ヒートショックプロテイン発現誘導剤
【課題】 ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導作用に基づくヒートショックプロテイン発現誘導剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤であり、また、ユーパリノライドＡ及び／又はＢが、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものであるヒートショックプロテイン発現誘導剤であって、ヤバツイをエタノール抽出して得たエタノール抽出物を、各種カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣにより分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及びＢの抽出方法である。
【解決手段】 ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤であり、また、ユーパリノライドＡ及び／又はＢが、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものであるヒートショックプロテイン発現誘導剤であって、ヤバツイをエタノール抽出して得たエタノール抽出物を、各種カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣにより分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及びＢの抽出方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として有用な熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン）の発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織あるいは固体においては、一般的な生理的温度より３℃以上高い温度に晒されたときに、生体の防御システムの一つとして、特異的タンパク質の発現（産生）が誘導されることが知られている。
このタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって測定した場合、分子量範囲１０〜１１０ＫＤａを有する一群のタンパク質として存在しており、熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン：heat shock proteins、以下、「ＨＳＰ」と称する場合もある）と呼ばれている。
【０００３】
ＨＳＰは、その分子量の相違により幾つかのファミリーが形成されており、例えば、ＨＳＰ９０ファミリー（分子量：９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下）、ＨＳＰ７０ファミリー（分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）、ＨＳＰ６０ファミリー（分子量：６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満）、及び低分子量ＨＳＰファミリー（分子量：６０ｋＤａ未満）のように分類されている。
【０００４】
ＨＳＰの機能は多岐にわたっており、例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０ファミリーは、変性タンパク質に結合して、天然のフォールディング（高次構造・折り畳み構造）に巻き戻す作用や、第三のタンパク質や核酸との会合、細胞内での局在化や膜透過への関与など、いわゆる分子シャペロンと呼ばれる機能を担っていることが明らかにされている（非特許文献１及び２）。
なお、分子シャペロンとは、ポリペプチド鎖の合成に引き続くフォールディングや酵素の不可逆的な熱変性の抑制に関与している一連の蛋白質をさす。
【０００５】
このＨＳＰ発現の誘導（産生）を利用した療法の一つとして、癌温熱免疫療法がある。すなわち、全身を加温することによりＨＳＰの生成を誘導し、全身の免疫機能を活発にするのと同時に、がん細胞と正常細胞の識別能力を向上させ、副作用が無く、癌細胞のみを死滅させる治療法である。
【０００６】
ところで、このＨＳＰは、高温ばかりではなく、外的傷害、放射線、紫外線などの外界からのストレスに晒された場合にも、生体防御システムとして、その発現（産生）が誘導される。
すなわち、高温、紫外線などの生体に対するストレスは、細胞のタンパク質を変性させ、不溶性沈殿を形成して細胞にダメージを与える。したがって、かかる細胞へのダメージを防御する目的で、ＨＳＰの発現が誘導されることとなる。
【０００７】
かかる観点から、水生プランクトンであるアルテミアの孵化直前の耐久卵から水抽出した活性エキス（アルテミアエキス）成分が、ヒト皮膚細胞においてＨＳＰ７０の産生を誘発することが見出され、かかる作用を利用した抗皮膚ストレス（ストレス防御）用化粧料が提案されている（特許文献１）。
【０００８】
更に最近、脳梗塞やアルツハイマー病など脳疾患の原因である神経細胞死が、細胞を保護する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の損傷によって生じることが明らかにされた（非特許文献３）。
また、ＨＳＰ誘導物質が潰瘍性大腸炎やアルツハイマー病に有効であることが示されている（非特許文献４）。
【０００９】
したがって、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）の発現誘導は、種々の病態の治療に有効であり、また、メラニン産生を抑制するものであり、効果的なＨＳＰ７０発現誘導作用を有する成分は、極めて有力な医薬品、或いは化粧品となる。
かかる観点より本発明者は、更に検討を進め、各種植物成分（生薬）について、ＨＳＰ７０発現を誘導する安全性の高い成分の検索を行ってきていたが、その検討の中で、植物成分としてサワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部の乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、ＨＳＰ７０の発現誘導を強化させることを見出した。
特に、ヤバツイのエタノール抽出エキスを、各種カラムクロマトグラフィー、或いは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で分画して得た成分（画分）には、極めて強いＨＳＰ７０の発現誘導が認められることを確認し、その画分の主成分を検討したところ、セスキテルペンラクトン化合物であるユーパリノライドＡ（Eupalinolide Ａ）、及びユーパリノライドＢ（Eupalinolide Ｂ）であることが判明した。
【００１０】
これらセスキテルペンラクトンであるユーパリノライドＡ及びＢは、すでに公知の化合物であるが、これまでの研究では、その構造決定と、細胞毒性に関する報告（非特許文献５）のみであって、このものにＨＳＰの発現を誘導する作用があることについては、一切記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−２３８２９７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Hendrick, J. P. & Hartl, F. -U., Ann. Rev. Biochem., 62, 349-384 (1993)
【非特許文献２】Georgopoulos, C. & Welch, W. J., Ann. Rev. Cell Biol., 9, 601-634 (1993)
【非特許文献３】北国新聞、2009年10月24日
【非特許文献４】Tanaka, K. & Mizushima, T., Int. J. Hyperthermia, 8,668-676(2009)
【非特許文献５】Yang, N. Y., et al., J. Asian Nat. Prod. Res., 9(3-5), 339-345 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、セスキテルペンラクトンであるユーパリノライドＡ及びＢからなるヒートショックプロテイン発現誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、その態様は、以下の構成からなる。
（１）ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤；
（２）ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）が、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものである上記（１）に記載のヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤；
（３）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）より、以下の抽出・分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の抽出方法であって、
（ａ）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）をエタノール抽出して得た抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行った後、９０％メタノール溶液に溶解して得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得、
（ｂ）次いで、上記で得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィーに付し、順次、水溶出−５０％メタノール溶出−メタノール溶出−アセトン溶出を行い、メタノール溶出画分（画分Ｂ）を得、
（ｃ）上記で得たメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を得、
（ｄ）最後に、上記で得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）をＨＰＬＣ（カラム：ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出すること、
からなる抽出方法；
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、セスキテルペンラクトン化合物であるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤、特にＨＳＰ７０の発現誘導剤が提供される。
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出・単離されたものであり、ＨＳＰの発現誘導作用により、特に生成したＨＳＰ７０がチロシナーゼ、及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制するとともに、脳梗塞やアルツハイマー病など脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１で行った、ヤバツイから、本発明のＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢの抽出・単離について、その分画操作の流れを示したフロー図である。
【図２】実施例２におけるＨＳＰの発現と細胞生存率について、ユーパリノライドＡ及びＢの結果を示した図である。
【図３】実施例３のＡＧＳ細胞におけるＨＳＰ７０発現効果について、ユーパリノライドＡ及びＢの結果を示した図である。
【図４】実施例４における、ヒートショック等のストレスと、ユーパリノライドＡ及びＢのＨＳＰ７０発現増強効果を示した図である。
【図５】実施例５における、アルコールストレスに晒した場合のユーパリノライドＡ及びＢの細胞保護作用の結果を示した図である。
【図６】実施例５における、menadioneと共に培養した場合のユーパリノライドＡ及びＢの細胞保護作用の結果を示した図である。
【００１７】
【図７】実施例６における、本発明のＨＳＰ誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢによるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果を示す、メラニン含有量を示した図である。
【図８】実施例６における、本発明のＨＳＰ誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢによるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果を示す、チロシナーゼ活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、上記したように、その基本は、ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤であって、特に、ＨＳＰ７０の生成により、チロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制する効果を発揮するとともに、ＨＳＰの損傷によって生じる脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用である。
【００１９】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の化学式を以下に示した。
すなわち、ユーパリノライドＡにあっては下記化学式（Ｉ）、ユーパリノライドＢにあっては下記化学式（ＩＩ）で示される化合物である。
【００２０】
【化１】
【００２１】
両者は同一の分子式（Ｃ２４Ｈ３０Ｏ９）を有し、その化学構造式も極めて類似するものであるが、立体的構造として、その４位において、ユーパリノライドＡがＺ型を保持しているのに対して、ユーパリノライドＢがＥ型を保持している点で相違するのみである。
【００２２】
このユーパリノライドＡ及びＢは、好ましくは、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出・単離することにより得ることができ、本発明の一態様としては、ユーパリノライドＡ及び／又はＢが、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものであるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）誘導剤でもある。
【００２３】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）は、キク科ヒヨドリバナ属植物に属し、日本全国、東南アジアに生育する多年草である。この地上部乾燥生薬は、ヤバツイ（野馬追）と称され、中国においては解熱・解毒薬として使用されている生薬成分である。
【００２４】
本願発明が提供するＨＳＰ誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢのヤバツイからの抽出、単離は、具体的には以下のようにして行うことができる。
すなわち、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（以下、特に断らない限り、「ヤバツイ」と称する。）をエタノール抽出してエタノール抽出物を得る。
なお、ヤバツイは、生薬として市販されており、例えば、丸善製薬（株）から入手することができる。
抽出にあたっては、ヤバツイ１００ｇに対して、エタノールを０．５〜２Ｌ程度加え、加熱還流条件下で抽出を行うのがよい。抽出時間は一概に限定できないが、１〜５時間程度、好ましくは２時間程度でよい。また、抽出温度は、７０℃〜エタノールの沸点付近の温度で行うのがよい。抽出操作を完了した段階で、冷却後綿栓濾過を行い、エタノール抽出液を得る。
この抽出操作を２〜５回、好ましくは３〜４回程度繰り返し、併せたエタノール抽出溶液を減圧下に濃縮し、残渣として、ヤバツイの粗エタノール抽出物を得る。
【００２５】
上記で得たヤバツイの粗エタノール抽出物を分画操作することにより、目的とするユーパリノライドＡ及び／又はＢを単離するのであるが、具体的には以下のようにして行うことができる。
最初に、ヤバツイの粗エタノール抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行う。具体的には、粗エタノール抽出物を９０％メタノール溶液に懸濁させ、分液漏斗に移して少量のヘキサンにより抽出することにより脱脂処理を行う。
脱脂処理した９０％メタノール層を減圧乾固し、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）が得られる。
【００２６】
次いで、上記で得られた９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ポリスチレンゲルカラムクロマトグラフィー、具体的には、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐ（和光純薬工業）カラムクロマトグラフィーに付し、順次、水、５０％メタノール、メタノール溶液の段階的グラジエント法、及びアセトン溶液にて溶出を行い、各溶出画分を得る。
かかる操作において得られたメタノール溶出画分（画分Ｂ）に、ＨＳＰ発現誘導が強く認められた。
【００２７】
ＨＳＰ発現誘導が強く観察されたメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液による段階的グラジエント法で溶出を行い、それぞれの溶出画分を得た。
かかる操作において得られた５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）に、ＨＳＰ発現誘導が強く認められた。
【００２８】
次いで、ＨＳＰ発現誘導が強く観察された５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出して全１２個の溶出画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）を得た。
かくして得られた溶出画分Ｄ１〜Ｄ１２のうち、特に、画分Ｄ３並びに画分Ｄ７に、極めて強いＨＳＰ発現誘導作用があることが判明した。
【００２９】
この画分Ｄ３及びＤ７について、ＨＳＰ発現誘導作用物質の特定を検討したところ、画分Ｄ３には、ユーパリノライドＡが、画分Ｄ７にはユーパリノライドＢが主成分として含有されていることが判明した。
かかる画分Ｄ３及びＤ７について、一般的に汎用されている単離・結晶化等の操作を行い、目的とするユーパリノライドＡ及び／又はＢを得ることができる。
したがって、本発明は、また、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）より、抽出・分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の抽出方法でもある。
【００３０】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、ＨＳＰのなかでも、特に、ＨＳＰ７０の発現誘導によるメラニン産生抑制作用を発揮する。
すなわち、ＨＳＰ７０は、メラニン産生に関与するチロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させるものであり、その結果、メラニンの産生が抑制されるとともに、ＨＳＰの損傷によって生じる脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用である。
【００３１】
したがって、本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、例えば、脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤、メラニン産生抑制化粧料、特に美白化粧料として使用するのに適している。
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、医薬品として錠剤、カプセル、粉末剤などの経口投与剤、注射剤、点滴剤などの非経口投与剤とし、化粧料としては、具体的には、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液剤、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、チークカラー等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローション等の身体用化粧料等を挙げることができる。
【００３２】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、ユーパリノライドＡ及び／又はＢを含有するものであるが、上記の抽出・単離操作により得たヤバツイの抽出物を、そのまま含有してもよい。
また、各種製剤として使用されている薬理学的に許容されている他の慣用成分と共に、所望の形態で使用することができる。
【００３３】
この場合において、本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢの含有量は、一概に限定できず、また、病態の予防・改善の目的、用いる人の性別、体重、年齢、剤型、病態の種類や程度、使用部位、使用回数などの種々の条件により一概に限定できない。
例えば、経口剤として投与する場合には、０．１〜１００μｇ／ｋｇ／日で、一日１回から数回に分けて適用することができるが、使用量は、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。
また、上記の抽出・単離操作により得たヤバツイの抽出物を、そのまま含有する場合には、その抽出画分に含有されるユーパリノライドＡ及び／又はＢの量に換算した量で含有させることができる。
【００３４】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、上記したように、医療効果を目的として使用されるとともに、メラニン産生抑制化粧料として使用される。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明を、ヤバツイからのユーパリノライドＡ及び／又はＢの抽出・単離の実際、並びに、ＨＳＰ７０の発現の誘導の試験を説明しながら、より詳細に説明していく。
【００３６】
なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：ユーパリノライドＡ及び／又はＢの抽出・単離
丸善製薬（株）から入手したヤバツイ［サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬］の１０．１ｇを５００ｍＬのナス型フラスコに入れ、１００ｍＬのエタノールを加え、７０℃の水浴上で２時間還流抽出した。冷却後、綿栓濾過してエタノール抽出液を得た。
この還流抽出操作を３回繰り返した後、得られたエタノール抽出液を合わせて減圧濃縮し、エタノール抽出物（４９９ｍｇ）を得た。
このエタノール抽出物を１００ｍＬの９０％メタノールに懸濁させ、分液漏斗に移して３０ｍＬのヘキサンにて３回処理を行い、脱脂した。９０％メタノール溶液層をエバポレーターで減圧乾固し、３１０ｍｇの９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得た。
この段階で得られた、ヘキサン溶液溶解画分と、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）について、免疫ブロット法により活性を検討したところ、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）が、活性が強いものであった。
【００３８】
この活性の強かった９０％メタノール溶出画分を、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィー（φ１７ｍｍ×１００ｍｍ：和光純薬工業）の段階的グラジエント法に付し、順次、水（８０ｍＬ）、５０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（１００ｍＬ）、及びアセトン（１００ｍＬ）溶液にて溶出を行い、各溶出画分を得た。
その結果、水溶出画分（１１９ｍｇ）、５０％メタノール溶出画分（４９ｍｇ）、メタノール溶出画分（画分Ｂ）（１２５ｍｇ）及びアセトン溶出画分（２０ｍｇ）を得た。
得られた四つの画分のうち、メタノール溶出画分（画分Ｂ）（１２５ｍｇ）が最も活性が強いものであった。
【００３９】
次いで、活性の強かったメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、Chromatorex ＯＤＳカラムロマトグラフィー（φ１５ｍｍ×１５０ｍｍ）に付し、水−メタノール（１：０→０：１、ｖ／ｖ）の段階的グラジエント法により溶出し、これにより、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）（４９ｍｇ）を得た。
得られた三つの画分のうち、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）が最も活性が強いものであった。
【００４０】
最後に、得られた５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Cosmosil ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳカラム：φ２０ｍｍ×３５０ｍｍ）に付し、４０％メタノールにて分取し、１２個の溶出画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）を得た。
これらの溶出画分Ｄ１〜Ｄ１２について活性を検討したところ、画分Ｄ３及び画分Ｄ７が最も活性が強いものであり、画分Ｄ３より式（Ｉ）で示されるユーパリノライドＡを４．６ｍｇ（収率：０．０５％）、画分Ｄ７より式（ＩＩ）で示されるユーパリノライドＢを４．５ｍｇ（収率：０．０４％）得ることができた。
これらの化学構造は、赤外線吸収スペクトル、Ｈ１或いはＣ１３磁気共鳴スペクトル等の標品との比較による物理化学的手段により決定することができた。
【００４１】
以上の分画処理の流れ（フロー）を、図１に示した。
【００４２】
実施例２：ＨＳＰの発現と細胞生存率
マウスメラノーマ由来のＢ１６細胞（理研バイオリソースセンター）を、各濃度のユーパリノライドＡ又はＢと共に、ＤＭＥＭ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。
ＨＳＰ７０の発現量は、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体（Stressgen社）を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。
細胞生存率は、ＭＴＴ法に従い、全細胞の抽出物を、抗ＨＳＰ７０抗体又はアクチンと共にイムノブロット法により測定した。
【００４３】
その結果を図２に示した。
図２中、上段にユーパリノライドＡの結果を、下段にユーパリノライドＢの結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、ユーパリノライドＡ及びＢは、濃度依存的にＨＳＰを発現しており、その時の細胞生存率に変化がなく、安全なものであることが確認された。
【００４４】
実施例３：ＡＧＳ細胞におけるＨＳＰ７０発現効果
ヒト胃粘膜上皮細胞（ＡＧＳ細胞）を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度と共に、ＲＰＭＩ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。
ＨＳＰ７０の発現量は、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体（Stressgen社）を用いたウエスタン・ブロット法により測定した。
細胞生存率は、ＭＴＴ法に従い、全細胞の抽出物を、抗ＨＳＰ７０抗体又はアクチンと共にイムノブロット法により測定した。
【００４５】
その結果を、図３に示した。
図３中、上段にユーパリノライドＡの結果を、下段にユーパリノライドＢの結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、ＡＧＳ細胞においても、実施例２と同様にユーパリノライドＡ及びＢは、濃度依存的にＨＳＰ７０を発現しており、その時の細胞生存率に変化がなく、安全なものであることが確認された。
【００４６】
実施例４：他のストレスとのＨＳＰ７０発現増強効果
ＡＧＳ細胞を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度（０、１及び２μｇ／ｍＬ）と共に、ＲＰＭＩ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で３時間培養した。次いで、４０℃／１時間のヒートショックを与え、続いて３７℃にて６時間ヒートショックからの回復を行った。
一方、ＡＧＳ細胞を同様に、ストレスとして３．５％エタノールと共に２４時間培養した。
ストレスを与えないで培養したＡＧＳ細胞、並びにヒートショックストレス或いはアルコールストレスを与えて培養した各ＡＧＳ細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、上記実施例と同様に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体（Stressgen社）を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。
また、細胞生存率は、ＭＴＴ法に従い、全細胞の抽出物を、抗ＨＳＰ７０抗体又はアクチンと共にイムノブロット法により測定した。
【００４７】
その結果を、図４に示した。
図４中、上段にヒートショックを与えた場合の結果を、下段にアルコールストレスを与えた場合の結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、ヒートショックを与えない場合であってもＨＳＰ７０の発現は誘導されているが、ヒートショックを与えた場合においては、ＨＳＰ７０がより多く誘導されることが判明した。
アルコールストレスを与えた場合であっても同様であった。
以上の結果から、ユーパリノライドＡ又はＢは、他のストレスによりＨＳＰ７０発現の増強効果があることが理解される。
【００４８】
実施例５：ストレスに晒した場合のユーパリノライドＡ及びＢの細胞保護作用
ＡＧＳ細胞を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度（０、２．５及び５．０μｇ／ｍＬ）と共に前処理し、新鮮な培地で洗浄し、ＲＰＭＩ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で１８時間培養した。最後に３．５％エタノール、又は１５μＭのmenadioneと共に２４時間培養した。
細胞の生存率は、前実施例と同様にＭＴＴ法により行った。アポトーシスを起こした細胞（sub-G1中の細胞）は、fluorescence activated cell sortingによりカウントした、値は、平均値±S.D.で表示した。
【００４９】
その結果を、図５及び図６に示した。
図５は、３．５％エタノールと共に培養した結果であるが、ユーパリノライドＡ又はＢは、濃度依存的に細胞生存率を高めていることが判明する。
また、図６は１５μＭのmenadioneと共に培養した結果であるが、３．５％エタノールの場合と同様、ユーパリノライドＡ又はＢは、濃度依存的に細胞生存率を高めていることが判明する。
【００５０】
実施例６：ユーパリノライドＡ及びＢによるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果
Ｂ１６細胞を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度（５．０及び１０．０μｇ／ｍＬ）と共に培養した。細胞を、さらに１００μＭのＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine：Sigma社）の添加、或いは無添加にて７２時間、或いは４８時間培養した。
各サンプルの蛋白質量を、Bio-Rad protein assay kitにより求め、同量の蛋白質量に揃えた後、４９０ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（Fluostar Galaxy社）により測定した。
細胞抽出中のメラニンの量を測定し、コントロールとの比較で表示した。
また、チロシナーゼ活性をコントロールとの比較で表示した。
【００５１】
その結果を、図７及び図８に示した。
図７に、メラニン含有量を示し、図８にチロシナーゼ活性を示した。
いずれの場合において、ユーパリノライドＡ又はＢは、メラニン生成を抑制し、チロシナーゼ活性も低下させていることが理解される。
特に、ＩＢＭＸの添加におけるメラニン生成の抑制、並びにチロシナーゼ活性の低下は強いものであることが判明した。
【００５２】
実施例７：ＨＳＰ７０発現の確認
培養液を満たした培養皿に、ヒト線維芽細胞株（NBIRGB：理化学研究所、バイオリソースセンター）を１×１０２個／ｍＬの細胞懸濁となるように播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養を行った。
この培養液に、上記実施例１で抽出・単離したユーパリノライドＡ又はＢ、並びに実施例１の分離過程で得たヤバツイの溶媒抽出物（画分Ａ〜Ｃ）を上記したイムノブロット法に従ってＨＳＰ７０の発現誘導を検討した。
評価は、ＨＳＰ７０の発現を２倍にする最小有効濃度（ＭＥＣ２．０（μｇ／ｍｌ））として表示した。
あわせて、その時の細胞生存率（Safe Induction（SI）Index）（％）も検討した。
その結果を下記表１に示した。
なお、表中には、実施例１で調製したヤバツイの溶媒抽出物として画分Ａ〜Ｃの結果も示した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表中の結果より明らかなように、ユーパリノライドＡ及びＢには、極めて強いＨＳＰ７０の発現誘導作用があることが判明する。
また、画分Ａ〜Ｃにあっても、ＨＳＰ７０発現誘導作用があることが判明する。
ヤバツイ自体はすでに中国において解熱・解毒薬として使用されている生薬であることから、ヤバツイから抽出・単離したユーパリノライドＡ及びＢは、細胞毒性がなく、安全なものであることが判明した。
【００５５】
既に上記で説明したように、ＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢによるＨＳＰの発現、特にＨＳＰ７０の発現誘導は、脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤としての医薬品として有用であり、さらにメラニン産生抑制化粧料となる。
【００５６】
以下に、本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢの製剤応用例を示した。
応用例１：皮膚外用剤
以下の処方により、皮膚外用剤（クリーム剤）を得た。
スクワラン ２０重量％
ミツロウ ５
精製ホホバ油 ５
グリセリンモノステアレート ２
ソルビタンモノステアレート ２
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２
グリセリン ５
ユーパリノライドＡ １
ユーパリノライドＢ １
精製水 １００とする残部
【００５７】
応用例２：注射剤
ユーパリノライドＡ又はＢを、塩化ナトリウム、及び溶解補助剤としてポリソルベート２０ともに注射用滅菌精製水に溶解し、１％含有注射剤を得た。
【００５８】
応用例３：静脈注射剤
ユーパリノライドＡ又はＢの１％（ｗ／ｗ）、シュークロース１０％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）を５％キシリトール水溶液に溶解した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥剤に、別にバイアル充填した０．５％カルメロースあるいは注射用水を加えることにより静脈注射用剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上記載のように、本発明により、ユーパリノライドＡ及び／又はＢからなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤が提供される。
本発明が提供するユーパリノライドＡ及び／又はＢは、ＨＳＰ、特にＨＳＰ７０の発現を誘導し、ＨＳＰの損傷によって生じる脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用であるとともに、発現が誘導されたＨＳＰ７０がメラニン産生を制御させ、その結果、メラニンの産生を抑制するものであり、その結果、シミの予防・改善作用のある化粧料を提供することができる、極めて特異的なものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として有用な熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン）の発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織あるいは固体においては、一般的な生理的温度より３℃以上高い温度に晒されたときに、生体の防御システムの一つとして、特異的タンパク質の発現（産生）が誘導されることが知られている。
このタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって測定した場合、分子量範囲１０〜１１０ＫＤａを有する一群のタンパク質として存在しており、熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン：heat shock proteins、以下、「ＨＳＰ」と称する場合もある）と呼ばれている。
【０００３】
ＨＳＰは、その分子量の相違により幾つかのファミリーが形成されており、例えば、ＨＳＰ９０ファミリー（分子量：９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下）、ＨＳＰ７０ファミリー（分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）、ＨＳＰ６０ファミリー（分子量：６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満）、及び低分子量ＨＳＰファミリー（分子量：６０ｋＤａ未満）のように分類されている。
【０００４】
ＨＳＰの機能は多岐にわたっており、例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０ファミリーは、変性タンパク質に結合して、天然のフォールディング（高次構造・折り畳み構造）に巻き戻す作用や、第三のタンパク質や核酸との会合、細胞内での局在化や膜透過への関与など、いわゆる分子シャペロンと呼ばれる機能を担っていることが明らかにされている（非特許文献１及び２）。
なお、分子シャペロンとは、ポリペプチド鎖の合成に引き続くフォールディングや酵素の不可逆的な熱変性の抑制に関与している一連の蛋白質をさす。
【０００５】
このＨＳＰ発現の誘導（産生）を利用した療法の一つとして、癌温熱免疫療法がある。すなわち、全身を加温することによりＨＳＰの生成を誘導し、全身の免疫機能を活発にするのと同時に、がん細胞と正常細胞の識別能力を向上させ、副作用が無く、癌細胞のみを死滅させる治療法である。
【０００６】
ところで、このＨＳＰは、高温ばかりではなく、外的傷害、放射線、紫外線などの外界からのストレスに晒された場合にも、生体防御システムとして、その発現（産生）が誘導される。
すなわち、高温、紫外線などの生体に対するストレスは、細胞のタンパク質を変性させ、不溶性沈殿を形成して細胞にダメージを与える。したがって、かかる細胞へのダメージを防御する目的で、ＨＳＰの発現が誘導されることとなる。
【０００７】
かかる観点から、水生プランクトンであるアルテミアの孵化直前の耐久卵から水抽出した活性エキス（アルテミアエキス）成分が、ヒト皮膚細胞においてＨＳＰ７０の産生を誘発することが見出され、かかる作用を利用した抗皮膚ストレス（ストレス防御）用化粧料が提案されている（特許文献１）。
【０００８】
更に最近、脳梗塞やアルツハイマー病など脳疾患の原因である神経細胞死が、細胞を保護する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の損傷によって生じることが明らかにされた（非特許文献３）。
また、ＨＳＰ誘導物質が潰瘍性大腸炎やアルツハイマー病に有効であることが示されている（非特許文献４）。
【０００９】
したがって、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）の発現誘導は、種々の病態の治療に有効であり、また、メラニン産生を抑制するものであり、効果的なＨＳＰ７０発現誘導作用を有する成分は、極めて有力な医薬品、或いは化粧品となる。
かかる観点より本発明者は、更に検討を進め、各種植物成分（生薬）について、ＨＳＰ７０発現を誘導する安全性の高い成分の検索を行ってきていたが、その検討の中で、植物成分としてサワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部の乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、ＨＳＰ７０の発現誘導を強化させることを見出した。
特に、ヤバツイのエタノール抽出エキスを、各種カラムクロマトグラフィー、或いは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で分画して得た成分（画分）には、極めて強いＨＳＰ７０の発現誘導が認められることを確認し、その画分の主成分を検討したところ、セスキテルペンラクトン化合物であるユーパリノライドＡ（Eupalinolide Ａ）、及びユーパリノライドＢ（Eupalinolide Ｂ）であることが判明した。
【００１０】
これらセスキテルペンラクトンであるユーパリノライドＡ及びＢは、すでに公知の化合物であるが、これまでの研究では、その構造決定と、細胞毒性に関する報告（非特許文献５）のみであって、このものにＨＳＰの発現を誘導する作用があることについては、一切記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−２３８２９７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Hendrick, J. P. & Hartl, F. -U., Ann. Rev. Biochem., 62, 349-384 (1993)
【非特許文献２】Georgopoulos, C. & Welch, W. J., Ann. Rev. Cell Biol., 9, 601-634 (1993)
【非特許文献３】北国新聞、2009年10月24日
【非特許文献４】Tanaka, K. & Mizushima, T., Int. J. Hyperthermia, 8,668-676(2009)
【非特許文献５】Yang, N. Y., et al., J. Asian Nat. Prod. Res., 9(3-5), 339-345 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、セスキテルペンラクトンであるユーパリノライドＡ及びＢからなるヒートショックプロテイン発現誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、その態様は、以下の構成からなる。
（１）ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤；
（２）ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）が、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものである上記（１）に記載のヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤；
（３）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）より、以下の抽出・分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の抽出方法であって、
（ａ）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）をエタノール抽出して得た抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行った後、９０％メタノール溶液に溶解して得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得、
（ｂ）次いで、上記で得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィーに付し、順次、水溶出−５０％メタノール溶出−メタノール溶出−アセトン溶出を行い、メタノール溶出画分（画分Ｂ）を得、
（ｃ）上記で得たメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を得、
（ｄ）最後に、上記で得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）をＨＰＬＣ（カラム：ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出すること、
からなる抽出方法；
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、セスキテルペンラクトン化合物であるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤、特にＨＳＰ７０の発現誘導剤が提供される。
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出・単離されたものであり、ＨＳＰの発現誘導作用により、特に生成したＨＳＰ７０がチロシナーゼ、及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制するとともに、脳梗塞やアルツハイマー病など脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１で行った、ヤバツイから、本発明のＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢの抽出・単離について、その分画操作の流れを示したフロー図である。
【図２】実施例２におけるＨＳＰの発現と細胞生存率について、ユーパリノライドＡ及びＢの結果を示した図である。
【図３】実施例３のＡＧＳ細胞におけるＨＳＰ７０発現効果について、ユーパリノライドＡ及びＢの結果を示した図である。
【図４】実施例４における、ヒートショック等のストレスと、ユーパリノライドＡ及びＢのＨＳＰ７０発現増強効果を示した図である。
【図５】実施例５における、アルコールストレスに晒した場合のユーパリノライドＡ及びＢの細胞保護作用の結果を示した図である。
【図６】実施例５における、menadioneと共に培養した場合のユーパリノライドＡ及びＢの細胞保護作用の結果を示した図である。
【００１７】
【図７】実施例６における、本発明のＨＳＰ誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢによるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果を示す、メラニン含有量を示した図である。
【図８】実施例６における、本発明のＨＳＰ誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢによるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果を示す、チロシナーゼ活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、上記したように、その基本は、ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤であって、特に、ＨＳＰ７０の生成により、チロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制する効果を発揮するとともに、ＨＳＰの損傷によって生じる脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用である。
【００１９】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の化学式を以下に示した。
すなわち、ユーパリノライドＡにあっては下記化学式（Ｉ）、ユーパリノライドＢにあっては下記化学式（ＩＩ）で示される化合物である。
【００２０】
【化１】
【００２１】
両者は同一の分子式（Ｃ２４Ｈ３０Ｏ９）を有し、その化学構造式も極めて類似するものであるが、立体的構造として、その４位において、ユーパリノライドＡがＺ型を保持しているのに対して、ユーパリノライドＢがＥ型を保持している点で相違するのみである。
【００２２】
このユーパリノライドＡ及びＢは、好ましくは、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出・単離することにより得ることができ、本発明の一態様としては、ユーパリノライドＡ及び／又はＢが、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものであるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）誘導剤でもある。
【００２３】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）は、キク科ヒヨドリバナ属植物に属し、日本全国、東南アジアに生育する多年草である。この地上部乾燥生薬は、ヤバツイ（野馬追）と称され、中国においては解熱・解毒薬として使用されている生薬成分である。
【００２４】
本願発明が提供するＨＳＰ誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢのヤバツイからの抽出、単離は、具体的には以下のようにして行うことができる。
すなわち、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（以下、特に断らない限り、「ヤバツイ」と称する。）をエタノール抽出してエタノール抽出物を得る。
なお、ヤバツイは、生薬として市販されており、例えば、丸善製薬（株）から入手することができる。
抽出にあたっては、ヤバツイ１００ｇに対して、エタノールを０．５〜２Ｌ程度加え、加熱還流条件下で抽出を行うのがよい。抽出時間は一概に限定できないが、１〜５時間程度、好ましくは２時間程度でよい。また、抽出温度は、７０℃〜エタノールの沸点付近の温度で行うのがよい。抽出操作を完了した段階で、冷却後綿栓濾過を行い、エタノール抽出液を得る。
この抽出操作を２〜５回、好ましくは３〜４回程度繰り返し、併せたエタノール抽出溶液を減圧下に濃縮し、残渣として、ヤバツイの粗エタノール抽出物を得る。
【００２５】
上記で得たヤバツイの粗エタノール抽出物を分画操作することにより、目的とするユーパリノライドＡ及び／又はＢを単離するのであるが、具体的には以下のようにして行うことができる。
最初に、ヤバツイの粗エタノール抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行う。具体的には、粗エタノール抽出物を９０％メタノール溶液に懸濁させ、分液漏斗に移して少量のヘキサンにより抽出することにより脱脂処理を行う。
脱脂処理した９０％メタノール層を減圧乾固し、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）が得られる。
【００２６】
次いで、上記で得られた９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ポリスチレンゲルカラムクロマトグラフィー、具体的には、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐ（和光純薬工業）カラムクロマトグラフィーに付し、順次、水、５０％メタノール、メタノール溶液の段階的グラジエント法、及びアセトン溶液にて溶出を行い、各溶出画分を得る。
かかる操作において得られたメタノール溶出画分（画分Ｂ）に、ＨＳＰ発現誘導が強く認められた。
【００２７】
ＨＳＰ発現誘導が強く観察されたメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液による段階的グラジエント法で溶出を行い、それぞれの溶出画分を得た。
かかる操作において得られた５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）に、ＨＳＰ発現誘導が強く認められた。
【００２８】
次いで、ＨＳＰ発現誘導が強く観察された５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出して全１２個の溶出画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）を得た。
かくして得られた溶出画分Ｄ１〜Ｄ１２のうち、特に、画分Ｄ３並びに画分Ｄ７に、極めて強いＨＳＰ発現誘導作用があることが判明した。
【００２９】
この画分Ｄ３及びＤ７について、ＨＳＰ発現誘導作用物質の特定を検討したところ、画分Ｄ３には、ユーパリノライドＡが、画分Ｄ７にはユーパリノライドＢが主成分として含有されていることが判明した。
かかる画分Ｄ３及びＤ７について、一般的に汎用されている単離・結晶化等の操作を行い、目的とするユーパリノライドＡ及び／又はＢを得ることができる。
したがって、本発明は、また、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）より、抽出・分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の抽出方法でもある。
【００３０】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、ＨＳＰのなかでも、特に、ＨＳＰ７０の発現誘導によるメラニン産生抑制作用を発揮する。
すなわち、ＨＳＰ７０は、メラニン産生に関与するチロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させるものであり、その結果、メラニンの産生が抑制されるとともに、ＨＳＰの損傷によって生じる脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用である。
【００３１】
したがって、本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、例えば、脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤、メラニン産生抑制化粧料、特に美白化粧料として使用するのに適している。
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、医薬品として錠剤、カプセル、粉末剤などの経口投与剤、注射剤、点滴剤などの非経口投与剤とし、化粧料としては、具体的には、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液剤、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、チークカラー等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローション等の身体用化粧料等を挙げることができる。
【００３２】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、ユーパリノライドＡ及び／又はＢを含有するものであるが、上記の抽出・単離操作により得たヤバツイの抽出物を、そのまま含有してもよい。
また、各種製剤として使用されている薬理学的に許容されている他の慣用成分と共に、所望の形態で使用することができる。
【００３３】
この場合において、本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢの含有量は、一概に限定できず、また、病態の予防・改善の目的、用いる人の性別、体重、年齢、剤型、病態の種類や程度、使用部位、使用回数などの種々の条件により一概に限定できない。
例えば、経口剤として投与する場合には、０．１〜１００μｇ／ｋｇ／日で、一日１回から数回に分けて適用することができるが、使用量は、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。
また、上記の抽出・単離操作により得たヤバツイの抽出物を、そのまま含有する場合には、その抽出画分に含有されるユーパリノライドＡ及び／又はＢの量に換算した量で含有させることができる。
【００３４】
本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤は、上記したように、医療効果を目的として使用されるとともに、メラニン産生抑制化粧料として使用される。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明を、ヤバツイからのユーパリノライドＡ及び／又はＢの抽出・単離の実際、並びに、ＨＳＰ７０の発現の誘導の試験を説明しながら、より詳細に説明していく。
【００３６】
なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：ユーパリノライドＡ及び／又はＢの抽出・単離
丸善製薬（株）から入手したヤバツイ［サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬］の１０．１ｇを５００ｍＬのナス型フラスコに入れ、１００ｍＬのエタノールを加え、７０℃の水浴上で２時間還流抽出した。冷却後、綿栓濾過してエタノール抽出液を得た。
この還流抽出操作を３回繰り返した後、得られたエタノール抽出液を合わせて減圧濃縮し、エタノール抽出物（４９９ｍｇ）を得た。
このエタノール抽出物を１００ｍＬの９０％メタノールに懸濁させ、分液漏斗に移して３０ｍＬのヘキサンにて３回処理を行い、脱脂した。９０％メタノール溶液層をエバポレーターで減圧乾固し、３１０ｍｇの９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得た。
この段階で得られた、ヘキサン溶液溶解画分と、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）について、免疫ブロット法により活性を検討したところ、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）が、活性が強いものであった。
【００３８】
この活性の強かった９０％メタノール溶出画分を、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィー（φ１７ｍｍ×１００ｍｍ：和光純薬工業）の段階的グラジエント法に付し、順次、水（８０ｍＬ）、５０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（１００ｍＬ）、及びアセトン（１００ｍＬ）溶液にて溶出を行い、各溶出画分を得た。
その結果、水溶出画分（１１９ｍｇ）、５０％メタノール溶出画分（４９ｍｇ）、メタノール溶出画分（画分Ｂ）（１２５ｍｇ）及びアセトン溶出画分（２０ｍｇ）を得た。
得られた四つの画分のうち、メタノール溶出画分（画分Ｂ）（１２５ｍｇ）が最も活性が強いものであった。
【００３９】
次いで、活性の強かったメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、Chromatorex ＯＤＳカラムロマトグラフィー（φ１５ｍｍ×１５０ｍｍ）に付し、水−メタノール（１：０→０：１、ｖ／ｖ）の段階的グラジエント法により溶出し、これにより、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）（４９ｍｇ）を得た。
得られた三つの画分のうち、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）が最も活性が強いものであった。
【００４０】
最後に、得られた５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Cosmosil ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳカラム：φ２０ｍｍ×３５０ｍｍ）に付し、４０％メタノールにて分取し、１２個の溶出画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）を得た。
これらの溶出画分Ｄ１〜Ｄ１２について活性を検討したところ、画分Ｄ３及び画分Ｄ７が最も活性が強いものであり、画分Ｄ３より式（Ｉ）で示されるユーパリノライドＡを４．６ｍｇ（収率：０．０５％）、画分Ｄ７より式（ＩＩ）で示されるユーパリノライドＢを４．５ｍｇ（収率：０．０４％）得ることができた。
これらの化学構造は、赤外線吸収スペクトル、Ｈ１或いはＣ１３磁気共鳴スペクトル等の標品との比較による物理化学的手段により決定することができた。
【００４１】
以上の分画処理の流れ（フロー）を、図１に示した。
【００４２】
実施例２：ＨＳＰの発現と細胞生存率
マウスメラノーマ由来のＢ１６細胞（理研バイオリソースセンター）を、各濃度のユーパリノライドＡ又はＢと共に、ＤＭＥＭ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。
ＨＳＰ７０の発現量は、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体（Stressgen社）を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。
細胞生存率は、ＭＴＴ法に従い、全細胞の抽出物を、抗ＨＳＰ７０抗体又はアクチンと共にイムノブロット法により測定した。
【００４３】
その結果を図２に示した。
図２中、上段にユーパリノライドＡの結果を、下段にユーパリノライドＢの結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、ユーパリノライドＡ及びＢは、濃度依存的にＨＳＰを発現しており、その時の細胞生存率に変化がなく、安全なものであることが確認された。
【００４４】
実施例３：ＡＧＳ細胞におけるＨＳＰ７０発現効果
ヒト胃粘膜上皮細胞（ＡＧＳ細胞）を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度と共に、ＲＰＭＩ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。
ＨＳＰ７０の発現量は、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体（Stressgen社）を用いたウエスタン・ブロット法により測定した。
細胞生存率は、ＭＴＴ法に従い、全細胞の抽出物を、抗ＨＳＰ７０抗体又はアクチンと共にイムノブロット法により測定した。
【００４５】
その結果を、図３に示した。
図３中、上段にユーパリノライドＡの結果を、下段にユーパリノライドＢの結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、ＡＧＳ細胞においても、実施例２と同様にユーパリノライドＡ及びＢは、濃度依存的にＨＳＰ７０を発現しており、その時の細胞生存率に変化がなく、安全なものであることが確認された。
【００４６】
実施例４：他のストレスとのＨＳＰ７０発現増強効果
ＡＧＳ細胞を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度（０、１及び２μｇ／ｍＬ）と共に、ＲＰＭＩ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で３時間培養した。次いで、４０℃／１時間のヒートショックを与え、続いて３７℃にて６時間ヒートショックからの回復を行った。
一方、ＡＧＳ細胞を同様に、ストレスとして３．５％エタノールと共に２４時間培養した。
ストレスを与えないで培養したＡＧＳ細胞、並びにヒートショックストレス或いはアルコールストレスを与えて培養した各ＡＧＳ細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、上記実施例と同様に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体（Stressgen社）を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。
また、細胞生存率は、ＭＴＴ法に従い、全細胞の抽出物を、抗ＨＳＰ７０抗体又はアクチンと共にイムノブロット法により測定した。
【００４７】
その結果を、図４に示した。
図４中、上段にヒートショックを与えた場合の結果を、下段にアルコールストレスを与えた場合の結果を示した。
図中に示した結果からも判明するように、ヒートショックを与えない場合であってもＨＳＰ７０の発現は誘導されているが、ヒートショックを与えた場合においては、ＨＳＰ７０がより多く誘導されることが判明した。
アルコールストレスを与えた場合であっても同様であった。
以上の結果から、ユーパリノライドＡ又はＢは、他のストレスによりＨＳＰ７０発現の増強効果があることが理解される。
【００４８】
実施例５：ストレスに晒した場合のユーパリノライドＡ及びＢの細胞保護作用
ＡＧＳ細胞を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度（０、２．５及び５．０μｇ／ｍＬ）と共に前処理し、新鮮な培地で洗浄し、ＲＰＭＩ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で１８時間培養した。最後に３．５％エタノール、又は１５μＭのmenadioneと共に２４時間培養した。
細胞の生存率は、前実施例と同様にＭＴＴ法により行った。アポトーシスを起こした細胞（sub-G1中の細胞）は、fluorescence activated cell sortingによりカウントした、値は、平均値±S.D.で表示した。
【００４９】
その結果を、図５及び図６に示した。
図５は、３．５％エタノールと共に培養した結果であるが、ユーパリノライドＡ又はＢは、濃度依存的に細胞生存率を高めていることが判明する。
また、図６は１５μＭのmenadioneと共に培養した結果であるが、３．５％エタノールの場合と同様、ユーパリノライドＡ又はＢは、濃度依存的に細胞生存率を高めていることが判明する。
【００５０】
実施例６：ユーパリノライドＡ及びＢによるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果
Ｂ１６細胞を、ユーパリノライドＡ又はＢの各濃度（５．０及び１０．０μｇ／ｍＬ）と共に培養した。細胞を、さらに１００μＭのＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine：Sigma社）の添加、或いは無添加にて７２時間、或いは４８時間培養した。
各サンプルの蛋白質量を、Bio-Rad protein assay kitにより求め、同量の蛋白質量に揃えた後、４９０ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（Fluostar Galaxy社）により測定した。
細胞抽出中のメラニンの量を測定し、コントロールとの比較で表示した。
また、チロシナーゼ活性をコントロールとの比較で表示した。
【００５１】
その結果を、図７及び図８に示した。
図７に、メラニン含有量を示し、図８にチロシナーゼ活性を示した。
いずれの場合において、ユーパリノライドＡ又はＢは、メラニン生成を抑制し、チロシナーゼ活性も低下させていることが理解される。
特に、ＩＢＭＸの添加におけるメラニン生成の抑制、並びにチロシナーゼ活性の低下は強いものであることが判明した。
【００５２】
実施例７：ＨＳＰ７０発現の確認
培養液を満たした培養皿に、ヒト線維芽細胞株（NBIRGB：理化学研究所、バイオリソースセンター）を１×１０２個／ｍＬの細胞懸濁となるように播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養を行った。
この培養液に、上記実施例１で抽出・単離したユーパリノライドＡ又はＢ、並びに実施例１の分離過程で得たヤバツイの溶媒抽出物（画分Ａ〜Ｃ）を上記したイムノブロット法に従ってＨＳＰ７０の発現誘導を検討した。
評価は、ＨＳＰ７０の発現を２倍にする最小有効濃度（ＭＥＣ２．０（μｇ／ｍｌ））として表示した。
あわせて、その時の細胞生存率（Safe Induction（SI）Index）（％）も検討した。
その結果を下記表１に示した。
なお、表中には、実施例１で調製したヤバツイの溶媒抽出物として画分Ａ〜Ｃの結果も示した。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表中の結果より明らかなように、ユーパリノライドＡ及びＢには、極めて強いＨＳＰ７０の発現誘導作用があることが判明する。
また、画分Ａ〜Ｃにあっても、ＨＳＰ７０発現誘導作用があることが判明する。
ヤバツイ自体はすでに中国において解熱・解毒薬として使用されている生薬であることから、ヤバツイから抽出・単離したユーパリノライドＡ及びＢは、細胞毒性がなく、安全なものであることが判明した。
【００５５】
既に上記で説明したように、ＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及び／又はＢによるＨＳＰの発現、特にＨＳＰ７０の発現誘導は、脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤としての医薬品として有用であり、さらにメラニン産生抑制化粧料となる。
【００５６】
以下に、本発明が提供するＨＳＰ発現誘導剤であるユーパリノライドＡ及びＢの製剤応用例を示した。
応用例１：皮膚外用剤
以下の処方により、皮膚外用剤（クリーム剤）を得た。
スクワラン ２０重量％
ミツロウ ５
精製ホホバ油 ５
グリセリンモノステアレート ２
ソルビタンモノステアレート ２
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２
グリセリン ５
ユーパリノライドＡ １
ユーパリノライドＢ １
精製水 １００とする残部
【００５７】
応用例２：注射剤
ユーパリノライドＡ又はＢを、塩化ナトリウム、及び溶解補助剤としてポリソルベート２０ともに注射用滅菌精製水に溶解し、１％含有注射剤を得た。
【００５８】
応用例３：静脈注射剤
ユーパリノライドＡ又はＢの１％（ｗ／ｗ）、シュークロース１０％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）を５％キシリトール水溶液に溶解した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥剤に、別にバイアル充填した０．５％カルメロースあるいは注射用水を加えることにより静脈注射用剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上記載のように、本発明により、ユーパリノライドＡ及び／又はＢからなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤が提供される。
本発明が提供するユーパリノライドＡ及び／又はＢは、ＨＳＰ、特にＨＳＰ７０の発現を誘導し、ＨＳＰの損傷によって生じる脳梗塞やアルツハイマー病などの脳疾患、潰瘍性大腸炎などの治療剤として有用であるとともに、発現が誘導されたＨＳＰ７０がメラニン産生を制御させ、その結果、メラニンの産生を抑制するものであり、その結果、シミの予防・改善作用のある化粧料を提供することができる、極めて特異的なものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤。
【請求項２】
ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）が、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものである請求項１に記載のヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤。
【請求項３】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）より、以下の抽出・分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の抽出方法であって、
（ａ）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）をエタノール抽出して得た抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行った後、９０％メタノール溶液に溶解して得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得、
（ｂ）次いで、上記で得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィーに付し、順次、水溶出−５０％メタノール溶出−メタノール溶出−アセトン溶出を行い、メタノール溶出画分（画分Ｂ）を得、
（ｃ）上記で得たメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を得、
（ｄ）最後に、上記で得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）をＨＰＬＣ（カラム：ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出すること、
からなる抽出方法。
【請求項１】
ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）からなるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤。
【請求項２】
ユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）が、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）から抽出したものである請求項１に記載のヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導剤。
【請求項３】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）より、以下の抽出・分画処理することからなるユーパリノライドＡ及び／又はＢ（Eupalinolide Ａ及び／又はＢ）の抽出方法であって、
（ａ）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）をエタノール抽出して得た抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行った後、９０％メタノール溶液に溶解して得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得、
（ｂ）次いで、上記で得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ＭＣｌ・ＧＥＬ ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィーに付し、順次、水溶出−５０％メタノール溶出−メタノール溶出−アセトン溶出を行い、メタノール溶出画分（画分Ｂ）を得、
（ｃ）上記で得たメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を得、
（ｄ）最後に、上記で得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）をＨＰＬＣ（カラム：ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出すること、
からなる抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−７１９０２（Ｐ２０１３−７１９０２Ａ）
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１０７５７（Ｐ２０１１−２１０７５７）
【出願日】平成２３年９月２７日（２０１１．９．２７）
【出願人】（３０３０１０４５２）株式会社ＬＴＴバイオファーマ (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２７日（２０１１．９．２７）
【出願人】（３０３０１０４５２）株式会社ＬＴＴバイオファーマ (27)
【Ｆターム（参考）】
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