ヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法
【課題】日本人のｍｔＤＮＡを主要なハプログループに分類できる迅速なｍｔＳＮＰｓ検出方法を提供すること、及びその方法を用いて各種疾患の遺伝的危険度を予測する遺伝子検出方法等を提供すること。
【解決手段】ミトコンドリアゲノムのコード領域における２０数個の多型に関する遺伝子型を決定することにより、日本人のミトコンドリアゲノムを１０個〜１２個の代表的なハプログループに分類する方法。ＭＳ、２型糖尿病、アテローム血栓性脳梗塞、心筋梗塞に関連するハプログループを同定することができる。
【解決手段】ミトコンドリアゲノムのコード領域における２０数個の多型に関する遺伝子型を決定することにより、日本人のミトコンドリアゲノムを１０個〜１２個の代表的なハプログループに分類する方法。ＭＳ、２型糖尿病、アテローム血栓性脳梗塞、心筋梗塞に関連するハプログループを同定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法、及びそのためのキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアゲノムにおける母系遺伝的な変異は、過去２０万年の間にホモサピエンスがアフリカからアジアへそしてヨーロッパへと拡散する間に、新らたな突然変異がそれに順次追加されて来た結果である（非特許文献１）。ミトコンドリアゲノムの突然変異の発生率は、核ゲノムの突然変異の発生率よりも約１０倍高いので、ホモサピエンスの比較的短い歴史の間に蓄積されて来た古代のミトコンドリア多型は、現代人の代謝特性の解明に貢献する可能性がある（非特許文献２）。世界の様々な地域で発見されたミトコンドリアのハプログループは、人類が寒冷な気候とその下での栄養条件に適応的に選択されて来た結果であると推測することができる（非特許文献２〜非特許文献４）。
【０００３】
ミトコンドリアハプログループ間で機能的な差が存在する事を示す証拠が、精子運動性（非特許文献５）、敗血症後の生存率（非特許文献６）、及びパーキンソン病に対する感受性（非特許文献７）の研究によって与えられている。初期の研究では、我々は、肥満（非特許文献１１）、るい痩（非特許文献１２）、２型糖尿病（非特許文献１１）、或いはアテローム性動脈硬化症といったエネルギー代謝に関与するものと同じく、例えば寿命（非特許文献８）、パーキンソン病（非特許文献９、１０）及びアルツハイマー病といった年齢関連疾患に関与するミトコンドリア単一ヌクレオチド多型（ｍｔＳＮＰｓ）を同定することを目標としていた。
【０００４】
この目的のために、我々は７つの異なる集団に属する６７２名分の完全ミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定した。各集団はおのおの９６名から構成され、百寿者、パーキンソン病罹患者、アルツハイマー病罹患者、肥満者、非肥満者、重度の血管性病変を持つ２型糖尿病、血管性病変を持たない２型糖尿病罹患者の７群であった。
これらの調査結果から、我々は、ヒトのミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）を構築した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記ｍｔＳＮＰデータを活用するための遺伝子検出法として、適当なものが開発されていなかったために、これらのデータを十分に生かし切ることができなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ｍｔＤＮＡの多型（ｍｔＳＮＰ）を効果的に検出するための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、長年に亘ってヒトミトコンドリアゲノムに関する研究を行っている者である。ヒトミトコンドリアＤＮＡは、連鎖した複数のｍｔＳＮＰを有するハプログループに分類することができる。図３〜図５には、ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示した。このハプログループの分布は、人種間において、かなり大きな隔たりがある。個々の日本人は、主要な１０個〜１２個のハプログループによって、そのほとんど（約９０パーセント以上）を分類することができる。各ハプログループは、数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰによって特徴付けられる。例えば、ハプログループＦは、８７０１、９５４０、１０３９８、１０８７３、１５３０１、１６５１９、１２７０５、１６２２３、１６１８３、１６５１９、３９７０、１３９２８、１６３０４、２４８、６３９２、１０３１０等の位置にｍｔＳＮＰを有している（その他のハプログループについても、同様の状況が存在する）。ハプログループ分類をするために、これら全てのｍｔＳＮＰを調べようとするのは、大変な労力が掛かるため大規模な研究には向きにくい。しかしながら、これらのうちのいずれのｍｔＳＮＰを選択・検出すれば、適切にハプログループを分類することが可能であるかについては明確には知られていなかった。加えて、選択した各ｍｔＳＮＰを迅速かつ的確に検出する方法については開発が十分に進んでいなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、ミトコンドリアゲノムのコード領域における包括的な多型分析を基にして、全部で１８６個の核酸プローブを用いて、所定部位の多型を認識する遺伝子検出方法の開発に成功した。この方法により、日本人において少なくとも主要な１０個〜１２個のハプログループ（１０個の場合には、Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５である。１１個の場合には、これら１０個にＭ７ｃを追加することができる。また、１２個の場合には、これら１１個にＮ９ｂを追加することができる。）を分類することにより、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００８】
つまり、各ハプログループが持っている数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰのうち、適当に１個〜５個のｍｔＳＮＰを選択することにより、表１〜表３に示すｍｔＳＮＰｓを検出すれば、ハプログループの分類が可能であること、及びそのための効率的な検出方法を開発した。
この遺伝子検出方法を利用することにより、上記各ハプログループと、４種類の疾患（すなわち、メタボリックシンドローム（ＭＳ）、２型糖尿病、心筋梗塞、及びアテローム血栓性脳梗塞）との関係を大規模に解析した。その結果、次のことがわかった。
【０００９】
ＭＳにおいては、ハプログループＮ９ａ、Ｇ１及びＤ５において、特に女性の場合には、疾患に対する抵抗性が認められた。
２型糖尿病においては、ハプログループＦを持つ者は罹患する危険性が高いこと、ハプログループＮ９ａを持つ者は疾患に対する抵抗性を有すること（特に、女性の場合）、および女性の場合にはハプログループＡを持つ者は罹患する危険性が高いことがわかった。
心筋梗塞においては、ハプログループＮ９ｂを持つ者が疾患に対する抵抗性を有すること、及びハプログループＧ１を持つ者は罹患する危険性が高いこと（特に、男性の場合）がわかった。
アテローム血栓性脳梗塞においては、ハプログループＡを持つ者は、罹患する危険性が高いこと（特に、女性の場合）がわかった。
【００１０】
こうして、上記課題を解決するために、第一の発明に係るヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出することを特徴とする。配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブは、後述のように、適当な目的（すなわち、ａが多型チェック用、ｂが野生型認識用、ｐがＰＣＲ産物チェック用、ｍがマクロハプログループＭチェック用、ｎがマクロハプログループＮチェック用である）のために設計されたものである。すなわち、これらの核酸プローブは有用な多型部位を認識できることがわかっていることから、これらの多型部位から少なくとも５個以上の多型部位を検出することにより、後述の効果を持つ検出方法とできる。
第一の発明においては、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出することが好ましい。
また、これら１０個のハプログループに加えて、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１１個のハプログループ、或いは、更に１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出することもできる。
【００１１】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）＞多型塩基」の順で記載する。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ」は、５２３１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、その多型が生じている遺伝子（ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の位置について、カッコ書きで情報を示すことがある。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）」とは、上記多型について、ＮＤ２遺伝子において、アミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置（欠失または挿入に関する塩基情報）」の順で記載する。例えば、「８２７２（9-bp deletion in non-coding region）」とは、８２７２位の非コード領域における９個の塩基の欠失多型であることを意味している。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。
【００１２】
一般にミトコンドリアＤＮＡ多型（ｍｔＳＮＰｓ）或いはミトコンドリアＤＮＡハプログループは、対象となる集団（例えば、日本人・中国人・韓国人を含む東アジア人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。このため、日本人以外の集団において、疾患との関係が指摘されているハプログループであっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人におけるハプログループおよび疾患との関連が裏付けられるわけではない。
【００１３】
本発明において、ｍｔＳＮＰを検出する方法としては、従来公知の方法、例えばＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ（或いはＤＮＡマイクロアレイ）、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法などの方法を用いることができる。これらの中でも、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることにより、数百個程度の多型であれば迅速に測定することができる。なお、同方法の詳細については後に詳述する。
第一の発明においては、ヒトミトコンドリアＤＮＡを含む試料から前記１０個或いは１２個のハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ工程、このＰＣＲ工程によって増幅されたＤＮＡフラグメントと前記ｍｔＳＮＰのいずれか一つを認識する核酸プローブとをハイブリッドさせるハイブリッド工程、前記核酸プローブによって認識されたｍｔＳＮＰを検出する検出工程とを含むことが好ましい。
【００１４】
ＤＮＡプライマーとしては、適当な長さ（例えば、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上）のものを合成して用いることができる。ＰＣＲ工程によって合成されるＤＮＡフラグメントは、表１〜表３に記載のｍｔＳＮＰを含むものであれば適当な長さのもの（例えば、５０塩基対（１００塩基対、または１５０塩基対）〜３０００塩基対（２０００塩基対、または１０００塩基対）の範囲で適当な長さに選択できる）が合成されるようにして、ＤＮＡプライマーを設計することができる。また、ＤＮＡフラグメントの長さは、１９０塩基対〜５２０塩基対であることが好ましい。
ＤＮＡプライマーについては、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものを用いることにより、１７種類のＤＮＡフラグメントを合成することが好ましい。
【００１５】
核酸プローブは、全長が１５塩基〜４０塩基であり、かつ検出すべきｍｔＳＮＰの位置が５’末端または３’末端から５塩基以上内側に位置させることが好ましい。核酸プローブのＴｍは、任意に設定することができるが、一般的にＤＮＡフラグメントの二重鎖をほどいて変性させるための温度である９０℃程度よりも十分に低く、かつ室温である２５℃よりも十分に高いことが好ましい。そのような温度設定としては、４０℃〜７０℃（好ましくは、４５℃〜６５℃）を選択することができる。Ｔｍとしては、簡易式として、４℃ｘ（ＧまたはＣ数）＋２℃ｘ（ＡまたはＴ数）を用いることができる。
また、核酸プローブをＤＮＡフラグメントとハイブリッドさせる際には、複数の核酸プローブを用いる場合に同じ温度設定で実施できることが操作上の簡易性の観点から見て好ましい。そのため、全ての核酸プローブのＴｍを適当な範囲に収まるように設計することが好ましい。例えば、ハイブリッド工程における温度から２０℃（好ましくは１５℃）程度までの範囲に収めることが好ましい。例えば、ハイブリッド工程が５２℃で行われる場合には、Ｔｍを５０℃（好ましくは５２℃）〜７０℃（好ましくは６７℃）の範囲に設定することが好ましい。
【００１６】
そのような核酸プローブとして、１０個のハプログループを検出する場合には、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載のものを用いることが好ましい。また、１２個のハプログループを検出する場合には、更に配列番号１３８、配列番号１８０、配列番号２１３に記載の核酸プローブを用いることが好ましい。
【００１７】
遺伝子検出方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。この方法は、Ｇ＆Ｇサイエンス社が主体となって開発されたものである（非特許文献２０）。但し、この方法をｍｔＳＮＰに応用するのは本発明者らが始めてである。この方法を用いるためには、ＤＮＡプライマーはビオチン化されており、核酸プローブは固相化されていると共に、検出工程においては、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素を用いることが好ましい。また、核酸プローブは、３’或いは５’の末端のいずれかを固相化、或いは末端ではない適当な位置を固相化しても良い。また、固相化用の担体としては、平板状（プレート）或いは球状のものを用いることができる。
【００１８】
第二の発明におけるヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キットは、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出する核酸プローブを備えることができる。また、この発明においては、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出するための核酸プローブを備えたことを特徴とする。本発明においては、前記１０個のハプログループに加えて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出するための核酸プローブを備えることができる。
【００１９】
また、本発明においては、前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＰＣＲ法によって増幅可能なビオチン化されたＤＮＡプライマーセットと、前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを検出するための核酸プローブが固相化された担体と、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素とを備えることが好ましい。そのようなＤＮＡプライマーセットとして、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものを用いることができる。
【００２０】
また、核酸プローブとしては、ハプログループが１０個の場合には、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載のものを用いることができる。また、ハプログループを１１個とする場合には、配列番号１８０に記載の核酸プローブを、１２個とする場合には、更に配列番号１３８、配列番号２１３に記載の核酸プローブを用いることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、日本人のｍｔＤＮＡのハプログループを簡易に検出することができる。このハプログループ分類により、各種の疾患（例えば、ＭＳ、２型糖尿病、心筋梗塞、アテローム血栓性脳梗塞など）の遺伝的危険度を予測することができる。この発明を用いることにより、各種の疾患に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００２３】
＜ハプログループ分類のためのミトコンドリア多型の選択＞
１．１０個のハプログループへの分類
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース (http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml) 及び日本人の系統樹（非特許文献１３）を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である１６６個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において発見された１０個の主要なハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，及びＤ５）を定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表１に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、及び各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「＊」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
２．１１個または１２個のハプログループへの分類
更に、上記１０個に加えて、Ｍ７ｃを加えた１１個のハプログループを定義するｍｔＳＮＰｓ、及び更にＮ９ｂを加えた１２個のハプログループを定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表２及び表３に示した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】
表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、および各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「Syn」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
＜多型の遺伝子タイピング＞
被験者である日本人から５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含む試験管に、７ｍＬの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてＤＮＡ（ヒトｍｔＤＮＡを含む試料）を分離した。
ＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ工程を実施した。このとき使用したＤＮＡプライマーを表４及び表５に示した。表４中のＤＮＡ配列は、配列番号１〜配列番号２８として、配列表に示した。また、表５中のＤＮＡ配列は、配列番号２９〜配列番号５６として、配列表に示した。これらの配列番号のうち、１０個〜１２個のハプログループを同定するために必要なＤＮＡフラグメントを合成するためのＤＮＡプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載の３４個のものである。これら３４個のＤＮＡプライマーを利用することにより、１７種類のＤＮＡフラグメントが合成される。本実施形態においては、更に１１種類の別のＤＮＡフラグメントを合成するためのＤＮＡプライマーの塩基配列が用いられた。
【００２９】
【表４】
【００３０】
【表５】
【００３１】
表中、左よりフラグメント番号（Fragment）、フォワードプライマー（Forward primer）における位置（positon）及びその塩基配列（Sequence(5'→3'））、リバースプライマー（Reverse primer）における位置（Position）及びその塩基配列（Sequence(5'→3')）、及びＤＮＡフラグメント（Product）の長さ（bp）を示す。
ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社、日本）で決定した。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献２０）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。
【００３２】
また、ハプロタイピングのために使用した核酸プローブの塩基配列を表６〜表１１に示した。今回のタイピングには、最大で１００種類の多型の判定が行えるものを用いた。本発明に係る１０個のハプログループを同定するためには、少なくとも配列番号６６（3010a）、配列番号７４（4048a）、配列番号７５（4071a）、配列番号７８（4386a）、配列番号８３（4833a）、配列番号８６（5108a）、配列番号８８（5178a）、配列番号９０（5231a）、配列番号９９（8272a）、配列番号１０７（8794a）、配列番号１１５（10310a）、配列番号１１６（10397a）、配列番号１２８（12811a）、配列番号１３３（13563a）、配列番号１３４（13928a）、配列番号１４７（15497a）、配列番号１５７（663a）、配列番号１５８（709a）、配列番号１６３（2772a）、配列番号１７４（3970a）、配列番号１８１（4883a）、配列番号１８８（6680a）、配列番号１９３（8200a）、配列番号２２１（12358a）、配列番号２２２（12372a）に記載の塩基配列を備えた核酸プローブを用いればよい。また、１１個のハプログループを同定するには、これらに加えて、配列番号１８０（4850a）に記載の核酸プローブを用いればよい。１２個のハプログループを同定するには、更に配列番号１３８（14893a）、配列番号２１３（11016a）に記載の核酸プローブを用いればよい。本実施形態では、これらのｍｔＳＮＰよりも多くのＳＮＰを検出するための多くの核酸プローブが開示されている。
本実施形態においては、１８６種類の核酸プローブを用いるために、全体を１００種類のセット（プローブセットＡ）と８６種類のセット（プローブセットＢ）とに分けて、タイピングを行った。表６〜表８にはプローブセットＡの詳細を、表９〜表１１にはプローブセットＢの詳細を示した。
【００３３】
【表６】
【００３４】
【表７】
【００３５】
【表８】
【００３６】
【表９】
【００３７】
【表１０】
【００３８】
【表１１】
【００３９】
表６〜表８については、第１のセット（プローブセットＡ）について、ｍｔＤＮＡにおける位置（Position）、目的（Purpose）、プローブの塩基配列（Sequence）を示している。また、目的の欄については、「ａ」が多型チェック用、「ｂ」が野生型チェック用、「ｐ」がＰＣＲ産物チェック用、「ｍ」及び「ｎ」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表９〜表１１については、第２のセット（プローブセットＢ）について、上記と同じ意味である。各塩基配列については、配列番号５７〜配列番号２４２として、配列表に示した。
【００４０】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の基本的な考え方は、非特許文献２０に記載の通りである。以下には、この方法をｍｔＳＮＰに応用した本実施形態の方法について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズ（本発明における固相に該当する）の微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている（本発明における核酸プローブの固相化に該当する）。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている（Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社（Austin）、米国テキサス州）。こうして、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。
【００４１】
複数種類の核酸プローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類の核酸プローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
本実施例においては、表６〜表８に記載の１００種類のプローブを第１セット（セットＡ）とし、表９〜表１１に記載の８６種類のプローブを第２セット（セットＢ）として、２セットを用いることで、合計１８６種類の多型を検出可能な検出系とした。これら１８６種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアＤＮＡを少なくとも１２種類のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５）に分類することができる。
【００４２】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順を示した。
＜ＰＣＲ工程（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡフラグメントを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチン化したプライマーを用いた。ｍｔＤＮＡフラグメントを増幅するために２８−ｐｌｅｘ ＰＣＲを行った。２ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（３０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２.５％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０.１μＭずつのプライマーセットを混合し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.６２５Ｕ）と１ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００４３】
＜ハイブリッド工程（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（１.５Ｍ ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１２５％ Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００４４】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに７５μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００４５】
＜検出工程（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを検出した。検出には、２種類のレーザを使用して行った。ビーズの種類については、６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光については、５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００４６】
この方法に拠る遺伝子タイピングの精度を確かめるために、９１個のＤＮＡサンプルを材料に使用した。これらのＤＮＡサンプルは、ミトコンドリアゲノムの全塩基配列が直接シーケンスによって既に決定されているものである。各例において、ルミネックスシーケンス特異性オリゴヌクレオチドハイブリッドアッセイシステム（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によって決定された遺伝子型は、直接シーケンスによって決定されたものと一致した。
【００４７】
１．メタボリックシンドロームへの応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人１３３７名（男性８８３名、女性４５４名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月の間に、３つの研究参加病院（岐阜県立岐阜病院、多治見病院及び下呂温泉病院）の１つを外来した受診者、或いは入院者である。診断は、成人治療パネルIII（非特許文献１６）により提唱されたメタボリックシンドローム（ＭＳ）に関する修正定義に基づいて行った。この修正版は、スコットランド西部冠動脈疾患予防研究（非特許文献１７）及び女性の健康に関する研究（非特許文献１８）においても使用されたものである。但し、それらの研究では、ウエストサイズの代わりに体重指標（ＢＭＩ）が採用されている。日本人及び他のアジア人集団においては、肥満指標のためのＢＭＩ基準を改訂する必要性が最近認識されている（非特許文献１９）。このため、我々はこの改定基準を基にして、ＢＭＩ値が２５ｋｇ／ｍ２以上の者を肥満者とした。
【００４８】
対象者が次の５つの因子の内の３つ以上を持っている場合にＭＳであると診断した。５つの因子とは、（１）２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、（２）トリグリセリド血清濃度が１.６５ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ）以上、（３）ＨＤＬコレステロール血清濃度が、男性では１.０４ｍｍｏｌ／Ｌ（４０ｍｇ／ｄＬ）未満、女性では１.３０ｍｍｏｌ／Ｌ（５０ｍｇ／ｄＬ）未満、（４）収縮期血圧が１３０ｍｍＨｇ以上、かつ拡張期血圧が８５ｍｍＨｇ以上、及び（５）絶食時血漿グルコース濃度が６.０５ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）以上の５個である。
【００４９】
これらの基準に基づき、８７１名（男性５８４名、女性２８７名）がＭＳ患者であると診断された。対照群は、総数４６６名（男性２９９名、女性１６７名）である。対照群者は、参加病院に年に一度の健康チェックのために外来受診した者達である。これらの者は、ＭＳの５つの基準のうちのいずれも有していなかった。また、肥満、高脂血症、異常脂血症、高血圧症、或いは糖尿病の既往歴も何ら有していなかった。代謝性もしくは内分泌性疾患の患者、或いは二次性の糖尿病を引き起こす薬剤を服用する者は、本研究の対象からは除外した。研究プロトコルは、岐阜県国際バイオ研究所のヒト研究に関する倫理委員会により承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１０個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【００５０】
＜統計的分析＞
量的な臨床データは、ＭＳ罹患群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
ＭＳと関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、及び各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、ＭＳを従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、及び９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【００５１】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１０個のハプログループを調べたので、０.０５を１０で除して、０.００５とした。こうして、０.００５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
【００５２】
＜結果＞
１３３７名の被験者に関する基礎的データを表１２に示した。
【表１２】
【００５３】
表中において、最左欄は上段から順に、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、糖尿病（Diabetes mellitus）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）におけるＭＳ群（MS）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、女性（Women）におけるＭＳ群の値と対照群の値とＰ値、男性（Men）におけるＭＳ群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本以上の喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。糖尿病については、絶食時血漿グルコース濃度が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、または高脂血症剤を服用している者とした。
【００５４】
年齢及び性別（女／男比率）については、いずれもＭＳ罹患群と対照群との間で統計的な差異は認められなかった。ＢＭＩ、トリグリセリド、絶食時血糖濃度、及びヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）比率は、対照群に比べるとＭＳ罹患群においては有意に高かった。ＨＤＬコレステロールはＭＳ罹患群では対照群に比べて有意に低かった。喫煙率、高血圧症、高コレステロール血症及び真性糖尿病は、対照群に比較してＭＳ罹患群では有意に高かった。
年齢、性別、喫煙状態を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果、Ｐ値が０.０５未満で、ハプログループＮ９ａがＭＳに対する抵抗性に関連した。また、ハプログループＮ９ａ，Ｇ１，Ｄ５の３グループの女性は、ＭＳに対する抵抗性に関連することが明らかとなった（表１３）。
【００５５】
【表１３】
【００５６】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である年齢（Age）・性別（Gender）・喫煙率（Smoking）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＮ９ａを、女性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ａ、Ｇ１、Ｄ５を、男性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子（該当するハプログループなし）をそれぞれ意味している。
我々は、ハプログループの多重比較について、０.００５未満のＰ値が得られた場合に、その関連が有意であると考えた。この基準に基づくと、ハプログループＮ９ａは、女性ではＭＳに対する抵抗性に有意に関係していた。ステップワイズ前向き選択法の結果、女性については、ハプログループＮ９ａがＭＳに対する保護因子であることが明らかになった（表１４）。しかしながら、男性については、これらのハプログループのうちのいずれもＭＳとの関連は示されなかった。
【００５７】
【表１４】
【００５８】
女性の場合は、ステップワイズ前向き選択法の結果、年齢、ハプログループＮ９ａ，Ｇ１及びＤ５が、ＭＳに対して独立的な危険因子、或いは保護因子であることが明らかとなった。ハプログループＮ９ａ，Ｇ１及びＤ５のＭＳからの保護作用についての全体としての貢献度は、０.０３６１であった。これは女性の場合には、ミトコンドリアゲノム多型がＭＳに対する感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示している。
表１５には、ｍｔＳＮＰｓのうち、ＭＳに対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【００５９】
【表１５】
【００６０】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
年齢、性別及び喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析によれば、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ａ１９０Ｔ）が、全対象者でＭＳへの抵抗性に関連することが明らかとなった（Ｐ＜０.０５）。
更に、ハプログループＮ９ａを代表する３個のｍｔＳＮＰｓである５２３１Ｇ＞Ａ、１２３７２Ｇ＞Ａ、及び１２３５８Ａ＞Ｇ、ハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃ、及びサブハプログループＧ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰである３７５９Ａ＞Ｇは、ＭＳに対する抵抗性と関連があった。これと対照的に、３個のｍｔＳＮＰｓ、すなわちサブハプログループＦ１を代表する１２４０６Ｇ＞Ａ、サブハプログループＤ４ｂ２ｂを代表する９２９６Ｃ＞Ｔ、及びサブハプログループＢ４ｃを代表する１５３４６Ｇ＞Ａは、ＭＳへの感受性に関連があった（Ｐ＜０.０５）。
【００６１】
女性の場合には、年齢及び喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ａを代表する３個のｍｔＳＮＰｓである５２３１Ｇ＞Ａ、１２３７２Ｇ＞Ａ、及び１２３５８Ａ＞Ｇが、それぞれ危険率（Ｐ）が０.０００９、０.００４２、及び０.００４２で、ＭＳに対する抵抗性と関係することが明らかになった。更に、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃも、ＭＳへの抵抗性と関係していた。
ハプログループＧ１を代表する２個のｍｔＳＮＰｓである８２００Ｔ＞Ｃ及び１５４９７Ｇ＞Ａ、サブハプログループＧ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１５８６０Ａ＞Ｇ、サブハプログループＧ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰである３７５９Ａ＞Ｇは、ＭＳに対する抵抗と関係があった。
【００６２】
対照的に、２つのｍｔＳＮＰｓ、即ちサブハプログループＦ１を代表する１２４０６Ｇ＞Ａ、及びサブハプログループＤ５を代表する１０３９７Ａ＞Ｇは、ＭＳへの感受性と関係があった（Ｐ＜０.０５）。
男性の場合は、ハプログループＮ９ｂ１を代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞ＡがＭＳへの感受性に関係があった（Ｐ＜０.０５）。
我々は１６６個の異なるｍｔＳＮＰｓに対して修正ボンフェローニ法を適用したが、これらのＰ値のうちのいずれも有意レベルが０.０００３以下を示さなかった。
【００６３】
表１６に示すように、ステップワイズ前向き選択法によれば、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａが、女性の場合にはＭＳに対する保護因子であることが明らかとなった（Ｐ＝０.０００３）。
４個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち５２３１Ｇ＞Ａ、８２００Ｔ＞Ｃ、３７５９Ａ＞Ｇ、及び１５３１４Ｇ＞ＡのＭＳへの保護作用の全体としての貢献度は、０.０５５２であった。これは、女性の場合には、これらのｍｔＳＮＰｓがＭＳへの感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示唆している。
【００６４】
【表１６】
【００６５】
＜考察＞
我々は１３３７名に基づく大規模な関連解析を行い、１０種類の主要なミトコンドリアハプログループのそれぞれとＭＳとの間の関係を調査した。これらのハプログループのうち、Ｎ９ａ、Ｇ１、及びＤ５の３つは、女性の場合には、ＭＳに対する抵抗性と有意に関係していた。ハプログループＮ９ａに特有なｍｔＳＮＰｓの大部分は、５２３１Ｇ＞Ａ及び１２３７２Ｇ＞Ａを含む同義変異であるが、これらは本研究の遺伝子タイピングを行うのに使用した。
このハプログループにおいて、機能的な多型としては、１５０Ｃ＞Ｔ及び３３８Ｃ＞Ｔが候補として挙げられる。これらはミトコンドリアゲノムの非コード領域にある。１５０Ｃ＞Ｔ置換はイタリアの百寿者で最初に報告された（非特許文献２１）。また、以前に我々は、この置換がフィンランド人と日本人共に健康な長寿と関連していることを報告した（非特許文献２２）。このように、１５０Ｃ＞Ｔは、女性ではＭＳに対する抵抗性を付与する可能性がある。
【００６６】
ハプログループＭ９ａに特異的なｍｔＳＮＰｓのうちで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５遺伝子産物（ＮＤ５）において、Ｔｈｒ８Ａｌａ置換を惹き起こす１２３５８Ａ＞Ｇは、機能的な多型の一つであるかも知れない。
ＮＤ５はｍｔＤＮＡにコードされたサブユニットの７個の内の一つであるが、これらのサブユニットは呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素、ＥＣ１．６．５．３）の約４１個のポリペプチドに含まれる。複合体Ｉは、ＮＡＤＨから電子を受け取り、それをユビキノン（補酵素Ｑ１０）に転送する。その際に得られたエネルギーを用いて、ミトコンドリア内膜を通してプロトンを輸送する。ＮＤ５は、おそらく疎水性蛋白質断片の構成成分である。このサブユニットは、複合体Ｉの機能には欠かすことができない。ＮＤ５遺伝子における各種のミスセンス変異（例えば、１２７０６Ｔ＞Ｃ（Ｆ２４Ｌ）、１２７７０Ａ＞Ｇ（Ｅ１４５Ｇ）、１３０４５Ａ＞Ｃ（Ｍ２３７Ｌ）、１３０８４Ａ＞Ｔ（Ｓ２５０Ｃ）、１３５１３Ｇ＞Ａ（Ｄ３９３Ｎ）、１３０４２Ｇ＞Ａ（Ａ２３６Ｔ）、１３７３０Ａ（Ｅ４６５Ｇ））が、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）（非特許文献２３）、リー症候群（非特許文献２４）、或いはミトコンドリア性ミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様症状を呈する症候群（ＭＥＬＡＳ）（非特許文献２５）の患者において報告されている。従って、１２３５８Ａ＞Ｇによって惹き起こされたＴｈｒ８Ａｌａ置換がＮＤ５サブユニット及び複合体Ｉの機能に影響を及ぼす可能性がある。１２３５８Ａ＞Ｇがミトコンドリアの機能に対して与える影響については、このハプログループを持つｍｔＤＮＡを導入した細胞を用いた実験により調査されるべきである。
【００６７】
１５０Ｃ＞Ｔと１２３５８Ａ＞Ｇの両ＳＮＰｓを持つハプログループＮ９ａを有する女性の代謝的特徴は、内臓肥満、インスリン抵抗性及び脂質代謝に影響を与え、それによってＭＳに対する抵抗性が与えられるものと考えられる。
ハプログループＧ１に特有のｍｔＳＮＰｓのなかでは、１５３２３Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ａ１９３Ｔ）または１５４９７Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ｇ２５１Ｓ）のいずれかは、機能的多型のようである。
国立長寿医療研究センターの加齢に関する縦断的研究（ＮＩＬＳ−ＬＳＡ）の一部としての我々の以前の調査によれば、１５４９７Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ｇ２５１Ｓ）が、日本人集団の中年及び年配者層における肥満と関係していることが明らかとなった（非特許文献２６）。
【００６８】
年齢及び喫煙状態を補正した統計解析によれば、１５４９７Ｇを持つ女性に比較すると、１５４９７Ａを持つ女性では、体重、ＢＭＩ、ウエスト及びヒップ廻りのサイズ、脂肪量、脂肪以外の質量、腹腔内脂肪、及びトリグリセリドが有意に大きい事が分かった。また、血漿インスリン濃度は、１５４９７Ｇを持つ女性に比べると、１５４９７Ａを持つ女性の方が２０％高かった。ところが、絶食時血漿グルコース及びヘモグロビンＡｌｃは、２つの集団の間で有意差は見られなかった。これらの結果は、１５４９７Ａが、高血圧症、高血糖或いは高コレステロール血症（これらはＭＳを構成する因子である）を伴わない単純肥満に関係することを示唆している。こうして、１５４９７Ａを伴うハプログループＧ１がＭＳに対する抵抗性を獲得しているとの本研究の結果は、グルコース及びコレステロール代謝が１５４９７Ａ対立遺伝子を持つ女性では比較的正常であるとの我々の既報と一致するものである。ミトコンドリアの酸化的リン酸化系は、細胞活動のために必要な主要なエネルギー源である。上記の結果は、チトクロームｂｃ１複合体におけるミトコンドリアのエネルギー保存効率の上昇によって、結果としてエネルギー消費の減少を惹き起こしたということかも知れない（非特許文献１０）。別の可能性として、複合体IIIのユビキノン結合部位の一つであるＱ０部位でユビキノンの還元を抑制することが、結果として脂肪酸のベータ酸化を減少させ、脂肪を蓄積させるのかも知れない。アンドリューらは、２５１位のグリシンがアスパラギン酸に置換された場合に、Ｑｐ部位にある２７１位のグルタミン残基との間の電荷反撥を惹き起こすので、Ｍｔ１５４９８Ｇ＞Ａ突然変異に起因するＧ２５１Ｄ置換が病因であると主張している（非特許文献２７）。この置換は、Ｑｐ部位の構造を変え、ヒドロキノン結合を損なう可能性がある。２５１位のグリシンをセリンに置換しても、２７１位のグルタミン酸との間に電荷反発を惹き起こさないと考えられるが、この置換がＱｐ部位に対するユビキノンの親和性に影響を及ぼすことは推測し得る。
【００６９】
我々は、ハプログループＤ５に関しても、同様にｍｔＳＮＰデータベース(http://www.giib.or.jp/mtsnp/search_mtSNP_e.html)を用いて、ミトコンドリアゲノムにおける機能的なｍｔＳＮＰｓを探索した。ハプログループＤ５に属するサブハプログループの間で、サブハプログループＤ５ａ１、Ｄ５ａ２、及びＤ５ｂ２は、日本人集団においては高頻度に観察される。我々の以前の研究によれば、３名の日本人の百寿者（個体番号TCsq0012(女性、１００歳）、個体番号GCsq0022(男性、１０２歳)、個体番号TCsq0030(女性、１００歳））は、各々ハプログループＤ５ａ１、Ｄ５ａ２、及びＤ５ｂ２を持っていた(非特許文献１３、図１Ｂ）。また、我々は、５１７８Ｃ＞Ａ多型（ＮＤ２：Ｌ２３７Ｍ）を特徴とするハプログループＤが長寿に関係していること、及びこの多型が加齢に関連する疾患に対する抵抗性を与えるということを報告している（非特許文献８）。５１７８Ｃ＞Ａに加え、更にハプログループＤ５を持つ者は、ミトコンドリアゲノムの非コード領域に１５０Ｃ＞Ｔ塩基多型を持っている。１５０Ｃ＞Ｔ変異が、日本人百寿者とフィンランドの９０歳以上の高齢者の両者において、各々の対照群に比較してより頻繁に検出されることを我々は最近報告した（非特許文献２２）。今回の研究で明らかとなったように、ハプログループＤ５がＭＳに対して防御的効果を示すという結果は、１５０Ｃ＞Ｔが長寿と関係しているという以前の我々の報告に一致するものである。
【００７０】
ミトコンドリアには組換え機構が存在しないので、各ハプログループ或いはサブハプログループにおけるｍｔＳＮＰｓの全ては、相互に強固にリンクしている。従って、今回の研究において調査されたｍｔＳＮＰｓのあるものが、ＭＳに対する抵抗性を担っている他のミトコンドリア遺伝子の機能的多型と、連鎖不平衡の関係にあるということがあり得る。
女性の場合、ハプログループＮ９ａ、Ｇ１及びＤ５は、ＭＳに対する抵抗性と関連していた。一方、男性の場合には、このような関係は見出されなかった。遺伝的変異が肥満に関係する度合いが、男性に比して女性ではより高いとの考えを支持する他の証拠がある（非特許文献２８、２９）。クマジーらは、性相互作用により遺伝子型を導入し、脂肪重量をメンデル混合モデルにて分析したところ、男性では脂肪重量の分散値全体の３７％を主な遺伝子が担い、一方女性では４３％が担っていた（非特許文献）。しかしながら、我々の知る限りでは、ｍｔＤＮＡ多型とＭＳとの関係における性別の影響に関してほとんど報告がない。以前の関連解析には、核遺伝子多型とＭＳとの関係について調査がされている。
【００７１】
山田らは、アポリポ蛋白Ａ−Ｖ遺伝子プロモーター領域における単一ヌクレオチド多型がＭＳと関係することを示した（投稿中）。これらｍｔＳＮＰｓ及び核ＳＮＰｓの遺伝子タイピングは、ＭＳの遺伝的危険度を予測するのに有益であり、かつＭＳの一次予防に貢献できる。
このように、本実施形態によれば、日本人のｍｔＤＮＡを１０個のハプログループに分類することにより、ハプログループとＭＳとの関係が示された。
【００７２】
２．２型糖尿病への応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人２９０６名（男性１９３８名、女性９６８名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月の間に、３つの研究参加病院（岐阜県立岐阜病院、多治見病院および下呂温泉病院）の１つを外来した受診者、或いは入院患者であった。２型糖尿病患者は、絶食時血漿グルコースレベルが６.９９ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）濃度が６.５％以上を示す者、或いは糖尿病に対する薬物治療下にあった。２型糖尿病は、世界保健機構により承認された基準に従って定義した。これらの基準に基づいて、研究対象集団中の１２８９名の被験者（男性８９０名、女性３９９名）が、２型糖尿病患者であると診断された。残りの１６１７名（男性１０４８名、女性５６９名）は対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者である。対照群は、絶食時血漿グルコースレベルが６.１１ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）未満であり、ヘモグロビンＡｌｃが５.６％未満を示し、かつ２型糖尿病の既往歴ならびに２型糖尿病に対する薬物治療を受けた経験が無い者であった。
研究プロトコルは、岐阜県国際バイオ研究所のヒト研究に関する倫理委員会により承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１０個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【００７３】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、２型糖尿病患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
２型糖尿病と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、２型糖尿病を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【００７４】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１０個のハプログループを調べたので、０.０５を１０で除して、０.００５とした。こうして、０.００５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
【００７５】
＜結果＞
２９０６名の被験者に関する基礎的データを表１７に示した。
【表１７】
【００７６】
表中において、最左欄は上段から順に、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）における２型糖尿病患者群（Type 2 diabetes）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、女性（Women）における２型糖尿病患者群の値と対照群の値とＰ値、男性（Men）における２型糖尿病患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本以上の喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、または高脂血症剤を服用している者とした。
【００７７】
年齢は２型糖尿病患者群において対照群よりも低かったが、ＢＭＩ、収縮期および弛緩期血圧、トリグリセリド、絶食時血漿グルコース濃度、およびヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）比率は、対照群に比べると２型糖尿病患者群においては有意に高かった（Ｐ＜０.０５）。
年齢とＨＤＬコレステロールは、対照群に比して２型糖尿病患者者の方が有意に低かった（Ｐ＜０.０５）。喫煙率、高血圧症、高コレステロール血症は、対照群に比較して２型糖尿病患者群では有意に高かった（Ｐ＜０.０５）。女性／男性の比率は、対照群に比して２型糖尿病患者群の方が有意に低かった（Ｐ＜０.０５）。
年齢、性別、喫煙状態を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表１８に示した。
【００７８】
【表１８】
【００７９】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である年齢（Age）・性別（Gender）・喫煙率（Smoking）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＦ、Ｎ９ａを、女性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ａ、Ｆ、Ａを、男性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＦをそれぞれ意味している。
【００８０】
表に示す通り、Ｐ値が０.０５未満で、ハプログループＦを持つ被験者が、２型糖尿病罹患のリスクが有意に高いことが明らかとなった。これとは対照的に、ハプログループＮ９ａを持つ被験者は、２型糖尿病に罹患するリスクが低い傾向を示した（P = 0.023, オッズ率 0.64（95% CI 0.43-0.94））。ハプログループＮ９ａを持つ女性は、２型糖尿病罹患のリスクが有意に低かった（P =0.0042, オッズ率 0.27（95% CI 0.10-0.62））。一方、ハプログループＦおよびＡを持つ女性は２型糖尿病罹患のリスクが高い傾向を示した（Ｆについては、P = 0.0165, オッズ率 1.78（95% CI 1.11-2.89）；Ａについては、P = 0.0405, オッズ率 1.67（95% CI 1.02-2.73））。ハプログループＦを持つ男性は、２型糖尿病に罹患するリスクが高かった（P = 0.0482, オッズ率1.43（95% CI 1.00-2.05））。
我々は、ハプログループの多重比較について、０.００５未満のＰ値が得られた場合に、その関連が有意であると考えた。この基準に基づくと、ハプログループＦは、全ての被験者について２型糖尿病に対する感受性に有意に関与していた（P = 0.0028）。一方、女性について、ハプログループＮ９ａは、２型糖尿病に対する抵抗性に有意に関与していた（ P = 0.0042）。
表１９には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【００８１】
【表１９】
【００８２】
表より、ハプログループＦは全ての被験者について、２型糖尿病に対する危険因子であることが明らかとなった（P = 0.0035）。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａは２型糖尿病に対する防御因子であり（P = 0.0013）、ハプログループＦとＡは２型糖尿病に対して独立な危険因子である可能性が示された（Ｆについて、P = 0.0227；Ａについて、P = 0.0374）。しかし男性の場合には、これらのハプログループのいずれも、２型糖尿病との関連性を示さなかった。
女性の場合、ハプログループＮ９ａ、Ｆ、およびＡの２型糖尿病への抵抗性に対する総合的な寄与は０.０１５２（３つのハプログループの寄与率(R2)の和）であった。これはミトコンドリアゲノム多型が、特に女性においては、２型糖尿病への感受性に影響する重要な遺伝要因であることを示唆している。
表２０には、ｍｔＳＮＰｓのうち、２型糖尿病に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【００８３】
【表２０】
【００８４】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＦを代表する３個のｍｔＳＮＰである３９７０Ｃ＞Ｔ、１０３１０Ｇ＞Ａおよび１３９２８Ｇ＞Ｃ、ハプログループＦ１を代表するｍｔＳＮＰである１２４０６Ｇ＞Ａ（配列番号２２３の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、ハプログループＦ１ｂ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１３９２８Ｇ＞Ｃが、全ての被験者に関して、糖尿病と関連性を持つことが明らかになった（P = 0.0014 [10310G>A] , P = 0.0025 [12406G>A], P = 0.0028 [3970C>T], P=0.0028 [13928G>C]。これらは149 個のmtSNP の比較に対しての無修正値（ボンフェローニの補正を行っていない値）である）。個々のｍｔＳＮＰについては、各ハプロタイプに対応していることから、ハプロタイプに適用した有意水準（Ｐ＜０.００５）で判断を行った。
【００８５】
サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔ（配列番号１４１の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＦ１ｂ１ａまたはＮ９ｂ１を代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞Ａ（配列番号８７の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＢ５ｂ３を代表するｍｔＳＮＰである８８５６Ｇ＞Ａ（配列番号２０１の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、およびサブハプログループＦ１ｂ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４４７６Ｇ＞Ａ（配列番号１３７の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）を保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対する危険性が高かった。
対照的に、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃ（配列番号１４３の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＮ９ａを代表する２個のｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａ、並びにサブハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ（配列番号２３７の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）を保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に抵抗性を示した。
【００８６】
女性については、年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ａを代表する２個のｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａが、糖尿病に対する抵抗性に関係することが明らかになった（ P = 0.0025 , P = 0.0035。これは149 個のmtSNP の比較に対しての無修正値である）。これに対し、サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔは、糖尿病に対する危険性が高かった（P = 0.0035）。更に、サブハプログループＦ１を代表するｍｔＳＮＰである１２４０６Ｇ＞Ａ、ハプログループＦを代表する３個のｍｔＳＮＰである１３９２８Ｇ＞Ｃ、１０３１０Ｇ＞Ａ、および３９７０Ｃ＞Ｔ、サブハプログループＡ１ａを代表するｍｔＳＮＰである４６５５Ｇ＞Ａ（配列番号１７６の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＢ５ｂ３を代表するｍｔＳＮＰである８８５６Ｇ＞Ａ、ハプログループＡを代表する２個のｍｔＳＮＰである６６３Ａ＞Ｇおよび８７９４Ｃ＞Ｔを保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが高いことがわかった。
【００８７】
これに対し、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである１２３５８Ａ＞Ｇ、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃを持つ女性は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが低いことがわかった。
男性の場合には、年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＦを代表するｍｔＳＮＰである１０３１０Ｇ＞Ａを持つと、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが高いことがわかった。
表２１に示すように、ステップワイズ前向き選択法によれば、ハプログループＦを代表するｍｔＳＮＰである１０３１０Ｇ＞Ａが全被験者で２型糖尿病に対する危険因子であることが明らかになった（P = 0.0018）。
【００８８】
【表２１】
【００８９】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａが、２型糖尿病に対する防御因子であることが明らかになった（P = 0.0006）。他方、サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔは、２型糖尿病に対する危険因子であった（P = 0.0036）。７個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち５２３１Ｇ＞Ａ、１４９４４Ｃ＞Ｔ、１２４０６Ｇ＞Ａ、８７６２Ｔ＞Ｃ、８８５６Ｇ＞Ａ、１２３５８Ａ＞Ｇ、および８３８３Ｔ＞Ｃの糖尿病に対する感受性ならびに／若しくは防御性への総合的な寄与は０.０３６４（７個のｍｔＳＮＰｓの寄与率（R2）の和）であった。
【００９０】
男性の場合には、サブハプログループＦ４ａを代表するｍｔＳＮＰである７８６１Ｔ＞Ｃ（配列番号１９１の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）は、２型糖尿病に対する危険因子であった（P = 0.0005）。４個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち７８６１Ｔ＞Ｃ、１３９１Ｔ＞Ｃ（配列番号１６０の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、１０３１０Ｇ＞Ａ、および１５０４７Ｇ＞Ａ（配列番号２３６の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）の２型糖尿病に対する感受性への総合的な寄与は０.０１０１（４個のｍｔＳＮＰｓの寄与率（R2）の和）であった。
これらの結果は、上記のｍｔＳＮＰｓが、特に女性の場合には２型糖尿病に対する感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示している。
【００９１】
＜考察＞
我々は、２９０６名の被験者に基づく大規模な関連解析を行い、２型糖尿病と１０個の主要なミトコンドリアハプログループとの間の関係を調査した。これらのハプログループのうち、ハプログループＦは全ての被験者で２型糖尿病のリスクに有意に関係していた。女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、２型糖尿病に対する抵抗性に有意に関係していた。一方、ハプログループＦおよびハプログループＡは、２型糖尿病に対するリスクに関係していた。男性の場合には、ハプログループＦは、２型糖尿病のリスクと関係していた。
【００９２】
我々は、ミトコンドリアＤＮＡ配列の解析から、日本人集団がマクロハプログループＮとＭとに分割されることを報告した（非特許文献１３）。マクロハプログループＭは、１０個の強固なｍｔＳＮＰｓがリンクしたマクロハプログループＮとは異なっている。マクロハプログループＮには、４個の主要なハプログループ、すなわちＦ、Ｂ、Ａ、およびＮ９ａが含まれる。他方、マクロハプログループＭには、６個の主要なハプログループ、すなわちＭ７ａ、Ｍ７ｂ、Ｇ１、Ｇ２、Ｄ４およびＤ５が含まれる。こうして、日本人集団は、これら１０個の主なハプログループに分類される。
【００９３】
ハプログループＦに特異なｍｔＳＮＰに、１３９２８Ｇ＞Ｃトランスバージョンは、潜在的な機能的多型の１つである。このｍｔＳＮＰは、ＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット５遺伝子産物（ＮＤ５）中で、Ｓ５３１Ｔ置換を起こすことが知られている。ＮＤ５はｍｔＤＮＡにコードされたサブユニットの７個の内の一つであるが、これらのサブユニットは呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素、ＥＣ１．６．５．３）の約４１個のポリペプチドに含まれている。複合体Ｉは、ＮＡＤＨから電子を受け取り、それをユビキノン（補酵素Ｑ１０）に転送する。その際に得られたエネルギーを用いて、ミトコンドリア内膜を通してプロトンを輸送する。
【００９４】
ＮＤ５は、複合体Ｉの機能には欠かすことができない。その理由は、ＮＤ５遺伝子中の様々なミスセンス変異が、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）（非特許文献２３）、リー症候群（非特許文献３２）、またはミトコンドリア性ミオパチー、脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様症状から成る症候群（ＭＥＬＡＳ）（非特許文献７）に罹患する患者において報告されているからである。従って、１３９２８Ｇ＞Ｃによって惹き起こされるＳ５３１Ｔ置換が、ＮＤ５サブユニットおよび複合体Ｉの機能に影響を及ぼすと考えることができる。１３９２８Ｇ＞Ｃ（ＮＤ５：Ｓ５３１Ｔ）がミトコンドリア機能に及ぼす具体的な作用については、このハプログループを伴うｍｔＤＮＡを持つ細胞質雑種細胞系統を使う実験によって確認することができ得る。
【００９５】
ハプログループＦを持つ個人の代謝特性は、おそらくインスリン分泌ならびに／あるいはインスリン抵抗性に影響を与えることによって、２型糖尿病に対する抵抗性を得るものと思われる。ハプログループＦに属するサブハプログループ（Ｆ１ａ、Ｆ１ｂ、Ｆ１ｃ、Ｆ２ａ、Ｆ３、Ｆ４ａ、およびＦ４ｂ）の内、サブハプログループＦ１ｂは１６１８９Ｇ＞Ｃ多型によって定義される。この多型はハプログループＢにおいても検出されること、およびハプログループＢは本研究では糖尿病に関係しなかったことから、１６１８９Ｔ＞Ｃ多型は２型糖尿病とは関係しないと判断される。
【００９６】
ハプログループＮ９ａに特有のｍｔＳＮＰｓは、ほとんど同義突然変異である。これらの同義突然変異のうち、５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａは、本研究の遺伝子タイピングに使用した。このハプログループに於ける機能的な多型として考えられる候補は、１５０Ｃ＞Ｔおよび３３８Ｃ＞Ｔであるが、これらはミトコンドリアゲノムの非コード領域にある。１５０Ｃ＞Ｔ置換は、イタリアの百寿者で最初に報告された（非特許文献３０）。また我々は、この置換がフィンランドと日本の両国で共に健康的な長寿者と関連していることを報告している（非特許文献３１）。このため、１５０Ｃ＞Ｔは、女性の場合には２型糖尿病に対する抵抗性を授与するものと考えられる。
【００９７】
ハプログループＮ９ａに特異なｍｔＳＮＰｓのうちでは、１２３５８Ａ＞ＧがＮＤ５サブユニットにＴ８Ａ置換（８位のスレオニンをアラニンに置換する）を惹き起こすことから、潜在的な機能的な多型であると考えられる。１２３５８Ａ＞Ｇによって惹き起こされたＴ８Ａ置換が、ＮＤ５サブユニットおよび複合体Ｉの機能に影響を与えるかも知れない。１２３５８Ａ＞Ｇ（ＮＤ５：Ｔ８Ａ）がミトコンドリア機能に与える具体的な作用については、細胞実験によって調査することができ得る。１５０Ｃ＞Ｔと１２３５８Ａ＞Ｇの両者を備えたハプログループＮ９ａを持つ女性の代謝特性は、２型糖尿病に対する抵抗性の機構を理解するために更なる調査が望まれる。
【００９８】
本研究において、女性の場合には、ハプログループＡが２型糖尿病への感受性と関連を持つことを見出した。ハプログループＡは８７９４Ｃ＞Ｔ突然変異を特徴とするが、この変異はＡＴＰａｓｅサブユニット６においてＨ９０Ｙ置換（９０位のヒスチジンをチロシンに置換する）を惹き起こす。ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅは、核ＤＮＡにコードされた１０−１６個のサブユニットおよびｍｔＤＮＡにコードされた２個のサブユニット（ＡＴＰａｓｅ６およびＡＴＰａｓｅ８）から構成される。ＡＴＰ６遺伝子は、サブユニットaをコードする。サブユニットａは、ＡＴＰａｓｅのＦｏセクタを横断してプロトンを輸送する際に重要な役割を果たす。Ｌ１５６Ｒ置換を惹き起こす８９９３Ｔ＞Ｇトランスバージョン、およびＬ１５６Ｐ置換を惹き起こす８９９３Ｔ＞Ｃトランジションは、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、および色素視神経網膜炎）症候群（非特許文献３２、３３）の原因となる病原性突然変異である。従って、８７９４Ｃ＞Ｔによって惹き起こされたＨ９０Ｙ置換がＡＴＰ６サブユニットとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（複合体Ｖ）の機能に影響を与える可能性がある。
【００９９】
ミトコンドリア機能および代謝に対する８７９４Ｃ＞Ｔ（ＡＴＰ６：Ｈ９０Ｙ）の実際の効果については、この多型と２型糖尿病に対する感受性との関係を理解するために更なる調査が望まれる。ミトコンドリアには組換え機構が存在しないので、各ハプログループあるいはサブハプログループに於けるｍｔＳＮＰｓの全ては、相互に強く連鎖している。従って、本研究で調べたｍｔＳＮＰｓのいくつかが連鎖不均衡にあって、２型糖尿病に対する感受性若しくは抵抗性を実際に担う他のミトコンドリア遺伝子の機能的な多型にそのｍｔＳＮＰが連鎖している可能性がある。女性の場合、ハプログループＮ９ａは２型糖尿病に対する抵抗性に関係していたが、この関係は男性の場合には検出されなかった。
【０１００】
遺伝的変異と肥満との関係は、男性の場合に比べると女性の方が強いという考えを支持する他の証拠がある（非特許文献３４、３５）。Ｃｏｍｕｚｚｉｅらは、性相互作用により遺伝子型を導入し、脂肪重量をメンデル混合モデルにて分析したところ、男性では脂肪重量の分散値全体の３７％を主な遺伝子が担い、女性では４３％を担っていた（非特許文献３５）。これまでに、核遺伝子多型と糖尿病との間の関係についての関連解析がいくつか認められる。グルコキナーゼをコードする遺伝子の多型（非特許文献３６）、インスリン受容体基質１（非特許文献３７）、ペルオキシソーム増殖因子活性性受容体γ（非特許文献３８）、カルパイン−１０（非特許文献３９）、およびアディポネクチン（非特許文献４０）は、糖尿病に関連するものと報告されている。
しかしながら、ミトコンドリアＤＮＡ多型と２型糖尿病との関係に対する性別の果たす影響に関しては、今までのところほとんど報告が見られない。本明細書が、初めての報告である。
このように、本実施形態によれば、日本人のｍｔＤＮＡを１０個のハプログループに分類することにより、ハプログループと２型糖尿病との関係が示された。このことにより、２型糖尿病の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【０１０１】
３．心筋梗塞への応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人２１３７名（男性１４４２名、女性６９５名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月までに３つの参加病院（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院）の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。心筋梗塞を伴う１１８１名（男性９２０名、女性２６１名）の対象者は、全てが冠動脈造影と左室造影検査によって、病態が確認された。残りの９５６名（男性５２２名、女性４３４名）は、対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者であった。対照群は、うっ血性心不全、末梢性動脈閉塞性疾患、動脈硬化性疾患、梗塞性・出血性脳卒中、他の脳疾患、および他の血栓・塞栓・出血性疾患の既往歴が無い者であった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１２個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【０１０２】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、心筋梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定、またはマン・ホイットニーＵ検定（the Mann−Whitney U test）を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
心筋梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、ＢＭＩ、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、心筋梗塞を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【０１０３】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１２個のハプログループを調べたので、０.０５を１２で除して、０.００４とした。こうして、０.００４未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
＜結果＞
２１３７名の被験者に関する基礎的データを表２２に示した。
【０１０４】
【表２２】
【０１０５】
表中において、最左欄は上段から順に、対象数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、２型糖尿病（Type-2 diabetes）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）における心筋梗塞（MI）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、男性（Male）における心筋梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値、女性（Female）における心筋梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本より多くの喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇより大きい、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。２型糖尿病については、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％より大きい、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、または高脂血症剤を服用している者とした。
【０１０６】
年齢、高血圧、中性脂肪、空腹時血糖、ヘモグロビンＡｌｃでは心筋梗塞患者群と対照群との間に差がなかった。性別、ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症（HC）、糖尿病については、心筋梗塞患者群のほうが対照群よりも有意に高値であった。ＨＤＬコレステロールは、対照群よりも心筋梗塞患者群の方が、有意に低値であった。
年齢、性別、喫煙歴、ＢＭＩ、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表２３に示した。
【０１０７】
【表２３】
【０１０８】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である性別（Gender）・高コレステロール血症（HC)・２型糖尿病（Type-2 diabetes）・ＢＭＩと遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＮ９ｂ，Ｇ１，Ｍ７ｃを、男性における従来の危険因子である高コレステロール血症・２型糖尿病・ＢＭＩと遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ｂ，Ｇ１を、女性における従来の危険因子である高コレステロール血症と遺伝的危険因子（該当なし）を、それぞれ意味している。
【０１０９】
ハプログループＮ９ｂは、被験者全員（P = 0.0019）、および男性（P = 0.0007）において、心筋梗塞に対して抵抗性が認められた。また、ハプログループＭ７ｃは、被験者全員において、有意に心筋梗塞に対して抵抗性が認められた(P = 0.0357)。一方、男性の場合には、ハプログループＧ１が心筋梗塞のリスクが高い傾向があった(P<0.05)。
表２４には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【０１１０】
【表２４】
【０１１１】
表より、ハプログループＮ９ｂは、被験者全員において、心筋梗塞のリスクが低いことが明らかとなった（P = 0.0018)。
男性の場合には、高コレステロール血症、糖尿病とともに、ハプログループＮ９ｂは、心筋梗塞に対して独立した抵抗性の因子であった（P = 0.0005)。また、女性の場合には、心筋梗塞に関連したハプログループは認められなかった。
表２５には、ｍｔＳＮＰｓのうち、心筋梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【０１１２】
【表２５】
【０１１３】
表中、「＊」は表３において示すように、１２個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００４未満であることを示している。
年齢、性別、喫煙状態、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ｂを代表する２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａ（ＮＤ４：Ｓｅｒ８６Ａｓｎ）、１４８９３Ａ＞Ｇ（Ｃｙｔｂ：ｓｙｎ）、およびハプログループＢ４ｂを代表する４８２０Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）の３個のｍｔＳＮＰｓが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった（P < 0.005）。一方、ハプログループＭを代表するｍｔＳＮＰである１０３９８Ａ＞Ｇ（ＮＤ３：Ｔｈｒ１１４Ａｌａ）と８７０１Ａ＞Ｇ（ＡＴＰ６：Ｔｈｒ５９Ａｌａ）の２個のｍｔＳＮＰｓが、心筋梗塞に感受性が有ることがわかった（P < 0.005）。
【０１１４】
男性の場合には、年齢、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ｂを代表する２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａと１４８９３Ａ＞Ｇが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった(各々P = 0.0006, P= 0.0007)。さらにハプログループＮ９ｂ＋Ｙを代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞Ａは、心筋梗塞に対して抵抗性を示した。また、ハプログループＢ４ｂを代表するｍｔＳＮＰである４８２０Ｇ＞Ａと６０２３Ｇ＞Ａは、男性の場合には、心筋梗塞に対して抵抗性があった（P < 0.05）。一方、ハプログループＧ１を代表するｍｔＳＮＰである８２００Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に感受性があることがわかった（P = 0.034）。
【０１１５】
女性の場合には、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１０４１０Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に感受性があることがわかった（P = 0.0012）。また、ハプログループＤ４ａを代表する他の３個のｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ、８４７３Ｔ＞Ｃ、１４９７９Ｔ＞Ｃ、ハプログループＭを代表する３個のｍｔＳＮＰである８７０１Ａ＞Ｇ、１０３９８Ａ＞Ｇ、１０４００Ｃ＞Ｔ、ハプログループＢを代表するｍｔＳＮＰである８２７２ｄ９、およびハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａは、それぞれ心筋梗塞に対する危険性が高かった（P < 0.05）。
表２６に示すように、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【０１１６】
【表２６】
【０１１７】
表中、「＊」は表３において示すように、１２個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００４未満であることを示している。
２個のｍｔＳＮＰ（11016G>A (N9a)、4820G>A (B4b)）は、全対照者にとって心筋梗塞に抵抗性を示した(それぞれP = 0.0009, P = 0.0019)。１０個のｍｔＳＮＰ（11016G>A, 4820G>A, 8793T>C, 856A>G,4850C>T, 9833T>C, 8200T>C, 10410T>C, 9296C>T and 15508C>T)の総合的な寄与は０.０１９７（上記１０個の寄与率（R2）の総和）であった。
【０１１８】
男性の場合には、ハプログループＮ９ｂを代表するｍｔＳＮＰである１４８９３Ａ＞Ｇは、防御的な因子であった(P = 0.0005)。４個のｍｔＳＮＰ（14893A>G, 4820G>a, 8200T>C, 8793T>C）の総合的な寄与は０.０１３７（上記４個の寄与率（R2）の総和）であった。
女性の場合には、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１０４１０Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に対する危険因子であった（P = 0.0012）。５個のｍｔＳＮＰ（10410T>C, 9296C>T, 10398A>G, 856A>G, 9833T>C）の総合的な寄与は０.０３２０（上記５個の寄与率（R2）の総和）であった。
【０１１９】
＜考察＞
我々は、１２種類の主要なミトコンドリアハプログループと心筋梗塞との関係に付いて、２１３７名の日本人を対象とした大規模な関連解析を行った。年齢、性別、喫煙履歴、ＢＭＩ、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無で補正したところ、全対象者について、ハプログループＮ９ｂを持つ者は心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0019)。特に、男性の場合には、ハプログループＮ９ｂは、心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0007)。ハプログループＮ９ｂは、４カ所の多型（10607, 11016, 13183, 14893）で特徴付けられる。このハプログループは、東アジア全体で見ると、大変まれであり中国南部と韓国にはほとんど認められない。一方、土着の琉球人とアイヌ人を含めた日本人には最もよく認められる（非特許文献１３）。
【０１２０】
遺伝子型タイピングに用いられる２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａと１３１８３Ａ＞Ｇとを除くと、ハプログループＮ９ｂを特徴付けるほとんどのｍｔＳＮＰは同義置換である（例えば、5147G>A, 10607C>T, 14893A>G 。非特許文献４１）。ハプログループＮ９ｂを特徴付けるｍｔＳＮＰのうち、心筋梗塞の危険性に関連する可能性のある機能的多型としては、２つの多型、すなわち１１０１６Ｇ＞Ａ（ND4: Ser>Asn）と１３１８３Ａ＞Ｇ（ND5: Ile>Val）がある。アミノ酸残基が、種の中で保存されているかどうか確認するために、この２個の多型について、ｍｔＳＮＰデータベースに登録された６１種類の哺乳類のアミノ酸配列と比較した。１３１８３Ａ＞Ｇ多型は、グランサム値（Grantham value）が２９であり保存的置換であった（非特許文献４２）。また、６１種類の哺乳類の中で、この位置のアミノ酸は多様性があるために、機能的多型の一つである可能性は低かった。
【０１２１】
一方、１１０１６Ｇ＞Ａ多型については、Ｓｅｒ＞Ａｓｎはグランサム値は４６であり、保存的置換としての値は高くなかった。しかし、６１種類の哺乳類の中で、この位置のアミノ酸がセリンであったのは、３種類の生物種（ヒト、シロガオオマキザル、およびアフリカサバンナゾウ）で認められるのみであった。従って、セリンは、ヒトにとって特徴的なアミノ酸の一つである可能性が高い。
【０１２２】
ハプログループＭ７ｃは、２個の多型（4071, 4850）によって特徴付けられる。ハプログループＭ７ｃは、全対象者において、心筋梗塞が有意に低かった(P<0.05)。このハプログループは、中国全体では最も多様性が高いが（７６％±１１％）、アイヌでは存在せず、本州人には頻度が少ないが、マレーシアサバー州の住民とフィリピン人にはよく見られる（非特許文献１３）。ハプログループＭ７ｃに属するＨＮｓｑ０１６０は、９０１７Ｔ＞Ｃ（グランサム値８９のＩ１６４Ｔとなる）を伴い、百寿者に認められる。したがって、ハプログループＭ７ｃは、心筋梗塞に対抗し、長寿に関係が深いと思われる。
【０１２３】
本研究では、男性の場合には、ハプログループＧ１は、心筋梗塞の危険因子であった(P<0.05)。ハプログループＧの本幹には、３個のｍｔＳＮＰｓ（709, 4833, 5108）がある（非特許文献１０、１３)。近年、８２００位と１５４９７位のｍｔＳＮＰｓがハプログループＧ１の決定に用いられるようになった(非特許文献１３、４３)。１５３２３Ｇ＞Ａと１５４９７Ｇ＞Ａは、Ｃｙｔｂに非同義置換を生じる多型であり、これらが機能的な多型である可能性がある。１５３２３Ｇ＞Ａにより生じるＡｌａ１９３Ｔｈｒと、１５４９７Ｇ＞Ａにより生じるＧｌｙ２５１Ｓｅｒの２つのアミノ酸置換のグランサム値は、それぞれ５８、５６である。ＣｙｔｂにおけるＧｌｙ２５１は、６１種類の哺乳類中、５５種類で保存されている。国立長寿研究所の加齢研究（ＮＩＬＳ−ＬＳＡ）で行われた研究によれば、１５４９７Ｇ＞Ａは、中年・初老日本人対象における肥満に関係があった（非特許文献２６）。
【０１２４】
また、本発明者らの研究成果によれば、年齢と喫煙状態の補正をすると、女性の場合には、体重、ＢＭＩ、ウエスト・ヒップ比、脂肪量、脂肪のない量（fat-free mass）、腹腔内脂肪、中性脂肪は、１５４９７Ｇ型に比べると、１５４９７Ａ型の方が有意に増加していた。また、血糖とヘモグロビンＡｌｃには違いが見られなかったが、血清中インシュリン量は、１５４９７Ｇ型より１５４９７Ａ型の方が２０％高値であった。したがってこれらの観察では、１５４９７Ａは、高血圧、高血糖、高コレステロール血症を伴わない単純肥満と関係があることが示唆された。したがって、Ｃｙｔｂ遺伝子の１５４９７Ｇ＞Ａ多型は、不完全なサイトクロムｂ分子を形成し、エネルギー代謝の減少を引き起こすような、重要な多型である可能性がある。
【０１２５】
１５４９８Ｇ＞Ａ多型によるＧｌｙ２５１Ａｓｐ置換は、病的であると言われている。この位置のグリシンがアスパラギン酸に変わると、複合体IIIのユビキノン結合部位のＱｐ部位の残基であるＧｌｕ２７１によって、電気的な斥力を生じることになる（非特許文献２７、４４）。そうすると、Ｑｐ部位の構造を変化させ、ヒドロキノン結合が弱くなる。１５４９７Ｇ＞Ａにより生じるＧｌｙ２５１Ｓｅｒ置換は、Ｇｌｕ２７１による斥力を生じることにならないが、この置換はＱｐ部位のユビキノンとの結合に影響を与える可能性が高い。
【０１２６】
本研究の当初の目的は、心筋梗塞に対抗する或いは危険性のあるハプログループを明らかにする事であった。しかし、我々が予想しなかった事に、サブハプログループＢ４ｂ、Ｄ４ａ、マクロハプログループＭで示されるｍｔＳＮＰが心筋梗塞に関連している事が示唆された。厳格な基準（P>0.005）で選んだ多型の中には、サブハプログループＢ４ｂ、Ｄ４ａ、マクロハプログループＭと心筋梗塞との間に有意な関連が示された。心筋梗塞・冠動脈疾患を含む心疾患と、核ＤＮＡの変異との間の関係を評価した報告が多く認められる。現在までに、心筋梗塞と関係のある多くの遺伝子（例えば、connexin 37, plasminogen-activator inhibitor type 1, and stromelysin-1遺伝子など）が報告されている。冠動脈疾患の遺伝的リスクを診断するシステムが、これらの核ＤＮＡ多型を基礎として展開されている（非特許文献４５）。ｍｔＤＮＡと核ＤＮＡとの多型が、心筋梗塞の予測をする情報を与えることが判明し、それによって、この疾患の一次予防に有用であろう。
【０１２７】
近年、脳梗塞などの動脈硬化性疾患とミトコンドリア多型やハプロタイプの関係を論じた報告が散見される。Ｆｉｎｎｉｌａらは、コンホメーション感受性ゲル電気泳動（conformation sensitive gel electrophoresis：CSGE）とダイレクト・シークエンス法を用いることによって、患者群と対照群のｍｔＤＮＡのコード領域の全塩基配列を決定し、１２３０８Ａ＞Ｇ多型によって見いだされるハプログループＵが、偏頭痛において後頭葉発作のリスクの構成要素になることを示した（非特許文献４６、４７）。
【０１２８】
我々の大規模研究によれば、男性の場合には、ハプログループＮ９ｂは心筋梗塞の発症が有意に低くなる保護因子であった。一方、女性の場合には、そのような関係は見られなかった。この理由については、現段階では不明である。
一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると１０歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、ＮＯやＰＧＩ２の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン１の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす（非特許文献４８）。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するｍｔＳＮＰが男性と女性とで異なるのかも知れない。
【０１２９】
最近数年間の間に、心筋梗塞と核ＤＮＡにコードされる遺伝子中の多型との関係を調べた報告が相次いでいる（非特許文献４５）。対象となった遺伝子としては、例えばシクロオキシゲナーゼ２（非特許文献４９）、ロイコトリエンＡ４ヒドロゲナーゼ（非特許文献５０）、５−リポキシゲナーゼ活性化蛋白質（非特許文献５１）、リンフォトキシンα（非特許文献５２）、ＬＧＡＬＳ２コード化ガレクチン２（非特許文献５３）、細胞骨格蛋白パラディン、チロシンキナーゼ、２つのＧタンパク結合受容体（非特許文献５４）などがある。また、初期の心筋梗塞と遺伝子中の多型との関係を調べた報告として、対象とされた遺伝子には、血小板脱顆粒中のＶＡＭＰ８、リボ核蛋白をコードするＨＮＲＰＵＬ１（非特許文献５５）、プラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター・タイプ１（非特許文献５６）、血清マトリックスメタロプロテアーゼ３（非特許文献５７）がある。そうすると、ｍｔＤＮＡの多型と核ＤＮＡの多型との両者が、心筋梗塞などの冠状動脈疾患に対する遺伝的リスクを評価するために役立ち、疾患の一次予防に寄与すると思われる。
このように、本実施形態によれば、日本人のｍｔＤＮＡを１２個のハプログループに分類することにより、心筋梗塞の遺伝的危険度を予測することができた。このことにより、心筋梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【０１３０】
４．アテローム血栓性脳梗塞への応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人１０８１名（男性６４１名、女性４４０名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月までに３つの参加病院（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院）の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。アテローム血栓性脳梗塞を伴う患者群は、３４６名（男性２３４名、女性１１２名）であった。患者群について虚血性や出血性脳卒中の鑑別は、新たに突然発症した神経学的な巣症状や徴候が２４時間以上持続すること、および脳ＣＴ或いは脳ＭＲＩ（または、その両者の検査）により確認された。脳卒中の分類は、Classification of Cerebrovascular Diseases III (非特許文献５８)を用いて決定した。心原性塞栓症とラクナ梗塞、一過性脳虚血発作、脳血管奇形、脳腫瘍、外傷性脳血管障害、心臓弁膜症を伴うか心房細動、心臓弁膜症を伴わない心房細動に関する患者は除外した。７３５名（男性４０７名、女性３２８名）の健常者である対照群は、健康診断のために参加病院を受診した者であった。対照群には、虚血性あるいは出血性脳卒中、冠動脈疾患、末梢性動脈閉塞性疾患、他の動脈硬化性疾患、他の血栓、塞栓、出血性疾患の既往歴は無かった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１１個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【０１３１】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、アテローム血栓性脳梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定、またはマン・ホイットニーＵ検定（the Mann−Whitney U test）を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
アテローム血栓性脳梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、ＢＭＩ（body mass index）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、アテローム血栓性脳梗塞を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１１個のハプログループを調べたので、０.０５を１１で除して、０.００４５とした。こうして、０.００４５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
【０１３２】
＜結果＞
１０８１名の被験者に関する基礎的データを表２７に示した。
【表２７】
【０１３３】
表中において、最左欄は上段から順に、対象数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、２型糖尿病（Type-2 diabetes）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群（CI）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、男性（Male）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値、女性（Female）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本より多くの喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇより大きい、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。２型糖尿病については、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％より大きい、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、または高脂血症剤を服用している者とした。
【０１３４】
ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症、総コレステロール値、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、空腹時血糖値、ヘモグロビンＡｌｃはアテローム血栓性脳梗塞患者の全員と対照群とでは差がなかった。年齢、高血圧、収縮期血圧、拡張期血圧、２型糖尿病では、アテローム血栓性脳梗塞患者群の方が対照群よりも有意に高値であった（P < 0.005）。反対に、女性/男性比は、アテローム血栓性脳梗塞患者群が対象群よりも有意に低かった（P = 0.0001）。ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症については、いずれも疾患群と対照群との間に差異は認められなかった。
表２８には、カイ二乗検定により、ミトコンドリアハプログループの分布を評価した結果を示した。
【０１３５】
【表２８】
【０１３６】
表に示す通り、全対象者を評価した場合には、Ｎ９ａ(P = 0.0174, OR = 0.435)とＭ７ｃ(P = 0.0260, OR = 0.251)の二つのハプログループが、アテローム血栓性脳梗塞に関連していることがわかった。女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、オッズ比０.１３９で疾患の危険性が低い傾向があった（P = 0.0073)。
年齢、性別、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表２９に示した。
【０１３７】
【表２９】
【０１３８】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である性別（Gender）・２型糖尿病（Type-2 diabetes）・高血圧（Hypertension）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）（対象となるハプログループなし）を、女性における従来の危険因子である高血圧・２型糖尿病と遺伝的危険因子であるハプログループＡを、男性における従来の危険因子である２型糖尿病・高血圧と遺伝的危険因子（該当なし）を、それぞれ意味している。
【０１３９】
女性の場合には、ハプログループＡでアテローム血栓性脳梗塞への感受性（オッズ比２.０９）が認められた（P=0.0409）。なお、全員を対象とした場合、および、男性の場合には、いずれのハプログループについても有意差は認められなかった。
表３０には、ｍｔＳＮＰｓのうち、アテローム血栓性脳梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【０１４０】
【表３０】
【０１４１】
年齢、性別、喫煙状態、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、全対象群では、ハプログループＤ５のサブハプログループであるハプログループＤ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰの３７５９Ａ＞Ｇは、アテローム血栓性脳梗塞に対する抵抗性を示すことがわかった（P < 0.05）。また、ハプログループＡ１のサブハプログループであるハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰの１４９４４Ｃ＞Ｔと、ハプログループＤ５のサブハプログループであるハプログループＤ５ａ２を代表するｍｔＳＮＰの１３１０Ｃ＞Ｔは、アテローム血栓性脳梗塞に罹患しやすいことがわかった（P < 0.05）。
女性の場合には、年齢、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症で補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔが、アテローム血栓性脳梗塞に罹りやすいことがわかった（P < 0.05）。男性の場合には、ハプログループＤ５ａ２（ハプログループＤ５のサブハプログループ）を代表するｍｔＳＮＰである１３１０Ｃ＞Ｔが、アテローム血栓性脳梗塞に罹患しやすいことがわかった（P < 0.05）。
表３１には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【０１４２】
【表３１】
【０１４３】
表中、「＊」は表２において示すように、１１個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。
全対照群において、３個のｍｔＳＮＰ（すなわち、ハプログループＤ５ｂ１ｂを代表する３７５９Ａ＞Ｇ、ハプログループＭ７ｃを代表する４８５０Ｃ＞Ｔ、およびハプログループＤ４ｂ２ａを代表する１４２８７Ｔ＞Ｃ）がアテローム血栓性脳梗塞に抵抗性があることがわかった（P < 0.05）。また、２個のｍｔＳＮＰ（すなわち、ハプログループＤ５ａ２を代表する１３１０Ｃ＞Ｔ、およびハプログループＡ１ａ１ａを代表する１４９４４Ｃ＞Ｔ）が、アテローム血栓性脳梗塞に感受性があることがわかった（P < 0.05）。これら５個のｍｔＳＮＰの総合的な寄与（各ｍｔＳＮＰの寄与率（R2）の総和）は、０.１２１であった。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａは、アテローム血栓性脳梗塞に対して抵抗性が認められた（P = 0.0214)。男性の場合には、ハプログループＤ５ａ２を代表するｍｔＳＮＰである１３１０Ｃ＞Ｔは、アテローム血栓性脳梗塞に対する感受性が認められた（P = 0.0235）。
【０１４４】
＜考察＞
我々は１０８１名の日本人に基づく大規模な関連解析を行い、１１個の主要なミトコンドリアハプログループのそれぞれとアテローム血栓性脳梗塞との間の関係を調査した。カイ二乗検定によって、患者群と対照群との間の定性的な比較を行ったところ、ミトコンドリアハプログループＮ９ａとＭ７ｃについては、有意に（P<0.05）疾患の罹患率が低いことがわかった。また、女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、アテローム血栓性脳梗塞の罹患率が低くなる傾向が認められた（P = 0.0073）。
多項ロジスティック回帰分析法によれば、女性の場合には、ハプログループＡは、アテローム血栓性脳梗塞に有意に（P<0.05)関係していた。ハプログループＮ９ａ及びＭ７ｃと、アテローム血栓性脳梗塞との関係は、２型糖尿病についての補正を行うと、消失するようにも見える。ハプログループＭ７ｃについての理由は明確ではないものの、前記応用例に示すように、ハプログループＮ９ａは、メタボリック症候群と２型糖尿病に対して抵抗性があることがわかった。
これは、ミトコンドリアハプログループとアテローム血栓性脳梗塞との関係を調べた最初の報告である。
【０１４５】
ハプログループＡを代表するｍｔＳＮＰである８７９４Ｃ＞Ｔは、ＡＴＰａｓｅサブユニット６においてＨ９０Ｙ置換（９０位のヒスチジンをチロシンに置換する）を引き起こす。ＡＴＰ６遺伝子は、サブユニットａをコードしている。サブユニットａは、ＡＴＰａｓｅ（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｖ）のＦｏセクタを横断してプロトンを輸送する際に重要な役割を果たす（非特許文献１３）。Ｈｉｓ９０Ｔｙｓの置換のグランサム値は８３であることから（非特許文献４２）、この多型は機能的多型である可能性がある。Ｌ１５６Ｒ置換を引き起こす８９９３Ｔ＞Ｇトランスバージョンは、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、および色素視神経網膜炎）症候群（非特許文献３２、３３）の原因となる病原性突然変異である。従って、８７９４Ｃ＞Ｔによって惹き起こされたＨ９０Ｙ置換がＡＴＰ６サブユニットとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｖ）の機能に影響を与える可能性がある。しかしながら、ミトコンドリア機能および代謝に対する８７９４Ｃ＞Ｔ（ＡＴＰ６：Ｈ９０Ｙ）の実際の効果については未知であることから、この多型とアテローム血栓性脳梗塞に対する感受性との関係を理解するために更なる調査が望まれる。また、前述（２型糖尿病への応用）のように、この多型と２型糖尿病との関係も明らかとなった。
【０１４６】
本実施形態によれば、女性の場合には、ハプログループＡとアテローム血栓性脳梗塞との関係が示されたが、男性の場合には、そのような関係は認められなかった。性別による相違の原因は、今のところ不明である。一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると１０歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、ＮＯやＰＧＩ２の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン１の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす（非特許文献４８）。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するｍｔＳＮＰが男性と女性とで異なるのかも知れない。
【０１４７】
虚血性脳卒中は多くの病因に基づく不均一な疾患であるが、小動脈及び大動脈に発生することが一般的である。脳卒中と頸動脈アテローム血栓に関しては、いくつかの遺伝的リスクに関する報告がある（非特許文献５９、６０、６１）。頸動脈での脈管内膜−中膜壁厚（ＩＭＴ）は、無症状アテローム血栓性脳梗塞の代理指標であり、将来の虚血性脳卒中に対する強力な予測指標である。近親関係（双子、兄弟、及び家族）の調査結果によれば、ＩＭＴには遺伝的な関連が認められるが、関連する遺伝子は同定されていない。細胞間物質（stromelysin-1、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ３）、炎症(インターロイキン６）、脂質代謝（肝リパーゼ、アポリポ蛋白Ｅ、コレステロールエステルトランスファ蛋白、パラオキソナーゼ）、及び凝固系（ファクターＶライデン、フィブリノーゲン）に関与する遺伝子の機能的な変異があるとＩＭＴが高いという報告がある。更に、ラクナ脳梗塞は、アテローム血栓性脳梗塞の初期において発症原因の元になることが示唆されている。ラクナ脳梗塞を含む血栓性梗塞は、アメリカ人やヨーロッパ各国人に比べて、日本人を含むモンゴリアンを起源とする東アジア人に多く発症する（非特許文献６２、６３、６４、６５）。ミトコンドリアＤＮＡのＤループ中の高変異部位における１６１８９Ｔ＞Ｃトランジションは、インスリン抵抗性糖尿病、２型糖尿病、ラクナ脳梗塞に罹患しやすいという報告がある。フィニーラらによれば、ｍｔＳＮＰの１２３０８Ａ＞Ｇによって代表されるミトコンドリアハプログループＵは、片頭痛における後頭梗塞の危険性が高い危険因子であることが示された（非特許文献６６、６７）。
このように本実施形態によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、アテローム血栓性脳梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、アテローム血栓性脳梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【０１４８】
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【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図３】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（１）である。図の下端には、ハプログループ及びサブハプログループを示している（図４及び図４においても同じである）。
【図４】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（２）である。
【図５】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（３）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法、及びそのためのキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアゲノムにおける母系遺伝的な変異は、過去２０万年の間にホモサピエンスがアフリカからアジアへそしてヨーロッパへと拡散する間に、新らたな突然変異がそれに順次追加されて来た結果である（非特許文献１）。ミトコンドリアゲノムの突然変異の発生率は、核ゲノムの突然変異の発生率よりも約１０倍高いので、ホモサピエンスの比較的短い歴史の間に蓄積されて来た古代のミトコンドリア多型は、現代人の代謝特性の解明に貢献する可能性がある（非特許文献２）。世界の様々な地域で発見されたミトコンドリアのハプログループは、人類が寒冷な気候とその下での栄養条件に適応的に選択されて来た結果であると推測することができる（非特許文献２〜非特許文献４）。
【０００３】
ミトコンドリアハプログループ間で機能的な差が存在する事を示す証拠が、精子運動性（非特許文献５）、敗血症後の生存率（非特許文献６）、及びパーキンソン病に対する感受性（非特許文献７）の研究によって与えられている。初期の研究では、我々は、肥満（非特許文献１１）、るい痩（非特許文献１２）、２型糖尿病（非特許文献１１）、或いはアテローム性動脈硬化症といったエネルギー代謝に関与するものと同じく、例えば寿命（非特許文献８）、パーキンソン病（非特許文献９、１０）及びアルツハイマー病といった年齢関連疾患に関与するミトコンドリア単一ヌクレオチド多型（ｍｔＳＮＰｓ）を同定することを目標としていた。
【０００４】
この目的のために、我々は７つの異なる集団に属する６７２名分の完全ミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定した。各集団はおのおの９６名から構成され、百寿者、パーキンソン病罹患者、アルツハイマー病罹患者、肥満者、非肥満者、重度の血管性病変を持つ２型糖尿病、血管性病変を持たない２型糖尿病罹患者の７群であった。
これらの調査結果から、我々は、ヒトのミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）を構築した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記ｍｔＳＮＰデータを活用するための遺伝子検出法として、適当なものが開発されていなかったために、これらのデータを十分に生かし切ることができなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ｍｔＤＮＡの多型（ｍｔＳＮＰ）を効果的に検出するための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、長年に亘ってヒトミトコンドリアゲノムに関する研究を行っている者である。ヒトミトコンドリアＤＮＡは、連鎖した複数のｍｔＳＮＰを有するハプログループに分類することができる。図３〜図５には、ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示した。このハプログループの分布は、人種間において、かなり大きな隔たりがある。個々の日本人は、主要な１０個〜１２個のハプログループによって、そのほとんど（約９０パーセント以上）を分類することができる。各ハプログループは、数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰによって特徴付けられる。例えば、ハプログループＦは、８７０１、９５４０、１０３９８、１０８７３、１５３０１、１６５１９、１２７０５、１６２２３、１６１８３、１６５１９、３９７０、１３９２８、１６３０４、２４８、６３９２、１０３１０等の位置にｍｔＳＮＰを有している（その他のハプログループについても、同様の状況が存在する）。ハプログループ分類をするために、これら全てのｍｔＳＮＰを調べようとするのは、大変な労力が掛かるため大規模な研究には向きにくい。しかしながら、これらのうちのいずれのｍｔＳＮＰを選択・検出すれば、適切にハプログループを分類することが可能であるかについては明確には知られていなかった。加えて、選択した各ｍｔＳＮＰを迅速かつ的確に検出する方法については開発が十分に進んでいなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、ミトコンドリアゲノムのコード領域における包括的な多型分析を基にして、全部で１８６個の核酸プローブを用いて、所定部位の多型を認識する遺伝子検出方法の開発に成功した。この方法により、日本人において少なくとも主要な１０個〜１２個のハプログループ（１０個の場合には、Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５である。１１個の場合には、これら１０個にＭ７ｃを追加することができる。また、１２個の場合には、これら１１個にＮ９ｂを追加することができる。）を分類することにより、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００８】
つまり、各ハプログループが持っている数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰのうち、適当に１個〜５個のｍｔＳＮＰを選択することにより、表１〜表３に示すｍｔＳＮＰｓを検出すれば、ハプログループの分類が可能であること、及びそのための効率的な検出方法を開発した。
この遺伝子検出方法を利用することにより、上記各ハプログループと、４種類の疾患（すなわち、メタボリックシンドローム（ＭＳ）、２型糖尿病、心筋梗塞、及びアテローム血栓性脳梗塞）との関係を大規模に解析した。その結果、次のことがわかった。
【０００９】
ＭＳにおいては、ハプログループＮ９ａ、Ｇ１及びＤ５において、特に女性の場合には、疾患に対する抵抗性が認められた。
２型糖尿病においては、ハプログループＦを持つ者は罹患する危険性が高いこと、ハプログループＮ９ａを持つ者は疾患に対する抵抗性を有すること（特に、女性の場合）、および女性の場合にはハプログループＡを持つ者は罹患する危険性が高いことがわかった。
心筋梗塞においては、ハプログループＮ９ｂを持つ者が疾患に対する抵抗性を有すること、及びハプログループＧ１を持つ者は罹患する危険性が高いこと（特に、男性の場合）がわかった。
アテローム血栓性脳梗塞においては、ハプログループＡを持つ者は、罹患する危険性が高いこと（特に、女性の場合）がわかった。
【００１０】
こうして、上記課題を解決するために、第一の発明に係るヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出することを特徴とする。配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブは、後述のように、適当な目的（すなわち、ａが多型チェック用、ｂが野生型認識用、ｐがＰＣＲ産物チェック用、ｍがマクロハプログループＭチェック用、ｎがマクロハプログループＮチェック用である）のために設計されたものである。すなわち、これらの核酸プローブは有用な多型部位を認識できることがわかっていることから、これらの多型部位から少なくとも５個以上の多型部位を検出することにより、後述の効果を持つ検出方法とできる。
第一の発明においては、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出することが好ましい。
また、これら１０個のハプログループに加えて、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１１個のハプログループ、或いは、更に１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出することもできる。
【００１１】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）＞多型塩基」の順で記載する。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ」は、５２３１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、その多型が生じている遺伝子（ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の位置について、カッコ書きで情報を示すことがある。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）」とは、上記多型について、ＮＤ２遺伝子において、アミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置（欠失または挿入に関する塩基情報）」の順で記載する。例えば、「８２７２（9-bp deletion in non-coding region）」とは、８２７２位の非コード領域における９個の塩基の欠失多型であることを意味している。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。
【００１２】
一般にミトコンドリアＤＮＡ多型（ｍｔＳＮＰｓ）或いはミトコンドリアＤＮＡハプログループは、対象となる集団（例えば、日本人・中国人・韓国人を含む東アジア人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。このため、日本人以外の集団において、疾患との関係が指摘されているハプログループであっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人におけるハプログループおよび疾患との関連が裏付けられるわけではない。
【００１３】
本発明において、ｍｔＳＮＰを検出する方法としては、従来公知の方法、例えばＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ（或いはＤＮＡマイクロアレイ）、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法などの方法を用いることができる。これらの中でも、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることにより、数百個程度の多型であれば迅速に測定することができる。なお、同方法の詳細については後に詳述する。
第一の発明においては、ヒトミトコンドリアＤＮＡを含む試料から前記１０個或いは１２個のハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ工程、このＰＣＲ工程によって増幅されたＤＮＡフラグメントと前記ｍｔＳＮＰのいずれか一つを認識する核酸プローブとをハイブリッドさせるハイブリッド工程、前記核酸プローブによって認識されたｍｔＳＮＰを検出する検出工程とを含むことが好ましい。
【００１４】
ＤＮＡプライマーとしては、適当な長さ（例えば、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上）のものを合成して用いることができる。ＰＣＲ工程によって合成されるＤＮＡフラグメントは、表１〜表３に記載のｍｔＳＮＰを含むものであれば適当な長さのもの（例えば、５０塩基対（１００塩基対、または１５０塩基対）〜３０００塩基対（２０００塩基対、または１０００塩基対）の範囲で適当な長さに選択できる）が合成されるようにして、ＤＮＡプライマーを設計することができる。また、ＤＮＡフラグメントの長さは、１９０塩基対〜５２０塩基対であることが好ましい。
ＤＮＡプライマーについては、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものを用いることにより、１７種類のＤＮＡフラグメントを合成することが好ましい。
【００１５】
核酸プローブは、全長が１５塩基〜４０塩基であり、かつ検出すべきｍｔＳＮＰの位置が５’末端または３’末端から５塩基以上内側に位置させることが好ましい。核酸プローブのＴｍは、任意に設定することができるが、一般的にＤＮＡフラグメントの二重鎖をほどいて変性させるための温度である９０℃程度よりも十分に低く、かつ室温である２５℃よりも十分に高いことが好ましい。そのような温度設定としては、４０℃〜７０℃（好ましくは、４５℃〜６５℃）を選択することができる。Ｔｍとしては、簡易式として、４℃ｘ（ＧまたはＣ数）＋２℃ｘ（ＡまたはＴ数）を用いることができる。
また、核酸プローブをＤＮＡフラグメントとハイブリッドさせる際には、複数の核酸プローブを用いる場合に同じ温度設定で実施できることが操作上の簡易性の観点から見て好ましい。そのため、全ての核酸プローブのＴｍを適当な範囲に収まるように設計することが好ましい。例えば、ハイブリッド工程における温度から２０℃（好ましくは１５℃）程度までの範囲に収めることが好ましい。例えば、ハイブリッド工程が５２℃で行われる場合には、Ｔｍを５０℃（好ましくは５２℃）〜７０℃（好ましくは６７℃）の範囲に設定することが好ましい。
【００１６】
そのような核酸プローブとして、１０個のハプログループを検出する場合には、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載のものを用いることが好ましい。また、１２個のハプログループを検出する場合には、更に配列番号１３８、配列番号１８０、配列番号２１３に記載の核酸プローブを用いることが好ましい。
【００１７】
遺伝子検出方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。この方法は、Ｇ＆Ｇサイエンス社が主体となって開発されたものである（非特許文献２０）。但し、この方法をｍｔＳＮＰに応用するのは本発明者らが始めてである。この方法を用いるためには、ＤＮＡプライマーはビオチン化されており、核酸プローブは固相化されていると共に、検出工程においては、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素を用いることが好ましい。また、核酸プローブは、３’或いは５’の末端のいずれかを固相化、或いは末端ではない適当な位置を固相化しても良い。また、固相化用の担体としては、平板状（プレート）或いは球状のものを用いることができる。
【００１８】
第二の発明におけるヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キットは、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出する核酸プローブを備えることができる。また、この発明においては、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出するための核酸プローブを備えたことを特徴とする。本発明においては、前記１０個のハプログループに加えて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出するための核酸プローブを備えることができる。
【００１９】
また、本発明においては、前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＰＣＲ法によって増幅可能なビオチン化されたＤＮＡプライマーセットと、前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを検出するための核酸プローブが固相化された担体と、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素とを備えることが好ましい。そのようなＤＮＡプライマーセットとして、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものを用いることができる。
【００２０】
また、核酸プローブとしては、ハプログループが１０個の場合には、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載のものを用いることができる。また、ハプログループを１１個とする場合には、配列番号１８０に記載の核酸プローブを、１２個とする場合には、更に配列番号１３８、配列番号２１３に記載の核酸プローブを用いることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、日本人のｍｔＤＮＡのハプログループを簡易に検出することができる。このハプログループ分類により、各種の疾患（例えば、ＭＳ、２型糖尿病、心筋梗塞、アテローム血栓性脳梗塞など）の遺伝的危険度を予測することができる。この発明を用いることにより、各種の疾患に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００２３】
＜ハプログループ分類のためのミトコンドリア多型の選択＞
１．１０個のハプログループへの分類
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース (http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml) 及び日本人の系統樹（非特許文献１３）を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である１６６個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において発見された１０個の主要なハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，及びＤ５）を定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表１に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、及び各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「＊」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
２．１１個または１２個のハプログループへの分類
更に、上記１０個に加えて、Ｍ７ｃを加えた１１個のハプログループを定義するｍｔＳＮＰｓ、及び更にＮ９ｂを加えた１２個のハプログループを定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表２及び表３に示した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】
表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、および各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「Syn」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
＜多型の遺伝子タイピング＞
被験者である日本人から５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含む試験管に、７ｍＬの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてＤＮＡ（ヒトｍｔＤＮＡを含む試料）を分離した。
ＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ工程を実施した。このとき使用したＤＮＡプライマーを表４及び表５に示した。表４中のＤＮＡ配列は、配列番号１〜配列番号２８として、配列表に示した。また、表５中のＤＮＡ配列は、配列番号２９〜配列番号５６として、配列表に示した。これらの配列番号のうち、１０個〜１２個のハプログループを同定するために必要なＤＮＡフラグメントを合成するためのＤＮＡプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載の３４個のものである。これら３４個のＤＮＡプライマーを利用することにより、１７種類のＤＮＡフラグメントが合成される。本実施形態においては、更に１１種類の別のＤＮＡフラグメントを合成するためのＤＮＡプライマーの塩基配列が用いられた。
【００２９】
【表４】
【００３０】
【表５】
【００３１】
表中、左よりフラグメント番号（Fragment）、フォワードプライマー（Forward primer）における位置（positon）及びその塩基配列（Sequence(5'→3'））、リバースプライマー（Reverse primer）における位置（Position）及びその塩基配列（Sequence(5'→3')）、及びＤＮＡフラグメント（Product）の長さ（bp）を示す。
ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社、日本）で決定した。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献２０）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。
【００３２】
また、ハプロタイピングのために使用した核酸プローブの塩基配列を表６〜表１１に示した。今回のタイピングには、最大で１００種類の多型の判定が行えるものを用いた。本発明に係る１０個のハプログループを同定するためには、少なくとも配列番号６６（3010a）、配列番号７４（4048a）、配列番号７５（4071a）、配列番号７８（4386a）、配列番号８３（4833a）、配列番号８６（5108a）、配列番号８８（5178a）、配列番号９０（5231a）、配列番号９９（8272a）、配列番号１０７（8794a）、配列番号１１５（10310a）、配列番号１１６（10397a）、配列番号１２８（12811a）、配列番号１３３（13563a）、配列番号１３４（13928a）、配列番号１４７（15497a）、配列番号１５７（663a）、配列番号１５８（709a）、配列番号１６３（2772a）、配列番号１７４（3970a）、配列番号１８１（4883a）、配列番号１８８（6680a）、配列番号１９３（8200a）、配列番号２２１（12358a）、配列番号２２２（12372a）に記載の塩基配列を備えた核酸プローブを用いればよい。また、１１個のハプログループを同定するには、これらに加えて、配列番号１８０（4850a）に記載の核酸プローブを用いればよい。１２個のハプログループを同定するには、更に配列番号１３８（14893a）、配列番号２１３（11016a）に記載の核酸プローブを用いればよい。本実施形態では、これらのｍｔＳＮＰよりも多くのＳＮＰを検出するための多くの核酸プローブが開示されている。
本実施形態においては、１８６種類の核酸プローブを用いるために、全体を１００種類のセット（プローブセットＡ）と８６種類のセット（プローブセットＢ）とに分けて、タイピングを行った。表６〜表８にはプローブセットＡの詳細を、表９〜表１１にはプローブセットＢの詳細を示した。
【００３３】
【表６】
【００３４】
【表７】
【００３５】
【表８】
【００３６】
【表９】
【００３７】
【表１０】
【００３８】
【表１１】
【００３９】
表６〜表８については、第１のセット（プローブセットＡ）について、ｍｔＤＮＡにおける位置（Position）、目的（Purpose）、プローブの塩基配列（Sequence）を示している。また、目的の欄については、「ａ」が多型チェック用、「ｂ」が野生型チェック用、「ｐ」がＰＣＲ産物チェック用、「ｍ」及び「ｎ」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表９〜表１１については、第２のセット（プローブセットＢ）について、上記と同じ意味である。各塩基配列については、配列番号５７〜配列番号２４２として、配列表に示した。
【００４０】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の基本的な考え方は、非特許文献２０に記載の通りである。以下には、この方法をｍｔＳＮＰに応用した本実施形態の方法について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズ（本発明における固相に該当する）の微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている（本発明における核酸プローブの固相化に該当する）。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている（Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社（Austin）、米国テキサス州）。こうして、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。
【００４１】
複数種類の核酸プローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類の核酸プローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
本実施例においては、表６〜表８に記載の１００種類のプローブを第１セット（セットＡ）とし、表９〜表１１に記載の８６種類のプローブを第２セット（セットＢ）として、２セットを用いることで、合計１８６種類の多型を検出可能な検出系とした。これら１８６種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアＤＮＡを少なくとも１２種類のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｍ７ｃ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５）に分類することができる。
【００４２】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順を示した。
＜ＰＣＲ工程（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡフラグメントを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチン化したプライマーを用いた。ｍｔＤＮＡフラグメントを増幅するために２８−ｐｌｅｘ ＰＣＲを行った。２ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（３０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２.５％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０.１μＭずつのプライマーセットを混合し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０.６２５Ｕ）と１ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００４３】
＜ハイブリッド工程（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（１.５Ｍ ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１２５％ Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００４４】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに７５μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００４５】
＜検出工程（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを検出した。検出には、２種類のレーザを使用して行った。ビーズの種類については、６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光については、５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００４６】
この方法に拠る遺伝子タイピングの精度を確かめるために、９１個のＤＮＡサンプルを材料に使用した。これらのＤＮＡサンプルは、ミトコンドリアゲノムの全塩基配列が直接シーケンスによって既に決定されているものである。各例において、ルミネックスシーケンス特異性オリゴヌクレオチドハイブリッドアッセイシステム（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によって決定された遺伝子型は、直接シーケンスによって決定されたものと一致した。
【００４７】
１．メタボリックシンドロームへの応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人１３３７名（男性８８３名、女性４５４名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月の間に、３つの研究参加病院（岐阜県立岐阜病院、多治見病院及び下呂温泉病院）の１つを外来した受診者、或いは入院者である。診断は、成人治療パネルIII（非特許文献１６）により提唱されたメタボリックシンドローム（ＭＳ）に関する修正定義に基づいて行った。この修正版は、スコットランド西部冠動脈疾患予防研究（非特許文献１７）及び女性の健康に関する研究（非特許文献１８）においても使用されたものである。但し、それらの研究では、ウエストサイズの代わりに体重指標（ＢＭＩ）が採用されている。日本人及び他のアジア人集団においては、肥満指標のためのＢＭＩ基準を改訂する必要性が最近認識されている（非特許文献１９）。このため、我々はこの改定基準を基にして、ＢＭＩ値が２５ｋｇ／ｍ２以上の者を肥満者とした。
【００４８】
対象者が次の５つの因子の内の３つ以上を持っている場合にＭＳであると診断した。５つの因子とは、（１）２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、（２）トリグリセリド血清濃度が１.６５ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ）以上、（３）ＨＤＬコレステロール血清濃度が、男性では１.０４ｍｍｏｌ／Ｌ（４０ｍｇ／ｄＬ）未満、女性では１.３０ｍｍｏｌ／Ｌ（５０ｍｇ／ｄＬ）未満、（４）収縮期血圧が１３０ｍｍＨｇ以上、かつ拡張期血圧が８５ｍｍＨｇ以上、及び（５）絶食時血漿グルコース濃度が６.０５ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）以上の５個である。
【００４９】
これらの基準に基づき、８７１名（男性５８４名、女性２８７名）がＭＳ患者であると診断された。対照群は、総数４６６名（男性２９９名、女性１６７名）である。対照群者は、参加病院に年に一度の健康チェックのために外来受診した者達である。これらの者は、ＭＳの５つの基準のうちのいずれも有していなかった。また、肥満、高脂血症、異常脂血症、高血圧症、或いは糖尿病の既往歴も何ら有していなかった。代謝性もしくは内分泌性疾患の患者、或いは二次性の糖尿病を引き起こす薬剤を服用する者は、本研究の対象からは除外した。研究プロトコルは、岐阜県国際バイオ研究所のヒト研究に関する倫理委員会により承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１０個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【００５０】
＜統計的分析＞
量的な臨床データは、ＭＳ罹患群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
ＭＳと関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、及び各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、ＭＳを従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、及び９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【００５１】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１０個のハプログループを調べたので、０.０５を１０で除して、０.００５とした。こうして、０.００５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
【００５２】
＜結果＞
１３３７名の被験者に関する基礎的データを表１２に示した。
【表１２】
【００５３】
表中において、最左欄は上段から順に、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、糖尿病（Diabetes mellitus）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）におけるＭＳ群（MS）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、女性（Women）におけるＭＳ群の値と対照群の値とＰ値、男性（Men）におけるＭＳ群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本以上の喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。糖尿病については、絶食時血漿グルコース濃度が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、または高脂血症剤を服用している者とした。
【００５４】
年齢及び性別（女／男比率）については、いずれもＭＳ罹患群と対照群との間で統計的な差異は認められなかった。ＢＭＩ、トリグリセリド、絶食時血糖濃度、及びヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）比率は、対照群に比べるとＭＳ罹患群においては有意に高かった。ＨＤＬコレステロールはＭＳ罹患群では対照群に比べて有意に低かった。喫煙率、高血圧症、高コレステロール血症及び真性糖尿病は、対照群に比較してＭＳ罹患群では有意に高かった。
年齢、性別、喫煙状態を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果、Ｐ値が０.０５未満で、ハプログループＮ９ａがＭＳに対する抵抗性に関連した。また、ハプログループＮ９ａ，Ｇ１，Ｄ５の３グループの女性は、ＭＳに対する抵抗性に関連することが明らかとなった（表１３）。
【００５５】
【表１３】
【００５６】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である年齢（Age）・性別（Gender）・喫煙率（Smoking）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＮ９ａを、女性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ａ、Ｇ１、Ｄ５を、男性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子（該当するハプログループなし）をそれぞれ意味している。
我々は、ハプログループの多重比較について、０.００５未満のＰ値が得られた場合に、その関連が有意であると考えた。この基準に基づくと、ハプログループＮ９ａは、女性ではＭＳに対する抵抗性に有意に関係していた。ステップワイズ前向き選択法の結果、女性については、ハプログループＮ９ａがＭＳに対する保護因子であることが明らかになった（表１４）。しかしながら、男性については、これらのハプログループのうちのいずれもＭＳとの関連は示されなかった。
【００５７】
【表１４】
【００５８】
女性の場合は、ステップワイズ前向き選択法の結果、年齢、ハプログループＮ９ａ，Ｇ１及びＤ５が、ＭＳに対して独立的な危険因子、或いは保護因子であることが明らかとなった。ハプログループＮ９ａ，Ｇ１及びＤ５のＭＳからの保護作用についての全体としての貢献度は、０.０３６１であった。これは女性の場合には、ミトコンドリアゲノム多型がＭＳに対する感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示している。
表１５には、ｍｔＳＮＰｓのうち、ＭＳに対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【００５９】
【表１５】
【００６０】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
年齢、性別及び喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析によれば、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ａ１９０Ｔ）が、全対象者でＭＳへの抵抗性に関連することが明らかとなった（Ｐ＜０.０５）。
更に、ハプログループＮ９ａを代表する３個のｍｔＳＮＰｓである５２３１Ｇ＞Ａ、１２３７２Ｇ＞Ａ、及び１２３５８Ａ＞Ｇ、ハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃ、及びサブハプログループＧ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰである３７５９Ａ＞Ｇは、ＭＳに対する抵抗性と関連があった。これと対照的に、３個のｍｔＳＮＰｓ、すなわちサブハプログループＦ１を代表する１２４０６Ｇ＞Ａ、サブハプログループＤ４ｂ２ｂを代表する９２９６Ｃ＞Ｔ、及びサブハプログループＢ４ｃを代表する１５３４６Ｇ＞Ａは、ＭＳへの感受性に関連があった（Ｐ＜０.０５）。
【００６１】
女性の場合には、年齢及び喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ａを代表する３個のｍｔＳＮＰｓである５２３１Ｇ＞Ａ、１２３７２Ｇ＞Ａ、及び１２３５８Ａ＞Ｇが、それぞれ危険率（Ｐ）が０.０００９、０.００４２、及び０.００４２で、ＭＳに対する抵抗性と関係することが明らかになった。更に、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃも、ＭＳへの抵抗性と関係していた。
ハプログループＧ１を代表する２個のｍｔＳＮＰｓである８２００Ｔ＞Ｃ及び１５４９７Ｇ＞Ａ、サブハプログループＧ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１５８６０Ａ＞Ｇ、サブハプログループＧ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰである３７５９Ａ＞Ｇは、ＭＳに対する抵抗と関係があった。
【００６２】
対照的に、２つのｍｔＳＮＰｓ、即ちサブハプログループＦ１を代表する１２４０６Ｇ＞Ａ、及びサブハプログループＤ５を代表する１０３９７Ａ＞Ｇは、ＭＳへの感受性と関係があった（Ｐ＜０.０５）。
男性の場合は、ハプログループＮ９ｂ１を代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞ＡがＭＳへの感受性に関係があった（Ｐ＜０.０５）。
我々は１６６個の異なるｍｔＳＮＰｓに対して修正ボンフェローニ法を適用したが、これらのＰ値のうちのいずれも有意レベルが０.０００３以下を示さなかった。
【００６３】
表１６に示すように、ステップワイズ前向き選択法によれば、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａが、女性の場合にはＭＳに対する保護因子であることが明らかとなった（Ｐ＝０.０００３）。
４個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち５２３１Ｇ＞Ａ、８２００Ｔ＞Ｃ、３７５９Ａ＞Ｇ、及び１５３１４Ｇ＞ＡのＭＳへの保護作用の全体としての貢献度は、０.０５５２であった。これは、女性の場合には、これらのｍｔＳＮＰｓがＭＳへの感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示唆している。
【００６４】
【表１６】
【００６５】
＜考察＞
我々は１３３７名に基づく大規模な関連解析を行い、１０種類の主要なミトコンドリアハプログループのそれぞれとＭＳとの間の関係を調査した。これらのハプログループのうち、Ｎ９ａ、Ｇ１、及びＤ５の３つは、女性の場合には、ＭＳに対する抵抗性と有意に関係していた。ハプログループＮ９ａに特有なｍｔＳＮＰｓの大部分は、５２３１Ｇ＞Ａ及び１２３７２Ｇ＞Ａを含む同義変異であるが、これらは本研究の遺伝子タイピングを行うのに使用した。
このハプログループにおいて、機能的な多型としては、１５０Ｃ＞Ｔ及び３３８Ｃ＞Ｔが候補として挙げられる。これらはミトコンドリアゲノムの非コード領域にある。１５０Ｃ＞Ｔ置換はイタリアの百寿者で最初に報告された（非特許文献２１）。また、以前に我々は、この置換がフィンランド人と日本人共に健康な長寿と関連していることを報告した（非特許文献２２）。このように、１５０Ｃ＞Ｔは、女性ではＭＳに対する抵抗性を付与する可能性がある。
【００６６】
ハプログループＭ９ａに特異的なｍｔＳＮＰｓのうちで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５遺伝子産物（ＮＤ５）において、Ｔｈｒ８Ａｌａ置換を惹き起こす１２３５８Ａ＞Ｇは、機能的な多型の一つであるかも知れない。
ＮＤ５はｍｔＤＮＡにコードされたサブユニットの７個の内の一つであるが、これらのサブユニットは呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素、ＥＣ１．６．５．３）の約４１個のポリペプチドに含まれる。複合体Ｉは、ＮＡＤＨから電子を受け取り、それをユビキノン（補酵素Ｑ１０）に転送する。その際に得られたエネルギーを用いて、ミトコンドリア内膜を通してプロトンを輸送する。ＮＤ５は、おそらく疎水性蛋白質断片の構成成分である。このサブユニットは、複合体Ｉの機能には欠かすことができない。ＮＤ５遺伝子における各種のミスセンス変異（例えば、１２７０６Ｔ＞Ｃ（Ｆ２４Ｌ）、１２７７０Ａ＞Ｇ（Ｅ１４５Ｇ）、１３０４５Ａ＞Ｃ（Ｍ２３７Ｌ）、１３０８４Ａ＞Ｔ（Ｓ２５０Ｃ）、１３５１３Ｇ＞Ａ（Ｄ３９３Ｎ）、１３０４２Ｇ＞Ａ（Ａ２３６Ｔ）、１３７３０Ａ（Ｅ４６５Ｇ））が、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）（非特許文献２３）、リー症候群（非特許文献２４）、或いはミトコンドリア性ミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中様症状を呈する症候群（ＭＥＬＡＳ）（非特許文献２５）の患者において報告されている。従って、１２３５８Ａ＞Ｇによって惹き起こされたＴｈｒ８Ａｌａ置換がＮＤ５サブユニット及び複合体Ｉの機能に影響を及ぼす可能性がある。１２３５８Ａ＞Ｇがミトコンドリアの機能に対して与える影響については、このハプログループを持つｍｔＤＮＡを導入した細胞を用いた実験により調査されるべきである。
【００６７】
１５０Ｃ＞Ｔと１２３５８Ａ＞Ｇの両ＳＮＰｓを持つハプログループＮ９ａを有する女性の代謝的特徴は、内臓肥満、インスリン抵抗性及び脂質代謝に影響を与え、それによってＭＳに対する抵抗性が与えられるものと考えられる。
ハプログループＧ１に特有のｍｔＳＮＰｓのなかでは、１５３２３Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ａ１９３Ｔ）または１５４９７Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ｇ２５１Ｓ）のいずれかは、機能的多型のようである。
国立長寿医療研究センターの加齢に関する縦断的研究（ＮＩＬＳ−ＬＳＡ）の一部としての我々の以前の調査によれば、１５４９７Ｇ＞Ａ（Ｃｙｔｂ：Ｇ２５１Ｓ）が、日本人集団の中年及び年配者層における肥満と関係していることが明らかとなった（非特許文献２６）。
【００６８】
年齢及び喫煙状態を補正した統計解析によれば、１５４９７Ｇを持つ女性に比較すると、１５４９７Ａを持つ女性では、体重、ＢＭＩ、ウエスト及びヒップ廻りのサイズ、脂肪量、脂肪以外の質量、腹腔内脂肪、及びトリグリセリドが有意に大きい事が分かった。また、血漿インスリン濃度は、１５４９７Ｇを持つ女性に比べると、１５４９７Ａを持つ女性の方が２０％高かった。ところが、絶食時血漿グルコース及びヘモグロビンＡｌｃは、２つの集団の間で有意差は見られなかった。これらの結果は、１５４９７Ａが、高血圧症、高血糖或いは高コレステロール血症（これらはＭＳを構成する因子である）を伴わない単純肥満に関係することを示唆している。こうして、１５４９７Ａを伴うハプログループＧ１がＭＳに対する抵抗性を獲得しているとの本研究の結果は、グルコース及びコレステロール代謝が１５４９７Ａ対立遺伝子を持つ女性では比較的正常であるとの我々の既報と一致するものである。ミトコンドリアの酸化的リン酸化系は、細胞活動のために必要な主要なエネルギー源である。上記の結果は、チトクロームｂｃ１複合体におけるミトコンドリアのエネルギー保存効率の上昇によって、結果としてエネルギー消費の減少を惹き起こしたということかも知れない（非特許文献１０）。別の可能性として、複合体IIIのユビキノン結合部位の一つであるＱ０部位でユビキノンの還元を抑制することが、結果として脂肪酸のベータ酸化を減少させ、脂肪を蓄積させるのかも知れない。アンドリューらは、２５１位のグリシンがアスパラギン酸に置換された場合に、Ｑｐ部位にある２７１位のグルタミン残基との間の電荷反撥を惹き起こすので、Ｍｔ１５４９８Ｇ＞Ａ突然変異に起因するＧ２５１Ｄ置換が病因であると主張している（非特許文献２７）。この置換は、Ｑｐ部位の構造を変え、ヒドロキノン結合を損なう可能性がある。２５１位のグリシンをセリンに置換しても、２７１位のグルタミン酸との間に電荷反発を惹き起こさないと考えられるが、この置換がＱｐ部位に対するユビキノンの親和性に影響を及ぼすことは推測し得る。
【００６９】
我々は、ハプログループＤ５に関しても、同様にｍｔＳＮＰデータベース(http://www.giib.or.jp/mtsnp/search_mtSNP_e.html)を用いて、ミトコンドリアゲノムにおける機能的なｍｔＳＮＰｓを探索した。ハプログループＤ５に属するサブハプログループの間で、サブハプログループＤ５ａ１、Ｄ５ａ２、及びＤ５ｂ２は、日本人集団においては高頻度に観察される。我々の以前の研究によれば、３名の日本人の百寿者（個体番号TCsq0012(女性、１００歳）、個体番号GCsq0022(男性、１０２歳)、個体番号TCsq0030(女性、１００歳））は、各々ハプログループＤ５ａ１、Ｄ５ａ２、及びＤ５ｂ２を持っていた(非特許文献１３、図１Ｂ）。また、我々は、５１７８Ｃ＞Ａ多型（ＮＤ２：Ｌ２３７Ｍ）を特徴とするハプログループＤが長寿に関係していること、及びこの多型が加齢に関連する疾患に対する抵抗性を与えるということを報告している（非特許文献８）。５１７８Ｃ＞Ａに加え、更にハプログループＤ５を持つ者は、ミトコンドリアゲノムの非コード領域に１５０Ｃ＞Ｔ塩基多型を持っている。１５０Ｃ＞Ｔ変異が、日本人百寿者とフィンランドの９０歳以上の高齢者の両者において、各々の対照群に比較してより頻繁に検出されることを我々は最近報告した（非特許文献２２）。今回の研究で明らかとなったように、ハプログループＤ５がＭＳに対して防御的効果を示すという結果は、１５０Ｃ＞Ｔが長寿と関係しているという以前の我々の報告に一致するものである。
【００７０】
ミトコンドリアには組換え機構が存在しないので、各ハプログループ或いはサブハプログループにおけるｍｔＳＮＰｓの全ては、相互に強固にリンクしている。従って、今回の研究において調査されたｍｔＳＮＰｓのあるものが、ＭＳに対する抵抗性を担っている他のミトコンドリア遺伝子の機能的多型と、連鎖不平衡の関係にあるということがあり得る。
女性の場合、ハプログループＮ９ａ、Ｇ１及びＤ５は、ＭＳに対する抵抗性と関連していた。一方、男性の場合には、このような関係は見出されなかった。遺伝的変異が肥満に関係する度合いが、男性に比して女性ではより高いとの考えを支持する他の証拠がある（非特許文献２８、２９）。クマジーらは、性相互作用により遺伝子型を導入し、脂肪重量をメンデル混合モデルにて分析したところ、男性では脂肪重量の分散値全体の３７％を主な遺伝子が担い、一方女性では４３％が担っていた（非特許文献）。しかしながら、我々の知る限りでは、ｍｔＤＮＡ多型とＭＳとの関係における性別の影響に関してほとんど報告がない。以前の関連解析には、核遺伝子多型とＭＳとの関係について調査がされている。
【００７１】
山田らは、アポリポ蛋白Ａ−Ｖ遺伝子プロモーター領域における単一ヌクレオチド多型がＭＳと関係することを示した（投稿中）。これらｍｔＳＮＰｓ及び核ＳＮＰｓの遺伝子タイピングは、ＭＳの遺伝的危険度を予測するのに有益であり、かつＭＳの一次予防に貢献できる。
このように、本実施形態によれば、日本人のｍｔＤＮＡを１０個のハプログループに分類することにより、ハプログループとＭＳとの関係が示された。
【００７２】
２．２型糖尿病への応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人２９０６名（男性１９３８名、女性９６８名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月の間に、３つの研究参加病院（岐阜県立岐阜病院、多治見病院および下呂温泉病院）の１つを外来した受診者、或いは入院患者であった。２型糖尿病患者は、絶食時血漿グルコースレベルが６.９９ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）濃度が６.５％以上を示す者、或いは糖尿病に対する薬物治療下にあった。２型糖尿病は、世界保健機構により承認された基準に従って定義した。これらの基準に基づいて、研究対象集団中の１２８９名の被験者（男性８９０名、女性３９９名）が、２型糖尿病患者であると診断された。残りの１６１７名（男性１０４８名、女性５６９名）は対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者である。対照群は、絶食時血漿グルコースレベルが６.１１ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）未満であり、ヘモグロビンＡｌｃが５.６％未満を示し、かつ２型糖尿病の既往歴ならびに２型糖尿病に対する薬物治療を受けた経験が無い者であった。
研究プロトコルは、岐阜県国際バイオ研究所のヒト研究に関する倫理委員会により承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１０個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【００７３】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、２型糖尿病患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
２型糖尿病と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、２型糖尿病を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【００７４】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１０個のハプログループを調べたので、０.０５を１０で除して、０.００５とした。こうして、０.００５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
【００７５】
＜結果＞
２９０６名の被験者に関する基礎的データを表１７に示した。
【表１７】
【００７６】
表中において、最左欄は上段から順に、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）における２型糖尿病患者群（Type 2 diabetes）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、女性（Women）における２型糖尿病患者群の値と対照群の値とＰ値、男性（Men）における２型糖尿病患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本以上の喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、または高脂血症剤を服用している者とした。
【００７７】
年齢は２型糖尿病患者群において対照群よりも低かったが、ＢＭＩ、収縮期および弛緩期血圧、トリグリセリド、絶食時血漿グルコース濃度、およびヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）比率は、対照群に比べると２型糖尿病患者群においては有意に高かった（Ｐ＜０.０５）。
年齢とＨＤＬコレステロールは、対照群に比して２型糖尿病患者者の方が有意に低かった（Ｐ＜０.０５）。喫煙率、高血圧症、高コレステロール血症は、対照群に比較して２型糖尿病患者群では有意に高かった（Ｐ＜０.０５）。女性／男性の比率は、対照群に比して２型糖尿病患者群の方が有意に低かった（Ｐ＜０.０５）。
年齢、性別、喫煙状態を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表１８に示した。
【００７８】
【表１８】
【００７９】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である年齢（Age）・性別（Gender）・喫煙率（Smoking）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＦ、Ｎ９ａを、女性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ａ、Ｆ、Ａを、男性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＦをそれぞれ意味している。
【００８０】
表に示す通り、Ｐ値が０.０５未満で、ハプログループＦを持つ被験者が、２型糖尿病罹患のリスクが有意に高いことが明らかとなった。これとは対照的に、ハプログループＮ９ａを持つ被験者は、２型糖尿病に罹患するリスクが低い傾向を示した（P = 0.023, オッズ率 0.64（95% CI 0.43-0.94））。ハプログループＮ９ａを持つ女性は、２型糖尿病罹患のリスクが有意に低かった（P =0.0042, オッズ率 0.27（95% CI 0.10-0.62））。一方、ハプログループＦおよびＡを持つ女性は２型糖尿病罹患のリスクが高い傾向を示した（Ｆについては、P = 0.0165, オッズ率 1.78（95% CI 1.11-2.89）；Ａについては、P = 0.0405, オッズ率 1.67（95% CI 1.02-2.73））。ハプログループＦを持つ男性は、２型糖尿病に罹患するリスクが高かった（P = 0.0482, オッズ率1.43（95% CI 1.00-2.05））。
我々は、ハプログループの多重比較について、０.００５未満のＰ値が得られた場合に、その関連が有意であると考えた。この基準に基づくと、ハプログループＦは、全ての被験者について２型糖尿病に対する感受性に有意に関与していた（P = 0.0028）。一方、女性について、ハプログループＮ９ａは、２型糖尿病に対する抵抗性に有意に関与していた（ P = 0.0042）。
表１９には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【００８１】
【表１９】
【００８２】
表より、ハプログループＦは全ての被験者について、２型糖尿病に対する危険因子であることが明らかとなった（P = 0.0035）。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａは２型糖尿病に対する防御因子であり（P = 0.0013）、ハプログループＦとＡは２型糖尿病に対して独立な危険因子である可能性が示された（Ｆについて、P = 0.0227；Ａについて、P = 0.0374）。しかし男性の場合には、これらのハプログループのいずれも、２型糖尿病との関連性を示さなかった。
女性の場合、ハプログループＮ９ａ、Ｆ、およびＡの２型糖尿病への抵抗性に対する総合的な寄与は０.０１５２（３つのハプログループの寄与率(R2)の和）であった。これはミトコンドリアゲノム多型が、特に女性においては、２型糖尿病への感受性に影響する重要な遺伝要因であることを示唆している。
表２０には、ｍｔＳＮＰｓのうち、２型糖尿病に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【００８３】
【表２０】
【００８４】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＦを代表する３個のｍｔＳＮＰである３９７０Ｃ＞Ｔ、１０３１０Ｇ＞Ａおよび１３９２８Ｇ＞Ｃ、ハプログループＦ１を代表するｍｔＳＮＰである１２４０６Ｇ＞Ａ（配列番号２２３の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、ハプログループＦ１ｂ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１３９２８Ｇ＞Ｃが、全ての被験者に関して、糖尿病と関連性を持つことが明らかになった（P = 0.0014 [10310G>A] , P = 0.0025 [12406G>A], P = 0.0028 [3970C>T], P=0.0028 [13928G>C]。これらは149 個のmtSNP の比較に対しての無修正値（ボンフェローニの補正を行っていない値）である）。個々のｍｔＳＮＰについては、各ハプロタイプに対応していることから、ハプロタイプに適用した有意水準（Ｐ＜０.００５）で判断を行った。
【００８５】
サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔ（配列番号１４１の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＦ１ｂ１ａまたはＮ９ｂ１を代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞Ａ（配列番号８７の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＢ５ｂ３を代表するｍｔＳＮＰである８８５６Ｇ＞Ａ（配列番号２０１の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、およびサブハプログループＦ１ｂ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４４７６Ｇ＞Ａ（配列番号１３７の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）を保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対する危険性が高かった。
対照的に、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃ（配列番号１４３の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＮ９ａを代表する２個のｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａ、並びにサブハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ（配列番号２３７の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）を保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に抵抗性を示した。
【００８６】
女性については、年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ａを代表する２個のｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａが、糖尿病に対する抵抗性に関係することが明らかになった（ P = 0.0025 , P = 0.0035。これは149 個のmtSNP の比較に対しての無修正値である）。これに対し、サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔは、糖尿病に対する危険性が高かった（P = 0.0035）。更に、サブハプログループＦ１を代表するｍｔＳＮＰである１２４０６Ｇ＞Ａ、ハプログループＦを代表する３個のｍｔＳＮＰである１３９２８Ｇ＞Ｃ、１０３１０Ｇ＞Ａ、および３９７０Ｃ＞Ｔ、サブハプログループＡ１ａを代表するｍｔＳＮＰである４６５５Ｇ＞Ａ（配列番号１７６の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、サブハプログループＢ５ｂ３を代表するｍｔＳＮＰである８８５６Ｇ＞Ａ、ハプログループＡを代表する２個のｍｔＳＮＰである６６３Ａ＞Ｇおよび８７９４Ｃ＞Ｔを保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが高いことがわかった。
【００８７】
これに対し、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである１２３５８Ａ＞Ｇ、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃを持つ女性は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが低いことがわかった。
男性の場合には、年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＦを代表するｍｔＳＮＰである１０３１０Ｇ＞Ａを持つと、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが高いことがわかった。
表２１に示すように、ステップワイズ前向き選択法によれば、ハプログループＦを代表するｍｔＳＮＰである１０３１０Ｇ＞Ａが全被験者で２型糖尿病に対する危険因子であることが明らかになった（P = 0.0018）。
【００８８】
【表２１】
【００８９】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａが、２型糖尿病に対する防御因子であることが明らかになった（P = 0.0006）。他方、サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔは、２型糖尿病に対する危険因子であった（P = 0.0036）。７個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち５２３１Ｇ＞Ａ、１４９４４Ｃ＞Ｔ、１２４０６Ｇ＞Ａ、８７６２Ｔ＞Ｃ、８８５６Ｇ＞Ａ、１２３５８Ａ＞Ｇ、および８３８３Ｔ＞Ｃの糖尿病に対する感受性ならびに／若しくは防御性への総合的な寄与は０.０３６４（７個のｍｔＳＮＰｓの寄与率（R2）の和）であった。
【００９０】
男性の場合には、サブハプログループＦ４ａを代表するｍｔＳＮＰである７８６１Ｔ＞Ｃ（配列番号１９１の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）は、２型糖尿病に対する危険因子であった（P = 0.0005）。４個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち７８６１Ｔ＞Ｃ、１３９１Ｔ＞Ｃ（配列番号１６０の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）、１０３１０Ｇ＞Ａ、および１５０４７Ｇ＞Ａ（配列番号２３６の塩基配列を持つ核酸プローブを用いることにより検出可能である。本実施形態においては検出されている。）の２型糖尿病に対する感受性への総合的な寄与は０.０１０１（４個のｍｔＳＮＰｓの寄与率（R2）の和）であった。
これらの結果は、上記のｍｔＳＮＰｓが、特に女性の場合には２型糖尿病に対する感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示している。
【００９１】
＜考察＞
我々は、２９０６名の被験者に基づく大規模な関連解析を行い、２型糖尿病と１０個の主要なミトコンドリアハプログループとの間の関係を調査した。これらのハプログループのうち、ハプログループＦは全ての被験者で２型糖尿病のリスクに有意に関係していた。女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、２型糖尿病に対する抵抗性に有意に関係していた。一方、ハプログループＦおよびハプログループＡは、２型糖尿病に対するリスクに関係していた。男性の場合には、ハプログループＦは、２型糖尿病のリスクと関係していた。
【００９２】
我々は、ミトコンドリアＤＮＡ配列の解析から、日本人集団がマクロハプログループＮとＭとに分割されることを報告した（非特許文献１３）。マクロハプログループＭは、１０個の強固なｍｔＳＮＰｓがリンクしたマクロハプログループＮとは異なっている。マクロハプログループＮには、４個の主要なハプログループ、すなわちＦ、Ｂ、Ａ、およびＮ９ａが含まれる。他方、マクロハプログループＭには、６個の主要なハプログループ、すなわちＭ７ａ、Ｍ７ｂ、Ｇ１、Ｇ２、Ｄ４およびＤ５が含まれる。こうして、日本人集団は、これら１０個の主なハプログループに分類される。
【００９３】
ハプログループＦに特異なｍｔＳＮＰに、１３９２８Ｇ＞Ｃトランスバージョンは、潜在的な機能的多型の１つである。このｍｔＳＮＰは、ＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット５遺伝子産物（ＮＤ５）中で、Ｓ５３１Ｔ置換を起こすことが知られている。ＮＤ５はｍｔＤＮＡにコードされたサブユニットの７個の内の一つであるが、これらのサブユニットは呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素、ＥＣ１．６．５．３）の約４１個のポリペプチドに含まれている。複合体Ｉは、ＮＡＤＨから電子を受け取り、それをユビキノン（補酵素Ｑ１０）に転送する。その際に得られたエネルギーを用いて、ミトコンドリア内膜を通してプロトンを輸送する。
【００９４】
ＮＤ５は、複合体Ｉの機能には欠かすことができない。その理由は、ＮＤ５遺伝子中の様々なミスセンス変異が、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）（非特許文献２３）、リー症候群（非特許文献３２）、またはミトコンドリア性ミオパチー、脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様症状から成る症候群（ＭＥＬＡＳ）（非特許文献７）に罹患する患者において報告されているからである。従って、１３９２８Ｇ＞Ｃによって惹き起こされるＳ５３１Ｔ置換が、ＮＤ５サブユニットおよび複合体Ｉの機能に影響を及ぼすと考えることができる。１３９２８Ｇ＞Ｃ（ＮＤ５：Ｓ５３１Ｔ）がミトコンドリア機能に及ぼす具体的な作用については、このハプログループを伴うｍｔＤＮＡを持つ細胞質雑種細胞系統を使う実験によって確認することができ得る。
【００９５】
ハプログループＦを持つ個人の代謝特性は、おそらくインスリン分泌ならびに／あるいはインスリン抵抗性に影響を与えることによって、２型糖尿病に対する抵抗性を得るものと思われる。ハプログループＦに属するサブハプログループ（Ｆ１ａ、Ｆ１ｂ、Ｆ１ｃ、Ｆ２ａ、Ｆ３、Ｆ４ａ、およびＦ４ｂ）の内、サブハプログループＦ１ｂは１６１８９Ｇ＞Ｃ多型によって定義される。この多型はハプログループＢにおいても検出されること、およびハプログループＢは本研究では糖尿病に関係しなかったことから、１６１８９Ｔ＞Ｃ多型は２型糖尿病とは関係しないと判断される。
【００９６】
ハプログループＮ９ａに特有のｍｔＳＮＰｓは、ほとんど同義突然変異である。これらの同義突然変異のうち、５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａは、本研究の遺伝子タイピングに使用した。このハプログループに於ける機能的な多型として考えられる候補は、１５０Ｃ＞Ｔおよび３３８Ｃ＞Ｔであるが、これらはミトコンドリアゲノムの非コード領域にある。１５０Ｃ＞Ｔ置換は、イタリアの百寿者で最初に報告された（非特許文献３０）。また我々は、この置換がフィンランドと日本の両国で共に健康的な長寿者と関連していることを報告している（非特許文献３１）。このため、１５０Ｃ＞Ｔは、女性の場合には２型糖尿病に対する抵抗性を授与するものと考えられる。
【００９７】
ハプログループＮ９ａに特異なｍｔＳＮＰｓのうちでは、１２３５８Ａ＞ＧがＮＤ５サブユニットにＴ８Ａ置換（８位のスレオニンをアラニンに置換する）を惹き起こすことから、潜在的な機能的な多型であると考えられる。１２３５８Ａ＞Ｇによって惹き起こされたＴ８Ａ置換が、ＮＤ５サブユニットおよび複合体Ｉの機能に影響を与えるかも知れない。１２３５８Ａ＞Ｇ（ＮＤ５：Ｔ８Ａ）がミトコンドリア機能に与える具体的な作用については、細胞実験によって調査することができ得る。１５０Ｃ＞Ｔと１２３５８Ａ＞Ｇの両者を備えたハプログループＮ９ａを持つ女性の代謝特性は、２型糖尿病に対する抵抗性の機構を理解するために更なる調査が望まれる。
【００９８】
本研究において、女性の場合には、ハプログループＡが２型糖尿病への感受性と関連を持つことを見出した。ハプログループＡは８７９４Ｃ＞Ｔ突然変異を特徴とするが、この変異はＡＴＰａｓｅサブユニット６においてＨ９０Ｙ置換（９０位のヒスチジンをチロシンに置換する）を惹き起こす。ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅは、核ＤＮＡにコードされた１０−１６個のサブユニットおよびｍｔＤＮＡにコードされた２個のサブユニット（ＡＴＰａｓｅ６およびＡＴＰａｓｅ８）から構成される。ＡＴＰ６遺伝子は、サブユニットaをコードする。サブユニットａは、ＡＴＰａｓｅのＦｏセクタを横断してプロトンを輸送する際に重要な役割を果たす。Ｌ１５６Ｒ置換を惹き起こす８９９３Ｔ＞Ｇトランスバージョン、およびＬ１５６Ｐ置換を惹き起こす８９９３Ｔ＞Ｃトランジションは、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、および色素視神経網膜炎）症候群（非特許文献３２、３３）の原因となる病原性突然変異である。従って、８７９４Ｃ＞Ｔによって惹き起こされたＨ９０Ｙ置換がＡＴＰ６サブユニットとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（複合体Ｖ）の機能に影響を与える可能性がある。
【００９９】
ミトコンドリア機能および代謝に対する８７９４Ｃ＞Ｔ（ＡＴＰ６：Ｈ９０Ｙ）の実際の効果については、この多型と２型糖尿病に対する感受性との関係を理解するために更なる調査が望まれる。ミトコンドリアには組換え機構が存在しないので、各ハプログループあるいはサブハプログループに於けるｍｔＳＮＰｓの全ては、相互に強く連鎖している。従って、本研究で調べたｍｔＳＮＰｓのいくつかが連鎖不均衡にあって、２型糖尿病に対する感受性若しくは抵抗性を実際に担う他のミトコンドリア遺伝子の機能的な多型にそのｍｔＳＮＰが連鎖している可能性がある。女性の場合、ハプログループＮ９ａは２型糖尿病に対する抵抗性に関係していたが、この関係は男性の場合には検出されなかった。
【０１００】
遺伝的変異と肥満との関係は、男性の場合に比べると女性の方が強いという考えを支持する他の証拠がある（非特許文献３４、３５）。Ｃｏｍｕｚｚｉｅらは、性相互作用により遺伝子型を導入し、脂肪重量をメンデル混合モデルにて分析したところ、男性では脂肪重量の分散値全体の３７％を主な遺伝子が担い、女性では４３％を担っていた（非特許文献３５）。これまでに、核遺伝子多型と糖尿病との間の関係についての関連解析がいくつか認められる。グルコキナーゼをコードする遺伝子の多型（非特許文献３６）、インスリン受容体基質１（非特許文献３７）、ペルオキシソーム増殖因子活性性受容体γ（非特許文献３８）、カルパイン−１０（非特許文献３９）、およびアディポネクチン（非特許文献４０）は、糖尿病に関連するものと報告されている。
しかしながら、ミトコンドリアＤＮＡ多型と２型糖尿病との関係に対する性別の果たす影響に関しては、今までのところほとんど報告が見られない。本明細書が、初めての報告である。
このように、本実施形態によれば、日本人のｍｔＤＮＡを１０個のハプログループに分類することにより、ハプログループと２型糖尿病との関係が示された。このことにより、２型糖尿病の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【０１０１】
３．心筋梗塞への応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人２１３７名（男性１４４２名、女性６９５名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月までに３つの参加病院（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院）の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。心筋梗塞を伴う１１８１名（男性９２０名、女性２６１名）の対象者は、全てが冠動脈造影と左室造影検査によって、病態が確認された。残りの９５６名（男性５２２名、女性４３４名）は、対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者であった。対照群は、うっ血性心不全、末梢性動脈閉塞性疾患、動脈硬化性疾患、梗塞性・出血性脳卒中、他の脳疾患、および他の血栓・塞栓・出血性疾患の既往歴が無い者であった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１２個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【０１０２】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、心筋梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定、またはマン・ホイットニーＵ検定（the Mann−Whitney U test）を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
心筋梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、ＢＭＩ、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、心筋梗塞を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【０１０３】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１２個のハプログループを調べたので、０.０５を１２で除して、０.００４とした。こうして、０.００４未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
＜結果＞
２１３７名の被験者に関する基礎的データを表２２に示した。
【０１０４】
【表２２】
【０１０５】
表中において、最左欄は上段から順に、対象数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、２型糖尿病（Type-2 diabetes）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）における心筋梗塞（MI）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、男性（Male）における心筋梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値、女性（Female）における心筋梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本より多くの喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇより大きい、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。２型糖尿病については、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％より大きい、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、または高脂血症剤を服用している者とした。
【０１０６】
年齢、高血圧、中性脂肪、空腹時血糖、ヘモグロビンＡｌｃでは心筋梗塞患者群と対照群との間に差がなかった。性別、ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症（HC）、糖尿病については、心筋梗塞患者群のほうが対照群よりも有意に高値であった。ＨＤＬコレステロールは、対照群よりも心筋梗塞患者群の方が、有意に低値であった。
年齢、性別、喫煙歴、ＢＭＩ、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表２３に示した。
【０１０７】
【表２３】
【０１０８】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である性別（Gender）・高コレステロール血症（HC)・２型糖尿病（Type-2 diabetes）・ＢＭＩと遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＮ９ｂ，Ｇ１，Ｍ７ｃを、男性における従来の危険因子である高コレステロール血症・２型糖尿病・ＢＭＩと遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ｂ，Ｇ１を、女性における従来の危険因子である高コレステロール血症と遺伝的危険因子（該当なし）を、それぞれ意味している。
【０１０９】
ハプログループＮ９ｂは、被験者全員（P = 0.0019）、および男性（P = 0.0007）において、心筋梗塞に対して抵抗性が認められた。また、ハプログループＭ７ｃは、被験者全員において、有意に心筋梗塞に対して抵抗性が認められた(P = 0.0357)。一方、男性の場合には、ハプログループＧ１が心筋梗塞のリスクが高い傾向があった(P<0.05)。
表２４には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【０１１０】
【表２４】
【０１１１】
表より、ハプログループＮ９ｂは、被験者全員において、心筋梗塞のリスクが低いことが明らかとなった（P = 0.0018)。
男性の場合には、高コレステロール血症、糖尿病とともに、ハプログループＮ９ｂは、心筋梗塞に対して独立した抵抗性の因子であった（P = 0.0005)。また、女性の場合には、心筋梗塞に関連したハプログループは認められなかった。
表２５には、ｍｔＳＮＰｓのうち、心筋梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【０１１２】
【表２５】
【０１１３】
表中、「＊」は表３において示すように、１２個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００４未満であることを示している。
年齢、性別、喫煙状態、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ｂを代表する２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａ（ＮＤ４：Ｓｅｒ８６Ａｓｎ）、１４８９３Ａ＞Ｇ（Ｃｙｔｂ：ｓｙｎ）、およびハプログループＢ４ｂを代表する４８２０Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）の３個のｍｔＳＮＰｓが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった（P < 0.005）。一方、ハプログループＭを代表するｍｔＳＮＰである１０３９８Ａ＞Ｇ（ＮＤ３：Ｔｈｒ１１４Ａｌａ）と８７０１Ａ＞Ｇ（ＡＴＰ６：Ｔｈｒ５９Ａｌａ）の２個のｍｔＳＮＰｓが、心筋梗塞に感受性が有ることがわかった（P < 0.005）。
【０１１４】
男性の場合には、年齢、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ｂを代表する２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａと１４８９３Ａ＞Ｇが、心筋梗塞に抵抗性を示すことがわかった(各々P = 0.0006, P= 0.0007)。さらにハプログループＮ９ｂ＋Ｙを代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞Ａは、心筋梗塞に対して抵抗性を示した。また、ハプログループＢ４ｂを代表するｍｔＳＮＰである４８２０Ｇ＞Ａと６０２３Ｇ＞Ａは、男性の場合には、心筋梗塞に対して抵抗性があった（P < 0.05）。一方、ハプログループＧ１を代表するｍｔＳＮＰである８２００Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に感受性があることがわかった（P = 0.034）。
【０１１５】
女性の場合には、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１０４１０Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に感受性があることがわかった（P = 0.0012）。また、ハプログループＤ４ａを代表する他の３個のｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａ、８４７３Ｔ＞Ｃ、１４９７９Ｔ＞Ｃ、ハプログループＭを代表する３個のｍｔＳＮＰである８７０１Ａ＞Ｇ、１０３９８Ａ＞Ｇ、１０４００Ｃ＞Ｔ、ハプログループＢを代表するｍｔＳＮＰである８２７２ｄ９、およびハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａは、それぞれ心筋梗塞に対する危険性が高かった（P < 0.05）。
表２６に示すように、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【０１１６】
【表２６】
【０１１７】
表中、「＊」は表３において示すように、１２個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００４未満であることを示している。
２個のｍｔＳＮＰ（11016G>A (N9a)、4820G>A (B4b)）は、全対照者にとって心筋梗塞に抵抗性を示した(それぞれP = 0.0009, P = 0.0019)。１０個のｍｔＳＮＰ（11016G>A, 4820G>A, 8793T>C, 856A>G,4850C>T, 9833T>C, 8200T>C, 10410T>C, 9296C>T and 15508C>T)の総合的な寄与は０.０１９７（上記１０個の寄与率（R2）の総和）であった。
【０１１８】
男性の場合には、ハプログループＮ９ｂを代表するｍｔＳＮＰである１４８９３Ａ＞Ｇは、防御的な因子であった(P = 0.0005)。４個のｍｔＳＮＰ（14893A>G, 4820G>a, 8200T>C, 8793T>C）の総合的な寄与は０.０１３７（上記４個の寄与率（R2）の総和）であった。
女性の場合には、ハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１０４１０Ｔ＞Ｃは、心筋梗塞に対する危険因子であった（P = 0.0012）。５個のｍｔＳＮＰ（10410T>C, 9296C>T, 10398A>G, 856A>G, 9833T>C）の総合的な寄与は０.０３２０（上記５個の寄与率（R2）の総和）であった。
【０１１９】
＜考察＞
我々は、１２種類の主要なミトコンドリアハプログループと心筋梗塞との関係に付いて、２１３７名の日本人を対象とした大規模な関連解析を行った。年齢、性別、喫煙履歴、ＢＭＩ、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無で補正したところ、全対象者について、ハプログループＮ９ｂを持つ者は心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0019)。特に、男性の場合には、ハプログループＮ９ｂは、心筋梗塞の罹患率は有意に低値であった(P=0.0007)。ハプログループＮ９ｂは、４カ所の多型（10607, 11016, 13183, 14893）で特徴付けられる。このハプログループは、東アジア全体で見ると、大変まれであり中国南部と韓国にはほとんど認められない。一方、土着の琉球人とアイヌ人を含めた日本人には最もよく認められる（非特許文献１３）。
【０１２０】
遺伝子型タイピングに用いられる２個のｍｔＳＮＰである１１０１６Ｇ＞Ａと１３１８３Ａ＞Ｇとを除くと、ハプログループＮ９ｂを特徴付けるほとんどのｍｔＳＮＰは同義置換である（例えば、5147G>A, 10607C>T, 14893A>G 。非特許文献４１）。ハプログループＮ９ｂを特徴付けるｍｔＳＮＰのうち、心筋梗塞の危険性に関連する可能性のある機能的多型としては、２つの多型、すなわち１１０１６Ｇ＞Ａ（ND4: Ser>Asn）と１３１８３Ａ＞Ｇ（ND5: Ile>Val）がある。アミノ酸残基が、種の中で保存されているかどうか確認するために、この２個の多型について、ｍｔＳＮＰデータベースに登録された６１種類の哺乳類のアミノ酸配列と比較した。１３１８３Ａ＞Ｇ多型は、グランサム値（Grantham value）が２９であり保存的置換であった（非特許文献４２）。また、６１種類の哺乳類の中で、この位置のアミノ酸は多様性があるために、機能的多型の一つである可能性は低かった。
【０１２１】
一方、１１０１６Ｇ＞Ａ多型については、Ｓｅｒ＞Ａｓｎはグランサム値は４６であり、保存的置換としての値は高くなかった。しかし、６１種類の哺乳類の中で、この位置のアミノ酸がセリンであったのは、３種類の生物種（ヒト、シロガオオマキザル、およびアフリカサバンナゾウ）で認められるのみであった。従って、セリンは、ヒトにとって特徴的なアミノ酸の一つである可能性が高い。
【０１２２】
ハプログループＭ７ｃは、２個の多型（4071, 4850）によって特徴付けられる。ハプログループＭ７ｃは、全対象者において、心筋梗塞が有意に低かった(P<0.05)。このハプログループは、中国全体では最も多様性が高いが（７６％±１１％）、アイヌでは存在せず、本州人には頻度が少ないが、マレーシアサバー州の住民とフィリピン人にはよく見られる（非特許文献１３）。ハプログループＭ７ｃに属するＨＮｓｑ０１６０は、９０１７Ｔ＞Ｃ（グランサム値８９のＩ１６４Ｔとなる）を伴い、百寿者に認められる。したがって、ハプログループＭ７ｃは、心筋梗塞に対抗し、長寿に関係が深いと思われる。
【０１２３】
本研究では、男性の場合には、ハプログループＧ１は、心筋梗塞の危険因子であった(P<0.05)。ハプログループＧの本幹には、３個のｍｔＳＮＰｓ（709, 4833, 5108）がある（非特許文献１０、１３)。近年、８２００位と１５４９７位のｍｔＳＮＰｓがハプログループＧ１の決定に用いられるようになった(非特許文献１３、４３)。１５３２３Ｇ＞Ａと１５４９７Ｇ＞Ａは、Ｃｙｔｂに非同義置換を生じる多型であり、これらが機能的な多型である可能性がある。１５３２３Ｇ＞Ａにより生じるＡｌａ１９３Ｔｈｒと、１５４９７Ｇ＞Ａにより生じるＧｌｙ２５１Ｓｅｒの２つのアミノ酸置換のグランサム値は、それぞれ５８、５６である。ＣｙｔｂにおけるＧｌｙ２５１は、６１種類の哺乳類中、５５種類で保存されている。国立長寿研究所の加齢研究（ＮＩＬＳ−ＬＳＡ）で行われた研究によれば、１５４９７Ｇ＞Ａは、中年・初老日本人対象における肥満に関係があった（非特許文献２６）。
【０１２４】
また、本発明者らの研究成果によれば、年齢と喫煙状態の補正をすると、女性の場合には、体重、ＢＭＩ、ウエスト・ヒップ比、脂肪量、脂肪のない量（fat-free mass）、腹腔内脂肪、中性脂肪は、１５４９７Ｇ型に比べると、１５４９７Ａ型の方が有意に増加していた。また、血糖とヘモグロビンＡｌｃには違いが見られなかったが、血清中インシュリン量は、１５４９７Ｇ型より１５４９７Ａ型の方が２０％高値であった。したがってこれらの観察では、１５４９７Ａは、高血圧、高血糖、高コレステロール血症を伴わない単純肥満と関係があることが示唆された。したがって、Ｃｙｔｂ遺伝子の１５４９７Ｇ＞Ａ多型は、不完全なサイトクロムｂ分子を形成し、エネルギー代謝の減少を引き起こすような、重要な多型である可能性がある。
【０１２５】
１５４９８Ｇ＞Ａ多型によるＧｌｙ２５１Ａｓｐ置換は、病的であると言われている。この位置のグリシンがアスパラギン酸に変わると、複合体IIIのユビキノン結合部位のＱｐ部位の残基であるＧｌｕ２７１によって、電気的な斥力を生じることになる（非特許文献２７、４４）。そうすると、Ｑｐ部位の構造を変化させ、ヒドロキノン結合が弱くなる。１５４９７Ｇ＞Ａにより生じるＧｌｙ２５１Ｓｅｒ置換は、Ｇｌｕ２７１による斥力を生じることにならないが、この置換はＱｐ部位のユビキノンとの結合に影響を与える可能性が高い。
【０１２６】
本研究の当初の目的は、心筋梗塞に対抗する或いは危険性のあるハプログループを明らかにする事であった。しかし、我々が予想しなかった事に、サブハプログループＢ４ｂ、Ｄ４ａ、マクロハプログループＭで示されるｍｔＳＮＰが心筋梗塞に関連している事が示唆された。厳格な基準（P>0.005）で選んだ多型の中には、サブハプログループＢ４ｂ、Ｄ４ａ、マクロハプログループＭと心筋梗塞との間に有意な関連が示された。心筋梗塞・冠動脈疾患を含む心疾患と、核ＤＮＡの変異との間の関係を評価した報告が多く認められる。現在までに、心筋梗塞と関係のある多くの遺伝子（例えば、connexin 37, plasminogen-activator inhibitor type 1, and stromelysin-1遺伝子など）が報告されている。冠動脈疾患の遺伝的リスクを診断するシステムが、これらの核ＤＮＡ多型を基礎として展開されている（非特許文献４５）。ｍｔＤＮＡと核ＤＮＡとの多型が、心筋梗塞の予測をする情報を与えることが判明し、それによって、この疾患の一次予防に有用であろう。
【０１２７】
近年、脳梗塞などの動脈硬化性疾患とミトコンドリア多型やハプロタイプの関係を論じた報告が散見される。Ｆｉｎｎｉｌａらは、コンホメーション感受性ゲル電気泳動（conformation sensitive gel electrophoresis：CSGE）とダイレクト・シークエンス法を用いることによって、患者群と対照群のｍｔＤＮＡのコード領域の全塩基配列を決定し、１２３０８Ａ＞Ｇ多型によって見いだされるハプログループＵが、偏頭痛において後頭葉発作のリスクの構成要素になることを示した（非特許文献４６、４７）。
【０１２８】
我々の大規模研究によれば、男性の場合には、ハプログループＮ９ｂは心筋梗塞の発症が有意に低くなる保護因子であった。一方、女性の場合には、そのような関係は見られなかった。この理由については、現段階では不明である。
一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると１０歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、ＮＯやＰＧＩ２の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン１の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす（非特許文献４８）。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するｍｔＳＮＰが男性と女性とで異なるのかも知れない。
【０１２９】
最近数年間の間に、心筋梗塞と核ＤＮＡにコードされる遺伝子中の多型との関係を調べた報告が相次いでいる（非特許文献４５）。対象となった遺伝子としては、例えばシクロオキシゲナーゼ２（非特許文献４９）、ロイコトリエンＡ４ヒドロゲナーゼ（非特許文献５０）、５−リポキシゲナーゼ活性化蛋白質（非特許文献５１）、リンフォトキシンα（非特許文献５２）、ＬＧＡＬＳ２コード化ガレクチン２（非特許文献５３）、細胞骨格蛋白パラディン、チロシンキナーゼ、２つのＧタンパク結合受容体（非特許文献５４）などがある。また、初期の心筋梗塞と遺伝子中の多型との関係を調べた報告として、対象とされた遺伝子には、血小板脱顆粒中のＶＡＭＰ８、リボ核蛋白をコードするＨＮＲＰＵＬ１（非特許文献５５）、プラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター・タイプ１（非特許文献５６）、血清マトリックスメタロプロテアーゼ３（非特許文献５７）がある。そうすると、ｍｔＤＮＡの多型と核ＤＮＡの多型との両者が、心筋梗塞などの冠状動脈疾患に対する遺伝的リスクを評価するために役立ち、疾患の一次予防に寄与すると思われる。
このように、本実施形態によれば、日本人のｍｔＤＮＡを１２個のハプログループに分類することにより、心筋梗塞の遺伝的危険度を予測することができた。このことにより、心筋梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【０１３０】
４．アテローム血栓性脳梗塞への応用
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人１０８１名（男性６４１名、女性４４０名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月までに３つの参加病院（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院）の一つを外来した受診者、或いは入院患者であった。アテローム血栓性脳梗塞を伴う患者群は、３４６名（男性２３４名、女性１１２名）であった。患者群について虚血性や出血性脳卒中の鑑別は、新たに突然発症した神経学的な巣症状や徴候が２４時間以上持続すること、および脳ＣＴ或いは脳ＭＲＩ（または、その両者の検査）により確認された。脳卒中の分類は、Classification of Cerebrovascular Diseases III (非特許文献５８)を用いて決定した。心原性塞栓症とラクナ梗塞、一過性脳虚血発作、脳血管奇形、脳腫瘍、外傷性脳血管障害、心臓弁膜症を伴うか心房細動、心臓弁膜症を伴わない心房細動に関する患者は除外した。７３５名（男性４０７名、女性３２８名）の健常者である対照群は、健康診断のために参加病院を受診した者であった。対照群には、虚血性あるいは出血性脳卒中、冠動脈疾患、末梢性動脈閉塞性疾患、他の動脈硬化性疾患、他の血栓、塞栓、出血性疾患の既往歴は無かった。
研究プロトコールは、ヘルシンキ宣言に従っており、三重大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、各参加病院の倫理委員会によって承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
上記対象者について、１１個のハプログループへの分類を行うため、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を実施した。
【０１３１】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、アテローム血栓性脳梗塞患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定、またはマン・ホイットニーＵ検定（the Mann−Whitney U test）を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
アテローム血栓性脳梗塞と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、ＢＭＩ（body mass index）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、高尿酸血症および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、アテローム血栓性脳梗塞を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１１個のハプログループを調べたので、０.０５を１１で除して、０.００４５とした。こうして、０.００４５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
【０１３２】
＜結果＞
１０８１名の被験者に関する基礎的データを表２７に示した。
【表２７】
【０１３３】
表中において、最左欄は上段から順に、対象数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、２型糖尿病（Type-2 diabetes）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群（CI）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、男性（Male）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値、女性（Female）におけるアテローム血栓性脳梗塞患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本より多くの喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇより大きい、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。２型糖尿病については、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ（６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％より大きい、或いは両基準を満たす者、または抗糖尿病薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きい、または高脂血症剤を服用している者とした。
【０１３４】
ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症、総コレステロール値、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、空腹時血糖値、ヘモグロビンＡｌｃはアテローム血栓性脳梗塞患者の全員と対照群とでは差がなかった。年齢、高血圧、収縮期血圧、拡張期血圧、２型糖尿病では、アテローム血栓性脳梗塞患者群の方が対照群よりも有意に高値であった（P < 0.005）。反対に、女性/男性比は、アテローム血栓性脳梗塞患者群が対象群よりも有意に低かった（P = 0.0001）。ＢＭＩ、喫煙率、高コレステロール血症については、いずれも疾患群と対照群との間に差異は認められなかった。
表２８には、カイ二乗検定により、ミトコンドリアハプログループの分布を評価した結果を示した。
【０１３５】
【表２８】
【０１３６】
表に示す通り、全対象者を評価した場合には、Ｎ９ａ(P = 0.0174, OR = 0.435)とＭ７ｃ(P = 0.0260, OR = 0.251)の二つのハプログループが、アテローム血栓性脳梗塞に関連していることがわかった。女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、オッズ比０.１３９で疾患の危険性が低い傾向があった（P = 0.0073)。
年齢、性別、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症の有無を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表２９に示した。
【０１３７】
【表２９】
【０１３８】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である性別（Gender）・２型糖尿病（Type-2 diabetes）・高血圧（Hypertension）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）（対象となるハプログループなし）を、女性における従来の危険因子である高血圧・２型糖尿病と遺伝的危険因子であるハプログループＡを、男性における従来の危険因子である２型糖尿病・高血圧と遺伝的危険因子（該当なし）を、それぞれ意味している。
【０１３９】
女性の場合には、ハプログループＡでアテローム血栓性脳梗塞への感受性（オッズ比２.０９）が認められた（P=0.0409）。なお、全員を対象とした場合、および、男性の場合には、いずれのハプログループについても有意差は認められなかった。
表３０には、ｍｔＳＮＰｓのうち、アテローム血栓性脳梗塞に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【０１４０】
【表３０】
【０１４１】
年齢、性別、喫煙状態、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、全対象群では、ハプログループＤ５のサブハプログループであるハプログループＤ５ｂ１ｂを代表するｍｔＳＮＰの３７５９Ａ＞Ｇは、アテローム血栓性脳梗塞に対する抵抗性を示すことがわかった（P < 0.05）。また、ハプログループＡ１のサブハプログループであるハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰの１４９４４Ｃ＞Ｔと、ハプログループＤ５のサブハプログループであるハプログループＤ５ａ２を代表するｍｔＳＮＰの１３１０Ｃ＞Ｔは、アテローム血栓性脳梗塞に罹患しやすいことがわかった（P < 0.05）。
女性の場合には、年齢、喫煙歴、ＢＭＩ、２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症で補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔが、アテローム血栓性脳梗塞に罹りやすいことがわかった（P < 0.05）。男性の場合には、ハプログループＤ５ａ２（ハプログループＤ５のサブハプログループ）を代表するｍｔＳＮＰである１３１０Ｃ＞Ｔが、アテローム血栓性脳梗塞に罹患しやすいことがわかった（P < 0.05）。
表３１には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【０１４２】
【表３１】
【０１４３】
表中、「＊」は表２において示すように、１１個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。
全対照群において、３個のｍｔＳＮＰ（すなわち、ハプログループＤ５ｂ１ｂを代表する３７５９Ａ＞Ｇ、ハプログループＭ７ｃを代表する４８５０Ｃ＞Ｔ、およびハプログループＤ４ｂ２ａを代表する１４２８７Ｔ＞Ｃ）がアテローム血栓性脳梗塞に抵抗性があることがわかった（P < 0.05）。また、２個のｍｔＳＮＰ（すなわち、ハプログループＤ５ａ２を代表する１３１０Ｃ＞Ｔ、およびハプログループＡ１ａ１ａを代表する１４９４４Ｃ＞Ｔ）が、アテローム血栓性脳梗塞に感受性があることがわかった（P < 0.05）。これら５個のｍｔＳＮＰの総合的な寄与（各ｍｔＳＮＰの寄与率（R2）の総和）は、０.１２１であった。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａは、アテローム血栓性脳梗塞に対して抵抗性が認められた（P = 0.0214)。男性の場合には、ハプログループＤ５ａ２を代表するｍｔＳＮＰである１３１０Ｃ＞Ｔは、アテローム血栓性脳梗塞に対する感受性が認められた（P = 0.0235）。
【０１４４】
＜考察＞
我々は１０８１名の日本人に基づく大規模な関連解析を行い、１１個の主要なミトコンドリアハプログループのそれぞれとアテローム血栓性脳梗塞との間の関係を調査した。カイ二乗検定によって、患者群と対照群との間の定性的な比較を行ったところ、ミトコンドリアハプログループＮ９ａとＭ７ｃについては、有意に（P<0.05）疾患の罹患率が低いことがわかった。また、女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、アテローム血栓性脳梗塞の罹患率が低くなる傾向が認められた（P = 0.0073）。
多項ロジスティック回帰分析法によれば、女性の場合には、ハプログループＡは、アテローム血栓性脳梗塞に有意に（P<0.05)関係していた。ハプログループＮ９ａ及びＭ７ｃと、アテローム血栓性脳梗塞との関係は、２型糖尿病についての補正を行うと、消失するようにも見える。ハプログループＭ７ｃについての理由は明確ではないものの、前記応用例に示すように、ハプログループＮ９ａは、メタボリック症候群と２型糖尿病に対して抵抗性があることがわかった。
これは、ミトコンドリアハプログループとアテローム血栓性脳梗塞との関係を調べた最初の報告である。
【０１４５】
ハプログループＡを代表するｍｔＳＮＰである８７９４Ｃ＞Ｔは、ＡＴＰａｓｅサブユニット６においてＨ９０Ｙ置換（９０位のヒスチジンをチロシンに置換する）を引き起こす。ＡＴＰ６遺伝子は、サブユニットａをコードしている。サブユニットａは、ＡＴＰａｓｅ（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｖ）のＦｏセクタを横断してプロトンを輸送する際に重要な役割を果たす（非特許文献１３）。Ｈｉｓ９０Ｔｙｓの置換のグランサム値は８３であることから（非特許文献４２）、この多型は機能的多型である可能性がある。Ｌ１５６Ｒ置換を引き起こす８９９３Ｔ＞Ｇトランスバージョンは、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、および色素視神経網膜炎）症候群（非特許文献３２、３３）の原因となる病原性突然変異である。従って、８７９４Ｃ＞Ｔによって惹き起こされたＨ９０Ｙ置換がＡＴＰ６サブユニットとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｖ）の機能に影響を与える可能性がある。しかしながら、ミトコンドリア機能および代謝に対する８７９４Ｃ＞Ｔ（ＡＴＰ６：Ｈ９０Ｙ）の実際の効果については未知であることから、この多型とアテローム血栓性脳梗塞に対する感受性との関係を理解するために更なる調査が望まれる。また、前述（２型糖尿病への応用）のように、この多型と２型糖尿病との関係も明らかとなった。
【０１４６】
本実施形態によれば、女性の場合には、ハプログループＡとアテローム血栓性脳梗塞との関係が示されたが、男性の場合には、そのような関係は認められなかった。性別による相違の原因は、今のところ不明である。一般的に、女性が冠動脈疾患や心筋梗塞に罹患する危険性は男性の危険性に比べると１０歳程度の遅れがあることから考えると、同世代の男性と女性が心臓疾患に罹患する理由は異なっているのかも知れない。性ホルモンであるエストロゲンは、血管壁や血管運動神経系に対して、ＮＯやＰＧＩ２の生産、血管内皮細胞からのエンドセリン１の放出抑制などの好ましい影響を及ぼす（非特許文献４８）。このため、エストロゲンなどの性ホルモン量が男女で異なることにより、心筋梗塞に関与するｍｔＳＮＰが男性と女性とで異なるのかも知れない。
【０１４７】
虚血性脳卒中は多くの病因に基づく不均一な疾患であるが、小動脈及び大動脈に発生することが一般的である。脳卒中と頸動脈アテローム血栓に関しては、いくつかの遺伝的リスクに関する報告がある（非特許文献５９、６０、６１）。頸動脈での脈管内膜−中膜壁厚（ＩＭＴ）は、無症状アテローム血栓性脳梗塞の代理指標であり、将来の虚血性脳卒中に対する強力な予測指標である。近親関係（双子、兄弟、及び家族）の調査結果によれば、ＩＭＴには遺伝的な関連が認められるが、関連する遺伝子は同定されていない。細胞間物質（stromelysin-1、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ３）、炎症(インターロイキン６）、脂質代謝（肝リパーゼ、アポリポ蛋白Ｅ、コレステロールエステルトランスファ蛋白、パラオキソナーゼ）、及び凝固系（ファクターＶライデン、フィブリノーゲン）に関与する遺伝子の機能的な変異があるとＩＭＴが高いという報告がある。更に、ラクナ脳梗塞は、アテローム血栓性脳梗塞の初期において発症原因の元になることが示唆されている。ラクナ脳梗塞を含む血栓性梗塞は、アメリカ人やヨーロッパ各国人に比べて、日本人を含むモンゴリアンを起源とする東アジア人に多く発症する（非特許文献６２、６３、６４、６５）。ミトコンドリアＤＮＡのＤループ中の高変異部位における１６１８９Ｔ＞Ｃトランジションは、インスリン抵抗性糖尿病、２型糖尿病、ラクナ脳梗塞に罹患しやすいという報告がある。フィニーラらによれば、ｍｔＳＮＰの１２３０８Ａ＞Ｇによって代表されるミトコンドリアハプログループＵは、片頭痛における後頭梗塞の危険性が高い危険因子であることが示された（非特許文献６６、６７）。
このように本実施形態によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、アテローム血栓性脳梗塞の遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、アテローム血栓性脳梗塞の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【０１４８】
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【非特許文献５０】Helgadottir A, Manolescu A, Helgason A, Thorleifsson G, Thorsteinsdottir U, Gudbjartsson DF, Gretarsdottir S, Magnusson KP, Gudmundsson G, Hicks A, Jonsson T, Grant SF, Sainz J, O'Brien SJ, Sveinbjornsdottir S, Valdimarsson EM, Matthiasson SE, Levey AI, Abramson JL, Reilly MP, Vaccarino V, Wolfe ML, Gudnason V, Quyyumi AA, Topol EJ, Rader DJ, Thorgeirsson G, Gulcher JR, Hakonarson H, Kong A, Stefansson K (2006) A variant of the gene encoding leukotriene A4 hydrolase confers ethnicity-specific risk of myocardial infarction. Nat Genet 38: 68-74
【非特許文献５１】Helgadottir A, Manolescu A, Thorleifsson G, Gretarsdottir S, Jonsdottir H, Thorsteinsdottir U, Samani NJ, Gudmundsson G, Grant SF, Thorgeirsson G, Sveinbjornsdottir S, Valdimarsson EM, Matthiasson SE, Johannsson H, Gudmundsdottir O, Gurney ME, Sainz J, Thorhallsdottir M, Andresdottir M, Frigge ML, Topol EJ, Kong A, Gudnason V, Hakonarson H, Gulcher JR, Stefansson K (2004) The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers risk of myocardial infarction and stroke. Nat Genet 36: 233-239
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【非特許文献５３】Ozaki K, Inoue K, Sato H, Iida A, Ohnishi Y, Sekine A, Sato H, Odashiro K, Nobuyoshi M, Hori M, Nakamura Y, Tanaka T (2004) Functional variation in LGALS2 confers risk of myocardial infarction and regulates lymphotoxin-alpha secretion in vitro. Nature 429: 72-75
【非特許文献５４】Shiffman D, Ellis SG, Rowland CM, Malloy MJ, Luke MM, Iakoubova OA, Pullinger CR, Cassano J, Aouizerat BE, Fenwick RG, Reitz RE, Catanese JJ, Leong DU, Zellner C, Sninsky JJ, Topol EJ, Devlin JJ, Kane JP (2005) Identification of four gene variants associated with myocardial infarction. Am J Hum Genet 77: 596-605
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【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図３】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（１）である。図の下端には、ハプログループ及びサブハプログループを示している（図４及び図４においても同じである）。
【図４】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（２）である。
【図５】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（３）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出することを特徴とするヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項２】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出することを特徴とする請求項１に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項３】
前記１０個のハプログループに加えて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出することを特徴とする請求項１または２に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項４】
ヒトミトコンドリアＤＮＡを含む試料から前記１０個または１２個のハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ工程、このＰＣＲ工程によって増幅されたＤＮＡフラグメントと前記ｍｔＳＮＰのいずれか一つを認識する核酸プローブとをハイブリッドさせるハイブリッド工程、前記核酸プローブによって認識されたｍｔＳＮＰを検出する検出工程とを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項５】
前記核酸プローブは、全長が１５塩基〜４０塩基であり、かつ検出すべき前記ｍｔＳＮＰの位置が５’末端または３’末端から５塩基以上内側に位置することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項６】
前記ＤＮＡフラグメントの全長は、１９０塩基対〜５２０塩基対であることを特徴とする請求項４または５に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項７】
前記ＤＮＡプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものであり、前記ＰＣＲ工程においては、少なくとも１７種類のＤＮＡフラグメントを合成し、前記検出工程においては、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載の核酸プローブを用いることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項８】
前記検出工程においては、更に配列番号１３８、配列番号１８０、配列番号２１３に記載の核酸プローブを用いることを特徴とする請求項７に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項９】
前記ＤＮＡプライマーはビオチン化されており、前記核酸プローブは固相化されていると共に、前記検出工程においては、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素を用いるＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法であることを特徴とする請求項４〜８のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項１０】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出する核酸プローブを備えたことを特徴とするヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１１】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出するための核酸プローブを備えたことを特徴とする請求項１０に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１２】
前記１０個のハプログループに加えて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出するための核酸プローブを備えたことを特徴とする請求項１１に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１３】
前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＰＣＲ法によって増幅可能なビオチン化されたＤＮＡプライマーセットと、前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを検出するための核酸プローブが固相化された担体と、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素とを備えたことを特徴とする請求項１１または１２に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１４】
前記ＤＮＡプライマーセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものであり、前記核酸プローブは、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載のものであることを特徴とする請求項１３に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出することを特徴とするヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項２】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出することを特徴とする請求項１に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項３】
前記１０個のハプログループに加えて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出することを特徴とする請求項１または２に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項４】
ヒトミトコンドリアＤＮＡを含む試料から前記１０個または１２個のハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するＰＣＲ工程、このＰＣＲ工程によって増幅されたＤＮＡフラグメントと前記ｍｔＳＮＰのいずれか一つを認識する核酸プローブとをハイブリッドさせるハイブリッド工程、前記核酸プローブによって認識されたｍｔＳＮＰを検出する検出工程とを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項５】
前記核酸プローブは、全長が１５塩基〜４０塩基であり、かつ検出すべき前記ｍｔＳＮＰの位置が５’末端または３’末端から５塩基以上内側に位置することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項６】
前記ＤＮＡフラグメントの全長は、１９０塩基対〜５２０塩基対であることを特徴とする請求項４または５に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項７】
前記ＤＮＡプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものであり、前記ＰＣＲ工程においては、少なくとも１７種類のＤＮＡフラグメントを合成し、前記検出工程においては、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載の核酸プローブを用いることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項８】
前記検出工程においては、更に配列番号１３８、配列番号１８０、配列番号２１３に記載の核酸プローブを用いることを特徴とする請求項７に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項９】
前記ＤＮＡプライマーはビオチン化されており、前記核酸プローブは固相化されていると共に、前記検出工程においては、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素を用いるＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法であることを特徴とする請求項４〜８のいずれかに記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出法。
【請求項１０】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、配列番号５７〜配列番号２４２に記載の塩基配列を備えた１８６個の核酸プローブが認識する多型部位のうちの少なくとも５個以上の多型部位を検出する核酸プローブを備えたことを特徴とするヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１１】
ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、次のｍｔＳＮＰによってグループ分けされる少なくとも１０個のハプログループ、すなわち３９７０Ｔ、１３９２８Ａ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、８２７２の９ｂｐ欠失を有するハプログループＢと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、２７７２Ｔ、４３８６Ｃを有するハプログループＭ７ａと、４０７１Ｔ、４０４８Ａ、６６８０Ｃ、１２８１１Ｃを有するハプログループＭ７ｂと、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、８２００Ｃ、１５４９７Ａを有するハプログループＧ１と、７０９Ａ、４８３３Ｇ、５１０８Ｃ、１３５６３Ｇを有するハプログループＧ２と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、３０１０Ａを有するハプログループＤ４と、４８８３Ｔ、５１７８Ａ、１０３９７Ｇを有するハプログループＤ５とを検出するための核酸プローブを備えたことを特徴とする請求項１０に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１２】
前記１０個のハプログループに加えて、１１０１６Ａ、１４８９３Ｇを有するハプログループＮ９ｂと、４０７１Ｔ、４８５０Ｔを有するハプログループＭ７ｃを合わせた少なくとも１２個のハプログループを検出するための核酸プローブを備えたことを特徴とする請求項１１に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１３】
前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを含む塩基配列をＰＣＲ法によって増幅可能なビオチン化されたＤＮＡプライマーセットと、前記ハプログループが有するｍｔＳＮＰを検出するための核酸プローブが固相化された担体と、ストレプトアビジンに結合した蛍光色素とを備えたことを特徴とする請求項１１または１２に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【請求項１４】
前記ＤＮＡプライマーセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号１１〜配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５〜配列番号２８、配列番号３３〜配列番号４４、配列番号４９〜配列番号５２に記載のものであり、前記核酸プローブは、配列番号６６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１４７、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６３、配列番号１７４、配列番号１８１、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号２２１、配列番号２２２に記載のものであることを特徴とする請求項１３に記載のヒトミトコンドリアＤＮＡに関する遺伝子検出用キット。
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２００７−３３０１５１（Ｐ２００７−３３０１５１Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６５２９６（Ｐ２００６−１６５２９６）
【出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年（平成１７年）１２月１４日 日本ミトコンドリア学会発行の「国際学術集会 ミトコンドリアと生命２００９」に発表
【出願人】（５９７１４４０６０）
【出願人】（５０６０２３８０６）
【出願人】（３９９０７７６７４）Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 (21)
【出願人】（５９７１１２４７２）財団法人岐阜県研究開発財団 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年（平成１７年）１２月１４日 日本ミトコンドリア学会発行の「国際学術集会 ミトコンドリアと生命２００９」に発表
【出願人】（５９７１４４０６０）
【出願人】（５０６０２３８０６）
【出願人】（３９９０７７６７４）Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社 (21)
【出願人】（５９７１１２４７２）財団法人岐阜県研究開発財団 (25)
【Ｆターム（参考）】
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