ヒト胚性幹細胞の分化
本発明は、多能性幹細胞からの、インスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。詳細には、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を産生する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／２８９，６７１号（２００９年１２月２３日出願）の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。詳細には、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を産生する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。
【０００３】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにより３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００４】
膵臓の形成は、胚体内胚葉が膵臓内胚葉へと分化することにより生じる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成より先に発達が進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程として特徴付けられる。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００５】
島細胞の特徴を保持する細胞が、マウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９，２００１）は、膵島と同様のインスリン分泌構造へのマウスの胚性幹細胞の分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７，２０００）は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が血糖を正常化することを報告している。
【０００６】
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【０００７】
別の例において、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８，２００３）は、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００８】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５）。
【０００９】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚性幹細胞株を報告している。この結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨｎｆ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０，２００４）。
【００１０】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。また、インスリン及びＰｄｘ１のｍＲＮＡ発現レベルはレチノイン酸に影響されないが、３ｎＭ ＦＧＦ７処理により、Ｐｄｘ１の転写物量が増加する結果となることが認められた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１１】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＰＤＸ１陽性細胞への胚性幹細胞の分化を特異的に増加させる増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦβ２によってＰＤＸ１陽性細胞がより高い比率で再現性良く得られたことを観察した（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６）。
【００１２】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ−３β［陽性］内胚葉細胞への誘導を示した（米国特許第２００６／０００３４４６Ａ１号）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，１０３巻、１６８０６ページ、２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。
【００１４】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えばヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【００１５】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみで分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；同第０１／５１６１６号）。
【００１６】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、内胚葉性器官の特徴の一部を有するより成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。
【００１７】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を介して細胞を指向させることにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵臓器官形成を模倣する」と述べている。
【００１８】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７Ａ１号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化させた。次に、細胞をノギンなどのＴＧＦβアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンとの組み合わせと培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘導した。
【００１９】
一例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ１の過剰発現が、膵臓に多く見られる遺伝子の発現を上昇させたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、ｉｎ ｖｉｖｏでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２０】
別の例において、Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎらは次のように述べている。「Ｎｇｎ３を初期活性化させると、ほぼ例外なくグルカゴン＋細胞を誘導し、膵臓前駆細胞プールを消費した。Ｅ１１．５からＰＤＸ−１前駆細胞はコンピテントになり、インスリン［陽性］でＰＰ［陽性］の細胞へと分化した」（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＫＡら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １２，４５７〜４６５，Ｍａｒｃｈ ２００７）。
【００２１】
例えば、Ｄｉｅｚらは、次のように述べている。「９及び１０週において、ほとんどのグルカゴン陽性細胞はインスリンを共発現したが、これらのステージにおいて明確にインスリンのみの細胞がはっきりと検出可能であった。インスリン及びグルカゴンを共発現する細胞は、全試験期間中（９〜２１週）に観察されたが、全インスリン及びグルカゴン発現細胞のごく一部にすぎなかった」（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２００９ Ｓｅｐ；５７（９）：８１１〜２４．２００９ Ａｐｒ １３）。
【００２２】
一例として、Ｃｈｅｎらは、「（−）−インドラクタムＶ［（ＩＬＶ）］は、プロテインキナーゼＣシグナル伝達を活性化し、内胚葉系に既に確定したｈＥＳＣの膵臓特殊化に向かわせる．．．ＩＬＶ及びレチノイン酸は、関連メカニズムを介して機能する．．．ＩＬＶは、レチノイン酸よりも、高いＰＤＸ−１発現細胞誘導（ＰＤＸ−１を発現する細胞の比率）を示す」（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，１９５〜１９６（Ａｐｒｉｌ ２００９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ０４０９−１９５）と述べている。
【００２３】
Ｌｙｔｔｌｅらは、「ＮＫＸ６−１がインスリン細胞のみと共局在したことは、ＮＫＸ６−１がヒトβ細胞発生に独占的に関与することを示す」（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００８ Ｊｕｌ：５１（７）：１１６９〜８０，２００８）と述べている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、β細胞に更によく類似する機能性インスリン発現細胞を生成するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法開発の必要性が著しく今も残っている。本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からインスリン発現細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと、多能性幹細胞集団を分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する。
ａ．多能性幹細胞を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の細胞におけるインスリン及びグルカゴンの発現に対するＴＰＢ処理の影響を示す。パネルａ及びｂは、ＴＰＢで処理した細胞のそれぞれインスリン及びグルカゴンの発現を示す。対照細胞集団をパネルｃ及びｄに示す。
【図２】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリン及びグルカゴンの発現に対する様々な濃度のＴＰＢの影響を示す。パネルａ〜ｄは、示される濃度のＴＰＢで処理した細胞集団のインスリン及びグルカゴンの発現を示す。
【図３】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリン及びグルカゴンの発現に対するプロテインキナーゼＣ阻害剤の影響を示す。パネルａは、ＴＰＢで処理した細胞のインスリン及びグルカゴンの発現を表し、パネルｃは対応するＤＡＰＩ染色を表す。パネルｂは、ＴＰＢ及びＧＯ ６９７６で処理した細胞のインスリン及びグルカゴンの発現を表し、パネルｄは対応するＤＡＰＩ染色を表す。
【図４】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリンの発現に対する様々なプロテインキナーゼＣ阻害剤の影響を示す。パネルａは、ＴＰＢで処理した細胞のインスリンの発現を示す。パネルｂは、ＩＬＶで処理した細胞のインスリンの発現を示す。パネルｃは、ＰＭＡで処理した細胞のインスリンの発現を示す。
【図５】本発明の方法に従って処理された細胞における、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーの発現を示す。これらのパネルは、インスリン及びＮＫＸ６．１（パネルａ）、インスリン及びＰＤＸ１（パネルｂ）、インスリン及びＮＥＵＲＯＤ１（パネルｃ）、インスリン及びソマトスタチン（パネルｄ）、並びにインスリン及びグレリン（パネルｅ）の発現を表す。
【図６】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリン及びグルカゴンの発現を示す。パネルａ〜ｃは、１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及びｐ３８キナーゼ阻害剤（米国特許第６，２１４，８３０号に開示されるもの、２．５μＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した細胞（ステージ３、処理８、実施例２）における、インスリン発現（パネルａ）、グルカゴン発現（パネルｂ）、及びＤＡＰＩ染色（パネルｃ）を示す。パネルｄ〜ｆは、１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した細胞（ステージ３、処理９、実施例２）における、インスリン発現（パネルｄ）、グルカゴン発現（パネルｅ）、及びＤＡＰＩ染色（パネルｆ）を示す。
【図７】本発明の細胞の投与４、８、及び１２週間後の（ＳＣＩＤ）−ｂｅｉｇｅ（Ｂｇ）マウスにおいて、グルコース負荷に続いてヒトＣペプチドが検出されたことを示す。
【図８】記載される濃度の様々なプロテインキナーゼＣ阻害剤処理後に得られた、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞の比率を示す。
【図９】実施例６に記載の方法に従って処理した細胞の、ＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１α発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
開示を明確にするため、及び限定ではなく、本発明の「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００２９】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにおいて自己再生及び分化して、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞を含む、後代細胞を産生する、能力で定義される未分化細胞である。幹細胞は、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する能力、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じ、及び胚盤胞への注入後、全部ではないとしても大部分の組織に実質的に寄与する能力によっても特徴付けられる。
【００３０】
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じる能力を意味する単能性に分類される。
【００３１】
分化は、非特殊化（「未確定」）又は低特殊化細胞が、例えば神経細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特徴を得るプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「確定した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で低特殊化（又は確定）した状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発生及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、未確定の細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用可能である。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」又は「ステージ１細胞」又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞には、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞、及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、及び後部前腸細胞が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差次的な発現は、陽性マーカーのレベルの上昇、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で充分高いか又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００３７】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１（存在する場合）の発現が減少し、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）の説明書に従ってＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基質として発生させることによって検出可能である。未分化の多能性幹細胞は、ＯＣＴ４及びＴＥＲＴも通常発現し、ＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
【００３８】
増殖した多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。あるいは、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより、多能性を決定してもよい。
【００３９】
増殖した多能性幹細胞株を、標準的なＧバンド法を使用して核型決定し、確立された対応する霊長類種の核型と比較してもよい。細胞が正倍数体であり、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する、「正常な核型」を有する細胞を得ることが望ましい。
【００４０】
多能性幹細胞源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、供給源となる細胞は、供給源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ））などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【００４１】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）により記載されるように調製される。
【００４２】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、典型的にはフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を本質的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の、分化を伴わない増殖は、あらかじめ別の細胞型を培養することにより馴化培地を使用して支持される。あるいは、フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の、分化を伴わない増殖は、既知組成培地を使用して支持される。
【００４３】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：２８２巻、５３９１号、１１４５〜１１４７ページ）は、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からの多能性幹細胞株の培養について開示している。
【００４４】
Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層のパネルを、それらのヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力に関して評価した。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
【００４５】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、フィーダーを含まない培養において霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるか又は胚性幹細胞から分化された間葉系及び線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、また、この細胞系の、１次フィーダー細胞層としての使用も開示している。
【００４６】
別の例において、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でのヒト多能性幹細胞の長期間増殖のための方法を開示している。
【００４７】
別の例において、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自発的分化に由来するフィーダー細胞システムを開示している。
【００４８】
更なる例において、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒト胎盤から得たフィーダー細胞源を開示している。
【００４９】
Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００５０】
別の例において、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒト出生後包皮線維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。
【００５１】
米国特許第６６４２０４８号は、フィーダーを含まない培養における霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるか、あるいは胚性幹細胞から分化した間葉系及び線維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
【００５２】
別の例において、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて調整される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と呼ばれる分化かつ不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【００５３】
別の例において、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞誘導体から得られた馴化培地を開示している。
【００５４】
別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための既知組成培地を開示している。
【００５５】
代替的な培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を追加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生の誘発が可能な異なる増殖因子を追加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持されている、フィーダーを含まずかつ血清を含まない培養システムを開示している。
【００５６】
別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦを追加した培地を使用して、線維芽細胞又は馴化培地の非存在において、ヒト胚性幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００５７】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞を含まない合成培地中でのヒト胚性幹細胞の培養方法を開示しており、この方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代用物質、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代用物質を含有する培地中で幹細胞を培養する工程を含み、この培地は、哺乳動物胎児血清を本質的に含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化することが可能な少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層以外の供給源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は条件培地なしで未分化状態の幹細胞の増殖を支持するものである。
【００５８】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞などの幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液では、培地は培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地及び実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸を含む。
【００５９】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基本培地を含む、細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な栄養素血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外マトリックス成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む」と述べている。
【００６０】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。１つの方法は、哺乳動物の胎児血清を本質的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも本質的に含まない）培地中で、線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で、幹細胞を培養する。好ましい形態では、十分な量の線維芽細胞増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた線維芽細胞フィーダー層の必要性がなくなる」と述べている。
【００６１】
更なる例において、国際公開第２００５０６５３５４号は、フィーダー及び血清を本質的に含まない合成等張培地を開示しており、この培地は、ａ．基本培地と、ｂ．実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量のｂＦＧＦと、ｃ．実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量のインスリンと、ｄ．実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量のアスコルビン酸と、を含む。
【００６２】
別の例において、国際公開第２００５０８６８４５号は、細胞を未分化な状態に維持するのに充分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質の構成員、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の構成員、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間幹細胞を曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【００６３】
多能性幹細胞は、好適な培養基材上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であって、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００６４】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。これには、増殖させる細胞型に応じて、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００６５】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下で、基質上に好適に分布させることで播いてもよい。これらすべての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益が得られ、かつ当業者により容易に決定可能である。
【００６６】
好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃ １１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ ＃ １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ ＃ Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ ＃ １３２５６−０２９等から調製することもできる。
【００６７】
多能性幹細胞からの、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を産生するための方法を提供し、この方法は以下の工程ａ、ｂ、ｃ及びｄを包含する：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程。
【００６８】
本発明の一態様では、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する。
【００６９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定され得る。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを最小量発現する。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【００７０】
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。
【００７１】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７２】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７３】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７４】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７５】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００７６】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）に開示されている。
【００７７】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【００７８】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７９】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８０】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８１】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８２】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８３】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８４】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８５】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化され得る。
【００８６】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化され得る。
【００８７】
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１を共発現するが、最小量のＣＤＸ２及びＮＧＮ３を発現しない。
【００８８】
一実施形態では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＦＧＦ７を追加した第１培地で培養し、次いで細胞を、ＦＧＦ７、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体アゴニスト、レチノイン酸、及びヘッジホッグシグナル経路阻害剤を追加した第２培地で培養することにより、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１を共発現するが、最小量のＣＤＸ２及びＮＧＮ３を発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる。
【００８９】
一実施形態では、ＦＧＦ７は、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ７は、５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。
【００９０】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９１】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体アゴニストは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦβ−Ｉ、ＴＧＦβ−ＩＩ、ＧＤＦ−８、及びＧＤＦ−１１からなる群から選択される。
【００９２】
アクチビンＡは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、アクチビンＡは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、アクチビンＡは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９３】
アクチビンＢは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、アクチビンＢは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、アクチビンＢは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９４】
ＴＧＦβ−Ｉは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＴＧＦβ−Ｉは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＴＧＦβ−Ｉは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９５】
ＴＧＦβ−ＩＩは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｎＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＴＧＦβ−ＩＩは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＴＧＦβ−ＩＩは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９６】
ＧＤＦ−８は、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＧＤＦ−８は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−８は５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９７】
ＧＤＦ−１１は、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＧＤＦ−１１は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−１１は５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９８】
レチノイン酸は、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、レチノイン酸は１μＭの濃度で使用される。
【００９９】
一実施形態では、ヘッジホッグシグナル経路阻害剤はシクロパミン−ＫＡＡＤである。シクロパミン−ＫＡＡＤは、約０．０２５μＭ〜約２．５μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、シクロパミン−ＫＡＡＤは０．２５μＭの濃度で使用される。
【０１００】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。
【０１０１】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編集、２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、並びにイムノアッセイ、例えば切片材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及び完全細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１０２】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
【０１０３】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１０４】
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、及びＴｒａ １−８１のうちのすくなくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
【０１０５】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なのは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【０１０６】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なのは、膵臓内胚葉系に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１０７】
膵臓内分泌系のマーカーを発現する細胞への、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化する。
【０１０８】
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１を共発現するが、最小量のＣＤＸ２及びＮＧＮ３を発現しない。
【０１０９】
一実施形態では、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する。
【０１１０】
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及びプロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる。
【０１１１】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【０１１２】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤である。一実施形態では、ＡＬＫ５の阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは１μＭの濃度で使用される。
【０１１３】
一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム、インドラクタムＶ、及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテートからなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムである。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムは、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用することができる。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム、インドラクタムＶ、及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテートは、本明細書で「ＴＰＢ」と称される。
【０１１４】
膵臓内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６からなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する。
【０１１５】
治療
一態様では、本発明は、Ｉ型糖尿病に罹患しているか、あるいはＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を培養する工程と、多能性幹細胞を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる工程と、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を患者に移植する工程と、を含む。
【０１１６】
更に別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患しているか、あるいはＩＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を培養する工程と、多能性幹細胞を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる工程と、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を患者に移植する工程と、を含む。
【０１１７】
適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤には、例えば、特に、インスリン、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを挙げてもよい。他の医薬化合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（mimetibody）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。
【０１１８】
多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞へと分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞を、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化をレシピエント内で行ってもよい。
【０１１９】
胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として移植してもよく、あるいは肝門静脈内に注入され得るクラスターに形成してもよい。あるいは、細胞を、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス中で提供してもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入してもよい。細胞を、レシピエントの適切な部位内に移植してもよい。移植部位には、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【０１２０】
移植された細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与してもよい。特定の実施形態では、増殖因子は、投与された細胞をｉｎ ｖｉｖｏで分化させるように使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にｉｎ ｓｉｔｕで曝露されてもよい。移植された細胞を誘導して、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の投与された増殖因子の任意の組み合わせにより分化させることができる。
【０１２１】
移植に使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に依存し、当業者により決定され得る。
【０１２２】
一態様では、本発明は、糖尿病に罹患しているか、あるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をβ細胞系にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に移植する前に、この支持体上にｉｎ ｖｉｔｒｏで維持してもよい。あるいは、細胞を含む支持体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで更に培養することなく直接患者に移植してもよい。所望により、支持体を、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品と共に組み込んでもよい。
【０１２３】
本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア、及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に好適である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３ Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照のこと。
【０１２４】
医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、薬剤を、支持体を形成するのに先立ち、ポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示されている化合物を支持体に組み込む。
【０１２５】
支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。
【０１２６】
支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１２７】
支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１２８】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１２９】
支持体には、例えば、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物には、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキセンディン４、ノダル、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物学的ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。
【０１３０】
骨格内への本発明の細胞の組み込みは、細胞を骨格上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単に拡散により骨格内に入ることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１ Ｐｔ ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸骨格上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、遠心分離細胞固定化法（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。
【０１３１】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１）
インスリン及びＮＫＸ６．１、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の形成
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコーティングしたディッシュと０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで、
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１００−１９）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃ １１３３０−０３２）で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで、
ｂ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃ ２３９８０４）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ ３３４４−ＮＧ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃ １０５６９）で４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃ ０７９１）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ａｘｘｏｒａ；カタログ＃ ＡＬＸ−２７０−４４５）、及び５００ｎＭのＴＢＰ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃ ５６５７４０）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって培養する（ステージ４）。
【０１３３】
対照として、別の細胞集団を、１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４、対照群）。
【０１３４】
図１に示すように、ステージ４におけるＴＢＰ処理により、インスリン発現細胞が増加する結果となった（図１、パネルａ）。なお、これらインスリン発現細胞の約６０％が単独の内分泌ホルモン発現細胞であり、これらの細胞はインスリンを発現し、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリン（図１、パネルａ及びｂ、図５、パネルｄ及びｅ）を発現しなかった。ＴＢＰ処理を受けた培養においては、グルカゴン発現細胞も確認された。ほとんどのグルカゴン発現細胞は、インスリンも共発現した（図１、パネルａ及びｂ）。対照群について、細胞の大部分はインスリン及びグルカゴンを共発現した（図１、パネルｃ及びｄ）。
【０１３５】
異なる実験において、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理１：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理１）、又は
ｄ．処理２：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び１００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理２）、又は
ｅ．処理３：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び２０ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理３）、又は
ｆ．処理４：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理４）にわたって処理した。
【０１３６】
免疫細胞化学的分析を用い、本発明の細胞の形成に対する様々な濃度のＴＰＢの影響を評価した。インスリン単独発現細胞数の著しい増加が、５００ｎＭ及び１００ｎＭのＴＰＢ処理群の両方（図２、パネルａ及びｂ）において観察された。ＦＡＣＳ分析では、両方の処理によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて１２％のインスリン単独発現細胞をもたらし、この集団の１５％がＮＫＸ６．１も発現していたことが確認された（表１−ＮＫＸ６．１／ＩＮＳ発現細胞は総集団の２．４％であった）。対照群と同様に、２０ｎＭのＴＰＢにおいては、ほとんどの細胞がインスリン及びグルカゴンを共発現した（図２、パネルｃ及びｄ）。
【０１３７】
【表１】
【０１３８】
内分泌ホルモン発現細胞形成への作用が、プロテインキナーゼＣの活性化を介してなされたことを更に確認するため、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の別の細胞集団を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬ ＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理５：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理５）、又は
ｄ．処理６：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、５００ｎＭのＴＰＢ、及び５μＭのＧＯ ６９７６を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理６）、又は
ｅ．処理７：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で処理し（ステージ４、処理７）、次いで
ｆ．１％のＢ２７を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ５）。
【０１３９】
ＧＯ ６９７６は、Ｃａ2+依存性プロテインキナーゼＣのイソ型を選択的に阻害するといわれている。ＴＰＢのみ（図３、パネルａ）、並びにＴＰＢ及びＧＯ ６９７６（図３、パネルｂ）を与えられた培養液において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の数が著しく減少する。ＦＡＣＳ分析では、ＴＰＢ処理（処理６）が、３０．６％のシナプトフィジン発現細胞、１２％のインスリン単独発現細胞、及び４．６％のグルカゴン発現細胞をもたらしたことが確認された。一方、ＴＢＰ及びＧＯ ６９７６処理（処理７）は、１０．６％のシナプトフィジン発現細胞と、検出できないレベルのインスリン単独発現細胞をもたらした（表２）。処理６と処理７との間で、観察された総細胞数に違いはなかった（図３、パネルｃ及びｄ参照、処理６及び処理７の総細胞数を表すＤＡＰＩ染色を示す）。これらの結果は、プロテインキナーゼＣのシグナル伝達が、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成に重要であり得ることを示唆する。
【０１４０】
その他のプロテインキナーゼＣ活性化因子も調べた。これらはインドラクタムＶ（ＩＬＶ）（Ａｘｘｏｒａ；カタログ＃ ＡＬＸ−４２０−０１１−Ｃ３００）及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃５２４４００）とした。しかし、ＴＰＢのみがインスリン単独発現細胞の形成を示した（図４、パネルａ）。ＩＬＶ（図４、パネルｂ）及びＰＭＡ（図４、パネルｃ）の両方が５００ｎＭにおいて、６日後にインスリン及びグルカゴンを共発現する細胞をもたらした。ＦＡＣＳ分析では、ＴＰＢ処理が、１２％のインスリン単独発現細胞、及び４．６％のグルカゴン発現細胞、並びに７．１％のインスリン及びグルカゴンを共発現する細胞をもたらしたことが確認された。一方、ＩＬＶ処理は、３％のインスリン単独発現細胞、及び１２％のグルカゴン細胞、並びに１２％のインスリン及びグルカゴンを共発現する細胞をもたらした（表２）。免疫細胞化学的分析により、ＴＰＢで処理した培養液において、インスリン発現細胞の２０％がＮＫＸ６．１（図５、パネルａ）及びＰＤＸ１（図５、パネルｂ）を共発現したことが示された。インスリン発現細胞の大部分は、内分泌腺マーカー（ｍａｋｅｒ）であるＮＥＵＲＯＤを共発現した（図５、パネルｃ）。ソマトスタチン又はグレリン（ＧＨＲＬ）を共発現したインスリン発現細胞はほとんどなかった（図５、パネルｄ及びｅ）。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
（実施例２）
インスリン及びＮＫＸ６．１、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成する別法
異なる実験において、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬ ＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．処理８：１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及びｐ３８キナーゼ阻害剤（米国特許第６，２１４，８３０号に開示されるもの、２．５μＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間（ステージ３、処理８）、又は
ｃ．処理９：１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間（ステージ３、処理９）、次いで
ｄ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１４３】
ステージ３、処理８により、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現したが、ＣＤＸ２及びＮＧＮ３を共発現しなかった膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の形成をもたらした。一方、ステージ３、処理９では、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＧＮ３を共発現した膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の形成をもたらした。これらの細胞集団に対するプロテインキナーゼＣ活性化因子処理の影響を調べた（上記ステージ４）。
【０１４４】
ＦＡＣＳ分析を行い、インスリン単独陽性細胞、グルカゴン単独陽性細胞、インスリン／グルカゴン二重陽性細胞、ＮＫＸ６．１陽性細胞を発現する細胞、インスリン／ＮＫＸ６．１陽性細胞、及びシナプトフィジン陽性細胞（膵臓内分泌腺マーカー）の比率を明らかにした。
【０１４５】
表３に示すように、処理８で形成された細胞集団は、シナプトフィジン発現で表される、より大部分の内分泌細胞を生じ、総細胞集団の４９．７％はシナプトフィジンを発現した。総集団の２７．８％はインスリン単独陽性細胞であった。
【０１４６】
一方、処理９で形成された細胞集団が生じたシナプトフィジン発現細胞は、たった２５．７％であった。総集団の７．６％はインスリン単独発現細胞であった。両方の処理で観察されたグルカゴン単独発現細胞に有意差はなく、グルカゴン発現細胞の比率はインスリン発現細胞より有意に低かった。
【０１４７】
かなりの量のインスリン発現細胞はまた、ＮＫＸ６．１も共発現した。処理８を受けた細胞集団では、総集団の１１％がインスリン及びＮＫＸ６．１を発現した。処理９を受けた細胞集団では、総集団の２％がインスリン及びＮＫＸ６．１を発現した。
【０１４８】
免疫蛍光分析によりこれを確認した（図６）。処理８は、処理９に比べてインスリン発現細胞を増加させた（図６、パネルａ及びｄ）。ほとんどのグルカゴン発現細胞は多ホルモン細胞であった（図６、パネルａ、ｂ、ｄ及びｅ）。これらの結果は、処理８で生じた細胞集団（ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現したが、ＣＤＸ２及びＮＧＮ３は共発現しなかった膵臓内胚葉系に特徴的なマーカー（maker）を発現する細胞）は、本発明の方法により、より効率的に誘導され成熟した機能性インスリン発現細胞になれることを示唆する。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
（実施例３）
インスリン及びＮＫＸ６．１、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成する別法
別の実験において、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及びｐ３８キナーゼ阻害剤（ＪＮＪ３０２６５８２、２．５μＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理１０：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理１０）、又は
ｄ．処理１１：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で９日間（ステージ４、処理１１）、又は
ｅ．処理１２：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で１２日間にわたって処理した（ステージ４、処理１２）。
【０１５１】
表４に示すように、プロテインキナーゼＣ活性化因子による処理期間を、９日間（処理１１）又は１２日間（処理１２）のいずれかに延長したとき、更なる効果はみられなかった。インスリン単独発現細胞は、処理１０で６日間処理後、総集団の２７．８％であった。反対に、インスリン発現細胞は、９日間処理（処理１１）後１０％に、１２日間処理（処理１２）後更に４％に減少した。同時に、インスリン及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞集団の総比率も、処理の延長後に著しく下がった。これらの結果は、ノギン、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ、及びプロテインキナーゼＣ活性化因子による６日間処理は、本発明の細胞の形成に十分であったことを示唆した。
【０１５２】
【表４】
【０１５３】
（実施例４）
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−ｂｅｉｇｅ（Ｂｇ）マウスへの、本発明の細胞の移植
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１５４】
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。得られた細胞集合体を回収し、５百万個の細胞を含有する集合体を免疫不全マウス（ＳＣＩＤ／Ｂｇ、動物番号４７、４８、４９、５０、及び５１）の腎臓被膜に移植した。図７を参照されたい。
【０１５５】
４週間後、これらの移植物中のインスリン産生細胞の機能性を、動物にグルコースを投与しインスリン分泌を誘導することにより試験した。動物を約１５〜２０時間にわたって絶食させ、その後、後眼窩から血液サンプルを採取した（処理前グルコース）。次いで各動物に、約３ｇ／ｋｇのグルコース／３０％のデキストロース溶液を腹腔内注射により投与し、グルコース注入の約６０分後に血液を採取した。非常に感受性の高い、ヒト特異的なＣペプチドＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＨ）を使用して、マウス血清を用いて血中ヒトＣペプチドを検出した。ヒトＣペプチドの検出は、インスリン分泌が移植細胞に由来していることを示す。
【０１５６】
移植後４週目程の早期に、動物血清中のヒトＣペプチドを検出した。ヒトＣペプチドは経時的に増加した。移植データを図７にまとめる。１ヶ月の終了時点で、試験群の６０％の動物において、グルコース投与に応答するヒトＣペプチド（０．２ｎｇ／ｍＬ未満）が検出できた。４週間後、４例中３例のマウスで、ヒトＣペプチドのグルコース刺激化血清濃度が５〜１０倍上昇した。移植１２週間後、移植マウスにおけるヒトｃペプチドの平均グルコース刺激化血清濃度は、１ｍｇ／ｍＬより高かった（ｎ＝４）。
【０１５７】
（実施例５）
ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成する別法
簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを追加したＲＰＭＩ培地により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎＭ ＰＭＡ、又は１００ｎＭのＴＰＢ、又は２０ｎＭのホルボール−１２，１３−ジブチラート（ＰＤＢｕ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ、カタログ＃５２４３９０）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１５８】
対照として、別の細胞集団を、１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを追加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１５９】
ステージ４の６日目に培養液を２回サンプリングし、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ウェルあたり１００視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総ＰＤＸ１発現細胞、及び総ＮＫＸ６．１発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１タンパク質発現細胞は、総細胞集団の比率として報告した。図８に示すように、プロテインキナーゼＣ活性化因子処理群では、対照処理で得られたサンプルと比較して低い有効濃度（約２０ｎＭ）において、ＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１発現細胞集団が劇的に増加した。ステージ４の６日目までに、プロテインキナーゼＣ活性化因子又は対照処理のいずれかを受けた細胞集団では、集団の９２％±４％がＰＤＸ１を発現した。プロテインキナーゼＣ活性化因子処理群では、７５％±５％のＰＤＸ１発現細胞がＮＫＸ６．１を発現した。しかし、ノギン及びＴＧＦβ受容体阻害剤のみで処理された集団（対照）では、ＰＤＸ１発現細胞の５８％±５％のみがＮＫＸ６．１を発現した。プロテインキナーゼＣ活性化因子の存在下では、２０％のＮＫＸ６．１発現細胞は、増殖マーカー、ＥｄＵ（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｃ１０３３７）に対して共に陽性であった。
【０１６０】
この実験では、プロテインキナーゼＣ活性化因子を比較的低い有効濃度（〜２０ｎＭ）でノギン及びＴＧＦβ受容体阻害剤と組み合わせて用いると、Ｎｋｘ６．１発現の上方制御、並びにＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する細胞比率の増加を促進できることを示す。
【０１６１】
（実施例６）
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、プロテインキナーゼＣ活性化因子による処理
簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを追加したＲＰＭＩ培地により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．Ｔ１：１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間（ステージ３、Ｔ１）、又は
Ｔ２：１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、及び１００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３、Ｔ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１６２】
図９に示すように、対照群（Ｔ１）と比較してＴＰＢで処理した細胞（Ｔ２）において、膵臓内胚葉マーカーであるＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１αの顕著な下方制御が観察された。ＮＫＸ６．１は免疫組織化学的に検出できなかった。これらのデータは、ステージ３におけるプロテインキナーゼ活性化因子処理により、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞の生成が促進されなかったことを示唆する。
【０１６３】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全容を本明細書に援用するものである。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／２８９，６７１号（２００９年１２月２３日出願）の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。詳細には、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を産生する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。
【０００３】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにより３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００４】
膵臓の形成は、胚体内胚葉が膵臓内胚葉へと分化することにより生じる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成より先に発達が進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程として特徴付けられる。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００５】
島細胞の特徴を保持する細胞が、マウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９，２００１）は、膵島と同様のインスリン分泌構造へのマウスの胚性幹細胞の分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７，２０００）は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が血糖を正常化することを報告している。
【０００６】
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【０００７】
別の例において、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８，２００３）は、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００８】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５）。
【０００９】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚性幹細胞株を報告している。この結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨｎｆ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０，２００４）。
【００１０】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。また、インスリン及びＰｄｘ１のｍＲＮＡ発現レベルはレチノイン酸に影響されないが、３ｎＭ ＦＧＦ７処理により、Ｐｄｘ１の転写物量が増加する結果となることが認められた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１１】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＰＤＸ１陽性細胞への胚性幹細胞の分化を特異的に増加させる増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦβ２によってＰＤＸ１陽性細胞がより高い比率で再現性良く得られたことを観察した（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６）。
【００１２】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ−３β［陽性］内胚葉細胞への誘導を示した（米国特許第２００６／０００３４４６Ａ１号）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，１０３巻、１６８０６ページ、２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。
【００１４】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えばヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【００１５】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみで分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；同第０１／５１６１６号）。
【００１６】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、内胚葉性器官の特徴の一部を有するより成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。
【００１７】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を介して細胞を指向させることにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵臓器官形成を模倣する」と述べている。
【００１８】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７Ａ１号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化させた。次に、細胞をノギンなどのＴＧＦβアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンとの組み合わせと培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘導した。
【００１９】
一例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ１の過剰発現が、膵臓に多く見られる遺伝子の発現を上昇させたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、ｉｎ ｖｉｖｏでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２０】
別の例において、Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎらは次のように述べている。「Ｎｇｎ３を初期活性化させると、ほぼ例外なくグルカゴン＋細胞を誘導し、膵臓前駆細胞プールを消費した。Ｅ１１．５からＰＤＸ−１前駆細胞はコンピテントになり、インスリン［陽性］でＰＰ［陽性］の細胞へと分化した」（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＫＡら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １２，４５７〜４６５，Ｍａｒｃｈ ２００７）。
【００２１】
例えば、Ｄｉｅｚらは、次のように述べている。「９及び１０週において、ほとんどのグルカゴン陽性細胞はインスリンを共発現したが、これらのステージにおいて明確にインスリンのみの細胞がはっきりと検出可能であった。インスリン及びグルカゴンを共発現する細胞は、全試験期間中（９〜２１週）に観察されたが、全インスリン及びグルカゴン発現細胞のごく一部にすぎなかった」（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２００９ Ｓｅｐ；５７（９）：８１１〜２４．２００９ Ａｐｒ １３）。
【００２２】
一例として、Ｃｈｅｎらは、「（−）−インドラクタムＶ［（ＩＬＶ）］は、プロテインキナーゼＣシグナル伝達を活性化し、内胚葉系に既に確定したｈＥＳＣの膵臓特殊化に向かわせる．．．ＩＬＶ及びレチノイン酸は、関連メカニズムを介して機能する．．．ＩＬＶは、レチノイン酸よりも、高いＰＤＸ−１発現細胞誘導（ＰＤＸ−１を発現する細胞の比率）を示す」（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，１９５〜１９６（Ａｐｒｉｌ ２００９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ０４０９−１９５）と述べている。
【００２３】
Ｌｙｔｔｌｅらは、「ＮＫＸ６−１がインスリン細胞のみと共局在したことは、ＮＫＸ６−１がヒトβ細胞発生に独占的に関与することを示す」（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００８ Ｊｕｌ：５１（７）：１１６９〜８０，２００８）と述べている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、β細胞に更によく類似する機能性インスリン発現細胞を生成するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法開発の必要性が著しく今も残っている。本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からインスリン発現細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと、多能性幹細胞集団を分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する。
ａ．多能性幹細胞を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の細胞におけるインスリン及びグルカゴンの発現に対するＴＰＢ処理の影響を示す。パネルａ及びｂは、ＴＰＢで処理した細胞のそれぞれインスリン及びグルカゴンの発現を示す。対照細胞集団をパネルｃ及びｄに示す。
【図２】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリン及びグルカゴンの発現に対する様々な濃度のＴＰＢの影響を示す。パネルａ〜ｄは、示される濃度のＴＰＢで処理した細胞集団のインスリン及びグルカゴンの発現を示す。
【図３】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリン及びグルカゴンの発現に対するプロテインキナーゼＣ阻害剤の影響を示す。パネルａは、ＴＰＢで処理した細胞のインスリン及びグルカゴンの発現を表し、パネルｃは対応するＤＡＰＩ染色を表す。パネルｂは、ＴＰＢ及びＧＯ ６９７６で処理した細胞のインスリン及びグルカゴンの発現を表し、パネルｄは対応するＤＡＰＩ染色を表す。
【図４】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリンの発現に対する様々なプロテインキナーゼＣ阻害剤の影響を示す。パネルａは、ＴＰＢで処理した細胞のインスリンの発現を示す。パネルｂは、ＩＬＶで処理した細胞のインスリンの発現を示す。パネルｃは、ＰＭＡで処理した細胞のインスリンの発現を示す。
【図５】本発明の方法に従って処理された細胞における、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーの発現を示す。これらのパネルは、インスリン及びＮＫＸ６．１（パネルａ）、インスリン及びＰＤＸ１（パネルｂ）、インスリン及びＮＥＵＲＯＤ１（パネルｃ）、インスリン及びソマトスタチン（パネルｄ）、並びにインスリン及びグレリン（パネルｅ）の発現を表す。
【図６】本発明の方法に従って処理された細胞における、インスリン及びグルカゴンの発現を示す。パネルａ〜ｃは、１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及びｐ３８キナーゼ阻害剤（米国特許第６，２１４，８３０号に開示されるもの、２．５μＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した細胞（ステージ３、処理８、実施例２）における、インスリン発現（パネルａ）、グルカゴン発現（パネルｂ）、及びＤＡＰＩ染色（パネルｃ）を示す。パネルｄ〜ｆは、１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した細胞（ステージ３、処理９、実施例２）における、インスリン発現（パネルｄ）、グルカゴン発現（パネルｅ）、及びＤＡＰＩ染色（パネルｆ）を示す。
【図７】本発明の細胞の投与４、８、及び１２週間後の（ＳＣＩＤ）−ｂｅｉｇｅ（Ｂｇ）マウスにおいて、グルコース負荷に続いてヒトＣペプチドが検出されたことを示す。
【図８】記載される濃度の様々なプロテインキナーゼＣ阻害剤処理後に得られた、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞の比率を示す。
【図９】実施例６に記載の方法に従って処理した細胞の、ＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１α発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
開示を明確にするため、及び限定ではなく、本発明の「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００２９】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにおいて自己再生及び分化して、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞を含む、後代細胞を産生する、能力で定義される未分化細胞である。幹細胞は、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する能力、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じ、及び胚盤胞への注入後、全部ではないとしても大部分の組織に実質的に寄与する能力によっても特徴付けられる。
【００３０】
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じる能力を意味する単能性に分類される。
【００３１】
分化は、非特殊化（「未確定」）又は低特殊化細胞が、例えば神経細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特徴を得るプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「確定した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で低特殊化（又は確定）した状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発生及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、未確定の細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用可能である。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」又は「ステージ１細胞」又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞には、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞、及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、及び後部前腸細胞が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差次的な発現は、陽性マーカーのレベルの上昇、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で充分高いか又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００３７】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１（存在する場合）の発現が減少し、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）の説明書に従ってＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基質として発生させることによって検出可能である。未分化の多能性幹細胞は、ＯＣＴ４及びＴＥＲＴも通常発現し、ＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
【００３８】
増殖した多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。あるいは、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより、多能性を決定してもよい。
【００３９】
増殖した多能性幹細胞株を、標準的なＧバンド法を使用して核型決定し、確立された対応する霊長類種の核型と比較してもよい。細胞が正倍数体であり、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する、「正常な核型」を有する細胞を得ることが望ましい。
【００４０】
多能性幹細胞源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、供給源となる細胞は、供給源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ））などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【００４１】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）により記載されるように調製される。
【００４２】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、典型的にはフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を本質的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の、分化を伴わない増殖は、あらかじめ別の細胞型を培養することにより馴化培地を使用して支持される。あるいは、フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の、分化を伴わない増殖は、既知組成培地を使用して支持される。
【００４３】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：２８２巻、５３９１号、１１４５〜１１４７ページ）は、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からの多能性幹細胞株の培養について開示している。
【００４４】
Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層のパネルを、それらのヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力に関して評価した。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
【００４５】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、フィーダーを含まない培養において霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるか又は胚性幹細胞から分化された間葉系及び線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、また、この細胞系の、１次フィーダー細胞層としての使用も開示している。
【００４６】
別の例において、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でのヒト多能性幹細胞の長期間増殖のための方法を開示している。
【００４７】
別の例において、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自発的分化に由来するフィーダー細胞システムを開示している。
【００４８】
更なる例において、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒト胎盤から得たフィーダー細胞源を開示している。
【００４９】
Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００５０】
別の例において、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒト出生後包皮線維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。
【００５１】
米国特許第６６４２０４８号は、フィーダーを含まない培養における霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるか、あるいは胚性幹細胞から分化した間葉系及び線維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
【００５２】
別の例において、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて調整される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と呼ばれる分化かつ不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【００５３】
別の例において、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞誘導体から得られた馴化培地を開示している。
【００５４】
別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための既知組成培地を開示している。
【００５５】
代替的な培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を追加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生の誘発が可能な異なる増殖因子を追加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持されている、フィーダーを含まずかつ血清を含まない培養システムを開示している。
【００５６】
別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦを追加した培地を使用して、線維芽細胞又は馴化培地の非存在において、ヒト胚性幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００５７】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞を含まない合成培地中でのヒト胚性幹細胞の培養方法を開示しており、この方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代用物質、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代用物質を含有する培地中で幹細胞を培養する工程を含み、この培地は、哺乳動物胎児血清を本質的に含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化することが可能な少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層以外の供給源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は条件培地なしで未分化状態の幹細胞の増殖を支持するものである。
【００５８】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞などの幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液では、培地は培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地及び実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸を含む。
【００５９】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基本培地を含む、細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な栄養素血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外マトリックス成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む」と述べている。
【００６０】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。１つの方法は、哺乳動物の胎児血清を本質的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも本質的に含まない）培地中で、線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で、幹細胞を培養する。好ましい形態では、十分な量の線維芽細胞増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた線維芽細胞フィーダー層の必要性がなくなる」と述べている。
【００６１】
更なる例において、国際公開第２００５０６５３５４号は、フィーダー及び血清を本質的に含まない合成等張培地を開示しており、この培地は、ａ．基本培地と、ｂ．実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量のｂＦＧＦと、ｃ．実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量のインスリンと、ｄ．実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を支持するのに十分な量のアスコルビン酸と、を含む。
【００６２】
別の例において、国際公開第２００５０８６８４５号は、細胞を未分化な状態に維持するのに充分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質の構成員、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の構成員、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間幹細胞を曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【００６３】
多能性幹細胞は、好適な培養基材上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であって、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００６４】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。これには、増殖させる細胞型に応じて、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００６５】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下で、基質上に好適に分布させることで播いてもよい。これらすべての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益が得られ、かつ当業者により容易に決定可能である。
【００６６】
好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃ １１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ ＃ １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ ＃ Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ ＃ １３２５６−０２９等から調製することもできる。
【００６７】
多能性幹細胞からの、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を産生するための方法を提供し、この方法は以下の工程ａ、ｂ、ｃ及びｄを包含する：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程。
【００６８】
本発明の一態様では、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する。
【００６９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への多能性幹細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定され得る。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを最小量発現する。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【００７０】
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。
【００７１】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７２】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７３】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７４】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７５】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００７６】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）に開示されている。
【００７７】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清と共に培養することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【００７８】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７９】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８０】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８１】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８２】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８３】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８４】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８５】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化され得る。
【００８６】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化され得る。
【００８７】
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１を共発現するが、最小量のＣＤＸ２及びＮＧＮ３を発現しない。
【００８８】
一実施形態では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＦＧＦ７を追加した第１培地で培養し、次いで細胞を、ＦＧＦ７、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体アゴニスト、レチノイン酸、及びヘッジホッグシグナル経路阻害剤を追加した第２培地で培養することにより、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１を共発現するが、最小量のＣＤＸ２及びＮＧＮ３を発現しない、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる。
【００８９】
一実施形態では、ＦＧＦ７は、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ７は、５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。
【００９０】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９１】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体アゴニストは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦβ−Ｉ、ＴＧＦβ−ＩＩ、ＧＤＦ−８、及びＧＤＦ−１１からなる群から選択される。
【００９２】
アクチビンＡは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、アクチビンＡは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、アクチビンＡは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９３】
アクチビンＢは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、アクチビンＢは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、アクチビンＢは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９４】
ＴＧＦβ−Ｉは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＴＧＦβ−Ｉは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＴＧＦβ−Ｉは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９５】
ＴＧＦβ−ＩＩは、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｎＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＴＧＦβ−ＩＩは２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＴＧＦβ−ＩＩは５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９６】
ＧＤＦ−８は、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＧＤＦ−８は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−８は５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９７】
ＧＤＦ−１１は、約２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＧＤＦ−１１は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態では、ＧＤＦ−１１は５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００９８】
レチノイン酸は、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、レチノイン酸は１μＭの濃度で使用される。
【００９９】
一実施形態では、ヘッジホッグシグナル経路阻害剤はシクロパミン−ＫＡＡＤである。シクロパミン−ＫＡＡＤは、約０．０２５μＭ〜約２．５μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、シクロパミン−ＫＡＡＤは０．２５μＭの濃度で使用される。
【０１００】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。
【０１０１】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編集、２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、並びにイムノアッセイ、例えば切片材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及び完全細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１０２】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
【０１０３】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１０４】
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、及びＴｒａ １−８１のうちのすくなくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
【０１０５】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なのは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【０１０６】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なのは、膵臓内胚葉系に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１０７】
膵臓内分泌系のマーカーを発現する細胞への、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化する。
【０１０８】
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１を共発現するが、最小量のＣＤＸ２及びＮＧＮ３を発現しない。
【０１０９】
一実施形態では、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する。
【０１１０】
一実施形態では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及びプロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる。
【０１１１】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【０１１２】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤である。一実施形態では、ＡＬＫ５の阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは１μＭの濃度で使用される。
【０１１３】
一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム、インドラクタムＶ、及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテートからなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムである。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムは、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用することができる。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム、インドラクタムＶ、及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテートは、本明細書で「ＴＰＢ」と称される。
【０１１４】
膵臓内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６からなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する。
【０１１５】
治療
一態様では、本発明は、Ｉ型糖尿病に罹患しているか、あるいはＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を培養する工程と、多能性幹細胞を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる工程と、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を患者に移植する工程と、を含む。
【０１１６】
更に別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患しているか、あるいはＩＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を培養する工程と、多能性幹細胞を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる工程と、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞を患者に移植する工程と、を含む。
【０１１７】
適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤には、例えば、特に、インスリン、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを挙げてもよい。他の医薬化合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（mimetibody）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。
【０１１８】
多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞へと分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞を、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化をレシピエント内で行ってもよい。
【０１１９】
胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として移植してもよく、あるいは肝門静脈内に注入され得るクラスターに形成してもよい。あるいは、細胞を、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス中で提供してもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入してもよい。細胞を、レシピエントの適切な部位内に移植してもよい。移植部位には、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【０１２０】
移植された細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与してもよい。特定の実施形態では、増殖因子は、投与された細胞をｉｎ ｖｉｖｏで分化させるように使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にｉｎ ｓｉｔｕで曝露されてもよい。移植された細胞を誘導して、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の投与された増殖因子の任意の組み合わせにより分化させることができる。
【０１２１】
移植に使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に依存し、当業者により決定され得る。
【０１２２】
一態様では、本発明は、糖尿病に罹患しているか、あるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をβ細胞系にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に移植する前に、この支持体上にｉｎ ｖｉｔｒｏで維持してもよい。あるいは、細胞を含む支持体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで更に培養することなく直接患者に移植してもよい。所望により、支持体を、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品と共に組み込んでもよい。
【０１２３】
本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア、及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に好適である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３ Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照のこと。
【０１２４】
医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、薬剤を、支持体を形成するのに先立ち、ポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示されている化合物を支持体に組み込む。
【０１２５】
支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。
【０１２６】
支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１２７】
支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１２８】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１２９】
支持体には、例えば、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物には、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキセンディン４、ノダル、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物学的ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。
【０１３０】
骨格内への本発明の細胞の組み込みは、細胞を骨格上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単に拡散により骨格内に入ることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１ Ｐｔ ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸骨格上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、遠心分離細胞固定化法（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。
【０１３１】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１）
インスリン及びＮＫＸ６．１、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の形成
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコーティングしたディッシュと０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで、
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１００−１９）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃ １１３３０−０３２）で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで、
ｂ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃ ２３９８０４）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ ３３４４−ＮＧ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃ １０５６９）で４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃ ０７９１）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ａｘｘｏｒａ；カタログ＃ ＡＬＸ−２７０−４４５）、及び５００ｎＭのＴＢＰ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃ ５６５７４０）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって培養する（ステージ４）。
【０１３３】
対照として、別の細胞集団を、１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４、対照群）。
【０１３４】
図１に示すように、ステージ４におけるＴＢＰ処理により、インスリン発現細胞が増加する結果となった（図１、パネルａ）。なお、これらインスリン発現細胞の約６０％が単独の内分泌ホルモン発現細胞であり、これらの細胞はインスリンを発現し、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリン（図１、パネルａ及びｂ、図５、パネルｄ及びｅ）を発現しなかった。ＴＢＰ処理を受けた培養においては、グルカゴン発現細胞も確認された。ほとんどのグルカゴン発現細胞は、インスリンも共発現した（図１、パネルａ及びｂ）。対照群について、細胞の大部分はインスリン及びグルカゴンを共発現した（図１、パネルｃ及びｄ）。
【０１３５】
異なる実験において、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理１：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理１）、又は
ｄ．処理２：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び１００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理２）、又は
ｅ．処理３：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び２０ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理３）、又は
ｆ．処理４：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理４）にわたって処理した。
【０１３６】
免疫細胞化学的分析を用い、本発明の細胞の形成に対する様々な濃度のＴＰＢの影響を評価した。インスリン単独発現細胞数の著しい増加が、５００ｎＭ及び１００ｎＭのＴＰＢ処理群の両方（図２、パネルａ及びｂ）において観察された。ＦＡＣＳ分析では、両方の処理によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて１２％のインスリン単独発現細胞をもたらし、この集団の１５％がＮＫＸ６．１も発現していたことが確認された（表１−ＮＫＸ６．１／ＩＮＳ発現細胞は総集団の２．４％であった）。対照群と同様に、２０ｎＭのＴＰＢにおいては、ほとんどの細胞がインスリン及びグルカゴンを共発現した（図２、パネルｃ及びｄ）。
【０１３７】
【表１】
【０１３８】
内分泌ホルモン発現細胞形成への作用が、プロテインキナーゼＣの活性化を介してなされたことを更に確認するため、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の別の細胞集団を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬ ＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理５：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理５）、又は
ｄ．処理６：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、５００ｎＭのＴＰＢ、及び５μＭのＧＯ ６９７６を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理６）、又は
ｅ．処理７：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で処理し（ステージ４、処理７）、次いで
ｆ．１％のＢ２７を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ５）。
【０１３９】
ＧＯ ６９７６は、Ｃａ2+依存性プロテインキナーゼＣのイソ型を選択的に阻害するといわれている。ＴＰＢのみ（図３、パネルａ）、並びにＴＰＢ及びＧＯ ６９７６（図３、パネルｂ）を与えられた培養液において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の数が著しく減少する。ＦＡＣＳ分析では、ＴＰＢ処理（処理６）が、３０．６％のシナプトフィジン発現細胞、１２％のインスリン単独発現細胞、及び４．６％のグルカゴン発現細胞をもたらしたことが確認された。一方、ＴＢＰ及びＧＯ ６９７６処理（処理７）は、１０．６％のシナプトフィジン発現細胞と、検出できないレベルのインスリン単独発現細胞をもたらした（表２）。処理６と処理７との間で、観察された総細胞数に違いはなかった（図３、パネルｃ及びｄ参照、処理６及び処理７の総細胞数を表すＤＡＰＩ染色を示す）。これらの結果は、プロテインキナーゼＣのシグナル伝達が、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成に重要であり得ることを示唆する。
【０１４０】
その他のプロテインキナーゼＣ活性化因子も調べた。これらはインドラクタムＶ（ＩＬＶ）（Ａｘｘｏｒａ；カタログ＃ ＡＬＸ−４２０−０１１−Ｃ３００）及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃５２４４００）とした。しかし、ＴＰＢのみがインスリン単独発現細胞の形成を示した（図４、パネルａ）。ＩＬＶ（図４、パネルｂ）及びＰＭＡ（図４、パネルｃ）の両方が５００ｎＭにおいて、６日後にインスリン及びグルカゴンを共発現する細胞をもたらした。ＦＡＣＳ分析では、ＴＰＢ処理が、１２％のインスリン単独発現細胞、及び４．６％のグルカゴン発現細胞、並びに７．１％のインスリン及びグルカゴンを共発現する細胞をもたらしたことが確認された。一方、ＩＬＶ処理は、３％のインスリン単独発現細胞、及び１２％のグルカゴン細胞、並びに１２％のインスリン及びグルカゴンを共発現する細胞をもたらした（表２）。免疫細胞化学的分析により、ＴＰＢで処理した培養液において、インスリン発現細胞の２０％がＮＫＸ６．１（図５、パネルａ）及びＰＤＸ１（図５、パネルｂ）を共発現したことが示された。インスリン発現細胞の大部分は、内分泌腺マーカー（ｍａｋｅｒ）であるＮＥＵＲＯＤを共発現した（図５、パネルｃ）。ソマトスタチン又はグレリン（ＧＨＲＬ）を共発現したインスリン発現細胞はほとんどなかった（図５、パネルｄ及びｅ）。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
（実施例２）
インスリン及びＮＫＸ６．１、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成する別法
異なる実験において、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬ ＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．処理８：１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及びｐ３８キナーゼ阻害剤（米国特許第６，２１４，８３０号に開示されるもの、２．５μＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間（ステージ３、処理８）、又は
ｃ．処理９：１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間（ステージ３、処理９）、次いで
ｄ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１４３】
ステージ３、処理８により、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現したが、ＣＤＸ２及びＮＧＮ３を共発現しなかった膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の形成をもたらした。一方、ステージ３、処理９では、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＧＮ３を共発現した膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の形成をもたらした。これらの細胞集団に対するプロテインキナーゼＣ活性化因子処理の影響を調べた（上記ステージ４）。
【０１４４】
ＦＡＣＳ分析を行い、インスリン単独陽性細胞、グルカゴン単独陽性細胞、インスリン／グルカゴン二重陽性細胞、ＮＫＸ６．１陽性細胞を発現する細胞、インスリン／ＮＫＸ６．１陽性細胞、及びシナプトフィジン陽性細胞（膵臓内分泌腺マーカー）の比率を明らかにした。
【０１４５】
表３に示すように、処理８で形成された細胞集団は、シナプトフィジン発現で表される、より大部分の内分泌細胞を生じ、総細胞集団の４９．７％はシナプトフィジンを発現した。総集団の２７．８％はインスリン単独陽性細胞であった。
【０１４６】
一方、処理９で形成された細胞集団が生じたシナプトフィジン発現細胞は、たった２５．７％であった。総集団の７．６％はインスリン単独発現細胞であった。両方の処理で観察されたグルカゴン単独発現細胞に有意差はなく、グルカゴン発現細胞の比率はインスリン発現細胞より有意に低かった。
【０１４７】
かなりの量のインスリン発現細胞はまた、ＮＫＸ６．１も共発現した。処理８を受けた細胞集団では、総集団の１１％がインスリン及びＮＫＸ６．１を発現した。処理９を受けた細胞集団では、総集団の２％がインスリン及びＮＫＸ６．１を発現した。
【０１４８】
免疫蛍光分析によりこれを確認した（図６）。処理８は、処理９に比べてインスリン発現細胞を増加させた（図６、パネルａ及びｄ）。ほとんどのグルカゴン発現細胞は多ホルモン細胞であった（図６、パネルａ、ｂ、ｄ及びｅ）。これらの結果は、処理８で生じた細胞集団（ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現したが、ＣＤＸ２及びＮＧＮ３は共発現しなかった膵臓内胚葉系に特徴的なマーカー（maker）を発現する細胞）は、本発明の方法により、より効率的に誘導され成熟した機能性インスリン発現細胞になれることを示唆する。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
（実施例３）
インスリン及びＮＫＸ６．１、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成する別法
別の実験において、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及びｐ３８キナーゼ阻害剤（ＪＮＪ３０２６５８２、２．５μＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理１０：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間（ステージ４、処理１０）、又は
ｄ．処理１１：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で９日間（ステージ４、処理１１）、又は
ｅ．処理１２：１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で１２日間にわたって処理した（ステージ４、処理１２）。
【０１５１】
表４に示すように、プロテインキナーゼＣ活性化因子による処理期間を、９日間（処理１１）又は１２日間（処理１２）のいずれかに延長したとき、更なる効果はみられなかった。インスリン単独発現細胞は、処理１０で６日間処理後、総集団の２７．８％であった。反対に、インスリン発現細胞は、９日間処理（処理１１）後１０％に、１２日間処理（処理１２）後更に４％に減少した。同時に、インスリン及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞集団の総比率も、処理の延長後に著しく下がった。これらの結果は、ノギン、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ、及びプロテインキナーゼＣ活性化因子による６日間処理は、本発明の細胞の形成に十分であったことを示唆した。
【０１５２】
【表４】
【０１５３】
（実施例４）
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−ｂｅｉｇｅ（Ｂｇ）マウスへの、本発明の細胞の移植
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地により１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び５００ｎＭのＴＢＰを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１５４】
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。得られた細胞集合体を回収し、５百万個の細胞を含有する集合体を免疫不全マウス（ＳＣＩＤ／Ｂｇ、動物番号４７、４８、４９、５０、及び５１）の腎臓被膜に移植した。図７を参照されたい。
【０１５５】
４週間後、これらの移植物中のインスリン産生細胞の機能性を、動物にグルコースを投与しインスリン分泌を誘導することにより試験した。動物を約１５〜２０時間にわたって絶食させ、その後、後眼窩から血液サンプルを採取した（処理前グルコース）。次いで各動物に、約３ｇ／ｋｇのグルコース／３０％のデキストロース溶液を腹腔内注射により投与し、グルコース注入の約６０分後に血液を採取した。非常に感受性の高い、ヒト特異的なＣペプチドＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＨ）を使用して、マウス血清を用いて血中ヒトＣペプチドを検出した。ヒトＣペプチドの検出は、インスリン分泌が移植細胞に由来していることを示す。
【０１５６】
移植後４週目程の早期に、動物血清中のヒトＣペプチドを検出した。ヒトＣペプチドは経時的に増加した。移植データを図７にまとめる。１ヶ月の終了時点で、試験群の６０％の動物において、グルコース投与に応答するヒトＣペプチド（０．２ｎｇ／ｍＬ未満）が検出できた。４週間後、４例中３例のマウスで、ヒトＣペプチドのグルコース刺激化血清濃度が５〜１０倍上昇した。移植１２週間後、移植マウスにおけるヒトｃペプチドの平均グルコース刺激化血清濃度は、１ｍｇ／ｍＬより高かった（ｎ＝４）。
【０１５７】
（実施例５）
ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成する別法
簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを追加したＲＰＭＩ培地により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎＭ ＰＭＡ、又は１００ｎＭのＴＰＢ、又は２０ｎＭのホルボール−１２，１３−ジブチラート（ＰＤＢｕ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ、カタログ＃５２４３９０）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１５８】
対照として、別の細胞集団を、１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを追加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１５９】
ステージ４の６日目に培養液を２回サンプリングし、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ウェルあたり１００視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総ＰＤＸ１発現細胞、及び総ＮＫＸ６．１発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１タンパク質発現細胞は、総細胞集団の比率として報告した。図８に示すように、プロテインキナーゼＣ活性化因子処理群では、対照処理で得られたサンプルと比較して低い有効濃度（約２０ｎＭ）において、ＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１発現細胞集団が劇的に増加した。ステージ４の６日目までに、プロテインキナーゼＣ活性化因子又は対照処理のいずれかを受けた細胞集団では、集団の９２％±４％がＰＤＸ１を発現した。プロテインキナーゼＣ活性化因子処理群では、７５％±５％のＰＤＸ１発現細胞がＮＫＸ６．１を発現した。しかし、ノギン及びＴＧＦβ受容体阻害剤のみで処理された集団（対照）では、ＰＤＸ１発現細胞の５８％±５％のみがＮＫＸ６．１を発現した。プロテインキナーゼＣ活性化因子の存在下では、２０％のＮＫＸ６．１発現細胞は、増殖マーカー、ＥｄＵ（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｃ１０３３７）に対して共に陽性であった。
【０１６０】
この実験では、プロテインキナーゼＣ活性化因子を比較的低い有効濃度（〜２０ｎＭ）でノギン及びＴＧＦβ受容体阻害剤と組み合わせて用いると、Ｎｋｘ６．１発現の上方制御、並びにＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する細胞比率の増加を促進できることを示す。
【０１６１】
（実施例６）
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、プロテインキナーゼＣ活性化因子による処理
簡潔に述べると、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュと、０．２％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを追加したＲＰＭＩ培地により１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．Ｔ１：１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間（ステージ３、Ｔ１）、又は
Ｔ２：１％のＢ２７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、及び１００ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３、Ｔ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で６日間にわたって処理した（ステージ４）。
【０１６２】
図９に示すように、対照群（Ｔ１）と比較してＴＰＢで処理した細胞（Ｔ２）において、膵臓内胚葉マーカーであるＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１αの顕著な下方制御が観察された。ＮＫＸ６．１は免疫組織化学的に検出できなかった。これらのデータは、ステージ３におけるプロテインキナーゼ活性化因子処理により、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞の生成が促進されなかったことを示唆する。
【０１６３】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全容を本明細書に援用するものである。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、前記集団の１０％未満の細胞がグルカゴンを発現する、細胞集団。
【請求項２】
前記細胞の少なくとも３０％がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記細胞の少なくとも４０％がＮＫＸ．６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記細胞の少なくとも５０％がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記細胞の少なくとも６０％がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記細胞の少なくとも５％がインスリンを発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項７】
ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成する方法であって、前記集団の１０％未満の細胞がグルカゴンを発現し、前記方法が、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及びプロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で培養することにより、前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、前記膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程と、を含む、方法。
【請求項１】
ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、前記集団の１０％未満の細胞がグルカゴンを発現する、細胞集団。
【請求項２】
前記細胞の少なくとも３０％がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記細胞の少なくとも４０％がＮＫＸ．６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記細胞の少なくとも５０％がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記細胞の少なくとも６０％がＮＫＸ６．１を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記細胞の少なくとも５％がインスリンを発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項７】
ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成する方法であって、前記集団の１０％未満の細胞がグルカゴンを発現し、前記方法が、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及びプロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で培養することにより、前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＮＫＸ６．１及びインスリン、並びに最小量のグルカゴンを共発現する、前記膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる工程と、を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１５４８０（Ｐ２０１３−５１５４８０Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６０５８（Ｐ２０１２−５４６０５８）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０７５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９０１７
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０７５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９０１７
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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