ヒトオーファンＧタンパク質共役型受容体
【課題】膜貫通受容体、より具体的には内在性のヒトオーファンＧタンパク質共役型受容体の提供。
【解決手段】特定の塩基配列から成るｃＤＮＡによりコードされるＧタンパク質共役型受容体（［ＧＰＣＲ］）。特定の塩基配列から成るｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。前記プラスミドを含んでなる宿主細胞。ヒトＧＰＣＲの同定はジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトＧＰＣＲのいくつかを同定した。他の開示される内在性ヒトＧＰＣＲは特定のＥＳＴクローンをクエリ配列として使用するＥＳＴデータベース（ｄｂｓｅｓｔ）のＢＬＡＳＴ検索を実施することにより同定した。そのあと、同定された特定のＥＳＴクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【解決手段】特定の塩基配列から成るｃＤＮＡによりコードされるＧタンパク質共役型受容体（［ＧＰＣＲ］）。特定の塩基配列から成るｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。前記プラスミドを含んでなる宿主細胞。ヒトＧＰＣＲの同定はジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトＧＰＣＲのいくつかを同定した。他の開示される内在性ヒトＧＰＣＲは特定のＥＳＴクローンをクエリ配列として使用するＥＳＴデータベース（ｄｂｓｅｓｔ）のＢＬＡＳＴ検索を実施することにより同定した。そのあと、同定された特定のＥＳＴクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許文書は、以下の出願（全部は示された出願日に米国特許・商標庁（ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ ＴｒａｄｅｍａｒｋＯｆｆｉｃｅ）に米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．ＥｘｐｒｅｓｓＭａｉｌ）を介して出願された）、すなわち１９９８年１１月２０日に出願された米国仮出願第６０／１０９，２１３号の利益を主張する１９９９年２月２６日に出願された米国仮出願第６０／１２１，８５２号；１９９９年２月１６日に出願された米国仮出願第６０／１２０，４１６号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４６号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４９号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３６号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３９号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，５６７号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３７，１２７号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３７，１３１号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３７号からの優先権を主張する１９９９年６月２９日に出願された米国仮出願第１４１，４４８号；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＣＨＮ１０−１）；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／１５６，３３３号；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／１５６，５５５号；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／１５６，６３４号；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＲＵＰ６−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＲＵＰ７−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＣＨＮ６−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＲＵＰ５−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＣＨＮ９−１）のそれぞれの優先権の利益を主張する。本特許文書は、１９９８年１０月１３日に申請された米国第０９／１７０，４９６号、および１９９９年１０月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．ＥｘｐｒｅｓｓＭａｉｌ）を介して）出願された米国第（不明）号（ウッドコック（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ）ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）クルツ（Ｋｕｒｔｚ）マキエヴィッツ（Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒｒｉｓ）、ＬＬＰ処理予定事項表番号ＡＲＥＮ−００５４）（双方は引用により本明細書に組み込まれる）に関する。本特許文書は、１９９９年７月３０日に出願された米国第０９／３６４，４２５号（そっくりそのまま引用により組み込まれる）にもまた関する。本出願は、１９９９年１０月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．ＥｘｐｒｅｓｓＭａｉｌ）を介して）出願された米国第＿＿＿＿号（ウッドコック（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ）、ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）、クルツ（Ｋｕｒｔｚ）、マキエヴィッツ（Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒｒｉｓ）、ＬＬＰ処理予定事項表番号ＡＲＥＮ−００５０）（そっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる）に対する優先権もまた主張する。前述の出願のそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本特許文書に開示される発明は、膜貫通受容体、およびより具体的には内在性のオーファンヒトＧタンパク質共役型受容体（「ＧＰＣＲ」）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトでは多数の受容体のクラスが存在するが、はるかに最も豊富かつ治療に関係するものは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲもしくは複数のＧＰＣＲ）のクラスにより代表される。ヒトゲノム内には数十万個の遺伝子が存在することが推定されており、そしてこれらのなかでおよそ２％もしくは２，０００個の遺伝子がＧＰＣＲをコードすると推定されている。内在性リガンドが同定されている、ＧＰＣＲを包含する受容体は「既知」受容体と称される一方、内在性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受容体と称される。ＧＰＣＲは製薬学的製品の開発に重要な一領域を代表する。すなわち、１００種の既知のＧＰＣＲのおよそ２０種から全処方薬の６０％が開発されている。この卓越性は、とりわけＧＰＣＲの場合には単に意味論上でない。従って、オーファンＧＰＣＲは、製薬業界にとって、金が１９世紀後半のカリフォルニアにとって、成長、拡張、増強および開発の契機となったところのものである。
【０００４】
ＧＰＣＲは１つの共通の構造モチーフを共有する。全部のこれらの受容体は、７個のαヘリックスを形成する２２ないし２４個の間の疎水性アミノ酸の７個の連なりを有し、そのそれぞれは膜に広がっている（各広がり(span)は数字により同定されている。すなわち膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）など）。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外もしくは「細胞外」側で、膜貫通−２と膜貫通−３、膜貫通−４と膜貫通−５、および膜貫通−６と膜貫通−７の間でアミノ酸の鎖により結合されている（これらはそれぞれ「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）と称される）。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の内もしくは「細胞内」側で、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫通−４、および膜貫通−５と膜貫通−６の間でもまたアミノ酸の鎖により結合されている（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２およびＩＣ−３）と称される）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空隙中に存し、また、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の外側の細胞外空隙中に存する。
【０００５】
一般に、内在性リガンドが受容体と結合する場合（しばしば受容体の「活性化」と称される）、細胞内領域のコンホメーションの変化が存在し、それは細胞内領域と細胞内の「Ｇタンパク質」との間の共役(coupling)を可能にする。ＧＰＣＲはＧタンパク質に関して「乱交性」であること、すなわちＧＰＣＲは１種以上のＧタンパク質と相互作用する可能性があることが報告されている。ケナキン、非特許文献１を参照されたい。他のＧタンパク質が存在するが、現在のところＧｑ、Ｇｓ、ＧｉおよびＧｏが同定されたＧタンパク質である。Ｇタンパク質との内在性リガンドで活性化されたＧＰＣＲの共役がシグナル伝達カスケード過程（「シグナル伝達」と称される）を開始する。正常な条件下では、シグナル伝達は最終的に細胞の活性化もしくは細胞の阻害をもたらす。受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられている。
【０００６】
ＧＰＣＲは、生理学的条件下では２種の異なるコンホメーション、すなわち「不活性」状態と「活性状態」との間の平衡で細胞膜中に存在する。不活性状態の受容体は、細胞内のシグナル伝達経路に連結して生物学的応答を生じさせることが不可能である。受容体のコンホメーションの活性状態への変化は（Ｇタンパク質を介する）伝達経路への連鎖を可能にし、そして生物学的応答を生じさせる。受容体は、内在性リガンドもしくは薬物のような化合物により活性状態で安定化させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．、４３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９５（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト内在性オーファンＧタンパク質共役型受容体を本明細書で開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 配列番号１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２） 配列番号２を含んで成る配列番号１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３） ベクターおよび配列番号１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４） 項目３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５） 配列番号３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６） 配列番号４を含んで成る配列番号３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７） ベクターおよび配列番号３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目８） 項目７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目９） 配列番号５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１０） 配列番号６を含んで成る配列番号５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１１） ベクターおよび配列番号５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目１２） 項目１１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１３） 配列番号７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１４） 配列番号８を含んで成る配列番号７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１５） ベクターおよび配列番号７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目１６） 項目１５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１７） 配列番号９を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１８） 配列番号１０を含んで成る配列番号９のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１９） ベクターおよび配列番号９のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目２０） 項目１９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２１） 配列番号１１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２２） 配列番号１２を含んで成る配列番号１１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２３） ベクターおよび配列番号１１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目２４） 項目２３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２５） 配列番号１３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２６） 配列番号１４を含んで成る配列番号１３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２７） ベクターおよび配列番号１３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目２８） 項目２７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２９） 配列番号１５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３０） 配列番号１６を含んで成る配列番号１５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３１） ベクターおよび配列番号１５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目３２） 項目３１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３３） 配列番号１７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３４） 配列番号１８を含んで成る配列番号１７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３５） ベクターおよび配列番号１７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目３６） 項目３５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３７） 配列番号１９を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３８） 配列番号２０を含んで成る配列番号１９のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３９） ベクターおよび配列番号１９のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４０） 項目３９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４１） 配列番号２１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４２） 配列番号２２を含んで成る配列番号２１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４３） ベクターおよび配列番号２１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４４） 項目４３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４５） 配列番号２３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４６） 配列番号２４を含んで成る配列番号２３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４７） ベクターおよび配列番号２３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４８） 項目４７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４９） 配列番号２５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５０） 配列番号２６を含んで成る配列番号２５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５１） ベクターおよび配列番号２５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目５２） 項目５１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５３） 配列番号２７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５４） 配列番号２８を含んで成る配列番号２７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５５） ベクターおよび配列番号２７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目５６） 項目５５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５７） 配列番号２９を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５８） 配列番号３０を含んで成る配列番号２９のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５９） ベクターおよび配列番号２９のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目６０） 項目５９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６１） 配列番号３１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６２） 配列番号３２を含んで成る配列番号３１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６３） ベクターおよび配列番号３１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目６４） 項目６３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６５） 配列番号３３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６６） 配列番号３４を含んで成る配列番号３３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６７） ベクターおよび配列番号３３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目６８） 項目６７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６９） 配列番号３５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７０） 配列番号３６を含んで成る配列番号３５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７１） ベクターおよび配列番号３５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目７２） 項目７１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目７３） 配列番号３７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７４） 配列番号３８を含んで成る配列番号３７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７５） ベクターおよび配列番号３７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目７６） 項目７５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
【００１０】
受容体を中核として発展してきた学術文献は、受容体に対する多様な影響を有するリガンドを指す多数の用語を採用している。明快さおよび一貫性のため、本特許文書を通じて以下の定義を使用するであろう。これらの定義がこれらの用語の他の定義と対立する限において、以下の定義が支配する：本明細書で使用されるアミノ酸の略語を表１に示す：
【００１１】
【表１】
【００１２】
組成物は最低１種の成分を含んで成る物質を意味する。
【００１３】
内在性は哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、そして制限でなく「受容体」という用語に関しての内在性は、哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒト）もしくはウイルスにより天然に産生されるものを意味する。対照的に、この情況における非内在性という用語は、哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒト）もしくはウイルスにより天然に産生されないものを意味する。
【００１４】
宿主細胞は、その中に組み込まれたプラスミドおよび／もしくはベクターを有することが可能な細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは宿主細胞が複製する際に自律的分子として典型的に複製され（一般に、プラスミドはその後真核生物宿主細胞への導入のため単離される）；真核生物宿主細胞の場合には、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように、プラスミドが宿主細胞の細胞ＤＮＡに組込まれる。好ましくは、本明細書に開示される本発明の目的上、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくは２９３、２９３ＴおよびＣＯＳ−７細胞より成る群から選択される。
【００１５】
リガンドは、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在する分子を意味する。
非オーファン受容体は、内在性の天然に存在するリガンドに特異的な内在性の天然に存在する分子を意味し、ここで、受容体へのリガンドの結合が細胞内シグナル伝達経路を活性化する。
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されていないかもしくは未知である内在性受容体を意味する。
【００１６】
プラスミドはベクターおよびｃＤＮＡの組み合わせを意味する。一般に、プラスミドは、ｃＤＮＡの複製および／もしくはタンパク質としてのその発現の目的上、宿主細胞に導入される。
ｃＤＮＡに関するベクターは、最低１個のｃＤＮＡを組み込むことが可能かつ宿主細胞への組込みが可能な環状ＤＮＡを意味する。
【００１７】
以下のセクションの順序は表象的な効率について示され、また、後に続く開示もしくは請求の範囲に対する制限として意図されず、またそのように解釈されるべきでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】発明にかかる、本明細書で提供されるある種のドットブロットの参照「格子」を提供する（それぞれ図２Ａおよび２Ｂもまた参照されたい）。
【図１Ｂ】発明にかかる、本明細書で提供されるある種のドットブロットの参照「格子」を提供する（それぞれ図２Ａおよび２Ｂもまた参照されたい）。
【図２】発明にかかる、それぞれｈＣＨＮ３およびｈＣＨＮ８から生じるある種のドットブロット分析の結果の再現を提供する（それぞれ図１Ａおよび１Ｂもまた参照されたい）。
【図３】発明にかかる、ｈＲＵＰ３のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の再現を提供する。
【図４】発明にかかる、ｈＲＵＰ４のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の再現を提供する。
【図５】発明にかかる、ｈＲＵＰ６のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の再現を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力は、ヒトゲノム内に配置されている核酸配列に関する夥しい量の情報の同定をもたらし；それは、この努力によって、いずれかの特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するかも知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴うことなく、遺伝子配列情報が利用可能にされているというのが実情である。ヒトゲノム内の核酸配列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、本明細書で開示される多様なＧＰＣＲは、ジェンバンク［ＧｅｎＢａｎｋ］（商標）データベースを再検討することにより発見された一方、他のＧＰＣＲは、既に配列決定されたＧＰＣＲの核酸配列を利用してＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ（商標）検索を実施することにより発見された。下の表Ａは、ＧＰＣＲのそれぞれの相同なＧＰＣＲと一緒に、開示される内在性のオーファンＧＰＣＲを列挙する。
【００２０】
【表２】
【００２１】
受容体の相同性は、人体内での開示される受容体の役割の正しい認識を得ることに関して有用である。加えて、こうした相同性は、開示されるオーファンＧＰＣＲの天然の活性化物質であることができる可能な内在性リガンド（１種もしくは複数）に関しての洞察を提供する可能性がある。
Ｂ．受容体スクリーニング
受容体の伝統的研究は、アンタゴニストおよび受容体に影響を及ぼす可能性のある他の分子を見出すように発見を進行させることができる前に内在性リガンドを最初に同定しなければならないという演繹的過程（歴史的に基づく）から常に進行したため、内在性リガンドの同定（これは主として受容体の内在性リガンドを必要とする受容体結合アッセイの実施の一手段を提供するという目的上）のための技術は過去数年のあいだにより容易に利用可能になった。最初にアンタゴニストが知られているかも知れない場合でさえ、探索は内在性リガンドを探すように直ちに拡大した。この思考様式は、構成的に活性化される受容体の発見後でさえも受容体の研究に存続している。これまで認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび反作用薬を発見するのに最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患にとって、治療薬で望ましいものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬物ではなく、それぞれ受容体の活性状態を減少させるかもしくは受容体の活性を高めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させるもしくは高める化合物は内在性リガンドと同一部位で結合する必要がないためである。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物についてのいかなる探索もリガンド非依存的な活性状態に対する化合物のスクリーニングにより開始すべきである。
【００２２】
当該技術分野で既知であるとおり、ＧＰＣＲはそれへの受容体の内在性リガンドの結合を伴わなくてもそれらの内在性の状態で「活性」であることができる。こうした天然に活性の受容体を、とりわけ反作用薬の直接同定のために（すなわち受容体の内在性リガンドを必要とせずに）スクリーニングすることができる。あるいは、例えば受容体の内在性リガンドの非存在下で活性である非内在性バージョンの受容体を確立するための受容体の突然変異を介して受容体を「活性化する」ことができる。
【００２３】
本明細書に開示される、内在性のもしくは非内在性の構成的に活性化されるバージョンのヒトオーファンＧＰＣＲに対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内在性リガンドの使用を必要とすることなく、この細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接の同定を提供することができる。本明細書に開示される内在性のバージョンのヒトＧＰＣＲが発現および／もしくは過剰発現されている身体内の領域を決定することにより、受容体の発現および／もしくは過剰発現を伴う関連疾患／障害状態を決定することが可能であり；こうした一アプローチを本特許文書で開示する。
【００２４】
本明細書に開示されるヒトオーファンＧＰＣＲの構成的活性化を明示するかも知れない突然変異の創製に関して、ＧＰＣＲのＴＭ６内（典型的にはＴＭ６／ＩＣ３界面に近づく）に配置されると想定されているプロリン残基からの距離に基づく（こうしたプロリン残基は極めて保存されているようである）。この残基から１６アミノ酸残基に配置されるアミノ酸残基（おそらく受容体のＩＣ３領域中に配置される）を最も好ましくはリシン残基に突然変異することにより、こうした活性化を得ることができる。この目的を達成するためにはこの位置の突然変異で他のアミノ酸残基が有用であるかも知れない。
Ｃ．疾患／障害の同定および／もしくは選択
好ましくは、（ａ）組織ｍＲＮＡに対するドットブロット分析、および／もしくは（ｂ）組織サンプル中の受容体の発現のＲＴ−ＰＣＲ同定のためのプローブを作成するのにヒトオーファンＧＰＣＲのＤＮＡ配列を使用することができる。組織供給源、もしくは疾患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ましく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。
Ｄ．候補化合物のスクリーニング
１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
Ｇタンパク質受容体が構成的に活性（すなわちそれに結合する内在性リガンドの非存在下で活性）になった場合、それはＧタンパク質（例えばＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ）に結合しかつＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。その後、Ｇタンパク質がＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常な条件下で失活型になる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニターするのに、ＧＴＰの加水分解不可能な類似物［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用することができる。［35Ｓ］ＧＴＰγＳはリガンドの不存在下および存在下での膜へのＧタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告されている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は、１９９５年にトレイノル（Ｔｒａｙｎｏｒ）とナホルスキ（Ｎａｈｏｒｓｋｉ）により報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に関係なく、全部のＧタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能であるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
「包括的」Ｇタンパク質共役型受容体アッセイ（すなわちアゴニスト、部分的アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイ）を使用して候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わりに細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「分離する」かも知れない。
ａ．ＧｓおよびＧｉ
Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（およびＧｏ）はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの転化を触媒し；従って、Ｇｓタンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの増大された細胞レベルと関連する。他方、Ｇｉ（もしくはＧｏ）タンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低下された細胞レベルと関連する。一般に、“ＩｎｄｉｒｅｃｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＳｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．）ら編 サイナウアアソシエーツインク（ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９９２）を参照されたい。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬（すなわちこうした化合物はｃＡＭＰのレベルを低下させることができる）であるかどうかを決定することができる。ｃＡＭＰを測定するための当該技術分野で既知の多様なアプローチを利用することができ；最も好ましいアプローチはＥＬＩＳＡに基づく形式での抗ｃＡＭＰ抗体の使用に頼る。利用することができる別の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。環状ＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性のＤＮＡ結合タンパク質もしくは転写因子（ＣＲＥＢ）（その後ｃＡＭＰ応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する）の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ）の前に複数のｃＡＭＰ応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたＧｓに結合された受容体は、ｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら１９９５）。
ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、この酵素は順にリン脂質ＰＩＰ2を加水分解して、２種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）を放出する。ＩＰ3の増大された蓄積はＧｑおよびＧｏ会合型受容体の活性化と関連する。一般に、“ＩｎｄｉｒｅｃｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．）ら編サイナウアアソシエーツ インク（ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９９２）を参照されたい。ＩＰ3の蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が例えばＧｑもしくはＧｏ会合型受容体に対する反作用薬である（すなわちこうした化合物はＩＰ3のレベルを低下させることができる）かどうかを決定することができる。Ｇｑ会合型受容体はＡＰ１レポーターアッセイ（ここでＧｑ依存性のホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こす）を使用してもまた検査することができ；従って、活性化されたＧｑ会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それにより、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングのための内在性の構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲもしくは非内在性の構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲの使用は興味深い挑戦を提供し、ここでは定義によりそれに結合される内在性リガンドの不存在下でさえ該受容体は活性である。従って、活性化された受容体により得られるシグナルを高めることが可能であるアプローチを利用することがしばしば有用である。好ましい一アプローチはＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【００２５】
一般に、ＧＰＣＲが上で示されたアッセイ技術（ならびに他者）を使用して構成的に活性化される、もしくはされていることが決定されれば、内在性ＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の共役は評価することが可能なシグナル伝達経路を提供する。哺乳動物発現系の使用によりスクリーニングが起こることが最も好ましいため、こうした系はその中に内在性Ｇタンパク質を有することが期待されよう。従って、定義により、こうした系においては、構成的に活性化されたオーファンＧＰＣＲが連続的にシグナルを発するであろう。この点に関して、例えば受容体に対する反作用薬の存在下で、とりわけスクリーニングの情況でそれが反作用薬と接触される場合にそれが受容体をより容易に識別することが可能であろうことがよりありそうであるように、このシグナルを高めることが好ましい。
【００２６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質の効力を高めることを意図している。ＧＰＣＲ融合タンパク質は非内在性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを用いるスクリーニングに好ましい。なぜなら、こうしたアプローチは、こうしたスクリーニング技術で最も好ましく利用されるシグナルを増大させるからであるが、とは言えＧＰＣＲ融合タンパク質は内在性の構成的に活性化されたＧＰＣＲとともに使用することもまた可能であり、そして好ましくは使用する。これは大きな「Ｓ／Ｎ」比の助長で重要であり；こうした大きな比は本明細書で開示されるような候補化合物のスクリーニングに重要かつ好ましい。
【００２７】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は当業者の範囲内にある。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系が、研究者の特定のニーズに合う可能性のある多様なアプローチを提供する。こうしたＧＰＣＲ融合タンパク質構築物に対する重要な基準は、ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の双方が同じ読み枠にある（好ましくはＧＰＣＲの配列がＧタンパク質の配列の上流にある）こと、および、ＧＰＣＲの発現に際してＧタンパク質もまた発現することが可能であるようにＧＰＣＲの「終止」コドンを欠失もしくは置き換えなくてはならないことである。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接連結することができるか、もしくは２者の間にスペーサー残基（好ましくは約１２を越えないが、この数字は当業者により容易に確かめることが可能である）が存在することができる。われわれは、使用されないいくつかの制限部位が発現に際して効果的にスペーサーとなるであろうことに、スペーサーの使用の（便宜性に基づく）好みを有する。最も好ましくは、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の創製に先立ちＧＰＣＲに共役するＧタンパク質を同定することができる。同定された数種のみのＧタンパク質が存在するため、その中の内在性のＧＰＣＲ配列の挿入にＧタンパク質の配列を含んで成る構築物（すなわち普遍的Ｇタンパク質構築物）が利用可能であることが好ましく；これは、異なる配列を有する多様な異なった内在性ＧＰＣＲの大スケールのスクリーニングの情況で効率を提供する。
Ｅ．他の利用性
本明細書に開示されるヒトオーファンＧＰＣＲの好ましい使用は、（好ましくは製薬学的作用物質としての使用のための）反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであることができるが、これらのバージョンのヒトＧＰＣＲは研究の設定でもまた利用することができる。例えば、ＧＰＣＲを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解（それがシグナル伝達カスケードの理解に適用されるため）に利用することができる。ヒトオーファンＧＰＣＲの価値は、身体内でのこうした受容体の位置（１種もしくは複数）を決定することにより、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容体の役割を理解するのにＧＰＣＲを使用することができることにおいて、研究ツールとしてのその利用性が高められることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許文書の検討に基づき当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例は本発明の解明の目的上（そして制限でなく）提示する。特定の核酸およびアミノ酸の配列が本明細書で開示される一方、当業者は、下に報告される同一のもしくは実質的に類似の結果を達成しつつこれらの配列に対する小さな改変を行う能力があると信じられる。下に別の方法で示されない限り、開示される内在性オーファンヒトＧＰＣＲの全部の核酸配列は配列決定しかつ確認している。同等の受容体の目的上、当業者は、機能的に同等な受容体を得るために開示された配列に対し保存的置換を行うことができることを容易に認識するであろう。
【００２９】
実施例１
内在性のヒトＧＰＣＲ
１．ヒトＧＰＣＲの同定
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトＧＰＣＲのいくつかを同定した。データベースを検索する間に以下のｃＤＮＡクローンを下に明示されるとおり同定した。
【００３０】
【表３】
【００３１】
他の開示される内在性ヒトＧＰＣＲは、以下のＥＳＴクローンをクエリ配列として使用するＥＳＴデータベース（ｄｂｅｓｔ）のＢＬＡＳＴ検索を実施することにより同定した。その後、同定された以下のＥＳＴクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【００３２】
【表４】
【００３３】
２．完全長のクローニング
ａ．ｈＧ２Ａ（配列番号２３および２４）
マウスＥＳＴクローン１１７９４２６を使用して、３種のアミノ酸ｈＧ２Ａコーディング配列以外の全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディング配列の５’端は５’ＲＡＣＥ（商標）を使用することにより得、また、ＰＣＲのための鋳型はクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のヒト脾マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡであった。開示されるヒトＧ２Ａは、以下：
５’−ＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号３９；１回目のＰＣＲ）
５’−ＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号４０；２回目のＰＣＲ）
のような配列番号３９および配列番号４０に示されるような第一回および第二回のＰＣＲのためのＧ２ＡのｃＤＮＡに特異的なプライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、９４℃３０秒間、次いで９４℃５秒間および７２℃４分間の５周期；ならびに９４°５秒間および７０°４分間の３０周期で、アドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ＧＣポリメラーゼキット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；製造説明書に従うことができる）を使用して実施した。およそ１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。Ｔ７シークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（ＵＳＢアマーシャム（ＵＳＢＡｍｅｒｓｈａｍ）；製造元の説明書に従うことができる）を使用してクローン化された挿入物を配列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。Ｐ32標識されたフラグメントを用いてＲＮＡドットブロット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；製造元の説明書に従うことができる）をプロービングすることによりヒトＧ２Ａの発現を検出することができる。
ｂ．ｈＣＨＮ９（配列番号３３および３４）
ＥＳＴクローン１５４１５３６の配列決定は、ｈＣＨＮ９が１個の開始コドンのみを有する（すなわち終止コドンは欠けていた）部分的ｃＤＮＡクローンであることを示した。ｈＣＨＮ９をデータベース（ｎｒ）に対して「ＢＬＡＳＴ検索する(blast)」のに使用した場合、ｈＣＨＮ９の３’の配列はロイコトリエンＢ４受容体のｃＤＮＡの５’非翻訳領域（ｈＣＨＮ９のコーディング配列と同じ読み枠に終止コドンを含有した）に１００％相同であった。ＬＴＢ４ＲのｃＤＮＡの５’非翻訳領域がｈＣＨＮ９の３’配列であったかどうかを決定するために、ｈＣＨＮ９に見出される開始コドンに隣接する５’配列およびＬＴＢ４Ｒの５’非翻訳領域に見出される終止コドンを取り巻く３’配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを実施した。利用された５’プライマー配列は以下のとおりであった：
５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号４１；センス）および
５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号４２；アンチセンス）
製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺ｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。周期条件は、９４℃１分間、６５℃１分間ならびに７２℃１分および１０秒間の３０周期であった。予測された大きさと一致する１．１ｋｂのフラグメントをＰＣＲから得た。本ＰＣＲフラグメントをｐＣＭＶにサブクローニングし（下を参照されたい）そして配列決定した（配列番号３３を参照されたい）。
ｃ．ｈＲＵＰ４（配列番号３７および３８） 鋳型としてヒト脳ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いるＲＴ−ＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ４をクローン化した：
５’−ＴＣＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号４３；センス）および
５’−ＴＧＣＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４４；アンチセンス）。
以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃３０秒間；５５℃３０秒間、７２℃４５秒間および７２℃１０分間により、タックプラス［ＴａｑＰｌｕｓ］（商標）プレシジョン
［Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；製造説明書に従うことができる）を使用してＰＣＲを実施した。周期２から４を３０回反復した。
【００３４】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、そして５００ｂｐのＰＣＲフラグメントを単離しかつｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））およびＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して配列決定した。配列分析は、該ＰＣＲフラグメントが実際に、他のＧＰＣＲとの類似性をもつ１個の連続的読取り枠を有する代替スプライシングされた形態のＡＩ３０７６５８であったことを示した。このＰＣＲフラグメントの完了された配列は以下のとおりであった：
【００３５】
【表５】
【００３６】
上の配列に基づき、２種のセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４６；オリゴ１）、
５’−ＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号４７；オリゴ２）
および、２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡ−３’（配列番号４８；オリゴ３）５’−ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４９；オリゴ４）
を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４００−１）を用いる３’−および５’−ｒａｃｅＰＣＲに使用した。ＲＡＣＥＰＣＲにより生成されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））および数種の内的プライマーを使用して配列決定した。３’ＲＡＣＥ産物はポリ（Ａ）テール(tail)およびＴＡＡ終止コドンで終了する１個の完了される読取り枠を含有した。５’ＲＡＣＥ産物は不完全な５’端を含有した（すなわちＡＴＧ開始コドンが存在しなかった）。
【００３７】
新たな５’配列に基づき、オリゴ３および以下のプライマー：
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号５０；オリゴ５）を第２回の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲに使用し、そしてＰＣＲ産物を上のとおり分析した。第３回の５’ＲＡＣＥＰＣＲは、アンチセンスプライマー：
５’−ＴＧＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５１；オリゴ６）および
５’−ＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−３’（配列番号５２；オリゴ７）
を利用して実施した。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲの産物の配列は開始コドンＡＴＧの存在を示し、また、さらなる回の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲはいかなるそれ以上の５’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣ−３’（配列番号５３；オリゴ８）
およびオリゴ４を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳型（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成された６５０ｂｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された５’配列を確認した。オリゴ２および以下のアンチセンスプライマー：
５’−ＴＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号５４；オリゴ９）
を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳型（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成された６７０ｂｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された３’配列を確認した。
ｄ．ｈＲＵＰ５（配列番号９および１０）
以下の配列：
５’−ＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号５５）
５’−ＴＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号５６）
を有した、ＡＴＧ開始コドンから上流のセンスプライマー（配列番号５５）、および終止コドンとしてＴＣＡを含有するアンチセンスプライマー（配列番号５６）、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ５をクローン化した。段階２から段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４℃１５秒間；６９℃４０秒間；７２℃３分間；および７２℃６分間による５０μｌの反応中での増幅にアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．４ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した。配列番号９を参照されたい。
ｅ．ｈＲＵＰ６（配列番号１１および１２）
プライマー：
５’−ＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号５７）および
５’−ＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号５８）
ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ６をクローン化した。以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４℃５秒間；６６℃４０秒間；７２℃２．５秒間および７２℃７分間による５０μｌの反応中での増幅にアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、製造元の説明書に従う）を使用した。周期２から４を３０回反復した。１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩビッグダイターミネーター［Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キット（Ｐ．Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号１１を参照されたい）。
ｆ．ｈＲＵＰ７（配列番号１３および１４）
プライマー：
５’−ＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＣ−３’（配列番号５９；センス）および
５’−ＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＣ−３’（配列番号６０；アンチセンス）
ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ７をクローン化した。段階２ないし段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃１５秒間；６０℃２０秒間；７２℃２分間；７２℃１０分間による５０μｌの反応中での増幅にアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．２５ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩビッグダイ ターミネーター［Ｂｉｇ ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キット（Ｐ．Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完全に配列決定した。配列番号１３を参照されたい。
ｇ．ｈＡＲＥ−５（配列番号５および６）
ｈＡＲＥ５特異的プライマー５’−ＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣ−３’配列番号６９（センス、開始コドンＡＴＧの５’）および５’−ＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’配列番号７０（アンチセンス、終止コドンＴＧＡの３’）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＡＲＥ−５をクローン化した。段階２ないし段階４が３５回反復された以下の周期、すなわち、９６℃、２分；９６℃、２０秒；５８℃、３０秒；７２℃、２分；および７２℃、１０分による増幅に、タックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００３８】
予測された大きさの１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号５）。
ｈ．ｈＡＲＥ−４（配列番号３および４）
ｈＡＲＥ−４特異的プライマー５’−ＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＣＣ−３’配列番号６７（センス、開始コドンＡＴＧの５’）および５’−ＧＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＧ−３’配列番号６８（アンチセンス、終止コドンＴＧＡの３’）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＡＲＥ−４をクローン化した。段階２ないし段階３が３５回反復された以下の周期、すなわち９４℃、３分；９４℃、３０秒；５９℃、２分；７２℃、１０分による増幅にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））および５％ＤＭＳＯを使用した。
【００３９】
予測された大きさの１．１２ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号３）。
ｉ．ｈＡＲＥ−３（配列番号１および２）
ｈＡＲＥ−３特異的プライマー５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔＣＣＡＴＣＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣ−３’配列番号６５（センス、小文字のヌクレオチドはＨｉｎｄＩＩＩのオーバーハングを表し、開始コドンとしてのＡＴＧ）および５’−ｇａｔｃａｇａｔｃｔＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣ−３’配列番号６６（アンチセンス、小文字のヌクレオチドはＸｂａＩのオーバーハングを表し、終止コドンとしてのＴＣＡ）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＡＲＥ−３をクローン化した。段階２ないし段階４が３５回反復された以下の周期、すなわち９４℃、３分；９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、２分；７２℃、１０分による増幅にタックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００４０】
予測された大きさの１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＲＣ／ＣＭＶ２ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位でクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号１）。
ｊ．ｈＲＵＰ３（配列番号７および８）
ｈＲＵＰ３特異的プライマー５’−ＧＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＴＧＧ−３’配列番号７１（センス、開始コドンとしてのＡＴＧ）および５’−ＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＣＣＧＴＣ−３’配列番号７２（アンチセンス、終止コドンＴＡＡの３’）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ３をクローン化した。段階２ないし段階４が３５回反復された以下の周期、すなわち９４℃、３分；９４℃、１分；５８℃、１分；７２℃、２分；７２℃、１０分による増幅にタックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００４１】
予測された大きさの１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼキット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号７）。
【００４２】
実施例２
受容体の発現
タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞を利用することが最も好ましい。これの主な理由は実地的なことに基づく。すなわち、例えばＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用は、可能な一方で、受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい（事実、酵母の場合は包含しない）非哺乳動物細胞、および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のうちＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞がとりわけ好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。開示されるＧＰＣＲの発現のための一般的手順は以下のとおりである。
【００４３】
第１日に、１５０ｍｍプレートあたり１×１０7個の２９３Ｔ細胞をプレート培養した。第２日に２本の反応チューブを準備することができる（各チューブについて後に続く比率はプレート１枚あたりである）。すなわち、チューブＡは、１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ（アーヴィンサイエンティフィック（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州アーヴィン）中に２０μｇのＤＮＡ（例えばｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクター、など）を混合することにより準備することができ；チューブＢは１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中に１２０μｌのリポフェクタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を混合することにより準備することができる。チューブＡおよびＢは反転（数回）により混合し、次いで室温で３０〜４５分間インキュベートする。混合状態を「トランスフェクション混合物」と称することができる。プレート培養された２９３Ｔ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭを添加する。その後、細胞に２．４ｍｌのトランスフェクション混合物を添加し、次いで３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベートすることができる。その後、トランスフェクション混合物を吸引により除去し、次いで２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加した。それから細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートすることができる。７２時間のインキュベーション後に、細胞をそれから収穫しかつ分析に利用することができる。
【００４４】
実施例３
開示されるヒトＧＰＣＲの組織分布
本明細書に開示されるＧＰＣＲの組織分布の測定にはいくつかのアプローチを使用することができる。
１．ドットブロット分析
商業的に入手可能なヒト組織のドットブロット形式を使用して、内在性オーファンＧＰＣＲが局在化されている領域の決定のため、こうした受容体をプロービングした。実施例１のＧＰＣＲからのｃＤＮＡフラグメント（放射標識された）をプローブとして使用したか、もしくは使用することができる。すなわち、製造元の説明書に従って、プライム−イットＩＩ［Ｐｒｉｍｅ−ＩｔＩＩ］（商標）ランダムプライマー標識キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、＃３００３８５）を使用する完全な受容体のｃＤＮＡ（ベクターから切り出された）を使用して、放射標識されたプローブを生成したか、もしくは生成することができる。製造元の説明書に従い、ヒトＲＮＡマスターブロット［ＭａｓｔｅｒＢｌｏｔ］（商標）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、＃７７７０−１）を内在性ヒトＧＰＣＲ放射標識プローブとハイブリダイズさせ、そしてストリンジェントな条件下で洗浄した。ブロットを−８０℃で一夜、コダック（Ｋｏｄａｋ）バイオマックス［ＢｉｏＭａｘ］（商標）オートラジオグラフィーフィルムに露光させた。数種の受容体についての結果を表ＢおよびＣに要約する（多様な組織およびそれらの位置を同定する格子についてはそれぞれ図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。ｈＣＨＮ３およびｈＣＨＮ８を使用して生じられた結果についての例示的ドットブロットを、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに提供する。
【００４５】
【表６】
【００４６】
【表７】
【００４７】
２．ＲＴ−ＰＣＲ
ａ．ｈＲＵＰ３
ｈＲＵＰ３のｍＲＮＡの組織分布を確かめるため、ｈＲＵＰ３特異的プライマーおよび鋳型としてのヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。４０μｌの反応中で以下の反応周期、すなわち９４℃２分間；９４℃１５秒間；５５℃３０秒間；７２℃１分間；７２℃、１０分間を使用するＰＣＲ反応にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を利用した。プライマーは以下のとおりであった：
５’−ＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６１；センス）
５’−ＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号６２；アンチセンス）。
【００４８】
反応の２０μｌを１％アガロースゲルに負荷し；結果を図３に示す。
【００４９】
図３のデータにより支持されるとおり、利用されたｃＤＮＡパネル中の１６のヒト組織（脳、結腸、心、腎、肺、卵巣、膵、胎盤、前立腺、骨格、小腸、脾、精巣、胸腺白血球および肝）のうち、単一のｈＲＵＰ３のバンドは膵からのみ明らかである。他のＧＰＣＲを用いるｈＲＵＰ３のタンパク質配列の付加的な比較分析は、ｈＲＵＰ３の内在性リガンドが小分子であることが予測されるような、小分子の内在性リガンドを有するＧＰＣＲにｈＲＵＰ３が関することを示唆する。
ｂ．ｈＲＵＰ４
プライマーとしてｈＲＵＰ４ オリゴ８および４、ならびに鋳型としてヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。周期２から４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃３０秒間、９４℃１０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間および７２℃５分間による４０μｌの反応中での増幅にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００５０】
２０μｌの反応を１％アガロースゲルに負荷してＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し、そして、ｈＲＵＰ４のｍＲＮＡは多くのヒト組織で発現されて見出され、心および腎で最も強い発現であった（図４を参照されたい）。ＰＣＲフラグメントの真正性を確認するために、ｈＲＵＰ４の５’端由来の３００ｂｐのフラグメントをサザンブロット分析のプローブとして使用した。該プローブは、プライム−イットＩＩ［Ｐｒｉｍｅ−ＩｔＩＩ］（商標）ランダムプライマー標識キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して32Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、そしてプローブクワント［ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ］（商標）Ｇ−５０微小カラム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して精製した。１２時間のプレハイブリダイゼーション後に４２℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。ブロットを最後に６５℃で０．１×ＳＳＣで洗浄した。サザンブロットは、該ＰＣＲフラグメントをｈＲＵＰ４として確認した。
ｃ．ｈＲＵＰ５
以下のｈＲＵＰ５特異的プライマー：
５’−ＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号６３；センス）
５’−ＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号６４；アンチセンス）
および、鋳型としてヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。以下の周期、すなわち９４℃３０秒間、９４℃１０秒間、６２℃１．５分間、７２℃５分間によりかつ周期２から３が３０回反復された４０μｌの反応中での増幅にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。２０μｌの反応を１．５％アガロースゲルに負荷してＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し、そしてｈＲＵＰ５のｍＲＮＡは末梢血白血球でのみ発現されて見出された（データは示されない）。
ｄ．ｈＲＵＰ６
ｈＲＵＰ６の発現を確認しかつその組織分布を決定するためにＲＴ−ＰＣＲを適用した。ＡＣ００５８７１およびＧＰＲ６６セグメントの整列に基づく、使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の配列：
５’−ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号７３；センス）
５’−ＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号７４；アンチセンス）
を有し、また、ヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を鋳型として使用した。以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４℃５秒間；６６℃４０秒間、７２℃２．５分間および７２℃７分間により４０μｌの反応中でタックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；製造説明書に従うことができる）を使用してＰＣＲを実施した。周期２から４を３０回反復した。
【００５１】
反応の２０μｌを１．２％アガロースゲルに負荷してＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し、そして、主として胸腺で、また、心、腎、肺、前立腺、小腸および精巣中でより少ない発現で、ｈＲＵＰ６を表す特異的な７６０ｂｐのＤＮＡフラグメントが発現された（図５を参照されたい）。
【００５２】
本特許文書で挙げられる特許、出願および印刷された刊行物のそれぞれはこれによりそっくりそのまま引用により組み込まれることが意図される。
【００５３】
当業者は、多数の変更および改変を、本発明の技術思想から離れることなく本発明の好ましい態様に対し行ってよいことを認識するであろう。全部のこうした変形物は本発明および後に続く請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【００５４】
多様なベクターが当業者に利用可能であるが、内在性および非内在性双方のヒトＧＰＣＲに対する利用の目的上、利用されるベクターはｐＣＭＶであることが最も好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ ＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙｆｏｒｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅＰｕｒｐｏｓｅ ｏｆＰａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の規定の下に、１９９８年１０月１３日にアメリカン タイプ カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，米国バージニア州マナサス２０１１０−２２０９）に寄託された。該ＤＮＡはＡＴＣＣにより試験され、そしてそうであることが決定された。ＡＴＣＣはｐＣＭＶに対し以下の寄託番号：ＡＴＣＣ＃２０３３５１を割り当てている。
【技術分野】
【０００１】
本特許文書は、以下の出願（全部は示された出願日に米国特許・商標庁（ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ ＴｒａｄｅｍａｒｋＯｆｆｉｃｅ）に米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．ＥｘｐｒｅｓｓＭａｉｌ）を介して出願された）、すなわち１９９８年１１月２０日に出願された米国仮出願第６０／１０９，２１３号の利益を主張する１９９９年２月２６日に出願された米国仮出願第６０／１２１，８５２号；１９９９年２月１６日に出願された米国仮出願第６０／１２０，４１６号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４６号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４９号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３６号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３９号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，５６７号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３７，１２７号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３７，１３１号；１９９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３７号からの優先権を主張する１９９９年６月２９日に出願された米国仮出願第１４１，４４８号；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＣＨＮ１０−１）；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／１５６，３３３号；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／１５６，５５５号；１９９９年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／１５６，６３４号；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＲＵＰ６−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＲＵＰ７−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＣＨＮ６−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＲＵＰ５−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナファーマシューティカルズインク（ＡｒｅｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定事項表番号ＣＨＮ９−１）のそれぞれの優先権の利益を主張する。本特許文書は、１９９８年１０月１３日に申請された米国第０９／１７０，４９６号、および１９９９年１０月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．ＥｘｐｒｅｓｓＭａｉｌ）を介して）出願された米国第（不明）号（ウッドコック（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ）ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）クルツ（Ｋｕｒｔｚ）マキエヴィッツ（Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒｒｉｓ）、ＬＬＰ処理予定事項表番号ＡＲＥＮ−００５４）（双方は引用により本明細書に組み込まれる）に関する。本特許文書は、１９９９年７月３０日に出願された米国第０９／３６４，４２５号（そっくりそのまま引用により組み込まれる）にもまた関する。本出願は、１９９９年１０月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．ＥｘｐｒｅｓｓＭａｉｌ）を介して）出願された米国第＿＿＿＿号（ウッドコック（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ）、ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）、クルツ（Ｋｕｒｔｚ）、マキエヴィッツ（Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒｒｉｓ）、ＬＬＰ処理予定事項表番号ＡＲＥＮ−００５０）（そっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる）に対する優先権もまた主張する。前述の出願のそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本特許文書に開示される発明は、膜貫通受容体、およびより具体的には内在性のオーファンヒトＧタンパク質共役型受容体（「ＧＰＣＲ」）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトでは多数の受容体のクラスが存在するが、はるかに最も豊富かつ治療に関係するものは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲもしくは複数のＧＰＣＲ）のクラスにより代表される。ヒトゲノム内には数十万個の遺伝子が存在することが推定されており、そしてこれらのなかでおよそ２％もしくは２，０００個の遺伝子がＧＰＣＲをコードすると推定されている。内在性リガンドが同定されている、ＧＰＣＲを包含する受容体は「既知」受容体と称される一方、内在性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受容体と称される。ＧＰＣＲは製薬学的製品の開発に重要な一領域を代表する。すなわち、１００種の既知のＧＰＣＲのおよそ２０種から全処方薬の６０％が開発されている。この卓越性は、とりわけＧＰＣＲの場合には単に意味論上でない。従って、オーファンＧＰＣＲは、製薬業界にとって、金が１９世紀後半のカリフォルニアにとって、成長、拡張、増強および開発の契機となったところのものである。
【０００４】
ＧＰＣＲは１つの共通の構造モチーフを共有する。全部のこれらの受容体は、７個のαヘリックスを形成する２２ないし２４個の間の疎水性アミノ酸の７個の連なりを有し、そのそれぞれは膜に広がっている（各広がり(span)は数字により同定されている。すなわち膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）など）。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外もしくは「細胞外」側で、膜貫通−２と膜貫通−３、膜貫通−４と膜貫通−５、および膜貫通−６と膜貫通−７の間でアミノ酸の鎖により結合されている（これらはそれぞれ「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）と称される）。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の内もしくは「細胞内」側で、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫通−４、および膜貫通−５と膜貫通−６の間でもまたアミノ酸の鎖により結合されている（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−２およびＩＣ−３）と称される）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空隙中に存し、また、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の外側の細胞外空隙中に存する。
【０００５】
一般に、内在性リガンドが受容体と結合する場合（しばしば受容体の「活性化」と称される）、細胞内領域のコンホメーションの変化が存在し、それは細胞内領域と細胞内の「Ｇタンパク質」との間の共役(coupling)を可能にする。ＧＰＣＲはＧタンパク質に関して「乱交性」であること、すなわちＧＰＣＲは１種以上のＧタンパク質と相互作用する可能性があることが報告されている。ケナキン、非特許文献１を参照されたい。他のＧタンパク質が存在するが、現在のところＧｑ、Ｇｓ、ＧｉおよびＧｏが同定されたＧタンパク質である。Ｇタンパク質との内在性リガンドで活性化されたＧＰＣＲの共役がシグナル伝達カスケード過程（「シグナル伝達」と称される）を開始する。正常な条件下では、シグナル伝達は最終的に細胞の活性化もしくは細胞の阻害をもたらす。受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられている。
【０００６】
ＧＰＣＲは、生理学的条件下では２種の異なるコンホメーション、すなわち「不活性」状態と「活性状態」との間の平衡で細胞膜中に存在する。不活性状態の受容体は、細胞内のシグナル伝達経路に連結して生物学的応答を生じさせることが不可能である。受容体のコンホメーションの活性状態への変化は（Ｇタンパク質を介する）伝達経路への連鎖を可能にし、そして生物学的応答を生じさせる。受容体は、内在性リガンドもしくは薬物のような化合物により活性状態で安定化させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．、４３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９５（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト内在性オーファンＧタンパク質共役型受容体を本明細書で開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 配列番号１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２） 配列番号２を含んで成る配列番号１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３） ベクターおよび配列番号１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４） 項目３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５） 配列番号３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６） 配列番号４を含んで成る配列番号３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７） ベクターおよび配列番号３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目８） 項目７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目９） 配列番号５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１０） 配列番号６を含んで成る配列番号５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１１） ベクターおよび配列番号５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目１２） 項目１１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１３） 配列番号７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１４） 配列番号８を含んで成る配列番号７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１５） ベクターおよび配列番号７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目１６） 項目１５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１７） 配列番号９を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１８） 配列番号１０を含んで成る配列番号９のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１９） ベクターおよび配列番号９のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目２０） 項目１９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２１） 配列番号１１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２２） 配列番号１２を含んで成る配列番号１１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２３） ベクターおよび配列番号１１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目２４） 項目２３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２５） 配列番号１３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２６） 配列番号１４を含んで成る配列番号１３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２７） ベクターおよび配列番号１３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目２８） 項目２７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２９） 配列番号１５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３０） 配列番号１６を含んで成る配列番号１５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３１） ベクターおよび配列番号１５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目３２） 項目３１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３３） 配列番号１７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３４） 配列番号１８を含んで成る配列番号１７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３５） ベクターおよび配列番号１７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目３６） 項目３５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３７） 配列番号１９を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３８） 配列番号２０を含んで成る配列番号１９のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３９） ベクターおよび配列番号１９のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４０） 項目３９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４１） 配列番号２１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４２） 配列番号２２を含んで成る配列番号２１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４３） ベクターおよび配列番号２１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４４） 項目４３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４５） 配列番号２３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４６） 配列番号２４を含んで成る配列番号２３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４７） ベクターおよび配列番号２３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目４８） 項目４７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４９） 配列番号２５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５０） 配列番号２６を含んで成る配列番号２５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５１） ベクターおよび配列番号２５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目５２） 項目５１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５３） 配列番号２７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５４） 配列番号２８を含んで成る配列番号２７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５５） ベクターおよび配列番号２７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目５６） 項目５５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５７） 配列番号２９を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５８） 配列番号３０を含んで成る配列番号２９のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５９） ベクターおよび配列番号２９のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目６０） 項目５９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６１） 配列番号３１を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６２） 配列番号３２を含んで成る配列番号３１のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６３） ベクターおよび配列番号３１のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目６４） 項目６３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６５） 配列番号３３を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６６） 配列番号３４を含んで成る配列番号３３のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６７） ベクターおよび配列番号３３のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目６８） 項目６７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６９） 配列番号３５を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７０） 配列番号３６を含んで成る配列番号３５のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７１） ベクターおよび配列番号３５のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目７２） 項目７１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目７３） 配列番号３７を含んで成るヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７４） 配列番号３８を含んで成る配列番号３７のｃＤＮＡによりコードされるヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７５） ベクターおよび配列番号３７のｃＤＮＡを含んで成るプラスミド。
（項目７６） 項目７５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
【００１０】
受容体を中核として発展してきた学術文献は、受容体に対する多様な影響を有するリガンドを指す多数の用語を採用している。明快さおよび一貫性のため、本特許文書を通じて以下の定義を使用するであろう。これらの定義がこれらの用語の他の定義と対立する限において、以下の定義が支配する：本明細書で使用されるアミノ酸の略語を表１に示す：
【００１１】
【表１】
【００１２】
組成物は最低１種の成分を含んで成る物質を意味する。
【００１３】
内在性は哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、そして制限でなく「受容体」という用語に関しての内在性は、哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒト）もしくはウイルスにより天然に産生されるものを意味する。対照的に、この情況における非内在性という用語は、哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒト）もしくはウイルスにより天然に産生されないものを意味する。
【００１４】
宿主細胞は、その中に組み込まれたプラスミドおよび／もしくはベクターを有することが可能な細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは宿主細胞が複製する際に自律的分子として典型的に複製され（一般に、プラスミドはその後真核生物宿主細胞への導入のため単離される）；真核生物宿主細胞の場合には、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように、プラスミドが宿主細胞の細胞ＤＮＡに組込まれる。好ましくは、本明細書に開示される本発明の目的上、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくは２９３、２９３ＴおよびＣＯＳ−７細胞より成る群から選択される。
【００１５】
リガンドは、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在する分子を意味する。
非オーファン受容体は、内在性の天然に存在するリガンドに特異的な内在性の天然に存在する分子を意味し、ここで、受容体へのリガンドの結合が細胞内シグナル伝達経路を活性化する。
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されていないかもしくは未知である内在性受容体を意味する。
【００１６】
プラスミドはベクターおよびｃＤＮＡの組み合わせを意味する。一般に、プラスミドは、ｃＤＮＡの複製および／もしくはタンパク質としてのその発現の目的上、宿主細胞に導入される。
ｃＤＮＡに関するベクターは、最低１個のｃＤＮＡを組み込むことが可能かつ宿主細胞への組込みが可能な環状ＤＮＡを意味する。
【００１７】
以下のセクションの順序は表象的な効率について示され、また、後に続く開示もしくは請求の範囲に対する制限として意図されず、またそのように解釈されるべきでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】発明にかかる、本明細書で提供されるある種のドットブロットの参照「格子」を提供する（それぞれ図２Ａおよび２Ｂもまた参照されたい）。
【図１Ｂ】発明にかかる、本明細書で提供されるある種のドットブロットの参照「格子」を提供する（それぞれ図２Ａおよび２Ｂもまた参照されたい）。
【図２】発明にかかる、それぞれｈＣＨＮ３およびｈＣＨＮ８から生じるある種のドットブロット分析の結果の再現を提供する（それぞれ図１Ａおよび１Ｂもまた参照されたい）。
【図３】発明にかかる、ｈＲＵＰ３のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の再現を提供する。
【図４】発明にかかる、ｈＲＵＰ４のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の再現を提供する。
【図５】発明にかかる、ｈＲＵＰ６のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の再現を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力は、ヒトゲノム内に配置されている核酸配列に関する夥しい量の情報の同定をもたらし；それは、この努力によって、いずれかの特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するかも知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴うことなく、遺伝子配列情報が利用可能にされているというのが実情である。ヒトゲノム内の核酸配列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、本明細書で開示される多様なＧＰＣＲは、ジェンバンク［ＧｅｎＢａｎｋ］（商標）データベースを再検討することにより発見された一方、他のＧＰＣＲは、既に配列決定されたＧＰＣＲの核酸配列を利用してＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ（商標）検索を実施することにより発見された。下の表Ａは、ＧＰＣＲのそれぞれの相同なＧＰＣＲと一緒に、開示される内在性のオーファンＧＰＣＲを列挙する。
【００２０】
【表２】
【００２１】
受容体の相同性は、人体内での開示される受容体の役割の正しい認識を得ることに関して有用である。加えて、こうした相同性は、開示されるオーファンＧＰＣＲの天然の活性化物質であることができる可能な内在性リガンド（１種もしくは複数）に関しての洞察を提供する可能性がある。
Ｂ．受容体スクリーニング
受容体の伝統的研究は、アンタゴニストおよび受容体に影響を及ぼす可能性のある他の分子を見出すように発見を進行させることができる前に内在性リガンドを最初に同定しなければならないという演繹的過程（歴史的に基づく）から常に進行したため、内在性リガンドの同定（これは主として受容体の内在性リガンドを必要とする受容体結合アッセイの実施の一手段を提供するという目的上）のための技術は過去数年のあいだにより容易に利用可能になった。最初にアンタゴニストが知られているかも知れない場合でさえ、探索は内在性リガンドを探すように直ちに拡大した。この思考様式は、構成的に活性化される受容体の発見後でさえも受容体の研究に存続している。これまで認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび反作用薬を発見するのに最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患にとって、治療薬で望ましいものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬物ではなく、それぞれ受容体の活性状態を減少させるかもしくは受容体の活性を高めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させるもしくは高める化合物は内在性リガンドと同一部位で結合する必要がないためである。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物についてのいかなる探索もリガンド非依存的な活性状態に対する化合物のスクリーニングにより開始すべきである。
【００２２】
当該技術分野で既知であるとおり、ＧＰＣＲはそれへの受容体の内在性リガンドの結合を伴わなくてもそれらの内在性の状態で「活性」であることができる。こうした天然に活性の受容体を、とりわけ反作用薬の直接同定のために（すなわち受容体の内在性リガンドを必要とせずに）スクリーニングすることができる。あるいは、例えば受容体の内在性リガンドの非存在下で活性である非内在性バージョンの受容体を確立するための受容体の突然変異を介して受容体を「活性化する」ことができる。
【００２３】
本明細書に開示される、内在性のもしくは非内在性の構成的に活性化されるバージョンのヒトオーファンＧＰＣＲに対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内在性リガンドの使用を必要とすることなく、この細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接の同定を提供することができる。本明細書に開示される内在性のバージョンのヒトＧＰＣＲが発現および／もしくは過剰発現されている身体内の領域を決定することにより、受容体の発現および／もしくは過剰発現を伴う関連疾患／障害状態を決定することが可能であり；こうした一アプローチを本特許文書で開示する。
【００２４】
本明細書に開示されるヒトオーファンＧＰＣＲの構成的活性化を明示するかも知れない突然変異の創製に関して、ＧＰＣＲのＴＭ６内（典型的にはＴＭ６／ＩＣ３界面に近づく）に配置されると想定されているプロリン残基からの距離に基づく（こうしたプロリン残基は極めて保存されているようである）。この残基から１６アミノ酸残基に配置されるアミノ酸残基（おそらく受容体のＩＣ３領域中に配置される）を最も好ましくはリシン残基に突然変異することにより、こうした活性化を得ることができる。この目的を達成するためにはこの位置の突然変異で他のアミノ酸残基が有用であるかも知れない。
Ｃ．疾患／障害の同定および／もしくは選択
好ましくは、（ａ）組織ｍＲＮＡに対するドットブロット分析、および／もしくは（ｂ）組織サンプル中の受容体の発現のＲＴ−ＰＣＲ同定のためのプローブを作成するのにヒトオーファンＧＰＣＲのＤＮＡ配列を使用することができる。組織供給源、もしくは疾患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ましく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。
Ｄ．候補化合物のスクリーニング
１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
Ｇタンパク質受容体が構成的に活性（すなわちそれに結合する内在性リガンドの非存在下で活性）になった場合、それはＧタンパク質（例えばＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ）に結合しかつＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。その後、Ｇタンパク質がＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常な条件下で失活型になる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニターするのに、ＧＴＰの加水分解不可能な類似物［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用することができる。［35Ｓ］ＧＴＰγＳはリガンドの不存在下および存在下での膜へのＧタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告されている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は、１９９５年にトレイノル（Ｔｒａｙｎｏｒ）とナホルスキ（Ｎａｈｏｒｓｋｉ）により報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に関係なく、全部のＧタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能であるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
「包括的」Ｇタンパク質共役型受容体アッセイ（すなわちアゴニスト、部分的アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイ）を使用して候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わりに細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「分離する」かも知れない。
ａ．ＧｓおよびＧｉ
Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（およびＧｏ）はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの転化を触媒し；従って、Ｇｓタンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの増大された細胞レベルと関連する。他方、Ｇｉ（もしくはＧｏ）タンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低下された細胞レベルと関連する。一般に、“ＩｎｄｉｒｅｃｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＳｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．）ら編 サイナウアアソシエーツインク（ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９９２）を参照されたい。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬（すなわちこうした化合物はｃＡＭＰのレベルを低下させることができる）であるかどうかを決定することができる。ｃＡＭＰを測定するための当該技術分野で既知の多様なアプローチを利用することができ；最も好ましいアプローチはＥＬＩＳＡに基づく形式での抗ｃＡＭＰ抗体の使用に頼る。利用することができる別の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。環状ＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性のＤＮＡ結合タンパク質もしくは転写因子（ＣＲＥＢ）（その後ｃＡＭＰ応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそして遺伝子の発現を駆動する）の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ）の前に複数のｃＡＭＰ応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたＧｓに結合された受容体は、ｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら１９９５）。
ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、この酵素は順にリン脂質ＰＩＰ2を加水分解して、２種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）を放出する。ＩＰ3の増大された蓄積はＧｑおよびＧｏ会合型受容体の活性化と関連する。一般に、“ＩｎｄｉｒｅｃｔＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．）ら編サイナウアアソシエーツ インク（ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９９２）を参照されたい。ＩＰ3の蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が例えばＧｑもしくはＧｏ会合型受容体に対する反作用薬である（すなわちこうした化合物はＩＰ3のレベルを低下させることができる）かどうかを決定することができる。Ｇｑ会合型受容体はＡＰ１レポーターアッセイ（ここでＧｑ依存性のホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こす）を使用してもまた検査することができ；従って、活性化されたＧｑ会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それにより、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングのための内在性の構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲもしくは非内在性の構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲの使用は興味深い挑戦を提供し、ここでは定義によりそれに結合される内在性リガンドの不存在下でさえ該受容体は活性である。従って、活性化された受容体により得られるシグナルを高めることが可能であるアプローチを利用することがしばしば有用である。好ましい一アプローチはＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【００２５】
一般に、ＧＰＣＲが上で示されたアッセイ技術（ならびに他者）を使用して構成的に活性化される、もしくはされていることが決定されれば、内在性ＧＰＣＲと共役する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の共役は評価することが可能なシグナル伝達経路を提供する。哺乳動物発現系の使用によりスクリーニングが起こることが最も好ましいため、こうした系はその中に内在性Ｇタンパク質を有することが期待されよう。従って、定義により、こうした系においては、構成的に活性化されたオーファンＧＰＣＲが連続的にシグナルを発するであろう。この点に関して、例えば受容体に対する反作用薬の存在下で、とりわけスクリーニングの情況でそれが反作用薬と接触される場合にそれが受容体をより容易に識別することが可能であろうことがよりありそうであるように、このシグナルを高めることが好ましい。
【００２６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質の効力を高めることを意図している。ＧＰＣＲ融合タンパク質は非内在性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを用いるスクリーニングに好ましい。なぜなら、こうしたアプローチは、こうしたスクリーニング技術で最も好ましく利用されるシグナルを増大させるからであるが、とは言えＧＰＣＲ融合タンパク質は内在性の構成的に活性化されたＧＰＣＲとともに使用することもまた可能であり、そして好ましくは使用する。これは大きな「Ｓ／Ｎ」比の助長で重要であり；こうした大きな比は本明細書で開示されるような候補化合物のスクリーニングに重要かつ好ましい。
【００２７】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は当業者の範囲内にある。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系が、研究者の特定のニーズに合う可能性のある多様なアプローチを提供する。こうしたＧＰＣＲ融合タンパク質構築物に対する重要な基準は、ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の双方が同じ読み枠にある（好ましくはＧＰＣＲの配列がＧタンパク質の配列の上流にある）こと、および、ＧＰＣＲの発現に際してＧタンパク質もまた発現することが可能であるようにＧＰＣＲの「終止」コドンを欠失もしくは置き換えなくてはならないことである。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接連結することができるか、もしくは２者の間にスペーサー残基（好ましくは約１２を越えないが、この数字は当業者により容易に確かめることが可能である）が存在することができる。われわれは、使用されないいくつかの制限部位が発現に際して効果的にスペーサーとなるであろうことに、スペーサーの使用の（便宜性に基づく）好みを有する。最も好ましくは、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の創製に先立ちＧＰＣＲに共役するＧタンパク質を同定することができる。同定された数種のみのＧタンパク質が存在するため、その中の内在性のＧＰＣＲ配列の挿入にＧタンパク質の配列を含んで成る構築物（すなわち普遍的Ｇタンパク質構築物）が利用可能であることが好ましく；これは、異なる配列を有する多様な異なった内在性ＧＰＣＲの大スケールのスクリーニングの情況で効率を提供する。
Ｅ．他の利用性
本明細書に開示されるヒトオーファンＧＰＣＲの好ましい使用は、（好ましくは製薬学的作用物質としての使用のための）反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接同定のためであることができるが、これらのバージョンのヒトＧＰＣＲは研究の設定でもまた利用することができる。例えば、ＧＰＣＲを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解（それがシグナル伝達カスケードの理解に適用されるため）に利用することができる。ヒトオーファンＧＰＣＲの価値は、身体内でのこうした受容体の位置（１種もしくは複数）を決定することにより、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容体の役割を理解するのにＧＰＣＲを使用することができることにおいて、研究ツールとしてのその利用性が高められることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許文書の検討に基づき当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例は本発明の解明の目的上（そして制限でなく）提示する。特定の核酸およびアミノ酸の配列が本明細書で開示される一方、当業者は、下に報告される同一のもしくは実質的に類似の結果を達成しつつこれらの配列に対する小さな改変を行う能力があると信じられる。下に別の方法で示されない限り、開示される内在性オーファンヒトＧＰＣＲの全部の核酸配列は配列決定しかつ確認している。同等の受容体の目的上、当業者は、機能的に同等な受容体を得るために開示された配列に対し保存的置換を行うことができることを容易に認識するであろう。
【００２９】
実施例１
内在性のヒトＧＰＣＲ
１．ヒトＧＰＣＲの同定
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース情報の再検討に基づき、開示された内在性ヒトＧＰＣＲのいくつかを同定した。データベースを検索する間に以下のｃＤＮＡクローンを下に明示されるとおり同定した。
【００３０】
【表３】
【００３１】
他の開示される内在性ヒトＧＰＣＲは、以下のＥＳＴクローンをクエリ配列として使用するＥＳＴデータベース（ｄｂｅｓｔ）のＢＬＡＳＴ検索を実施することにより同定した。その後、同定された以下のＥＳＴクローンをプローブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【００３２】
【表４】
【００３３】
２．完全長のクローニング
ａ．ｈＧ２Ａ（配列番号２３および２４）
マウスＥＳＴクローン１１７９４２６を使用して、３種のアミノ酸ｈＧ２Ａコーディング配列以外の全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディング配列の５’端は５’ＲＡＣＥ（商標）を使用することにより得、また、ＰＣＲのための鋳型はクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のヒト脾マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡであった。開示されるヒトＧ２Ａは、以下：
５’−ＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号３９；１回目のＰＣＲ）
５’−ＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号４０；２回目のＰＣＲ）
のような配列番号３９および配列番号４０に示されるような第一回および第二回のＰＣＲのためのＧ２ＡのｃＤＮＡに特異的なプライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、９４℃３０秒間、次いで９４℃５秒間および７２℃４分間の５周期；ならびに９４°５秒間および７０°４分間の３０周期で、アドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ＧＣポリメラーゼキット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；製造説明書に従うことができる）を使用して実施した。およそ１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。Ｔ７シークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（ＵＳＢアマーシャム（ＵＳＢＡｍｅｒｓｈａｍ）；製造元の説明書に従うことができる）を使用してクローン化された挿入物を配列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。Ｐ32標識されたフラグメントを用いてＲＮＡドットブロット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；製造元の説明書に従うことができる）をプロービングすることによりヒトＧ２Ａの発現を検出することができる。
ｂ．ｈＣＨＮ９（配列番号３３および３４）
ＥＳＴクローン１５４１５３６の配列決定は、ｈＣＨＮ９が１個の開始コドンのみを有する（すなわち終止コドンは欠けていた）部分的ｃＤＮＡクローンであることを示した。ｈＣＨＮ９をデータベース（ｎｒ）に対して「ＢＬＡＳＴ検索する(blast)」のに使用した場合、ｈＣＨＮ９の３’の配列はロイコトリエンＢ４受容体のｃＤＮＡの５’非翻訳領域（ｈＣＨＮ９のコーディング配列と同じ読み枠に終止コドンを含有した）に１００％相同であった。ＬＴＢ４ＲのｃＤＮＡの５’非翻訳領域がｈＣＨＮ９の３’配列であったかどうかを決定するために、ｈＣＨＮ９に見出される開始コドンに隣接する５’配列およびＬＴＢ４Ｒの５’非翻訳領域に見出される終止コドンを取り巻く３’配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを実施した。利用された５’プライマー配列は以下のとおりであった：
５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号４１；センス）および
５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号４２；アンチセンス）
製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺ｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。周期条件は、９４℃１分間、６５℃１分間ならびに７２℃１分および１０秒間の３０周期であった。予測された大きさと一致する１．１ｋｂのフラグメントをＰＣＲから得た。本ＰＣＲフラグメントをｐＣＭＶにサブクローニングし（下を参照されたい）そして配列決定した（配列番号３３を参照されたい）。
ｃ．ｈＲＵＰ４（配列番号３７および３８） 鋳型としてヒト脳ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いるＲＴ−ＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ４をクローン化した：
５’−ＴＣＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号４３；センス）および
５’−ＴＧＣＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４４；アンチセンス）。
以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃３０秒間；５５℃３０秒間、７２℃４５秒間および７２℃１０分間により、タックプラス［ＴａｑＰｌｕｓ］（商標）プレシジョン
［Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；製造説明書に従うことができる）を使用してＰＣＲを実施した。周期２から４を３０回反復した。
【００３４】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、そして５００ｂｐのＰＣＲフラグメントを単離しかつｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））およびＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して配列決定した。配列分析は、該ＰＣＲフラグメントが実際に、他のＧＰＣＲとの類似性をもつ１個の連続的読取り枠を有する代替スプライシングされた形態のＡＩ３０７６５８であったことを示した。このＰＣＲフラグメントの完了された配列は以下のとおりであった：
【００３５】
【表５】
【００３６】
上の配列に基づき、２種のセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４６；オリゴ１）、
５’−ＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号４７；オリゴ２）
および、２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡ−３’（配列番号４８；オリゴ３）５’−ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４９；オリゴ４）
を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４００−１）を用いる３’−および５’−ｒａｃｅＰＣＲに使用した。ＲＡＣＥＰＣＲにより生成されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））および数種の内的プライマーを使用して配列決定した。３’ＲＡＣＥ産物はポリ（Ａ）テール(tail)およびＴＡＡ終止コドンで終了する１個の完了される読取り枠を含有した。５’ＲＡＣＥ産物は不完全な５’端を含有した（すなわちＡＴＧ開始コドンが存在しなかった）。
【００３７】
新たな５’配列に基づき、オリゴ３および以下のプライマー：
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号５０；オリゴ５）を第２回の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲに使用し、そしてＰＣＲ産物を上のとおり分析した。第３回の５’ＲＡＣＥＰＣＲは、アンチセンスプライマー：
５’−ＴＧＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５１；オリゴ６）および
５’−ＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−３’（配列番号５２；オリゴ７）
を利用して実施した。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲの産物の配列は開始コドンＡＴＧの存在を示し、また、さらなる回の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲはいかなるそれ以上の５’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣ−３’（配列番号５３；オリゴ８）
およびオリゴ４を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳型（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成された６５０ｂｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された５’配列を確認した。オリゴ２および以下のアンチセンスプライマー：
５’−ＴＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号５４；オリゴ９）
を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳型（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成された６７０ｂｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された３’配列を確認した。
ｄ．ｈＲＵＰ５（配列番号９および１０）
以下の配列：
５’−ＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号５５）
５’−ＴＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号５６）
を有した、ＡＴＧ開始コドンから上流のセンスプライマー（配列番号５５）、および終止コドンとしてＴＣＡを含有するアンチセンスプライマー（配列番号５６）、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ５をクローン化した。段階２から段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４℃１５秒間；６９℃４０秒間；７２℃３分間；および７２℃６分間による５０μｌの反応中での増幅にアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．４ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した。配列番号９を参照されたい。
ｅ．ｈＲＵＰ６（配列番号１１および１２）
プライマー：
５’−ＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号５７）および
５’−ＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号５８）
ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ６をクローン化した。以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４℃５秒間；６６℃４０秒間；７２℃２．５秒間および７２℃７分間による５０μｌの反応中での増幅にアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、製造元の説明書に従う）を使用した。周期２から４を３０回反復した。１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩビッグダイターミネーター［Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キット（Ｐ．Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号１１を参照されたい）。
ｆ．ｈＲＵＰ７（配列番号１３および１４）
プライマー：
５’−ＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＣ−３’（配列番号５９；センス）および
５’−ＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＣ−３’（配列番号６０；アンチセンス）
ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ７をクローン化した。段階２ないし段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃１５秒間；６０℃２０秒間；７２℃２分間；７２℃１０分間による５０μｌの反応中での増幅にアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．２５ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩビッグダイ ターミネーター［Ｂｉｇ ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キット（Ｐ．Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完全に配列決定した。配列番号１３を参照されたい。
ｇ．ｈＡＲＥ−５（配列番号５および６）
ｈＡＲＥ５特異的プライマー５’−ＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣ−３’配列番号６９（センス、開始コドンＡＴＧの５’）および５’−ＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’配列番号７０（アンチセンス、終止コドンＴＧＡの３’）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＡＲＥ−５をクローン化した。段階２ないし段階４が３５回反復された以下の周期、すなわち、９６℃、２分；９６℃、２０秒；５８℃、３０秒；７２℃、２分；および７２℃、１０分による増幅に、タックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００３８】
予測された大きさの１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号５）。
ｈ．ｈＡＲＥ−４（配列番号３および４）
ｈＡＲＥ−４特異的プライマー５’−ＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＣＣ−３’配列番号６７（センス、開始コドンＡＴＧの５’）および５’−ＧＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＧ−３’配列番号６８（アンチセンス、終止コドンＴＧＡの３’）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＡＲＥ−４をクローン化した。段階２ないし段階３が３５回反復された以下の周期、すなわち９４℃、３分；９４℃、３０秒；５９℃、２分；７２℃、１０分による増幅にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））および５％ＤＭＳＯを使用した。
【００３９】
予測された大きさの１．１２ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号３）。
ｉ．ｈＡＲＥ−３（配列番号１および２）
ｈＡＲＥ−３特異的プライマー５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔＣＣＡＴＣＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣ−３’配列番号６５（センス、小文字のヌクレオチドはＨｉｎｄＩＩＩのオーバーハングを表し、開始コドンとしてのＡＴＧ）および５’−ｇａｔｃａｇａｔｃｔＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣ−３’配列番号６６（アンチセンス、小文字のヌクレオチドはＸｂａＩのオーバーハングを表し、終止コドンとしてのＴＣＡ）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＡＲＥ−３をクローン化した。段階２ないし段階４が３５回反復された以下の周期、すなわち９４℃、３分；９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、２分；７２℃、１０分による増幅にタックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００４０】
予測された大きさの１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＲＣ／ＣＭＶ２ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位でクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号１）。
ｊ．ｈＲＵＰ３（配列番号７および８）
ｈＲＵＰ３特異的プライマー５’−ＧＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＴＧＧ−３’配列番号７１（センス、開始コドンとしてのＡＴＧ）および５’−ＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＣＣＧＴＣ−３’配列番号７２（アンチセンス、終止コドンＴＡＡの３’）、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより完全長のｈＲＵＰ３をクローン化した。段階２ないし段階４が３５回反復された以下の周期、すなわち９４℃、３分；９４℃、１分；５８℃、１分；７２℃、２分；７２℃、１０分による増幅にタックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００４１】
予測された大きさの１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ＤＮＡシークェナーゼキット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した（配列番号７）。
【００４２】
実施例２
受容体の発現
タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞を利用することが最も好ましい。これの主な理由は実地的なことに基づく。すなわち、例えばＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用は、可能な一方で、受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい（事実、酵母の場合は包含しない）非哺乳動物細胞、および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のうちＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞がとりわけ好ましいが、利用される特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。開示されるＧＰＣＲの発現のための一般的手順は以下のとおりである。
【００４３】
第１日に、１５０ｍｍプレートあたり１×１０7個の２９３Ｔ細胞をプレート培養した。第２日に２本の反応チューブを準備することができる（各チューブについて後に続く比率はプレート１枚あたりである）。すなわち、チューブＡは、１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ（アーヴィンサイエンティフィック（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州アーヴィン）中に２０μｇのＤＮＡ（例えばｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクター、など）を混合することにより準備することができ；チューブＢは１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ中に１２０μｌのリポフェクタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を混合することにより準備することができる。チューブＡおよびＢは反転（数回）により混合し、次いで室温で３０〜４５分間インキュベートする。混合状態を「トランスフェクション混合物」と称することができる。プレート培養された２９３Ｔ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭを添加する。その後、細胞に２．４ｍｌのトランスフェクション混合物を添加し、次いで３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベートすることができる。その後、トランスフェクション混合物を吸引により除去し、次いで２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加した。それから細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートすることができる。７２時間のインキュベーション後に、細胞をそれから収穫しかつ分析に利用することができる。
【００４４】
実施例３
開示されるヒトＧＰＣＲの組織分布
本明細書に開示されるＧＰＣＲの組織分布の測定にはいくつかのアプローチを使用することができる。
１．ドットブロット分析
商業的に入手可能なヒト組織のドットブロット形式を使用して、内在性オーファンＧＰＣＲが局在化されている領域の決定のため、こうした受容体をプロービングした。実施例１のＧＰＣＲからのｃＤＮＡフラグメント（放射標識された）をプローブとして使用したか、もしくは使用することができる。すなわち、製造元の説明書に従って、プライム−イットＩＩ［Ｐｒｉｍｅ−ＩｔＩＩ］（商標）ランダムプライマー標識キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、＃３００３８５）を使用する完全な受容体のｃＤＮＡ（ベクターから切り出された）を使用して、放射標識されたプローブを生成したか、もしくは生成することができる。製造元の説明書に従い、ヒトＲＮＡマスターブロット［ＭａｓｔｅｒＢｌｏｔ］（商標）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、＃７７７０−１）を内在性ヒトＧＰＣＲ放射標識プローブとハイブリダイズさせ、そしてストリンジェントな条件下で洗浄した。ブロットを−８０℃で一夜、コダック（Ｋｏｄａｋ）バイオマックス［ＢｉｏＭａｘ］（商標）オートラジオグラフィーフィルムに露光させた。数種の受容体についての結果を表ＢおよびＣに要約する（多様な組織およびそれらの位置を同定する格子についてはそれぞれ図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。ｈＣＨＮ３およびｈＣＨＮ８を使用して生じられた結果についての例示的ドットブロットを、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに提供する。
【００４５】
【表６】
【００４６】
【表７】
【００４７】
２．ＲＴ−ＰＣＲ
ａ．ｈＲＵＰ３
ｈＲＵＰ３のｍＲＮＡの組織分布を確かめるため、ｈＲＵＰ３特異的プライマーおよび鋳型としてのヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。４０μｌの反応中で以下の反応周期、すなわち９４℃２分間；９４℃１５秒間；５５℃３０秒間；７２℃１分間；７２℃、１０分間を使用するＰＣＲ反応にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を利用した。プライマーは以下のとおりであった：
５’−ＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６１；センス）
５’−ＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号６２；アンチセンス）。
【００４８】
反応の２０μｌを１％アガロースゲルに負荷し；結果を図３に示す。
【００４９】
図３のデータにより支持されるとおり、利用されたｃＤＮＡパネル中の１６のヒト組織（脳、結腸、心、腎、肺、卵巣、膵、胎盤、前立腺、骨格、小腸、脾、精巣、胸腺白血球および肝）のうち、単一のｈＲＵＰ３のバンドは膵からのみ明らかである。他のＧＰＣＲを用いるｈＲＵＰ３のタンパク質配列の付加的な比較分析は、ｈＲＵＰ３の内在性リガンドが小分子であることが予測されるような、小分子の内在性リガンドを有するＧＰＣＲにｈＲＵＰ３が関することを示唆する。
ｂ．ｈＲＵＰ４
プライマーとしてｈＲＵＰ４ オリゴ８および４、ならびに鋳型としてヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。周期２から４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃３０秒間、９４℃１０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間および７２℃５分間による４０μｌの反応中での増幅にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。
【００５０】
２０μｌの反応を１％アガロースゲルに負荷してＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し、そして、ｈＲＵＰ４のｍＲＮＡは多くのヒト組織で発現されて見出され、心および腎で最も強い発現であった（図４を参照されたい）。ＰＣＲフラグメントの真正性を確認するために、ｈＲＵＰ４の５’端由来の３００ｂｐのフラグメントをサザンブロット分析のプローブとして使用した。該プローブは、プライム−イットＩＩ［Ｐｒｉｍｅ−ＩｔＩＩ］（商標）ランダムプライマー標識キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して32Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、そしてプローブクワント［ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ］（商標）Ｇ−５０微小カラム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して精製した。１２時間のプレハイブリダイゼーション後に４２℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。ブロットを最後に６５℃で０．１×ＳＳＣで洗浄した。サザンブロットは、該ＰＣＲフラグメントをｈＲＵＰ４として確認した。
ｃ．ｈＲＵＰ５
以下のｈＲＵＰ５特異的プライマー：
５’−ＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号６３；センス）
５’−ＡＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号６４；アンチセンス）
および、鋳型としてヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。以下の周期、すなわち９４℃３０秒間、９４℃１０秒間、６２℃１．５分間、７２℃５分間によりかつ周期２から３が３０回反復された４０μｌの反応中での増幅にタック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用した。２０μｌの反応を１．５％アガロースゲルに負荷してＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し、そしてｈＲＵＰ５のｍＲＮＡは末梢血白血球でのみ発現されて見出された（データは示されない）。
ｄ．ｈＲＵＰ６
ｈＲＵＰ６の発現を確認しかつその組織分布を決定するためにＲＴ−ＰＣＲを適用した。ＡＣ００５８７１およびＧＰＲ６６セグメントの整列に基づく、使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の配列：
５’−ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号７３；センス）
５’−ＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号７４；アンチセンス）
を有し、また、ヒト多組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を鋳型として使用した。以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４℃５秒間；６６℃４０秒間、７２℃２．５分間および７２℃７分間により４０μｌの反応中でタックプラスプレシジョン［ＴａｑＰｌｕｓＰｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；製造説明書に従うことができる）を使用してＰＣＲを実施した。周期２から４を３０回反復した。
【００５１】
反応の２０μｌを１．２％アガロースゲルに負荷してＲＴ−ＰＣＲ産物を分析し、そして、主として胸腺で、また、心、腎、肺、前立腺、小腸および精巣中でより少ない発現で、ｈＲＵＰ６を表す特異的な７６０ｂｐのＤＮＡフラグメントが発現された（図５を参照されたい）。
【００５２】
本特許文書で挙げられる特許、出願および印刷された刊行物のそれぞれはこれによりそっくりそのまま引用により組み込まれることが意図される。
【００５３】
当業者は、多数の変更および改変を、本発明の技術思想から離れることなく本発明の好ましい態様に対し行ってよいことを認識するであろう。全部のこうした変形物は本発明および後に続く請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【００５４】
多様なベクターが当業者に利用可能であるが、内在性および非内在性双方のヒトＧＰＣＲに対する利用の目的上、利用されるベクターはｐＣＭＶであることが最も好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ ＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙｆｏｒｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅＰｕｒｐｏｓｅ ｏｆＰａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の規定の下に、１９９８年１０月１３日にアメリカン タイプ カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，米国バージニア州マナサス２０１１０−２２０９）に寄託された。該ＤＮＡはＡＴＣＣにより試験され、そしてそうであることが決定された。ＡＴＣＣはｐＣＭＶに対し以下の寄託番号：ＡＴＣＣ＃２０３３５１を割り当てている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
出願当初明細書に記載されるＧタンパク質共役型受容体ポリペプチドを用いる治療方法。
【請求項１】
出願当初明細書に記載されるＧタンパク質共役型受容体ポリペプチドを用いる治療方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−２９８７９１（Ｐ２００９−２９８７９１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５９３３９（Ｐ２００９−１５９３３９）
【出願日】平成２１年７月３日（２００９．７．３）
【分割の表示】特願２００７−１２９９２３（Ｐ２００７−１２９９２３）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１３日（１９９９．１０．１３）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３日（２００９．７．３）
【分割の表示】特願２００７−１２９９２３（Ｐ２００７−１２９９２３）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１３日（１９９９．１０．１３）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
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