
［２］ 下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物である、［１］の化合物。
【化２】
［３］ ［１］または［２］の化合物を含む、タンパク質分析用試薬。
［４］ ［３］のタンパク質分析用試薬と試料中のタンパク質と接触させ、該タンパク質分析用試薬から生じる蛍光を検出し、それによってタンパク質を定性的または定量的に分析することを含む、タンパク質の分析方法。
［５］ 蛍光光度法および吸光光度法を用いて、試料中のタンパク質を定性的または定量的に分析する、［４］の方法。
［６］ 電気泳動により、試料中のタンパク質を分離することを含む、［４］の方法。
［７］ ［１］または［２］の化合物の、タンパク質分析用試薬としての使用。
【発明の効果】
【００２１】
本発明を用いることにより、簡便、迅速かつ高感度なタンパク質の分析が可能となる。また、本発明における化合物は安価かつ容易に合成できることから、タンパク質の分析に要するコストを低減することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の化合物とタンパク質との複合体形成による蛍光発生の概略を表す模式図である。
【図２】図２は、本発明の化合物の合成スキームを表す模式図である。
【図３】図３は、本発明の化合物の、ＢＳＡの存在下および不存在下における吸収スペクトルを示す特性図である。
【図４】図４は、本発明の化合物の、ＢＳＡの存在下における励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す特性図である。
【図５】図５は、本発明の化合物の種々の濃度のＢＳＡの存在下における蛍光スペクトルを示す特性図である。
【図６】図６は、本発明の化合物の６６０ｎｍにおける蛍光強度とＢＳＡ濃度との関係を示す特性図である。
【図７】図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された各種タンパク質の、本発明の化合物を用いた蛍光像である。励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ。オボトランスフェリン（７８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、カルボアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）、シトクロムｃ（１２ｋＤａ）。
【図８】図８は、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質混合物（Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ Ｌｙｓａｔｅ）の、本発明の化合物を用いた蛍光像である。励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で表わされる構造を有する。
【００２４】
【化３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、
Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基であり、ここでＲ７が３級アミノ基である場合、窒素原子は炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基、水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖などを有する］。各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物がタンパク質と結合し、呈色変化または蛍光強度の向上を観察し得る限り、特に上記のものに限定されない。
【００２５】
上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、例えば下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物が挙げられる。
【００２６】
【化４】
【００２７】
本発明の化合物には、上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表わされる化合物の塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩、アンモニウム塩など）を含む。
【００２８】
本発明の化合物は、図１に示すようにタンパク質の不存在下（遊離状態）では顕著な蛍光を生じない。しかしこれをタンパク質に作用させると、相互作用によりタンパク質と複合体を形成し、当該化合物がタンパク質の疎水場に入ることによって、当該化合物の蛍光量子収率が増加し得、それによって蛍光を生じる。
【００２９】
本明細書において、「タンパク質」には、ペプチド、タンパク質複合体（例えば、糖タンパク質、タンパク質−核酸複合体、標識されたタンパク質など）を含み、また天然および非天然（組換えタンパク質など）のものも含む。
【００３０】
また、本明細書において、「蛍光」とは、ある分子に特定の波長の光（励起光）を照射した際に該分子から発せられる照射光とは異なる波長の光を意味する。
【００３１】
さらに、本明細書において、「相互作用」とは、本発明の化合物とタンパク質との間に何らかの物理的および／または化学的作用が生じている状態を意味し、例えば、タンパク質が、疎水性相互作用、電荷移動相互作用などにより互いに結合している状態がこれに含まれる。
【００３２】
本発明の化合物はまた、タンパク質の不存在下（遊離状態）における呈色とタンパク質と複合体を形成している状態における呈色とに変化を生じ得る。これは当該化合物がタンパク質の疎水場に入ることによって、光の吸収波長が長波長側に移動することによって、例えば薄い青色から濃い青色に色調が変化し得る。
【００３３】
上記特徴により、本発明の化合物は特に、タンパク質の分析用試薬として用いることができる。
【００３４】
本明細書において、タンパク質の「分析」とは、タンパク質を定性的に検出すること、すなわちタンパク質の存在の有無を確認すること、タンパク質の分子量を測定すること、タンパク質の分布を決定すること、定量的に測定することなどを含む。
【００３５】
本発明の化合物をタンパク質分析用試薬として用いるには、試料中のタンパク質と本発明の化合物とを接触させ、タンパク質との相互作用により当該化合物から生じる蛍光を検出および／または測定することによって行う。あるいはタンパク質との相互作用により当該化合物の呈色変化を検出することによって行う。
【００３６】
分析対象となるタンパク質は、特に限定されない。本発明の化合物は、様々なタンパク質の疎水場に入ることによって、疎水性相互作用による非共有結合的な複合体を形成し、それによって、当該化合物は蛍光を生じたり、または当該化合物の呈色変化を生じたりすることができる。
【００３７】
分析対象となるタンパク質を含む試料は、分析対象となるタンパク質を含む限り、液体または固体のいずれの形状を有していても良い。このような試料としては、体液（血液、リンパ液、汗、涙、母乳、唾液、胃液、腸液、精液、羊水、膣液、鼻水、糞尿など）、細胞、組織およびこれらの破砕物、タンパク質を電気泳動したゲル（ポリアクリルアミド、アガロースゲルなど）、タンパク質を移した膜（セルロールアセテート膜、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
タンパク質分析用試薬として使用される本発明の化合物は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、アルコール（炭素数１〜３）、ＤＭＳＯなど適当な溶媒中に溶解または懸濁して用いることができる。また、本発明の化合物は、固相に固定化されていても良い。本発明の化合物を固定化するための固相は、その上でタンパク質との相互作用により生じる蛍光または呈色変化の検出および／または測定が行えるものであれば特に限定されることなく、任意のものを選択することができる。このような固相の材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）が挙げられる。固相の形状および材質は特に限定されるものではない。
【００３９】
タンパク質を含む試料と本発明の化合物との接触は、タンパク質を含む試料の種類や量、および本発明の化合物の形態や量などに応じて、適宜決定することができる。例えば、試料に含まれるタンパク質の量が、およそ０〜１０００μｇである場合には、およそ５〜５００μＭ、好ましくは５〜１００μＭの本発明の化合物を、２０〜４０℃、好ましくは室温、さらに好ましくは２５℃にて、１〜３０分間、好ましくは１〜１０分間、接触させることによって行うことができる。
【００４０】
試料中に含まれるタンパク質との相互作用により本発明の化合物から生じる蛍光の検出および／または測定は、市販の通常用いられる機器を使用して行うことができる。例えば、用いることができる機器としては、マイクロプレートリーダー、蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、感光性フィルムなどが挙げられる。また、試料中に含まれるタンパク質との相互作用により生じる本発明の化合物の呈色変化は、目視観察や市販の通常用いられる機器（分光光度計、プレートリーダーなど）を使用して行うことができる。
【００４１】
本発明の化合物を用いることによる、試料中に含まれるタンパク質の検出感度は、タンパク質を含む試料の種類や量、および本発明の化合物の形態や量などに応じて変化し得るが、水溶液中のタンパク質であれば、２０ｎｇ／ｍＬ、ゲル中のタンパク質であれば０．０２ｎｇの検出限界を有し、従来のタンパク質の検出に用いられている分析用試薬と比較して、その検出感度は非常に高い。そのため、本発明の化合物をタンパク質分析用試薬として用いることによって、微量の試料のみしか必要とせず、また蛍光または呈色変化の検出は一般的な機器により実施可能である。
【００４２】
また、本発明の化合物は、電気泳動により分離されたタンパク質の分析に利用することができる。タンパク質を電気泳動したゲルを、本発明の化合物を含む水溶液中に浸漬することによって、ゲル中のタンパク質と本発明の化合物とを接触させることができる。あるいは、電気泳動後に本発明の化合物を含む水溶液中にタンパク質を電気泳動したゲルを浸漬する代わりに、電気泳動用の緩衝液または電気泳動用ゲル中に本発明の化合物を電気泳動前に添加または混合することにより、電気泳動中に本発明の化合物とタンパク質との相互作用を同時に行うことによっても実施することができる。また、試料中のタンパク質を本発明の化合物に接触させ、その後、電気泳動を行うことによって実施することもできる。
【００４３】
さらに、本発明の化合物は、特定のタンパク質に対して一定の割合で結合するために、既知濃度のタンパク質が含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作製することによって、試料中に含まれるタンパク質の量を簡便に定量することができる。
【００４４】
またさらに、本発明の化合物は、抗体などと異なり、様々なタンパク質と結合することができ、そのため試料中に含まれる複数種のタンパク質を網羅的に分析することができる。
【００４５】
上記のとおり、本発明の化合物をタンパク質分析用試薬として用いることによって、非常に効率のよいタンパク質の検出および／または測定を実現することができる。
【実施例】
【００４６】
実施例１：化合物の合成
タンパク質分析用試薬として用いるため化合物の合成を行った。当該化合物の合成は、図２に示す合成スキームに従って行った。以下に、各合成反応について詳述する。
（１） １−エチル−２−（２−（メチル（フェニル）アミノ）ビニル）キノリニウムヨージドの合成
【００４７】
【化５】
【００４８】
Ａｒ雰囲気下、１００ｍＬ三口フラスコにキナルジンエチオジド １．０ｇ、Ｎ−メチルアニリン ０．７ｇ、オルトギ酸トリメチル １．０ｇ、２−メトキシエタノール ２０ｍＬを加え、１２時間還流した。溶媒を減圧留去後、残渣を酢酸エチルで洗浄した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；クロロホルム：メタノール＝２：１ｖ／ｖ）で精製し、緑色固体として表題の化合物が得られた（収率：８７％）。
1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz, r.t., TMS, δ/ppm) 1.58 (t, 3H), 3.44 (s, 3H), 4.81 (q, 2H), 6.10 (d, 1H), 6.60 (d, 2H), 6.77 (t, 1H), 6.78 (d, 1H), 7.23 (t, 2H), 7.29 (d, 1H), 8.10 (t, 1H), 8.23 (t, 1H), 8.42 (d, 1H), 8.61 (d, 1H), 8.98 (d, 1H).
【００４９】
（２） ２−（２−（（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチルキノリン−２（１Ｈ）−イリデン）プロプ−１−エニル）−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−イリデン）マロノニトリルの合成
【００５０】
【化６】
【００５１】
１００ｍＬ三口フラスコに、１−エチル−２−（２−（メチル（フェニル）アミノ）ビニル）キノリニウムヨージド ０．５ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、４−（ジシアノメチレン）−２，６−ジメチル４Ｈ−ピラン ０．２ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ピリジン ２０ｍＬ、トリエチルアミン５ｍＬを加え、Ａｒ気流下、１２時間還流した。溶媒を減圧留去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１０：１ｖ／ｖ）で精製し、表題の化合物が得られた（収率：８１％）。
1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz, r.t., TMS, δ/ppm) 1.31 (t, 3H), 2.24 (s, 3H), 4.56 (q, 2H), 5.27 (s, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.91 (d, 1H), 6.48 〜 6.55 (m, 3H), 6.72 (t, 1H), 7.11 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 7.91 (d, 1H), 8.71 (d, 1H).
【００５２】
実施例２：合成した化合物の特性評価（吸収スペクトル測定）
実施例１で合成した化合物の吸収スペクトル測定を行った。吸収スペクトル測定に際しては、下記条件にて吸光光度計を用いて行った。
濃度：［化合物］＝５μＭ
［ＢＳＡ］＝０，５０μｇ／ｍＬ
溶媒：ＨＥＰＥＳ，２０．０ｍＭ（ｐＨ７．２）
測定温度：２５℃
【００５３】
ＢＳＡの存在下（５０μｇ／ｍＬ）または非存在下における化合物の吸収スペクトルを図３に示す。
ＢＳＡの存在下において、吸光度が増加した。
【００５４】
実施例３：合成した化合物の特性評価（励起スペクトルおよび蛍光スペクトル測定）
実施例１で合成した化合物の励起スペクトルおよび蛍光スペクトル測定を行った。測定に際しては、下記条件にて蛍光光度計を用いて行った。
濃度：［化合物］＝５μＭ
［ＢＳＡ］＝０〜５０μｇ／ｍＬ
溶媒：ＨＥＰＥＳ，２０．０ｍＭ（ｐＨ７．２）
測定温度：２５℃
励起波長：５８３ｎｍ
励起スペクトルにおける検出波長：６６０ｎｍ
【００５５】
ＢＳＡの存在下（５０μｇ／ｍＬ）における化合物の励起スペクトルと蛍光スペクトルを図４に示す。極大励起波長は５８３ｎｍ、極大蛍光波長は６６０ｎｍとなり、７７ｎｍのストークスシフトが観察された。
【００５６】
次に励起波長を５８３ｎｍとし、種々の濃度（０、０．７、１．５、３．１、６．２、１２．５、２５．０、５０．０μｇ／ｍＬ）のＢＳＡを添加した時の化合物の蛍光スペクトル変化を測定した。結果を図５に示す。
【００５７】
添加したＢＳＡ濃度の増加に伴い、蛍光強度の増加が観察された。ＢＳＡを５０μｇ／ｍＬ添加した時の蛍光強度は、化合物単独の蛍光強度と比較して、約５０００倍増加した。
【００５８】
化合物にＢＳＡを添加した時の６６０ｎｍにおける蛍光強度をＢＳＡ濃度に対してプロットしたところ、図６に示したように、良好な直線関係が得られた。また検出限界は２０ｎｇ／ｍＬであり、これまでに開発した分析試薬よりも約５倍感度が良いことが分かった。
【００５９】
実施例４：合成した化合物の特性評価（電気泳動実験）
実施例１で合成した化合物の電気泳動実験を行った。電気泳動実験は下記条件にて行った。
染色液；実施例１で合成した化合物５０ｍｇをＤＭＳＯ ５００μＬに溶解し、これを１００μＬとり、メタノール：水＝１：１ｖ／ｖの混合溶媒を加えて５０ｍＬとし、染色液を調製した。
固定化液と洗浄液；水：メタノール：酢酸＝８７：１０：３ｖ／ｖ
タンパク質サンプル：市販の分子量マーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｅｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ ＩＶ；メルク社製）を使用した。このマーカーには、オボトランスフェリン（７８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、カルボアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）、およびシトクロムｃ（１２ｋＤａ）が質量換算で等量ずつ含まれる。
電気泳動装置：ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌキット（ディー・アール・シー株式会社）
検出装置：Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥヘルスケア社）
【００６０】
電気泳動終了後、ゲルを取り出し、固定化液中で３０分間洗浄した。その後、染色液中で３０分間、ゲルを浸した後、洗浄液中で３０分間洗浄した。
【００６１】
結果を図７に示す。電気泳動によって泳動されたゲル中のタンパク質は、染色液中の化合物と複合体を形成することによって、図７に示したような、明瞭な蛍光のバンドを示した。検出限界は、０．０２ｎｇであった。
【００６２】
また、下記の構造を有する既存のタンパク質分析用試薬（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２７，１７７９９ （２００５））との比較を行った。
【００６３】
【化７】
【００６４】
結果を以下の表１および表２に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
既存のタンパク質分析用試薬の検出限界は３０ｎｇであり、実施例１で合成した化合物の検出限界は０．０２ｎｇであり、既存のタンパク質分析用試薬の検出感度の約１５００倍であることが明らかとなった。
【００６８】
実施例５：合成した化合物の特性評価（２次元電気泳動実験）
実施例１で合成した化合物の２次元電気泳動実験を行った。電気泳動実験は下記条件にて行った。
染色液；実施例１で合成した化合物５０ｍｇをＤＭＳＯ ５００μＬに溶解し、これを１００μＬとり、メタノール：水＝１：１ｖ／ｖの混合溶媒を加えて５０ｍＬとし、染色液を調製した。
固定化液と洗浄液；水：メタノール：酢酸＝８７：１０：３ｖ／ｖ
タンパク質サンプル：マウス肝臓ライセート （２０μｇ）
電気泳動装置：ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌキット（ディー・アール・シー株式会社）
検出装置：Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥヘルスケア社）
【００６９】
電気泳動終了後、ゲルを取り出し、固定化液中で３０分間洗浄した。その後、染色液中で３０分間、ゲルを浸した後、洗浄液中で３０分間洗浄した。
【００７０】
結果を図８に示す。電気泳動によって泳動されたゲル中の様々なタンパク質は、染色液中の化合物と複合体を形成することによって、図８に示したような、明瞭な蛍光のスポットを示した。
【００７１】
以上の結果から、本発明の化合物は、様々なタンパク質と複合体を形成し、蛍光を発することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、タンパク質の分析のための簡便、迅速かつ高感度な手段を実現することができる。本発明は、生化学、医療、分析化学など様々な分野において、ペプチドまたはタンパク質の高感度、網羅的かつハイスループットな分析手段として利用されることが大いに期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を検出するための化合物およびそれを用いた試料中のタンパク質を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内のタンパク質を網羅的に調べて病気の状態や原因を探るプロテオーム研究の進展に伴って、癌マーカータンパク質のように疾患の目印となるタンパク質を決定しようとする研究が急速に加速している。とりわけ、タンパク質表面、タンパク質表面間の分子認識は、生命現象における共通の言語と考えられ、細胞外からの情報の多くは、細胞膜や細胞内部でのタンパク質表面を介した相互作用によって、増幅し伝達される。
【０００３】
近年、ＤＮＡチップ技術の向上により、ＲＮＡの発現を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析が盛んに行われている。しかしながら、このＲＮＡ発現プロファイルとタンパク質の発現プロファイルは必ずしも一致するわけでなく、その相関は５０％以下であると言われている（非特許文献１）。そこで、ＲＮＡの網羅的解析に加え、タンパク質の網羅的解析が重要視されている。近年、著しく発展している二次元電気泳動法や質量分析計、さらにはプロテインチップのようなゲノム解析に匹敵するハイスループット分析を駆使して、タンパク質の機能を明らかにする試みが盛んに行われている。今後は、その成果を医療や健康管理の現場で役立てるために、疾患のマーカーとなるタンパク質を、簡便かつ迅速に分析する技術の確立が必要とされている。
【０００４】
試料中のタンパク質を定量するための代表的な方法としては、（１）吸光光度法、（２）Ｂｉｕｒｅｔ試薬を用いるＢｉｕｒｅｔ法、（３）フェノール試薬とＢｉｕｒｅｔ法を組み合わせたＬｏｗｒｙ法、（４）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法などが挙げられる。また、特定のタンパク質を特異的に測定する方法として、（５）ＥＬＩＳＡ法が用いられている。これらの手法の特徴は以下に示すとおりである。
【０００５】
（１）吸光光度法：タンパク質中に含まれるチロシンおよびトリプトファンに起因する２８０ｎｍ付近での吸収を利用して、タンパク質濃度を算出する方法である。タンパク質の種類によって、チロシンおよびトリプトファンの含有量が異なるため、同じ濃度であっても２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０ｎｍ）は変動しうるので、通常、対照濃度（１ｍｇ／ｍＬなど）でのＡ２８０ｎｍを１．０として、試料中のタンパク質濃度を算出する。操作が簡便であり、かつ測定後に試料の回収が可能である。タンパク質の種類によりＡ２８０ｎｍが変動する。２８０ｎｍ付近の光を吸収しないタンパク質（例えば、コラーゲン、ゼラチン）については測定を行うことができない。紫外光を吸収する物質の混入により定量が妨害される。
【０００６】
（２）Ｂｉｕｒｅｔ法：アルカリ性条件下でタンパク質をＣｕ２＋溶液と反応させ、Ｃｕ２＋がポリペプチド鎖中の窒素原子と配位結合することにより呈する赤色を、５４０ｎｍにおける吸光度から測定することで、タンパク質濃度を算出する方法である。タンパク質の種類による発色率の違いが少ない。操作が簡単である。感度が低い。したがって低濃度試料の測定には使用することができない。
【０００７】
（３）Ｌｏｗｒｙ法：タンパク質をフェノール試薬（リンモリブデン酸とリンタングステン酸を酸性溶液に溶解させたもの）と反応させ、フェノール試薬がタンパク質中のチロシン、トリプトファンおよびシステインと反応することにより呈する青色を検出することで、タンパク質濃度を測定する方法である。ペプチド結合に由来する発色が強いため、Ｂｉｕｒｅｔ法よりもはるかに感度が高く、最も一般的に使用されている方法である。還元反応により呈色が起こるため、他の還元物質による干渉を受ける。操作が煩雑で測定までに時間がかかる。タンパク質の種類によって発色率が異なる。
【０００８】
（４）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法：酸性溶液中でＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０（トリフェニルメタン系青色色素）がタンパク質に結合することにより起こる色調変化（赤紫色から青色へ、極大吸収波長：４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフト）を利用して、タンパク質を定量する。混入物質による影響を受けにくい。操作が簡単である。タンパク質の種類によって発色率が異なる。界面活性剤の混入により発色が阻害される。
【０００９】
（５）ＥＬＩＳＡ法：特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を利用して、対象となるタンパク質の定量を行う免疫学的方法である。特定のタンパク質の濃度を測定することができる。測定に時間がかかる。
【００１０】
また、種々の化学物質の測定には、蛍光測定法が用いられている。蛍光測定法は、高感度であること、必要とされる試料が少量であること、大掛かりな装置や熟練した技術を必要としないこと、などの利点を有する。
【００１１】
蛍光測定法を利用したタンパク質定量については、これまでも報告されている。蛍光色素とタンパク質との直接的な結合を用いる方法としては、例えば、フルオレサミンを利用した方法（フルオレサミンが第１級アミンと結合すると、４９５ｎｍの強い蛍光を発する蛍光物質となることを利用する）、シアニン色素を用いる方法、アゾール誘導体を用いる方法などがある（特許文献１）。しかしながら、これらの方法では、タンパク質の種類によって検出率が異なること、検量線が直線とならないこと、色素同士の会合により測定誤差が生じること、ストークスシフトが小さいことなどの問題点がある。
【００１２】
また、タンパク質の分子量を測定することや、タンパク質を同定するための試料を調製するために用いられている電気泳動法に目を向けてみると、通常、電気泳動で分離されたタンパク質は、電気泳動前もしくは電気泳動後にタンパク質と相互作用を示す化合物を含んだ試薬を作用させ、目視もしくは専用の検出器にて検出できるようにする必要がある。
【００１３】
試料中のタンパク質を検出するために、タンパク質を染色する方法が従来的に用いられている。タンパク質を染色する方法としては、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色法、銀染色法、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染色法などが挙げられる。
【００１４】
これらの慣用の手法のうち、ＣＢＢ法は、簡便かつ迅速に行うことができるが、検出感度が低く（検出限界：５０〜１００ｎｇ）、タンパク質の種類によって検出感度が大きく異なるという問題を有する。銀染色法は、検出限界が１〜１０ｎｇであり高感度な方法であるが、定量性がなく、また銀を含む廃液の特別な処理が必要であるという欠点を有する。Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（インビトロジェン社）などの蛍光色素を用いる方法は、銀染色を上回る検出感度を示す場合があるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用する場合、担体に残存するＳＤＳの影響を受け易く、目的タンパク質が検出できない場合がある。また、バックグラウンドが比較的高いため、蛍光色素を用いてタンパク質を染色する前に固定処理を行い、且つ染色後に十分な時間の洗浄・脱色が必要である。このことから、迅速性がなく、同時に作業者に負担が大きいという問題がある。
【００１５】
上記の様々な手法に存在する様々な欠点を勘案すると、タンパク質を検出および／または測定するための新たな手法が必要であることが理解されよう。すなわち、当該分野においては、依然としてタンパク質を簡便、迅速かつ高感度に検出および／または測定することができる新規手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００６−２３４７７２号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】礒辺俊明、高橋信弘/編 「プロテオーム解析法」羊土社(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、簡便、迅速かつ高感度なタンパク質の分析を行うための新規手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、タンパク質の不存在下では顕著な蛍光を生じないが、これをタンパク質に作用させると、当該タンパク質との相互作用により複合体を形成して、それによって蛍光を生じる化合物を見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］ 下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物あるいはその塩。
【化１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、
Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基であり、ここでＲ７が３級アミノ基である場合、窒素原子は炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基、水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖などを有する。］
［２］ 下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物である、［１］の化合物。
【化２】
［３］ ［１］または［２］の化合物を含む、タンパク質分析用試薬。
［４］ ［３］のタンパク質分析用試薬と試料中のタンパク質と接触させ、該タンパク質分析用試薬から生じる蛍光を検出し、それによってタンパク質を定性的または定量的に分析することを含む、タンパク質の分析方法。
［５］ 蛍光光度法および吸光光度法を用いて、試料中のタンパク質を定性的または定量的に分析する、［４］の方法。
［６］ 電気泳動により、試料中のタンパク質を分離することを含む、［４］の方法。
［７］ ［１］または［２］の化合物の、タンパク質分析用試薬としての使用。
【発明の効果】
【００２１】
本発明を用いることにより、簡便、迅速かつ高感度なタンパク質の分析が可能となる。また、本発明における化合物は安価かつ容易に合成できることから、タンパク質の分析に要するコストを低減することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の化合物とタンパク質との複合体形成による蛍光発生の概略を表す模式図である。
【図２】図２は、本発明の化合物の合成スキームを表す模式図である。
【図３】図３は、本発明の化合物の、ＢＳＡの存在下および不存在下における吸収スペクトルを示す特性図である。
【図４】図４は、本発明の化合物の、ＢＳＡの存在下における励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す特性図である。
【図５】図５は、本発明の化合物の種々の濃度のＢＳＡの存在下における蛍光スペクトルを示す特性図である。
【図６】図６は、本発明の化合物の６６０ｎｍにおける蛍光強度とＢＳＡ濃度との関係を示す特性図である。
【図７】図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された各種タンパク質の、本発明の化合物を用いた蛍光像である。励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ。オボトランスフェリン（７８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、カルボアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）、シトクロムｃ（１２ｋＤａ）。
【図８】図８は、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質混合物（Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ Ｌｙｓａｔｅ）の、本発明の化合物を用いた蛍光像である。励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で表わされる構造を有する。
【００２４】
【化３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、
Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基であり、ここでＲ７が３級アミノ基である場合、窒素原子は炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基、水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖などを有する］。各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物がタンパク質と結合し、呈色変化または蛍光強度の向上を観察し得る限り、特に上記のものに限定されない。
【００２５】
上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、例えば下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物が挙げられる。
【００２６】
【化４】
【００２７】
本発明の化合物には、上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表わされる化合物の塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩、アンモニウム塩など）を含む。
【００２８】
本発明の化合物は、図１に示すようにタンパク質の不存在下（遊離状態）では顕著な蛍光を生じない。しかしこれをタンパク質に作用させると、相互作用によりタンパク質と複合体を形成し、当該化合物がタンパク質の疎水場に入ることによって、当該化合物の蛍光量子収率が増加し得、それによって蛍光を生じる。
【００２９】
本明細書において、「タンパク質」には、ペプチド、タンパク質複合体（例えば、糖タンパク質、タンパク質−核酸複合体、標識されたタンパク質など）を含み、また天然および非天然（組換えタンパク質など）のものも含む。
【００３０】
また、本明細書において、「蛍光」とは、ある分子に特定の波長の光（励起光）を照射した際に該分子から発せられる照射光とは異なる波長の光を意味する。
【００３１】
さらに、本明細書において、「相互作用」とは、本発明の化合物とタンパク質との間に何らかの物理的および／または化学的作用が生じている状態を意味し、例えば、タンパク質が、疎水性相互作用、電荷移動相互作用などにより互いに結合している状態がこれに含まれる。
【００３２】
本発明の化合物はまた、タンパク質の不存在下（遊離状態）における呈色とタンパク質と複合体を形成している状態における呈色とに変化を生じ得る。これは当該化合物がタンパク質の疎水場に入ることによって、光の吸収波長が長波長側に移動することによって、例えば薄い青色から濃い青色に色調が変化し得る。
【００３３】
上記特徴により、本発明の化合物は特に、タンパク質の分析用試薬として用いることができる。
【００３４】
本明細書において、タンパク質の「分析」とは、タンパク質を定性的に検出すること、すなわちタンパク質の存在の有無を確認すること、タンパク質の分子量を測定すること、タンパク質の分布を決定すること、定量的に測定することなどを含む。
【００３５】
本発明の化合物をタンパク質分析用試薬として用いるには、試料中のタンパク質と本発明の化合物とを接触させ、タンパク質との相互作用により当該化合物から生じる蛍光を検出および／または測定することによって行う。あるいはタンパク質との相互作用により当該化合物の呈色変化を検出することによって行う。
【００３６】
分析対象となるタンパク質は、特に限定されない。本発明の化合物は、様々なタンパク質の疎水場に入ることによって、疎水性相互作用による非共有結合的な複合体を形成し、それによって、当該化合物は蛍光を生じたり、または当該化合物の呈色変化を生じたりすることができる。
【００３７】
分析対象となるタンパク質を含む試料は、分析対象となるタンパク質を含む限り、液体または固体のいずれの形状を有していても良い。このような試料としては、体液（血液、リンパ液、汗、涙、母乳、唾液、胃液、腸液、精液、羊水、膣液、鼻水、糞尿など）、細胞、組織およびこれらの破砕物、タンパク質を電気泳動したゲル（ポリアクリルアミド、アガロースゲルなど）、タンパク質を移した膜（セルロールアセテート膜、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
タンパク質分析用試薬として使用される本発明の化合物は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、アルコール（炭素数１〜３）、ＤＭＳＯなど適当な溶媒中に溶解または懸濁して用いることができる。また、本発明の化合物は、固相に固定化されていても良い。本発明の化合物を固定化するための固相は、その上でタンパク質との相互作用により生じる蛍光または呈色変化の検出および／または測定が行えるものであれば特に限定されることなく、任意のものを選択することができる。このような固相の材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）が挙げられる。固相の形状および材質は特に限定されるものではない。
【００３９】
タンパク質を含む試料と本発明の化合物との接触は、タンパク質を含む試料の種類や量、および本発明の化合物の形態や量などに応じて、適宜決定することができる。例えば、試料に含まれるタンパク質の量が、およそ０〜１０００μｇである場合には、およそ５〜５００μＭ、好ましくは５〜１００μＭの本発明の化合物を、２０〜４０℃、好ましくは室温、さらに好ましくは２５℃にて、１〜３０分間、好ましくは１〜１０分間、接触させることによって行うことができる。
【００４０】
試料中に含まれるタンパク質との相互作用により本発明の化合物から生じる蛍光の検出および／または測定は、市販の通常用いられる機器を使用して行うことができる。例えば、用いることができる機器としては、マイクロプレートリーダー、蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、感光性フィルムなどが挙げられる。また、試料中に含まれるタンパク質との相互作用により生じる本発明の化合物の呈色変化は、目視観察や市販の通常用いられる機器（分光光度計、プレートリーダーなど）を使用して行うことができる。
【００４１】
本発明の化合物を用いることによる、試料中に含まれるタンパク質の検出感度は、タンパク質を含む試料の種類や量、および本発明の化合物の形態や量などに応じて変化し得るが、水溶液中のタンパク質であれば、２０ｎｇ／ｍＬ、ゲル中のタンパク質であれば０．０２ｎｇの検出限界を有し、従来のタンパク質の検出に用いられている分析用試薬と比較して、その検出感度は非常に高い。そのため、本発明の化合物をタンパク質分析用試薬として用いることによって、微量の試料のみしか必要とせず、また蛍光または呈色変化の検出は一般的な機器により実施可能である。
【００４２】
また、本発明の化合物は、電気泳動により分離されたタンパク質の分析に利用することができる。タンパク質を電気泳動したゲルを、本発明の化合物を含む水溶液中に浸漬することによって、ゲル中のタンパク質と本発明の化合物とを接触させることができる。あるいは、電気泳動後に本発明の化合物を含む水溶液中にタンパク質を電気泳動したゲルを浸漬する代わりに、電気泳動用の緩衝液または電気泳動用ゲル中に本発明の化合物を電気泳動前に添加または混合することにより、電気泳動中に本発明の化合物とタンパク質との相互作用を同時に行うことによっても実施することができる。また、試料中のタンパク質を本発明の化合物に接触させ、その後、電気泳動を行うことによって実施することもできる。
【００４３】
さらに、本発明の化合物は、特定のタンパク質に対して一定の割合で結合するために、既知濃度のタンパク質が含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作製することによって、試料中に含まれるタンパク質の量を簡便に定量することができる。
【００４４】
またさらに、本発明の化合物は、抗体などと異なり、様々なタンパク質と結合することができ、そのため試料中に含まれる複数種のタンパク質を網羅的に分析することができる。
【００４５】
上記のとおり、本発明の化合物をタンパク質分析用試薬として用いることによって、非常に効率のよいタンパク質の検出および／または測定を実現することができる。
【実施例】
【００４６】
実施例１：化合物の合成
タンパク質分析用試薬として用いるため化合物の合成を行った。当該化合物の合成は、図２に示す合成スキームに従って行った。以下に、各合成反応について詳述する。
（１） １−エチル−２−（２−（メチル（フェニル）アミノ）ビニル）キノリニウムヨージドの合成
【００４７】
【化５】
【００４８】
Ａｒ雰囲気下、１００ｍＬ三口フラスコにキナルジンエチオジド １．０ｇ、Ｎ−メチルアニリン ０．７ｇ、オルトギ酸トリメチル １．０ｇ、２−メトキシエタノール ２０ｍＬを加え、１２時間還流した。溶媒を減圧留去後、残渣を酢酸エチルで洗浄した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；クロロホルム：メタノール＝２：１ｖ／ｖ）で精製し、緑色固体として表題の化合物が得られた（収率：８７％）。
1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz, r.t., TMS, δ/ppm) 1.58 (t, 3H), 3.44 (s, 3H), 4.81 (q, 2H), 6.10 (d, 1H), 6.60 (d, 2H), 6.77 (t, 1H), 6.78 (d, 1H), 7.23 (t, 2H), 7.29 (d, 1H), 8.10 (t, 1H), 8.23 (t, 1H), 8.42 (d, 1H), 8.61 (d, 1H), 8.98 (d, 1H).
【００４９】
（２） ２−（２−（（１Ｅ，３Ｅ）−３−（１−エチルキノリン−２（１Ｈ）−イリデン）プロプ−１−エニル）−６−メチル−４Ｈ−ピラン−４−イリデン）マロノニトリルの合成
【００５０】
【化６】
【００５１】
１００ｍＬ三口フラスコに、１−エチル−２−（２−（メチル（フェニル）アミノ）ビニル）キノリニウムヨージド ０．５ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、４−（ジシアノメチレン）−２，６−ジメチル４Ｈ−ピラン ０．２ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ピリジン ２０ｍＬ、トリエチルアミン５ｍＬを加え、Ａｒ気流下、１２時間還流した。溶媒を減圧留去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１０：１ｖ／ｖ）で精製し、表題の化合物が得られた（収率：８１％）。
1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz, r.t., TMS, δ/ppm) 1.31 (t, 3H), 2.24 (s, 3H), 4.56 (q, 2H), 5.27 (s, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.91 (d, 1H), 6.48 〜 6.55 (m, 3H), 6.72 (t, 1H), 7.11 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 7.91 (d, 1H), 8.71 (d, 1H).
【００５２】
実施例２：合成した化合物の特性評価（吸収スペクトル測定）
実施例１で合成した化合物の吸収スペクトル測定を行った。吸収スペクトル測定に際しては、下記条件にて吸光光度計を用いて行った。
濃度：［化合物］＝５μＭ
［ＢＳＡ］＝０，５０μｇ／ｍＬ
溶媒：ＨＥＰＥＳ，２０．０ｍＭ（ｐＨ７．２）
測定温度：２５℃
【００５３】
ＢＳＡの存在下（５０μｇ／ｍＬ）または非存在下における化合物の吸収スペクトルを図３に示す。
ＢＳＡの存在下において、吸光度が増加した。
【００５４】
実施例３：合成した化合物の特性評価（励起スペクトルおよび蛍光スペクトル測定）
実施例１で合成した化合物の励起スペクトルおよび蛍光スペクトル測定を行った。測定に際しては、下記条件にて蛍光光度計を用いて行った。
濃度：［化合物］＝５μＭ
［ＢＳＡ］＝０〜５０μｇ／ｍＬ
溶媒：ＨＥＰＥＳ，２０．０ｍＭ（ｐＨ７．２）
測定温度：２５℃
励起波長：５８３ｎｍ
励起スペクトルにおける検出波長：６６０ｎｍ
【００５５】
ＢＳＡの存在下（５０μｇ／ｍＬ）における化合物の励起スペクトルと蛍光スペクトルを図４に示す。極大励起波長は５８３ｎｍ、極大蛍光波長は６６０ｎｍとなり、７７ｎｍのストークスシフトが観察された。
【００５６】
次に励起波長を５８３ｎｍとし、種々の濃度（０、０．７、１．５、３．１、６．２、１２．５、２５．０、５０．０μｇ／ｍＬ）のＢＳＡを添加した時の化合物の蛍光スペクトル変化を測定した。結果を図５に示す。
【００５７】
添加したＢＳＡ濃度の増加に伴い、蛍光強度の増加が観察された。ＢＳＡを５０μｇ／ｍＬ添加した時の蛍光強度は、化合物単独の蛍光強度と比較して、約５０００倍増加した。
【００５８】
化合物にＢＳＡを添加した時の６６０ｎｍにおける蛍光強度をＢＳＡ濃度に対してプロットしたところ、図６に示したように、良好な直線関係が得られた。また検出限界は２０ｎｇ／ｍＬであり、これまでに開発した分析試薬よりも約５倍感度が良いことが分かった。
【００５９】
実施例４：合成した化合物の特性評価（電気泳動実験）
実施例１で合成した化合物の電気泳動実験を行った。電気泳動実験は下記条件にて行った。
染色液；実施例１で合成した化合物５０ｍｇをＤＭＳＯ ５００μＬに溶解し、これを１００μＬとり、メタノール：水＝１：１ｖ／ｖの混合溶媒を加えて５０ｍＬとし、染色液を調製した。
固定化液と洗浄液；水：メタノール：酢酸＝８７：１０：３ｖ／ｖ
タンパク質サンプル：市販の分子量マーカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｅｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ ＩＶ；メルク社製）を使用した。このマーカーには、オボトランスフェリン（７８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、カルボアンヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）、およびシトクロムｃ（１２ｋＤａ）が質量換算で等量ずつ含まれる。
電気泳動装置：ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌキット（ディー・アール・シー株式会社）
検出装置：Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥヘルスケア社）
【００６０】
電気泳動終了後、ゲルを取り出し、固定化液中で３０分間洗浄した。その後、染色液中で３０分間、ゲルを浸した後、洗浄液中で３０分間洗浄した。
【００６１】
結果を図７に示す。電気泳動によって泳動されたゲル中のタンパク質は、染色液中の化合物と複合体を形成することによって、図７に示したような、明瞭な蛍光のバンドを示した。検出限界は、０．０２ｎｇであった。
【００６２】
また、下記の構造を有する既存のタンパク質分析用試薬（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２７，１７７９９ （２００５））との比較を行った。
【００６３】
【化７】
【００６４】
結果を以下の表１および表２に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
既存のタンパク質分析用試薬の検出限界は３０ｎｇであり、実施例１で合成した化合物の検出限界は０．０２ｎｇであり、既存のタンパク質分析用試薬の検出感度の約１５００倍であることが明らかとなった。
【００６８】
実施例５：合成した化合物の特性評価（２次元電気泳動実験）
実施例１で合成した化合物の２次元電気泳動実験を行った。電気泳動実験は下記条件にて行った。
染色液；実施例１で合成した化合物５０ｍｇをＤＭＳＯ ５００μＬに溶解し、これを１００μＬとり、メタノール：水＝１：１ｖ／ｖの混合溶媒を加えて５０ｍＬとし、染色液を調製した。
固定化液と洗浄液；水：メタノール：酢酸＝８７：１０：３ｖ／ｖ
タンパク質サンプル：マウス肝臓ライセート （２０μｇ）
電気泳動装置：ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌキット（ディー・アール・シー株式会社）
検出装置：Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥヘルスケア社）
【００６９】
電気泳動終了後、ゲルを取り出し、固定化液中で３０分間洗浄した。その後、染色液中で３０分間、ゲルを浸した後、洗浄液中で３０分間洗浄した。
【００７０】
結果を図８に示す。電気泳動によって泳動されたゲル中の様々なタンパク質は、染色液中の化合物と複合体を形成することによって、図８に示したような、明瞭な蛍光のスポットを示した。
【００７１】
以上の結果から、本発明の化合物は、様々なタンパク質と複合体を形成し、蛍光を発することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、タンパク質の分析のための簡便、迅速かつ高感度な手段を実現することができる。本発明は、生化学、医療、分析化学など様々な分野において、ペプチドまたはタンパク質の高感度、網羅的かつハイスループットな分析手段として利用されることが大いに期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物あるいはその塩。
【化１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、
Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基であり、ここでＲ７が３級アミノ基である場合、窒素原子は炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基、水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖などを有する。］
【請求項２】
下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を含む、タンパク質分析用試薬。
【請求項４】
請求項３に記載のタンパク質分析用試薬と試料中のタンパク質と接触させ、該タンパク質分析用試薬から生じる蛍光を検出し、それによってタンパク質を定性的または定量的に分析することを含む、タンパク質の分析方法。
【請求項５】
蛍光光度法および吸光光度法を用いて、試料中のタンパク質を定性的または定量的に分析する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
電気泳動により、試料中のタンパク質を分離することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の化合物の、タンパク質分析用試薬としての使用。
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物あるいはその塩。
【化１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ互いに独立に、水素原子；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基；水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖であり、
Ｒ７は酸素原子、硫黄原子、または、２級もしくは３級アミノ基であり、ここでＲ７が３級アミノ基である場合、窒素原子は炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のアルキル基；炭素数１から１０の直鎖型または分枝型のエーテル；フェニル基；フェニル基の一部をアミノ基、ハロゲンまたはニトロ基に置換したフェニル基；アミノ基；シアノ基；ニトロ基；カルボン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；スルホン酸またはその塩、エステルもしくはアミド；チオール基、水酸基もしくはその塩；ケトン；ハロゲン；または糖などを有する。］
【請求項２】
下記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を含む、タンパク質分析用試薬。
【請求項４】
請求項３に記載のタンパク質分析用試薬と試料中のタンパク質と接触させ、該タンパク質分析用試薬から生じる蛍光を検出し、それによってタンパク質を定性的または定量的に分析することを含む、タンパク質の分析方法。
【請求項５】
蛍光光度法および吸光光度法を用いて、試料中のタンパク質を定性的または定量的に分析する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
電気泳動により、試料中のタンパク質を分離することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の化合物の、タンパク質分析用試薬としての使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−３１０８２（Ｐ２０１２−３１０８２Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７０８０５（Ｐ２０１０−１７０８０５）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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