免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体
【課題】本発明は、ＥＬＩＳＡにおいて高い検出感度を実現するＰＥＧリンカーを有する物質固定化用担体を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、支持体と、前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層とを少なくとも含み、前記親水性ポリマー層が、ポリエチレングリコール鎖と、標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基とを含む、物質固定化用担体、該担体への被固定化物質の固定化方法、並びに、該担体を使用した免疫アッセイによる測定法及びそのためのキットに関する。
【解決手段】本発明は、免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、支持体と、前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層とを少なくとも含み、前記親水性ポリマー層が、ポリエチレングリコール鎖と、標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基とを含む、物質固定化用担体、該担体への被固定化物質の固定化方法、並びに、該担体を使用した免疫アッセイによる測定法及びそのためのキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アッセイに用いるための固相担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法の一種である酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）は、創薬、診断、環境計測、食品を含む幅広い分野で利用されている。典型的なＥＬＩＳＡは、（１）抗体または抗原の固定化（固相化）、（２）標的物質の結合、（３）酵素標識抗体の結合、（４）酵素反応、（５）光学的検出（吸収、蛍光、発光）、の５つの工程からなる。標識用酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどが用いられる。ＥＬＩＳＡは数ある免疫測定法のなかでも特に感度が高い。しかし、実際には固相担体への生体分子の非特異吸着が原因で期待する感度が得られないことも多い。特に酵素標識抗体のような複合体は固相担体に吸着しやすく、これがＥＬＩＳＡにおけるノイズの主な原因となっている。このような非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキング処理が試みられるが、その効果は限定的と言わざるを得ない。そこで、生体分子の非特異吸着を効果的に防ぐポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）に注目が集まっている。すなわち、抗体または抗原の固定化を、ＰＥＧリンカーを介して行うことによって、固相担体への生体分子の非特異吸着を防ぐ試みがなされている。
【０００３】
特許文献１には、ＰＥＧリンカーを介して抗体を金表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、金表面に非イオン性官能基を導入し、ここにヘテロ二官能性ＰＥＧの片末端を共有結合させ、別の末端に抗体を結合させる、というものである。この方法によって表面プラズモン共鳴法におけるノイズが有意に低減されることが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、ＰＥＧリンカーを介して核酸やタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧリンカーを有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧリンカーの末端に核酸やタンパク質を結合させる、というものである。この方法によってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ＰＥＧリンカーを介して核酸をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、シランカップリング剤をガラス表面に適用してアミノ基を導入し、ここにホモ二官能性ＰＥＧの片末端を共有結合させ、別の末端に核酸を結合させる、というものである。この方法によってバイオセンサの感度が改善されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１６４３４８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３７１５号公報
【特許文献３】特開２００６−５０９２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、ＰＥＧリンカーを介して生体分子を固定化する方法は知られているが、ＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイにおいて高い感度が発揮される、ＰＥＧリンカーを介して固定化を行う物質固定化用担体は開示されていない。
【０００８】
また、標的物質と特異的に結合する抗体、抗原等の被固定化物質を固相担体に固定化する免疫アッセイにおいて、ＰＥＧリンカーを有する物質固定化用担体に、生体関連物質である被固定化物質をその活性を維持したまま高密度に固定化することは困難であった。
【０００９】
本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、ＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイにおいて高い検出感度を実現する、ＰＥＧリンカーを有する物質固定化用担体、該担体への被固定化物質の固定化方法、並びに、該担体を使用した免疫アッセイ法及びそのためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、表面に特定の条件を満足するＰＥＧリンカーを含む親水性ポリマー層を備える支持体を物質固定化用担体として用いて免疫アッセイを行った場合に高い検出感度を実現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
（２）前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
（１）の物質固定化用担体。
（３）前記窒素を含有する官能基が、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基又はスクシンイミジルオキシカルボニル基である、（２）の物質固定化用担体。
（４）免疫アッセイに用いるための物質固定化担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と、前記被固定化物質とが共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
（５）（１）〜（３）のいずれかの物質固定化用担体と、前記被固定化物質とから、前記官能基と前記被固定化物質とを反応させて共有結合を形成することにより製造されたものである、（４）の物質固定化担体。
（６）（４）又は（５）の物質固定化担体の製造方法であって、
（１）〜（３）のいずれかの物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、被固定化物質接触工程と、
前記物質固定化用担体に接触させた前記溶液を乾燥濃縮させる、乾燥濃縮工程と、
を含む方法。
（７）前記溶液が糖類を含む、（６）の方法。
（８）前記糖類がトレハロースである、（７）の方法。
（９）前記溶液が非イオン性界面活性剤を含む、（６）〜（８）のいずれかの方法。
（１０）前記乾燥濃縮工程の後に、前記物質固定化担体とアミノ基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、（６）〜（９）のいずれかの方法。
（１１）（４）又は（５）の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定する方法。
（１２）（１）〜（３）のいずれかの物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
（１３）（４）又は（５）の物質固定化担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
（１４）サンドイッチ方式の免疫アッセイに用いるための、（１３）のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、（４）又は（５）の物質固定化担体と、
被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
（１５）直接競合方式の免疫アッセイに用いるための、（１３）のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、（４）又は（５）の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質と
を少なくとも含むキット。
（１６）間接競合方式の免疫アッセイに用いるための、（１３）のキットであって、
被固定化物質が標的物質である、（４）又は（５）の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
（１７）免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
ポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含み、
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
物質固定化用担体。
（１８）（１７）の物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の物質固定化用担体を用いて免疫アッセイを行うことにより高い検出感度を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を示す。
【図２】図２は、物質固定化用担体の製造方法に関する本発明の一実施形態を示す。
【図３】図３は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（間接法）の一実施形態を示す。
【図４】図４は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（間接法）の検量線を示す。
【図５】図５は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の一実施形態を示す。
【図６】図６は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−１】図７−１は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度０％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−２】図７−２は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度０．６％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−３】図７−３は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度１．２５％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−４】図７−４は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度２．５％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−５】図７−５は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度５％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−６】図７−６は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度１０％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図８】図８は、サンドイッチＥＬＩＳＡの反応系の一例を模式的に示す。
【図９】図９は、直接競合ＥＬＩＳＡの反応系の一例を模式的に示す。
【図１０】図１０は、間接競合ＥＬＩＳＡの反応系の一例を模式的に示す。
【図１１】図１１は、本発明の物質固定化用担体の製造方法の一例の概略を示す。
【図１２】図１２は、本発明の物質固定化担体の製造方法の一例の概略を示す。
【図１３】図１３は、本発明の物質固定化用担体の実施形態の一例を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（支持体）
本発明における支持体の材料及び形状は、免疫アッセイにおける固相の支持体として利用可能な材料及び形状であれば特に限定されない。支持体の材料としてはプラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄における問題が小さいことから免疫アッセイ用担体の支持体の材料として特に好ましい。すなわち本発明において好ましい支持体は、その全部又は少なくとも一部にプラスチックを含む。支持体の、後述する親水性ポリマー層が形成される側の表面がプラスチックを含むことが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。プラスチックの具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。予め支持体表面にプラズマ処理やコロナ処理などの親水化処理が施されていてもよい。支持体は、免疫アッセイにおける固相として利用可能な表面を有している支持体であればよく、全体の形状は特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
【００１４】
（親水性ポリマー層）
支持体の表面には、親水性ポリマー層が配置される。親水性ポリマー層はポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）を少なくとも含む。「ポリエチレングリコール鎖（又はＰＥＧ鎖）」とは次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。驚くべきことに、親水性ポリマー層におけるＰＥＧ鎖の数平均分子量が免疫アッセイの感度に影響を与える。十分に高感度の免疫アッセイを行うためにはＰＥＧ鎖の数平均分子量は１７６以上（ｍが４以上）であることが好ましく、より好ましくは３６２以上である。ＰＥＧ鎖の数平均分子量が上記の下限よりも小さい場合には実験例で確認されている通り十分な感度が達成できない場合がある。ＰＥＧ鎖の数平均分子量の上限は特に限定されないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増すため取扱いが難しいこと、及び、ＰＥＧ鎖の高密度での配置が難しいことから、ＰＥＧ鎖の数平均分子量は２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。
【００１５】
ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＰＥＧ又は担体から解離させたＰＥＧ：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＰＥＧ数平均分子量は蒸気圧浸透圧法または膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００１６】
固定化前の物質固定化用担体におけるＰＥＧ鎖の一端には、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていることが好ましい。このような官能基としては、被固定化物質と共有結合を形成することが可能な、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＰＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＰＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質への反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
【００１７】
ＰＥＧ鎖の結合密度も免疫アッセイの検出感度に影響する。ＰＥＧ鎖の結合密度はＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いてある程度推定することができる。エチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）は（ＸＰＳ）においてＣ（１ｓ）シグナルのＣ−Ｏ成分を与え、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基等の窒素原子含有官能基はＸＰＳにおいてＮ（１ｓ）シグナルを与える。元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−ＯはＰＥＧ鎖の結合密度と明確な相関がある。免疫アッセイでの高い検出感度を実現するためには、官能基がｎ個の窒素原子を含有する場合、元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏが０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下であることが好ましい。「０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下」とは、例えば、ｎ＝１の場合は「０．０１０以上、０．０５０以下」を意味し、ｎ＝２の場合は「０．０１０以上、０．１００以下」を意味し、ｎ＝３の場合は「０．０１０以上、０．１５０以下」を意味し、ｎ＝４の場合は「０．０１０以上、０．２００以下」を意味する。本発明におけるＸＰＳは、アルバック・ファイ社製のＸ線分光分析装置「ＥＳＣＡ５６００」を用い、光電子取り込み角度を４５°に設定して測定される。ｎ個の窒素原子を含有する官能基としては、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基（ｎ＝２）及びスクシンイミジルオキシカルボニル基（ｎ＝１）以外にイソシアネート基（ｎ＝１）、アジドカルボニル基（ｎ＝３）、カルボジイミド基（ｎ＝２）、マレイミジル基（ｎ＝１）、アジリジン−２−イル基（ｎ＝１）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基（ｎ＝３）、１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基（ｎ＝４）が挙げられる。これらの官能基についても、ＸＰＳにより求められる、親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたときの窒素濃度（Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏ）が上記と同様の数値範囲であることが好ましい。
【００１８】
親水性ポリマー層には官能基が付加されていないＰＥＧ鎖や、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００１９】
（親水性ポリマー層の形成方法）
支持体の、免疫アッセイにおける固相として利用される位置の表面に親水性ポリマー層が形成される。親水性ポリマー層は、支持体表面に化学的又は物理的に固定された官能基との共有結合により支持体に固定化されることができる。
【００２０】
本発明の物質固定化用担体は、図１１に概略を示すとおり、プライマー層又はカップリング剤を用いて支持体の表面に官能基を導入する工程Ｓ１１０１と、前記官能基にＰＥＧ鎖を連結させる工程Ｓ１１０２と、ＰＥＧ鎖末端へ官能基を連結する工程Ｓ１１０３とを含む方法により製造することができる。
【００２１】
（プライマー層による官能基の導入）
支持体が表面にプラスチックを含む支持体である場合、該表面にはプライマー層が形成され、該プライマー層の表面に親水性ポリマー層が形成されていることが好ましい。このとき、プライマー層のポリシロキサンの側鎖上の官能基が、ＰＥＧ鎖末端と共有結合を形成される。この場合の、本発明の物質固定化用担体の実施形態の概要を図１３を参照して説明する。
【００２２】
物質固定化用担体１０は、表面Ｓにプラスチックを含む支持体１１と、表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層１２と、プライマー層１２上に配置された、ＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層１３とを備える。
【００２３】
親水性ポリマー層１３のＰＥＧ鎖−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−はプライマー層１２を構成するポリシロキサンの側鎖Ａと共有結合を介して連結されている。ここで側鎖Ａは、後述する式１のシラノール化合物が有する、Ｒ１に由来する基であり、Ｒ１上の官能基又は該官能基から誘導された官能基がＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基と共有結合を形成して形成された二価の基を指す。ケイ素原子に結合する基Ｘは式１のシラノール化合物のＲ１（ｐ＝２の場合）、Ｒ２（ｐ＋ｑ＝３の場合）、又はヒドロキシル基（ｑ＝３の場合）に由来する基である。プライマー層１２中のポリシロキサンは直鎖状であってもよいし、分岐鎖状又は網目状の構造を有していてもよいが、好ましくは分岐鎖状又は網目状の構造を有する。ポリシロキサンが分岐鎖状又は網目状の構造を有するとき、Ｘは、他の繰り返し単位（図示していない）のケイ素原子と結合する架橋基である。架橋基としてのＸとしては、式１のシラノール化合物のヒドロキシル基に由来するエーテル基（−Ｏ−）が挙げられる。ポリシロキサンが直鎖状の構造を有するとき、Ｘは、式１に定義するＲ１又はＲ２、未反応のヒドロキシル基、加水分解されずに残存した式２に定義する基Ｙ等の一価の基である。ＰＥＧ鎖の両端のうち、ポリシロキサンと連結されていない側の端部には、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基Ｒ３が、直接的に、或いは必要に応じてリンカーを介して間接的に連結されていることが好ましい。図１３においてＱは結合、又はリンカーを示す。
【００２４】
図１３に示す本実施形態において、支持体１１は、少なくとも表面Ｓにプラスチックを含む。ポリシロキサンを含むプライマー層１２は支持体１１の表面Ｓに物理吸着により結合することができる。物理吸着はファンデルワールス力または疎水性相互作用により生じると考えられる。プライマー層１２と支持体１１の表面Ｓとの間には共有結合等の化学結合が形成される必要はないため、表面Ｓがポリスチレン等の、反応性官能基を含まないプラスチックからなる場合であっても、プライマー層１２を結合させることができる。
【００２５】
プライマー層１２中におけるポリシロキサンの状態は必ずしも明らかではないが、図２に示すように複数のポリシロキサン分子の主鎖部分同士が会合し、側鎖である有機基が支持体表面及び親水性層の側に面した二層構造を形成している可能性がある。このような二重構造が形成される機構は以下のように推定される。まず、シラノールのポリマー化によってファンデルワールス力が増大したポリシロキサンがプラスチック表面に物理吸着する。このとき、プラスチック表面とシラノール化合物の有機基との間に働く疎水性相互作用によりシラノール化合物の有機基はプラスチック側に配向する。ポリシロキサンの一層目が形成された後、溶媒側に配向したシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に別のポリシロキサンが結合する。このとき、シラノール基同士の水素結合によりシラノール化合物の有機基は溶媒側に配向する。その結果、ポリシロキサンは図２に示すような二層構造となると考えられる。溶媒側に配向した有機基は親水性層との共有結合を形成することができる。
【００２６】
プライマー層は、少なくともポリシロキサンを含む層により形成することができる。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、シラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。シラノール化合物の縮合はシラノール化合物の分子間で起こる反応である。支持体表面のプラスチック分子が反応性の官能基を有してない場合には、シラノール化合物と支持体表面のプラスチック分子との間では反応は起こらない。すなわち、シラノール化合物及び形成されたポリシロキサンは支持体表面のプラスチック分子とは化学的に反応せずに、単に物理的に吸着しているだけである。この点は、ガラスを支持体とする場合とは大きく異なる。このようなシラノール化合物のプラスチック表面への物理吸着力は、モノマーでは極めて弱いが、ある程度縮合が進み、ポリマー（ポリシロキサン）となれば強くなる。シラノール化合物を適度に縮合することによって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。
【００２７】
（シラノール化合物）
本発明で用いられるシラノール化合物は、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に加えて、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有する。この有機基はポリシロキサンの側鎖となる。シラノール化合物は典型的には式１で表される構造を有する：
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（ＯＨ）ｑ ・・・・（式１）
（ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。ｐ＝１かつｑ＝２又は３であることが好ましく、ｐ＝１かつｑ＝３であることがより好ましい。ｐ＋ｑ＝４である場合、Ｒ２は存在しない。
【００２８】
Ｒ１は、好ましくは、水素原子が１つ以上（好ましくは１つ）の官能基により、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換されている、炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜６の炭化水素基である（ただし、前記炭化水素基の全部又は一部がビニル基である場合のように、前記炭化水素基自体が官能基である場合は官能基により置換されている必要はない）。前記炭化水素基は、直鎖又は分岐鎖或いは環構造を有する、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基（アルキル基、炭素数２以上のアルケニル基、又は炭素数２以上のアルキニル基）であってもよいし、単環又は多環の炭素数６以上の芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記脂肪族炭化水素基によって置換された前記芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記芳香族炭化水素基によって置換され前記脂肪族炭化水素基であってもよい。前記炭化水素基では、炭素−炭素結合が、１又は２個の、酸素、窒素及び硫黄から選択される同一又は異なる原子により中断されていてもよい。炭化水素基の例としては好ましくはプロピル基、エチル基が挙げられる。
【００２９】
Ｒ１における、前記炭化水素基の１つ以上の水素を、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換する官能基としては、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基、又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換可能な官能基であれば特に限定されないが、典型的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでも、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。グリシジル基又はエポキシ基は、それ自体がＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成可能であるが、特開２００９−１５６８６４号公報に記載されている方法に従って、グリシジル基又はエポキシ基をアルデヒド基に変換し、形成されたアルデヒド基と、ＰＥＧが有するヒドロキシル基とを反応させてもよい。これらの官能基は、前記炭化水素基の水素原子を直接置換してもよいし、適切なリンカー構造を介して置換してもよい。リンカー構造としては、例えば炭素の数が０〜３個、窒素、酸素及び硫黄から選択される同一又は異なるヘテロ原子の数が０〜３個である二価の基が挙げられ、例えば、炭化水素基が左側に、官能基が右側にそれぞれ結合するとしたとき、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−、−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−（Ｎ＝Ｃ＝Ｎ）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｏ−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−（Ｏ＝Ｓ＝Ｏ）−で表される構造が挙げられる。
【００３０】
Ｒ１の特に好ましい態様としては３−グリシドキシプロピル基、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル)エチル基が挙げられる。
【００３１】
Ｒ２は、好ましくは、置換基により置換されていないという点を除いてＲ１について上述したものと同様の（ただしＲ１とは独立して選択される）炭化水素基であり、なかでも、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。
【００３２】
（加水分解によりシラノール化合物を生成するケイ素化合物）
前記シラノール化合物は、加水分解によりシラノール基(Si-OH)を生成可能な基を有するケイ素化合物を、加水分解することにより生成することができる。このようなケイ素化合物は式２で表される構造を有する：
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（Ｙ）ｑ ・・・・（式２）
（Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐ、ｑ、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれシラノール化合物に関して定義したとおりである）。
【００３３】
Ｙとしては、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアルコキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基等が好ましい。Ｙとしては特に、炭素数１〜６のアルコキシ基（特にメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）、炭素数１〜６の、アルコキシ基により置換されたアルコキシ基（例えばメトキシエトキシ基）、炭素数１〜６のアルキルカルボニルオキシ基（例えばアセトキシ基）、塩素原子が好ましい。
【００３４】
式２のケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。
【００３５】
（プライマー層の形成方法）
ポリシロキサンを含むプライマー層は、支持体の表面上において式１のシラノール化合物を重合させる工程（プライマー層形成工程）を含む方法により形成可能である。該工程は、好ましくは、式２のケイ素化合物を以下のように加水分解し、式１のシラノール化合物を生成する工程と、生成したシラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を前記支持体の表面上に接触させる工程とを含む。加水分解の条件は特に限定されないが、例えば次の方法が可能である。まず、式２のケイ素化合物に希塩酸を添加し、基Ｙを加水分解する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は２〜４とする。この操作によって基Ｙはシラノール基へ変換され、式１のシラノール化合物が生成する。
【００３６】
次いでシラノール化合物を支持体表面に適用し、縮合重合によりポリシロキサンを形成する。式１のシラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解する。シラノール化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができるが、これらに限定されない。塩基の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。アルコールはエタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。このシラノール化合物溶液を支持体のプラスチック表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）が好ましい。以上の操作によって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が物理吸着によって形成される。プライマー層の被覆密度は、シラノールや塩基の濃度、あるいはシラノール溶液をプラスチック表面に接触させる時間によって制御可能である。プライマー層の被覆密度が高ければ高いほど、次の工程で共有結合させるＰＥＧ鎖の結合密度も高くなる。
【００３７】
形成されたポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を誘導体化して他の官能基に変換する場合には、プライマー層形成後に引き続き、ポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換する誘導体化工程を行う。
【００３８】
（シランカップリング剤による官能基の導入）
支持体が表面にガラス、石英またはシリコンを含む支持体である場合、該表面に、シランカップリング剤の加水分解により生成される、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有するシラノール化合物を結合させることにより、或いは、更に、必要に応じて該官能基をＰＥＧと共有結合を形成することができる他の官能基に変換する誘導体化により、支持体表面にＰＥＧと共有結合を形成することができる官能基を導入することができる。該官能基とＰＥＧの一端との反応によりシランカップリング剤と親水性ポリマー層のＰＥＧ鎖とを共有結合により連結することができる。
【００３９】
シラノール化合物としては、プライマー層に関して上述した式１のシラノール化合物と同様のものを使用することができる。
【００４０】
シランカップリング剤としては、プライマー層に関して上述した式２のケイ素化合物と同様のものを使用することができる。
【００４１】
この実施形態では、支持体表面に導入された、シラノール化合物又はシランカップリング剤に由来する有機基上の官能基又は該官能基から誘導された他の官能基がＰＥＧ末端のヒドロキシル基と共有結合を形成するために用いられる。
【００４２】
（親水性ポリマー層の形成）
プライマー層、シランカップリング剤等により官能基が導入された支持体表面に、ＰＥＧを反応させてＰＥＧ鎖を形成する（Ｓ１１０２）。このとき触媒量の濃硫酸を含むＰＥＧを接触させる。ここで、数平均分子量が１０００を超えるＰＥＧはあらかじめ加熱融解しておく。必要に応じて、ＰＥＧをｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどで希釈して用いてもよい。このＰＥＧ溶液をプラスチック表面に接触させ、加熱する。加熱温度は６０〜１００℃の範囲で設定できるが、プラスチックの耐熱性を加味すると８０℃前後（７５℃〜８５℃）が好ましい。加熱時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定できるが、加熱温度が８０℃前後の場合は１０〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、プライマー層にＰＥＧ鎖が共有結合する。このとき、ＰＥＧ鎖の結合密度はプライマー層の被覆密度に依存する。
【００４３】
最後に、ＰＥＧ鎖の一端に、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる（Ｓ１１０３）。官能基の導入方法は特に限定されない。(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として導入する方法の好ましい実施形態は次の通りである。一端がプライマー層、シランカップリング剤等を介して支持体表面に固定されたＰＥＧ鎖の他端に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）または炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。
【００４４】
【化１】
【００４５】
上記の反応は、水分をほとんど含まない有機溶媒中で実施される必要がある。一般にプラスチックは有機溶剤に対する耐性が低いため、支持体がプラスチックを含む場合には、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１重量％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。支持体がプラスチックを含む場合には、プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定することが好ましく、ＣＤＩ濃度が０．５Ｍ前後（０．４〜０．６Ｍ）のときは１０分間〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、官能基が共有結合されたＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層が形成される。
【００４６】
（被固定化物質）
本発明の物質固定化用担体には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。「標的物質と結合する抗原又は抗体」が被固定化物質である実施形態（後述するサンドイッチ法又は直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（後述する間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００４７】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（DNA、RNA）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００４８】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００４９】
被固定化物質は、ＰＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＰＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００５０】
（被固定化物質の固定化）
被固定化物質の固定化は例えば、図１２に概略を示すように、本発明の物質固定化用担体と、被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる工程Ｓ１２０１と、該溶液を乾燥濃縮して被固定化物質を物質固定化用担体のＰＥＧ鎖末端に共有結合させる工程Ｓ１２０２とを少なくとも含み、必要に応じてさらに、未反応のＰＥＧ鎖末端の官能基と、アミノ基含有低分子化合物とを接触させ、ＰＥＧ鎖末端の官能基を不活性化する工程Ｓ１２０３とを含む方法により行うことができる。
【００５１】
まず、被固定化物質を緩衝液に溶解する。ここで、アミノ基成分を含まない緩衝液を用いることが好ましい。例えば、リン酸緩衝液や炭酸−重炭酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液のｐＨは７．０〜１０．０の範囲で調整することが望ましい。被固定化物質の終濃度は０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で調整するとよい。この被固定化物質溶解液を担体と接触させ（Ｓ１２０１）、そのまま乾燥濃縮させる（Ｓ１２０２）。乾燥濃縮によって、被固定化物質の反応系中での濃度が高まるため被固定化物質の固定化が著しく促進される。被固定化物質が少量しか準備できない場合は溶液中の被固定化物質の濃度を高めることは困難であるが、このような場合でも、比較的低濃度の被固定化物質溶解液を物質固定化用担体に接触させ、次いで乾燥濃縮することにより、被固定化物質の反応系中での濃度を高めることができ、固定化反応を促進することができる。被固定化物質が抗原、抗体等のタンパク質である場合は、乾燥によってタンパク質が変性することがある。乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐためには、被固定化物質溶解液にトレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類を添加することが好ましい。糖類のなかでもトレハロースは、適度な保湿性を有していること、溶液の乾燥濃縮が容易であること、並びに、乾燥濃縮時に粗大な結晶が形成されにくく均質な乾燥濃縮が可能であることから好ましい。糖類の終濃度は１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で調整すると良い。被固定化物質溶解液を担体の広範囲に渡って接触させたい場合は、被固定化物質溶解液にＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０などの非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。非イオン性界面活性剤の使用により、被固定化物質溶解液が担体表面に薄く濡れ広がるため、被固定化物質の使用量を節約できるだけでなく、乾燥濃縮に要する時間を短縮することができる。被固定化物質溶解液中の非イオン性界面活性剤の終濃度は０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲で調整するとよい。
【００５２】
乾燥濃縮が進行すると、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＰＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合、ウレタン結合等の共有結合が形成される。ここで、反応温度は４〜３７℃、接触時間は５分〜２４時間の範囲で設定するとよい。その結果、被固定化物質はＰＥＧ鎖を介して担体に固定化される。
【００５３】
所望の被固定化物質をＰＥＧ鎖に結合させた後は、ＰＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい（Ｓ１２０３）。これによって、免疫アッセイに関与する物質が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。この操作は、当該官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。この低分子化合物をＰＢＳなどの緩衝液に１０〜１０００ｍＭとなるように溶解し、既に所望の物質を固定化した担体と接触させる。反応温度は４〜３７℃、反応時間は２分〜２４時間の範囲で設定するとよい。
【００５４】
（免疫アッセイ）
本発明はまた、本発明の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む免疫アッセイに関する。本発明において「標的物質を測定する」とは、測定対象試料中の標的物質の存在の有無、及び／又は、測定対象試料中の標的物質の量を測定することを指す。免疫アッセイは、具体的には、本発明の物質固定化担体と、測定対象試料とを、該担体上の被固定化物質に、該測定対象試料中の標的物質の量に相関した量の抗原又は抗体（ここで該抗原又は抗体とは、測定対象試料中の標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能抗原又は検出可能抗体等を指す）が抗原抗体反応により結合する条件において接触させる工程と、前記工程において被固定化物質に結合した抗原又は抗体を検出する工程とを含む。
【００５５】
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイは公知の方法で実施することができ、サンドイッチ方式、直接競合方式、間接競合方式等の任意の態様とすることができる。
【００５６】
サンドイッチ方式の免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、該被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。図８では、抗原である標的物質１０３と特異的に結合する抗体１０２が固定化された物質固定化担体１０１と、標識物質（酵素など）により標識された、直接的に検出可能な標識抗体１０４とを用いて測定対象試料中の標的物質１０３を測定するサンドイッチ方式の免疫アッセイの一例を模式的に示す。
【００５７】
サンドイッチ方式の免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質との抗原抗体反応を行う、一次反応工程（図８（ｂ））と、
一次反応工程の後に、前記物質固定化担体と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体とを接触させ、被固定化物質に結合した標的物質と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体との抗原抗体反応を行う、二次反応工程（図８（ｃ））と、
二次反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程（図８（ｄ））と
を少なくとも含む。
【００５８】
一次反応工程及び二次反応工程では、抗原抗体反応後に、担体に固定化されていない成分を洗浄除去する洗浄工程を適宜含む。
【００５９】
二次反応工程に用いられる「検出可能抗原又は検出可能抗体」は、被固定化物質と競合しない位置において標的物質と結合する。検出可能抗原又は検出可能抗体は、検出可能な標識物質と連結された標識抗原又は標識抗体（直接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよいし、検出可能な標識物質と、更なる反応によって連結されて標識されうる抗原又は抗体（間接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよい。後者の例としては、検出可能な標識物質と連結された二次抗体と結合可能な抗原又は抗体や、ビオチン−アビジン（又はビオチン−ストレプトアビジン）結合対の一方と連結された標識物質と結合可能な、前記結合対の他方と連結された抗原又は抗体等が挙げられる。
【００６０】
直接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質とが少なくとも用いられる。図９では、抗原である標的物質１１３と特異的に結合する抗体１１２が固定化された物質固定化担体１１１と、測定対象試料中の標的物質１１３と競合的に抗体１１２と結合する、標識物質（酵素など）により標識された、直接的に検出可能な標的物質１１４（標識抗原）とを用いて測定対象試料中の標的物質１１３を測定する直接競合方式による免疫アッセイの一例を模式的に示す。
【００６１】
直接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能標的物質と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応と、検出可能標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、直接競合反応工程（図９（ｂ），（ｃ））と、
直接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した検出可能標的物質を検出する、検出工程（図９（ｅ））と
を少なくとも含む。
【００６２】
直接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能標的物質とを洗浄除去する工程（図９（ｄ））が適宜含まれる。
【００６３】
直接競合方式による免疫アッセイにおいて、標的物質は抗原又は抗体であり、検出可能標的物質は対応する検出可能抗原又は検出可能抗体である。検出可能標的物質としては、測定対象試料中の標的物質とは独立して検出することができるものである限り、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体において、抗原又は抗体として標的物質が用いられたものが使用可能である。
【００６４】
間接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。図１０では、抗原である標的物質１２３と同一の被固定化物質１２２が固定化された物質固定化担体１２１と、測定対象試料中の標的物質１２３と被固定化物質１２２とが競合的に結合する、標識された二次抗体１２５を介して間接的に検出可能な一次抗体１２４とを用いて測定対象試料中の標的物質１２３を測定する間接競合方式による免疫アッセイの一例を模式的に示す。
【００６５】
間接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能抗原又は検出可能抗体と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応と、前記被固定化物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、間接競合反応工程（図１０（ｂ），（ｃ））と、
間接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程（図１０（ｅ），（ｆ））と
を少なくとも含む。
【００６６】
間接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能抗原又は検出可能抗体とを洗浄除去する工程（図１０（ｄ））が適宜含まれる。
【００６７】
検出可能抗原又は検出可能抗体としては、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体と同様のものが使用できる。
【００６８】
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイにおいて抗原又は抗体を検出する手段は特に限定されず、任意の標識物質により直接的又は間接的に標識された抗原又は抗体を用いることができる。標識物質としては、酵素（ＥＬＩＳＡ法）、核酸（イムノPCR）、電気化学発光物質（電気化学発光法）、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等の、増幅された検出シグナルを生成することができる標識物質が挙げられる。本発明の免疫アッセイは、安全性及び簡便性を考慮すると、標識物質として酵素を用いる、酵素活性に基づいて検出を行う酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。標識物質として用いることができる酵素は特に限定されないが、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼが挙げられる。酵素活性による検出の方法としては、酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等を用いた検出方法が挙げられ、なかでも化学発光基質を用いた検出方法が好ましい。発色基質を用いると酵素反応にかなりの時間がかかる。これは、本発明において定量しようとする標的物質の濃度領域が従来の１〜２桁も低いためである。化学発光基質を用いた検出は、一般に、発色基質を用いた検出よりも感度が高いため、酵素反応に要する時間を短縮することができる。特に、フェムトグラムのレベルの微量な標的物質の検出に使用される高感度な化学発光基質を用いれば、感度の点で相乗効果を得ることができる。このような化学発光基質としてはＥＣＬＴＭＡｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア）、ＥＣＬＴＭＰｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）、イムノスター（登録商標）ＬＤ（和光純薬）、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＣＳＰＤ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が挙げられ、そのための酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。化学発光を検出するための検出器としては、発光プレートリーダーやＣＣＤイメージャーを用いることができる。これらの検出器はダイナミックレンジが広いという点でも都合がよい。すなわち、本発明の物質固定化担体と化学発光基質とを組み合わせれば、迅速かつ高感度でダイナミックレンジの広いＥＬＩＳＡを達成できる。
【００６９】
（免疫アッセイ用キット）
本発明の物質固定化用担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分としては、免疫アッセイの種類に応じて、被固定化物質に抗原抗体反応により結合した標的物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体や、被固定化物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体（直接的又は間接的に検出可能な標的物質を含む）が例示できる。更に、免疫アッセイに必要な成分としては、間接的な検出に用いるための、前記間接的に検出可能な抗原又は抗体と結合可能な標識物質や、検出用試薬（例えば標識物質が酵素である場合には酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等）が挙げられる。「直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体」及び「直接的又は間接的に検出可能な標的物質」は上記「免疫アッセイ」の欄にて説明したのと同様のものが使用できる。該キットは更に、被固定化物質を物質固定化用担体に固定化するために用いられる試薬（例えば糖類や非イオン性界面活性剤が溶解された、被固定化物質を溶解するための緩衝液）を含んでもよい。
【００７０】
本発明の物質固定化担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分の具体例は上記の通りである。
【００７１】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００７２】
［実施例１］
図１は物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を表す。ポリスチレンからなる支持体表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成されている。プライマー層にはＰＥＧ鎖の片末端が共有結合している。ＰＥＧ鎖の別の片末端には（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が存在する。親水性ポリマー層は、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１７６〜２５０００であるという条件、ＸＰＳにおける元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏが０．０１０〜０．１００の範囲にあるという条件、のうち少なくとも１つの条件を満足する。
【００７３】
［実施例２］
図２に示した方法で物質固定化用担体を製造した。具体的な手順を以下に記す。
１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに４ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で７５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ４０００（数平均分子量２７００〜３４００、関東化学）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま９０℃で３０分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＰＥＧを含む親水性ポリマー層が形成された。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに１０μｌずつ分注した。そのまま室温で２０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって親水性ポリマー層に含まれるＰＥＧの末端に（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が導入されたＰＥＧ誘導体が形成された。
【００７４】
［実施例３］
実施例２の物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を用いて図３に示すＥＬＩＳＡ（間接法、抗原-抗体-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００７５】
以下、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００（和光純薬）を含む炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファー、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００および０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄バッファー、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを希釈バッファーとする。まず、リゾチーム（和光純薬）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５０μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。この溶液を実施例２の９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μｌずつ分注した。３７℃で１０分間放置して乾燥濃縮させた後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いて０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識２次抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４０００倍希釈し（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。各ウェルに化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出し、図４（本発明）のような検量線を作成した。感度は０．０３ｎｇ／ｍｌであった。
【００７６】
（比較例１）
未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）および従来品の９６穴マイクロプレート（酸素プラズマ処理によって親水化されたポリスチレン製９６穴マイクロプレート）を用いて図３に示すＥＬＩＳＡ（間接法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００７７】
以下、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳを洗浄バッファー、１％ＢＳＡを含むＰＢＳをブロッキングバッファーおよび希釈バッファーとする。まず、リゾチーム（和光純薬）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。この溶液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で２時間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーを各ウェルに２００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。希釈バッファーを用いて０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を調製し、各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識２次抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４０００倍希釈し（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。各ウェルに化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出し、図４（未処理、従来品）のような検量線を作成した。未処理品と従来品の感度はいずれも３．９ｎｇ／ｍｌであった。
【００７８】
［実施例４］
実施例２で得られた９６穴マイクロプレートを用いて図５に示すＥＬＩＳＡ（抗体-抗原-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００７９】
５％トレハロース（和光純薬）及び０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００（和光純薬）を含む炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファーとする。抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。この溶液を実施例２で得られた９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μｌずつ分注した。３７℃で２時間放置して乾燥濃縮させた後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いて０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてビオチン標識２次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を５００倍希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を４０００倍希釈し（終濃度０．２５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出、図６（本発明）のような検量線を作成した。感度は０．１５ｐｇ／ｍｌであった。
【００８０】
（比較例２）
未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）および従来品の９６穴マイクロプレート（酸素プラズマ処理によって親水化されたポリスチレン製９６穴マイクロプレート）を用いて図５に示すＥＬＩＳＡ（抗体-抗原-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００８１】
比較例１と同様の各種バッファーを用いた。抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。この溶液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で２時間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーを各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。希釈バッファーを用いて０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてビオチン標識２次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を５００倍希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を４０００倍希釈し（終濃度０．２５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出、図６（未処理、従来品）のような検量線を作成した。未処理品と従来品の感度はそれぞれ９．８ｐｇ／ｍｌと２．４ｐｇ／ｍｌであった。
【００８２】
【表１】
【００８３】
［実施例５］
シラノール処理時間およびＰＥＧ鎖の数平均分子量がＥＬＩＳＡ（間接法）の感度に及ぼす影響を調べた。具体的な手順を以下に記す。
【００８４】
１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で６０〜１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ（１３種）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま８０℃で４５分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＰＥＧを含む親水性ポリマー層が形成された。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに２０μｌずつ分注した。そのまま室温で３０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって親水性ポリマー層に含まれるＰＥＧの末端に（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が導入されたＰＥＧ誘導体が形成された。以上の操作により、ＰＥＧ鎖の結合密度やＰＥＧ鎖の数平均分子量の異なる物質固定化用担体が得られた。これらの物質固定化用担体を用いて実施例３に記載の方法でＥＬＩＳＡの感度を測定した。その結果、表２に示すようにＰＥＧ鎖の数平均分子量が１７６以上で従来よりも顕著に高い感度が得られることがわかった。また、ＰＥＧ鎖の分子量が大きい場合は比較的低密度であっても高い感度が実現できることがわかった。
【００８５】
【表２】
【００８６】
表２に示す各原料の数平均分子量は以下の通りである。
【００８７】
【表３】
【００８８】
［実施例６］
実施例５で得られた物質固定化用担体のＸＰＳ分析を行った。ＸＰＳ分析は、アルバック・ファイ社製のＸ線分光分析装置「ＥＳＣＡ５６００」を用い、光電子取り込み角度を４５°に設定して行った。その結果、表２に示すようにＥＬＩＳＡの感度とＮ（１ｓ）／Ｃ−Ｏとの間に明確な相関が認められた。すなわち、Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏの値が０．０１０〜０．１００の範囲にあるときに従来よりも顕著に高い感度が得られることがわかった。
【００８９】
［実施例７］
前述のように、乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐ目的で、緩衝液にトレハロースを添加することが重要である。実施例４において、トレハロース濃度の異なる緩衝液を６種類用意し、ＥＬＩＳＡにおけるトレハロース濃度依存性を検討した。その結果、図７−１〜７−６に示すように、５〜１０％（ｗ／ｖ）のトレハロースで固相化時間（被固定化物質溶解溶液の接触から乾燥濃縮工程完了までの時間）に伴うシグナルの低下を防ぐことができることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アッセイに用いるための固相担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法の一種である酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）は、創薬、診断、環境計測、食品を含む幅広い分野で利用されている。典型的なＥＬＩＳＡは、（１）抗体または抗原の固定化（固相化）、（２）標的物質の結合、（３）酵素標識抗体の結合、（４）酵素反応、（５）光学的検出（吸収、蛍光、発光）、の５つの工程からなる。標識用酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどが用いられる。ＥＬＩＳＡは数ある免疫測定法のなかでも特に感度が高い。しかし、実際には固相担体への生体分子の非特異吸着が原因で期待する感度が得られないことも多い。特に酵素標識抗体のような複合体は固相担体に吸着しやすく、これがＥＬＩＳＡにおけるノイズの主な原因となっている。このような非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキング処理が試みられるが、その効果は限定的と言わざるを得ない。そこで、生体分子の非特異吸着を効果的に防ぐポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）に注目が集まっている。すなわち、抗体または抗原の固定化を、ＰＥＧリンカーを介して行うことによって、固相担体への生体分子の非特異吸着を防ぐ試みがなされている。
【０００３】
特許文献１には、ＰＥＧリンカーを介して抗体を金表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、金表面に非イオン性官能基を導入し、ここにヘテロ二官能性ＰＥＧの片末端を共有結合させ、別の末端に抗体を結合させる、というものである。この方法によって表面プラズモン共鳴法におけるノイズが有意に低減されることが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、ＰＥＧリンカーを介して核酸やタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧリンカーを有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧリンカーの末端に核酸やタンパク質を結合させる、というものである。この方法によってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ＰＥＧリンカーを介して核酸をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、シランカップリング剤をガラス表面に適用してアミノ基を導入し、ここにホモ二官能性ＰＥＧの片末端を共有結合させ、別の末端に核酸を結合させる、というものである。この方法によってバイオセンサの感度が改善されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１６４３４８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３７１５号公報
【特許文献３】特開２００６−５０９２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、ＰＥＧリンカーを介して生体分子を固定化する方法は知られているが、ＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイにおいて高い感度が発揮される、ＰＥＧリンカーを介して固定化を行う物質固定化用担体は開示されていない。
【０００８】
また、標的物質と特異的に結合する抗体、抗原等の被固定化物質を固相担体に固定化する免疫アッセイにおいて、ＰＥＧリンカーを有する物質固定化用担体に、生体関連物質である被固定化物質をその活性を維持したまま高密度に固定化することは困難であった。
【０００９】
本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、ＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイにおいて高い検出感度を実現する、ＰＥＧリンカーを有する物質固定化用担体、該担体への被固定化物質の固定化方法、並びに、該担体を使用した免疫アッセイ法及びそのためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、表面に特定の条件を満足するＰＥＧリンカーを含む親水性ポリマー層を備える支持体を物質固定化用担体として用いて免疫アッセイを行った場合に高い検出感度を実現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
（２）前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
（１）の物質固定化用担体。
（３）前記窒素を含有する官能基が、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基又はスクシンイミジルオキシカルボニル基である、（２）の物質固定化用担体。
（４）免疫アッセイに用いるための物質固定化担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と、前記被固定化物質とが共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
（５）（１）〜（３）のいずれかの物質固定化用担体と、前記被固定化物質とから、前記官能基と前記被固定化物質とを反応させて共有結合を形成することにより製造されたものである、（４）の物質固定化担体。
（６）（４）又は（５）の物質固定化担体の製造方法であって、
（１）〜（３）のいずれかの物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、被固定化物質接触工程と、
前記物質固定化用担体に接触させた前記溶液を乾燥濃縮させる、乾燥濃縮工程と、
を含む方法。
（７）前記溶液が糖類を含む、（６）の方法。
（８）前記糖類がトレハロースである、（７）の方法。
（９）前記溶液が非イオン性界面活性剤を含む、（６）〜（８）のいずれかの方法。
（１０）前記乾燥濃縮工程の後に、前記物質固定化担体とアミノ基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、（６）〜（９）のいずれかの方法。
（１１）（４）又は（５）の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定する方法。
（１２）（１）〜（３）のいずれかの物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
（１３）（４）又は（５）の物質固定化担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
（１４）サンドイッチ方式の免疫アッセイに用いるための、（１３）のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、（４）又は（５）の物質固定化担体と、
被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
（１５）直接競合方式の免疫アッセイに用いるための、（１３）のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、（４）又は（５）の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質と
を少なくとも含むキット。
（１６）間接競合方式の免疫アッセイに用いるための、（１３）のキットであって、
被固定化物質が標的物質である、（４）又は（５）の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
（１７）免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
ポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含み、
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
物質固定化用担体。
（１８）（１７）の物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の物質固定化用担体を用いて免疫アッセイを行うことにより高い検出感度を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を示す。
【図２】図２は、物質固定化用担体の製造方法に関する本発明の一実施形態を示す。
【図３】図３は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（間接法）の一実施形態を示す。
【図４】図４は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（間接法）の検量線を示す。
【図５】図５は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の一実施形態を示す。
【図６】図６は、本発明の物質固定化担体を用いたＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−１】図７−１は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度０％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−２】図７−２は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度０．６％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−３】図７−３は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度１．２５％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−４】図７−４は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度２．５％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−５】図７−５は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度５％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図７−６】図７−６は、実施例７における被固定化物質溶解液のトレハロース濃度１０％（ｗ／ｖ）である場合のＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の検量線を示す。
【図８】図８は、サンドイッチＥＬＩＳＡの反応系の一例を模式的に示す。
【図９】図９は、直接競合ＥＬＩＳＡの反応系の一例を模式的に示す。
【図１０】図１０は、間接競合ＥＬＩＳＡの反応系の一例を模式的に示す。
【図１１】図１１は、本発明の物質固定化用担体の製造方法の一例の概略を示す。
【図１２】図１２は、本発明の物質固定化担体の製造方法の一例の概略を示す。
【図１３】図１３は、本発明の物質固定化用担体の実施形態の一例を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（支持体）
本発明における支持体の材料及び形状は、免疫アッセイにおける固相の支持体として利用可能な材料及び形状であれば特に限定されない。支持体の材料としてはプラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄における問題が小さいことから免疫アッセイ用担体の支持体の材料として特に好ましい。すなわち本発明において好ましい支持体は、その全部又は少なくとも一部にプラスチックを含む。支持体の、後述する親水性ポリマー層が形成される側の表面がプラスチックを含むことが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。プラスチックの具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。予め支持体表面にプラズマ処理やコロナ処理などの親水化処理が施されていてもよい。支持体は、免疫アッセイにおける固相として利用可能な表面を有している支持体であればよく、全体の形状は特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
【００１４】
（親水性ポリマー層）
支持体の表面には、親水性ポリマー層が配置される。親水性ポリマー層はポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）を少なくとも含む。「ポリエチレングリコール鎖（又はＰＥＧ鎖）」とは次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。驚くべきことに、親水性ポリマー層におけるＰＥＧ鎖の数平均分子量が免疫アッセイの感度に影響を与える。十分に高感度の免疫アッセイを行うためにはＰＥＧ鎖の数平均分子量は１７６以上（ｍが４以上）であることが好ましく、より好ましくは３６２以上である。ＰＥＧ鎖の数平均分子量が上記の下限よりも小さい場合には実験例で確認されている通り十分な感度が達成できない場合がある。ＰＥＧ鎖の数平均分子量の上限は特に限定されないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増すため取扱いが難しいこと、及び、ＰＥＧ鎖の高密度での配置が難しいことから、ＰＥＧ鎖の数平均分子量は２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。
【００１５】
ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＰＥＧ又は担体から解離させたＰＥＧ：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＰＥＧ数平均分子量は蒸気圧浸透圧法または膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００１６】
固定化前の物質固定化用担体におけるＰＥＧ鎖の一端には、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていることが好ましい。このような官能基としては、被固定化物質と共有結合を形成することが可能な、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＰＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＰＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質への反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
【００１７】
ＰＥＧ鎖の結合密度も免疫アッセイの検出感度に影響する。ＰＥＧ鎖の結合密度はＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いてある程度推定することができる。エチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）は（ＸＰＳ）においてＣ（１ｓ）シグナルのＣ−Ｏ成分を与え、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基等の窒素原子含有官能基はＸＰＳにおいてＮ（１ｓ）シグナルを与える。元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−ＯはＰＥＧ鎖の結合密度と明確な相関がある。免疫アッセイでの高い検出感度を実現するためには、官能基がｎ個の窒素原子を含有する場合、元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏが０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下であることが好ましい。「０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下」とは、例えば、ｎ＝１の場合は「０．０１０以上、０．０５０以下」を意味し、ｎ＝２の場合は「０．０１０以上、０．１００以下」を意味し、ｎ＝３の場合は「０．０１０以上、０．１５０以下」を意味し、ｎ＝４の場合は「０．０１０以上、０．２００以下」を意味する。本発明におけるＸＰＳは、アルバック・ファイ社製のＸ線分光分析装置「ＥＳＣＡ５６００」を用い、光電子取り込み角度を４５°に設定して測定される。ｎ個の窒素原子を含有する官能基としては、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基（ｎ＝２）及びスクシンイミジルオキシカルボニル基（ｎ＝１）以外にイソシアネート基（ｎ＝１）、アジドカルボニル基（ｎ＝３）、カルボジイミド基（ｎ＝２）、マレイミジル基（ｎ＝１）、アジリジン−２−イル基（ｎ＝１）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基（ｎ＝３）、１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基（ｎ＝４）が挙げられる。これらの官能基についても、ＸＰＳにより求められる、親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたときの窒素濃度（Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏ）が上記と同様の数値範囲であることが好ましい。
【００１８】
親水性ポリマー層には官能基が付加されていないＰＥＧ鎖や、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００１９】
（親水性ポリマー層の形成方法）
支持体の、免疫アッセイにおける固相として利用される位置の表面に親水性ポリマー層が形成される。親水性ポリマー層は、支持体表面に化学的又は物理的に固定された官能基との共有結合により支持体に固定化されることができる。
【００２０】
本発明の物質固定化用担体は、図１１に概略を示すとおり、プライマー層又はカップリング剤を用いて支持体の表面に官能基を導入する工程Ｓ１１０１と、前記官能基にＰＥＧ鎖を連結させる工程Ｓ１１０２と、ＰＥＧ鎖末端へ官能基を連結する工程Ｓ１１０３とを含む方法により製造することができる。
【００２１】
（プライマー層による官能基の導入）
支持体が表面にプラスチックを含む支持体である場合、該表面にはプライマー層が形成され、該プライマー層の表面に親水性ポリマー層が形成されていることが好ましい。このとき、プライマー層のポリシロキサンの側鎖上の官能基が、ＰＥＧ鎖末端と共有結合を形成される。この場合の、本発明の物質固定化用担体の実施形態の概要を図１３を参照して説明する。
【００２２】
物質固定化用担体１０は、表面Ｓにプラスチックを含む支持体１１と、表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層１２と、プライマー層１２上に配置された、ＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層１３とを備える。
【００２３】
親水性ポリマー層１３のＰＥＧ鎖−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−はプライマー層１２を構成するポリシロキサンの側鎖Ａと共有結合を介して連結されている。ここで側鎖Ａは、後述する式１のシラノール化合物が有する、Ｒ１に由来する基であり、Ｒ１上の官能基又は該官能基から誘導された官能基がＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基と共有結合を形成して形成された二価の基を指す。ケイ素原子に結合する基Ｘは式１のシラノール化合物のＲ１（ｐ＝２の場合）、Ｒ２（ｐ＋ｑ＝３の場合）、又はヒドロキシル基（ｑ＝３の場合）に由来する基である。プライマー層１２中のポリシロキサンは直鎖状であってもよいし、分岐鎖状又は網目状の構造を有していてもよいが、好ましくは分岐鎖状又は網目状の構造を有する。ポリシロキサンが分岐鎖状又は網目状の構造を有するとき、Ｘは、他の繰り返し単位（図示していない）のケイ素原子と結合する架橋基である。架橋基としてのＸとしては、式１のシラノール化合物のヒドロキシル基に由来するエーテル基（−Ｏ−）が挙げられる。ポリシロキサンが直鎖状の構造を有するとき、Ｘは、式１に定義するＲ１又はＲ２、未反応のヒドロキシル基、加水分解されずに残存した式２に定義する基Ｙ等の一価の基である。ＰＥＧ鎖の両端のうち、ポリシロキサンと連結されていない側の端部には、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基Ｒ３が、直接的に、或いは必要に応じてリンカーを介して間接的に連結されていることが好ましい。図１３においてＱは結合、又はリンカーを示す。
【００２４】
図１３に示す本実施形態において、支持体１１は、少なくとも表面Ｓにプラスチックを含む。ポリシロキサンを含むプライマー層１２は支持体１１の表面Ｓに物理吸着により結合することができる。物理吸着はファンデルワールス力または疎水性相互作用により生じると考えられる。プライマー層１２と支持体１１の表面Ｓとの間には共有結合等の化学結合が形成される必要はないため、表面Ｓがポリスチレン等の、反応性官能基を含まないプラスチックからなる場合であっても、プライマー層１２を結合させることができる。
【００２５】
プライマー層１２中におけるポリシロキサンの状態は必ずしも明らかではないが、図２に示すように複数のポリシロキサン分子の主鎖部分同士が会合し、側鎖である有機基が支持体表面及び親水性層の側に面した二層構造を形成している可能性がある。このような二重構造が形成される機構は以下のように推定される。まず、シラノールのポリマー化によってファンデルワールス力が増大したポリシロキサンがプラスチック表面に物理吸着する。このとき、プラスチック表面とシラノール化合物の有機基との間に働く疎水性相互作用によりシラノール化合物の有機基はプラスチック側に配向する。ポリシロキサンの一層目が形成された後、溶媒側に配向したシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に別のポリシロキサンが結合する。このとき、シラノール基同士の水素結合によりシラノール化合物の有機基は溶媒側に配向する。その結果、ポリシロキサンは図２に示すような二層構造となると考えられる。溶媒側に配向した有機基は親水性層との共有結合を形成することができる。
【００２６】
プライマー層は、少なくともポリシロキサンを含む層により形成することができる。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、シラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。シラノール化合物の縮合はシラノール化合物の分子間で起こる反応である。支持体表面のプラスチック分子が反応性の官能基を有してない場合には、シラノール化合物と支持体表面のプラスチック分子との間では反応は起こらない。すなわち、シラノール化合物及び形成されたポリシロキサンは支持体表面のプラスチック分子とは化学的に反応せずに、単に物理的に吸着しているだけである。この点は、ガラスを支持体とする場合とは大きく異なる。このようなシラノール化合物のプラスチック表面への物理吸着力は、モノマーでは極めて弱いが、ある程度縮合が進み、ポリマー（ポリシロキサン）となれば強くなる。シラノール化合物を適度に縮合することによって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。
【００２７】
（シラノール化合物）
本発明で用いられるシラノール化合物は、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に加えて、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有する。この有機基はポリシロキサンの側鎖となる。シラノール化合物は典型的には式１で表される構造を有する：
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（ＯＨ）ｑ ・・・・（式１）
（ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。ｐ＝１かつｑ＝２又は３であることが好ましく、ｐ＝１かつｑ＝３であることがより好ましい。ｐ＋ｑ＝４である場合、Ｒ２は存在しない。
【００２８】
Ｒ１は、好ましくは、水素原子が１つ以上（好ましくは１つ）の官能基により、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換されている、炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜６の炭化水素基である（ただし、前記炭化水素基の全部又は一部がビニル基である場合のように、前記炭化水素基自体が官能基である場合は官能基により置換されている必要はない）。前記炭化水素基は、直鎖又は分岐鎖或いは環構造を有する、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基（アルキル基、炭素数２以上のアルケニル基、又は炭素数２以上のアルキニル基）であってもよいし、単環又は多環の炭素数６以上の芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記脂肪族炭化水素基によって置換された前記芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記芳香族炭化水素基によって置換され前記脂肪族炭化水素基であってもよい。前記炭化水素基では、炭素−炭素結合が、１又は２個の、酸素、窒素及び硫黄から選択される同一又は異なる原子により中断されていてもよい。炭化水素基の例としては好ましくはプロピル基、エチル基が挙げられる。
【００２９】
Ｒ１における、前記炭化水素基の１つ以上の水素を、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換する官能基としては、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基、又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換可能な官能基であれば特に限定されないが、典型的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでも、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。グリシジル基又はエポキシ基は、それ自体がＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成可能であるが、特開２００９−１５６８６４号公報に記載されている方法に従って、グリシジル基又はエポキシ基をアルデヒド基に変換し、形成されたアルデヒド基と、ＰＥＧが有するヒドロキシル基とを反応させてもよい。これらの官能基は、前記炭化水素基の水素原子を直接置換してもよいし、適切なリンカー構造を介して置換してもよい。リンカー構造としては、例えば炭素の数が０〜３個、窒素、酸素及び硫黄から選択される同一又は異なるヘテロ原子の数が０〜３個である二価の基が挙げられ、例えば、炭化水素基が左側に、官能基が右側にそれぞれ結合するとしたとき、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−、−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−（Ｎ＝Ｃ＝Ｎ）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｏ−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−（Ｏ＝Ｓ＝Ｏ）−で表される構造が挙げられる。
【００３０】
Ｒ１の特に好ましい態様としては３−グリシドキシプロピル基、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル)エチル基が挙げられる。
【００３１】
Ｒ２は、好ましくは、置換基により置換されていないという点を除いてＲ１について上述したものと同様の（ただしＲ１とは独立して選択される）炭化水素基であり、なかでも、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。
【００３２】
（加水分解によりシラノール化合物を生成するケイ素化合物）
前記シラノール化合物は、加水分解によりシラノール基(Si-OH)を生成可能な基を有するケイ素化合物を、加水分解することにより生成することができる。このようなケイ素化合物は式２で表される構造を有する：
（Ｒ１）ｐ（Ｒ２）４−ｐ−ｑＳｉ（Ｙ）ｑ ・・・・（式２）
（Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐ、ｑ、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれシラノール化合物に関して定義したとおりである）。
【００３３】
Ｙとしては、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアルコキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基等が好ましい。Ｙとしては特に、炭素数１〜６のアルコキシ基（特にメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）、炭素数１〜６の、アルコキシ基により置換されたアルコキシ基（例えばメトキシエトキシ基）、炭素数１〜６のアルキルカルボニルオキシ基（例えばアセトキシ基）、塩素原子が好ましい。
【００３４】
式２のケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。
【００３５】
（プライマー層の形成方法）
ポリシロキサンを含むプライマー層は、支持体の表面上において式１のシラノール化合物を重合させる工程（プライマー層形成工程）を含む方法により形成可能である。該工程は、好ましくは、式２のケイ素化合物を以下のように加水分解し、式１のシラノール化合物を生成する工程と、生成したシラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を前記支持体の表面上に接触させる工程とを含む。加水分解の条件は特に限定されないが、例えば次の方法が可能である。まず、式２のケイ素化合物に希塩酸を添加し、基Ｙを加水分解する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は２〜４とする。この操作によって基Ｙはシラノール基へ変換され、式１のシラノール化合物が生成する。
【００３６】
次いでシラノール化合物を支持体表面に適用し、縮合重合によりポリシロキサンを形成する。式１のシラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解する。シラノール化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができるが、これらに限定されない。塩基の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。アルコールはエタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。このシラノール化合物溶液を支持体のプラスチック表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）が好ましい。以上の操作によって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が物理吸着によって形成される。プライマー層の被覆密度は、シラノールや塩基の濃度、あるいはシラノール溶液をプラスチック表面に接触させる時間によって制御可能である。プライマー層の被覆密度が高ければ高いほど、次の工程で共有結合させるＰＥＧ鎖の結合密度も高くなる。
【００３７】
形成されたポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を誘導体化して他の官能基に変換する場合には、プライマー層形成後に引き続き、ポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換する誘導体化工程を行う。
【００３８】
（シランカップリング剤による官能基の導入）
支持体が表面にガラス、石英またはシリコンを含む支持体である場合、該表面に、シランカップリング剤の加水分解により生成される、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有するシラノール化合物を結合させることにより、或いは、更に、必要に応じて該官能基をＰＥＧと共有結合を形成することができる他の官能基に変換する誘導体化により、支持体表面にＰＥＧと共有結合を形成することができる官能基を導入することができる。該官能基とＰＥＧの一端との反応によりシランカップリング剤と親水性ポリマー層のＰＥＧ鎖とを共有結合により連結することができる。
【００３９】
シラノール化合物としては、プライマー層に関して上述した式１のシラノール化合物と同様のものを使用することができる。
【００４０】
シランカップリング剤としては、プライマー層に関して上述した式２のケイ素化合物と同様のものを使用することができる。
【００４１】
この実施形態では、支持体表面に導入された、シラノール化合物又はシランカップリング剤に由来する有機基上の官能基又は該官能基から誘導された他の官能基がＰＥＧ末端のヒドロキシル基と共有結合を形成するために用いられる。
【００４２】
（親水性ポリマー層の形成）
プライマー層、シランカップリング剤等により官能基が導入された支持体表面に、ＰＥＧを反応させてＰＥＧ鎖を形成する（Ｓ１１０２）。このとき触媒量の濃硫酸を含むＰＥＧを接触させる。ここで、数平均分子量が１０００を超えるＰＥＧはあらかじめ加熱融解しておく。必要に応じて、ＰＥＧをｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどで希釈して用いてもよい。このＰＥＧ溶液をプラスチック表面に接触させ、加熱する。加熱温度は６０〜１００℃の範囲で設定できるが、プラスチックの耐熱性を加味すると８０℃前後（７５℃〜８５℃）が好ましい。加熱時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定できるが、加熱温度が８０℃前後の場合は１０〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、プライマー層にＰＥＧ鎖が共有結合する。このとき、ＰＥＧ鎖の結合密度はプライマー層の被覆密度に依存する。
【００４３】
最後に、ＰＥＧ鎖の一端に、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる（Ｓ１１０３）。官能基の導入方法は特に限定されない。(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として導入する方法の好ましい実施形態は次の通りである。一端がプライマー層、シランカップリング剤等を介して支持体表面に固定されたＰＥＧ鎖の他端に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）または炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。
【００４４】
【化１】
【００４５】
上記の反応は、水分をほとんど含まない有機溶媒中で実施される必要がある。一般にプラスチックは有機溶剤に対する耐性が低いため、支持体がプラスチックを含む場合には、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１重量％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。支持体がプラスチックを含む場合には、プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定することが好ましく、ＣＤＩ濃度が０．５Ｍ前後（０．４〜０．６Ｍ）のときは１０分間〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、官能基が共有結合されたＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層が形成される。
【００４６】
（被固定化物質）
本発明の物質固定化用担体には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。「標的物質と結合する抗原又は抗体」が被固定化物質である実施形態（後述するサンドイッチ法又は直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（後述する間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００４７】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（DNA、RNA）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００４８】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００４９】
被固定化物質は、ＰＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＰＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００５０】
（被固定化物質の固定化）
被固定化物質の固定化は例えば、図１２に概略を示すように、本発明の物質固定化用担体と、被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる工程Ｓ１２０１と、該溶液を乾燥濃縮して被固定化物質を物質固定化用担体のＰＥＧ鎖末端に共有結合させる工程Ｓ１２０２とを少なくとも含み、必要に応じてさらに、未反応のＰＥＧ鎖末端の官能基と、アミノ基含有低分子化合物とを接触させ、ＰＥＧ鎖末端の官能基を不活性化する工程Ｓ１２０３とを含む方法により行うことができる。
【００５１】
まず、被固定化物質を緩衝液に溶解する。ここで、アミノ基成分を含まない緩衝液を用いることが好ましい。例えば、リン酸緩衝液や炭酸−重炭酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液のｐＨは７．０〜１０．０の範囲で調整することが望ましい。被固定化物質の終濃度は０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で調整するとよい。この被固定化物質溶解液を担体と接触させ（Ｓ１２０１）、そのまま乾燥濃縮させる（Ｓ１２０２）。乾燥濃縮によって、被固定化物質の反応系中での濃度が高まるため被固定化物質の固定化が著しく促進される。被固定化物質が少量しか準備できない場合は溶液中の被固定化物質の濃度を高めることは困難であるが、このような場合でも、比較的低濃度の被固定化物質溶解液を物質固定化用担体に接触させ、次いで乾燥濃縮することにより、被固定化物質の反応系中での濃度を高めることができ、固定化反応を促進することができる。被固定化物質が抗原、抗体等のタンパク質である場合は、乾燥によってタンパク質が変性することがある。乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐためには、被固定化物質溶解液にトレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類を添加することが好ましい。糖類のなかでもトレハロースは、適度な保湿性を有していること、溶液の乾燥濃縮が容易であること、並びに、乾燥濃縮時に粗大な結晶が形成されにくく均質な乾燥濃縮が可能であることから好ましい。糖類の終濃度は１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で調整すると良い。被固定化物質溶解液を担体の広範囲に渡って接触させたい場合は、被固定化物質溶解液にＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０などの非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。非イオン性界面活性剤の使用により、被固定化物質溶解液が担体表面に薄く濡れ広がるため、被固定化物質の使用量を節約できるだけでなく、乾燥濃縮に要する時間を短縮することができる。被固定化物質溶解液中の非イオン性界面活性剤の終濃度は０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲で調整するとよい。
【００５２】
乾燥濃縮が進行すると、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＰＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合、ウレタン結合等の共有結合が形成される。ここで、反応温度は４〜３７℃、接触時間は５分〜２４時間の範囲で設定するとよい。その結果、被固定化物質はＰＥＧ鎖を介して担体に固定化される。
【００５３】
所望の被固定化物質をＰＥＧ鎖に結合させた後は、ＰＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい（Ｓ１２０３）。これによって、免疫アッセイに関与する物質が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。この操作は、当該官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。この低分子化合物をＰＢＳなどの緩衝液に１０〜１０００ｍＭとなるように溶解し、既に所望の物質を固定化した担体と接触させる。反応温度は４〜３７℃、反応時間は２分〜２４時間の範囲で設定するとよい。
【００５４】
（免疫アッセイ）
本発明はまた、本発明の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む免疫アッセイに関する。本発明において「標的物質を測定する」とは、測定対象試料中の標的物質の存在の有無、及び／又は、測定対象試料中の標的物質の量を測定することを指す。免疫アッセイは、具体的には、本発明の物質固定化担体と、測定対象試料とを、該担体上の被固定化物質に、該測定対象試料中の標的物質の量に相関した量の抗原又は抗体（ここで該抗原又は抗体とは、測定対象試料中の標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能抗原又は検出可能抗体等を指す）が抗原抗体反応により結合する条件において接触させる工程と、前記工程において被固定化物質に結合した抗原又は抗体を検出する工程とを含む。
【００５５】
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイは公知の方法で実施することができ、サンドイッチ方式、直接競合方式、間接競合方式等の任意の態様とすることができる。
【００５６】
サンドイッチ方式の免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、該被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。図８では、抗原である標的物質１０３と特異的に結合する抗体１０２が固定化された物質固定化担体１０１と、標識物質（酵素など）により標識された、直接的に検出可能な標識抗体１０４とを用いて測定対象試料中の標的物質１０３を測定するサンドイッチ方式の免疫アッセイの一例を模式的に示す。
【００５７】
サンドイッチ方式の免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質との抗原抗体反応を行う、一次反応工程（図８（ｂ））と、
一次反応工程の後に、前記物質固定化担体と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体とを接触させ、被固定化物質に結合した標的物質と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体との抗原抗体反応を行う、二次反応工程（図８（ｃ））と、
二次反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程（図８（ｄ））と
を少なくとも含む。
【００５８】
一次反応工程及び二次反応工程では、抗原抗体反応後に、担体に固定化されていない成分を洗浄除去する洗浄工程を適宜含む。
【００５９】
二次反応工程に用いられる「検出可能抗原又は検出可能抗体」は、被固定化物質と競合しない位置において標的物質と結合する。検出可能抗原又は検出可能抗体は、検出可能な標識物質と連結された標識抗原又は標識抗体（直接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよいし、検出可能な標識物質と、更なる反応によって連結されて標識されうる抗原又は抗体（間接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよい。後者の例としては、検出可能な標識物質と連結された二次抗体と結合可能な抗原又は抗体や、ビオチン−アビジン（又はビオチン−ストレプトアビジン）結合対の一方と連結された標識物質と結合可能な、前記結合対の他方と連結された抗原又は抗体等が挙げられる。
【００６０】
直接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質とが少なくとも用いられる。図９では、抗原である標的物質１１３と特異的に結合する抗体１１２が固定化された物質固定化担体１１１と、測定対象試料中の標的物質１１３と競合的に抗体１１２と結合する、標識物質（酵素など）により標識された、直接的に検出可能な標的物質１１４（標識抗原）とを用いて測定対象試料中の標的物質１１３を測定する直接競合方式による免疫アッセイの一例を模式的に示す。
【００６１】
直接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能標的物質と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応と、検出可能標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、直接競合反応工程（図９（ｂ），（ｃ））と、
直接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した検出可能標的物質を検出する、検出工程（図９（ｅ））と
を少なくとも含む。
【００６２】
直接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能標的物質とを洗浄除去する工程（図９（ｄ））が適宜含まれる。
【００６３】
直接競合方式による免疫アッセイにおいて、標的物質は抗原又は抗体であり、検出可能標的物質は対応する検出可能抗原又は検出可能抗体である。検出可能標的物質としては、測定対象試料中の標的物質とは独立して検出することができるものである限り、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体において、抗原又は抗体として標的物質が用いられたものが使用可能である。
【００６４】
間接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。図１０では、抗原である標的物質１２３と同一の被固定化物質１２２が固定化された物質固定化担体１２１と、測定対象試料中の標的物質１２３と被固定化物質１２２とが競合的に結合する、標識された二次抗体１２５を介して間接的に検出可能な一次抗体１２４とを用いて測定対象試料中の標的物質１２３を測定する間接競合方式による免疫アッセイの一例を模式的に示す。
【００６５】
間接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能抗原又は検出可能抗体と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応と、前記被固定化物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、間接競合反応工程（図１０（ｂ），（ｃ））と、
間接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程（図１０（ｅ），（ｆ））と
を少なくとも含む。
【００６６】
間接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能抗原又は検出可能抗体とを洗浄除去する工程（図１０（ｄ））が適宜含まれる。
【００６７】
検出可能抗原又は検出可能抗体としては、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体と同様のものが使用できる。
【００６８】
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイにおいて抗原又は抗体を検出する手段は特に限定されず、任意の標識物質により直接的又は間接的に標識された抗原又は抗体を用いることができる。標識物質としては、酵素（ＥＬＩＳＡ法）、核酸（イムノPCR）、電気化学発光物質（電気化学発光法）、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等の、増幅された検出シグナルを生成することができる標識物質が挙げられる。本発明の免疫アッセイは、安全性及び簡便性を考慮すると、標識物質として酵素を用いる、酵素活性に基づいて検出を行う酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。標識物質として用いることができる酵素は特に限定されないが、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼが挙げられる。酵素活性による検出の方法としては、酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等を用いた検出方法が挙げられ、なかでも化学発光基質を用いた検出方法が好ましい。発色基質を用いると酵素反応にかなりの時間がかかる。これは、本発明において定量しようとする標的物質の濃度領域が従来の１〜２桁も低いためである。化学発光基質を用いた検出は、一般に、発色基質を用いた検出よりも感度が高いため、酵素反応に要する時間を短縮することができる。特に、フェムトグラムのレベルの微量な標的物質の検出に使用される高感度な化学発光基質を用いれば、感度の点で相乗効果を得ることができる。このような化学発光基質としてはＥＣＬＴＭＡｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア）、ＥＣＬＴＭＰｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）、イムノスター（登録商標）ＬＤ（和光純薬）、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＣＳＰＤ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が挙げられ、そのための酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。化学発光を検出するための検出器としては、発光プレートリーダーやＣＣＤイメージャーを用いることができる。これらの検出器はダイナミックレンジが広いという点でも都合がよい。すなわち、本発明の物質固定化担体と化学発光基質とを組み合わせれば、迅速かつ高感度でダイナミックレンジの広いＥＬＩＳＡを達成できる。
【００６９】
（免疫アッセイ用キット）
本発明の物質固定化用担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分としては、免疫アッセイの種類に応じて、被固定化物質に抗原抗体反応により結合した標的物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体や、被固定化物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体（直接的又は間接的に検出可能な標的物質を含む）が例示できる。更に、免疫アッセイに必要な成分としては、間接的な検出に用いるための、前記間接的に検出可能な抗原又は抗体と結合可能な標識物質や、検出用試薬（例えば標識物質が酵素である場合には酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等）が挙げられる。「直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体」及び「直接的又は間接的に検出可能な標的物質」は上記「免疫アッセイ」の欄にて説明したのと同様のものが使用できる。該キットは更に、被固定化物質を物質固定化用担体に固定化するために用いられる試薬（例えば糖類や非イオン性界面活性剤が溶解された、被固定化物質を溶解するための緩衝液）を含んでもよい。
【００７０】
本発明の物質固定化担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分の具体例は上記の通りである。
【００７１】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００７２】
［実施例１］
図１は物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を表す。ポリスチレンからなる支持体表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成されている。プライマー層にはＰＥＧ鎖の片末端が共有結合している。ＰＥＧ鎖の別の片末端には（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が存在する。親水性ポリマー層は、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１７６〜２５０００であるという条件、ＸＰＳにおける元素濃度比Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏが０．０１０〜０．１００の範囲にあるという条件、のうち少なくとも１つの条件を満足する。
【００７３】
［実施例２］
図２に示した方法で物質固定化用担体を製造した。具体的な手順を以下に記す。
１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに４ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で７５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ４０００（数平均分子量２７００〜３４００、関東化学）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま９０℃で３０分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＰＥＧを含む親水性ポリマー層が形成された。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに１０μｌずつ分注した。そのまま室温で２０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって親水性ポリマー層に含まれるＰＥＧの末端に（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が導入されたＰＥＧ誘導体が形成された。
【００７４】
［実施例３］
実施例２の物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を用いて図３に示すＥＬＩＳＡ（間接法、抗原-抗体-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００７５】
以下、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００（和光純薬）を含む炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファー、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００および０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄バッファー、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを希釈バッファーとする。まず、リゾチーム（和光純薬）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５０μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。この溶液を実施例２の９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μｌずつ分注した。３７℃で１０分間放置して乾燥濃縮させた後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いて０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識２次抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４０００倍希釈し（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。各ウェルに化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出し、図４（本発明）のような検量線を作成した。感度は０．０３ｎｇ／ｍｌであった。
【００７６】
（比較例１）
未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）および従来品の９６穴マイクロプレート（酸素プラズマ処理によって親水化されたポリスチレン製９６穴マイクロプレート）を用いて図３に示すＥＬＩＳＡ（間接法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００７７】
以下、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＰＢＳを洗浄バッファー、１％ＢＳＡを含むＰＢＳをブロッキングバッファーおよび希釈バッファーとする。まず、リゾチーム（和光純薬）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。この溶液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で２時間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーを各ウェルに２００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。希釈バッファーを用いて０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を調製し、各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識２次抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４０００倍希釈し（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。各ウェルに化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出し、図４（未処理、従来品）のような検量線を作成した。未処理品と従来品の感度はいずれも３．９ｎｇ／ｍｌであった。
【００７８】
［実施例４］
実施例２で得られた９６穴マイクロプレートを用いて図５に示すＥＬＩＳＡ（抗体-抗原-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００７９】
５％トレハロース（和光純薬）及び０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００（和光純薬）を含む炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を固相化バッファーとする。抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。この溶液を実施例２で得られた９６穴マイクロプレートの各ウェルに５μｌずつ分注した。３７℃で２時間放置して乾燥濃縮させた後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いて０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてビオチン標識２次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を５００倍希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を４０００倍希釈し（終濃度０．２５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出、図６（本発明）のような検量線を作成した。感度は０．１５ｐｇ／ｍｌであった。
【００８０】
（比較例２）
未処理の９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）および従来品の９６穴マイクロプレート（酸素プラズマ処理によって親水化されたポリスチレン製９６穴マイクロプレート）を用いて図５に示すＥＬＩＳＡ（抗体-抗原-抗体サンドイッチ法）を実施した。具体的な手順を以下に記す。
【００８１】
比較例１と同様の各種バッファーを用いた。抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を固相化バッファーに溶解し、終濃度５μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。この溶液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で２時間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、ブロッキングバッファーを各ウェルに１００μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで２回洗浄した。希釈バッファーを用いて０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を調製し、各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で６０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。希釈バッファーを用いてビオチン標識２次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を５００倍希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで１回洗浄した。次に、希釈バッファーを用いてＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を４０００倍希釈し（終濃度０．２５μｇ／ｍｌ）、これを各ウェルに５０μｌずつ分注した。室温で３０分間放置した後、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した。化学発光基質であるイムノスターＬＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）を用いて化学発光画像を取得した。最後に、専用のソフトウェアを用いて化学発光強度を算出、図６（未処理、従来品）のような検量線を作成した。未処理品と従来品の感度はそれぞれ９．８ｐｇ／ｍｌと２．４ｐｇ／ｍｌであった。
【００８２】
【表１】
【００８３】
［実施例５］
シラノール処理時間およびＰＥＧ鎖の数平均分子量がＥＬＩＳＡ（間接法）の感度に及ぼす影響を調べた。具体的な手順を以下に記す。
【００８４】
１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加した。ここに、さらに０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。このシラノール溶液を９６穴マイクロプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）の各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま室温で６０〜１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってマイクロプレートのウェル内にポリシロキサンとエポキシ基を含むプライマー層が形成された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ（１３種）を各ウェルに１００μｌずつ分注した。そのまま８０℃で４５分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってプライマー層上にＰＥＧを含む親水性ポリマー層が形成された。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに２０μｌずつ分注した。そのまま室温で３０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって親水性ポリマー層に含まれるＰＥＧの末端に（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基が導入されたＰＥＧ誘導体が形成された。以上の操作により、ＰＥＧ鎖の結合密度やＰＥＧ鎖の数平均分子量の異なる物質固定化用担体が得られた。これらの物質固定化用担体を用いて実施例３に記載の方法でＥＬＩＳＡの感度を測定した。その結果、表２に示すようにＰＥＧ鎖の数平均分子量が１７６以上で従来よりも顕著に高い感度が得られることがわかった。また、ＰＥＧ鎖の分子量が大きい場合は比較的低密度であっても高い感度が実現できることがわかった。
【００８５】
【表２】
【００８６】
表２に示す各原料の数平均分子量は以下の通りである。
【００８７】
【表３】
【００８８】
［実施例６］
実施例５で得られた物質固定化用担体のＸＰＳ分析を行った。ＸＰＳ分析は、アルバック・ファイ社製のＸ線分光分析装置「ＥＳＣＡ５６００」を用い、光電子取り込み角度を４５°に設定して行った。その結果、表２に示すようにＥＬＩＳＡの感度とＮ（１ｓ）／Ｃ−Ｏとの間に明確な相関が認められた。すなわち、Ｎ（１ｓ）／Ｃ−Ｏの値が０．０１０〜０．１００の範囲にあるときに従来よりも顕著に高い感度が得られることがわかった。
【００８９】
［実施例７］
前述のように、乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐ目的で、緩衝液にトレハロースを添加することが重要である。実施例４において、トレハロース濃度の異なる緩衝液を６種類用意し、ＥＬＩＳＡにおけるトレハロース濃度依存性を検討した。その結果、図７−１〜７−６に示すように、５〜１０％（ｗ／ｖ）のトレハロースで固相化時間（被固定化物質溶解溶液の接触から乾燥濃縮工程完了までの時間）に伴うシグナルの低下を防ぐことができることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
【請求項２】
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
請求項１の物質固定化用担体。
【請求項３】
前記窒素を含有する官能基が、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基又はスクシンイミジルオキシカルボニル基である、請求項２の物質固定化用担体。
【請求項４】
免疫アッセイに用いるための物質固定化担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と、前記被固定化物質とが共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項の物質固定化用担体と、前記被固定化物質とから、前記官能基と前記被固定化物質とを反応させて共有結合を形成することにより製造されたものである、請求項４の物質固定化担体。
【請求項６】
請求項４又は５の物質固定化担体の製造方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項の物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、被固定化物質接触工程と、
前記物質固定化用担体に接触させた前記溶液を乾燥濃縮させる、乾燥濃縮工程と、
を含む方法。
【請求項７】
前記溶液が糖類を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
前記糖類がトレハロースである、請求項７の方法。
【請求項９】
前記溶液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項６〜８のいずれか１項の方法。
【請求項１０】
前記乾燥濃縮工程の後に、前記物質固定化担体とアミノ基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、請求項６〜９のいずれか１項の方法。
【請求項１１】
請求項４又は５の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定する方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項の物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【請求項１３】
請求項４又は５の物質固定化担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【請求項１４】
サンドイッチ方式の免疫アッセイに用いるための、請求項１３のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、請求項４又は５の物質固定化担体と、
被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項１５】
直接競合方式の免疫アッセイに用いるための、請求項１３のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、請求項４又は５の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質と
を少なくとも含むキット。
【請求項１６】
間接競合方式の免疫アッセイに用いるための、請求項１３のキットであって、
被固定化物質が標的物質である、請求項４又は５の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項１７】
免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
ポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含み、
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
物質固定化用担体。
【請求項１８】
請求項１７の物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【請求項１】
免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
【請求項２】
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
請求項１の物質固定化用担体。
【請求項３】
前記窒素を含有する官能基が、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基又はスクシンイミジルオキシカルボニル基である、請求項２の物質固定化用担体。
【請求項４】
免疫アッセイに用いるための物質固定化担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と、前記被固定化物質とが共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項の物質固定化用担体と、前記被固定化物質とから、前記官能基と前記被固定化物質とを反応させて共有結合を形成することにより製造されたものである、請求項４の物質固定化担体。
【請求項６】
請求項４又は５の物質固定化担体の製造方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項の物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、被固定化物質接触工程と、
前記物質固定化用担体に接触させた前記溶液を乾燥濃縮させる、乾燥濃縮工程と、
を含む方法。
【請求項７】
前記溶液が糖類を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
前記糖類がトレハロースである、請求項７の方法。
【請求項９】
前記溶液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項６〜８のいずれか１項の方法。
【請求項１０】
前記乾燥濃縮工程の後に、前記物質固定化担体とアミノ基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、請求項６〜９のいずれか１項の方法。
【請求項１１】
請求項４又は５の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定する方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項の物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【請求項１３】
請求項４又は５の物質固定化担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【請求項１４】
サンドイッチ方式の免疫アッセイに用いるための、請求項１３のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、請求項４又は５の物質固定化担体と、
被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項１５】
直接競合方式の免疫アッセイに用いるための、請求項１３のキットであって、
被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、請求項４又は５の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質と
を少なくとも含むキット。
【請求項１６】
間接競合方式の免疫アッセイに用いるための、請求項１３のキットであって、
被固定化物質が標的物質である、請求項４又は５の物質固定化担体と、
測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項１７】
免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含み、
前記親水性ポリマー層が、
ポリエチレングリコール鎖と、
標的物質と結合する抗原又は抗体である被固定化物質或いは標的物質である被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含み、
前記官能基が、ｎ個の窒素原子を含有する官能基を含み、
前記親水性ポリマー層中の窒素濃度が、前記親水性ポリマー層中のＣ−Ｏ結合に由来する炭素濃度を１としたとき、０．０１０以上、０．０５０×ｎ以下である、
物質固定化用担体。
【請求項１８】
請求項１７の物質固定化用担体を含む、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図７−５】
【図７−６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図７−５】
【図７−６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１３−１１４７９（Ｐ２０１３−１１４７９Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４３２５８（Ｐ２０１１−１４３２５８）
【出願日】平成２３年６月２８日（２０１１．６．２８）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２８日（２０１１．６．２８）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
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