メチロトローフ酵母における蛋白質グリコシル化の修飾
本発明は、哺乳類様のグリコシル化を伴う糖蛋白質を生じさせるための方法及び遺伝子操作されたメチロトローフ酵母に関する。本発明は、哺乳類様のグリコシル化を伴う糖蛋白質を生じさせることができるメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクターにも関する。遺伝子操作されたメチロトローフ酵母から生成した糖蛋白質も提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳類様グリコシル化により糖蛋白質を生産するための方法及び操作されたメチロトローフ酵母株に関する。本発明は、哺乳類様グリコシル化により糖蛋白質を生産することができるメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクターにも関する。遺伝子工学によるメチロトローフ酵母株から生産された糖蛋白質も提供される。
発明の背景
ピキアパストリスを含むメチロトローフ酵母は、商業上又は医学上重要な組換え蛋白質の生産のために広く使用されてきた。しかしながら、幾つかの治療用糖蛋白質の生産及び医学上の応用は、これらの酵母と標的生物、例えば哺乳類又はヒト被験者の間の蛋白質結合糖質の生合成の違いにより妨げられ得る。
【０００２】
蛋白質のＮ−グリコシル化は細胞質網状構造（ＥＲ）を起源とし、そこでは、ドリコール（脂質キャリアー中間体）上で集合したＮ結合オリゴサッカライド（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が隣の蛋白質の適当なＡｓｎに転移される。これは、全ての真核生物のＮ−結合糖蛋白質に共通の事象である。３つのグルコース残基と一つの特定のα−１，２−結合マンノース残基がＥＲ中の特異的グルコシダーゼと一つの１，２−マンノシダーゼにより除去されて、コアのオリゴサッカライド構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をもたらす。このコアの糖構造を有する蛋白質はゴルジ体に運ばれて、そこで、糖部分が様々な修飾を受ける。酵母と高度真核生物の間ではゴルジ体内の糖鎖の修飾に顕著な違いがある。
【０００３】
哺乳類細胞においては、糖鎖の修飾は３つの異なる経路により進行し、それが添加される蛋白質部分に依存する。即ち、（１）コアの糖鎖は変化しない；（２）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェート部分（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）のコア糖鎖中のマンノースの６位への添加によりコアの糖鎖が変化し、続いてＧｌｃＮＡｃ部分の除去による糖蛋白質中の酸性糖鎖の形成する；又は（３）マンノシダーゼＩによる３マンノース残基の除去の結果としてコア糖鎖が最初にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換されて；そしてＧｌｃＮＡｃの添加及び２つのさらなるマンノース残基の除去、続くＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（Ｇａｌ）、及びＮ−アセチルノイラミニ酸（シアル酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれる）の連続添加により様々なハイブリッド又は複合体糖鎖を形成することにより、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がさらに修飾される（Ｒ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４，１９８５；Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−２６３０４，１９９８）。
【０００４】
酵母においては、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは削られない（not trimmed）。ゴルジ体内の糖鎖の修飾は、別々のマンノシルトランスフェラーゼによるマンノース残基の一連の添加（「外部鎖」グリコシル化）を含む。外部鎖グリコシル化の構造は生物に特異的であって、典型的にはサッカロミセスセレビシエにおいて５０を超えるマンノース残基を伴い、そしてもっとも共通にはピキアパストリスにおいてＭａｎ１４ＧｌｃＮＡｃ２より小さな構造を伴う。高いマンノース種のこの酵母特異的外部鎖グリコシル化は、高グリコシル化又は高マンノース化とも呼ばれる。
【０００５】
グリコシル化は、蛋白質のフォールディング、安定性及び生物活性を修正するのに非常に重要である。ヒト体内において、グリコシル化は、蛋白質の薬力学特性、例えば組織分配及び血流からの浄化に、一部必須である。さらに、グリカン構造は、抗原応答に関与し得る。例えば、α−ガラクトースの糖蛋白質上の存在はブタからの異種移植に対する免疫反応に関する主要な理由である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，３（６）：６５０−６５８，１９９９）が、酵母に対する糖蛋白質に対する免疫反応は、主に、α−１，３−マンノース、β結合マンノース及び／又はホスホモノ−又はホスホジエステル結合の何れかの上のリン酸残基の存在による（Ｂａｌｌｏｕ，Ｃ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８５：４４０−４７０，１９９０；Ｙｉｐ ｅｔ ｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１（７）：２７２３−２７２７，１９９４）。
【０００６】
高グリコシル化はしばしば望まれないが、何故ならば、糖質組成及び分子量の両方において組換え蛋白質生成物の不均質性を導き、蛋白質の精製を複雑にし得るからである。高グリコシル化された酵素の比活性（ユニット／質量）は、糖質の増加した部分により低下し得る。さらに、外部の鎖のグリコシル化はしばしば免疫原性が強く、治療への応用においては望まれないかもしれない。さらに、大きな外部の鎖状の糖（chain sugar）は治療用蛋白質の免疫原決定基を遮断し得る。例えば、ピキアパストリスにおいて発現されたインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）は３０−４０までのマンノース残基を含むＮ−グリカンによりグリコシル化される。高グリコシル化されたＮＡは、ＮＡ分子の上部の可変性の免疫支配性表面ループがＮ−グリカンにより遮断されるために、マウスにおいて免疫原性が低下する（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：３３２−３３８，１９９７）。
【０００７】
よって、哺乳類（例えば、ヒト）の糖質構造に似せた糖質構造を有する組換え糖蛋白質を生じるメチロトローフ酵母株を遺伝子操作することが望まれる。
発明の概要
本発明は、哺乳類様のＮ−グリカンを伴う糖蛋白質を生じさせるための、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株及び方法に向けられる。本発明は、哺乳類様のＮ−グリカンを伴う糖蛋白質を生じさせることができる遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクター及びキットにも向けられる。
【０００８】
本明細書の中で使用されている用語「メチロトローフ酵母」は、限定ではないが、メタノール上で生育可能な酵母株、例えば、属カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、及びピキアを含む。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、コアのマンノース構造及び末端ガラクトース残基に結合した５又はそれより少ないマンノース残基及び少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有することにより特徴付けされる、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生じる、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母を提供する。
【００１０】
好ましい態様において、本発明は、哺乳類様のＮ−グリカン構造、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を提供する。
【００１１】
本発明によれば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる上記メチロトローフ酵母株は、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するように遺伝子操作される。好ましくは、当該メチロトローフ酵母株は、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子が不活性化されるようにも遺伝子操作される。
【００１２】
遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株内での発現のためのα−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、あらゆる種の起源であることができ、マウス、ウサギ又はヒトのような哺乳類の種、及びアスペルギルス、又はトリコデルマリセイのような真菌を含む。本発明における使用のための好ましいα−１，２−マンノシダーゼは、トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼである。好ましくは、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、その基質であるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃが利用可能な分泌経路中の部位を標的化する。より好ましくは、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、ＥＲ滞留（retention）シグナルを含むように遺伝子操作されて、ＥＲを標的化する。好ましいＥＲ滞留シグナルは、ペプチドＨＤＥＬ（配列番号：１）である。
【００１３】
遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株における発現のためのＧｎＴＩ又はその機能部分は、あらゆる種の起源であることができ、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線虫及び原生動物、例えば、リーシュマニアタレントレを含む。本発明における使用のための好ましいＧｎＴＩは、ヒトＧｎＴＩであり、配列番号：１３に示される。好ましくは、ＧｎＴＩ又はその機能部分は、その基質であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が利用可能な分泌経路中の部位を標的化する。より好ましくは、ＧｎＴＩまたはその機能部分は、ゴルジ滞留シグナルを含むように遺伝子操作されて、ゴルジ体を標的化する。好ましいゴルジ滞留シグナルは、配列番号：１１に示されるペプチドであり、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２蛋白質の最初の１００アミノ酸からなる。
【００１４】
遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株における発現のためのＧａｌＴ又はその機能部分は、あらゆる種の起源であることができ、ヒト、植物（例えば、アラビドプシスサリアナ）、昆虫（例えば、ドロソフィラメラノガスター）を含む。本発明における使用のための好ましいＧａｌＴは、ヒトＧａｌＴであり、配列番号：２１に示される。好ましくは、ＧａｌＴ又はその機能部分は、ゴルジ滞留シグナルを含むように遺伝子操作されて、ゴルジ体を標的化する。好ましいゴルジ滞留シグナルは、配列番号：１１に示されるペプチドであり、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２蛋白質の最初の１００アミノ酸からなる。
【００１５】
メチロトローフ酵母株は、例えば、形質転換によりこれらの酵素をコードする株ヌクレオチド配列へ導入することにより上記の所望の酵素を発現するように遺伝子操作することができる。好ましくは、コーディング配列はベクター内に提供され、各配列は、酵母株中で機能するプロモーター配列及び３’ターミネーション配列に作動可能に連結されるように配置される。ベクター又はその直鎖状断片で、次に、株を形質転換する。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、上記メチロトローフ酵母株は、ＯＣＨ１遺伝子が破壊されるようにも遺伝子操作される。遺伝子の破壊は、ゲノミックＯＣＨ１配列とノックアウトベクター中のＯＣＨ１配列の間の相同組換えにより達成することができる。
【００１７】
さらなる側面において、本発明は、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質生じるメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクターを提供する。
一つの態様において、本発明は、発現される酵素、即ち、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ，ＧａｌＴ，又はこれらの蛋白質の何れかの機能部分をコードするヌクレオチド配列を含む「ノックイン」ベクターを提供する。コーディング配列は、コードされた蛋白質の発現のためにメチロトローフ酵母中で機能するプロモーター配列及び３’ターミネーション配列に作動可能に連結されるように配置される。２つ又はそれより多いコーディング配列をメチロトローフ酵母株へ同時形質転換するために同じベクター中に入れることができる。好ましくは、当該ベクターは、形質転換体の便利な選択のための選択可能なマーカー遺伝子も含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、メチロトローフ酵母株に導入されたときにゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するか又は破壊する不活性化ベクター（又は「ノックアウト」ベクター）を提供する。
【００１９】
ＯＣＨ１ノックアウトベクターは選択可能なマーカーを含むことができ、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子との二重相同組換えを媒介するのに十分な長さのＯＣＨ１配列に対して両５’及び３’末端にて作動可能に連結する。或いは、ＯＣＨ１不活性化ベクターは、破壊されるＯＣＨ１遺伝子の一部を含むことができ、その部分はＯＣＨ１蛋白質を一切コードしないか又はＯＣＨ１蛋白質の不活性断片をコードし、そして選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。ＯＣＨ１部分は、何れかの公知のプロモーター配列に対して作動可能な連結はされず、そして上記ベクターの直鎖状断片の形質転換に際して、１回の相同組換えによりゲノミックＯＣＨ１座に組み込まれる。好ましくは、一つ又はそれより多い不活性化変異、例えば停止コドン又はフレームシフト変異も、ベクター中のＯＣＨ１配列内に導入されることにより、何れかの可能性のある活性ＯＣＨ１ポリペプチドの生産を阻止する。
【００２０】
さらに別の側面において、本発明は、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質の生成方法を提供する。目的の糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、哺乳類様Ｎ−グリカンを生じさせるように遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株に導入することができる。或いは、目的の糖蛋白質を発現するメチロトローフ酵母株を修飾することにより、
所望の酵素（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧａｌＴ）を発現させ、そしてゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化することができ、それにより、哺乳類様Ｎ−グリカンを伴う糖蛋白質を生成する。
【００２１】
また別の側面において、本発明の方法を用いることにより生成された糖蛋白質、即ち、哺乳類様のＮ−グリカン、特にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖蛋白質が、本発明により提供される。
【００２２】
さらなる側面において、本発明は、本発明の一つ又はそれより多いベクター、又は本発明の遺伝子操作された一つ又はそれより多い株を含むキットを提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類様又はヒト様Ｎ−グリコシル化を伴う組換え糖蛋白質を作成するための、方法、ベクター及び遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株に向けられる。
【００２３】
「哺乳類」は、哺乳類のあらゆる種、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ等を含むことを意味する。
典型的には複雑な種類の哺乳類のグリカン、例えば、ヒトにおいて生じたグリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の内部コア構造に結合したシアリル−Ｎ−アセチル−ラクトサミン配列を伴う２から６の外部ブランチを有する。哺乳類のＮ−グリカンは、ＥＲ中で形成されるコアオリゴサッカライド構造であるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に由来する。このコアの糖構造を有する蛋白質はゴルジ体に輸送されて、そこで、ゴルジ体マンノシダーゼＩ（ゴルジ体α−１，２−マンノシダーゼ）により３つのマンノース残基を除去した結果として、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換される。蛋白質がゴルジ体を通して加工されるにつれ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、さらに、ＧｌｃＮＡｃの追加と２つのさらなるマンノース残基の除去、次に、ＧｌｃＮＡｃ，ガラクトース（Ｇａｌ）及びシアル酸（ＳＡ）残基の追加により、修飾される。
【００２４】
本明細書にて使用される用語「哺乳類様Ｎ−グリコシル化」は、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株内で生成された糖蛋白質のＮ−グリカンが、５つ又はそれ未満のマンノース残基を含み、そして哺乳類細胞、例えばヒト細胞において生じた蛋白質のＮ−グリカンの生合成におけるＮ−グリカン又は中間体糖質構造の特徴を有することを意味する。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株において生成された糖蛋白質は、５つ又はそれ未満のマンノース残基、及びマンノース残基を含むコア構造及びターミナルガラクトース残基に結合した少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。例えば、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株内で生成された糖蛋白質は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有し、図１に描写されるとおりである。この糖質（ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）のＩＵＰＡＣの命名は、Ｇａｌ（β−１，４）ＧｌｃＮａｃ（β−１，２）Ｍａｎ（α−１，３）｛Ｍａｎ（α−１，３）［Ｍａｎ（α−１，６）］Ｍａｎ（α−１，６）｝Ｍａｎ（β−１，４）ＧｌｃＮａｃ（β−１，４）ＧｌｃＮａｃである。その拡大された命名は、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−｛α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−［α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→６）］−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→６）｝−β−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→４）−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃである。
【００２６】
ピキア、特にピキアパストリスを含むメチロトローフ酵母の細胞質網状構造（ＥＲ）を通り過ぎる糖蛋白質上のＮ−グリカンの大多数は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２オリゴサッカライド構造を有する。糖蛋白質がＥＲからゴルジ体に輸送された後は、追加のマンノース残基が別のマンノシルトランスフェラーゼによりこのコア糖部分に追加されて、高マンノースコア又は延長されて分枝したマンナン外部鎖からなるオリゴサッカライド構造を有する糖蛋白質をもたらす。
【００２７】
本発明によれば、哺乳類様グリコシル化を伴う組換え糖蛋白質を生成するためには、メチロトローフ酵母を修飾することにより、一連の工程において糖質構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を哺乳類様Ｎ−グリカンに変換する酵素を発現させる。好ましくは、メチロトローフ酵母は、高マンノース構造の生産に関与する一つ又はそれより多い酵素、例えばＯＣＨ１遺伝子によりコードされるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの発現を不活性化するようにも修飾される。
【００２８】
本明細書において使用される用語「メチロトローフ酵母」は、限定ではないが、メタノール上で生育できる酵母株、例えば、属カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、及びピキアを含む。本発明の好ましいメチロトローフ酵母は、属ピキアの株である。特に好ましいのは、ピキアパストリス株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１），ＧＳ１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４），ＰＰＦ１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７），ＰＰＹ１２０Ｈ，ＹＧＣ４，及びそれらに由来する株である。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、コアのマンノース含有構造及びターミナルガラクトース残基に結合した５つ又はそれ未満のマンノース残基及び少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有する特徴を有する、哺乳類様Ｎ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生成する遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を提供する。
【００３０】
好ましい態様において、本発明は、哺乳類様Ｎ−グリカン構造、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を提供する。
【００３１】
本発明によれば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる上記のメチロトローフ酵母株は、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するように遺伝子操作される。好ましくは、当該メチロトローフ酵母株は、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子が不活性化されるようにも遺伝子操作される。
【００３２】
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の非還元末端においてα−１，２−結合したマンノース残基を分断し、そして糖蛋白質上のこのコアのオリゴサッカライドをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換し、これは哺乳類Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのアクセプター基質である。
【００３３】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株を操作して、当該株に、例えば形質転換により、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を導入することにより、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を発現することができる。α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列は、如何なる種に由来することもできる。多数のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子がクローン化されて、当業者には利用可能であり、例えば、マウスのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９８６４−９８７１，１９９４）、ウサギのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９−８７２−９８８１，１９９４）又はヒトα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８：５８５−５９５，１９９８）をコードする哺乳類遺伝子、並びに、例えば、アスペルギルスα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（ｍｓｄＳ遺伝子）、又はトリコデルマリセイα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５５−２６３，２０００）を含む真菌遺伝子を含む。蛋白質の配列分析が、これまでに同定された真核生物α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の間の高度の保存を明らかにした。
【００３４】
好ましくは、本ベクターにおける使用のためのヌクレオチド配列は、真菌のα−１，２−マンノシダーゼ、より好ましくは、トリコデルマリセイα−１，２−マンノシダーゼ、そしてより特定すれば、Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５５−６３（２０００）に記載されたトリコデルマリセイα−１，２−マンノシダーゼをコードする。
【００３５】
「機能部分」は、完全長蛋白質の酵素活性を実質上保持したα−１，２−マンノシダーゼのポリペプチド断片を意味する。「実質上」は、完全長α−１，２−マンノシダーゼの酵素活性の少なくとも約４０％、又は好ましくは少なくとも５０％またはそれ以上が保持されることを意味する。多数のα−１，２−マンノシダーゼの、触媒ドメインを含む様々なドメインの特性決定は、記録されている。例えば、”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ Ｇｏｌｇｉ ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｃＤＮＡ， ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｍａｍｍａｌｌｓ”，Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１３ ９８６４−７１（１９９４）；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｌｐｈａ １，２−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ”，Ｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１３ ９８７２−８１（１９９４）；”Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｓ １，２−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ”，Ｍａｒａｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７７：２５５−６３（２０００）；及び米国特許出願２００２０１８８１０９を参照されたく、引用により本明細書に編入される。当業者は、当業界で公知の技術の組み合わせを用いることによりα−１，２−マンノシダーゼの機能部分を容易に同定して作成することができる。適切な発現系から発現されて精製された目的のα−１，２−マンノシダーゼの一部の活性は、引用により本明細書に編入される米国特許出願２００２０１８８１０９に記載されたインビトロ又はインビボアッセイを用いることにより確認することができる。
【００３６】
本発明によれば、メチロトローフ酵母内で発現されたα−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、好ましくは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（α−１，２−マンノシダーゼの基質）が糖蛋白質上で既に形成されているが、追加のマンノース残基により糖鎖を伸長するゴルジ体のグリコシルトランスフェラーゼには到達していない分泌経路中の部位を標的化する。本発明の好ましい態様において、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、α−１，２−マンノシダーゼがメチロトローフ酵母株内で発現されてＥＲを標的化するように、ＥＲ滞留シグナルを含むように操作される。
【００３７】
「ＥＲ滞留シグナル」は、ＥＲに輸送されてＥＲ中で滞留するようにペプチド配列を有する蛋白質を指示するペプチド配列を意味する。そのようなＥＲ滞留配列は、しばしば、ＥＲ中に存在して機能する蛋白質の中に見いだされる。ＥＲ滞留シグナルの複数の選択が当業者に利用可能であり、例えば、サッカロミセスセレビシエのＥＲ蛋白質のＭＮＳ１の最初の２１アミノ酸残基（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０：１１７１−１１７７，１９９８）及びペプチドＨＤＥＬ（配列番号：１）である。
【００３８】
本発明における使用のための好ましいＥＲ滞留シグナルは、ペプチドＨＤＥＬ（配列番号：１）である。ＨＤＥＬペプチド配列は、多数の酵母蛋白質のＣ−末端に見いだされ、ＥＲのための滞留／修正（retrieval）シグナルとして作用する（Ｐｅｌｈａｍ ＥＭＢＯ Ｊ．７：９１３−９１８，１９８８）。ＨＤＥＬ配列を有する蛋白質は、膜結合受容体（Ｅｒｄ２ｐ）により結合して、次に、ゴルジ体からＥＲに戻るための逆行（retrograde）輸送経路に入る。
【００３９】
本発明における使用のためのα−１，２−マンノシダーゼは、さらに、例えば、抗体が利用可能なエピトープタグを含むように操作することができ、例えば、当業界でよく知られているＭｙｃ，ＨＡ，ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６タグである。エピトープタグを付加されたα−１，２−マンノシダーゼは、発現及び細胞外局在化の両方のために便利に精製、又は監視され得る。
【００４０】
本発明によれば、ＥＲ滞留シグナルを、α−１，２−マンノシダーゼの蛋白質配列のどこか、しかし好ましくはα−１，２−マンノシダーゼのＣ末端において、遺伝子操作することにより配置することができる。
【００４１】
ＥＲ滞留シグナル及びエピトープタグは、当業界公知の分子生物学の技術の何れかを用いて、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列に、そのようなシグナル又はタグをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分に容易に挿入することができる。
【００４２】
操作された酵母株内でのα−１，２−マンノシダーゼの発現は、ｍＲＮＡレベルにおいては例えばノーザンブロット分析により、そして蛋白質レベルにおいてはウエスタンブロット分析により確認することができる。蛋白質の細胞内局在は様々な技術を用いることにより分析することができ、細胞成分分画（subcellular fractionation）及び免疫蛍光の実験を含む。α−１，２−マンノシダーゼもＥＲ中での局在は、細胞成分分画実験においてこの酵素と公知のＥＲ滞留蛋白質（例えば、プロテインジスルフィドイソメラーゼ）との共沈殿により決定することができる。ＥＲ中の局在は、ＥＲ滞留蛋白質の免疫蛍光染色パターン特性、典型的には核周囲染色パターンにより、決定することもできる。
【００４３】
メチロトローフ酵母株中で発現されたα−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分が期待されたマンノーストリミング活性を有することを確認するために、インビトロ及びインビボ両方のアッセイを用いることができる。典型的には、インビトロアッセイは、インビトロで合成された基質、例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の免疫酵母株で発現されて精製された酵素による消化、及びそのような酵素がＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を例えばＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に削る能力を評価することを含む。インビボアッセイにおいては、α−１，２−マンノシダーゼ又はその一部をメチロトローフ酵母内で、そのような酵母内でＮ−グリカンを生じるターミナルα−１，２−結合したマンノース残基によりグリコシル化されることが知られている糖蛋白質と同時発現させる。そのようなα−１，２−マンノシダーゼ又はその一部の酵素活性は、糖蛋白質のＮ−グリカンの構造中のα−１，２−結合したマンノース残基の数の低下に基づいて測定することができる。インビトロ及びインビボの両アッセイにおいて、糖質基の組成は、当業界でよく知られており且つ本明細書の以下の実施例において例示される技術を用いて測定することができる。
【００４４】
さらに、本発明によれば、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列をマンノース酵母株に、例えば形質転換により導入することにより、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ又はその機能部分を発現するようにマンノース酵母株を操作することができる。ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩはβ−１，２−ＧｌｃＮＡｃのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への付加に必須であり、糖蛋白質上のこのコアオリゴサッカライドをＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へ変換する。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のマンノース残基は哺乳類ゴルジ体マンノシダーゼＩＩによりさらに削られて、追加の糖ユニット、例えばガラクトースが哺乳類糖蛋白質のハイブリッド−又はコンプレックス−タイプの糖ブランチ特性を形成するために（towards）追加される。
【００４５】
メチロトローフ酵母株への導入のためのＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列は、あらゆる種、例えば、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線虫及び原生動物、例えばリーシュマニアタレントレを含む。好ましくは、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、ヒトＧｎＴＩであり、そしてより好ましくは配列番号：１３に示されるヒトＧｎＴＩである。
【００４６】
ＧｎＴＩの「機能部分」は、完全長のＧｎＴＩの酵素活性を実質上保持するＧｎＴＩのポリペプチド断片を意味する。「実質上」は、少なくとも約４０％、又は好ましくは少なくとも約５０％またはそれ以上の完全長のＧｎＴＩの酵素活性が保持されることを意味する。ＧｎＴＩ又はその一部の酵素活性は、Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９（２１）：１３４１９−２４，２００２）；Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９（３）：７０１−７，１９９７），又は本明細書中の以下の実施例に記載されるアッセイにより測定することができる。当業者は、当業界で公知の技術の組み合わせを用いてＧｎＴＩの機能部分を容易に同定して作成することができる。例えば、本発明により例示されるとおり、ヒトＧｎＴＩの触媒ドメイン（最後の３２７残基を含む）はヒトＧｎＴＩの「機能部分」を構成する。
【００４７】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株において発現されたＧｎＴＩ又はその機能部分は、好ましくは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｎＴＩの基質）が糖蛋白質上に既に形成された分泌経路中の部位を標的化する。好ましくは、ＧｎＴＩ又はその機能部分はゴルジ体を標的化する。
【００４８】
従って、本発明の好ましい態様においては、ＧｎＴＩ又はその機能部分がゴルジ体局在化シグナルを含むように操作される。
本明細書において使用される「ゴルジ体局在化シグナル」は、ペプチド配列であって、そのような配列を有する蛋白質をメチロトローフ酵母株のゴルジ体に振り向け（directs）、そして当該蛋白質をその中に保持するペプチド配列を意味する。そのようなゴルジ体局在化配列は、ゴルジ体に存在して機能する蛋白質中にしばしば見いだされる。
【００４９】
ゴルジ体局在化シグナルの選択は、当業者に利用可能である。本発明における使用のための好ましいゴルジ体局在化シグナルは、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２蛋白質（ＳｃＫｒｅ２）のＮ末端部分に由来するペプチド；より好ましくは配列番号：１０に示されるＳｃＫｒｅ２である。特に好ましいゴルジ体局在化シグナルは、配列番号：１０に示されるＳｃＫｒｅ２蛋白質のアミノ酸１−１００からなる、ペプチド（配列番号：１１）である。
【００５０】
本発明によれば、ゴルジ体局在化シグナルは、ＧｎＴＩ内の如何なる場所に配置されてもよいが、好ましくはＧｎＴＩの末端、そしてより好ましくはＧｎＴＩのＮ末端に配置され得る。
【００５１】
本発明における使用のためのＧｎＴＩは、例えば、抗体が利用可能なエピトープタグ、例えば、当業界でよく知られているＭｙｃ，ＨＡ，ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６を含むようにさらに操作され得る。エピトープタグを付加されたＧｎＴＩは便利に精製されるか、又は発現及び細胞内局在に関して監視され得る。
【００５２】
ゴルジ体局在化シグナル及びエピトープタグは、当業界公知の分子生物学の技術の何れかを用いて、ＧｎＴＩ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列に、そのようなシグナル又はタグをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、ＧｎＴＩ又はその機能部分に容易に挿入することができる。
【００５３】
さらに、本発明によれば、メチロトローフ酵母株をβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列をマンノース酵母株に、典型的には形質転換により導入することにより、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するようにマンノース酵母株を操作することができる。ＧａｌＴはβ−１，４−ガラクトース残基をグリカン構造（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）の左のアーム上のＧｌｃＮＡｃへの付加し、図１に描写されるとおりである。
【００５４】
メチロトローフ酵母株への導入のためのＧａｌＴ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列は、あらゆる種、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、マウス）、植物（例えば、アラビドプシスサリアナ）、昆虫（例えば、ドロソフィラメラノガスター）、又は線虫（シーノラブディティスエレガンス）に由来することができる。好ましくは、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、ヒトＧａｌＴ、そしてより好ましくは配列番号：２１に示されたヒトＧａｌＴをコードする。
【００５５】
ＧａｌＴの「機能部分」は、完全長のＧａｌＴの酵素活性を実質上保持するＧａｌＴのポリペプチド断片を意味する。「実質上」は、少なくとも約４０％、又は好ましくは少なくとも約５０％またはそれ以上の完全長のＧａｌＴの酵素活性が保持されることを意味する。ＧａｌＴ又はその一部の酵素活性は、Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９（３）：７０１−７，１９９７），又は本明細書中の以下の実施例に記載されるアッセイにより測定することができる。当業者は、当業界で公知の技術の組み合わせを用いてＧａｌＴの機能部分を容易に同定して作成することができる。例えば、本発明により例示されるとおり、ヒトＧａｌＴの触媒ドメインはヒトＧａｌＴの「機能部分」を構成する。
【００５６】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株において発現されたＧａｌＴ又はその機能部分は、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｌｃＮＡｃＭの基質）が糖蛋白質上に既に形成された分泌経路中の部位を標的化する。好ましくは、ＧａｌＴ又はその機能部分はゴルジ体を標的化する。
【００５７】
従って、本発明の好ましい態様において、ＧａｌＴ又はその機能部分は、上で記載されたとおり、ゴルジ体局在化シグナルを含むように操作される。ＧａｌＴをゴルジ体に標的化するための好ましいゴルジ体局在化シグナルは、配列番号：１０に示されるＳｃＫｒｅ２蛋白質のアミノ酸１−１００からなる、ペプチド（配列番号：１１）である。
【００５８】
本発明における使用のためのＧａｌＴは、例えば、抗体が利用可能なエピトープタグ、例えば、当業界でよく知られているＭｙｃ，ＨＡ，ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６を含むようにさらに操作され得る。エピトープタグを付加されたＧａｌＴは便利に精製されるか、又は発現及び細胞内局在に関して監視され得る。
【００５９】
ゴルジ体局在化シグナル及びエピトープタグは、当業界公知の分子生物学の技術の何れかを用いて、ＧａｌＴ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列に、そのようなシグナル又はタグをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、ＧａｌＴ又はその機能部分に容易に挿入することができる。
【００６０】
メチロトローフ酵母株内での所望の蛋白質（即ち、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ，ＧａｌＴ，又はこれらの酵素の何れかの機能部分）の発現を達成するためには、当該蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、上記メチロトローフ酵母株内で機能するプロモーター及び３’終結配列に作動可能なような連結にてベクター内に配置させることができる。当該ベクターを、次に、メチロトローフ酵母株へ、例えば、形質転換により導入する。
【００６１】
メチロトローフ酵母内で蛋白質の発現に適したプロモーターは、構成的プロモーター及び誘導可能なプロモーターの両方を含む。構成的プロモーターは、例えば、ピキアパストリスのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター（「ＧＡＰプロモーター」）を含む。誘導可能なプロモーターの例は、例えば、ピキアパストリスの「アルコールオキシダーゼＩプロモーター（「ＡＯＸプロモーター」）（米国特許第４，８５５，２３１号）、又はピキアパストリスのホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（「ＦＬＤプロモーター」）（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２１６：９３−１０２，１９９８）を含む。
【００６２】
３’終結配列は、当該配列が作動可能に連結した遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化するために機能する構造遺伝子の停止コドンの３’の配列であり、例えば、ポリアデニル化を導く配列である。３’終結配列は、ピキア又はメチロトローフ酵母から得ることができる。本発明の実施に有用なピキアパストリスの３’終結配列の例は、ＡＯＸ１遺伝子及びＨＩＳ４の遺伝子由来の終結配列を含む。
【００６３】
ベクター又はその直鎖状断片の形質転換は、あらゆる公知の方法、例えば、Ｃｒｅｇｇ ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１２）：３３７６−８５，１９８５）により記載されたようなスフェロプラスト技術、又はＥＰ３１２，９３４に記載されたピキアにおける使用のために修飾された、Ｉｔｏら（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４８（２）：３４１，（１９８４））により記載された全細胞塩化リチウム酵母形質転換系を用いて実施することができる。形質転換に有用な他の方法は、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９（１９７８））；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３（１９８３））；米国特許第４，８７９，２３１号；及びＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ５９：１１５（１９８７））に記載された方法を含む。エレクトロポレーション及びＰＥＧ１０００全細胞形質転換手法を使用することもできる。Ｃｒｅｇｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．２７−３９（１９９８）を参照。
【００６４】
形質転換された酵母細胞は、限定ではないが、（細胞の栄養要求性のために）必要とされる生化学生成物の不在下での形質転換後に栄養要求性細胞を培養すること、新規な表現型の選択及び検出、又は形質転換体内に含まれる耐性遺伝子の不在下で当該酵母に毒性の抗生物質の存在下で培養することを含む、適切な技術を用いることにより選択することができる。形質転換体はゲノム中の発現カセットの組み込みにより選択及び／又は確認することもでき、例えばサザンブロット又はＰＣＲ分析により評価することができる。
【００６５】
上で記載されたとおり、α−１，２−マンノシダーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、又はその機能部分の発現に加えて、上記メチロトローフ酵母株は、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを有する糖蛋白質を有効に生成するためにゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するように遺伝子操作もされる。
【００６６】
ＯＣＨ１遺伝子は、初期ゴルジ体複合体内に局在化してＮ−結合コアオリゴサッカライド（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）へのα−１，６−ポリマンノース外部鎖付加を開始する膜結合性α−１，１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。サッカロミセスセレビシエのＯＣＨ１遺伝子及びピキアのＯＣＨ１遺伝子はクローン化されている（それぞれ、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２５１１−１９，１９９２、及び日本特許出願番号０７１４５００５）。当業者は、当業界で公知の技術を用いることにより、他のメチロトローフ酵母からＯＣＨ１遺伝子を単離することができる。
【００６７】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株のＯＣＨ１遺伝子の破壊は不活性蛋白質産物の生成か又は生成物なしの何れかをもたらし得る。当該破壊は、外来ＤＮＡ配列の上記コーディング配列への挿入の形態及び／又は当該コーディング配列の幾つか又は全ての欠失の形態を採ってよい。遺伝子破壊は、相同組換えにより生じさせることができ、本質的にはＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｖｏｌ １０１：２０２−２１１，１９８３）に記載される。
【００６８】
二重相同組換えによりゲノミックＯＣＨ１遺伝子を破壊するためには、ＯＣＨ１「ノックアウト」ベクターを構築することができ、それは相同組換えを媒介するのに十分な長さのＯＣＨ１遺伝子の一部に対してその５’及び３’末端の両方において作動可能に連結された選択可能なマーカー遺伝子を含む。当該選択可能マーカーは、宿主細胞栄養要求性を相補するか又は抗生物質耐性を提供するあらゆる数の遺伝子の一つであり得、ＵＲＡ３，ＡＲＧ４，ＨＩＳ４，ＡＤＥ１，ＬＥＵ２，ＨＩＳ３，Ｓｈ ｂｌｅ（ストレプトアロテイカスヒンダスタヌスのブレオマイシン遺伝子）及びＢＳＤ（アスペルギルステレウスからのブラスチシジンＳデアミナーゼ）遺伝子を含む。他の適切な選択可能マーカーは、メチロトローフ酵母の蔗糖上の生育を可能にさせるサッカロミセスセレビシエ由来のインベルターゼ遺伝子；活性βガラクトシダーゼの発現のために青いコロニーをもたらすｌａｃＺ遺伝子を含む。ＯＣＨ１不活性化ベクターの直鎖状ＤＮＡ断片は、その５’及び３’両末端においてＯＣＨ１配列と共に選択可能マーカーを含み、のちに、当業界で公知の形質転換方法の何れかを用いることにより宿主メチロトローフ酵母細胞内に導入される。直鎖状断片のゲノミックＯＣＨ１座への組み込み及びＯＣＨ１遺伝子の破壊は、選択可能マーカーに基づいて測定することができ、そして例えば、サザンブロット分析により確認することができる。
【００６９】
或いは、ＯＣＨ１遺伝子の一部を含み、但し当該一部はあらゆるＯＣＨ１プロモーター配列を欠き、そしてＯＣＨ１蛋白質を全くコードしないか又は不活性部分をコードする、ＯＣＨ１遺伝子ノックアウトベクターを構築することができる。「不活性断片」は、完全長ＯＣＨ１蛋白質の断片であって、当該断片が完全長のＯＣＨ１蛋白質の活性の、好ましくは約１０％未満、そしてより好ましくは約０％を有するものを意味する。ＯＣＨ１遺伝子のそのような部分は、メチロトローフ酵母において機能するあらゆるプロモーター配列に作動可能に連結されずにベクター内に挿入される。このベクターは、ＯＣＨ１遺伝子内の部位においてのちに直鎖状化され、そして当業界で公知のあらゆる形質転換方法を用いてメチロトローフ酵母株を形質転換することができる。１回の相同組換えにより、この直鎖状化されたベクターは次にＯＣＨ１座に組み込まれて、染色体中に２つのｏｃｈ１配列をもたらすが、何れもが活性なＯｃｈ１ｐ蛋白質を生成することができず、図３Ａに描写されるとおりである。
【００７０】
好ましくは、不活性化変異を直鎖状化された部位の５’（上流の）部位及びＯＣＨ１の翻訳開始コドンの３’（下流）の部位においてベクター中のｏｃｈ１配列内にも挿入される。「不活性化変異（inactivating mutation）」は、停止コドンを導入する変異、フレームシフト変異又は読み枠の破壊を引き起こすあらゆる他の変異を意味する。そのような変異は、当業界で公知の部位特異的変異導入方法の何れかを用いてベクター内にｏｃｈ１配列内に導入され得る。そのような不活性化変異は、たとえノックアウトベクター中のＯｃｈ１配列に対して５’に幾つかのプロモーター配列が存在しようとも、機能しないＯｃｈ１ｐ蛋白質が相同組換え後に形成されることを保証する。
【００７１】
本明細書において上で記載されたような遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株は、所望であればさらに修飾することができる。例えば、あらゆるその他のピキアのマンノシルトランスフェラーゼをコードする追加の遺伝子の破壊を作成することができる。α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ又はＧａｌＴ以外の哺乳類グリコシル化経路中で機能する酵素をコードする遺伝子が、哺乳類様Ｎ−グリカンの比率を増加させるため、及び／又は、所望であれば哺乳類様Ｎ−グリカンをさらに修飾するために、導入することができる。例えば、上で記載された遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株をさらに修飾することにより、ＵＤＰ−グルコースをＵＤＰ−ガラクトースに、そして逆もまた同じく変換するサッカロミセスセレビシエのＧＡＬ−１０にコードされた酵素を発現することができる。これは、サイトゾルのＵＤＰ−ガラクトースのレベルを増加させるかもしれず、次に、ＧａｌＴの活性を刺激してＧａｌＧｌｃＮａｃＭ５ＧｌｃＮａｃ２グリカンの比率を増加させる。さらに、上で記載された遺伝子操作されたメチロトローフ酵母は、ゴルジ体中でマンノシダーゼＩＩを発現するようにさらに修飾され得て、ＧａｌＧｌｃＮａｃＭ５ＧｌｃＮａｃ２から追加のマンノース残基を除去し、それにより他の糖残基の追加を許容する。
【００７２】
遺伝子修飾の順序は本発明には必須ではない。α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧａｌＴをコードするヌクレオチド配列の導入、及びゲノミックＯＣＨ１遺伝子の破壊は、連続してか、如何なる順序でも、又は同時に、２つ又はそれより多い別々のベクター又はコーディング配列により共形質転換（co-transformation）することによるか又は２つ又はそれより多い別々のコーディング配列を含む一つのベクターによる形質転換により行うことができる。
【００７３】
さらなる側面において、本発明は、５又はそれ未満のマンノース残基及びコアマンノース含有構造並びにターミナルガラクトース残基に結合した少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有するものとして特徴付けされる哺乳類様Ｎ−グリカン構造、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する構造を生じるメチロトローフ酵母株を生じさせるのに有用なベクターを提供する。
【００７４】
一つの態様において、本発明は、発現される酵素、即ち、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ，ＧａｌＴ，又はこれらの酵素の何れかの機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。そのようなベクターは、「ノックイン」ベクターとも呼ばれる。コーディング配列は、コードされた蛋白質の発現のために宿主メチロトローフ酵母において機能するプロモーター及び３’終結配列に作動可能に連結して配置され得る。２つ又はそれより多いコーディング配列をメチロトローフ酵母株への同時形質転換のための同じベクター内に入れることができる。好ましくは、当該ベクターは、形質転換の便利な選択のための上で記載された選択可能なマーカー遺伝子の何れか一つも含む。
【００７５】
本発明によれば、ノックインベクターは、メチロトローフ酵母株内で発現される所望の蛋白質をコードする配列を含み、組み込み型ベクター又は複製型ベクター（例えば、複製型環状プラスミド）の何れかであり得る。組み込み型ベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号に開示されており、引用により本明細書に編入される。組み込み型ベクターは、通常、少なくとも第１の挿入可能ＤＮＡ断片、選択可能なマーカー遺伝子、及び第２の挿入可能なＤＮＡ断片の連続して並んだ配置（serially arranged sequence）を含む。第１及び第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、各々、約２００ヌクレオチドの長さであり得て、形質転換される種のゲノミックＤＮＡの一部に相補なヌクレオチド配列を有する。発現のための目的の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列をこのベクター中で第１の挿入可能ＤＮＡ断片と第２の挿入可能ＤＮＡ断片の間に挿入するが、マーカー遺伝子の前又は後である。組み込み型ベクターは宿主細胞ゲノムへの目的のヌクレオチド配列の組み込みを促進するために酵母形質転換に先立って直鎖状にすることができる。
【００７６】
別の態様において、本発明は、メチロトローフ酵母株に導入されたときにゲノムＯＣＨ１遺伝子を不活性化するか又は破壊する不活性化ベクター（又は「ノックアウト」ベクター）を提供する。
【００７７】
ゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するためのベクターは、上で記載されたとおり、相同組換えを媒介するのに十分な長さのＯＣＨ１遺伝子の一部に、その５’及び３’末端の両方において作動可能に連結した選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。メチロトローフ酵母細胞の、その５’及び３’末端の両方においてＯＣＨ１配列を選択可能なマーカー遺伝子と共に含み得るそのようなＯＣＨ１不活性化ベクターの直鎖状ＤＮＡ断片による形質転換は、ゲノミックＯＣＨ１座への直鎖状断片の組み込み及びゲノミックＯＣＨ１遺伝子の破壊を導く。
【００７８】
或いは、ＯＣＨ１不活性化ベクターは、破壊されるＯＣＨ１遺伝子の一部及び上で記載された選択可能なマーカー遺伝子の何れか一つを含むことができるが、上記一部はＯＣＨ１蛋白質を何もコードしないか又はＯＣＨ１蛋白質の不活性断片をコードする。そのようなＯＣＨ１遺伝子の一部は如何なるＯＣＨ１プロモーター配列をも欠き、そして如何なるプロモーター配列に対しても作動可能に連結していない。そのようなベクターはＯＣＨ１遺伝子内の部位において直鎖状化し、そして次にメチロトローフ酵母株を形質転換することができ、１回の相同組換え媒介性の組み込みにより、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子の不活性化をもたらす。好ましくは、不活性化変異、例えば、停止コドン又はフレームシフト変異も、直鎖状化部位の５’（上流）の部位及びＯＣＨ１の翻訳開始コドンの３’（下流）の部位においてベクター中のＯＣＨ１配列内に導入される。
【００７９】
所望であれば、メチロトローフ酵母株中で発現される酵素をコードするヌクレオチド配列は、「ノックインアンドノックアウト」ベクターを創製するために、同じベクター中でゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化することができるヌクレオチド配列と組み合わせることができる。
【００８０】
ノックインベクター及びノックアウトベクターの両方を含む本発明のベクターは、細菌中で機能する選択可能なマーカー遺伝子、並びに細菌中で複製及び細胞外染色体の維持管理に必須の配列をも含むことができる。細菌の選択可能なマーカー遺伝子の例は、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔｒ）、ハイグロマイシン耐性、ブラスチシジン耐性及びゼオシン耐性（Ｚｅｏｒ）遺伝子を含む。
【００８１】
さらに、上記のベクターの何れも、さらに、メチロトローフ酵母株中でのそのような糖蛋白質の発現のための、目的の糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８２】
さらに別の側面において、本発明は、哺乳類様Ｎ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生じさせる方法を提供する。
本明細書にて使用される「糖蛋白質」は、一つ又はそれより多いアスパラギン残基上又は一つ又はそれより多いセリン又はスレオニン残基、又はアスパラギン及びセリン又はスレオニン残基の両方の上の何れかで、メチロトローフ酵母株中において、グリコシル化される蛋白質を意味する。好ましくは、糖蛋白質は宿主メチロトローフ酵母株に対して異種である。
【００８３】
本発明によれば、減少したグリコシル化を伴う目的の糖蛋白質の生産は、多数の様式において達成できる。例えば、目的の糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、哺乳類様Ｎ−グリカンを応じるように予め操作されたメチロトローフ酵母株に導入することができる。
【００８４】
糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、宿主株中で機能するプロモーター配列及び３’終結配列に対して作動可能に配置することができる。当該ヌクレオチド配列は、追加の配列、例えば、蛋白質生成物の分泌が望まれる場合に運搬（transit）ペプチドをコードするシグナル配列を含むことができる。そのようなシグナル配列は、よく知られており、容易に利用可能であって、サッカロミセスセレビシエのアルファメイティング因子プレプロ（αｍｆ）、ピキアパストリス酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列等を含む。
【００８５】
或いは、目的の糖蛋白質のコーディング配列を導入されたメイティング酵母株を修飾することにより、所望の酵素（即ち、ａ−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧａｌＴ）を発現させ、そして上記のとおりにゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化し、それにより哺乳類様Ｎ−グリカンを有する糖蛋白質を生産することができる。
【００８６】
メイティング酵母株中で生産された糖蛋白質は慣用の方法により精製することができる。精製プロトコルは、精製される特定の蛋白質の性質により決定することができる。そのような決定は当業者の範囲内である。例えば、細胞培養培地を細胞から分離し、そして当該細胞から分泌される蛋白質を日常の単離技術、例えば沈殿、免疫吸着、フラクショネーション又は様々なクロマトグラフ法により培地から単離することができる。
【００８７】
本発明の方法により生産することができる糖蛋白質は、細菌、真菌又はウイルスの蛋白質又は抗原、例えば、バチルスアミロリクエファシエンスのα−アミラーゼ、サッカロミセスセレビシエのインベルターゼ、トリパノゾーマクルジのトランス−シアリダーゼ、ＨＩＶエンベロープ蛋白質、インフルエンザウイルスのＡヘマグルチニン、インフルエンザのノイラミニダーゼ、ウシヘルペスウイルスのタイプ１糖蛋白質Ｄ；蛋白質、哺乳類起源の蛋白質、例えばヒト蛋白質、成長因子又は受容体、例えば、ヒトアンギオスタチン、ヒトＢ７−１，Ｂ７−２及びＢ−７受容体ＣＴＬＡ−４，ヒト組織因子、成長因子（例えば、血小板由来の成長因子）、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−Ｉ、ウロキナーゼ、ヒトリソソーム蛋白質、例えば、α−ガラクトシダーゼ、プラスミノーゲン、トロンビン、因子ＸＩＩＩ；及びイムノグロブリン又はイムノグロブリンの断片（例えば、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２）を含む。本発明の遺伝子操作されたピキア株において発現され得る追加の有用な糖蛋白質に関しては、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ ａｎｄ Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１９３−２００（１９９９），及びＫｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９１５−９４４（１９８７）を参照されたい。
【００８８】
本発明の方法を用いて生産される糖蛋白質、即ち、哺乳類様のＮ−グリカン、特にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖蛋白質も、本発明の一部である。
【００８９】
また別の側面において、本発明は、上で記載された本発明のノックインベクター、ノックアウトベクター、又はノックインアンドノックアウトベクターの一つ又はそれより多くを含むキットを提供する。
【００９０】
より特定すれば、本発明のキットは、α−マンノシダーゼＩ又はその機能部分をコードする、好ましくはＥＲ滞留シグナルを含む、ヌクレオチド配列を有するベクター；ＧｎＴＩ又はその機能部分をコードする、好ましくはゴルジ体滞留シグナルを含む、ヌクレオチド配列を有するベクター；ＧａｌＴ又はその機能部分をコードする、好ましくはゴルジ体滞留シグナルを含む、ヌクレオチド配列を有するベクター；又はメチロトローフ酵母中でゲノミックＯＣＨ１遺伝子を破壊することができるベクター、又はその何れかの組み合わせを含む。
【００９１】
上記キットは、目的の異種糖蛋白質をコードする配列を有する核酸分子を含むこともできる。どのような核酸分子は、本明細書において前で記載されたノッキングイン又はノッキングアウトのための配列を含む別のベクター又は同じベクター内に提供することができる。或いは、キット中のノックイン又はノックアウトベクターは、目的の異種蛋白質をコードするヌクレオチド配列の挿入のための便利なクローニング部位を有する。
【００９２】
上記キットは、本明細書において前で記載された、ノックイン、ノックアウト又はノックインアンドノックアウトベクターの何れかにより形質転換され得るメチロトローフ酵母株を含むこともできる。或いは、上記キットは、哺乳類様Ｎ−グリカンを生じさせるために操作されたメチロトローフ酵母株を含むことができる。
【００９３】
本発明は、さらに、以下の実施例により例示される。
実施例１
方法と材料
ベクターの構築と形質転換
ピキアパストリス配列はＧｅｎＢａｎｋにて受け入れ番号Ｅ１２４５６（配列番号：２）にて見いだされ、日本特許出願番号０７１４５００５に記載され、引用により本明細書に編入される。この配列は、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの全ての典型的な特徴を示し、そしてサッカロミセスセレビシエのＯＣＨ１にほとんど相同であり、即ち、本明細書においてはピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子と呼ぶ。
【００９４】
ピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子の完全ＯＲＦを、ＰＣＲにより、鋳型として株ＧＳ１１５から単離されたゲノミックＤＮＡ、及び以下のオリゴヌクレオチド５’ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＣＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号：４）及び５’ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＧＴＣＣ（配列番号：５）を用いて単離した。単離されたＯＣＨ１遺伝子をｐＵＣ１８内にクローン化することにより、プラスミドｐＵＣ１８ｐＯＣＨ１を得て、ＯＣＨ１遺伝子配列の同定を配列決定により確認した。
【００９５】
プラスミドｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８（２８７５ｂｐ，配列番号：６、図３Ａに模式的に描写する）はＡｌａ２５−Ａｌａ１５５をコードするピキアパストリスＯＣＨ１のＯＲＦの断片を含み、当該断片はｐＰＩＣＺＢ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）のＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入された。２つの停止コドンをインフレームにてコドンＡｌａ２５の前に配置することにより、末端削除された蛋白質の起こり得る合成を阻止した。消化後のフィルイン及び再ライゲーションにより、ｐＰＩＣＺＢのポリリンカーのＢｓｔＢＩ部位を予め排除した。クローン化されたＯＲＦ１遺伝子の内部に位置する唯一のＢｓｔＢＩ部位を上記プラスミドの直鎖状化に用いることができる（不活性化戦略の全体像に関しては図３Ａを参照）。
【００９６】
ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５（５４８５ｂｐ，配列番号：９、図３Ｂに模式的に描写する）を以下のとおりに構築した。ピキアパストリスＨＩＳ４転写終結配列を含むｐＰＩＣ９（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）のＸｂａＩ／ＣｌａＩ断片を、ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈ Ｍ８のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位の間に挿入した。のちに、ＧＡＰプロモーター及びｐｒｅＭＦマンノシダーゼＨＤＥＬカセットを含むｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，５０３（２−３）：１７３−１７８，２００１）の２．３ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入した。この構築物のために使用される全ての制限部位（ＮｏｔＩ部位を除く）をクレノーＤＮＡポリメラーゼによりフィルインした。ｐＧＡＰＺＭＦｍａｎＨＤＥＬ内の唯一のＢｓｔＢＩ部位を、消化後のフィルイン及び再ライゲーションにより排除した。
【００９７】
ヒトＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ）をゴルジ体に標的化するため、ＧｎＴＩのＮ−末端部分を、酵母のゴルジ体における直鎖状化に必須のサッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２のＮ−末端部分により置き換えた（Ｌｕｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１３１（４）：９１３−９２７，１９９５）。プラスミドＹＥｐ３５２Ｋｒｅ２（Ｈｏｗａｒｄ Ｂｕｓｓｅｙ博士、ＭｃＧｉｌｌ大学、モントリオール、カナダ、により提供）を生成したが、Ｋｒｅ２遺伝子のＳａｃＩ／ＰｖｕＩＩ断片を、ＳａｌＩ（クレノーにより平滑化）及びＳａｌＩにより消化されていたＹｅｐ３５２ベクターに挿入することにより生成した。ＹＥ３５２Ｋｒｅ２をＳａｃＩ／ＰｖｕＩにより消化してＴ４−ポリメラーゼにより平滑化した。Ｋｒｅ２遺伝子の５’末端を単離して、クレノー平滑化されたＳｇｒＡＩ／ＸｂａＩにより開いたｐＵＣｈＧｎＴＩ（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４９（３）：７０１−７０７，１９９７）にクローン化した。２つのＤＮＡ断片の融合場所を標準手法を用いて配列決定した。結果のＫｒｅ２−ＧｎＴＩオープンリーディングフレームは、Ｋｒｅ２遺伝子のＮ−末端部分（配列番号：１１に示されるとおり、Ｋｒｅ２蛋白質の最初の１１０アミノ酸をコードする）及びＧｎＴＩの触媒ドメイン（配列番号：１３に示されるとおり、ＧｎＴＩ蛋白質の最後の３２７アミノ酸）を含み、ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩにより二重消化して、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで開いたｐＰＩＣ６Ａベクター（インビトロジェン）内へ、両断片をクレノーポリメラーゼにより平滑化した後に、連結した。結果のプラスミドはｐＰＩＣ６ＡＫｒｅｃｏＧｎＴＩと命名した（配列番号：１４、図３Ｃにおいて模式的に描写される）。それは、メタノールにより誘導可能なＡＯＸ１プロモーターの制御下にＫｒｅ２ＧｎＴＩのオープンリーディングフレームを、そして抗生物質ブラスチシジンに対して耐性のアスペルギルステレウスカラノＢＳＤ遺伝子を含む。
【００９８】
ＧａｌＴの局在化は、ＧｎＴＩを標的化するために行われたのと同じ様式にて、Ｋｒｅ２ｐのＮ末端部分へのＧａｌＴの触媒ドメインの融合により達成された。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをｈｅｐｇ２のｃＤＮＡライブラリーからオリゴヌクレオチド５’ＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ（配列番号：１５）及び５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣ（配列番号：１６）をスターター配列として用いて増幅した。増幅された断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩにてｐＵＣ１８にクローン化された。ＧａｌＴ蛋白質のＮ末端の７７アミノ酸を削除するため、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを実施した：５’ＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ（配列番号：１５）及び５’ＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣ（配列番号：１７）。増幅された断片をＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに切断して、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｇｒＡ Ｉクレノー平滑化ｐＵＣＫｒｅＧｎＴＩベクターに連結した。結果のＫｒｅ２−ＧａｌＴ融合構築物を再びＰＣＲによりプライマー：５’ＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ（配列番号：１８）及び５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＡＧ（配列番号：１９）を用いて増幅した。増幅された断片をＥｃｏＲＶ／ＢｓｔＢ ＩにてｐＢＬＵＲＡ ＩＸ（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２６３：１５９−１６９，２００１）（Ｊａｍｅｓ Ｃｒｅｇｇ（オレゴンインスティチュートオブサイエンスアンドテクノロジー、ビーバートン、ＵＳＡ）より提供）に挿入した。最後に、ＵＲＡ３遺伝子をカナマイシン耐性カセットにより置き換えたが、ベクターｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ４からのＳｐｅＩ／ＳｍａＩ断片をＳｐｅＩ／ＳｓｐＩにおいて開いたプラスミドに連結することによった。最後のプラスミドはｐＢＩＫａｎＭＸ４ＫｒｅｈＧａｌＴ（配列番号：７、図３Ｄに模式的に描写される）と呼ばれるが、ＡＯＸ１プロモーターに作動可能に連結したＫｒｅ２−ＧａｌＴ融合蛋白質をコードする配列を含んだ。当該融合蛋白質は、Ｋｒｅ２の最初の１００アミノ酸及びＧａｌＴの最後の３２０アミノ酸から構成された。
【００９９】
これらのプラスミドによる、様々な蛋白質を発現するＧＳ１１５ピキア株に対する形質転換は、前に記載されたとおりに行った（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０３：２７−３９，１９９８）。ＰｐＯＣＨ１座における正確なゲノミックインテグレーションは、ゲノミックＤＮＡ上のＰＣＲにより確認した。
蛋白質の調製
分泌されたトリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼを、ＨＩＣ、アニオン交換及びゲル濾過クロマトグラフの組み合わせを用いて、記載されたとおりに精製した（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７７（２−３）：２５５−２６３，２０００；Ｖａｎ Ｐｅｔｅｇｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１２（１）：１５７−１６５，２００１）。全てのＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験は１０％ＰＡＡゲル上において標準泳動条件下で行った。酵母の細胞壁のマンノ蛋白質をＢａｌｌｏｕ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８５：４４０−４７０，１９９０）に記載されたとおりに放出させたが、０．９％のＮａＣｌ水溶液中の酵母細胞の大規模な洗浄、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ中の酵母細胞の延期されたオートクレーブ（９０分）、続くメタノール沈殿（４容）を含んだ。
Ｎ−グリカン分析
ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡ配列決定機（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）上でのレーザー誘導性ＤＮＡ配列決定機補助によるフルオロフォア補助糖質電気泳動により、記載されたとおりに（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１（４）：２７５−２８１，２００１）、Ｎグリカン分析を行った。簡単に言えば、糖蛋白質を、マルチスクリーンイムノビロン−Ｐ上に固定化し、そしてＰＮＧａｓｅ処理により脱グリコシル化した。Ｎ−グリカンを除去し、そしてＡＰＴＳにより誘導した。過剰の標識をセファデックスＧ１０樹脂上のサイズ分画により除去した。ＡＰＴＳ−標識されたオリゴサッカライドの蒸発後に、ＲＯＸ−標識されたＧＥＮＥＳＣＡＮ ５００標準混合物（アプライドバイオシステムズ）を加えて、内部標準化を許容した。この混合物をＡＢＩ ３７７Ａ ＤＮＡ配列決定機（アプライドバイオシステムズ）上で、１２％ポリアクリルアミドゲルにより、８９ｍＭ Ｔｒｉｓ，８９ｍＭ 硼酸塩、２．２ｍＭ ＥＤＴＡバッファー中で泳動した。各ゲル上で、ウシＲＮａｓｅ ＢとマルトデキストロースラダーのＮ−グリカンをレファレンスとして泳動した。データ解析は、ＧＥＮＥＳＣＡＮ ３．１ソフトウエア（アプライドバイオシステムズ）を用いて実施した。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Ｇｌｙｋｏ）及びβ−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）によるエキソグリコシダーゼ処理を、標識されたグリカン上で、一晩、３７℃において２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５中で実施した。慣用のＦＡＣＥ（Ｎ−グリカンのＡＮＴＳ標識と３０％ＰＡＡミニゲル上の電気泳動）をＪａｃｋｓｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２７０（３）：７０５−７１３，１９９０）により記載されたとおりに実施した。ＤＳＡ−ＦＡＣＥ法は非常に高い解析度と感度を有するが、慣用のＦＡＣＥは高分子量のＮ−グリカン（「高グリコシル化」）の複合混合物の検出によく適合されており、分解されていなかった（not resolved）ので、慣用のＦＡＣＥ内のゲル上では特徴的な「スメア」を形成した。即ち、ＤＳＡ−ＦＡＣＥと慣用のＦＡＣＥ分析の組み合わせは、酵母により生じる糖蛋白質の特徴の、より完全な写真を与えた。
成長曲線の測定
新鮮な一晩酵母培養物を新鮮なＹＰＤ培地によりＯＤ６００ ０．０２まで希釈し、そして２５０ｒｐｍにて３０℃において一晩生育させた（１２時間、ＯＤ ６００＜３．０）。実験を開始するために、５０ｍＬのポリプロピレンチューブ中の１０ｍＬの新鮮なＹＰＤに一晩酵母培養物を接種し、０．５のＯＤ６００値から始めた。アリコートを２時間ごとに採取し、そしてＯＤ６００値を測定した。全ての酵母株を同じ時間平行してランさせた。
【０１００】
実施例２
ＯＣＨ１の不活性化
ゲノミックピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子の破壊は、以下のとおりにして１回の相同組換えにより達成した。プラスミド、ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８（図３Ａ）を実施例１において記載されたとおりに生成したが、ピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子の塩基対番号７３−４６７を含み、その前に当該ベクター中の可能な初期翻訳開始部位からのリードスルーを回避するために２つのインフレームのナンセンスコドンを置いた。この断片は、形質転換前の上記ベクターの直鎖状化に有用な中心に位置するＢｓｔＢ Ｉ部位を含んだ。このベクターは、ピキアのゲノミックＯＣＨ１座への１回の相同組換えによるインテグレーションに際してベクター中に存在するＯＣＨ１遺伝子を複製するはずである。結果として、ピキア染色体内のＯＣＨ１遺伝子は２つのＯｃｈ１配列に置き換わった。第１のＯＣＨ１配列は、最大で１６１のアミノ酸長の蛋白質生成物をコードし（そのうちの６アミノ酸はベクター中の配列からであった）、完全長ＯＣＨ１遺伝子によりコードされたタイプＩＩの膜貫通蛋白質の触媒ドメインを含まなかった。第２のＯＣＨ１配列は、完全長の蛋白質の最初の２５アミノ酸のコーディング配列を欠き、そして可能な上流の翻訳開始部位からの如何なるリードスルーをも阻止するはずの２つのインフレームの停止コドンを含んだ。
【０１０１】
株ＧＳ１１５をプラスミドｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８により形質転換した。形質転換体をＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８と呼ぶか、又は短くＭ８株又はｏｃｈ１株と呼んだ。図３Ａにおいて特定されたプライマーの組み合わせによるゲノミックＤＮＡのＰＣＲは、３つの個別の実験により示されたところによれば、ゼオシン耐性形質転換体の約５０％における、予測されたゲノミック座へのこの構築物の正確なインテグレーションを示した。
【０１０２】
細胞壁のマンノ蛋白質のＮ−グリカンの分析は、図４において演繹されるとおり、グリコシル化パターンの変化を明らかにした。優位なピークは、野生型ＧＳ１１５株からの細胞壁マンノ蛋白質に関してはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２であり、主要なピークはＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８株に関してはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である（図４のパネル２から３を比較）。Ｎ−グリカンにおけるこの変化は、Ｍ８株の完全長ＯＣＨ１のＯＲＦによる形質転換の後に復帰した。
【０１０３】
Ｍ８株からの分泌された糖蛋白質の不均質性が低下したか否かを確認するために、野生型ＧＳ１１５株中の分泌された蛋白質である典型的には高グリコシル化された（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，７７（２−３）：２５５−２６３，２０００）トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼをｏｃｈ１のＭ８株を用いて分析した。トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼをコードする配列により形質転換されたＭ８株の細胞の培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（図５Ａ）。ゲルは、高グリコシル化された蛋白質の特徴であるスメアがＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８株において生成した蛋白質には不在であったことを明らかにした。平行して、分泌された糖蛋白質をＰＮＧａｓｅＦ処理により脱グリコシル化し、そしてグリカンをミニゲル上のＦＡＣＥ分析により分析した。典型的にはＦＡＣＥ分析においては、大きな高グリコシル構造が解析されず、一つのスメアバンドとして出現する（図５Ｂ）。スメアバンドはｏｃｈ１株からの糖蛋白質においては不在であり、ｏｃｈ１株からのＮ−グリカンの不均質性が低下したことが確認された。
【０１０４】
実施例３
ＥＲ滞留したマンノシダーゼ−ＨＤＥＬの発現
ピキアパストリスのＮ−グリカンをさらにヒト化するために、ＥＲ滞留されたトリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼ−ＨＤＥＬをｏｃｈ１株中で発現させた。ピキアパストリス発現株の容易な変換のために、トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼ−ＨＤＥＬをコードするヌクレオチド配列をｏｃｈ１不活性化ベクターに挿入した。結果のコンビネーションベクターをｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５と呼び、その構成を実施例１に記載する。
【０１０５】
株ＧＳ１１５を直鎖状化されたｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５により形質転換した。当該ベクターの正確なインテグレーションはＰＣＲ分析により確認した。当該形質転換体からのマンノ蛋白質のＮ−グリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥ法により分析した。グリカンのプロフィールは、均質なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークを明らかにした（図４、パネル４）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークと、５から２５までのグルコースユニットのサイズエリアのこの方法の検出限界を超える全ての小さなピークの積分（integration）は、この高等真核種の高マンノースグリカンがこの混合物中に存在する全Ｎ−グリカンプールの少なくとも９０％を成したことを明らかにした。
【０１０６】
別のアプローチにおいては、マンノシダーゼ−ＨＤＥＬをメタノール誘導可能ＡＯＸ１プロモーターの制御下で発現させた。２つのマンノシダーゼ発現株（即ち、構成的及び誘導可能）の間のＮ−グリカンプロフィールに明確な差異は検出できなかった。
【０１０７】
異種蛋白質のＮ−グリカン修飾を確認するため、Ｌａｒｏｙ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２０（３）：３８９−３９３，２０００）に記載されたとおりに、ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５プラスミドで、トリパノゾーマクルジのトランス−シアリダーゼ発現ピキア株を形質転換した。この点に関して（here too）、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が精製された蛋白質上に検出され、精製された蛋白質上の全Ｎ−グリカンの９５％より多くを占める。
【０１０８】
振盪フラスコ培養におけるｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５形質転換株の成長曲線分析は、その倍加時間が野生型株のそれを密接に模倣したことを示した。しかしながら、操作された株は野生型株より約２０％低い光学密度において定常期に到達したことから、高細胞密度のストレス条件に対していくらか感受性であり得たことを示す。にもかかわらず、そのストレス感受性の表現型はサッカロミセスセレビシエのｏｃｈ１株よりもはるかに劣って表現された（much less pronounced）。
【０１０９】
実施例４
ゴルジ体局在Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
（Ｋｒｅ２ＧｎＴＩ）の発現
ＧｎＴＩをゴルジ体に標的化するために、サイトゾル部分、膜貫通領域及び管腔幹領域（luminal stem region）を含むＧｎＴＩのＮ−末端部分をコードするヌクレオチド配列を、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２シグナル配列をコードするヌクレオチド配列により置き換えた。これは、Ｋｒｅ２ｐからの最初の３２７アミノ酸及びＧｎＴＩの最後の３２７アミノ酸を有するキメラ蛋白質をコードするヌクレオチド配列をもたらした。
【０１１０】
ピキアパストリスにおける発現のために、Ｋｒｅ２−ＧｎＴＩキメラ配列を、ブラスチシジン耐性マーカーを有するプラスミド中で強力なメタノール誘導可能性ＡＯＸ１プロモーターの制御下に置いた。結果の構築物であるｐＰＩＣ６ＫｒｅｃｏＧｎＴＩ（実施例１に記載されるとおり）をＮｓｉＩ消化によるＡＯＸ１座内の直鎖状化の後にＧＳ１１５ Ｍ５株を形質転換した。当該形質転換体内の上記構築物の存在は、ＡＯＸ１の３’及び５’プライマーを用いたゲノミックＤＮＡ上でのＰＣＲにより確認した。
【０１１１】
幾つかの形質転換体のマンノ蛋白質のＮ−グリカンはＤＳＡ−ＦＡＣＥ法により分析した。優位なピークは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークより大きな約１つのグルコースユニットであった（図４、パネル５）。このピークが末端ＧｌｃＮＡｃを有するか否かを決定するため、エキソグリコシダーゼ消化を、β−Ｇｌｃ−ＮＡｃ結合を加水分解する酵素であるβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いて実施した。この酵素による消化に際して、上記ピークはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にシフトして戻った（図４、パネル６）。これは、オリジナルピークがＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を表すことを示し、即ち、キメラＧｎＴＩ酵素の正確なインビボ活性を証明する。
【０１１２】
Ｋｒｅ２ＧｎＴＩキメラの過剰発現は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのほとんど完全な変換を導く。これは、十分なＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃドナー基質がゴルジ体においてＮ−アセチルグルコサミニレート、ほとんど全てのグリカンに存在したことを示唆する。
【０１１３】
実施例５
ゴルジ体滞留β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現
ヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１の、当該酵素の膜貫通ドメイン及びサイトゾル部分を含むＮ末端部分（最初の７７アミノ酸）をコードするヌクレオチド配列を、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２シグナル配列をコードするヌクレオチド配列で置き換えた。このキメラ融合配列をＡＯＸ１プロモーター及びＡＯＸ１の３’末端をターミネーターとする制御下に置いた。最終的なプラスミドであるｐＢ１ＫａｎＭＸ４ＫｒｅｈＧａｌＴ（実施例１に記載される）をＰｍｅＩによりＭ５−ＧｎＴＩ株の形質転換前に直鎖状化した。
【０１１４】
Ｎ−グリカン分析を幾つかの形質転換体からのマンノ蛋白質にて実施した。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークより大きな約１ユニットのグルコースのピークが形質転換体において検出されたが、当該ピークは非形質転換株においては不在であった（図３、パネル７）。このピークが末端β−ガラクトースを含むグリカンであるか否かを決定するため、Ｎ−グリカンをβ−ガラクトシダーゼにより消化した。グリカンプロフィールの消化後に、このピークはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２位置にシフトして戻った（図４、パネル８、パネル７と比較）。β−ガラクトシダーゼ消化の前と後にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークを積分することにより、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の量を決定した。これらの２つのピークの差し引きは、約１０％のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換されたことを明らかにした。０．２％ガラクトースを含む追加の培地はＧａｌ−含有オリゴサッカライドの量を増加させなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、Ｍ８ＧｌｃＮＡｃ２，Ｍ５ＧｌｃＮＡｃ２，ＧｌｃＮＡｃＭ５ＧｌｃＮｃ２，及びＧａｌ ＧｌｃＮＡｃＭ５ＧｌｃＮＡｃ２を描写する。
【図２】図２は、酵母とヒトのＮ−結合グリコシル化及びピキアパストリスのグリコシル化のヒト化のための戦略を模式的に描写する。糖操作工程は、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼＯＣＨ１の不活性化、ＨＤＥＬ標識されたα−１，２−マンノシダーゼの過剰発現及びゴルジ局在化ＧｎＴＩ及びＧａｌＴの過剰発現を含む。最後に部分的に得られたハイブリッド構造を組み立てる（framed）。
【図３】図３Ａは、一回の相同組換えによりゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するための戦略を模式的に描写する。図３Ｂは、ピキアパストリスのグリカン操作のために使用されたプラスミドｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５を模式的に描写する。ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５をＢｓｔＢＩにより直鎖状化し、次に形質転換し、そしてピキアパストリスのゲノムに正確に組み込むことにより、ＯＣＨ１遺伝子が不活性化された。図３Ｃは、ｐＰＩＣ６ＡＫｒｅｃｏＧｎＴＩを模式的に描写する。 図３Ｄは、ｐＢ１ＫａｎＭＸ４ＫｒｅｈＧａｌＴを模式的に描写する。
【図４】図４は、異なったグリカン操作をされたピキアパストリス株からのＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を模式的に描写する。パネル１：オリゴマルトースレファレンス。パネル２−９はＮ−グリカンを表し：２：−野生型株ＧＳ１１５からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；３：ｏｃｈ１不活性化された株からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；４：ｏｃｈ１不活性化されたＭａｎＨＤＥＬ発現株からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；５：ｏｃｈ１不活性化されたＭａｎＨＤＥＬ，ＫｒｅＧｎＴＩ発現株からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；６：５と同じであるが、但し、グリカンがβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼにより処理され、そしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２位置にシフトし、ターミナルＧｌｃＮＡｃが存在したことを示すことを除く；７：ｏｃｈ１不活性化されたＭａｎＨＤＥＬ，ＫｒｅＧｎＴＩ，ＫｒｅＧａｌＴ発現株からのＮ−グリカンを表し、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を表す追加のピークを伴うが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる処理により消失した；９：ウシＲＮａｓｅＢからのレファレンスグリカン（Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２）。
【図５】図５Ａは、ピキアパストリスＯＣＨ１の不活性化後のグリコシル化を示す。５Ａ：トリコデルマリセイのマンノシダーゼを分泌するピキアパストリス株のＣＢＢ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。操作されていない株（ＷＴ）においては、明確なスメアが見えるが、このスメアはｏｃｈ１不活性化された株（ｏｃｈ１（Ｍ８））においては消失した。図５Ｂは、ピキアパストリスＯＣＨ１の不活性化後のグリコシル化を示す。５Ｂ：操作されていない株（ＷＴ）及びｏｃｈ１株により分泌されたマンノシダーゼに由来するＮ−グリカンのＦＡＣＥ分析。高い電気泳動移動度のバンドはＭａｎ８及びＭａｎ９により示され、「コア」Ｎ−グリカン構造を表す。
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳類様グリコシル化により糖蛋白質を生産するための方法及び操作されたメチロトローフ酵母株に関する。本発明は、哺乳類様グリコシル化により糖蛋白質を生産することができるメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクターにも関する。遺伝子工学によるメチロトローフ酵母株から生産された糖蛋白質も提供される。
発明の背景
ピキアパストリスを含むメチロトローフ酵母は、商業上又は医学上重要な組換え蛋白質の生産のために広く使用されてきた。しかしながら、幾つかの治療用糖蛋白質の生産及び医学上の応用は、これらの酵母と標的生物、例えば哺乳類又はヒト被験者の間の蛋白質結合糖質の生合成の違いにより妨げられ得る。
【０００２】
蛋白質のＮ−グリコシル化は細胞質網状構造（ＥＲ）を起源とし、そこでは、ドリコール（脂質キャリアー中間体）上で集合したＮ結合オリゴサッカライド（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が隣の蛋白質の適当なＡｓｎに転移される。これは、全ての真核生物のＮ−結合糖蛋白質に共通の事象である。３つのグルコース残基と一つの特定のα−１，２−結合マンノース残基がＥＲ中の特異的グルコシダーゼと一つの１，２−マンノシダーゼにより除去されて、コアのオリゴサッカライド構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をもたらす。このコアの糖構造を有する蛋白質はゴルジ体に運ばれて、そこで、糖部分が様々な修飾を受ける。酵母と高度真核生物の間ではゴルジ体内の糖鎖の修飾に顕著な違いがある。
【０００３】
哺乳類細胞においては、糖鎖の修飾は３つの異なる経路により進行し、それが添加される蛋白質部分に依存する。即ち、（１）コアの糖鎖は変化しない；（２）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェート部分（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）のコア糖鎖中のマンノースの６位への添加によりコアの糖鎖が変化し、続いてＧｌｃＮＡｃ部分の除去による糖蛋白質中の酸性糖鎖の形成する；又は（３）マンノシダーゼＩによる３マンノース残基の除去の結果としてコア糖鎖が最初にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換されて；そしてＧｌｃＮＡｃの添加及び２つのさらなるマンノース残基の除去、続くＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（Ｇａｌ）、及びＮ−アセチルノイラミニ酸（シアル酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれる）の連続添加により様々なハイブリッド又は複合体糖鎖を形成することにより、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がさらに修飾される（Ｒ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４，１９８５；Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−２６３０４，１９９８）。
【０００４】
酵母においては、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは削られない（not trimmed）。ゴルジ体内の糖鎖の修飾は、別々のマンノシルトランスフェラーゼによるマンノース残基の一連の添加（「外部鎖」グリコシル化）を含む。外部鎖グリコシル化の構造は生物に特異的であって、典型的にはサッカロミセスセレビシエにおいて５０を超えるマンノース残基を伴い、そしてもっとも共通にはピキアパストリスにおいてＭａｎ１４ＧｌｃＮＡｃ２より小さな構造を伴う。高いマンノース種のこの酵母特異的外部鎖グリコシル化は、高グリコシル化又は高マンノース化とも呼ばれる。
【０００５】
グリコシル化は、蛋白質のフォールディング、安定性及び生物活性を修正するのに非常に重要である。ヒト体内において、グリコシル化は、蛋白質の薬力学特性、例えば組織分配及び血流からの浄化に、一部必須である。さらに、グリカン構造は、抗原応答に関与し得る。例えば、α−ガラクトースの糖蛋白質上の存在はブタからの異種移植に対する免疫反応に関する主要な理由である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，３（６）：６５０−６５８，１９９９）が、酵母に対する糖蛋白質に対する免疫反応は、主に、α−１，３−マンノース、β結合マンノース及び／又はホスホモノ−又はホスホジエステル結合の何れかの上のリン酸残基の存在による（Ｂａｌｌｏｕ，Ｃ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８５：４４０−４７０，１９９０；Ｙｉｐ ｅｔ ｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１（７）：２７２３−２７２７，１９９４）。
【０００６】
高グリコシル化はしばしば望まれないが、何故ならば、糖質組成及び分子量の両方において組換え蛋白質生成物の不均質性を導き、蛋白質の精製を複雑にし得るからである。高グリコシル化された酵素の比活性（ユニット／質量）は、糖質の増加した部分により低下し得る。さらに、外部の鎖のグリコシル化はしばしば免疫原性が強く、治療への応用においては望まれないかもしれない。さらに、大きな外部の鎖状の糖（chain sugar）は治療用蛋白質の免疫原決定基を遮断し得る。例えば、ピキアパストリスにおいて発現されたインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）は３０−４０までのマンノース残基を含むＮ−グリカンによりグリコシル化される。高グリコシル化されたＮＡは、ＮＡ分子の上部の可変性の免疫支配性表面ループがＮ−グリカンにより遮断されるために、マウスにおいて免疫原性が低下する（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：３３２−３３８，１９９７）。
【０００７】
よって、哺乳類（例えば、ヒト）の糖質構造に似せた糖質構造を有する組換え糖蛋白質を生じるメチロトローフ酵母株を遺伝子操作することが望まれる。
発明の概要
本発明は、哺乳類様のＮ−グリカンを伴う糖蛋白質を生じさせるための、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株及び方法に向けられる。本発明は、哺乳類様のＮ−グリカンを伴う糖蛋白質を生じさせることができる遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクター及びキットにも向けられる。
【０００８】
本明細書の中で使用されている用語「メチロトローフ酵母」は、限定ではないが、メタノール上で生育可能な酵母株、例えば、属カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、及びピキアを含む。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、コアのマンノース構造及び末端ガラクトース残基に結合した５又はそれより少ないマンノース残基及び少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有することにより特徴付けされる、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生じる、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母を提供する。
【００１０】
好ましい態様において、本発明は、哺乳類様のＮ−グリカン構造、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を提供する。
【００１１】
本発明によれば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる上記メチロトローフ酵母株は、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するように遺伝子操作される。好ましくは、当該メチロトローフ酵母株は、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子が不活性化されるようにも遺伝子操作される。
【００１２】
遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株内での発現のためのα−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、あらゆる種の起源であることができ、マウス、ウサギ又はヒトのような哺乳類の種、及びアスペルギルス、又はトリコデルマリセイのような真菌を含む。本発明における使用のための好ましいα−１，２−マンノシダーゼは、トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼである。好ましくは、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、その基質であるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃが利用可能な分泌経路中の部位を標的化する。より好ましくは、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、ＥＲ滞留（retention）シグナルを含むように遺伝子操作されて、ＥＲを標的化する。好ましいＥＲ滞留シグナルは、ペプチドＨＤＥＬ（配列番号：１）である。
【００１３】
遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株における発現のためのＧｎＴＩ又はその機能部分は、あらゆる種の起源であることができ、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線虫及び原生動物、例えば、リーシュマニアタレントレを含む。本発明における使用のための好ましいＧｎＴＩは、ヒトＧｎＴＩであり、配列番号：１３に示される。好ましくは、ＧｎＴＩ又はその機能部分は、その基質であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が利用可能な分泌経路中の部位を標的化する。より好ましくは、ＧｎＴＩまたはその機能部分は、ゴルジ滞留シグナルを含むように遺伝子操作されて、ゴルジ体を標的化する。好ましいゴルジ滞留シグナルは、配列番号：１１に示されるペプチドであり、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２蛋白質の最初の１００アミノ酸からなる。
【００１４】
遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株における発現のためのＧａｌＴ又はその機能部分は、あらゆる種の起源であることができ、ヒト、植物（例えば、アラビドプシスサリアナ）、昆虫（例えば、ドロソフィラメラノガスター）を含む。本発明における使用のための好ましいＧａｌＴは、ヒトＧａｌＴであり、配列番号：２１に示される。好ましくは、ＧａｌＴ又はその機能部分は、ゴルジ滞留シグナルを含むように遺伝子操作されて、ゴルジ体を標的化する。好ましいゴルジ滞留シグナルは、配列番号：１１に示されるペプチドであり、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２蛋白質の最初の１００アミノ酸からなる。
【００１５】
メチロトローフ酵母株は、例えば、形質転換によりこれらの酵素をコードする株ヌクレオチド配列へ導入することにより上記の所望の酵素を発現するように遺伝子操作することができる。好ましくは、コーディング配列はベクター内に提供され、各配列は、酵母株中で機能するプロモーター配列及び３’ターミネーション配列に作動可能に連結されるように配置される。ベクター又はその直鎖状断片で、次に、株を形質転換する。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、上記メチロトローフ酵母株は、ＯＣＨ１遺伝子が破壊されるようにも遺伝子操作される。遺伝子の破壊は、ゲノミックＯＣＨ１配列とノックアウトベクター中のＯＣＨ１配列の間の相同組換えにより達成することができる。
【００１７】
さらなる側面において、本発明は、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質生じるメチロトローフ酵母株を生成するのに有用なベクターを提供する。
一つの態様において、本発明は、発現される酵素、即ち、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ，ＧａｌＴ，又はこれらの蛋白質の何れかの機能部分をコードするヌクレオチド配列を含む「ノックイン」ベクターを提供する。コーディング配列は、コードされた蛋白質の発現のためにメチロトローフ酵母中で機能するプロモーター配列及び３’ターミネーション配列に作動可能に連結されるように配置される。２つ又はそれより多いコーディング配列をメチロトローフ酵母株へ同時形質転換するために同じベクター中に入れることができる。好ましくは、当該ベクターは、形質転換体の便利な選択のための選択可能なマーカー遺伝子も含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、メチロトローフ酵母株に導入されたときにゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するか又は破壊する不活性化ベクター（又は「ノックアウト」ベクター）を提供する。
【００１９】
ＯＣＨ１ノックアウトベクターは選択可能なマーカーを含むことができ、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子との二重相同組換えを媒介するのに十分な長さのＯＣＨ１配列に対して両５’及び３’末端にて作動可能に連結する。或いは、ＯＣＨ１不活性化ベクターは、破壊されるＯＣＨ１遺伝子の一部を含むことができ、その部分はＯＣＨ１蛋白質を一切コードしないか又はＯＣＨ１蛋白質の不活性断片をコードし、そして選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。ＯＣＨ１部分は、何れかの公知のプロモーター配列に対して作動可能な連結はされず、そして上記ベクターの直鎖状断片の形質転換に際して、１回の相同組換えによりゲノミックＯＣＨ１座に組み込まれる。好ましくは、一つ又はそれより多い不活性化変異、例えば停止コドン又はフレームシフト変異も、ベクター中のＯＣＨ１配列内に導入されることにより、何れかの可能性のある活性ＯＣＨ１ポリペプチドの生産を阻止する。
【００２０】
さらに別の側面において、本発明は、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質の生成方法を提供する。目的の糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、哺乳類様Ｎ−グリカンを生じさせるように遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株に導入することができる。或いは、目的の糖蛋白質を発現するメチロトローフ酵母株を修飾することにより、
所望の酵素（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧａｌＴ）を発現させ、そしてゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化することができ、それにより、哺乳類様Ｎ−グリカンを伴う糖蛋白質を生成する。
【００２１】
また別の側面において、本発明の方法を用いることにより生成された糖蛋白質、即ち、哺乳類様のＮ−グリカン、特にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖蛋白質が、本発明により提供される。
【００２２】
さらなる側面において、本発明は、本発明の一つ又はそれより多いベクター、又は本発明の遺伝子操作された一つ又はそれより多い株を含むキットを提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳類様又はヒト様Ｎ−グリコシル化を伴う組換え糖蛋白質を作成するための、方法、ベクター及び遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株に向けられる。
【００２３】
「哺乳類」は、哺乳類のあらゆる種、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ等を含むことを意味する。
典型的には複雑な種類の哺乳類のグリカン、例えば、ヒトにおいて生じたグリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の内部コア構造に結合したシアリル−Ｎ−アセチル−ラクトサミン配列を伴う２から６の外部ブランチを有する。哺乳類のＮ−グリカンは、ＥＲ中で形成されるコアオリゴサッカライド構造であるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に由来する。このコアの糖構造を有する蛋白質はゴルジ体に輸送されて、そこで、ゴルジ体マンノシダーゼＩ（ゴルジ体α−１，２−マンノシダーゼ）により３つのマンノース残基を除去した結果として、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２がＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換される。蛋白質がゴルジ体を通して加工されるにつれ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、さらに、ＧｌｃＮＡｃの追加と２つのさらなるマンノース残基の除去、次に、ＧｌｃＮＡｃ，ガラクトース（Ｇａｌ）及びシアル酸（ＳＡ）残基の追加により、修飾される。
【００２４】
本明細書にて使用される用語「哺乳類様Ｎ−グリコシル化」は、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株内で生成された糖蛋白質のＮ−グリカンが、５つ又はそれ未満のマンノース残基を含み、そして哺乳類細胞、例えばヒト細胞において生じた蛋白質のＮ−グリカンの生合成におけるＮ−グリカン又は中間体糖質構造の特徴を有することを意味する。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株において生成された糖蛋白質は、５つ又はそれ未満のマンノース残基、及びマンノース残基を含むコア構造及びターミナルガラクトース残基に結合した少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。例えば、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株内で生成された糖蛋白質は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有し、図１に描写されるとおりである。この糖質（ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）のＩＵＰＡＣの命名は、Ｇａｌ（β−１，４）ＧｌｃＮａｃ（β−１，２）Ｍａｎ（α−１，３）｛Ｍａｎ（α−１，３）［Ｍａｎ（α−１，６）］Ｍａｎ（α−１，６）｝Ｍａｎ（β−１，４）ＧｌｃＮａｃ（β−１，４）ＧｌｃＮａｃである。その拡大された命名は、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−｛α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→３）−［α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→６）］−α−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→６）｝−β−Ｄ−Ｍａｎｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→４）−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃである。
【００２６】
ピキア、特にピキアパストリスを含むメチロトローフ酵母の細胞質網状構造（ＥＲ）を通り過ぎる糖蛋白質上のＮ−グリカンの大多数は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２オリゴサッカライド構造を有する。糖蛋白質がＥＲからゴルジ体に輸送された後は、追加のマンノース残基が別のマンノシルトランスフェラーゼによりこのコア糖部分に追加されて、高マンノースコア又は延長されて分枝したマンナン外部鎖からなるオリゴサッカライド構造を有する糖蛋白質をもたらす。
【００２７】
本発明によれば、哺乳類様グリコシル化を伴う組換え糖蛋白質を生成するためには、メチロトローフ酵母を修飾することにより、一連の工程において糖質構造Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を哺乳類様Ｎ−グリカンに変換する酵素を発現させる。好ましくは、メチロトローフ酵母は、高マンノース構造の生産に関与する一つ又はそれより多い酵素、例えばＯＣＨ１遺伝子によりコードされるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの発現を不活性化するようにも修飾される。
【００２８】
本明細書において使用される用語「メチロトローフ酵母」は、限定ではないが、メタノール上で生育できる酵母株、例えば、属カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、及びピキアを含む。本発明の好ましいメチロトローフ酵母は、属ピキアの株である。特に好ましいのは、ピキアパストリス株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１），ＧＳ１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４），ＰＰＦ１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７），ＰＰＹ１２０Ｈ，ＹＧＣ４，及びそれらに由来する株である。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、コアのマンノース含有構造及びターミナルガラクトース残基に結合した５つ又はそれ未満のマンノース残基及び少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有する特徴を有する、哺乳類様Ｎ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生成する遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を提供する。
【００３０】
好ましい態様において、本発明は、哺乳類様Ｎ−グリカン構造、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株を提供する。
【００３１】
本発明によれば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖蛋白質を生じる上記のメチロトローフ酵母株は、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するように遺伝子操作される。好ましくは、当該メチロトローフ酵母株は、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子が不活性化されるようにも遺伝子操作される。
【００３２】
α−１，２−マンノシダーゼは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の非還元末端においてα−１，２−結合したマンノース残基を分断し、そして糖蛋白質上のこのコアのオリゴサッカライドをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換し、これは哺乳類Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのアクセプター基質である。
【００３３】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株を操作して、当該株に、例えば形質転換により、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を導入することにより、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を発現することができる。α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列は、如何なる種に由来することもできる。多数のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子がクローン化されて、当業者には利用可能であり、例えば、マウスのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９８６４−９８７１，１９９４）、ウサギのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｌａｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９−８７２−９８８１，１９９４）又はヒトα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８：５８５−５９５，１９９８）をコードする哺乳類遺伝子、並びに、例えば、アスペルギルスα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（ｍｓｄＳ遺伝子）、又はトリコデルマリセイα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５５−２６３，２０００）を含む真菌遺伝子を含む。蛋白質の配列分析が、これまでに同定された真核生物α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の間の高度の保存を明らかにした。
【００３４】
好ましくは、本ベクターにおける使用のためのヌクレオチド配列は、真菌のα−１，２−マンノシダーゼ、より好ましくは、トリコデルマリセイα−１，２−マンノシダーゼ、そしてより特定すれば、Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５５−６３（２０００）に記載されたトリコデルマリセイα−１，２−マンノシダーゼをコードする。
【００３５】
「機能部分」は、完全長蛋白質の酵素活性を実質上保持したα−１，２−マンノシダーゼのポリペプチド断片を意味する。「実質上」は、完全長α−１，２−マンノシダーゼの酵素活性の少なくとも約４０％、又は好ましくは少なくとも５０％またはそれ以上が保持されることを意味する。多数のα−１，２−マンノシダーゼの、触媒ドメインを含む様々なドメインの特性決定は、記録されている。例えば、”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ Ｇｏｌｇｉ ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｃＤＮＡ， ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｍａｍｍａｌｌｓ”，Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１３ ９８６４−７１（１９９４）；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｌｐｈａ １，２−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ”，Ｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１３ ９８７２−８１（１９９４）；”Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｓ １，２−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ”，Ｍａｒａｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７７：２５５−６３（２０００）；及び米国特許出願２００２０１８８１０９を参照されたく、引用により本明細書に編入される。当業者は、当業界で公知の技術の組み合わせを用いることによりα−１，２−マンノシダーゼの機能部分を容易に同定して作成することができる。適切な発現系から発現されて精製された目的のα−１，２−マンノシダーゼの一部の活性は、引用により本明細書に編入される米国特許出願２００２０１８８１０９に記載されたインビトロ又はインビボアッセイを用いることにより確認することができる。
【００３６】
本発明によれば、メチロトローフ酵母内で発現されたα−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、好ましくは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（α−１，２−マンノシダーゼの基質）が糖蛋白質上で既に形成されているが、追加のマンノース残基により糖鎖を伸長するゴルジ体のグリコシルトランスフェラーゼには到達していない分泌経路中の部位を標的化する。本発明の好ましい態様において、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分は、α−１，２−マンノシダーゼがメチロトローフ酵母株内で発現されてＥＲを標的化するように、ＥＲ滞留シグナルを含むように操作される。
【００３７】
「ＥＲ滞留シグナル」は、ＥＲに輸送されてＥＲ中で滞留するようにペプチド配列を有する蛋白質を指示するペプチド配列を意味する。そのようなＥＲ滞留配列は、しばしば、ＥＲ中に存在して機能する蛋白質の中に見いだされる。ＥＲ滞留シグナルの複数の選択が当業者に利用可能であり、例えば、サッカロミセスセレビシエのＥＲ蛋白質のＭＮＳ１の最初の２１アミノ酸残基（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０：１１７１−１１７７，１９９８）及びペプチドＨＤＥＬ（配列番号：１）である。
【００３８】
本発明における使用のための好ましいＥＲ滞留シグナルは、ペプチドＨＤＥＬ（配列番号：１）である。ＨＤＥＬペプチド配列は、多数の酵母蛋白質のＣ−末端に見いだされ、ＥＲのための滞留／修正（retrieval）シグナルとして作用する（Ｐｅｌｈａｍ ＥＭＢＯ Ｊ．７：９１３−９１８，１９８８）。ＨＤＥＬ配列を有する蛋白質は、膜結合受容体（Ｅｒｄ２ｐ）により結合して、次に、ゴルジ体からＥＲに戻るための逆行（retrograde）輸送経路に入る。
【００３９】
本発明における使用のためのα−１，２−マンノシダーゼは、さらに、例えば、抗体が利用可能なエピトープタグを含むように操作することができ、例えば、当業界でよく知られているＭｙｃ，ＨＡ，ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６タグである。エピトープタグを付加されたα−１，２−マンノシダーゼは、発現及び細胞外局在化の両方のために便利に精製、又は監視され得る。
【００４０】
本発明によれば、ＥＲ滞留シグナルを、α−１，２−マンノシダーゼの蛋白質配列のどこか、しかし好ましくはα−１，２−マンノシダーゼのＣ末端において、遺伝子操作することにより配置することができる。
【００４１】
ＥＲ滞留シグナル及びエピトープタグは、当業界公知の分子生物学の技術の何れかを用いて、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列に、そのようなシグナル又はタグをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分に容易に挿入することができる。
【００４２】
操作された酵母株内でのα−１，２−マンノシダーゼの発現は、ｍＲＮＡレベルにおいては例えばノーザンブロット分析により、そして蛋白質レベルにおいてはウエスタンブロット分析により確認することができる。蛋白質の細胞内局在は様々な技術を用いることにより分析することができ、細胞成分分画（subcellular fractionation）及び免疫蛍光の実験を含む。α−１，２−マンノシダーゼもＥＲ中での局在は、細胞成分分画実験においてこの酵素と公知のＥＲ滞留蛋白質（例えば、プロテインジスルフィドイソメラーゼ）との共沈殿により決定することができる。ＥＲ中の局在は、ＥＲ滞留蛋白質の免疫蛍光染色パターン特性、典型的には核周囲染色パターンにより、決定することもできる。
【００４３】
メチロトローフ酵母株中で発現されたα−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分が期待されたマンノーストリミング活性を有することを確認するために、インビトロ及びインビボ両方のアッセイを用いることができる。典型的には、インビトロアッセイは、インビトロで合成された基質、例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の免疫酵母株で発現されて精製された酵素による消化、及びそのような酵素がＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を例えばＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に削る能力を評価することを含む。インビボアッセイにおいては、α−１，２−マンノシダーゼ又はその一部をメチロトローフ酵母内で、そのような酵母内でＮ−グリカンを生じるターミナルα−１，２−結合したマンノース残基によりグリコシル化されることが知られている糖蛋白質と同時発現させる。そのようなα−１，２−マンノシダーゼ又はその一部の酵素活性は、糖蛋白質のＮ−グリカンの構造中のα−１，２−結合したマンノース残基の数の低下に基づいて測定することができる。インビトロ及びインビボの両アッセイにおいて、糖質基の組成は、当業界でよく知られており且つ本明細書の以下の実施例において例示される技術を用いて測定することができる。
【００４４】
さらに、本発明によれば、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列をマンノース酵母株に、例えば形質転換により導入することにより、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ又はその機能部分を発現するようにマンノース酵母株を操作することができる。ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩはβ−１，２−ＧｌｃＮＡｃのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への付加に必須であり、糖蛋白質上のこのコアオリゴサッカライドをＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へ変換する。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のマンノース残基は哺乳類ゴルジ体マンノシダーゼＩＩによりさらに削られて、追加の糖ユニット、例えばガラクトースが哺乳類糖蛋白質のハイブリッド−又はコンプレックス−タイプの糖ブランチ特性を形成するために（towards）追加される。
【００４５】
メチロトローフ酵母株への導入のためのＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列は、あらゆる種、例えば、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線虫及び原生動物、例えばリーシュマニアタレントレを含む。好ましくは、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、ヒトＧｎＴＩであり、そしてより好ましくは配列番号：１３に示されるヒトＧｎＴＩである。
【００４６】
ＧｎＴＩの「機能部分」は、完全長のＧｎＴＩの酵素活性を実質上保持するＧｎＴＩのポリペプチド断片を意味する。「実質上」は、少なくとも約４０％、又は好ましくは少なくとも約５０％またはそれ以上の完全長のＧｎＴＩの酵素活性が保持されることを意味する。ＧｎＴＩ又はその一部の酵素活性は、Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９（２１）：１３４１９−２４，２００２）；Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９（３）：７０１−７，１９９７），又は本明細書中の以下の実施例に記載されるアッセイにより測定することができる。当業者は、当業界で公知の技術の組み合わせを用いてＧｎＴＩの機能部分を容易に同定して作成することができる。例えば、本発明により例示されるとおり、ヒトＧｎＴＩの触媒ドメイン（最後の３２７残基を含む）はヒトＧｎＴＩの「機能部分」を構成する。
【００４７】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株において発現されたＧｎＴＩ又はその機能部分は、好ましくは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｎＴＩの基質）が糖蛋白質上に既に形成された分泌経路中の部位を標的化する。好ましくは、ＧｎＴＩ又はその機能部分はゴルジ体を標的化する。
【００４８】
従って、本発明の好ましい態様においては、ＧｎＴＩ又はその機能部分がゴルジ体局在化シグナルを含むように操作される。
本明細書において使用される「ゴルジ体局在化シグナル」は、ペプチド配列であって、そのような配列を有する蛋白質をメチロトローフ酵母株のゴルジ体に振り向け（directs）、そして当該蛋白質をその中に保持するペプチド配列を意味する。そのようなゴルジ体局在化配列は、ゴルジ体に存在して機能する蛋白質中にしばしば見いだされる。
【００４９】
ゴルジ体局在化シグナルの選択は、当業者に利用可能である。本発明における使用のための好ましいゴルジ体局在化シグナルは、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２蛋白質（ＳｃＫｒｅ２）のＮ末端部分に由来するペプチド；より好ましくは配列番号：１０に示されるＳｃＫｒｅ２である。特に好ましいゴルジ体局在化シグナルは、配列番号：１０に示されるＳｃＫｒｅ２蛋白質のアミノ酸１−１００からなる、ペプチド（配列番号：１１）である。
【００５０】
本発明によれば、ゴルジ体局在化シグナルは、ＧｎＴＩ内の如何なる場所に配置されてもよいが、好ましくはＧｎＴＩの末端、そしてより好ましくはＧｎＴＩのＮ末端に配置され得る。
【００５１】
本発明における使用のためのＧｎＴＩは、例えば、抗体が利用可能なエピトープタグ、例えば、当業界でよく知られているＭｙｃ，ＨＡ，ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６を含むようにさらに操作され得る。エピトープタグを付加されたＧｎＴＩは便利に精製されるか、又は発現及び細胞内局在に関して監視され得る。
【００５２】
ゴルジ体局在化シグナル及びエピトープタグは、当業界公知の分子生物学の技術の何れかを用いて、ＧｎＴＩ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列に、そのようなシグナル又はタグをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、ＧｎＴＩ又はその機能部分に容易に挿入することができる。
【００５３】
さらに、本発明によれば、メチロトローフ酵母株をβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列をマンノース酵母株に、典型的には形質転換により導入することにより、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するようにマンノース酵母株を操作することができる。ＧａｌＴはβ−１，４−ガラクトース残基をグリカン構造（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）の左のアーム上のＧｌｃＮＡｃへの付加し、図１に描写されるとおりである。
【００５４】
メチロトローフ酵母株への導入のためのＧａｌＴ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列は、あらゆる種、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、マウス）、植物（例えば、アラビドプシスサリアナ）、昆虫（例えば、ドロソフィラメラノガスター）、又は線虫（シーノラブディティスエレガンス）に由来することができる。好ましくは、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、ヒトＧａｌＴ、そしてより好ましくは配列番号：２１に示されたヒトＧａｌＴをコードする。
【００５５】
ＧａｌＴの「機能部分」は、完全長のＧａｌＴの酵素活性を実質上保持するＧａｌＴのポリペプチド断片を意味する。「実質上」は、少なくとも約４０％、又は好ましくは少なくとも約５０％またはそれ以上の完全長のＧａｌＴの酵素活性が保持されることを意味する。ＧａｌＴ又はその一部の酵素活性は、Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９（３）：７０１−７，１９９７），又は本明細書中の以下の実施例に記載されるアッセイにより測定することができる。当業者は、当業界で公知の技術の組み合わせを用いてＧａｌＴの機能部分を容易に同定して作成することができる。例えば、本発明により例示されるとおり、ヒトＧａｌＴの触媒ドメインはヒトＧａｌＴの「機能部分」を構成する。
【００５６】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株において発現されたＧａｌＴ又はその機能部分は、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｌｃＮＡｃＭの基質）が糖蛋白質上に既に形成された分泌経路中の部位を標的化する。好ましくは、ＧａｌＴ又はその機能部分はゴルジ体を標的化する。
【００５７】
従って、本発明の好ましい態様において、ＧａｌＴ又はその機能部分は、上で記載されたとおり、ゴルジ体局在化シグナルを含むように操作される。ＧａｌＴをゴルジ体に標的化するための好ましいゴルジ体局在化シグナルは、配列番号：１０に示されるＳｃＫｒｅ２蛋白質のアミノ酸１−１００からなる、ペプチド（配列番号：１１）である。
【００５８】
本発明における使用のためのＧａｌＴは、例えば、抗体が利用可能なエピトープタグ、例えば、当業界でよく知られているＭｙｃ，ＨＡ，ＦＬＡＧ及びＨｉｓ６を含むようにさらに操作され得る。エピトープタグを付加されたＧａｌＴは便利に精製されるか、又は発現及び細胞内局在に関して監視され得る。
【００５９】
ゴルジ体局在化シグナル及びエピトープタグは、当業界公知の分子生物学の技術の何れかを用いて、ＧａｌＴ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列に、そのようなシグナル又はタグをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、ＧａｌＴ又はその機能部分に容易に挿入することができる。
【００６０】
メチロトローフ酵母株内での所望の蛋白質（即ち、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ，ＧａｌＴ，又はこれらの酵素の何れかの機能部分）の発現を達成するためには、当該蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、上記メチロトローフ酵母株内で機能するプロモーター及び３’終結配列に作動可能なような連結にてベクター内に配置させることができる。当該ベクターを、次に、メチロトローフ酵母株へ、例えば、形質転換により導入する。
【００６１】
メチロトローフ酵母内で蛋白質の発現に適したプロモーターは、構成的プロモーター及び誘導可能なプロモーターの両方を含む。構成的プロモーターは、例えば、ピキアパストリスのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター（「ＧＡＰプロモーター」）を含む。誘導可能なプロモーターの例は、例えば、ピキアパストリスの「アルコールオキシダーゼＩプロモーター（「ＡＯＸプロモーター」）（米国特許第４，８５５，２３１号）、又はピキアパストリスのホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（「ＦＬＤプロモーター」）（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２１６：９３−１０２，１９９８）を含む。
【００６２】
３’終結配列は、当該配列が作動可能に連結した遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化するために機能する構造遺伝子の停止コドンの３’の配列であり、例えば、ポリアデニル化を導く配列である。３’終結配列は、ピキア又はメチロトローフ酵母から得ることができる。本発明の実施に有用なピキアパストリスの３’終結配列の例は、ＡＯＸ１遺伝子及びＨＩＳ４の遺伝子由来の終結配列を含む。
【００６３】
ベクター又はその直鎖状断片の形質転換は、あらゆる公知の方法、例えば、Ｃｒｅｇｇ ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１２）：３３７６−８５，１９８５）により記載されたようなスフェロプラスト技術、又はＥＰ３１２，９３４に記載されたピキアにおける使用のために修飾された、Ｉｔｏら（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４８（２）：３４１，（１９８４））により記載された全細胞塩化リチウム酵母形質転換系を用いて実施することができる。形質転換に有用な他の方法は、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９（１９７８））；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３（１９８３））；米国特許第４，８７９，２３１号；及びＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ５９：１１５（１９８７））に記載された方法を含む。エレクトロポレーション及びＰＥＧ１０００全細胞形質転換手法を使用することもできる。Ｃｒｅｇｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．２７−３９（１９９８）を参照。
【００６４】
形質転換された酵母細胞は、限定ではないが、（細胞の栄養要求性のために）必要とされる生化学生成物の不在下での形質転換後に栄養要求性細胞を培養すること、新規な表現型の選択及び検出、又は形質転換体内に含まれる耐性遺伝子の不在下で当該酵母に毒性の抗生物質の存在下で培養することを含む、適切な技術を用いることにより選択することができる。形質転換体はゲノム中の発現カセットの組み込みにより選択及び／又は確認することもでき、例えばサザンブロット又はＰＣＲ分析により評価することができる。
【００６５】
上で記載されたとおり、α−１，２−マンノシダーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、又はその機能部分の発現に加えて、上記メチロトローフ酵母株は、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを有する糖蛋白質を有効に生成するためにゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するように遺伝子操作もされる。
【００６６】
ＯＣＨ１遺伝子は、初期ゴルジ体複合体内に局在化してＮ−結合コアオリゴサッカライド（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）へのα−１，６−ポリマンノース外部鎖付加を開始する膜結合性α−１，１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードする。サッカロミセスセレビシエのＯＣＨ１遺伝子及びピキアのＯＣＨ１遺伝子はクローン化されている（それぞれ、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２５１１−１９，１９９２、及び日本特許出願番号０７１４５００５）。当業者は、当業界で公知の技術を用いることにより、他のメチロトローフ酵母からＯＣＨ１遺伝子を単離することができる。
【００６７】
本発明によれば、メチロトローフ酵母株のＯＣＨ１遺伝子の破壊は不活性蛋白質産物の生成か又は生成物なしの何れかをもたらし得る。当該破壊は、外来ＤＮＡ配列の上記コーディング配列への挿入の形態及び／又は当該コーディング配列の幾つか又は全ての欠失の形態を採ってよい。遺伝子破壊は、相同組換えにより生じさせることができ、本質的にはＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｖｏｌ １０１：２０２−２１１，１９８３）に記載される。
【００６８】
二重相同組換えによりゲノミックＯＣＨ１遺伝子を破壊するためには、ＯＣＨ１「ノックアウト」ベクターを構築することができ、それは相同組換えを媒介するのに十分な長さのＯＣＨ１遺伝子の一部に対してその５’及び３’末端の両方において作動可能に連結された選択可能なマーカー遺伝子を含む。当該選択可能マーカーは、宿主細胞栄養要求性を相補するか又は抗生物質耐性を提供するあらゆる数の遺伝子の一つであり得、ＵＲＡ３，ＡＲＧ４，ＨＩＳ４，ＡＤＥ１，ＬＥＵ２，ＨＩＳ３，Ｓｈ ｂｌｅ（ストレプトアロテイカスヒンダスタヌスのブレオマイシン遺伝子）及びＢＳＤ（アスペルギルステレウスからのブラスチシジンＳデアミナーゼ）遺伝子を含む。他の適切な選択可能マーカーは、メチロトローフ酵母の蔗糖上の生育を可能にさせるサッカロミセスセレビシエ由来のインベルターゼ遺伝子；活性βガラクトシダーゼの発現のために青いコロニーをもたらすｌａｃＺ遺伝子を含む。ＯＣＨ１不活性化ベクターの直鎖状ＤＮＡ断片は、その５’及び３’両末端においてＯＣＨ１配列と共に選択可能マーカーを含み、のちに、当業界で公知の形質転換方法の何れかを用いることにより宿主メチロトローフ酵母細胞内に導入される。直鎖状断片のゲノミックＯＣＨ１座への組み込み及びＯＣＨ１遺伝子の破壊は、選択可能マーカーに基づいて測定することができ、そして例えば、サザンブロット分析により確認することができる。
【００６９】
或いは、ＯＣＨ１遺伝子の一部を含み、但し当該一部はあらゆるＯＣＨ１プロモーター配列を欠き、そしてＯＣＨ１蛋白質を全くコードしないか又は不活性部分をコードする、ＯＣＨ１遺伝子ノックアウトベクターを構築することができる。「不活性断片」は、完全長ＯＣＨ１蛋白質の断片であって、当該断片が完全長のＯＣＨ１蛋白質の活性の、好ましくは約１０％未満、そしてより好ましくは約０％を有するものを意味する。ＯＣＨ１遺伝子のそのような部分は、メチロトローフ酵母において機能するあらゆるプロモーター配列に作動可能に連結されずにベクター内に挿入される。このベクターは、ＯＣＨ１遺伝子内の部位においてのちに直鎖状化され、そして当業界で公知のあらゆる形質転換方法を用いてメチロトローフ酵母株を形質転換することができる。１回の相同組換えにより、この直鎖状化されたベクターは次にＯＣＨ１座に組み込まれて、染色体中に２つのｏｃｈ１配列をもたらすが、何れもが活性なＯｃｈ１ｐ蛋白質を生成することができず、図３Ａに描写されるとおりである。
【００７０】
好ましくは、不活性化変異を直鎖状化された部位の５’（上流の）部位及びＯＣＨ１の翻訳開始コドンの３’（下流）の部位においてベクター中のｏｃｈ１配列内にも挿入される。「不活性化変異（inactivating mutation）」は、停止コドンを導入する変異、フレームシフト変異又は読み枠の破壊を引き起こすあらゆる他の変異を意味する。そのような変異は、当業界で公知の部位特異的変異導入方法の何れかを用いてベクター内にｏｃｈ１配列内に導入され得る。そのような不活性化変異は、たとえノックアウトベクター中のＯｃｈ１配列に対して５’に幾つかのプロモーター配列が存在しようとも、機能しないＯｃｈ１ｐ蛋白質が相同組換え後に形成されることを保証する。
【００７１】
本明細書において上で記載されたような遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株は、所望であればさらに修飾することができる。例えば、あらゆるその他のピキアのマンノシルトランスフェラーゼをコードする追加の遺伝子の破壊を作成することができる。α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ又はＧａｌＴ以外の哺乳類グリコシル化経路中で機能する酵素をコードする遺伝子が、哺乳類様Ｎ−グリカンの比率を増加させるため、及び／又は、所望であれば哺乳類様Ｎ−グリカンをさらに修飾するために、導入することができる。例えば、上で記載された遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株をさらに修飾することにより、ＵＤＰ−グルコースをＵＤＰ−ガラクトースに、そして逆もまた同じく変換するサッカロミセスセレビシエのＧＡＬ−１０にコードされた酵素を発現することができる。これは、サイトゾルのＵＤＰ−ガラクトースのレベルを増加させるかもしれず、次に、ＧａｌＴの活性を刺激してＧａｌＧｌｃＮａｃＭ５ＧｌｃＮａｃ２グリカンの比率を増加させる。さらに、上で記載された遺伝子操作されたメチロトローフ酵母は、ゴルジ体中でマンノシダーゼＩＩを発現するようにさらに修飾され得て、ＧａｌＧｌｃＮａｃＭ５ＧｌｃＮａｃ２から追加のマンノース残基を除去し、それにより他の糖残基の追加を許容する。
【００７２】
遺伝子修飾の順序は本発明には必須ではない。α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧａｌＴをコードするヌクレオチド配列の導入、及びゲノミックＯＣＨ１遺伝子の破壊は、連続してか、如何なる順序でも、又は同時に、２つ又はそれより多い別々のベクター又はコーディング配列により共形質転換（co-transformation）することによるか又は２つ又はそれより多い別々のコーディング配列を含む一つのベクターによる形質転換により行うことができる。
【００７３】
さらなる側面において、本発明は、５又はそれ未満のマンノース残基及びコアマンノース含有構造並びにターミナルガラクトース残基に結合した少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有するものとして特徴付けされる哺乳類様Ｎ−グリカン構造、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する構造を生じるメチロトローフ酵母株を生じさせるのに有用なベクターを提供する。
【００７４】
一つの態様において、本発明は、発現される酵素、即ち、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ，ＧａｌＴ，又はこれらの酵素の何れかの機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。そのようなベクターは、「ノックイン」ベクターとも呼ばれる。コーディング配列は、コードされた蛋白質の発現のために宿主メチロトローフ酵母において機能するプロモーター及び３’終結配列に作動可能に連結して配置され得る。２つ又はそれより多いコーディング配列をメチロトローフ酵母株への同時形質転換のための同じベクター内に入れることができる。好ましくは、当該ベクターは、形質転換の便利な選択のための上で記載された選択可能なマーカー遺伝子の何れか一つも含む。
【００７５】
本発明によれば、ノックインベクターは、メチロトローフ酵母株内で発現される所望の蛋白質をコードする配列を含み、組み込み型ベクター又は複製型ベクター（例えば、複製型環状プラスミド）の何れかであり得る。組み込み型ベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号に開示されており、引用により本明細書に編入される。組み込み型ベクターは、通常、少なくとも第１の挿入可能ＤＮＡ断片、選択可能なマーカー遺伝子、及び第２の挿入可能なＤＮＡ断片の連続して並んだ配置（serially arranged sequence）を含む。第１及び第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、各々、約２００ヌクレオチドの長さであり得て、形質転換される種のゲノミックＤＮＡの一部に相補なヌクレオチド配列を有する。発現のための目的の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列をこのベクター中で第１の挿入可能ＤＮＡ断片と第２の挿入可能ＤＮＡ断片の間に挿入するが、マーカー遺伝子の前又は後である。組み込み型ベクターは宿主細胞ゲノムへの目的のヌクレオチド配列の組み込みを促進するために酵母形質転換に先立って直鎖状にすることができる。
【００７６】
別の態様において、本発明は、メチロトローフ酵母株に導入されたときにゲノムＯＣＨ１遺伝子を不活性化するか又は破壊する不活性化ベクター（又は「ノックアウト」ベクター）を提供する。
【００７７】
ゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するためのベクターは、上で記載されたとおり、相同組換えを媒介するのに十分な長さのＯＣＨ１遺伝子の一部に、その５’及び３’末端の両方において作動可能に連結した選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。メチロトローフ酵母細胞の、その５’及び３’末端の両方においてＯＣＨ１配列を選択可能なマーカー遺伝子と共に含み得るそのようなＯＣＨ１不活性化ベクターの直鎖状ＤＮＡ断片による形質転換は、ゲノミックＯＣＨ１座への直鎖状断片の組み込み及びゲノミックＯＣＨ１遺伝子の破壊を導く。
【００７８】
或いは、ＯＣＨ１不活性化ベクターは、破壊されるＯＣＨ１遺伝子の一部及び上で記載された選択可能なマーカー遺伝子の何れか一つを含むことができるが、上記一部はＯＣＨ１蛋白質を何もコードしないか又はＯＣＨ１蛋白質の不活性断片をコードする。そのようなＯＣＨ１遺伝子の一部は如何なるＯＣＨ１プロモーター配列をも欠き、そして如何なるプロモーター配列に対しても作動可能に連結していない。そのようなベクターはＯＣＨ１遺伝子内の部位において直鎖状化し、そして次にメチロトローフ酵母株を形質転換することができ、１回の相同組換え媒介性の組み込みにより、ゲノミックＯＣＨ１遺伝子の不活性化をもたらす。好ましくは、不活性化変異、例えば、停止コドン又はフレームシフト変異も、直鎖状化部位の５’（上流）の部位及びＯＣＨ１の翻訳開始コドンの３’（下流）の部位においてベクター中のＯＣＨ１配列内に導入される。
【００７９】
所望であれば、メチロトローフ酵母株中で発現される酵素をコードするヌクレオチド配列は、「ノックインアンドノックアウト」ベクターを創製するために、同じベクター中でゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化することができるヌクレオチド配列と組み合わせることができる。
【００８０】
ノックインベクター及びノックアウトベクターの両方を含む本発明のベクターは、細菌中で機能する選択可能なマーカー遺伝子、並びに細菌中で複製及び細胞外染色体の維持管理に必須の配列をも含むことができる。細菌の選択可能なマーカー遺伝子の例は、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔｒ）、ハイグロマイシン耐性、ブラスチシジン耐性及びゼオシン耐性（Ｚｅｏｒ）遺伝子を含む。
【００８１】
さらに、上記のベクターの何れも、さらに、メチロトローフ酵母株中でのそのような糖蛋白質の発現のための、目的の糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８２】
さらに別の側面において、本発明は、哺乳類様Ｎ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生じさせる方法を提供する。
本明細書にて使用される「糖蛋白質」は、一つ又はそれより多いアスパラギン残基上又は一つ又はそれより多いセリン又はスレオニン残基、又はアスパラギン及びセリン又はスレオニン残基の両方の上の何れかで、メチロトローフ酵母株中において、グリコシル化される蛋白質を意味する。好ましくは、糖蛋白質は宿主メチロトローフ酵母株に対して異種である。
【００８３】
本発明によれば、減少したグリコシル化を伴う目的の糖蛋白質の生産は、多数の様式において達成できる。例えば、目的の糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、哺乳類様Ｎ−グリカンを応じるように予め操作されたメチロトローフ酵母株に導入することができる。
【００８４】
糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、宿主株中で機能するプロモーター配列及び３’終結配列に対して作動可能に配置することができる。当該ヌクレオチド配列は、追加の配列、例えば、蛋白質生成物の分泌が望まれる場合に運搬（transit）ペプチドをコードするシグナル配列を含むことができる。そのようなシグナル配列は、よく知られており、容易に利用可能であって、サッカロミセスセレビシエのアルファメイティング因子プレプロ（αｍｆ）、ピキアパストリス酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列等を含む。
【００８５】
或いは、目的の糖蛋白質のコーディング配列を導入されたメイティング酵母株を修飾することにより、所望の酵素（即ち、ａ−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩ及びＧａｌＴ）を発現させ、そして上記のとおりにゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化し、それにより哺乳類様Ｎ−グリカンを有する糖蛋白質を生産することができる。
【００８６】
メイティング酵母株中で生産された糖蛋白質は慣用の方法により精製することができる。精製プロトコルは、精製される特定の蛋白質の性質により決定することができる。そのような決定は当業者の範囲内である。例えば、細胞培養培地を細胞から分離し、そして当該細胞から分泌される蛋白質を日常の単離技術、例えば沈殿、免疫吸着、フラクショネーション又は様々なクロマトグラフ法により培地から単離することができる。
【００８７】
本発明の方法により生産することができる糖蛋白質は、細菌、真菌又はウイルスの蛋白質又は抗原、例えば、バチルスアミロリクエファシエンスのα−アミラーゼ、サッカロミセスセレビシエのインベルターゼ、トリパノゾーマクルジのトランス−シアリダーゼ、ＨＩＶエンベロープ蛋白質、インフルエンザウイルスのＡヘマグルチニン、インフルエンザのノイラミニダーゼ、ウシヘルペスウイルスのタイプ１糖蛋白質Ｄ；蛋白質、哺乳類起源の蛋白質、例えばヒト蛋白質、成長因子又は受容体、例えば、ヒトアンギオスタチン、ヒトＢ７−１，Ｂ７−２及びＢ−７受容体ＣＴＬＡ−４，ヒト組織因子、成長因子（例えば、血小板由来の成長因子）、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−Ｉ、ウロキナーゼ、ヒトリソソーム蛋白質、例えば、α−ガラクトシダーゼ、プラスミノーゲン、トロンビン、因子ＸＩＩＩ；及びイムノグロブリン又はイムノグロブリンの断片（例えば、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２）を含む。本発明の遺伝子操作されたピキア株において発現され得る追加の有用な糖蛋白質に関しては、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ ａｎｄ Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１９３−２００（１９９９），及びＫｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９１５−９４４（１９８７）を参照されたい。
【００８８】
本発明の方法を用いて生産される糖蛋白質、即ち、哺乳類様のＮ−グリカン、特にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを有する糖蛋白質も、本発明の一部である。
【００８９】
また別の側面において、本発明は、上で記載された本発明のノックインベクター、ノックアウトベクター、又はノックインアンドノックアウトベクターの一つ又はそれより多くを含むキットを提供する。
【００９０】
より特定すれば、本発明のキットは、α−マンノシダーゼＩ又はその機能部分をコードする、好ましくはＥＲ滞留シグナルを含む、ヌクレオチド配列を有するベクター；ＧｎＴＩ又はその機能部分をコードする、好ましくはゴルジ体滞留シグナルを含む、ヌクレオチド配列を有するベクター；ＧａｌＴ又はその機能部分をコードする、好ましくはゴルジ体滞留シグナルを含む、ヌクレオチド配列を有するベクター；又はメチロトローフ酵母中でゲノミックＯＣＨ１遺伝子を破壊することができるベクター、又はその何れかの組み合わせを含む。
【００９１】
上記キットは、目的の異種糖蛋白質をコードする配列を有する核酸分子を含むこともできる。どのような核酸分子は、本明細書において前で記載されたノッキングイン又はノッキングアウトのための配列を含む別のベクター又は同じベクター内に提供することができる。或いは、キット中のノックイン又はノックアウトベクターは、目的の異種蛋白質をコードするヌクレオチド配列の挿入のための便利なクローニング部位を有する。
【００９２】
上記キットは、本明細書において前で記載された、ノックイン、ノックアウト又はノックインアンドノックアウトベクターの何れかにより形質転換され得るメチロトローフ酵母株を含むこともできる。或いは、上記キットは、哺乳類様Ｎ−グリカンを生じさせるために操作されたメチロトローフ酵母株を含むことができる。
【００９３】
本発明は、さらに、以下の実施例により例示される。
実施例１
方法と材料
ベクターの構築と形質転換
ピキアパストリス配列はＧｅｎＢａｎｋにて受け入れ番号Ｅ１２４５６（配列番号：２）にて見いだされ、日本特許出願番号０７１４５００５に記載され、引用により本明細書に編入される。この配列は、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの全ての典型的な特徴を示し、そしてサッカロミセスセレビシエのＯＣＨ１にほとんど相同であり、即ち、本明細書においてはピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子と呼ぶ。
【００９４】
ピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子の完全ＯＲＦを、ＰＣＲにより、鋳型として株ＧＳ１１５から単離されたゲノミックＤＮＡ、及び以下のオリゴヌクレオチド５’ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＣＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号：４）及び５’ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＧＴＣＣ（配列番号：５）を用いて単離した。単離されたＯＣＨ１遺伝子をｐＵＣ１８内にクローン化することにより、プラスミドｐＵＣ１８ｐＯＣＨ１を得て、ＯＣＨ１遺伝子配列の同定を配列決定により確認した。
【００９５】
プラスミドｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８（２８７５ｂｐ，配列番号：６、図３Ａに模式的に描写する）はＡｌａ２５−Ａｌａ１５５をコードするピキアパストリスＯＣＨ１のＯＲＦの断片を含み、当該断片はｐＰＩＣＺＢ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）のＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入された。２つの停止コドンをインフレームにてコドンＡｌａ２５の前に配置することにより、末端削除された蛋白質の起こり得る合成を阻止した。消化後のフィルイン及び再ライゲーションにより、ｐＰＩＣＺＢのポリリンカーのＢｓｔＢＩ部位を予め排除した。クローン化されたＯＲＦ１遺伝子の内部に位置する唯一のＢｓｔＢＩ部位を上記プラスミドの直鎖状化に用いることができる（不活性化戦略の全体像に関しては図３Ａを参照）。
【００９６】
ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５（５４８５ｂｐ，配列番号：９、図３Ｂに模式的に描写する）を以下のとおりに構築した。ピキアパストリスＨＩＳ４転写終結配列を含むｐＰＩＣ９（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）のＸｂａＩ／ＣｌａＩ断片を、ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈ Ｍ８のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位の間に挿入した。のちに、ＧＡＰプロモーター及びｐｒｅＭＦマンノシダーゼＨＤＥＬカセットを含むｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬ（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，５０３（２−３）：１７３−１７８，２００１）の２．３ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入した。この構築物のために使用される全ての制限部位（ＮｏｔＩ部位を除く）をクレノーＤＮＡポリメラーゼによりフィルインした。ｐＧＡＰＺＭＦｍａｎＨＤＥＬ内の唯一のＢｓｔＢＩ部位を、消化後のフィルイン及び再ライゲーションにより排除した。
【００９７】
ヒトＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ（ＧｎＴＩ）をゴルジ体に標的化するため、ＧｎＴＩのＮ−末端部分を、酵母のゴルジ体における直鎖状化に必須のサッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２のＮ−末端部分により置き換えた（Ｌｕｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１３１（４）：９１３−９２７，１９９５）。プラスミドＹＥｐ３５２Ｋｒｅ２（Ｈｏｗａｒｄ Ｂｕｓｓｅｙ博士、ＭｃＧｉｌｌ大学、モントリオール、カナダ、により提供）を生成したが、Ｋｒｅ２遺伝子のＳａｃＩ／ＰｖｕＩＩ断片を、ＳａｌＩ（クレノーにより平滑化）及びＳａｌＩにより消化されていたＹｅｐ３５２ベクターに挿入することにより生成した。ＹＥ３５２Ｋｒｅ２をＳａｃＩ／ＰｖｕＩにより消化してＴ４−ポリメラーゼにより平滑化した。Ｋｒｅ２遺伝子の５’末端を単離して、クレノー平滑化されたＳｇｒＡＩ／ＸｂａＩにより開いたｐＵＣｈＧｎＴＩ（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４９（３）：７０１−７０７，１９９７）にクローン化した。２つのＤＮＡ断片の融合場所を標準手法を用いて配列決定した。結果のＫｒｅ２−ＧｎＴＩオープンリーディングフレームは、Ｋｒｅ２遺伝子のＮ−末端部分（配列番号：１１に示されるとおり、Ｋｒｅ２蛋白質の最初の１１０アミノ酸をコードする）及びＧｎＴＩの触媒ドメイン（配列番号：１３に示されるとおり、ＧｎＴＩ蛋白質の最後の３２７アミノ酸）を含み、ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩにより二重消化して、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで開いたｐＰＩＣ６Ａベクター（インビトロジェン）内へ、両断片をクレノーポリメラーゼにより平滑化した後に、連結した。結果のプラスミドはｐＰＩＣ６ＡＫｒｅｃｏＧｎＴＩと命名した（配列番号：１４、図３Ｃにおいて模式的に描写される）。それは、メタノールにより誘導可能なＡＯＸ１プロモーターの制御下にＫｒｅ２ＧｎＴＩのオープンリーディングフレームを、そして抗生物質ブラスチシジンに対して耐性のアスペルギルステレウスカラノＢＳＤ遺伝子を含む。
【００９８】
ＧａｌＴの局在化は、ＧｎＴＩを標的化するために行われたのと同じ様式にて、Ｋｒｅ２ｐのＮ末端部分へのＧａｌＴの触媒ドメインの融合により達成された。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをｈｅｐｇ２のｃＤＮＡライブラリーからオリゴヌクレオチド５’ＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ（配列番号：１５）及び５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣ（配列番号：１６）をスターター配列として用いて増幅した。増幅された断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩにてｐＵＣ１８にクローン化された。ＧａｌＴ蛋白質のＮ末端の７７アミノ酸を削除するため、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを実施した：５’ＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ（配列番号：１５）及び５’ＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣ（配列番号：１７）。増幅された断片をＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに切断して、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｇｒＡ Ｉクレノー平滑化ｐＵＣＫｒｅＧｎＴＩベクターに連結した。結果のＫｒｅ２−ＧａｌＴ融合構築物を再びＰＣＲによりプライマー：５’ＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ（配列番号：１８）及び５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＴＡＡＧ（配列番号：１９）を用いて増幅した。増幅された断片をＥｃｏＲＶ／ＢｓｔＢ ＩにてｐＢＬＵＲＡ ＩＸ（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２６３：１５９−１６９，２００１）（Ｊａｍｅｓ Ｃｒｅｇｇ（オレゴンインスティチュートオブサイエンスアンドテクノロジー、ビーバートン、ＵＳＡ）より提供）に挿入した。最後に、ＵＲＡ３遺伝子をカナマイシン耐性カセットにより置き換えたが、ベクターｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ４からのＳｐｅＩ／ＳｍａＩ断片をＳｐｅＩ／ＳｓｐＩにおいて開いたプラスミドに連結することによった。最後のプラスミドはｐＢＩＫａｎＭＸ４ＫｒｅｈＧａｌＴ（配列番号：７、図３Ｄに模式的に描写される）と呼ばれるが、ＡＯＸ１プロモーターに作動可能に連結したＫｒｅ２−ＧａｌＴ融合蛋白質をコードする配列を含んだ。当該融合蛋白質は、Ｋｒｅ２の最初の１００アミノ酸及びＧａｌＴの最後の３２０アミノ酸から構成された。
【００９９】
これらのプラスミドによる、様々な蛋白質を発現するＧＳ１１５ピキア株に対する形質転換は、前に記載されたとおりに行った（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０３：２７−３９，１９９８）。ＰｐＯＣＨ１座における正確なゲノミックインテグレーションは、ゲノミックＤＮＡ上のＰＣＲにより確認した。
蛋白質の調製
分泌されたトリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼを、ＨＩＣ、アニオン交換及びゲル濾過クロマトグラフの組み合わせを用いて、記載されたとおりに精製した（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７７（２−３）：２５５−２６３，２０００；Ｖａｎ Ｐｅｔｅｇｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１２（１）：１５７−１６５，２００１）。全てのＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験は１０％ＰＡＡゲル上において標準泳動条件下で行った。酵母の細胞壁のマンノ蛋白質をＢａｌｌｏｕ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８５：４４０−４７０，１９９０）に記載されたとおりに放出させたが、０．９％のＮａＣｌ水溶液中の酵母細胞の大規模な洗浄、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ中の酵母細胞の延期されたオートクレーブ（９０分）、続くメタノール沈殿（４容）を含んだ。
Ｎ−グリカン分析
ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡ配列決定機（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）上でのレーザー誘導性ＤＮＡ配列決定機補助によるフルオロフォア補助糖質電気泳動により、記載されたとおりに（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１（４）：２７５−２８１，２００１）、Ｎグリカン分析を行った。簡単に言えば、糖蛋白質を、マルチスクリーンイムノビロン−Ｐ上に固定化し、そしてＰＮＧａｓｅ処理により脱グリコシル化した。Ｎ−グリカンを除去し、そしてＡＰＴＳにより誘導した。過剰の標識をセファデックスＧ１０樹脂上のサイズ分画により除去した。ＡＰＴＳ−標識されたオリゴサッカライドの蒸発後に、ＲＯＸ−標識されたＧＥＮＥＳＣＡＮ ５００標準混合物（アプライドバイオシステムズ）を加えて、内部標準化を許容した。この混合物をＡＢＩ ３７７Ａ ＤＮＡ配列決定機（アプライドバイオシステムズ）上で、１２％ポリアクリルアミドゲルにより、８９ｍＭ Ｔｒｉｓ，８９ｍＭ 硼酸塩、２．２ｍＭ ＥＤＴＡバッファー中で泳動した。各ゲル上で、ウシＲＮａｓｅ ＢとマルトデキストロースラダーのＮ−グリカンをレファレンスとして泳動した。データ解析は、ＧＥＮＥＳＣＡＮ ３．１ソフトウエア（アプライドバイオシステムズ）を用いて実施した。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Ｇｌｙｋｏ）及びβ−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）によるエキソグリコシダーゼ処理を、標識されたグリカン上で、一晩、３７℃において２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５中で実施した。慣用のＦＡＣＥ（Ｎ−グリカンのＡＮＴＳ標識と３０％ＰＡＡミニゲル上の電気泳動）をＪａｃｋｓｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２７０（３）：７０５−７１３，１９９０）により記載されたとおりに実施した。ＤＳＡ−ＦＡＣＥ法は非常に高い解析度と感度を有するが、慣用のＦＡＣＥは高分子量のＮ−グリカン（「高グリコシル化」）の複合混合物の検出によく適合されており、分解されていなかった（not resolved）ので、慣用のＦＡＣＥ内のゲル上では特徴的な「スメア」を形成した。即ち、ＤＳＡ−ＦＡＣＥと慣用のＦＡＣＥ分析の組み合わせは、酵母により生じる糖蛋白質の特徴の、より完全な写真を与えた。
成長曲線の測定
新鮮な一晩酵母培養物を新鮮なＹＰＤ培地によりＯＤ６００ ０．０２まで希釈し、そして２５０ｒｐｍにて３０℃において一晩生育させた（１２時間、ＯＤ ６００＜３．０）。実験を開始するために、５０ｍＬのポリプロピレンチューブ中の１０ｍＬの新鮮なＹＰＤに一晩酵母培養物を接種し、０．５のＯＤ６００値から始めた。アリコートを２時間ごとに採取し、そしてＯＤ６００値を測定した。全ての酵母株を同じ時間平行してランさせた。
【０１００】
実施例２
ＯＣＨ１の不活性化
ゲノミックピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子の破壊は、以下のとおりにして１回の相同組換えにより達成した。プラスミド、ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８（図３Ａ）を実施例１において記載されたとおりに生成したが、ピキアパストリスＯＣＨ１遺伝子の塩基対番号７３−４６７を含み、その前に当該ベクター中の可能な初期翻訳開始部位からのリードスルーを回避するために２つのインフレームのナンセンスコドンを置いた。この断片は、形質転換前の上記ベクターの直鎖状化に有用な中心に位置するＢｓｔＢ Ｉ部位を含んだ。このベクターは、ピキアのゲノミックＯＣＨ１座への１回の相同組換えによるインテグレーションに際してベクター中に存在するＯＣＨ１遺伝子を複製するはずである。結果として、ピキア染色体内のＯＣＨ１遺伝子は２つのＯｃｈ１配列に置き換わった。第１のＯＣＨ１配列は、最大で１６１のアミノ酸長の蛋白質生成物をコードし（そのうちの６アミノ酸はベクター中の配列からであった）、完全長ＯＣＨ１遺伝子によりコードされたタイプＩＩの膜貫通蛋白質の触媒ドメインを含まなかった。第２のＯＣＨ１配列は、完全長の蛋白質の最初の２５アミノ酸のコーディング配列を欠き、そして可能な上流の翻訳開始部位からの如何なるリードスルーをも阻止するはずの２つのインフレームの停止コドンを含んだ。
【０１０１】
株ＧＳ１１５をプラスミドｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８により形質転換した。形質転換体をＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８と呼ぶか、又は短くＭ８株又はｏｃｈ１株と呼んだ。図３Ａにおいて特定されたプライマーの組み合わせによるゲノミックＤＮＡのＰＣＲは、３つの個別の実験により示されたところによれば、ゼオシン耐性形質転換体の約５０％における、予測されたゲノミック座へのこの構築物の正確なインテグレーションを示した。
【０１０２】
細胞壁のマンノ蛋白質のＮ−グリカンの分析は、図４において演繹されるとおり、グリコシル化パターンの変化を明らかにした。優位なピークは、野生型ＧＳ１１５株からの細胞壁マンノ蛋白質に関してはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２であり、主要なピークはＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８株に関してはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である（図４のパネル２から３を比較）。Ｎ−グリカンにおけるこの変化は、Ｍ８株の完全長ＯＣＨ１のＯＲＦによる形質転換の後に復帰した。
【０１０３】
Ｍ８株からの分泌された糖蛋白質の不均質性が低下したか否かを確認するために、野生型ＧＳ１１５株中の分泌された蛋白質である典型的には高グリコシル化された（Ｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，７７（２−３）：２５５−２６３，２０００）トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼをｏｃｈ１のＭ８株を用いて分析した。トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼをコードする配列により形質転換されたＭ８株の細胞の培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（図５Ａ）。ゲルは、高グリコシル化された蛋白質の特徴であるスメアがＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ８株において生成した蛋白質には不在であったことを明らかにした。平行して、分泌された糖蛋白質をＰＮＧａｓｅＦ処理により脱グリコシル化し、そしてグリカンをミニゲル上のＦＡＣＥ分析により分析した。典型的にはＦＡＣＥ分析においては、大きな高グリコシル構造が解析されず、一つのスメアバンドとして出現する（図５Ｂ）。スメアバンドはｏｃｈ１株からの糖蛋白質においては不在であり、ｏｃｈ１株からのＮ−グリカンの不均質性が低下したことが確認された。
【０１０４】
実施例３
ＥＲ滞留したマンノシダーゼ−ＨＤＥＬの発現
ピキアパストリスのＮ−グリカンをさらにヒト化するために、ＥＲ滞留されたトリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼ−ＨＤＥＬをｏｃｈ１株中で発現させた。ピキアパストリス発現株の容易な変換のために、トリコデルマリセイのα−１，２−マンノシダーゼ−ＨＤＥＬをコードするヌクレオチド配列をｏｃｈ１不活性化ベクターに挿入した。結果のコンビネーションベクターをｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５と呼び、その構成を実施例１に記載する。
【０１０５】
株ＧＳ１１５を直鎖状化されたｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５により形質転換した。当該ベクターの正確なインテグレーションはＰＣＲ分析により確認した。当該形質転換体からのマンノ蛋白質のＮ−グリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥ法により分析した。グリカンのプロフィールは、均質なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークを明らかにした（図４、パネル４）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークと、５から２５までのグルコースユニットのサイズエリアのこの方法の検出限界を超える全ての小さなピークの積分（integration）は、この高等真核種の高マンノースグリカンがこの混合物中に存在する全Ｎ−グリカンプールの少なくとも９０％を成したことを明らかにした。
【０１０６】
別のアプローチにおいては、マンノシダーゼ−ＨＤＥＬをメタノール誘導可能ＡＯＸ１プロモーターの制御下で発現させた。２つのマンノシダーゼ発現株（即ち、構成的及び誘導可能）の間のＮ−グリカンプロフィールに明確な差異は検出できなかった。
【０１０７】
異種蛋白質のＮ−グリカン修飾を確認するため、Ｌａｒｏｙ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２０（３）：３８９−３９３，２０００）に記載されたとおりに、ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５プラスミドで、トリパノゾーマクルジのトランス−シアリダーゼ発現ピキア株を形質転換した。この点に関して（here too）、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が精製された蛋白質上に検出され、精製された蛋白質上の全Ｎ−グリカンの９５％より多くを占める。
【０１０８】
振盪フラスコ培養におけるｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５形質転換株の成長曲線分析は、その倍加時間が野生型株のそれを密接に模倣したことを示した。しかしながら、操作された株は野生型株より約２０％低い光学密度において定常期に到達したことから、高細胞密度のストレス条件に対していくらか感受性であり得たことを示す。にもかかわらず、そのストレス感受性の表現型はサッカロミセスセレビシエのｏｃｈ１株よりもはるかに劣って表現された（much less pronounced）。
【０１０９】
実施例４
ゴルジ体局在Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
（Ｋｒｅ２ＧｎＴＩ）の発現
ＧｎＴＩをゴルジ体に標的化するために、サイトゾル部分、膜貫通領域及び管腔幹領域（luminal stem region）を含むＧｎＴＩのＮ−末端部分をコードするヌクレオチド配列を、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２シグナル配列をコードするヌクレオチド配列により置き換えた。これは、Ｋｒｅ２ｐからの最初の３２７アミノ酸及びＧｎＴＩの最後の３２７アミノ酸を有するキメラ蛋白質をコードするヌクレオチド配列をもたらした。
【０１１０】
ピキアパストリスにおける発現のために、Ｋｒｅ２−ＧｎＴＩキメラ配列を、ブラスチシジン耐性マーカーを有するプラスミド中で強力なメタノール誘導可能性ＡＯＸ１プロモーターの制御下に置いた。結果の構築物であるｐＰＩＣ６ＫｒｅｃｏＧｎＴＩ（実施例１に記載されるとおり）をＮｓｉＩ消化によるＡＯＸ１座内の直鎖状化の後にＧＳ１１５ Ｍ５株を形質転換した。当該形質転換体内の上記構築物の存在は、ＡＯＸ１の３’及び５’プライマーを用いたゲノミックＤＮＡ上でのＰＣＲにより確認した。
【０１１１】
幾つかの形質転換体のマンノ蛋白質のＮ−グリカンはＤＳＡ−ＦＡＣＥ法により分析した。優位なピークは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークより大きな約１つのグルコースユニットであった（図４、パネル５）。このピークが末端ＧｌｃＮＡｃを有するか否かを決定するため、エキソグリコシダーゼ消化を、β−Ｇｌｃ−ＮＡｃ結合を加水分解する酵素であるβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いて実施した。この酵素による消化に際して、上記ピークはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２にシフトして戻った（図４、パネル６）。これは、オリジナルピークがＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を表すことを示し、即ち、キメラＧｎＴＩ酵素の正確なインビボ活性を証明する。
【０１１２】
Ｋｒｅ２ＧｎＴＩキメラの過剰発現は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのほとんど完全な変換を導く。これは、十分なＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃドナー基質がゴルジ体においてＮ−アセチルグルコサミニレート、ほとんど全てのグリカンに存在したことを示唆する。
【０１１３】
実施例５
ゴルジ体滞留β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現
ヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１の、当該酵素の膜貫通ドメイン及びサイトゾル部分を含むＮ末端部分（最初の７７アミノ酸）をコードするヌクレオチド配列を、サッカロミセスセレビシエのＫｒｅ２シグナル配列をコードするヌクレオチド配列で置き換えた。このキメラ融合配列をＡＯＸ１プロモーター及びＡＯＸ１の３’末端をターミネーターとする制御下に置いた。最終的なプラスミドであるｐＢ１ＫａｎＭＸ４ＫｒｅｈＧａｌＴ（実施例１に記載される）をＰｍｅＩによりＭ５−ＧｎＴＩ株の形質転換前に直鎖状化した。
【０１１４】
Ｎ−グリカン分析を幾つかの形質転換体からのマンノ蛋白質にて実施した。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークより大きな約１ユニットのグルコースのピークが形質転換体において検出されたが、当該ピークは非形質転換株においては不在であった（図３、パネル７）。このピークが末端β−ガラクトースを含むグリカンであるか否かを決定するため、Ｎ−グリカンをβ−ガラクトシダーゼにより消化した。グリカンプロフィールの消化後に、このピークはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２位置にシフトして戻った（図４、パネル８、パネル７と比較）。β−ガラクトシダーゼ消化の前と後にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークを積分することにより、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の量を決定した。これらの２つのピークの差し引きは、約１０％のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に変換されたことを明らかにした。０．２％ガラクトースを含む追加の培地はＧａｌ−含有オリゴサッカライドの量を増加させなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、Ｍ８ＧｌｃＮＡｃ２，Ｍ５ＧｌｃＮＡｃ２，ＧｌｃＮＡｃＭ５ＧｌｃＮｃ２，及びＧａｌ ＧｌｃＮＡｃＭ５ＧｌｃＮＡｃ２を描写する。
【図２】図２は、酵母とヒトのＮ−結合グリコシル化及びピキアパストリスのグリコシル化のヒト化のための戦略を模式的に描写する。糖操作工程は、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼＯＣＨ１の不活性化、ＨＤＥＬ標識されたα−１，２−マンノシダーゼの過剰発現及びゴルジ局在化ＧｎＴＩ及びＧａｌＴの過剰発現を含む。最後に部分的に得られたハイブリッド構造を組み立てる（framed）。
【図３】図３Ａは、一回の相同組換えによりゲノミックＯＣＨ１遺伝子を不活性化するための戦略を模式的に描写する。図３Ｂは、ピキアパストリスのグリカン操作のために使用されたプラスミドｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５を模式的に描写する。ｐＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５をＢｓｔＢＩにより直鎖状化し、次に形質転換し、そしてピキアパストリスのゲノムに正確に組み込むことにより、ＯＣＨ１遺伝子が不活性化された。図３Ｃは、ｐＰＩＣ６ＡＫｒｅｃｏＧｎＴＩを模式的に描写する。 図３Ｄは、ｐＢ１ＫａｎＭＸ４ＫｒｅｈＧａｌＴを模式的に描写する。
【図４】図４は、異なったグリカン操作をされたピキアパストリス株からのＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を模式的に描写する。パネル１：オリゴマルトースレファレンス。パネル２−９はＮ−グリカンを表し：２：−野生型株ＧＳ１１５からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；３：ｏｃｈ１不活性化された株からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；４：ｏｃｈ１不活性化されたＭａｎＨＤＥＬ発現株からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；５：ｏｃｈ１不活性化されたＭａｎＨＤＥＬ，ＫｒｅＧｎＴＩ発現株からのＮ−グリカンを表し、主要ピークを表すＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を伴う；６：５と同じであるが、但し、グリカンがβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼにより処理され、そしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２位置にシフトし、ターミナルＧｌｃＮＡｃが存在したことを示すことを除く；７：ｏｃｈ１不活性化されたＭａｎＨＤＥＬ，ＫｒｅＧｎＴＩ，ＫｒｅＧａｌＴ発現株からのＮ−グリカンを表し、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を表す追加のピークを伴うが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる処理により消失した；９：ウシＲＮａｓｅＢからのレファレンスグリカン（Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２）。
【図５】図５Ａは、ピキアパストリスＯＣＨ１の不活性化後のグリコシル化を示す。５Ａ：トリコデルマリセイのマンノシダーゼを分泌するピキアパストリス株のＣＢＢ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。操作されていない株（ＷＴ）においては、明確なスメアが見えるが、このスメアはｏｃｈ１不活性化された株（ｏｃｈ１（Ｍ８））においては消失した。図５Ｂは、ピキアパストリスＯＣＨ１の不活性化後のグリコシル化を示す。５Ｂ：操作されていない株（ＷＴ）及びｏｃｈ１株により分泌されたマンノシダーゼに由来するＮ−グリカンのＦＡＣＥ分析。高い電気泳動移動度のバンドはＭａｎ８及びＭａｎ９により示され、「コア」Ｎ−グリカン構造を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアのマンノース構造及び末端ガラクトース残基に結合した５又はそれより少ないマンノース残基及び少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有することにより特徴付けされる、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生じる、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株。
【請求項２】
哺乳類様のＮ−グリカン構造、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含む、請求項１記載の株。
【請求項３】
属カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、及びピキアの株である、請求項１記載の株。
【請求項４】
ピキアパストリス株である、請求項３記載の株。
【請求項５】
（１）α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及び（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現する、請求項２記載の株。
【請求項６】
ＯＣＨ１遺伝子が不活性化されている、請求項２記載の株。
【請求項７】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分が哺乳類の種又は真菌の種の起源のものである、請求項５記載の株。
【請求項８】
哺乳類の種がマウス、ウサギ又はヒトから選択される、請求項７記載の株。
【請求項９】
真菌の種がアスペルギルス、又はトリコデルマリセイから選択される、請求項７記載の株。
【請求項１０】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分が上記株のＥＲ又はゴルジ体を標的化する、請求項５記載の株。
【請求項１１】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分がＥＲ滞留シグナルを含むように操作される、請求項１０記載の株。
【請求項１２】
ＥＲ滞留シグナルがＨＤＥＬ（配列番号：１）を含む、請求項１１記載の株。
【請求項１３】
ＧｎＴＩ又はその機能部分が、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線虫及び原生動物からなる群から選択される種の起源のものである、請求項５記載の株。
【請求項１４】
ＧｎＴＩ又はその機能部分がヒト起源のものである、請求項１３記載の株。
【請求項１５】
ＧｎＴＩ又はその機能部分が上記株のゴルジ体を標的化する、請求項５記載の株。
【請求項１６】
ＧｎＴＩ又はその機能部分がゴルジ体滞留シグナルを含むように操作される、請求項１５記載の株。
【請求項１７】
ゴルジ体滞留シグナルが配列番号：１１を含む、請求項１６記載の株。
【請求項１８】
ＧａｌＴ又はその機能部分が、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫及び線虫からなる群から選択される種の起源のものである、請求項５記載の株。
【請求項１９】
ＧａｌＴ又はその機能部分がヒト起源のものである、請求項１８記載の株。
【請求項２０】
ＧａｌＴ又はその機能部分が上記株のゴルジ体を標的化する、請求項５記載の株。
【請求項２１】
ＧａｌＴ又はその機能部分がゴルジ体滞留シグナルを含むように操作される、請求項２０記載の株。
【請求項２２】
ゴルジ体滞留シグナルが配列番号：１１を含む、請求項２１記載の株。
【請求項２３】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸＩＩプロモーター、ＧＡＰプロモーター、及びＦＬＤプロモーターからなる群から選択されるプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２４】
ＧｎＴＩ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸＩＩプロモーター、ＧＡＰプロモーター、及びＦＬＤプロモーターからなる群から選択されるプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２５】
ＧａｌＴ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸＩＩプロモーター、ＧＡＰプロモーター、及びＦＬＤプロモーターからなる群から選択されるプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２６】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーターから発現され、そして、ＧｎＴＩ又はその機能部分がピキアパストリスのＧＡＰプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２７】
哺乳類様グリカンがヒト様グリカンである、請求項１記載の株。
【請求項２８】
哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質を組換えにより生成する方法であって、糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列により請求項１−２又は５−６の何れか１項に記載の株を形質転換し、そして当該株中で糖蛋白質を発現させることを含む方法。
【請求項２９】
糖蛋白質が細菌、真菌、ウイルス又は哺乳類起源のものである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８記載の方法により生産れた糖蛋白質。
【請求項３２】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質をメチロトローフ酵母株中で組換えにより生成する方法であって、糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列により上記株を形質転換し；当該株を修飾するが、修飾された株が（１）α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及び（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するようにし、そしてその際修飾された株中でのゲノミックＯＣＨ１遺伝子が不活性化されて；修飾された株中で糖蛋白質を生成する方法。
【請求項３４】
糖蛋白質が細菌、真菌、ウイルス又は哺乳類起源のものである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
請求項３３記載の方法により生産れた糖蛋白質。
【請求項３７】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
プロモーター及び３’終結配列に対して作動可能なように連結したＧａｌＴをコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、当該プロモーター及び３’終結配列は当該株中で上記ＧａｌＴの発現を達成するようにメチロトローフ酵母株中で機能する、上記ベクター。
【請求項３９】
（１）α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、及び（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含むキットであって、但し、ベクターの各々はコードされた蛋白質のメチロトローフ酵母株中での発現を指示することができる、キット。
【請求項４０】
メチロトローフ酵母株のゲノミックＯＣＨ１遺伝子を破壊することができるベクターをさらに含む、請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
メチロトローフ酵母株に対して異種の糖蛋白質をコードするベクターをさらに含む、請求項３９記載のキット。
【請求項４２】
メチロトローフ酵母株をさらに含む、請求項３９記載のキット。
【請求項１】
コアのマンノース構造及び末端ガラクトース残基に結合した５又はそれより少ないマンノース残基及び少なくとも一つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有することにより特徴付けされる、哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質を生じる、遺伝子操作されたメチロトローフ酵母株。
【請求項２】
哺乳類様のＮ−グリカン構造、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含む、請求項１記載の株。
【請求項３】
属カンジダ、ハンセヌラ、トルロプシス、及びピキアの株である、請求項１記載の株。
【請求項４】
ピキアパストリス株である、請求項３記載の株。
【請求項５】
（１）α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及び（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現する、請求項２記載の株。
【請求項６】
ＯＣＨ１遺伝子が不活性化されている、請求項２記載の株。
【請求項７】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分が哺乳類の種又は真菌の種の起源のものである、請求項５記載の株。
【請求項８】
哺乳類の種がマウス、ウサギ又はヒトから選択される、請求項７記載の株。
【請求項９】
真菌の種がアスペルギルス、又はトリコデルマリセイから選択される、請求項７記載の株。
【請求項１０】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分が上記株のＥＲ又はゴルジ体を標的化する、請求項５記載の株。
【請求項１１】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分がＥＲ滞留シグナルを含むように操作される、請求項１０記載の株。
【請求項１２】
ＥＲ滞留シグナルがＨＤＥＬ（配列番号：１）を含む、請求項１１記載の株。
【請求項１３】
ＧｎＴＩ又はその機能部分が、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線虫及び原生動物からなる群から選択される種の起源のものである、請求項５記載の株。
【請求項１４】
ＧｎＴＩ又はその機能部分がヒト起源のものである、請求項１３記載の株。
【請求項１５】
ＧｎＴＩ又はその機能部分が上記株のゴルジ体を標的化する、請求項５記載の株。
【請求項１６】
ＧｎＴＩ又はその機能部分がゴルジ体滞留シグナルを含むように操作される、請求項１５記載の株。
【請求項１７】
ゴルジ体滞留シグナルが配列番号：１１を含む、請求項１６記載の株。
【請求項１８】
ＧａｌＴ又はその機能部分が、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫及び線虫からなる群から選択される種の起源のものである、請求項５記載の株。
【請求項１９】
ＧａｌＴ又はその機能部分がヒト起源のものである、請求項１８記載の株。
【請求項２０】
ＧａｌＴ又はその機能部分が上記株のゴルジ体を標的化する、請求項５記載の株。
【請求項２１】
ＧａｌＴ又はその機能部分がゴルジ体滞留シグナルを含むように操作される、請求項２０記載の株。
【請求項２２】
ゴルジ体滞留シグナルが配列番号：１１を含む、請求項２１記載の株。
【請求項２３】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸＩＩプロモーター、ＧＡＰプロモーター、及びＦＬＤプロモーターからなる群から選択されるプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２４】
ＧｎＴＩ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸＩＩプロモーター、ＧＡＰプロモーター、及びＦＬＤプロモーターからなる群から選択されるプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２５】
ＧａｌＴ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸＩＩプロモーター、ＧＡＰプロモーター、及びＦＬＤプロモーターからなる群から選択されるプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２６】
α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分がピキアパストリスのＡＯＸ１プロモーターから発現され、そして、ＧｎＴＩ又はその機能部分がピキアパストリスのＧＡＰプロモーターから発現される、請求項５記載の株。
【請求項２７】
哺乳類様グリカンがヒト様グリカンである、請求項１記載の株。
【請求項２８】
哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質を組換えにより生成する方法であって、糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列により請求項１−２又は５−６の何れか１項に記載の株を形質転換し、そして当該株中で糖蛋白質を発現させることを含む方法。
【請求項２９】
糖蛋白質が細菌、真菌、ウイルス又は哺乳類起源のものである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８記載の方法により生産れた糖蛋白質。
【請求項３２】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類様のＮ−グリカン構造を有する糖蛋白質をメチロトローフ酵母株中で組換えにより生成する方法であって、糖蛋白質をコードするヌクレオチド配列により上記株を形質転換し；当該株を修飾するが、修飾された株が（１）α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分、及び（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分を発現するようにし、そしてその際修飾された株中でのゲノミックＯＣＨ１遺伝子が不活性化されて；修飾された株中で糖蛋白質を生成する方法。
【請求項３４】
糖蛋白質が細菌、真菌、ウイルス又は哺乳類起源のものである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
請求項３３記載の方法により生産れた糖蛋白質。
【請求項３７】
糖蛋白質がイムノグロブリン又はその断片である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
プロモーター及び３’終結配列に対して作動可能なように連結したＧａｌＴをコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、当該プロモーター及び３’終結配列は当該株中で上記ＧａｌＴの発現を達成するようにメチロトローフ酵母株中で機能する、上記ベクター。
【請求項３９】
（１）α−１，２−マンノシダーゼ又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（又はＧｎＴＩ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、及び（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）又はその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含むキットであって、但し、ベクターの各々はコードされた蛋白質のメチロトローフ酵母株中での発現を指示することができる、キット。
【請求項４０】
メチロトローフ酵母株のゲノミックＯＣＨ１遺伝子を破壊することができるベクターをさらに含む、請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
メチロトローフ酵母株に対して異種の糖蛋白質をコードするベクターをさらに含む、請求項３９記載のキット。
【請求項４２】
メチロトローフ酵母株をさらに含む、請求項３９記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５１１２２３（Ｐ２００７−５１１２２３Ａ）
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９９３９（Ｐ２００６−５３９９３９）
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８０７
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５９４０６３３１５）リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８０７
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５９４０６３３１５）リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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