分散物及び脳神経変性疾患治療薬
【課題】本発明は、複合粒子を有する分散物を提供することを課題とする。
【解決手段】疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物。
【解決手段】疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散物及び脳神経変性疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、精神活動と運動制御に関わっており、特定の領域に各機能が局在している。例えば、大脳皮質には思考、記憶、知覚及び言語の機能を担う領域があり、線条体や小脳には主に体性運動や体運動の機能調整を担う領域がある。近年、生活習慣の乱れなどによって、これらの脳領域の恒常性の破綻に伴う、アルツハイマー型認知症などの脳神経変性疾患やうつ病などの精神疾患が増加の一途を辿っている。そのため、疾患治療に向けた薬物輸送システムの技術開発が望まれている。
【０００３】
脳は、その恒常性を維持するため、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ-Ｂｒａｉｎ-Ｂａｒｒｉｅｒ（以下「ＢＢＢ」ともいう。））を介して、血液中から脳内に取り込む物質を厳密に制御している。そのため、アルツハイマー型認知症などの脳神経変性疾患の診断や治療のための薬剤の開発においては、ＢＢＢ透過性を向上させることが課題であり、脳神経変性疾患領域に薬剤を確実に蓄積できるようにデザインする必要がある。その手段の一つとして、人工低密度リポタンパク質キャリアを利用した薬物輸送システムとして、リポソーム表面にアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ：ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ）が結合した薬剤内包リポソームが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００６−５１６５３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前述の薬剤内包リポソームは、その表面にＡｐｏＥが結合しているものの、該ＡｐｏＥを認識する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、主に肝臓で発現しているため、薬剤内包リポソームは肝臓に多く蓄積すると考えられる。また、ＡｐｏＥの分子種の一つであるＡｐｏＥ２はＬＤＬＲでは認識されない。さらに、ＢＢＢを形成している脳血管内皮細胞は、ＬＤＬＲではなく、ＬＤＬＲファミリーの一つである低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質-８（ＬＲＰ-８：Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ-８）が主に発現している。また、粒径１ｎｍ〜１００ｎｍの物質のＢＢＢにおける輸送は、クラスリン被覆ピットやカベオラ被覆ピットが関与していると言われている。そのため、前記薬剤内包リポソーム表面に該ＡｐｏＥが存在する人工低密度リポタンパク質というだけでは、該キャリアのＢＢＢ透過性の効率が一概に上昇するとは限らない。このため、現在においてもＢＢＢ透過性を示す薬剤キャリアの更なる開発が待ち望まれている。また、現時点において、脳神経変性疾患領域に薬物を蓄積させることが可能なキャリアは開発されていない。
【０００６】
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。
すなわち、本発明は、ＢＢＢ透過性が良好であるとともに、脳組織の局所に蓄積することが可能な分散物を提供することを課題とする。また、本発明は、該分散物を利用した、脳神経変性疾患治療薬、医薬組成物及び造影補助試薬を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該分散物の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記の課題を抜本的に解決するため、詳細な実験・検討を行った結果、特定の成分で調製された複合粒子がＢＢＢ透過性を持ち、脳組織内の特定領域への局在化を可能とする知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
前記の課題を解決するための具体的な手段は以下の通りである。
＜１＞ 疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物。
＜２＞ 前記複合粒子がリン脂質及びアポリポタンパク質を疎水性粒子表面に有する＜１＞に記載の複合粒子を有する分散物。
＜３＞ 前記リン脂質の複合粒子の全質量に対する含有量が、０．２質量％〜２０質量％である＜１＞又は＜２＞に記載の複合粒子を有する分散物。
＜４＞ 前記アポリポタンパク質が、０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの量で含まれる＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜５＞ 前記アポリポタンパク質が、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ１００及びアポリポタンパク質Ｅ４からなる群より選ばれる少なくとも１種のアポリポタンパク質である＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜６＞ 前記疎水性粒子が、金属ナノ粒子又は生分解性ポリマーである＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜７＞ 前記疎水性粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜８＞ 前記複合粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜９＞ 前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーであり、かつ該生分解性ポリマーが薬物を内包している＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜１０＞ ＜９＞に記載の複合粒子を有する分散物を有効成分として含有する脳神経変性疾患治療薬。
＜１１＞ 脳神経変性疾患が、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症候群及び脊髄小脳変性症からなる群より選ばれる少なくとも１種の疾患である＜１０＞に記載の脳神経変性疾患治療薬。
＜１２＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物を含有する医薬組成物。
＜１３＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物を含有する造影補助試薬。
＜１４＞ 疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む複合粒子の分散物の製造方法。
＜１５＞ 疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む製造方法により得られる複合粒子の分散物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＢＢＢ透過性が良好であるとともに、脳組織内の特定領域への局在化を可能とする分散物を提供することができる。また、本発明によれば、該分散物を利用した、脳神経変性疾患治療薬、医薬組成物及び造影補助試薬を提供することができる。さらに、本発明によれば、該分散物の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施例にかかる複合粒子の作製手順を示した模式図である。
【図２】本実施例にかかる金ナノ粒子及びリン脂質被覆金ナノ粒子を観察した透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）像である。
【図３】本実施例にかかる各複合粒子(Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４)の脳血管内皮細胞における時間経過に伴う取り込み量を示したグラフである。
【図４】本実施例にかかる複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１）が脳血管内皮細胞のクラスリン被覆小胞内に存在しているところを観察したＴＥＭ像並びにレーザー共焦点顕微鏡像である。
【図５】各複合粒子(Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４)の各脳領域における分布図である。
【図６】脳連続切片（１００枚）における複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳神経細胞数を示したグラフである。
【図７】複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳領域別における脳神経細胞数を示したグラフである。
【図８】複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ終脳の領域別における脳神経細胞数を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の分散物、分散物の製造方法、脳神経変性疾患治療薬、医薬組成物及び造影補助試薬について詳述する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
なお、本発明において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１１】
本発明は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物に関する。
本発明にかかる複合粒子は、粒径１ｎｍ〜１００ｎｍの疎水性粒子と、特定量のリン脂質及びアポリポタンパク質を含む構成としたことで、ナノサイズの疎水性粒子が、生体内で安定に分散でき、かつＢＢＢにおける物質の輸送機構に関わる脳血管内皮細胞のクラスリン被覆ピットやカベオラ被覆ピットに認識されるようになった。このメカニズムにより、良好なＢＢＢ透過性を実現すると同時に、脳組織内の特定領域への局在化を可能とする複合粒子を提供するものである。
【００１２】
≪分散物≫
本発明の分散物は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有しており、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。
本発明の分散物は、水性相に複合粒子が分散しているものである。
以下、複合粒子を構成する成分である疎水性粒子、リン脂質、アポリポタンパク質及びその他の成分、並びに水性相を構成する成分について説明する。
＜疎水性粒子＞
本発明にかかる複合粒子に含まれる疎水性粒子としては、粒子と水などの媒質との間の親和性の強弱により、疎水性の傾向を示すコロイドであり、粒子表面の帯電に起因する静電気的な反発及びブラウン運動の能力を有する粒子である限り、特に制限はなく、公知のものを利用することができる。具体的には、金属ナノ粒子、生分解性ポリマー、デンドリマー、量子ドット、ラテックス粒子、シリカ粒子、疎水性アミノ酸を含有するタンパク質粒子（例えば、アルブミン粒子）等が挙げられ、脳神経変性疾患治療薬や医薬組成物及び造影補助試薬を提供することの観点より、金属ナノ粒子又は生分解性ポリマーが好ましい。
【００１３】
また、金属ナノ粒子に使用しうる金属元素としては、アルカリ金属（周期律表第１族元素）、アルカリ土類金属（周期律表第２族元素）、遷移金属等が挙げられ、中でも金又は磁性体（酸化鉄、酸化クロム、コバルト、フェライト）が好ましく、生体への影響などの観点より、金がより好ましい。
【００１４】
中でも、疎水性粒子としては、所望する粒径及び均一サイズの粒子を容易に作製が可能であり、リン脂質との親和性に優れ、大きな電気陰性度を持つことや水溶液中で安定に分散できることなどの観点より、金ナノ粒子がより好ましい。
【００１５】
生分解性ポリマーとしては、Ｐｏｌｙ-ε-ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＣＬ）、Ｐｏｌｙ(ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ)（ＰＬＡ）、Ｐｏｌｙ （ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＧＡ）、Ｅｓｔｅｒ-ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｐｏｌｙ(ＤＬ-lａｃｔｉｃ-ｃｏ-ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ) (ＰＬＧＡ)等が挙げられ、生分解性ポリマーの分解速度による薬物放出量の制御や薬物の運搬性及び生体による利用効率（バイオアベイラビィリティ）の観点より、ＰＬＧＡ又はＰＬＡが好ましく、ＰＬＧＡがより好ましい。
【００１６】
前記疎水性粒子の粒径は、１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲とすることで、脳血管内皮細胞表面に存在しているクラスリン被覆ピット (サイズ：１００ｎｍ〜１５０ｎｍ)やカベオラ被覆ピット（サイズ：５０ｎｍ〜８０ｎｍ）を介したエンドサイトーシスが容易となるため好ましい。
【００１７】
前記疎水性粒子が、金属ナノ粒子である場合には、その粒径は１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、肝臓における非特異的な蓄積の低減の観点から、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
【００１８】
前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーである場合には、その粒径は１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーである場合には、その粒径は、生体に存在する粒径５ｎｍ〜１５ｎｍの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）や粒径１８ｎｍ〜２８ｎｍの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ）と同等サイズであるとの観点から、１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００１９】
疎水性粒子の粒径は、疎水性粒子の種類に応じた公知の方法により、適宜所望の大きさに調整することができる。例えば、金ナノ粒子の場合には、塩化金酸塩溶液の還元によるファラデー法などにより、粒径を調整することが可能である。
本明細書において、粒径とは、特に断らない限り、平均粒子径を表す。平均粒子径は、ＴＥＭ（日本電子社製）等により、任意に５００個の粒子を選択して、個別に粒子サイズを測定して、その測定値の算術平均値をとったものである。
【００２０】
なお、前記疎水性粒子の製造方法としては、疎水性粒子の種類に応じた公知の方法を使用し、製造することができる。
例えば、金ナノ粒子は、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ. １９８２, １２０, ４３５−４５５などに記載の方法により製造することができる。
また、生分解性ポリマーであるＰＬＧＡは、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０１０, ２６(２２), １６９５８−１６９６２などに記載の方法により製造することができる。
また、本発明において疎水性粒子は、市販されているものを使用することもできる。
【００２１】
＜リン脂質＞
本発明にかかる複合粒子には、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質が含まれる。
リン脂質としては、グリセロールを骨格とするグリセロリン脂質やスフィンゴシンを骨格とするスフィンゴリン脂質である限り、特に制限はなく、公知のものを利用することができる。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジル酸、ホスファチジルグリコシド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン等が挙げられ、リポタンパク質を構成する代表的なリン脂質であることの観点より、ホスファチジルコリンが好ましい。
【００２２】
本発明にかかる複合粒子には、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質が含まれる。また、臨界ミセル濃度としては０．５μｇ／ｍｌ〜８．０μｇ／ｍｌが好ましく、１．０μｇ／ｍｌ〜６．０μｇ／ｍｌがより好ましく、２．０μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌがさらに好ましい。
リン脂質の臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満である場合には、疎水性粒子表面を十分に被覆することができず、１０μｇ／ｍｌより高い臨界ミセル濃度を用いた場合には、リン脂質の水溶性が高すぎるため、疎水性粒子表面にリン脂質が吸着しない。
また、リン脂質の臨界ミセル濃度を２．０μｇ／ｍｌ以上とすることで、リン脂質の疎水性粒子表面被覆率が１００％となるため好ましい。
前記リン脂質は、複合粒子の全質量に対して０．２質量％〜２０質量％含まれていることが好ましく、リン脂質による疎水性粒子の表面被覆率という観点より、２．０質量％〜２０質量％含まれていることがより好ましい。
【００２３】
＜アポリポタンパク質＞
本発明にかかる複合粒子には、アポリポタンパク質が含まれる。
本発明にかかる複合粒子に含まれるアポリポタンパク質としては、血漿アポリポタンパク質である限り、特に制限はなく、公知のものを利用することができる。具体的には、アポリポタンパク質-Ａ１〜４、アポリポタンパク質-Ｂ４８、アポリポタンパク質-Ｂ１００、アポリポタンパク質-Ｃ１〜３、アポリポタンパク質-Ｄ、アポリポタンパク質-Ｅ２〜４、アポリポタンパク質-Ｊ等が挙げられ、脳神経変性疾患治療薬や医薬組成物及び造影補助試薬を提供することの観点より、アポリポタンパク質-Ａ１、アポリポタンパク質-Ｂ１００又はアポリポタンパク質-Ｅ４が好ましく、中でも、アポリポタンパク質-Ｂ１００がより好ましい。
【００２４】
アポリポタンパク質は、上記アポリポタンパク質のうち、１種単独のアポリポタンパク質を含んでいてもよく、２種以上のアポリポタンパク質を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明にかかる複合粒子には、脳組織の特異的な領域への蓄積という観点から、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質が含まれ、より好ましくは１．０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質が含まれ、１．０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質が含まれることがさらに好ましい。
前記アポリポタンパク質は、複合粒子の分散物の全質量に対して０．２質量％〜２０質量％含まれていることが好ましく、２．０質量％〜２０質量％含まれていることがより好ましく、２．０質量％含まれていることがさらに好ましい。
２．０質量％〜２０質量％の範囲とすることで、脳組織内の特定領域への局在化が可能であり、好ましい。
【００２６】
本発明にかかる複合粒子は、疎水性粒子を核として、該疎水性粒子の表面をリン脂質が被覆している。該リン脂質は、該疎水性粒子上に層（以下、「リン脂質層」ともいう）を形成する。該リン脂質層は、単層であっても複数層であってもよいが、複合粒子の調製が容易であることの観点より、単層である場合が好ましい。
【００２７】
アポリポタンパク質は、機能を損なわない限り複合粒子中の如何なる領域に存在していてもよい。例えば、リン脂質層中に、アポリポタンパク質の一部が入り込んでもよいし、リン脂質層の外側、すなわち複合粒子の表面に存在してもよい。複合粒子は、脳組織内の特定領域への局在化を可能とすることの観点より、その表面にアポリポタンパク質を有している場合が好ましい。
【００２８】
本発明にかかる複合粒子の粒径は、１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２７ｎｍであることがさらに好ましい。
１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲とすることで、脳血管内皮細胞表面に存在しているクラスリン被覆ピット(サイズ：１００ｎｍ〜１５０ｎｍ)やカベオラ被覆ピット(サイズ：５０ｎｍ〜８０ｎｍ) を介したエンドサイトーシスが容易であり好ましい。
【００２９】
＜その他の成分＞
本発明にかかる複合粒子に含まれるその他の成分としては、前記疎水性粒子、前記リン脂質及び前記アポリポタンパク質の他に、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。
他の成分としては、脂肪酸、ラベル用試薬、タンパク質、脂溶性ビタミン、コレステロール、中性脂肪 (トリグリセリド)、ホルモン、糖鎖、遺伝子、薬剤等が挙げられる。
脂肪酸としては、リノール酸、α-、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等が挙げられ、脳神経機能の維持及び促進の観点から、アラキドン酸やドコサエキサエン酸等が好ましい。
【００３０】
ラベル用試薬としては、蛍光物質、放射線標識化合物、核磁気共鳴画像用造影剤などが挙げられ、蛍光顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡、二光子顕微鏡、質量顕微鏡、電子顕微鏡、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）等を用いた顕微観察の用途に用いることができる。
タンパク質としては、ＢＢＢ透過性の能力を持つアルブミン、トランスフェリン、成長因子等が挙げられる。
ビタミンとしては、ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等が挙げられ、脳神経機能の維持・促進の用途に用いることができる。
前記その他の成分は、複合粒子の核の部分、リン脂質層又は複合粒子の表面のいずれに存在してもよい。例えば、他の成分がラベル用試薬である蛍光物質などの場合には、リン脂質及びアポリポタンパク質に結合して存在しても、複合粒子の表面に存在してもよい。
【００３１】
（薬剤）
本発明にかかる複合粒子としては、前記疎水性粒子が、前記生分解性ポリマーであり、かつ該生分解性ポリマーが薬物を内包している場合が挙げられる。
生分解性ポリマーに内包される薬剤としては、人体に対して何らかの治療効果を奏する物質であれば特に制限はなく、神経変性疾患治療剤、抗がん剤、精神疾患治療剤（抗うつ剤等）などが挙げられ、神経変性疾患治療剤又は精神疾患治療剤が好ましく、本発明にかかる複合粒子の脳領域への局在性の観点より、神経変性疾患治療剤がより好ましい。
神経変性疾患治療剤としては、アルツハイマー型認知症治療剤、パーキンソン症候群治療剤及び脊髄小脳変性症治療剤などが挙げられ、具体的には、脂溶性ビタミン；ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等、脂肪酸；リノール酸、α-、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等、ドネペジル塩酸塩(アリセプト（登録商標）)などが挙げられる。
【００３２】
抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤などが挙げられ、具体的には、テモゾロミド (テモダール（登録商標）) 、ニムスチン (ニドラン（登録商標）)、エノシタビン(サンラビン（登録商標）)などが挙げられる。
抗うつ剤としては、三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、脂溶性ビタミン；ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等、脂肪酸；リノール酸、α-,γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等が挙げられる。
【００３３】
本発明における薬剤としては、上記薬剤は、１種単独でもよく、２種以上であってもよい。
本発明における薬剤の含有量は、特に制限はなく、各薬剤の有効投与量により適宜設定できる。例えば、薬剤としてビタミンＡ１を用いる場合には、疎水性粒子である生分解性ポリマーに対して、５．０×１０−５質量％〜５．０×１０−４質量％であることが好ましい。
【００３４】
本発明において、薬剤はどのような形で複合粒子に含まれていてもよいが、好ましくは生分解性ポリマーに内包されている。
本発明において、上記薬剤を、生分解性ポリマーに内包させる方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、ＡＣＳ ＮＡＮＯ. ２００８, ２（８）, １６９６−１７０２等に記載の方法に従い、生分解性ポリマーに薬剤を内包させることができる。
【００３５】
＜水性相を構成する成分＞
水性相を構成する成分としては、水、生理食塩水、エタノール等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種以上を混合して使用してもよい。溶媒としては、生体組織を傷つけないなどの観点より、生理食塩水がより好ましい。
【００３６】
本発明の分散物を得る方法のうち、好ましい方法としては以下に述べる製造方法が挙げられる。
≪分散物の製造方法≫
本発明にかかる複合粒子の分散物は、疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製すること（以下、「リン脂質被覆粒子調製工程」ともいう。）と、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合すること（以下、「混合工程」ともいう。）とを含む製造方法により製造することができる。
本発明にかかる複合粒子の分散物の製造方法は、リン脂質被覆粒子調製工程と、混合工程とを含むことにより、簡便で効率のよい複合粒子の製造方法を提供しうるものである。
【００３７】
＜リン脂質被覆粒子調製工程＞
本発明にかかる複合粒子の分散物の製造方法は、疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製するリン脂質被覆粒子調製工程を含む。
リン脂質被覆粒子調製工程においては、疎水性粒子表面におけるリン脂質の自己集合の原理を利用することで、リン脂質被覆粒子を調製することが可能である。
【００３８】
疎水性粒子の粒径は、好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍであり、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
疎水性粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であれば、疎水性粒子表面のリン脂質の被覆率の制御が容易であり好ましい。
疎水性粒子の種類や好ましい範囲等は、前記複合粒子を構成する成分について記載した疎水性粒子と同様のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。
【００３９】
リン脂質の臨界ミセル濃度は０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである。
リン脂質の臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満である場合には、疎水性粒子表面を十分に被覆することができず、１０μｇ／ｍｌより高い臨界ミセル濃度を用いた場合には、リン脂質の水溶性が高すぎるため、疎水性粒子表面にリン脂質が吸着しない。
【００４０】
なお、上記臨界ミセル濃度は、リン脂質のアシル基の長さにより適宜、上記範囲内において、最適の値に変更することができる。例えば、リン脂質としてホスファチジルコリン（ＰＣ）を用いた場合、アシル基の長さと臨界ミセル濃度との関係としては、ＰＣ（１０：０／１０：０）の場合には、２．０μｇ／ｍｌ〜６．０μｇ／ｍｌであり、ＰＣ（１２：０／１２：０）の場合には、０．１μｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌである。
ここで、ＰＣ（１０：０／１０：０）とは、ホスファチジルコリン中における２本のアシル基が飽和状態であり、該アシル基の炭素数が１０であることを意味する。
【００４１】
本明細書において、臨界ミセル濃度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法に従い測定する。溶媒はメタノール、クロロホルム及び純水（ｐｐｂレベル）の混合液である。
リン脂質の種類や好ましい範囲等は、前記複合粒子を構成する成分について記載したリン脂質と同様のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。
【００４２】
前記疎水性粒子及び前記リン脂質を混合する際の温度としては、特に制限はされないが、３５℃〜３７℃が好ましい。また、リン脂質被覆粒子調製工程の際には、約１分間のボルテックを必要とする。調整する時間としては、特に制限はされないが、３時間〜１２時間が好ましい。また、疎水性粒子分散水溶液に既にクエン酸ナトリウムなどの分散安定剤が付加されている場合には、疎水性粒子を一度遠心し沈殿させ、その上澄みを純水に交換することが好ましい。
【００４３】
＜混合工程＞
本発明にかかる複合粒子の分散物の製造方法は、前記リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合する混合工程を含む。
【００４４】
アポリポタンパク質の添加量は、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであり、脳組織内の特定領域への蓄積の観点より１．０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであることがより好ましく、さらに好ましくは１．０μｇ／ｍｌである。
アポリポタンパク質の種類や好ましい範囲等は、前記複合粒子を構成する成分について記載したアポリポタンパク質と同様のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。
【００４５】
本発明における混合工程において、温度は特に制限はされないが、３５℃〜３７℃が好ましい。また、混合工程の際にはボルテックを必要としない。混合時間としては、特に制限はされないが、３時間〜５時間が挙げられる。
【００４６】
なお、疎水性粒子である生分解性ポリマーに薬剤が内包されている場合には、例えば、前記リン脂質被覆粒子調製工程の前に、生分解性ポリマーに薬剤を内包する薬剤内包工程を含んでいてもよい。
薬剤内包工程としては、公知の方法を利用することができ、例えば、ＡＣＳ ＮＡＮＯ. ２００８, ２（８）, １６９６−１７０２等に記載の方法に従い、生分解性ポリマーに薬剤を内包させることができる。
【００４７】
さらに、別の態様として、本発明は、疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製すること（以下、「リン脂質被覆粒子調製工程」ともいう。）と、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合すること（以下、「混合工程」ともいう。）とを含む製造方法により得られる複合粒子を提供する。
【００４８】
疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製するリン脂質被覆粒子調製工程と、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合する混合工程とは、前記複合粒子の製造方法に記載のリポタンパク質作製工程及び混合工程と同義であり、好ましい範囲等も同様である。
【００４９】
≪脳神経変性疾患治療薬≫
本発明の脳神経変性疾患治療薬は、疎水性粒子である生分解性ポリマーと、該生分解性ポリマーに内包された薬剤と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を有効成分として含有する。
また、本発明における別の態様としては、疎水性粒子である生分解性ポリマーと、該生分解性ポリマーに内包された薬剤と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を患者に投与することを含む脳神経変性疾患の診断及び治療の方法を提供しうる。
本発明の脳神経変性疾患治療薬は、疎水性粒子である生分解性ポリマーと、該生分解性ポリマーに内包された薬剤と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を有効成分として含有することにより、脳内への移行性が良好で、優れた治療効果を発揮しうる、脳神経変性疾患治療薬を提供しうるものである。
【００５０】
脳神経変性疾患としては、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症候群及び脊髄小脳変性症が挙げられる。
【００５１】
薬剤としては、神経変性疾患治療剤が挙げられる。
神経変性疾患治療剤としては、アルツハイマー型認知症治療剤、パーキンソン症候群治療剤及び脊髄小脳変性症治療剤などが挙げられ、具体的には、脂溶性ビタミン；ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等、脂肪酸；リノール酸、α-、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等、ドネペジル塩酸塩 (アリセプト（登録商標）)などが挙げられ、脳神経機能の恒常性の維持及び促進の観点より、脂溶性ビタミン又は脂肪酸が好ましい。
【００５２】
本発明の神経変性疾患治療薬の有効成分である分散物における前記複合粒子の含有量は、用途により適宜設定しうるが、治療効果の観点より、例えば、前記複合粒子を、分散物全量に対して、好ましくは１質量％〜１０質量％含有する。
本発明の神経変性疾患治療薬の有効成分である分散物における薬剤の含有量は、特に制限はなく、各薬剤の有効投与量により適宜設定できる。例えば、薬剤としてビタミンＡ１を用いる場合には、疎水性粒子である生分解性ポリマーに対して、５．０×１０−５質量％〜５．０×１０−４質量％であることが好ましい。
【００５３】
生分解性ポリマー、リン脂質及びアポリポタンパク質については、本発明の神経変性疾患治療薬の効果を損なわない範囲において、前記複合粒子を構成する成分について記載した全ての事項が適用される。
【００５４】
≪医薬組成物≫
本発明の医薬組成物は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有する。
本発明の医薬組成物は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有することにより、脳内への移行性が良好で、副作用の発現頻度を抑制しうる医薬組成物を提供しうるものである。
【００５５】
本発明の医薬組成物における前記複合粒子の含有量は、用途により適宜設定しうるが、治療効果の観点より、例えば、前記複合粒子を、医薬組成物の全固形分に対して、好ましくは１質量％〜１０質量％含有する。
本明細書において、全固形分とは、医薬組成物中、溶液や生理食塩水を除いた、全成分の合計含量のことである。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、神経変性疾患治療、抗がん治療、精神疾患治療（抗うつ治療等)等の各種疾患の治療のために使用することができる。
具体的には、薬学上許容しうる担体（希釈剤、溶解補助剤など）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤の形態で、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、疎水性粒子や該疎水性粒子である生分解性ポリマーに内包された薬剤の種類や活性により、最適な投与量を決定することができる。例えば薬剤として、ビタミンＡ１を生分解性ポリマーに内包する場合を例に取れば、投与量はビタミンＡ１量として５ｍｇ／ｋｇ〜１７０ｍｇ／ｋｇが好ましい。
【００５７】
疎水性粒子、リン脂質及びアポリポタンパク質については、本発明の医薬組成物の効果を損なわない範囲において、前記複合粒子を構成する成分について記載した全ての事項が適用される。
【００５８】
≪造影補助試薬≫
本発明の造影補助試薬は、疎水性粒子としてのラベル用疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有する。
本発明の造影補助試薬は、疎水性粒子としてのラベル用疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有することにより、ＢＢＢ透過性が良好で、脳の恒常性の変化（脳の自己組織化）が生じていると考えられる領域の特定などに有用な造影補助試薬を提供しうるものである。
【００５９】
本発明の造影補助試薬は、疎水性粒子としてのラベル用疎水性粒子を含む。前記ラベル用疎水性粒子としては、蛍光顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡、二光子顕微鏡、質量顕微鏡、電子顕微鏡、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ)、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）等により画像解析が可能なコントラスト像を生じさせる、公知のもの全てが挙げられる。中でも、金属ナノ粒子、ラベル用試薬を内包する生分解性ポリマー、量子ドット等が良好な画像化能を有する観点より好ましい。
【００６０】
前記ラベル用試薬を内包する生分解性ポリマーにおける、ラベル用試薬としては、各種顕微観察技術でコントラスト像を生じさせるものであれば、特に限定されない。例えば、蛍光色素（例えば、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ＣＭ-ＤｉＩ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ-４８８、-５９４（登録商標）等）、放射線標識化合物（例えば、Ｉｎ-１１１、Ｔｃ-９９ｍ、Ｉ-１２３、Ｉ-１２５ Ｆ-１８、Ｇａ-６７、Ｇａ-６８等）、不対スピン原子又はフリーラジカル（例えば、Ｆｅ、ランタイド類（ｌａｎｔｈｉｄｅｓ）、Ｇｄ等）及び核磁気共鳴画像用造影剤（例えば、キレート化した（ＤＴＰＡ）マンガン等）等が挙げられる。
また、前記ラベル用試薬は、ラベル用疎水性粒子としての生分解性ポリマーに内包されるだけではなく、該生分解性ポリマーとは独立して、造影補助試薬に含有されていてもよい。造影補助試薬にかかる複合粒子の分散物が、ラベル用疎水性粒子として金属ナノ粒子や、量子ドットの他に、さらに、前記ラベル用試薬を含んでいる態様も本発明の造影補助試薬に含まれる。
【００６１】
本発明にかかる造影補助試薬が、疎水性粒子に加えてさらにラベル用試薬を含む場合の製造方法について、ラベル用試薬が蛍光色素である場合を例に挙げて簡単に説明する。すなわち、本発明におけるリン脂質被覆粒子調製工程後に、該リン脂質被覆粒子が含まれる溶液に、適当量の蛍光色素を添加し、該蛍光色素で表面がラベルされたリン脂質被覆粒子と、アポリポタンパク質とを混合して、造影補助試薬を得ることもできる。
なお、本発明の造影補助試薬の製造方法はこれに制限されるものではなく、公知の方法を利用することができる。
【００６２】
疎水性粒子、リン脂質及びアポリポタンパク質については、本発明の造影補助試薬の効果を損なわない範囲において、前記複合粒子を構成する成分について記載した全ての事項が適用される。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
＜実施例１＞ 複合粒子（分散物）の調製
平均粒径２０ｎｍのコロイド状金ナノ粒子（Ｇ１６５２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように、クエン酸ナトリウムなどの分散安定剤を遠心し除去した後、純水（ｐｐｂレベル）に分散させた。また、３５℃の純水（ｐｐｂ レベル）にＰＣ（１０：０／１０：０）（８５０３２５Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を、最終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した後、０．１μｍのカットオフ特性を持つ親水性メンブレンフィルターで、リポソーム及び凝集物を除去した。この調整したＰＣ溶液（臨界ミセル濃度２．８μｇ／ｍｌ）及びコロイド状金ナノ粒子溶液を混合し、３７℃で一晩攪拌 (約１０時間撹拌) することにより、コロイド状金ナノ粒子表面に１層のＰＣが吸着した、リン脂質被覆金ナノ粒子を得た。
【００６５】
次に、リン脂質被覆金ナノ粒子と、１．０μｇ／ｍｌに調整した蛍光物質(商品名Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ＣＭ-ＤｉＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製)とを３０分間反応させた後、１．０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質(Ａ１、Ｂ１００又はＥ４)をリン脂質被覆金ナノ粒子に吸着させた。
最後に、３７℃、２０，０００×ｇで５分間の遠心を２回行い、上清を除いた沈殿を生理食塩水によって再分散させた後に、０．１μｍのフィルターによって濾過して、複合粒子を得た。なお、リン脂質の複合粒子の全質量に対する含有量は４．５質量％である。
【００６６】
図１に実施例１にかかる複合粒子の作製手順を模式的に示す。
図１は、コロイド状の金ナノ粒子をリン脂質で被覆し、リン脂質被覆金ナノ粒子を調製し、その後、蛍光物質で該リン脂質被覆金ナノ粒子をラベルし、最後にアポリポタンパク質をリン脂質被覆金ナノ粒子に吸着させ、複合粒子を得る工程を模式化した図である。
【００６７】
作製したリン脂質被覆金ナノ粒子をＴＥＭにより観察した。また、各複合粒子の平均粒径を動的光散乱法 (ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ)により評価した。
【００６８】
図２は本実施例にかかるリン脂質被覆金ナノ粒子を観察したＴＥＭ像を示す。ＴＥＭで観察した結果、各複合粒子は、いずれも２０ｎｍの金ナノ粒子の表面に、３．３ｎｍの１層のＰＣが吸着した形状を示すことが明らかとなった。
また、ＤＬＳ測定の結果、各複合粒子の平均粒径は、それぞれ、５１＋／−０．０ｎｍ(複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１）)、３０＋／−１．９ｎｍ(複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）)、３８＋／−３．８ｎｍ(複合粒子（Ａｐｏ-Ｅ４）)であった。
【００６９】
＜実施例２＞ 複合粒子の脳血管内皮細胞への取り込み機構の解明
細胞培養培地（商品名ダルベッコイーグル培地、和光社製）に、１０％ウシ胎児血清（商品名Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加して、マウスの脳組織由来の血管内皮細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ｂＥｎｄ．３）を培養した。培養は３７℃、５％ＣＯ２環境下で行なった。
細胞免疫化学的解析に供するために、ラット由来のコラーゲンでコーティングした１．１ｃｍ２のガラスプレートに、血管内皮細胞を播種し、２４ウェルプレート（面積１．５５×１．５５ｃｍ２、高さ１．７５ｃｍ）において、約２．５×１０４細胞／ｃｍ２のサブコンフルエンス状態まで培養させた。その後、前記細胞培養培地に、複合粒子の最終濃度が２．５μｇ／ｍｌとなるように、実施例１で調整した複合粒子を添加し、１時間、３時間、６時間又は１２時間培養して、各サンプルを得た。
その後、各サンプルをＰＢＳで２度洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定化し、１０ｎｇ／ｍｌのジギトニンで処理し、３％ ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でブロッキングした。１時間後、各サンプルを、Ｃｌａｔｈｉｒｎ ＨＣ Ｈ−３００（ｓｃ−９０６９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）又はＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （Ｃ-ｔｅｒｍ）（１９５６-１、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社製）のいずれかとともに４℃で一晩反応させた。続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ-４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ‐ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ａ１１０３４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を添加して反応させ、ビスベンズイミド Ｈ３３３４２ 三塩酸塩（商品名Ｂ２２６１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて核染色を行った。
【００７０】
図３は本実施例にかかる各複合粒子(Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４)の脳血管内皮細胞における時間経過に伴う取り込み量を示す。図３中、縦軸は複合粒子の血管内皮細胞への取り込み量（カウント／細胞）を示し、横軸は用いたサンプルの培養時間を示す。また、レーザー共焦点顕微鏡（ライカＳＰ−ＩＩ、ライカ社製）を用いて、１時間後、３時間後、６時間後及び１２時間後それぞれの処理時間における、各複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４）の血管内皮細胞への取り込み量の増加が確認された。
【００７１】
図４は、本実施例にかかる複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１）が脳血管内皮細胞のクラスリン被覆小胞（ＣＶ：Ｃｌａｔｈｒｉｎ Ｖｅｓｉｃｌｅ）内に存在しているところを観察したＴＥＭ像並びにレーザー共焦点顕微鏡（ライカＳＰ−ＩＩ、ライカ社製）像を示す。１２時間培養後の脳血管内皮細胞サンプルを観察した結果、各複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４）が、クラスリンにより被覆され、血管内皮細胞に取り込まれたことを見出した。また同様に、各複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４）は、ＬＤＬＲを介して血管内皮細胞内へ輸送されるものではないことも見出した。
【００７２】
これらの結果より、各複合粒子は、開口分泌されたクラスリン経路を介して、血液中から脳実質内に取り込まれる可能性があることが明らかとなった。
【００７３】
＜実施例３＞ 複合粒子の脳における自己組織化
５週齢のＣ５７ＢＬ/６Ｊ雄性マウスに、生理食塩水で希釈した２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌの各複合粒子 (Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４) 溶液１００μｌを、尾静脈より投与した。なお、コントロールには生理食塩水を使用した。
【００７４】
２４時間後、５０μｇ／ｍｌのペントバルビタールを腹腔内注射し、麻酔下で切開し、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水で毎分１ｍｌの流速で血液を灌流し、４％パラホルムアルデヒド溶液で脳組織を固定した。固定後、５％スクロースで脱水し、矢状方向に半割した脳試料を厚さ約１０μｍでミクロトームを用い連続切片を作製した。メタノール洗浄により自家蛍光を持つ付着物を除去したスライドガラスに固定化し、蛍光顕微鏡による観察に供した。
【００７５】
図５は各複合粒子 （Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４）の脳組織内における分布図を示す。また、脳組織領域別における各複合粒子の蓄積度合を比較した結果、複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）は、複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１或いはＡｐｏ-Ｅ４）に比べ、大脳皮質、線条体、小脳及び海馬に局在化することが可能であった。
【００７６】
図６は脳連続切片（１００枚）における複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳神経細胞数を示す。コントロールは生理食塩水を投与した。エラーバーは各群マウス３匹あたりの標準偏差であり、 図６中、＊Ｐ＜０．０００５はＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用い示した。この結果、複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）は、統計学的解析より確実にＢＢＢ透過性能を持っていることが証明された。
【００７７】
図７及び図８は複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳組織領域別における脳神経細胞数を示す。
この結果、複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）は、小脳及び終脳の特定領域に局在化することが可能であった。
【００７８】
以上の結果より、本発明にかかる複合粒子は、ＢＢＢ透過性が良好であるとともに、脳組織内の特定領域への局在化が可能であることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散物及び脳神経変性疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、精神活動と運動制御に関わっており、特定の領域に各機能が局在している。例えば、大脳皮質には思考、記憶、知覚及び言語の機能を担う領域があり、線条体や小脳には主に体性運動や体運動の機能調整を担う領域がある。近年、生活習慣の乱れなどによって、これらの脳領域の恒常性の破綻に伴う、アルツハイマー型認知症などの脳神経変性疾患やうつ病などの精神疾患が増加の一途を辿っている。そのため、疾患治療に向けた薬物輸送システムの技術開発が望まれている。
【０００３】
脳は、その恒常性を維持するため、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ-Ｂｒａｉｎ-Ｂａｒｒｉｅｒ（以下「ＢＢＢ」ともいう。））を介して、血液中から脳内に取り込む物質を厳密に制御している。そのため、アルツハイマー型認知症などの脳神経変性疾患の診断や治療のための薬剤の開発においては、ＢＢＢ透過性を向上させることが課題であり、脳神経変性疾患領域に薬剤を確実に蓄積できるようにデザインする必要がある。その手段の一つとして、人工低密度リポタンパク質キャリアを利用した薬物輸送システムとして、リポソーム表面にアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ：ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ）が結合した薬剤内包リポソームが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００６−５１６５３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前述の薬剤内包リポソームは、その表面にＡｐｏＥが結合しているものの、該ＡｐｏＥを認識する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、主に肝臓で発現しているため、薬剤内包リポソームは肝臓に多く蓄積すると考えられる。また、ＡｐｏＥの分子種の一つであるＡｐｏＥ２はＬＤＬＲでは認識されない。さらに、ＢＢＢを形成している脳血管内皮細胞は、ＬＤＬＲではなく、ＬＤＬＲファミリーの一つである低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質-８（ＬＲＰ-８：Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ-８）が主に発現している。また、粒径１ｎｍ〜１００ｎｍの物質のＢＢＢにおける輸送は、クラスリン被覆ピットやカベオラ被覆ピットが関与していると言われている。そのため、前記薬剤内包リポソーム表面に該ＡｐｏＥが存在する人工低密度リポタンパク質というだけでは、該キャリアのＢＢＢ透過性の効率が一概に上昇するとは限らない。このため、現在においてもＢＢＢ透過性を示す薬剤キャリアの更なる開発が待ち望まれている。また、現時点において、脳神経変性疾患領域に薬物を蓄積させることが可能なキャリアは開発されていない。
【０００６】
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。
すなわち、本発明は、ＢＢＢ透過性が良好であるとともに、脳組織の局所に蓄積することが可能な分散物を提供することを課題とする。また、本発明は、該分散物を利用した、脳神経変性疾患治療薬、医薬組成物及び造影補助試薬を提供することを課題とする。さらに、本発明は、該分散物の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記の課題を抜本的に解決するため、詳細な実験・検討を行った結果、特定の成分で調製された複合粒子がＢＢＢ透過性を持ち、脳組織内の特定領域への局在化を可能とする知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
前記の課題を解決するための具体的な手段は以下の通りである。
＜１＞ 疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物。
＜２＞ 前記複合粒子がリン脂質及びアポリポタンパク質を疎水性粒子表面に有する＜１＞に記載の複合粒子を有する分散物。
＜３＞ 前記リン脂質の複合粒子の全質量に対する含有量が、０．２質量％〜２０質量％である＜１＞又は＜２＞に記載の複合粒子を有する分散物。
＜４＞ 前記アポリポタンパク質が、０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの量で含まれる＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜５＞ 前記アポリポタンパク質が、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ１００及びアポリポタンパク質Ｅ４からなる群より選ばれる少なくとも１種のアポリポタンパク質である＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜６＞ 前記疎水性粒子が、金属ナノ粒子又は生分解性ポリマーである＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜７＞ 前記疎水性粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜８＞ 前記複合粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜９＞ 前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーであり、かつ該生分解性ポリマーが薬物を内包している＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物。
＜１０＞ ＜９＞に記載の複合粒子を有する分散物を有効成分として含有する脳神経変性疾患治療薬。
＜１１＞ 脳神経変性疾患が、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症候群及び脊髄小脳変性症からなる群より選ばれる少なくとも１種の疾患である＜１０＞に記載の脳神経変性疾患治療薬。
＜１２＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物を含有する医薬組成物。
＜１３＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の複合粒子を有する分散物を含有する造影補助試薬。
＜１４＞ 疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む複合粒子の分散物の製造方法。
＜１５＞ 疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む製造方法により得られる複合粒子の分散物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＢＢＢ透過性が良好であるとともに、脳組織内の特定領域への局在化を可能とする分散物を提供することができる。また、本発明によれば、該分散物を利用した、脳神経変性疾患治療薬、医薬組成物及び造影補助試薬を提供することができる。さらに、本発明によれば、該分散物の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施例にかかる複合粒子の作製手順を示した模式図である。
【図２】本実施例にかかる金ナノ粒子及びリン脂質被覆金ナノ粒子を観察した透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）像である。
【図３】本実施例にかかる各複合粒子(Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４)の脳血管内皮細胞における時間経過に伴う取り込み量を示したグラフである。
【図４】本実施例にかかる複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１）が脳血管内皮細胞のクラスリン被覆小胞内に存在しているところを観察したＴＥＭ像並びにレーザー共焦点顕微鏡像である。
【図５】各複合粒子(Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４)の各脳領域における分布図である。
【図６】脳連続切片（１００枚）における複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳神経細胞数を示したグラフである。
【図７】複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳領域別における脳神経細胞数を示したグラフである。
【図８】複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ終脳の領域別における脳神経細胞数を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の分散物、分散物の製造方法、脳神経変性疾患治療薬、医薬組成物及び造影補助試薬について詳述する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
なお、本発明において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。また、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１１】
本発明は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物に関する。
本発明にかかる複合粒子は、粒径１ｎｍ〜１００ｎｍの疎水性粒子と、特定量のリン脂質及びアポリポタンパク質を含む構成としたことで、ナノサイズの疎水性粒子が、生体内で安定に分散でき、かつＢＢＢにおける物質の輸送機構に関わる脳血管内皮細胞のクラスリン被覆ピットやカベオラ被覆ピットに認識されるようになった。このメカニズムにより、良好なＢＢＢ透過性を実現すると同時に、脳組織内の特定領域への局在化を可能とする複合粒子を提供するものである。
【００１２】
≪分散物≫
本発明の分散物は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有しており、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。
本発明の分散物は、水性相に複合粒子が分散しているものである。
以下、複合粒子を構成する成分である疎水性粒子、リン脂質、アポリポタンパク質及びその他の成分、並びに水性相を構成する成分について説明する。
＜疎水性粒子＞
本発明にかかる複合粒子に含まれる疎水性粒子としては、粒子と水などの媒質との間の親和性の強弱により、疎水性の傾向を示すコロイドであり、粒子表面の帯電に起因する静電気的な反発及びブラウン運動の能力を有する粒子である限り、特に制限はなく、公知のものを利用することができる。具体的には、金属ナノ粒子、生分解性ポリマー、デンドリマー、量子ドット、ラテックス粒子、シリカ粒子、疎水性アミノ酸を含有するタンパク質粒子（例えば、アルブミン粒子）等が挙げられ、脳神経変性疾患治療薬や医薬組成物及び造影補助試薬を提供することの観点より、金属ナノ粒子又は生分解性ポリマーが好ましい。
【００１３】
また、金属ナノ粒子に使用しうる金属元素としては、アルカリ金属（周期律表第１族元素）、アルカリ土類金属（周期律表第２族元素）、遷移金属等が挙げられ、中でも金又は磁性体（酸化鉄、酸化クロム、コバルト、フェライト）が好ましく、生体への影響などの観点より、金がより好ましい。
【００１４】
中でも、疎水性粒子としては、所望する粒径及び均一サイズの粒子を容易に作製が可能であり、リン脂質との親和性に優れ、大きな電気陰性度を持つことや水溶液中で安定に分散できることなどの観点より、金ナノ粒子がより好ましい。
【００１５】
生分解性ポリマーとしては、Ｐｏｌｙ-ε-ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＣＬ）、Ｐｏｌｙ(ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ)（ＰＬＡ）、Ｐｏｌｙ （ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＧＡ）、Ｅｓｔｅｒ-ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｐｏｌｙ(ＤＬ-lａｃｔｉｃ-ｃｏ-ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ) (ＰＬＧＡ)等が挙げられ、生分解性ポリマーの分解速度による薬物放出量の制御や薬物の運搬性及び生体による利用効率（バイオアベイラビィリティ）の観点より、ＰＬＧＡ又はＰＬＡが好ましく、ＰＬＧＡがより好ましい。
【００１６】
前記疎水性粒子の粒径は、１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲とすることで、脳血管内皮細胞表面に存在しているクラスリン被覆ピット (サイズ：１００ｎｍ〜１５０ｎｍ)やカベオラ被覆ピット（サイズ：５０ｎｍ〜８０ｎｍ）を介したエンドサイトーシスが容易となるため好ましい。
【００１７】
前記疎水性粒子が、金属ナノ粒子である場合には、その粒径は１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、肝臓における非特異的な蓄積の低減の観点から、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
【００１８】
前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーである場合には、その粒径は１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーである場合には、その粒径は、生体に存在する粒径５ｎｍ〜１５ｎｍの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）や粒径１８ｎｍ〜２８ｎｍの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ）と同等サイズであるとの観点から、１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００１９】
疎水性粒子の粒径は、疎水性粒子の種類に応じた公知の方法により、適宜所望の大きさに調整することができる。例えば、金ナノ粒子の場合には、塩化金酸塩溶液の還元によるファラデー法などにより、粒径を調整することが可能である。
本明細書において、粒径とは、特に断らない限り、平均粒子径を表す。平均粒子径は、ＴＥＭ（日本電子社製）等により、任意に５００個の粒子を選択して、個別に粒子サイズを測定して、その測定値の算術平均値をとったものである。
【００２０】
なお、前記疎水性粒子の製造方法としては、疎水性粒子の種類に応じた公知の方法を使用し、製造することができる。
例えば、金ナノ粒子は、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ. １９８２, １２０, ４３５−４５５などに記載の方法により製造することができる。
また、生分解性ポリマーであるＰＬＧＡは、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０１０, ２６(２２), １６９５８−１６９６２などに記載の方法により製造することができる。
また、本発明において疎水性粒子は、市販されているものを使用することもできる。
【００２１】
＜リン脂質＞
本発明にかかる複合粒子には、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質が含まれる。
リン脂質としては、グリセロールを骨格とするグリセロリン脂質やスフィンゴシンを骨格とするスフィンゴリン脂質である限り、特に制限はなく、公知のものを利用することができる。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジル酸、ホスファチジルグリコシド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン等が挙げられ、リポタンパク質を構成する代表的なリン脂質であることの観点より、ホスファチジルコリンが好ましい。
【００２２】
本発明にかかる複合粒子には、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質が含まれる。また、臨界ミセル濃度としては０．５μｇ／ｍｌ〜８．０μｇ／ｍｌが好ましく、１．０μｇ／ｍｌ〜６．０μｇ／ｍｌがより好ましく、２．０μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌがさらに好ましい。
リン脂質の臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満である場合には、疎水性粒子表面を十分に被覆することができず、１０μｇ／ｍｌより高い臨界ミセル濃度を用いた場合には、リン脂質の水溶性が高すぎるため、疎水性粒子表面にリン脂質が吸着しない。
また、リン脂質の臨界ミセル濃度を２．０μｇ／ｍｌ以上とすることで、リン脂質の疎水性粒子表面被覆率が１００％となるため好ましい。
前記リン脂質は、複合粒子の全質量に対して０．２質量％〜２０質量％含まれていることが好ましく、リン脂質による疎水性粒子の表面被覆率という観点より、２．０質量％〜２０質量％含まれていることがより好ましい。
【００２３】
＜アポリポタンパク質＞
本発明にかかる複合粒子には、アポリポタンパク質が含まれる。
本発明にかかる複合粒子に含まれるアポリポタンパク質としては、血漿アポリポタンパク質である限り、特に制限はなく、公知のものを利用することができる。具体的には、アポリポタンパク質-Ａ１〜４、アポリポタンパク質-Ｂ４８、アポリポタンパク質-Ｂ１００、アポリポタンパク質-Ｃ１〜３、アポリポタンパク質-Ｄ、アポリポタンパク質-Ｅ２〜４、アポリポタンパク質-Ｊ等が挙げられ、脳神経変性疾患治療薬や医薬組成物及び造影補助試薬を提供することの観点より、アポリポタンパク質-Ａ１、アポリポタンパク質-Ｂ１００又はアポリポタンパク質-Ｅ４が好ましく、中でも、アポリポタンパク質-Ｂ１００がより好ましい。
【００２４】
アポリポタンパク質は、上記アポリポタンパク質のうち、１種単独のアポリポタンパク質を含んでいてもよく、２種以上のアポリポタンパク質を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明にかかる複合粒子には、脳組織の特異的な領域への蓄積という観点から、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質が含まれ、より好ましくは１．０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質が含まれ、１．０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質が含まれることがさらに好ましい。
前記アポリポタンパク質は、複合粒子の分散物の全質量に対して０．２質量％〜２０質量％含まれていることが好ましく、２．０質量％〜２０質量％含まれていることがより好ましく、２．０質量％含まれていることがさらに好ましい。
２．０質量％〜２０質量％の範囲とすることで、脳組織内の特定領域への局在化が可能であり、好ましい。
【００２６】
本発明にかかる複合粒子は、疎水性粒子を核として、該疎水性粒子の表面をリン脂質が被覆している。該リン脂質は、該疎水性粒子上に層（以下、「リン脂質層」ともいう）を形成する。該リン脂質層は、単層であっても複数層であってもよいが、複合粒子の調製が容易であることの観点より、単層である場合が好ましい。
【００２７】
アポリポタンパク質は、機能を損なわない限り複合粒子中の如何なる領域に存在していてもよい。例えば、リン脂質層中に、アポリポタンパク質の一部が入り込んでもよいし、リン脂質層の外側、すなわち複合粒子の表面に存在してもよい。複合粒子は、脳組織内の特定領域への局在化を可能とすることの観点より、その表面にアポリポタンパク質を有している場合が好ましい。
【００２８】
本発明にかかる複合粒子の粒径は、１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましく、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２７ｎｍであることがさらに好ましい。
１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲とすることで、脳血管内皮細胞表面に存在しているクラスリン被覆ピット(サイズ：１００ｎｍ〜１５０ｎｍ)やカベオラ被覆ピット(サイズ：５０ｎｍ〜８０ｎｍ) を介したエンドサイトーシスが容易であり好ましい。
【００２９】
＜その他の成分＞
本発明にかかる複合粒子に含まれるその他の成分としては、前記疎水性粒子、前記リン脂質及び前記アポリポタンパク質の他に、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。
他の成分としては、脂肪酸、ラベル用試薬、タンパク質、脂溶性ビタミン、コレステロール、中性脂肪 (トリグリセリド)、ホルモン、糖鎖、遺伝子、薬剤等が挙げられる。
脂肪酸としては、リノール酸、α-、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等が挙げられ、脳神経機能の維持及び促進の観点から、アラキドン酸やドコサエキサエン酸等が好ましい。
【００３０】
ラベル用試薬としては、蛍光物質、放射線標識化合物、核磁気共鳴画像用造影剤などが挙げられ、蛍光顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡、二光子顕微鏡、質量顕微鏡、電子顕微鏡、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）等を用いた顕微観察の用途に用いることができる。
タンパク質としては、ＢＢＢ透過性の能力を持つアルブミン、トランスフェリン、成長因子等が挙げられる。
ビタミンとしては、ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等が挙げられ、脳神経機能の維持・促進の用途に用いることができる。
前記その他の成分は、複合粒子の核の部分、リン脂質層又は複合粒子の表面のいずれに存在してもよい。例えば、他の成分がラベル用試薬である蛍光物質などの場合には、リン脂質及びアポリポタンパク質に結合して存在しても、複合粒子の表面に存在してもよい。
【００３１】
（薬剤）
本発明にかかる複合粒子としては、前記疎水性粒子が、前記生分解性ポリマーであり、かつ該生分解性ポリマーが薬物を内包している場合が挙げられる。
生分解性ポリマーに内包される薬剤としては、人体に対して何らかの治療効果を奏する物質であれば特に制限はなく、神経変性疾患治療剤、抗がん剤、精神疾患治療剤（抗うつ剤等）などが挙げられ、神経変性疾患治療剤又は精神疾患治療剤が好ましく、本発明にかかる複合粒子の脳領域への局在性の観点より、神経変性疾患治療剤がより好ましい。
神経変性疾患治療剤としては、アルツハイマー型認知症治療剤、パーキンソン症候群治療剤及び脊髄小脳変性症治療剤などが挙げられ、具体的には、脂溶性ビタミン；ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等、脂肪酸；リノール酸、α-、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等、ドネペジル塩酸塩(アリセプト（登録商標）)などが挙げられる。
【００３２】
抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤などが挙げられ、具体的には、テモゾロミド (テモダール（登録商標）) 、ニムスチン (ニドラン（登録商標）)、エノシタビン(サンラビン（登録商標）)などが挙げられる。
抗うつ剤としては、三環系抗うつ剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、脂溶性ビタミン；ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等、脂肪酸；リノール酸、α-,γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等が挙げられる。
【００３３】
本発明における薬剤としては、上記薬剤は、１種単独でもよく、２種以上であってもよい。
本発明における薬剤の含有量は、特に制限はなく、各薬剤の有効投与量により適宜設定できる。例えば、薬剤としてビタミンＡ１を用いる場合には、疎水性粒子である生分解性ポリマーに対して、５．０×１０−５質量％〜５．０×１０−４質量％であることが好ましい。
【００３４】
本発明において、薬剤はどのような形で複合粒子に含まれていてもよいが、好ましくは生分解性ポリマーに内包されている。
本発明において、上記薬剤を、生分解性ポリマーに内包させる方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、ＡＣＳ ＮＡＮＯ. ２００８, ２（８）, １６９６−１７０２等に記載の方法に従い、生分解性ポリマーに薬剤を内包させることができる。
【００３５】
＜水性相を構成する成分＞
水性相を構成する成分としては、水、生理食塩水、エタノール等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種以上を混合して使用してもよい。溶媒としては、生体組織を傷つけないなどの観点より、生理食塩水がより好ましい。
【００３６】
本発明の分散物を得る方法のうち、好ましい方法としては以下に述べる製造方法が挙げられる。
≪分散物の製造方法≫
本発明にかかる複合粒子の分散物は、疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製すること（以下、「リン脂質被覆粒子調製工程」ともいう。）と、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合すること（以下、「混合工程」ともいう。）とを含む製造方法により製造することができる。
本発明にかかる複合粒子の分散物の製造方法は、リン脂質被覆粒子調製工程と、混合工程とを含むことにより、簡便で効率のよい複合粒子の製造方法を提供しうるものである。
【００３７】
＜リン脂質被覆粒子調製工程＞
本発明にかかる複合粒子の分散物の製造方法は、疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製するリン脂質被覆粒子調製工程を含む。
リン脂質被覆粒子調製工程においては、疎水性粒子表面におけるリン脂質の自己集合の原理を利用することで、リン脂質被覆粒子を調製することが可能である。
【００３８】
疎水性粒子の粒径は、好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍであり、１ｎｍ〜５０ｎｍであることがより好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。
疎水性粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であれば、疎水性粒子表面のリン脂質の被覆率の制御が容易であり好ましい。
疎水性粒子の種類や好ましい範囲等は、前記複合粒子を構成する成分について記載した疎水性粒子と同様のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。
【００３９】
リン脂質の臨界ミセル濃度は０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである。
リン脂質の臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満である場合には、疎水性粒子表面を十分に被覆することができず、１０μｇ／ｍｌより高い臨界ミセル濃度を用いた場合には、リン脂質の水溶性が高すぎるため、疎水性粒子表面にリン脂質が吸着しない。
【００４０】
なお、上記臨界ミセル濃度は、リン脂質のアシル基の長さにより適宜、上記範囲内において、最適の値に変更することができる。例えば、リン脂質としてホスファチジルコリン（ＰＣ）を用いた場合、アシル基の長さと臨界ミセル濃度との関係としては、ＰＣ（１０：０／１０：０）の場合には、２．０μｇ／ｍｌ〜６．０μｇ／ｍｌであり、ＰＣ（１２：０／１２：０）の場合には、０．１μｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌである。
ここで、ＰＣ（１０：０／１０：０）とは、ホスファチジルコリン中における２本のアシル基が飽和状態であり、該アシル基の炭素数が１０であることを意味する。
【００４１】
本明細書において、臨界ミセル濃度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法に従い測定する。溶媒はメタノール、クロロホルム及び純水（ｐｐｂレベル）の混合液である。
リン脂質の種類や好ましい範囲等は、前記複合粒子を構成する成分について記載したリン脂質と同様のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。
【００４２】
前記疎水性粒子及び前記リン脂質を混合する際の温度としては、特に制限はされないが、３５℃〜３７℃が好ましい。また、リン脂質被覆粒子調製工程の際には、約１分間のボルテックを必要とする。調整する時間としては、特に制限はされないが、３時間〜１２時間が好ましい。また、疎水性粒子分散水溶液に既にクエン酸ナトリウムなどの分散安定剤が付加されている場合には、疎水性粒子を一度遠心し沈殿させ、その上澄みを純水に交換することが好ましい。
【００４３】
＜混合工程＞
本発明にかかる複合粒子の分散物の製造方法は、前記リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合する混合工程を含む。
【００４４】
アポリポタンパク質の添加量は、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであり、脳組織内の特定領域への蓄積の観点より１．０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであることがより好ましく、さらに好ましくは１．０μｇ／ｍｌである。
アポリポタンパク質の種類や好ましい範囲等は、前記複合粒子を構成する成分について記載したアポリポタンパク質と同様のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。
【００４５】
本発明における混合工程において、温度は特に制限はされないが、３５℃〜３７℃が好ましい。また、混合工程の際にはボルテックを必要としない。混合時間としては、特に制限はされないが、３時間〜５時間が挙げられる。
【００４６】
なお、疎水性粒子である生分解性ポリマーに薬剤が内包されている場合には、例えば、前記リン脂質被覆粒子調製工程の前に、生分解性ポリマーに薬剤を内包する薬剤内包工程を含んでいてもよい。
薬剤内包工程としては、公知の方法を利用することができ、例えば、ＡＣＳ ＮＡＮＯ. ２００８, ２（８）, １６９６−１７０２等に記載の方法に従い、生分解性ポリマーに薬剤を内包させることができる。
【００４７】
さらに、別の態様として、本発明は、疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製すること（以下、「リン脂質被覆粒子調製工程」ともいう。）と、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合すること（以下、「混合工程」ともいう。）とを含む製造方法により得られる複合粒子を提供する。
【００４８】
疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製するリン脂質被覆粒子調製工程と、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合する混合工程とは、前記複合粒子の製造方法に記載のリポタンパク質作製工程及び混合工程と同義であり、好ましい範囲等も同様である。
【００４９】
≪脳神経変性疾患治療薬≫
本発明の脳神経変性疾患治療薬は、疎水性粒子である生分解性ポリマーと、該生分解性ポリマーに内包された薬剤と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を有効成分として含有する。
また、本発明における別の態様としては、疎水性粒子である生分解性ポリマーと、該生分解性ポリマーに内包された薬剤と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を患者に投与することを含む脳神経変性疾患の診断及び治療の方法を提供しうる。
本発明の脳神経変性疾患治療薬は、疎水性粒子である生分解性ポリマーと、該生分解性ポリマーに内包された薬剤と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を有効成分として含有することにより、脳内への移行性が良好で、優れた治療効果を発揮しうる、脳神経変性疾患治療薬を提供しうるものである。
【００５０】
脳神経変性疾患としては、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症候群及び脊髄小脳変性症が挙げられる。
【００５１】
薬剤としては、神経変性疾患治療剤が挙げられる。
神経変性疾患治療剤としては、アルツハイマー型認知症治療剤、パーキンソン症候群治療剤及び脊髄小脳変性症治療剤などが挙げられ、具体的には、脂溶性ビタミン；ビタミンＡ１、ビタミンＤ２、ビタミンα-、β-、γ-、δ-Ｅ等、脂肪酸；リノール酸、α-、γ-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサエキサエン酸等、ドネペジル塩酸塩 (アリセプト（登録商標）)などが挙げられ、脳神経機能の恒常性の維持及び促進の観点より、脂溶性ビタミン又は脂肪酸が好ましい。
【００５２】
本発明の神経変性疾患治療薬の有効成分である分散物における前記複合粒子の含有量は、用途により適宜設定しうるが、治療効果の観点より、例えば、前記複合粒子を、分散物全量に対して、好ましくは１質量％〜１０質量％含有する。
本発明の神経変性疾患治療薬の有効成分である分散物における薬剤の含有量は、特に制限はなく、各薬剤の有効投与量により適宜設定できる。例えば、薬剤としてビタミンＡ１を用いる場合には、疎水性粒子である生分解性ポリマーに対して、５．０×１０−５質量％〜５．０×１０−４質量％であることが好ましい。
【００５３】
生分解性ポリマー、リン脂質及びアポリポタンパク質については、本発明の神経変性疾患治療薬の効果を損なわない範囲において、前記複合粒子を構成する成分について記載した全ての事項が適用される。
【００５４】
≪医薬組成物≫
本発明の医薬組成物は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有する。
本発明の医薬組成物は、疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有することにより、脳内への移行性が良好で、副作用の発現頻度を抑制しうる医薬組成物を提供しうるものである。
【００５５】
本発明の医薬組成物における前記複合粒子の含有量は、用途により適宜設定しうるが、治療効果の観点より、例えば、前記複合粒子を、医薬組成物の全固形分に対して、好ましくは１質量％〜１０質量％含有する。
本明細書において、全固形分とは、医薬組成物中、溶液や生理食塩水を除いた、全成分の合計含量のことである。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、神経変性疾患治療、抗がん治療、精神疾患治療（抗うつ治療等)等の各種疾患の治療のために使用することができる。
具体的には、薬学上許容しうる担体（希釈剤、溶解補助剤など）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤の形態で、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、疎水性粒子や該疎水性粒子である生分解性ポリマーに内包された薬剤の種類や活性により、最適な投与量を決定することができる。例えば薬剤として、ビタミンＡ１を生分解性ポリマーに内包する場合を例に取れば、投与量はビタミンＡ１量として５ｍｇ／ｋｇ〜１７０ｍｇ／ｋｇが好ましい。
【００５７】
疎水性粒子、リン脂質及びアポリポタンパク質については、本発明の医薬組成物の効果を損なわない範囲において、前記複合粒子を構成する成分について記載した全ての事項が適用される。
【００５８】
≪造影補助試薬≫
本発明の造影補助試薬は、疎水性粒子としてのラベル用疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有する。
本発明の造影補助試薬は、疎水性粒子としてのラベル用疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物を含有することにより、ＢＢＢ透過性が良好で、脳の恒常性の変化（脳の自己組織化）が生じていると考えられる領域の特定などに有用な造影補助試薬を提供しうるものである。
【００５９】
本発明の造影補助試薬は、疎水性粒子としてのラベル用疎水性粒子を含む。前記ラベル用疎水性粒子としては、蛍光顕微鏡、レーザー共焦点顕微鏡、二光子顕微鏡、質量顕微鏡、電子顕微鏡、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ)、機能的核磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）等により画像解析が可能なコントラスト像を生じさせる、公知のもの全てが挙げられる。中でも、金属ナノ粒子、ラベル用試薬を内包する生分解性ポリマー、量子ドット等が良好な画像化能を有する観点より好ましい。
【００６０】
前記ラベル用試薬を内包する生分解性ポリマーにおける、ラベル用試薬としては、各種顕微観察技術でコントラスト像を生じさせるものであれば、特に限定されない。例えば、蛍光色素（例えば、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ＣＭ-ＤｉＩ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ-４８８、-５９４（登録商標）等）、放射線標識化合物（例えば、Ｉｎ-１１１、Ｔｃ-９９ｍ、Ｉ-１２３、Ｉ-１２５ Ｆ-１８、Ｇａ-６７、Ｇａ-６８等）、不対スピン原子又はフリーラジカル（例えば、Ｆｅ、ランタイド類（ｌａｎｔｈｉｄｅｓ）、Ｇｄ等）及び核磁気共鳴画像用造影剤（例えば、キレート化した（ＤＴＰＡ）マンガン等）等が挙げられる。
また、前記ラベル用試薬は、ラベル用疎水性粒子としての生分解性ポリマーに内包されるだけではなく、該生分解性ポリマーとは独立して、造影補助試薬に含有されていてもよい。造影補助試薬にかかる複合粒子の分散物が、ラベル用疎水性粒子として金属ナノ粒子や、量子ドットの他に、さらに、前記ラベル用試薬を含んでいる態様も本発明の造影補助試薬に含まれる。
【００６１】
本発明にかかる造影補助試薬が、疎水性粒子に加えてさらにラベル用試薬を含む場合の製造方法について、ラベル用試薬が蛍光色素である場合を例に挙げて簡単に説明する。すなわち、本発明におけるリン脂質被覆粒子調製工程後に、該リン脂質被覆粒子が含まれる溶液に、適当量の蛍光色素を添加し、該蛍光色素で表面がラベルされたリン脂質被覆粒子と、アポリポタンパク質とを混合して、造影補助試薬を得ることもできる。
なお、本発明の造影補助試薬の製造方法はこれに制限されるものではなく、公知の方法を利用することができる。
【００６２】
疎水性粒子、リン脂質及びアポリポタンパク質については、本発明の造影補助試薬の効果を損なわない範囲において、前記複合粒子を構成する成分について記載した全ての事項が適用される。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
＜実施例１＞ 複合粒子（分散物）の調製
平均粒径２０ｎｍのコロイド状金ナノ粒子（Ｇ１６５２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように、クエン酸ナトリウムなどの分散安定剤を遠心し除去した後、純水（ｐｐｂレベル）に分散させた。また、３５℃の純水（ｐｐｂ レベル）にＰＣ（１０：０／１０：０）（８５０３２５Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を、最終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した後、０．１μｍのカットオフ特性を持つ親水性メンブレンフィルターで、リポソーム及び凝集物を除去した。この調整したＰＣ溶液（臨界ミセル濃度２．８μｇ／ｍｌ）及びコロイド状金ナノ粒子溶液を混合し、３７℃で一晩攪拌 (約１０時間撹拌) することにより、コロイド状金ナノ粒子表面に１層のＰＣが吸着した、リン脂質被覆金ナノ粒子を得た。
【００６５】
次に、リン脂質被覆金ナノ粒子と、１．０μｇ／ｍｌに調整した蛍光物質(商品名Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ＣＭ-ＤｉＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製)とを３０分間反応させた後、１．０μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質(Ａ１、Ｂ１００又はＥ４)をリン脂質被覆金ナノ粒子に吸着させた。
最後に、３７℃、２０，０００×ｇで５分間の遠心を２回行い、上清を除いた沈殿を生理食塩水によって再分散させた後に、０．１μｍのフィルターによって濾過して、複合粒子を得た。なお、リン脂質の複合粒子の全質量に対する含有量は４．５質量％である。
【００６６】
図１に実施例１にかかる複合粒子の作製手順を模式的に示す。
図１は、コロイド状の金ナノ粒子をリン脂質で被覆し、リン脂質被覆金ナノ粒子を調製し、その後、蛍光物質で該リン脂質被覆金ナノ粒子をラベルし、最後にアポリポタンパク質をリン脂質被覆金ナノ粒子に吸着させ、複合粒子を得る工程を模式化した図である。
【００６７】
作製したリン脂質被覆金ナノ粒子をＴＥＭにより観察した。また、各複合粒子の平均粒径を動的光散乱法 (ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ)により評価した。
【００６８】
図２は本実施例にかかるリン脂質被覆金ナノ粒子を観察したＴＥＭ像を示す。ＴＥＭで観察した結果、各複合粒子は、いずれも２０ｎｍの金ナノ粒子の表面に、３．３ｎｍの１層のＰＣが吸着した形状を示すことが明らかとなった。
また、ＤＬＳ測定の結果、各複合粒子の平均粒径は、それぞれ、５１＋／−０．０ｎｍ(複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１）)、３０＋／−１．９ｎｍ(複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）)、３８＋／−３．８ｎｍ(複合粒子（Ａｐｏ-Ｅ４）)であった。
【００６９】
＜実施例２＞ 複合粒子の脳血管内皮細胞への取り込み機構の解明
細胞培養培地（商品名ダルベッコイーグル培地、和光社製）に、１０％ウシ胎児血清（商品名Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、Ｂｉｏ Ｗｅｓｔ社製）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加して、マウスの脳組織由来の血管内皮細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ｂＥｎｄ．３）を培養した。培養は３７℃、５％ＣＯ２環境下で行なった。
細胞免疫化学的解析に供するために、ラット由来のコラーゲンでコーティングした１．１ｃｍ２のガラスプレートに、血管内皮細胞を播種し、２４ウェルプレート（面積１．５５×１．５５ｃｍ２、高さ１．７５ｃｍ）において、約２．５×１０４細胞／ｃｍ２のサブコンフルエンス状態まで培養させた。その後、前記細胞培養培地に、複合粒子の最終濃度が２．５μｇ／ｍｌとなるように、実施例１で調整した複合粒子を添加し、１時間、３時間、６時間又は１２時間培養して、各サンプルを得た。
その後、各サンプルをＰＢＳで２度洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定化し、１０ｎｇ／ｍｌのジギトニンで処理し、３％ ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でブロッキングした。１時間後、各サンプルを、Ｃｌａｔｈｉｒｎ ＨＣ Ｈ−３００（ｓｃ−９０６９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）又はＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （Ｃ-ｔｅｒｍ）（１９５６-１、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社製）のいずれかとともに４℃で一晩反応させた。続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ-４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ‐ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ａ１１０３４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を添加して反応させ、ビスベンズイミド Ｈ３３３４２ 三塩酸塩（商品名Ｂ２２６１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて核染色を行った。
【００７０】
図３は本実施例にかかる各複合粒子(Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４)の脳血管内皮細胞における時間経過に伴う取り込み量を示す。図３中、縦軸は複合粒子の血管内皮細胞への取り込み量（カウント／細胞）を示し、横軸は用いたサンプルの培養時間を示す。また、レーザー共焦点顕微鏡（ライカＳＰ−ＩＩ、ライカ社製）を用いて、１時間後、３時間後、６時間後及び１２時間後それぞれの処理時間における、各複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４）の血管内皮細胞への取り込み量の増加が確認された。
【００７１】
図４は、本実施例にかかる複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１）が脳血管内皮細胞のクラスリン被覆小胞（ＣＶ：Ｃｌａｔｈｒｉｎ Ｖｅｓｉｃｌｅ）内に存在しているところを観察したＴＥＭ像並びにレーザー共焦点顕微鏡（ライカＳＰ−ＩＩ、ライカ社製）像を示す。１２時間培養後の脳血管内皮細胞サンプルを観察した結果、各複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４）が、クラスリンにより被覆され、血管内皮細胞に取り込まれたことを見出した。また同様に、各複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００及びＡｐｏ-Ｅ４）は、ＬＤＬＲを介して血管内皮細胞内へ輸送されるものではないことも見出した。
【００７２】
これらの結果より、各複合粒子は、開口分泌されたクラスリン経路を介して、血液中から脳実質内に取り込まれる可能性があることが明らかとなった。
【００７３】
＜実施例３＞ 複合粒子の脳における自己組織化
５週齢のＣ５７ＢＬ/６Ｊ雄性マウスに、生理食塩水で希釈した２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌの各複合粒子 (Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４) 溶液１００μｌを、尾静脈より投与した。なお、コントロールには生理食塩水を使用した。
【００７４】
２４時間後、５０μｇ／ｍｌのペントバルビタールを腹腔内注射し、麻酔下で切開し、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水で毎分１ｍｌの流速で血液を灌流し、４％パラホルムアルデヒド溶液で脳組織を固定した。固定後、５％スクロースで脱水し、矢状方向に半割した脳試料を厚さ約１０μｍでミクロトームを用い連続切片を作製した。メタノール洗浄により自家蛍光を持つ付着物を除去したスライドガラスに固定化し、蛍光顕微鏡による観察に供した。
【００７５】
図５は各複合粒子 （Ａｐｏ-Ａ１、Ａｐｏ-Ｂ１００、Ａｐｏ-Ｅ４）の脳組織内における分布図を示す。また、脳組織領域別における各複合粒子の蓄積度合を比較した結果、複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）は、複合粒子（Ａｐｏ-Ａ１或いはＡｐｏ-Ｅ４）に比べ、大脳皮質、線条体、小脳及び海馬に局在化することが可能であった。
【００７６】
図６は脳連続切片（１００枚）における複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳神経細胞数を示す。コントロールは生理食塩水を投与した。エラーバーは各群マウス３匹あたりの標準偏差であり、 図６中、＊Ｐ＜０．０００５はＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用い示した。この結果、複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）は、統計学的解析より確実にＢＢＢ透過性能を持っていることが証明された。
【００７７】
図７及び図８は複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）を取込んだ脳組織領域別における脳神経細胞数を示す。
この結果、複合粒子（Ａｐｏ-Ｂ１００）は、小脳及び終脳の特定領域に局在化することが可能であった。
【００７８】
以上の結果より、本発明にかかる複合粒子は、ＢＢＢ透過性が良好であるとともに、脳組織内の特定領域への局在化が可能であることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物。
【請求項２】
前記複合粒子がアポリポタンパク質を表面に有する請求項１に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項３】
前記リン脂質の複合粒子の全質量に対する含有量が、０．２質量％〜２０質量％である請求項１又は請求項２に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項４】
前記アポリポタンパク質が、０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの量で含まれる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項５】
前記アポリポタンパク質が、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ１００及びアポリポタンパク質Ｅ４からなる群より選ばれる少なくとも１種のアポリポタンパク質である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項６】
前記疎水性粒子が、金属ナノ粒子又は生分解性ポリマーである請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項７】
前記疎水性粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項８】
前記複合粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項９】
前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーであり、かつ該生分解性ポリマーが薬剤を内包している請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項１０】
請求項９に記載の複合粒子を有する分散物を有効成分として含有する脳神経変性疾患治療薬。
【請求項１１】
脳神経変性疾患が、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症候群及び脊髄小脳変性症からなる群より選ばれる少なくとも１種の疾患である請求項１０に記載の脳神経変性疾患治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物を含有する造影補助試薬。
【請求項１４】
疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む複合粒子を有する分散物の製造方法。
【請求項１５】
疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む製造方法により得られる複合粒子を有する分散物。
【請求項１】
疎水性粒子と、臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質と、アポリポタンパク質と、を含む複合粒子を有する分散物。
【請求項２】
前記複合粒子がアポリポタンパク質を表面に有する請求項１に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項３】
前記リン脂質の複合粒子の全質量に対する含有量が、０．２質量％〜２０質量％である請求項１又は請求項２に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項４】
前記アポリポタンパク質が、０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの量で含まれる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項５】
前記アポリポタンパク質が、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ１００及びアポリポタンパク質Ｅ４からなる群より選ばれる少なくとも１種のアポリポタンパク質である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項６】
前記疎水性粒子が、金属ナノ粒子又は生分解性ポリマーである請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項７】
前記疎水性粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項８】
前記複合粒子の粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍである請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項９】
前記疎水性粒子が、生分解性ポリマーであり、かつ該生分解性ポリマーが薬剤を内包している請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物。
【請求項１０】
請求項９に記載の複合粒子を有する分散物を有効成分として含有する脳神経変性疾患治療薬。
【請求項１１】
脳神経変性疾患が、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症候群及び脊髄小脳変性症からなる群より選ばれる少なくとも１種の疾患である請求項１０に記載の脳神経変性疾患治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の複合粒子を有する分散物を含有する造影補助試薬。
【請求項１４】
疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む複合粒子を有する分散物の製造方法。
【請求項１５】
疎水性粒子及び臨界ミセル濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌのリン脂質を混合してリン脂質被覆粒子を調製することと、該リン脂質被覆粒子及びアポリポタンパク質を混合することとを含む製造方法により得られる複合粒子を有する分散物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−３５７９３（Ｐ２０１３−３５７９３Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７４３２３（Ｐ２０１１−１７４３２３）
【出願日】平成２３年８月９日（２０１１．８．９）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月９日（２０１１．８．９）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
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