メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法
【課題】細菌を通常の培養条件下で培養することにより、その細菌がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であるかどうかの判別をする方法を提供する。
【解決手段】分離培養した細菌をβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体とともに培養することにより、金属−ＥＤＴＡキレート錯体の存在下と非存在下での被検菌の発育状況を比較して、発育に対する金属−ＥＤＴＡキレート錯体による影響の有無を調べることにより、被検菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかを判別することが可能となる。
【解決手段】分離培養した細菌をβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体とともに培養することにより、金属−ＥＤＴＡキレート錯体の存在下と非存在下での被検菌の発育状況を比較して、発育に対する金属−ＥＤＴＡキレート錯体による影響の有無を調べることにより、被検菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかを判別することが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、β−ラクタム薬とメタロ−β−ラクタマーゼ阻害物質を組み合わせることにより、簡便にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に関するものである。さらに本発明は、β−ラクタム薬とメタロ−β−ラクタマーゼ阻害物質を含む、簡便にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に用いるキットおよびこのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１９４０年代に抗菌薬としてペニシリンが使用されるようになり、細菌により引き起こされる感染症を制御できると考えられた。しかし、まもなく抗菌薬の不活化酵素や抗菌薬の排出機構を有する薬剤耐性菌が分離され始めた。そこで、これらの耐性細菌により引き起こされる感染症を制御するため、より幅広く安定な抗菌力を有する新型の抗菌薬が開発され、使用された。
【０００３】
この中で、ペニシリン、セフェム等のβ−ラクタム薬に関しては、β−ラクタマーゼと呼ばれる加水分解酵素の存在が古くから知られている。このβ−ラクタマーゼは、酵素の活性中心にセリン残基を持つセリン−β−ラクタマーゼ及び亜鉛原子を活性発現に必要とするメタロ−β−ラクタマーゼの２種類が知られている。
【０００４】
一方、１９８０年代に開発された、広域な抗菌スペクトルを有するカルバペネム系薬剤に対して耐性を獲得した緑膿菌やセラチア菌が分離されるようになった。これらの耐性菌の性状を詳細に検討したところ、後者のメタロ−β−ラクタマーゼを産生することが明らかになった。
【０００５】
このメタロ−β−ラクタマーゼは、その活性中心に存在する亜鉛原子に結合した不安定なＨ２Ｏ分子がβ−ラクタム環を攻撃し、加水分解するとされている。それゆえ、メタロ−β−ラクタマーゼは、グラム陰性桿菌が通常産生するセリン−β−ラクタマーゼにより分解されにくいカルバペネム系薬剤やβ-ラクタマーゼ阻害剤をも容易に分解・不活化してしまうという憂慮すべき性質を示している（非特許文献１）。
【０００６】
なお、メタロ−β−ラクタマーゼの阻害剤である有機チオール化合物のメルカプト酢酸またはメルカプトプロピオン酸を含浸したディスクとセフタジジム（ＣＡＺ）ディスクを、菌を接種した培地上に置くことにより、培養後に有機チオール化合物を含浸したディスクと隣接したＣＡＺディスクの発育阻止円が生じることによって、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると簡便に判別できる（特許文献１）。
【０００７】
また、液体のメルカプト酢酸に代えて、メルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）を含浸したディスクを用いることにより、保存安定性に優れたキットを提供することが可能となった（特許文献２）。
【０００８】
しかし、これらの方法では判別できないＮＤＭ−１型のメタロ−β−ラクタマーゼを産生する多剤耐性菌が多くの国で分離されるようになった。それゆえ、メタロ−β−ラクタマーゼを産生する多剤耐性菌であるかどうかを判別することが感染症の治療するための重要な情報となるため、ＮＤＭ−１型も含めたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法が必要不可欠となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−２２４９９８公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３８８公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】荒川宣親、週間医学界新聞、第２２５６号、７．院内感染
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
メタロ−β−ラクタマーゼを産生する菌は、多剤耐性菌であることが多いため、感染のごく早い時期にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを調べることが必要である。それゆえ、簡便な方法を用いて全ての型のメタロ−β−ラクタマーゼを検出することが、この細菌に対する治療に重要となるため、この検出方法が不可欠になっている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者は、メタロ−β−ラクタマーゼに対して阻害効果を有するが、細菌の発育を抑制するエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に着目し、メタロ−β−ラクタマーゼを検出する方法の検討を進めた。すると、金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることにより、細菌の増殖を阻害せず、メタロ−β−ラクタマーゼの活性を阻害することが判った。
【００１３】
さらに、金属−ＥＤＴＡキレート錯体に有機チオール化合物を加えることにより、より効果が高くなることが判明した。具体的には、β−ラクタム薬の抗菌効果を測る際に、金属−ＥＤＴＡキレート錯体単独、もしくは金属−ＥＤＴＡキレート錯体とメルカプト酢酸ナトリウムの混合物を添加することにより、メタロ−β−ラクタマーゼを検出することができる。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（２）平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（３）平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスク並びにβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（４）β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（５）金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（６）β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（７）前記β−ラクタム薬がカルバペネム系薬剤、セファマイシン系薬剤、およびセファロスポリン系薬剤から選ばれる１以上の薬剤である（１）〜（６）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（８）前記カルバペネム系薬剤がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（９）前記セファマイシン系薬剤がセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１０）前記セファロスポリン系薬剤がセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１１）前記金属−ＥＤＴＡキレート錯体がＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡから選ばれる少なくとも１以上の化合物である（１）〜（１０）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１２）金属−ＥＤＴＡキレート錯体にさらに有機チオール化合物を添加する（１）〜（１１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１３）前記有機チオール化合物がメルカプト酢酸ナトリウムである（１）〜（１２）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１４）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含む、（１）〜（１１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
（１５）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体および有機チオール化合物を含む、（１２）〜（１３）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明を実施することにより、臨床の場で発生する多剤耐性菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかを容易に判別することが可能となり、その後の治療方針を決定するための一助となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】β−ラクタム薬を含浸したディスクおよびβ−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を単独で含浸させたディスクを並べて比較した模式図。その阻止円径の差（ｄ）がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別の指標となる。
【図２】β−ラクタム薬を含浸したディスクおよびβ−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体の両方を含浸させたディスクを比較した模式図。その阻止円径の差（ｄ）がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別の指標となる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明を、一例として被検菌の培養にはミュラーヒントン寒天培地を用い、β−ラクタム薬のイミペネムおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体のＭｇ−ＥＤＴＡによる被検菌の発育への影響によりメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を説明するが、本例に限定されることはない。
【００１８】
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、ミュラーヒントン寒天培地に接種した。
【００１９】
次に、同一平板培地上にイミペネムを含浸したディスクを３ｃｍ以上離して２枚置き、その１枚のイミペネムを含浸したディスクの中心から１．５〜２．０ｃｍ離してＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを置いた。
【００２０】
３５℃で１６〜１８時間培養後にＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止円の形状と単独で置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止円の形状の違いを観察した。
【００２１】
被検菌としてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を用いた場合、図１に示すとおり、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯（ｂ）が、独立して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止体（ａ）に比べて、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクとイミペネムを含浸したディスクの中心をつないだ軸方向に対して垂直方向に拡大を認めた。
【００２２】
被検菌として別のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を用いた場合、単独で置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯は認められないものの、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクは阻止帯の形成が認められた。
【００２３】
一方、被検菌としてメタロ−β−ラクタマーゼ非産生菌を用いた場合、単独で置いたイミペネムを含浸したディスクとＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯は同等であった。
【００２４】
以上、本例の試験を実施することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を容易に判別することが可能となる
【００２５】
すなわち、細菌のβ−ラクタム薬に対する感受性試験を実施する際に、被験対象のβ−ラクタム薬の他に金属−ＥＤＴＡキレート錯体もしくは金属−ＥＤＴＡキレート錯体と有機チオール化合物の混合物を添加することにより、その細菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかの判別が出来る。
【００２６】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法が適用出来る被検菌としては腸内細菌、緑膿菌が挙げられるが、これらの菌に限定されない。また、本試験に用いる培地としては、平板培地ではミュラーヒントン寒天培地を、液体培地としてはミュラーヒントンブイヨンを使用することが好ましい。
【００２７】
使用するβ−ラクタム薬は、カルバペネム系薬剤としてはイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムが、セファマイシン系薬剤としてはセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスが、セファロスポリン系薬剤としてはセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムが各々挙げられるが、これらの薬剤に限定されない。
【００２８】
使用する金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてはＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されず、Ｚｎ−ＥＤＴＡを除く金属−ＥＤＴＡ錯体であれば良い。好ましくは、Ｍｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、およびＣａ−ＥＤＴＡである。
【実施例】
【００２９】
１．β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた試験
［実施例１］金属−ＥＤＴＡキレート錯体によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
【００３０】
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離して二枚のβ−ラクタム薬含浸ディスクを置き、その中の一枚のディスクの中心から１．５ｃｍ離して金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを置いた。
【００３１】
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の形状およびβ−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた場合の阻止円の形状の違いを観察した。
【００３２】
具体的には、β−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円が、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べることにより、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの中心を繋いだ軸方向に対して垂直方向に拡大するかを確認した。
【００３３】
β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べることにより、図１に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００３４】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１７）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）を用いた。
【００３５】
β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。
【００３６】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体として、Ｃａ−ＥＤＴＡ（１２．５ｍｇ／ディスク）、Ｃｏ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、Ｍｎ−ＥＤＴＡ（１０ｍｇ／ディスク）、Ｍｇ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、Ｃｕ−ＥＤＴＡ（１５ｍｇ／ディスク）、Ｚｎ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、およびＦｅ−ＥＤＴＡ（２ｍｇ／ディスク）を用いた。なお、対照として、メルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含浸ディスクを用いた。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１に示す結果より、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する上で、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸させたディスクを用いることが最も有効と判断された。しかしながら、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡを含浸させたディスクにおいても、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別に有効であった。一方、Ｚｎ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを用いた場合には、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別することは出来なかった。
【００３９】
［比較例１］メタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌
メタロ−β−ラクタマーゼとは異なるβ−ラクタマーゼを産生していると確認しているＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを組み合わせて試験を行なったが、阻止円の変化は認められず、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌ではないと判別された。
【００４２】
［実施例２］Ｍｇ−ＥＤＴＡの濃度の違いによる試験結果への影響
被検菌として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７１）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと１０ｍｇ／ディスク、８ｍｇ／ディスク、および６ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
表３に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、Ｍｇ−ＥＤＴＡの含浸量が６〜１０ｍｇ／ディスクの間で、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００４５】
［実施例３］Ｍｇ−ＥＤＴＡの濃度の違いによる試験結果への影響（低濃度）
被検菌として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）を用い、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびパニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと６０μｇ／ディスク、３０μｇ／ディスク、１０μｇ／ディスク、および５μｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４６】
【表４】
【００４７】
表４に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、Ｍｇ−ＥＤＴＡの含浸量が３０μｇ／ディスク以上で、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００４８】
［実施例４］β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの距離の違いによる試験結果への影響
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと９ｍｇ／ディスクおよび１０ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、ディスクの中心間の距離を２．０ｃｍ、１．５ｃｍ、および１．０ｃｍとし、加えてディスク同士を接触させた試験を実施した。なお、その他の条件は［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの中心間の距離を２．０ｃｍとしてもメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であったが、その距離を１．５ｃｍ以下にすることによりメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の明瞭な判別が行なえるようになった。
【００５１】
［実施例５］種々のβ−ラクタム薬含浸ディスクを用いた検討
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＥＫＮ７１７３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ビアペネム（ＢＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、パニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、セフブペラゾン（ＣＢＰＺ：７５μｇ力価／ディスク）、セフメタゾール（ＣＭＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフミノクス（ＣＭＮＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォキシチン（ＣＦＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォタキシム（ＣＴＸ：３０μｇ力価／ディスク）、およびセフェピム（ＣＦＰＭ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと１２ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００５２】
【表６】
【００５３】
表６に示す結果より、多くのβ−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせることにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００５４】
２．β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた試験
［実施例６］β−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
【００５５】
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離してβ−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを置いた。
【００５６】
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の大きさとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの阻止円の大きさの違いを観察した。
【００５７】
β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを比較することにより、図２に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００５８】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）を用いた。
【００５９】
β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ビアペネム（ＢＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、パニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、セフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォタキシム（ＣＴＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフブペラゾン（ＣＢＰＺ：７５μｇ力価／ディスク）、セフミノクス（ＣＭＮＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォキシチン（ＣＦＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフメタゾール（ＣＭＺ：３０μｇ力価／ディスク）、およびセフェピム（ＣＦＰＭ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。
【００６０】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体として、Ｃａ−ＥＤＴＡおよびＭｇ−ＥＤＴＡを用い、各々１２ｍｇ／ディスクとなるようにβ−ラクタム薬含浸ディスクに添加した。
【００６１】
【表７】
【００６２】
表７に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの阻止円の大きさを比較することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００６３】
３．β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べた試験
［実施例７］金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
【００６４】
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離して二枚のβ−ラクタム薬含浸ディスクを置き、その中の一枚のディスクの中心から１．５ｃｍ離して金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを置いた。
【００６５】
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の形状およびβ−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べた場合の阻止円の形状の違いを観察した。
【００６６】
具体的には、β−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円が、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べることにより、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクの中心を繋いだ軸方向に対して垂直方向に拡大するかを確認した。
【００６７】
β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べることにより、図１に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００６８】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ９１５６）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（ＥＫＮ９９９５）を用い、β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。
【００６９】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＣａ−ＥＤＴＡを用い、ディスクに１２ｍｇのＣａ−ＥＤＴＡおよび１ｍｇのメルカプト酢酸ナトリウムを含浸させて試験に用いた。なお、各々Ｃａ−ＥＤＴＡおよびメルカプト酢酸ナトリウムを単独で含浸したディスクも準備し、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００７０】
【表８】
【００７１】
表８に示す結果より、Ｃａ−ＥＤＴＡ含浸ディスクまたはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを用いてもメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であったが、両者を混合してディスクに含浸することによりメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の明瞭な判別が行なえるようになった。
【００７２】
４．β−ラクタム薬含有平板培地を用いた試験
［実施例８］金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地およびイミペネム（ＩＰＭ：５０μｇ力価／ｍＬ）含有ミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
次に、各々の平板培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（１０μｇ／ディスク）含浸ディスクを置いた。
【００７３】
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の平板培地に置いたＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの阻止円を計測し、その大きさに変化が認められたものを＋、変化が認められなかったものを−と判定した。
【００７４】
被検菌として、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）並びにメタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いた。
【００７５】
その結果、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌は全て＋となり、メタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌は全て−となった。これらと表１および表２が同じ結果を示していることより、β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置いて培養後の阻止円の大きさを観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。
【００７６】
５．金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地を用いた試験
［実施例９］β−ラクタム薬含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地および金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（１００μｇ／ｍＬ）含有ミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
次に、各々の平板培地上にイミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを置いた。
【００７７】
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の平板培地に置いたβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円を計測し、５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、ミュラーヒントン寒天培地においてβ−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、Ｍｇ−ＥＤＴＡ含有ミュラーヒントン寒天培地において１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００７８】
被検菌として、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）並びにメタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いた。
【００７９】
【表９】
【００８０】
表９と表１および表２が同等の結果を示していることより、金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置いて培養後の阻止円の大きさを観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。
【００８１】
６．微量液体希釈法を用いた試験
［実施例１０］金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
ミュラーヒントンブロス培地並びに金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（５００μｇ／ｍＬ）およびＣａ−ＥＤＴＡ（５００μｇ／ｍＬ）含有ミュラーヒントンブロス培地を用いてイミペネム（ＩＰＭ）の希釈系列を作製した。
次に、各々の希釈系列のウェルに最終接種菌液量が約５×１０４ＣＦＵ／ウェルとなるように被検菌を接種した。
【００８２】
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の希釈系列での被検菌の増殖よりＭＩＣ値を求め、金属−ＥＤＴＡキレート錯体の有無により３管以上のＭＩＣ値の低下が認められたものを＋、認められなかったものを−と判定した。
【００８３】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）を用いた。
【００８４】
【表１０】
【００８５】
表１０と表１が同等の結果を示していることより、β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
従来、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別に、β−ラクタム薬と有機チオール化合物であるメルカプト酢酸ナトリウムを組み合わせて、被検菌の発育抑制効果の変化の有無が用いられてきた。
【００８７】
しかしながら、メタロ−β−ラクタマーゼの遺伝子型の中で、メルカプト酢酸ナトリウムを用いてもそのβ−ラクタマーゼ活性が抑制されないＮＤＭ−１と呼ばれる遺伝子型のメタロ−β−ラクタマーゼを発現する細菌が検出されるようになった。
【００８８】
すなわち、従来の方法ではメタロ−β−ラクタマーゼを産生している菌の全てを検出できないこととなった。その結果、医療行為を行なう上で、治療薬としての抗菌薬の選択に支障を来たす虞が生じている。
【００８９】
そこで、本願発明の技術を用いることにより、より広範囲のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別することが出来るようになり、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌による感染症を治療する上で有用な情報を得ることが可能となり、早期に治療薬としての抗菌薬を選択出来、感染症の治癒に寄与する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、β−ラクタム薬とメタロ−β−ラクタマーゼ阻害物質を組み合わせることにより、簡便にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に関するものである。さらに本発明は、β−ラクタム薬とメタロ−β−ラクタマーゼ阻害物質を含む、簡便にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に用いるキットおよびこのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１９４０年代に抗菌薬としてペニシリンが使用されるようになり、細菌により引き起こされる感染症を制御できると考えられた。しかし、まもなく抗菌薬の不活化酵素や抗菌薬の排出機構を有する薬剤耐性菌が分離され始めた。そこで、これらの耐性細菌により引き起こされる感染症を制御するため、より幅広く安定な抗菌力を有する新型の抗菌薬が開発され、使用された。
【０００３】
この中で、ペニシリン、セフェム等のβ−ラクタム薬に関しては、β−ラクタマーゼと呼ばれる加水分解酵素の存在が古くから知られている。このβ−ラクタマーゼは、酵素の活性中心にセリン残基を持つセリン−β−ラクタマーゼ及び亜鉛原子を活性発現に必要とするメタロ−β−ラクタマーゼの２種類が知られている。
【０００４】
一方、１９８０年代に開発された、広域な抗菌スペクトルを有するカルバペネム系薬剤に対して耐性を獲得した緑膿菌やセラチア菌が分離されるようになった。これらの耐性菌の性状を詳細に検討したところ、後者のメタロ−β−ラクタマーゼを産生することが明らかになった。
【０００５】
このメタロ−β−ラクタマーゼは、その活性中心に存在する亜鉛原子に結合した不安定なＨ２Ｏ分子がβ−ラクタム環を攻撃し、加水分解するとされている。それゆえ、メタロ−β−ラクタマーゼは、グラム陰性桿菌が通常産生するセリン−β−ラクタマーゼにより分解されにくいカルバペネム系薬剤やβ-ラクタマーゼ阻害剤をも容易に分解・不活化してしまうという憂慮すべき性質を示している（非特許文献１）。
【０００６】
なお、メタロ−β−ラクタマーゼの阻害剤である有機チオール化合物のメルカプト酢酸またはメルカプトプロピオン酸を含浸したディスクとセフタジジム（ＣＡＺ）ディスクを、菌を接種した培地上に置くことにより、培養後に有機チオール化合物を含浸したディスクと隣接したＣＡＺディスクの発育阻止円が生じることによって、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると簡便に判別できる（特許文献１）。
【０００７】
また、液体のメルカプト酢酸に代えて、メルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）を含浸したディスクを用いることにより、保存安定性に優れたキットを提供することが可能となった（特許文献２）。
【０００８】
しかし、これらの方法では判別できないＮＤＭ−１型のメタロ−β−ラクタマーゼを産生する多剤耐性菌が多くの国で分離されるようになった。それゆえ、メタロ−β−ラクタマーゼを産生する多剤耐性菌であるかどうかを判別することが感染症の治療するための重要な情報となるため、ＮＤＭ−１型も含めたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法が必要不可欠となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−２２４９９８公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３８８公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】荒川宣親、週間医学界新聞、第２２５６号、７．院内感染
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
メタロ−β−ラクタマーゼを産生する菌は、多剤耐性菌であることが多いため、感染のごく早い時期にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを調べることが必要である。それゆえ、簡便な方法を用いて全ての型のメタロ−β−ラクタマーゼを検出することが、この細菌に対する治療に重要となるため、この検出方法が不可欠になっている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者は、メタロ−β−ラクタマーゼに対して阻害効果を有するが、細菌の発育を抑制するエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に着目し、メタロ−β−ラクタマーゼを検出する方法の検討を進めた。すると、金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることにより、細菌の増殖を阻害せず、メタロ−β−ラクタマーゼの活性を阻害することが判った。
【００１３】
さらに、金属−ＥＤＴＡキレート錯体に有機チオール化合物を加えることにより、より効果が高くなることが判明した。具体的には、β−ラクタム薬の抗菌効果を測る際に、金属−ＥＤＴＡキレート錯体単独、もしくは金属−ＥＤＴＡキレート錯体とメルカプト酢酸ナトリウムの混合物を添加することにより、メタロ−β−ラクタマーゼを検出することができる。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（２）平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（３）平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスク並びにβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（４）β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（５）金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（６）β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（７）前記β−ラクタム薬がカルバペネム系薬剤、セファマイシン系薬剤、およびセファロスポリン系薬剤から選ばれる１以上の薬剤である（１）〜（６）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（８）前記カルバペネム系薬剤がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（９）前記セファマイシン系薬剤がセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１０）前記セファロスポリン系薬剤がセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１１）前記金属−ＥＤＴＡキレート錯体がＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡから選ばれる少なくとも１以上の化合物である（１）〜（１０）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１２）金属−ＥＤＴＡキレート錯体にさらに有機チオール化合物を添加する（１）〜（１１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１３）前記有機チオール化合物がメルカプト酢酸ナトリウムである（１）〜（１２）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１４）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含む、（１）〜（１１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
（１５）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体および有機チオール化合物を含む、（１２）〜（１３）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明を実施することにより、臨床の場で発生する多剤耐性菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかを容易に判別することが可能となり、その後の治療方針を決定するための一助となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】β−ラクタム薬を含浸したディスクおよびβ−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を単独で含浸させたディスクを並べて比較した模式図。その阻止円径の差（ｄ）がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別の指標となる。
【図２】β−ラクタム薬を含浸したディスクおよびβ−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体の両方を含浸させたディスクを比較した模式図。その阻止円径の差（ｄ）がメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別の指標となる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明を、一例として被検菌の培養にはミュラーヒントン寒天培地を用い、β−ラクタム薬のイミペネムおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体のＭｇ−ＥＤＴＡによる被検菌の発育への影響によりメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を説明するが、本例に限定されることはない。
【００１８】
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、ミュラーヒントン寒天培地に接種した。
【００１９】
次に、同一平板培地上にイミペネムを含浸したディスクを３ｃｍ以上離して２枚置き、その１枚のイミペネムを含浸したディスクの中心から１．５〜２．０ｃｍ離してＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを置いた。
【００２０】
３５℃で１６〜１８時間培養後にＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止円の形状と単独で置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止円の形状の違いを観察した。
【００２１】
被検菌としてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を用いた場合、図１に示すとおり、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯（ｂ）が、独立して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止体（ａ）に比べて、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクとイミペネムを含浸したディスクの中心をつないだ軸方向に対して垂直方向に拡大を認めた。
【００２２】
被検菌として別のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を用いた場合、単独で置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯は認められないものの、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクは阻止帯の形成が認められた。
【００２３】
一方、被検菌としてメタロ−β−ラクタマーゼ非産生菌を用いた場合、単独で置いたイミペネムを含浸したディスクとＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯は同等であった。
【００２４】
以上、本例の試験を実施することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を容易に判別することが可能となる
【００２５】
すなわち、細菌のβ−ラクタム薬に対する感受性試験を実施する際に、被験対象のβ−ラクタム薬の他に金属−ＥＤＴＡキレート錯体もしくは金属−ＥＤＴＡキレート錯体と有機チオール化合物の混合物を添加することにより、その細菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかの判別が出来る。
【００２６】
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法が適用出来る被検菌としては腸内細菌、緑膿菌が挙げられるが、これらの菌に限定されない。また、本試験に用いる培地としては、平板培地ではミュラーヒントン寒天培地を、液体培地としてはミュラーヒントンブイヨンを使用することが好ましい。
【００２７】
使用するβ−ラクタム薬は、カルバペネム系薬剤としてはイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムが、セファマイシン系薬剤としてはセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスが、セファロスポリン系薬剤としてはセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムが各々挙げられるが、これらの薬剤に限定されない。
【００２８】
使用する金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてはＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されず、Ｚｎ−ＥＤＴＡを除く金属−ＥＤＴＡ錯体であれば良い。好ましくは、Ｍｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、およびＣａ−ＥＤＴＡである。
【実施例】
【００２９】
１．β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた試験
［実施例１］金属−ＥＤＴＡキレート錯体によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
【００３０】
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離して二枚のβ−ラクタム薬含浸ディスクを置き、その中の一枚のディスクの中心から１．５ｃｍ離して金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを置いた。
【００３１】
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の形状およびβ−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた場合の阻止円の形状の違いを観察した。
【００３２】
具体的には、β−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円が、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べることにより、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの中心を繋いだ軸方向に対して垂直方向に拡大するかを確認した。
【００３３】
β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べることにより、図１に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００３４】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１７）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）を用いた。
【００３５】
β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。
【００３６】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体として、Ｃａ−ＥＤＴＡ（１２．５ｍｇ／ディスク）、Ｃｏ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、Ｍｎ−ＥＤＴＡ（１０ｍｇ／ディスク）、Ｍｇ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、Ｃｕ−ＥＤＴＡ（１５ｍｇ／ディスク）、Ｚｎ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、およびＦｅ−ＥＤＴＡ（２ｍｇ／ディスク）を用いた。なお、対照として、メルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含浸ディスクを用いた。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１に示す結果より、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する上で、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸させたディスクを用いることが最も有効と判断された。しかしながら、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡを含浸させたディスクにおいても、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別に有効であった。一方、Ｚｎ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを用いた場合には、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別することは出来なかった。
【００３９】
［比較例１］メタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌
メタロ−β−ラクタマーゼとは異なるβ−ラクタマーゼを産生していると確認しているＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを組み合わせて試験を行なったが、阻止円の変化は認められず、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌ではないと判別された。
【００４２】
［実施例２］Ｍｇ−ＥＤＴＡの濃度の違いによる試験結果への影響
被検菌として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７１）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと１０ｍｇ／ディスク、８ｍｇ／ディスク、および６ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
表３に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、Ｍｇ−ＥＤＴＡの含浸量が６〜１０ｍｇ／ディスクの間で、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００４５】
［実施例３］Ｍｇ−ＥＤＴＡの濃度の違いによる試験結果への影響（低濃度）
被検菌として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）を用い、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびパニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと６０μｇ／ディスク、３０μｇ／ディスク、１０μｇ／ディスク、および５μｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４６】
【表４】
【００４７】
表４に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、Ｍｇ−ＥＤＴＡの含浸量が３０μｇ／ディスク以上で、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００４８】
［実施例４］β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの距離の違いによる試験結果への影響
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと９ｍｇ／ディスクおよび１０ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、ディスクの中心間の距離を２．０ｃｍ、１．５ｃｍ、および１．０ｃｍとし、加えてディスク同士を接触させた試験を実施した。なお、その他の条件は［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００４９】
【表５】
【００５０】
表５に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの中心間の距離を２．０ｃｍとしてもメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であったが、その距離を１．５ｃｍ以下にすることによりメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の明瞭な判別が行なえるようになった。
【００５１】
［実施例５］種々のβ−ラクタム薬含浸ディスクを用いた検討
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＥＫＮ７１７３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ビアペネム（ＢＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、パニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、セフブペラゾン（ＣＢＰＺ：７５μｇ力価／ディスク）、セフメタゾール（ＣＭＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフミノクス（ＣＭＮＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォキシチン（ＣＦＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォタキシム（ＣＴＸ：３０μｇ力価／ディスク）、およびセフェピム（ＣＦＰＭ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと１２ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００５２】
【表６】
【００５３】
表６に示す結果より、多くのβ−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせることにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００５４】
２．β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた試験
［実施例６］β−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
【００５５】
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離してβ−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを置いた。
【００５６】
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の大きさとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの阻止円の大きさの違いを観察した。
【００５７】
β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを比較することにより、図２に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００５８】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）を用いた。
【００５９】
β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ビアペネム（ＢＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、パニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、セフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォタキシム（ＣＴＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフブペラゾン（ＣＢＰＺ：７５μｇ力価／ディスク）、セフミノクス（ＣＭＮＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォキシチン（ＣＦＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフメタゾール（ＣＭＺ：３０μｇ力価／ディスク）、およびセフェピム（ＣＦＰＭ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。
【００６０】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体として、Ｃａ−ＥＤＴＡおよびＭｇ−ＥＤＴＡを用い、各々１２ｍｇ／ディスクとなるようにβ−ラクタム薬含浸ディスクに添加した。
【００６１】
【表７】
【００６２】
表７に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの阻止円の大きさを比較することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。
【００６３】
３．β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べた試験
［実施例７］金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
【００６４】
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離して二枚のβ−ラクタム薬含浸ディスクを置き、その中の一枚のディスクの中心から１．５ｃｍ離して金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを置いた。
【００６５】
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の形状およびβ−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べた場合の阻止円の形状の違いを観察した。
【００６６】
具体的には、β−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円が、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べることにより、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクの中心を繋いだ軸方向に対して垂直方向に拡大するかを確認した。
【００６７】
β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べることにより、図１に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００６８】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ９１５６）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（ＥＫＮ９９９５）を用い、β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。
【００６９】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＣａ−ＥＤＴＡを用い、ディスクに１２ｍｇのＣａ−ＥＤＴＡおよび１ｍｇのメルカプト酢酸ナトリウムを含浸させて試験に用いた。なお、各々Ｃａ−ＥＤＴＡおよびメルカプト酢酸ナトリウムを単独で含浸したディスクも準備し、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
【００７０】
【表８】
【００７１】
表８に示す結果より、Ｃａ−ＥＤＴＡ含浸ディスクまたはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを用いてもメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であったが、両者を混合してディスクに含浸することによりメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の明瞭な判別が行なえるようになった。
【００７２】
４．β−ラクタム薬含有平板培地を用いた試験
［実施例８］金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地およびイミペネム（ＩＰＭ：５０μｇ力価／ｍＬ）含有ミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
次に、各々の平板培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（１０μｇ／ディスク）含浸ディスクを置いた。
【００７３】
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の平板培地に置いたＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの阻止円を計測し、その大きさに変化が認められたものを＋、変化が認められなかったものを−と判定した。
【００７４】
被検菌として、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）並びにメタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いた。
【００７５】
その結果、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌は全て＋となり、メタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌は全て−となった。これらと表１および表２が同じ結果を示していることより、β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置いて培養後の阻止円の大きさを観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。
【００７６】
５．金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地を用いた試験
［実施例９］β−ラクタム薬含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地および金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（１００μｇ／ｍＬ）含有ミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
次に、各々の平板培地上にイミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを置いた。
【００７７】
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の平板培地に置いたβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円を計測し、５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、ミュラーヒントン寒天培地においてβ−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、Ｍｇ−ＥＤＴＡ含有ミュラーヒントン寒天培地において１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。
【００７８】
被検菌として、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）並びにメタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いた。
【００７９】
【表９】
【００８０】
表９と表１および表２が同等の結果を示していることより、金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置いて培養後の阻止円の大きさを観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。
【００８１】
６．微量液体希釈法を用いた試験
［実施例１０］金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
ミュラーヒントンブロス培地並びに金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（５００μｇ／ｍＬ）およびＣａ−ＥＤＴＡ（５００μｇ／ｍＬ）含有ミュラーヒントンブロス培地を用いてイミペネム（ＩＰＭ）の希釈系列を作製した。
次に、各々の希釈系列のウェルに最終接種菌液量が約５×１０４ＣＦＵ／ウェルとなるように被検菌を接種した。
【００８２】
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の希釈系列での被検菌の増殖よりＭＩＣ値を求め、金属−ＥＤＴＡキレート錯体の有無により３管以上のＭＩＣ値の低下が認められたものを＋、認められなかったものを−と判定した。
【００８３】
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）を用いた。
【００８４】
【表１０】
【００８５】
表１０と表１が同等の結果を示していることより、β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
従来、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別に、β−ラクタム薬と有機チオール化合物であるメルカプト酢酸ナトリウムを組み合わせて、被検菌の発育抑制効果の変化の有無が用いられてきた。
【００８７】
しかしながら、メタロ−β−ラクタマーゼの遺伝子型の中で、メルカプト酢酸ナトリウムを用いてもそのβ−ラクタマーゼ活性が抑制されないＮＤＭ−１と呼ばれる遺伝子型のメタロ−β−ラクタマーゼを発現する細菌が検出されるようになった。
【００８８】
すなわち、従来の方法ではメタロ−β−ラクタマーゼを産生している菌の全てを検出できないこととなった。その結果、医療行為を行なう上で、治療薬としての抗菌薬の選択に支障を来たす虞が生じている。
【００８９】
そこで、本願発明の技術を用いることにより、より広範囲のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別することが出来るようになり、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌による感染症を治療する上で有用な情報を得ることが可能となり、早期に治療薬としての抗菌薬を選択出来、感染症の治癒に寄与する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項２】
平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項３】
平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスク並びにβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項４】
β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項５】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項６】
β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項７】
前記β−ラクタム薬がカルバペネム系薬剤、セファマイシン系薬剤、およびセファロスポリン系薬剤から選ばれる１以上の薬剤である請求項１〜６記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項８】
前記カルバペネム系薬剤がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である請求項１〜７記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項９】
前記セファマイシン系薬剤がセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である請求項１〜７記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１０】
前記セファロスポリン系薬剤がセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である請求項１〜７記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１１】
前記金属−ＥＤＴＡキレート錯体がＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡから選ばれる少なくとも１以上の化合物である請求項１〜１０記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１２】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体にさらに有機チオール化合物を添加する請求項１〜１１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１３】
前記有機チオール化合物がメルカプト酢酸ナトリウムである請求項１〜１２記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１４】
β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含む、請求項１〜請求項１１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
【請求項１５】
β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体および有機チオール化合物を含む、請求項１２〜請求項１３記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
【請求項１】
β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項２】
平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項３】
平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスク並びにβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項４】
β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項５】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項６】
β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することによる請求項１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項７】
前記β−ラクタム薬がカルバペネム系薬剤、セファマイシン系薬剤、およびセファロスポリン系薬剤から選ばれる１以上の薬剤である請求項１〜６記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項８】
前記カルバペネム系薬剤がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である請求項１〜７記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項９】
前記セファマイシン系薬剤がセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である請求項１〜７記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１０】
前記セファロスポリン系薬剤がセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である請求項１〜７記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１１】
前記金属−ＥＤＴＡキレート錯体がＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡから選ばれる少なくとも１以上の化合物である請求項１〜１０記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１２】
金属−ＥＤＴＡキレート錯体にさらに有機チオール化合物を添加する請求項１〜１１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１３】
前記有機チオール化合物がメルカプト酢酸ナトリウムである請求項１〜１２記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
【請求項１４】
β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含む、請求項１〜請求項１１記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
【請求項１５】
β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体および有機チオール化合物を含む、請求項１２〜請求項１３記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１３−７４８８５（Ｐ２０１３−７４８８５Ａ）
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９９０５２（Ｐ２０１２−１９９０５２）
【出願日】平成２４年９月１１日（２０１２．９．１１）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月１１日（２０１２．９．１１）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
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