光増感性蛍光タンパク質
【課題】単量体型の光増感性蛍光タンパク質、光増感活性が高い光増感性蛍光タンパク質、又はＫｉｌｌｅｒＲｅｄとは異なる、励起波長及び蛍光波長を有する光増感性蛍光タンパク質を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、発色団補助光不活性化法に用いることのできる、光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体、および該タンパク質をコードするＤＮＡ。また、該タンパク質を用いる光増感性の活性酸素産生方法、さらに標的分子の機能解析方法。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、発色団補助光不活性化法に用いることのできる、光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体、および該タンパク質をコードするＤＮＡ。また、該タンパク質を用いる光増感性の活性酸素産生方法、さらに標的分子の機能解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感性蛍光タンパク質に関する。本発明によれば、発色団補助光不活性化法において、標的タンパク質を効率よく破壊することができる。
【背景技術】
【０００２】
生体試料内の任意のタンパク質の機能を調べる方法として、標的タンパク質をコードする遺伝子を破壊する、いわゆる遺伝子ノックアウト法、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに結合して分解するＲＮＡ干渉法、又は標的タンパク質に対する抗体を作用させることで機能不活性化を行う方法などが知られている。これらの方法はいずれも標的タンパク質が発現している細胞内の全ての領域の標的タンパク質に効果が及ぶことを特徴とする。従って、細胞内の任意の位置に存在する標的タンパク質だけを選択的に不活性化する事は、原理上不可能であった。
【０００３】
一方、標的タンパク質の機能部位を光照射依存的に産生された活性酸素による酸化によって時空間的に不活性化し、そのタンパク質の機能解析を行う方法として、発色団補助光不活性化法（chromophore-assisted light inactivation；以下、ＣＡＬＩと称することがある）が知られている。具体的には、発色団補助光不活性化法はマラカイトグリーン、ローダミン誘導体、又はフルオレセイン誘導体などを光増感剤として用い、標的分子（例えば、標的タンパク質）に結合させ、標的分子の機能を抑制することによって、標的分子の機能を解析する方法である。例えば、フルオレセイン誘導体を用いた場合、フルオレセイン誘導体から、発生する一重項酸素（活性酸素）が標的タンパク質の機能を破壊することが知られている。
しかしながら、発色団補助光不活性化法は、通常フルオレセイン標識した標的分子に対する抗体又はフルオレセイン標識した標的分子（例えば、標的タンパク質）をマイクロインジェクション等で細胞に導入する必要があり、操作が煩雑であるという問題点があった。
【０００４】
最近、Ｌｕｋｙａｎｏｖらは、発色団補助光不活性化法に用いることのできる光増感性蛍光タンパク質（ＣＡＬＩ色素）である、「ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ」を報告した（特許文献１及び非特許文献１）。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄはタンパク質であるため、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄをコードするＤＮＡを含むプラスミドなどを用いることによって、形質転換又はトランスフェクションなどの手法により、光増感性蛍光タンパク質（ＣＡＬＩ色素）を細胞内において発現させることが可能になった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／１１７６９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（米国）２００６年、第２４巻、ｐ．９５〜９９
【非特許文献２】「フェブス・レター（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒ）」（オランダ）２００９年、第５８３巻、ｐ．２８３９−２８４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、細胞内において二量体を形成するため、多くのタンパク質はＫｉｌｌｅｒＲｅｄと融合しただけで、立体障害などによる機能の不活性化が起こり、光照射依存的な標的タンパク質の機能不活性化を行うことができないという問題を有していた。
また、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、光増感活性が低いため、活性酸素の産生量がフルオレセインよりも少ないという問題を有していた。
更に、例えば、生体試料内の２つ以上の標的タンパク質を、個別に光照射によって不活性化する場合には、吸光特性の異なる光増感性蛍光タンパク質が必要である。しかしながら、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ以外の吸光スペクトルを有する光増感性蛍光タンパク質は報告されておらず、別の励起波長及び蛍光波長を有する光増感性蛍光タンパク質の開発が望まれていた。
従って、本発明の目的は、単量体型の光増感性蛍光タンパク質を提供することである。また、本発明の別の目的は、光増感活性が高い光増感性蛍光タンパク質を提供することである。更に、本発明の別の目的は、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄとは異なる、励起波長及び蛍光波長を有する光増感性蛍光タンパク質を提供することである。
【０００８】
本発明者は、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中において、光刺激により活性酸素を効率良く産生することのできる光増感活性の高い光増感性蛍光タンパク質について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列において、５番目のグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に、１６２番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に、１７４番目のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に、そして２０６番目のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）に置換した変異体であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄは、単量体として細胞内などに存在するようになることを見出した。更に、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅは、一重項酸素の産生量が増加し、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ４５５ｎｍ及び５４４ｎｍにシフトすることを見出した。
更に、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの４６番のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎは、一重項酸素の産生量がＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して増加し、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ４３９ｎｍ及び４９６ｎｍにシフトすることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列、からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に関する。
本発明の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体の好ましい態様においては、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体が、他のタンパク質と結合した融合タンパク質である。
また、本発明は、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするＤＮＡに関する。
本発明のＤＮＡの好ましい態様においては、配列表の配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、及び配列番号５で表される塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列からなるＤＮＡである。
更に、本発明は、前記ＤＮＡを含むプラスミドに関する。
更に、本発明は、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、光増感性の活性酸素産生方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法に関する。
本発明の光増感性の活性酸素産生方法の好ましい態様においては、前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である。
更に、本発明は、光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、標的分子の機能解析方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法に関する。
本発明の標的分子の機能解析方法の好ましい態様においては、前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体によれば、単量体として細胞内などに存在することが可能であり、多くのタンパク質に対してＣＡＬＩにおける光増感性蛍光タンパク質として用いることが可能である。
本発明の光増感性蛍光タンパク質及びその機能的等価改変体、特にはＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅによれば、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの６８番目のチロシンをトリプトファンに置換（Ｙ６８Ｗ）することで、励起極大／蛍光極大を４５５ｎｍ／５４４ｎｍ（目視ではオレンジ色）にシフトし、更に、一重項酸素の産生量がＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して増加する。従って、ＣＡＬＩにおいて、増強型光増感性蛍光タンパク質として用いることが可能であり、更にＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎなどと同時に用いることにより、２種以上の標的タンパク質の機能相関などを解析することが可能である。
本発明の光増感性蛍光タンパク質及びその機能的等価改変体、特にはＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎによれば、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの４６番のバリンをアラニンに置換することで、励起極大／蛍光極大を４３９ｎｍ／４９６ｎｍ（目視では緑色）にシフトし、一重項酸素の産生量がＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して増加する。従って、ＣＡＬＩにおいて、増強型光増感性蛍光タンパク質として用いることが可能であり、更にＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅなどと同時に用いることにより、２種以上の標的タンパク質の機能相関などを解析することが可能である。
なお、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＸ線結晶構造解析を行った論文（非特許文献２）によれば、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの４６番のバリンをアラニンに置換（Ｖ４６Ａ）することは、発色団の光増感作用により発生した活性酸素をＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質の外部に効率良く放出するようになる可能性が記載されている。
しかしながら、後述の実施例に示すように、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＲｅｄにＶ４６Ａ変異を導入すると、活性酸素の放出量は減少した。一方、Ｙ６８Ｗ変異が導入されているＳｕｐｅｒｎｏｖａ−ＯｒａｎｇｅにＶ４６Ａ変異を導入したＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎでは、活性酸素の放出量が２倍以上に増大し、更に蛍光波長がグリーンに変化した。従って、光増感性蛍光タンパク質において、変異の導入により、活性酸素の放出量が増加したり、又は減少したりすることを予想すること、また蛍光波長が変化することは当業者であっても決して容易ではなく、試行錯誤を要するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ、及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎの励起スペクトル（Ａ）及び蛍光スペクトル（Ｂ）を示したグラフである。
【図２】ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎ、及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ−Ｖ４６Ａの活性酸素の産生量を示したグラフである。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチアシアネート）は陽性コントロールを示し、Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘＰＢＳ）は陰性コントロールを示している。
【図３】Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＲｅｄをＨｅｌａ細胞に導入し、光照射を行い、０時間、３時間、及び６時間後の細胞の微分干渉画像を示した写真である。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄがミトコンドリアに発現している細胞は、６時間後にアポトーシスにより、死滅している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の光増感性蛍光タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００１３】
本発明の機能的等価改変体は、前記光増感性蛍光タンパク質の機能的等価改変体である。本明細書において、「機能的等価改変体」とは、そのアミノ酸配列が、元となるタンパク質のアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるタンパク質と実質的に同じ活性を示すタンパク質を意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば１０個であり、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個である。
【００１４】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第１の実施態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第１光増感性蛍光タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第１機能的等価改変体と称する；以下、第１光増感性蛍光タンパク質及び第１機能的等価改変体を、まとめて第１光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。
第１光増感性蛍光タンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる光増感性蛍光タンパク質（すなわち、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）のアミノ酸配列において、５番目のグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に置換（以下、Ｇ５Ｖと称することがある）、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換（以下、Ｎ１４７Ｓと称することがある）、１６２番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に置換（以下、Ｌ１６２Ｔと称することがある）、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に置換（以下、Ｆ１６４Ｔと称することがある）、１７４番目のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に置換（以下、Ｌ１７４Ｋと称することがある）、そして２０６番目のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）に置換（以下、Ｍ２０６Ｔと称することがある）したアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第１光増感性蛍光タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄである。
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、二量体を形成することが知られているが、これに対してＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄは、試料中（例えば、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中）において、単量体で存在する。また、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ５７９ｎｍ及び６１０ｎｍである。
【００１５】
本発明の第１光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換（以下、Ｌ１６２Ｔ、及びＦ１６４Ｔの置換を有するＫｉｌｌｅｒＲｅｄの変異体を、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔと称する）により、二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが、単量体となる。従って、前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔは、標的タンパク質との融合タンパク質として発現しても、標的タンパク質の機能を阻害しない。一方、Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔは、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して５８５ｎｍにおける吸光及び６１０ｎｍにおける蛍光が減少した。
しかしながら、前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔに、更にＧ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、及びＭ２０６Ｔの置換を導入することにより、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと同等の蛍光強度を有するＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄを得ることができた。
【００１６】
本発明の第１機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５７９ｎｍ及び６１０ｎｍであることを意味する。なお、励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５７９ｎｍ及び６１０ｎｍであるとは、好ましくは５６９〜５８９ｎｍ及び６００〜６２０ｎｍであり、より好ましくは５７４〜５８４ｎｍ及び６０５〜６１５ｎｍである。第１機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００１７】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第２の実施態様は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第２光増感性蛍光タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第２機能的等価改変体と称する；以下、第２光増感性蛍光タンパク質及び第２機能的等価改変体を、まとめて第２光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。第２光増感性蛍光タンパク質は、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄのアミノ酸配列において、６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換（以下、Ｙ６８Ｗと称する）したアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第２光増感性蛍光タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅである。
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ４５５ｎｍ及び５４４ｎｍであり、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して、一重項酸素の産生量が増加している。
【００１８】
本発明の第２光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により、二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが、単量体となり、Ｙ６８Ｗの置換により、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれおよそ４５５ｎｍ及び５４４ｎｍとなる。
本発明の第２機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４５５ｎｍ及び５４４ｎｍであることを意味する。なお、励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４５５ｎｍ及び５４４ｎｍであるとは、好ましくは４４５〜４６５ｎｍ及び５３４〜５５４ｎｍであり、より好ましくは４５０〜４６０ｎｍ及び５３９〜５４９ｎｍである。第２機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号８で表されるアミノ酸配列において、Ｌ１６２Ｔ、Ｆ１６４Ｔ、及びＹ６８Ｗの置換が導入されたタンパク質、及び前記タンパク質において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質、並びに前記配列番号４で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００１９】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第３の実施態様は、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第３光増感性蛍光タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第３機能的等価改変体と称する；以下、第３光増感性蛍光タンパク質及び第３機能的等価改変体を、まとめて第３光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。第３光増感性蛍光タンパク質は、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅのアミノ酸配列において、４６番のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換（以下、Ｖ４６Ａと称する）したアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第３光増感性蛍光タンパク質は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎである。
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ４３９ｎｍ及び４９６ｎｍであり、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して、一重項酸素の産生量が増加している。
【００２０】
本発明の第３光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが単量体となり、Ｙ６８Ｗ及びＶ４６Ａの置換により、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ４３９ｎｍ及び４９６ｎｍとなる。
本発明の第３機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４３９ｎｍ及び４９６ｎｍであることを意味する。なお励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４３９ｎｍ及び４９６ｎｍであるとは、好ましくは４２９〜４４９ｎｍ及び４８６〜５０６ｎｍであり、より好ましくは４３４〜４４４ｎｍ及び５９１〜５０１ｎｍである。第３機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号８で表されるアミノ酸配列において、Ｌ１６２Ｔ、Ｆ１６４Ｔ、Ｙ６８Ｗ及びＶ４６Ａの置換が導入されたタンパク質、及び前記タンパク質において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質、並びに前記配列番号６で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００２１】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第４の実施態様は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第４タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第４機能的等価改変体と称する；以下、第４光増感性蛍光タンパク質及び第４機能的等価改変体を、まとめて第４光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。
第４光増感性蛍光タンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる光増感性蛍光タンパク質（すなわち、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）のアミノ酸配列において、Ｌ１６２Ｔ、Ｆ１６４Ｔ、及びＮ１４７Ｓの置換を有するアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第４光増感性蛍光タンパク質は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓである。
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓの励起極大波長は、５１２ｎｍであり、蛍光は黄緑色（目視）を示す。
【００２２】
本発明の第４光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが単量体となり、Ｎ１４７Ｓの置換により、励起極大波長が５１２ｎｍで、蛍光が黄緑色となる。
【００２３】
本発明の第４機能的等価改変体は、実質的にＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓと同じ活性を有するものである。「ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長が約５１２ｎｍ及び蛍光が黄緑色であることを意味する。なお、励起極大波長が約５１２ｎｍであるとは、好ましくは５０２〜５２２ｎｍであり、より好ましくは５０７〜５１７ｎｍである。第４機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号９で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００２４】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第５の実施態様は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第５タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第５機能的等価改変体と称する；以下、第５光増感性蛍光タンパク質及び第５機能的等価改変体を、まとめて第５光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。
第５光増感性蛍光タンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる光増感性蛍光タンパク質（すなわち、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）のアミノ酸配列において、Ｌ１６２ＴＦ１６４Ｔ、Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、Ｍ２０６Ｔ、及びＶ４６Ａの置換を有するアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第５光増感性蛍光タンパク質は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａである。
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ５０９ｎｍ及び５９４ｎｍである。
【００２５】
本発明の第５光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが単量体となり、Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、Ｍ２０６Ｔ、及びＶ４６Ａの置換により、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ５０９ｎｍ及び５９４ｎｍとなる。
【００２６】
本発明の第５機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５０９ｎｍ及び５９４ｎｍであることを意味する。なお、励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５０９ｎｍ及び５９４ｎｍであるとは、好ましくは４９９〜５１９ｎｍ及び５８４〜６０４ｎｍであり、より好ましくは５０４〜５１４ｎｍ及び５８９〜５９９ｎｍである。第５機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００２７】
本発明の光増感性蛍光タンパク質及び機能的等価改変体（以下、まとめて本発明の光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）は、光の照射によって、活性酸素（例えば、一重項酸素）を産生することが可能である。従って、本発明のタンパク質等を細胞内に導入し、適当な励起波長の光を照射することによって、一重項酸素を発生させ、細胞に障害を与え、更には細胞を死滅させることもできる。
また、本発明のタンパク質等は、発色団補助光不活性化法に用いることもできる。具体的には本発明の光増感性蛍光タンパク質等を標的タンパク質に結合させ、光の照射によって活性酸素（例えば、一重項酸素）を産生することによって、その標的タンパク質の機能を抑制、又はその標的タンパク質を破壊することによって、標的タンパク質の機能を解析することができる。
【００２８】
本発明による光増感性蛍光タンパク質及び機能的等価改変体は、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、光増感性蛍光タンパク質であるＫｉｌｌｅｒＲｅｄをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により調製することが可能である。
更に得られたプラスミドを用いて、大腸菌などの宿主細胞を形質転換し、形質転換体を得ることができる。得られた形質転換体（すなわち、本発明による光増感性蛍光タンパク質又は機能的等価改変体をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する形質転換体）を、前記光増感性蛍光タンパク質等の発現が可能な条件下で培養し、タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から光増感性蛍光タンパク質等を分離及び精製することにより調製することができる。前記の分離及び精製方法としては、例えば、光増感性蛍光タンパク質にＨｉｓタグを付けニッケルＮＴＡカラムで生成する方法、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の光増感性蛍光タンパク質等は、他のタンパク質と結合した融合タンパク質とすることができる。融合される他のタンパク質は、光増感性蛍光タンパク質等の活性を完全に阻害しない限り、特に制限されるものではなく、例えば、発色団補助光不活性化法における標的タンパク質、又は標的分子に結合させる結合タンパク質を挙げることができる。
【００３０】
前記標的タンパク質は、発色団補助光不活性化法において、機能を解析されるタンパク質である。標的タンパク質を本発明の光増感性蛍光タンパク質等との融合タンパク質とした場合、光の照射により光増感性蛍光タンパク質等から産生された活性酸素が、容易に標的タンパク質を不活化することができる。これは、産生された活性酸素により、半径約１０〜５０Åに存在する標的分子が特異的に不活化されるためである。本発明の光増感性蛍光タンパク質等は、単量体であるため、標的タンパク質の細胞内における本来の局在性や活性を妨害することが少ない。後述の実施例で示すように、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄと、標的タンパク質（例えば、チューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３）とを、融合タンパク質として発現させた場合、標的タンパク質の局在化に影響を与えなかった。
【００３１】
前記結合タンパク質は、発色団補助光不活性化法において、標的分子に光増感性蛍光タンパク質を結合させるタンパク質である。結合タンパク質は、標的分子に結合することのできるタンパク質であれば、特に限定されるものではないが、例えば、抗体及びその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は抗体可変領域全長の遺伝子産物）、レセプター、又はリガンドを挙げることができる。
【００３２】
前記融合タンパク質は、公知の遺伝子組み換え技術によって、調整することが可能である。具体的には、光増感性蛍光タンパク質等をコードするＤＮＡと、他のタンパク質をコードするＤＮＡとを、定法に従って、発現用プラスミドに導入する。得られたプラスミドを、形質転換などにより、宿主細胞に導入することによって、融合タンパク質を発現させることが可能である。
【００３３】
本発明によるＤＮＡは、本発明の光増感性蛍光タンパク質等をコードする限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列表の配列番号１、３、又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。配列表の配列番号１で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄをコードする。また、配列表の配列番号３で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅをコードする。更に、配列表の配列番号５で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎをコードする。
【００３４】
本発明によるプラスミドは、本発明による前記ＤＮＡを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ＤＮＡを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
得られたプラスミドを所望の宿主細胞に形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。前記形質転換体も、本発明による前記プラスミドを含む限り、特に限定されるものではない。
【００３５】
前記宿主細胞としては、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３６】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００３７】
本発明の光増感性の活性酸素産生方法は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等を用いる。前記光増感性蛍光タンパク質等に、励起光を照射することにより、光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素が産生される。
本発明の光増感性の活性酸素産生方法によれば、例えば、細胞に前記光増感性蛍光タンパク質等を導入し、そして励起光を照射することにより、光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素が産生され、細胞を死滅させることができる。
前記励起光の波長は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素を産生させることのできる波長である。本発明の第１光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は、４９０〜６２０ｎｍが好ましく、５４０〜５８０ｎｍがより好ましく、５６０〜５８０ｎｍが最も好ましい。本発明の第２光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は４００〜５００ｎｍが好ましく、４２０〜４８０ｎｍがより好ましく、４４０〜４６０ｎｍが最も好ましい。本発明の第３光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は３９０〜４８０ｎｍが好ましく、３９０〜４６０ｎｍがより好ましく、４３０〜４５０ｎｍが最も好ましい。
また前記励起光としては、前記励起波長の光のほか、多光子励起現象にもとづき、前記励起波長のおよそ整数倍の波長を有する光を用いることもできる。
【００３８】
本発明の光増感性の活性酸素産生方法によれば、細胞のアポトーシスを誘導することが可能である。アポトーシスを誘導することにより、本発明の光増感性の活性酸素産生方法は、光線力学療法（ＰＤＴ）に用いることができる。光線力学療法とは、光増感性の物質を腫瘍細胞に取り込ませ、光を照射することにより、細胞を死滅させる腫瘍の治療方法である。より具体的には、腫瘍細胞又は腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞内に、本発明の光増感性蛍光タンパク質等を導入し、適当な光を照射することにより、活性酸素を発生させる。この活性酸素により、腫瘍細胞又は腫瘍組織が傷害され、腫瘍が消失するものである。
【００３９】
本発明の標的分子の機能解析方法は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等を用いる。前記光増感性蛍光タンパク質等に、励起光を照射することにより、光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素が産生される。産生された活性酸素は近傍の標的分子を破壊し、それにより破壊された標的分子の機能を解析することが可能である。
前記励起光の波長は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素を産生させることのできる波長である。本発明の第１光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は、４９０〜６２０ｎｍが好ましく、５４０〜５８０ｎｍがより好ましく、５６０〜５８０ｎｍが最も好ましい。本発明の第２光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は４００〜５００ｎｍが好ましく、４２０〜４８０ｎｍがより好ましく、４４０〜４６０ｎｍが最も好ましい。本発明の第３光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は３９０〜４８０ｎｍが好ましく、３９０〜４６０ｎｍがより好ましく、４３０〜４５０ｎｍが最も好ましい。
また前記励起光としては、前記励起波長の光のほか、多光子励起現象にもとづき、前記励起波長のおよそ整数倍の波長を有する光を用いることもできる。
より具体的には本発明の標的分子の機能解析方法は、発色団補助光不活性化法として、用いることができる。
【００４０】
本発明の方法において、標的分子とは、その生理的機能を解明する対象となる生体分子をいい、特にこれらに限定されないが、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、シグナル伝達物質などが挙げられる。特には、本発明の方法において好ましい標的分子は、タンパク質であり、酵素、受容体タンパク質、リガンドタンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写制御タンパク質、骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、スキャホールドタンパク質等を挙げることができる。
【００４１】
前記光増感性蛍光タンパク質等が産生する活性酸素は、一重項酸素である。前記一重項酸素は、励起状態の光増感性蛍光タンパク質発色団が項間交差によって励起３重項状態に遷移し、発色団近傍に存在する基底状態の３重項酸素にエネルギーを転移することにより発生する。発生した一重項酸素は、約１０〜５０Åの半径で光増感性蛍光タンパク質等に結合された標的分子（例えば、標的タンパク質）あるいはその機能性部位を選択的に不活化することができる。このようにして、標的分子自体あるいは標的分子の特定部位を不活性化することによって、その標的物質の生理的機能を解析することができる。例えば、このような不活性化によって、タンパク質の機能性部位の同定、その機能性部位の機能の確認、リガンドの機能の確認、機能性部位のタンパク質寿命に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質動態に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質フォールディングに及ぼす影響の確認などを行うことができる。
なお、本発明の標的分子の機能解析方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイに、また細胞内外の標的分子に利用可能である。
【００４２】
本発明の標的分子の機能解析方法において、光増感性蛍光タンパク質等を標的分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、シグナル伝達物質）に結合させる方法は、特に限定されず、例えば化学結合によることが好ましい。光増感性蛍光タンパク質等を標的分子に共有結合により結合させることができる。また、光増感性蛍光タンパク質等に標的分子に対する抗体を共有結合により結合させ、その抗体により光増感性蛍光タンパク質等を標的分子に結合させることができる。更に、光増感性蛍光タンパク質等と標的分子に対する抗体とを融合タンパク質として発現させ、その抗体により光増感性蛍光タンパク質等を標的分子に結合させることができる。更には、標的分子がタンパク質の場合は、光増感性蛍光タンパク質等と標的タンパク質とを融合タンパク質として発現させることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
《実施例１》
本実施例では、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列に変異を導入することにより、単量体として存在することのできる光増感蛍光タンパク質の作製を試みた。
具体的には、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列における５番目のグリシン（Ｇ）、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）、１６２番目のロイシン（Ｌ）、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）、１７４番目のロイシン（Ｌ）、２０６番目のメチオニン（Ｍ）を、それぞれ、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トレオニン（Ｔ）、リシン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）に変異させるために、Ｓａｗａｎｏらの方法（Sawano A and Miyawaki A. Nucleic Acid Research 28,E78,2000）に従って、部位特異的突然変異誘発法により、順次変異を導入した。
【００４５】
（１）１６２番目のロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）への置換
１６２番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１６２Ｔ:5’-GTGCGCCAGACCGCCACCATC-3’（配列番号１１）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１６２Ｔの末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。変異を導入する鋳型プラスミドＤＮＡとしては、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ遺伝子を含むプラスミドベクターを鋳型に用いたポリメラーゼ連鎖反応により、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ遺伝子の上流と下流にそれぞれＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを付加してＫｉｌｌｅｒＲｅｄ遺伝子を増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、プラプラスミドｐＲＳＥＴＢ（インビロロジェン社）に挿入して得られたＫｉｌｌｅｒＲｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いた。
【００４６】
突然変異鎖の合成は、以下の通り行った。以下の組成の反応溶液４０μＬを準備し、ＰＣＲ法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した。
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ ５０ｎｇ、
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１６２Ｔ １０ｐｍｏｌ、
ｄＮＴＰ ３．７５ｎｍｏｌ、
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １．２５Ｕ、
ＰｆｕＤＮＡリガーゼ ２０Ｕ
なお、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製であり、１０×Ｐｆｕポリメラーゼバッファー中に溶解したものである。また、ＰｆｕＤＮＡリガーゼは、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のものであり、１０×ＰｆｕＤＮＡリガーゼバッファー中に溶解したものである。
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。すなわち、まず、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕＤＮＡリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後９４℃、１分の最初の変性を行った。続いて、９４℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとして３５サイクル行った。最後に７５℃、１０分のポストインキュベーションを行った。
【００４７】
得られたＰＣＲ産物を、以下の反応条件に従い、ＤｐｎＩによって切断し、変異の導入されていないメチル化又はヘミメチル化した鋳型プラスミドＤＮＡを選択的に消化した。具体的には、前記ＰＣＲ後の反応溶液４０μＬに１μＬ（２０Ｕ）のＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ社製）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。なお、ＤｐｎＩは〔５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’〕を認識して２本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。更に、ＤｐｎＩで処理した反応溶液２０．４μＬに対して、フェノールクロロホルム抽出を行ってサンプルを精製し、上清をエタノール沈殿して乾燥させた。
【００４８】
次に、得られたＤＮＡを用いて、形質転換及び発現を行った。前記１本鎖突然変異導入環状ＤＮＡ鎖を用いて、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテントセル（ＪＭ１０９（ＤＥ３））を形質転換した。そして形質転換した大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて培養し、生育した単一コロニーをピックアップして１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培養液２ｍＬ中へ移し、３７℃で一晩培養して増殖させた。
１６２番目のロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）への置換は、定法に従い、塩基配列のシークエンスを行い、変異の導入されたプラスミドを、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／ｐＲＳＥＴＢと命名した。
【００４９】
（２）１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）のトレオニン（Ｔ）への置換
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／ｐＲＳＥＴＢの１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ１６４Ｔ：5’-CAGACCGCCACCATCGGCTTC-3’（配列番号１２）
１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）への置換は、鋳型プラスミドＤＮＡとして、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｆ１６４Ｔを用いることを除いては、前記（１）の操作を繰り返し、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
【００５０】
（３）ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔの発現
得られたプラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢタンパク質は、Ｔ７発現系（ｐＲＳＥＴＢ／ＪＭ１０９（ＤＥ３））を用いて発現させた。すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテントセル（ＪＭ１０９（ＤＥ３））をＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢで形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて培養した。その後、生育した単一コロニーをピックアップして１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培養液３００ｍＬ中へ植菌し、２３℃で４日間培養した。得られた細胞をフレンチプレスにより破砕し、得られた上清液から、ニッケルキレートカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてポリヒスチジン標識化タンパク質を精製した。更に、この溶出液（１００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）をＰＤ１０脱塩・バッファー交換カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて精製し、タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔを得た。
【００５１】
（４）ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔの発色及び単量体化の確認
得られたＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔを、ｐｓｅｕｄｏ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにより解析した。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔのバンドは、二量体のＫｉｌｌｅｒＲｅｄのバンドと比較すると、低分子量にシフトし、単量体として存在した。
しかしながら、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔは、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較すると、６１０ｎｍにおける蛍光が減衰した。結果を、表１に示す。
【００５２】
（５）Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、及びＭ２０６Ｔの置換の導入
Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、及びＭ２０６Ｔの置換を、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔに導入するため、以下のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｇ５Ｖ：5’-GGTTCAGAGGTCGGCCCCGCC-3’（配列番号１３）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｎ１４７Ｓ：5’-CAGACCGCCACCATCGGCTTC-3’（配列番号１４）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１７４Ｋ：5’-GACGGCGGCAAGATGATGGGC-3’（配列番号１５）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｍ２０６Ｔ：5’-ACCAAGCAGACGAGGGACACT-3’（配列番号１６）
【００５３】
５番目のグリシン（Ｇ）のバリン（Ｖ）への置換は、鋳型プラスミドＤＮＡとして、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｇ５Ｖを用いることを除いては、前記（１）の操作を繰り返し、５番目のグリシン（Ｇ）のバリン（Ｖ）に置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ_Ｇ５Ｖ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
以下、同様の操作により、順次変異を導入し、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列において、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に、１７４番目のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に、そして２０６番目のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）に置換したタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
【００５４】
（６）Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの発現
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄタンパク質は、プラスミドとしてＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いたことを除いては、前記（３）の操作を繰り返し、精製タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄを得た。
【００５５】
《比較例１〜２１》
比較例１〜２１では、二量体のＫｉｌｌｅｒＲｅｄを、単量体にするための変異の導入を試みた。具体的には、各比較例では以下のアミノ酸の置換を行った。
比較例１：１２６番目のアスパラギンをアルギニン（Ｎ１２６Ｒ）に置換した。
比較例２：１２８番目のアスパラギン酸をトレオニン（Ｄ１２８Ｔ）に置換した。
比較例３：１２６番目のアスパラギンをアルギニンに置換（Ｎ１２６Ｒ）し、１２８番目のアスパラギン酸をトレオニン（Ｎ１２６Ｒ／Ｄ１２８Ｔ）に置換した。
比較例４：１５４番目のヒスチジンをグルタミン酸（Ｈ１５４Ｅ）に置換した。
比較例５：１６５番目のイソロイシンをアルギニン（Ｉ１６５Ｒ）に置換した。
比較例６：１６３番目のアラニンをリシン（Ａ１６３Ｋ／Ｉ１６５Ｒ）に置換し、１６５番目のイソロイシンをアルギニン（Ｎ１２６Ｒ／Ｄ１２８Ｔ）に置換した。
比較例７：１７６番目のメチオニンをアスパラギン酸（Ｍ１７６Ｄ）に置換した。
比較例８：１９６番目のプロリンをアラニン（Ｐ１９６Ａ）に置換した。
比較例９：１９８番目のフェニルアラニンをリシン（Ｆ１９８Ｋ）に置換した。
比較例１０：１４０番目のグルタミンをアラニン（Ｑ１４０Ａ）に置換した。
比較例１１：２６番目のリシンをグルタミン酸（Ｋ２６Ｅ）に置換した。
比較例１２：１７４番目のロイシンをヒスチジン（Ｌ１７４Ｈ）に置換した。
比較例１３：１７４番目のロイシンをアルギニン（Ｌ１７４Ｒ）に置換した。
比較例１４：２２７番目のバリンをリシン（Ｖ２２７Ｋ）に置換した。
比較例１５：２３０番目のイソロイシンをリシン（Ｉ２３０Ｋ）に置換した。
比較例１６：２３４番目のイソロイシンをリシン（Ｉ２３４Ｋ）に置換した。
比較例１７：１５２番目のフェニルアラニンをトレオニン（Ｆ１５２Ｔ）に置換した。
比較例１８：１６２番目のロイシンをリシン（Ｌ１６２Ｋ）に置換した。
比較例１９：１６４番目のフェニルアラニンをリシン（Ｆ１６４Ｋ）に置換した。
比較例２０：１６７番目のフェニルアラニンをリシン（Ｆ１６７Ｋ）に置換した。
比較例２１：１６７番目のフェニルアラニンをトレオニン（Ｆ１６７Ｔ）に置換した。
前記各比較例において、それぞれの置換に対応するプライマーを合成し、それぞれのプライマーを用いたことを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返すことにより、それぞれの変異を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。
得られたプラスミドを用いることを除いては、前記実施例の工程（３）及び（４）の操作を繰り返すことにより、それぞれのタンパク質の発色及び単量体化を確認した。比較例１〜２１では、得られたタンパク質は、二量体のままで、単量体化しなかった。結果を纏めて、表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
《実施例２》
本実施例では、前記タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した。
６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｙ６８Ｗ：5’-GCCACCTGATCCAGTGGGGCGAGCCC-3’（配列番号１７）
鋳型プラスミドＤＮＡとして、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｙ６８Ｗを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
更に、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅを得た。
【００５８】
《実施例３》
本実施例では、前記タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの４６番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した。
４６番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａ：5’-GGCGACTTCAACGCCCACGCCGTG-3’（配列番号１８）
鋳型プラスミドＤＮＡとして、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
更に、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎを得た。
【００５９】
《実施例４》
本実施例では、タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔに、更にＮ１４７Ｓの置換を導入し、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓの作製を試みた。
鋳型プラスミドＤＮＡとして、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
更に、プラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓ（配列番号９）を得た。
【００６０】
《実施例５》
本実施例では、前記タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの４６番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した。
鋳型プラスミドＤＮＡとして、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを得た。更に、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａ（配列番号１０）を得た。
【００６１】
《比較例２２〜２７》
比較例２２〜２７では、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの発色団の発色を変化させるための変異の導入を試みた。具体的には、各比較例では、Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔの置換に、更に以下のアミノ酸の置換を行った。
比較例１：１５０番目のヒスチジンをトレオニン（Ｈ１５０Ｔ）に置換した。
比較例２：１４８番目のグルタミン酸をトレオニン（Ｅ１４８Ｔ）に置換した。
比較例３：１４８番目のグルタミン酸をリシン（Ｅ１４８Ｋ）に置換した。
比較例４：１４８番目のグルタミン酸をバリン（Ｅ１４８Ｖ）に置換した。
比較例５：２２６番目のセリンをイソロイシン（Ｓ２２６Ｉ）に置換した。
比較例６：１４８番目のグルタミン酸をバリン（Ｅ１４８Ｖ）に置換し、２２６番目のセリンをイソロイシン（Ｓ２２６Ｉ）に置換した。
前記各比較例において、それぞれの置換に対応するプライマーを合成し、それぞれのプライマーを用いたことを除いては、前記実施例１の工程（５）の操作を繰り返すことにより、それぞれの変異を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。
得られたプラスミドを用いることを除いては、前記実施例の工程（３）及び（４）の操作を繰り返すことにより、それぞれのタンパク質の発色及び単量体化を確認した。比較例２２〜２７で得られたタンパク質は、赤色からの発色のシフトは見られず、また、発色の増強も見られなかった。結果を纏めて表２に示す。
【００６２】
【表２】
【００６３】
《実施例６》
得られたタンパク質が所望の突然変異を導入したものであることを、該タンパク質の励起波長及び発光波長を測定するとともに既存のタンパク質（ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ等）の励起波長及び発光波長と比較することにより確認した。
得られたタンパク質の励起波長を測定し、規格化したものを図１（Ａ）中に曲線で示す。また、得られたタンパク質の蛍光波長を測定し、正規化したものを図１（Ｂ）中曲線で示す。なお、図１（Ａ）及び（Ｂ）には、比較のためにＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄについて励起波長及び蛍光波長を併せて示す。図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、上述した方法で変異を導入したタンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅは励起波長のピークが４５５ｎｍ、蛍光波長のピークが５４４ｎｍであり、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎは励起波長のピークが４３９ｎｍ、蛍光波長のピークが４６９ｎｍであることがわかる。これに対してＫｉｌｌｅｒＲｅｄの励起波長のピークは５８５ｎｍであり、蛍光波長のピークは６１０ｎｍ、またＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの励起波長のピークは５７９ｎｍであり、蛍光波長のピークは６１０ｎｍである。
なお、この表３において、λａｂｓはナノメーター単位での吸光度スペクトルのピークを表している。（ε）は１０３Ｍ−１ｃｍ−１単位でのモル吸光係数である。λｅｍはナノメーター単位での蛍光スペクトルのピークを表している。
【００６４】
更に、実施例４で得られたＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓ及び、実施例５で得られたＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａについても、励起波長及び、蛍光波長を測定した。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓは、励起波長のピークが５１２ｎｍ、そして蛍光が黄緑色であり、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａは励起波長のピークが５０９ｎｍ、蛍光波長のピークが５９４ｎｍであった。
【００６５】
《実施例７》
また、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎについて活性酸素量の測定を行った。ここではまず、１０μＭ ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９，１０−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ（以下ＡＤＰＡと記す）を含む５０μＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎタンパク質溶液をそれぞれ１００μＬずつ調製した。ＡＤＰＡは励起極大が３８０ｎｍ、蛍光極大が４３０ｎｍの一重項酸素検出用試薬である。一重項酸素とは活性酸素の一種で、大変強力な酸化能力を有しており、ＡＤＰＡが一重項酸素と反応することでＡＤＰＡは過酸化物へと変化し、４３０ｎｍにある蛍光ピークが失われる。
得られたサンプル溶液を以下の測定条件に従って、活性酸素測定を行った。すなわち、１５μＬをテラサキディッシュに添加し、ＹＡＧレーザー（ＬＯＴＩＳ社、ＬＳ−２１３７Ｕ−ＹＡＧ、周波数１０Ｈｚ、パルス幅１５ｎｓ）の第三高調波（３５５ｎｍ）をオプティカルパラメトリック発振器（ＬＯＴＩＳ社、ＬＴ−２２１４−ＯＰＯ）を用いて波長変換し、２０ｍＪ／ｃｍ２／パルスのエネルギー密度で５分間照射した後、これを１ｍＬの１×ＰＢＳで希釈し、分光蛍光光度計Ｆ−２５００（日立）を用いてＡＤＰＡの退色率を測定した。レーザーの波長はそれぞれＫｉｌｌｅｒＲｅｄとＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄが５８０ｎｍ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅが４５０ｎｍ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎが４４０ｎｍである。上述した突然変異を導入した蛍光タンパク質を含む４つの蛍光タンパク質の活性酸素量の比較を図２に示す。図２においてＫＲ各種光増感性蛍光タンパク質によるＡＤＰＡ褪色率、すなわち活性酸素放出量を示している。なお、図２では比較のためフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の活性酸素量で規格化した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
《実施例８》
本実施例では、実施例１において得られたＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄを、チューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３との融合タンパク質として発現させた。前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢに、ＰＣＲで得られたチューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３をコードするＤＮＡを挿入した。得られたプラスミドを、それぞれｔｕｂｌｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、ｋｅｒａｔｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、及びＣｘ４３Ｓ−ｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢと称する。
得られたプラスミドｔｕｂｌｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、ｋｅｒａｔｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、及びＣｘ４３−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、細胞内局在を蛍光顕微鏡で調べた。
チューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３、それぞれ、細胞の微小管、中間系フィラメント、及びギャップジャンクションに局在しており、それぞれのタンパク質が存在している位置で発現しており、タンパク質の局在化に影響を与えなかった。
【００６８】
《実施例９》
本実施例では、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄにミトコンドリアマトリクス移行シグナルをつなげることで細胞内のミトコンドリアに導入し、光照射によってミトコンドリア機能を不活性化することによりアポトーシスを誘導した。
１μｇのプラスミド＿Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐｃＤＮＡ３、を、トランスフェクション試薬（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、３５ｍｍガラスボトム皿上で培養しているＨｅｌａ細胞に導入した。２日間培養後、５８０ｎｍの光を８Ｗ／ｃｍ２のパワー密度で９０秒間照射した後、０時間、３時間、及び６時間の細胞を微分干渉顕微鏡を用いて観察した。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄが、ミトコンドリアに発現している細胞は、６時間後には退縮し、死滅した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体は、発色団補助光不活性化法に用いることが可能であり、標的分子の機能解析に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感性蛍光タンパク質に関する。本発明によれば、発色団補助光不活性化法において、標的タンパク質を効率よく破壊することができる。
【背景技術】
【０００２】
生体試料内の任意のタンパク質の機能を調べる方法として、標的タンパク質をコードする遺伝子を破壊する、いわゆる遺伝子ノックアウト法、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに結合して分解するＲＮＡ干渉法、又は標的タンパク質に対する抗体を作用させることで機能不活性化を行う方法などが知られている。これらの方法はいずれも標的タンパク質が発現している細胞内の全ての領域の標的タンパク質に効果が及ぶことを特徴とする。従って、細胞内の任意の位置に存在する標的タンパク質だけを選択的に不活性化する事は、原理上不可能であった。
【０００３】
一方、標的タンパク質の機能部位を光照射依存的に産生された活性酸素による酸化によって時空間的に不活性化し、そのタンパク質の機能解析を行う方法として、発色団補助光不活性化法（chromophore-assisted light inactivation；以下、ＣＡＬＩと称することがある）が知られている。具体的には、発色団補助光不活性化法はマラカイトグリーン、ローダミン誘導体、又はフルオレセイン誘導体などを光増感剤として用い、標的分子（例えば、標的タンパク質）に結合させ、標的分子の機能を抑制することによって、標的分子の機能を解析する方法である。例えば、フルオレセイン誘導体を用いた場合、フルオレセイン誘導体から、発生する一重項酸素（活性酸素）が標的タンパク質の機能を破壊することが知られている。
しかしながら、発色団補助光不活性化法は、通常フルオレセイン標識した標的分子に対する抗体又はフルオレセイン標識した標的分子（例えば、標的タンパク質）をマイクロインジェクション等で細胞に導入する必要があり、操作が煩雑であるという問題点があった。
【０００４】
最近、Ｌｕｋｙａｎｏｖらは、発色団補助光不活性化法に用いることのできる光増感性蛍光タンパク質（ＣＡＬＩ色素）である、「ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ」を報告した（特許文献１及び非特許文献１）。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄはタンパク質であるため、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄをコードするＤＮＡを含むプラスミドなどを用いることによって、形質転換又はトランスフェクションなどの手法により、光増感性蛍光タンパク質（ＣＡＬＩ色素）を細胞内において発現させることが可能になった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／１１７６９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（米国）２００６年、第２４巻、ｐ．９５〜９９
【非特許文献２】「フェブス・レター（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒ）」（オランダ）２００９年、第５８３巻、ｐ．２８３９−２８４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、細胞内において二量体を形成するため、多くのタンパク質はＫｉｌｌｅｒＲｅｄと融合しただけで、立体障害などによる機能の不活性化が起こり、光照射依存的な標的タンパク質の機能不活性化を行うことができないという問題を有していた。
また、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、光増感活性が低いため、活性酸素の産生量がフルオレセインよりも少ないという問題を有していた。
更に、例えば、生体試料内の２つ以上の標的タンパク質を、個別に光照射によって不活性化する場合には、吸光特性の異なる光増感性蛍光タンパク質が必要である。しかしながら、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ以外の吸光スペクトルを有する光増感性蛍光タンパク質は報告されておらず、別の励起波長及び蛍光波長を有する光増感性蛍光タンパク質の開発が望まれていた。
従って、本発明の目的は、単量体型の光増感性蛍光タンパク質を提供することである。また、本発明の別の目的は、光増感活性が高い光増感性蛍光タンパク質を提供することである。更に、本発明の別の目的は、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄとは異なる、励起波長及び蛍光波長を有する光増感性蛍光タンパク質を提供することである。
【０００８】
本発明者は、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中において、光刺激により活性酸素を効率良く産生することのできる光増感活性の高い光増感性蛍光タンパク質について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列において、５番目のグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に、１６２番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に、１７４番目のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に、そして２０６番目のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）に置換した変異体であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄは、単量体として細胞内などに存在するようになることを見出した。更に、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅは、一重項酸素の産生量が増加し、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ４５５ｎｍ及び５４４ｎｍにシフトすることを見出した。
更に、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの４６番のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎは、一重項酸素の産生量がＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して増加し、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ４３９ｎｍ及び４９６ｎｍにシフトすることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列、からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に関する。
本発明の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体の好ましい態様においては、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体が、他のタンパク質と結合した融合タンパク質である。
また、本発明は、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするＤＮＡに関する。
本発明のＤＮＡの好ましい態様においては、配列表の配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、及び配列番号５で表される塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列からなるＤＮＡである。
更に、本発明は、前記ＤＮＡを含むプラスミドに関する。
更に、本発明は、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、光増感性の活性酸素産生方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法に関する。
本発明の光増感性の活性酸素産生方法の好ましい態様においては、前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である。
更に、本発明は、光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、標的分子の機能解析方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法に関する。
本発明の標的分子の機能解析方法の好ましい態様においては、前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体によれば、単量体として細胞内などに存在することが可能であり、多くのタンパク質に対してＣＡＬＩにおける光増感性蛍光タンパク質として用いることが可能である。
本発明の光増感性蛍光タンパク質及びその機能的等価改変体、特にはＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅによれば、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの６８番目のチロシンをトリプトファンに置換（Ｙ６８Ｗ）することで、励起極大／蛍光極大を４５５ｎｍ／５４４ｎｍ（目視ではオレンジ色）にシフトし、更に、一重項酸素の産生量がＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して増加する。従って、ＣＡＬＩにおいて、増強型光増感性蛍光タンパク質として用いることが可能であり、更にＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎなどと同時に用いることにより、２種以上の標的タンパク質の機能相関などを解析することが可能である。
本発明の光増感性蛍光タンパク質及びその機能的等価改変体、特にはＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎによれば、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの４６番のバリンをアラニンに置換することで、励起極大／蛍光極大を４３９ｎｍ／４９６ｎｍ（目視では緑色）にシフトし、一重項酸素の産生量がＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して増加する。従って、ＣＡＬＩにおいて、増強型光増感性蛍光タンパク質として用いることが可能であり、更にＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅなどと同時に用いることにより、２種以上の標的タンパク質の機能相関などを解析することが可能である。
なお、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＸ線結晶構造解析を行った論文（非特許文献２）によれば、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの４６番のバリンをアラニンに置換（Ｖ４６Ａ）することは、発色団の光増感作用により発生した活性酸素をＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質の外部に効率良く放出するようになる可能性が記載されている。
しかしながら、後述の実施例に示すように、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＲｅｄにＶ４６Ａ変異を導入すると、活性酸素の放出量は減少した。一方、Ｙ６８Ｗ変異が導入されているＳｕｐｅｒｎｏｖａ−ＯｒａｎｇｅにＶ４６Ａ変異を導入したＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎでは、活性酸素の放出量が２倍以上に増大し、更に蛍光波長がグリーンに変化した。従って、光増感性蛍光タンパク質において、変異の導入により、活性酸素の放出量が増加したり、又は減少したりすることを予想すること、また蛍光波長が変化することは当業者であっても決して容易ではなく、試行錯誤を要するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ、及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎの励起スペクトル（Ａ）及び蛍光スペクトル（Ｂ）を示したグラフである。
【図２】ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎ、及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ−Ｖ４６Ａの活性酸素の産生量を示したグラフである。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチアシアネート）は陽性コントロールを示し、Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘＰＢＳ）は陰性コントロールを示している。
【図３】Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−ＲｅｄをＨｅｌａ細胞に導入し、光照射を行い、０時間、３時間、及び６時間後の細胞の微分干渉画像を示した写真である。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄがミトコンドリアに発現している細胞は、６時間後にアポトーシスにより、死滅している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の光増感性蛍光タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００１３】
本発明の機能的等価改変体は、前記光増感性蛍光タンパク質の機能的等価改変体である。本明細書において、「機能的等価改変体」とは、そのアミノ酸配列が、元となるタンパク質のアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるタンパク質と実質的に同じ活性を示すタンパク質を意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば１０個であり、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個である。
【００１４】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第１の実施態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第１光増感性蛍光タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第１機能的等価改変体と称する；以下、第１光増感性蛍光タンパク質及び第１機能的等価改変体を、まとめて第１光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。
第１光増感性蛍光タンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる光増感性蛍光タンパク質（すなわち、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）のアミノ酸配列において、５番目のグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）に置換（以下、Ｇ５Ｖと称することがある）、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換（以下、Ｎ１４７Ｓと称することがある）、１６２番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に置換（以下、Ｌ１６２Ｔと称することがある）、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に置換（以下、Ｆ１６４Ｔと称することがある）、１７４番目のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に置換（以下、Ｌ１７４Ｋと称することがある）、そして２０６番目のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）に置換（以下、Ｍ２０６Ｔと称することがある）したアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第１光増感性蛍光タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄである。
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、二量体を形成することが知られているが、これに対してＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄは、試料中（例えば、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中）において、単量体で存在する。また、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ５７９ｎｍ及び６１０ｎｍである。
【００１５】
本発明の第１光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換（以下、Ｌ１６２Ｔ、及びＦ１６４Ｔの置換を有するＫｉｌｌｅｒＲｅｄの変異体を、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔと称する）により、二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが、単量体となる。従って、前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔは、標的タンパク質との融合タンパク質として発現しても、標的タンパク質の機能を阻害しない。一方、Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔは、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して５８５ｎｍにおける吸光及び６１０ｎｍにおける蛍光が減少した。
しかしながら、前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔに、更にＧ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、及びＭ２０６Ｔの置換を導入することにより、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと同等の蛍光強度を有するＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄを得ることができた。
【００１６】
本発明の第１機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５７９ｎｍ及び６１０ｎｍであることを意味する。なお、励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５７９ｎｍ及び６１０ｎｍであるとは、好ましくは５６９〜５８９ｎｍ及び６００〜６２０ｎｍであり、より好ましくは５７４〜５８４ｎｍ及び６０５〜６１５ｎｍである。第１機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００１７】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第２の実施態様は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第２光増感性蛍光タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第２機能的等価改変体と称する；以下、第２光増感性蛍光タンパク質及び第２機能的等価改変体を、まとめて第２光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。第２光増感性蛍光タンパク質は、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄのアミノ酸配列において、６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換（以下、Ｙ６８Ｗと称する）したアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第２光増感性蛍光タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅである。
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ４５５ｎｍ及び５４４ｎｍであり、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して、一重項酸素の産生量が増加している。
【００１８】
本発明の第２光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により、二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが、単量体となり、Ｙ６８Ｗの置換により、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれおよそ４５５ｎｍ及び５４４ｎｍとなる。
本発明の第２機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４５５ｎｍ及び５４４ｎｍであることを意味する。なお、励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４５５ｎｍ及び５４４ｎｍであるとは、好ましくは４４５〜４６５ｎｍ及び５３４〜５５４ｎｍであり、より好ましくは４５０〜４６０ｎｍ及び５３９〜５４９ｎｍである。第２機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号８で表されるアミノ酸配列において、Ｌ１６２Ｔ、Ｆ１６４Ｔ、及びＹ６８Ｗの置換が導入されたタンパク質、及び前記タンパク質において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質、並びに前記配列番号４で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００１９】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第３の実施態様は、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第３光増感性蛍光タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第３機能的等価改変体と称する；以下、第３光増感性蛍光タンパク質及び第３機能的等価改変体を、まとめて第３光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。第３光増感性蛍光タンパク質は、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅのアミノ酸配列において、４６番のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換（以下、Ｖ４６Ａと称する）したアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第３光増感性蛍光タンパク質は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎである。
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ４３９ｎｍ及び４９６ｎｍであり、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較して、一重項酸素の産生量が増加している。
【００２０】
本発明の第３光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが単量体となり、Ｙ６８Ｗ及びＶ４６Ａの置換により、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ４３９ｎｍ及び４９６ｎｍとなる。
本発明の第３機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４３９ｎｍ及び４９６ｎｍであることを意味する。なお励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約４３９ｎｍ及び４９６ｎｍであるとは、好ましくは４２９〜４４９ｎｍ及び４８６〜５０６ｎｍであり、より好ましくは４３４〜４４４ｎｍ及び５９１〜５０１ｎｍである。第３機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号８で表されるアミノ酸配列において、Ｌ１６２Ｔ、Ｆ１６４Ｔ、Ｙ６８Ｗ及びＶ４６Ａの置換が導入されたタンパク質、及び前記タンパク質において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質、並びに前記配列番号６で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００２１】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第４の実施態様は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第４タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第４機能的等価改変体と称する；以下、第４光増感性蛍光タンパク質及び第４機能的等価改変体を、まとめて第４光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。
第４光増感性蛍光タンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる光増感性蛍光タンパク質（すなわち、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）のアミノ酸配列において、Ｌ１６２Ｔ、Ｆ１６４Ｔ、及びＮ１４７Ｓの置換を有するアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第４光増感性蛍光タンパク質は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓである。
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓの励起極大波長は、５１２ｎｍであり、蛍光は黄緑色（目視）を示す。
【００２２】
本発明の第４光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが単量体となり、Ｎ１４７Ｓの置換により、励起極大波長が５１２ｎｍで、蛍光が黄緑色となる。
【００２３】
本発明の第４機能的等価改変体は、実質的にＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓと同じ活性を有するものである。「ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長が約５１２ｎｍ及び蛍光が黄緑色であることを意味する。なお、励起極大波長が約５１２ｎｍであるとは、好ましくは５０２〜５２２ｎｍであり、より好ましくは５０７〜５１７ｎｍである。第４機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号９で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００２４】
本発明の光増感性蛍光タンパク質の第５の実施態様は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下、第５タンパク質と称する）又はその機能的等価改変体（以下、第５機能的等価改変体と称する；以下、第５光増感性蛍光タンパク質及び第５機能的等価改変体を、まとめて第５光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）であり、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその機能的等価改変体であることが好ましい。
第５光増感性蛍光タンパク質は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる光増感性蛍光タンパク質（すなわち、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）のアミノ酸配列において、Ｌ１６２ＴＦ１６４Ｔ、Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、Ｍ２０６Ｔ、及びＶ４６Ａの置換を有するアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質である。代表的な第５光増感性蛍光タンパク質は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａである。
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａの励起極大波長及び蛍光極大波長は、それぞれ５０９ｎｍ及び５９４ｎｍである。
【００２５】
本発明の第５光増感性蛍光タンパク質等において、前記Ｌ１６２Ｔ及びＦ１６４Ｔの置換により二量体であったＫｉｌｌｅｒＲｅｄが単量体となり、Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、Ｍ２０６Ｔ、及びＶ４６Ａの置換により、励起極大波長及び蛍光極大波長が、それぞれ５０９ｎｍ及び５９４ｎｍとなる。
【００２６】
本発明の第５機能的等価改変体は、実質的にＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａと同じ活性を有するものである。「Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａと同じ活性」とは、光照射により活性酸素を産生すること、光照射により蛍光を発生すること、試料中において単量体で存在すること、そして励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５０９ｎｍ及び５９４ｎｍであることを意味する。なお、励起極大波長及び蛍光極大波長がそれぞれ約５０９ｎｍ及び５９４ｎｍであるとは、好ましくは４９９〜５１９ｎｍ及び５８４〜６０４ｎｍであり、より好ましくは５０４〜５１４ｎｍ及び５８９〜５９９ｎｍである。第５機能的等価改変体としては、例えば、前記配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、第２番目のグリシン及び第３番目のセリンを欠如したタンパク質を挙げることができる。
【００２７】
本発明の光増感性蛍光タンパク質及び機能的等価改変体（以下、まとめて本発明の光増感性蛍光タンパク質等と称することがある）は、光の照射によって、活性酸素（例えば、一重項酸素）を産生することが可能である。従って、本発明のタンパク質等を細胞内に導入し、適当な励起波長の光を照射することによって、一重項酸素を発生させ、細胞に障害を与え、更には細胞を死滅させることもできる。
また、本発明のタンパク質等は、発色団補助光不活性化法に用いることもできる。具体的には本発明の光増感性蛍光タンパク質等を標的タンパク質に結合させ、光の照射によって活性酸素（例えば、一重項酸素）を産生することによって、その標的タンパク質の機能を抑制、又はその標的タンパク質を破壊することによって、標的タンパク質の機能を解析することができる。
【００２８】
本発明による光増感性蛍光タンパク質及び機能的等価改変体は、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、光増感性蛍光タンパク質であるＫｉｌｌｅｒＲｅｄをコードするＤＮＡを含むプラスミドベクターを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により調製することが可能である。
更に得られたプラスミドを用いて、大腸菌などの宿主細胞を形質転換し、形質転換体を得ることができる。得られた形質転換体（すなわち、本発明による光増感性蛍光タンパク質又は機能的等価改変体をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する形質転換体）を、前記光増感性蛍光タンパク質等の発現が可能な条件下で培養し、タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から光増感性蛍光タンパク質等を分離及び精製することにより調製することができる。前記の分離及び精製方法としては、例えば、光増感性蛍光タンパク質にＨｉｓタグを付けニッケルＮＴＡカラムで生成する方法、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の光増感性蛍光タンパク質等は、他のタンパク質と結合した融合タンパク質とすることができる。融合される他のタンパク質は、光増感性蛍光タンパク質等の活性を完全に阻害しない限り、特に制限されるものではなく、例えば、発色団補助光不活性化法における標的タンパク質、又は標的分子に結合させる結合タンパク質を挙げることができる。
【００３０】
前記標的タンパク質は、発色団補助光不活性化法において、機能を解析されるタンパク質である。標的タンパク質を本発明の光増感性蛍光タンパク質等との融合タンパク質とした場合、光の照射により光増感性蛍光タンパク質等から産生された活性酸素が、容易に標的タンパク質を不活化することができる。これは、産生された活性酸素により、半径約１０〜５０Åに存在する標的分子が特異的に不活化されるためである。本発明の光増感性蛍光タンパク質等は、単量体であるため、標的タンパク質の細胞内における本来の局在性や活性を妨害することが少ない。後述の実施例で示すように、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄと、標的タンパク質（例えば、チューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３）とを、融合タンパク質として発現させた場合、標的タンパク質の局在化に影響を与えなかった。
【００３１】
前記結合タンパク質は、発色団補助光不活性化法において、標的分子に光増感性蛍光タンパク質を結合させるタンパク質である。結合タンパク質は、標的分子に結合することのできるタンパク質であれば、特に限定されるものではないが、例えば、抗体及びその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は抗体可変領域全長の遺伝子産物）、レセプター、又はリガンドを挙げることができる。
【００３２】
前記融合タンパク質は、公知の遺伝子組み換え技術によって、調整することが可能である。具体的には、光増感性蛍光タンパク質等をコードするＤＮＡと、他のタンパク質をコードするＤＮＡとを、定法に従って、発現用プラスミドに導入する。得られたプラスミドを、形質転換などにより、宿主細胞に導入することによって、融合タンパク質を発現させることが可能である。
【００３３】
本発明によるＤＮＡは、本発明の光増感性蛍光タンパク質等をコードする限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列表の配列番号１、３、又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。配列表の配列番号１で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄをコードする。また、配列表の配列番号３で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅをコードする。更に、配列表の配列番号５で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎをコードする。
【００３４】
本発明によるプラスミドは、本発明による前記ＤＮＡを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ＤＮＡを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
得られたプラスミドを所望の宿主細胞に形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。前記形質転換体も、本発明による前記プラスミドを含む限り、特に限定されるものではない。
【００３５】
前記宿主細胞としては、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３６】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００３７】
本発明の光増感性の活性酸素産生方法は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等を用いる。前記光増感性蛍光タンパク質等に、励起光を照射することにより、光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素が産生される。
本発明の光増感性の活性酸素産生方法によれば、例えば、細胞に前記光増感性蛍光タンパク質等を導入し、そして励起光を照射することにより、光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素が産生され、細胞を死滅させることができる。
前記励起光の波長は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素を産生させることのできる波長である。本発明の第１光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は、４９０〜６２０ｎｍが好ましく、５４０〜５８０ｎｍがより好ましく、５６０〜５８０ｎｍが最も好ましい。本発明の第２光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は４００〜５００ｎｍが好ましく、４２０〜４８０ｎｍがより好ましく、４４０〜４６０ｎｍが最も好ましい。本発明の第３光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は３９０〜４８０ｎｍが好ましく、３９０〜４６０ｎｍがより好ましく、４３０〜４５０ｎｍが最も好ましい。
また前記励起光としては、前記励起波長の光のほか、多光子励起現象にもとづき、前記励起波長のおよそ整数倍の波長を有する光を用いることもできる。
【００３８】
本発明の光増感性の活性酸素産生方法によれば、細胞のアポトーシスを誘導することが可能である。アポトーシスを誘導することにより、本発明の光増感性の活性酸素産生方法は、光線力学療法（ＰＤＴ）に用いることができる。光線力学療法とは、光増感性の物質を腫瘍細胞に取り込ませ、光を照射することにより、細胞を死滅させる腫瘍の治療方法である。より具体的には、腫瘍細胞又は腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞内に、本発明の光増感性蛍光タンパク質等を導入し、適当な光を照射することにより、活性酸素を発生させる。この活性酸素により、腫瘍細胞又は腫瘍組織が傷害され、腫瘍が消失するものである。
【００３９】
本発明の標的分子の機能解析方法は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等を用いる。前記光増感性蛍光タンパク質等に、励起光を照射することにより、光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素が産生される。産生された活性酸素は近傍の標的分子を破壊し、それにより破壊された標的分子の機能を解析することが可能である。
前記励起光の波長は、本発明の光増感性蛍光タンパク質等から活性酸素を産生させることのできる波長である。本発明の第１光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は、４９０〜６２０ｎｍが好ましく、５４０〜５８０ｎｍがより好ましく、５６０〜５８０ｎｍが最も好ましい。本発明の第２光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は４００〜５００ｎｍが好ましく、４２０〜４８０ｎｍがより好ましく、４４０〜４６０ｎｍが最も好ましい。本発明の第３光増感性蛍光タンパク質等では、前記励起波長は３９０〜４８０ｎｍが好ましく、３９０〜４６０ｎｍがより好ましく、４３０〜４５０ｎｍが最も好ましい。
また前記励起光としては、前記励起波長の光のほか、多光子励起現象にもとづき、前記励起波長のおよそ整数倍の波長を有する光を用いることもできる。
より具体的には本発明の標的分子の機能解析方法は、発色団補助光不活性化法として、用いることができる。
【００４０】
本発明の方法において、標的分子とは、その生理的機能を解明する対象となる生体分子をいい、特にこれらに限定されないが、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、シグナル伝達物質などが挙げられる。特には、本発明の方法において好ましい標的分子は、タンパク質であり、酵素、受容体タンパク質、リガンドタンパク質、シグナル伝達タンパク質、転写制御タンパク質、骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、スキャホールドタンパク質等を挙げることができる。
【００４１】
前記光増感性蛍光タンパク質等が産生する活性酸素は、一重項酸素である。前記一重項酸素は、励起状態の光増感性蛍光タンパク質発色団が項間交差によって励起３重項状態に遷移し、発色団近傍に存在する基底状態の３重項酸素にエネルギーを転移することにより発生する。発生した一重項酸素は、約１０〜５０Åの半径で光増感性蛍光タンパク質等に結合された標的分子（例えば、標的タンパク質）あるいはその機能性部位を選択的に不活化することができる。このようにして、標的分子自体あるいは標的分子の特定部位を不活性化することによって、その標的物質の生理的機能を解析することができる。例えば、このような不活性化によって、タンパク質の機能性部位の同定、その機能性部位の機能の確認、リガンドの機能の確認、機能性部位のタンパク質寿命に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質動態に及ぼす影響の確認、機能性部位のタンパク質フォールディングに及ぼす影響の確認などを行うことができる。
なお、本発明の標的分子の機能解析方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイに、また細胞内外の標的分子に利用可能である。
【００４２】
本発明の標的分子の機能解析方法において、光増感性蛍光タンパク質等を標的分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、シグナル伝達物質）に結合させる方法は、特に限定されず、例えば化学結合によることが好ましい。光増感性蛍光タンパク質等を標的分子に共有結合により結合させることができる。また、光増感性蛍光タンパク質等に標的分子に対する抗体を共有結合により結合させ、その抗体により光増感性蛍光タンパク質等を標的分子に結合させることができる。更に、光増感性蛍光タンパク質等と標的分子に対する抗体とを融合タンパク質として発現させ、その抗体により光増感性蛍光タンパク質等を標的分子に結合させることができる。更には、標的分子がタンパク質の場合は、光増感性蛍光タンパク質等と標的タンパク質とを融合タンパク質として発現させることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
《実施例１》
本実施例では、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列に変異を導入することにより、単量体として存在することのできる光増感蛍光タンパク質の作製を試みた。
具体的には、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列における５番目のグリシン（Ｇ）、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）、１６２番目のロイシン（Ｌ）、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）、１７４番目のロイシン（Ｌ）、２０６番目のメチオニン（Ｍ）を、それぞれ、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トレオニン（Ｔ）、リシン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）に変異させるために、Ｓａｗａｎｏらの方法（Sawano A and Miyawaki A. Nucleic Acid Research 28,E78,2000）に従って、部位特異的突然変異誘発法により、順次変異を導入した。
【００４５】
（１）１６２番目のロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）への置換
１６２番目のロイシン（Ｌ）をトレオニン（Ｔ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１６２Ｔ:5’-GTGCGCCAGACCGCCACCATC-3’（配列番号１１）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１６２Ｔの末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。変異を導入する鋳型プラスミドＤＮＡとしては、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ遺伝子を含むプラスミドベクターを鋳型に用いたポリメラーゼ連鎖反応により、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ遺伝子の上流と下流にそれぞれＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを付加してＫｉｌｌｅｒＲｅｄ遺伝子を増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切り出し、プラプラスミドｐＲＳＥＴＢ（インビロロジェン社）に挿入して得られたＫｉｌｌｅｒＲｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いた。
【００４６】
突然変異鎖の合成は、以下の通り行った。以下の組成の反応溶液４０μＬを準備し、ＰＣＲ法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した。
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ ５０ｎｇ、
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１６２Ｔ １０ｐｍｏｌ、
ｄＮＴＰ ３．７５ｎｍｏｌ、
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １．２５Ｕ、
ＰｆｕＤＮＡリガーゼ ２０Ｕ
なお、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製であり、１０×Ｐｆｕポリメラーゼバッファー中に溶解したものである。また、ＰｆｕＤＮＡリガーゼは、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のものであり、１０×ＰｆｕＤＮＡリガーゼバッファー中に溶解したものである。
サーマルサイクラーは以下の通りプログラムした。すなわち、まず、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕＤＮＡリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後９４℃、１分の最初の変性を行った。続いて、９４℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとして３５サイクル行った。最後に７５℃、１０分のポストインキュベーションを行った。
【００４７】
得られたＰＣＲ産物を、以下の反応条件に従い、ＤｐｎＩによって切断し、変異の導入されていないメチル化又はヘミメチル化した鋳型プラスミドＤＮＡを選択的に消化した。具体的には、前記ＰＣＲ後の反応溶液４０μＬに１μＬ（２０Ｕ）のＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ社製）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。なお、ＤｐｎＩは〔５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’〕を認識して２本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。更に、ＤｐｎＩで処理した反応溶液２０．４μＬに対して、フェノールクロロホルム抽出を行ってサンプルを精製し、上清をエタノール沈殿して乾燥させた。
【００４８】
次に、得られたＤＮＡを用いて、形質転換及び発現を行った。前記１本鎖突然変異導入環状ＤＮＡ鎖を用いて、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテントセル（ＪＭ１０９（ＤＥ３））を形質転換した。そして形質転換した大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて培養し、生育した単一コロニーをピックアップして１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培養液２ｍＬ中へ移し、３７℃で一晩培養して増殖させた。
１６２番目のロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）への置換は、定法に従い、塩基配列のシークエンスを行い、変異の導入されたプラスミドを、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／ｐＲＳＥＴＢと命名した。
【００４９】
（２）１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）のトレオニン（Ｔ）への置換
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／ｐＲＳＥＴＢの１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ１６４Ｔ：5’-CAGACCGCCACCATCGGCTTC-3’（配列番号１２）
１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）への置換は、鋳型プラスミドＤＮＡとして、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｆ１６４Ｔを用いることを除いては、前記（１）の操作を繰り返し、１６４番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトレオニン（Ｔ）に置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
【００５０】
（３）ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔの発現
得られたプラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢタンパク質は、Ｔ７発現系（ｐＲＳＥＴＢ／ＪＭ１０９（ＤＥ３））を用いて発現させた。すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテントセル（ＪＭ１０９（ＤＥ３））をＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢで形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ固体培地で３７℃にて培養した。その後、生育した単一コロニーをピックアップして１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培養液３００ｍＬ中へ植菌し、２３℃で４日間培養した。得られた細胞をフレンチプレスにより破砕し、得られた上清液から、ニッケルキレートカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてポリヒスチジン標識化タンパク質を精製した。更に、この溶出液（１００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）をＰＤ１０脱塩・バッファー交換カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて精製し、タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔを得た。
【００５１】
（４）ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔの発色及び単量体化の確認
得られたＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔを、ｐｓｅｕｄｏ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにより解析した。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔのバンドは、二量体のＫｉｌｌｅｒＲｅｄのバンドと比較すると、低分子量にシフトし、単量体として存在した。
しかしながら、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔは、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄと比較すると、６１０ｎｍにおける蛍光が減衰した。結果を、表１に示す。
【００５２】
（５）Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、及びＭ２０６Ｔの置換の導入
Ｇ５Ｖ、Ｎ１４７Ｓ、Ｌ１７４Ｋ、及びＭ２０６Ｔの置換を、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔに導入するため、以下のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｇ５Ｖ：5’-GGTTCAGAGGTCGGCCCCGCC-3’（配列番号１３）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｎ１４７Ｓ：5’-CAGACCGCCACCATCGGCTTC-3’（配列番号１４）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｌ１７４Ｋ：5’-GACGGCGGCAAGATGATGGGC-3’（配列番号１５）
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｍ２０６Ｔ：5’-ACCAAGCAGACGAGGGACACT-3’（配列番号１６）
【００５３】
５番目のグリシン（Ｇ）のバリン（Ｖ）への置換は、鋳型プラスミドＤＮＡとして、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｇ５Ｖを用いることを除いては、前記（１）の操作を繰り返し、５番目のグリシン（Ｇ）のバリン（Ｖ）に置換されたタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ_Ｇ５Ｖ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
以下、同様の操作により、順次変異を導入し、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのアミノ酸配列において、１４７番目のアスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に、１７４番目のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に、そして２０６番目のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）に置換したタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
【００５４】
（６）Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの発現
Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄタンパク質は、プラスミドとしてＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いたことを除いては、前記（３）の操作を繰り返し、精製タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄを得た。
【００５５】
《比較例１〜２１》
比較例１〜２１では、二量体のＫｉｌｌｅｒＲｅｄを、単量体にするための変異の導入を試みた。具体的には、各比較例では以下のアミノ酸の置換を行った。
比較例１：１２６番目のアスパラギンをアルギニン（Ｎ１２６Ｒ）に置換した。
比較例２：１２８番目のアスパラギン酸をトレオニン（Ｄ１２８Ｔ）に置換した。
比較例３：１２６番目のアスパラギンをアルギニンに置換（Ｎ１２６Ｒ）し、１２８番目のアスパラギン酸をトレオニン（Ｎ１２６Ｒ／Ｄ１２８Ｔ）に置換した。
比較例４：１５４番目のヒスチジンをグルタミン酸（Ｈ１５４Ｅ）に置換した。
比較例５：１６５番目のイソロイシンをアルギニン（Ｉ１６５Ｒ）に置換した。
比較例６：１６３番目のアラニンをリシン（Ａ１６３Ｋ／Ｉ１６５Ｒ）に置換し、１６５番目のイソロイシンをアルギニン（Ｎ１２６Ｒ／Ｄ１２８Ｔ）に置換した。
比較例７：１７６番目のメチオニンをアスパラギン酸（Ｍ１７６Ｄ）に置換した。
比較例８：１９６番目のプロリンをアラニン（Ｐ１９６Ａ）に置換した。
比較例９：１９８番目のフェニルアラニンをリシン（Ｆ１９８Ｋ）に置換した。
比較例１０：１４０番目のグルタミンをアラニン（Ｑ１４０Ａ）に置換した。
比較例１１：２６番目のリシンをグルタミン酸（Ｋ２６Ｅ）に置換した。
比較例１２：１７４番目のロイシンをヒスチジン（Ｌ１７４Ｈ）に置換した。
比較例１３：１７４番目のロイシンをアルギニン（Ｌ１７４Ｒ）に置換した。
比較例１４：２２７番目のバリンをリシン（Ｖ２２７Ｋ）に置換した。
比較例１５：２３０番目のイソロイシンをリシン（Ｉ２３０Ｋ）に置換した。
比較例１６：２３４番目のイソロイシンをリシン（Ｉ２３４Ｋ）に置換した。
比較例１７：１５２番目のフェニルアラニンをトレオニン（Ｆ１５２Ｔ）に置換した。
比較例１８：１６２番目のロイシンをリシン（Ｌ１６２Ｋ）に置換した。
比較例１９：１６４番目のフェニルアラニンをリシン（Ｆ１６４Ｋ）に置換した。
比較例２０：１６７番目のフェニルアラニンをリシン（Ｆ１６７Ｋ）に置換した。
比較例２１：１６７番目のフェニルアラニンをトレオニン（Ｆ１６７Ｔ）に置換した。
前記各比較例において、それぞれの置換に対応するプライマーを合成し、それぞれのプライマーを用いたことを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返すことにより、それぞれの変異を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。
得られたプラスミドを用いることを除いては、前記実施例の工程（３）及び（４）の操作を繰り返すことにより、それぞれのタンパク質の発色及び単量体化を確認した。比較例１〜２１では、得られたタンパク質は、二量体のままで、単量体化しなかった。結果を纏めて、表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
《実施例２》
本実施例では、前記タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した。
６８番目のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｙ６８Ｗ：5’-GCCACCTGATCCAGTGGGGCGAGCCC-3’（配列番号１７）
鋳型プラスミドＤＮＡとして、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｙ６８Ｗを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
更に、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅを得た。
【００５８】
《実施例３》
本実施例では、前記タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅの４６番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した。
４６番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換するため、以下の変異導入用のプライマーを合成した。
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａ：5’-GGCGACTTCAACGCCCACGCCGTG-3’（配列番号１８）
鋳型プラスミドＤＮＡとして、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
更に、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎを得た。
【００５９】
《実施例４》
本実施例では、タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔに、更にＮ１４７Ｓの置換を導入し、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓの作製を試みた。
鋳型プラスミドＤＮＡとして、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを得た。
更に、プラスミドＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓ（配列番号９）を得た。
【００６０】
《実施例５》
本実施例では、前記タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの４６番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した。
鋳型プラスミドＤＮＡとして、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを用いること、及びプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ−Ｖ４６Ａを用いることを除いては、前記実施例１の工程（１）の操作を繰り返し、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを得た。更に、プラスミドＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａ／ｐＲＳＥＴＢを用いることを除いては、前記実施例１の工程（３）の操作を繰り返し、タンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａ（配列番号１０）を得た。
【００６１】
《比較例２２〜２７》
比較例２２〜２７では、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの発色団の発色を変化させるための変異の導入を試みた。具体的には、各比較例では、Ｌ１６２Ｔ／Ｆ１６４Ｔの置換に、更に以下のアミノ酸の置換を行った。
比較例１：１５０番目のヒスチジンをトレオニン（Ｈ１５０Ｔ）に置換した。
比較例２：１４８番目のグルタミン酸をトレオニン（Ｅ１４８Ｔ）に置換した。
比較例３：１４８番目のグルタミン酸をリシン（Ｅ１４８Ｋ）に置換した。
比較例４：１４８番目のグルタミン酸をバリン（Ｅ１４８Ｖ）に置換した。
比較例５：２２６番目のセリンをイソロイシン（Ｓ２２６Ｉ）に置換した。
比較例６：１４８番目のグルタミン酸をバリン（Ｅ１４８Ｖ）に置換し、２２６番目のセリンをイソロイシン（Ｓ２２６Ｉ）に置換した。
前記各比較例において、それぞれの置換に対応するプライマーを合成し、それぞれのプライマーを用いたことを除いては、前記実施例１の工程（５）の操作を繰り返すことにより、それぞれの変異を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。
得られたプラスミドを用いることを除いては、前記実施例の工程（３）及び（４）の操作を繰り返すことにより、それぞれのタンパク質の発色及び単量体化を確認した。比較例２２〜２７で得られたタンパク質は、赤色からの発色のシフトは見られず、また、発色の増強も見られなかった。結果を纏めて表２に示す。
【００６２】
【表２】
【００６３】
《実施例６》
得られたタンパク質が所望の突然変異を導入したものであることを、該タンパク質の励起波長及び発光波長を測定するとともに既存のタンパク質（ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ等）の励起波長及び発光波長と比較することにより確認した。
得られたタンパク質の励起波長を測定し、規格化したものを図１（Ａ）中に曲線で示す。また、得られたタンパク質の蛍光波長を測定し、正規化したものを図１（Ｂ）中曲線で示す。なお、図１（Ａ）及び（Ｂ）には、比較のためにＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄについて励起波長及び蛍光波長を併せて示す。図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、上述した方法で変異を導入したタンパク質Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅは励起波長のピークが４５５ｎｍ、蛍光波長のピークが５４４ｎｍであり、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎは励起波長のピークが４３９ｎｍ、蛍光波長のピークが４６９ｎｍであることがわかる。これに対してＫｉｌｌｅｒＲｅｄの励起波長のピークは５８５ｎｍであり、蛍光波長のピークは６１０ｎｍ、またＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄの励起波長のピークは５７９ｎｍであり、蛍光波長のピークは６１０ｎｍである。
なお、この表３において、λａｂｓはナノメーター単位での吸光度スペクトルのピークを表している。（ε）は１０３Ｍ−１ｃｍ−１単位でのモル吸光係数である。λｅｍはナノメーター単位での蛍光スペクトルのピークを表している。
【００６４】
更に、実施例４で得られたＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓ及び、実施例５で得られたＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａについても、励起波長及び、蛍光波長を測定した。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ＿Ｌ１６２Ｔ_Ｆ１６４Ｔ＿Ｎ１４７Ｓは、励起波長のピークが５１２ｎｍ、そして蛍光が黄緑色であり、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ＿Ｖ４６Ａは励起波長のピークが５０９ｎｍ、蛍光波長のピークが５９４ｎｍであった。
【００６５】
《実施例７》
また、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎについて活性酸素量の測定を行った。ここではまず、１０μＭ ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９，１０−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ（以下ＡＤＰＡと記す）を含む５０μＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅ及びＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎタンパク質溶液をそれぞれ１００μＬずつ調製した。ＡＤＰＡは励起極大が３８０ｎｍ、蛍光極大が４３０ｎｍの一重項酸素検出用試薬である。一重項酸素とは活性酸素の一種で、大変強力な酸化能力を有しており、ＡＤＰＡが一重項酸素と反応することでＡＤＰＡは過酸化物へと変化し、４３０ｎｍにある蛍光ピークが失われる。
得られたサンプル溶液を以下の測定条件に従って、活性酸素測定を行った。すなわち、１５μＬをテラサキディッシュに添加し、ＹＡＧレーザー（ＬＯＴＩＳ社、ＬＳ−２１３７Ｕ−ＹＡＧ、周波数１０Ｈｚ、パルス幅１５ｎｓ）の第三高調波（３５５ｎｍ）をオプティカルパラメトリック発振器（ＬＯＴＩＳ社、ＬＴ−２２１４−ＯＰＯ）を用いて波長変換し、２０ｍＪ／ｃｍ２／パルスのエネルギー密度で５分間照射した後、これを１ｍＬの１×ＰＢＳで希釈し、分光蛍光光度計Ｆ−２５００（日立）を用いてＡＤＰＡの退色率を測定した。レーザーの波長はそれぞれＫｉｌｌｅｒＲｅｄとＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄが５８０ｎｍ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｏｒａｎｇｅが４５０ｎｍ、Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｇｒｅｅｎが４４０ｎｍである。上述した突然変異を導入した蛍光タンパク質を含む４つの蛍光タンパク質の活性酸素量の比較を図２に示す。図２においてＫＲ各種光増感性蛍光タンパク質によるＡＤＰＡ褪色率、すなわち活性酸素放出量を示している。なお、図２では比較のためフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の活性酸素量で規格化した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
《実施例８》
本実施例では、実施例１において得られたＳｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄを、チューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３との融合タンパク質として発現させた。前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢに、ＰＣＲで得られたチューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３をコードするＤＮＡを挿入した。得られたプラスミドを、それぞれｔｕｂｌｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、ｋｅｒａｔｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、及びＣｘ４３Ｓ−ｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢと称する。
得られたプラスミドｔｕｂｌｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、ｋｅｒａｔｉｎ−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢ、及びＣｘ４３−Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐＲＳＥＴＢを、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、細胞内局在を蛍光顕微鏡で調べた。
チューブリン、ケラチン、又はＣｘ４３、それぞれ、細胞の微小管、中間系フィラメント、及びギャップジャンクションに局在しており、それぞれのタンパク質が存在している位置で発現しており、タンパク質の局在化に影響を与えなかった。
【００６８】
《実施例９》
本実施例では、前記Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄにミトコンドリアマトリクス移行シグナルをつなげることで細胞内のミトコンドリアに導入し、光照射によってミトコンドリア機能を不活性化することによりアポトーシスを誘導した。
１μｇのプラスミド＿Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄ／ｐｃＤＮＡ３、を、トランスフェクション試薬（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、３５ｍｍガラスボトム皿上で培養しているＨｅｌａ細胞に導入した。２日間培養後、５８０ｎｍの光を８Ｗ／ｃｍ２のパワー密度で９０秒間照射した後、０時間、３時間、及び６時間の細胞を微分干渉顕微鏡を用いて観察した。Ｓｕｐｅｒｎｏｖａ−Ｒｅｄが、ミトコンドリアに発現している細胞は、６時間後には退縮し、死滅した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体は、発色団補助光不活性化法に用いることが可能であり、標的分子の機能解析に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列、からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体。
【請求項２】
前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体が、他のタンパク質と結合した融合タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質又はその機能的等価改変体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、及び配列番号５で表される塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列からなる、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、光増感性の活性酸素産生方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法。
【請求項７】
前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である、請求項６に記載の光増感性の活性酸素産生方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、標的分子の機能解析方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である、請求項８に記載の標的分子の機能解析方法。
【請求項１０】
前記標的分子が、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖質、及び脂質からなる群から選択される少なくとも１つの標的分子である、請求項９に記載の標的分子の機能解析方法。
【請求項１】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列、からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体。
【請求項２】
前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体が、他のタンパク質と結合した融合タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質又はその機能的等価改変体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、及び配列番号５で表される塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列からなる、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、光増感性の活性酸素産生方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法。
【請求項７】
前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である、請求項６に記載の光増感性の活性酸素産生方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体を用いた、標的分子の機能解析方法であって、前記光増感性蛍光タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
前記励起光の波長が、４９０〜５８０ｎｍ、４００〜５００ｎｍ、及び３９０〜４４０ｎｍからなる群から選択される少なくとも１つの波長である、請求項８に記載の標的分子の機能解析方法。
【請求項１０】
前記標的分子が、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖質、及び脂質からなる群から選択される少なくとも１つの標的分子である、請求項９に記載の標的分子の機能解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−７８２６４（Ｐ２０１３−７８２６４Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２６０３（Ｐ２０１０−２２６０３）
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月３日（２０１０．２．３）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]