代替軽鎖の発現
本発明は、非相同性シグナル配列を有する代替軽鎖配列を含む代替軽鎖（ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標））構造体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非相同性シグナル配列を有する代替軽鎖配列を含む代替軽鎖（ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ）（商標）構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂリンパ球により産生される抗体（Ｉｇ）分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖で構築されている。ＨおよびＬ鎖のアミノ末端ドメインのアミノ酸配列は、特に抗原結合部位を形成する３つの高度可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）に可変性（ＶＨおよびＶＬ）がある。ＨおよびＬ鎖のアッセンブリは、Ｌ鎖の定常領域（ＣＬ）と、重鎖の第一の定常領域（ＣＨ１）の間のジスルフィド結合により、そしてＶＨドメインとＶＬドメインの間の非共有結合的相互作用により安定化されている。
【０００３】
ヒトおよび多くの動物、例えばマウスにおいて、抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子は、Ｖ領域の遺伝子フラグメントコード化部分の段階的な体細胞再配列により組立てられる。Ｂリンパ球発達の様々な段階が、Ｉｇ遺伝子ｌｏｃｉの再配列状態により特徴づけられる（例えば、Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．＆Ｒｏｌｉｎｋ，Ａ．，Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ｅｄ．，１９９９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｐｈｉａ参照）。
【０００４】
Ｂ細胞の前駆体（プレＢ細胞）は、完全に発達した軽鎖の代わりにＶｐｒｅＢ（１〜３）およびλ５と呼ばれる遺伝子組が生成されること、ならびにμ重鎖が同時発現されることにより、骨髄において同定された。
【０００５】
ヒトＶｐｒｅＢ１（ＣＡＧ３０４９５）の主なアイソフォームは、１４５ａａ長ポリペプチド（配列番号１）である。それは、ＩｇＶドメイン様構造を有するが、典型的なＶドメインの最後のβ鎖（β７）が欠如しており、任意の別のタンパク質に対して配列相同性を示さないカルボキシル末端を有する。ＶｐｒｅＢ２は、１４２アミノ酸のマウスＶｐｒｅＢ２ポリペプチド（Ｐ１３３７３；配列番号２）およびマウスＶｐｒｅＢ２配列の１７１アミノ酸長スプライスバリアント（ＣＡＡ０１９６４１；配列番号３）をはじめとする複数のアイソフォームを有する。ＶｐｒｅＢ１およびＶｐｒｅＢ２配列は、ＥＰ０２６９１２７および米国特許第５，１８２，２０５号；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．５（１０）：Ｒ８４（２００４）；およびＨｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１４）：５５５２−５５５６（１９８９）に開示されている。ヒトＶｐｒｅＢ３（配列番号４）の主なアイソフォームは、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．５（１０）：Ｒ８４（２００４）に開示された１２３ａａ長タンパク質（ＣＡＧ３０４９６）である。
【０００６】
ＶｐｒｅＢ（１〜３）は、もう一方タンパク質λ５とは非共有結合的に会合されている。ヒトλ５は、２０９アミノ酸ポリペプチド（ＣＡＡ０１９６２：配列番号５）であり、抗体軽鎖と強力な相同性を有するＩｇＣドメイン様構造と、そのアミノ酸末端に向かって、２つの機能的に異なる領域とを含み、その領域の一方は、Ｖλドメインのβ７鎖に対して強力な相同性を示す。ヒトλ５様タンパク質は、２１３アミノ酸（ＮＰ＿０６４４５５；配列番号６）を有し、抗体λ軽鎖定常領域に対して約８４％の配列同一性を示す。
【０００７】
更なる詳細については、以下のレビュー雑誌を参照されたい：Ｋａｒａｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３：１−４１（１９９６）；Ｍｅｌｃｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：６０−６８（１９９３）；およびＭｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２５７１−２５７３（１９９９）。
【０００８】
ＶｐｒｅＢとλ５のポリペプチドは、一緒になって、代替軽鎖または偽軽鎖と呼ばれる非共有結合的に会合されたＩｇ軽鎖様構造を形成している。初期のプレＢ細胞の表面では、代替軽鎖が、シグナルトランスデューサーＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂヘテロ二量体と会合された膜結合Ｉｇμ重鎖にジスルフィド結合して、Ｂ細胞受容体様構造、いわゆるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）を形成している。
【０００９】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙは、抗体レパートリーの正常な発達の間に生成されるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づいている。抗体とは異なり、プレＢＣＲは、２つの代替軽鎖成分、ＶｐｒｅＢおよびλ５と対になった抗体重鎖で構成された三量体である。ＶｐｒｅＢおよびλ５は両者とも、遺伝子再配列を受けず、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの開始前に初期プレＢ細胞内で発現される遺伝子によりコードされている。プレＢＣＲは、重鎖と、２つの非共有結合的に会合されたタンパク質：ＶｐｒｅＢおよびλ５とで構成されている成熟免疫グロブリンと構造的に異なっており、即ちそれらは、抗体内の２つとは対照的に３つの成分を有する。更に、ＶｐｒｅＢは、Ｖλ Ｉｇドメインと相同性があり、λ５は、抗体のＣλドメインと相同性があるが、それぞれは、非標準のペプチド伸長を有しており、つまりＶｐｒｅＢ１は、Ｃ末端に追加の２１残基を有し、λ５は、Ｎ末端に５０アミノ酸の伸長を有する。
【００１０】
κ様代替軽鎖（κ様ＳＬＣ）を用いて、κ様β細胞受容体（κ様ＢＣＲ）が同定された（Ｆｒａｎｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １３：５９３７−４３（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：３０５−１１（１９９８）；Ｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：１７８０７−１４（２００５））。
【００１１】
Ｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（１８）：１７８０７−１７８１４（２００５）には、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：３０８−３１１（１９９８）により過去に報告されたｃＤＮＡ配列と同一であることが判明された、再配列されていないＶκ遺伝子の生成物であるＶκ様タンパク質の同定または分子特徴づけが報告された。ところが、Ｆｎａｎｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １３：５９３７−４３（１９９４）には、Ｂ細胞前駆体の表面でμ重鎖と会合し、それによりＢ細胞発達のためのλ５経路の代替法を提供する能力を有する、再配列された生殖細胞系ＪＣｋの同定および特徴づけが報告されている。
【００１２】
κ様およびλ様のプレＢＣＲが協調的に作用して軽鎖再配列を促進し、Ｂ細胞始原を確実に成熟させることが提案された。レビューについては、ＭｃＫｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：４０４３（２００６）を参照されたい。
【００１３】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの設計および生成の更なる詳細は、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号、２００８年７月１１日出願の米国特許仮出願第６１／１３４，９２９号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に提供されている。
【００１４】
代替軽鎖は、プレＢ細胞上でのタンパク質産生および細胞外提示を可能にするリーダー配列を有する。しかし、典型的には、設計された代替軽鎖構造体の組換え発現は、同一の重鎖を用いた抗体よりも低いことが見出されている。それ故、代替軽鎖構造体の組換え発現の効率を改善することが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、少なくとも一部は、非相同性リーダー配列を用いることにより、代替軽鎖構造体の組換え発現の効率を顕著に改善しうるという実験的発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様において、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣポリペプチドを含有するＳＬＣ構造体をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態において、ＳＬＣポリペプチドとしては、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢポリペプチドは、天然型ＶｐｒｅＢ１配列、天然型ＶｐｒｅＢ２配列、天然型ＶｐｒｅＢ３配列、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、天然型ＶｐｒｅＢ配列は、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ様ポリペプチド、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の一実施形態において、λ５ポリペプチドは、配列番号７のヒトλ５様、配列番号８のヒトλ５ポリペプチド、配列番号９のヒトλ５ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の実施形態において、ＳＬＣポリペプチドとしては、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の一実施形態において、Ｖκ様ポリペプチド配列は、配列番号１２〜２４、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、ＪＣκポリペプチド配列は、配列番号２６〜３９、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。
【００１７】
別の態様において、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＳＬＣポリペプチドをコードした単離された核酸分子を提供し、ＳＬＣポリペプチドとしては、ＳＬＣポリペプチド融合体、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。一実施形態において、ＳＬＣ融合体としては、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢポリペプチド配列およびλ５ポリペプチド配列の融合は、それぞれＶｐｒｅＢ配列およびλ５配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。別の一実施形態において、ＶｐｒｅＢポリペプチド配列は、カルボキシ末端で、λ５ポリペプチド配列のアミノ末端に連結されている。一実施形態において、ＳＬＣ融合体としては、Ｖκ様−ＪＣκポリペプチド融合体、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の実施形態において、Ｖκ様ポリペプチド配列およびＪＣκポリペプチド配列の融合は、それぞれＶκ様配列およびＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。別の一実施形態において、Ｖκ様ポリペプチド配列は、カルボキシ末端で、ＪＣκポリペプチド配列のアミノ末端に融合されている。
【００１８】
別の一態様において、本発明は、非ＳＬＣ分子を含有するＳＬＣ融合体を提供する。一実施形態において、ＳＬＣ融合体は、非ＳＬＣ分子と、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、およびＪＣκ配列の少なくとも１つとを含有する。別の実施形態において、非ＳＬＣ分子は、非ＳＬＣポリペプチドであってもよい。一実施形態において、融合体は、非ＳＬＣポリペプチドに融合されたλ５配列またはＶｐｒｅＢ配列を含む。別の一実施形態において、融合は、ＶｐｒｅＢ配列またはλ５配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。幾つかの実施形態において、λ５配列のＮ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＣ末端に融合されているか、またはＶｐｒｅＢ配列のＶ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＮ末端に融合されている。別の一実施形態において、融合体は、非ＳＬＣポリペプチドに融合されたＶκ様またはＪＣκ配列を含む。別の一実施形態において、融合は、Ｖκ様配列またはＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。幾つかの実施形態において、ＪＣκ配列のＮ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＣ末端に融合されているか、またはＶκ様配列のＣ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＮ末端に融合されている。一実施形態において、本発明は、ＳＬＣポリペプチドが非ＳＬＣ分子を含有するＳＬＣ融合ポリペプチドを含む、ＳＬＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
全ての実施形態において、非相同性分泌リーダー配列は、抗体、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、消化酵素、および細胞外マトリックスの成分からなる群より選択される分泌されたポリペプチドのリーダー配列であってもよい。一実施形態において、サイトカインは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β（ＴＮＦ−αおよび−β）；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子からなる群より選択される分泌された他のポリペプチドからなる群より選択されてもよい。
【００２０】
全ての実施形態において、分泌リーダー配列は、ヒトおよび非ヒトホ乳類アルブミン、トランスフェリン、ＣＤ３６、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ならびにニューブラスチンのリーダー配列からなる群より選択されてもよい。
【００２１】
全ての実施形態において、分泌リーダー配列は、合成配列であってもよい。
【００２２】
全ての実施形態において、分泌リーダー配列は、天然型分泌リーダー配列のコンセンサス配列であってもよい。
【００２３】
全ての実施形態において、非相同性シグナル配列は、配列番号３６（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）であってもよい。
【００２４】
全ての実施形態において、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２５】
一態様において、本発明は、ベクターおよび組換え宿主細胞を提供する。全ての実施形態において、ベクターは、本明細書に記載された核酸分子を含有していてもよい。全ての実施形態において、組換え宿主細胞は、本明細書に記載された核酸で形質転換されていてもよい。
【００２６】
別の態様において、本発明は、組換え宿主細胞内での代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドまたはＳＬＣ構造体の発現方法を提供する。一実施形態において、その方法は、ＳＬＣポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、組換え宿主細胞を、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体をコードする核酸分子で形質転換するステップを含む。別の一実施形態において、組換え宿主細胞は、真核細胞である。別の一実施形態において、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。幾つかの実施形態において、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体は、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、およびＶκ様−ＪＣκポリペプチド融合体の１種以上を含むＳＬＣポリペプチドからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】天然型リーダー配列を有する配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列；配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２配列；配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３様配列；図１１で「ＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌ」（配列番号５）と称された「三量体」内のトランケート型ＶｐｒｅＢ１の配列；ならびにマウスＩｇκリーダー配列を有する配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列を示す。下線は、ＶｐｒｅＢアミノ酸配列内のリーダー配列を示す。
【図２】配列番号７のヒトλ５様配列；配列番号８のヒトλ５配列；図１１で「λ５ ｄＴａｉｌ」（配列番号９）と称された「三量体」内のトランケート型λ５配列；ならびにマウスＩｇκリーダー配列を有する配列番号１０のヒトλ５ ｄＴａｉｌ配列を示す。下線は、λ５アミノ酸配列内のリーダー配列を示す。
【図３】配列番号３５としてのヒトＶｐｒｅＢ１−λ５キメラアミノ酸配列を示す（マウスＩｇκリーダー配列に下線）。
【図４Ａ】および
【図４Ｂ】（Ａ）配列番号１１のヒトＶκ様ヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（ＡＪ００４９５６；配列番号１２）（天然型リーダー配列に下線）、ならびに（Ｂ）それぞれがＡＪ００４９５６Ｖκ様プロトタイプ配列（配列番号１２）に直線状に並んだ、異なる長さの伸長（配列番号１３〜２４）を含む、Ｖκファミリー全てからの可能なＶκ様タンパク質の予測される成熟アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測される成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には２本の下線を、潜在的リーダー開裂配列には１本の下線を付す）、（Ｂ）残りのκＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）からの予測されるＪＣκ様アミノ酸配列（配列番号２７〜３１）、ならびに（Ｃ）追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付したＪＣκ（配列番号３２）、追加されたマウスＩｇκリーダー配列のみに下線を付した組換えＪＣκ（配列番号３３）、および追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付した予測されるプロセッシングＪＣκ（配列番号３４）、を含むＪＣｋを設計された分泌最適化バリアント示す。
【図５Ｂ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測される成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には２本の下線を、潜在的リーダー開裂配列には１本の下線を付す）、（Ｂ）残りのκＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）からの予測されるＪＣκ様アミノ酸配列（配列番号２７〜３１）、ならびに（Ｃ）追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付したＪＣκ（配列番号３２）、追加されたマウスＩｇκリーダー配列のみに下線を付した組換えＪＣκ（配列番号３３）、および追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付した予測されるプロセッシングＪＣκ（配列番号３４）、を含むＪＣｋを設計された分泌最適化バリアント示す。
【図５Ｃ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測される成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には２本の下線を、潜在的リーダー開裂配列には１本の下線を付す）、（Ｂ）残りのκＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）からの予測されるＪＣκ様アミノ酸配列（配列番号２７〜３１）、ならびに（Ｃ）追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付したＪＣκ（配列番号３２）、追加されたマウスＩｇκリーダー配列のみに下線を付した組換えＪＣκ（配列番号３３）、および追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付した予測されるプロセッシングＪＣκ（配列番号３４）、を含むＪＣｋを設計された分泌最適化バリアント示す。
【図６】ＶｐｒｅＢおよびλ５配列により形成された代替軽鎖の略図、代替軽鎖配列を含む例示的な融合ポリペプチド、ならびにＶ−Ｊ結合から得られた抗体軽鎖構造である。
【図７】様々な代替軽鎖欠失および一本鎖構造体の略図である。
【図８】代替軽鎖構造体への組み合わせ的機能多様性（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）の組込みを概略的に図示している。
【図９】様々な例示的代替軽鎖構造体の遺伝子およびタンパク質構造を示す。
【図１０】代替軽鎖（ＳＬＣ）成分に機能性を加える様々な代表的方法を示す。
【図１１】様々な三量体および二量体代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体を示す。
【図１２】様々なヘテロ二量体代替κ軽鎖欠失バリアントの略図である。「完全長」構造体において、Ｖκ様およびＪＣκ配列は両者とも、それぞれＣ−末端およびＮ−末端の伸長（テール）を保持している。ｄＪバリアントでは、ＪＣκのＮ−末端伸長が欠失されている。ｄＶκテールバリアントでは、Ｖκ様配列のＣ−末端伸長が、除去されているが、ＪＣκのＮ−末端伸長は保持されている。「短κ」バリアントでは、Ｖκ様配列のＣ末端テールおよびＪＣκ配列のＮ−末端伸長は両者とも、保持されている。
【図１３】個別に、または別のタンパク質、例えば、抗体重鎖またはそのフラグメントと一緒に用いることができる、κ様軽鎖欠失および一本鎖構造体。
【図１４】κ様代替軽鎖構造体への組み合わせ的機能多様性の組込み。赤線は、追加された多様性、例えば、ペプチドライブラリーを示す。
【図１５】軽鎖は、遺伝子再配列およびＲＮＡプロセッシングの生成物である。
【図１６Ａ】Ｖκ様タンパク質が再配列されていないＶκＩＶ−遺伝子転写および翻訳から得られることを示す。ＶκＩＶは、７１のＶＬ生殖細胞系遺伝子のうちの１つである。Ｖκ様タンパク質を作製することが可能なＶＬ生殖細胞系遺伝子は更に７０存在するため、κＶ遺伝子は更に３９、そしてλＶ遺伝子は更に３１存在する。
【図１６Ｂ】ＪＣκが、再配列されていないＪおよびＣ生殖細胞系からのプロセッシングＲＮＡの生成物であることを示す。ＪＣκは、４５のＪＣ生殖細胞系の組み合わせのうちの１つである。ＪＣκ様タンパク質を作製することが可能なＶＬ生殖細胞系遺伝子が更に４４存在し、つまりＣκを組み合わせるＪκ遺伝子が更に４、そして１０のＣλ遺伝子と組み合わせるＪλ遺伝子が更に４存在する（合計４０）。
【図１７】κ様代替軽鎖成分に機能性を加えた略図を示す。二機能性および三機能性構造を示す。Ａ：ｓｃＦｖを制約された融合体；Ｂ：Ｖκ様−ｓｃＦｖ融合体；Ｃ：ＪＣκ−ｓｃＦｖ融合体；ＳＬＣ二重融合。
【図１８】代替軽鎖の機能的テール伸長のタイプを示す。
【図１９】κ様およびλ様代替軽鎖機能的キメラを示す。
【図２０】（Ａ）Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成、（Ｂ）二機能性および二重特異性Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成、ならびに（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）に表わされた分子のクローニング方策を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
他に断りがなければ、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）は、本願で用いられる多くの用語の概説を当業者に提供する。
【００２９】
当業者には、本発明の実践で用いられうる、本明細書に記載されたものと類似または同一の多くの方法および材料が認識されよう。事実、本発明は、記載された方法および材料に限定されない。本発明の目的では、次の用語を以下の通り定義する。
【００３０】
本願全体を通して、単数形の使用は、他に明記されない限り、複数形を包含する。
【００３１】
本願において、「または」の使用は、他に明記されない限り、「および／または」を包含する。
【００３２】
更に用語「包含する」、「はじめとする」、および「包含された」は、限定されていない。
【００３３】
本発明の文脈において、用語「抗体（Ａｂ）」は、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子組換えから得られた伝統的組換え重鎖およびＶＪ遺伝子組換えから得られた伝統的組換え軽鎖、またはそれらのフラグメントからの天然型抗体を指すために用いられる。
【００３４】
「天然型抗体」は、２つの同一軽（Ｌ）鎖および２つの同一重（Ｈ）鎖で構成された約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、ジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に、可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端の可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端の定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと直線状に並べられ、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと直線状に並べられている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に境界を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００３５】
抗体鎖に関連する用語「可変」は、抗体の間で配列が広範囲にわたって異なり、特定抗原に対する各特定抗体の結合および特異性に関与する、抗体鎖の部分を指すために用いられる。そのような可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の高度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然型重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、３つの高度可変領域により接続されたβシート配置を大きく採用し、それがループ接続を形成し、幾つかの例ではβシート構造の一部を形成している。各鎖の高度可変領域は、ＦＲによって接近してまとめられていて、別の鎖の高度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），ｐ６４７−６６９参照）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与せず、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などを示す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「高度可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高度可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（即ち、軽鎖可変ドメイン内の３０〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）および８６〜９６（Ｌ３）の残基、ならびに重鎖可変ドメイン内の３０〜３５（ＨＩ）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）の残基；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））を含む。
【００３７】
用語「フレームワーク領域」は、より異なるＣＤＲ領域の間に存在する、当該技術分野で認識された抗体可変領域の部分を指す。そのようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれ、重鎖または軽鎖抗体可変領域内に見出される３つのＣＤＲを、三次元空間に保持するための足場を提供することで、ＣＤＲが抗原結合表面を形成することができる。
【００３８】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なる分類に割り付けることができる。抗体には５つの主要な分類、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらの複数は、亜分類（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に更に分別される場合がある。好ましい実施形態において、本発明のイムノアドヘシンの構築に用いられる免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖ドメインのものである。ヒトイムノアドヘシンでは、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を用いることの主な利点は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンが固定化プロテインＡ上で効率的に精製されうることである。しかし、特定のイムノアドヘシン構築用にＩｇ融合パートナーを選択する場合には、別の構造的および機能的性質を考慮すべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、より長く、より可撓性があるため、より大きな「アドヘシン」ドメインを収容することができ、ＩｇＧ１に融合されると適切にフォールディングまたは機能しない可能性がある。別の考慮すべき事柄は、結合価かもしれず、ＩｇＧイムノアドヘシンは、二価ホモ二量体であるが、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、基本的なＩｇホモ二量体単位の、それぞれ二量体または五量体構造をもたらす可能性がある。インビボ適用のために設計されたＶＥＧＦ受容体Ｉｇ様ドメイン／免疫グロブリンキメラでは、Ｆｃ領域に特有の薬物動態性およびエフェクター機能も重要となる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は全て、インビボ半減期２１日を有するが、補体系を活性化させる際のそれらの相対的能力は異なる。その上、様々な免疫グロブリンが、様々な数のアロタイピックアイソタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｉｃ ｉｓｏｔｙｐｅｓ）を有する。
【００３９】
異なる分類の免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４０】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種の明確に異なる型の一方に割り付けることができる。本明細書における抗体軽鎖の任意の参照は、κおよびλの両方の軽鎖を包含する。
【００４１】
「抗体フラグメント」は、一般に抗原が結合した、完全長抗体の一部、またはその可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例としては、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、および（ｓｃＦｖ）２フラグメントが挙げられる。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「抗体結合領域」は、抗原に結合しうる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の１部分以上を指す。典型的には、抗体結合領域は、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）（またはその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（またはその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、抗体軽鎖と重鎖の混合体（またはその可変領域）、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン、もしくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、または完全長抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体である。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、アミノ酸が少なくとも約３〜５、好ましくは少なくとも約５〜１０、または少なくとも約５〜１５、典型的には約５００以下または約１０００以下の配列を指し、単独で、またはより大きな配列の一部として、そのような配列に応答して生成された抗体に結合している配列を定義する。エピトープは、由来する親タンパク質の部分と同一の配列を有するポリペプチドに限定されない。事実、ウイルスゲノムは、不断に変化する状態にあり、単離物の間に比較的高度の変動性が示される。したがって用語「エピトープ」は、天然型配列と同一の配列に加え、天然型配列への修飾、例えば欠失、置換および／または挿入を包含する。一般にそのような修飾は、本質的に保存的であるが、非保存的修飾も企図される。その用語は、具体的には「ミモトープ」、即ち、連続した直線状天然型配列を画定しない配列、または天然型タンパク質中には必ずしも生じないが、天然型タンパク質上のエピトープを機能的に模倣している配列を包含する。用語「エピトープ」は、具体的には線形および立体配座エピトープを包含する。
【００４４】
用語「代替軽鎖ポリペプチド」または「ＳＬＣポリペプチド」は、本明細書では、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのバリアントを指すために用いられる。
【００４５】
用語「非代替軽鎖分子」または「非ＳＬＣ分子」は、本明細書では、ＳＬＣポリペプチドでない分子を指すために用いられる。非ＳＬＣ分子は、ポリペプチド、例えば、サイトカインまたは抗体フラグメントであってもよい。
【００４６】
用語「ＶｐｒｅＢ」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、詳細には、非限定的に、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３様配列、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴをはじめとする任意の天然型配列またはバリアントＶｐｒｅＢポリペプチド、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、そのような天然型配列ポリペプチドのバリアントをはじめとするアイソフォームを指す。
【００４７】
用語「λ５」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、詳細には、非限定的に、配列番号６のヒトλ５、配列番号７のヒトλ５様タンパク質、配列番号９として示されるヒトλ５ ｄＴ、配列番号１０のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、そのような天然型配列λ５ポリペプチドのバリアントをはじめとするアイソフォームを指す。
【００４８】
用語「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」および「ＶｐｒｅＢポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書ではアミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列ＶｐｒｅＢポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、好ましくは天然型配列ＶｐｒｅＢポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントＶｐｒｅＢポリペプチドとしては、非限定的に、ＶｐｒｅＢ配列のＣ末端の非Ｉｇ様ユニークテールが部分的または完全に除去されているＶｐｒｅＢポリペプチドが挙げられる。
【００４９】
用語「バリアントλ５ポリペプチド」および「λ５ポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書では、アミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列λ５ポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントλ５ポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントλ５ポリペプチド」は、好ましくは天然型配列λ５ポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントλ５ポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントλ５ポリペプチドとしては、非限定的に、λ５配列のＮ末端のユニークテールが部分的または完全に除去されているλ５ポリペプチドが挙げられる。
【００５０】
用語「バリアントＶκ様ポリペプチド」および「Ｖκ様ポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書では、アミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列Ｖκ様ポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、好ましくは天然型配列Ｖκ様ポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントＶκ様ポリペプチドとしては、非限定的に、Ｖκ様配列のＣ末端の非Ｉｇ様ユニークテールが部分的または完全に除去されているＶκ様ポリペプチドが挙げられる。
【００５１】
用語「バリアントＪＣκポリペプチド」および「ＪＣκポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書では、アミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列ＪＣκポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントＪＣκポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントＪＣκポリペプチド」は、好ましくは天然型配列ＪＣκポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントＪＣκポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントＪＣκポリペプチドとしては、非限定的に、ＪＣκ配列のＮ末端のユニークテールが部分的または完全に除去されているＪＣκポリペプチドが挙げられる。
【００５２】
アミノ酸配列同一性の百分率は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いて決定してもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、からダウンロードしてもよく、さもなければメリーランド州ベセスダのアメリカ国立衛生研究所から得てもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、複数の研究パラメータを利用しており、それらの研究パラメータの全てが、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ ｆｏｒ ｆｉｎａｌ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５、ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、をはじめとするデフォルト値に設定される。
【００５３】
用語「ＶｐｒｅＢ配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「ＶｐｒｅＢ」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５４】
用語「λ５配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「λ５」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５５】
用語「Ｖκ様配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「Ｖκ様」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５６】
用語「ＪＣκ配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「ＪＣκ」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「λ様代替軽鎖」は、ＶｐｒｅＢとλ５タンパク質との非共有結合的会合により形成される二量体を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「κ様代替軽鎖」は、Ｖκ様とＪＣκタンパク質との非共有結合的会合により形成される二量体を指す。
【００５９】
本明細書に定義される用語「λ様代替軽鎖」は、本明細書の先に定義された「ＶｐｒｅＢ配列」および／または「λ５配列」を含む任意のポリペプチド配列を意味する。具体的には、本明細書に定義される「λ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴ；および配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、それらのフラグメントおよびバリアントをはじめとする様々なアイソフォームが挙げられる。加えて用語「λ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号７のヒトλ５配列、配列番号８のヒトλ５様配列、配列番号９として示されるヒトλ５ ｄＴａｉｌ、配列番号１０のヒトλ５ ｄＴａｉｌ、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、それらのフラグメントおよびバリアントをはじめとするアイソフォームが挙げられる。加えて用語「λ様代替軽鎖配列」としては、本明細書の先に定義されたＶｐｒｅＢおよびλ５の両方の配列を含む配列が挙げられる。
【００６０】
本明細書に定義される用語「κ様代替軽鎖配列」は、本明細書の先に定義された「Ｖκ様配列」および／または「ＪＣκ」を含む任意のポリペプチド配列を意味する。具体的には、本明細書に定義される「κ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号１２〜２４のいずれかのヒトＶκ様配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、それらのフラグメントおよびバリアントをはじめとする様々なアイソフォームが挙げられる。加えて「κ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号１２〜２４のいずれかのヒトＶκ様配列、配列番号２５〜３５のいずれかのヒトＪＣκ配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、そのフラグメントおよびバリアントをはじめとするアイソフォームが挙げられる。加えて用語「κ様代替軽鎖配列」としては、本明細書の先に定義されたＶκ様およびＪＣκの両方の配列を含む配列が挙げられる。
【００６１】
用語「代替軽鎖構造体」は、最も広い意味で用いられ、異種アミノ酸配列、核酸、および代替軽鎖配列にコンジュゲートされた別の分子をはじめとする任意の、そして全ての追加の異種成分を包含し、「コンジュゲーション」は、以下に定義する。
【００６２】
「代替軽鎖構造体」は、本明細書では、「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ（商標）」または「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ」とも呼ばれ、その２つの用語は、互換的に用いられる。特定のＳｕｒｒｏｂｏｄｙ（商標）λ様代替軽鎖構造体は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１および２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に開示されている。同じく企図されるのは、米国特許公開第２０１０−００６２９５０号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に記載されたκ様代替軽鎖構造体であり、それらの開示の全体は、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
【００６３】
本発明のポリペプチドの文脈において、第一のアミノ酸配列に関する用語「異種アミノ酸配列」は、第一のアミノ酸配列に自然に会合されておらず、少なくとも第一のアミノ酸配列が本明細書の代替軽鎖構造体内に存在する形態ではないアミノ酸配列を指すために用いられる。したがって、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、またはＪＣκに関する「異種アミノ酸配列」は、その天然の環境において、天然型ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、またはＪＣκと会合されていない任意のアミノ酸配列である。これらには、非限定的に、ｉ）ＶｐｒｅＢと共に発達中のＢ細胞上に代替軽鎖を形成するそれらのλ５配列とは異なるλ５配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたλ５配列；ｉｉ）λ５と共に発達中のＢ細胞上に代替軽鎖を形成するそれらのＶｐｒｅＢ配列とは異なるＶｐｒｅＢ配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたＶｐｒｅＢ配列；ｉｉｉ）ＪＣκ様と共に発達中のＢ細胞上にκ様代替軽鎖を形成するそれらのＶκ様配列とは異なるＶκ様配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたＶκ様配列；ならびにｉｖ）Ｖκ様と共に発達中のＢ細胞上にκ様代替軽鎖を形成するそれらのＪＣκ配列とは異なるＪＣκ配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたＪＣκ配列が挙げられる。
【００６４】
ＶｐｒｅＢまたはλ５に関する「異種アミノ酸配列」は、天然の環境では、ＶｐｒｅＢまたはλ５配列は互いに共有結合的に会合、例えば融合されていないため、天然型配列ＶｐｒｅＢまたはλ５をはじめとする対応するＶｐｒｅＢまたはλ５と共有結合的に会合、例えば融合されている、ＶｐｒｅＢまたはλ５配列も包含する。同様に、Ｖκ様またはＪＣκに関する「異種アミノ酸配列」は、天然の環境では、Ｖκ様またはＪＣκ配列は互いに共有的に会合、例えば融合されていないため、天然型配列Ｖκ様またはＪＣκをはじめとする対応するＶκ様またはＪＣκと共有結合的に会合、例えば融合されている、Ｖκ様またはＪＣκ配列も包含する。異種アミノ酸配列としては、非限定的に、抗体および重鎖配列をはじめとする抗体配列ならびにそれらのフラグメント、例えば、抗体軽鎖および重鎖可変領域配列、ならびに抗体軽鎖および重鎖定常領域配列も挙げられる。
【００６５】
用語「コンジュゲート」、「コンジュゲートされた」および「コンジュゲーション」は、共有結合または非共有結合の任意の、そして全ての形態を指し、非限定的に、直接遺伝子融合または化学的融合、リンカーまたは架橋剤を介したカップリング、そして例えば、ファンデルワールス力を介した、またはロイシンジッパーを用いた非共有結合的会合が挙げられる。
【００６６】
用語「可撓性リンカー」は、本明細書では、化学構造に基づけば、意図された文脈および環境において三次元空間に固定されていると予測されない任意のリンカーを指すために用いられる。
【００６７】
用語「融合」は、本明細書では、１本のポリペプチド鎖内の異なる起点のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をインフレームで組み合わせることによって、それらのアミノ酸配列を組み合わせることを指すのに用いられる。用語「融合」は、その末端の１つと融合することに加えて、内部融合、即ちポリペプチド鎖内の異なる起点の配列を挿入することを明示的に包含する。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は全て、共有結合的「ペプチド結合」によって連結されたアミノ酸の一次配列を指す。一般に、ペプチドは、少数のアミノ酸、典型的には約２〜約５０のアミノ酸からなり、タンパク質よりも短い。本明細書で定義される用語「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質を包含する。
【００６９】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、典型的には、当該技術分野で認識された定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されるアミノ酸を指すが、修飾アミノ酸、合成アミノ酸または希アミノ酸を所望どおり使用してもよい。したがって、具体的には３７ ＣＦＲ １．８２２（ｂ）（４）に列挙された修飾および異常アミノ酸は、この定義に含まれ、本明細書に参照により明確に組み込まれる。アミノ酸は、様々な亜群に細分することができる。したがってアミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負電荷の側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正電荷の側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を有するとして分類することができる。アミノ酸は、小アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）および塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）として分類することもできる。
【００７０】
用語「ポリヌクレオチド」は、核酸、例えば、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ならびにそれらの類似体（例えば、ヌクレオチド類似体または核酸化学を利用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、所望通り、例えば当該技術分野で認識された核酸化学を利用して、合成的に生成し、または例えばポリメラーゼを用いて、酵素的に生成し、そして所望なら修飾してもよい。典型的な修飾としては、メチル化、ビオチン化、および当該技術分野で公知の別の修飾が挙げられる。加えて核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよく、所望ならば、検出可能な部分と連結させることができる。
【００７１】
参照ポリペプチドに関する用語「バリアント」は、天然型ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異または修飾（すなわち、改変）を有するポリペプチドを指す。「アミノ酸修飾」により生成されたバリアントは、例えば、天然型アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失、挿入および／または化学修飾することによって生成することができる。
【００７２】
「アミノ酸修飾」は、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を指す。例示的な修飾としては、アミノ酸置換、挿入および／または欠失が挙げられる
【００７３】
特定の位置「でのアミノ酸修飾」は、特定の残基の置換もしくは欠失、または特定の残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基に「隣接する」挿入は、その１つまたは２つの残基の内部の挿入を意味する。挿入は、Ｎ末端またはＣ末端から特定の残基までに存在してもよい。
【００７４】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列内の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基を、別の異なる「交換」アミノ酸残基で交換することを指す。交換残基は、「天然アミノ酸残基」（即ち、遺伝子コードによりコードされている）であってもよく、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リシン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されてもよい。１つ以上の非天然アミノ酸残基での置換も、本明細書でのアミノ酸置換の定義に包含される。
【００７５】
「非天然アミノ酸残基」は、先に列挙された天然アミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基と共有結合できる残基を指す。非天然アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよびＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１ ３３６（１９９１）に記載されるような別のアミノ酸残基類似体が挙げられる。そのような非天然アミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．の上記文献の手順を用いることができる。簡潔に述べると、これらの手順は、非天然アミノ酸残基によりサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化させて、ＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を行うことを含む。
【００７６】
「アミノ酸挿入」は、少なくとも１つのアミノ酸を所定のアミノ酸配列に組込むことを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、本願は、より大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５または最大約１０のアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入された残基は、先に開示された通り天然または非天然のものであってもよい。
【００７７】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【００７８】
用語「突然変異誘発」は、他に明記されていなければ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための、任意の当該技術分野で認識された技術を指す。突然変異誘発の好ましいタイプとしては、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、または別の部位特異的突然変異誘発が挙げられる。
【００７９】
「部位特異的突然変異誘発」は、当該技術分野における技術標準であり、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施して、限定されたミスマッチ以外の変異を誘発させると、所望の突然変異が現れる。簡潔に述べると、合成オリゴヌクレオチドを、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な鎖の合成を導くプライマーとして用い、得られた二本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌（ｐｈａｇｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）内に形質変換させる。形質転換された細菌の培養物を上層寒天に塗布し、ファージを含む単細胞からのプラーク形成を可能にする。理論的には、新しいプラークの５０％が、突然変異形態を一本鎖として有するファージを含有し、５０％が本来の配列を有する。完全一致のハイブリダイゼーションが可能であるが、本来の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを防止するのに十分となる温度で、該当するプラークを、キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズすることによって選択する。その後、プローブとハイブリダイズするプラークが選択され、配列決定および培養されて、ＤＮＡが回収される。
【００８０】
用語「ベクター」は、細胞内での自己複製が可能で、ＤＮＡセグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドが作動可能に連結されることで、結合したセグメントの複製をもたらすことができるｒＤＮＡ分子を指すために用いられる。１種以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導くことが可能なベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。用語「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、特定の宿主生物中の作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した制御配列としては、プロモータ、場合によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを用いることが公知である。ベクターは、追加のＤＮＡセグメントにライゲートされている場合がある環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」であってもよい。ベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされている場合があるファージベクターまたはウイルスベクターであってもよい。適切なベクター、例えば、細菌起源を有する細菌ベクターまたは複製およびエピソームホ乳類ベクターは、導入される宿主細胞内で自己複製が可能である。ベクターは、宿主細胞に導入する際、宿主細胞ゲノム、例えば、非エピソームホ乳類ベクターに合体させて、宿主ゲノムと一緒に複製してもよい。
【００８１】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係にある場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモータもしくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接すること、そして分泌リーダーの場合、隣接し、かつ読み取り期（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって果される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実践法に従って使用する。
【００８２】
「ファージディスプレイライブラリー」は、クローン化されたタンパク質配列の回収物をファージコートタンパク質との融合体として発現するタンパク質発現ライブラリーである。したがって、語句「ファージディスプレイライブラリー」は、本明細書では、外来（一般には非相同性）タンパク質を発現するファージ（例えば、繊維状ファージ）の回収物を指す。外来タンパク質は、ファージと接触している別の部分と自由に相互作用（結合）することができる。外来タンパク質を提示する各ファージは、ファージディスプレイライブラリーの「メンバー」である。
【００８３】
用語「繊維状ファージ」は、異種ポリペプチドを表面に提示することができるウイルス粒子を指し、非限定的に、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ１、およびＭ１３が挙げられる。繊維状ファージは、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）を含有していてもよい。様々な繊維状ファージディスプレイシステムが、当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８（１９８８）参照）。
【００８４】
用語「パンニング」は、標的に対する親和力および特異性が高い、抗体などの化合物を運搬する化合物を同定および単離する際の複数回のスクリーニング工程を指すために用いられる。
【００８５】
「リーダー配列」、「シグナルペプチド」、または「分泌リーダー」は、互換的に用いられ、一部であるポリペプチドの細胞内輸送を導くアミノ酸残基を含む配列を含有する。ポリペプチドは、典型的にはＮ末端に、分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列を含有する。これらのポリペプチドは、リーダー配列がシグナルエンドペプチターゼによりポリペプチドの残り部分から開裂されうる開裂部位を含んでいてもよい。そのような開裂により、成熟ポリペプチドが生成する。開裂は、典型的には、分泌の間に、またはインタクトポリペプチドが適切な細胞内コンパートメントに導かれた後に起こる。
【００８６】
「宿主細胞」は、本明細書に記載された分子をコードする核酸および／または核酸含有ベクターの形質転換のレシピエントとなりうる、またはレシピエントになった個々の細胞または細胞培養物を包含する。本発明の方法において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞であってもよい。別の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８７】
Ｂ．詳細な説明
本発明の方法を実施する技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｏ’Ｂｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｈｉｃｋｌｅ ａｎｄ Ｆｉｔｃｈ，ｅｄｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ，Ｔ．Ｒ．Ｇｌａｒｅ ａｎｄ Ｍ．Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２０００；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００１；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，ｅｄ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ，２００４をはじめとする標準的な実験教書に記載されている。突然変異誘発は、例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５））を利用して実施することができる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号に、ならびに「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）をはじめとする複数の教書に記載されている。
【００８８】
非相同性リーダー配列
ヒトＶｐｒｅＢ１（ＣＡＧ３０４９５）の主なアイソフォームは、１９アミノ酸のリーダー配列を含む１４５アミノ酸長のポリペプチド（図１の配列番号１）である。類似のリーダー配列が、別のＶｐｒｅＢポリペプチド内に存在する。ヒトトランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（天然型ＶｐｒｅＢ１のＣ末端にある特徴的「テール」が欠如）は、「ＶｐｒｅＢ１ ｄＴａｉｌ配列」とも呼ばれ、配列番号５として示される。
【００８９】
ヒトλ５（ＣＡＡ１０９６２）の主なアイソフォームは、３０アミノ酸のリーダー配列を含む２０９アミノ酸長のポリペプチド（配列番号７）である。類似のリーダー配列が、別のλ５ポリペプチド内に存在する。ヒトトランケート型λ５配列（天然型λ５のＮ末端にある特徴的「テール」が欠如）は、「λ５ ｄＴａｉｌ配列」とも呼ばれ、配列番号９として示される。
【００９０】
具体的には、天然型ヒトＶκ様ポリペプチド配列としては、非限定的に、２０アミノ酸のリーダー配列を含む配列番号１１として示されるＡＪ００４９５６のポリヌクレオチドによりコードされた、ヒトκ様ポリペプチド（配列番号１２）が挙げられる。類似のリーダー配列が、別のＶκ様ポリペプチド内に存在する。
【００９１】
天然型配列ＪＣκ様ポリペプチドとしては、非限定的に、潜在的な２２アミノ酸のリーダー配列を含み、そのうちの１５のアミノ酸が伝統的に組換えられたＪＣκ配列に特有に付加されている、プロトタイプリーダー配列（配列番号２６）が欠如した、図５Ａに示されたＡＡＢ３２９８７ ヒトＪＣκポリペプチドが挙げられる。類似の組換えリーダー配列が、別のＪＣκポリペプチド内に存在する。
【００９２】
本発明は、代替軽鎖構造体が、内在性リーダーＶｐｒｅＢリーダー配列および／もしくはλ５リーダー配列、または内在性Ｖκ様リーダー配列および／もしくはＪＣκリーダー配列を含む配列から生成された場合よりも高い収率で、代替軽鎖構造体を生成するための核酸およびポリペプチド構造体を提供する。本発明は、代替軽鎖構造体が、ＶｐｒｅＢ配列および／もしくはλ５の内在性リーダー、またはＶκ様および／もしくはＪＣκの内在性リーダーのコード配列を含むか、あるいは内在性リーダー配列を含まずにＤＮＡ配列から生成された場合よりも高い収率で、代替軽鎖構造体を生成するためのベクター、宿主細胞および方法も提供する。より高い収率は、少なくとも１種の内在性分泌リーダー配列を、本発明の非相同性リーダー配列と交換することにより実現される。したがって本発明は、非相同性リーダー配列を含む、代替軽鎖および代替軽鎖構造体を提供する。
【００９３】
好ましくは、非相同性リーダーペプチドにより実現される発現レベルは、発現が本質的に同じ条件下で実施される場合に、相同性リーダー配列を用いて実現される発現レベルよりも、少なくとも約５％高い、少なくとも約１０％高い、少なくとも約２０％高い、少なくとも約３０％高い、少なくとも約４０％高い、または少なくとも約５０％高い。
【００９４】
本発明において、非相同性リーダー配列は、天然型ＶｐｒｅＢリーダー配列および／もしくは天然型λ５リーダー配列の代わりに代替軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に融合されるか、または天然型Ｖκ様リーダー配列および／もしくは天然型ＪＣκリーダー配列の代わりにκ様代替軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に融合される。本発明人は、代替軽鎖配列（一緒に融合されるか、または非共有結合的に会合されている、ＶｐｒｅＢ／λ５配列またはＶκ様／ＪＣκ配列）および抗体重鎖配列を含む代替軽鎖配列構造体の生成時に、代替軽鎖の天然型リーダー配列とは対照的に、特定の非相同性リーダー配列が意外にも良好に機能することを発見した。
【００９５】
本発明によれば、非相同性リーダー配列は、抗体軽鎖ならびにヒトおよび非ヒトホ乳類分泌タンパク質のリーダー配列をはじめとする、高度翻訳タンパク質からの任意のリーダー配列であってもよい。分泌タンパク質が含まれており、それらの配列は、一般のデータベース、例えばＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＲｅｆＳｅｑ、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＣＢＩ−Ｇｅｎｅから入手できる。加えて、ＳＰＤ、つまりウェブに基づく分泌タンパク質データベース、ｈｔｔｐ：／／ｓｐｄ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．で入手できる、そのような配列の供給源である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００５，３３：Ｄ１６９−Ｄ１７３）。そのような分泌タンパク質としては、非限定的に、抗体、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、消化酵素、および細胞外マトリックスの成分が挙げられる。
【００９６】
サイトカインのうちで含まれるのは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β（ＴＮＦ−αおよび−β）；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子である。
【００９７】
本発明の構造体での使用に適した追加のリーダー配列は、一般に入手可能なシグナルペプチドデータベース、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｓ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｑ／ｓｐｄｂでアクセス可能なＳＰｄｂシグナルペプチドデータベースに含まれる（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５，６：２４９参照）。
【００９８】
適切な非相同性リーダー配列の具体的な例としては、非限定的に、ヒトおよび非ヒトホ乳類アルブミン、トランスフェリン、ＣＤ３６、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ニューブラスチンのリーダー配列、ならびに別の分泌ヒトおよび非ヒトタンパク質からのリーダーペプチドが挙げられる。
【００９９】
マウスＩｇκリーダー配列は、非相同性リーダー配列として用いられてもよい（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ−配列番号３６）。
【０１００】
非相同性リーダー配列が、ｉ）ＶｐｒｅＢおよびλ５の両方の代替軽鎖構造体、またはｉｉ）Ｖκ様およびＪＣκの両方の代替軽鎖構造体、に存在する場合、ｉ）またはｉｉ）内の各非相同性リーダー配列は、他方と同一であってもよく、または他方と異なっていてもよい。
【０１０１】
天然型タンパク質からのシグナルペプチドに加えて、本発明の非相同性リーダー配列としては、消化されて、本質的に生じるリーダー配列の性能を更に改善することができ、本発明の代替軽鎖構造体の発現で用いられる宿主生物中での最良の性能のために特別に適合させることができる、合成およびコンセンサスリーダー配列が挙げられる。
【０１０２】
代替軽鎖構造体
本明細書の代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体は、抗体レパートリーの通常の発達時に生成されるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づいている。抗体とは異なり、プレＢＣＲは、２つの代替軽鎖成分、ＶｐｒｅＢおよびλ５と対になった抗体重鎖で構成された三量体である。ＶｐｒｅＢおよびλ５は両者とも、遺伝子再配列を受けない遺伝子によりコードされ、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの開始前に初期のプロＢ細胞内で発現される。プレＢＣＲは、１つの重鎖と、２つの非共有結合的に会合されたタンパク質：ＶｐｒｅＢおよびλ５とで構成された成熟免疫グロブリンとは、構造的に異なっており、即ちそれらは、抗体内の２つの成分とは対照的に３つの成分を有する。更に、ＶｐｒｅＢはＶλＩｇドメインと相同性があり、λ５は抗体のＣλドメインと相同性があるが、それぞれは、非標準のペプチド伸長を有し、ＶｐｒｅＢ１は、Ｃ末端に追加の２１の残基を有し；λ５は、Ｎ末端に５０アミノ酸の伸長を有する。Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの設計および生成の更なる詳細については、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に提供されている。
【０１０３】
同様に、本明細書に記載されたκ様代替軽鎖構造体は、プレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づいている。κ様軽鎖は、ＪＣκ融合遺伝子と組になった生殖細胞系ＶκＩＶ遺伝子である。これらの遺伝子のそれぞれにおいて、ペプチド伸長は、ＣＤＲ３と類似した部位の付近に存在する。これらの２種のタンパク質は、ゲノムレベルで組換えられていないようであるため、重鎖への会合が相互に排他的で、λ様代替軽鎖に記載された会合と類似していると思われる。κ様代替軽鎖構造体の設計および生成の更なる詳細については、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、米国特許公開第２０１０−００６２９５０号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に見出すことができる。
【０１０４】
本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドと、非相同性シグナル配列を含む代替軽鎖配列を有するＳＬＣポリペプチドを含有するＳＬＣ構造体とを企図する。一実施形態において、ＳＬＣ構造体は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、λ５配列にコンジュゲートされたＶｐｒｅＢ配列を含んでいてもよい。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、天然型ＶｐｒｅＢ１配列、天然型ＶｐｒｅＢ２配列、天然型ＶｐｒｅＢ３配列ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の一実施形態において、天然型ＶｐｒｅＢ配列は、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ様ポリペプチド、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の一実施形態において、λ５配列は、配列番号７のヒトλ５様、配列番号８のヒトλ５ポリペプチド、または配列番号９のヒトλ５ ｄＴａｉｌポリペプチドの全てまたは一部を含む。
【０１０５】
本発明は、λ５配列およびＶｐｒｅＢ配列が共有結合リンカーにより結合されている、ＳＬＣ構造体も企図する。一実施形態において、本発明は、λ５配列がＶｐｒｅＢ配列と非共有結合的に会合されている、ＳＬＣ構造体を提供する。別の一実施形態において、本発明は、前記ＶｐｒｅＢ配列とλ５配列とのコンジュゲートが抗体重鎖配列と非共有結合的に会合されている、ＳＬＣ構造体を企図する。
【０１０６】
本明細書に記載された通り、本発明は、ＳＬＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子、およびＳＬＣポリペプチドを含むＳＬＣ構造体に関する。一実施形態において、本発明は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、λ５配列に融合されたＶｐｒｅＢ配列を含む代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ペプチドまたはペプチドリンカーによりλ５配列に結合されたＶｐｒｅＢ配列を含む代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の一実施形態において、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、核酸で形質転換された組換え宿主細胞を提供する。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、代替軽鎖構造体のライブラリーを提供する。別の実施形態において、ライブラリーは、ＳＬＣをコードする核酸を含む。別の一実施形態において、ライブラリーは、ディスプレイの形態であってもよい。
【０１０８】
別の一態様において、本発明は、κ様代替軽鎖ポリペプチドと、κ様ＳＬＣポリペプチドを含むＳＬＣ構造体とを企図する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列にコンジュゲートされたＶκ様配列を含むκ様ＳＬＣ構造体に関する。別の実施形態において、Ｖκ様配列は、配列番号１２〜２４、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。他の一実施形態において、ＪＣκ配列は、配列番号２６〜３９、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、Ｖκ様配列が前記ＪＣκ配列に融合されている、κ様ＳＬＣ構造体を企図する。別の実施形態において、融合は、それぞれ前記Ｖκ様配列および前記ＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および前記ＪＣκ配列が共有結合リンカーにより結合されている、κ様ＳＬＣ構造体を企図する。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列が前記ＪＣκと非共有結合的に会合されている、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列と前記ＪＣκ配列とのコンジュゲートが抗体重鎖配列と非共有結合的に会合されている、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、前記分泌リーダー配列が合成配列であってもよい、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、前記分泌リーダー配列が天然型分泌リーダー配列のコンセンサス配列であってもよい、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、κ様ＳＬＣ構造体をコードする、単離された核酸を提供する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列に融合されたＶκ様配列を含むκ様代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ペプチドまたはペプチドリンカーによりＪＣκ配列に結合されたＶκ様配列を含むκ様代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の一実施形態において、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、核酸で形質転換された組換え宿主細胞を提供する。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、κ様代替軽鎖構造体のライブラリーを提供する。別の実施形態において、ライブラリーは、κ様ＳＬＣをコードする核酸を含む。別の一実施形態において、ライブラリーは、ディスプレイの形態であってもよい。
【０１１４】
別の一態様において、本発明は、κ様ＳＬＣの発現方法を提供する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列に共有結合されたＶκ様配列を含むキメラ分子をコードする核酸で前記組換え宿主細胞を形質転換することを含む、組換え宿主細胞におけるκ様代替軽鎖の発現方法を提供する。一実施形態において、Ｖκ様配列は、ＪＣκ配列に融合されている。別の実施形態において、Ｖκ様配列は、ペプチドまたはペプチドリンカーを介してＪＣκ配列に結合されている。別の実施形態において、組換え宿主細胞は、真核細胞である。一実施形態において、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【０１１５】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号６として示されたＶｐｒｅＢ配列を含むＳＬＣ構造体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１０として示されたλ５配列を含むＳＬＣ構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号３５として示されたポリペプチドを含むＳＬＣ構造体を提供する。
【０１１６】
λ様Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの具体的な例としては、天然型配列のフラグメントおよびバリアントを含むＶｐｒｅＢ配列、例えば、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ２、またはＶｐｒｅＢ３配列が、天然型配列のフラグメントおよびバリアントを含むλ５配列にコンジュゲートされている、ポリペプチドが挙げられる。このタイプの代表的融合は、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に提供されている。非相同性リーダー配列での融合の例は、図３（配列番号３５）に示されている。
【０１１７】
直接の融合において、典型的にはＶｐｒｅＢ配列のＣ末端（例えば、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ２、またはＶｐｒｅＢ３配列）は、λ５配列のＮ末端に融合されている。完全長の天然型ＶｐｒｅＢ配列を完全長λ５配列に融合することは可能であるが（例えば、図７の最初の図解を参照）、典型的には融合は、２つのポリペプチドそれぞれのＣＤＲ３類似部位で、またはその周辺で起こる。ＶｐｒｅＢ１およびλ５の類似ＣＤＲ３部位に基づく代表的な融合構造体を、図６に示す。この実施形態において、融合は、ＣＤＲ３類似領域の片側の約１０のアミノ酸残基の内部で、またはその内部のある位置で起こってもよい。好ましい実施形態において、融合は、天然型ヒトＶｐｒｅＢ１配列（配列番号１）の約１１６アミノ酸残基から１２６アミノ酸残基の間、および天然型ヒトλ５配列（配列番号７）の約８２アミノ酸残基から９３アミノ酸残基の間で起こる。
【０１１８】
ＶｐｒｅＢ配列またはλ５配列を、それぞれ抗体λ軽鎖のＣＤＲ３領域または抗体軽鎖の可変領域に融合することもできる。ＶｐｒｅＢおよびλ５の一方だけがトランケートされている追加の構造体も、図７に示す。類似の構造体を、抗体κ軽鎖配列を用いて調製することができる。κ様代替軽鎖構造体の例示を、図１２〜１９に見出すことができる。
【０１１９】
更なる直接融合構造を、図１１の右側に示す。「ＳＬＣ融合１」と称される構造は、トランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（天然型ＶｐｒｅＢ１配列のＣ末端にある特徴的「テール」が欠如）の、同様にトランケートされたλ５配列への融合体が、抗体重鎖と非共有結合的に会合されている、２つの二量体で構成された四量体である。「ＳＬＣ融合２」と称される構造は、トランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（天然型ＶｐｒｅＢ１配列のＣ末端にある特徴的「テール」が欠如）の、抗体軽鎖構造体領域への融合体が、抗体重鎖と非共有結合的に会合されている、２つの二量体で構成された四量体である。「ＳＬＣ融合３」と称される構造は、抗体軽鎖可変領域のトランケート型λ５配列（天然型λ５のＮ末端にある特徴的「テール」が欠如）への融合体が、抗体重鎖と非共有結合的に会合されている、２つの二量体で構成された四量体である。
【０１２０】
先に注記された通り、本発明のポリペプチド構造体は、直接融合に加えて、ＶｐｒｅＢ配列（天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含む）と、異種配列、例えばλ５配列（天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含む）および／または抗体配列との非共有結合的会合を包含する。したがって、例えば完全長ＶｐｒｅＢ配列が、トランケート型λ５配列と非共有結合的に会合されていてもよい。あるいはトランケート型ＶｐｒｅＢ配列が、完全長λ５配列と非共有結合的に会合されていてもよい。
【０１２１】
抗体重鎖との非共有結合的会合において、非共有結合的に会合されたＶｐｒｅＢ１およびλ５配列を含む代替軽鎖構造体を、図１１の左側に示す。様々な例示を示したが、構造が、例えば完全長ＶｐｒｅＢ１およびλ５配列、トランケート型λ５配列と会合された完全長ＶｐｒｅＢ１配列（「λ５ ｄＴ」）、完全長λ５配列と会合されたトランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（「ＶｐｒｅＢ ｄＴ」）およびトランケート型λ５配列と会合されたトランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（「短」）を包含してもよい。
【０１２２】
図１１は、特定の具体的構造体を示しているが、様々な他の構造体を類似の様式で製造および使用しうることは、当業者には理解されよう。例えば構造は、図１１に示された構造とは対照的に、非対称で、各アームに異なる代替軽鎖配列を含んでいても、そして／または三量体もしくは五量体構造を有していてもよい。
【０１２３】
本明細書の代替軽鎖構造体（Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ）の全てが、抗体配列と会合されていてもよい。例えば図９に示す通り、ＶｐｒｅＢ−λ５融合体は、ペプチドリンカーにより、抗体重鎖の可変領域配列に連結することができる。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢ−λ５融合体は、抗体重鎖、または可変領域配列を含むそのフラグメントと非共有結合的に会合されて、二量体複合体を形成している。更に別の実施形態において、ＶｐｒｅＢおよびλ５配列は、互いに、そして抗体重鎖または可変領域配列を含むそのフラグメントに、非共有結合的に会合されており、それにより三量体複合体を形成している。抗体重鎖を含む実例の構造体を、図１１に示す。
【０１２４】
κ様Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの具体的例としては、天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含むＶκ様配列が、天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含むＪＣκ配列にコンジュゲートされているポリペプチドが挙げられる。この型の代表的な融合体は、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、米国特許公開第２００１−００６２９５０号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に示されている。
【０１２５】
本明細書のポリペプチド構造体の具体的例としては、Ｖκ様および／またはＪＣκ配列が抗体重鎖、またはそのフラグメントに会合されているポリペプチドが挙げられる。Ｖκ様配列およびＪＣκ配列の両方を含む具体的なヘテロ二量体構造体を、図１２に示す。図１２に示す通り、本発明のκ様代替軽鎖構造体では、Ｖκ様ポリペプチドおよび／またはＪＣκポリペプチドは、類似の抗体配列内に存在しない、それぞれＣ−およびＮ−末端伸長を含有していてもよい。あるいは伸長の一部または全体が、本明細書のκ様代替軽鎖構造体から除去されていてもよい。
【０１２６】
個別に用いられうる、または追加の異種配列、例えば抗体重鎖配列、例えば、完全長抗体重鎖またはそのフラグメントにより、更に誘導体化および／または会合されうる他のκ様代替軽鎖構造体。
【０１２７】
Ｖκ様ポリペプチドおよび／またはＪＣκポリペプチドのＣ−およびＮ−末端伸長は、本発明の構造体に存在する必要はないが、図１４に示す通り、ループライブラリーをスクリーニングした結果、それらは直線伸長、または例えば多様性に制約のある形態のいずれかにより、組み合わせ的機能多様性を創り出すための特有の好機を提供するため、少なくとも１種のそのような付加物の少なくとも一部を保持することが有益となる。加えて、Ｖκ様ポリペプチドおよび／またはＪＣκポリペプチドの「テール」部分が、他のペプチドおよび／またはポリペプチドに融合されて、様々な所望の特性、例えば、結合の強化、追加の結合特異性、ｐＫの上昇、半減期の改善、半減期の短縮、細胞表面への固定、細胞内トランスロケーションの増加、ドミナントネガティブ活性などを提供することができる。具体的な機能的テール伸長を、図１８に列挙する。
【０１２８】
所望なら、本発明の構造体を、例えば、公知の治療抗体をはじめとする抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域の公知配列または配列モチーフを、κ様代替軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３類似領域に組込む、または付加することにより、設計することができる。これにより、抗体ではないが、公知の治療抗体と同様の、またはそれを超えた結合特異性または親和力を示す分子を作製することができる。
【０１２９】
Ｖκ様およびＪＣκ遺伝子は、独立したタンパク質として、そして代替軽鎖として機能することができるポリペプチドをコードしているため、代替様の軽鎖を、真の軽鎖から設計することができ、そして設計された真の代替軽鎖のために提案されたこれまでの適用例に用いることができる。これは、ＶｐｒｅＢまたはＶκ様遺伝子のいずれかに類似したペプチド伸長を含む可変軽領域を発現することにより、果たすことができる。同様に、定常領域を、λ５またはＪＣκ遺伝子のいずれかおよびそれらのペプチド伸長と似せるように設計することができる。更に任意のキメラまたはヘテロ二量体の組み合わせは、本明細書の範囲内である。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、ＳＬＣ構造体は、異種アミノ酸配列または非ＳＬＣポリペプチドを含む。特定の実施形態において、異種アミノ酸配列は、１種以上の追加の機能性を、本発明の構造体に付加する。ＳＬＣ構造体は、非ＳＬＣポリペプチドを含むように設計されてもよい。一実施形態において、非ＳＬＣポリペプチドは、第一のＳＬＣ成分および／または第二のＳＬＣ成分に融合されている。非ＳＬＣポリペプチドのアミノ末端が、第一のＳＬＣ成分のカルボキシ末端に融合されていてもよく、そして／または非ＳＬＣポリペプチドのカルボキシ末端が、第二のＳＬＣ成分のアミノ末端に融合されていてもよい。別の実施形態において、第一のＳＬＣ成分は、ＶｐｒｅＢポリペプチドまたはＶκ様ポリペプチドである。別の一実施形態において、第二のＳＬＣ成分は、λ５ポリペプチドまたはＪＣκポリペプチドである。
【０１３１】
所望の結合特異性を有する抗体可変領域配列を含む、追加の機能性を有するλ様ＳＬＣ構造体を、図１０に示す。詳細には図１０は、ＶｐｒｅＢおよびλ５に連結する融合タンパク質を作製するための抗ＶＥＧＦ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の挿入を示している（図１０Ａ）。こうして得られた、設計されたＳＬＣ制約ｓｃＦｖは、抗ＴＮＦ−α抗体の重鎖と対をなしている。図１０Ｂは、ＶｐｒｅＢのＣ末端への抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖの融合を表わしている。図１０Ｃは、λ５のアミノ末端への抗オボアルブミンｓｃＦｖの融合を表わしている。ＴＮＦ−αおよびオボアルブミンの両方に結合する能力を有する３部のタンパク質複合体を形成することができる。図１０Ｄは、三特異性分子を作製するための、２つの融合構造体（ＶｐｒｅＢ−抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖおよびλ５−抗オボアルブミン）と抗ＴＮＦ−α抗体の重鎖との組み合わせを表わしている。ＶｐｒｅＢおよびλ５ポリペプチド配列を含む様々な二機能性および三機能性構造体を、そのような方策を用いて構築してもよい。加えて図８に表わされる通り、組み合わせ的機能多様性を、λ様ＳＬＣ構造体に組込んでもよい。
【０１３２】
所望の結合特異性を有する抗体可変領域配列を含む追加の機能性を有するκ様ＳＬＣ構造体を、図１７に示す。詳細には図１７は、本明細書の先に記載された、Ｖκ様およびＪＣκポリペプチド配列を含む様々な二機能性および三機能性構造体を示している。
【０１３３】
本発明の代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体は、二量体または２部構成で提供されてもよい。この構成の例を図９に提供し、それは、２部構成に対応するＶｐｒｅＢ−λ５融合体および抗体重鎖（右側、下から二番目の図）のタンパク質構造を示している。ＳＬＣ構造体は、三量体または３部構成で提供されてもよい。図９は、３部構成に対応するＶｐｒｅＢ、λ５、および抗体重鎖（右側、一番下の図）のタンパク質構造を示している。
【０１３４】
本発明の代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体は、二機能または二特異性形態で提供されてもよい。図２０は、この例を示し、（Ａ）は、Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成を表しており、（Ｂ）は、二機能性および二特異性Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成を表わしている。図２０（Ｂ）に示される通り、ＳＬＣ構造体は、ＳＬＣポリペプチド成分（例えば、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはバリアント）、および非ＳＬＣ分子を有するＳＬＣ融合ポリペプチドを含んでいてもよい。一実施形態において、非ＳＬＣ分子は、特定の機能を有する任意のポリペプチドであってもよい。別の実施形態において、ポリペプチドは、追加の機能性を提供しうるサイトカインであってもよい。別の実施形態において、非ＳＬＣポリペプチドは、追加の特異性を提供しうる抗体フラグメントであってもよい。図２０（Ｃ）は、実例のＳＬＣ融合クローニング方策およびその各アミノ酸を表わしている。斜線のエリアは、ＶｐｒｅＢ（アミノ酸１２０〜１４５）およびλ５（アミノ酸３８〜９２）の非免疫グロブリンテール領域を表す。「Ｌ」は、内在性リーダー配列を示し、「ｍＬ」は、合成Ｉｇκリーダー配列を示す。「融合」は、非ＳＬＣ分子など、該当する遺伝子の融合部位を示す。
【０１３５】
代替軽鎖構造体の調製
核酸コード代替軽鎖、例えば、ＶｐｒｅＢおよびλ５ポリペプチド、またはＶκ様もしくはＪＣκポリペプチドを、天然供給源、例えば、発達中のＢ細胞から単離することができ、そして／または合成もしくは半合成法により得ることができる。このＤＮＡが同定され単離されるか、さもなければ生成されれば、更なるクローニングまたは発現のために複製可能なベクターにライゲートすることができる。
【０１３６】
本明細書のポリペプチドのコード配列を発現するために用いうるクローニングおよび発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、市販されている。一般にベクター成分は、非限定的に、以下のものの１つ以上が挙げられる：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモータ、および転写終結配列。本明細書のベクター内の代替軽鎖構造体をコードするＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物（ホ乳類）細胞であり、ホ乳類細胞が好ましい。
【０１３７】
適切なホ乳類宿主細胞系の例としては、非限定的に、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；懸濁培養での増殖用にサブクローニングされたヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞系２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
【０１３８】
ホ乳類細胞内での使用に関しては、発現ベクターでの制御機能が、多くの場合、ウイルス材料により提供される。したがって、一般に用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得ることができる。他のプロモータ、例えば、β−アクチンプロモータは、非相同性供給源から生成させる。適切なプロモータの例としては、非限定的に、ＳＶ４０ウイルスの初期または後期プロモータ（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））、ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモータ（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８；３５５−３６０（１９８２））、ならびに通常は所望の遺伝子配列に関連するプロモータおよび／または制御配列が挙げられるが、但し、そのような制御配列が、宿主細胞系と適合することが前提である。
【０１３９】
高等な真核生物による、所望の非相同性ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモータ上で作用してその転写開始活性を高める、通常は１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーは、相対的に配列および位置非依存性であるが、好ましくは発現ベクター内に存在するプロモータ配列の上流に位置する。エンハンサーは、プロモータと同じ供給源、例えば真核細胞ウイルスから、例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーから生成させてもよい。
【０１４０】
ホ乳類宿主細胞内で用いられる発現ベクターは、ポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０（初期および後期）またはＨＢＶなどのウイルス由来のものも含んでいる。
【０１４１】
複製起点は、外来起源、例えばＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源から得ることができる、または宿主細胞により提供することができる、ベクターの構築により提供されてよい。
【０１４２】
発現ベクターは、通常、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または発育に必要なタンパク質をコードする選択マーカーを含む。ホ乳類細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１４３】
適切なホ乳類発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、市販されている。したがって例えば、本発明の代替軽鎖構造体は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモータ領域を含むｐＣＩ発現ベクター（プロメガ）を用いてホ乳類宿主細胞内で産生させて、ＤＮＡ挿入部の構成的発現を促進することができる。ベクターは、ｐＴＴ５発現ベクター（カナダ国立研究機構）であってもよい。ベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を選択マーカーとして含むことができる。
【０１４４】
本発明の代替軽鎖構造体は、細菌宿主細胞内で産生することもできる。細菌系内で使用される制御要素としては、場合によりオペレータ−配列を含むプロモータ、およびリボソーム結合部位が挙げられる。適切なプロモータとしては、非限定的に、ガラクトース（ｇａｌ）、ラクトース（ｌａｃ）、マルトース、トリプトファン（ｔｒｐ）、β−ラクタマーゼプロモータ、バクテリオファージλ、およびＴ７プロモータが挙げられる。加えて合成プロモータ、例えばｔａｃプロモータを用いることができる。細菌系内で使用されるプロモータは、一般に、Ｆａｂ分子をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列も含有する。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適している。
【０１４５】
抗体代替軽鎖配列を含む多重鎖構造体内の各鎖のコード配列は、真核生物および原核生物の宿主をはじめとする所望の宿主細胞をコトランスフェクトするのに用いられる、別個の調節配列の制御下では、または別個の発現ベクター内では、同じ発現ベクター内に存在することができる。したがって、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から市販されるＤｕｅｔ（商標）ベクターを用いて、同義遺伝子を共発現させることができる。
【０１４６】
形質転換された宿主細胞は、様々な培地で培養させてもよい。ホ乳類宿主細胞を培養するための市販の培地としては、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（シグマ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），（シグマ）が挙げられる。加えてＨａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）およびＢａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）に記載された培地のいずれも、宿主細胞用の培地として用いることができる。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現用に選択される宿主細胞によって過去に利用されたものであり、製造業者の説明書に含まれるか、さもなければ当業者には自明であろう。
【０１４７】
ホ乳類、細菌（例えば大腸菌）、または他の宿主細胞を培養するのに更に適した培地は、標準の教書、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の上記文献またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．の上記文献にも記載されている。
【０１４８】
一態様において、本発明は、組換え宿主細胞内での代替軽鎖の発現方法を提供する。一実施形態において、その方法は、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ融合ポリペプチドをコードする核酸を提供するステップを含む。別の実施形態において、その方法は、組換え宿主細胞を、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ融合ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトするステップを含む。一実施形態において、ＳＬＣ融合ポリペプチドをコードする核酸は、第一のＳＬＣ配列および／または第二のＳＬＣ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、第二のＳＬＣ配列に共有結合された第一のＳＬＣ配列を含むキメラ分子である。第一のＳＬＣ配列は、ＶｐｒｅＢ配列、Ｖκ様配列、またはそれらの融合ポリペプチドであってもよい。第二のＳＬＣ配列は、λ５配列、ＪＣκ配列、またはそれらの融合ポリペプチドであってもよい。
【０１４９】
一実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、λ５配列に共有結合されている。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、λ５配列に融合されている。別の一実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、ペプチドまたはペプチドリンカーを介して、λ５配列に結合されている。別の一実施形態において、Ｖκ様配列は、前記κ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列に共有結合されている。別の医師実施形態において、Ｖκ様配列は、ＪＣκ配列に融合されている。別の実施形態において、Ｖκ様配列は、ペプチドまたはペプチドリンカーを介して、ＪＣκ配列に結合されている。
【０１５０】
全ての実施形態において、発現方法は、代替軽鎖ポリペプチドおよび／または代替軽鎖融合ポリペプチドをはじめとする、代替軽鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップを含んでいてもよい。
【０１５１】
全ての実施形態において、その方法は、抗体重鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップを更に含んでいてもよい。
【０１５２】
一態様において、本発明は、改善された収率を有する代替軽鎖ポリペプチドおよび／または代替軽鎖融合ポリペプチドの発現方法を提供する。一実施形態において、天然型リーダー配列の代わりに非相同性リーダー配列を用いる本発明の方法は、天然型リーダー配列を非相同性リーダー配列で交換されていない方法よりも、大きなポリペプチド発現および収率を特徴とする。
【０１５３】
一実施形態において、組換え宿主細胞は、細菌細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。一実施形態において、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【０１５４】
一態様において、本発明は、本明細書に記載された核酸を含有する宿主細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも１種の核酸で形質転換された組換え宿主細胞を提供する。別の一実施形態において、宿主細胞は、非ＳＬＣ分子を含んでいても、または含んでいなくてもよい、ＳＬＣ融合をコードする核酸で形質転換されている。
【０１５５】
全ての実施形態において、宿主細胞は、抗体重鎖をコードする核酸で更に形質転換されている。
【０１５６】
全ての実施形態において、本発明は、本明細書に記載された核酸を含有するベクターを提供する。全ての実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載された核酸を含有する少なくとも１種のベクターで形質転換されている。
【０１５７】
精製は、当該技術分野で公知の方法により実施することができる。好ましい実施形態において、代替軽鎖構造体は、Ｎｉ−ＮＴＡ精製システム（インビトロジェン）を用いて６×Ｈｉｓタグ形態で精製される。
【０１５８】
κ様ＳＬＣ分子は、既存の軽鎖Ｖ遺伝子および軽鎖定常遺伝子から設計することができる。図１５に示す通り、軽鎖は、遺伝子再配列およびＲＮＡプロセッシングの生成物である。κ様ＳＬＣ分子の成分は、再配列されていない軽鎖Ｖ遺伝子および再配列された軽鎖ＪＣ遺伝子からの別の機能を提供するため、残りのκおよびλ軽鎖Ｖ遺伝子全てから類似の翻訳タンパク質を設計して、Ｖκ様分子（図１６Ａ）、ならびに残りのκＪＣ再配列（４ＪＣκ様）（図１６Ｂ）と、λＪＣ再配列（４“Ｊ”×１０“定数”＝４０ＪＣλ様）（図１６Ｂ）との全ての組み合わせを作製することが実行可能である。これらの設計分子のそれぞれ１つは、ＶｐｒｅＢおよびλ５、ならびにそれらの組み合わせおよびキメラを用いて、Ｖκ様およびＪＣκを用いたもの、および２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１８９７０に含まれるものと類似の目的を果たすことができる。
【０１５９】
本発明の代替軽鎖を用いて、疾患の予防および／または処置のための分子を構築することができる。そのような適用では、代替軽鎖を含有する分子は、通常、医薬組成物の形態で用いられる。技術および配合は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．１９９０）に見出してもよい。Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ，」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２−２Ｓ（１９８８）も参照されたい。
【０１６０】
ポリペプチドを基剤とする医薬組成物は、典型的には、凍結乾燥された配合剤または水性配合剤の形態で配合される。許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびクレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンをはじめとする他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１６１】
その分子は、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中で、コアセルベーション技術、または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセリロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）により、マイクロカプセルに封入してもよい。そのような技術は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
【０１６２】
本明細書に開示された代替軽鎖を含有する分子は、免疫リポソームとして配合されてもよい。分子を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号、同第４，５４４，５４５号および１９９７年１０月２３日公開のＷＯ９７／３８７３１に記載されたものなど、当該技術分野で公知の方法により調製される。循環時間を高めたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１６３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相エバポレーション法により生成させることができる。リポソームは、画定された孔径のフィルターから押出されて、所望の口径を有するリポソームが生成される。本発明の分子のフラグメントは、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートすることができる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２））。化学療法剤が、場合によりリポソーム中に含有されている。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０１６４】
疾患の予防または処置では、分子の適切な投与量は、処置される感染のタイプ、疾患の重症度および経過、ならびに抗体が予防目的または治療目的で投与されるか否かに依存する。分子は、一度に、または一連の処置を通して、適切に患者に投与される。疾患のタイプおよび重症度にもよるが、例えば、１回以上の別々の投与または連続注入のいずれにしろ、抗体約１μｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇが、患者に投与される典型的な初期候補投与量である。
【０１６５】
本発明の代替軽鎖を含有する分子は、疾患の処置または予防における使用に適している。一実施形態において、本発明は、医薬として使用される、または疾患の処置に使用される代替軽鎖含有分子を提供する。別の実施形態において、本発明は、疾患を処置する医薬の製造のための、代替軽鎖含有分子の使用を提供する。その分子は、ＳＬＣペプチドまたはＳＬＣ融合体をコードする核酸であってもよい。
【０１６６】
一態様において、本発明は、治療上効果的な量の代替軽鎖含有分子をホ乳類に投与するステップを含む、ホ乳類における疾患を処置するのに有用な方法を提供する。治療組成物を、医師の指示通り、短期（急性）もしくは慢性で、または間欠的に投与することができる。
【０１６７】
本発明は、疾患の処置、予防および／または診断に有用な材料を含有する製造品のキットおよび物品も提供する。キットは、容器と、容器の表面に設置しうる、または容器と結合しうるラベルとを含んでいる。容器は、瓶、バイアル、注射器、または任意の他の適切な容器であってもよく、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成させてもよい。容器は、本明細書に記載された代替軽鎖含有分子を有する組成物を保持しており、滅菌されたアクセスポートを有していてもよい。容器の例としては、静注液バッグ、または皮下注射針により穿孔することができるストッパー付きバイアルが挙げられる。キットは、様々な試薬、例えば希釈剤および緩衝剤を保持する追加の容器を有していてもよい。ラベルは、組成物および目的の使用のための説明書の記載を提供してもよい。分子を含有するキットは、細胞からのポリペプチドの精製または免疫沈降法のための、例えば細胞アッセイ用に、使用が見出される。例えば、タンパク質の単離および精製では、キットは、ビーズ（セファロースビーズ）に結び付いたタンパク質に結合する代替軽鎖含有分子を含有することができる。インビトロで、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて、タンパク質の検出および定量用の分子を含有するキットを提供することができる。検出に有用なそのような分子は、標識、例えば蛍光または放射線標識と共に提供されてもよい。
【０１６８】
キットは、本明細書に記載された代替軽鎖を活性剤として含む分子を含む少なくとも１つの容器を有する。ラベルを提供して、組成物が疾患の処置に使用しうることを示してもよい。ラベルは、処置を必要とする対象へ投与するための説明書を提供してもよい。キットは、薬学的に許容しうる緩衝剤、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を有する追加の容器を更に含んでいてもよい。最後に、キットは、別の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および注射器をはじめとする任意の別の適切な材料を含有していてもよい。
【０１６９】
本発明の更なる詳細を、以下の非限定的実施例において提供する。
【０１７０】
実施例１−ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの上清を、ヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞において一過性に生成させた。ｐＴＴ５プラスミド（カナダ国立研究機構）を用いて、組換えＳｕｒｒｏｂｏｄｙ軽鎖構造体を提供した。非相同性リーダー配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号３６−マウスＩｇκリーダー配列）での天然型リーダー配列の置換を行った、または行わなかったプラスミドの代替軽鎖核酸配列を提供した。以下の核酸配列を含有するｐＴＴ５プラスミドを用いた：（ａ）天然型リーダー配列（配列番号１−図１）もしくは配列番号３６の非相同性マウスＩｇκリーダー配列を含むヒトＶｐｒｅＢ１、（ｂ）天然型リーダー配列（配列番号８−図２）もしくは配列番号３６の非相同性マウスＩｇκリーダー配列を含むヒトλ５、または（ｃ）ＶｐｒｅＢ１およびλ５と、天然型ＶｐｒｅＢ１リーダー配列もしくは配列番号３６の非相同性マウスＩｇκリーダー配列との融合（配列番号３５−図３）。（ａ）および（ｂ）のプラスミドは、３部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成に対応し、（ｃ）のプラスミドは、３部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成に対応する。これらのプラスミドを、抗体重鎖を含有するｐＴＴ５プラスミドでコトランスフェクトした。
【０１７１】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙを、本質的には過去にＸｕ ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：１０７５６−１０７６１；Ｋａｓｈｙａｐ ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：５９８６−５９９１に記載された通り、ＨＥＫ２９３のＦｒｅｅｓｔｙｌｅに基づく系（インビトロジェン）で一過性に生成させた。ＨＥＫ２９３細胞を０．２５〜２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で増殖培地中で増殖させ、その後、トランスフェクションの１日前に、増殖培地９０ｍｌを含む新しい振とうフラスコに０．７５×１０６細胞／ｍｌの密度で接種した。一晩発育させた後、細胞密度を１〜１．５×１０６細胞／ｍｌであることを検証した。発現では、ｐＴＴ５発現ベクターを用いた。次に、ＤＮＡトランスフェクション剤混合物を、以下の通り調製した。プラスミドＤＮＡ（ｐＴＴ５−ＳＬＣ分子）合計０．１ｍｇに対応するＤＮＡ溶液を１０ｍｌ遠沈管内で混合して、増殖培地で最終容量を５ｍＬにした。２部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成では、抗体重鎖を含有するプラスミド０．０５ｍｇを、ＶｐｒｅＢ１−λ５キメラプラスミド（Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ融合体）０．０５ｍｇと混合した。３部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成では、抗体重鎖を含有するプラスミド０．０３３ｍｇを、ＶｐｒｅＢ１プラスミド０．０３３ｍｇおよびλ５プラスミド０．０３３ｍｇと混合した。次に、増殖培地４．８ｍｌをＰＥＩ ０．２ｍｌと混和してプラスミドＤＮＡ溶液に添加することにより、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション溶液を調製した。混合物を力強く１〜２秒間ボルテックス処理した。室温で１５分間インキュベートした後、プラスミドＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を、１０ｍｌピペットで１〜１．５×１０６細胞／ｍｌの密度のＨＥＫ２９３細胞を含むフラスコに移した。フラスコを直ちに回転させて、振とうインキュベータに移動させた。１２５ｒｐｍのシェーカープラットホームの付いた、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータで、細胞を６日間発育させた。得られた培養上清におけるタンパク質生成レベルを、定量的反応速度分析（フォルテバイオのＯｃｔｅｔ：抗Ｆｃセンサー）により決定した。下の表に示す通り、マウスＩｇκ軽鎖リーダー配列を置換したことで、一過性組換えＳｕｒｒｏｂｏｄｙ発現レベルが改善している。表１（ｍｇ／Ｌ）に示す通り、タンパク質レベルが少なくとも２０倍改善された。
【０１７２】
表１
【０１７３】
３部および２部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの複数回のトランスフェクションから得られた精製タンパク質を更に分析すれば、高レベルの収量が裏づけられる。非相同性リーダーを用いた、独立したトランスフェクションのタンパク質収量を、４ヶ月の期間にわたりモニタリングした。プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかのクロマトグラフィー担体および低ｐＨでの溶出を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムで、タンパク質を精製した。表２（ｍｇ／Ｌ）に示される通り、どちらの構成においても、平均収量は、内在性代替軽鎖リーダー配列を用いて認められたものよりも実質的に高くなった。
【０１７４】
表２
【０１７５】
以下の表３は、表２で平均をとった、様々な２部および３部ＳＬＣ形態で測定された各濃度を提供している。先に記載された通り、一般に２部構成は、Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ軽鎖融合体および１つの抗体重鎖を含み、３部構成は、２つのＳｕｒｒｏｂｏｄｙポリペプチドおよび抗体重鎖を含む。１列目の１〜４７行目は、２部構成を有する４７の異なる構造体に対応し、１列目の４９〜６３行目は、３部構成を有する１５の異なる構造体に対応する。４列目は、検査されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙの特徴の幾つかを提供している。「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ」は、２つのプロペプチドおよび１つの重鎖で作製されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。「融合体」は、２つのＳＬＣポリペプチドおよび１つの重鎖の融合体で作製されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。「ペプチドタグを含む融合体」は、エピトープタグが組込まれたＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。「機能性ペプチド融合体」は、特定の機能を有する少なくとも１つの非ＳＬＣポリペプチドが組込まれているＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。
【０１７６】
表３
【０１７７】
表３は、収率の改善が、ＳＬＣポリペプチドと、ＳＬＣ融合ポリペプチドと、非ＳＬＣ分子を含有するＳＬＣ融合ポリペプチドと、を含むＳｕｒｒｏｂｏｄｙをはじめとする複数のＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構成で得ることができる証拠を提供している。
【０１７８】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ分子を、チャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞中でも一過性に発現させることができる。Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの上清を、（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞中で一過性に産生してもよい。組換えＳＬＣポリペプチドまたは非ＳＬＣポリペプチドのプラスミドを、製造業者の説明書に従って、１０％ウシ胎仔血清を補充されたダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（インビトロジェン、カタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、抗体重鎖を含有するプラスミドとコトランスフェクトした。３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、培地をＧｌｕｔａｍａｘ−１（インビトロジェン、カタログ番号１２３６２）を含む新しいＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ血清使用量低減培地と交換した。トランスフェクトされた上清を７２時間後に回収して、０．２２μｍフィルター装置でろ過した。
【０１７９】
実施例２−ＣＨＯ細胞における安定発現
真核生物コドンを最適化させた可溶性分泌遺伝子（ＤＮＡ２．０）として、ホ乳類で発現された、またはデノボ合成で生成された代替軽鎖構造体を、ホ乳類タンパク質発現のために、ｐＣＩプラスミド（プロメガ）にサブクローニングした。製造業者の指導書に従ってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞（インビトロジェン）にトランスフェクトする前に、配列を検証した。製造業者の指導書に従って、ＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン）を合計３２μｇとし、所望の代替軽鎖を同量用いて、Ｔ−７５フラスコ中の８０％コンフルエントの細胞のトランスフェクションを実施した。トランスフェクションごとにＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ ２０ｍｌ中に、細胞にタンパク質を産生させた。４日後に、ニッケルキレートクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、キアゲン）を用いて、分泌されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙを培養上清から精製した。得られた精製Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙを、遠心式サイズろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０）を用いて滅菌ＰＢＳに緩衝液交換して、Ａ２８０読み取り、ＳＤＳゲル、またはウェスタンブロット分析により、公知の標準物質と比較して、それらのタンパク質濃度を決定した。
【０１８０】
前述の記載では本発明は、特定の実施形態を参照して示したが、それはそのように限定されるものではない。事実、図示されたものおよび本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者に自明となり、それは添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１８１】
本明細書に引用された個々の発行物、特許および特許出願が、具体的かつ個別に参考として本明細書に組込まれていることを示されたのと同程度に、全ての発行物、特許および特許出願は、全ての目的でその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非相同性シグナル配列を有する代替軽鎖配列を含む代替軽鎖（ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ）（商標）構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂリンパ球により産生される抗体（Ｉｇ）分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖で構築されている。ＨおよびＬ鎖のアミノ末端ドメインのアミノ酸配列は、特に抗原結合部位を形成する３つの高度可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）に可変性（ＶＨおよびＶＬ）がある。ＨおよびＬ鎖のアッセンブリは、Ｌ鎖の定常領域（ＣＬ）と、重鎖の第一の定常領域（ＣＨ１）の間のジスルフィド結合により、そしてＶＨドメインとＶＬドメインの間の非共有結合的相互作用により安定化されている。
【０００３】
ヒトおよび多くの動物、例えばマウスにおいて、抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子は、Ｖ領域の遺伝子フラグメントコード化部分の段階的な体細胞再配列により組立てられる。Ｂリンパ球発達の様々な段階が、Ｉｇ遺伝子ｌｏｃｉの再配列状態により特徴づけられる（例えば、Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．＆Ｒｏｌｉｎｋ，Ａ．，Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ｅｄ．，１９９９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｐｈｉａ参照）。
【０００４】
Ｂ細胞の前駆体（プレＢ細胞）は、完全に発達した軽鎖の代わりにＶｐｒｅＢ（１〜３）およびλ５と呼ばれる遺伝子組が生成されること、ならびにμ重鎖が同時発現されることにより、骨髄において同定された。
【０００５】
ヒトＶｐｒｅＢ１（ＣＡＧ３０４９５）の主なアイソフォームは、１４５ａａ長ポリペプチド（配列番号１）である。それは、ＩｇＶドメイン様構造を有するが、典型的なＶドメインの最後のβ鎖（β７）が欠如しており、任意の別のタンパク質に対して配列相同性を示さないカルボキシル末端を有する。ＶｐｒｅＢ２は、１４２アミノ酸のマウスＶｐｒｅＢ２ポリペプチド（Ｐ１３３７３；配列番号２）およびマウスＶｐｒｅＢ２配列の１７１アミノ酸長スプライスバリアント（ＣＡＡ０１９６４１；配列番号３）をはじめとする複数のアイソフォームを有する。ＶｐｒｅＢ１およびＶｐｒｅＢ２配列は、ＥＰ０２６９１２７および米国特許第５，１８２，２０５号；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．５（１０）：Ｒ８４（２００４）；およびＨｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１４）：５５５２−５５５６（１９８９）に開示されている。ヒトＶｐｒｅＢ３（配列番号４）の主なアイソフォームは、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．５（１０）：Ｒ８４（２００４）に開示された１２３ａａ長タンパク質（ＣＡＧ３０４９６）である。
【０００６】
ＶｐｒｅＢ（１〜３）は、もう一方タンパク質λ５とは非共有結合的に会合されている。ヒトλ５は、２０９アミノ酸ポリペプチド（ＣＡＡ０１９６２：配列番号５）であり、抗体軽鎖と強力な相同性を有するＩｇＣドメイン様構造と、そのアミノ酸末端に向かって、２つの機能的に異なる領域とを含み、その領域の一方は、Ｖλドメインのβ７鎖に対して強力な相同性を示す。ヒトλ５様タンパク質は、２１３アミノ酸（ＮＰ＿０６４４５５；配列番号６）を有し、抗体λ軽鎖定常領域に対して約８４％の配列同一性を示す。
【０００７】
更なる詳細については、以下のレビュー雑誌を参照されたい：Ｋａｒａｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３：１−４１（１９９６）；Ｍｅｌｃｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：６０−６８（１９９３）；およびＭｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２５７１−２５７３（１９９９）。
【０００８】
ＶｐｒｅＢとλ５のポリペプチドは、一緒になって、代替軽鎖または偽軽鎖と呼ばれる非共有結合的に会合されたＩｇ軽鎖様構造を形成している。初期のプレＢ細胞の表面では、代替軽鎖が、シグナルトランスデューサーＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂヘテロ二量体と会合された膜結合Ｉｇμ重鎖にジスルフィド結合して、Ｂ細胞受容体様構造、いわゆるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）を形成している。
【０００９】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙは、抗体レパートリーの正常な発達の間に生成されるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づいている。抗体とは異なり、プレＢＣＲは、２つの代替軽鎖成分、ＶｐｒｅＢおよびλ５と対になった抗体重鎖で構成された三量体である。ＶｐｒｅＢおよびλ５は両者とも、遺伝子再配列を受けず、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの開始前に初期プレＢ細胞内で発現される遺伝子によりコードされている。プレＢＣＲは、重鎖と、２つの非共有結合的に会合されたタンパク質：ＶｐｒｅＢおよびλ５とで構成されている成熟免疫グロブリンと構造的に異なっており、即ちそれらは、抗体内の２つとは対照的に３つの成分を有する。更に、ＶｐｒｅＢは、Ｖλ Ｉｇドメインと相同性があり、λ５は、抗体のＣλドメインと相同性があるが、それぞれは、非標準のペプチド伸長を有しており、つまりＶｐｒｅＢ１は、Ｃ末端に追加の２１残基を有し、λ５は、Ｎ末端に５０アミノ酸の伸長を有する。
【００１０】
κ様代替軽鎖（κ様ＳＬＣ）を用いて、κ様β細胞受容体（κ様ＢＣＲ）が同定された（Ｆｒａｎｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １３：５９３７−４３（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：３０５−１１（１９９８）；Ｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：１７８０７−１４（２００５））。
【００１１】
Ｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（１８）：１７８０７−１７８１４（２００５）には、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：３０８−３１１（１９９８）により過去に報告されたｃＤＮＡ配列と同一であることが判明された、再配列されていないＶκ遺伝子の生成物であるＶκ様タンパク質の同定または分子特徴づけが報告された。ところが、Ｆｎａｎｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １３：５９３７−４３（１９９４）には、Ｂ細胞前駆体の表面でμ重鎖と会合し、それによりＢ細胞発達のためのλ５経路の代替法を提供する能力を有する、再配列された生殖細胞系ＪＣｋの同定および特徴づけが報告されている。
【００１２】
κ様およびλ様のプレＢＣＲが協調的に作用して軽鎖再配列を促進し、Ｂ細胞始原を確実に成熟させることが提案された。レビューについては、ＭｃＫｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：４０４３（２００６）を参照されたい。
【００１３】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの設計および生成の更なる詳細は、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号、２００８年７月１１日出願の米国特許仮出願第６１／１３４，９２９号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に提供されている。
【００１４】
代替軽鎖は、プレＢ細胞上でのタンパク質産生および細胞外提示を可能にするリーダー配列を有する。しかし、典型的には、設計された代替軽鎖構造体の組換え発現は、同一の重鎖を用いた抗体よりも低いことが見出されている。それ故、代替軽鎖構造体の組換え発現の効率を改善することが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、少なくとも一部は、非相同性リーダー配列を用いることにより、代替軽鎖構造体の組換え発現の効率を顕著に改善しうるという実験的発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様において、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣポリペプチドを含有するＳＬＣ構造体をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態において、ＳＬＣポリペプチドとしては、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢポリペプチドは、天然型ＶｐｒｅＢ１配列、天然型ＶｐｒｅＢ２配列、天然型ＶｐｒｅＢ３配列、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、天然型ＶｐｒｅＢ配列は、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ様ポリペプチド、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の一実施形態において、λ５ポリペプチドは、配列番号７のヒトλ５様、配列番号８のヒトλ５ポリペプチド、配列番号９のヒトλ５ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の実施形態において、ＳＬＣポリペプチドとしては、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の一実施形態において、Ｖκ様ポリペプチド配列は、配列番号１２〜２４、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、ＪＣκポリペプチド配列は、配列番号２６〜３９、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。
【００１７】
別の態様において、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＳＬＣポリペプチドをコードした単離された核酸分子を提供し、ＳＬＣポリペプチドとしては、ＳＬＣポリペプチド融合体、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。一実施形態において、ＳＬＣ融合体としては、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢポリペプチド配列およびλ５ポリペプチド配列の融合は、それぞれＶｐｒｅＢ配列およびλ５配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。別の一実施形態において、ＶｐｒｅＢポリペプチド配列は、カルボキシ末端で、λ５ポリペプチド配列のアミノ末端に連結されている。一実施形態において、ＳＬＣ融合体としては、Ｖκ様−ＪＣκポリペプチド融合体、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。別の実施形態において、Ｖκ様ポリペプチド配列およびＪＣκポリペプチド配列の融合は、それぞれＶκ様配列およびＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。別の一実施形態において、Ｖκ様ポリペプチド配列は、カルボキシ末端で、ＪＣκポリペプチド配列のアミノ末端に融合されている。
【００１８】
別の一態様において、本発明は、非ＳＬＣ分子を含有するＳＬＣ融合体を提供する。一実施形態において、ＳＬＣ融合体は、非ＳＬＣ分子と、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、およびＪＣκ配列の少なくとも１つとを含有する。別の実施形態において、非ＳＬＣ分子は、非ＳＬＣポリペプチドであってもよい。一実施形態において、融合体は、非ＳＬＣポリペプチドに融合されたλ５配列またはＶｐｒｅＢ配列を含む。別の一実施形態において、融合は、ＶｐｒｅＢ配列またはλ５配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。幾つかの実施形態において、λ５配列のＮ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＣ末端に融合されているか、またはＶｐｒｅＢ配列のＶ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＮ末端に融合されている。別の一実施形態において、融合体は、非ＳＬＣポリペプチドに融合されたＶκ様またはＪＣκ配列を含む。別の一実施形態において、融合は、Ｖκ様配列またはＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。幾つかの実施形態において、ＪＣκ配列のＮ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＣ末端に融合されているか、またはＶκ様配列のＣ末端が、非ＳＬＣポリペプチドのＮ末端に融合されている。一実施形態において、本発明は、ＳＬＣポリペプチドが非ＳＬＣ分子を含有するＳＬＣ融合ポリペプチドを含む、ＳＬＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
全ての実施形態において、非相同性分泌リーダー配列は、抗体、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、消化酵素、および細胞外マトリックスの成分からなる群より選択される分泌されたポリペプチドのリーダー配列であってもよい。一実施形態において、サイトカインは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β（ＴＮＦ−αおよび−β）；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子からなる群より選択される分泌された他のポリペプチドからなる群より選択されてもよい。
【００２０】
全ての実施形態において、分泌リーダー配列は、ヒトおよび非ヒトホ乳類アルブミン、トランスフェリン、ＣＤ３６、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ならびにニューブラスチンのリーダー配列からなる群より選択されてもよい。
【００２１】
全ての実施形態において、分泌リーダー配列は、合成配列であってもよい。
【００２２】
全ての実施形態において、分泌リーダー配列は、天然型分泌リーダー配列のコンセンサス配列であってもよい。
【００２３】
全ての実施形態において、非相同性シグナル配列は、配列番号３６（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）であってもよい。
【００２４】
全ての実施形態において、本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２５】
一態様において、本発明は、ベクターおよび組換え宿主細胞を提供する。全ての実施形態において、ベクターは、本明細書に記載された核酸分子を含有していてもよい。全ての実施形態において、組換え宿主細胞は、本明細書に記載された核酸で形質転換されていてもよい。
【００２６】
別の態様において、本発明は、組換え宿主細胞内での代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドまたはＳＬＣ構造体の発現方法を提供する。一実施形態において、その方法は、ＳＬＣポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、組換え宿主細胞を、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体をコードする核酸分子で形質転換するステップを含む。別の一実施形態において、組換え宿主細胞は、真核細胞である。別の一実施形態において、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。幾つかの実施形態において、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体は、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、およびＶκ様−ＪＣκポリペプチド融合体の１種以上を含むＳＬＣポリペプチドからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】天然型リーダー配列を有する配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列；配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２配列；配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３様配列；図１１で「ＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌ」（配列番号５）と称された「三量体」内のトランケート型ＶｐｒｅＢ１の配列；ならびにマウスＩｇκリーダー配列を有する配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列を示す。下線は、ＶｐｒｅＢアミノ酸配列内のリーダー配列を示す。
【図２】配列番号７のヒトλ５様配列；配列番号８のヒトλ５配列；図１１で「λ５ ｄＴａｉｌ」（配列番号９）と称された「三量体」内のトランケート型λ５配列；ならびにマウスＩｇκリーダー配列を有する配列番号１０のヒトλ５ ｄＴａｉｌ配列を示す。下線は、λ５アミノ酸配列内のリーダー配列を示す。
【図３】配列番号３５としてのヒトＶｐｒｅＢ１−λ５キメラアミノ酸配列を示す（マウスＩｇκリーダー配列に下線）。
【図４Ａ】および
【図４Ｂ】（Ａ）配列番号１１のヒトＶκ様ヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（ＡＪ００４９５６；配列番号１２）（天然型リーダー配列に下線）、ならびに（Ｂ）それぞれがＡＪ００４９５６Ｖκ様プロトタイプ配列（配列番号１２）に直線状に並んだ、異なる長さの伸長（配列番号１３〜２４）を含む、Ｖκファミリー全てからの可能なＶκ様タンパク質の予測される成熟アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測される成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には２本の下線を、潜在的リーダー開裂配列には１本の下線を付す）、（Ｂ）残りのκＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）からの予測されるＪＣκ様アミノ酸配列（配列番号２７〜３１）、ならびに（Ｃ）追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付したＪＣκ（配列番号３２）、追加されたマウスＩｇκリーダー配列のみに下線を付した組換えＪＣκ（配列番号３３）、および追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付した予測されるプロセッシングＪＣκ（配列番号３４）、を含むＪＣｋを設計された分泌最適化バリアント示す。
【図５Ｂ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測される成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には２本の下線を、潜在的リーダー開裂配列には１本の下線を付す）、（Ｂ）残りのκＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）からの予測されるＪＣκ様アミノ酸配列（配列番号２７〜３１）、ならびに（Ｃ）追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付したＪＣκ（配列番号３２）、追加されたマウスＩｇκリーダー配列のみに下線を付した組換えＪＣκ（配列番号３３）、および追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付した予測されるプロセッシングＪＣκ（配列番号３４）、を含むＪＣｋを設計された分泌最適化バリアント示す。
【図５Ｃ】（Ａ）配列番号２５のヒトＪＣκヌクレオチド配列およびそのコード化タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）（予測される成熟ＪＣｋタンパク質と比較したユニーク配列には２本の下線を、潜在的リーダー開裂配列には１本の下線を付す）、（Ｂ）残りのκＪ定常領域再配列（Ｊ１〜Ｊ５Ｃκ）からの予測されるＪＣκ様アミノ酸配列（配列番号２７〜３１）、ならびに（Ｃ）追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付したＪＣκ（配列番号３２）、追加されたマウスＩｇκリーダー配列のみに下線を付した組換えＪＣκ（配列番号３３）、および追加されたマウスＩｇκリーダー配列に下線を付した予測されるプロセッシングＪＣκ（配列番号３４）、を含むＪＣｋを設計された分泌最適化バリアント示す。
【図６】ＶｐｒｅＢおよびλ５配列により形成された代替軽鎖の略図、代替軽鎖配列を含む例示的な融合ポリペプチド、ならびにＶ−Ｊ結合から得られた抗体軽鎖構造である。
【図７】様々な代替軽鎖欠失および一本鎖構造体の略図である。
【図８】代替軽鎖構造体への組み合わせ的機能多様性（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）の組込みを概略的に図示している。
【図９】様々な例示的代替軽鎖構造体の遺伝子およびタンパク質構造を示す。
【図１０】代替軽鎖（ＳＬＣ）成分に機能性を加える様々な代表的方法を示す。
【図１１】様々な三量体および二量体代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体を示す。
【図１２】様々なヘテロ二量体代替κ軽鎖欠失バリアントの略図である。「完全長」構造体において、Ｖκ様およびＪＣκ配列は両者とも、それぞれＣ−末端およびＮ−末端の伸長（テール）を保持している。ｄＪバリアントでは、ＪＣκのＮ−末端伸長が欠失されている。ｄＶκテールバリアントでは、Ｖκ様配列のＣ−末端伸長が、除去されているが、ＪＣκのＮ−末端伸長は保持されている。「短κ」バリアントでは、Ｖκ様配列のＣ末端テールおよびＪＣκ配列のＮ−末端伸長は両者とも、保持されている。
【図１３】個別に、または別のタンパク質、例えば、抗体重鎖またはそのフラグメントと一緒に用いることができる、κ様軽鎖欠失および一本鎖構造体。
【図１４】κ様代替軽鎖構造体への組み合わせ的機能多様性の組込み。赤線は、追加された多様性、例えば、ペプチドライブラリーを示す。
【図１５】軽鎖は、遺伝子再配列およびＲＮＡプロセッシングの生成物である。
【図１６Ａ】Ｖκ様タンパク質が再配列されていないＶκＩＶ−遺伝子転写および翻訳から得られることを示す。ＶκＩＶは、７１のＶＬ生殖細胞系遺伝子のうちの１つである。Ｖκ様タンパク質を作製することが可能なＶＬ生殖細胞系遺伝子は更に７０存在するため、κＶ遺伝子は更に３９、そしてλＶ遺伝子は更に３１存在する。
【図１６Ｂ】ＪＣκが、再配列されていないＪおよびＣ生殖細胞系からのプロセッシングＲＮＡの生成物であることを示す。ＪＣκは、４５のＪＣ生殖細胞系の組み合わせのうちの１つである。ＪＣκ様タンパク質を作製することが可能なＶＬ生殖細胞系遺伝子が更に４４存在し、つまりＣκを組み合わせるＪκ遺伝子が更に４、そして１０のＣλ遺伝子と組み合わせるＪλ遺伝子が更に４存在する（合計４０）。
【図１７】κ様代替軽鎖成分に機能性を加えた略図を示す。二機能性および三機能性構造を示す。Ａ：ｓｃＦｖを制約された融合体；Ｂ：Ｖκ様−ｓｃＦｖ融合体；Ｃ：ＪＣκ−ｓｃＦｖ融合体；ＳＬＣ二重融合。
【図１８】代替軽鎖の機能的テール伸長のタイプを示す。
【図１９】κ様およびλ様代替軽鎖機能的キメラを示す。
【図２０】（Ａ）Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成、（Ｂ）二機能性および二重特異性Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成、ならびに（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）に表わされた分子のクローニング方策を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
他に断りがなければ、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）は、本願で用いられる多くの用語の概説を当業者に提供する。
【００２９】
当業者には、本発明の実践で用いられうる、本明細書に記載されたものと類似または同一の多くの方法および材料が認識されよう。事実、本発明は、記載された方法および材料に限定されない。本発明の目的では、次の用語を以下の通り定義する。
【００３０】
本願全体を通して、単数形の使用は、他に明記されない限り、複数形を包含する。
【００３１】
本願において、「または」の使用は、他に明記されない限り、「および／または」を包含する。
【００３２】
更に用語「包含する」、「はじめとする」、および「包含された」は、限定されていない。
【００３３】
本発明の文脈において、用語「抗体（Ａｂ）」は、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子組換えから得られた伝統的組換え重鎖およびＶＪ遺伝子組換えから得られた伝統的組換え軽鎖、またはそれらのフラグメントからの天然型抗体を指すために用いられる。
【００３４】
「天然型抗体」は、２つの同一軽（Ｌ）鎖および２つの同一重（Ｈ）鎖で構成された約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、ジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に、可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端の可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端の定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと直線状に並べられ、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと直線状に並べられている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に境界を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００３５】
抗体鎖に関連する用語「可変」は、抗体の間で配列が広範囲にわたって異なり、特定抗原に対する各特定抗体の結合および特異性に関与する、抗体鎖の部分を指すために用いられる。そのような可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の高度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然型重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、３つの高度可変領域により接続されたβシート配置を大きく採用し、それがループ接続を形成し、幾つかの例ではβシート構造の一部を形成している。各鎖の高度可変領域は、ＦＲによって接近してまとめられていて、別の鎖の高度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），ｐ６４７−６６９参照）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与せず、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などを示す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「高度可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高度可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（即ち、軽鎖可変ドメイン内の３０〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）および８６〜９６（Ｌ３）の残基、ならびに重鎖可変ドメイン内の３０〜３５（ＨＩ）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）の残基；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））を含む。
【００３７】
用語「フレームワーク領域」は、より異なるＣＤＲ領域の間に存在する、当該技術分野で認識された抗体可変領域の部分を指す。そのようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれ、重鎖または軽鎖抗体可変領域内に見出される３つのＣＤＲを、三次元空間に保持するための足場を提供することで、ＣＤＲが抗原結合表面を形成することができる。
【００３８】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なる分類に割り付けることができる。抗体には５つの主要な分類、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらの複数は、亜分類（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に更に分別される場合がある。好ましい実施形態において、本発明のイムノアドヘシンの構築に用いられる免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖ドメインのものである。ヒトイムノアドヘシンでは、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を用いることの主な利点は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンが固定化プロテインＡ上で効率的に精製されうることである。しかし、特定のイムノアドヘシン構築用にＩｇ融合パートナーを選択する場合には、別の構造的および機能的性質を考慮すべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、より長く、より可撓性があるため、より大きな「アドヘシン」ドメインを収容することができ、ＩｇＧ１に融合されると適切にフォールディングまたは機能しない可能性がある。別の考慮すべき事柄は、結合価かもしれず、ＩｇＧイムノアドヘシンは、二価ホモ二量体であるが、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、基本的なＩｇホモ二量体単位の、それぞれ二量体または五量体構造をもたらす可能性がある。インビボ適用のために設計されたＶＥＧＦ受容体Ｉｇ様ドメイン／免疫グロブリンキメラでは、Ｆｃ領域に特有の薬物動態性およびエフェクター機能も重要となる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は全て、インビボ半減期２１日を有するが、補体系を活性化させる際のそれらの相対的能力は異なる。その上、様々な免疫グロブリンが、様々な数のアロタイピックアイソタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｉｃ ｉｓｏｔｙｐｅｓ）を有する。
【００３９】
異なる分類の免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４０】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種の明確に異なる型の一方に割り付けることができる。本明細書における抗体軽鎖の任意の参照は、κおよびλの両方の軽鎖を包含する。
【００４１】
「抗体フラグメント」は、一般に抗原が結合した、完全長抗体の一部、またはその可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例としては、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、および（ｓｃＦｖ）２フラグメントが挙げられる。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「抗体結合領域」は、抗原に結合しうる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の１部分以上を指す。典型的には、抗体結合領域は、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）（またはその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（またはその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、抗体軽鎖と重鎖の混合体（またはその可変領域）、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン、もしくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、または完全長抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体である。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、アミノ酸が少なくとも約３〜５、好ましくは少なくとも約５〜１０、または少なくとも約５〜１５、典型的には約５００以下または約１０００以下の配列を指し、単独で、またはより大きな配列の一部として、そのような配列に応答して生成された抗体に結合している配列を定義する。エピトープは、由来する親タンパク質の部分と同一の配列を有するポリペプチドに限定されない。事実、ウイルスゲノムは、不断に変化する状態にあり、単離物の間に比較的高度の変動性が示される。したがって用語「エピトープ」は、天然型配列と同一の配列に加え、天然型配列への修飾、例えば欠失、置換および／または挿入を包含する。一般にそのような修飾は、本質的に保存的であるが、非保存的修飾も企図される。その用語は、具体的には「ミモトープ」、即ち、連続した直線状天然型配列を画定しない配列、または天然型タンパク質中には必ずしも生じないが、天然型タンパク質上のエピトープを機能的に模倣している配列を包含する。用語「エピトープ」は、具体的には線形および立体配座エピトープを包含する。
【００４４】
用語「代替軽鎖ポリペプチド」または「ＳＬＣポリペプチド」は、本明細書では、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのバリアントを指すために用いられる。
【００４５】
用語「非代替軽鎖分子」または「非ＳＬＣ分子」は、本明細書では、ＳＬＣポリペプチドでない分子を指すために用いられる。非ＳＬＣ分子は、ポリペプチド、例えば、サイトカインまたは抗体フラグメントであってもよい。
【００４６】
用語「ＶｐｒｅＢ」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、詳細には、非限定的に、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３様配列、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴをはじめとする任意の天然型配列またはバリアントＶｐｒｅＢポリペプチド、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、そのような天然型配列ポリペプチドのバリアントをはじめとするアイソフォームを指す。
【００４７】
用語「λ５」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、詳細には、非限定的に、配列番号６のヒトλ５、配列番号７のヒトλ５様タンパク質、配列番号９として示されるヒトλ５ ｄＴ、配列番号１０のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、そのような天然型配列λ５ポリペプチドのバリアントをはじめとするアイソフォームを指す。
【００４８】
用語「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」および「ＶｐｒｅＢポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書ではアミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列ＶｐｒｅＢポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、好ましくは天然型配列ＶｐｒｅＢポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントＶｐｒｅＢポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントＶｐｒｅＢポリペプチドとしては、非限定的に、ＶｐｒｅＢ配列のＣ末端の非Ｉｇ様ユニークテールが部分的または完全に除去されているＶｐｒｅＢポリペプチドが挙げられる。
【００４９】
用語「バリアントλ５ポリペプチド」および「λ５ポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書では、アミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列λ５ポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントλ５ポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントλ５ポリペプチド」は、好ましくは天然型配列λ５ポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントλ５ポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントλ５ポリペプチドとしては、非限定的に、λ５配列のＮ末端のユニークテールが部分的または完全に除去されているλ５ポリペプチドが挙げられる。
【００５０】
用語「バリアントＶκ様ポリペプチド」および「Ｖκ様ポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書では、アミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列Ｖκ様ポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、好ましくは天然型配列Ｖκ様ポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントＶκ様ポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントＶκ様ポリペプチドとしては、非限定的に、Ｖκ様配列のＣ末端の非Ｉｇ様ユニークテールが部分的または完全に除去されているＶκ様ポリペプチドが挙げられる。
【００５１】
用語「バリアントＪＣκポリペプチド」および「ＪＣκポリペプチドのバリアント」は、互換的に用いられ、本明細書では、アミノ酸修飾の結果、１ヶ所以上のアミノ酸位置が天然型配列ＪＣκポリペプチドと異なっているポリペプチドと定義される。本明細書で定義される「バリアントＪＣκポリペプチド」は、天然型抗体λもしくはκ軽鎖配列、またはそれらのフラグメントとは異なる。「バリアントＪＣκポリペプチド」は、好ましくは天然型配列ＪＣκポリペプチドと、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持する。別の好ましい実施形態において、「バリアントＪＣκポリペプチド」は、天然型抗体λまたはκ軽鎖配列と９５％未満、または９０％未満、または８５％未満、または８０％未満、または７５％未満、または７０％未満、または６５％未満、または６０％未満のアミノ酸配列が同一である。具体的には、バリアントＪＣκポリペプチドとしては、非限定的に、ＪＣκ配列のＮ末端のユニークテールが部分的または完全に除去されているＪＣκポリペプチドが挙げられる。
【００５２】
アミノ酸配列同一性の百分率は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いて決定してもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、からダウンロードしてもよく、さもなければメリーランド州ベセスダのアメリカ国立衛生研究所から得てもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、複数の研究パラメータを利用しており、それらの研究パラメータの全てが、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ ｆｏｒ ｆｉｎａｌ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５、ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、をはじめとするデフォルト値に設定される。
【００５３】
用語「ＶｐｒｅＢ配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「ＶｐｒｅＢ」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５４】
用語「λ５配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「λ５」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５５】
用語「Ｖκ様配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「Ｖκ様」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５６】
用語「ＪＣκ配列」は、本明細書では、本明細書の先に定義された「ＪＣκ」またはそのフラグメントの配列を指すために用いられる。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「λ様代替軽鎖」は、ＶｐｒｅＢとλ５タンパク質との非共有結合的会合により形成される二量体を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「κ様代替軽鎖」は、Ｖκ様とＪＣκタンパク質との非共有結合的会合により形成される二量体を指す。
【００５９】
本明細書に定義される用語「λ様代替軽鎖」は、本明細書の先に定義された「ＶｐｒｅＢ配列」および／または「λ５配列」を含む任意のポリペプチド配列を意味する。具体的には、本明細書に定義される「λ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴ；および配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ１アミノ酸配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、それらのフラグメントおよびバリアントをはじめとする様々なアイソフォームが挙げられる。加えて用語「λ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号７のヒトλ５配列、配列番号８のヒトλ５様配列、配列番号９として示されるヒトλ５ ｄＴａｉｌ、配列番号１０のヒトλ５ ｄＴａｉｌ、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、それらのフラグメントおよびバリアントをはじめとするアイソフォームが挙げられる。加えて用語「λ様代替軽鎖配列」としては、本明細書の先に定義されたＶｐｒｅＢおよびλ５の両方の配列を含む配列が挙げられる。
【００６０】
本明細書に定義される用語「κ様代替軽鎖配列」は、本明細書の先に定義された「Ｖκ様配列」および／または「ＪＣκ」を含む任意のポリペプチド配列を意味する。具体的には、本明細書に定義される「κ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号１２〜２４のいずれかのヒトＶκ様配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、それらのフラグメントおよびバリアントをはじめとする様々なアイソフォームが挙げられる。加えて「κ様代替軽鎖配列」としては、非限定的に、配列番号１２〜２４のいずれかのヒトＶκ様配列、配列番号２５〜３５のいずれかのヒトＪＣκ配列、ならびにスプライスバリアントおよび翻訳後修飾により形成されたバリアント、別のホ乳類のその相同物に加えて、そのフラグメントおよびバリアントをはじめとするアイソフォームが挙げられる。加えて用語「κ様代替軽鎖配列」としては、本明細書の先に定義されたＶκ様およびＪＣκの両方の配列を含む配列が挙げられる。
【００６１】
用語「代替軽鎖構造体」は、最も広い意味で用いられ、異種アミノ酸配列、核酸、および代替軽鎖配列にコンジュゲートされた別の分子をはじめとする任意の、そして全ての追加の異種成分を包含し、「コンジュゲーション」は、以下に定義する。
【００６２】
「代替軽鎖構造体」は、本明細書では、「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ（商標）」または「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ」とも呼ばれ、その２つの用語は、互換的に用いられる。特定のＳｕｒｒｏｂｏｄｙ（商標）λ様代替軽鎖構造体は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１および２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に開示されている。同じく企図されるのは、米国特許公開第２０１０−００６２９５０号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に記載されたκ様代替軽鎖構造体であり、それらの開示の全体は、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
【００６３】
本発明のポリペプチドの文脈において、第一のアミノ酸配列に関する用語「異種アミノ酸配列」は、第一のアミノ酸配列に自然に会合されておらず、少なくとも第一のアミノ酸配列が本明細書の代替軽鎖構造体内に存在する形態ではないアミノ酸配列を指すために用いられる。したがって、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、またはＪＣκに関する「異種アミノ酸配列」は、その天然の環境において、天然型ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、またはＪＣκと会合されていない任意のアミノ酸配列である。これらには、非限定的に、ｉ）ＶｐｒｅＢと共に発達中のＢ細胞上に代替軽鎖を形成するそれらのλ５配列とは異なるλ５配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたλ５配列；ｉｉ）λ５と共に発達中のＢ細胞上に代替軽鎖を形成するそれらのＶｐｒｅＢ配列とは異なるＶｐｒｅＢ配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたＶｐｒｅＢ配列；ｉｉｉ）ＪＣκ様と共に発達中のＢ細胞上にκ様代替軽鎖を形成するそれらのＶκ様配列とは異なるＶκ様配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたＶκ様配列；ならびにｉｖ）Ｖκ様と共に発達中のＢ細胞上にκ様代替軽鎖を形成するそれらのＪＣκ配列とは異なるＪＣκ配列、例えば、アミノ酸配列バリアント、例えば、トランケートおよび／または誘導体化されたＪＣκ配列が挙げられる。
【００６４】
ＶｐｒｅＢまたはλ５に関する「異種アミノ酸配列」は、天然の環境では、ＶｐｒｅＢまたはλ５配列は互いに共有結合的に会合、例えば融合されていないため、天然型配列ＶｐｒｅＢまたはλ５をはじめとする対応するＶｐｒｅＢまたはλ５と共有結合的に会合、例えば融合されている、ＶｐｒｅＢまたはλ５配列も包含する。同様に、Ｖκ様またはＪＣκに関する「異種アミノ酸配列」は、天然の環境では、Ｖκ様またはＪＣκ配列は互いに共有的に会合、例えば融合されていないため、天然型配列Ｖκ様またはＪＣκをはじめとする対応するＶκ様またはＪＣκと共有結合的に会合、例えば融合されている、Ｖκ様またはＪＣκ配列も包含する。異種アミノ酸配列としては、非限定的に、抗体および重鎖配列をはじめとする抗体配列ならびにそれらのフラグメント、例えば、抗体軽鎖および重鎖可変領域配列、ならびに抗体軽鎖および重鎖定常領域配列も挙げられる。
【００６５】
用語「コンジュゲート」、「コンジュゲートされた」および「コンジュゲーション」は、共有結合または非共有結合の任意の、そして全ての形態を指し、非限定的に、直接遺伝子融合または化学的融合、リンカーまたは架橋剤を介したカップリング、そして例えば、ファンデルワールス力を介した、またはロイシンジッパーを用いた非共有結合的会合が挙げられる。
【００６６】
用語「可撓性リンカー」は、本明細書では、化学構造に基づけば、意図された文脈および環境において三次元空間に固定されていると予測されない任意のリンカーを指すために用いられる。
【００６７】
用語「融合」は、本明細書では、１本のポリペプチド鎖内の異なる起点のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をインフレームで組み合わせることによって、それらのアミノ酸配列を組み合わせることを指すのに用いられる。用語「融合」は、その末端の１つと融合することに加えて、内部融合、即ちポリペプチド鎖内の異なる起点の配列を挿入することを明示的に包含する。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は全て、共有結合的「ペプチド結合」によって連結されたアミノ酸の一次配列を指す。一般に、ペプチドは、少数のアミノ酸、典型的には約２〜約５０のアミノ酸からなり、タンパク質よりも短い。本明細書で定義される用語「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質を包含する。
【００６９】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、典型的には、当該技術分野で認識された定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されるアミノ酸を指すが、修飾アミノ酸、合成アミノ酸または希アミノ酸を所望どおり使用してもよい。したがって、具体的には３７ ＣＦＲ １．８２２（ｂ）（４）に列挙された修飾および異常アミノ酸は、この定義に含まれ、本明細書に参照により明確に組み込まれる。アミノ酸は、様々な亜群に細分することができる。したがってアミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負電荷の側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正電荷の側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を有するとして分類することができる。アミノ酸は、小アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）および塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）として分類することもできる。
【００７０】
用語「ポリヌクレオチド」は、核酸、例えば、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ならびにそれらの類似体（例えば、ヌクレオチド類似体または核酸化学を利用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、所望通り、例えば当該技術分野で認識された核酸化学を利用して、合成的に生成し、または例えばポリメラーゼを用いて、酵素的に生成し、そして所望なら修飾してもよい。典型的な修飾としては、メチル化、ビオチン化、および当該技術分野で公知の別の修飾が挙げられる。加えて核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよく、所望ならば、検出可能な部分と連結させることができる。
【００７１】
参照ポリペプチドに関する用語「バリアント」は、天然型ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異または修飾（すなわち、改変）を有するポリペプチドを指す。「アミノ酸修飾」により生成されたバリアントは、例えば、天然型アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失、挿入および／または化学修飾することによって生成することができる。
【００７２】
「アミノ酸修飾」は、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を指す。例示的な修飾としては、アミノ酸置換、挿入および／または欠失が挙げられる
【００７３】
特定の位置「でのアミノ酸修飾」は、特定の残基の置換もしくは欠失、または特定の残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基に「隣接する」挿入は、その１つまたは２つの残基の内部の挿入を意味する。挿入は、Ｎ末端またはＣ末端から特定の残基までに存在してもよい。
【００７４】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列内の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基を、別の異なる「交換」アミノ酸残基で交換することを指す。交換残基は、「天然アミノ酸残基」（即ち、遺伝子コードによりコードされている）であってもよく、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リシン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されてもよい。１つ以上の非天然アミノ酸残基での置換も、本明細書でのアミノ酸置換の定義に包含される。
【００７５】
「非天然アミノ酸残基」は、先に列挙された天然アミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基と共有結合できる残基を指す。非天然アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよびＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１ ３３６（１９９１）に記載されるような別のアミノ酸残基類似体が挙げられる。そのような非天然アミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．の上記文献の手順を用いることができる。簡潔に述べると、これらの手順は、非天然アミノ酸残基によりサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化させて、ＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を行うことを含む。
【００７６】
「アミノ酸挿入」は、少なくとも１つのアミノ酸を所定のアミノ酸配列に組込むことを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、本願は、より大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３〜約５または最大約１０のアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入された残基は、先に開示された通り天然または非天然のものであってもよい。
【００７７】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【００７８】
用語「突然変異誘発」は、他に明記されていなければ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための、任意の当該技術分野で認識された技術を指す。突然変異誘発の好ましいタイプとしては、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、または別の部位特異的突然変異誘発が挙げられる。
【００７９】
「部位特異的突然変異誘発」は、当該技術分野における技術標準であり、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施して、限定されたミスマッチ以外の変異を誘発させると、所望の突然変異が現れる。簡潔に述べると、合成オリゴヌクレオチドを、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な鎖の合成を導くプライマーとして用い、得られた二本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌（ｐｈａｇｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）内に形質変換させる。形質転換された細菌の培養物を上層寒天に塗布し、ファージを含む単細胞からのプラーク形成を可能にする。理論的には、新しいプラークの５０％が、突然変異形態を一本鎖として有するファージを含有し、５０％が本来の配列を有する。完全一致のハイブリダイゼーションが可能であるが、本来の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを防止するのに十分となる温度で、該当するプラークを、キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズすることによって選択する。その後、プローブとハイブリダイズするプラークが選択され、配列決定および培養されて、ＤＮＡが回収される。
【００８０】
用語「ベクター」は、細胞内での自己複製が可能で、ＤＮＡセグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドが作動可能に連結されることで、結合したセグメントの複製をもたらすことができるｒＤＮＡ分子を指すために用いられる。１種以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導くことが可能なベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。用語「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、特定の宿主生物中の作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した制御配列としては、プロモータ、場合によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを用いることが公知である。ベクターは、追加のＤＮＡセグメントにライゲートされている場合がある環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」であってもよい。ベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされている場合があるファージベクターまたはウイルスベクターであってもよい。適切なベクター、例えば、細菌起源を有する細菌ベクターまたは複製およびエピソームホ乳類ベクターは、導入される宿主細胞内で自己複製が可能である。ベクターは、宿主細胞に導入する際、宿主細胞ゲノム、例えば、非エピソームホ乳類ベクターに合体させて、宿主ゲノムと一緒に複製してもよい。
【００８１】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係にある場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモータもしくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接すること、そして分泌リーダーの場合、隣接し、かつ読み取り期（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって果される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実践法に従って使用する。
【００８２】
「ファージディスプレイライブラリー」は、クローン化されたタンパク質配列の回収物をファージコートタンパク質との融合体として発現するタンパク質発現ライブラリーである。したがって、語句「ファージディスプレイライブラリー」は、本明細書では、外来（一般には非相同性）タンパク質を発現するファージ（例えば、繊維状ファージ）の回収物を指す。外来タンパク質は、ファージと接触している別の部分と自由に相互作用（結合）することができる。外来タンパク質を提示する各ファージは、ファージディスプレイライブラリーの「メンバー」である。
【００８３】
用語「繊維状ファージ」は、異種ポリペプチドを表面に提示することができるウイルス粒子を指し、非限定的に、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ１、およびＭ１３が挙げられる。繊維状ファージは、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）を含有していてもよい。様々な繊維状ファージディスプレイシステムが、当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８（１９８８）参照）。
【００８４】
用語「パンニング」は、標的に対する親和力および特異性が高い、抗体などの化合物を運搬する化合物を同定および単離する際の複数回のスクリーニング工程を指すために用いられる。
【００８５】
「リーダー配列」、「シグナルペプチド」、または「分泌リーダー」は、互換的に用いられ、一部であるポリペプチドの細胞内輸送を導くアミノ酸残基を含む配列を含有する。ポリペプチドは、典型的にはＮ末端に、分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列を含有する。これらのポリペプチドは、リーダー配列がシグナルエンドペプチターゼによりポリペプチドの残り部分から開裂されうる開裂部位を含んでいてもよい。そのような開裂により、成熟ポリペプチドが生成する。開裂は、典型的には、分泌の間に、またはインタクトポリペプチドが適切な細胞内コンパートメントに導かれた後に起こる。
【００８６】
「宿主細胞」は、本明細書に記載された分子をコードする核酸および／または核酸含有ベクターの形質転換のレシピエントとなりうる、またはレシピエントになった個々の細胞または細胞培養物を包含する。本発明の方法において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞であってもよい。別の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００８７】
Ｂ．詳細な説明
本発明の方法を実施する技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｏ’Ｂｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｈｉｃｋｌｅ ａｎｄ Ｆｉｔｃｈ，ｅｄｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ，Ｔ．Ｒ．Ｇｌａｒｅ ａｎｄ Ｍ．Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，２０００；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００１；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，ｅｄ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ，２００４をはじめとする標準的な実験教書に記載されている。突然変異誘発は、例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５））を利用して実施することができる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号に、ならびに「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）をはじめとする複数の教書に記載されている。
【００８８】
非相同性リーダー配列
ヒトＶｐｒｅＢ１（ＣＡＧ３０４９５）の主なアイソフォームは、１９アミノ酸のリーダー配列を含む１４５アミノ酸長のポリペプチド（図１の配列番号１）である。類似のリーダー配列が、別のＶｐｒｅＢポリペプチド内に存在する。ヒトトランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（天然型ＶｐｒｅＢ１のＣ末端にある特徴的「テール」が欠如）は、「ＶｐｒｅＢ１ ｄＴａｉｌ配列」とも呼ばれ、配列番号５として示される。
【００８９】
ヒトλ５（ＣＡＡ１０９６２）の主なアイソフォームは、３０アミノ酸のリーダー配列を含む２０９アミノ酸長のポリペプチド（配列番号７）である。類似のリーダー配列が、別のλ５ポリペプチド内に存在する。ヒトトランケート型λ５配列（天然型λ５のＮ末端にある特徴的「テール」が欠如）は、「λ５ ｄＴａｉｌ配列」とも呼ばれ、配列番号９として示される。
【００９０】
具体的には、天然型ヒトＶκ様ポリペプチド配列としては、非限定的に、２０アミノ酸のリーダー配列を含む配列番号１１として示されるＡＪ００４９５６のポリヌクレオチドによりコードされた、ヒトκ様ポリペプチド（配列番号１２）が挙げられる。類似のリーダー配列が、別のＶκ様ポリペプチド内に存在する。
【００９１】
天然型配列ＪＣκ様ポリペプチドとしては、非限定的に、潜在的な２２アミノ酸のリーダー配列を含み、そのうちの１５のアミノ酸が伝統的に組換えられたＪＣκ配列に特有に付加されている、プロトタイプリーダー配列（配列番号２６）が欠如した、図５Ａに示されたＡＡＢ３２９８７ ヒトＪＣκポリペプチドが挙げられる。類似の組換えリーダー配列が、別のＪＣκポリペプチド内に存在する。
【００９２】
本発明は、代替軽鎖構造体が、内在性リーダーＶｐｒｅＢリーダー配列および／もしくはλ５リーダー配列、または内在性Ｖκ様リーダー配列および／もしくはＪＣκリーダー配列を含む配列から生成された場合よりも高い収率で、代替軽鎖構造体を生成するための核酸およびポリペプチド構造体を提供する。本発明は、代替軽鎖構造体が、ＶｐｒｅＢ配列および／もしくはλ５の内在性リーダー、またはＶκ様および／もしくはＪＣκの内在性リーダーのコード配列を含むか、あるいは内在性リーダー配列を含まずにＤＮＡ配列から生成された場合よりも高い収率で、代替軽鎖構造体を生成するためのベクター、宿主細胞および方法も提供する。より高い収率は、少なくとも１種の内在性分泌リーダー配列を、本発明の非相同性リーダー配列と交換することにより実現される。したがって本発明は、非相同性リーダー配列を含む、代替軽鎖および代替軽鎖構造体を提供する。
【００９３】
好ましくは、非相同性リーダーペプチドにより実現される発現レベルは、発現が本質的に同じ条件下で実施される場合に、相同性リーダー配列を用いて実現される発現レベルよりも、少なくとも約５％高い、少なくとも約１０％高い、少なくとも約２０％高い、少なくとも約３０％高い、少なくとも約４０％高い、または少なくとも約５０％高い。
【００９４】
本発明において、非相同性リーダー配列は、天然型ＶｐｒｅＢリーダー配列および／もしくは天然型λ５リーダー配列の代わりに代替軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に融合されるか、または天然型Ｖκ様リーダー配列および／もしくは天然型ＪＣκリーダー配列の代わりにκ様代替軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に融合される。本発明人は、代替軽鎖配列（一緒に融合されるか、または非共有結合的に会合されている、ＶｐｒｅＢ／λ５配列またはＶκ様／ＪＣκ配列）および抗体重鎖配列を含む代替軽鎖配列構造体の生成時に、代替軽鎖の天然型リーダー配列とは対照的に、特定の非相同性リーダー配列が意外にも良好に機能することを発見した。
【００９５】
本発明によれば、非相同性リーダー配列は、抗体軽鎖ならびにヒトおよび非ヒトホ乳類分泌タンパク質のリーダー配列をはじめとする、高度翻訳タンパク質からの任意のリーダー配列であってもよい。分泌タンパク質が含まれており、それらの配列は、一般のデータベース、例えばＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＲｅｆＳｅｑ、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＣＢＩ−Ｇｅｎｅから入手できる。加えて、ＳＰＤ、つまりウェブに基づく分泌タンパク質データベース、ｈｔｔｐ：／／ｓｐｄ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．で入手できる、そのような配列の供給源である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００５，３３：Ｄ１６９−Ｄ１７３）。そのような分泌タンパク質としては、非限定的に、抗体、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、消化酵素、および細胞外マトリックスの成分が挙げられる。
【００９６】
サイトカインのうちで含まれるのは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β（ＴＮＦ−αおよび−β）；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子である。
【００９７】
本発明の構造体での使用に適した追加のリーダー配列は、一般に入手可能なシグナルペプチドデータベース、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｓ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｑ／ｓｐｄｂでアクセス可能なＳＰｄｂシグナルペプチドデータベースに含まれる（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５，６：２４９参照）。
【００９８】
適切な非相同性リーダー配列の具体的な例としては、非限定的に、ヒトおよび非ヒトホ乳類アルブミン、トランスフェリン、ＣＤ３６、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ニューブラスチンのリーダー配列、ならびに別の分泌ヒトおよび非ヒトタンパク質からのリーダーペプチドが挙げられる。
【００９９】
マウスＩｇκリーダー配列は、非相同性リーダー配列として用いられてもよい（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ−配列番号３６）。
【０１００】
非相同性リーダー配列が、ｉ）ＶｐｒｅＢおよびλ５の両方の代替軽鎖構造体、またはｉｉ）Ｖκ様およびＪＣκの両方の代替軽鎖構造体、に存在する場合、ｉ）またはｉｉ）内の各非相同性リーダー配列は、他方と同一であってもよく、または他方と異なっていてもよい。
【０１０１】
天然型タンパク質からのシグナルペプチドに加えて、本発明の非相同性リーダー配列としては、消化されて、本質的に生じるリーダー配列の性能を更に改善することができ、本発明の代替軽鎖構造体の発現で用いられる宿主生物中での最良の性能のために特別に適合させることができる、合成およびコンセンサスリーダー配列が挙げられる。
【０１０２】
代替軽鎖構造体
本明細書の代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体は、抗体レパートリーの通常の発達時に生成されるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づいている。抗体とは異なり、プレＢＣＲは、２つの代替軽鎖成分、ＶｐｒｅＢおよびλ５と対になった抗体重鎖で構成された三量体である。ＶｐｒｅＢおよびλ５は両者とも、遺伝子再配列を受けない遺伝子によりコードされ、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの開始前に初期のプロＢ細胞内で発現される。プレＢＣＲは、１つの重鎖と、２つの非共有結合的に会合されたタンパク質：ＶｐｒｅＢおよびλ５とで構成された成熟免疫グロブリンとは、構造的に異なっており、即ちそれらは、抗体内の２つの成分とは対照的に３つの成分を有する。更に、ＶｐｒｅＢはＶλＩｇドメインと相同性があり、λ５は抗体のＣλドメインと相同性があるが、それぞれは、非標準のペプチド伸長を有し、ＶｐｒｅＢ１は、Ｃ末端に追加の２１の残基を有し；λ５は、Ｎ末端に５０アミノ酸の伸長を有する。Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの設計および生成の更なる詳細については、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００８，１０５（３１）：１０７５６−６１、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に提供されている。
【０１０３】
同様に、本明細書に記載されたκ様代替軽鎖構造体は、プレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）に基づいている。κ様軽鎖は、ＪＣκ融合遺伝子と組になった生殖細胞系ＶκＩＶ遺伝子である。これらの遺伝子のそれぞれにおいて、ペプチド伸長は、ＣＤＲ３と類似した部位の付近に存在する。これらの２種のタンパク質は、ゲノムレベルで組換えられていないようであるため、重鎖への会合が相互に排他的で、λ様代替軽鎖に記載された会合と類似していると思われる。κ様代替軽鎖構造体の設計および生成の更なる詳細については、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、米国特許公開第２０１０−００６２９５０号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に見出すことができる。
【０１０４】
本発明は、代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドと、非相同性シグナル配列を含む代替軽鎖配列を有するＳＬＣポリペプチドを含有するＳＬＣ構造体とを企図する。一実施形態において、ＳＬＣ構造体は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、λ５配列にコンジュゲートされたＶｐｒｅＢ配列を含んでいてもよい。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、天然型ＶｐｒｅＢ１配列、天然型ＶｐｒｅＢ２配列、天然型ＶｐｒｅＢ３配列ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の一実施形態において、天然型ＶｐｒｅＢ配列は、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ様ポリペプチド、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。別の一実施形態において、λ５配列は、配列番号７のヒトλ５様、配列番号８のヒトλ５ポリペプチド、または配列番号９のヒトλ５ ｄＴａｉｌポリペプチドの全てまたは一部を含む。
【０１０５】
本発明は、λ５配列およびＶｐｒｅＢ配列が共有結合リンカーにより結合されている、ＳＬＣ構造体も企図する。一実施形態において、本発明は、λ５配列がＶｐｒｅＢ配列と非共有結合的に会合されている、ＳＬＣ構造体を提供する。別の一実施形態において、本発明は、前記ＶｐｒｅＢ配列とλ５配列とのコンジュゲートが抗体重鎖配列と非共有結合的に会合されている、ＳＬＣ構造体を企図する。
【０１０６】
本明細書に記載された通り、本発明は、ＳＬＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子、およびＳＬＣポリペプチドを含むＳＬＣ構造体に関する。一実施形態において、本発明は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、λ５配列に融合されたＶｐｒｅＢ配列を含む代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ペプチドまたはペプチドリンカーによりλ５配列に結合されたＶｐｒｅＢ配列を含む代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の一実施形態において、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、核酸で形質転換された組換え宿主細胞を提供する。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、代替軽鎖構造体のライブラリーを提供する。別の実施形態において、ライブラリーは、ＳＬＣをコードする核酸を含む。別の一実施形態において、ライブラリーは、ディスプレイの形態であってもよい。
【０１０８】
別の一態様において、本発明は、κ様代替軽鎖ポリペプチドと、κ様ＳＬＣポリペプチドを含むＳＬＣ構造体とを企図する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列にコンジュゲートされたＶκ様配列を含むκ様ＳＬＣ構造体に関する。別の実施形態において、Ｖκ様配列は、配列番号１２〜２４、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。他の一実施形態において、ＪＣκ配列は、配列番号２６〜３９、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、Ｖκ様配列が前記ＪＣκ配列に融合されている、κ様ＳＬＣ構造体を企図する。別の実施形態において、融合は、それぞれ前記Ｖκ様配列および前記ＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および前記ＪＣκ配列が共有結合リンカーにより結合されている、κ様ＳＬＣ構造体を企図する。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列が前記ＪＣκと非共有結合的に会合されている、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列と前記ＪＣκ配列とのコンジュゲートが抗体重鎖配列と非共有結合的に会合されている、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、前記分泌リーダー配列が合成配列であってもよい、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、前記分泌リーダー配列が天然型分泌リーダー配列のコンセンサス配列であってもよい、κ様ＳＬＣ構造体を提供する。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、κ様ＳＬＣ構造体をコードする、単離された核酸を提供する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列に融合されたＶκ様配列を含むκ様代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ペプチドまたはペプチドリンカーによりＪＣκ配列に結合されたＶκ様配列を含むκ様代替軽鎖をコードする核酸を提供する。別の一実施形態において、本発明は、核酸を含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、核酸で形質転換された組換え宿主細胞を提供する。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、κ様代替軽鎖構造体のライブラリーを提供する。別の実施形態において、ライブラリーは、κ様ＳＬＣをコードする核酸を含む。別の一実施形態において、ライブラリーは、ディスプレイの形態であってもよい。
【０１１４】
別の一態様において、本発明は、κ様ＳＬＣの発現方法を提供する。一実施形態において、本発明は、前記Ｖκ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列に共有結合されたＶκ様配列を含むキメラ分子をコードする核酸で前記組換え宿主細胞を形質転換することを含む、組換え宿主細胞におけるκ様代替軽鎖の発現方法を提供する。一実施形態において、Ｖκ様配列は、ＪＣκ配列に融合されている。別の実施形態において、Ｖκ様配列は、ペプチドまたはペプチドリンカーを介してＪＣκ配列に結合されている。別の実施形態において、組換え宿主細胞は、真核細胞である。一実施形態において、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【０１１５】
別の一実施形態において、本発明は、配列番号６として示されたＶｐｒｅＢ配列を含むＳＬＣ構造体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１０として示されたλ５配列を含むＳＬＣ構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号３５として示されたポリペプチドを含むＳＬＣ構造体を提供する。
【０１１６】
λ様Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの具体的な例としては、天然型配列のフラグメントおよびバリアントを含むＶｐｒｅＢ配列、例えば、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ２、またはＶｐｒｅＢ３配列が、天然型配列のフラグメントおよびバリアントを含むλ５配列にコンジュゲートされている、ポリペプチドが挙げられる。このタイプの代表的融合は、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１１８９７０号に提供されている。非相同性リーダー配列での融合の例は、図３（配列番号３５）に示されている。
【０１１７】
直接の融合において、典型的にはＶｐｒｅＢ配列のＣ末端（例えば、ＶｐｒｅＢ１、ＶｐｒｅＢ２、またはＶｐｒｅＢ３配列）は、λ５配列のＮ末端に融合されている。完全長の天然型ＶｐｒｅＢ配列を完全長λ５配列に融合することは可能であるが（例えば、図７の最初の図解を参照）、典型的には融合は、２つのポリペプチドそれぞれのＣＤＲ３類似部位で、またはその周辺で起こる。ＶｐｒｅＢ１およびλ５の類似ＣＤＲ３部位に基づく代表的な融合構造体を、図６に示す。この実施形態において、融合は、ＣＤＲ３類似領域の片側の約１０のアミノ酸残基の内部で、またはその内部のある位置で起こってもよい。好ましい実施形態において、融合は、天然型ヒトＶｐｒｅＢ１配列（配列番号１）の約１１６アミノ酸残基から１２６アミノ酸残基の間、および天然型ヒトλ５配列（配列番号７）の約８２アミノ酸残基から９３アミノ酸残基の間で起こる。
【０１１８】
ＶｐｒｅＢ配列またはλ５配列を、それぞれ抗体λ軽鎖のＣＤＲ３領域または抗体軽鎖の可変領域に融合することもできる。ＶｐｒｅＢおよびλ５の一方だけがトランケートされている追加の構造体も、図７に示す。類似の構造体を、抗体κ軽鎖配列を用いて調製することができる。κ様代替軽鎖構造体の例示を、図１２〜１９に見出すことができる。
【０１１９】
更なる直接融合構造を、図１１の右側に示す。「ＳＬＣ融合１」と称される構造は、トランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（天然型ＶｐｒｅＢ１配列のＣ末端にある特徴的「テール」が欠如）の、同様にトランケートされたλ５配列への融合体が、抗体重鎖と非共有結合的に会合されている、２つの二量体で構成された四量体である。「ＳＬＣ融合２」と称される構造は、トランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（天然型ＶｐｒｅＢ１配列のＣ末端にある特徴的「テール」が欠如）の、抗体軽鎖構造体領域への融合体が、抗体重鎖と非共有結合的に会合されている、２つの二量体で構成された四量体である。「ＳＬＣ融合３」と称される構造は、抗体軽鎖可変領域のトランケート型λ５配列（天然型λ５のＮ末端にある特徴的「テール」が欠如）への融合体が、抗体重鎖と非共有結合的に会合されている、２つの二量体で構成された四量体である。
【０１２０】
先に注記された通り、本発明のポリペプチド構造体は、直接融合に加えて、ＶｐｒｅＢ配列（天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含む）と、異種配列、例えばλ５配列（天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含む）および／または抗体配列との非共有結合的会合を包含する。したがって、例えば完全長ＶｐｒｅＢ配列が、トランケート型λ５配列と非共有結合的に会合されていてもよい。あるいはトランケート型ＶｐｒｅＢ配列が、完全長λ５配列と非共有結合的に会合されていてもよい。
【０１２１】
抗体重鎖との非共有結合的会合において、非共有結合的に会合されたＶｐｒｅＢ１およびλ５配列を含む代替軽鎖構造体を、図１１の左側に示す。様々な例示を示したが、構造が、例えば完全長ＶｐｒｅＢ１およびλ５配列、トランケート型λ５配列と会合された完全長ＶｐｒｅＢ１配列（「λ５ ｄＴ」）、完全長λ５配列と会合されたトランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（「ＶｐｒｅＢ ｄＴ」）およびトランケート型λ５配列と会合されたトランケート型ＶｐｒｅＢ１配列（「短」）を包含してもよい。
【０１２２】
図１１は、特定の具体的構造体を示しているが、様々な他の構造体を類似の様式で製造および使用しうることは、当業者には理解されよう。例えば構造は、図１１に示された構造とは対照的に、非対称で、各アームに異なる代替軽鎖配列を含んでいても、そして／または三量体もしくは五量体構造を有していてもよい。
【０１２３】
本明細書の代替軽鎖構造体（Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ）の全てが、抗体配列と会合されていてもよい。例えば図９に示す通り、ＶｐｒｅＢ−λ５融合体は、ペプチドリンカーにより、抗体重鎖の可変領域配列に連結することができる。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢ−λ５融合体は、抗体重鎖、または可変領域配列を含むそのフラグメントと非共有結合的に会合されて、二量体複合体を形成している。更に別の実施形態において、ＶｐｒｅＢおよびλ５配列は、互いに、そして抗体重鎖または可変領域配列を含むそのフラグメントに、非共有結合的に会合されており、それにより三量体複合体を形成している。抗体重鎖を含む実例の構造体を、図１１に示す。
【０１２４】
κ様Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの具体的例としては、天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含むＶκ様配列が、天然型配列のフラグメントまたはバリアントを含むＪＣκ配列にコンジュゲートされているポリペプチドが挙げられる。この型の代表的な融合体は、全体の開示が本明細書に参照により明確に組み込まれる、米国特許公開第２００１−００６２９５０号、およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９７，３５２−３６０に示されている。
【０１２５】
本明細書のポリペプチド構造体の具体的例としては、Ｖκ様および／またはＪＣκ配列が抗体重鎖、またはそのフラグメントに会合されているポリペプチドが挙げられる。Ｖκ様配列およびＪＣκ配列の両方を含む具体的なヘテロ二量体構造体を、図１２に示す。図１２に示す通り、本発明のκ様代替軽鎖構造体では、Ｖκ様ポリペプチドおよび／またはＪＣκポリペプチドは、類似の抗体配列内に存在しない、それぞれＣ−およびＮ−末端伸長を含有していてもよい。あるいは伸長の一部または全体が、本明細書のκ様代替軽鎖構造体から除去されていてもよい。
【０１２６】
個別に用いられうる、または追加の異種配列、例えば抗体重鎖配列、例えば、完全長抗体重鎖またはそのフラグメントにより、更に誘導体化および／または会合されうる他のκ様代替軽鎖構造体。
【０１２７】
Ｖκ様ポリペプチドおよび／またはＪＣκポリペプチドのＣ−およびＮ−末端伸長は、本発明の構造体に存在する必要はないが、図１４に示す通り、ループライブラリーをスクリーニングした結果、それらは直線伸長、または例えば多様性に制約のある形態のいずれかにより、組み合わせ的機能多様性を創り出すための特有の好機を提供するため、少なくとも１種のそのような付加物の少なくとも一部を保持することが有益となる。加えて、Ｖκ様ポリペプチドおよび／またはＪＣκポリペプチドの「テール」部分が、他のペプチドおよび／またはポリペプチドに融合されて、様々な所望の特性、例えば、結合の強化、追加の結合特異性、ｐＫの上昇、半減期の改善、半減期の短縮、細胞表面への固定、細胞内トランスロケーションの増加、ドミナントネガティブ活性などを提供することができる。具体的な機能的テール伸長を、図１８に列挙する。
【０１２８】
所望なら、本発明の構造体を、例えば、公知の治療抗体をはじめとする抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域の公知配列または配列モチーフを、κ様代替軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３類似領域に組込む、または付加することにより、設計することができる。これにより、抗体ではないが、公知の治療抗体と同様の、またはそれを超えた結合特異性または親和力を示す分子を作製することができる。
【０１２９】
Ｖκ様およびＪＣκ遺伝子は、独立したタンパク質として、そして代替軽鎖として機能することができるポリペプチドをコードしているため、代替様の軽鎖を、真の軽鎖から設計することができ、そして設計された真の代替軽鎖のために提案されたこれまでの適用例に用いることができる。これは、ＶｐｒｅＢまたはＶκ様遺伝子のいずれかに類似したペプチド伸長を含む可変軽領域を発現することにより、果たすことができる。同様に、定常領域を、λ５またはＪＣκ遺伝子のいずれかおよびそれらのペプチド伸長と似せるように設計することができる。更に任意のキメラまたはヘテロ二量体の組み合わせは、本明細書の範囲内である。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、ＳＬＣ構造体は、異種アミノ酸配列または非ＳＬＣポリペプチドを含む。特定の実施形態において、異種アミノ酸配列は、１種以上の追加の機能性を、本発明の構造体に付加する。ＳＬＣ構造体は、非ＳＬＣポリペプチドを含むように設計されてもよい。一実施形態において、非ＳＬＣポリペプチドは、第一のＳＬＣ成分および／または第二のＳＬＣ成分に融合されている。非ＳＬＣポリペプチドのアミノ末端が、第一のＳＬＣ成分のカルボキシ末端に融合されていてもよく、そして／または非ＳＬＣポリペプチドのカルボキシ末端が、第二のＳＬＣ成分のアミノ末端に融合されていてもよい。別の実施形態において、第一のＳＬＣ成分は、ＶｐｒｅＢポリペプチドまたはＶκ様ポリペプチドである。別の一実施形態において、第二のＳＬＣ成分は、λ５ポリペプチドまたはＪＣκポリペプチドである。
【０１３１】
所望の結合特異性を有する抗体可変領域配列を含む、追加の機能性を有するλ様ＳＬＣ構造体を、図１０に示す。詳細には図１０は、ＶｐｒｅＢおよびλ５に連結する融合タンパク質を作製するための抗ＶＥＧＦ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の挿入を示している（図１０Ａ）。こうして得られた、設計されたＳＬＣ制約ｓｃＦｖは、抗ＴＮＦ−α抗体の重鎖と対をなしている。図１０Ｂは、ＶｐｒｅＢのＣ末端への抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖの融合を表わしている。図１０Ｃは、λ５のアミノ末端への抗オボアルブミンｓｃＦｖの融合を表わしている。ＴＮＦ−αおよびオボアルブミンの両方に結合する能力を有する３部のタンパク質複合体を形成することができる。図１０Ｄは、三特異性分子を作製するための、２つの融合構造体（ＶｐｒｅＢ−抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖおよびλ５−抗オボアルブミン）と抗ＴＮＦ−α抗体の重鎖との組み合わせを表わしている。ＶｐｒｅＢおよびλ５ポリペプチド配列を含む様々な二機能性および三機能性構造体を、そのような方策を用いて構築してもよい。加えて図８に表わされる通り、組み合わせ的機能多様性を、λ様ＳＬＣ構造体に組込んでもよい。
【０１３２】
所望の結合特異性を有する抗体可変領域配列を含む追加の機能性を有するκ様ＳＬＣ構造体を、図１７に示す。詳細には図１７は、本明細書の先に記載された、Ｖκ様およびＪＣκポリペプチド配列を含む様々な二機能性および三機能性構造体を示している。
【０１３３】
本発明の代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体は、二量体または２部構成で提供されてもよい。この構成の例を図９に提供し、それは、２部構成に対応するＶｐｒｅＢ−λ５融合体および抗体重鎖（右側、下から二番目の図）のタンパク質構造を示している。ＳＬＣ構造体は、三量体または３部構成で提供されてもよい。図９は、３部構成に対応するＶｐｒｅＢ、λ５、および抗体重鎖（右側、一番下の図）のタンパク質構造を示している。
【０１３４】
本発明の代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体は、二機能または二特異性形態で提供されてもよい。図２０は、この例を示し、（Ａ）は、Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成を表しており、（Ｂ）は、二機能性および二特異性Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成を表わしている。図２０（Ｂ）に示される通り、ＳＬＣ構造体は、ＳＬＣポリペプチド成分（例えば、ＶｐｒｅＢ、λ５、Ｖκ様、ＪＣκポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくはバリアント）、および非ＳＬＣ分子を有するＳＬＣ融合ポリペプチドを含んでいてもよい。一実施形態において、非ＳＬＣ分子は、特定の機能を有する任意のポリペプチドであってもよい。別の実施形態において、ポリペプチドは、追加の機能性を提供しうるサイトカインであってもよい。別の実施形態において、非ＳＬＣポリペプチドは、追加の特異性を提供しうる抗体フラグメントであってもよい。図２０（Ｃ）は、実例のＳＬＣ融合クローニング方策およびその各アミノ酸を表わしている。斜線のエリアは、ＶｐｒｅＢ（アミノ酸１２０〜１４５）およびλ５（アミノ酸３８〜９２）の非免疫グロブリンテール領域を表す。「Ｌ」は、内在性リーダー配列を示し、「ｍＬ」は、合成Ｉｇκリーダー配列を示す。「融合」は、非ＳＬＣ分子など、該当する遺伝子の融合部位を示す。
【０１３５】
代替軽鎖構造体の調製
核酸コード代替軽鎖、例えば、ＶｐｒｅＢおよびλ５ポリペプチド、またはＶκ様もしくはＪＣκポリペプチドを、天然供給源、例えば、発達中のＢ細胞から単離することができ、そして／または合成もしくは半合成法により得ることができる。このＤＮＡが同定され単離されるか、さもなければ生成されれば、更なるクローニングまたは発現のために複製可能なベクターにライゲートすることができる。
【０１３６】
本明細書のポリペプチドのコード配列を発現するために用いうるクローニングおよび発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、市販されている。一般にベクター成分は、非限定的に、以下のものの１つ以上が挙げられる：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモータ、および転写終結配列。本明細書のベクター内の代替軽鎖構造体をコードするＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物（ホ乳類）細胞であり、ホ乳類細胞が好ましい。
【０１３７】
適切なホ乳類宿主細胞系の例としては、非限定的に、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；懸濁培養での増殖用にサブクローニングされたヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞系２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
【０１３８】
ホ乳類細胞内での使用に関しては、発現ベクターでの制御機能が、多くの場合、ウイルス材料により提供される。したがって、一般に用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得ることができる。他のプロモータ、例えば、β−アクチンプロモータは、非相同性供給源から生成させる。適切なプロモータの例としては、非限定的に、ＳＶ４０ウイルスの初期または後期プロモータ（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））、ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモータ（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８；３５５−３６０（１９８２））、ならびに通常は所望の遺伝子配列に関連するプロモータおよび／または制御配列が挙げられるが、但し、そのような制御配列が、宿主細胞系と適合することが前提である。
【０１３９】
高等な真核生物による、所望の非相同性ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモータ上で作用してその転写開始活性を高める、通常は１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーは、相対的に配列および位置非依存性であるが、好ましくは発現ベクター内に存在するプロモータ配列の上流に位置する。エンハンサーは、プロモータと同じ供給源、例えば真核細胞ウイルスから、例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーから生成させてもよい。
【０１４０】
ホ乳類宿主細胞内で用いられる発現ベクターは、ポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０（初期および後期）またはＨＢＶなどのウイルス由来のものも含んでいる。
【０１４１】
複製起点は、外来起源、例えばＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源から得ることができる、または宿主細胞により提供することができる、ベクターの構築により提供されてよい。
【０１４２】
発現ベクターは、通常、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または発育に必要なタンパク質をコードする選択マーカーを含む。ホ乳類細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１４３】
適切なホ乳類発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、市販されている。したがって例えば、本発明の代替軽鎖構造体は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモータ領域を含むｐＣＩ発現ベクター（プロメガ）を用いてホ乳類宿主細胞内で産生させて、ＤＮＡ挿入部の構成的発現を促進することができる。ベクターは、ｐＴＴ５発現ベクター（カナダ国立研究機構）であってもよい。ベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を選択マーカーとして含むことができる。
【０１４４】
本発明の代替軽鎖構造体は、細菌宿主細胞内で産生することもできる。細菌系内で使用される制御要素としては、場合によりオペレータ−配列を含むプロモータ、およびリボソーム結合部位が挙げられる。適切なプロモータとしては、非限定的に、ガラクトース（ｇａｌ）、ラクトース（ｌａｃ）、マルトース、トリプトファン（ｔｒｐ）、β−ラクタマーゼプロモータ、バクテリオファージλ、およびＴ７プロモータが挙げられる。加えて合成プロモータ、例えばｔａｃプロモータを用いることができる。細菌系内で使用されるプロモータは、一般に、Ｆａｂ分子をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列も含有する。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適している。
【０１４５】
抗体代替軽鎖配列を含む多重鎖構造体内の各鎖のコード配列は、真核生物および原核生物の宿主をはじめとする所望の宿主細胞をコトランスフェクトするのに用いられる、別個の調節配列の制御下では、または別個の発現ベクター内では、同じ発現ベクター内に存在することができる。したがって、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から市販されるＤｕｅｔ（商標）ベクターを用いて、同義遺伝子を共発現させることができる。
【０１４６】
形質転換された宿主細胞は、様々な培地で培養させてもよい。ホ乳類宿主細胞を培養するための市販の培地としては、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（シグマ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），（シグマ）が挙げられる。加えてＨａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）およびＢａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）に記載された培地のいずれも、宿主細胞用の培地として用いることができる。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現用に選択される宿主細胞によって過去に利用されたものであり、製造業者の説明書に含まれるか、さもなければ当業者には自明であろう。
【０１４７】
ホ乳類、細菌（例えば大腸菌）、または他の宿主細胞を培養するのに更に適した培地は、標準の教書、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の上記文献またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．の上記文献にも記載されている。
【０１４８】
一態様において、本発明は、組換え宿主細胞内での代替軽鎖の発現方法を提供する。一実施形態において、その方法は、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ融合ポリペプチドをコードする核酸を提供するステップを含む。別の実施形態において、その方法は、組換え宿主細胞を、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ融合ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトするステップを含む。一実施形態において、ＳＬＣ融合ポリペプチドをコードする核酸は、第一のＳＬＣ配列および／または第二のＳＬＣ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、第二のＳＬＣ配列に共有結合された第一のＳＬＣ配列を含むキメラ分子である。第一のＳＬＣ配列は、ＶｐｒｅＢ配列、Ｖκ様配列、またはそれらの融合ポリペプチドであってもよい。第二のＳＬＣ配列は、λ５配列、ＪＣκ配列、またはそれらの融合ポリペプチドであってもよい。
【０１４９】
一実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、λ５配列に共有結合されている。別の実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、λ５配列に融合されている。別の一実施形態において、ＶｐｒｅＢ配列は、ペプチドまたはペプチドリンカーを介して、λ５配列に結合されている。別の一実施形態において、Ｖκ様配列は、前記κ様配列および／または前記ＪＣκ配列の天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＪＣκ配列に共有結合されている。別の医師実施形態において、Ｖκ様配列は、ＪＣκ配列に融合されている。別の実施形態において、Ｖκ様配列は、ペプチドまたはペプチドリンカーを介して、ＪＣκ配列に結合されている。
【０１５０】
全ての実施形態において、発現方法は、代替軽鎖ポリペプチドおよび／または代替軽鎖融合ポリペプチドをはじめとする、代替軽鎖ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップを含んでいてもよい。
【０１５１】
全ての実施形態において、その方法は、抗体重鎖をコードする核酸で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップを更に含んでいてもよい。
【０１５２】
一態様において、本発明は、改善された収率を有する代替軽鎖ポリペプチドおよび／または代替軽鎖融合ポリペプチドの発現方法を提供する。一実施形態において、天然型リーダー配列の代わりに非相同性リーダー配列を用いる本発明の方法は、天然型リーダー配列を非相同性リーダー配列で交換されていない方法よりも、大きなポリペプチド発現および収率を特徴とする。
【０１５３】
一実施形態において、組換え宿主細胞は、細菌細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。一実施形態において、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。
【０１５４】
一態様において、本発明は、本明細書に記載された核酸を含有する宿主細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも１種の核酸で形質転換された組換え宿主細胞を提供する。別の一実施形態において、宿主細胞は、非ＳＬＣ分子を含んでいても、または含んでいなくてもよい、ＳＬＣ融合をコードする核酸で形質転換されている。
【０１５５】
全ての実施形態において、宿主細胞は、抗体重鎖をコードする核酸で更に形質転換されている。
【０１５６】
全ての実施形態において、本発明は、本明細書に記載された核酸を含有するベクターを提供する。全ての実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載された核酸を含有する少なくとも１種のベクターで形質転換されている。
【０１５７】
精製は、当該技術分野で公知の方法により実施することができる。好ましい実施形態において、代替軽鎖構造体は、Ｎｉ−ＮＴＡ精製システム（インビトロジェン）を用いて６×Ｈｉｓタグ形態で精製される。
【０１５８】
κ様ＳＬＣ分子は、既存の軽鎖Ｖ遺伝子および軽鎖定常遺伝子から設計することができる。図１５に示す通り、軽鎖は、遺伝子再配列およびＲＮＡプロセッシングの生成物である。κ様ＳＬＣ分子の成分は、再配列されていない軽鎖Ｖ遺伝子および再配列された軽鎖ＪＣ遺伝子からの別の機能を提供するため、残りのκおよびλ軽鎖Ｖ遺伝子全てから類似の翻訳タンパク質を設計して、Ｖκ様分子（図１６Ａ）、ならびに残りのκＪＣ再配列（４ＪＣκ様）（図１６Ｂ）と、λＪＣ再配列（４“Ｊ”×１０“定数”＝４０ＪＣλ様）（図１６Ｂ）との全ての組み合わせを作製することが実行可能である。これらの設計分子のそれぞれ１つは、ＶｐｒｅＢおよびλ５、ならびにそれらの組み合わせおよびキメラを用いて、Ｖκ様およびＪＣκを用いたもの、および２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１８９７０に含まれるものと類似の目的を果たすことができる。
【０１５９】
本発明の代替軽鎖を用いて、疾患の予防および／または処置のための分子を構築することができる。そのような適用では、代替軽鎖を含有する分子は、通常、医薬組成物の形態で用いられる。技術および配合は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．１９９０）に見出してもよい。Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ，」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２−２Ｓ（１９８８）も参照されたい。
【０１６０】
ポリペプチドを基剤とする医薬組成物は、典型的には、凍結乾燥された配合剤または水性配合剤の形態で配合される。許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびクレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンをはじめとする他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１６１】
その分子は、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中で、コアセルベーション技術、または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセリロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）により、マイクロカプセルに封入してもよい。そのような技術は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
【０１６２】
本明細書に開示された代替軽鎖を含有する分子は、免疫リポソームとして配合されてもよい。分子を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号、同第４，５４４，５４５号および１９９７年１０月２３日公開のＷＯ９７／３８７３１に記載されたものなど、当該技術分野で公知の方法により調製される。循環時間を高めたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１６３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相エバポレーション法により生成させることができる。リポソームは、画定された孔径のフィルターから押出されて、所望の口径を有するリポソームが生成される。本発明の分子のフラグメントは、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートすることができる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２））。化学療法剤が、場合によりリポソーム中に含有されている。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０１６４】
疾患の予防または処置では、分子の適切な投与量は、処置される感染のタイプ、疾患の重症度および経過、ならびに抗体が予防目的または治療目的で投与されるか否かに依存する。分子は、一度に、または一連の処置を通して、適切に患者に投与される。疾患のタイプおよび重症度にもよるが、例えば、１回以上の別々の投与または連続注入のいずれにしろ、抗体約１μｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇが、患者に投与される典型的な初期候補投与量である。
【０１６５】
本発明の代替軽鎖を含有する分子は、疾患の処置または予防における使用に適している。一実施形態において、本発明は、医薬として使用される、または疾患の処置に使用される代替軽鎖含有分子を提供する。別の実施形態において、本発明は、疾患を処置する医薬の製造のための、代替軽鎖含有分子の使用を提供する。その分子は、ＳＬＣペプチドまたはＳＬＣ融合体をコードする核酸であってもよい。
【０１６６】
一態様において、本発明は、治療上効果的な量の代替軽鎖含有分子をホ乳類に投与するステップを含む、ホ乳類における疾患を処置するのに有用な方法を提供する。治療組成物を、医師の指示通り、短期（急性）もしくは慢性で、または間欠的に投与することができる。
【０１６７】
本発明は、疾患の処置、予防および／または診断に有用な材料を含有する製造品のキットおよび物品も提供する。キットは、容器と、容器の表面に設置しうる、または容器と結合しうるラベルとを含んでいる。容器は、瓶、バイアル、注射器、または任意の他の適切な容器であってもよく、様々な材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成させてもよい。容器は、本明細書に記載された代替軽鎖含有分子を有する組成物を保持しており、滅菌されたアクセスポートを有していてもよい。容器の例としては、静注液バッグ、または皮下注射針により穿孔することができるストッパー付きバイアルが挙げられる。キットは、様々な試薬、例えば希釈剤および緩衝剤を保持する追加の容器を有していてもよい。ラベルは、組成物および目的の使用のための説明書の記載を提供してもよい。分子を含有するキットは、細胞からのポリペプチドの精製または免疫沈降法のための、例えば細胞アッセイ用に、使用が見出される。例えば、タンパク質の単離および精製では、キットは、ビーズ（セファロースビーズ）に結び付いたタンパク質に結合する代替軽鎖含有分子を含有することができる。インビトロで、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて、タンパク質の検出および定量用の分子を含有するキットを提供することができる。検出に有用なそのような分子は、標識、例えば蛍光または放射線標識と共に提供されてもよい。
【０１６８】
キットは、本明細書に記載された代替軽鎖を活性剤として含む分子を含む少なくとも１つの容器を有する。ラベルを提供して、組成物が疾患の処置に使用しうることを示してもよい。ラベルは、処置を必要とする対象へ投与するための説明書を提供してもよい。キットは、薬学的に許容しうる緩衝剤、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を有する追加の容器を更に含んでいてもよい。最後に、キットは、別の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および注射器をはじめとする任意の別の適切な材料を含有していてもよい。
【０１６９】
本発明の更なる詳細を、以下の非限定的実施例において提供する。
【０１７０】
実施例１−ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの上清を、ヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞において一過性に生成させた。ｐＴＴ５プラスミド（カナダ国立研究機構）を用いて、組換えＳｕｒｒｏｂｏｄｙ軽鎖構造体を提供した。非相同性リーダー配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号３６−マウスＩｇκリーダー配列）での天然型リーダー配列の置換を行った、または行わなかったプラスミドの代替軽鎖核酸配列を提供した。以下の核酸配列を含有するｐＴＴ５プラスミドを用いた：（ａ）天然型リーダー配列（配列番号１−図１）もしくは配列番号３６の非相同性マウスＩｇκリーダー配列を含むヒトＶｐｒｅＢ１、（ｂ）天然型リーダー配列（配列番号８−図２）もしくは配列番号３６の非相同性マウスＩｇκリーダー配列を含むヒトλ５、または（ｃ）ＶｐｒｅＢ１およびλ５と、天然型ＶｐｒｅＢ１リーダー配列もしくは配列番号３６の非相同性マウスＩｇκリーダー配列との融合（配列番号３５−図３）。（ａ）および（ｂ）のプラスミドは、３部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成に対応し、（ｃ）のプラスミドは、３部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成に対応する。これらのプラスミドを、抗体重鎖を含有するｐＴＴ５プラスミドでコトランスフェクトした。
【０１７１】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙを、本質的には過去にＸｕ ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：１０７５６−１０７６１；Ｋａｓｈｙａｐ ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：５９８６−５９９１に記載された通り、ＨＥＫ２９３のＦｒｅｅｓｔｙｌｅに基づく系（インビトロジェン）で一過性に生成させた。ＨＥＫ２９３細胞を０．２５〜２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で増殖培地中で増殖させ、その後、トランスフェクションの１日前に、増殖培地９０ｍｌを含む新しい振とうフラスコに０．７５×１０６細胞／ｍｌの密度で接種した。一晩発育させた後、細胞密度を１〜１．５×１０６細胞／ｍｌであることを検証した。発現では、ｐＴＴ５発現ベクターを用いた。次に、ＤＮＡトランスフェクション剤混合物を、以下の通り調製した。プラスミドＤＮＡ（ｐＴＴ５−ＳＬＣ分子）合計０．１ｍｇに対応するＤＮＡ溶液を１０ｍｌ遠沈管内で混合して、増殖培地で最終容量を５ｍＬにした。２部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成では、抗体重鎖を含有するプラスミド０．０５ｍｇを、ＶｐｒｅＢ１−λ５キメラプラスミド（Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ融合体）０．０５ｍｇと混合した。３部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ構成では、抗体重鎖を含有するプラスミド０．０３３ｍｇを、ＶｐｒｅＢ１プラスミド０．０３３ｍｇおよびλ５プラスミド０．０３３ｍｇと混合した。次に、増殖培地４．８ｍｌをＰＥＩ ０．２ｍｌと混和してプラスミドＤＮＡ溶液に添加することにより、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション溶液を調製した。混合物を力強く１〜２秒間ボルテックス処理した。室温で１５分間インキュベートした後、プラスミドＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を、１０ｍｌピペットで１〜１．５×１０６細胞／ｍｌの密度のＨＥＫ２９３細胞を含むフラスコに移した。フラスコを直ちに回転させて、振とうインキュベータに移動させた。１２５ｒｐｍのシェーカープラットホームの付いた、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータで、細胞を６日間発育させた。得られた培養上清におけるタンパク質生成レベルを、定量的反応速度分析（フォルテバイオのＯｃｔｅｔ：抗Ｆｃセンサー）により決定した。下の表に示す通り、マウスＩｇκ軽鎖リーダー配列を置換したことで、一過性組換えＳｕｒｒｏｂｏｄｙ発現レベルが改善している。表１（ｍｇ／Ｌ）に示す通り、タンパク質レベルが少なくとも２０倍改善された。
【０１７２】
表１
【０１７３】
３部および２部Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの複数回のトランスフェクションから得られた精製タンパク質を更に分析すれば、高レベルの収量が裏づけられる。非相同性リーダーを用いた、独立したトランスフェクションのタンパク質収量を、４ヶ月の期間にわたりモニタリングした。プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかのクロマトグラフィー担体および低ｐＨでの溶出を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムで、タンパク質を精製した。表２（ｍｇ／Ｌ）に示される通り、どちらの構成においても、平均収量は、内在性代替軽鎖リーダー配列を用いて認められたものよりも実質的に高くなった。
【０１７４】
表２
【０１７５】
以下の表３は、表２で平均をとった、様々な２部および３部ＳＬＣ形態で測定された各濃度を提供している。先に記載された通り、一般に２部構成は、Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ軽鎖融合体および１つの抗体重鎖を含み、３部構成は、２つのＳｕｒｒｏｂｏｄｙポリペプチドおよび抗体重鎖を含む。１列目の１〜４７行目は、２部構成を有する４７の異なる構造体に対応し、１列目の４９〜６３行目は、３部構成を有する１５の異なる構造体に対応する。４列目は、検査されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙの特徴の幾つかを提供している。「Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ」は、２つのプロペプチドおよび１つの重鎖で作製されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。「融合体」は、２つのＳＬＣポリペプチドおよび１つの重鎖の融合体で作製されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。「ペプチドタグを含む融合体」は、エピトープタグが組込まれたＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。「機能性ペプチド融合体」は、特定の機能を有する少なくとも１つの非ＳＬＣポリペプチドが組込まれているＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構造体である。
【０１７６】
表３
【０１７７】
表３は、収率の改善が、ＳＬＣポリペプチドと、ＳＬＣ融合ポリペプチドと、非ＳＬＣ分子を含有するＳＬＣ融合ポリペプチドと、を含むＳｕｒｒｏｂｏｄｙをはじめとする複数のＳｕｒｒｏｂｏｄｙ構成で得ることができる証拠を提供している。
【０１７８】
Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ分子を、チャイニーズハムスター卵巣Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞中でも一過性に発現させることができる。Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙの上清を、（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞中で一過性に産生してもよい。組換えＳＬＣポリペプチドまたは非ＳＬＣポリペプチドのプラスミドを、製造業者の説明書に従って、１０％ウシ胎仔血清を補充されたダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（インビトロジェン、カタログ番号１１６６８−０２７）を用いて、抗体重鎖を含有するプラスミドとコトランスフェクトした。３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、培地をＧｌｕｔａｍａｘ−１（インビトロジェン、カタログ番号１２３６２）を含む新しいＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ血清使用量低減培地と交換した。トランスフェクトされた上清を７２時間後に回収して、０．２２μｍフィルター装置でろ過した。
【０１７９】
実施例２−ＣＨＯ細胞における安定発現
真核生物コドンを最適化させた可溶性分泌遺伝子（ＤＮＡ２．０）として、ホ乳類で発現された、またはデノボ合成で生成された代替軽鎖構造体を、ホ乳類タンパク質発現のために、ｐＣＩプラスミド（プロメガ）にサブクローニングした。製造業者の指導書に従ってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞（インビトロジェン）にトランスフェクトする前に、配列を検証した。製造業者の指導書に従って、ＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン）を合計３２μｇとし、所望の代替軽鎖を同量用いて、Ｔ−７５フラスコ中の８０％コンフルエントの細胞のトランスフェクションを実施した。トランスフェクションごとにＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ ２０ｍｌ中に、細胞にタンパク質を産生させた。４日後に、ニッケルキレートクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、キアゲン）を用いて、分泌されたＳｕｒｒｏｂｏｄｙを培養上清から精製した。得られた精製Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙを、遠心式サイズろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０）を用いて滅菌ＰＢＳに緩衝液交換して、Ａ２８０読み取り、ＳＤＳゲル、またはウェスタンブロット分析により、公知の標準物質と比較して、それらのタンパク質濃度を決定した。
【０１８０】
前述の記載では本発明は、特定の実施形態を参照して示したが、それはそのように限定されるものではない。事実、図示されたものおよび本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者に自明となり、それは添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１８１】
本明細書に引用された個々の発行物、特許および特許出願が、具体的かつ個別に参考として本明細書に組込まれていることを示されたのと同程度に、全ての発行物、特許および特許出願は、全ての目的でその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＳＬＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
ＳＬＣポリペプチドが、ＶｐｒｅＢポリペプチドを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
ＳＬＣポリペプチドが、λ５ポリペプチドである、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ＶｐｒｅＢポリペプチドが、天然型ＶｐｒｅＢ１配列、天然型ＶｐｒｅＢ２配列、天然型ＶｐｒｅＢ３配列、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項２記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
天然型ＶｐｒｅＢ配列が、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ様ポリペプチド、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
λ５ポリペプチドが、配列番号７のヒトλ５様、配列番号８のヒトλ５ポリペプチド、配列番号９のヒトλ５ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項３記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ＳＬＣポリペプチドが、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体を含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
ＶｐｒｅＢポリペプチド配列およびλ５ポリペプチド配列の融合が、それぞれ前記ＶｐｒｅＢ配列および前記λ５配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる、請求項７記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
ＶｐｒｅＢポリペプチド配列が、カルボキシ末端で、λ５ポリペプチド配列のアミノ末端に連結されている、請求項７記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
ＳＬＣポリペプチドが、Ｖκ様ポリペプチドを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ＳＬＣポリペプチドが、ＪＣκポリペプチドを含む、請求項１または１０記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
Ｖκ様ポリペプチド配列が、配列番号１２〜２４、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項１０記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
ＪＣκポリペプチド配列が、配列番号２６〜３９、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項１１記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
ＳＬＣポリペプチドが、Ｖκ様−ＪＣκポリペプチド融合体である、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
Ｖκ様ポリペプチド配列およびＪＣκポリペプチド配列の融合が、それぞれ前記Ｖκ様配列および前記ＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる、請求項１４記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
Ｖκ様ポリペプチド配列が、カルボキシ末端で、ＪＣκポリペプチド配列のアミノ末端に連結されている、請求項１４記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
前記非相同性分泌リーダー配列が、抗体、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、消化酵素、および細胞外マトリックスの成分からなる群より選択される分泌されたポリペプチドのリーダー配列である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
前記サイトカインが、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β（ＴＮＦ−αおよび−β）；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子からなる群より選択される、請求項１７記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
前記分泌リーダー配列が、ヒトおよび非ヒトホ乳類アルブミン、トランスフェリン、ＣＤ３６、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ならびにニューブラスチンのリーダー配列からなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
前記分泌リーダー配列が、合成配列である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
前記分泌リーダー配列が、天然型分泌リーダー配列のコンセンサス配列である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体をコードする、請求項１〜２１のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の核酸分子または請求項２３記載のベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞。
【請求項２５】
代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、組換え宿主細胞を、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体をコードする核酸分子で形質転換することを含む、組換え宿主細胞内でのＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体の発現方法。
【請求項２６】
前記組換え宿主細胞が、真核細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記組換え宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記組換え宿主細胞が、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体が、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、およびＶκ様−ＪＣκポリペプチド融合体の１種以上を含むＳＬＣポリペプチドからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項１】
代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、ＳＬＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
ＳＬＣポリペプチドが、ＶｐｒｅＢポリペプチドを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
ＳＬＣポリペプチドが、λ５ポリペプチドである、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ＶｐｒｅＢポリペプチドが、天然型ＶｐｒｅＢ１配列、天然型ＶｐｒｅＢ２配列、天然型ＶｐｒｅＢ３配列、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項２記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
天然型ＶｐｒｅＢ配列が、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、配列番号５のヒトＶｐｒｅＢ様ポリペプチド、配列番号６のヒトＶｐｒｅＢ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
λ５ポリペプチドが、配列番号７のヒトλ５様、配列番号８のヒトλ５ポリペプチド、配列番号９のヒトλ５ ｄＴａｉｌポリペプチド、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項３記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ＳＬＣポリペプチドが、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体を含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
ＶｐｒｅＢポリペプチド配列およびλ５ポリペプチド配列の融合が、それぞれ前記ＶｐｒｅＢ配列および前記λ５配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる、請求項７記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
ＶｐｒｅＢポリペプチド配列が、カルボキシ末端で、λ５ポリペプチド配列のアミノ末端に連結されている、請求項７記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
ＳＬＣポリペプチドが、Ｖκ様ポリペプチドを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ＳＬＣポリペプチドが、ＪＣκポリペプチドを含む、請求項１または１０記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
Ｖκ様ポリペプチド配列が、配列番号１２〜２４、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項１０記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
ＪＣκポリペプチド配列が、配列番号２６〜３９、ならびにそれらのフラグメントおよびバリアントからなる群より選択される、請求項１１記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
ＳＬＣポリペプチドが、Ｖκ様−ＪＣκポリペプチド融合体である、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
Ｖκ様ポリペプチド配列およびＪＣκポリペプチド配列の融合が、それぞれ前記Ｖκ様配列および前記ＪＣκ配列のＣＤＲ３類似領域で、またはその周辺で起こる、請求項１４記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
Ｖκ様ポリペプチド配列が、カルボキシ末端で、ＪＣκポリペプチド配列のアミノ末端に連結されている、請求項１４記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
前記非相同性分泌リーダー配列が、抗体、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、消化酵素、および細胞外マトリックスの成分からなる群より選択される分泌されたポリペプチドのリーダー配列である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
前記サイトカインが、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β（ＴＮＦ−αおよび−β）；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子からなる群より選択される、請求項１７記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
前記分泌リーダー配列が、ヒトおよび非ヒトホ乳類アルブミン、トランスフェリン、ＣＤ３６、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ならびにニューブラスチンのリーダー配列からなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
前記分泌リーダー配列が、合成配列である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
前記分泌リーダー配列が、天然型分泌リーダー配列のコンセンサス配列である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
代替軽鎖（ＳＬＣ）構造体をコードする、請求項１〜２１のいずれか１項記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項記載の核酸分子または請求項２３記載のベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞。
【請求項２５】
代替軽鎖（ＳＬＣ）ポリペプチドの天然型分泌リーダー配列が非相同性分泌リーダー配列により交換されている、組換え宿主細胞を、ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体をコードする核酸分子で形質転換することを含む、組換え宿主細胞内でのＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体の発現方法。
【請求項２６】
前記組換え宿主細胞が、真核細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記組換え宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記組換え宿主細胞が、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
ＳＬＣポリペプチドまたはＳＬＣ構造体が、ＶｐｒｅＢポリペプチド、λ５ポリペプチド、ＶｐｒｅＢ−λ５ポリペプチド融合体、Ｖκ様ポリペプチド、ＪＣκポリペプチド、およびＶκ様−ＪＣκポリペプチド融合体の１種以上を含むＳＬＣポリペプチドからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１２−５３１２０８（Ｐ２０１２−５３１２０８Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１７７８５（Ｐ２０１２−５１７７８５）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４００５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１８０８
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０８３３９１６１）シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４００５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１８０８
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０８３３９１６１）シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー (10)
【Ｆターム（参考）】
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