ナチュラルキラーＴ細胞およびその取得方法
【課題】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）におけるＣＸＣＬ１６の関与の検討を行い、新たにＮＡＳＨの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することである。
【解決手段】
ＣＸＣＬ１６欠損マウスを用いたＮＡＳＨモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討し、さらに、ＣＸＣＬ１６と肝ＮＫＴ細胞の関係に着目し、ＮＡＳＨモデルマウスの肝ＮＫＴ細胞の動態・機能解析を行い、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するナチュラルキラーＴ細胞を見出した。
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）におけるＣＸＣＬ１６の関与の検討を行い、新たにＮＡＳＨの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することである。
【解決手段】
ＣＸＣＬ１６欠損マウスを用いたＮＡＳＨモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討し、さらに、ＣＸＣＬ１６と肝ＮＫＴ細胞の関係に着目し、ＮＡＳＨモデルマウスの肝ＮＫＴ細胞の動態・機能解析を行い、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するナチュラルキラーＴ細胞を見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するナチュラルキラーＴ細胞およびその取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、非アルコール性脂肪性肝疾患(non-alcoholic fatty liver disease:ＮＡＦＬＤ)および非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis:ＮＡＳＨ)は、メタボリックシンドローム罹患人口の増大に加え、その疾患の重篤性から臨床的・社会的な問題として注目を集めている。ＮＡＳＨに関しては、その疾患概念が病理診断所見から生まれた概念であるため、病理所見の変化については臨床一般にコンセンサスが得られているものの、分子病態機構についての詳細は未だ明らかになっておらず、効果的な治療法や診断法は未だ確立されていないのが現状である。
【０００３】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とＴ細胞の両方の特性を有した、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞に次ぐ第４のリンパ球である(非特許文献１）。ＮＫＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（major histo- compatibility；ＭＨＣ）クラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識することが示され、生体内においてもＣＤ１ｄにより胸腺内ポジティブセレクションされていると考えられている。胸腺内分化したＮＫＴ細胞は成熟に伴って末梢に遊走し、脾臓、骨髄そして肝臓に比較的多く存在している。特に、肝臓においては肝臓に存在する単核球細胞のうち１０％〜２０％がＮＫＴ細胞として存在しており、肝免疫系を制御している。
【０００４】
ケモカインは、免疫細胞の遊走能力に特化したサイトカインの一群である。現在までにヒトでは約５０種類のケモカインとそれに複数対応する受容体が同定されており、生体内における免疫細胞の恒常的な局在・移動を厳密に制御している。また、この厳密な制御機構の破綻が多くの免疫性の疾患の発症、および進展に関与しており、その疾患における重要性が認知されている。
ケモカインＣＸＣＬ１６は、比較的最近同定されたケモカインの１つであり、樹状細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に加え、肝臓の類洞内皮細胞に発現していることが報告されている（非特許文献２）。ＣＸＣＬ１６は大変ユニークな機能性分子であり、一般的なケモカインと同様に可溶型ケモカインとして細胞遊走活性を有することに加えて、細胞の膜結合型ケモカインとしても発現し、細胞接着分子、抗原提示の際の共刺激分子、そしてスカベンジャー受容体としての機能することも報告（非特許文献３）されており、多機能性ケモカインとして知られている。
【０００５】
肝臓において、類洞内皮細胞は恒常的にＣＸＣＬ１６を発現し、肝細胞では炎症時にＣＸＣＬ１６の発現が誘導される。特に、類洞内皮細胞に発現しているＣＸＣＬ１６は肝のＮＫＴ細胞を類洞内にトラップし、類洞内の免疫学的監視機構を行うために必須の分子であるとされている（非特許文献４）。
通常、ＮＫＴ細胞はα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）刺激に伴って迅速かつ大量のサイトカインを産生することから、生体免疫の制御細胞として機能すると考えられているが、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、肝臓のＮＫＴ細胞数の減少に加え、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＴｈ１応答性が減弱している。また、ＣＸＣＬ１６の受容体ＣＸＣＲ６欠損マウスでも、同様に肝臓、肺におけるＮＫＴ細胞数の減少、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４産生能の低下が認められており、ＮＫＴ細胞の質および量の減弱が報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat. Rev. Immunol., 7,505-518 (2007)
【非特許文献２】Nat. Immunol., 1(4),298-304 (2000)
【非特許文献３】J. Immunol., 179,8172-8179 (2007)
【非特許文献４】PLoS Biology, vol.3 (4),650-661 (2005)
【非特許文献５】J. Immunol., 181, 81-91(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、これまでケモカインによる種々疾病制御機構の解明を行ってきた。ケモカインは免疫細胞の動態を制御する一連のサイトカイン群であるため、特に炎症性疾患との関連性が強い。中でもＣＸＣＬ１６は、肝臓のｉＮＫＴ細胞の動態・機能制御を行うことで、肝免疫系の恒常性維持や肝炎症性疾患に関わっているが、ＣＸＣＬ１６と肝慢性炎症疾患であるＮＡＳＨとの直接的な関連性は全く報告がない。
本発明の課題は、ＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討を行い、新たにＮＡＳＨの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＣＸＣＬ１６欠損マウスを用いたＮＡＳＨモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討した。さらに、ＣＸＣＬ１６と肝ｉＮＫＴ細胞の関係に着目し、ＮＡＳＨモデルマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の動態・機能解析を行い、病態に寄与する可能性を検証した。加えて、解析したｉＮＫＴ細胞を介した病態形成機序を検証するために養子移植実験およびエキソビボ(ex vivo)での解析を行った結果、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。より具体的には、本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。
【００１０】
本発明のナチュラルキラーＴ細胞とは、Ｔ細胞受容体（T
cell receptor：ＴＣＲ）により、ＭＨＣクラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識し、さらに、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。
【００１１】
本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、例えば、以下の方法によって取得することができる。
（１）肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食などの脂肪肝を誘導する餌を摂食させる。
（２）病態モデル動物から肝臓を摘出する。
（３）摘出した肝臓から肝単核球を単離する。
（４）単離した肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離する。
【００１２】
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨの初期病態（例えば、肝細胞への中性脂肪蓄積など）を誘導することができる。具体的には、例えば、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞を養子移植することが挙げられる。この場合、例えば、レシピエントとしてＪα１８ノックアウトマウスなどのＮＫＴ細胞を欠損させたマウスを用いればよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨにおける肝細胞への中性脂肪蓄積などの初期病態を誘導することができる。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として、肝臓における異常免疫応答を基盤とする慢性炎症の研究に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣＤＡＡ食摂食のＣＸＣＬ１６ＫＯマウスにおける２週間後肝臓肉眼所見図（Ａ）および肝肥大を示す図（Ｂ）である。
【図２】（Ａ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝臓の病理組織図である。（Ｂ）脂質構成成分を示す図である。（Ｃ）ＣＤＡＡ食餌ＷＴマウスおよびＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスのＮＡＳ値を示す図である。
【図３】ＷＴマウス群とＣＸＣＬ１６ＫＯマウス群での肝単核球（mononuclear cells；ＭＮＣｓ）中の肝ＮＫＴ細胞比率を、フローサイトメーターを用いて解析した結果を示す図である。
【図４】α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果を示す図である。
【図５】α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＮＫＴ細胞自身のサイトカイン産生プロファイルを細胞内サイトカイン染色により評価した結果を示す図である。
【図６】ＣＤＡＡ食摂食のＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を養子移植した際の、レシピエントマウスの肝単核球におけるＮＫＴ細胞の存在をフローサイトメーターにより確認した図である。
【図７】ＣＤＡＡ食摂食のＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を単離し、同系 （ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）のＮＫＴ細胞欠損（Ｊα１８ＫＯ）マウスに養子移植したときの肝臓の病理組織図とその肥大の結果を示す図である。
【図８】図７の肝臓に含まれる脂質を抽出して、各脂質の肝臓含量を定量した結果を示す図である。
【図９】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる図７の肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価結果の示す図である。
【図１０】（Ａ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞をレシピエントに移入後、図７の肝単核球の共通活性化マーカーであるＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した図である。（Ｂ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞の移入による図７の肝臓中のｋｕｐｆｆｅｒ細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した図である。
【図１１】（Ａ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られた培養上清（ＣＭ）によるマウス初代肝細胞の脂質蓄積を示す図である。（Ｂ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られた培養上清（ＣＭ）には、非常に高濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生が確認されたことを示す図である。
【図１２】図１１（Ａ）の脂肪蓄積が抑制されることを、中和抗体を用いたサイトカイン機能阻害実験により検証した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞の取得に用いられる病態モデル動物として、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしないマウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられる。好ましいものとして、ケモカインＣＸＣＬ１６の発現が健常マウスの1/１００以下に低下しているマウス、ＣＸＣＬ１６欠損マウス、グルタミン酸ナトリウム誘発マウス（ＭＳＧマウス）などが挙げられる。
【００１６】
コリン欠乏食としては、例えば、コリン欠乏・Ｌ−アミノ酸規定食（Choline deficient
L-amino acid defined diet：ＣＤＡＡ)、メチオニン・コリン欠乏食（Methionine- and Choline
deficien diet：ＭＣＤ)などが挙げられるが、好ましいものとして、ＣＤＡＡが挙げられる。
コリン欠乏食を摂取させる期間としては、例えば、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、１週間以上、好ましくは２週間以上である。
【００１７】
肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離するには、例えば、ＣＤ１ｄとβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の複合体を蛍光色素のアロフイコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスチン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジンにより４量体化した試薬（例えば、Ｃｄ１ｄ
Ｔｅｔｒａｍｅｒなど）で肝単核球を標識した後、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）などを用いて行えばよい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１
＜コリン欠乏食食餌誘導性ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルの作製＞
（１）ＣＸＣＬ１６欠損マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスバックグラウンドのＣＸＣＬ１６（ＳＲ−ＰＳＯＸ）欠損マウス（ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス）は、Ｊ. Immunol., 179, 8172-8179(2007)に記載の方法に準じて作製した。すなわち、定法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン耐性株のうちＣＸＣＬ１６遺伝子欠損株をサザンブロット法にてスクリーニングすることで樹立した。
【００１９】
（２）動物飼育環境
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（wild
type:ＷＴマウス）およびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスは、富山大学和漢医薬学総合研究所病態生化学分野の動物飼育室にて飼育した。水および固形飼料は自由摂食とした。本実験は、国立大学法人富山大学動物実験取扱規則に基づき、動物実験委員会の承認後、動物倫理に十分配慮し行った。
【００２０】
（３）コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウス
コリン欠乏食は、Choline
deficient L-amino acid defined diet (ＣＤＡＡ：Ｄｙｅｔｓ社製) を用い、４〜５週齢、雄性のＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに２週間自由摂食させた。また、対照群として通常飼育食（Labo MR Stock, 日本農産工業製）を同様にＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの両マウスに摂食させた。
摂食開始から２週間後、マウスを犠牲死させ、血液、肝臓、脾臓、精巣上体部脂肪組織を採取した。血液は腹部下大静脈から採血をおこない、常温で1時間、４℃で一晩静置し、卓上遠心機にて４℃、３０００回転、２０分間遠心分離後、上清を血清サンプルとした。血清サンプルは解析に用いるまでディープフリーザー（−８０℃）内で保存した。肝臓は、一部ＲＴ−ＰＣＲ（後述）用サンプルとしてＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＲＮＡ ｌａｔｅｒ：キアゲン社）に浸けて解析に用いるまで−２０℃で保存した。また病理組織及び免疫染色用に１０ ％中性緩衝ホルマリン中にて４℃で保存した。精巣上体部脂肪組織は液体窒素にて瞬間凍結後、ディープフリーザーにて保管した。
【００２１】
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではわずか２週間のＣＤＡＡ食摂食により、脂肪肝に特徴的な強い白色性の肝臓肉眼所見（図１Ａ）および肝肥大を認めた（図１Ｂ）。
【００２２】
（４）肝臓の病理組織学的所見とその評価
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの病理組織学的評価は、ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍに基づいてＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）を算出した（Hepatology, 41, 1313-1321(2005))。ＮＡＳ≧５をＮＡＳＨ、ＮＡＳ＞３をＮＡＳＨ進行性脂肪肝と判断した。
このスコアリングシステムは、脂肪沈着を０〜３、肝小葉の細胞浸潤を０〜３、そして肝細胞のｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性の程度を０〜２として段階評価し、その合計値をＮＡＳ値として、ＮＡＳ値＜３を除外診断、ＮＡＳ値≧５をＮＡＳＨと診断するものである。
【００２３】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは肝臓への著しい大滴性脂肪沈着を認め（図２Ａ）、さらに脂質構成成分として中性脂肪が有意に増加している（図２Ｂ）。
【００２４】
ＣＤＡＡ食餌ＷＴではＮＡＳ値が３を越える個体が１匹も該当しなかったのに対し（平均ＮＡＳ値：２.４）、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＮＡＳ値が５以上の個体が全体の半数存在した（図２Ｃ）。
【００２５】
（５）肝臓組織中中性脂肪の定量
肝臓組織中中性脂肪の抽出はＦｏｌｃｈらの方法（J. Biol. Chem., 497-509(1987))を一部改変して行った。すなわち、１００ｍｇ〜２００ｍｇ肝臓に４ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を加え、ガラスホモジナイザーでホモジナイズした後、ポリプロピレン製ファルコンチューブに移して、５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を１ｍＬ添加し、１分間ボルテックスした。室温、１５００×ｇ、１０分間遠心分離し、パスツールピペットを用いて下層のクロロホルム層を別のファルコンチューブに移した。さらに収量を増やすため、上層に１容のクロロホルムを加えて同様にボルッテクス、遠心分離した後、下層を先の下層と合わせた。合わせたクロロホルム層のうち、１００μＬに２０μＬのイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）を加え、ドラフト内で自然乾燥させた。乾燥したものをイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）に溶かし、トリグリセライドＥ−テストワコー （和光純薬工業製）を用い、単位肝重量当たりの中性脂肪量を算出した（図２Ｂ）。
【００２６】
実施例２
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスにおける肝ｉＮＫＴ細胞＞
（１）マウス肝単核球の単離
通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食したＷＴおよびＣＸＣＬ１６欠損マウスの肝臓を温ハンクス平衡塩類液（Hanks' Balanced Salt Solutions：ＨＢＳＳ）にて還流後、摘出細断し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗いこみながらナイロンメッシュ 上でホモジナイズして細胞懸濁液を得た。４℃、２０００回転、１０分間の条件下で細胞懸濁液を遠心分離した後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して、３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア製）上に重層し、室温、２０００回転、３０分間の条件下、比重分離して単核球分画を得た。さらに、低張処理により赤血球を除去した。その後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＰＲＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁した。
【００２７】
（２）ｉＮＫＴ細胞の単離
磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）用いて肝単核球からｉＮＫＴ細胞を単離した。ＭＡＣＳには Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のｍｉｎｉ ＭＡＣＳ ｋｉｔ（Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズ、ＭＳカラム、ＭＡＣＳセパレーター）を用いた。すなわち、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（ＭＢＬ社製）によりｉＮＫＴ細胞をラベルした後、ｉＮＫＴ細胞を８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを脱気したもの）に懸濁し、Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズを２０μＬ添加した。氷上にて１５分間インキュベートした後、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。ＭＡＣＳ ＭＳカラムをＭＡＣＳ緩衝液にてリンスした後、Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳセパレーターを用いて調製した細胞懸濁液からｉＮＫＴ細胞をポジティブセレクションした。また純度を高めるために、２回ＭＳカラムに細胞を通し、純度が８０％以上のものを実験及び解析に用いた。さらに細胞洗浄による細胞の損失を抑えるため、一部セルローション（日本全薬工業製）を用いて細胞の洗浄を行った。
【００２８】
（３）ｉＮＫＴ細胞ポピュレーションの解析
肝単核球（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、卓上遠心機にて４℃、２０００回転、５分間遠心し、洗浄した。沈殿した細胞を５０μＬの２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ（ＦＣＭ緩衝液）に再懸濁した後、ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン２.４Ｇ２）０.５ｍｇ／ｍＬを１μＬ添加し、氷上にて１０分間インキュベートした。ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体によるＦｃ受容体のブロッキングの後、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥを１０ｍＬ添加し、室温にて３０分間インキュベートしてｉＮＫＴ細胞を蛍光標識した。続いて、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体を加え、氷上にて３０分間インキュベートした。ＦＣＭ緩衝液を１ｍＬ加え、４℃、２０００回転、５分間遠心して洗浄し、３００μＬのＦＣＭ緩衝液に懸濁した後、フローサイトメーターを用いて細胞表面上の蛍光強度を解析した。
【００２９】
ＷＴではＣＤＡＡ食摂食による肝ｉＮＫＴ細胞比率の変化は認められなかったのに対し、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは通常食摂食時に比べて、ＣＤＡＡ食餌により肝ｉＮＫＴ細胞が２倍近く増加している（図３Ａ）。
【００３０】
（４）ｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析
ｉＮＫＴ細胞ポピュレーション解析と同様に、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥにてｉＮＫＴ細胞を蛍光標識し、その後ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ４モノクローナルとＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした。続いて、磁気細胞分離法によりｉＮＫＴ細胞を単離し、フローサイトメーターを用いてｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析を行った。
【００３１】
ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスともＣＤＡＡ食摂食によりｉＮＫＴ細胞数がベースラインよりも増加していたが、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の増加率の方が顕著であった（図３Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＷＴマウスとＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞集団は構成しているｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションが異なっていた（図３Ｃ）。
【００３２】
実施例３
＜コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝ｉＮＫＴ細胞の機能解析＞
（１）in vitroにおける肝単核球培養とβ-ガラクトシルセラミド（β-GalCer）刺激
実施例２（１）の方法に従い、肝単核球を単離した後、細胞を１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。
ｉＮＫＴ細胞の特異的なリガンドであるβ−ガラクトシルセラミド（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：β−ＧａｌＣｅｒ）は、ジメチルスルスルホキシドにて１ ｍｇ／ｍＬに調製し、肝単核球刺激の際には終濃度１００ｎｇ／ｍＬとして用いた。
【００３３】
（２）酵素免疫測定法（Enzymed-linked
Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン産生量
肝単核球の培養上清、およびマウスの血清サンプル中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（ベイバイオサイエンス社製）を用いて定量した。
【００３４】
（３）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）刺激
０.５％ポリソルベイト２０添加生理食塩水によりＤＭＳＯ溶解β−ＧａｌＣｅｒを希釈し、２μｇ／２００μＬとして、各ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに経尾静脈投与した。投与から１．５時間後に各マウスを犠牲死させて肝単核球を採取し、ｉＮＫＴ細胞の細胞内サイトカイン染色を行った。
【００３５】
β−ＧａｌＣｅｒ刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果、ＷＴマウスではＣＤＡＡ食の摂食によっていずれのサイトカインにも有意な産生能の変化は見られなかった。一方、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ食餌により、いずれのサイトカインにおいてもベースラインよりもサイトカイン産生能が上昇していた。
【００３６】
（４）ｉＮＫＴ細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生プロファイル変化
細胞固定／細胞膜浸透化キット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、細胞内部のサイトカインの保持、細胞固定、細胞膜透過処理を行った。
すなわち、単離した肝単核球を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で２４ウェルプレート（コースター）に播種し、ゴルジ体からの小胞輸送阻害剤であるモネンシン存在下で、３時間培養して細胞内にサイトカインを蓄積させ、その後、細胞を回収し、前述のようにＦＣＭ緩衝液で洗浄した後、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識ラット抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４−５）およびＣＤ１ｄ ＴｅｔｒａｍｅｒによりｉＮＫＴ細胞の細胞表面抗原を蛍光標識した。続いて、キットのプロトコールに従って細胞固定、細胞膜透過処理を行い、細胞内の各種サイトカインを蛍光標識抗サイトカイン抗体にて染色した後、ＣＤ１ｄ ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性細胞をゲートし、フローサイトメーターにより解析を行った。なお、染色用抗サイトカイン抗体として、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（クローン：ＸＭＧ１.２）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０.１）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＦＩＴＣ標識抗マウス／ラットＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、また同位体対照としてＦＩＴＣ標識ラットＩｇＧ１κ抗体を用いた。
【００３７】
その結果、ＣＤＡＡ食摂食によりＷＴマウスのＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γ（１８.２％→２５.２％）、ＩＬ−４（３.７％→８.４％）の発現が亢進していた。
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ摂食によるＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞のサイトカイン産生亢進の程度がＩＦＮ−γ（９.６％→１７.９％）、ＩＬ−４（４.３％→１３.８％）共にＷＴよりも顕著であった（図５）。
【００３８】
実施例４
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスのＮＡＳＨ病態形成における機能変異ｉＮＫＴ細胞の寄与＞
（１）養子移植
通常食またはＣＤＡＡ食を摂食したＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウス（ドナー）の肝ｉＮＫＴ細胞をＭＡＣＳにより単離した。単離したｉＮＫＴ細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリパンブルー染色により生細胞数をカウントし、５.５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬ
ＰＢＳをｉＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス：レシピエント）に経尾静脈移入した。細胞移入から２週間後にマウスを犠牲死させ、血清、肝臓、精巣上体部脂肪組織を採取し、保存した。なお、肝臓へのｉＮＫＴ細胞生着の有無については、フローサイトメーターによりレシピエント肝単核球中のｉＮＫＴ細胞を検出することで確認した（図６）。
【００３９】
（２）肝臓の病理組織学的所見
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。また、ヘマトキシリンとスダンIVの対比染色により肝臓への脂肪沈着を評価した。
【００４０】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を養子移植したレシピエント肝では、他ドナーマウスから単離した肝ｉＮＫＴ細胞を移植した場合と比較しても、脂肪肝に特徴的な白色肝が明らかに認められた（図７Ａ上）。この時、各群のレシピエント肝重量比を算出すると、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の移植した場合、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスのｉＮＫＴ細胞を移植した場合より有意に高値を示し、ＣＤＡＡ食餌ＷＴ群の肝ｉＮＫＴ細胞を移植した場合より、高い傾向を示した（図７Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を移植したレシピエント肝では脂質蓄積が誘導された（図７Ａ下）。
【００４１】
（３）肝臓組織中脂質
肝臓組織中の中性脂肪、コレステロール、遊離コレステロール、リン脂質量はリポタンパク質の受託解析サービス（スカイライト・バイオテック社）により解析を行った。なお、解析にはホルマリン固定肝臓サンプルを用いた。
【００４２】
その結果、遊離コレステロール、総コレステロール、リン脂質はどのドナー由来の肝ｉＮＫＴ細胞を移植しても変化が認められないのに対し、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を移入した場合には、レシピエントマウスの肝臓に有意な中性脂肪の蓄積の誘導があった（図８）。
【００４３】
（４）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価
［ＲＮＡ抽出］
肝組織中ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。すなわち、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ中で保存した肝組織５０ｍｇを１．５ｍＬチューブ （ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ）にとり、６００μＬのＲＬＴ緩衝液（２−メルカプトエタノール添加（１％，ｖ／ｖ））を加えて氷上にてホモジナイズした。肝ホモジネートをキット付属のプロトコールにしたがってシリカゲルカラムに通し、ＲＮＡを溶出させた。得られたＲＮＡ濃度を吸光光度計にて測定し、各サンプル１ｎｇ／１０μＬに調製した。調製したＲＮＡサンプルは解析に用いるまで−３０℃で保存した。
［逆転写反応］
ＯＬＩＧＯ ＤＴプライマー（インビトロジェン）を用いてＭＲＮＡを増幅した後、逆転写反応はＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ II ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （インビトロジェン）を使用して行った。
［リアルタイムＰＣＲ］
逆転写反応によりｃＤＮＡを得た後、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）と Ｍｘ３０００ｐ（ストラタジーン社）および測定・解析ソフト ＭｘＰｒｏ（ストラタジーン社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。測定結果はすべてハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の発現量により比較Ｃｔ法にて補正した。
【００４４】
ＮＡＳＨ病態形成と関連の深い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βといった炎症性サイトカインの発現を指標に炎症状態を評価した。その結果、異常ｉＮＫＴ細胞を移入することで、レシピエントの肝臓でもＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの発現誘導が確認された（図９）。
【００４５】
（５）肝単核球の活性化状態解析
各レシピエントの肝単核球を単離し、ＲＰＥ標識抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６９モノクローナル抗体（クローンＨ１.２Ｆ３）で染色した後、ＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターで解析し、単核球活性化の指標とした。
【００４６】
ドナー由来ｉＮＫＴ細胞をレシピエントに移入後、肝単核球の共通活性化マーカーであるＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の機能異常ｉＮＫＴ細胞を移入した場合には、ＣＤ６９発現細胞の増加が認められた（図１０Ａ）。
【００４７】
ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のマーカーとしてＦ４／８０を用い、ＣＤ６９との二重染色によってｉＮＫＴ細胞の移入によるｋｕｐｆｆｅｒ細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の肝ｉＮＫＴ細胞移入によって、ＣＤ６９陽性ｋｕｐｐｅｒ細胞の割合が増加していた（図１０Ｂ）。
【００４８】
実施例５
＜機能変異ｉＮＫＴ細胞を起点とした肝細胞への脂肪蓄積機構＞
（１）肝ｉＮＫＴ細胞とその他肝単核球による共培養系
肝ｉＮＫＴ細胞は、それぞれ通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食させたＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝臓からＭＡＣＳを用いて単離した。また、ｉＮＫＴ細胞との共培養に用いた肝単核球はｉＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス）の肝臓より単離し、これにより他のｉＮＫＴ細胞による影響を排除した実験系を組み立てた。共培養系は、ｉＮＫＴ細胞：肝単核球＝２×１０４ｃｅｌｌｓ：８×１０４ｃｅｌｌｓを１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して９６ウェルプレートに播種し、３７℃、炭酸ガスインキュベーター内で７２時間培養した。
【００４９】
（２）マウス初代肝細胞培養
肝細胞を捲き込む前日に、９６ウェルプレートをマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でコーティングしておく。実際には、１ｍｇ／ｍＬマトリゲルをＰＢＳにより５０μｇ／ｍＬに希釈し、４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。続いて、クリーンベンチ内で一晩風乾し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１度洗浄した後に培養に用いた。
無処置ＷＴマウスまたはｉＮＫＴ細胞欠損マウスの肝臓をＥＧＴＡ添加ＨＢＳＳで還流後、肝臓を摘出し、１２５μｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（シグマ社）／ＨＢＳＳ溶液に浸けて細断して、３７℃温浴シェーカー中で１５分間インキュベートした。その後、肝組織をナイロンメッシュ（１００μｍ）に通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液を、４℃、５００回転、１分間遠心し、上清をアスピレーターにより除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を３回程洗浄し、上清が澄んできたら無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を１〜２回洗浄して肝細胞を得た。３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度に調整し、マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートに播種した。
【００５０】
（３）共培養系上清
（馴化培地）によるマウス初代肝細胞への脂肪蓄積誘導
肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１６時間培養し飢餓状態にしておく。肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、共培養系馴化培地にて肝細胞を２４ 時間培養した。
【００５１】
（４）肝細胞脂質染色
共培養系馴化培地下で２４時間培養した後、培養上清を除去して４％パラホルムアルデヒドで肝細胞を固定し、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて肝細胞中の脂質を染色した（Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏ染色）。
【００５２】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来の機能変異ｉＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られたＣＭでマウス初代肝細胞を培養することで非常に強力な脂質蓄積が誘導された（図１１Ａ）。
【００５３】
（５）共培養系におけるサイトカイン産生量
共培養系上清中に産生された液性因子として、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒｅａｄｙ Ｓｅｔ Ｇｏ！， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
【００５４】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞は肝単核球との共培養を行わずとも、それ単独でもＣＤＡＡ食餌ＷＴマウス、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞よりも高いＴＮＦ−α産生能を有していた（図１１Ｂ）。
【００５５】
（６）中和抗体によるサイトカイン機能阻害実験
Ｐｕｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ ＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはコントロールＩｇＧ（ラットＩｇＧ、Ｉｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ）を終濃度１μｇ／ｍＬとして、馴化培地を用いた初代肝細胞培養系に添加した。
【００５６】
その結果、機能変異ｉＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養ＣＭに抗ＩＦＮ−γ中和抗体、抗ＴＮＦ−α中和抗体をそれぞれ単独で添加させるだけで、共培養ＣＭによる脂質蓄積作用はほぼ完全に阻害された（図１２）。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のＴＮＦ−αの産生能を有することを特徴とするインバリンアントナチュラルキラーＴ細胞は、ＮＡＳＨにおける異常免疫応答を解明するためのツールとして有用である。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するナチュラルキラーＴ細胞およびその取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、非アルコール性脂肪性肝疾患(non-alcoholic fatty liver disease:ＮＡＦＬＤ)および非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis:ＮＡＳＨ)は、メタボリックシンドローム罹患人口の増大に加え、その疾患の重篤性から臨床的・社会的な問題として注目を集めている。ＮＡＳＨに関しては、その疾患概念が病理診断所見から生まれた概念であるため、病理所見の変化については臨床一般にコンセンサスが得られているものの、分子病態機構についての詳細は未だ明らかになっておらず、効果的な治療法や診断法は未だ確立されていないのが現状である。
【０００３】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とＴ細胞の両方の特性を有した、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞に次ぐ第４のリンパ球である(非特許文献１）。ＮＫＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（major histo- compatibility；ＭＨＣ）クラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識することが示され、生体内においてもＣＤ１ｄにより胸腺内ポジティブセレクションされていると考えられている。胸腺内分化したＮＫＴ細胞は成熟に伴って末梢に遊走し、脾臓、骨髄そして肝臓に比較的多く存在している。特に、肝臓においては肝臓に存在する単核球細胞のうち１０％〜２０％がＮＫＴ細胞として存在しており、肝免疫系を制御している。
【０００４】
ケモカインは、免疫細胞の遊走能力に特化したサイトカインの一群である。現在までにヒトでは約５０種類のケモカインとそれに複数対応する受容体が同定されており、生体内における免疫細胞の恒常的な局在・移動を厳密に制御している。また、この厳密な制御機構の破綻が多くの免疫性の疾患の発症、および進展に関与しており、その疾患における重要性が認知されている。
ケモカインＣＸＣＬ１６は、比較的最近同定されたケモカインの１つであり、樹状細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に加え、肝臓の類洞内皮細胞に発現していることが報告されている（非特許文献２）。ＣＸＣＬ１６は大変ユニークな機能性分子であり、一般的なケモカインと同様に可溶型ケモカインとして細胞遊走活性を有することに加えて、細胞の膜結合型ケモカインとしても発現し、細胞接着分子、抗原提示の際の共刺激分子、そしてスカベンジャー受容体としての機能することも報告（非特許文献３）されており、多機能性ケモカインとして知られている。
【０００５】
肝臓において、類洞内皮細胞は恒常的にＣＸＣＬ１６を発現し、肝細胞では炎症時にＣＸＣＬ１６の発現が誘導される。特に、類洞内皮細胞に発現しているＣＸＣＬ１６は肝のＮＫＴ細胞を類洞内にトラップし、類洞内の免疫学的監視機構を行うために必須の分子であるとされている（非特許文献４）。
通常、ＮＫＴ細胞はα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）刺激に伴って迅速かつ大量のサイトカインを産生することから、生体免疫の制御細胞として機能すると考えられているが、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、肝臓のＮＫＴ細胞数の減少に加え、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＴｈ１応答性が減弱している。また、ＣＸＣＬ１６の受容体ＣＸＣＲ６欠損マウスでも、同様に肝臓、肺におけるＮＫＴ細胞数の減少、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４産生能の低下が認められており、ＮＫＴ細胞の質および量の減弱が報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat. Rev. Immunol., 7,505-518 (2007)
【非特許文献２】Nat. Immunol., 1(4),298-304 (2000)
【非特許文献３】J. Immunol., 179,8172-8179 (2007)
【非特許文献４】PLoS Biology, vol.3 (4),650-661 (2005)
【非特許文献５】J. Immunol., 181, 81-91(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、これまでケモカインによる種々疾病制御機構の解明を行ってきた。ケモカインは免疫細胞の動態を制御する一連のサイトカイン群であるため、特に炎症性疾患との関連性が強い。中でもＣＸＣＬ１６は、肝臓のｉＮＫＴ細胞の動態・機能制御を行うことで、肝免疫系の恒常性維持や肝炎症性疾患に関わっているが、ＣＸＣＬ１６と肝慢性炎症疾患であるＮＡＳＨとの直接的な関連性は全く報告がない。
本発明の課題は、ＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討を行い、新たにＮＡＳＨの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＣＸＣＬ１６欠損マウスを用いたＮＡＳＨモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討した。さらに、ＣＸＣＬ１６と肝ｉＮＫＴ細胞の関係に着目し、ＮＡＳＨモデルマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の動態・機能解析を行い、病態に寄与する可能性を検証した。加えて、解析したｉＮＫＴ細胞を介した病態形成機序を検証するために養子移植実験およびエキソビボ(ex vivo)での解析を行った結果、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。より具体的には、本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。
【００１０】
本発明のナチュラルキラーＴ細胞とは、Ｔ細胞受容体（T
cell receptor：ＴＣＲ）により、ＭＨＣクラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識し、さらに、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。
【００１１】
本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、例えば、以下の方法によって取得することができる。
（１）肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食などの脂肪肝を誘導する餌を摂食させる。
（２）病態モデル動物から肝臓を摘出する。
（３）摘出した肝臓から肝単核球を単離する。
（４）単離した肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離する。
【００１２】
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨの初期病態（例えば、肝細胞への中性脂肪蓄積など）を誘導することができる。具体的には、例えば、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞を養子移植することが挙げられる。この場合、例えば、レシピエントとしてＪα１８ノックアウトマウスなどのＮＫＴ細胞を欠損させたマウスを用いればよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨにおける肝細胞への中性脂肪蓄積などの初期病態を誘導することができる。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として、肝臓における異常免疫応答を基盤とする慢性炎症の研究に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣＤＡＡ食摂食のＣＸＣＬ１６ＫＯマウスにおける２週間後肝臓肉眼所見図（Ａ）および肝肥大を示す図（Ｂ）である。
【図２】（Ａ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝臓の病理組織図である。（Ｂ）脂質構成成分を示す図である。（Ｃ）ＣＤＡＡ食餌ＷＴマウスおよびＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスのＮＡＳ値を示す図である。
【図３】ＷＴマウス群とＣＸＣＬ１６ＫＯマウス群での肝単核球（mononuclear cells；ＭＮＣｓ）中の肝ＮＫＴ細胞比率を、フローサイトメーターを用いて解析した結果を示す図である。
【図４】α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果を示す図である。
【図５】α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＮＫＴ細胞自身のサイトカイン産生プロファイルを細胞内サイトカイン染色により評価した結果を示す図である。
【図６】ＣＤＡＡ食摂食のＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を養子移植した際の、レシピエントマウスの肝単核球におけるＮＫＴ細胞の存在をフローサイトメーターにより確認した図である。
【図７】ＣＤＡＡ食摂食のＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を単離し、同系 （ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）のＮＫＴ細胞欠損（Ｊα１８ＫＯ）マウスに養子移植したときの肝臓の病理組織図とその肥大の結果を示す図である。
【図８】図７の肝臓に含まれる脂質を抽出して、各脂質の肝臓含量を定量した結果を示す図である。
【図９】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる図７の肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価結果の示す図である。
【図１０】（Ａ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞をレシピエントに移入後、図７の肝単核球の共通活性化マーカーであるＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した図である。（Ｂ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞の移入による図７の肝臓中のｋｕｐｆｆｅｒ細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した図である。
【図１１】（Ａ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られた培養上清（ＣＭ）によるマウス初代肝細胞の脂質蓄積を示す図である。（Ｂ）ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来のＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られた培養上清（ＣＭ）には、非常に高濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生が確認されたことを示す図である。
【図１２】図１１（Ａ）の脂肪蓄積が抑制されることを、中和抗体を用いたサイトカイン機能阻害実験により検証した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞の取得に用いられる病態モデル動物として、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしないマウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられる。好ましいものとして、ケモカインＣＸＣＬ１６の発現が健常マウスの1/１００以下に低下しているマウス、ＣＸＣＬ１６欠損マウス、グルタミン酸ナトリウム誘発マウス（ＭＳＧマウス）などが挙げられる。
【００１６】
コリン欠乏食としては、例えば、コリン欠乏・Ｌ−アミノ酸規定食（Choline deficient
L-amino acid defined diet：ＣＤＡＡ)、メチオニン・コリン欠乏食（Methionine- and Choline
deficien diet：ＭＣＤ)などが挙げられるが、好ましいものとして、ＣＤＡＡが挙げられる。
コリン欠乏食を摂取させる期間としては、例えば、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、１週間以上、好ましくは２週間以上である。
【００１７】
肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離するには、例えば、ＣＤ１ｄとβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の複合体を蛍光色素のアロフイコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスチン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジンにより４量体化した試薬（例えば、Ｃｄ１ｄ
Ｔｅｔｒａｍｅｒなど）で肝単核球を標識した後、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）などを用いて行えばよい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１
＜コリン欠乏食食餌誘導性ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルの作製＞
（１）ＣＸＣＬ１６欠損マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスバックグラウンドのＣＸＣＬ１６（ＳＲ−ＰＳＯＸ）欠損マウス（ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス）は、Ｊ. Immunol., 179, 8172-8179(2007)に記載の方法に準じて作製した。すなわち、定法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン耐性株のうちＣＸＣＬ１６遺伝子欠損株をサザンブロット法にてスクリーニングすることで樹立した。
【００１９】
（２）動物飼育環境
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（wild
type:ＷＴマウス）およびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスは、富山大学和漢医薬学総合研究所病態生化学分野の動物飼育室にて飼育した。水および固形飼料は自由摂食とした。本実験は、国立大学法人富山大学動物実験取扱規則に基づき、動物実験委員会の承認後、動物倫理に十分配慮し行った。
【００２０】
（３）コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウス
コリン欠乏食は、Choline
deficient L-amino acid defined diet (ＣＤＡＡ：Ｄｙｅｔｓ社製) を用い、４〜５週齢、雄性のＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに２週間自由摂食させた。また、対照群として通常飼育食（Labo MR Stock, 日本農産工業製）を同様にＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの両マウスに摂食させた。
摂食開始から２週間後、マウスを犠牲死させ、血液、肝臓、脾臓、精巣上体部脂肪組織を採取した。血液は腹部下大静脈から採血をおこない、常温で1時間、４℃で一晩静置し、卓上遠心機にて４℃、３０００回転、２０分間遠心分離後、上清を血清サンプルとした。血清サンプルは解析に用いるまでディープフリーザー（−８０℃）内で保存した。肝臓は、一部ＲＴ−ＰＣＲ（後述）用サンプルとしてＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＲＮＡ ｌａｔｅｒ：キアゲン社）に浸けて解析に用いるまで−２０℃で保存した。また病理組織及び免疫染色用に１０ ％中性緩衝ホルマリン中にて４℃で保存した。精巣上体部脂肪組織は液体窒素にて瞬間凍結後、ディープフリーザーにて保管した。
【００２１】
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではわずか２週間のＣＤＡＡ食摂食により、脂肪肝に特徴的な強い白色性の肝臓肉眼所見（図１Ａ）および肝肥大を認めた（図１Ｂ）。
【００２２】
（４）肝臓の病理組織学的所見とその評価
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの病理組織学的評価は、ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍに基づいてＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）を算出した（Hepatology, 41, 1313-1321(2005))。ＮＡＳ≧５をＮＡＳＨ、ＮＡＳ＞３をＮＡＳＨ進行性脂肪肝と判断した。
このスコアリングシステムは、脂肪沈着を０〜３、肝小葉の細胞浸潤を０〜３、そして肝細胞のｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性の程度を０〜２として段階評価し、その合計値をＮＡＳ値として、ＮＡＳ値＜３を除外診断、ＮＡＳ値≧５をＮＡＳＨと診断するものである。
【００２３】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは肝臓への著しい大滴性脂肪沈着を認め（図２Ａ）、さらに脂質構成成分として中性脂肪が有意に増加している（図２Ｂ）。
【００２４】
ＣＤＡＡ食餌ＷＴではＮＡＳ値が３を越える個体が１匹も該当しなかったのに対し（平均ＮＡＳ値：２.４）、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＮＡＳ値が５以上の個体が全体の半数存在した（図２Ｃ）。
【００２５】
（５）肝臓組織中中性脂肪の定量
肝臓組織中中性脂肪の抽出はＦｏｌｃｈらの方法（J. Biol. Chem., 497-509(1987))を一部改変して行った。すなわち、１００ｍｇ〜２００ｍｇ肝臓に４ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を加え、ガラスホモジナイザーでホモジナイズした後、ポリプロピレン製ファルコンチューブに移して、５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を１ｍＬ添加し、１分間ボルテックスした。室温、１５００×ｇ、１０分間遠心分離し、パスツールピペットを用いて下層のクロロホルム層を別のファルコンチューブに移した。さらに収量を増やすため、上層に１容のクロロホルムを加えて同様にボルッテクス、遠心分離した後、下層を先の下層と合わせた。合わせたクロロホルム層のうち、１００μＬに２０μＬのイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）を加え、ドラフト内で自然乾燥させた。乾燥したものをイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）に溶かし、トリグリセライドＥ−テストワコー （和光純薬工業製）を用い、単位肝重量当たりの中性脂肪量を算出した（図２Ｂ）。
【００２６】
実施例２
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスにおける肝ｉＮＫＴ細胞＞
（１）マウス肝単核球の単離
通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食したＷＴおよびＣＸＣＬ１６欠損マウスの肝臓を温ハンクス平衡塩類液（Hanks' Balanced Salt Solutions：ＨＢＳＳ）にて還流後、摘出細断し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗いこみながらナイロンメッシュ 上でホモジナイズして細胞懸濁液を得た。４℃、２０００回転、１０分間の条件下で細胞懸濁液を遠心分離した後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して、３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア製）上に重層し、室温、２０００回転、３０分間の条件下、比重分離して単核球分画を得た。さらに、低張処理により赤血球を除去した。その後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＰＲＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁した。
【００２７】
（２）ｉＮＫＴ細胞の単離
磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）用いて肝単核球からｉＮＫＴ細胞を単離した。ＭＡＣＳには Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のｍｉｎｉ ＭＡＣＳ ｋｉｔ（Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズ、ＭＳカラム、ＭＡＣＳセパレーター）を用いた。すなわち、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（ＭＢＬ社製）によりｉＮＫＴ細胞をラベルした後、ｉＮＫＴ細胞を８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを脱気したもの）に懸濁し、Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズを２０μＬ添加した。氷上にて１５分間インキュベートした後、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。ＭＡＣＳ ＭＳカラムをＭＡＣＳ緩衝液にてリンスした後、Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳセパレーターを用いて調製した細胞懸濁液からｉＮＫＴ細胞をポジティブセレクションした。また純度を高めるために、２回ＭＳカラムに細胞を通し、純度が８０％以上のものを実験及び解析に用いた。さらに細胞洗浄による細胞の損失を抑えるため、一部セルローション（日本全薬工業製）を用いて細胞の洗浄を行った。
【００２８】
（３）ｉＮＫＴ細胞ポピュレーションの解析
肝単核球（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、卓上遠心機にて４℃、２０００回転、５分間遠心し、洗浄した。沈殿した細胞を５０μＬの２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ（ＦＣＭ緩衝液）に再懸濁した後、ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン２.４Ｇ２）０.５ｍｇ／ｍＬを１μＬ添加し、氷上にて１０分間インキュベートした。ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体によるＦｃ受容体のブロッキングの後、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥを１０ｍＬ添加し、室温にて３０分間インキュベートしてｉＮＫＴ細胞を蛍光標識した。続いて、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体を加え、氷上にて３０分間インキュベートした。ＦＣＭ緩衝液を１ｍＬ加え、４℃、２０００回転、５分間遠心して洗浄し、３００μＬのＦＣＭ緩衝液に懸濁した後、フローサイトメーターを用いて細胞表面上の蛍光強度を解析した。
【００２９】
ＷＴではＣＤＡＡ食摂食による肝ｉＮＫＴ細胞比率の変化は認められなかったのに対し、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは通常食摂食時に比べて、ＣＤＡＡ食餌により肝ｉＮＫＴ細胞が２倍近く増加している（図３Ａ）。
【００３０】
（４）ｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析
ｉＮＫＴ細胞ポピュレーション解析と同様に、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥにてｉＮＫＴ細胞を蛍光標識し、その後ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ４モノクローナルとＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした。続いて、磁気細胞分離法によりｉＮＫＴ細胞を単離し、フローサイトメーターを用いてｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析を行った。
【００３１】
ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスともＣＤＡＡ食摂食によりｉＮＫＴ細胞数がベースラインよりも増加していたが、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の増加率の方が顕著であった（図３Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＷＴマウスとＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞集団は構成しているｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションが異なっていた（図３Ｃ）。
【００３２】
実施例３
＜コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝ｉＮＫＴ細胞の機能解析＞
（１）in vitroにおける肝単核球培養とβ-ガラクトシルセラミド（β-GalCer）刺激
実施例２（１）の方法に従い、肝単核球を単離した後、細胞を１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。
ｉＮＫＴ細胞の特異的なリガンドであるβ−ガラクトシルセラミド（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：β−ＧａｌＣｅｒ）は、ジメチルスルスルホキシドにて１ ｍｇ／ｍＬに調製し、肝単核球刺激の際には終濃度１００ｎｇ／ｍＬとして用いた。
【００３３】
（２）酵素免疫測定法（Enzymed-linked
Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン産生量
肝単核球の培養上清、およびマウスの血清サンプル中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（ベイバイオサイエンス社製）を用いて定量した。
【００３４】
（３）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）刺激
０.５％ポリソルベイト２０添加生理食塩水によりＤＭＳＯ溶解β−ＧａｌＣｅｒを希釈し、２μｇ／２００μＬとして、各ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに経尾静脈投与した。投与から１．５時間後に各マウスを犠牲死させて肝単核球を採取し、ｉＮＫＴ細胞の細胞内サイトカイン染色を行った。
【００３５】
β−ＧａｌＣｅｒ刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果、ＷＴマウスではＣＤＡＡ食の摂食によっていずれのサイトカインにも有意な産生能の変化は見られなかった。一方、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ食餌により、いずれのサイトカインにおいてもベースラインよりもサイトカイン産生能が上昇していた。
【００３６】
（４）ｉＮＫＴ細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生プロファイル変化
細胞固定／細胞膜浸透化キット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、細胞内部のサイトカインの保持、細胞固定、細胞膜透過処理を行った。
すなわち、単離した肝単核球を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で２４ウェルプレート（コースター）に播種し、ゴルジ体からの小胞輸送阻害剤であるモネンシン存在下で、３時間培養して細胞内にサイトカインを蓄積させ、その後、細胞を回収し、前述のようにＦＣＭ緩衝液で洗浄した後、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識ラット抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４−５）およびＣＤ１ｄ ＴｅｔｒａｍｅｒによりｉＮＫＴ細胞の細胞表面抗原を蛍光標識した。続いて、キットのプロトコールに従って細胞固定、細胞膜透過処理を行い、細胞内の各種サイトカインを蛍光標識抗サイトカイン抗体にて染色した後、ＣＤ１ｄ ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性細胞をゲートし、フローサイトメーターにより解析を行った。なお、染色用抗サイトカイン抗体として、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（クローン：ＸＭＧ１.２）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０.１）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＦＩＴＣ標識抗マウス／ラットＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、また同位体対照としてＦＩＴＣ標識ラットＩｇＧ１κ抗体を用いた。
【００３７】
その結果、ＣＤＡＡ食摂食によりＷＴマウスのＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γ（１８.２％→２５.２％）、ＩＬ−４（３.７％→８.４％）の発現が亢進していた。
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ摂食によるＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞のサイトカイン産生亢進の程度がＩＦＮ−γ（９.６％→１７.９％）、ＩＬ−４（４.３％→１３.８％）共にＷＴよりも顕著であった（図５）。
【００３８】
実施例４
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスのＮＡＳＨ病態形成における機能変異ｉＮＫＴ細胞の寄与＞
（１）養子移植
通常食またはＣＤＡＡ食を摂食したＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウス（ドナー）の肝ｉＮＫＴ細胞をＭＡＣＳにより単離した。単離したｉＮＫＴ細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリパンブルー染色により生細胞数をカウントし、５.５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬ
ＰＢＳをｉＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス：レシピエント）に経尾静脈移入した。細胞移入から２週間後にマウスを犠牲死させ、血清、肝臓、精巣上体部脂肪組織を採取し、保存した。なお、肝臓へのｉＮＫＴ細胞生着の有無については、フローサイトメーターによりレシピエント肝単核球中のｉＮＫＴ細胞を検出することで確認した（図６）。
【００３９】
（２）肝臓の病理組織学的所見
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。また、ヘマトキシリンとスダンIVの対比染色により肝臓への脂肪沈着を評価した。
【００４０】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を養子移植したレシピエント肝では、他ドナーマウスから単離した肝ｉＮＫＴ細胞を移植した場合と比較しても、脂肪肝に特徴的な白色肝が明らかに認められた（図７Ａ上）。この時、各群のレシピエント肝重量比を算出すると、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の移植した場合、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスのｉＮＫＴ細胞を移植した場合より有意に高値を示し、ＣＤＡＡ食餌ＷＴ群の肝ｉＮＫＴ細胞を移植した場合より、高い傾向を示した（図７Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を移植したレシピエント肝では脂質蓄積が誘導された（図７Ａ下）。
【００４１】
（３）肝臓組織中脂質
肝臓組織中の中性脂肪、コレステロール、遊離コレステロール、リン脂質量はリポタンパク質の受託解析サービス（スカイライト・バイオテック社）により解析を行った。なお、解析にはホルマリン固定肝臓サンプルを用いた。
【００４２】
その結果、遊離コレステロール、総コレステロール、リン脂質はどのドナー由来の肝ｉＮＫＴ細胞を移植しても変化が認められないのに対し、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を移入した場合には、レシピエントマウスの肝臓に有意な中性脂肪の蓄積の誘導があった（図８）。
【００４３】
（４）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価
［ＲＮＡ抽出］
肝組織中ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。すなわち、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ中で保存した肝組織５０ｍｇを１．５ｍＬチューブ （ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ）にとり、６００μＬのＲＬＴ緩衝液（２−メルカプトエタノール添加（１％，ｖ／ｖ））を加えて氷上にてホモジナイズした。肝ホモジネートをキット付属のプロトコールにしたがってシリカゲルカラムに通し、ＲＮＡを溶出させた。得られたＲＮＡ濃度を吸光光度計にて測定し、各サンプル１ｎｇ／１０μＬに調製した。調製したＲＮＡサンプルは解析に用いるまで−３０℃で保存した。
［逆転写反応］
ＯＬＩＧＯ ＤＴプライマー（インビトロジェン）を用いてＭＲＮＡを増幅した後、逆転写反応はＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ II ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （インビトロジェン）を使用して行った。
［リアルタイムＰＣＲ］
逆転写反応によりｃＤＮＡを得た後、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）と Ｍｘ３０００ｐ（ストラタジーン社）および測定・解析ソフト ＭｘＰｒｏ（ストラタジーン社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。測定結果はすべてハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の発現量により比較Ｃｔ法にて補正した。
【００４４】
ＮＡＳＨ病態形成と関連の深い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βといった炎症性サイトカインの発現を指標に炎症状態を評価した。その結果、異常ｉＮＫＴ細胞を移入することで、レシピエントの肝臓でもＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの発現誘導が確認された（図９）。
【００４５】
（５）肝単核球の活性化状態解析
各レシピエントの肝単核球を単離し、ＲＰＥ標識抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６９モノクローナル抗体（クローンＨ１.２Ｆ３）で染色した後、ＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターで解析し、単核球活性化の指標とした。
【００４６】
ドナー由来ｉＮＫＴ細胞をレシピエントに移入後、肝単核球の共通活性化マーカーであるＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の機能異常ｉＮＫＴ細胞を移入した場合には、ＣＤ６９発現細胞の増加が認められた（図１０Ａ）。
【００４７】
ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のマーカーとしてＦ４／８０を用い、ＣＤ６９との二重染色によってｉＮＫＴ細胞の移入によるｋｕｐｆｆｅｒ細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の肝ｉＮＫＴ細胞移入によって、ＣＤ６９陽性ｋｕｐｐｅｒ細胞の割合が増加していた（図１０Ｂ）。
【００４８】
実施例５
＜機能変異ｉＮＫＴ細胞を起点とした肝細胞への脂肪蓄積機構＞
（１）肝ｉＮＫＴ細胞とその他肝単核球による共培養系
肝ｉＮＫＴ細胞は、それぞれ通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食させたＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝臓からＭＡＣＳを用いて単離した。また、ｉＮＫＴ細胞との共培養に用いた肝単核球はｉＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス）の肝臓より単離し、これにより他のｉＮＫＴ細胞による影響を排除した実験系を組み立てた。共培養系は、ｉＮＫＴ細胞：肝単核球＝２×１０４ｃｅｌｌｓ：８×１０４ｃｅｌｌｓを１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して９６ウェルプレートに播種し、３７℃、炭酸ガスインキュベーター内で７２時間培養した。
【００４９】
（２）マウス初代肝細胞培養
肝細胞を捲き込む前日に、９６ウェルプレートをマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でコーティングしておく。実際には、１ｍｇ／ｍＬマトリゲルをＰＢＳにより５０μｇ／ｍＬに希釈し、４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。続いて、クリーンベンチ内で一晩風乾し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１度洗浄した後に培養に用いた。
無処置ＷＴマウスまたはｉＮＫＴ細胞欠損マウスの肝臓をＥＧＴＡ添加ＨＢＳＳで還流後、肝臓を摘出し、１２５μｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（シグマ社）／ＨＢＳＳ溶液に浸けて細断して、３７℃温浴シェーカー中で１５分間インキュベートした。その後、肝組織をナイロンメッシュ（１００μｍ）に通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液を、４℃、５００回転、１分間遠心し、上清をアスピレーターにより除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を３回程洗浄し、上清が澄んできたら無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を１〜２回洗浄して肝細胞を得た。３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度に調整し、マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートに播種した。
【００５０】
（３）共培養系上清
（馴化培地）によるマウス初代肝細胞への脂肪蓄積誘導
肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１６時間培養し飢餓状態にしておく。肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、共培養系馴化培地にて肝細胞を２４ 時間培養した。
【００５１】
（４）肝細胞脂質染色
共培養系馴化培地下で２４時間培養した後、培養上清を除去して４％パラホルムアルデヒドで肝細胞を固定し、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて肝細胞中の脂質を染色した（Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏ染色）。
【００５２】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来の機能変異ｉＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られたＣＭでマウス初代肝細胞を培養することで非常に強力な脂質蓄積が誘導された（図１１Ａ）。
【００５３】
（５）共培養系におけるサイトカイン産生量
共培養系上清中に産生された液性因子として、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒｅａｄｙ Ｓｅｔ Ｇｏ！， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
【００５４】
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞は肝単核球との共培養を行わずとも、それ単独でもＣＤＡＡ食餌ＷＴマウス、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞よりも高いＴＮＦ−α産生能を有していた（図１１Ｂ）。
【００５５】
（６）中和抗体によるサイトカイン機能阻害実験
Ｐｕｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ ＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはコントロールＩｇＧ（ラットＩｇＧ、Ｉｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ）を終濃度１μｇ／ｍＬとして、馴化培地を用いた初代肝細胞培養系に添加した。
【００５６】
その結果、機能変異ｉＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養ＣＭに抗ＩＦＮ−γ中和抗体、抗ＴＮＦ−α中和抗体をそれぞれ単独で添加させるだけで、共培養ＣＭによる脂質蓄積作用はほぼ完全に阻害された（図１２）。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のＴＮＦ−αの産生能を有することを特徴とするインバリンアントナチュラルキラーＴ細胞は、ＮＡＳＨにおける異常免疫応答を解明するためのツールとして有用である。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項２】
養子移植することによりレシピエント動物に、非アルコール性脂肪性肝炎を発症させる請求項１記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項３】
ナチュラルキラーＴ細胞が、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離されるものである請求項１および２記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項４】
非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物が、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物である請求項３記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項５】
病態モデル動物がげっ歯類である請求項３または４記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項６】
肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食を摂食させ、該病態モデル動物の肝臓から単離することを特徴とする肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞の取得方法。
【請求項７】
病態モデル動物がげっ歯類である請求項６記載の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進するナチュラルキラーＴ細胞の取得方法。
【請求項１】
肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項２】
養子移植することによりレシピエント動物に、非アルコール性脂肪性肝炎を発症させる請求項１記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項３】
ナチュラルキラーＴ細胞が、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離されるものである請求項１および２記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項４】
非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物が、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物である請求項３記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項５】
病態モデル動物がげっ歯類である請求項３または４記載のナチュラルキラーＴ細胞。
【請求項６】
肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食を摂食させ、該病態モデル動物の肝臓から単離することを特徴とする肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞の取得方法。
【請求項７】
病態モデル動物がげっ歯類である請求項６記載の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進するナチュラルキラーＴ細胞の取得方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１３−３４４５９（Ｐ２０１３−３４４５９Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７５６３０（Ｐ２０１１−１７５６３０）
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２３年２月１４日 平成２３年３月医学薬学教育部修士課程修了予定者修士論文発表会に発表（要旨集、スライド）
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２３年２月１４日 平成２３年３月医学薬学教育部修士課程修了予定者修士論文発表会に発表（要旨集、スライド）
【出願人】（３０５０６０５６７）国立大学法人富山大学 (194)
【Ｆターム（参考）】
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