乳酸産生菌及び肺機能
【課題】肺機能障害の治療用又は予防用の薬剤組成物の提供。
【解決手段】プロバイオティック乳酸産生菌（ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）菌株ＭＶ−１６）並びに、タンパク質及び／又は炭水化物及び／又は脂質及び／又は抗酸化剤などを含む補助食品、栄養組成物。
【効果】乳酸産生菌は、試験動物のＰｅｎＨ（enhanced pause）値を測定することによって判定される、気道狭窄に対する有意で有益な作用を及ぼす。
【解決手段】プロバイオティック乳酸産生菌（ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）菌株ＭＶ−１６）並びに、タンパク質及び／又は炭水化物及び／又は脂質及び／又は抗酸化剤などを含む補助食品、栄養組成物。
【効果】乳酸産生菌は、試験動物のＰｅｎＨ（enhanced pause）値を測定することによって判定される、気道狭窄に対する有意で有益な作用を及ぼす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品及び／又は薬剤組成物の分野に関する。本発明は、生きた（プロバイオティック）乳酸産生菌、死んだ、若しくは生存不可能なその細菌、並びに補助食品、栄養組成物、及び／又はこれらを含む薬剤組成物の新規使用を提供する。本発明はさらに、このような組成物を製造する方法、並びにこのような組成物中に含めるのに適した細菌を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肺機能の低下は、気道の狭窄、又は肺上皮から血流への酸素拡散の低下によって引き起こされる恐れがある。気道の狭窄は、例えば、気道抵抗（ＡＲ）の増加、及び気道過敏性又は気管支過敏性（ＡＨＲ又はＢＨＲ）をもたらす。ＡＨＲは、様々な刺激に対する過剰な気管支収縮反応をさし、（気道狭窄）刺激に対する感受性の増大によって反映される。さらに、対象においてＡＨＲが頻繁に起こると、気道リモデリング、及びそれにより気道狭窄、気道抵抗の増加がもたらされ、続いて肺機能のさらなる低下に向かう事象の悪循環が引き起こされる（Babu and Arshed, 2003）。気道狭窄は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、環境による肺疾患など、様々な肺の疾患又は障害に伴う症状である。気道狭窄は、上気道感染の後にも、またアトピー性で非喘息の患者（atopic non-asthmatics）、及び喘息の既往歴がある患者においても生じる。
【０００３】
ＣＯＰＤは、慢性気管支炎及び肺気腫を包含する包括的用語である。ＣＯＰＤの主要な危険因子は、能動喫煙及び／又は受動喫煙である。他の危険因子は、職業被曝、及びα１プロテイナーゼインヒビター（又はαＩアンチトリプシン）の遺伝的欠損である。慢性気管支炎の患者は、２年間連続して１年につき少なくとも３ヶ月間ほとんど毎日、慢性湿性咳嗽の病歴を有する。咳嗽増加、呼吸困難、呼気流量の減少、運動耐性低下、及び日常生活での活動障害に向かう緩やかな進行が観察されることが多い。粘液性分泌物の粘稠化、及び気管支壁の浮腫が気道狭窄の原因である。肺気腫では、肺胞壁の分解、又は肺胞を取り囲む肺毛細血管の消失、終末細気管支より末梢の気腔の拡張、肺胞壁破壊、及び肺胞表面積の減少によるガス拡散障害が観察される。肺胞の崩壊の他に、ＣＯＰＤに見られる形態変化は平滑筋細胞の過剰増殖である。こうした形態変化は、酸素摂取機能の低下、及び平滑筋収縮の障害をもたらす。続いて、これは、数ある中でメタコリン、ヒスタミン、冷気などの非特異的作用物質に対する肺（気道）過敏性、及び気道抵抗の増加をもたらす。
【０００４】
喘息は別の肺疾患である。喘息は、呼吸困難、胸部絞扼感、喘鳴、喀痰、咳嗽などの症状を伴う慢性疾患である。喘息の発現及び持続は、主に、抗原誘発性炎症の存在、及び気道構造に対するその作用（「アレルギー性喘息」）に起因すると考えられる。ＣＯＰＤの一部の症状は喘息に類似しているが、喘息とＣＯＰＤは同一でなく、こうした疾患を有する患者は、別々に治療されるべきであることを示唆する証拠が相当ある。ＣＯＰＤと対照的に、喘息患者における気道閉塞は可逆的である。
【０００５】
気道過敏性及び／又は気道抵抗が重要な役割を果たしている疾患は、健康の重大な障害となる。例えば、ＣＯＰＤは現在、世界で５番目に多い疾患で、死因の第５位となっており、ＣＯＰＤは、２０２０年までに世界で最も多い死因の第３位に位置する恐れがあると予測されている。ＣＯＰＤ患者のうちの３分の１を超える患者で、その疾患のために、患者は仕事ができないか、その仕事の能力が制限されるか、或いは過去１年以内に仕事をする時間が失われてしまうと報告されている。こうした間接費は、一次及び二次医療費からの直接費と併せて、９０年代中頃の米国でおよそ１１０億ドルであったと推定されている。
【０００６】
発展途上国での喘息の有病率は高い。例えば、英国での国民健康キャンペーンによる２００１年喘息検査によれば、現在、成人１３人に１人、子供８人に１人が喘息の治療を受けている。また、喘息に関する、生産性の損失による費用、健康治療における費用、及び社会保障費は巨額である（２００１年の英国で２２億ポンドという推定がある）。
【０００７】
ＣＯＰＤ又は喘息など、肺疾患の現在の治療法には薬物治療が含まれ、この治療は喫煙の中止を助ける。患者が喫煙の中止を成し遂げることは困難であり、薬物には、副作用が起こる恐れがあるという不利な点がある。こうした副作用は、使用する特異的な薬物に依存した、例えば、動悸、頻脈、振戦、身震い／神経過敏、頭痛、不眠症、口内乾燥、霧視、易刺激性、落ち着きのなさ、悪心、嘔吐、嗄声、副腎機能不全、免疫抑制、及び下痢からなり得る。さらに、患者は薬物に対する感受性が低下する恐れがある。
【０００８】
したがって、副作用がないが患者のＡＨＲ及びＡＲを軽減することにより、肺機能に対して有益な作用を及ぼす組成物及び方法がさらに必要である。
【０００９】
微生物の一部の菌株、特に乳酸桿菌（Lactobacillus）属及び／又はビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属するもの、いわゆる「プロバイオティック」菌株は、ヒト及び／又は動物による生存消費に対して有益な作用を及ぼすことが知られている。下痢、胃腸管又は尿路感染、腟感染、炎症性疾患、及びアレルギーに対する治療及び／又は予防効果が報告されている。こうした疾患におけるプロバイオティクスの作用機序は、病原菌の直接の排除を介したもの、及び／又は免疫系の調節を介したものである。例えば、特定のプロバイオティック菌株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、又はｉｎ ｖｉｖｏの腸で、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γに対して低減作用を及ぼすことが示されている（Schultz et al. 2003、Varcoe et al. 2003、Madsen et al. 2001、Tejada-Simon 1999）。国際公開第０３／０１０２９８号では、腸内に存在すると炎症誘発性サイトカインのレベルを明らかに低下させる免疫調節作用を有するラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）というプロバイオティック菌株が開示されている。同様に、国際公開第０３／０１０２９７号では、抗炎症作用を有するビフィドバクテリウム属というプロバイオティック菌株が開示されている。国際公開第０１／９７８２２号では、ラクトバチルスＧＧ（Lactobacillus GG）菌株（ＡＴＣＣ５３１０３）、及びアレルギー性炎症に関するビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）Ｂｂ−１２の使用が開示されている。国際公開第０１／３７８６５号では、プロバイオティック細菌投与後のＩｇＥ抗体のダウンレギュレーションが記載されている。
【特許文献１】国際公開第０３／０１０２９８号
【特許文献２】国際公開第０３／０１０２９７号
【特許文献３】国際公開第０１／９７８２２号
【特許文献４】国際公開第０１／３７８６５号
【非特許文献１】Babu and Arshed, 2003
【非特許文献２】Schultz et al. 2003
【非特許文献３】Varcoe et al. 2003
【非特許文献４】Madsen et al. 2001
【非特許文献５】Tejada-Simon 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プロバイオティクスの使用は当技術分野で記載されているが、現在までに記載されている細菌の菌株は、有益な抗アレルギー性の、且つ／又は抗炎症性の免疫系作用について、或いは抗病原菌作用について選択されている。こうした菌株が有益な作用を及ぼすことが示されている場合、この作用は、あらゆる場合においてこれらの作用様式を介して（直接的に、又は間接的に）及ぼされる。例えば、アレルギーの治療において、プロバイオティック菌株の消費は、ある抗炎症作用、又はＴｈ１／Ｔｈ２の均衡を回復させる免疫系に対してある作用を及ぼすと記載されており、したがって、このような菌株はアレルギー性喘息を治療する際に有用であると推定されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は初めて、肺機能に対する（すなわちＰｅｎＨ（enhanced pause：呼吸抵抗指数）に対する、またそれによりＡＨＲ及び／又はＡＲに対する）直接作用に関して、単離された細菌の菌株を試験し、驚くことに、乳酸産生菌の一部の菌株（群１及び群２、下記参照）がｉｎ ｖｉｖｏでの気道狭窄に対して、特にＡＨＲに対して有意で有益な作用を有すること、並びにこの作用が、抗炎症反応に依存せず、及びアレルギー患者で観察される（抗原特異的）免疫応答であるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン応答の均衡を取り戻すことにも依存していない作用様式によるものであることを発見した（Cross et al. 2002を参照）。さらに、以前に記載された、呼吸器障害を治療するのに使用される薬剤とは対照的に、本発明の菌株は、吸入する必要がなく、摂取することができる。したがって、この菌株を使用して、プロバイオティック菌株を用いて治療可能であることがこれまで知られていなかった、例えば、ＣＯＰＤ、非アレルギー性喘息などの呼吸器疾患を治療又は予防することができる。また、本発明の１種又は複数の菌株を、例えば既知のプロバイオティック菌株（例えば異なる作用様式を有する菌株）と一緒に同時投与することも本発明に包含される。さらに、本発明の菌株を死細胞、又はこうした菌株を含む組成物として投与して、肺機能に対して有益な作用を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
定義
本明細書では、「乳酸菌」及び「乳酸産生菌」を同義的に使用し、これは、それだけには限らないが、乳酸桿菌属、レンサ球菌属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エノコッカス属（Oenococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、腸球菌属（Enterococcus）、ビフィドバクテリウム属の細菌など、乳酸を発酵の最終産生物として産生する細菌をさす。
【００１３】
「プロバイオティクス」又は「プロバイオティック菌株」は、対象により（例えば経腸的に、又は吸入によって）摂取されると、宿主に対して有益な作用を及ぼす生きた微生物、好ましくは細菌の菌株をさす。
【００１４】
本明細書では、「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物、特に脊椎動物をさす。
【００１５】
本明細書では、「肺機能障害」という用語は、「非特異的な気道狭窄」によって引き起こされる、気道通過の低下をさす。肺機能障害という用語は、本明細書で、アレルゲンによって誘発されるとアレルギー性喘息で見られるような肺組織の免疫応答を伴う気道狭窄をさす「特異的な気道狭窄」を包含しない。肺機能障害は、気道抵抗（ＡＲ）又は気道過敏性（ＡＨＲ）として測定することができる。
【００１６】
「気道過敏性若しくは気管支過敏性」又は「気道反応亢進若しくは気管支反応亢進」（ＡＨＲ又はＢＨＲ）は、気管支収縮剤による刺激に応答した、気道狭窄の容易さ及び程度の増大をさす。ＡＨＲは、本明細書の別の場所に記載する気管支誘発試験によって測定することができる。本明細書では、「非特異的に誘発される気道過敏性」（非特異的なＡＨＲ）を、対象における（アレルゲンによって引き起こされる）アレルギー性反応に依存していないＡＨＲをさすのに使用する。それとは対照的に、「特異的な誘発されるＡＨＲ」は、特異的なアレルギー薬剤に感作された対象の免疫系に依存しているＡＨＲをさす。
【００１７】
「気道抵抗」（ＡＲ）は、ある速度で肺を空気が通過することに対する気道の抵抗の尺度をさす。ＡＲは、気管支誘発試験がまだ示されていない場合、ＡＨＲの基礎レベルと同じ値を有する。ＡＲは、気管支誘発試験において測定することもできる。
【００１８】
「ＦＥＶ１」は、肺活量計を用いて測定する、呼吸の最初の１秒間における努力呼気肺活量をさす。「ＦＶＣ」は、同様に肺活量計を用いて測定する努力肺活量をさす。ＦＥＶ１は、ヒトにおける肺の機能性及び気道狭窄の尺度である。試験動物において使用するＰｅｎＨ試験と対照的に、ヒト対象において実施される気管支誘発試験では通常、ＦＥＶ１が測定される。
【００１９】
「気道狭窄に対する有意で有益な作用」を有する菌株は、本明細書に記載のＰｅｎＨ試験において、適切な対照に比べて有意に低下したＰｅｎＨ値を有する菌株をさす。ＰｅｎＨを評価する代わりに、ヒトでの試験におけるＦＥＶ１など、同等の代替値を求めることができることを理解されたい。
【００２０】
「有意な抗炎症作用」という用語は、気管支肺胞洗浄で求める、炎症細胞の数の少なくとも１０％の増加と定義される。
【００２１】
「含む（comprising）」という用語は、述べられる部分、段階、又は成分の存在を明記するものとして解釈されるべきであるが、１種又は複数の追加の部分、段階、又は成分の存在を排除するものではない。したがって、乳酸菌を含む組成物は、追加の細菌の菌株などを含むことができる。
【００２２】
ＰｅｎＨ試験を使用してオバルブミン感作マウスに対する乳酸菌の数種の菌株（経口投与される）の作用を測定すると、驚いたことに、肺組織中への炎症細胞（例えば、好中球、好酸球、リンパ球、及びマクロファージ）の流入によって求めて、乳酸産生菌の一部の菌株が、付随する炎症に対する作用なしでＰｅｎＨに対して、特に気道過敏性に対して有意で有益な作用を及ぼすことができることが分かった。
【００２３】
驚いたことに、細菌株を気道狭窄に対するその作用（ＰｅｎＨによって判定する）、及びその抗炎症／免疫調節作用に基づいて区別し、群に分けることができる。したがって、炎症又は気道狭窄のどちらに対する活性も有していない細菌の菌株の一群を除いて、その示差的な作用様式に基づいて、乳酸産生菌を３つの群に分類することができる。群１の菌株（例えば、菌株ＴＤ１、すなわちMorinaga社製のビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）菌株ＭＶ−１６）は、有意な抗炎症作用、及び気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす。群１に属する他の菌は、ラクトバチルスＧＧ及びビフィドバクテリウムＢｂ−１２であり、こうした菌は、我々の実験でＰｅｎＨに対して２５％超減少させる影響を及ぼすことが分かっている。こうした菌株は、有意な抗炎症作用を及ぼすことが知られている（参照により本明細書に組み込む国際公開第０１／９７８２２）。群２の菌株（例えば、菌株ＴＤ２は、ＢＣＣＭ（商標）（Gent大、ベルギー）にアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ−２２１１０として寄託されている）は、有意な抗炎症作用を及ぼさないが、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす。群３の菌株（例えば、菌株ＴＤ５、すなわちRhodia Food社製のビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）Ｂｉ０７）は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼさないが、有意な抗炎症作用を及ぼす。このことにより、気道狭窄に対する有益な作用と抗炎症作用とは関連がないこと、及びこの細菌が炎症に対しても作用を及ぼすかどうかに関係なく、乳酸産生菌が気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼすことができることが明確に実証された。
【００２４】
肺組織の炎症を測定する、すなわち気管支中への抗炎症性細胞、特に、好中球、好酸球、リンパ球、及びマクロファージの流入を測定する一般的な方法によって判定できる限りにおいて、群２の菌株は免疫系を介してその作用を及ぼさないことが結論付けられている。しかし、こうした方法を使用して測定されない、又は測定できないが、群２の菌株が免疫系に何らかの他の新たな、若しくは異なる方式で作用していることも除外されない。いずれの場合においても、こうした菌株は、抗炎症作用がないことにより、アレルギー対象における抗炎症反応を介してその作用を及ぼす既知の菌株（ビフィドバクテリウムＢｂ−１２、ラクトバチルスＧＧなど）と明確に区別される。本発明の範囲を限定することなく、肺上皮細胞、又は肺の平滑筋細胞に対する直接の作用を予想することができるが、肺に対するこの作用の正確な機序は依然として明らかにされていない。
【００２５】
本発明の一実施形態では、肺機能障害（上記で定義した通り）の治療用又は予防用の組成物を調製するための乳酸産生菌株の使用が提供される。この組成物の調製用に適当に使用される乳酸産生菌は、群１及び／又は群２の細菌、すなわちＰｅｎＨ試験又はＦＥＶ１試験において測定することできる、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす細菌である。好ましくは、ＰｅｎＨ試験を使用する（Hamelmann et al. 1997に記載されている通り）。
【００２６】
上記のように、群１の菌株は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼし（定義した通り）、また試験対象に対して少なくとも１種の有意な抗炎症作用を及ぼす菌株である。群１の菌株は、例えば、サイトカインレベルを調節することにより免疫調節作用を及ぼすこともできる。群１の菌株は、例えば、Morinaga社製のビフィドバクテリウム・ブレーベ菌株ＭＶ−１６（本明細書では菌株ＴＤ１とも呼ぶ）である。
【００２７】
群２の菌株は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす（定義した通り）が、少なくとも付随する抗炎症作用を欠いている新規の菌株である。群２の菌株の一例はＬＭＧ Ｐ−２２１１０（本明細書ではＴＤ２とも呼ぶ）である。群２の菌株は免疫調節活性を有していないことが好ましい。本明細書の別の場所に開示する方法を使用して、群２の追加の菌株を容易に同定することができる。
【００２８】
群３の菌株は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼさない（定義した通り）が、少なくとも１種の抗炎症作用を及ぼす菌株である。Rhodia Food社製のビフィドバクテリウム・インファンティスＢｉ０７（本明細書ではＴＤ５とも呼ぶ）は、この群の一例である。
【００２９】
対照菌株と比較した、ある試験菌株の気道狭窄に対する有意な（有益な）作用を測定することにより、気道狭窄に対するある細菌株の有意で有益な作用が判定される。これは、試験動物又はヒト対象のいずれかを使用して行うことができるが、以下で論じる通り、それぞれの試験及び測定するパラメータは異なる（それぞれＰｅｎＨ試験及びＦＥＶ１試験）。したがって、有意なＰｅｎＨ値又はＦＥＶ１値により、気道狭窄に対して、特にＡＨＲ及び／又はＡＲに対して有意で有益な作用があるがどうかが判定される。どのレベルをこの点において「有意」と見なすかは、以下で論じる通り、試験及び使用するパラメータに依存する。重要な要素は、使用する試験に適した統計分析を実施する場合に、試験結果が統計的に有意であることである。少なくとも９５％の信頼限界を使用することが好ましい。当分野の技術者であれば、こうした試験、又は当技術分野で既知の同等の試験のいずれかを使用して、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす菌株を同定することができるはずである。このような菌株は、本発明の組成物及び方法での使用に適している。
【００３０】
ヒト対象−ＦＥＶ１
気管支収縮剤による刺激の前後におけるスパイロメトリーによるＦＥＶ１の判定が、ヒト対象におけるＡＨＲ反応及び／又はＡＲを定量するのに最も一般的に使用されている方法である。陽性試験は、特定の用量又はレベルの刺激物によるＦＥＶ１（１秒間の努力呼気肺活量）の定義される減少によって特徴付けられる。気管支誘発試験は通常、特定のプロトコールに従って、すなわち累積量を測定したＰＤ２０（Yan et al. 1983）（ＰＤ２０は、ＦＥＶ１が２０％低下する誘発量をさす）、又はより時間がかかるＰＣ測定方法（Cockcroft 1985）（ＰＣは誘発濃度をさす）のいずれかによって実施される。ＰＣ２０＜０．２５ｍｇ／ｍｌ（ＰＤ２０＜０．１μｍｏｌ）は重度の反応であり、ＰＣ２０ ０．２５〜２．０ｍｇ／ｍｌ（ＰＤ２０ ０．１〜０．８μｍｏｌ）は中等度の反応であり、ＰＣ２０ ２．０〜８．０ｍｇ／ｍｌ（ＰＤ２０、０．８〜８．０μｍｏｌ）は軽度の反応である。使用する、気管支収縮を起こす刺激は、薬物（ヒスタミン、メタコリン）、物理的刺激（非等張性のエアゾール剤、冷気／乾燥した空気、運動）、及び特異的感作物質（アレルゲン）である。ヒトにおいて、このような気管支誘発試験を使用して、ＡＨＲを診断するか、又はＡＨＲの診断を確認して、ＡＨＲの重症度を記録し、それにより治療的介入若しくは症状悪化の後のＡＨＲの変化を追跡調査し、慢性咳患者における喘息を除去し、誰が職場において、若しくはレクリエーション活動中に危険であるかを判定し、且つ／又は環境被曝若しくは職業被曝の前に対照若しくは基準を確立する。
【００３１】
ヒト試験対象における気管支誘発試験の後に測定されたＦＥＶ１の、対照の対象と比べて少なくとも１０％の低下は、肺機能の低下と見なされる（Cockroft 1985、Yan et al. 1983）。特定の菌株を補充した際に、且つ／又はその後にＦＥＶ１の基礎レベルが有意に（＜１０％）増加した場合、或いは気管支誘発試験の後、ＦＥＶ１の低下が有意な（＜１０％）減少であった場合、菌株は有益な作用を及ぼすと見なされる。
【００３２】
試験動物−ＰｅｎＨ試験
ある動物においてＦＥＶ１を測定することができないので、気道狭窄を測定する他の手段（すなわちＰｅｎＨ、及びそれによるＡＨＲ及びＡＲ）を設けた。参照により本明細書に組み込むHamelman et al. (1997)による記載の通り、プレチスモグラフを使用して、試験動物においてｉｎ ｖｉｖｏでＰｅｎＨを測定することが好ましい。要するに、試験動物（通常マウス）をプレチスモグラフの動物用チャンバー内に入れる。この動物が静かに呼吸する際、それにより１回換気量と呼吸中の胸部の動きとの差を表す、そのチャンバー内の圧力変動が作製される。差圧変換器により、動物用チャンバーと参照用チャンバーとの圧力の変化を測定する。最大呼気流量（ＰＥＦ）、１回換気量（ＴＶ）、呼気時間（Ｔｅ）、及び呼吸回数（ｆ）のような既知の肺機能パラメータの他に、ＰｅｎＨ（enhanced pause）も測定する。基礎ＰｅｎＨは、肺機能のどんな低下も来たしていない正常な動物でおよそ０．３０である。動物の基礎ＰｅｎＨもＡＲに関するパラメータと見なされる。気管支収縮（メタコリンによって誘発される）の際、ＰＥＦ及びＰＩＦ（最大吸気流量）は増加するが、Ｔｒ（緩和時間）及びＴｅは減少する。この結果、ＰｅｎＨの増加がもたらされる。意識下非拘束マウスにおける気道反応性のデータは、ＰｅｎＨとして表される。ＰｅｎＨの増加は、ＦＥＶ１の低下と相関関係がある。したがって、動物においてＰｅｎＨの増加を阻害する化合物によりＦＥＶ１が低下せず、それによりヒトにおいて気道狭窄が軽減し、肺機能が改善されることが想定され得る。
【００３３】
大まかに言えば、気管支誘発試験の後、対照対象と、試験菌株を投与した対象との間の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％以上等のＰｅｎＨ値の差が、試験菌株の有意な作用を表している。
【００３４】
上記の動物試験による方法（ＰｅｎＨ）又はヒト試験による方法（ＦＥＶ１）を使用して、どの菌株を本発明の組成物の製造に適当に使用するかを判定することができる。このようにして製造された組成物は、ヒト及び／又は動物対象における肺機能障害の治療及び／又は予防に対して有益な作用を及ぼすはずである。上記の通り、気管支誘発試験によりヒト対象に対する菌株及び／又はこうした菌株を含む組成物の作用を測定することもできる。
【００３５】
気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす菌株が群１又は群２に入るかどうかを判定するために、菌株の抗炎症作用（及び場合によっては免疫調節作用も）を、例えば実施例に記載の既知の方法を使用して判定する。使用する試験に適した既知の統計分析法を使用して、この作用が有意であるかどうかを判定する。大まかに言えば、対照と、試験菌株を投与した対象との間の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％のＰｅｎＨの差が、試験菌株の有意な作用を表している。
【００３６】
組成物
本発明の１種又は複数の菌株を使用して製造される組成物は、対象、特にＣＯＰＤ又は喘息などの肺機能障害、或いは気道過敏性及び／又は気道制限が起こる他の呼吸器疾患を患うヒト対象の摂取に適した任意の種類の組成物とすることができる。この組成物は、食品、補助食品組成物、栄養（食品）組成物、又は薬剤組成物であってもよい。この組成物、及び組成物の構成は、組成物の種類、及び好ましいその投与方法によって変わり得る。食品又は食品／栄養組成物は、本発明の１種（複数）の細菌株の他に、適当な食品ベースも含む。本明細書では、食品又は食品組成物には、ヒト又は動物の消費のために、固体（例えば粉末）、半固体、及び／又は液体（例えば飲み物又は飲料）が含まれることを理解されたい。食品又は食品／栄養組成物は、それだけには限らないが、ヨーグルト、ヨーグルトベースの飲料、又はバターミルクを含めた発酵乳製品などの乳製品であってもよい。このような食品又は食品組成物を、それ自体知られている方法で、例えば、本発明の１種（複数）の菌株を適当な食品又は食品ベースに適当な量添加することによって調製することができる（国際公開第０１／８２７１１号を参照のこと）。さらなる一実施形態では、この１種（複数）の菌株を、食品又は食品／栄養組成物を例えば発酵によって調製する際に、又は調製用に使用する。このような菌株の例には、本発明のプロバイオティック乳酸産生菌が含まれる。そうする際に、本発明の１種（複数）の菌株を、このような発酵食品又は食品／栄養組成物の調製用にそれ自体既知の方法で、例えば、乳酸産生菌を使用して発酵乳製品の調製用にそれ自体既知の方法で使用することができる。このような方法では、本発明の１種（複数）の菌株を、通常使用される微生物に添加して使用することができ、且つ／又は通常使用される１種又は複数又は一部の微生物と取り替えることができる。例えば、ヨーグルト又はヨーグルトベースの飲料など発酵乳製品の調製に、本発明の食品用の生きた乳酸産生菌を、スターターカルチャーに添加するか、又はその一部として使用することができ、或いはこのような発酵の際に適当に添加することもできる。
【００３７】
補助食品組成物
群１及び／又は群２の有効量の１種又は複数の菌株の他に、補助食品は、１種又は複数の担体、安定剤、プロバイオティクスなどを含むことができる。好ましくは、この組成物は、経腸（好ましくは経口）投与用に粉末の形であるが、経鼻投与又は吸入も適当であり得る。１種（複数）の菌株の生きた細胞を使用する場合、この細胞を、胃から保護するためにカプセル化した形で存在させてもよい。例えば、この組成物は、水、果汁、ミルク、又は他の飲料に溶解させることができる小袋に入った粉末の形でよい。この組成物は、群２の少なくとも１種の菌株、例えばＬＭＧ Ｐ−２２１１０などを含むことが好ましい。菌株あたりの生きた細胞の用量は、好ましくは菌株あたり少なくとも１×１０６ｃｆｕであり、好ましくは１日あたり約１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の間であり、より好ましくは約１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／日の間であり、より好ましくは約１×１０８〜５×１０１０ｃｆｕ／日であり、最も好ましくは１×１０９〜２×１０１０ｃｆｕ／日の間である。この有効量をいくつかのより少ない用量に細分し、例えば１日あたり２つ、３つ、又はそれ以上の部分に分けて投与してもよい。生きた細胞を使用する代わりに、以下でさらに詳細に記載する通り、死んだ、若しくは生存不可能な細胞を一部の組成物中で使用してもよい。
【００３８】
食品／栄養組成物
適当な用量の群１及び／又は群２の１種又は複数の菌株の他に、栄養組成物は、ヒト及び／又は動物の消費に適した炭水化物及び／又はタンパク質及び／又は脂質を含むことが好ましい。この組成物は、他の（プロバイオティック）菌株などの他の生物活性成分、及びプロバイオティック菌株を支持するプロバイオティクスを含んでも含まなくてもよい。１種（複数）の菌株の生きた細胞を使用する場合、この細胞を、胃から保護するためにカプセル化した形で存在させてもよい。菌株あたりの生きた細胞の用量は、好ましくは少なくとも１×１０６ｃｆｕであり、好ましくは１日あたり約１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の間であり、より好ましくは約１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／日の間であり、より好ましくは約１×１０８〜５×１０１０ｃｆｕ／日であり、最も好ましくは１×１０９〜２×１０１０ｃｆｕ／日の間である。この組成物は、群２の少なくとも１種の菌株、例えばＬＭＧ Ｐ−２２１１０などを含むことが好ましい。この栄養物は、液体又は粉末の形であることが好ましい。一実施形態では、この栄養物は、市販の「Respifor（登録商標）」様液体製品（Nutricia社製、オランダ）、すなわちミルクベースで、エネルギー密度が高く、タンパク質及び炭水化物が多く、抗酸化剤が濃縮されており、矯味剤を含むものである。この栄養物は、対象の通常の食品／飲料摂取の代わりとせず、それに追加して消費されることが好ましい。この栄養物は、経口的に、又は経管栄養摂取によるなど、経腸投与することが好ましい。
【００３９】
薬剤組成物
適当な用量の群１及び／又は群２の１種又は複数の菌株を使用して、肺機能障害の治療、治療法、又は予防のための薬剤組成物を製造することもできる。薬剤組成物は通常、経腸（例えば経口）、経鼻／吸入、経膣、又は直腸投与用に使用されるはずである。薬剤組成物は通常、本発明の１種（複数）の菌株に加えて薬剤担体を含むはずである。この好ましい形は、所期の投与形態及び（治療への）適用に依存する。この薬剤担体は、１種（複数）の菌株を対象の所望の体腔、例えば腸に送達するのに適した、適合性の、毒性のない、任意の物質とすることができる。例えば、滅菌水、又は不活性の固体を、製薬上許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤などを通常補充される担体として使用することができる。薬剤組成物は、追加の生物活性成分又は薬剤活性成分をさらに含むことができる。
【００４０】
さらなる一実施形態では、例えば国際公開第０１／９５７４１号に記載の通り、１種（複数）の菌株の死んだ、又は生存不可能な細菌細胞を、生きた（又は生存可能な）細菌の代わりに、又はそれに加えて上記の組成物に使用する。例えば、死んだ、又は生存不可能な細胞の使用量は、生きた細菌の使用量と同等とすることができる。当分野の技術者であれば、適当な量を容易に求めることができる。このような組成物では、「コロニー形成単位」が実行可能でない測定値である場合、細胞の量を計数する（例えばフローサイトメーターを使用して）か、或いは当分野の技術者に知られている別の方法で測定する。
【００４１】
生きた細胞を含む組成物に言及する場合、この細胞は、投与後に、又は液体で元に戻した後に再び活性となる例えば凍結乾燥細胞など、生存可能な細胞を包含することを理解されたい。
【００４２】
食品、補助食品、栄養組成物、又は薬剤組成物は、液体の形、例えば１種（複数）の菌株の安定した懸濁液か、固体の形、例えば粉末か、或いは半固体の形のいずれかである。例えば、経口投与用に、１種（複数）の菌株を、カプセル剤、錠剤、散剤などの固体剤形か、或いはエリキシル剤、シロップ剤、懸濁剤などの液体剤形で投与することもできる。１種（複数）の菌株をゼラチンカプセル中で、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース若しくはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの不活性成分及び粉末担体と一緒にゼラチンカプセル化することができる。上述の通り、この組成物は、タンパク質、炭水化物、ビタミン、無機質、微量元素、アミノ酸、他の生物活性成分若しくは薬剤活性成分、担体、安定剤、矯味剤、他のプロバイオティック菌株、プロバイオティクスなどの追加の成分を含むことができる。
【００４３】
群２の菌株は特に、ＣＯＰＤ、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、吸引（aspiration）、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、非特異的な吸入刺激物によって引き起こされる肺機能障害、肺水腫、気管狭窄、又は声帯機能障害などの肺機能障害の治療用又は予防用の組成物を調製するのに適している。もちろん、群２の菌株を、抗炎症活性を有することが分かっている菌株（群１及び／又は群３の菌株など）と組み合わせることができる。このような組合せは、炎症、例えばアレルギー性喘息を伴う肺疾患又は呼吸器疾患／障害の治療或いは予防に適している。
【００４４】
本発明の１種又は複数の菌株を含む組成物は、肺機能障害をすでに患っている患者を治療するのに適しており、或いはこれを、そのような肺機能障害を発症する高い危険性のある対象、例えば煙／喫煙、冷気などに曝露した対象に予防のために投与することもできる。
【００４５】
使用する細菌株は、乳酸産生菌であることが好ましく、また乳酸桿菌属又はビフィドバクテリウム属のものであることが好ましい。この細菌は、食用であるべきであり、すなわちヒト又は動物対象によって摂取される場合に有害でないものと見なすべきである。食用でない細菌、例えば対象によって摂取される場合、もはや有害でないように改変された病原細菌は、本発明の範囲内に包含されることを理解されたい。乳酸桿菌株は、以下の種、すなわちラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・デルブリッキ（L. delbrueckii）、ラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・クリスパタス（L. crispatus）、ラクトバチルス・サケイ（L. sakei）、ラクトバチルス・イエンセン（L. jensenii）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（L. sanfransiscensis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（L. fructivorans）、ラクトバチルス・ケフィリ（L. kefiri）、ラクトバチルス・クルバタス（L. curvatus）、ラクトバチルス・パラプランタルム（L. paraplantarum）、ラクトバチルス・ケフィアグラナム（L. kefirgranum）、ラクトバチルス・パラケフィア（L. parakefir）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバチルス・プランタルム（L. plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチルス・ジョンソニ（L. johnsonii）、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）、ラクトバチルス・キシロサス（L. xylosus）、ラクトバチルス・サリバリウスなどのものでよい。好ましい種は、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・サリバリウスであり、より好ましい種はラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・カゼイ、又はラクトバチルス・ラムノサスである。種ラクトバチルス・カゼイに属するラクトバチルス属菌株を使用することが最も好ましい。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ラクトバチルス・ラムノサス菌株、特に菌株ラクトバチルスＧＧは、安全性の問題を引き起こす恐れがあるので、また例えば菌株ラクトバチルスＧＧは、特定の用途に望ましくないであろう特徴を有するので（実施例参照）、それらの菌株は除外される。
【００４７】
ビフィドバクテリウム属菌株は、以下の種、すなわちビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・カテニュレイタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アンギュレイタム（B. angulatum）などのものであってよい。好ましい種は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及び／又はビフィドバクテリウム・アニマリス、特にビフィドバクテリウム・アニマリスサブスピーシーズラクティス（B. animalis subspecies lactis）である。
【００４８】
微生物の種の同定は、生化学的に、又は塩基配列決定法（例えば保存領域）により、又はパルスフィールドゲル電気泳動法などの既知の方法によって判定することができる。一般に、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域において少なくとも９７％の核酸配列同一性を示す場合（例えば、場合によっては、デフォルトパラメータを使用して、例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって整列する場合）、細菌の菌株は同一の種に属している。
【００４９】
ラクトバチルス・カゼイ菌株ＴＤ２は、ブダペスト条約に従ってＢＣＣＭ（商標）（Belgian Co-ordination Collections of Microorganisms、Gent、ベルギー）にアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ−２２１１０として寄託されている。ＬＭＧ Ｐ−２２１１０は特に、上記の通り組成物を調製するのに適しているが、本発明はこの菌株に限定されない。
【００５０】
本発明の寄託されている菌株又は他の任意の菌株の複製物及び／又は派生物が本発明によって包含されることを理解されたい。「複製物」という用語は、微生物の増殖、例えば培地中での細菌の増殖によって産生された材料など、実質的に改変されていない材料の複製を表す生物材料をさす。「派生物」という用語は、生物材料から作製され、例えば遺伝物質の遺伝的変化によって生じた、新たな特性を有するように実質的に改変された材料をさす。こうした変化は、自発的に生じ得るか、或いは化学的及び／又は物理的作用物質（例えば突然変異誘発因子）の適用の結果であり、且つ／又は当技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術によるものとすることができる。別の菌株に「由来する」菌株に言及する場合、得られた菌株が、元の菌株の、気道狭窄に対する有益な作用を依然として保持している限り、その菌株の「複製物」、並びにその菌株の「派生物」はどちらも包含され、したがってこれらを使用して肺機能障害を治療及び／又は予防することができることを理解されたい。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、少なくとも２種以上の菌株を１種の組成物中で組み合わせるか、或いは対象に同時投与する。抗炎症作用を及ぼす少なくとも１種の菌株（例えば、ＴＤ５など当技術分野で既知の菌株、又はＴＤ１など群１の菌株）と、気道狭窄に対して有益な作用を及ぼすが、抗炎症作用を及ぼさない他の少なくとも１種の菌株（例えば群２の菌株、例えばＴＤ２）とを組み合わせることが好ましい。異なる作用様式を発揮する菌株の組合せは、肺機能に対して強化作用を及ぼすことができるので、菌株のこの組合せは、場合によっては、抗炎症活性を有する１種（複数）の菌株のみの投与よりも優れている。この菌株を、様々な組成物中に存在させてもよく、対象への様々な組成物の投与の後にｉｎ ｖｉｖｏで組み合わせるだけでもよい。或いは、この菌株を単一の組成物中に存在させてもよい。どちらの場合でも、２種以上の菌株の投与は「同時投与」と呼ばれる。
【００５２】
さらなる一実施形態では、本明細書で上述した通り本発明の少なくとも１種の菌株を含む組成物が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる別の実施形態では、菌株ＬＭＧ Ｐ−２２１１０（ＴＤ２）、又は前記菌株に由来する任意の菌株が提供される。
【００５４】
上記の本発明の組成物を含む容器も提供される。このような容器は、１〜１００回、また個々の値がそれぞれ、１回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回、又はそれを超える回数など、１〜１００回分の用量が入る、錠剤、カプセル剤、散剤、アンプル剤、小袋などの形のパッケージでよい。同様に、パッケージは、１〜２００回、１〜５００回、又はそれを超える回数分の用量が入るものでもよい。異なる菌株を同時投与すべき場合、容器は、菌株を含む各々の組成物を別々の用量含むことができることを理解されたい。この容器は、組成物の有益な作用、又は健康への影響を記載したラベルを外側に含むことが好ましい。例えば、この容器に、組成物が「ＣＯＰＤ患者用」又は「健康改善」のものであると記載してもよい。この容器は、カートン製、プラスチック製、金属製などのものとすることができる。この容器はまた、組成物が液体又は粉末の形である場合、例えば吸入器など、組成物の投与に適した道具を含むことができる。この容器はさらに、使用説明書を含むこともできる。
【００５５】
本発明の目的はまた、肺機能の治療用又は予防用の組成物を調製する方法を提供することであり、この方法は、
ＰｅｎＨ試験を使用することにより、或いはヒト対象におけるＦＥＶ１値を求めることにより、気道狭窄に対する細菌株の、好ましくは乳酸産生菌の作用を試験するステップと、
ＰｅｎＨ及び／又はＦＥＶ１に対する影響に基づいて、気道狭窄に対する、特にＡＨＲに対する有意で有益な作用を有する菌株を選択するステップと、
選択された菌株を適当な液体又は固体培地中で増殖させるステップと、
場合によっては、例えば遠心分離及び／又はろ過によりこの菌株を培地から単離し、当技術分野で既知の後処理プロセス、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、及び／又は凍結を実施するステップと、
この菌株を対象への投与に適した形に製剤化するステップとを含む。
【００５６】
場合によっては、単離した菌株が、対象に対して有意な抗炎症作用を与えることができるかどうかも試験する。
【００５７】
上記の方法で使用する菌株をその自然環境から単離し、且つこの菌株が汚染物質を含んでいないことが好ましいことに留意されたい。単離された菌株を人工培地上で、又は（低脂肪）ミルク、ヨーグルトなどの天然培地上で増殖させることができる。次いで、これを直接使用して、本発明の組成物を製造することができ、或いは遠心分離及び／又はろ過によりこの細菌を濃縮し、又は培地から単離し、次いで適当な組成物に製剤化することもできる。微生物（例えば、酵母、細菌の様々な種）の定義されていない混合物を含む、例えばケフィアなどの既存の食品組成物は、このような製品がその細菌の構成（種）並びに細菌濃度（用量）に関して定義されていないので、本発明の組成物から除外される。しかし、本発明の１種又は複数の菌株を添加したこの組成物を食品ベースとして使用することができる。これにより導き出された組成物（少なくとも本発明の菌株のうちの少なくとも１種を含む）及びその使用のみは、本発明の実施形態と見なされる。
【００５８】
肺機能障害、特に、ＣＯＰＤ、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、吸引、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、非特異的な吸入刺激物に起因する肺機能障害、肺水腫、気管狭窄、及び／又は声帯機能障害の治療用又は予防用の医薬品を調製するための、本発明の群１及び／又は群２の菌株の使用は、本発明のさらなる一実施形態である。特に好ましい一実施形態では、この医薬品は、ＣＯＰＤ、吸引、非特異的な吸入刺激物に起因する肺機能障害、肺水腫、及び／又は気管狭窄からなるグループから選択される肺機能障害の治療用及び／又は予防用に使用される。
【００５９】
別の実施形態では、対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療用又は予防用の医薬品を調製するためのプロバイオティック乳酸菌の使用が提供される。
【００６０】
以下の非限定的な実施例は、本発明の菌株の同定及び使用を記載したものである。別段の記述がない限り、本発明の実施には、分子生物学、ウイルス学、微生物学、又は生化学の標準的な常法が使用される。
［実施例］
【実施例１】
【００６１】
菌株ＴＤ２の説明及び特徴及びプロバイオティック特性
菌株の単離
菌株ＴＤ２を健常人志願者の糞便から単離した。プロバイオティック菌株を求めて健常成人志願者の糞便を捜した。「健常」は、疾患や疾病にかかっておらず、消化管疾患を患っておらず、少なくとも６週間抗体を使用しておらず、少なくとも１週間プロバイオティック製品を摂取しておらず、乳タンパク質に不耐性でなく、且つ規則正しい排便習慣を有する成人を意味する。食習慣に関する日記を記録した。
【００６２】
嫌気チャンバー内で新鮮なヒト糞便を分析した。この糞便を９０ｍｌの保存培地（２０ｇ／ｌ緩衝ペプトン水、１．０ｍｌ／ｌ Tween 80、０．５ｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣｌ、リサズリン１錠／リットル、ｐＨ６．３（２Ｍ ＨＣｌで調整））で１０倍に希釈し、次いでUltra-Turraxを使用してホモジナイズした。希釈したペプトン（１．０ｇ／ｌ）生理食塩水中で段階希釈物を作製し、１０２〜１０７倍希釈物をLAMVAB上に蒔いた（Hartemink et al. 1997）。この最終培地は、５２ｇ／ｌ ＭＲＳ（De Man Rogosa and Sharpe、Oxoid社製）、０．２５ｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣｌ、０．０２５ｇ／ｌブロモクレゾールグリーン、２０ｇ／ｌ寒天、及び２０ｍｇ／ｌバンコマイシンからなるものであった。ＭＲＳ（１０４ｇ／ｌ）、Ｌ−システイン−ＨＣｌ（０．５ｇ／ｌ）、及びブロモクレゾールグリーン（０．０５ｇ／ｌ）を、寒天（４０ｇ／ｌ）と別にして１２１℃で１５分間オートクレーブで処理し、５０℃まで冷却した。０．２μｍフィルターを使用して、バンコマイシンの原液（２ｍｇ／ｍｌ）をろ過滅菌した。オートクレーブ処理した寒天と、ＭＲＳ、システイン、及びブロモクレゾールグリーンとを１：１の比で混合した。続いて、バンコマイシンを終濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるまで添加し、その後プレートに注いだ。このプレートを嫌気ジャー内で３７℃で３日間インキュベートした。コロニーをＭＲＳ寒天上に画線して純化し、３７℃でインキュベートした。
【００６３】
菌株の分類
１６ｓ ＲＮＡの塩基配列決定により、菌株の同定の信頼性が高くなる。Boom et al., (1990)に記載の方法に従って、菌株のＤＮＡの抽出を行った。表１に記載した８ｆ及び１５１０ｒプライマーを用いて、１６ｓ ＲＮＡ領域の増幅及び塩基配列決定を達成した。増幅プログラムは、９４℃で５分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で９０秒間を３０サイクル；最後に７２℃で４分間である。
【表１】
【００６４】
Sanger et al., (1977)によって開発されたＤＮＡ塩基配列決定法であるジデオキシ法により塩基配列決定を実施した。ＣＳＲ（サイクルシークエンス反応）においてABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（Applied Biosystems社製、Nieuwekerk aan de IJssel、オランダ）を表２に記載した全てのプライマーと組み合わせて使用した。ＣＳＲ用のプログラムは、９６℃で３０秒間の後、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、及び６０℃で４分間を２５サイクルであった。続いて、このＣＳＲ混合物を、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製、Nieuwekerk aan de IJssel、オランダ）の助けを借りて分析した。塩基配列のデータをChromas V1.51（Technelysium Pty社製、Tewantin、オーストラリア）で分析し、DNASIS for Windows V2.5（Hitachi Software Engineering社製、Wembley、英国）の助けを借りて整列させた。完全２本鎖の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定された領域をＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al. 1990）に入力し、菌株を判定するために、GenBank、EMBL、DDBJ、及びPDBデータベースにおいて（菌株の）他の（１６Ｓ ｒＤＮＡ）塩基配列と比較した。種ラクトバチルス・カゼイのものである菌株を同定した。
【００６５】
菌株の生存
ヒトの糞便から単離された菌株ラクトバチルス・カゼイＴＤ２、並びに既知のプロバイオティック菌株の胃及び小腸における生存を評価した。この菌株をヒトにおけるプロバイオティックとして使用する場合、胃及び小腸における生存は重要である。
【００６６】
この細菌をＭＲＳ中で２４時間増殖させ、続いてＭＲＳ中に再接種し２４時間増殖させた。１ｍｌの増殖培地を、８．３ｇ／ｌ細菌用ペプトン、３．１ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．１１ｇ／ｌ ＣａＣｌ２、１．１ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．６ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、２２．２ｍｇ／ｌペプシン、及び２２．２ｍｇ／ｌリパーゼ、ｐＨ３．０からなる９ｍｌの胃様培地に添加した。この細菌を胃様培地の培地中で２７℃で３時間インキュベートした。その後、細菌を含むインキュベートした胃様培地１ｍｌを小腸様培地９ｍｌと混合し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。この小腸様培地は、５．７ｇ／ｌ細菌用ペプトン、１．２５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．０５５ｇ／ｌ ＣａＣｌ２、０．１５ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．６８ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、０．３ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．７ｇ／ｌグルコース、２０．３ｇ／ｌパンクレアチン、及び５．５ｇ／ｌ胆汁、ｐＨ６．５からなる。試料をｔ＝０時間、３時間、及び６時間で採取し、ＭＲＳ寒天上に蒔いてコロニー形成単位を求めた。
【００６７】
下記の表２に示すように、ヒト糞便から単離したラクトバチルス・カゼイ、ＬＭＧ Ｐ−２２１１０は、胃様及び小腸様培地中において他のプロバイオティック菌株と類似の、又はそれよりさらに良好な生存率を示した。
【表２】
【００６８】
菌株の接着
プロバイオティクスの特性の１つは、プロバイオティクスが腸細胞と接着し、上皮細胞の結合部位を求めて病原体と競合し得ることである。上皮細胞への接着は、コロニー形成能、及び宿主に対するプロバイオティック作用とも関連がある。
【００６９】
ラクトバチルス・カゼイＬＭＧ Ｐ−２２１１０の接着性を試験した
菌株の一晩培養物を遠心分離（１０分、４０００ｒｐｍ、Sorval RT17）によって回収し、ＰＢＳ中で再懸濁させた。ビュルケルチュルク計算板を使用して、細胞の量を顕微鏡下で計数した。細菌を再度遠心分離し、ペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まないＣａｃｏ−２ １％ＦＣＳ培地中で再懸濁させた。Ｃａｃｏ−２細胞は、コンフルエント後２週間のものであり、これを２４ウェルプレートで増殖させた（１〜２×１０５Ｃａｃｏ−２細胞／ウェル）。ウェルあたり１×１０８ＣＦＵの細菌を添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、この培地からＣａｃｏ−２細胞を回収し、この細胞をＰＢＳで３回洗浄した（３７℃）。細胞を無菌のMili Q水で溶解させ、溶解した細胞の段階希釈物を作製し、ＭＲＳ寒天上に蒔いた。
【００７０】
ラクトバチルス・カゼイＬＭＧ Ｐ−２２１１０（ＴＤ２）は、よく知られている他のプロバイオティック菌株と少なくとも同じぐらい良好に接着するという結果が示された。接着性は陽性対照よりも良好であった。添加した培養物のうち約１３％が接着した。
【００７１】
溶血、又はヒスタミン及びチラミンの産生などの望ましくない特性は観察されなかった。
【実施例２】
【００７２】
オバルブミン感作マウスを乳酸菌株で予防的に処置した動物実験
動物：
特定の病原菌を有していない雄ＢＡＬＢ／ｃマウスをCharles River社（オランダMaastricht）から入手した。食物及び水を適宜与え、６〜９週齢になったマウスを使用した。すべての実験は、オランダのUtrecht大学の動物倫理委員会によって承認された。
【００７３】
試薬：
オバルブミン（グレードＶ）及びアセチル−β−塩化メチルコリン（メタコリン）をSigma Chemical社（米国ミズーリ州St. Louis）から入手した。水酸化アルミニウム（AlumInject）Pierce社から購入した（米国イリノイ州Rockford）。
【００７４】
感作、処置、及びチャレンジ：
マウスを、１００μｌの生理食塩水中の２．２５ｍｇ水酸化アルミニウム上に吸着させた１０μｇオバルブミン、又は生理食塩水のみに、０日目と７日目の２回の腹腔内注射によって感作させた。３５日目、３８日目、及び４１日目に、プレクシグラス製曝露チャンバー内での２０分間のオバルブミンエアゾール剤の吸入によりマウスにチャレンジした。Pari LC Star nebuliser（Pari respiratory Equipment社製、米国バージニア州Richmond）を使用して、生理食塩水中のオバルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を噴霧することによりエアゾール剤を作製した。２８日目に開始して実験の終わり（すなわち４２日目）まで毎日、マウスを菌株あたり１０９（ＣＦＵ）の乳酸菌で胃管を通じて経口的に処置した。
【００７５】
気道反応性の判定：
意識下非拘束マウスにおいて、噴霧により吸入させるメタコリンに対する気道反応性を、全身プレチスモグラフィー（BUXCO, EMKA社製、仏国Paris）を使用して最後のエアゾール剤チャレンジの２４時間後に判定した。気道反応をＰｅｎＨ（enhanced pause）で表した。
【００７６】
気管支肺胞洗浄：
コリン作動性の気道反応の測定後、動物を屠殺し、気管支肺胞洗浄を実施し、細胞の総数を求め、細胞を区別した。最初の洗浄液１ミリリットルの上清を分離し、後続の分析まで−７０℃で凍結した。全細胞（好中球、マクロファージ、好酸球、及びリンパ球）の流入を肺組織の炎症の測度と見なす。
【００７７】
統計分析：
一般的な線形モデル又は反復測定により、メタコリンに対する気道反応曲線を統計的に分析し、続いて群間の事後の比較を行った。マンホイットニーのＵ検定を使用して、細胞計数を統計的に分析した。ｐ＜０．０５の確率値を統計的に有意であると見なした。
【００７８】
結果：
結果を表３に示す。菌株ＴＤ２は、気道過敏性に対して有意な作用を示すが、炎症に対して有意な作用を示さない。一方、菌株ＴＤ５は、気道過敏性に対して有意な作用を示さないが、炎症に対してある作用を示す。菌株ＴＤ１は、気道過敏性と炎症のどちらに対してもある作用を示す。
【００７９】
こうした結果から、肺機能に対する乳酸産生菌の一部の菌株の示差的な作用が示され、また肺炎症に対する有益な作用が必ずしも肺機能に対して有益な作用をもたらすとは限らず、また逆も同様であることが示される。したがって、こうした結果から、肺機能に対して有益な作用を及ぼす乳酸を産生する菌株は、抗炎症作用を及ぼすその菌株とは異なり、肺機能障害を伴う疾患に対して治療効果及び／又は予防効果を及ぼし得ることが示される。こうした結果から、種ラクトバチルス・カゼイに属する菌株が特に効果的であることが示される。
【表３】
【実施例３】
【００８０】
エンドトキシン誘発肺気腫のマウスモデルにおける乳酸菌の作用を示す動物実験
ＬＰＳ処置によりマウスにおいて肺気腫を誘発することができる。
【００８１】
動物：
特定の病原菌を有していない雄ＢＡＬＢ／ｃ ｂｙＪＩｃｏマウスをCharles River社（オランダMaastricht）から入手した。食物及び水を適宜与え、７〜８週齢になったマウスを使用した。すべての実験は、オランダのUtrecht大学の動物倫理委員会によって承認された。
【００８２】
試薬：
ＬＰＳ：大腸菌、血清型Ｏ５５：Ｂ５：Sigma Chemical社製
メタコリン（アセチル−β−メチルコリン）をJanssen Chimica社（ベルギーBeerse）から入手した。
【００８３】
感作、処置、及びチャレンジ：
４週間（０日目、３日目、７日目、１０日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、及び２４日目）週２回、ＬＰＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌ中に５μｇ）、又は対照のＰＢＳ（５０μｌ）の鼻腔内投与により肺気腫を誘発した。１４日目に開始して実験の終わり（すなわち４２日目）まで毎日、マウスを、菌株あたり１０９（ＣＦＵ）の乳酸菌を含む０．２ｍｌの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）で胃管を通じて経口的に処置した。対照として０．２ｍｌの生理食塩水を添加した。
【００８４】
気道反応性及び気管支肺胞洗浄の判定を実施例２に記載の通り実施した。
【００８５】
右室肥大
右室の肥大は肺気腫の徴候である。４２日目に解剖顕微鏡下で、全心臓（１０例の動物のうち４例）を単離し、右室自由壁（ＲＶ）を完全に分離し取り出した。吸取り乾燥の後、左室と中隔（ＬＶ＋Ｓ）及びＲＶの重量を別々に測定した。ＲＶ重量とＬＶ＋Ｓ重量の比を右室肥大の指標として使用した。
【００８６】
統計分析：
メタコリンに対する気道反応曲線のデータ、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞計数、右室（ＲＶ）肥大を、相加平均±平均の標準誤差として表し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ノンパラメトリックな）を使用して群間の比較を行い、続いて群間の事後の比較（ボンフェローニの多重比較検定）を行った。ｐ＜０．０５の確率値を統計的に有意であると見なした。気道反応の測度はＮ＝１０、ＢＡＬ細胞計数はｎ＝６、ＲＶ肥大はｎ＝４である。
【００８７】
結果：
結果を表４に示す。再び、菌株ＴＤ２は、気道過敏性に対して有意な作用を示すが、炎症に対して有意な作用を示さない。
【００８８】
この結果から、乳酸産生菌の菌株ＴＤ２は、気道過敏性、及びＬＰＳによって誘発された肺気腫を患うマウスにおける右室肥大に対して有益な作用を及ぼし、これが抗炎症機序を介して起こらない作用であることが示される。こうした結果から、ＰｅｎＨに対してある影響を及ぼす特定の一部の菌株は、肺気腫及び／又はＣＯＰＤなどの肺機能障害を治療及び／又は予防する際に有益であることが示される。こうした結果から、ラクトバチルス・カゼイ菌株は適当であり、特に菌株ＴＤ２が適当であることが示される。
【表４】
【実施例４】
【００８９】
乳酸菌株を含む組成物
補助食品組成物
１．０．５ｇスキムミルク粉末、及びガラクトオリゴ糖と果糖多糖類との混合物０．５ｇを含み、１ｇあたり５×１０９ｃｆｕのＴＤ２を含むカプセル。用量：１日あたり２×１ｇ。
【００９０】
２．１ｇあたり５×１０９ｃｆｕのＴＤ１、及び５×１０９ｃｆｕのＴＤ２を含む粉末、マルトデキストリン；子袋入り。用量：１日あたり２×１ｇ。消費前に、水、果汁、ミルク、又はヨーグルトなどに溶解すること。
【００９１】
食品／栄養組成物
１．１２５ｍｌあたり５×１０９のＴＤ１の熱不活性化細胞を含む、ＣＯＰＤを患う患者に適応される液体栄養。推奨用量は１日あたり３×１２５ｍｌである。
１００ｍｌあたり
− タンパク質７．５ｇ（乳清カゼイン混合物、１／１）
− 炭水化物２２．５ｇ（グルコース０．３ｇ、ラクトース２．０ｇ、マルトース１．０ｇ、サッカロース３．０ｇ、多糖類１５．８ｇ）
− 脂肪３．３ｇ（飽和脂肪酸０．５ｇ、一不飽和脂肪酸１．９ｇ、ポリ不飽和酸０．９ｇ）
− 無機質（Ｎａ ５５ｍｇ、Ｋ １１０ｍｇ、Ｃｌ ６０ｍｇ、Ｃａ １５５ｍｇ、Ｐ １００ｍｇ、Ｍｇ １５ｍｇ）
− 微量元素（Ｆｅ ３．２ｍｇ、Ｚｎ ２．４ｍｇ、Ｃｕ ３６０μｇ、Ｍｎ ０．６６ｍｇ、Ｆ ０．２０ｍｇ、Ｍｏ ２０μｇ、Ｓｅ ２３μｇ、Ｃｒ １３μｇ、Ｉ ２７μｇ）
− ビタミン（ビタミンＡ １２７μｇＲＥ；プロビタミンカロテノイド７３μｇＲＥ、カロテノイド０．８ｍｇ、ビタミンＤ １．４μｇ、ビタミンＡ ５．０μｇα−ＴＥ、チアミン０．３０ｍｇ、リボフラビン０．３２ｍｇ、ナイアシン３．６ｍｇＮＥ、パントテン酸１．１ｍｇ、ビタミンＢ６ ０．３５ｍｇ、葉酸５３μｇ、ビタミンＢ１２ ０．５０μｇ、ビオチン８．０μｇ、ビタミンＣ ４０ｍｇ）
− コリン７４ｍｇ
【００９２】
２．ミルクベースの粉末；８５ｇ、小袋入り；２４０ｍｌの液体、例えばミルク、ヨーグルト、又は果汁と混合される；
粉末１００ｇにつき以下のものを含有
− ＴＤ２ １×１０１０ｃｆｕ
− タンパク質４．７ｇ
− 炭水化物６８．２ｇ（糖類２５ｇ）
− 脂肪２４．７ｇ
− 無機質（Ｎａ １４０ｍｇ、Ｋ ５７０ｍｇ、Ｃａ １３０ｍｇ、Ｐ ４００ｍｇ、Ｍｇ １４ｍｇ）
【００９３】
参考文献
Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-10
Babu and Arshad, 2003, Paediatr. Respir. Rev. 4:40 - 60.
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or methacholine: method of continuous aerosol generation and tidal
breathing inhalation. In: Hargreave FF. Woolcock AJ eds. Airway
responsiveness measurement and interpretation. Mississauga: Astra
Pharmaceuticals Canada: 22-8.
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Tejada-Simon, 1999, J. Food Prot. 62:162-169
Varcoe et al., 2003, J. Food Prot. 66:457-465
Yan et al. 1983, Thorax 38: 760-765
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品及び／又は薬剤組成物の分野に関する。本発明は、生きた（プロバイオティック）乳酸産生菌、死んだ、若しくは生存不可能なその細菌、並びに補助食品、栄養組成物、及び／又はこれらを含む薬剤組成物の新規使用を提供する。本発明はさらに、このような組成物を製造する方法、並びにこのような組成物中に含めるのに適した細菌を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肺機能の低下は、気道の狭窄、又は肺上皮から血流への酸素拡散の低下によって引き起こされる恐れがある。気道の狭窄は、例えば、気道抵抗（ＡＲ）の増加、及び気道過敏性又は気管支過敏性（ＡＨＲ又はＢＨＲ）をもたらす。ＡＨＲは、様々な刺激に対する過剰な気管支収縮反応をさし、（気道狭窄）刺激に対する感受性の増大によって反映される。さらに、対象においてＡＨＲが頻繁に起こると、気道リモデリング、及びそれにより気道狭窄、気道抵抗の増加がもたらされ、続いて肺機能のさらなる低下に向かう事象の悪循環が引き起こされる（Babu and Arshed, 2003）。気道狭窄は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、環境による肺疾患など、様々な肺の疾患又は障害に伴う症状である。気道狭窄は、上気道感染の後にも、またアトピー性で非喘息の患者（atopic non-asthmatics）、及び喘息の既往歴がある患者においても生じる。
【０００３】
ＣＯＰＤは、慢性気管支炎及び肺気腫を包含する包括的用語である。ＣＯＰＤの主要な危険因子は、能動喫煙及び／又は受動喫煙である。他の危険因子は、職業被曝、及びα１プロテイナーゼインヒビター（又はαＩアンチトリプシン）の遺伝的欠損である。慢性気管支炎の患者は、２年間連続して１年につき少なくとも３ヶ月間ほとんど毎日、慢性湿性咳嗽の病歴を有する。咳嗽増加、呼吸困難、呼気流量の減少、運動耐性低下、及び日常生活での活動障害に向かう緩やかな進行が観察されることが多い。粘液性分泌物の粘稠化、及び気管支壁の浮腫が気道狭窄の原因である。肺気腫では、肺胞壁の分解、又は肺胞を取り囲む肺毛細血管の消失、終末細気管支より末梢の気腔の拡張、肺胞壁破壊、及び肺胞表面積の減少によるガス拡散障害が観察される。肺胞の崩壊の他に、ＣＯＰＤに見られる形態変化は平滑筋細胞の過剰増殖である。こうした形態変化は、酸素摂取機能の低下、及び平滑筋収縮の障害をもたらす。続いて、これは、数ある中でメタコリン、ヒスタミン、冷気などの非特異的作用物質に対する肺（気道）過敏性、及び気道抵抗の増加をもたらす。
【０００４】
喘息は別の肺疾患である。喘息は、呼吸困難、胸部絞扼感、喘鳴、喀痰、咳嗽などの症状を伴う慢性疾患である。喘息の発現及び持続は、主に、抗原誘発性炎症の存在、及び気道構造に対するその作用（「アレルギー性喘息」）に起因すると考えられる。ＣＯＰＤの一部の症状は喘息に類似しているが、喘息とＣＯＰＤは同一でなく、こうした疾患を有する患者は、別々に治療されるべきであることを示唆する証拠が相当ある。ＣＯＰＤと対照的に、喘息患者における気道閉塞は可逆的である。
【０００５】
気道過敏性及び／又は気道抵抗が重要な役割を果たしている疾患は、健康の重大な障害となる。例えば、ＣＯＰＤは現在、世界で５番目に多い疾患で、死因の第５位となっており、ＣＯＰＤは、２０２０年までに世界で最も多い死因の第３位に位置する恐れがあると予測されている。ＣＯＰＤ患者のうちの３分の１を超える患者で、その疾患のために、患者は仕事ができないか、その仕事の能力が制限されるか、或いは過去１年以内に仕事をする時間が失われてしまうと報告されている。こうした間接費は、一次及び二次医療費からの直接費と併せて、９０年代中頃の米国でおよそ１１０億ドルであったと推定されている。
【０００６】
発展途上国での喘息の有病率は高い。例えば、英国での国民健康キャンペーンによる２００１年喘息検査によれば、現在、成人１３人に１人、子供８人に１人が喘息の治療を受けている。また、喘息に関する、生産性の損失による費用、健康治療における費用、及び社会保障費は巨額である（２００１年の英国で２２億ポンドという推定がある）。
【０００７】
ＣＯＰＤ又は喘息など、肺疾患の現在の治療法には薬物治療が含まれ、この治療は喫煙の中止を助ける。患者が喫煙の中止を成し遂げることは困難であり、薬物には、副作用が起こる恐れがあるという不利な点がある。こうした副作用は、使用する特異的な薬物に依存した、例えば、動悸、頻脈、振戦、身震い／神経過敏、頭痛、不眠症、口内乾燥、霧視、易刺激性、落ち着きのなさ、悪心、嘔吐、嗄声、副腎機能不全、免疫抑制、及び下痢からなり得る。さらに、患者は薬物に対する感受性が低下する恐れがある。
【０００８】
したがって、副作用がないが患者のＡＨＲ及びＡＲを軽減することにより、肺機能に対して有益な作用を及ぼす組成物及び方法がさらに必要である。
【０００９】
微生物の一部の菌株、特に乳酸桿菌（Lactobacillus）属及び／又はビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属するもの、いわゆる「プロバイオティック」菌株は、ヒト及び／又は動物による生存消費に対して有益な作用を及ぼすことが知られている。下痢、胃腸管又は尿路感染、腟感染、炎症性疾患、及びアレルギーに対する治療及び／又は予防効果が報告されている。こうした疾患におけるプロバイオティクスの作用機序は、病原菌の直接の排除を介したもの、及び／又は免疫系の調節を介したものである。例えば、特定のプロバイオティック菌株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、又はｉｎ ｖｉｖｏの腸で、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γに対して低減作用を及ぼすことが示されている（Schultz et al. 2003、Varcoe et al. 2003、Madsen et al. 2001、Tejada-Simon 1999）。国際公開第０３／０１０２９８号では、腸内に存在すると炎症誘発性サイトカインのレベルを明らかに低下させる免疫調節作用を有するラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）というプロバイオティック菌株が開示されている。同様に、国際公開第０３／０１０２９７号では、抗炎症作用を有するビフィドバクテリウム属というプロバイオティック菌株が開示されている。国際公開第０１／９７８２２号では、ラクトバチルスＧＧ（Lactobacillus GG）菌株（ＡＴＣＣ５３１０３）、及びアレルギー性炎症に関するビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）Ｂｂ−１２の使用が開示されている。国際公開第０１／３７８６５号では、プロバイオティック細菌投与後のＩｇＥ抗体のダウンレギュレーションが記載されている。
【特許文献１】国際公開第０３／０１０２９８号
【特許文献２】国際公開第０３／０１０２９７号
【特許文献３】国際公開第０１／９７８２２号
【特許文献４】国際公開第０１／３７８６５号
【非特許文献１】Babu and Arshed, 2003
【非特許文献２】Schultz et al. 2003
【非特許文献３】Varcoe et al. 2003
【非特許文献４】Madsen et al. 2001
【非特許文献５】Tejada-Simon 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プロバイオティクスの使用は当技術分野で記載されているが、現在までに記載されている細菌の菌株は、有益な抗アレルギー性の、且つ／又は抗炎症性の免疫系作用について、或いは抗病原菌作用について選択されている。こうした菌株が有益な作用を及ぼすことが示されている場合、この作用は、あらゆる場合においてこれらの作用様式を介して（直接的に、又は間接的に）及ぼされる。例えば、アレルギーの治療において、プロバイオティック菌株の消費は、ある抗炎症作用、又はＴｈ１／Ｔｈ２の均衡を回復させる免疫系に対してある作用を及ぼすと記載されており、したがって、このような菌株はアレルギー性喘息を治療する際に有用であると推定されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は初めて、肺機能に対する（すなわちＰｅｎＨ（enhanced pause：呼吸抵抗指数）に対する、またそれによりＡＨＲ及び／又はＡＲに対する）直接作用に関して、単離された細菌の菌株を試験し、驚くことに、乳酸産生菌の一部の菌株（群１及び群２、下記参照）がｉｎ ｖｉｖｏでの気道狭窄に対して、特にＡＨＲに対して有意で有益な作用を有すること、並びにこの作用が、抗炎症反応に依存せず、及びアレルギー患者で観察される（抗原特異的）免疫応答であるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン応答の均衡を取り戻すことにも依存していない作用様式によるものであることを発見した（Cross et al. 2002を参照）。さらに、以前に記載された、呼吸器障害を治療するのに使用される薬剤とは対照的に、本発明の菌株は、吸入する必要がなく、摂取することができる。したがって、この菌株を使用して、プロバイオティック菌株を用いて治療可能であることがこれまで知られていなかった、例えば、ＣＯＰＤ、非アレルギー性喘息などの呼吸器疾患を治療又は予防することができる。また、本発明の１種又は複数の菌株を、例えば既知のプロバイオティック菌株（例えば異なる作用様式を有する菌株）と一緒に同時投与することも本発明に包含される。さらに、本発明の菌株を死細胞、又はこうした菌株を含む組成物として投与して、肺機能に対して有益な作用を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
定義
本明細書では、「乳酸菌」及び「乳酸産生菌」を同義的に使用し、これは、それだけには限らないが、乳酸桿菌属、レンサ球菌属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エノコッカス属（Oenococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、腸球菌属（Enterococcus）、ビフィドバクテリウム属の細菌など、乳酸を発酵の最終産生物として産生する細菌をさす。
【００１３】
「プロバイオティクス」又は「プロバイオティック菌株」は、対象により（例えば経腸的に、又は吸入によって）摂取されると、宿主に対して有益な作用を及ぼす生きた微生物、好ましくは細菌の菌株をさす。
【００１４】
本明細書では、「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物、特に脊椎動物をさす。
【００１５】
本明細書では、「肺機能障害」という用語は、「非特異的な気道狭窄」によって引き起こされる、気道通過の低下をさす。肺機能障害という用語は、本明細書で、アレルゲンによって誘発されるとアレルギー性喘息で見られるような肺組織の免疫応答を伴う気道狭窄をさす「特異的な気道狭窄」を包含しない。肺機能障害は、気道抵抗（ＡＲ）又は気道過敏性（ＡＨＲ）として測定することができる。
【００１６】
「気道過敏性若しくは気管支過敏性」又は「気道反応亢進若しくは気管支反応亢進」（ＡＨＲ又はＢＨＲ）は、気管支収縮剤による刺激に応答した、気道狭窄の容易さ及び程度の増大をさす。ＡＨＲは、本明細書の別の場所に記載する気管支誘発試験によって測定することができる。本明細書では、「非特異的に誘発される気道過敏性」（非特異的なＡＨＲ）を、対象における（アレルゲンによって引き起こされる）アレルギー性反応に依存していないＡＨＲをさすのに使用する。それとは対照的に、「特異的な誘発されるＡＨＲ」は、特異的なアレルギー薬剤に感作された対象の免疫系に依存しているＡＨＲをさす。
【００１７】
「気道抵抗」（ＡＲ）は、ある速度で肺を空気が通過することに対する気道の抵抗の尺度をさす。ＡＲは、気管支誘発試験がまだ示されていない場合、ＡＨＲの基礎レベルと同じ値を有する。ＡＲは、気管支誘発試験において測定することもできる。
【００１８】
「ＦＥＶ１」は、肺活量計を用いて測定する、呼吸の最初の１秒間における努力呼気肺活量をさす。「ＦＶＣ」は、同様に肺活量計を用いて測定する努力肺活量をさす。ＦＥＶ１は、ヒトにおける肺の機能性及び気道狭窄の尺度である。試験動物において使用するＰｅｎＨ試験と対照的に、ヒト対象において実施される気管支誘発試験では通常、ＦＥＶ１が測定される。
【００１９】
「気道狭窄に対する有意で有益な作用」を有する菌株は、本明細書に記載のＰｅｎＨ試験において、適切な対照に比べて有意に低下したＰｅｎＨ値を有する菌株をさす。ＰｅｎＨを評価する代わりに、ヒトでの試験におけるＦＥＶ１など、同等の代替値を求めることができることを理解されたい。
【００２０】
「有意な抗炎症作用」という用語は、気管支肺胞洗浄で求める、炎症細胞の数の少なくとも１０％の増加と定義される。
【００２１】
「含む（comprising）」という用語は、述べられる部分、段階、又は成分の存在を明記するものとして解釈されるべきであるが、１種又は複数の追加の部分、段階、又は成分の存在を排除するものではない。したがって、乳酸菌を含む組成物は、追加の細菌の菌株などを含むことができる。
【００２２】
ＰｅｎＨ試験を使用してオバルブミン感作マウスに対する乳酸菌の数種の菌株（経口投与される）の作用を測定すると、驚いたことに、肺組織中への炎症細胞（例えば、好中球、好酸球、リンパ球、及びマクロファージ）の流入によって求めて、乳酸産生菌の一部の菌株が、付随する炎症に対する作用なしでＰｅｎＨに対して、特に気道過敏性に対して有意で有益な作用を及ぼすことができることが分かった。
【００２３】
驚いたことに、細菌株を気道狭窄に対するその作用（ＰｅｎＨによって判定する）、及びその抗炎症／免疫調節作用に基づいて区別し、群に分けることができる。したがって、炎症又は気道狭窄のどちらに対する活性も有していない細菌の菌株の一群を除いて、その示差的な作用様式に基づいて、乳酸産生菌を３つの群に分類することができる。群１の菌株（例えば、菌株ＴＤ１、すなわちMorinaga社製のビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）菌株ＭＶ−１６）は、有意な抗炎症作用、及び気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす。群１に属する他の菌は、ラクトバチルスＧＧ及びビフィドバクテリウムＢｂ−１２であり、こうした菌は、我々の実験でＰｅｎＨに対して２５％超減少させる影響を及ぼすことが分かっている。こうした菌株は、有意な抗炎症作用を及ぼすことが知られている（参照により本明細書に組み込む国際公開第０１／９７８２２）。群２の菌株（例えば、菌株ＴＤ２は、ＢＣＣＭ（商標）（Gent大、ベルギー）にアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ−２２１１０として寄託されている）は、有意な抗炎症作用を及ぼさないが、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす。群３の菌株（例えば、菌株ＴＤ５、すなわちRhodia Food社製のビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）Ｂｉ０７）は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼさないが、有意な抗炎症作用を及ぼす。このことにより、気道狭窄に対する有益な作用と抗炎症作用とは関連がないこと、及びこの細菌が炎症に対しても作用を及ぼすかどうかに関係なく、乳酸産生菌が気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼすことができることが明確に実証された。
【００２４】
肺組織の炎症を測定する、すなわち気管支中への抗炎症性細胞、特に、好中球、好酸球、リンパ球、及びマクロファージの流入を測定する一般的な方法によって判定できる限りにおいて、群２の菌株は免疫系を介してその作用を及ぼさないことが結論付けられている。しかし、こうした方法を使用して測定されない、又は測定できないが、群２の菌株が免疫系に何らかの他の新たな、若しくは異なる方式で作用していることも除外されない。いずれの場合においても、こうした菌株は、抗炎症作用がないことにより、アレルギー対象における抗炎症反応を介してその作用を及ぼす既知の菌株（ビフィドバクテリウムＢｂ−１２、ラクトバチルスＧＧなど）と明確に区別される。本発明の範囲を限定することなく、肺上皮細胞、又は肺の平滑筋細胞に対する直接の作用を予想することができるが、肺に対するこの作用の正確な機序は依然として明らかにされていない。
【００２５】
本発明の一実施形態では、肺機能障害（上記で定義した通り）の治療用又は予防用の組成物を調製するための乳酸産生菌株の使用が提供される。この組成物の調製用に適当に使用される乳酸産生菌は、群１及び／又は群２の細菌、すなわちＰｅｎＨ試験又はＦＥＶ１試験において測定することできる、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす細菌である。好ましくは、ＰｅｎＨ試験を使用する（Hamelmann et al. 1997に記載されている通り）。
【００２６】
上記のように、群１の菌株は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼし（定義した通り）、また試験対象に対して少なくとも１種の有意な抗炎症作用を及ぼす菌株である。群１の菌株は、例えば、サイトカインレベルを調節することにより免疫調節作用を及ぼすこともできる。群１の菌株は、例えば、Morinaga社製のビフィドバクテリウム・ブレーベ菌株ＭＶ−１６（本明細書では菌株ＴＤ１とも呼ぶ）である。
【００２７】
群２の菌株は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす（定義した通り）が、少なくとも付随する抗炎症作用を欠いている新規の菌株である。群２の菌株の一例はＬＭＧ Ｐ−２２１１０（本明細書ではＴＤ２とも呼ぶ）である。群２の菌株は免疫調節活性を有していないことが好ましい。本明細書の別の場所に開示する方法を使用して、群２の追加の菌株を容易に同定することができる。
【００２８】
群３の菌株は、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼさない（定義した通り）が、少なくとも１種の抗炎症作用を及ぼす菌株である。Rhodia Food社製のビフィドバクテリウム・インファンティスＢｉ０７（本明細書ではＴＤ５とも呼ぶ）は、この群の一例である。
【００２９】
対照菌株と比較した、ある試験菌株の気道狭窄に対する有意な（有益な）作用を測定することにより、気道狭窄に対するある細菌株の有意で有益な作用が判定される。これは、試験動物又はヒト対象のいずれかを使用して行うことができるが、以下で論じる通り、それぞれの試験及び測定するパラメータは異なる（それぞれＰｅｎＨ試験及びＦＥＶ１試験）。したがって、有意なＰｅｎＨ値又はＦＥＶ１値により、気道狭窄に対して、特にＡＨＲ及び／又はＡＲに対して有意で有益な作用があるがどうかが判定される。どのレベルをこの点において「有意」と見なすかは、以下で論じる通り、試験及び使用するパラメータに依存する。重要な要素は、使用する試験に適した統計分析を実施する場合に、試験結果が統計的に有意であることである。少なくとも９５％の信頼限界を使用することが好ましい。当分野の技術者であれば、こうした試験、又は当技術分野で既知の同等の試験のいずれかを使用して、気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす菌株を同定することができるはずである。このような菌株は、本発明の組成物及び方法での使用に適している。
【００３０】
ヒト対象−ＦＥＶ１
気管支収縮剤による刺激の前後におけるスパイロメトリーによるＦＥＶ１の判定が、ヒト対象におけるＡＨＲ反応及び／又はＡＲを定量するのに最も一般的に使用されている方法である。陽性試験は、特定の用量又はレベルの刺激物によるＦＥＶ１（１秒間の努力呼気肺活量）の定義される減少によって特徴付けられる。気管支誘発試験は通常、特定のプロトコールに従って、すなわち累積量を測定したＰＤ２０（Yan et al. 1983）（ＰＤ２０は、ＦＥＶ１が２０％低下する誘発量をさす）、又はより時間がかかるＰＣ測定方法（Cockcroft 1985）（ＰＣは誘発濃度をさす）のいずれかによって実施される。ＰＣ２０＜０．２５ｍｇ／ｍｌ（ＰＤ２０＜０．１μｍｏｌ）は重度の反応であり、ＰＣ２０ ０．２５〜２．０ｍｇ／ｍｌ（ＰＤ２０ ０．１〜０．８μｍｏｌ）は中等度の反応であり、ＰＣ２０ ２．０〜８．０ｍｇ／ｍｌ（ＰＤ２０、０．８〜８．０μｍｏｌ）は軽度の反応である。使用する、気管支収縮を起こす刺激は、薬物（ヒスタミン、メタコリン）、物理的刺激（非等張性のエアゾール剤、冷気／乾燥した空気、運動）、及び特異的感作物質（アレルゲン）である。ヒトにおいて、このような気管支誘発試験を使用して、ＡＨＲを診断するか、又はＡＨＲの診断を確認して、ＡＨＲの重症度を記録し、それにより治療的介入若しくは症状悪化の後のＡＨＲの変化を追跡調査し、慢性咳患者における喘息を除去し、誰が職場において、若しくはレクリエーション活動中に危険であるかを判定し、且つ／又は環境被曝若しくは職業被曝の前に対照若しくは基準を確立する。
【００３１】
ヒト試験対象における気管支誘発試験の後に測定されたＦＥＶ１の、対照の対象と比べて少なくとも１０％の低下は、肺機能の低下と見なされる（Cockroft 1985、Yan et al. 1983）。特定の菌株を補充した際に、且つ／又はその後にＦＥＶ１の基礎レベルが有意に（＜１０％）増加した場合、或いは気管支誘発試験の後、ＦＥＶ１の低下が有意な（＜１０％）減少であった場合、菌株は有益な作用を及ぼすと見なされる。
【００３２】
試験動物−ＰｅｎＨ試験
ある動物においてＦＥＶ１を測定することができないので、気道狭窄を測定する他の手段（すなわちＰｅｎＨ、及びそれによるＡＨＲ及びＡＲ）を設けた。参照により本明細書に組み込むHamelman et al. (1997)による記載の通り、プレチスモグラフを使用して、試験動物においてｉｎ ｖｉｖｏでＰｅｎＨを測定することが好ましい。要するに、試験動物（通常マウス）をプレチスモグラフの動物用チャンバー内に入れる。この動物が静かに呼吸する際、それにより１回換気量と呼吸中の胸部の動きとの差を表す、そのチャンバー内の圧力変動が作製される。差圧変換器により、動物用チャンバーと参照用チャンバーとの圧力の変化を測定する。最大呼気流量（ＰＥＦ）、１回換気量（ＴＶ）、呼気時間（Ｔｅ）、及び呼吸回数（ｆ）のような既知の肺機能パラメータの他に、ＰｅｎＨ（enhanced pause）も測定する。基礎ＰｅｎＨは、肺機能のどんな低下も来たしていない正常な動物でおよそ０．３０である。動物の基礎ＰｅｎＨもＡＲに関するパラメータと見なされる。気管支収縮（メタコリンによって誘発される）の際、ＰＥＦ及びＰＩＦ（最大吸気流量）は増加するが、Ｔｒ（緩和時間）及びＴｅは減少する。この結果、ＰｅｎＨの増加がもたらされる。意識下非拘束マウスにおける気道反応性のデータは、ＰｅｎＨとして表される。ＰｅｎＨの増加は、ＦＥＶ１の低下と相関関係がある。したがって、動物においてＰｅｎＨの増加を阻害する化合物によりＦＥＶ１が低下せず、それによりヒトにおいて気道狭窄が軽減し、肺機能が改善されることが想定され得る。
【００３３】
大まかに言えば、気管支誘発試験の後、対照対象と、試験菌株を投与した対象との間の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％以上等のＰｅｎＨ値の差が、試験菌株の有意な作用を表している。
【００３４】
上記の動物試験による方法（ＰｅｎＨ）又はヒト試験による方法（ＦＥＶ１）を使用して、どの菌株を本発明の組成物の製造に適当に使用するかを判定することができる。このようにして製造された組成物は、ヒト及び／又は動物対象における肺機能障害の治療及び／又は予防に対して有益な作用を及ぼすはずである。上記の通り、気管支誘発試験によりヒト対象に対する菌株及び／又はこうした菌株を含む組成物の作用を測定することもできる。
【００３５】
気道狭窄に対して有意で有益な作用を及ぼす菌株が群１又は群２に入るかどうかを判定するために、菌株の抗炎症作用（及び場合によっては免疫調節作用も）を、例えば実施例に記載の既知の方法を使用して判定する。使用する試験に適した既知の統計分析法を使用して、この作用が有意であるかどうかを判定する。大まかに言えば、対照と、試験菌株を投与した対象との間の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％のＰｅｎＨの差が、試験菌株の有意な作用を表している。
【００３６】
組成物
本発明の１種又は複数の菌株を使用して製造される組成物は、対象、特にＣＯＰＤ又は喘息などの肺機能障害、或いは気道過敏性及び／又は気道制限が起こる他の呼吸器疾患を患うヒト対象の摂取に適した任意の種類の組成物とすることができる。この組成物は、食品、補助食品組成物、栄養（食品）組成物、又は薬剤組成物であってもよい。この組成物、及び組成物の構成は、組成物の種類、及び好ましいその投与方法によって変わり得る。食品又は食品／栄養組成物は、本発明の１種（複数）の細菌株の他に、適当な食品ベースも含む。本明細書では、食品又は食品組成物には、ヒト又は動物の消費のために、固体（例えば粉末）、半固体、及び／又は液体（例えば飲み物又は飲料）が含まれることを理解されたい。食品又は食品／栄養組成物は、それだけには限らないが、ヨーグルト、ヨーグルトベースの飲料、又はバターミルクを含めた発酵乳製品などの乳製品であってもよい。このような食品又は食品組成物を、それ自体知られている方法で、例えば、本発明の１種（複数）の菌株を適当な食品又は食品ベースに適当な量添加することによって調製することができる（国際公開第０１／８２７１１号を参照のこと）。さらなる一実施形態では、この１種（複数）の菌株を、食品又は食品／栄養組成物を例えば発酵によって調製する際に、又は調製用に使用する。このような菌株の例には、本発明のプロバイオティック乳酸産生菌が含まれる。そうする際に、本発明の１種（複数）の菌株を、このような発酵食品又は食品／栄養組成物の調製用にそれ自体既知の方法で、例えば、乳酸産生菌を使用して発酵乳製品の調製用にそれ自体既知の方法で使用することができる。このような方法では、本発明の１種（複数）の菌株を、通常使用される微生物に添加して使用することができ、且つ／又は通常使用される１種又は複数又は一部の微生物と取り替えることができる。例えば、ヨーグルト又はヨーグルトベースの飲料など発酵乳製品の調製に、本発明の食品用の生きた乳酸産生菌を、スターターカルチャーに添加するか、又はその一部として使用することができ、或いはこのような発酵の際に適当に添加することもできる。
【００３７】
補助食品組成物
群１及び／又は群２の有効量の１種又は複数の菌株の他に、補助食品は、１種又は複数の担体、安定剤、プロバイオティクスなどを含むことができる。好ましくは、この組成物は、経腸（好ましくは経口）投与用に粉末の形であるが、経鼻投与又は吸入も適当であり得る。１種（複数）の菌株の生きた細胞を使用する場合、この細胞を、胃から保護するためにカプセル化した形で存在させてもよい。例えば、この組成物は、水、果汁、ミルク、又は他の飲料に溶解させることができる小袋に入った粉末の形でよい。この組成物は、群２の少なくとも１種の菌株、例えばＬＭＧ Ｐ−２２１１０などを含むことが好ましい。菌株あたりの生きた細胞の用量は、好ましくは菌株あたり少なくとも１×１０６ｃｆｕであり、好ましくは１日あたり約１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の間であり、より好ましくは約１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／日の間であり、より好ましくは約１×１０８〜５×１０１０ｃｆｕ／日であり、最も好ましくは１×１０９〜２×１０１０ｃｆｕ／日の間である。この有効量をいくつかのより少ない用量に細分し、例えば１日あたり２つ、３つ、又はそれ以上の部分に分けて投与してもよい。生きた細胞を使用する代わりに、以下でさらに詳細に記載する通り、死んだ、若しくは生存不可能な細胞を一部の組成物中で使用してもよい。
【００３８】
食品／栄養組成物
適当な用量の群１及び／又は群２の１種又は複数の菌株の他に、栄養組成物は、ヒト及び／又は動物の消費に適した炭水化物及び／又はタンパク質及び／又は脂質を含むことが好ましい。この組成物は、他の（プロバイオティック）菌株などの他の生物活性成分、及びプロバイオティック菌株を支持するプロバイオティクスを含んでも含まなくてもよい。１種（複数）の菌株の生きた細胞を使用する場合、この細胞を、胃から保護するためにカプセル化した形で存在させてもよい。菌株あたりの生きた細胞の用量は、好ましくは少なくとも１×１０６ｃｆｕであり、好ましくは１日あたり約１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の間であり、より好ましくは約１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／日の間であり、より好ましくは約１×１０８〜５×１０１０ｃｆｕ／日であり、最も好ましくは１×１０９〜２×１０１０ｃｆｕ／日の間である。この組成物は、群２の少なくとも１種の菌株、例えばＬＭＧ Ｐ−２２１１０などを含むことが好ましい。この栄養物は、液体又は粉末の形であることが好ましい。一実施形態では、この栄養物は、市販の「Respifor（登録商標）」様液体製品（Nutricia社製、オランダ）、すなわちミルクベースで、エネルギー密度が高く、タンパク質及び炭水化物が多く、抗酸化剤が濃縮されており、矯味剤を含むものである。この栄養物は、対象の通常の食品／飲料摂取の代わりとせず、それに追加して消費されることが好ましい。この栄養物は、経口的に、又は経管栄養摂取によるなど、経腸投与することが好ましい。
【００３９】
薬剤組成物
適当な用量の群１及び／又は群２の１種又は複数の菌株を使用して、肺機能障害の治療、治療法、又は予防のための薬剤組成物を製造することもできる。薬剤組成物は通常、経腸（例えば経口）、経鼻／吸入、経膣、又は直腸投与用に使用されるはずである。薬剤組成物は通常、本発明の１種（複数）の菌株に加えて薬剤担体を含むはずである。この好ましい形は、所期の投与形態及び（治療への）適用に依存する。この薬剤担体は、１種（複数）の菌株を対象の所望の体腔、例えば腸に送達するのに適した、適合性の、毒性のない、任意の物質とすることができる。例えば、滅菌水、又は不活性の固体を、製薬上許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤などを通常補充される担体として使用することができる。薬剤組成物は、追加の生物活性成分又は薬剤活性成分をさらに含むことができる。
【００４０】
さらなる一実施形態では、例えば国際公開第０１／９５７４１号に記載の通り、１種（複数）の菌株の死んだ、又は生存不可能な細菌細胞を、生きた（又は生存可能な）細菌の代わりに、又はそれに加えて上記の組成物に使用する。例えば、死んだ、又は生存不可能な細胞の使用量は、生きた細菌の使用量と同等とすることができる。当分野の技術者であれば、適当な量を容易に求めることができる。このような組成物では、「コロニー形成単位」が実行可能でない測定値である場合、細胞の量を計数する（例えばフローサイトメーターを使用して）か、或いは当分野の技術者に知られている別の方法で測定する。
【００４１】
生きた細胞を含む組成物に言及する場合、この細胞は、投与後に、又は液体で元に戻した後に再び活性となる例えば凍結乾燥細胞など、生存可能な細胞を包含することを理解されたい。
【００４２】
食品、補助食品、栄養組成物、又は薬剤組成物は、液体の形、例えば１種（複数）の菌株の安定した懸濁液か、固体の形、例えば粉末か、或いは半固体の形のいずれかである。例えば、経口投与用に、１種（複数）の菌株を、カプセル剤、錠剤、散剤などの固体剤形か、或いはエリキシル剤、シロップ剤、懸濁剤などの液体剤形で投与することもできる。１種（複数）の菌株をゼラチンカプセル中で、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース若しくはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの不活性成分及び粉末担体と一緒にゼラチンカプセル化することができる。上述の通り、この組成物は、タンパク質、炭水化物、ビタミン、無機質、微量元素、アミノ酸、他の生物活性成分若しくは薬剤活性成分、担体、安定剤、矯味剤、他のプロバイオティック菌株、プロバイオティクスなどの追加の成分を含むことができる。
【００４３】
群２の菌株は特に、ＣＯＰＤ、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、吸引（aspiration）、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、非特異的な吸入刺激物によって引き起こされる肺機能障害、肺水腫、気管狭窄、又は声帯機能障害などの肺機能障害の治療用又は予防用の組成物を調製するのに適している。もちろん、群２の菌株を、抗炎症活性を有することが分かっている菌株（群１及び／又は群３の菌株など）と組み合わせることができる。このような組合せは、炎症、例えばアレルギー性喘息を伴う肺疾患又は呼吸器疾患／障害の治療或いは予防に適している。
【００４４】
本発明の１種又は複数の菌株を含む組成物は、肺機能障害をすでに患っている患者を治療するのに適しており、或いはこれを、そのような肺機能障害を発症する高い危険性のある対象、例えば煙／喫煙、冷気などに曝露した対象に予防のために投与することもできる。
【００４５】
使用する細菌株は、乳酸産生菌であることが好ましく、また乳酸桿菌属又はビフィドバクテリウム属のものであることが好ましい。この細菌は、食用であるべきであり、すなわちヒト又は動物対象によって摂取される場合に有害でないものと見なすべきである。食用でない細菌、例えば対象によって摂取される場合、もはや有害でないように改変された病原細菌は、本発明の範囲内に包含されることを理解されたい。乳酸桿菌株は、以下の種、すなわちラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチルス・デルブリッキ（L. delbrueckii）、ラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）、ラクトバチルス・ブレビス（L. brevis）、ラクトバチルス・クリスパタス（L. crispatus）、ラクトバチルス・サケイ（L. sakei）、ラクトバチルス・イエンセン（L. jensenii）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（L. sanfransiscensis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（L. fructivorans）、ラクトバチルス・ケフィリ（L. kefiri）、ラクトバチルス・クルバタス（L. curvatus）、ラクトバチルス・パラプランタルム（L. paraplantarum）、ラクトバチルス・ケフィアグラナム（L. kefirgranum）、ラクトバチルス・パラケフィア（L. parakefir）、ラクトバチルス・ファーメンタム（L. fermentum）、ラクトバチルス・プランタルム（L. plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチルス・ジョンソニ（L. johnsonii）、ラクトバチルス・ガセリ（L. gasseri）、ラクトバチルス・キシロサス（L. xylosus）、ラクトバチルス・サリバリウスなどのものでよい。好ましい種は、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・サリバリウスであり、より好ましい種はラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・カゼイ、又はラクトバチルス・ラムノサスである。種ラクトバチルス・カゼイに属するラクトバチルス属菌株を使用することが最も好ましい。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ラクトバチルス・ラムノサス菌株、特に菌株ラクトバチルスＧＧは、安全性の問題を引き起こす恐れがあるので、また例えば菌株ラクトバチルスＧＧは、特定の用途に望ましくないであろう特徴を有するので（実施例参照）、それらの菌株は除外される。
【００４７】
ビフィドバクテリウム属菌株は、以下の種、すなわちビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・カテニュレイタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・アンギュレイタム（B. angulatum）などのものであってよい。好ましい種は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及び／又はビフィドバクテリウム・アニマリス、特にビフィドバクテリウム・アニマリスサブスピーシーズラクティス（B. animalis subspecies lactis）である。
【００４８】
微生物の種の同定は、生化学的に、又は塩基配列決定法（例えば保存領域）により、又はパルスフィールドゲル電気泳動法などの既知の方法によって判定することができる。一般に、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域において少なくとも９７％の核酸配列同一性を示す場合（例えば、場合によっては、デフォルトパラメータを使用して、例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって整列する場合）、細菌の菌株は同一の種に属している。
【００４９】
ラクトバチルス・カゼイ菌株ＴＤ２は、ブダペスト条約に従ってＢＣＣＭ（商標）（Belgian Co-ordination Collections of Microorganisms、Gent、ベルギー）にアクセッション番号ＬＭＧ Ｐ−２２１１０として寄託されている。ＬＭＧ Ｐ−２２１１０は特に、上記の通り組成物を調製するのに適しているが、本発明はこの菌株に限定されない。
【００５０】
本発明の寄託されている菌株又は他の任意の菌株の複製物及び／又は派生物が本発明によって包含されることを理解されたい。「複製物」という用語は、微生物の増殖、例えば培地中での細菌の増殖によって産生された材料など、実質的に改変されていない材料の複製を表す生物材料をさす。「派生物」という用語は、生物材料から作製され、例えば遺伝物質の遺伝的変化によって生じた、新たな特性を有するように実質的に改変された材料をさす。こうした変化は、自発的に生じ得るか、或いは化学的及び／又は物理的作用物質（例えば突然変異誘発因子）の適用の結果であり、且つ／又は当技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術によるものとすることができる。別の菌株に「由来する」菌株に言及する場合、得られた菌株が、元の菌株の、気道狭窄に対する有益な作用を依然として保持している限り、その菌株の「複製物」、並びにその菌株の「派生物」はどちらも包含され、したがってこれらを使用して肺機能障害を治療及び／又は予防することができることを理解されたい。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、少なくとも２種以上の菌株を１種の組成物中で組み合わせるか、或いは対象に同時投与する。抗炎症作用を及ぼす少なくとも１種の菌株（例えば、ＴＤ５など当技術分野で既知の菌株、又はＴＤ１など群１の菌株）と、気道狭窄に対して有益な作用を及ぼすが、抗炎症作用を及ぼさない他の少なくとも１種の菌株（例えば群２の菌株、例えばＴＤ２）とを組み合わせることが好ましい。異なる作用様式を発揮する菌株の組合せは、肺機能に対して強化作用を及ぼすことができるので、菌株のこの組合せは、場合によっては、抗炎症活性を有する１種（複数）の菌株のみの投与よりも優れている。この菌株を、様々な組成物中に存在させてもよく、対象への様々な組成物の投与の後にｉｎ ｖｉｖｏで組み合わせるだけでもよい。或いは、この菌株を単一の組成物中に存在させてもよい。どちらの場合でも、２種以上の菌株の投与は「同時投与」と呼ばれる。
【００５２】
さらなる一実施形態では、本明細書で上述した通り本発明の少なくとも１種の菌株を含む組成物が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる別の実施形態では、菌株ＬＭＧ Ｐ−２２１１０（ＴＤ２）、又は前記菌株に由来する任意の菌株が提供される。
【００５４】
上記の本発明の組成物を含む容器も提供される。このような容器は、１〜１００回、また個々の値がそれぞれ、１回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回、又はそれを超える回数など、１〜１００回分の用量が入る、錠剤、カプセル剤、散剤、アンプル剤、小袋などの形のパッケージでよい。同様に、パッケージは、１〜２００回、１〜５００回、又はそれを超える回数分の用量が入るものでもよい。異なる菌株を同時投与すべき場合、容器は、菌株を含む各々の組成物を別々の用量含むことができることを理解されたい。この容器は、組成物の有益な作用、又は健康への影響を記載したラベルを外側に含むことが好ましい。例えば、この容器に、組成物が「ＣＯＰＤ患者用」又は「健康改善」のものであると記載してもよい。この容器は、カートン製、プラスチック製、金属製などのものとすることができる。この容器はまた、組成物が液体又は粉末の形である場合、例えば吸入器など、組成物の投与に適した道具を含むことができる。この容器はさらに、使用説明書を含むこともできる。
【００５５】
本発明の目的はまた、肺機能の治療用又は予防用の組成物を調製する方法を提供することであり、この方法は、
ＰｅｎＨ試験を使用することにより、或いはヒト対象におけるＦＥＶ１値を求めることにより、気道狭窄に対する細菌株の、好ましくは乳酸産生菌の作用を試験するステップと、
ＰｅｎＨ及び／又はＦＥＶ１に対する影響に基づいて、気道狭窄に対する、特にＡＨＲに対する有意で有益な作用を有する菌株を選択するステップと、
選択された菌株を適当な液体又は固体培地中で増殖させるステップと、
場合によっては、例えば遠心分離及び／又はろ過によりこの菌株を培地から単離し、当技術分野で既知の後処理プロセス、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、及び／又は凍結を実施するステップと、
この菌株を対象への投与に適した形に製剤化するステップとを含む。
【００５６】
場合によっては、単離した菌株が、対象に対して有意な抗炎症作用を与えることができるかどうかも試験する。
【００５７】
上記の方法で使用する菌株をその自然環境から単離し、且つこの菌株が汚染物質を含んでいないことが好ましいことに留意されたい。単離された菌株を人工培地上で、又は（低脂肪）ミルク、ヨーグルトなどの天然培地上で増殖させることができる。次いで、これを直接使用して、本発明の組成物を製造することができ、或いは遠心分離及び／又はろ過によりこの細菌を濃縮し、又は培地から単離し、次いで適当な組成物に製剤化することもできる。微生物（例えば、酵母、細菌の様々な種）の定義されていない混合物を含む、例えばケフィアなどの既存の食品組成物は、このような製品がその細菌の構成（種）並びに細菌濃度（用量）に関して定義されていないので、本発明の組成物から除外される。しかし、本発明の１種又は複数の菌株を添加したこの組成物を食品ベースとして使用することができる。これにより導き出された組成物（少なくとも本発明の菌株のうちの少なくとも１種を含む）及びその使用のみは、本発明の実施形態と見なされる。
【００５８】
肺機能障害、特に、ＣＯＰＤ、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、吸引、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、非特異的な吸入刺激物に起因する肺機能障害、肺水腫、気管狭窄、及び／又は声帯機能障害の治療用又は予防用の医薬品を調製するための、本発明の群１及び／又は群２の菌株の使用は、本発明のさらなる一実施形態である。特に好ましい一実施形態では、この医薬品は、ＣＯＰＤ、吸引、非特異的な吸入刺激物に起因する肺機能障害、肺水腫、及び／又は気管狭窄からなるグループから選択される肺機能障害の治療用及び／又は予防用に使用される。
【００５９】
別の実施形態では、対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療用又は予防用の医薬品を調製するためのプロバイオティック乳酸菌の使用が提供される。
【００６０】
以下の非限定的な実施例は、本発明の菌株の同定及び使用を記載したものである。別段の記述がない限り、本発明の実施には、分子生物学、ウイルス学、微生物学、又は生化学の標準的な常法が使用される。
［実施例］
【実施例１】
【００６１】
菌株ＴＤ２の説明及び特徴及びプロバイオティック特性
菌株の単離
菌株ＴＤ２を健常人志願者の糞便から単離した。プロバイオティック菌株を求めて健常成人志願者の糞便を捜した。「健常」は、疾患や疾病にかかっておらず、消化管疾患を患っておらず、少なくとも６週間抗体を使用しておらず、少なくとも１週間プロバイオティック製品を摂取しておらず、乳タンパク質に不耐性でなく、且つ規則正しい排便習慣を有する成人を意味する。食習慣に関する日記を記録した。
【００６２】
嫌気チャンバー内で新鮮なヒト糞便を分析した。この糞便を９０ｍｌの保存培地（２０ｇ／ｌ緩衝ペプトン水、１．０ｍｌ／ｌ Tween 80、０．５ｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣｌ、リサズリン１錠／リットル、ｐＨ６．３（２Ｍ ＨＣｌで調整））で１０倍に希釈し、次いでUltra-Turraxを使用してホモジナイズした。希釈したペプトン（１．０ｇ／ｌ）生理食塩水中で段階希釈物を作製し、１０２〜１０７倍希釈物をLAMVAB上に蒔いた（Hartemink et al. 1997）。この最終培地は、５２ｇ／ｌ ＭＲＳ（De Man Rogosa and Sharpe、Oxoid社製）、０．２５ｇ／ｌ Ｌ−システイン−ＨＣｌ、０．０２５ｇ／ｌブロモクレゾールグリーン、２０ｇ／ｌ寒天、及び２０ｍｇ／ｌバンコマイシンからなるものであった。ＭＲＳ（１０４ｇ／ｌ）、Ｌ−システイン−ＨＣｌ（０．５ｇ／ｌ）、及びブロモクレゾールグリーン（０．０５ｇ／ｌ）を、寒天（４０ｇ／ｌ）と別にして１２１℃で１５分間オートクレーブで処理し、５０℃まで冷却した。０．２μｍフィルターを使用して、バンコマイシンの原液（２ｍｇ／ｍｌ）をろ過滅菌した。オートクレーブ処理した寒天と、ＭＲＳ、システイン、及びブロモクレゾールグリーンとを１：１の比で混合した。続いて、バンコマイシンを終濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるまで添加し、その後プレートに注いだ。このプレートを嫌気ジャー内で３７℃で３日間インキュベートした。コロニーをＭＲＳ寒天上に画線して純化し、３７℃でインキュベートした。
【００６３】
菌株の分類
１６ｓ ＲＮＡの塩基配列決定により、菌株の同定の信頼性が高くなる。Boom et al., (1990)に記載の方法に従って、菌株のＤＮＡの抽出を行った。表１に記載した８ｆ及び１５１０ｒプライマーを用いて、１６ｓ ＲＮＡ領域の増幅及び塩基配列決定を達成した。増幅プログラムは、９４℃で５分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で９０秒間を３０サイクル；最後に７２℃で４分間である。
【表１】
【００６４】
Sanger et al., (1977)によって開発されたＤＮＡ塩基配列決定法であるジデオキシ法により塩基配列決定を実施した。ＣＳＲ（サイクルシークエンス反応）においてABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（Applied Biosystems社製、Nieuwekerk aan de IJssel、オランダ）を表２に記載した全てのプライマーと組み合わせて使用した。ＣＳＲ用のプログラムは、９６℃で３０秒間の後、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、及び６０℃で４分間を２５サイクルであった。続いて、このＣＳＲ混合物を、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製、Nieuwekerk aan de IJssel、オランダ）の助けを借りて分析した。塩基配列のデータをChromas V1.51（Technelysium Pty社製、Tewantin、オーストラリア）で分析し、DNASIS for Windows V2.5（Hitachi Software Engineering社製、Wembley、英国）の助けを借りて整列させた。完全２本鎖の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列決定された領域をＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al. 1990）に入力し、菌株を判定するために、GenBank、EMBL、DDBJ、及びPDBデータベースにおいて（菌株の）他の（１６Ｓ ｒＤＮＡ）塩基配列と比較した。種ラクトバチルス・カゼイのものである菌株を同定した。
【００６５】
菌株の生存
ヒトの糞便から単離された菌株ラクトバチルス・カゼイＴＤ２、並びに既知のプロバイオティック菌株の胃及び小腸における生存を評価した。この菌株をヒトにおけるプロバイオティックとして使用する場合、胃及び小腸における生存は重要である。
【００６６】
この細菌をＭＲＳ中で２４時間増殖させ、続いてＭＲＳ中に再接種し２４時間増殖させた。１ｍｌの増殖培地を、８．３ｇ／ｌ細菌用ペプトン、３．１ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．１１ｇ／ｌ ＣａＣｌ２、１．１ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．６ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌ Ｄ−グルコース、２２．２ｍｇ／ｌペプシン、及び２２．２ｍｇ／ｌリパーゼ、ｐＨ３．０からなる９ｍｌの胃様培地に添加した。この細菌を胃様培地の培地中で２７℃で３時間インキュベートした。その後、細菌を含むインキュベートした胃様培地１ｍｌを小腸様培地９ｍｌと混合し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。この小腸様培地は、５．７ｇ／ｌ細菌用ペプトン、１．２５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．０５５ｇ／ｌ ＣａＣｌ２、０．１５ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．６８ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、０．３ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．７ｇ／ｌグルコース、２０．３ｇ／ｌパンクレアチン、及び５．５ｇ／ｌ胆汁、ｐＨ６．５からなる。試料をｔ＝０時間、３時間、及び６時間で採取し、ＭＲＳ寒天上に蒔いてコロニー形成単位を求めた。
【００６７】
下記の表２に示すように、ヒト糞便から単離したラクトバチルス・カゼイ、ＬＭＧ Ｐ−２２１１０は、胃様及び小腸様培地中において他のプロバイオティック菌株と類似の、又はそれよりさらに良好な生存率を示した。
【表２】
【００６８】
菌株の接着
プロバイオティクスの特性の１つは、プロバイオティクスが腸細胞と接着し、上皮細胞の結合部位を求めて病原体と競合し得ることである。上皮細胞への接着は、コロニー形成能、及び宿主に対するプロバイオティック作用とも関連がある。
【００６９】
ラクトバチルス・カゼイＬＭＧ Ｐ−２２１１０の接着性を試験した
菌株の一晩培養物を遠心分離（１０分、４０００ｒｐｍ、Sorval RT17）によって回収し、ＰＢＳ中で再懸濁させた。ビュルケルチュルク計算板を使用して、細胞の量を顕微鏡下で計数した。細菌を再度遠心分離し、ペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まないＣａｃｏ−２ １％ＦＣＳ培地中で再懸濁させた。Ｃａｃｏ−２細胞は、コンフルエント後２週間のものであり、これを２４ウェルプレートで増殖させた（１〜２×１０５Ｃａｃｏ−２細胞／ウェル）。ウェルあたり１×１０８ＣＦＵの細菌を添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、この培地からＣａｃｏ−２細胞を回収し、この細胞をＰＢＳで３回洗浄した（３７℃）。細胞を無菌のMili Q水で溶解させ、溶解した細胞の段階希釈物を作製し、ＭＲＳ寒天上に蒔いた。
【００７０】
ラクトバチルス・カゼイＬＭＧ Ｐ−２２１１０（ＴＤ２）は、よく知られている他のプロバイオティック菌株と少なくとも同じぐらい良好に接着するという結果が示された。接着性は陽性対照よりも良好であった。添加した培養物のうち約１３％が接着した。
【００７１】
溶血、又はヒスタミン及びチラミンの産生などの望ましくない特性は観察されなかった。
【実施例２】
【００７２】
オバルブミン感作マウスを乳酸菌株で予防的に処置した動物実験
動物：
特定の病原菌を有していない雄ＢＡＬＢ／ｃマウスをCharles River社（オランダMaastricht）から入手した。食物及び水を適宜与え、６〜９週齢になったマウスを使用した。すべての実験は、オランダのUtrecht大学の動物倫理委員会によって承認された。
【００７３】
試薬：
オバルブミン（グレードＶ）及びアセチル−β−塩化メチルコリン（メタコリン）をSigma Chemical社（米国ミズーリ州St. Louis）から入手した。水酸化アルミニウム（AlumInject）Pierce社から購入した（米国イリノイ州Rockford）。
【００７４】
感作、処置、及びチャレンジ：
マウスを、１００μｌの生理食塩水中の２．２５ｍｇ水酸化アルミニウム上に吸着させた１０μｇオバルブミン、又は生理食塩水のみに、０日目と７日目の２回の腹腔内注射によって感作させた。３５日目、３８日目、及び４１日目に、プレクシグラス製曝露チャンバー内での２０分間のオバルブミンエアゾール剤の吸入によりマウスにチャレンジした。Pari LC Star nebuliser（Pari respiratory Equipment社製、米国バージニア州Richmond）を使用して、生理食塩水中のオバルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を噴霧することによりエアゾール剤を作製した。２８日目に開始して実験の終わり（すなわち４２日目）まで毎日、マウスを菌株あたり１０９（ＣＦＵ）の乳酸菌で胃管を通じて経口的に処置した。
【００７５】
気道反応性の判定：
意識下非拘束マウスにおいて、噴霧により吸入させるメタコリンに対する気道反応性を、全身プレチスモグラフィー（BUXCO, EMKA社製、仏国Paris）を使用して最後のエアゾール剤チャレンジの２４時間後に判定した。気道反応をＰｅｎＨ（enhanced pause）で表した。
【００７６】
気管支肺胞洗浄：
コリン作動性の気道反応の測定後、動物を屠殺し、気管支肺胞洗浄を実施し、細胞の総数を求め、細胞を区別した。最初の洗浄液１ミリリットルの上清を分離し、後続の分析まで−７０℃で凍結した。全細胞（好中球、マクロファージ、好酸球、及びリンパ球）の流入を肺組織の炎症の測度と見なす。
【００７７】
統計分析：
一般的な線形モデル又は反復測定により、メタコリンに対する気道反応曲線を統計的に分析し、続いて群間の事後の比較を行った。マンホイットニーのＵ検定を使用して、細胞計数を統計的に分析した。ｐ＜０．０５の確率値を統計的に有意であると見なした。
【００７８】
結果：
結果を表３に示す。菌株ＴＤ２は、気道過敏性に対して有意な作用を示すが、炎症に対して有意な作用を示さない。一方、菌株ＴＤ５は、気道過敏性に対して有意な作用を示さないが、炎症に対してある作用を示す。菌株ＴＤ１は、気道過敏性と炎症のどちらに対してもある作用を示す。
【００７９】
こうした結果から、肺機能に対する乳酸産生菌の一部の菌株の示差的な作用が示され、また肺炎症に対する有益な作用が必ずしも肺機能に対して有益な作用をもたらすとは限らず、また逆も同様であることが示される。したがって、こうした結果から、肺機能に対して有益な作用を及ぼす乳酸を産生する菌株は、抗炎症作用を及ぼすその菌株とは異なり、肺機能障害を伴う疾患に対して治療効果及び／又は予防効果を及ぼし得ることが示される。こうした結果から、種ラクトバチルス・カゼイに属する菌株が特に効果的であることが示される。
【表３】
【実施例３】
【００８０】
エンドトキシン誘発肺気腫のマウスモデルにおける乳酸菌の作用を示す動物実験
ＬＰＳ処置によりマウスにおいて肺気腫を誘発することができる。
【００８１】
動物：
特定の病原菌を有していない雄ＢＡＬＢ／ｃ ｂｙＪＩｃｏマウスをCharles River社（オランダMaastricht）から入手した。食物及び水を適宜与え、７〜８週齢になったマウスを使用した。すべての実験は、オランダのUtrecht大学の動物倫理委員会によって承認された。
【００８２】
試薬：
ＬＰＳ：大腸菌、血清型Ｏ５５：Ｂ５：Sigma Chemical社製
メタコリン（アセチル−β−メチルコリン）をJanssen Chimica社（ベルギーBeerse）から入手した。
【００８３】
感作、処置、及びチャレンジ：
４週間（０日目、３日目、７日目、１０日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、及び２４日目）週２回、ＬＰＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌ中に５μｇ）、又は対照のＰＢＳ（５０μｌ）の鼻腔内投与により肺気腫を誘発した。１４日目に開始して実験の終わり（すなわち４２日目）まで毎日、マウスを、菌株あたり１０９（ＣＦＵ）の乳酸菌を含む０．２ｍｌの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）で胃管を通じて経口的に処置した。対照として０．２ｍｌの生理食塩水を添加した。
【００８４】
気道反応性及び気管支肺胞洗浄の判定を実施例２に記載の通り実施した。
【００８５】
右室肥大
右室の肥大は肺気腫の徴候である。４２日目に解剖顕微鏡下で、全心臓（１０例の動物のうち４例）を単離し、右室自由壁（ＲＶ）を完全に分離し取り出した。吸取り乾燥の後、左室と中隔（ＬＶ＋Ｓ）及びＲＶの重量を別々に測定した。ＲＶ重量とＬＶ＋Ｓ重量の比を右室肥大の指標として使用した。
【００８６】
統計分析：
メタコリンに対する気道反応曲線のデータ、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞計数、右室（ＲＶ）肥大を、相加平均±平均の標準誤差として表し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ノンパラメトリックな）を使用して群間の比較を行い、続いて群間の事後の比較（ボンフェローニの多重比較検定）を行った。ｐ＜０．０５の確率値を統計的に有意であると見なした。気道反応の測度はＮ＝１０、ＢＡＬ細胞計数はｎ＝６、ＲＶ肥大はｎ＝４である。
【００８７】
結果：
結果を表４に示す。再び、菌株ＴＤ２は、気道過敏性に対して有意な作用を示すが、炎症に対して有意な作用を示さない。
【００８８】
この結果から、乳酸産生菌の菌株ＴＤ２は、気道過敏性、及びＬＰＳによって誘発された肺気腫を患うマウスにおける右室肥大に対して有益な作用を及ぼし、これが抗炎症機序を介して起こらない作用であることが示される。こうした結果から、ＰｅｎＨに対してある影響を及ぼす特定の一部の菌株は、肺気腫及び／又はＣＯＰＤなどの肺機能障害を治療及び／又は予防する際に有益であることが示される。こうした結果から、ラクトバチルス・カゼイ菌株は適当であり、特に菌株ＴＤ２が適当であることが示される。
【表４】
【実施例４】
【００８９】
乳酸菌株を含む組成物
補助食品組成物
１．０．５ｇスキムミルク粉末、及びガラクトオリゴ糖と果糖多糖類との混合物０．５ｇを含み、１ｇあたり５×１０９ｃｆｕのＴＤ２を含むカプセル。用量：１日あたり２×１ｇ。
【００９０】
２．１ｇあたり５×１０９ｃｆｕのＴＤ１、及び５×１０９ｃｆｕのＴＤ２を含む粉末、マルトデキストリン；子袋入り。用量：１日あたり２×１ｇ。消費前に、水、果汁、ミルク、又はヨーグルトなどに溶解すること。
【００９１】
食品／栄養組成物
１．１２５ｍｌあたり５×１０９のＴＤ１の熱不活性化細胞を含む、ＣＯＰＤを患う患者に適応される液体栄養。推奨用量は１日あたり３×１２５ｍｌである。
１００ｍｌあたり
− タンパク質７．５ｇ（乳清カゼイン混合物、１／１）
− 炭水化物２２．５ｇ（グルコース０．３ｇ、ラクトース２．０ｇ、マルトース１．０ｇ、サッカロース３．０ｇ、多糖類１５．８ｇ）
− 脂肪３．３ｇ（飽和脂肪酸０．５ｇ、一不飽和脂肪酸１．９ｇ、ポリ不飽和酸０．９ｇ）
− 無機質（Ｎａ ５５ｍｇ、Ｋ １１０ｍｇ、Ｃｌ ６０ｍｇ、Ｃａ １５５ｍｇ、Ｐ １００ｍｇ、Ｍｇ １５ｍｇ）
− 微量元素（Ｆｅ ３．２ｍｇ、Ｚｎ ２．４ｍｇ、Ｃｕ ３６０μｇ、Ｍｎ ０．６６ｍｇ、Ｆ ０．２０ｍｇ、Ｍｏ ２０μｇ、Ｓｅ ２３μｇ、Ｃｒ １３μｇ、Ｉ ２７μｇ）
− ビタミン（ビタミンＡ １２７μｇＲＥ；プロビタミンカロテノイド７３μｇＲＥ、カロテノイド０．８ｍｇ、ビタミンＤ １．４μｇ、ビタミンＡ ５．０μｇα−ＴＥ、チアミン０．３０ｍｇ、リボフラビン０．３２ｍｇ、ナイアシン３．６ｍｇＮＥ、パントテン酸１．１ｍｇ、ビタミンＢ６ ０．３５ｍｇ、葉酸５３μｇ、ビタミンＢ１２ ０．５０μｇ、ビオチン８．０μｇ、ビタミンＣ ４０ｍｇ）
− コリン７４ｍｇ
【００９２】
２．ミルクベースの粉末；８５ｇ、小袋入り；２４０ｍｌの液体、例えばミルク、ヨーグルト、又は果汁と混合される；
粉末１００ｇにつき以下のものを含有
− ＴＤ２ １×１０１０ｃｆｕ
− タンパク質４．７ｇ
− 炭水化物６８．２ｇ（糖類２５ｇ）
− 脂肪２４．７ｇ
− 無機質（Ｎａ １４０ｍｇ、Ｋ ５７０ｍｇ、Ｃａ １３０ｍｇ、Ｐ ４００ｍｇ、Ｍｇ １４ｍｇ）
【００９３】
参考文献
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Varcoe et al., 2003, J. Food Prot. 66:457-465
Yan et al. 1983, Thorax 38: 760-765
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、誤嚥、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、肺水腫、気管狭窄、及び声帯機能障害からなるグループから選択される肺機能障害の治療用又は予防用の組成物を調製するための、細菌株ＭＶ−１６の使用。
【請求項２】
前記組成物が、抗炎症特性を有する他の少なくとも１種の細菌をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
組成物が、１種又は複数の担体及び／又はタンパク質及び／又は炭水化物及び／又は脂質及び／又は抗酸化剤をさらに含み、液体、粉末、固体、又はカプセルの形である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
組成物が、有効量で投与され、前記有効量が、１日あたり１×１０６から１×１０１２のコロニー形成単位の間の細胞数の細菌株ＭＶ−１６を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
組成物が、栄養組成物又は薬剤組成物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、誤嚥、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、肺水腫、気管狭窄、及び声帯機能障害からなるグループから選択される肺機能障害の治療用又は予防用の薬剤組成物であって、細菌株ＭＶ−１６を含む組成物。
【請求項７】
抗炎症特性を有する他の少なくとも１種の細菌をさらに含む、請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
１種又は複数の担体及び／又はタンパク質及び／又は炭水化物及び／又は脂質及び／又は抗酸化剤をさらに含み、液体、粉末、固体、又はカプセル状である、請求項６又は７に記載の薬剤組成物。
【請求項１】
対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、誤嚥、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、肺水腫、気管狭窄、及び声帯機能障害からなるグループから選択される肺機能障害の治療用又は予防用の組成物を調製するための、細菌株ＭＶ−１６の使用。
【請求項２】
前記組成物が、抗炎症特性を有する他の少なくとも１種の細菌をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
組成物が、１種又は複数の担体及び／又はタンパク質及び／又は炭水化物及び／又は脂質及び／又は抗酸化剤をさらに含み、液体、粉末、固体、又はカプセルの形である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
組成物が、有効量で投与され、前記有効量が、１日あたり１×１０６から１×１０１２のコロニー形成単位の間の細胞数の細菌株ＭＶ−１６を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
組成物が、栄養組成物又は薬剤組成物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、非アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、誤嚥、気管支内腫瘍、気管内腫瘍、肺水腫、気管狭窄、及び声帯機能障害からなるグループから選択される肺機能障害の治療用又は予防用の薬剤組成物であって、細菌株ＭＶ−１６を含む組成物。
【請求項７】
抗炎症特性を有する他の少なくとも１種の細菌をさらに含む、請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
１種又は複数の担体及び／又はタンパク質及び／又は炭水化物及び／又は脂質及び／又は抗酸化剤をさらに含み、液体、粉末、固体、又はカプセル状である、請求項６又は７に記載の薬剤組成物。
【公開番号】特開２０１２−２５７６０（Ｐ２０１２−２５７６０Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９０８３３（Ｐ２０１１−１９０８３３）
【出願日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【分割の表示】特願２００６−５４５２５４（Ｐ２００６−５４５２５４）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０５２９６８２１）エヌ．ブイ．・ヌートリシア (32)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【分割の表示】特願２００６−５４５２５４（Ｐ２００６−５４５２５４）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０５２９６８２１）エヌ．ブイ．・ヌートリシア (32)
【Ｆターム（参考）】
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