二量体化ペプチド
【課題】新たな癌抗原ペプチドおよび当該癌抗原ペプチドの癌ワクチンを提供する。
【解決手段】少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体がジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体に関する。
【解決手段】少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体がジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌ワクチン療法の分野に属し、詳細には細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせるペプチド二量体およびそれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡ抗原と称する）とにより形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃・破壊する。
【０００３】
癌抗原タンパク質は、Immunity, vol.10:281, 1999の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（J. Exp. Med., 179: 1005, 1994）、ＭＡＲＴ−１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994）、およびチロシナーゼ（J. Exp. Med., 178: 489, 1993）などのメラノソーム抗原、ならびにメラノーマ以外の癌抗原タンパク質としてＨＥＲ２／ｎｅｕ（J. Exp. Med., 181: 2109, 1995）、ＣＥＡ（J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995）、およびＰＳＡ（J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997）などの癌マーカーがある。
【０００４】
癌抗原ペプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成される約８から１１個のアミノ酸から成るペプチドである（Cur. Opin, Immunol., 5: 709, 1993；Cur. Opin, Immunol., 5: 719, 1993；Cell, 82: 13, 1995；Immunol. Rev., 146: 167, 1995）。前記のように、この生成された癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）との複合体が細胞表面に提示され、ＣＴＬにより認識される。従って、ＣＴＬによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、ＣＴＬを効率良く誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質から同定することが、非常に重要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、イン・ビボにて有用な癌抗原ペプチドから誘導される新たな癌抗原を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、癌抗原ペプチドとして証明されているペプチドの中にはシステイン残基が含まれているものがあり、意外にもこのようなペプチドを二量体化させて投与すると単量体と同等のＣＴＬの誘導活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１） 少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体；
（２） ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、上記（１）記載のペプチド二量体；
（３） ２つのペプチド単量体が１または２個のジスルフィド結合により結合している、上記（１）または（２）記載のペプチド二量体；
（４） ペプチド単量体が癌抑制遺伝子産物ＷＴ１に由来する、上記（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド二量体；
（５） ペプチド単量体がCys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa（配列番号：７２）（第2位のXaaは、Tyr、Phe、MetおよびTrpからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のXaaは、Phe、Leu、Ile、TrpおよびMetからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）である、上記（１）〜（４）のいずれか記載のペプチド二量体：
（６） ペプチド単量体がCys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：１１）、 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe（配列番号：１８）、Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr（配列番号：１９）、Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu（配列番号：２０）、Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：２１）、Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (配列番号：２２)、Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu（配列番号：２３）およびCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：４４）からなる群より選ばれる、上記（１）〜（４）のいずれか記載のペプチド二量体；
（７） 上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物；
（８） 癌ワクチンとして使用される、上記（７）に記載の医薬組成物；
（９） 上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体における、癌ワクチンを製造するための使用；および
（１０） 癌を治療または予防するための方法であって、上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としているＷＴ１陽性の患者に投与する方法：
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、トランスジェニックマウスにおけるペプチド二量体（配列番号：４４）によるCTL誘導の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のペプチド二量体は、２つのペプチド単量体間における少なくとも１対のシステイン残基のＳＨ基間でのジスルフィド結合によって２つの単量体が相互に結合して二量体化している。
【００１０】
本発明のペプチド二量体はＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明の二量体は、癌の治療または予防のための癌ワクチンに使用することができる。
【００１１】
本発明のペプチド二量体を構成するペプチド単量体は、少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなり、そしてＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる。「癌抗原ペプチドを生じさせる」とは、ペプチド単量体がＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される癌抗原ペプチドを生じさせる、という特性を有する意味である。ペプチド単量体は、それ自身ＣＴＬ誘導活性を有している限り特に制限されるものではないが、多くの癌種で高発現しているヒトＷｉｌｍｓ癌の癌抑制遺伝子ＷＴ１（Cell., 60:509, 1990、NCBIデータベースAccession No. XP_034418、配列番号：１）に由来しかつシステイン残基を少なくとも１つ含有するものが好ましい。ＷＴ1遺伝子は、Ｗｉｌｍｓ癌、無紅彩、泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ癌の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離され（Nature, 343:774, 1990）、そのゲノムＤＮＡは約５０kbであり１０のエキソンから成り、そしてそのｃＤＮＡは約3kbである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Cell., 60:509, 1990）。ＷＴ1遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ1アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平９−１０４６２７号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ1遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特開平９−１０４６２７号公報および国際公開第00/06602号パンフレット）、白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した（J. Immunol., 164: 1873-80, 2000およびJ. Clin. Immunol., 20, 195-202,2000）。癌免疫療法（癌ワクチン）は多くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、多くの癌種で高発現しているＷＴ１における癌抗原ペプチドの同定、および当該癌抗原ペプチドを利用した癌ワクチンの開発は重要である。これに関し、国際公開第00/06602号パンフレットおよび国際公開第00/18795号パンフレットには、ＷＴ１タンパク質の部分から成る幾つかの天然型の癌抗原ペプチドが記載されているが、イン・ビボでの効果は知られていない。
【００１２】
本発明に用いられる他のペプチド単量体としては、Immunity, vol.10:281, 1999の表中に記載の癌抗原タンパク質由来の癌抗原ペプチドでありかつシステイン残基を少なくとも１つ含有するものが挙げられる。
【００１３】
ＣＴＬ誘導活性は、ＨＬＡテトラマー法（Int. J. Cancer: 100, 565-570（2002））または限界希釈法(Nat. Med. :4, 321-327 (1998))によりＣＴＬの数を測定することにより確認することができる。あるいは、例えばHLA-A24拘束性のＣＴＬ誘導活性の場合、国際公開第02/47474号パンフレットおよびInt. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)に記述されたHLA-A24モデルマウスを用いることなどにより調べることができる。
【００１４】
ペプチド単量体のアミノ酸残基の個数は７〜３０個であるが、８〜１２個が好ましく、９〜１１個がより好ましい。ペプチド単量体中のシステイン残基の数は、ＨＬＡとの結合モチーフとペプチドの長さとを考慮し、１または２個であることが好ましい。
【００１５】
ペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１６】
得られたペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて分子間でジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合の形成方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１７】
具体的には、ペプチド単量体に含まれるシステイン残基が１個の場合、システイン側鎖の保護基を含むすべての保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液をアルカリ条件下で空気酸化反応に付す方法、あるいは、アルカリ性または酸性条件下酸化剤を添加してジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。ここで、酸化剤としては、ヨウ素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、フェリシアン化カリウムなどが挙げられる。
【００１８】
システイン残基が２個以上の場合も、前記と同様の方法を用いることができる。この場合はジスルフィド結合様式が異なる異性体が得られる。システイン側鎖の保護基を特定の組み合わせにすることにより、目的のシステイン残基間でジスルフィド結合を形成した二量体を得ることができる。前記保護基の組み合わせとしては、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基とＡｃｍ（アセトアミドメチル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基とＡｃｍ基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルチオ）基とＡｃｍ基、Ｓ−Ｂｕ−ｔ（Ｓ−tert−ブチル）基とＡｃｍ基などが挙げられる。例えばＭｅＢｚｌ基とＡｃｍ基の組み合わせの場合、まずＭｅＢｚｌ基とシステイン側鎖以外のその他の保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液を空気酸化反応に付して脱保護されたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成し、次いでヨウ素による脱保護および酸化を行ってＡｃｍ基で保護されていたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。
【００１９】
得られたペプチド二量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて精製することができる。ペプチド二量体の精製方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されているが、ＨＰＬＣが好ましい。
【００２０】
このようにして得られた本発明のペプチド二量体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成していることにより、溶液中での酸化剤等に対する安定性に優れており、医薬品原料として一定の品質とＣＴＬの誘導活性を保持するものである。
【００２１】
本発明に用いられるペプチド単量体の好ましい具体例としてＷＴ１を例に以下に示す。なお、本明細書においてアミノ酸残基を略号で表示する場合、次の３文字表記または１文字表記を用いる：
Ala（A） ：アラニン残基、Arg（R）：アルギニン残基、Asn（N）：アスパラギン残基、Asp（D）：アスパラギン酸残基、Cys（C）：システイン残基、Gln（Q）：グルタミン残基、Glu（E）：グルタミン酸残基、Gly（G）：グリシン残基、His（H）：ヒスチジン残基、Ile（I）：イソロイシン残基、Leu（L）：ロイシン残基、Lys（K）：リジン残基、Met（M）：メチオニン残基、Phe（F）：フェニルアラニン残基、Pro（P）：プロリン残基、Ser（S）：セリン残基、Thr（T）：トレオニン残基、Trp（W）：トリプトファン残基、Tyr（Y）：チロシン残基、Val（V）：バリン残基。
【００２２】
表中、「位置」とは配列番号１に記載のヒトＷＴ１におけるペプチドの位置を示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】
【表１１】
【００３４】
【表１２】
【００３５】
【表１３】
【００３６】
【表１４】
【００３７】
【表１５】
【００３８】
【表１６】
【００３９】
【表１７】
【００４０】
【表１８】
【００４１】
【表１９】
【００４２】
【表２０】
【００４３】
【表２１】
【００４４】
【表２２】
【００４５】
【表２３】
【００４６】
【表２４】
【００４７】
【表２５】
【００４８】
【表２６】
【００４９】
【表２７】
【００５０】
【表２８】
【００５１】
【表２９】
【００５２】
【表３０】
【００５３】
【表３１】
【００５４】
【表３２】
【００５５】
HLA分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。HLA-A24の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がチロシン（Tyr）、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン（Met）またはトリプトファン（Trp）であり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン(Phe)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、トリプトファン(Trp)またはメチオニン(Met)となることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994、Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155,p4307,1994）。従って、上記表４に示すペプチド単量体に加え、ペプチド単量体がCys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa（配列番号：７２）（第2位のXaaは、Tyr、Phe、MetおよびTrpからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のXaaは、Phe、Leu、Ile、TrpおよびMetからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）であるペプチドも、HLA-A24拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。
【００５６】
またHLA-A0201の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がロイシン（Leu）またはメチオニン(Met）であり、C末端のアミノ酸がバリン(Val)またはロイシン(Leu)となることが知られている。HLA-A0205の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がバリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン（Ile）またはメチオニン（Met）であり、C末端のアミノ酸がロイシン(Leu)となることが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155:p4749,1995）。従って、上記表２または３に示すペプチド単量体の第２位のアミノ酸またはＣ末端のアミノ酸を上記モチーフのいずれかに置換したペプチドもHLA-A0201またはHLA-A0205拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。
【００５７】
上記表４に示すペプチド単量体が本発明においては特に好適に用いられる。表４中、配列番号：４４のペプチドは、配列番号：１１（２３５〜２４３位）のアミノ酸配列において２３６位のメチオニンをチロシンに改変した非天然の改変型ペプチドである。よって、本発明におけるペプチド単量体には、天然型ペプチド中のシステイン残基以外の残基を一部改変したペプチドであって、ＣＴＬの誘導活性を有するペプチドも含まれる。
【００５８】
本発明は別の態様として、本発明のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物中の有効成分であるペプチド二量体の量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜20mgである。
【００５９】
本発明医薬組成物には有効成分として、本発明ペプチド二量体だけでなく、ペプチド単量体を含むことができる。本発明医薬組成物中に含まれる「ペプチド二量体」の割合は、ＣＴＬの誘導活性をもたらす限り特に制限されるものではないが、全ペプチド中５０％以上であり、７０〜１００％が好ましく、８０〜１００％がより好ましい。ペプチド二量体の割合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認することができる。
【００６０】
製薬的に許容されうる担体は、細胞性免疫を増強する作用を有するものである。当該担体としては、例えばアジュバントが挙げられる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニウム如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などの製剤化に必要な成分も担体に含まれる。
【００６１】
本発明医薬組成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。ＣＴＬを効率よく誘導する皮内投与や皮下投与が好ましい。投与回数および投与間隔は、治療または予防目的の疾患、患者の個体差により適宜調整することができるが、通常複数回であり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００６２】
例えば、ＷＴＩ由来のペプチド単量体から構成されるペプチド二量体を含有する本発明医薬組成物をＷＴＩ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原にペプチドが提示され、提示されたＨＬＡ抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の医薬組成物は、ＷＴＩ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
【００６３】
本発明はさらに別の態様として、本発明の医薬組成物をＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００６５】
製造例１
1. 保護ペプチド樹脂(H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resinの合成
Fmoc-Leu-Alko-樹脂（ここに、Alkoはｐ−アルコキシベンジルアルコール）12ｇ(渡辺化学製；0.81mmol/g)をAdvanced ChemTech社製ACT90型固相合成機の500ml反応槽内に入れ、一旦この樹脂をDMF等で洗浄後（工程１）、25%Pip（ピペリジン）で処理（3分×１回及び15分×１回）してFmoc基を切断後（工程２）、再びDMF等で樹脂を洗浄し（工程１）、Pipを除去した。この反応槽内に、Fmoc-Asn(Trt)-OH 29.36gとHOBT（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）7.5gをNMP（Ｎ−メチルピロリジノン）150mlに溶解した溶液を加え、更にDIPCI（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）7.6mlを加えて 30分間室温撹拌を行った（工程３）。30分後、NMPで樹脂を洗浄し（工程４）、Fmoc-Asn(Trt)-OH 29.36gとHOBT 7.5gを用いて再度カップリング反応を行い（工程５）、Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko樹脂を合成した。その後、工程２の脱保護操作を行い、H-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂とした。次いで、工程１の洗浄操作を行い、Fmoc-Met-OH 18.27g、Fmoc-Gln(Trt)-OH 30.04g、Fmoc-Asn(Trt)-OH29.36g、Fmoc-Trp(Boc) -OH 25.91g、Fmoc-Thr(tBu)-OH 19.56g、Fmoc-Tyr(tBu)-OH22.60g、Fmoc-Cys(Trt)-OH 28.82gを順次加え、工程３のカップリング反応を行った。但しFmoc-Thr(tBu)-OHについてはカップリングを3回繰り返して行った後、得られた樹脂をDMFで洗浄後、25%AC2O（無水酢酸）で15分×2回で未反応のアミノ基をキャッピングした。N末端のFmoc-Cys(Trt)-OHを縮合後、工程２の脱保護操作を行い、工程６の洗浄操作を実施し、H-Cys(Trt)- Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc) -Asn(Trt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resinを得た。上記合成工程の概要を表３３に示す。
【００６６】
【表３３】
【００６７】
2. 保護ペプチド樹脂の脱保護
上記操作によって得られた保護ペプチド樹脂(H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resin 14.06gにReagent K(5%フェノール/ 5%チオアニソール/5%H2O/2.5%エタンジチオール/TFA溶液)100mlとトリイソプロピルシラン (TIPS) 15mlを加え、室温で2.5時間攪拌した。その後、ジエチルエーテル約500mlを加え、グラスフィルターで濾過を行い、Reagent Kとジエチルエーテルを濾液として除いた。濾上物を約100mlのジエチルエーテルで3回洗浄し、洗浄後の濾上物に約100mlのTFAを加える操作を3回繰り返して行い、目的物を含む濾液を約300ml得た。この濾液を濃縮してTFAを除き、アセトニトリル約50mlと20%酢酸水約250ml加え凍結乾燥し、パウダー状の粗ペプチド(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH、配列番号：４４)6.12gを得た。
【００６８】
3. 粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド749mgをTFA 10mlに溶解し、HPLC(Shimazu製；LC8AD型)１液＝H2O/0.1%TFAで平衡化しているYMC社製 ODS C18 5cmΦ×50cmLのカラムにHPLCのポンプでチャージした。その状態で約30分間保ち、30分後、２液＝CH3CN/0.1%TFAの濃度を30分間で0％から15%迄上昇した。その後、更に330分かけて28%まで２液の濃度を上昇させ、目的とするペプチドの溶出液を220nmのUVでモニターしながら、目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、YMC社製ODS C18 4.6mmΦ×25cmLカラムをセットしたHPLC(日立製 L-4000型)で１液＝H2O/0.1%TFAと２液＝CH3CN/0.1%TFAの溶出液で、２液＝CH3CN/0.1%TFAの濃度を17%で平衡化しているカラムに注入し、220nmのUVでモニターしながら２液の濃度47%まで30分間で上昇させ、保持時間14.79分の目的ペプチド単量体の精製品227.5mgを得た。
・アミノ酸分析
加水分解：1%フェノール/6N塩酸水、110℃ 10時間
分析法：ニンヒドリン法
Asx:1.71(2) Thr:0.75(1) Glx:1.07(1) Met:0.91(1) ＊ Leu:(1) Tyr:0.82(1)
＊) Leu=基準アミノ酸 ( ) 内 理論値
・質量分析：LC/MS M+1=1173.0 (理論値＝1172.36)
・アミノ酸配列分析：N末2残基目 Tyrから、C末Leuまで順次確認した。
【００６９】
実施例１
次式で示される二量体の合成：
【化１】
製造例１により得られたペプチド単量体227.5mg、N-メチルグルカミン(NMG) 227.5mg、水23mlを加え室温で約2日間攪拌することにより、空気酸化を行った。その後、反応液中に酢酸ナトリウム2gを水5mlに溶解した水溶液を加え約20分間室温攪拌を行い、更に水200mlとアセトニトリル約200mlを加えた後、桐山ロート（ろ紙 No5C）で濾過し、濾上物を水（約50ml×3回）で洗浄した。濾上物を濾取し、水約200mlを加えて凍結乾燥を行い、目的とする粗ペプチド二量体158mgを得た。
【００７０】
粗ペプチド二量体の精製
粗ペプチド二量体158mgをDMSO 9mlに溶解し、HPLC(Shimazu製；LC8AD型)に１液＝H2O/1%AcOHで平衡化しているYMC社製ODS C18 5cmΦ×50cmLのカラムにHPLCのポンプでチャージした。その状態で約30分間保ち、30分後、２液＝CH3CN/1%AcOHの濃度を360分間で0％から40%迄上昇した。その後、目的とする二量体の溶出液を220nmのUVでモニターしながら、自動分画装置により目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、YMC社製ODS C18 4.6mmΦ×25cmLカラムをセットしたHPLC(日立製 L-4000型)で１液＝H2O/0.1%TFAと２液＝CH3CN/0.1%TFAの溶出液で、２液＝CH3CN/0.1%TFAの濃度を17%で平衡化しているカラムに注入し、220nmのUVでモニターしながら２液の濃度を0％から47%まで30分で上昇させ、保持時間20.51分の目的とするペプチド二量体精製品46.6mgを得た。
FAB.MS 2365.0 (理論値 2342.70) Na+ F=0.25%
【００７１】
試験例１
ペプチド二量体によるCTL誘導
実施例１にて調製したペプチド二量体のCTL誘導能をHLA-A24トランスジェニックマウス（Int. J. Cancer: 100, 565, 2002）を用いて評価した。ペプチド二量体をジメチルスルホキシド(DMSO)で溶解し、４０ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を作製した。このペプチド溶液35μｌを581μｌの10ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加してペプチド懸濁液を調製した。このペプチド懸濁液550μｌとMontanide ISA51（Seppic社）700μｌを連結したガラスシリンジを用いて混合し、エマルションを作製して投与液を調製した。
【００７２】
投与液200μｌをHLA-A24トランスジェニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは3匹用いた。投与７日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を100μｇ／ｍｌのペプチド二量体で1時間パルスした。ペプチドをパルスしていない脾細胞を24穴プレートに７×106個／wellで播種し、更に上記のペプチドをパルスした脾細胞を１×106個／well添加して培養した。培養液には、RPMI1640培地に10％FCS、10ｍM HEPES、20ｍM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM MEM非必須アミノ酸、1％ MEMビタミン、55μM 2-メルカプトエタノールを含ませ、5日間培養した。
【００７３】
培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的なCTLの活性を51Crリリースアッセイ(J. Immunol.: 159, 4753, 1997)により測定した。標的細胞としては、HLA-A24とH-2KｂのキメラのMHCクラスＩ分子(Int. J. Cancer: 100, 565, 2002)を安定的に発現するようにマウスリンパ腫由来細胞株EL-4細胞(ATCC株番号TIB-39)に遺伝子導入して作製した細胞株EL-4-A2402／Kbを用いた。標的細胞は3.7Mbq/106個で51Crラベル後、前記ペプチドを100μg/mlになるように添加して更に1時間パルスした。またペプチド非パルスの標的細胞を2時間51Crラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を1：120の割合で混合して4時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合よりCTL活性を求めた。結果を図１に示した。前記ペプチドを投与したマウスより調製した脾細胞は、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的CTLが誘導されていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により、インビボにおいてCTL誘導活性を有するペプチド二量体およびそれを有効成分として含有する医薬組成物が提供される。本発明は、多くの癌患者の病態の改善に有効であると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌ワクチン療法の分野に属し、詳細には細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせるペプチド二量体およびそれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド（癌抗原ペプチド）とＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡ抗原と称する）とにより形成される複合体を認識し、癌細胞を攻撃・破壊する。
【０００３】
癌抗原タンパク質は、Immunity, vol.10:281, 1999の表中に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（J. Exp. Med., 179: 1005, 1994）、ＭＡＲＴ−１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994）、およびチロシナーゼ（J. Exp. Med., 178: 489, 1993）などのメラノソーム抗原、ならびにメラノーマ以外の癌抗原タンパク質としてＨＥＲ２／ｎｅｕ（J. Exp. Med., 181: 2109, 1995）、ＣＥＡ（J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995）、およびＰＳＡ（J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997）などの癌マーカーがある。
【０００４】
癌抗原ペプチドは、癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成される約８から１１個のアミノ酸から成るペプチドである（Cur. Opin, Immunol., 5: 709, 1993；Cur. Opin, Immunol., 5: 719, 1993；Cell, 82: 13, 1995；Immunol. Rev., 146: 167, 1995）。前記のように、この生成された癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）との複合体が細胞表面に提示され、ＣＴＬにより認識される。従って、ＣＴＬによる癌細胞破壊を利用する癌免疫療法剤（癌ワクチン）を開発する場合、ＣＴＬを効率良く誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質から同定することが、非常に重要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、イン・ビボにて有用な癌抗原ペプチドから誘導される新たな癌抗原を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、癌抗原ペプチドとして証明されているペプチドの中にはシステイン残基が含まれているものがあり、意外にもこのようなペプチドを二量体化させて投与すると単量体と同等のＣＴＬの誘導活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１） 少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体；
（２） ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、上記（１）記載のペプチド二量体；
（３） ２つのペプチド単量体が１または２個のジスルフィド結合により結合している、上記（１）または（２）記載のペプチド二量体；
（４） ペプチド単量体が癌抑制遺伝子産物ＷＴ１に由来する、上記（１）〜（３）のいずれか記載のペプチド二量体；
（５） ペプチド単量体がCys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa（配列番号：７２）（第2位のXaaは、Tyr、Phe、MetおよびTrpからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のXaaは、Phe、Leu、Ile、TrpおよびMetからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）である、上記（１）〜（４）のいずれか記載のペプチド二量体：
（６） ペプチド単量体がCys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：１１）、 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe（配列番号：１８）、Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr（配列番号：１９）、Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu（配列番号：２０）、Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：２１）、Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (配列番号：２２)、Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu（配列番号：２３）およびCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：４４）からなる群より選ばれる、上記（１）〜（４）のいずれか記載のペプチド二量体；
（７） 上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物；
（８） 癌ワクチンとして使用される、上記（７）に記載の医薬組成物；
（９） 上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体における、癌ワクチンを製造するための使用；および
（１０） 癌を治療または予防するための方法であって、上記（１）〜（６）のいずれか記載のペプチド二量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としているＷＴ１陽性の患者に投与する方法：
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、トランスジェニックマウスにおけるペプチド二量体（配列番号：４４）によるCTL誘導の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のペプチド二量体は、２つのペプチド単量体間における少なくとも１対のシステイン残基のＳＨ基間でのジスルフィド結合によって２つの単量体が相互に結合して二量体化している。
【００１０】
本発明のペプチド二量体はＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明の二量体は、癌の治療または予防のための癌ワクチンに使用することができる。
【００１１】
本発明のペプチド二量体を構成するペプチド単量体は、少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなり、そしてＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる。「癌抗原ペプチドを生じさせる」とは、ペプチド単量体がＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される癌抗原ペプチドを生じさせる、という特性を有する意味である。ペプチド単量体は、それ自身ＣＴＬ誘導活性を有している限り特に制限されるものではないが、多くの癌種で高発現しているヒトＷｉｌｍｓ癌の癌抑制遺伝子ＷＴ１（Cell., 60:509, 1990、NCBIデータベースAccession No. XP_034418、配列番号：１）に由来しかつシステイン残基を少なくとも１つ含有するものが好ましい。ＷＴ1遺伝子は、Ｗｉｌｍｓ癌、無紅彩、泌尿生殖異常、精神発達遅延などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ癌の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離され（Nature, 343:774, 1990）、そのゲノムＤＮＡは約５０kbであり１０のエキソンから成り、そしてそのｃＤＮＡは約3kbである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Cell., 60:509, 1990）。ＷＴ1遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ1アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平９−１０４６２７号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ1遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特開平９−１０４６２７号公報および国際公開第00/06602号パンフレット）、白血病および固形癌における新しい癌抗原タンパク質であることが判明した（J. Immunol., 164: 1873-80, 2000およびJ. Clin. Immunol., 20, 195-202,2000）。癌免疫療法（癌ワクチン）は多くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、多くの癌種で高発現しているＷＴ１における癌抗原ペプチドの同定、および当該癌抗原ペプチドを利用した癌ワクチンの開発は重要である。これに関し、国際公開第00/06602号パンフレットおよび国際公開第00/18795号パンフレットには、ＷＴ１タンパク質の部分から成る幾つかの天然型の癌抗原ペプチドが記載されているが、イン・ビボでの効果は知られていない。
【００１２】
本発明に用いられる他のペプチド単量体としては、Immunity, vol.10:281, 1999の表中に記載の癌抗原タンパク質由来の癌抗原ペプチドでありかつシステイン残基を少なくとも１つ含有するものが挙げられる。
【００１３】
ＣＴＬ誘導活性は、ＨＬＡテトラマー法（Int. J. Cancer: 100, 565-570（2002））または限界希釈法(Nat. Med. :4, 321-327 (1998))によりＣＴＬの数を測定することにより確認することができる。あるいは、例えばHLA-A24拘束性のＣＴＬ誘導活性の場合、国際公開第02/47474号パンフレットおよびInt. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)に記述されたHLA-A24モデルマウスを用いることなどにより調べることができる。
【００１４】
ペプチド単量体のアミノ酸残基の個数は７〜３０個であるが、８〜１２個が好ましく、９〜１１個がより好ましい。ペプチド単量体中のシステイン残基の数は、ＨＬＡとの結合モチーフとペプチドの長さとを考慮し、１または２個であることが好ましい。
【００１５】
ペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１６】
得られたペプチド単量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて分子間でジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合の形成方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１７】
具体的には、ペプチド単量体に含まれるシステイン残基が１個の場合、システイン側鎖の保護基を含むすべての保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液をアルカリ条件下で空気酸化反応に付す方法、あるいは、アルカリ性または酸性条件下酸化剤を添加してジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。ここで、酸化剤としては、ヨウ素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、フェリシアン化カリウムなどが挙げられる。
【００１８】
システイン残基が２個以上の場合も、前記と同様の方法を用いることができる。この場合はジスルフィド結合様式が異なる異性体が得られる。システイン側鎖の保護基を特定の組み合わせにすることにより、目的のシステイン残基間でジスルフィド結合を形成した二量体を得ることができる。前記保護基の組み合わせとしては、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基とＡｃｍ（アセトアミドメチル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基とＡｃｍ基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルチオ）基とＡｃｍ基、Ｓ−Ｂｕ−ｔ（Ｓ−tert−ブチル）基とＡｃｍ基などが挙げられる。例えばＭｅＢｚｌ基とＡｃｍ基の組み合わせの場合、まずＭｅＢｚｌ基とシステイン側鎖以外のその他の保護基を除去した後、ペプチド単量体を含む溶液を空気酸化反応に付して脱保護されたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成し、次いでヨウ素による脱保護および酸化を行ってＡｃｍ基で保護されていたシステイン残基間にジスルフィド結合を形成する方法などが挙げられる。
【００１９】
得られたペプチド二量体は、通常のペプチド化学に用いられる方法に準じて精製することができる。ペプチド二量体の精製方法は、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されているが、ＨＰＬＣが好ましい。
【００２０】
このようにして得られた本発明のペプチド二量体は、システイン残基がジスルフィド結合を形成していることにより、溶液中での酸化剤等に対する安定性に優れており、医薬品原料として一定の品質とＣＴＬの誘導活性を保持するものである。
【００２１】
本発明に用いられるペプチド単量体の好ましい具体例としてＷＴ１を例に以下に示す。なお、本明細書においてアミノ酸残基を略号で表示する場合、次の３文字表記または１文字表記を用いる：
Ala（A） ：アラニン残基、Arg（R）：アルギニン残基、Asn（N）：アスパラギン残基、Asp（D）：アスパラギン酸残基、Cys（C）：システイン残基、Gln（Q）：グルタミン残基、Glu（E）：グルタミン酸残基、Gly（G）：グリシン残基、His（H）：ヒスチジン残基、Ile（I）：イソロイシン残基、Leu（L）：ロイシン残基、Lys（K）：リジン残基、Met（M）：メチオニン残基、Phe（F）：フェニルアラニン残基、Pro（P）：プロリン残基、Ser（S）：セリン残基、Thr（T）：トレオニン残基、Trp（W）：トリプトファン残基、Tyr（Y）：チロシン残基、Val（V）：バリン残基。
【００２２】
表中、「位置」とは配列番号１に記載のヒトＷＴ１におけるペプチドの位置を示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
【表９】
【００３２】
【表１０】
【００３３】
【表１１】
【００３４】
【表１２】
【００３５】
【表１３】
【００３６】
【表１４】
【００３７】
【表１５】
【００３８】
【表１６】
【００３９】
【表１７】
【００４０】
【表１８】
【００４１】
【表１９】
【００４２】
【表２０】
【００４３】
【表２１】
【００４４】
【表２２】
【００４５】
【表２３】
【００４６】
【表２４】
【００４７】
【表２５】
【００４８】
【表２６】
【００４９】
【表２７】
【００５０】
【表２８】
【００５１】
【表２９】
【００５２】
【表３０】
【００５３】
【表３１】
【００５４】
【表３２】
【００５５】
HLA分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。HLA-A24の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がチロシン（Tyr）、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン（Met）またはトリプトファン（Trp）であり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン(Phe)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、トリプトファン(Trp)またはメチオニン(Met)となることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994、Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155,p4307,1994）。従って、上記表４に示すペプチド単量体に加え、ペプチド単量体がCys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa（配列番号：７２）（第2位のXaaは、Tyr、Phe、MetおよびTrpからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のXaaは、Phe、Leu、Ile、TrpおよびMetからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）であるペプチドも、HLA-A24拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。
【００５６】
またHLA-A0201の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がロイシン（Leu）またはメチオニン(Met）であり、C末端のアミノ酸がバリン(Val)またはロイシン(Leu)となることが知られている。HLA-A0205の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がバリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン（Ile）またはメチオニン（Met）であり、C末端のアミノ酸がロイシン(Leu)となることが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155:p4749,1995）。従って、上記表２または３に示すペプチド単量体の第２位のアミノ酸またはＣ末端のアミノ酸を上記モチーフのいずれかに置換したペプチドもHLA-A0201またはHLA-A0205拘束性ペプチド単量体として好適に用いられる。
【００５７】
上記表４に示すペプチド単量体が本発明においては特に好適に用いられる。表４中、配列番号：４４のペプチドは、配列番号：１１（２３５〜２４３位）のアミノ酸配列において２３６位のメチオニンをチロシンに改変した非天然の改変型ペプチドである。よって、本発明におけるペプチド単量体には、天然型ペプチド中のシステイン残基以外の残基を一部改変したペプチドであって、ＣＴＬの誘導活性を有するペプチドも含まれる。
【００５８】
本発明は別の態様として、本発明のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物中の有効成分であるペプチド二量体の量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜20mgである。
【００５９】
本発明医薬組成物には有効成分として、本発明ペプチド二量体だけでなく、ペプチド単量体を含むことができる。本発明医薬組成物中に含まれる「ペプチド二量体」の割合は、ＣＴＬの誘導活性をもたらす限り特に制限されるものではないが、全ペプチド中５０％以上であり、７０〜１００％が好ましく、８０〜１００％がより好ましい。ペプチド二量体の割合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認することができる。
【００６０】
製薬的に許容されうる担体は、細胞性免疫を増強する作用を有するものである。当該担体としては、例えばアジュバントが挙げられる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニウム如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などの製剤化に必要な成分も担体に含まれる。
【００６１】
本発明医薬組成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。ＣＴＬを効率よく誘導する皮内投与や皮下投与が好ましい。投与回数および投与間隔は、治療または予防目的の疾患、患者の個体差により適宜調整することができるが、通常複数回であり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００６２】
例えば、ＷＴＩ由来のペプチド単量体から構成されるペプチド二量体を含有する本発明医薬組成物をＷＴＩ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原にペプチドが提示され、提示されたＨＬＡ抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の医薬組成物は、ＷＴＩ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
【００６３】
本発明はさらに別の態様として、本発明の医薬組成物をＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００６５】
製造例１
1. 保護ペプチド樹脂(H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resinの合成
Fmoc-Leu-Alko-樹脂（ここに、Alkoはｐ−アルコキシベンジルアルコール）12ｇ(渡辺化学製；0.81mmol/g)をAdvanced ChemTech社製ACT90型固相合成機の500ml反応槽内に入れ、一旦この樹脂をDMF等で洗浄後（工程１）、25%Pip（ピペリジン）で処理（3分×１回及び15分×１回）してFmoc基を切断後（工程２）、再びDMF等で樹脂を洗浄し（工程１）、Pipを除去した。この反応槽内に、Fmoc-Asn(Trt)-OH 29.36gとHOBT（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）7.5gをNMP（Ｎ−メチルピロリジノン）150mlに溶解した溶液を加え、更にDIPCI（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）7.6mlを加えて 30分間室温撹拌を行った（工程３）。30分後、NMPで樹脂を洗浄し（工程４）、Fmoc-Asn(Trt)-OH 29.36gとHOBT 7.5gを用いて再度カップリング反応を行い（工程５）、Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko樹脂を合成した。その後、工程２の脱保護操作を行い、H-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂とした。次いで、工程１の洗浄操作を行い、Fmoc-Met-OH 18.27g、Fmoc-Gln(Trt)-OH 30.04g、Fmoc-Asn(Trt)-OH29.36g、Fmoc-Trp(Boc) -OH 25.91g、Fmoc-Thr(tBu)-OH 19.56g、Fmoc-Tyr(tBu)-OH22.60g、Fmoc-Cys(Trt)-OH 28.82gを順次加え、工程３のカップリング反応を行った。但しFmoc-Thr(tBu)-OHについてはカップリングを3回繰り返して行った後、得られた樹脂をDMFで洗浄後、25%AC2O（無水酢酸）で15分×2回で未反応のアミノ基をキャッピングした。N末端のFmoc-Cys(Trt)-OHを縮合後、工程２の脱保護操作を行い、工程６の洗浄操作を実施し、H-Cys(Trt)- Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc) -Asn(Trt)- Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resinを得た。上記合成工程の概要を表３３に示す。
【００６６】
【表３３】
【００６７】
2. 保護ペプチド樹脂の脱保護
上記操作によって得られた保護ペプチド樹脂(H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-Resin 14.06gにReagent K(5%フェノール/ 5%チオアニソール/5%H2O/2.5%エタンジチオール/TFA溶液)100mlとトリイソプロピルシラン (TIPS) 15mlを加え、室温で2.5時間攪拌した。その後、ジエチルエーテル約500mlを加え、グラスフィルターで濾過を行い、Reagent Kとジエチルエーテルを濾液として除いた。濾上物を約100mlのジエチルエーテルで3回洗浄し、洗浄後の濾上物に約100mlのTFAを加える操作を3回繰り返して行い、目的物を含む濾液を約300ml得た。この濾液を濃縮してTFAを除き、アセトニトリル約50mlと20%酢酸水約250ml加え凍結乾燥し、パウダー状の粗ペプチド(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH、配列番号：４４)6.12gを得た。
【００６８】
3. 粗ペプチドの精製
得られた粗ペプチド749mgをTFA 10mlに溶解し、HPLC(Shimazu製；LC8AD型)１液＝H2O/0.1%TFAで平衡化しているYMC社製 ODS C18 5cmΦ×50cmLのカラムにHPLCのポンプでチャージした。その状態で約30分間保ち、30分後、２液＝CH3CN/0.1%TFAの濃度を30分間で0％から15%迄上昇した。その後、更に330分かけて28%まで２液の濃度を上昇させ、目的とするペプチドの溶出液を220nmのUVでモニターしながら、目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、YMC社製ODS C18 4.6mmΦ×25cmLカラムをセットしたHPLC(日立製 L-4000型)で１液＝H2O/0.1%TFAと２液＝CH3CN/0.1%TFAの溶出液で、２液＝CH3CN/0.1%TFAの濃度を17%で平衡化しているカラムに注入し、220nmのUVでモニターしながら２液の濃度47%まで30分間で上昇させ、保持時間14.79分の目的ペプチド単量体の精製品227.5mgを得た。
・アミノ酸分析
加水分解：1%フェノール/6N塩酸水、110℃ 10時間
分析法：ニンヒドリン法
Asx:1.71(2) Thr:0.75(1) Glx:1.07(1) Met:0.91(1) ＊ Leu:(1) Tyr:0.82(1)
＊) Leu=基準アミノ酸 ( ) 内 理論値
・質量分析：LC/MS M+1=1173.0 (理論値＝1172.36)
・アミノ酸配列分析：N末2残基目 Tyrから、C末Leuまで順次確認した。
【００６９】
実施例１
次式で示される二量体の合成：
【化１】
製造例１により得られたペプチド単量体227.5mg、N-メチルグルカミン(NMG) 227.5mg、水23mlを加え室温で約2日間攪拌することにより、空気酸化を行った。その後、反応液中に酢酸ナトリウム2gを水5mlに溶解した水溶液を加え約20分間室温攪拌を行い、更に水200mlとアセトニトリル約200mlを加えた後、桐山ロート（ろ紙 No5C）で濾過し、濾上物を水（約50ml×3回）で洗浄した。濾上物を濾取し、水約200mlを加えて凍結乾燥を行い、目的とする粗ペプチド二量体158mgを得た。
【００７０】
粗ペプチド二量体の精製
粗ペプチド二量体158mgをDMSO 9mlに溶解し、HPLC(Shimazu製；LC8AD型)に１液＝H2O/1%AcOHで平衡化しているYMC社製ODS C18 5cmΦ×50cmLのカラムにHPLCのポンプでチャージした。その状態で約30分間保ち、30分後、２液＝CH3CN/1%AcOHの濃度を360分間で0％から40%迄上昇した。その後、目的とする二量体の溶出液を220nmのUVでモニターしながら、自動分画装置により目的物を含む分画を集めた。集めた分画を、YMC社製ODS C18 4.6mmΦ×25cmLカラムをセットしたHPLC(日立製 L-4000型)で１液＝H2O/0.1%TFAと２液＝CH3CN/0.1%TFAの溶出液で、２液＝CH3CN/0.1%TFAの濃度を17%で平衡化しているカラムに注入し、220nmのUVでモニターしながら２液の濃度を0％から47%まで30分で上昇させ、保持時間20.51分の目的とするペプチド二量体精製品46.6mgを得た。
FAB.MS 2365.0 (理論値 2342.70) Na+ F=0.25%
【００７１】
試験例１
ペプチド二量体によるCTL誘導
実施例１にて調製したペプチド二量体のCTL誘導能をHLA-A24トランスジェニックマウス（Int. J. Cancer: 100, 565, 2002）を用いて評価した。ペプチド二量体をジメチルスルホキシド(DMSO)で溶解し、４０ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を作製した。このペプチド溶液35μｌを581μｌの10ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加してペプチド懸濁液を調製した。このペプチド懸濁液550μｌとMontanide ISA51（Seppic社）700μｌを連結したガラスシリンジを用いて混合し、エマルションを作製して投与液を調製した。
【００７２】
投与液200μｌをHLA-A24トランスジェニックマウスの尾根部皮下に投与した。マウスは3匹用いた。投与７日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を100μｇ／ｍｌのペプチド二量体で1時間パルスした。ペプチドをパルスしていない脾細胞を24穴プレートに７×106個／wellで播種し、更に上記のペプチドをパルスした脾細胞を１×106個／well添加して培養した。培養液には、RPMI1640培地に10％FCS、10ｍM HEPES、20ｍM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、1mM MEM非必須アミノ酸、1％ MEMビタミン、55μM 2-メルカプトエタノールを含ませ、5日間培養した。
【００７３】
培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的なCTLの活性を51Crリリースアッセイ(J. Immunol.: 159, 4753, 1997)により測定した。標的細胞としては、HLA-A24とH-2KｂのキメラのMHCクラスＩ分子(Int. J. Cancer: 100, 565, 2002)を安定的に発現するようにマウスリンパ腫由来細胞株EL-4細胞(ATCC株番号TIB-39)に遺伝子導入して作製した細胞株EL-4-A2402／Kbを用いた。標的細胞は3.7Mbq/106個で51Crラベル後、前記ペプチドを100μg/mlになるように添加して更に1時間パルスした。またペプチド非パルスの標的細胞を2時間51Crラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を1：120の割合で混合して4時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合よりCTL活性を求めた。結果を図１に示した。前記ペプチドを投与したマウスより調製した脾細胞は、ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールのペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的CTLが誘導されていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により、インビボにおいてCTL誘導活性を有するペプチド二量体およびそれを有効成分として含有する医薬組成物が提供される。本発明は、多くの癌患者の病態の改善に有効であると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体。
【請求項２】
ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、請求項１記載のペプチド二量体。
【請求項３】
２つのペプチド単量体が１または２個のジスルフィド結合により結合している、請求項１または２記載のペプチド二量体。
【請求項４】
ペプチド単量体が癌抑制遺伝子産物ＷＴ１に由来する、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド二量体。
【請求項５】
ペプチド単量体がCys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa（配列番号：７２）（第2位のXaaは、Tyr、Phe、MetおよびTrpからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のXaaは、Phe、Leu、Ile、TrpおよびMetからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）である請求項１〜４のいずれか記載のペプチド二量体。
【請求項６】
ペプチド単量体がCys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：１１）、 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe（配列番号：１８）、Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr（配列番号：１９）、Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu（配列番号：２０）、Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：２１）、Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (配列番号：２２)、Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu（配列番号：２３）およびCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：４４）からなる群より選ばれる、請求項１〜４のいずれか記載のペプチド二量体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。
【請求項８】
癌ワクチンとして使用される、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド二量体における、癌ワクチンを製造するための使用。
【請求項１０】
癌を治療または予防するための方法であって、請求項１〜６のいずれか記載のペプチド二量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としているＷＴ１陽性の患者に投与する方法。
【請求項１】
少なくとも１つのシステイン残基を含みかつ７〜３０個のアミノ酸残基からなる、ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる２つのペプチド単量体が相互にジスルフィド結合により結合しているペプチド二量体。
【請求項２】
ＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドを生じさせる、請求項１記載のペプチド二量体。
【請求項３】
２つのペプチド単量体が１または２個のジスルフィド結合により結合している、請求項１または２記載のペプチド二量体。
【請求項４】
ペプチド単量体が癌抑制遺伝子産物ＷＴ１に由来する、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド二量体。
【請求項５】
ペプチド単量体がCys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa（配列番号：７２）（第2位のXaaは、Tyr、Phe、MetおよびTrpからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示し、第９位のXaaは、Phe、Leu、Ile、TrpおよびMetからなる群より選ばれる１つのアミノ酸残基を示す）である請求項１〜４のいずれか記載のペプチド二量体。
【請求項６】
ペプチド単量体がCys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：１１）、 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe（配列番号：１８）、Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr（配列番号：１９）、Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu（配列番号：２０）、Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu（配列番号：２１）、Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (配列番号：２２)、Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu（配列番号：２３）およびCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：４４）からなる群より選ばれる、請求項１〜４のいずれか記載のペプチド二量体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド二量体と製薬的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。
【請求項８】
癌ワクチンとして使用される、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか記載のペプチド二量体における、癌ワクチンを製造するための使用。
【請求項１０】
癌を治療または予防するための方法であって、請求項１〜６のいずれか記載のペプチド二量体の治療または予防に有効な量を、それを必要としているＷＴ１陽性の患者に投与する方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−４７６０３（Ｐ２０１０−４７６０３Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６０９５７（Ｐ２００９−２６０９５７）
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【分割の表示】特願２００５−５０８０１１（Ｐ２００５−５０８０１１）の分割
【原出願日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（５０５４４３９５３）株式会社癌免疫研究所 (8)
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【分割の表示】特願２００５−５０８０１１（Ｐ２００５−５０８０１１）の分割
【原出願日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（５０５４４３９５３）株式会社癌免疫研究所 (8)
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
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