ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許出願シリアル番号第６１／１１０，２８７号（２００８年１０月３１日出願）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。具体的には本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞はＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程となっている。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚性幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。
【０００７】
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【０００８】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００９】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年）。
【００１０】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０、２００４年）。
【００１１】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７による処理によりＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１２】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に増大させる増殖因子の効果を研究した。彼らは、ＴＧＦ−β２によってＰｄｘ１陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６．）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下で、マウス胚性幹細胞からｂｒａｃｈｙｕｒｙ+／ＨＮＦ−３β+内胚葉細胞が誘導されることを示している（米国特許出願公開２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。
【００１４】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐａｇｅ １６８０６，２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。
【００１５】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【００１６】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８年）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児性腺組織から、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみでも分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；同第０１／５１６１６号）。
【００１７】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、一部の内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤｘ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。
【００１８】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞に転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００１９】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に細胞をノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰＤｘ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００２０】
１つの例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２１】
サイクリンはβ細胞機能に関係していると見なされてきた。例えば、Ｌｉｌｊａらは、「インスリンを分泌する膵臓β細胞にはＣｄｋ５が存在する」と報告する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，Ｉｓｓｕｅ ３６，３４１９９〜３４２０５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ７，２００１）。Ｌｉｌｊａらは、「Ｃｄｋ５はβ細胞中に存在し、インスリン開口分泌の正の調節因子として作用する。」と記載する。
【００２２】
他の例では、Ｍａｒｚｏらは「Ｃｄｋ４ノックインマウスではβ細胞集団が有意に増加し、かつＣｄｋ４ノックインマウスは、Ｃｄｋ４がＩ型糖尿病において膵臓β細胞集団を再生するのに潜在的な標的であることを示す、生理学的機能を有する」と記載する（Ｄｉａｂｅｔａｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．４７，Ｎｕｍｂｅｒ４，６８６〜６９４，Ａｐｒｉｌ １，２００４．）。
【００２３】
他の例では、Ｕｂｅｄａらは、サイクリン依存性キナーゼ５活性の阻害が、膵臓β細胞を糖毒性から保護するということを報告する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８１，Ｉｓｓｕｅ ３９，２８８５８〜２８８６４，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２９，２００６）。
【００２４】
他の例では、Ｗｅｉらは、グルコース刺激型のインスリン分泌の、Ｃｄｋ５依存性の制御を報告する（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，１１０４〜１１０８（１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００５．））。
【００２５】
他の例では、Ｖａｎｄｅｒｆｏｒｄらは以下のように記載している。「ＭａｆＡは膵臓のβ細胞内で発現される塩基性ロイシンジッパー型転写制御因子であり、β細胞のバイオロジーの様々な態様に関与していることから正常なグルコース恒常性を維持するために必要とされる。ＭａｆＡたんぱく質レベルは、未だ十分には特徴づけられていないメカニズムによって、高濃度のブドウ糖に反応して増加することが知られている。我々は、別々の細胞内シグナル伝達イベントがｍａｆＡ発現を制御するのか否かを調査した。我々は、一般的なキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンが、タンパク質の安定性を変化させることなくｍａｆＡ発現を誘導することを見出した。ＭＡＰキナーゼＪＮＫの阻害は、ｍａｆＡ発現に対するスタウロスポリンの効果を模倣する。カルモジュリンキナーゼとカルシウムシグナル伝達も同様に、高濃度のブドウ糖によりｍａｆＡ発現を刺激するのに重要である。しかしながら、スタウロスポリン、ＪＮＫ、及びカルモジュリンキナーゼは、インスリン発現の誘導に対して異なる効果を有する。これらのデータは、ＭａｆＡレベルが、複数のキナーゼ経路の協調作用により厳密に制御されていることを明らかにした。」（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ（２００８），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂｂ．２００８．１０．００１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、多能性幹細胞を膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞へと分化させるための方法の開発に対して、未だに有意な必要性が存在している。本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
一実施形態では、本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】パネルａは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのインスリン発現とグルカゴン発現の比に対する、ＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキナーゼ阻害剤ライブラリ由来の化合物の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。英数字ラベルは表１に示される同一の化合物と対応する。パネルｂは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのＭＡＦＡ発現とＡＲＸ４発現の比に対する、ＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキナーゼ阻害剤ライブラリ由来の化合物の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。英数字ラベルは表１に示される同一の化合物と対応する。
【図２Ａ】実施例１に記載の方法に従って処理した、ステージ６処理の４日目の細胞の４ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｂ】０．５μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ＃ ５３３０８１２で処理した、処理の４日目の細胞の４ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｃ】１μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ＃ ５３３０８１２で処理した、処理の４日目の細胞の４ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｄ】実施例１に記載の方法に従って処理した、ステージ６処理の６日目の細胞の２０ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｅ】０．５μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ ＃５３３０８１２で処理した、処理の６日目の細胞の２０ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｆ】１μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ＃ ５３３０８１２で処理した、処理の６日目の細胞の２０ｘ顕微鏡像を示す。
【図３】０．５μＭ（濃色のバー）又は１．０μＭ（淡色のバー）の化合物ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃５３３０８１２での５日間の処理後の、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞での、２３種の遺伝子の発現を示す。発現レベルは０日目、２日目及び５日目で測定した。
【図４】実施例４に記載の分化プロトコルの、ステージ７で処理した細胞における、膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現に対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ処理の効果を示す。
【図５】島様のクラスタのジチゾン（dithazone）染色に対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ処理の効果を示す。
【図６】実施例５に記載の方法に従って生産されたインスリン産生細胞中の、インスリン、シナプトフィジン及びグルカゴンの発現を示す。記載のたんぱく質の発現はＦＡＣＳにより測定した。
【図７】実施例５に記載の方法に従って生産されたインスリン産生細胞中の、インスリン、シナプトフィジン及びグルカゴンの発現を示す。記載のたんぱく質の発現はＦＡＣＳにより測定した。
【図８】本発明の方法により生産された、インスリン産生細胞中のＭＡＦＡ（パネルａ）及びインスリン（パネルｂ）の発現を示す。１、２、３及び４日目の細胞サンプルを、ＰＣＲ解析に用いた。ＣＤＫ阻害剤での処理の４日後に、ＣＤＫ阻害剤を培養物から除去し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１％Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ中で更に４日間培養した。４日間の終了時に、ＰＣＲ解析のためにサンプルを三つ組複製で回収した。
【図９】膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのＭＡＦＡ発現に対する、ＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキナーゼ阻害剤ライブラリＩ由来の化合物の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。
【図１０】膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞での、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及びＭＡＦＡのｍＲＮＡ発現に対するゲニステイン（genestein）の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００３０】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００３１】
幹細胞は、発生上の能力によって、（１）全ての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素（例えば、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。
【００３２】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化していない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわち、その細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００３３】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１、及び以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、β細胞が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ−、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、又はＰＴＦ１ αのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系の細胞が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、又はＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわちＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、又はＧＡＴＡ６のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４又はＮＫＸ２．２のうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン産生細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを産生することが可能な細胞を指す。
【００４４】
本明細書で言うところの「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「前腸後部細胞」は、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ１、ＨＮＦ１、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「原腸管細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−１又はＨＮＦ４Ａのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４９】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．））によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。
【００５０】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層からの細胞種の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００５１】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ、著しく変更されてはいない。
【００５２】
多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞等）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【００５３】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載されているように調製される。
【００５４】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより条件づけした培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。
【００５５】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞層を用いてヒト胚盤胞からの多能性幹細胞系を培養することについて開示している。
【００５６】
Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
【００５７】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー細胞培養中で霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を更に開示している。
【００５８】
別の例として、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。
【００５９】
別の例として、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。
【００６０】
更なる別の例として、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。
【００６１】
Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００６２】
別の例として、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。
【００６３】
米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー細胞培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
【００６４】
別の例として、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【００６５】
別の例として、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。
【００６６】
別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。
【００６７】
代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、無フィーダー細胞かつ無血清の培養システムを開示している。
【００６８】
別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００６９】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞方法を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有する培地中で細胞を培養し、この培地は、本質的に哺乳動物胎児血清を含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、ここで増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は馴化培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【００７０】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【００７１】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「１つの実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外基質成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びに、ヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。
【００７２】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。」と述べている。
【００７３】
更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、基本的に無フィーダー細胞かつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基礎培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のアスコルビン酸、を含む培地を開示している。
【００７４】
別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【００７５】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００７６】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００７７】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれてもよい。これら全特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【００７８】
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非不可欠アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。
【００７９】
多能性幹細胞からの膵臓ホルモン産生細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞を作製するための方法を提供し、かかる方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。
【００８０】
本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０又はＴｒａ１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。
【００８１】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群より選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８２】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ−１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００８３】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００８４】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤｘ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【００８５】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００８６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８７】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８８】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８９】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９０】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００９１】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５に開示されている。
【００９２】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【００９３】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９４】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９５】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９６】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９７】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９８】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９９】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【０１００】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【０１０１】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。
【０１０２】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１０３】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば、多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもの：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０、又はＴｒａ１−８１のうちの１つ以上の発現が挙げられる。
【０１０４】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１０５】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１０６】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１０７】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化させられる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０１０８】
本発明の一態様では、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。
【０１０９】
本発明の一態様では、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。
【０１１０】
本発明の１つの態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第６０／９９０，５２９号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に分化させる。
【０１１１】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、ＨＬＸＢ９、ＰＴＦ−１ α、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＨＮＦ−１ βなどの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。
【０１１２】
分化効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０１１３】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１１４】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【０１１５】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１６】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０１１７】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’ Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１８】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１９】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１２０】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２１】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２２】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２３】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２４】
本発明の一態様では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、この方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６１／１１０，２７８号に示された方法に従って、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。
【０１２５】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵内分泌系に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、膵内分泌系の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵内分泌系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵内分泌系に特異的なマーカーとしては、例えばＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ又はＩＳＬ１などの転写因子の１種以上の発現が挙げられる。
【０１２６】
β細胞系の細胞に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、β細胞系の細胞の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用することができる。β細胞系に特異的な特徴としては、例えば、特にＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＰＡＸ４、ＮＥＵＲＯＤ、ＨＮＦ１ β、ＨＮＦ６、ＨＮＦ３ β又はＭＡＦＡなどの転写因子の１つ以上の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定について当該技術分野で十分に確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。
【０１２７】
分化効率は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。あるいは分化効率は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０１２８】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１２９】
本発明の一態様では、分化効率は、処理後の所定の細胞培養物中のインスリン陽性細胞の百分率を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１００％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約９０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約８０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約７０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約６０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約４０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約３０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約２０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５％のインスリン陽性細胞を生成する。
【０１３０】
本発明の一態様では、分化効率は、グルコース刺激によるインスリン分泌を、細胞が放出するＣ−ペプチドの量を測定することで検出し、測定することにより求められる。一実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。
【０１３１】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのＭＡＦＡの発現の増加
一実施形態では、本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【０１３２】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ１を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ２を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ４を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ５を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ９を阻害し得る。あるいは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、これらの任意の組み合わせの、サイクリン依存性キナーゼの複数のイソ型を阻害し得る。
【０１３３】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤はタンパク質であり得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はペプチドであり得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤は低分子であり得る。一実施形態では、低分子サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、７−ｎ−ブチル−６−（４−ヒドロキシフェニル）［５Ｈ］ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン、９−ニトロ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン、３−（６−オキソ−９−ニトロ−５，６，７，１２−テトラヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）プロピオニトリル、（２Ｒ）−２−（（６−（（３−アミノ−５−クロロフェニル）アミノ）−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−ブタノール、アルシリアフラビンＡ、［６−ベンジルアミノ−２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−９−イソプロピルプリン、ブチロラクトンＩ、（Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン、２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−６−（ｏ−ヒドロキシベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン、１−（２，６−ジクロロフェニル）−１，５−ジヒドロ−６−（（４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル）メチル）−３−（１−メチルエチル）−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、Ｃｄｋ／サイクリン阻害ペプチドＩＩＩ、３−（２−クロロ−３−インドリルメチレン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン、エチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレート、ＲＯ−３３０６、Ｎ−（ｃｉｓ−２−アミノシクロヘキシル）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−９−エチル−９Ｈ−プリン−２，６−ジアミン、６−シクロヘキシルメトキシ−２−（４’−スルファモイルアニリノ）プリン、５−アミノ−３−（（４−（アミノスルホニル）フェニル）アミノ）−Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−カルボチオアミド、３−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン、Ｃｄｋ２阻害剤Ｉ、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩ、２（ビス−（ヒドロキシエチル）アミノ）−６−（４−メトキシベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン、４−（６−シクロヘキシルメトキシ−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチルベンズアミド、Ｎ４−（６−アミノピリミジン−４−イル）−スルファニルアミド、（４−（２−アミノ−４−メチルチアゾール−５−イル）ピリミジン−２−イル）−（３−ニトロフェニル）アミン、２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン、１，４−ジメトキシアクリジン−９（１０Ｈ）−チオン、５−（Ｎ−（４−メチルフェニル）アミノ）−２−メチル−４，７−ジオキソベンゾチアゾール、４−（３，５−ジアミノ−１Ｈピラゾール−４−イルアゾ）−フェノール、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−（３−クロロアニリノ）−９−イソプロピルプリン、ファスカプリシン、インジルビン−３’−モノオキシム、インジルビン−３’−モノオキシム、５−ヨード−，インジルビン−３’−モノオキシム−５−スルホン酸、イソグラヌラチミド、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−メチルプリン、６−（２−ヒドロキシベンジルアミノ）−２−（（１Ｒ）−（ヒドロキシメチル）プロピル）アミノ）−９−イソプロピルプリン、５−ブロモ−３−（２−（４−フルオロフェニル）−２−オキソエチリジン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２−（１Ｒ−イソプロピル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−（３−クロロアニリノ）−９−イソプロピル−プリン、ラパマイシン、２−（Ｒ）−（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン、スキトネミン、３−［１−（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メタ−（Ｚ）−イリデン］−５−メトキシ−１，３−ジヒドロインドール−２−オン、及び４−（３’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンからなる群から選択される。
【０１３４】
一実施形態では、サイクリン依存性キナーゼはエチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレートである。一実施形態では、エチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレートを、内分泌腺系に特徴的なマーカーを発現している細胞に約０．１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で、約１日〜７日間にわたって加える。
【０１３５】
一実施形態では、内分泌腺系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレートで約１日〜約７日間にわたって処理する。
【０１３６】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
ウシ胎児血清の非存在下での、ヒト胚性幹細胞の細胞株Ｈ１の膵内分泌細胞への分化
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の継代数５２の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたディッシュ（１：３０希釈）上で培養し、細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるために、以下の分化プロトコルを実施した。
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃１５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃１００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理した（ステージ５）。
【０１３８】
培地は毎日交換した。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ分析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３つ組複製で採取した。
【０１３９】
（実施例２）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＥＭＤキナーゼ阻害剤ライブラリＩＩ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数４４のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例１に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き、細胞をＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ化合物ライブラリ（カタログ＃５３９７４５，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）由来の化合物を最終濃度１μＭで含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で、４日間にわたって処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。プロトコルを通して、培地は毎日交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、インスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、及びＡｒｘ４の発現について解析した。結果は、リアルタイムＰＣＲでの測定結果により、処理サンプル対未処理対照の、インスリン／グルカゴン比（図１、パネルａ）、又はＭＡＦＡとＡＲＸ４の比（図１、パネルｂ）として表わされる。各ウェル＃について対応するＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃は、表１に列挙する。
【０１４０】
１μＭの濃度の化合物Ａ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＣ２での、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、およそ３．０の、あるいはそれよりも大きいインスリン／グルカゴン発現比をもたらした（図１のパネルａを参照されたい）。
【０１４１】
次いで、ＭＡＦＡ／ＡＲＸ４の比に対するこれらの化合物の効果を調べたところ、数個の化合物での膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、ライブラリ内の他の試験化合物よりも、ＭＡＦＡとＡＲＸ４の比に、より大きな変化をもたらしたことを観察した：化合物Ｃ２で処理した細胞は、約１０００のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比を示した。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の化合物Ｃ２での処理は、約１００のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比をもたらした（図１のパネルｂを参照されたい）。
【０１４２】
（実施例３）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理した細胞でのインスリン及びＭＡＦＡ発現に対する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤処理の効果
実施例２でインスリン発現とグルカゴン発現の比、又はＭＡＦＡとＡＲＸ４の比を増加させたいくつかの化合物は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤であった。このような化合物の１つはＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７（５−アミノ−３−（（４−（アミノスルホニル）フェニル）アミノ）−Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−カルボチオアミド）（カタログ＃ ２１７７１４；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）である。これらの観察結果を確証づけるために、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした１０ｃｍ2のディッシュ上で、継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を培養し、実施例１に記載の方法に従って、ステージ５まで処理した。ステージ５以降は、１％ Ｂ２７と１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２で、細胞を６日間にわたって処理した。培地は１日おきに交換した。リアルタイムＰＣＲ用の細胞サンプルを化合物での処理前、化合物処理の２日目及び５日目に採取した。
【０１４３】
化合物処理対未処理対照の４日目又は６日目の細胞の特徴的な顕微鏡写真を図２に示す。未処理細胞は高密度で充填され（図３、パネルａ及びｄ）、個別の細胞を区別することは困難である。しかしながら、０．５μＭ又は１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃５３３０７９７での６日間にわたる処理後には、未処理対照（図２、パネルｄ）と比較してそれぞれの核が目に見えるようになり（図２、パネルｅ及びｆ）、細胞集団に分化が生じたことを示している。これはまた、図２のパネルｂ及びｃに示されるような細胞層中の間隙により見出され得る、一部の細胞死を伴う。
【０１４４】
ＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７での細胞処理は、程度は異なるもののインスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、ＭＡＦＢ及びソマトスタチンの発現上昇をもたらした。培養０日目（処理前）と比較した場合の、処理あたりの遺伝子発現の相対的な誘導を図３のパネルａ〜ｖに示す。１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的に処理の４８時間の時点でのグルカゴン発現がおよそ１．５倍に上昇した。この発現量は、処理の５日以降に処理前のレベル未満に下降した。０．５μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７での処理では、グルカゴン発現の上昇は観察されなかった（図３、パネルａを参照されたい）。
【０１４５】
１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的にインスリン発現がおよそ１．５倍に上昇した（図３、パネルｂを参照されたい）。
【０１４６】
１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的にＭＡＦＡ発現がおよそ２００倍に上昇した（図３、パネルｄを参照されたい）。
【０１４７】
０．５μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的にＭＡＦＢ発現がおよそ１．５倍に上昇した（図３、パネルｃを参照されたい）。ソマトスタチンの発現では、用量依存的な上昇が観察された（図３、パネルｅ）。
【０１４８】
ＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、アミラーゼの発現量は変化しなかった（図３、パネルｆを参照されたい）。しかしながら、ＰＡＸ４（図３、パネルｈ）、ＮＫＸ６．１（図３、パネルｋ）、ＰＤＸ１（図３、パネルｌ）、ＮＥＵＲＯＤ（図３、パネルｏ）、及びＢＲＮ４（図３、パネルｑ）では発現レベルに減少が観察された。
【０１４９】
（実施例４）
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤処理は、島様クラスタにおいてＭＡＦＡ発現を上昇させた
継代数５２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたディッシュ（１：３０希釈）上で培養し、実施例１に記載の方法に従って分化させた。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に成熟させるために、追加のステージ（ステージ６）を加えた。この実施例では、ステージ６はＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）での７日間の処理から構成される。培地は毎日交換した。
【０１５０】
ステージ６後に、細胞は１Ｘアキュターゼ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で、室温で５分にわたって処理した。アキュターゼを除去し、細胞にＤＭＥＭ／１２＋１％ Ｂ２７を加えた。接着した細胞をセルスクレーパーを用いて取り外し、穏やかに再懸濁し、４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナー上に残った細胞を基本培地ですすぐことで取り外し、超低接着性の培養プレート（カタログ＃ ３４７１，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａ）上で懸濁液の状態で培養した。次いで細胞を以下のように処理した：細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）と、１μｍのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ（カタログ＃２１７７１４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）を含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で１０日間にわたって培養した（ステージ７）。ビヒクルで処理した細胞を対照として含めた。ＰＣＲ解析用に、７日目〜１０日目にサンプルを回収し、ジチゾン染色した。本実施例で概説された方法に従って、懸濁状態で培養した細胞は、形態的に膵臓の島クラスタに類似であると推測された。ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩでの処理は、島様クラスタの形態に影響を与えるようには見えなかった。
【０１５１】
図４のパネルａ〜ｉは、細胞クラスタの遺伝子発現プロファイルに対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ処理の効果を示す。ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩでの処理は、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現を上昇させ、特にプロインスリン転写因子のＭＡＦＡの発現を上昇させた。
【０１５２】
図５のパネルａ〜ｂは、クラスタのジチゾン（dithazone）（ＤＴＺ）染色に対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩの効果を示す。ＣＤＫ阻害剤で処理し、かつＤＴＺで染色した細胞クラスタは、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩで処理していないクラスタと比較したときに、より赤みの強い染色パターンを示した。
【０１５３】
（実施例５）
本発明の方法により作製されたインスリン産生細胞の、ＦＡＣＳ解析
継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用してインスリン産生細胞へと分化させた：
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃ ５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理し（ステージ５）、次いで
ｆ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で７日間にわたって処理し（ステージ６）、次いで
ｇ．アキュターゼで５分間にわたって処理した後に、接着しているあらゆる残りの細胞を掻き取りにより取り外した。次いで細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナー上に残った細胞を基本培地ですすぐことで取り外し、超低接着性の培養プレート上で、ＤＭＥＭ−高グルコース（カタログ＃ １１９９５−０７３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）＋１％ Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）、１μｍのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ（カタログ＃ ２１７７１４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）中に懸濁した状態で、５日間にわたって培養した（ステージ７）。
【０１５４】
ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、島様クラスタを単一細胞へと分散させ、冷ＰＢＳで洗浄した。固定のため、細胞を２００〜３００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ ５５４７２２，ＢＤ，Ｃａ）中に再懸濁し、４℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞を１ｍＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ ５５４７２３）で２回洗浄し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中に２％正常ヤギ血清を含有する１００μＬの染色／ブロッキング溶液中に再懸濁した。フローサイトメトリー解析のために、細胞は以下の一次抗体で染色した：抗−インスリン（ウサギｍＡｂ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｎｏ．Ｃ２７Ｃ９；１：１００希釈）；抗−グルカゴン（マウスＭａｂ，Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｇ２６５４，１：１００）；抗−シナプトフィジン（ウサギポリクローナル抗体，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｎｏ Ａ００１０，１：５０）。細胞を４℃で３０分にわたってインキュベートし、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、更に３０分間にわたって、以下のような適切な２次抗体中でインキュベートした：ヤギ抗−ウサギＡｌｅｘａ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ａ２１２４６）又はヤギ抗−マウス６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ａ２１２３５）；ヤギ抗−ウサギＲ−ＰＥ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｎｏ．ＡＬＩ４４０７）。二次抗体はすべて１：２００の希釈率で使用した。細胞は、少なくとも１回Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳアレイを使用して分析した。少なくとも１０，０００事象を分析のために得た。対照には未分化のＨ１細胞とβ−ＴＣ（ＣＲＬ−１１５０６（商標）ＡＴＣＣ，ＶＡ）細胞株を含んだ。
【０１５５】
図６のパネルａ〜ｃは、ビヒクルを含有している培地での、ステージ７での処理後の細胞に占める、インスリン陽性細胞、シナプトフィジン（synapthophysin）陽性細胞、及びグルカゴン陽性細胞の割合を示す。図７のパネルａ〜ｃは、１μＭのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩを含有している培地での、５日間にわたるステージ７での処理後の、インスリン陽性細胞、シナプトフィジン（synapthophysin）陽性細胞、及びグルカゴン陽性細胞の割合を示す。インスリンホルモン単独の陽性細胞の数は、ＣＤＫ阻害剤での処理後に３％から８％へと上昇した。加えて、多ホルモン（インスリン及びグルカゴン陽性）細胞の割合は、ＣＤＫ阻害剤での処理後に減少した。
【０１５６】
（実施例６）
ＣＤＫ阻害剤誘導型のＭＡＦＡ発現の動態
継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用してインスリン産生細胞へと分化させた：
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃ ５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理し（ステージ５）、次いで
ｆ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で７日間にわたって処理し（ステージ６）、次いで
ｇ．アキュターゼで５分間にわたって処理した後に、接着しているあらゆる残りの細胞を掻き取りにより取り外した。次いで細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナー上に残った細胞を基本培地ですすぐことで取り外し、超低接着性の培養プレート上で、ＤＭＥＭ−高グルコース（カタログ＃ １１９９５−０７３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）＋１％ Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）、２μｍのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ（カタログ＃ ２１７７１４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）中に懸濁した状態で、１〜８日間にわたって培養した（ステージ７）。
【０１５７】
１、２、３及び４日目のサンプルを、ＰＣＲ解析のために回収した。ＣＤＫ阻害剤での処理の４日後に、ＣＤＫ阻害剤を培養物から除去し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１％ Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ中で更に４日間培養した。４日間の終了時に、ＰＣＲ解析のためにサンプルを三つ組複製で回収した。
【０１５８】
図８のパネルａ〜ｂは、ステージ７の様々な時点でのＭＡＦＡ及びインスリンの発現パターンを示す。ＣＤＫ阻害剤処理は、ＭＡＦＡ発現とインスリン発現に有意な上昇をもたらし、これらは時間関数として上昇した。しかしながら、ＣＤＫ阻害剤の除去は、化合物除去の４日後に得たサンプルにおいてＭＡＦＡ及びインスリン発現の両方で有意な低下をもたらした。
【０１５９】
（実施例７）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＢＩＯＭＯＬ（商標）キナーゼ阻害剤ライブラリ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数５１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例１に記載の方法に従って、ステージ５まで分化させた。これに続き、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７中で１日間生育させ、次いでＢＩＯＭＯＬ（商標）化合物ライブラリ（カタログ＃ ２８３２，ＢＩＯＭＯＬ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｐａ）由来の化合物を最終濃度４μＭで含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７中で、６日間にわたって処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。処理プロトコルを通し、ビヒクル又は化合物を含有している培地は１日おきに交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、インスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、及びＡＲＸ４の発現について解析した。結果は、リアルタイムＰＣＲでの測定結果により、処理サンプル対未処理対照の、インスリン／グルカゴン比（表２）、又はＭＡＦＡとＡｒｘ４の比（表２）として表わされる。各英数字ウェル＃に対する、対応するカタログ＃、ＣＡＳ＃、及び化合物名又はＩＤ数を表３に列挙する。
【０１６０】
４μＭの濃度の化合物Ｃ８又はＦ１での、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、およそ１０．０の、あるいはそれよりも大きいインスリン／グルカゴン発現比をもたらした。Ｄ９で処理した細胞は、およそ１８４０．０のインスリン／グルカゴン発現比を有する（表２）。
【０１６１】
次いで、ＭＡＦＡ／ＡＲＸ４の比に対するこれらの化合物の効果を調べたところ、数個の化合物での膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、ライブラリ内の他の試験化合物よりも、ＭＡＦＡとＡＲＸ４の比に、より大きな変化をもたらしたことを観察した：化合物Ｂ６又はＦ１で処理した細胞は、およそ１０を超えるＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比を示した。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の化合物Ｃ８での処理は、約８４のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比をもたらした一方で、Ｄ９で処理した細胞は約２１２のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比を有した（表２）。
【０１６２】
（実施例８）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理した細胞でのインスリン及びＭＡＦＡ発現に対する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤の効果
継代数５１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例１に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１ ％Ｂ２７中で８日間にわたって生育させ、次いでサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を最終濃度０．６１２５、１．２５、又は５．０μＭで含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１ ％Ｂ２７中で、４日間にわたって処理した。６種の阻害剤を試験した：ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０８１２（ＥＭＤ ｃａｔ＃ ２１７７１４）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５６６（ＥＭＤ ｃａｔ＃２１７７１３）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７（ＥＭＤ ｃａｔ＃ ２１９４７６）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ７３２９２（ＥＭＤ ｃａｔ＃３４１２５１）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ ＃４５９２（ＥＭＤ ｃａｔ＃４９５６２０）、及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ １６０３５５（ＥＭＤ ｃａｔ ＃５５７３６０）。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。処理プロトコルを通し、ビヒクル又は化合物を含有している培地は１日おきに交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、インスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、及びＡＲＸ４の発現について解析した。結果は、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ビヒクル処理対照に対する倍数変化として記載される。
【０１６３】
化合物ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０８１２、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５６６、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７、及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ７３２９２の全てが、試験濃度でＭＡＦＡ発現を刺激したことを観察した（表４）。ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５９２及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ １６０３５５は試験濃度ではＭＡＦＡを刺激しなかった（表４）。化合物ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０８１２、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５６６、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５９２、及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ １６０３５５の全てが、インスリン発現を刺激したことは明らかであった（表４）。化合物（ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７）はグルカゴン及びＡｒｘ４発現（表４）の両方を減少させた一方で、ＭＡＦＡ発現を刺激した。
【０１６４】
（実施例９）
ウシ胎児血清を欠き、２５ｍＭグルコースを含有しているＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＨＧ）での、ヒト胚性幹細胞の細胞株Ｈ１の膵内分泌細胞への分化
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたディッシュ（１：３０希釈）上で培養し、以下のプロトコルを用いて、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させた：
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を加えたＲＰＭＩ培地で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で６日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理した（ステージ５）。
【０１６５】
培地は毎日交換した。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３つ組複製で採取した。
【０１６６】
（実施例１０）
実施例９に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＥＭＤキナーゼ阻害剤ライブラリＩ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例９に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き細胞を供給し、ステージ５の１、３及び５日目に、ＤＭＥＭ−ＨＧ、１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）と、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）と、ＤＭＳＯ（カタログ＃ ５３９７４４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）に溶解し、２．５μＭの最終濃度で処理したＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ化合物ライブラリ１由来の化合物とを含む培地で処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。培地はステージ５では１日おきに交換したことを除き、プロトコルを通して毎日交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。
【０１６７】
この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、ＭＡＦＡの発現について解析した。結果はリアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ＭＡＦＡ発現Ｈ１ヒト胚性幹細胞対未処理Ｈ１ヒト胚性幹細胞の倍数増加として表わす（表５）。
【０１６８】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の、２．５μＭ濃度の化合物Ａ４（Ｃａｔ＃，１２４００１，Ａｋｔ阻害剤ＩＶ）、Ｅ８（Ｃａｔ＃ ５２７４５０，ＰＫＲ阻害剤）、及びＦ９（Ｃａｔ＃５３９６４８，スタウロスポリン，Ｎ−ベンゾイル−）での処理は、ＭＡＦＡ発現の、ビヒクル処理対照を少なくとも４倍の上昇をもたらした（表５）。２．５μＭ濃度の化合物Ｅ６（Ｃａｔ＃ ５２１２３３，ＰＤＧＦ受容体チロシンナーゼ阻害剤ＩＶ）での処理は、ビヒクル処理対照を少なくとも２．５倍超えるＭＡＦＡ発現の上昇をもたらした（表５）。
【０１６９】
（実施例１１）
実施例９に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＥＭＤキナーゼ阻害剤ライブラリＩＩ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数４６のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例９に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き細胞を供給し、ステージ５の１、３及び５日目に、ＤＭＥＭ−ＨＧと、１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）と、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）（ステージ５）と、ＤＭＳＯ（表１及び６，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）に溶解させ最終濃度２．５μＭに処理したＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ化合物ライブラリＩＩ由来の化合物と、を含む培地で処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。培地はステージ５では１日おきに交換したことを除き、プロトコルを通して毎日交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。
【０１７０】
この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、ＭＡＦＡの発現について解析した。リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ＭＡＦＡ発現を刺激した化合物に関する結果を示し、かつＭＡＦＡ発現対対照サンプルにおける倍数上昇として表わす（図９）。
【０１７１】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の、２．５μＭ濃度の：アルステルパウロン、２−シアノエチル；ＳＵ９５１６；アルステルパウロン；Ｃｄｋ１／２阻害剤ＩＩＩ；カゼインキナーゼＩ阻害剤、Ｄ４４７６；又はＭＥＫ１／２阻害剤のいずれかでの処理は、未処理対照に対してＭＡＦＡ発現の４．５倍の上昇をもたらした（表７）。
【０１７２】
（実施例１２）
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡ発現を促進する低分子阻害剤での、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の細胞周期の進行の阻害
細胞周期の進行に由来して生じる細胞増殖は、細胞外増殖因子で細胞を刺激することにより活性化及び維持され得る。増殖因子は増殖因子受容体の細胞外ドメインへと結合し、受容体の細胞内ドメインの立体構造スイッチを誘導する。このシフトは受容体二量体化及び受容体の細胞内ドメイン上に位置するチロシンキナーゼの活性化を開始し、下流の複数のセリン／スレオニンキナーゼのリン酸化及び活性化を導き、最終的には細胞周期の進行と細胞増殖をもたらす。
【０１７３】
通常の生理学的な条件下では、インスリンと転写因子ＭＡＦＡの発現とにより特徴づけられる成熟した膵臓β細胞は無活動状態であり、細胞周期のＧ０に留まる傾向がある。しかしながら、機能性臓器を形成するのに十分な細胞を生成し、成熟した動物に関する要求を満たす、本発明の膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、細胞周期を循環している必要がある。その結果、本発明の膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は胚発生のある時点でβ細胞へと分化し、活動的に細胞周期により増殖している細胞から、休眠細胞へと移行する。
【０１７４】
我々のデータは、低分子キナーゼ阻害剤によりシグナルカスケードをブロックして細胞周期の進行を阻害することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に、成熟膵臓β細胞のマーカーであるＭＡＦＡの発現を誘導させ得ることを示す。増殖因子受容体（ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＩＶ）に標的とされるキナーゼ阻害剤、又はチロシンキナーゼ受容体の下流のキナーゼを中断する阻害剤（ＭＥＫ１／２阻害剤、ＰＫＲ阻害剤、又はＡｋｔ阻害剤ＩＶ）は、増殖性の、増殖因子／キナーゼに基づくシグナル伝達を中断して細胞周期の休止をもたらし、ＭＡＦＡ発現を誘導する。スタウロスポリンのような広域スペクトル阻害剤の使用は、効果的にＭＡＦＡを誘導できるが、有効濃度では細胞毒性でもある。サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（アルステルパウロン、２−シアノエチル；ＳＵ９５１６；アルステルパウロン；又はＣｄｋ１／２阻害剤ＩＩＩ）のような、より直接的な化合物は、スタウロスポリンのような広域スペクトル阻害剤と比較して、より少ない細胞毒性でＭＡＦＡを誘導する。
【０１７５】
広域スペクトルのキナーゼ阻害剤が、ＭＡＦＡ発現と、本発明の、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している、より成熟した表現型の細胞とを誘導し得るか判定するために、Ｈ１ヒトＥＳ細胞を実施例９に記載の方法に従って分化させ、ステージ５の１、３、及び５日目に、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤のゲニステイン（ヒト及びマウス細胞株のＧ２期を休止させ、複数のキナーゼを阻害することが示されている）で処理した。内分泌腺ホルモンのインスリン、ソマトスタチン、及び転写因子ＭＡＦＡの全てが、投与量１０及び３０ｎｇ／ｍＬで未処理対照に対して発現量の増加を示した一方で、内分泌腺ホルモングルカゴンは１０ｎｇ／ｍＬで発現を増加させた（図１０）。我々は投与量１００ｎｇ／ｍＬでのゲニステインで、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチン発現の損失と関連付けられる有意な毒性を観察した。
【０１７６】
これらのデータは、増殖因子受容体チロシンキナーゼから細胞内シグナル伝達キナーゼを介して核及びサイクリン依存性キナーゼに向かうシグナル伝達を阻害するために、標的にされる低分子量のキナーゼ阻害剤により、シグナルカスケードをブロックすることで、細胞周期の進行を阻害することにより、本発明の、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に、成熟膵臓β細胞のマーカーであるＭＡＦＡを発現させることができることを示す。
【０１７７】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【０１７８】
【表１】
【０１７９】
【表２−１】
【０１８０】
【表２−２】
【０１８１】
【表２−３】
【０１８２】
【表３−１】
【０１８３】
【表３−２】
【０１８４】
【表３−３】
【０１８５】
【表４】
【０１８６】
【表５−１】
【０１８７】
【表５−２】
【０１８８】
【表５−３】
【０１８９】
【表６−１】
【０１９０】
【表６−２】
【０１９１】
【表６−３】
【０１９２】
【表７】
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許出願シリアル番号第６１／１１０，２８７号（２００８年１０月３１日出願）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。具体的には本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞はＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程となっている。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚性幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。
【０００７】
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【０００８】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００９】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年）。
【００１０】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０、２００４年）。
【００１１】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７による処理によりＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１２】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に増大させる増殖因子の効果を研究した。彼らは、ＴＧＦ−β２によってＰｄｘ１陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６．）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下で、マウス胚性幹細胞からｂｒａｃｈｙｕｒｙ+／ＨＮＦ−３β+内胚葉細胞が誘導されることを示している（米国特許出願公開２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。
【００１４】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐａｇｅ １６８０６，２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。
【００１５】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【００１６】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８年）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児性腺組織から、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみでも分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；同第０１／５１６１６号）。
【００１７】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、一部の内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤｘ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。
【００１８】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞に転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００１９】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に細胞をノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰＤｘ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００２０】
１つの例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２１】
サイクリンはβ細胞機能に関係していると見なされてきた。例えば、Ｌｉｌｊａらは、「インスリンを分泌する膵臓β細胞にはＣｄｋ５が存在する」と報告する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，Ｉｓｓｕｅ ３６，３４１９９〜３４２０５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ７，２００１）。Ｌｉｌｊａらは、「Ｃｄｋ５はβ細胞中に存在し、インスリン開口分泌の正の調節因子として作用する。」と記載する。
【００２２】
他の例では、Ｍａｒｚｏらは「Ｃｄｋ４ノックインマウスではβ細胞集団が有意に増加し、かつＣｄｋ４ノックインマウスは、Ｃｄｋ４がＩ型糖尿病において膵臓β細胞集団を再生するのに潜在的な標的であることを示す、生理学的機能を有する」と記載する（Ｄｉａｂｅｔａｌｏｇｉａ，Ｖｏｌ．４７，Ｎｕｍｂｅｒ４，６８６〜６９４，Ａｐｒｉｌ １，２００４．）。
【００２３】
他の例では、Ｕｂｅｄａらは、サイクリン依存性キナーゼ５活性の阻害が、膵臓β細胞を糖毒性から保護するということを報告する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８１，Ｉｓｓｕｅ ３９，２８８５８〜２８８６４，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２９，２００６）。
【００２４】
他の例では、Ｗｅｉらは、グルコース刺激型のインスリン分泌の、Ｃｄｋ５依存性の制御を報告する（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１，１１０４〜１１０８（１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００５．））。
【００２５】
他の例では、Ｖａｎｄｅｒｆｏｒｄらは以下のように記載している。「ＭａｆＡは膵臓のβ細胞内で発現される塩基性ロイシンジッパー型転写制御因子であり、β細胞のバイオロジーの様々な態様に関与していることから正常なグルコース恒常性を維持するために必要とされる。ＭａｆＡたんぱく質レベルは、未だ十分には特徴づけられていないメカニズムによって、高濃度のブドウ糖に反応して増加することが知られている。我々は、別々の細胞内シグナル伝達イベントがｍａｆＡ発現を制御するのか否かを調査した。我々は、一般的なキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンが、タンパク質の安定性を変化させることなくｍａｆＡ発現を誘導することを見出した。ＭＡＰキナーゼＪＮＫの阻害は、ｍａｆＡ発現に対するスタウロスポリンの効果を模倣する。カルモジュリンキナーゼとカルシウムシグナル伝達も同様に、高濃度のブドウ糖によりｍａｆＡ発現を刺激するのに重要である。しかしながら、スタウロスポリン、ＪＮＫ、及びカルモジュリンキナーゼは、インスリン発現の誘導に対して異なる効果を有する。これらのデータは、ＭａｆＡレベルが、複数のキナーゼ経路の協調作用により厳密に制御されていることを明らかにした。」（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ（２００８），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂｂ．２００８．１０．００１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、多能性幹細胞を膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞へと分化させるための方法の開発に対して、未だに有意な必要性が存在している。本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
一実施形態では、本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】パネルａは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのインスリン発現とグルカゴン発現の比に対する、ＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキナーゼ阻害剤ライブラリ由来の化合物の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。英数字ラベルは表１に示される同一の化合物と対応する。パネルｂは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのＭＡＦＡ発現とＡＲＸ４発現の比に対する、ＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキナーゼ阻害剤ライブラリ由来の化合物の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。英数字ラベルは表１に示される同一の化合物と対応する。
【図２Ａ】実施例１に記載の方法に従って処理した、ステージ６処理の４日目の細胞の４ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｂ】０．５μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ＃ ５３３０８１２で処理した、処理の４日目の細胞の４ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｃ】１μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ＃ ５３３０８１２で処理した、処理の４日目の細胞の４ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｄ】実施例１に記載の方法に従って処理した、ステージ６処理の６日目の細胞の２０ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｅ】０．５μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ ＃５３３０８１２で処理した、処理の６日目の細胞の２０ｘ顕微鏡像を示す。
【図２Ｆ】１μＭの化合物ＰｕｂＣｈｅｍＩＤ＃ ５３３０８１２で処理した、処理の６日目の細胞の２０ｘ顕微鏡像を示す。
【図３】０．５μＭ（濃色のバー）又は１．０μＭ（淡色のバー）の化合物ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃５３３０８１２での５日間の処理後の、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞での、２３種の遺伝子の発現を示す。発現レベルは０日目、２日目及び５日目で測定した。
【図４】実施例４に記載の分化プロトコルの、ステージ７で処理した細胞における、膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現に対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ処理の効果を示す。
【図５】島様のクラスタのジチゾン（dithazone）染色に対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ処理の効果を示す。
【図６】実施例５に記載の方法に従って生産されたインスリン産生細胞中の、インスリン、シナプトフィジン及びグルカゴンの発現を示す。記載のたんぱく質の発現はＦＡＣＳにより測定した。
【図７】実施例５に記載の方法に従って生産されたインスリン産生細胞中の、インスリン、シナプトフィジン及びグルカゴンの発現を示す。記載のたんぱく質の発現はＦＡＣＳにより測定した。
【図８】本発明の方法により生産された、インスリン産生細胞中のＭＡＦＡ（パネルａ）及びインスリン（パネルｂ）の発現を示す。１、２、３及び４日目の細胞サンプルを、ＰＣＲ解析に用いた。ＣＤＫ阻害剤での処理の４日後に、ＣＤＫ阻害剤を培養物から除去し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１％Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ中で更に４日間培養した。４日間の終了時に、ＰＣＲ解析のためにサンプルを三つ組複製で回収した。
【図９】膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのＭＡＦＡ発現に対する、ＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキナーゼ阻害剤ライブラリＩ由来の化合物の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。
【図１０】膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞での、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及びＭＡＦＡのｍＲＮＡ発現に対するゲニステイン（genestein）の効果を、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００３０】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００３１】
幹細胞は、発生上の能力によって、（１）全ての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素（例えば、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。
【００３２】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化していない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわち、その細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００３３】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１、及び以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、β細胞が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ−、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、又はＰＴＦ１ αのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系の細胞が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、又はＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわちＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、又はＧＡＴＡ６のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４又はＮＫＸ２．２のうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン産生細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを産生することが可能な細胞を指す。
【００４４】
本明細書で言うところの「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「前腸後部細胞」は、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ１、ＨＮＦ１、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「原腸管細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−１又はＨＮＦ４Ａのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４９】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．））によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。
【００５０】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層からの細胞種の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００５１】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ、著しく変更されてはいない。
【００５２】
多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞等）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【００５３】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載されているように調製される。
【００５４】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより条件づけした培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。
【００５５】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞層を用いてヒト胚盤胞からの多能性幹細胞系を培養することについて開示している。
【００５６】
Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
【００５７】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー細胞培養中で霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を更に開示している。
【００５８】
別の例として、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。
【００５９】
別の例として、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。
【００６０】
更なる別の例として、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。
【００６１】
Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００６２】
別の例として、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。
【００６３】
米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー細胞培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
【００６４】
別の例として、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【００６５】
別の例として、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。
【００６６】
別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。
【００６７】
代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、無フィーダー細胞かつ無血清の培養システムを開示している。
【００６８】
別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００６９】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞方法を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有する培地中で細胞を培養し、この培地は、本質的に哺乳動物胎児血清を含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、ここで増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は馴化培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【００７０】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【００７１】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「１つの実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外基質成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びに、ヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。
【００７２】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。」と述べている。
【００７３】
更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、基本的に無フィーダー細胞かつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基礎培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のアスコルビン酸、を含む培地を開示している。
【００７４】
別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【００７５】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００７６】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００７７】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれてもよい。これら全特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【００７８】
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非不可欠アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。
【００７９】
多能性幹細胞からの膵臓ホルモン産生細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞を作製するための方法を提供し、かかる方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。
【００８０】
本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０又はＴｒａ１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。
【００８１】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群より選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８２】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ−１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００８３】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００８４】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤｘ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【００８５】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００８６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８７】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８８】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８９】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９０】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００９１】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５に開示されている。
【００９２】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【００９３】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９４】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９５】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９６】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９７】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９８】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９９】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【０１００】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【０１０１】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。
【０１０２】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１０３】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば、多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもの：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１−６０、又はＴｒａ１−８１のうちの１つ以上の発現が挙げられる。
【０１０４】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１０５】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１０６】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１０７】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化させられる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０１０８】
本発明の一態様では、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。
【０１０９】
本発明の一態様では、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。
【０１１０】
本発明の１つの態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第６０／９９０，５２９号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に分化させる。
【０１１１】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、ＨＬＸＢ９、ＰＴＦ−１ α、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＨＮＦ−１ βなどの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。
【０１１２】
分化効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０１１３】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１１４】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【０１１５】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１１６】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０１１７】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’ Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１８】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１９】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１２０】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２１】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２２】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２３】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２４】
本発明の一態様では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、この方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６１／１１０，２７８号に示された方法に従って、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。
【０１２５】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵内分泌系に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、膵内分泌系の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵内分泌系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵内分泌系に特異的なマーカーとしては、例えばＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ又はＩＳＬ１などの転写因子の１種以上の発現が挙げられる。
【０１２６】
β細胞系の細胞に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、β細胞系の細胞の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用することができる。β細胞系に特異的な特徴としては、例えば、特にＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＰＡＸ４、ＮＥＵＲＯＤ、ＨＮＦ１ β、ＨＮＦ６、ＨＮＦ３ β又はＭＡＦＡなどの転写因子の１つ以上の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定について当該技術分野で十分に確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。
【０１２７】
分化効率は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。あるいは分化効率は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０１２８】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
【０１２９】
本発明の一態様では、分化効率は、処理後の所定の細胞培養物中のインスリン陽性細胞の百分率を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１００％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約９０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約８０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約７０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約６０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約４０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約３０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約２０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５％のインスリン陽性細胞を生成する。
【０１３０】
本発明の一態様では、分化効率は、グルコース刺激によるインスリン分泌を、細胞が放出するＣ−ペプチドの量を測定することで検出し、測定することにより求められる。一実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。
【０１３１】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でのＭＡＦＡの発現の増加
一実施形態では、本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法を提供する。
【０１３２】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ１を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ２を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ４を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ５を阻害し得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はサイクリン依存性キナーゼ９を阻害し得る。あるいは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、これらの任意の組み合わせの、サイクリン依存性キナーゼの複数のイソ型を阻害し得る。
【０１３３】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤はタンパク質であり得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はペプチドであり得る。あるいはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤は低分子であり得る。一実施形態では、低分子サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、７−ｎ−ブチル−６−（４−ヒドロキシフェニル）［５Ｈ］ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン、９−ニトロ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン、３−（６−オキソ−９−ニトロ−５，６，７，１２−テトラヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）プロピオニトリル、（２Ｒ）−２−（（６−（（３−アミノ−５−クロロフェニル）アミノ）−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−ブタノール、アルシリアフラビンＡ、［６−ベンジルアミノ−２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−９−イソプロピルプリン、ブチロラクトンＩ、（Ｚ）−１−（３−エチル−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン、２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−６−（ｏ−ヒドロキシベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン、１−（２，６−ジクロロフェニル）−１，５−ジヒドロ−６−（（４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル）メチル）−３−（１−メチルエチル）−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、Ｃｄｋ／サイクリン阻害ペプチドＩＩＩ、３−（２−クロロ−３−インドリルメチレン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン、エチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレート、ＲＯ−３３０６、Ｎ−（ｃｉｓ−２−アミノシクロヘキシル）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−９−エチル−９Ｈ−プリン−２，６−ジアミン、６−シクロヘキシルメトキシ−２−（４’−スルファモイルアニリノ）プリン、５−アミノ−３−（（４−（アミノスルホニル）フェニル）アミノ）−Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−カルボチオアミド、３−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン、Ｃｄｋ２阻害剤Ｉ、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩ、２（ビス−（ヒドロキシエチル）アミノ）−６−（４−メトキシベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン、４−（６−シクロヘキシルメトキシ−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチルベンズアミド、Ｎ４−（６−アミノピリミジン−４−イル）−スルファニルアミド、（４−（２−アミノ−４−メチルチアゾール−５−イル）ピリミジン−２−イル）−（３−ニトロフェニル）アミン、２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン、１，４−ジメトキシアクリジン−９（１０Ｈ）−チオン、５−（Ｎ−（４−メチルフェニル）アミノ）−２−メチル−４，７−ジオキソベンゾチアゾール、４−（３，５−ジアミノ−１Ｈピラゾール−４−イルアゾ）−フェノール、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−（３−クロロアニリノ）−９−イソプロピルプリン、ファスカプリシン、インジルビン−３’−モノオキシム、インジルビン−３’−モノオキシム、５−ヨード−，インジルビン−３’−モノオキシム−５−スルホン酸、イソグラヌラチミド、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−メチルプリン、６−（２−ヒドロキシベンジルアミノ）−２−（（１Ｒ）−（ヒドロキシメチル）プロピル）アミノ）−９−イソプロピルプリン、５−ブロモ−３−（２−（４−フルオロフェニル）−２−オキソエチリジン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２−（１Ｒ−イソプロピル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−（３−クロロアニリノ）−９−イソプロピル−プリン、ラパマイシン、２−（Ｒ）−（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン、スキトネミン、３−［１−（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メタ−（Ｚ）−イリデン］−５−メトキシ−１，３−ジヒドロインドール−２−オン、及び４−（３’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンからなる群から選択される。
【０１３４】
一実施形態では、サイクリン依存性キナーゼはエチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレートである。一実施形態では、エチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレートを、内分泌腺系に特徴的なマーカーを発現している細胞に約０．１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で、約１日〜７日間にわたって加える。
【０１３５】
一実施形態では、内分泌腺系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エチル−（６−ヒドロキシ−４−フェニルベンゾ［４，５］フロ［２，３−ｂ］）ピリジン−３−カルボキシレートで約１日〜約７日間にわたって処理する。
【０１３６】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
ウシ胎児血清の非存在下での、ヒト胚性幹細胞の細胞株Ｈ１の膵内分泌細胞への分化
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の継代数５２の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたディッシュ（１：３０希釈）上で培養し、細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるために、以下の分化プロトコルを実施した。
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃１５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃１００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理した（ステージ５）。
【０１３８】
培地は毎日交換した。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ分析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３つ組複製で採取した。
【０１３９】
（実施例２）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＥＭＤキナーゼ阻害剤ライブラリＩＩ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数４４のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例１に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き、細胞をＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ化合物ライブラリ（カタログ＃５３９７４５，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）由来の化合物を最終濃度１μＭで含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で、４日間にわたって処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。プロトコルを通して、培地は毎日交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、インスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、及びＡｒｘ４の発現について解析した。結果は、リアルタイムＰＣＲでの測定結果により、処理サンプル対未処理対照の、インスリン／グルカゴン比（図１、パネルａ）、又はＭＡＦＡとＡＲＸ４の比（図１、パネルｂ）として表わされる。各ウェル＃について対応するＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃は、表１に列挙する。
【０１４０】
１μＭの濃度の化合物Ａ６、Ｂ７、Ｂ８、又はＣ２での、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、およそ３．０の、あるいはそれよりも大きいインスリン／グルカゴン発現比をもたらした（図１のパネルａを参照されたい）。
【０１４１】
次いで、ＭＡＦＡ／ＡＲＸ４の比に対するこれらの化合物の効果を調べたところ、数個の化合物での膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、ライブラリ内の他の試験化合物よりも、ＭＡＦＡとＡＲＸ４の比に、より大きな変化をもたらしたことを観察した：化合物Ｃ２で処理した細胞は、約１０００のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比を示した。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の化合物Ｃ２での処理は、約１００のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比をもたらした（図１のパネルｂを参照されたい）。
【０１４２】
（実施例３）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理した細胞でのインスリン及びＭＡＦＡ発現に対する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤処理の効果
実施例２でインスリン発現とグルカゴン発現の比、又はＭＡＦＡとＡＲＸ４の比を増加させたいくつかの化合物は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤であった。このような化合物の１つはＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７（５−アミノ−３−（（４−（アミノスルホニル）フェニル）アミノ）−Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−カルボチオアミド）（カタログ＃ ２１７７１４；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）である。これらの観察結果を確証づけるために、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした１０ｃｍ2のディッシュ上で、継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を培養し、実施例１に記載の方法に従って、ステージ５まで処理した。ステージ５以降は、１％ Ｂ２７と１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２で、細胞を６日間にわたって処理した。培地は１日おきに交換した。リアルタイムＰＣＲ用の細胞サンプルを化合物での処理前、化合物処理の２日目及び５日目に採取した。
【０１４３】
化合物処理対未処理対照の４日目又は６日目の細胞の特徴的な顕微鏡写真を図２に示す。未処理細胞は高密度で充填され（図３、パネルａ及びｄ）、個別の細胞を区別することは困難である。しかしながら、０．５μＭ又は１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃５３３０７９７での６日間にわたる処理後には、未処理対照（図２、パネルｄ）と比較してそれぞれの核が目に見えるようになり（図２、パネルｅ及びｆ）、細胞集団に分化が生じたことを示している。これはまた、図２のパネルｂ及びｃに示されるような細胞層中の間隙により見出され得る、一部の細胞死を伴う。
【０１４４】
ＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７での細胞処理は、程度は異なるもののインスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、ＭＡＦＢ及びソマトスタチンの発現上昇をもたらした。培養０日目（処理前）と比較した場合の、処理あたりの遺伝子発現の相対的な誘導を図３のパネルａ〜ｖに示す。１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的に処理の４８時間の時点でのグルカゴン発現がおよそ１．５倍に上昇した。この発現量は、処理の５日以降に処理前のレベル未満に下降した。０．５μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７での処理では、グルカゴン発現の上昇は観察されなかった（図３、パネルａを参照されたい）。
【０１４５】
１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的にインスリン発現がおよそ１．５倍に上昇した（図３、パネルｂを参照されたい）。
【０１４６】
１μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的にＭＡＦＡ発現がおよそ２００倍に上昇した（図３、パネルｄを参照されたい）。
【０１４７】
０．５μＭのＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、結果的にＭＡＦＢ発現がおよそ１．５倍に上昇した（図３、パネルｃを参照されたい）。ソマトスタチンの発現では、用量依存的な上昇が観察された（図３、パネルｅ）。
【０１４８】
ＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ＃ ５３３０７９７で５日間にわたって処理した、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞では、アミラーゼの発現量は変化しなかった（図３、パネルｆを参照されたい）。しかしながら、ＰＡＸ４（図３、パネルｈ）、ＮＫＸ６．１（図３、パネルｋ）、ＰＤＸ１（図３、パネルｌ）、ＮＥＵＲＯＤ（図３、パネルｏ）、及びＢＲＮ４（図３、パネルｑ）では発現レベルに減少が観察された。
【０１４９】
（実施例４）
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤処理は、島様クラスタにおいてＭＡＦＡ発現を上昇させた
継代数５２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたディッシュ（１：３０希釈）上で培養し、実施例１に記載の方法に従って分化させた。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に成熟させるために、追加のステージ（ステージ６）を加えた。この実施例では、ステージ６はＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）での７日間の処理から構成される。培地は毎日交換した。
【０１５０】
ステージ６後に、細胞は１Ｘアキュターゼ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で、室温で５分にわたって処理した。アキュターゼを除去し、細胞にＤＭＥＭ／１２＋１％ Ｂ２７を加えた。接着した細胞をセルスクレーパーを用いて取り外し、穏やかに再懸濁し、４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナー上に残った細胞を基本培地ですすぐことで取り外し、超低接着性の培養プレート（カタログ＃ ３４７１，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａ）上で懸濁液の状態で培養した。次いで細胞を以下のように処理した：細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）と、１μｍのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ（カタログ＃２１７７１４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）を含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で１０日間にわたって培養した（ステージ７）。ビヒクルで処理した細胞を対照として含めた。ＰＣＲ解析用に、７日目〜１０日目にサンプルを回収し、ジチゾン染色した。本実施例で概説された方法に従って、懸濁状態で培養した細胞は、形態的に膵臓の島クラスタに類似であると推測された。ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩでの処理は、島様クラスタの形態に影響を与えるようには見えなかった。
【０１５１】
図４のパネルａ〜ｉは、細胞クラスタの遺伝子発現プロファイルに対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ処理の効果を示す。ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩでの処理は、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現を上昇させ、特にプロインスリン転写因子のＭＡＦＡの発現を上昇させた。
【０１５２】
図５のパネルａ〜ｂは、クラスタのジチゾン（dithazone）（ＤＴＺ）染色に対する、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩの効果を示す。ＣＤＫ阻害剤で処理し、かつＤＴＺで染色した細胞クラスタは、ＣＤＫ阻害剤ＩＩＩで処理していないクラスタと比較したときに、より赤みの強い染色パターンを示した。
【０１５３】
（実施例５）
本発明の方法により作製されたインスリン産生細胞の、ＦＡＣＳ解析
継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用してインスリン産生細胞へと分化させた：
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃ ５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理し（ステージ５）、次いで
ｆ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で７日間にわたって処理し（ステージ６）、次いで
ｇ．アキュターゼで５分間にわたって処理した後に、接着しているあらゆる残りの細胞を掻き取りにより取り外した。次いで細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナー上に残った細胞を基本培地ですすぐことで取り外し、超低接着性の培養プレート上で、ＤＭＥＭ−高グルコース（カタログ＃ １１９９５−０７３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）＋１％ Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）、１μｍのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ（カタログ＃ ２１７７１４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）中に懸濁した状態で、５日間にわたって培養した（ステージ７）。
【０１５４】
ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、島様クラスタを単一細胞へと分散させ、冷ＰＢＳで洗浄した。固定のため、細胞を２００〜３００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ ５５４７２２，ＢＤ，Ｃａ）中に再懸濁し、４℃で３０分間にわたってインキュベートした。細胞を１ｍＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ ５５４７２３）で２回洗浄し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中に２％正常ヤギ血清を含有する１００μＬの染色／ブロッキング溶液中に再懸濁した。フローサイトメトリー解析のために、細胞は以下の一次抗体で染色した：抗−インスリン（ウサギｍＡｂ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｎｏ．Ｃ２７Ｃ９；１：１００希釈）；抗−グルカゴン（マウスＭａｂ，Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｇ２６５４，１：１００）；抗−シナプトフィジン（ウサギポリクローナル抗体，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｎｏ Ａ００１０，１：５０）。細胞を４℃で３０分にわたってインキュベートし、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、更に３０分間にわたって、以下のような適切な２次抗体中でインキュベートした：ヤギ抗−ウサギＡｌｅｘａ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ａ２１２４６）又はヤギ抗−マウス６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ａ２１２３５）；ヤギ抗−ウサギＲ−ＰＥ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｎｏ．ＡＬＩ４４０７）。二次抗体はすべて１：２００の希釈率で使用した。細胞は、少なくとも１回Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳアレイを使用して分析した。少なくとも１０，０００事象を分析のために得た。対照には未分化のＨ１細胞とβ−ＴＣ（ＣＲＬ−１１５０６（商標）ＡＴＣＣ，ＶＡ）細胞株を含んだ。
【０１５５】
図６のパネルａ〜ｃは、ビヒクルを含有している培地での、ステージ７での処理後の細胞に占める、インスリン陽性細胞、シナプトフィジン（synapthophysin）陽性細胞、及びグルカゴン陽性細胞の割合を示す。図７のパネルａ〜ｃは、１μＭのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩを含有している培地での、５日間にわたるステージ７での処理後の、インスリン陽性細胞、シナプトフィジン（synapthophysin）陽性細胞、及びグルカゴン陽性細胞の割合を示す。インスリンホルモン単独の陽性細胞の数は、ＣＤＫ阻害剤での処理後に３％から８％へと上昇した。加えて、多ホルモン（インスリン及びグルカゴン陽性）細胞の割合は、ＣＤＫ阻害剤での処理後に減少した。
【０１５６】
（実施例６）
ＣＤＫ阻害剤誘導型のＭＡＦＡ発現の動態
継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用してインスリン産生細胞へと分化させた：
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃ ５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理し（ステージ５）、次いで
ｆ．ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７で７日間にわたって処理し（ステージ６）、次いで
ｇ．アキュターゼで５分間にわたって処理した後に、接着しているあらゆる残りの細胞を掻き取りにより取り外した。次いで細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナー上に残った細胞を基本培地ですすぐことで取り外し、超低接着性の培養プレート上で、ＤＭＥＭ−高グルコース（カタログ＃ １１９９５−０７３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）＋１％ Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）、２μｍのＣＤＫ阻害剤ＩＩＩ（カタログ＃ ２１７７１４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）中に懸濁した状態で、１〜８日間にわたって培養した（ステージ７）。
【０１５７】
１、２、３及び４日目のサンプルを、ＰＣＲ解析のために回収した。ＣＤＫ阻害剤での処理の４日後に、ＣＤＫ阻害剤を培養物から除去し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１％ Ｂ２７＋２０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ中で更に４日間培養した。４日間の終了時に、ＰＣＲ解析のためにサンプルを三つ組複製で回収した。
【０１５８】
図８のパネルａ〜ｂは、ステージ７の様々な時点でのＭＡＦＡ及びインスリンの発現パターンを示す。ＣＤＫ阻害剤処理は、ＭＡＦＡ発現とインスリン発現に有意な上昇をもたらし、これらは時間関数として上昇した。しかしながら、ＣＤＫ阻害剤の除去は、化合物除去の４日後に得たサンプルにおいてＭＡＦＡ及びインスリン発現の両方で有意な低下をもたらした。
【０１５９】
（実施例７）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＢＩＯＭＯＬ（商標）キナーゼ阻害剤ライブラリ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数５１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例１に記載の方法に従って、ステージ５まで分化させた。これに続き、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７中で１日間生育させ、次いでＢＩＯＭＯＬ（商標）化合物ライブラリ（カタログ＃ ２８３２，ＢＩＯＭＯＬ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｐａ）由来の化合物を最終濃度４μＭで含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７中で、６日間にわたって処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。処理プロトコルを通し、ビヒクル又は化合物を含有している培地は１日おきに交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、インスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、及びＡＲＸ４の発現について解析した。結果は、リアルタイムＰＣＲでの測定結果により、処理サンプル対未処理対照の、インスリン／グルカゴン比（表２）、又はＭＡＦＡとＡｒｘ４の比（表２）として表わされる。各英数字ウェル＃に対する、対応するカタログ＃、ＣＡＳ＃、及び化合物名又はＩＤ数を表３に列挙する。
【０１６０】
４μＭの濃度の化合物Ｃ８又はＦ１での、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、およそ１０．０の、あるいはそれよりも大きいインスリン／グルカゴン発現比をもたらした。Ｄ９で処理した細胞は、およそ１８４０．０のインスリン／グルカゴン発現比を有する（表２）。
【０１６１】
次いで、ＭＡＦＡ／ＡＲＸ４の比に対するこれらの化合物の効果を調べたところ、数個の化合物での膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の処理は、ライブラリ内の他の試験化合物よりも、ＭＡＦＡとＡＲＸ４の比に、より大きな変化をもたらしたことを観察した：化合物Ｂ６又はＦ１で処理した細胞は、およそ１０を超えるＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比を示した。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の化合物Ｃ８での処理は、約８４のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比をもたらした一方で、Ｄ９で処理した細胞は約２１２のＭＡＦＡ／ＡＲＸ４比を有した（表２）。
【０１６２】
（実施例８）
実施例１に概説された分化プロトコルに従って処理した細胞でのインスリン及びＭＡＦＡ発現に対する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤の効果
継代数５１のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例１に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１ ％Ｂ２７中で８日間にわたって生育させ、次いでサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を最終濃度０．６１２５、１．２５、又は５．０μＭで含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１ ％Ｂ２７中で、４日間にわたって処理した。６種の阻害剤を試験した：ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０８１２（ＥＭＤ ｃａｔ＃ ２１７７１４）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５６６（ＥＭＤ ｃａｔ＃２１７７１３）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７（ＥＭＤ ｃａｔ＃ ２１９４７６）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ７３２９２（ＥＭＤ ｃａｔ＃３４１２５１）、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ ＃４５９２（ＥＭＤ ｃａｔ＃４９５６２０）、及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ １６０３５５（ＥＭＤ ｃａｔ ＃５５７３６０）。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。処理プロトコルを通し、ビヒクル又は化合物を含有している培地は１日おきに交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、インスリン、グルカゴン、ＭＡＦＡ、及びＡＲＸ４の発現について解析した。結果は、リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ビヒクル処理対照に対する倍数変化として記載される。
【０１６３】
化合物ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０８１２、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５６６、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７、及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ７３２９２の全てが、試験濃度でＭＡＦＡ発現を刺激したことを観察した（表４）。ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５９２及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ １６０３５５は試験濃度ではＭＡＦＡを刺激しなかった（表４）。化合物ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０８１２、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５６６、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７、ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ４５９２、及びＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ １６０３５５の全てが、インスリン発現を刺激したことは明らかであった（表４）。化合物（ＰｕｂＣｈｅｍ ＩＤ＃ ５３３０７９７）はグルカゴン及びＡｒｘ４発現（表４）の両方を減少させた一方で、ＭＡＦＡ発現を刺激した。
【０１６４】
（実施例９）
ウシ胎児血清を欠き、２５ｍＭグルコースを含有しているＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＨＧ）での、ヒト胚性幹細胞の細胞株Ｈ１の膵内分泌細胞への分化
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートしたディッシュ（１：３０希釈）上で培養し、以下のプロトコルを用いて、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させた：
ａ．２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を加えたＲＰＭＩ培地で２日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｃ．ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で６日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｄ．ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で３日間にわたって処理し（ステージ４）、次いで
ｅ．ＤＭＥＭ−ＨＧ＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）で７日間にわたって処理した（ステージ５）。
【０１６５】
培地は毎日交換した。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３つ組複製で採取した。
【０１６６】
（実施例１０）
実施例９に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＥＭＤキナーゼ阻害剤ライブラリＩ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例９に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き細胞を供給し、ステージ５の１、３及び５日目に、ＤＭＥＭ−ＨＧ、１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）と、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）と、ＤＭＳＯ（カタログ＃ ５３９７４４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）に溶解し、２．５μＭの最終濃度で処理したＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ化合物ライブラリ１由来の化合物とを含む培地で処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。培地はステージ５では１日おきに交換したことを除き、プロトコルを通して毎日交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。
【０１６７】
この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、ＭＡＦＡの発現について解析した。結果はリアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ＭＡＦＡ発現Ｈ１ヒト胚性幹細胞対未処理Ｈ１ヒト胚性幹細胞の倍数増加として表わす（表５）。
【０１６８】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の、２．５μＭ濃度の化合物Ａ４（Ｃａｔ＃，１２４００１，Ａｋｔ阻害剤ＩＶ）、Ｅ８（Ｃａｔ＃ ５２７４５０，ＰＫＲ阻害剤）、及びＦ９（Ｃａｔ＃５３９６４８，スタウロスポリン，Ｎ−ベンゾイル−）での処理は、ＭＡＦＡ発現の、ビヒクル処理対照を少なくとも４倍の上昇をもたらした（表５）。２．５μＭ濃度の化合物Ｅ６（Ｃａｔ＃ ５２１２３３，ＰＤＧＦ受容体チロシンナーゼ阻害剤ＩＶ）での処理は、ビヒクル処理対照を少なくとも２．５倍超えるＭＡＦＡ発現の上昇をもたらした（表５）。
【０１６９】
（実施例１１）
実施例９に概説された分化プロトコルに従って処理された細胞に対する、ＥＭＤキナーゼ阻害剤ライブラリＩＩ由来の化合物の効果のスクリーニング
継代数４６のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコートした２４ウェルディッシュ（１：３０希釈）上に播種し、実施例９に記載の方法に従ってステージ５まで分化させた。これに続き細胞を供給し、ステージ５の１、３及び５日目に、ＤＭＥＭ−ＨＧと、１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）と、１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）（ステージ５）と、ＤＭＳＯ（表１及び６，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）に溶解させ最終濃度２．５μＭに処理したＥＭＤ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ化合物ライブラリＩＩ由来の化合物と、を含む培地で処理した。ビヒクルを含有しているウェルを対照として含めた。培地はステージ５では１日おきに交換したことを除き、プロトコルを通して毎日交換した。全てのサンプルは２つ組複製で処理した。
【０１７０】
この処理の最後に、ＰＣＲ解析用にＲＮＡを回収した。サンプルはリアルタイムＰＣＲにより、ＭＡＦＡの発現について解析した。リアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ＭＡＦＡ発現を刺激した化合物に関する結果を示し、かつＭＡＦＡ発現対対照サンプルにおける倍数上昇として表わす（図９）。
【０１７１】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の、２．５μＭ濃度の：アルステルパウロン、２−シアノエチル；ＳＵ９５１６；アルステルパウロン；Ｃｄｋ１／２阻害剤ＩＩＩ；カゼインキナーゼＩ阻害剤、Ｄ４４７６；又はＭＥＫ１／２阻害剤のいずれかでの処理は、未処理対照に対してＭＡＦＡ発現の４．５倍の上昇をもたらした（表７）。
【０１７２】
（実施例１２）
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡ発現を促進する低分子阻害剤での、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の細胞周期の進行の阻害
細胞周期の進行に由来して生じる細胞増殖は、細胞外増殖因子で細胞を刺激することにより活性化及び維持され得る。増殖因子は増殖因子受容体の細胞外ドメインへと結合し、受容体の細胞内ドメインの立体構造スイッチを誘導する。このシフトは受容体二量体化及び受容体の細胞内ドメイン上に位置するチロシンキナーゼの活性化を開始し、下流の複数のセリン／スレオニンキナーゼのリン酸化及び活性化を導き、最終的には細胞周期の進行と細胞増殖をもたらす。
【０１７３】
通常の生理学的な条件下では、インスリンと転写因子ＭＡＦＡの発現とにより特徴づけられる成熟した膵臓β細胞は無活動状態であり、細胞周期のＧ０に留まる傾向がある。しかしながら、機能性臓器を形成するのに十分な細胞を生成し、成熟した動物に関する要求を満たす、本発明の膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、細胞周期を循環している必要がある。その結果、本発明の膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は胚発生のある時点でβ細胞へと分化し、活動的に細胞周期により増殖している細胞から、休眠細胞へと移行する。
【０１７４】
我々のデータは、低分子キナーゼ阻害剤によりシグナルカスケードをブロックして細胞周期の進行を阻害することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に、成熟膵臓β細胞のマーカーであるＭＡＦＡの発現を誘導させ得ることを示す。増殖因子受容体（ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＩＶ）に標的とされるキナーゼ阻害剤、又はチロシンキナーゼ受容体の下流のキナーゼを中断する阻害剤（ＭＥＫ１／２阻害剤、ＰＫＲ阻害剤、又はＡｋｔ阻害剤ＩＶ）は、増殖性の、増殖因子／キナーゼに基づくシグナル伝達を中断して細胞周期の休止をもたらし、ＭＡＦＡ発現を誘導する。スタウロスポリンのような広域スペクトル阻害剤の使用は、効果的にＭＡＦＡを誘導できるが、有効濃度では細胞毒性でもある。サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（アルステルパウロン、２−シアノエチル；ＳＵ９５１６；アルステルパウロン；又はＣｄｋ１／２阻害剤ＩＩＩ）のような、より直接的な化合物は、スタウロスポリンのような広域スペクトル阻害剤と比較して、より少ない細胞毒性でＭＡＦＡを誘導する。
【０１７５】
広域スペクトルのキナーゼ阻害剤が、ＭＡＦＡ発現と、本発明の、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している、より成熟した表現型の細胞とを誘導し得るか判定するために、Ｈ１ヒトＥＳ細胞を実施例９に記載の方法に従って分化させ、ステージ５の１、３、及び５日目に、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤のゲニステイン（ヒト及びマウス細胞株のＧ２期を休止させ、複数のキナーゼを阻害することが示されている）で処理した。内分泌腺ホルモンのインスリン、ソマトスタチン、及び転写因子ＭＡＦＡの全てが、投与量１０及び３０ｎｇ／ｍＬで未処理対照に対して発現量の増加を示した一方で、内分泌腺ホルモングルカゴンは１０ｎｇ／ｍＬで発現を増加させた（図１０）。我々は投与量１００ｎｇ／ｍＬでのゲニステインで、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチン発現の損失と関連付けられる有意な毒性を観察した。
【０１７６】
これらのデータは、増殖因子受容体チロシンキナーゼから細胞内シグナル伝達キナーゼを介して核及びサイクリン依存性キナーゼに向かうシグナル伝達を阻害するために、標的にされる低分子量のキナーゼ阻害剤により、シグナルカスケードをブロックすることで、細胞周期の進行を阻害することにより、本発明の、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に、成熟膵臓β細胞のマーカーであるＭＡＦＡを発現させることができることを示す。
【０１７７】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【０１７８】
【表１】
【０１７９】
【表２−１】
【０１８０】
【表２−２】
【０１８１】
【表２−３】
【０１８２】
【表３−１】
【０１８３】
【表３−２】
【０１８４】
【表３−３】
【０１８５】
【表４】
【０１８６】
【表５−１】
【０１８７】
【表５−２】
【０１８８】
【表５−３】
【０１８９】
【表６−１】
【０１９０】
【表６−２】
【０１９１】
【表６−３】
【０１９２】
【表７】
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法。
【請求項１】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む培地中で培養することで、ＭＡＦＡの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞でＭＡＦＡの発現を増加させるための方法。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５０７２９２（Ｐ２０１２−５０７２９２Ａ）
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３４６３８（Ｐ２０１１−５３４６３８）
【出願日】平成２１年１０月２３日（２００９．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１７７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５１２２３
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２３日（２００９．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１７７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５１２２３
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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