【課題】前癌と癌細胞用のマーカー、及び前記細胞の増殖阻害方法の提供。
【解決手段】正常、前癌又は癌細胞の中で異なった形で発現するキメラＲＮＡと称されるヒトミトコンドリアＲＮＡの新規なファミリー。前記キメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド。研究用、癌診断及び癌治療用における、前記オリゴヌクレオチド又はその類似物の使用。前記オリゴヌクレオチドの、センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡでハイブリダイズすることによって、前記オリゴヌクレオチドをし、正常に増殖する細胞、前癌細胞及び癌細胞を識別する方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本発明の技術分野
本発明は、２００３年５月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６０／４７２１０
６の利益を主張する。
本発明は、ヒトのミトコンドリアキメラＲＮＡと称される、ヒトミトコンドリアＲＮＡ
の新規なファミリーに関連する癌治療法、癌診断及び研究試薬に関する。
特に、本発明は、ヒトミトコンドリアＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドに関する
。本発明のオリゴヌクレオチドは、癌細胞死を誘発するキメラＲＮＡにハイブリタイズす
る。本発明により提供される組成物と方法は、新規な癌治療として有効である。更に、こ
のオリゴヌクレオチドは、休止期及び増殖期の正常細胞、前癌および癌細胞においてミト
コンドリアキメラＲＮＡの発現が異なることに基づき癌と前癌細胞の診断に用いることが
できる。
【背景技術】
【０００２】
２．本発明の背景技術
２．１ ミトコンドリア
ミトコンドリアは、酸化性りん酸化反応により必須分子であるアデノシン三りん酸（Ａ
ＴＰ）を製造する細胞内小器官である。１６６５塩基対のヒトミトコンドリア（ｍｔＤＮ
Ａ）は、２つのリボゾームＲＮＡ、２２転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡｓ）、及び同じ数のポリペ
プチドをエンコードしている１３オープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）をエンコードし
ている（Clayton,Hum Reprod. Suppl 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Act
a,1410:103-123, 1999）。
Ｇ＋Ｔ塩基組成物の成分を基に、mtＤＮＡの２つの鎖は、ボイヤント密度（浮遊密度）
が異なり、セシウムクロライド勾配（gradient）を変性して（denaturating）分離される
。重鎖（又はＨ鎖）は、２つのリボゾームＲＮＡs(12Sと16S)、１４ｔＲＮＡs、並びに、
ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5、COXI、COX II、COX III、ATP6、ATP8及びCyt bに対応
する１２ポリペプチドをエンコードしている。
軽鎖（又はＬ鎖）は、８ｔＲＮＡｓ及びコンプレックスＮＡＤハイドロゼナーゼＮＳ６
をコードしている(Clayton,Hum Reprod. Suppl 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Bio
phys. Acta,1410:103-123, 1999)。
【０００３】
多くのmtＤＮＡは、置換ループ又はＤループと呼ばれる短い３つの鎖構造を含んでいる
。ヒトにおいて１,００６の塩基対である、この領域は、フェニルアラニンのtＲＮＡ(tRN
A^Phe)及びプロリンのtＲＮＡ(tRNA^Pro)の遺伝子に接しており、Ｌ鎖に相補してＨ鎖を置
換する短核酸鎖を含んでいる(Clayton, Hum Reprod. Suppl 2:11-17, 2000; Taanman, Bi
ochim. Biophys.Acta, 1410:103-123, 1999)。
この領域は、mtＤＮＡ発現のための主なコントロール・サイトとして発展しており、リ
ーデング鎖又は複製のＨ鎖起点、及びＨ鎖(HSP)とＬ鎖(LSP)の転写のための主なプロモー
ターを含んでいる。
ＨＳＰとＬＳＰ(約150bp)は隣接しているにもかかわらず、これらの調節要素は、ミト
コンドリア疾病を有する患者のモデルを利用するインビボ（体内）(Chinnery and Turnbu
ll, Mol. Med.Today, 6:425432, 2000)と同様に、インビトロ（体外）でも機能的に独立
である(Shueyand Attardi, J Biol Chem. 260:1952-1958, 1985; Taanman, Biochim. Bi
ophys. Acta,1410:103-123, 1999)。
【０００４】
双方の鎖は、ポリシトロンＲＮＡsとして転写され、これらはその後個々のmＲＮＡ、t
ＲＮＡ及びｒＲＮＡをリリースするためにプロセスされる(Taanman, Biochim. Biophys.
Acta,1410:103-123, 1999)。
ヒトでは、ミトコンドリアのＲＮＡポリメラーゼは、イースト・ミトコンドリアＲＮＡ
ポリメラーゼの配列、及びいくつかのバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと著しい
相同性を有する１,２３０のアミノ酸の蛋白質である(Tirantiら,Hum Mol Genet. 6:615-
625, 1997)。
更に、転写要因のファミリーは、哺乳類のmtＤＮＡ転写として本質的で、ＤＮＡ結合蛋
白の高移動性グループ(ＨＭＧ)-ｂｏｘファミリーのメンバーである、ミトコンドリア転
写因子Ａ又はＴＦＭＡなどで特徴づけらている(Parisi and Clayton, Science. 252:965-
969, 1991)。
最近、2つの独立した報告書で、ヒトおよびマウスにおける新規な転写因子ＴＦＢ１Ｍ
とＴＦＢ２Ｍの特徴について記述されている(McCulloch et al., Mol. Cell Biol. 22:11
16-1125, 2002;Falkenberg et al., Nat Genet. 31:289-294, 2002; Rantanen et al.,
Mamm Genome.14:1-6, 2003)。
mtＤＮＡ転写に包含されるcis-とtrans-活動因子についてなされた相当の進歩にもかか
わらず、機能の詳細については、十分には理解されていない。
【０００５】
２．２ ミトコンドリアおよびアポトーシス
ミトコンドリアは、細胞がよくコントロールされた又はプログラムされた方法で細胞が
死滅する基本的な生物学のプロセスである、アポトーシス（細胞死）における中心的な役
割を果たす。この細胞自殺プログラムは、進化の間、そして後生動物の成熟したホメオス
タシスには本質的である。アポトーシスは、不必要な、損傷した、突然変異した、そして
老化した細胞を撲滅するために活性化される(Meier et al., Nature 407:796-801, 2000)
。アポトーシスの不規則化（disregulation）は、いくつかの病理学の発表で示されてい
る。
このように、アポトーシスの異常な抑制は、腫瘍形成の特徴で、この場合、広範なアポ
トーシスが発作、敗血性ショック及び神経性変性不調（neurodegerative disorders）の
ような急性の疾病と関係づけられている。
現在、アポトーシスのプロセスは、外因性と内因性経路として知られている２つの主な
経路について述べられている(Zornig et al., Biochim.Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 20
01)。
外因性経路は、異なるリガンドが死のレセプターに結合することにより、細胞膜で開始
されるプロセスである(Krammer, Nature 407:789-795, 2000; Zornigら, Biochim. Bioph
ys. Acta,1551:F1-f37, 2001)。
【０００６】
カスパーゼは、アポトーシスにおいて蛋白分解性カスケードに関与する。カスパーゼは
、蛋白分解性成熟又はアポトーシス誘導プロセッシングを受ける不活性プレカーサーたん
ぱく質として合成される(Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)
。
しかしながら、より最近、いくつかの実験証拠は、リソソームプロテアーゼがアポトー
シス性損傷後に蛋白質分解の代替となる経路を構成することを示している(Guicciardi et
al.,Oncogene, 23:2881-2890, 2004)。
他方、ヒトのオンコプロテイン（癌タンパク）Ｂｃｌ-２に同種のアンチ−アポトーシ
ス性蛋白が記述されている。この蛋白は、アンチ−アポトーシス（Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w
）あるいはプロ−アポトーシス（Bax、Bak、Bim、Bid等）であるたんぱく質のファミリー
に属する(Zorninget al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
【０００７】
ミトコンドリアは、特にアポトーシス性プロセスの間の初期に影響を受ける、そして現
在、これらは、細胞死の中心的なコーディネーターとして認識されている(Boya et al.,
Biochem.Biophys. Res. Commun. 304:575-581, 2003; Ferri and Kroemer, Nature Cell
Biol.3:E255-E263, 2001; Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 20
01)。
いくつかのプロ−アポトーシスシグナルと損傷経路は、Ｂｃｌ-２蛋白の制御下にある
ミトコンドリア膜浸透、現象を誘発するミトコンドリアに集中する(Boya et al., Bioche
m. Biophys.Res. Commun. 304:575-581, 2003; Zornig et al., Biochim. Biophys. Act
a, 1551:F1-F37,2001)。
細胞がアポトーシス傷害を受けた後に、トランス−膜ポテンシャル(Dy_m )は、消失して
、外部のミトコンドリア膜の完全な浸透が起こり、そしてその結果、有害なミトコンドリ
ア内部膜蛋白の漏出が起こる。
ミトコンドリア蛋白質の漏出の最初の例は、シトクロムｃの放出であった(Liu et al.,
Apoptosis,6:453-462, 2001)。
シトクロムｃがサイトゾル中に存在すると、それは、アポプトゾームと名付けられた、
カスパーゼを活性化する錯体の組み立てを促進する。
シトクロムｃは、Ａｐａｆ-１(アポトーシスプロテアーゼ活性因子-1)に結合して、ｄ
ＡＴＯ／ＡＴＰの錯体への結合と、Ａｐａｆ-１のオリゴマー化を促進する(Adrain et al
., 1999;Benedict et al., 2000)。
Ａｐａｆ-１のオリゴマー化は、前駆体の蛋白質分解活性化を触媒するプロ-カスパーゼ
-９の補充と活性プロ-カスパーゼ-９の生成を可能にする(Adrainet al., J. Biol. Chem
.274:20855-20860, 1999; Benedict et al., J. Biol. Chem., 275:8461-8468, 2000)。
【０００８】
アポトーシス蛋白質の細胞基質抑制剤のファミリーは、記述されており、ＸＩＡＰ、c-
ＩＡＰ１及びc-ＩＡＰ２として知られている。これらの蛋白質は、処理されたカスパーゼ
-３及びカスパーゼ-９に結合して抑制し、そしてその結果、分解のカスケードを停止する
。しかし、細胞は、更にこのアンチ−アポトーシス経路をバイパスするための対抗メカニ
ズムを含んでいる。
アポトーシスを被る細胞において、カスパーゼは、Ｓｍａｃ(カスパーゼの第２のミト
コンドリアの活性剤)あるいはＤＩＡＢＬＯ(蛋白質をLowplに結び付けるDirect IAP)と
して知られている蛋白質のＩＡＰに結合することにより、この抑制の影響から解放される
(Verhagen etal., Apoptosis, 7:163-166, 2002)。
ＩＡＰに結合することによって、Ｓｍａｃ/ＤＩＡＢＬＯは、ＩＡＰから活性カスパー
ゼを置換し、その結果細胞死を促進する。
ＨｔｒＡ２として知られている他の蛋白質は、アポトーシス損傷後に、ミトコンドリア
から細胞基質に開放される、この場合、たんぱく質は、Ｓｍａｃ/ＤＩＡＢＬＯと同じ方
法でＩＡＰに結合する、そしてそれによりカスパーゼ活性を促進する(Verhagen et al.,
Apoptosis,7:163-166, 2002; Martins et al., 2001; Suzuki et al., Mol. Cell, 8:61
3-621, 2001;Hedge et al., Apoptosis, 7:123-132, 2002)。
【０００９】
アポトーシス誘発因子(AIF)は、アポトーシスカスケードの他の成分である。
アポトーシスの誘発後、ＡＩＦは、細胞基質と核に移動する。核では、ＡＩＦが周辺の
クロマチン凝縮およびＤＮＡ断片化（fragmentation）を引き起こす。ＡＩＦは、末梢の
クロマチル縮合とＤＮＡ断片化を誘発する。ＡＩＦは、更にDy_m消失とホスファチジルセ
リン露出のようなアポトーシスのいくつかの特徴を引き起こす(Zornig et al., Biochim.
Biophys. Acta,1551:F1-F37, 2001)。
ＡＩＦのアポトーシス活性を規制するように思われる因子は、熱ショック蛋白質70であ
る(Ravagnanet al., Nature Cell Biol. 3:839-843, 2001)。
ＡＩＦのように、ミトコンドリアを出て、核に移動する他のミトコンドリア因子は、エ
ンドヌクレアーゼＧ（endonuclease G）かエンドＧ（Endo G）である。
核では、エンドＧがカスパーゼ抑制剤の存在下でもＤＮＡ断片化を発生する(Li et al.,
Nature,412:95-99, 2001)。
エンドＧは、ＣＡＤ(カスパーゼに活性化されたＤＮＡse)のように、その活性化がカス
パーゼに極めて依存しているヌクレアーゼと同様の様式で作用する(Samejima et al., J.
Biol.Chem., 276:45427-45432, 2001)。
【００１０】
２．３ 癌および前癌
癌は、細胞の悪性疾患で、その独自の特徴、すなわち細胞サイクルの通常の制御を失っ
て不規則に成長し、分化が欠如し、及び他の細胞組織に進入して転移する。発癌は、正常
細胞が悪性細胞に変化することによるプロセスである。
発癌は、開始が遺伝的事象で始まり、その後に初期腺腫の形成が促進される期間に改変
された細胞が選択的に増加する多段階プロセスである。
連続的な発癌補助作用がないと、腺腫は消退して消滅する。
第二の遺伝的事象で、少量の発癌補助作用を受けた腺腫は、後発の腺腫形成が進行して
、その後悪性の変化をたどる(McKinnell et al., “The Biology Basis of Cancer”, Ch
. 3, 1998)。
【００１１】
癌の病因は複雑で、細胞サイクル規則の改変、染色体異常、及び染色体破損を含んでい
る。発癌性ウィルス、化学品、放射線（紫外線あるいは電離放射線)、及び免疫障害のよ
うなタイプの感染性因子は、発癌の主な原因であると考えられている(McKinnell et al.,
“TheBiological Basis of Cancer, Ch.3, 1998)。
【００１２】
癌もミトコンドリアの機能障害と関係のあることは長い間提案されてきた。
これらの理論のうちの1つは、ミトコンドリアの突然変異が細胞形質転換と癌の主要な
原因であるとする提案である(Warburg, 1956; Carew and Huang, Mol. Cancer, 1:1-12,
2002)。
ミトコンドリアＤＮＡ(mtＤＮＡ)の変質は、血液作用による腫瘍(Clayton and Vinogra
d, Nature,216:652-657, 1967)、及び乳癌(Tan et al., 2002; Parrella et al., 2001)
において報告されている。
いくつかの部位のmtＤＮＡの突然変異と欠失（deletions）は、また患者において、直
腸癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肝細胞性癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌および
脳腫瘍で明らかにされてきている(reviewd by Carew and Huang, Mol. Cancer, 1:1-12,
2002)。
一般的に、腫瘍タイプと関係のない癌において、mtＤＮＡ変質の２つの主な特徴がある
と推定される。大部分の突然変異は、ＴからＣとＧからＡへの塩基の転移である。第二に
、突然変異が生ずる特別の遺伝子における多様性はあるが、Ｄ−ループは、ほとんどの腺
腫タイプにおいてmtＤＮＡの最も頻繁な体細胞の突然変異領域になると思われる。
【００１３】
前癌とは、悪性細胞に進化または分化する形質転換細胞として定義される。いくつかの
例は、ＤＮＡまたはＲＮＡのオンコウィルスによって変化した細胞である。
本発明は、ミトコンドリアＲＮＡの新規なファミリー、及び診断法と癌治療を目標とし
てこれらのＲＮＡの使用に関する。
本発明は、組成物と方法を提供する、そしてこのことは、腫瘍細胞又は前悪性細胞もし
くは腫瘍形成ウィルスで変化した細胞と正常細胞とを区別するのに有用である。
特に、以下に詳述するように、本発明は、前癌及び癌細胞と正常細胞とを区別する診断
検査のための組成物と方法を提供する。
本発明の他の態様では、多くの又は選択的な癌細胞死を誘発するための組成物と方法が
提供される。それ故、本発明は、研究のみならず、癌および前癌の診断と治療に用いるこ
とが可能である、組成物及び方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
３．発明の概要
本発明は、正常な休止及び増殖する細胞、前癌細胞及び癌細胞において特異的に発現さ
れる、ミトコンドリアキメラＲＮＡと称される、新規なヒトミトコンドリアＲＮＡのファ
ミリーを検出するのに有用な組成物及び方法を対象とする。
【００１５】
３.１ センスミトコンドリアキメラＲＮＡ
本発明の１の態様において、１６ＳミトコンドリアリボゾームＲＮＡ（SEQ ID NO 1)の
５’末端に共有結合している８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列（inverted repeat）
を含むミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するための組成物及び方法が提供される。
この逆方向反復配列は、mtＤＮＡの１６Ｓ遺伝子のＬ−鎖から転写されるＲＮＡの８１
５ヌクレオチドのフラグメントに相当する。
このように、この新規なＲＮＡの合成は、mtＤＮＡの１６ＳのＬ―鎖とＨ−鎖の転写を
必要とする。mtＤＮＡの両鎖の転写は、異なるプロモーターに規制されるので、我々は、
ミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1)として、本発明におけるこの新規なＲＮＡに
ついて言及する。更に、８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列は“センス”１６ＳのＲＮ
Ａ（Ｈ−鎖から転写された）に結合されるので、我々は、“センスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ”として、この新規なＲＮＡについて言及する。
【００１６】
本発明は、培養細胞、細胞サンプル及び組織切片（tissue sections）におけるセンス
ミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を検出する組成物と方法を提供する。
この検出は、insituハイブリダイゼーション、対応するcＤＮＡの合成とＰＣＲによる
増殖、転写媒介増殖（transcription mediated amplification）（ＴＭＡ）(Comanor et
al., J. ClinVirol., 28:14-26, 2003)もしくはノーザンブロット、又は当技術分野の技
術者に自明である他の方法により行われる。
【００１７】
本発明の１の側面によると、in situ ハイブリダイゼーションアッセイは、センスミト
コンドリアキメラＲＮＡが正常の増殖期の細胞、異なる腫瘍型の人体生検に存在する腫瘍
細胞におけると同様に培養中の腫瘍細胞に発現することを示す。センスミトコンドリアキ
メラＲＮＡは、正常の休止期の細胞には発現しない。
本発明の他の態様によると、パピローマ・ウイルス（乳頭腫ウィルス）１６又は１８に
より形質転換（transform）した細胞中の第二の新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａを検出する方法と構成が提供される(Hausen, Biochim. Biophys. Acta, 1288:F55-F78,
1996)。
これらの形質転換した細胞において、１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に共有結
合している７５４ヌクレオチドの逆方向反復配列からなる、新規なセンスミトコンドリア
キメラＲＮＡが発現する（SEQ ID NO 2）。
このＲＮＡは、正常な増殖細胞中又は腫瘍細胞中には存在しない。本方法と組成物は、
また１６ＳミトコンドリアＲＮＡ（SEQ ID NO 3）の５’末端に共有結合している６９４
ヌクレオチドの逆方向反復配列からなる第三のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡがＨＴ
ＬＶ−１で形質転換した細胞中に存在することを実証する。
【００１８】
３.２ アンチセンスのミトコンドリアキメラＲＮＡ
本発明は、更に正常な増殖細胞がSEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6に対応する
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現することを示す方法と組成物を提供する
。
これらの転写産物は、１６ＳミトコンドリアリボゾームのＲＮＡ（Ｌ−鎖から転写され
た）の５’末端に結合している、それ故にアンチセンスのミトコンドリアＲＮＡ名である
、可変の長さ（Ｈ−鎖から転写された）の逆方向反復配列を含む。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現は、形質転換した又は前癌細胞中のみ
ならず、異なるタイプの腫瘍のヒト生検中に存在する腫瘍細胞中と同様に、増殖中の腫瘍
細胞系中で下方制御（down regulate）される。
従って、本発明は、通常の増殖細胞を癌細胞と前癌細胞から区別するセンスとアンチセ
ンスのミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を検出する方法と組成物を提供し、それ故に悪
性細胞と癌のための新規なマーカーを提供する。
【００１９】
３.３ 癌療法
本発明の他の態様では、方法と組成物は、センスとアンチセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡを阻害（interfere）するために提供される。
１つの好ましい態様は、低コピー数のこの転写産物を含む腫瘍細胞中のアンチセンスの
ミトコンドリアキメラＲＮＡを阻害することである。この阻害は、その配列がアンチセン
スのミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4及び／又はSEQ ID NO 5 及び／又は SEQ I
D NO 6)の配列に相補している、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を用
いて行われる。１又はそれ以上のこれらの相補的なオリゴヌクオチドを用いた異なるタイ
プの腫瘍細胞の処理は、細胞死又はアポトーシスを誘発する。
【００２０】
これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５核酸塩基がSEQ ID NO 4及び／又はSEQ
ID NO 5及び／又はSEQID NO 6に相補する１５ないし５０のヌクレオチドの合成物であ
る。
これらの相補的なオリゴヌクレオチドの例は、SEQ ID NOS 9〜98の中で示される。
ヒトリンパ球（正常な休止細胞）又はフィトヘムアグルチニン（植物性血球凝集素）で
活性化されたヒトリンパ球(正常な増殖細胞)の処理は、アンチセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡの配列に相補するオリゴヌクレオチドを用いて同条件で処理した後にはアポトー
シスを受けないので、アポトーシスの誘発は、選択的である。
もし、腫瘍細胞がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1及び／又はSEQ ID
NO 2及び／又はSEQ IDNO 3）を標的又は相補するオリゴヌクレオチドで処理すると、細
胞死又はアポトーシスの誘発が減じられる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
アンチセンスミトコンドリアキメラＤＮＡの分離された核酸分子であって、かつSEQ ID
NO 4、SEQID NO 5又はSEQ ID NO 6のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
（項目２）
項目1に記載のSEQID NO 4、SEQ ID NO 5又はSEQ ID NO 6のアンチセンスのミトコン
ドリアキメラＤＮＡに相補する、長さで１０ないし５０核酸塩基の合成物又はオリゴヌク
レオチド。
（項目３）
前記合成物又はオリゴヌクレオチドが、長さ１０から５０核酸塩基で、SEQ ID NOが９
から９８で構成されるグループから選択される配列の少なくとも１０核酸塩基部分を含む
、項目２に記載の合成物。
（項目４）
前記合成物又はオリゴヌクレオチドが、長さ１０から５０までの核酸塩基で、前癌およ
び癌細胞死を誘発する、SEQ ID NOが９から９８で構成されるグループから選択される配
列の少なくとも１０核酸塩基部を含む、項目２に記載の合成物。
（項目５）
前記オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5又はSEQ ID NO 6のアンチセンス
ミトコンドリアのキメラＲＮＡでハイブリダイズされて、前癌及び癌細胞死を誘発する、
項目２に記載の合成物。
（項目６）
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾されたインターヌクレオシド連鎖を含
む、項目２に記載の合成物。
（項目７）
前記修飾されたインターヌクレオシド連鎖がホスフォロチオエート、メチルホスフォネ
ート、ホスフォロジチオエート、ホスフォロトリエステル、ペプチド性核酸、及びロック
された核酸連鎖から構成されるグループから選択された、項目６に記載の合成物。
（項目８）
前記合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目２に記載の合成物。
（項目９）
前記修飾された糖部分が２’-Oメトキシエチル、２’-Oメチル及びモルフォリノ基から
構成されるグループから選択される、項目８に記載の合成物。
（項目１０）
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1の修飾された核酸塩基を含む、項目２に記載
の合成物。
（項目１１）
修飾された核酸塩基が５-メチルシトシンである、項目１０に記載の合成物。
（項目１２）
前記オリゴヌクレオチドが、ホスフォロチオエート連鎖で結合されたＤＮＡ残基を含む
キメラ核酸であり、該ＤＮＡ残基がホスフォロチオエート連鎖で共に結合された２’-Oメ
トキシエチル又は２’-OメチルＲＮＡ残基の少なくとも３つの残基により５’及び３’サ
イドで側面に位置されている、項目２に記載の合成物。
（項目１３）
前記合成物がリボザイムである、項目２に記載の合成物。
（項目１４）
前記合成物が低分子干渉ＲＮＡすなわちsiＲＮＡである、項目２に記載の合成物。
（項目１５）
センスミトコンドリアキメラＤＮＡの分離された核酸分子であって、かつSEQ ID NO 1
、SEQID NO 2又はSEQ ID NO 3のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目１６）
項目１５のSEQID NO 1、SEQ ID NQ.2又はSEQ ID NO 3のセンスミトコンドリアキメ
ラＤＮＡを標的とする、長さ１０から５０核酸塩基の合成物又はオリゴヌクレオチド。
（項目１７）
前記合成物又はオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO 99〜197から構成されるグループから
選択された配列の少なくとも１０核酸塩基部を含み、長さで５０核酸塩基以下である、請
求項１６に記載の合成物。
（項目１８）
前記合成物又はオリゴヌクレオチドが前癌又は癌細胞死を誘発するSEQ ID NO 99〜197
から構成されるグループから選択された配列の少なくとも１０核酸塩基部を含み、長さで
５０核酸塩基以下である、項目１６に記載の合成物。
（項目１９）
前記オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2又はSEQ ID NO 3のセンスミトコ
ンドリアキメラＤＮＡでハイブリダイズされていて、前癌又は癌細胞死を誘発する、請求
項１６に記載の合成物。
（項目２０）
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１の修飾されたインターヌクレオシド連鎖を含む
、項目１６に記載の合成物。
（項目２１）
前記修飾インターヌクレオシド連鎖がホスフォロチオエート、メチルホスフォネート、
ホスフォロジチオエート、ホスフォロトリエステル、ペプチド性核酸、及びロックされた
核酸連鎖から構成されるグループから選択された、項目２０に記載の合成物。
（項目２２）
前記合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目１６に記載の合成物。
（項目２３）
前記修飾された糖部分が２’-Oメトキシエチル、２’-Oメチル及びモルフォリノ基から
構成されるグループから選択されている、項目２３に記載の合成物。
（項目２４）
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1の修飾された核酸塩基を含む、項目１６に記
載の合成物。
（項目２５）
前記修飾された核酸塩基が５-メチルシトシンである、項目２４に記載の合成物。
（項目２６）
前記オリゴヌクレオチドが、ホスフォロチオエート連鎖で結合されたＤＮＡ残基を含む
キメラ核酸であり、該ＤＮＡ残基がホスフォロチオエート連鎖で結合された２’-Oメトキ
シエチル又は２’-OメチルＲＮＡ残基の少なくとも３つの残基により５’及び３’サイド
で側面に位置されている、項目１６に記載の合成物。
（項目２７）
前記合成物がリボザイムである、項目１６に記載の合成物。
（項目２８）
前記合成物が低分子干渉ＲＮＡ又はsiＲＮＡである、項目１６に記載の合成物。
（項目２９）
SEQID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSEQ ID NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ及び／又はSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2もしくはSEQ ID NO 3のセンスミトコンドリ
アキメラＲＮＡに相補する、長さ１０から５０核酸塩基の１以上のオリゴヌクレオチド、
並びに薬剤の受け入れ可能なキャリアー又は希釈剤を含む、薬剤組成物。
（項目３０）
前記キャリアー又は希釈剤が乳剤、リポソーム、浸透促進剤、界面活性剤、キレート試
薬、キャリアーを含む、項目２９に記載の薬剤組成物。
（項目３１）
経口、口腔、非経口もしくは直腸投与、又は吸入もしくは通気による肺投与用の、請求
項２９に記載の薬剤組成物。
（項目３２）
SEQID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSEQ ID NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ及び／又はSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2もしくはSEQ ID NO 3のセンスミトコンドリ
アキメラＲＮＡに相補する、長さ１０から５０核酸塩基の合成物で、癌もしくは前癌細胞
又は組織と接触させることを含む、細胞又は組織中における前癌又は癌細胞死の誘発方法
。
（項目３３）
SEQID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSEQ ID NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ及び／又はSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2もしくはSEQ ID NO 3のセンスミトコンドリ
アキメラＲＮＡに相補する、長さ１０から５０核酸塩基の２以上の合成物で、細胞又は組
織と接触させることを含む、細胞又は組織中における前癌又は癌細胞死の誘発方法。
（項目３４）
前癌又は癌細胞死を誘発することが可能である、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSE
Q ID NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ及び／又はSEQID NO 1、SEQ ID N
O 2もしくはSEQID NO 3のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補する、長さ１０から
５０核酸塩基の合成物の治療に有効な量をヒト又は動物に投与することを含む、前癌又は
癌を有する疑いのあるヒト又は動物の治療方法。
（項目３５）
SEQID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSEQ ID NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ及び／又はSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2もしくはSEQ ID NO 3のセンスミトコンドリ
アキメラＲＮＡに相補する、長さ１０から５０核酸塩基の２以上の合成物の治療に有効な
量をヒト又は動物に投与することを含む、前癌又は癌細胞死の誘発することが可能である
、前癌又は癌を有する疑いのあるヒト又は動物の治療方法。
（項目３６）
前記合成物又は複数の合成物が癌の治療に対して化学療法薬と併用して投与される、請
求項３４に記載の方法
（項目３７）
癌の化学療法薬治療の効能改善方法であって、前癌又は癌細胞死を誘発する、SEQ ID N
O 4、SEQ IDNO 5もしくはSEQ ID NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ及び
／又はSEQID NO 1、SEQ ID NO 2もしくはSEQ ID NO 3のセンスミトコンドリアキメラＲ
ＮＡに相補する、長さ１０から５０核酸塩基の合成物又は複数の合成物を化学療法薬治療
と併用して投与することを含む、改善方法。
（項目３８）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１つの修飾されたインターヌクレオシド連鎖
を含む、オリゴヌクレオチドである項目３２に記載の方法。
（項目３９）
前記修飾されたインターヌクレオシド連鎖がホスフォロチオエート、メチルホスフォネ
ート、ホスフォロジチオエート、ホスフォロトリエステル、ペプチド性核酸、及びロック
された核酸連鎖から構成されるグループから選択された、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目３２
に記載の方法。
（項目４１）
前記修飾された糖部分が２’-Oメトキシエチル、２’-Oメチル及びモルフォリノ基から
構成されるグループから選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
哺乳類の細胞において、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6のアンチセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡ及びSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3のセンスミトコン
ドリアキメラＲＮＡの存在又は不存在を決定することによる正常、前癌又は癌細胞を識別
するハイブリダイゼーション法であって、該方法は、下記ａ）ないしｃ）を含むハイブリ
ダイゼーション法。
ａ）サンプルを、少なくとも１つの検出可能なプローブが標的ミトコンドリアキメラＲＮ
Ａ配列にハイブリダイズするプローブとして、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSEQ ID
NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ及び／又はSEQID NO 1、SEQ ID NO 2
もしくはSEQID NO 3のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補する長さ１０から５０
核酸塩基の２又はそれ以上の独立して検出可能な又は標識された合成物と接触させる
ｂ）検出可能な合成物の標的配列へのハイブリダイゼーションの検出、同定、又は定量
ｃ）正常、前癌又は癌細胞における、センス及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａの異なる発現のパターンで得られた結果の相互の関連付けと比較
（項目４３）
個々に独立して検出可能なプローブがオリゴヌクレオチドである、項目４２に記載の
方法。
（項目４４）
前記プローブがＤＮＡ及び／又はＲＮＡの１０から５０残基のオリゴヌクレオチドを含
む、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記プローブがSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5
あるいはSEQID NO 6のＲＮＡの領域で少なくとも９５％がホモロジーである１０から５
０残基のオリゴヌクレオチドを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾されたインターヌクレオシド連鎖を含
む項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記修飾されたインターヌクレオシド連鎖がホスフォロチオエート、メチルホスフォネ
ート、ホスフォロジチオエート、ホスフォロトリエステル、ペプチド性核酸、及びロック
された核酸連鎖から構成されるグループから選択されている、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾された糖部分を含む、項目４８に記
載の方法。
（項目４９）
前記修飾された糖部分が２’-Oメトキシエチル、２’-Oメチル及びモルフォリノ基から
構成されるグループから選択されている、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記オリゴヌクレオチドが放射能、又はジゴキシゲニン、ビオチン、蛍光色素のグルー
プから選択されたハプテンで標識されている、項目４５に記載の方法。
（項目５１）
前記検出方法がアンチビオチン抗体、アンチジゴキシゲニン抗体及びアンチフルオレセ
イン抗体を含む、項目４２に記載の方法。
（項目５２）
前記抗体が抗体とアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼと接合している、請求
項５１に記載の方法。
（項目５３）
前記検出方法がストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ接合と増殖試薬を含む、
項目４２に記載の方法。
（項目５４）
センスミトコンドリアＲＮＡを標的にする前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識さ
れており、またアンチセンスミトコンドリアＲＮＡを標的にする前記アンチセンスミトコ
ンドリアＲＮＡが異なる発光の蛍光色素で標識されている、項目４２に記載の方法。
（項目５５）
前記検出方法が異なる蛍光色素の発光の検出を含み、蛍光顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡
、レーザースキャナ装置、又は流量血球計算器で検出される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記サンプルが正常な休止又は増殖細胞、培養下の前癌及び癌細胞のサンプルを含む、
項目４２に記載の方法。
（項目５７）
前記サンプルが癌を有する疑いのある患者からの細胞を含む、項目４２に記載の方法
。
（項目５８）
前記サンプルが固定された又は冷凍のヒトの生体からの組織切片である、項目４２に
記載の方法。
（項目５９）
前記サンプルが尿、肺洗浄、唾液、コロノサイト、血液塗抹標本、骨髄の塗抹標本、腹
水、血液、又はリンパ液循環転移細胞中に存在する細胞を含む、項目４２に記載の方法
。
（項目６０）
項目４２の方法による、正常なヒト増殖細胞及び形質転換又は悪性ヒト細胞を識別す
るのに有用なinsituハイブリダイゼーション用キットであって、下記Ａ）ないしｄ）を
含むキット。
ａ）センス及び／又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にする１又はそれ
以上の検出可能な、標識されたオリゴヌクレオチド
ｂ）標識検出のために接合された抗体試薬
ｃ）ハイブリダイゼーションと洗浄緩衝液
ｄ）固定されたヒト正常増殖細胞の１又はそれ以上のスライド、及び対照として、固定さ
れ形質転換された又は悪性ヒト細胞の１又はそれ以上のスライド
（項目６１）
前記オリゴヌクレオチドの標識がジゴキシゲニン、バイオチン、フルオレセインのグル
ープから選択されたハプテンを含む、項目６０のキット。
（項目６２）
前記検出方法がアンチビオチン抗体、アンチジゴキシゲニン抗体及びアンチフルオレセ
イン抗体を含む項目６０に記載のキット。
（項目６３）
前記抗体がアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼと接合した抗体である、請求
項６０に記載のキット。
（項目６４）
前記検出方法が抗ビオチン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体又は抗フルオレセイン抗体に対
する抗体と接合したアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、及び増殖試薬を含む
、項目６０に記載のキット。
（項目６５）
前記検出方法がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ接合及び増殖試薬を含む
、項目６０に記載のキット。
（項目６６）
前記増殖試薬がアルカリホスファターゼニトロブルーテトラゾリウム用基質又はペルオ
キシダーゼ用基質である、項目６０に記載のキット。
（項目６７）
サンプルの中にある細胞質、細胞核、及び細胞の核小体中のアンチセンス（SEQ ID NO
4、5及び6）又はセンス（SEQID NO 1、2及び3）ミトコンドリアキメラＲＮＡの細胞局在
化を決定するinsituハイブリダイゼーション法であって、下記ａ）とｂ）を含むin situ
ハイブリダイゼーション法。
ａ）サンプルを、少なくとも１つの検出可能なプローブが標識ミトコンドリアキメラＲＮ
Ａ配列にハイブリタイズするプローブとして、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5もしくはSEQ ID
NO 6のアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ及び／又はSEQID NO 1、SEQ ID NO 2
もしくはSEQID NO 3のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補する長さ１０から５０
核酸塩基の１又はそれ以上の独立して検出可能な合成物又は標識された合成物と接触させ
る
ｂ）検出可能な合成物の標的配列へのハイブリダイゼーションの検出、同定、又は定量
（項目６８）
項目６７の方法によるサンプルの中に存在する細胞質、細胞核、及び細胞の核小体中
のアンチセンス（SEQ ID NO 4,5及び6）又はセンス（SEQ ID NO 1、2及び3）ミトコンド
リアキメラＲＮＡの細胞局在化を決定するin situハイブリダイゼーション用キットであ
って、下記ａ）ないしｄ）を含むキット。
ａ）センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にする、標識された１又
はそれ以上の検出可能なオリゴヌクレオチド
ｂ）標識検出のために接合された抗体試薬
ｃ）ハイブリダイゼーションと洗浄緩衝液
ｄ）固定されたヒト正常増殖細胞の１又はそれ以上のスライド、及び対照として固定され
形質転換された又は悪性のヒト細胞の１又はそれ以上のスライド
（項目６９）
前記センス及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの検出、同定及び定量が以下
の手順のいずれかにより行われる、項目４２に記載の方法。
insituハイブリダイゼーション又は蛍光in situハイブリダイゼーション、ドットブロ
ット、ノーザンブロット及びＰＣＲによるｃＤＮＡ増殖又はＴＭＡによるＲＮＡ増殖
（項目７０）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１の修飾されたインターヌクレオシド連鎖を
含むオリゴヌクレオチドである、項目３３に記載の方法。
（項目７１）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１の修飾されたインターヌクレオシド連鎖を
含むオリゴヌクレオチドである、項目３４に記載の方法。
（項目７２）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１の修飾されたインターヌクレオシド連鎖を
含むオリゴヌクレオチドである、項目３５に記載の方法。
（項目７３）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目３３
に記載の方法。
（項目７４）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目３４
に記載の方法。
（項目７５）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目３５
に記載の方法。
（項目７６）
前記合成物又は複数の合成物が少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、項目３６
に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ、Ｂ及びＣは、SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2及びSEQ ID NO 3に相当するセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造を示す線画である。 矢印は、ピースによりＲＮＡを増殖するのに用いるプライマーの相対的位置を示す。 線の下部の矢印は、リバースプライマーで、線の先頭の矢は、フォワードプライマーである。プライマー１は、１６Ｓミトコンドリアの５’末端に隣接して位置付けされる。黒線は、センス１６Ｓミトコンドリアに相当する、一方、点線は、アンチセンス１６Ｓミトコンドリアに相当する。
【００２２】
【図２】図２は、図１Ａに示したプライマー１とプライマー３の間で得られた増殖産物を示すアガロースゲル電気泳動である。 増殖は、鋳型としてＳｉＨａ(癌細胞)、ＨＰＶ１６(HFK698)で形質転換されたヒト角化細胞、あるいはＨＴＬＶ-１で形質転換されたＢリンパ細胞を用いて、ＰＴ−ＣＲにより実行された。ＳｉＨａ細胞からのＲＮＡで、２１０ｂｐの1つの単一アンプリコンだけが得られ、SEQID NO 1のセグメントに相当する。ＨＰＶ１６で形質転換されたヒト角化細胞の全ＲＮＡにおいて、２１０ｂｐのアンプリコンに加えて、１５０ｂｐの２番目のアンプリコンが得られた、SEQ ID NO 2に相当する。 ＨＴＬＶ-１で形質転換された細胞からのＲＮＡで、２１０ｂｐ及び１５０ｂｐのアンプリコンに加えて、３番目のアンプリコンが得られ、SEQ ID NO 3に相当する。
【００２３】
【図３】図３は、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5及びSEQ ID NO 6に相当するアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造を示す線画である。矢印は、増殖に用いられたプライマーを示す。プライマー１は、アンチセンスの１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に隣接して位置付けされる。 これらの転写産物の配列を得るための方策は、図１に記載されたのと同様である。
【００２４】
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、培養液中でいくつかの腫瘍細胞を用いて行われたin situハイブリダイゼーション分析を示す。 細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされ、そしてジゴキシゲニンでラベル表示された(左パネル)。 更に、細胞は、ジゴキシゲニンでラベル表示されたアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブで並行してハイブリダイズされた（右パネル）。細胞系は左側で識別される。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、培養液中でいくつかの腫瘍細胞を用いて行われたin situハイブリダイゼーション分析を示す。 細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされ、そしてジゴキシゲニンでラベル表示された(左パネル)。 更に、細胞は、ジゴキシゲニンでラベル表示されたアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブで並行してハイブリダイズされた（右パネル）。細胞系は左側で識別される。
【００２５】
【図５Ａ】図５Ａは、異なる腫瘍細胞タイプに相当するヒトの生検のいくつかのセクションのin situハイブリダイゼーションである。 腫瘍セクションは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされ、ジゴキシゲニンでラベル表示された（左パネル）。 更に、並列の腫瘍セクションは、ジゴキシゲニンでラベル表示されたアンチセンスセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされた（右パネル）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ジゴキシゲニンでラベル表示されたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われた、異なるヒト腫瘍細胞のin situハイブリダイゼーションである。
【００２６】
【図６】図６は、正常増殖細胞のin situハイブリダイゼーションである。 サンプルは、センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にしたプローブでハイブリダイズし、ジゴキシゲニンでラベル表示された。 強いハイブリダイゼーションシグナルは、双方のプローブで得られた、１つはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補し（左パネル）、同様に他はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補する（右パネル）。 組織あるいは細胞は、左側で識別される。
【００２７】
【図７】図７は、ミトゲンＰＨＡで増殖するために刺激されたヒトリンパ細胞における発現の変化を示すための免疫細胞化学及びin situハイブリダイゼーションである。 ＰＨＡで刺激４８時間後、リンパ細胞は、抗原Ｋｉ-６７及びＰＣＮＡを表現する。 これらの抗原は、コントロール中又は休止リンパ細胞中では発現されない（左パネル）。前記in situハイブリダイゼーションは、センス及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドで行ない、ジゴキシゲニンでラベル表示された。刺激を受けたリンパ細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡだけでなくセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現した（右パネル）。
【００２８】
【図８】図８は、核小体中でセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化を示す腫瘍細胞のinsituハイブリダイゼーションである。 細胞あるいは腫瘍セクションは、左側で示される。
【００２９】
【図９】図９は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブで処理された腫瘍ＨＬ-６０細胞に生じる変化示す蛍光顕微鏡検査である。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、活性化されたカスパーゼに高い親和性で結合する化合物(VAD-fmok)で染色されることを示す。この化合物は、フルオレスセインで標識される。アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブは、（Ｂ，Ｃと対比して）同じ方法でも薬剤スタウロスポリンよりも高いカスパーゼ活性を誘発する。 活性化されたカスパーゼは、対照として、コントロール未処理細胞（Ａ）又は１２ＳミトコンドリアＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブで処理された細胞（Ｄ）中では検出されなかった。ＥとＦは、ＤＡＰＩでＨＬ-６０細胞の染色を示す。 コントロール細胞（未処理）は、核の均質な染色を示す（Ｅ）、一方、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブで処理された細胞は、広範な核の断片化を示す（Ｆ）。
【００３０】
【図１０】図１０は、休止及び増殖リンパ細胞の異なる処理条件後のアポトーシスを起こした細胞の割合を示す。 アポトーシスは、ＤＡＰＩ染色により休止中の細胞又はＰＨＡに刺激されたリンパ細胞で測定された。バー１及び２は、未処理細胞に相当する。コントロール（１）又はＰＨＡに刺激されたリンパ細胞（２）の低い自然のアポトーシスが観察された。同様の低いレベルのアポトーシスは、休止中のリンパ細胞又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にする１５ｕＭのオリゴヌクレオチドプローブで１５時間処理されたＰＨＡ刺激リンパ細胞で観察された、アポトーシスは正常細胞中では誘発されないことを示した。対照として、休止中の細胞とＰＨＡに刺激されたリンパ細胞は、スタウロスポリンで処理された。これらの条件下では、休止中のリンパ細胞(５)あるいはＰＨＡに刺激されたリンパ細胞(６)の約９０％がアポトーシスをこうむる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
４.発明の詳細な説明
４.１ ヒトミトコンドリアキメラＲＮＡファミリー
本発明は、ヒトの細胞がヒトのミトコンドリアキメラＲＮＡと称される、新規なミトコ
ンドリアＲＮＡのファミリーを発現するという驚くべき発見に基づくものである。
【００３２】
これらの転写産物に１つは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡと名付けられた、ミト
コンドリアの１６ＳリボゾームＲＮＡの５’末端に共有結合している８１５ヌクレオチド
の長い逆方向反復配列が含まれる。この長い逆方向反復配列は、長い二重鎖幹と５０ヌク
レオチドを形成する、位置５１から８６６の１６ＳリボゾームＲＮＡに十分に相補してい
る。
図１Ａに示すように、８１５塩基対のステムは、逆方向転写酵素（reverse transcript
ase）が相当するｃＤＮＡを合成するのに重要な問題を示す。従って、新しい戦略は、図
１Ａに例示するＲＴ−ＰＣＲによりこのＲＮＡを増殖するのに用いられる。
各重なり合うフラグメントの配列を得た後に、それらは、SEQ ID No1(図１Ａ)に示すセ
ンスミトコンドリアキメラＲＮＡの完全な配列を得るためにコンティグ（contigs）とし
て組み立てられる。
【００３３】
この発明の他の側面は、癌遺伝子のヒトの乳頭腫ウィルス（パピローマ・ウイルス）１
６又は１８で形質転換した細胞中に発現する他の新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａの発見である。
人間の包皮角化細胞（Human foreskin keratinocytes）(HFK)は、ＨＰＶ１６又は１８
により感染した(Hausen,Biochim. Biophys. Acta, 1288:F55-F78, 1996)。
この感染は、ＨＦＫの形質転換又は不死化を引き起こす。
しかしながら、これらの細胞は、関連するＳｉＨａ細胞（ＨＰＶ１６に感染した）又は
ＨｅＬａ細胞（ＨＰＶ１８に感染した）のような発癌性ではない。
これらの細胞は、ＳｉＨａとＨｅＬａ細胞に類似するセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａ（SEQ ID NO1）を発現する。
しかしながら、形質転換した細胞は、更に１６ＳリボゾームＲＮＡ(図１Ｂ)(SEQ ID No
2)に結合する７５４ヌクレオチドの逆方向反復配列を含む、他の第二のセンスミトコン
ドリアキメラＲＮＡを発現する。この新しいセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常
なヒトの細胞（HFK）中もしくは発癌性細胞（SiHa又はHeLa細胞）中では下方制御される
か、又は発現しない。
【００３４】
この発明の別の態様で、我々は、ＨＴＬＶ-１(Kobayashi et al., EMBO J., 3:1339-13
43, 1984)で形質転換した細胞中で第三のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を決
定した。
ＨＴＬＶ-１に感染したＭＴ-２細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQID NO
1)とＨＰＶ１６あるいは１８(SEQID NO 2)で形質転換された細胞中に発現するセンスミ
トコンドリアキメラＲＮＡを発現する。
これらの転写産物に加えて、ＨＴＬＶ-１で感染された細胞は、１６ＳリボゾームＲＮ
Ａの５’末端に結合する６９４ヌクレオチドの逆方向反復配列を含む、第三のセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡを発現する。
この新規なＲＮＡ(図１Ｃ)(SEQID NO 3)は、正常な増殖する細胞の中で、癌細胞の中
で、あるいはＨＰＶ１６あるいは１８で形質転換されたＨＦＫの中では発現されない。
【００３５】
前節に記載したヒトの包皮角化細胞（forskin keratinocytes）（HFK）のような正常の
増殖する細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(図６) (SEQ ID NO 1)を過剰発現（
over express）する。
フィトヘムアグルチニン（phytohaemagglutinin）(PHA)のようなミトゲンで活性化され
たヒトのリンパ細胞は、細胞周期のSフェーズに入って、ＤＮＡの合成を始める（Yu et a
l., J. Biol.Chem., 266:7588-7595, 1991）。
増殖する細胞として、リンパ細胞は、Ｋｉ-６７のような増殖に関連して、細胞核抗原
またはＰＣＮＡを増殖する抗原を発現する(Bantis et al., Cytopathology, 15:25-31, 2
004)。
脾臓の胚の中心にあるリンパ細胞、精原細胞、及び胚の細胞のような他の増殖する細胞
は、またセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)(図4)を過剰発現する。対照的
に、活性化されないリンパ細胞、又は筋細胞のような非増殖細胞は、センスミトコンドリ
アキメラＲＮＡ(図7)を発現しない。
【００３６】
本発明の他の態様で、腫瘍細胞と正常に増殖する細胞とを区別する方法が提供される。
以前に記述したように、腫瘍細胞と正常に増殖する細胞は、SEQ ID NO 1に記述したセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
更に、ＨＰＶおよびＨＴＬＶ-１で感染された特別の状況において、付加的なキメラＲ
ＮＡが見出される(SEQ ID NO 2及びSEQ ID NO 3)。
しかしながら、本発明は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現すると
いう驚くべき発見に基づくものである。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現は、ＰＨＡ(図7)で活性化されたヒト
のリンパ細胞中で、正常なＨＦＫで及び他の正常な増殖する細胞(図6)中で確認された。
この発明の他の驚くべき発見は、正常に増殖する細胞と異なり、腫瘍細胞がアンチセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡを発現しないか、又はその生産を下方制御するということ
である(図6及び図7と図4を比較する)。
【００３７】
ＲＴ-ＰＣＲによってオーバーラップしているフラグメントに基づくキメラＲＮＡを増
殖するために同様の方策を用いて、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造が決
定された(図３)。
コンティグにおけるその配列と組み立ては、アンチセンスの１６Ｓミトコンドリアリボ
ゾームＲＮＡ(図３Ａ、Ｂ及びＣ)(SEQID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)の５’末端
に結合している異なる長さの逆方向反復配列を含むアンチセンスミトコンドリアキメラＲ
ＮＡの複雑なファミリーを明らかにする。
その配列は、またこれらのＲＮＡにおける二重鎖構造又はステムの生成、及び７、９６
及び４５１ヌクレオチド(図３Ａ、Ｂ及びＣ、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)
をそれぞれ有するループの生成を明らかにする。
【００３８】
本発明の他の態様では、腫瘍ウィルスによって細胞の発癌性形質転換を生じさせる方法
と組成物が提供される。ＨｅＬａ細胞(HPV 18に感染した)又はＳｉＨａ細胞(HPV 16に感
染した)は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する、しかしアンチセンスミ
トコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する。他方、正常な増殖細胞であるＨＦＫは
、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡと同様にセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ
の双方を過剰発現する。
ＨＰＶ１６あるいはＨＰＶ１８でＨＦＫの形質転換の後に、細胞は、腫瘍表現型を得、
これらはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現し、そしてアンチセンスミトコン
ドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する。センスミトコンドリアキメラＲＮＡの過剰発
現及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現の下方制御は、in situハイブリ
ダイゼーション、ＲＴ-ＰＣＲによるＲＮＡの増殖、又は当該分野の技術者によってよく
知られた方法によるＲＮＡを決定する他の方法を用いることにより決定される。これらの
方法と組成物は、他の腫瘍ウィルスで又は形質転換又は発癌性を誘発する複合物により、
キメラＲＮＡ細胞ファミリーの発現における変化を決定するのに用いられる(McKinnell e
t al., “Thebiological basis of Cancer, Cambridge University Press1998)。
【００３９】
４.２ 癌および前癌診断
本発明により、方法と組成物は、生体サンプル中にセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ
とアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの存在を検出するために提供される。
1つの好ましい態様では、検出は、insituハイブリダイゼーションにより行われる。
生体サンプルの細胞中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンド
リアキメラＲＮＡの検出は、細胞が正常な増殖中の細胞であることを示す。
他の態様において、腫瘍細胞によるin situハイブリダイゼーションの結果は、センス
ミトコンドリアキメラＲＮＡの発現と、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの下方
制御又は不存在を示す。
もし、生体サンプルが非増殖の正常細胞を含む場合、in situハイブリダイゼーション
は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのい
ずれも発現しないことを示す。
【００４０】
生体サンプルは、培養中の又は血液スミア（smears）もしくは骨髄スミア中の正常細胞
（休止又は増殖する細胞）、培養中の腫瘍細胞、及び腫瘍ウィルスで形質転換された正常
細胞として理解される。
更に、生体細胞は、膀胱もしくは腎臓癌を有する疑いのある患者からの尿もしくは膀胱
洗浄から得られた細胞、又は頭と首の癌を有する疑いのある患者の唾液からの細胞、肺癌
を有する疑いのある患者の管支肺胞からの細胞を含む。また、生体サンプルは、白血病を
有する疑いのある患者の血液からの細胞スミア、又は転移を有する疑いのある患者の血液
、リンパ液、リンパ節からの細胞スミアを含む。
【００４１】
本発明による生体サンプルは、当分野の技術者に良く知られた技術である、組織病理学
の分析のため急速冷凍した組織あるいは細胞サンプルの使用を含む。
あるいは、生体サンプルは、当分野でよく知られた多種多様の固定プロトコル(Frederi
ck et al,Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 14, Frederick M
. Ausubul etal. edS., 1995; Celis, Cell Biology, A Laboratoty Handbook, Julio E
. Celis, ed.,1994)により行うことができる化学処理の使用により固定される薄片の生
体検査になりうる。
生体サンプルは、また化学的修飾、ホルマリン処理又は当該分野でよく知られた他の固
定がなされていない非固定の生物由来物質であってもよい。
【００４２】
あるいは、insituハイブリダイゼーションは、パラフィン又は他の包埋ができるポリ
マーのような物質に包埋された生体サンプルの使用により行うことができる。
包埋により得られたブロックは、ミクロトームで約４ないし１０μｍの厚みの切片にす
る。この切片は、ポリリシン又はムッセル（mussel）接着性蛋白質のような技術分野で知
られた接着性物質で被覆されてガラス又はポラスチックスライドに乗せられる(Burzio et
al.,Curr. Opin. Biotechnol., 8:309-312, 1997)。
【００４３】
in situハイブリダイゼーションは、この分野の技術者によく知られた方法で行われる
。例えば、細胞中でセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SE
Q ID NO 3）、又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQID NO 4, SEQ ID NO 5
, SEQ ID NO 6)の１又は２以上の配列を標的にした１又は２以上の標識されたプローブか
らなるハイブリダイゼーション溶液は、ハイブリダイゼーション条件下で細胞と接触され
る。そのハイブリダイゼーションシグナルは、それから正常の又は制御された癌及び前癌
細胞から予め決定されたハイブリダイゼーションパターンと比較される。
【００４４】
ここに使用されているように、in situハイブリダイゼーションを行うために標識され
たプローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は当該分野で知られている任意の方法により製造され
うる合成核酸である。
合成核酸は、インビトロで転写されたリボプローブ又はＰＣＲフラグメントを含む。
この発明の好ましい態様において、合成された相補的なオリゴヌクレオチドが用いられ
る。相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも長さ約１０のヌクレオチド、よ
り好ましくは少なくとも約１４、特に好ましくは少なくとも長さ１８のヌクレオチドであ
る。当業者は、長さが１０ヌクレオチドから、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はア
ンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡにハイブリダイゼーションが可能である長さにま
で拡張できることを理解する。ここでの好ましい態様において、長さは、約３０ヌクレオ
チド、より好ましくは約２５ヌクレオチド、そしと最も好ましくは１０から５０ヌクレオ
チドである。
より長いプロービング核酸もまた使用できる。プローブの配列は、少なくとも９５％が
SEQ ID NO 1、SEQID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5及びSEQ ID NO 6に
リストされた配列に同種である。
【００４５】
本発明の相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、一般にリン酸ジエステル（phosphod
iester）結合を含む、しかし、ある場合には、限定されるものではないが、ホスフォロチ
オエート（phosphorothioate）(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437-1441, 1991;
及び米国特許番号5,644,048),ペプチド性核酸（peptide nucleic acid）又はＰＮＡ(Eg
holm, Nature,365:566-568, 1993; 及び米国特許番号6,656,687), phosphoramide (Beau
cage, MethodsMol. Biol. 20:33-61, 1993), ホスフォアミド（phosphoramide） (Beauc
age, MethodsMol. Biol. 20:33-61, 1993), ホスフォロジチオエート（phosphorodithio
ate）(Capaldi etal., Nucleic Acids Res., 28:E40, 2000)からなるインターヌクレオ
シド連鎖を交互に含むオリゴヌクレオチドプローブ類似体も含まれる。
他の相補的なオリゴヌクレオチド類似体は、限定されるものではないが、モルフォリノ
（morpholino）(Summerton, Biochim. Biophys. Acta, 1489:141-158, 1999)、ロックさ
れたオリゴヌクレオチド（locked oligonucleotides） (Wahlestedt wt al., Proc. Natl
. Acad. Sci.US, 97:5633-5638, 2000)、ペプチド性核酸（peptidic nucleic acids）又
はＰＮＡ(Nielsen et al., 1993; Hyrup and Nielsen, 1996)又は2-O-(2-メトキシ)エチ
ル変性５’及び３’末端オリゴヌクレオチド（2-o-(2-methoxy) ethyl modified 5’ and
3’ endoligonucleotides）(McKay et al., J. Biol. Chem., 274:1715-1722, 1999)な
どを含む。
これらの引例のすべては、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる。
核酸は、デオキシリボ−とリボ−ヌクレオチドのいかなる結合、及びウラシル、アデニ
ン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キササナイン（xathanine）、ハイポキサ
ナイン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン（isoguanine）等を含むいかな
る塩基の結合を含めることができる。
【００４６】
本発明の他の態様では、核酸またはオリゴヌクレオチドプローブは、センスミトコンド
リアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡによるハイブリダイゼー
ションを検出するために標識される。プローブは、その技術分野で知られている任意の方
法により検出可能なマーカーにより標識される。
プローブを標識する方法は、ランダムのプライミング、エンドラベリング、ＰＣＲ、及
びニックトランスレーションを含む。
酵素の標識付けは、核酸ポリメラーゼ、３つの未標識ヌクレオチド、及び標識が直接付
けられるか、標識するためにリンカーアーム（linker arm）を含むか、又はハプテンもし
くは標識が付けられた結合分子が結合するかもしれない他の分子に付けられる4番めのヌ
クレオチドの存在下で行なわれる。
適切な直接の標識は、.sup.32 P、.sup.3 Hおよび.sup.35 Sのような放射性のラベル、
並びに蛍光性のマーカーのような非放射性の標識を含む。
好ましい蛍光色素(fluorophores)は、５(６)カルボキシフルオレセン[5(6)carboxyfluo
rescein]、６-((７-アミノの-４-メチルコウマリン-３-アセチル)アミノ)ヘキサノイック
酸[6-((7-amino-4-methylcoumarin-3-acetyl)amino)hexanoic acid]、５（及び６）-カ
ルボキシ-X-ローダミン[5(and6)-carboxy-X-rhodamine]、シアニン２(Cy２)染料[Cyanin
e 2 (Cy2) Dye]、シアニン３(Cy３)染料[Cyanine3 (Cy3) Dye]、シアニン３.５(Cy３.５
)染料[Cyanine 3.5(Cy3.5) Dye]、シアニン５(Cy５)染料[Cyanine 5 (Cy5) Dye]、シア
ニン５.５(Cy５.５)染料[Cyanine 5.5 (Cy5.5) Dye]、シアニン７(Cy７)染料[Cyanine 7
(Cy7) Dye]、シアニン９(Cy９)染料[Cyanine9 (Cy9) Dye]、（シアニン染料2、3、3.5
、5および5.5は、Amersham,Arlington Heights, III からのNHSエステルとして入手可能
である。）、又はアレクサ染料[Alexa dyes]（Alexa 488、Alexa 532、Alexa 556、Alexa
590等を含む。）(MolecularProbes, Eugene, Oreg.)を含む。
【００４７】
プローブは、ハプテン又は他の分子に共有結合しているヌクレオチドに結合することに
より直接的に標識される。好ましいハプテンは、限定されるものではないが、５(６)-カ
ルボキシフルオレセイン[5(6)-carboxyfluorescein]、２,４-ジニトロフェニルジオキシ
ゼニン[2,4-dinitrophenyl、digoxigenin]、及びビオチンを含み、そしてそのハプテン又
は他の分子に対する標識された抗体でプローブの検出を行う。
ビオチンの場合、検出は、検出可能なラベルに接合しているアビディン（avidin）ある
いはストレプトアビジン(streptavidin)により行うことができる。
抗体、ストレプトアビジンおよびアビディンは、蛍光性のマーカーで、あるいはそれら
を検出可能にするアルカリホスファターゼかホースラディッシュ・ペルオキシダーゼのよ
うな酵素のマーカーに接合される。
接合されたストレプトアビジン(streptavidin)、アビディン及び抗体アンチジゴキシゲ
ニン(digoxigenin)は、ベクター研究所(バーリンゲーム,カリフォルニア)およびボエリン
ゲルマンハイム(BoehringerMannheim)(インディアナポリス、インディア)のような会社
から商業的に入手可能である。
他の具体例では、抗体又はストレプトアビジンは、多くの安定した蛍光放射量子ドット
に接合される(Wuet al., Nature Biotechnol. 21:41-46, 2003)。
【００４８】
抗体とストレプトアビジンに結合している酵素は、酵素に対する基質（substrate）を
提供することにより、熱量反応を通して検出することができる。
種々の基質の存在において、異なる色は、反応により生成され、そしてこれらの色は、
多数のプローブを別々に検知するために視覚化することができる。
当該分野で公知のいかなる基質も使用できる。
アルカリ性ホスファターゼに対する好ましい基板は、５-ブロモ-４-クロロ-３-インド
リルホスフェーテ(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)(BCIP)及びニトロブルーテト
ラゾリウム（nitroblue tetrazolium）(NBT)を含む。
ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）用の好ましい基質は
、ジアミノベンゾエート(diaminobenzoate)(DAB)である。
その分野の当業者は、更にその他の酵素活性を用いることが可能であることを理解する
。
【００４９】
本発明の他の具体例では、正確で複製可能な結果を達成するin situハイブリダイゼー
ションを行うための条件が記述される。
核酸ハイブリダイゼーションの分野の技術者は、ハイブリダイゼーションの厳格性をコ
ントロールするために一般に使用される因子がホルムアミド濃度あるいは他の化学的変性
試薬、塩濃度又は可変のイオン強度、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐ
Ｈとカオトロピック剤（chaotropic agents）の存在又は不存在、を含むことを認識する
であろう。
これらの厳格因子は、それによりキメラＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブの
ハイブリダイゼーションの厳格さをコントロールするために調整することができる。分析
用の最適の厳格さは、所望の厳格さの程度が達成されるまで、各厳格因子の実験によって
実験的に決定される。
【００５０】
最良のinsituハイブリダイゼーションを制御するための他の条件は、例えば、標的の
キメラＲＮＡよりも生体サンプル中に存在する、成分に対するプローブの非特定結合をブ
ロックする化学薬品の使用である。
ブロッキング試薬（遮断薬）は、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡあるいは
標識されていないオリゴヌクレオチドである。
ハイブリダイゼーション溶液中で結合しているブロッキング試薬は、標識されたプロー
ブの非特定結合を制御する、そしてそれ故分析のシグナル対ノイス比を増加する。
本発明の他の側面において、プローブは、センス又はアンチセンスのミトコンドリアＲ
ＮＡの配列に相補する配列を有する(SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID N
O 4, SEQ ID NO5 and SEQ ID N 6 参照)
【００５１】
生化学的配列の固定は、また実験的に決定されるin situハイブリダイゼーションの重
要な側面である。グルタルアルデヒドのような高度に架橋された固定剤は、標的のセンス
ミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡへのプローブ
のアクセスがブロックされるので、推奨されない。
この発明の好ましい方法は、冷凍のサンプルも好ましいが、ホルマリンで固定された生
体サンプルである。センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリア
キメラＲＮＡを標識されたプローブに触れさせるために、付加的な操作を用いることがで
きる。
例えば、生体サンプルは、プローブが標的キメラＲＮＡにアクセスするのをブロックす
る蛋白質を除去するためにプロテイナーゼＫで消化することができる。
in situハイブリダイゼーションに先立って、生体サンプルをプロテイナーゼＫ又は他
のプロテアーゼで処理することは、当該分野の技術者によく知られている。
【００５２】
前述したように、キメラＲＮＡとアンチセンスキメラＲＮＡ中の長い逆方向反復配列は
、高度に安定な二重鎖の生成を誘発する。キメラＲＮＡの単一鎖領域の第二の構造を有す
るこれらの構造は、プローブが標的キメラＲＮＡにアクセスするのにバリヤーを構成する
。
従って、本発明の他の側面では、生体サンプルは、キメラＲＮＡを変性するために、室
温で１０分間０．２ＭのＨＣｌで処理される。
該サンプルは、ここに記述するin situハイブリダイゼーションプロトコルを適用する
前に、ｐＨ７．４の緩衝溶液で数回洗浄することにより急速に中和される。
ここに記述する、通常のルーチン実験およびその開示の下にこの分野の技術者は、ここ
に記述する方法と組成物を利用して分析を行うための適切なハイブリゼイション条件を容
易に決めることができる。適切なin situハイブリダイゼーション条件は、in situハイブ
リダイゼーション操作を行うのに適切なこれらの条件である。
従って、適切なinsitu ハイブリダイゼーション条件は、ここにおける開示と引例（場
合によっては更なるルーチン実験を用いて）を用いて明らかになる。
【００５３】
本発明の他の具体例において、in situハイブリダイゼーションにより決められたよう
にセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化（localization）は、癌を持つ患者の予後
と管理に重要な情報である。腫瘍細胞において、センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、
遅発エンドソーム／リソソームに付随する細胞質中に最も見出される。しかし、核小体中
の局在化は、また、ある細胞中にも見出される。
ヒトの生体検査における腫瘍細胞の存在において、そのハイブリダイゼーションのシグ
ナルは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡが細胞質中にのみ、又は細胞質と核小体中も
しくは細胞質と細胞核中に存在することを示す。
従って、異なる局在化は、重要な予後の重要性を持つこともよそうされる。
好ましい具体例において、例えば乳房、大腸及び前立腺腫瘍からのヒトの生検のパネル
は、キメラＲＮＡを検出するためのin situハイブリダイゼーションにより研究されうる
。
肯定的なハイブリダイゼーションシグナルと共に（プローブがどのように標識されたか
には左右されず）、細胞内局在化（唯一細胞質、細胞質及び核小体、又は細胞質及び細胞
核）は、各腫瘍中で確立され、そしてその結果は各患者の生存と比較された。
【００５４】
この発明の他の側面において、正常な及び／又は腫瘍細胞を含む個別細胞の混合物は、
蛍光色素（fluorochrome）で標識され、センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブを有する検査液中
でハイブリダイゼーションされる。
例えば、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にしているプローブは、ローダミン
で標識表示され、そしてセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にしているプローブは
、アレクサ（Alexa）４８８で標識表示されうる。
以前に記述した条件の下にハイブリダイゼーションと洗浄後に、細胞は、細胞内の標識
表示するフローサイトメトリー（flow cytometry）により分析することができる。
【００５５】
本発明の好ましい態様は、腫瘍細胞中のキメラＲＮＡの特定の局在化について得られた
情報が予後診断の重要な更なる情報を提供するので、in situハイブリダイゼーションに
用いることである。
本発明の更に他の態様において、代替分子法は、正常、前癌及び癌細胞中でのキメラＲ
ＮＡの発現及びセンスとアンチセンスキメラＲＮＡの差次的発現を検出するのに用いられ
る。これらの別法は、限定されるものではないがノーザンブロット、ドットブロット、キ
メラＲＮＡとアンチセンスキメラＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド配列、ＲＴ−ＰＣＲ
によるＲＮＡの増殖、インビトロ転移介在性増殖又はＴＭＡによるＲＮＡの増殖、Ｓ１又
はリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）アッセイ、等を含む。
【００５６】
本発明の１つの態様で、センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、１６ＳリボソームＲＮ
Ａの５’末端部を含む領域、又は逆方向反復配列の部分的もしくは全領域の増殖により得
られたプローブを用いて診断目的で検出することができる。
図１に示すように、リバースプライマーは例えばプライマー１（SEQ ID NO 139）にす
ることができ、そしてフォワードプライマーは、プライマー３,４,５,６又は７（SEQ ID
NOS129,11,106,102,63）にすることができる。他の部分に位置するプライマーもまた使
用することができ、そしてこれらは該分野の技術者により容易にデザインできる。この発
明の他の側面で、逆転写活性を有する酵素とヘキサマー又はより長鎖のようなランダムプ
ライマーにより合成されるｃＤＮＡは、当該分野の技術者によく知られている。
【００５７】
得られた２１０、３５０、５００もしくは８５０ｂｐ、又は他の部分に位置するプライ
マーを用いて得られた他のサイズのアンプリコン（amplicons、単位複製配列）は、アガ
ロースゲル又はポリアクリルアミドゲル中の電気泳動(Sambrook et al., 1989)及び臭化
エチジウム又は他の挿入染料を用いて染色することにより検出できる。
このアンプリコンは、メーカーの指示書により精製される。
【００５８】
ミトコンドリアキメラＲＮＡの検出は、ノーザンブロットにより行うことができる(Sam
brook et al.,1989)。
アガロースゲル中のＲＮＡの分離後に、フラグメントは、当該分野の技術者によく知ら
れた操作により膜（ニトロセルロースまたはナイロン）に転送される(Sambrook et al.,
1989)。膜を調べるために、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの１０００から１２５の
位置に相当する２５０ｂｐのフラグメントは、増殖される。
アンプリコンは、製造指示書により精製され(Wizard, Promega)、そして１０ナノグラ
ムが第２の増殖のために鋳型として用いられる。
この増殖は、ＰＣＲ（Invitrogen）と³²P-a-dCTP (Amerscham)の５マイクロキュリーの
鎖混合物で行う。放射性の増殖フラグメントは、９５℃で１０分間インキュベートにより
変性し、変性されたプローブは、ハイブリダイゼーション混合物に添加される。膜は、６
５℃で１６時間、ハイブリダイズされて、その後２倍のＳＳＣ緩衝液で２度、６０℃で０
．５倍のＳＳＣで２度、そして４５℃で０．２倍のＳＳＣで洗浄される(Sambrook et al.
, 1989)。洗浄された膜は、−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに曝される(Sambrooket al., 1
989)。
膜上のハイブリダイゼーションシグナルは、１６ＳリボゾームＲＮＡ(1559のヌクレオ
チド)と８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列に相当するサイズである２,４００のヌクレ
オチドの主な成分に相当する。
【００５９】
本発明の他の態様で、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの一部は、細胞又は細胞の組
織から抽出された全ＲＮＡのリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）の消化の後に検出され
る。
二重鎖構造又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのステムは、リボヌクレアーゼによ
る消化に耐性がある。
細胞又は細胞の組織からトリゾール(TriZol) (Invitrogen)で抽出された全ＲＮＡは、
２倍のＳＳＣの小容量中に溶解される。溶液は、５０μｇ／ｍｌの最終濃度でＲＮＡ分解
酵素Ａ(Sigma)を用いてインキュベートされる。
２５℃で３０分後に、ヌクレアーゼに対するＲＮＡ耐性は、トリゾールで抽出され、−
２０℃で一晩イソプロパノールを用いて沈殿させる。ヌクレアーゼに対するＲＮＡ耐性は
、蒸留されたＤＥＰＣ処理水に溶解し、そしてＲＴ-ＰＣＲ増殖のために鋳型として用い
られる。
１６ＳリボゾームＲＮＡの位置５５および７９０を標的とするプライマーを用いて行っ
た増殖は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)のステムと同じ配列で１０
０％同一性を示す配列と約７３０塩基対のフラグメントを生ずる。
その一方、キメラＲＮＡで３’ハーフに相補する単一鎖、又は１２Ｓミトコンドリアリ
ボゾームＲＮＡ、又は１８ＳリボゾームＲＮＡもしくはＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡは、
リボヌクレアーゼＡで処理することにより全体的に消化され、そしてそれ故、これらのＲ
ＮＡを標的にするプライマーが用いられた場合に、増殖生成物は、得られない。
【００６０】
本発明の他の態様では、全ＲＮＡがリボヌクレアーゼＡで処理された後、得られたセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡのステムは、ノーザンブロットにより検出できる。ヌクレ
アーゼに耐性を示し、トリゾールによる抽出とイソプロピルアルコールを用いた沈殿によ
り回収されるＲＮＡは、アガロースゲル中の電気泳動によって分離される。転移の後に、
膜は、前述したプローブでブロットされ、そしてセンスミトコンドリアキメラＲＮＡをノ
ーザンブロット(Sambrooket al., 1989)するのに用いられる。
【００６１】
他の態様では、この発明は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡを生体サンプル中でアッセイを検出するのに適したキッドを教示
する。キメラＲＮＡの検出に適した、一般的で好ましい態様、組成物及び方法が提供され
、in situハイブリダイゼーションによるアンチセンスキメラＲＮＡは、既に本明細書で
記述された。
好ましいオリゴヌクレオチドプローブ配列は、限定されるものではないがリストに記載
されている。更に、オリゴヌクレオチドプローブを使用するのに適した方法あるいはサン
プル中のキメラＲＮＡもしくはアンチセンスキメラＲＮＡを検出するキッドのオリゴヌク
レオチドプローブは、既に本明細書で記述された。
【００６２】
本発明のキットは、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと、サンプル中のセンスミ
トコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するため
に用いるinsituハイブリダイゼーションを行うために選択された試薬又は組成物からな
る。２以上のオリゴヌクレオチドの各セットは独立して検知可能な構成部分で好ましくは
ラベル化され、そして生体サンプルの個々の細胞において、センスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡが検出される。
好ましい態様において、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコン
ドリアキメラＲＮＡを検出するのに用いるキットのオリゴヌクレオチドプローブは、異な
るハプテンで各セットごとに標識される。このハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、
あるいは異なる酵素(例えばアルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼ)で標識し
た抗体あるいはストレプトアビジンでin situハイブリダイゼーション方法で認識できる
フルオレセイン（蛍光色素）とすることができる。
他の方法として、プローブの各セットの各オリゴヌクレオチドプローブは、独立して検
出可能な蛍光性のグループで標識できる。
例えば、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプロ
ーブのセットは、ローダミンで標識できる、一方、アンチセンスミトコンドリアキメラＲ
ＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブのセットは、アレクサ４８８(Alexa 4
88)で標識できる。
更に、生体サンプルの細胞中のキメラＲＮＡ又はアンチセンスキメラＲＮＡの局在化を
決定する方法が提供される。
更に、本発明の組成物と方法は、共焦点顕微鏡分析を用いて異なる細胞小器官の特定の
マーカーでキメラＲＮＡ又はアンチセンスキメラＲＮＡの共−局在化（co-localization
）を決定するのに使用することができる。
【００６３】
ここに提供される組成物および方法は、前癌および癌の検知と診断に特に有効であると
考えられる。
ここに提供されるような用語「癌」は、以下の確認されている特異な条件のいずれか１
により悩まされる細胞を含んでいる。
これらは、急性慢性である骨髄性白血病、急性慢性であるリンパ芽球の白血病、多発性
骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンのリンパ腫あるいは悪性リンパ腫;胃癌、食道癌か腺癌
、膵臓送管の腺癌、インスリノーマ（膵島細胞腫）、グルカゴン産生腫瘍（glucagonoma
）、ガストリノーマ（gastrinoma）、小腸腺癌（small bowel adenocarcinoma）、結腸直
腸癌;肝細胞性の癌、肝細胞性の腺腫;カルチノイド、腎臓腺癌のような尿生殖路、ウイル
ム腫瘍（Wilm'stumor）、膀胱および尿道癌および前立腺癌、精上皮腫のような精巣癌、
奇形腫、奇形癌、間質細胞癌腫; 子宮内膜の癌、子宮頚癌、卵巣癌、外陰癌と膣癌、セル
トリ-Ｌ-アイディグ（Sertoli-L-eydig）細胞癌、黒色腫および卵管癌;肺、歯槽と細気管
支の癌;脳腫瘍; 皮膚悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌及びカルポシ(Karposi)肉
腫を含む。
繊維肉腫、心臓の血管肉腫と横紋筋肉腫、及び他の悪性癌は、当該分野の技術者によく
知られている。
【００６４】
４.３ 癌および前癌療法
化学療法薬は、癌細胞増殖および存続に影響を与える一連の細胞応答を含む。
これらの細胞応答の研究された最良のものは、アポトーシスであり、抗癌剤が共通のア
ポトーシス経路を活性化することにより腫瘍細胞を殺すことができることは現在明らかで
ある。。
不運にも、これらの薬は、さらに急速に分裂する骨髄の正常細胞、正常な造血と腸の細
胞および髪の毛マトリックスのケラチン生成細胞にも影響を与える(McKinnell et al., T
he biological Basisof cancer, 1998; Komarov et al., Science 285:1733-1737, 1999
; Johnstone etal., Cell 108:153-164, 2002)。
【００６５】
他方、多くの腫瘍細胞が細胞死開始因子、調整因子及び細胞死の遂行因子を変化させる
、これらは、異なる癌タイプの腫瘍細胞がなぜ種々の化学療法薬と放射線に耐性を示すこ
とになるかを説明している。
この変化は、固有の経路の因子、ポストミトコンドリアル事象及び細胞死の固有の経路
について報告されている(Rampino et al., Science 275:967-969, 1997; Vogelstein et
al., Nature408: 307-310, 2000; Teitz et al., Nature Med. 6:529-535, 2000; Reed,
J. Clin.Oncol., 17:2941-2953, 1999; Johnston et al., Cell 108:153-164, 2002)。
従って、癌治療法のパラダイムは、腫瘍細胞の細胞死の選択的誘引となる操作、正常な
増殖細胞を変化させない操作、及び異なる細胞死経路を変化又は突然変異させる要因を回
避する操作である。
【００６６】
本発明の構成および方法は、正常な増殖細胞と同様のレベルで、腫瘍及び前腫瘍細胞が
センスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現するという発見に基づく。
これらの転写産物の構造は、図１、図２、及びSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO
3、SEQ ID NO 4、SEQID NO 5およびSEQ ID NO 6における対応する配列である。
【００６７】
その一方、他の驚きの発見は、前腫瘍及び腫瘍細胞がセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａを過剰発現し、そしてアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを下方制御する、とい
うことである。前腫瘍及び腫瘍細胞におけるアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの
合成の抑制と阻害は、癌細胞と正常増殖細胞間の表現型の新たな差異を構成する、これは
、本発明の主な態様に１つとして考えられる。
さらに、異なる癌タイプのヒトの生検における癌はまた、培養中の癌と同じ表現型を示
す(図５Ａおよび５Ｂ)。
【００６８】
センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの機能
は明確ではないが、密接な相関関係はこれらのＲＮＡの発現と細胞増殖間に存在する。例
えば、肝臓、腎臓および脾臓のような細胞組織中の、Ｋi-６７、ＰＣＮＡあるいはリン酸
化されたヒストンＨ３(histone H3)のような抗原を意味するようなもので定義される正常
な増殖する細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡだけでなくセンスミトコン
ドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
Ｋi-６７又はＰＣＮＡを発現しない同様の細胞組織の非増殖細胞において、センスミト
コンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは発現しない。更に
、図７に示すように、ミトゲンＰＨＡで活性化されたヒトのリンパ球は、ＤＮＡを合成し
、増殖する抗原Ｋi-６７とＰＣＮＡを発現する。
この活性化されたリンパ球は、またアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡだけでな
くセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する（図７）。
対照的に、休止しているリンパ球又は非活性リンパ球は、センスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡもアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡも発現しない。
【００６９】
本発明の1つの基本部分である、前述の発見は、正常の増殖細胞がセンスとアンチセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する期間、腫瘍細胞はセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡを発現し、そしてアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する
、ことを示す。
細胞増殖におけるこれらのＲＮＡの機能を理解するために、培養中の癌細胞は、センス
ミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3)又はアンチセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)を標的にする
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された。
他の驚くべき発見である結果は、これらの条件下で細胞は、予定された細胞死又はアポ
トーシスをこうむることを示した。
センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで
６ないし１５時間処理され処理後、細胞の７５〜９６％は、アポトーシス(表２参照)を被
る。
処理された細胞で観察された変化は、クロマチン凝縮、核断片化、ＤＮＡ断片化、カス
パーゼ活性及び細胞膜の変化プロセスであった。
４またはそれ以上のミスマッチ又はスクランブルオリゴヌクレオチドを有する制御オリ
ゴヌクレオチドは、アポトーシスを誘発しなかった。
【００７０】
また、センス又はアンチセンス１２ＳミトコンドリアＲＮＡを標的とする、又はｍＲＮ
ＡもしくはミトコンドリアＮＤ１サブユニットのアンチセンス転写産物を標的とするオリ
ゴヌクレオチドで処理しても細胞は影響を受けなかった。
一般に、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドは
、同じ濃度ではセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドより
もより効果的であった。
このことは、予期された結果であった、なぜなら腫瘍細胞は、センスミトコンドリアキ
メラＲＮＡを過剰発現し、そしてそれ故細胞内でこの転写産物のすべてのコピーを阻害す
る細胞内のオリゴヌクレオチド濃度に到達ことが困難だからである。
他方、腫瘍細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを下方制御するので、細
胞あたりのコピー数が低くこのＲＮＡで阻害することが容易になる。
【００７１】
アポトーシスの誘発は、腫瘍細胞に対してまた選択的である。休止しているヒトリンパ
球又はＰＨＡで４８時間活性化したヒトのリンパ球は、アンチセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡに相補する、又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標識にするオリゴヌクレ
オチドで、一晩処理をしても、また相補的オリゴヌクレオチド（１５ｕＭ）の高用量で処
理しても影響されない。
【００７２】
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)
を標的にする相補的オリゴヌクレオチドで処理することによるアポトーシスの誘発は、限
定されるものではないが前骨髄球性白血病細胞ＨＬ-６０、急性リンパ芽球の白血病MOLT-
4、Ｔ−リンパ球白血病細胞、Jurkat、Ｔ細胞白血病、Devernelle、又はＢリンパ腫、Ｎ
ＳＯ／２又は骨髄腫、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５、ＰＣ-３、Ｃａｃｏ-２、Ｈｅｐ-２及
びＨｅｐＧ２で達成される。
治療の効かない（化学療法又は放射線治療）腫瘍細胞のパラダイムと見なすことができ
る、ＭＣＦ／７（乳癌）とメラノーマの２つの細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡ(SEQID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)を標的とする相補的オリゴヌクレオ
チドで１５時間処理するとき、８０％以上アポトーシスを受ける。
より低いアポーシス結果は、センスキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)に相補するオリゴヌク
レオチドで得られた。
すでに記載したように、４つのミスマッチ又はスクランブルオリゴヌクレオチドを有す
るオリゴヌクレオチドは、細胞死を誘発しない。
【００７３】
以下の記載は、治療標的として、センスキメラＲＮＡとアンチセンスキメラＲＮＡを用
いて癌を処理するための方法と組成物である。
好ましい態様は、限定されるものでないが、アンチセンスキメラＲＮＡに相補するオリ
ゴヌクレオチドを用いて癌を処理するための方法と組成物である。
この治療の結果は、処理された対象で少なくとも健康に良い利益を生ずる、この利益は
、癌の場合に癌の沈静化に限定されないが、癌の症状の緩和及び癌の転移拡散の制御を含
む。このようなすべての方法は、腫瘍細胞において、及び正常細胞においてはマイナーな
効果でアポトーシスの誘発を伴う。
特定のＲＮＡを標的する相補的なオリゴヌクレオチドは、多くのさまざまなｍＲＮＡの
発現又は対応するたんぱく質の合成を少なくするかなくす為に用いられてきた(e.g. Vick
ers et al., J.Biol. Chem., 278:7108-7118, 2003)。
現在、異なる化学的性質を有する約４２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、可能性
のある薬剤としてスクリーニングされている(Stephens and Rivers, Curr. Opin. Mol. T
herapeut.,5:118-122, 2003) (参照例：U.S. Pat. Nos. 5,801,154; 6,576,759; 6,720,
413; 6,573,050and 6,673,917)。
これらの引例のすべては、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる
【００７４】
この発明の1つの側面において、アンチセンスキメラＲＮＡを標的にする１以上のオリゴ
ヌクレオチドが用いられる。
2つ以上の相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、より有効で、ある程度の相乗作用を
示す。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミ
トコンドリアキメラＲＮＡに相補することができる。
相補的なオリゴヌクレオチドは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンス
ミトコンドリアキメラＲＮＡに結合し、それらの機能を妨げる。
絶対的な相補性は、好ましいが、要求はされない。
ここで記述するように、一部のＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡで
ハイブリダイズして安定な二重鎖を形成するに十分な相補性を有する配列を意味する。ハ
イブリダイズする能力は、両者の相補の程度とオリゴヌクレオチドの長さによる。一般に
、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡでのミスマッチの増加した塩基を多く含む
が、それでも安定な二重鎖を形成する。
当該分野の技術者は、ハイブリダイズ化された錯体の融点を決定する標準操作の使用に
よりミスマッチの許容程度を確認することができる。
【００７６】
一般に、異なる蛋白質をｍＲＮＡでハイブリダイズするための相補的オリゴヌクレオチ
ドは、ＡＵＧスタートコドンの相補物を含むｍＲＮＡの５’未翻訳領域、又はより効果的
な３’未翻訳領域を標的にする。
ｍＲＮＡコード領域に相補するオリゴヌクレオチドは、翻訳の効果が低い抑制剤である
(前の引例を参照)。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、非
コードＲＮＡであり、それ故オリゴヌクレオチドの標的領域は、これらの転写産物のいか
なる領域とも相補することができる。最も効果的な領域は、各３０ヌクレオチドでデザイ
ンされた相補的オリゴヌクレオチドを用いてアンチセンス又はセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡの配列をスキャニングすることにより決定されたアンチセンスミトコンドリアキ
メラＲＮＡの単一鎖セグメントの周りに局在化される。
この分野の技術者は、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、及びSE
Q ID NO 6の転写産物の完全な配列内の他の配列が代替の相補的なオリゴヌクレオチドを
デザインするための標的であることを理解する。。
【００７７】
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標
的とし、本発明によると腫瘍細胞死を誘発することになるこの相補的なオリゴヌクレオチ
ドは、一般にナチュラルなリン酸ジエステル結合と異なるバックボーンを含む。このオリ
ゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスフォロチオエーテ(Mag et al., Nucleic Acids
Res.19:1437-1441, 1991; and U.S. Pat. No. 5,644,048)、ペプチド核酸又はＰＮＡ(E
gholm, Nature,365:566-568, 1993; and U.S. Pat. No. 6,656,687)、ホスフォアミド(B
eaucage,Methods Mol. Biol. 20:33-61, 1993)、ホスフォロチジオエーテ(Capaldi et a
l., NucleicAcids Res., 28:E40, 2000)を含む、交互に並ぶインターヌクレオシド結合
を有することができる。
他のオリゴヌクレオチド誘導体は、限定されないがモルホリノ(Summerton, Biochim. B
iophys. Acta,1489:141-158, 1999)、固定されたオリゴヌクレオチド(Wahlestedt wt al
., Proc. Natl.Acad. Sci. US, 97:5633-5638, 2000)、ペプチド核酸又はＰＮＡ(Nielse
n et al., 1993;Hyrup and Nielsen, 1996)又は２-o-(２-メトキシ)エチル修飾５’と３
’末端オリゴヌクレオチド(McKay et al., J. Biol. Chem., 274:1715-1722, 1999)のよ
うなものを含む。
これらの引例のすべては、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる。
核酸は、デオキシリボ−とリボ核酸のいかなる結合、及びウラシル、アデニン、チミン
、シトシン、グアニン、イノシン、キササニン(xathanine)、ハイポキササニン（hypoxat
hanine）イソシトシン、イソグアニンを含む、塩基のいかなる結合も含むことができる。
【００７８】
本発明による相補的オリゴヌクレオチドは、限定されないが
５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、
５-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、
５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、
５-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、
ベータD-ガラクトシルキオシン(beta-D-galactosylqueosine)、イノシン、
Ｎ６-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、
２、２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン
、5-メチルシトシン、Ｎ６アデニン、7-メチルグアニン、
５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、
ベータＤ−マノシルキオシン(beta-D-mannosylqueosine)、
５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトシキウラシル、
２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシアセテック酸（Ｖ）
、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、プソイドウラシル、キオシン(queosine)、
２-チオシトシン(thiocytosine)、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、
４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシアセテックアシッド メチル
エステル、ウラシル-５-オキシアセテック酸（Ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-(
３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、
（acp3）w及び２,６-ジアミノプリン
を含むグループから選択された少なくとも１つの修飾塩基部分を含む。
【００７９】
相補的なオリゴヌクレオチドは、更に限定されないがアラビノース、２-フルオロアラ
ビノーズ、キシルロース及びヘキソースを含むグループから選択された少なくとも１つの
修飾糖部分を含むことができる。
【００８０】
本発明の他の態様では、相補的なオリゴヌクレオチドが、アンチセンスミトコンドリア
キメラＲＮＡのいかなる領域とも、又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのいかなる領
域ともハイブリダイズするようにデザインされる。
相補的なオリゴヌクレオチドは、長さで少なくとも１０のヌクレオチドでなければなら
ず、長さで１０から５０のヌクレオチド範囲の相補的オリゴヌクレオチドが好ましい。
特定の側面では、相補的なオリゴヌクレオチドが少なくとも１２のヌクレオチド、少な
くとも１８のヌクレオチド、少なくとも２２のヌクレオチド、少なくとも３０のヌクレオ
チド、少なくとも５０のヌクレオチドである。
【００８１】
In vivoだけでなくinvitro実験においても、アンチセンス又は相補的オリゴヌクレオ
チドの非特定の生物学的効果で、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミ
トコンドリアキメラＲＮＡの機能を用いてアンチセンス阻害を識別する制御を利用する実
験を考慮することは重要である。
従って、オリゴヌクレオチドのデザインは、参照することにより明らかに本発明に組み
込まれる、米国特許番号 6,673,917で報告されているように動物細胞に有毒効果があるCp
Gトラック、5' GGGGトラックおよび他の配列の存在は、避けなければならない。
更に、配列5'CGTTAの存在は、報告されているアンチセンスでない効果を避けられる(T
idd et al.,Nucleic Acids Res. 28:2242-2250, 2000)。
【００８２】
本発明の他の態様では、癌を有する動物又は病人の治療薬として、センスミトコンドリ
アキメラＲＮＡを標的とする又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする
相補的オリゴヌクレオチドは、抗癌治療剤と放射線療法に対する活性を誘発することがで
きる。
増感又は過敏性として知られている誘発される感度は、抗癌治療又は放射線療法に対す
る耐性を示す腫瘍細胞中で測定される。
抗癌剤は、これらの当該分野で使用中であり既に知られている、又は未発見の薬剤から
なる。従来の化学療法薬の中には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質および抗微小
管薬がある。
これらの薬のいくつかの例はシスプラチン、メトトレキサート、ドキソルビシン,
ダクチノマイシン、マイトマイシン、シクロホスファミドなどである。
この発明の他の側面で、癌を有する動物又は病人をアンチセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡ及び／又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にした相補的オリゴヌクレオ
チドでの処理と共に又は処理後に、患者は、放射線療法で処理される、この場合、前記放
射線療法は、紫外線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、Ｘ線および電子線を含んで
いる。
【００８３】
この発明の他の側面で、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコン
ドリアキメラＲＮＡの機能で腫瘍細胞死の阻害は、ＲＮＡ阻害又はＲＮＡサイレンシング
によりもたらされる。
過去6年にわたって、ＲＮＡ阻害(RNAi)は、哺乳類細胞中の遺伝子サイレンシングに対
する新規で有望なアプローチとして浮上してきている(Elbashir et al., Nature 411:494
-498, 2001;McManus et al., Nature Rev. Genet. 3:737-747, 2002)。
長さで約１９から２１のヌクレオチドの合成的に合成された二重鎖のＲＮＡ分子は、ｍ
ＲＮＡの分解とその後の蛋白質ノックダウンをもたらす、特にそれらの相補的標的ｍＲＮ
Ａにハイブリダイズする。
いくつかの異なる遺伝子は、小さなＲＮＡ又はsiＲＮＡ阻害により成功裡にサイレン化
される(Lu etal., Curr. Opin. Mol. Ther. 5:225-234, 2003.; Wacheck et al., Oligo
nucleotides13:393-400, 2003)。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標
的とする１９から２１のヌクレオチドの合成された二重鎖のＲＮＡは、これらの転写産物
を分解して、腫瘍細胞死を誘発する。
当該分野の技術者は、siＲＮＡの配列がアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又は
センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID N
O 4, SEQ ID NO5, and SEQ ID NO 6)のいかなる領域にも相補する必要があることは理解
するだろう。
【００８４】
この発明の他の態様で、リボザイムは、腫瘍細胞死を誘発するためにアンチセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを阻害するのに用いるこ
とができる。
リボザイムの配列は、腫瘍細胞死を引き起こすのにより効果的な転写産物の特定の領域
を開裂するために、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4, SEQ ID NO
5, SEQ ID NO 6)又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQID NO 1, SEQ ID NO 2, SE
Q ID NO 3)の配列によりデザインされなければならない。
リボザイムは、ＲＮＡの特定の開裂を触媒することが可能な酵素ＲＮＡ分子である(Ros
si, Curr.Biology 4:469-471, 1994)。
【００８５】
リボザイム作用のメカニズムは、標的ＲＮＡに相補するリボザイム分子の配列の特定の
ハイブリダイゼーションを含み、その後エンドヌクレアーゼ的に切断する。
リボザイム分子の構成は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補する1つ以上の配列を含んでいる
と予想され、ｍＲＮＡ開裂の原因であることがよく知られ、また米国特許番号5,093,246
（これは参照によってその全部がここに組み入れられる）に記述された触媒配列を含んで
いると思われる。
本発明の範囲内において、ハンマーヘッドリボザイム分子は、アンチセンスミトコンド
リアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断を
特異的及び効果的に触媒するように作り出されている。
ハンマーヘッドリボザイムの構造と生産は、当該分野でよく知られており、また記述さ
れている(Haseloffet al., Gene, 82:43-52, 1989)。
本発明のリボザイムは、更にＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを含んでいる(Zaug et al.
, Science,224:574-578, 1984)。
【００８６】
遺伝子治療は、癌にかかっている患者か、癌の予防あるいは禁止が望ましい患者への核
酸の投与によって行なわれる癌の治療あるいは予防に言及する。
本発明のこの態様では、細胞内で生産された治療用核酸は、腫瘍細胞死を誘発するこれ
らのミトコンドリア転移産物の機能を阻害又は禁止することによる治療の影響を調節する
、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標
的にする相補的ＲＮＡである。
従って、1つの好ましいアプローチは、アンチセンスＲＮＡの転移産物がＲＮＡポリメ
ラーゼII又はIIIの強いプロモーターの制御下で置換された、組み換えられたＤＮＡの利
用である。
相補的ＲＮＡをコード化する配列は、ほ乳類、好ましくはヒト細胞中で作用するその技
術分野で知られているいかなるプロモーターでも発現する。
【００８７】
このようなプロモーターは、限定されるものでないが、ＳＶ４初期プロモーター領域(B
enoist andChambon, Nature 290:304-310, 1981)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター(Wagneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445, 1981)、メタロチ
オネイン遺伝子の調節塩基配列(Brinster et al., Nature 296:39-42, 1982)、ラウス肉
腫ウイルス(Yamamotoet al., Cell 22:787-797, 1980)、等を含む。
相補的ＲＮＡを生産する組み換えられたＤＮＡ構造は、限定されるものでないが、アデ
ノウィルス・ベクター、アデノ関連性ウィルス・ベクター、単純ヘルペスウィルス・ベク
ター、ワクシニアウィルス・ベクター、及びレトロウィルス・ベクターを含むウィルス・
ベクターにすることができる。
当該分野の技術者によく知られている方法を使用して、このベクターは、製薬組成物と
して標的腫瘍細胞中に導入される。
【００８８】
薬学的に受理可能なキャリヤーにおける相補的核酸（相補的オリゴヌクレオチド、siＲ
ＮＡ、リボザイム、又はウィルス・ベクター）の効果的量からなる、本発明の薬剤組成物
は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの
作用を阻害するために癌患者に投与され、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する。
相補的な核酸は、薬剤組成物中に配合される、この薬剤組成物は、キャリヤー、希釈剤
、バッファー、予防薬、界面活性剤、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）、リポソームあるい
はこの分野で周知の他の脂質製剤を含めることができる。
前記薬剤組成物は、局所適用、経口、非経口又は直腸投与によって投与される。
非経口投与は、静脈、皮下、腹腔内、又は筋肉注射、又は吸入又は通気による肺内投与
を含んでいる。
【００８９】
本発明の組成物は、治療学、診断学、予防処置、そして研究試薬およびキットとして利
用することができる。
ここに提供される組成物及び方法は、癌の治療に特に役立つと考えられる。
ここに提供される用語「癌」は、次の識別された特異な条件のうちのいずれか1つで悩
まされる細胞を含んでいる。
これらは、急性慢性である脊髄性白血病、急性慢性であるリンパ芽球白血病、多発性骨
髄腫、ホジキン病、非ホジキンのリンパ腫あるいは悪性リンパ腫;胃癌、食道癌又は腺癌
、膵臓送管の腺癌、インシュリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、多発性胃潰瘍、
小さな腸腺癌、結腸直腸癌；肝細胞性の癌、肝細胞性の腺腫；類癌腫、腎臓腺癌のような
尿生殖器官、ウイルム腫瘍（Wilm's tumor）、膀胱および尿道癌及び前立腺腺癌、精上皮
腫のような精巣癌、奇形腫、奇形癌、間質細胞癌腫；子宮内膜の癌、子宮頚癌、卵巣癌、
外陰癌と膣癌、セルトリ-Ｌ-アイディグ（Sertoli-L-eydig）細胞癌、黒色腫および卵管
癌；肺、歯槽と細気管支の癌;脳腫瘍；皮膚悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌及
びカルポシ(Karposi)肉腫を含む。
繊維肉腫、心臓の血管肉腫と横紋筋肉腫、及び他の悪性癌は、当該分野の熟練技術者に
よく知られている。
ここに提供される用語「癌細胞」は、上記の識別された特異な条件のうちのいずれか1
つで悩まされる細胞を含んでいる。
次の例は、本発明の様々な側面の実行のために最良の方法を述べるだけでなく、上記の
記述された発明を使用する方法について記述する役割を果たす。
これらの例は、本発明の範囲を少しも制限することはなく、むしろこれらは実例となる目
的のために示されることが理解される。
【実施例】
【００９０】
[実施例１]
センスミトコンドリアヒトキメラＲＮＡの分離と配列
(図１Ａ、SEQ ID NO1)
最初の実験は、推定のヒトセンスミトコンドリアキメラＲＮＡがより複雑で安定な、マ
ウスのキメラＲＮＡである第二の構造を含むことを示した(Villegas et al., DNA & Cell
Biol.19:579-588, 2000; Villegas et al., Nucleic Acids Res. 30:1895-1901, 2002)
。
それ故、またマウスミトコンドリアキメラＲＮＡの第二の構造に基づき、理論的なヒト
のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの第二の構造が、推定された(図１Ａ)。
理論的なヒトの転写産物は、未知の長さ(図１Ａ)のループを形成するアンチセンス１６
ＳミトコンドリアＲＮＡのフラグメントに５’末端で結合しているセンス１６Ｓミトコン
ドリアＲＮＡの完全な配列を含んでいた。
アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡのセグメントは、センス１６Ｓミトコンドリ
アＲＮＡに十分に相補した、またそれゆえセンス１６Ｓ転写産物の５’末端に結合する逆
方向反復配列に相当する。この構造に基づき、プライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによるこの推
定の転写産物を増殖するようにデザインされた。
１つのリバースプライマーは、ヒトセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端から
１１から３１に位置、又は理論的ループの始点に位置していた（プライマー１、図１Ａ）
（SEQ IDNO 1）。
【００９１】
用いたフォワードプライマーの配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの位置２１
３−２３４の配列で、図１Ａの中のプライマー３に相当する。
ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０、Ｄｕ１４５、ＭＣＦ／７及びヒトのリンパ細胞を含むヒト
の組織と細胞からＲＮＡの増殖は、プライマー１と３（図１Ａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲに
よりＰＨＡ（実施例７参照）で刺激され、約２１０ｂｐの固有のアンプリコン(図２)を産
出する。
ＲＴ−ＰＣＲは、前記した方法で実施した(Villegas et al., DNA & Cell Biol. 19:57
9-588, 2000;Villegas et al., Nucleic Acids Res. 30:1895-1901, 2002)。
個々のヒトの組織あるいは細胞からのアンプリコンは、クローン化された、また両鎖は
配列された。
すべての場合に、２１６ｂｐの同一鎖が得られ、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの
５’末端の最初の３１ヌクレチドに結合している１８４ヌクレチドの逆方向反復配列を含
んでいた。
その後、我々は、逆方向反復配列が１８４ヌクレチドより長いか、またアンチセンス１
６ＳミトコンドリアＲＮＡ（図１Ａ）の５’末端に向かって更に拡張しているかを決定し
た。
前記したＨｅＬａ細胞又は他の細胞からのｃＤＮＡは、前記したようにループに位置す
るリバースプライマー１と、推定のより長い逆方向反復配列の５’末端に向かってウォー
クするプライマー４から７との間で増殖された（図１Ａ）。
このアプローチを用いて、プライマー1が、プライマー４、５及び６とそれぞれ結合す
るのに使用されたとき、およそ５００、７００及び８００ｂｐの増殖フラグメントが得ら
れた。
【００９２】
他方、ｃＤＮＡがプライマー１とプライマー７の間で増殖されたとき、増殖産物は得ら
れなかった、これは、逆方向反復配列の５’末端がプライマー７とプライマー８の間であ
ったためと推定される（以下を参照）。
前記８００ｂｐのアンプリコンの完全な配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ(S
EQ ID NO 1)(図１Ａ)の最初の３１ヌクレオチドに結合する７６９ヌクレオチドの逆方向
反復配列を示す。
センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合する逆方向反復配列の３’末端で配列は、２
１６ｂｐのアンプリコンの同じ領域に見出されるものと同一である。このことは、重要で
ある、なぜなら両者の場合に我々は、同じＲＮＡを増殖していたからである。
更に、配列は、アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの３’末端のその５０ヌクレ
オチドがセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの逆方向反復配列中には見当たらない、こと
を示した。
すべて、これらの結果は、二重鎖構造が逆方向反復配列と後者の５１の位置で始まるセ
ンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡとの間で形成され、また５０ヌクレオチドの推定ループ
を形成することを示唆する。
【００９３】
ループのサイズを確認するために、ヒトのｃＤＮＡは、逆方向反復配列の３’末端に位
置するフォワードプライマー２と、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ（図１Ａ）の位置
２１３−２３４でまたリバースであるプライマー３との間でＰＣＲにより増殖された。お
よそ２４０ｂｐのアンプリコンが得られた、またこの配列は、センス１６Ｓミトコンドリ
アＲＮＡの最初の２３４ヌクレオチドが逆方向反復配列の３’末端の最後の２５ヌクレオ
チドに結合していたことを示した。逆方向反復配列の２５ヌクレオチドの配列は、センス
１６ＳミトコンドリアＲＮＡの位置５１から７５（図１Ａ）に十分に相補していた。
【００９４】
プライマー１と６で得られたアンプリコンの配列、及びプライマー２と３で得られたア
ンプリコンの配列がコンティグのように組い立てられる場合には、ヒトセンスミトコンド
リアキメラＲＮＡの新たな構造は、５０ヌクレオチドのループと少なくとも７６９ｂｐの
二重鎖構造であることを確認した（図１Ａ）(SEQ ID NO 1参照)。
【００９５】
二重鎖ＲＮＡは、RNaseAによって消化されないので、ヒトセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡのステムは、この酵素に耐性がなければならない。一方、ループ又は二重鎖を越
えて拡張したセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ鎖の３’の領域は、酵素により消化され
なければならない。
ＨｅＬａ細胞又は他の細胞からのＲＮＡは、RNase A（50μｇ／ｍｌ）によって消化され
、続いてフェノール抽出された、そしてヌクレアーゼ耐性物質はエタノール沈殿により回
収された。
消化されたＲＮＡからのｃＤＮＡは、図１Ａに示すプライマーを用いてＰＣＲにより増
殖された。
プライマー１と６で得られた約８００ｂｐのアンプリコンは、ループが酵素により消化
されたことを示すRNaseA消化後には増殖されなかった。図１Ａに示したようにプライマ
ー１０と１１で得られた３６０ｂｐのアンプリコンと同じであった。
すべて、これらの結果は、ステムを超えて拡張したセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ
の３’領域だけでなくループも酵素により消化されたことを示した。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡの二重鎖の構造に一致しまたプライマー８と６で得
られた７５０ｂｐアンプリコンの増殖は、RNase A消化により影響されなかった。
リボ核酸消化に耐性を示す二重鎖フラグメントの配列は、予期されたステムの配列と同
一であった。
【００９６】
センスミトコンドリアキメラＲＮＡの逆方向反復配列の５’末端を決めるために、RNas
e A消化後に得られた転写産物のステムは、５’ＲＡＣＥ分析に用いられた。
逆方向反復配列の５’末端決定は、メーカーのインストラクション（Invitrogen）に従
って行われた。
この結果は、逆方向反復配列がプライマー１と６を用いたセンスミトコンドリアキメラ
ＲＮＡの増殖後に得られたアンプリコンの５’末端から４６の付加的ヌクレオチドに伸び
ていることを示した。
要約すると、８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列は、１６ＳミトコンドリアＲＮＡの
最初の８６５ヌクレオチドの５’末端に結合している。この転写産物の配列は、ヒト１６
Ｓミトコンドリア遺伝子（ＨとＬ鎖）(SEQ ID NO 1)と９９．８％の同一性を示した。二
重鎖ステムの両端の５’末端は、５’ＲＡＣＥにより確認された。
【００９７】
上記の結果は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡが８１５塩基対のステムあるいは二
重鎖構造と５０ヌクレオチドを含んでいたことを示した。
しかしながら、これらの結果は、逆方向反復配列が完全な１６ＳミトコンドリアＲＮＡ
に結合していることを立証するものではない。３’末端から完全なｃＤＮＡの合成のよう
な従来のアプローチの使用は役に立たない、なぜなら転写産物の二重鎖構造は、Ｔｔｈを
含む逆転写酵素に対し克服できない問題を示すからである(Myers and Gelfand, Biochemi
stry30:7661-7666, 1991)。
もし８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列が１６ＳミトコンドリアＲＮＡの１５５９ヌ
クレオチドに結合したら、２．３Ｋｂの転写産物が予期できる。
ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０及びＭＣＦ／７細胞から全ＲＮＡのノーザンブロット分析は
、^３２Ｐで標識されたプローブを用いて行われ、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの二
重鎖構造を標的にした。その結果は、１．６Ｋｂのバンドを除いて、センスミトコンドリ
アキメラＲＮＡとセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡにそれぞれ対応する約２．４Ｋｂの
バンドを示した。
もし前記ＲＮＡがノーザンブロットより先にRNase Aで消化されたら、およそ０．８Ｋ
ｂのシングルハイブリダイゼーションバンドが得られた、これはセンスミトコンドリアキ
メラＲＮＡのステムのサイズに相当する。
すべて、これらの結果は、前記センスミトコンドリアキメラＲＮＡが完全なセンス１６
ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に結合した８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列を含
んでいて、SEQID NO 1に相当していた、ことを強く実証した。
【００９８】
逆方向反復配列とセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ間の結合領域を、ヌクレオチドプ
ローブを用いて具体的に検出することが可能である。
プローブは、逆方向反復配列の３’末端とセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ間の結合
点の各サイドで７から１０のヌクレオチドを含まなければならない。
このオリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーション、又はＲＴ−ＰＣＲもし
くはこの新規なＲＮＡを検出するための分野の技術者によく知られた任意の方法による増
殖に用いることができる。
【００９９】
センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常な増殖細胞（ヒトの包皮角化細胞、脾臓、
ＰＨＡで刺激されたリンパ球、マウス胚）中、前癌細胞（ＨＰＶ１６又は１８で形質転換
された角化細胞、ＨＴＬＶ−１で形質転換されたＭＴ−２細胞）中に、そして癌細胞中に
存在する。正常な休止細胞中には存在しない。これらの結果の要約は、表１（実施例４）
に示されている。
【０１００】
[実施例２]
乳頭腫ウィルスで形質転換されたヒトの角化細胞は、新規なセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡを合成する(図１Ｂ、SEQID NO 2)
ヒトの包皮角化細胞(ＨＦＫ)は、ヒトの乳頭腫ウィルス１６（ＨＰＶ１６）に既に感染
した細胞溶解物を用いた培養により形質転換された。
この細胞は、３部のＫ−ＳＦＭ、１部のＤＭＥＭ培地（Invitrogen）、５ｎｇ/ｍｌの
下垂体抽出物、及び１０％の子牛胎児血清で培養された。
培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２であった。２４時間の感染後、形質転換されたＨＦＫ
は、が新しいフラスコに転送され、同じ条件下で培養された。
この後に、細胞(HFK698)は、１：４から１：３の分離比率を使用して、３日ごとに新し
い培養フラスコに連続的に転送された。
１９継代後に、細胞(HPV16で形質転換されたHFK698)は、記載したように集菌され(Haus
en,Biochim.Biophys. Acta, 1288:F55-F78, 1996)、１０分間の３００×ｇでの遠心分離
で集められ、そして塩性のリン酸塩バッファー(PBS)で2度洗浄された。
全ＲＮＡは、トリゾール(Invitrogene)で洗浄された細胞から抽出された。
約２００ナノグラムのＲＮＡは、実施例１に記載したようにランダムのヘキサマー（he
xamers）でｃＤＮＡを合成するために使用された。
【０１０１】
ｃＤＮＡは、図１Ａに記述されているように、リバースプライマー１とフォワードプラ
イマー３を用いてＰＣＲにより増殖された。
この増殖プロトコルは、予期した２１０ｂｐのアンプリコンを生じた、ここでセンス１
６ＳミトコンドリアＲＮＡの最初の３１ヌクレオチドは、実施例１に記述したように１８
４ヌクレオチドの逆方向反復配列に結合していた。
この増殖製品の電気泳動分析は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当する２１０
塩基対のアンプリコンと、図２に示すように約１５０塩基対の他の増殖フラグメントの存
在を示した。この新しいフラグメント(SEQ ID NO 2)の完全な存在は、センス１６Ｓミト
コンドリアＲＮＡの５’ 末端から最初の３１のヌクレオチドが１２１ヌクレオチドの逆
方向反復配列に結合されており、これはSEQ ID NO 1のセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａの逆方向反復配列と比較すると、６３ヌクレオチドより短い。
【０１０２】
このより短い逆方向反復配列は、ミトコンドリアキメラＲＮＡの構造においてＲＮＡ９
６ヌクレオチド（図１Ｂ）のより長いループを生成する。
配列の残部は、SEQID NO 1と同一である。
この新規なミトコンドリアキメラＲＮＡは、ＳｉＨａ細胞(図４Ａ)には存在しない、こ
れは、ＰＨＡで刺激されたヒトリンパ球のような増殖型細胞中にも存在しない、ＨＰＶで
形質転換された発癌性細胞である（実施例参照）。
同様の結果は、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８で形質転換された又は不滅化された（しかし
発癌性ではない）細胞は、前−悪性細胞と考えられ、それ故新規なセンスミトコンドリア
キメラＲＮＡは、前−悪性細胞の新規なポテンシャルマーカーである。
【０１０３】
１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合しているSEQ ID NO 2の逆方向反復配列の３’末端
の配列がSEQID NO 1の同じ領域とは異なるので、オリゴヌクレオチドプローブは、この
転写産物の特別の検出に用いることができる。
このプローブは、逆方向反復配列の３’末端とSEQ ID NO 7のオリゴヌクレオチドのよ
うなセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの始めとの間の結合点の各端で７ないし１０のヌ
クレオチドを含まなければならない。
このオリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーションもしくはＲＴ−ＰＣＲに
よる増殖、又は前癌細胞のこの新規な特別のマーカーを検出する、この分野の技術者によ
く知られた任意の方法に用いることができる。
【０１０４】
[実施例３]
HTLV-1で形質転換されたヒトMT-2細胞は、第３の新規なセンスミトコンドリアキメラＲ
ＮＡの発現を誘発する(図１Ｃ、SEQ ID NO 3)。
HTLV-1で形質転換されたヒトMT-2細胞は、記述された方法で培養された(Kobayashiet
al., EMBO J.,3:1339-1343, 1984)。
細胞は集菌され、３００×ｇで１０分間遠心分離され、ＰＢＳで２度洗浄された。最後
の細胞ペレットは、実施例１で記述したようにトリゾールで抽出された。
ｃＤＮＡは、ＲＮＡを鋳型として用いてランダムヘキサマーで合成された、またｃＤＮ
Ａは、リバースプライマー１および図１Ａに記述されるようなフォワードプライマー３を
使用して、ＰＣＲにより増殖された。
以前に記述したように、この増殖プロトコルは、実施例１に記述したセンスミトコンド
リアキメラＲＮＡに相当する、１８４ヌクレオチドの逆方向反復配列に結合したセンス１
６ＳミトコンドリアＲＮＡの最初の３１ヌクレオチドを含む２１０塩基対のアンプリコン
を生ずる。
増殖産物の電気泳動分析は、すでに記述された２１０塩基対のアンプリコンの存在に加
えて、約１５０塩基対のバンドを示した(図２を参照)。
【０１０５】
この１５０塩基対のアンプリコンの配列は、ＨＰＶ１６あるいはＨＰＶ１８(SEQ ID NO
2)で形質転換された細胞中で発現する第２のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当
する、実施例２で記述したアンプリコンの配列に同じである。
更に、新しい増殖産物は、約１００ｂｐであることが見出された(図２)。
この第３のアンプリコンの配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に結
合して、１６７ヌクレオチドのループを発生する、６１ヌクレオチドの逆方向反復配列を
示した(図１Ｃ；SEQID NO 3)。
この新規なアンプリコンは、正常細胞中に、腫瘍細胞中にまたＥＰＶ１６あるいは１８
で形質転換された細胞中には存在しなかった。
従って、この新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、発癌性レトロウイルスで形
質転換された細胞のポテンシャルマーカーである。
【０１０６】
１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合しているSEQ ID NO 3の逆方向反復配列の３’末端
の配列は、SEQID NO 1及びSEQ ID NO 2の同じ領域とは異なるので、オリゴヌクレオチド
プローブは、この転写産物の特定の検出に用いることができる。
このプローブは、逆方向反復配列の３’末端とSEQ ID NO 8のオリゴヌクレオチドのよ
うなセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの始まりとの間の結合点の各端で７から１０のヌ
クレオチドに及ばなければならない。
このオリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーションもしくはＲＴ−ＰＣＲに
よる増殖、又はレトロウィルス腫瘍ウィルスで形質転換された細胞のこの特別なマーカー
を検出する、この分野の技術者によく知られた任意の方法に用いることができる。
【０１０７】
[実施例４]
ヒトアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造
我々の最初の実験は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当するキメラＲＮ
Ａの第二のファミリーは、いくつかの細胞研究に存在することを示した。
ヒトアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造を決定するために、センスミトコ
ンドリアキメラＲＮＡに用いられる方法が採用された（図１）。
理論的なアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、アンチセンス１６Ｓミトコンド
リアＲＮＡの５’末端に結合している逆方向反復配列としてのセンス１６Ｓミトコンドリ
アＲＮＡのフラグメントを含んでいた。
後者のＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡのＬ−鎖から転写され、そして１６Ｓミトコン
ドリア遺伝子に相当する（図３）。このＲＮＡを増殖するために、リバースプライマーは
アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に接近してハイブリダイズされた、
またフォワードプライマーは、逆方向反復配列（図３）の推定のフラグメントの異なる位
置でハイブリダイズされた。
ＰＨＡで４８時間刺激されたヒトリンパ球からの全ＲＮＡは、鋳型として用いられた。
ｃＤＮＡは、実施例１に記載したようにランダムヘキサマーで合成された。
【０１０８】
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増殖は、アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端
の始めに接近した位置でのリバースプライマー（プライマー１、図３）及び逆方向反復配
列（図３）上に位置する異なるフォワードプライマーで行われた。
３つの主なアンプリコンだけが得られた、これは逆方向反復配列のサイズとループのサ
イズで異なっていた。
これらのアンプリコンは、精製され、配列が決定された。これらのアンチセンスミトコ
ンドリアキメラＲＮＡの１つは、３６５ヌクレオチドの逆方向反復配列と１７のヌクレオ
チド(SEQ IDNO 4)のループを含んでいる。
他のＲＮＡは、９６ヌクレオチドのループと１８９ヌクレオチド(SEQ ID NO 5)の逆方
向反復配列を含んでいる。
更に、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの他の種は、２９６ヌクレオチドの逆
方向反復配列と４５１ヌクレオチド(SEQ ID NO 6)のループを含んでいる。
３つのアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのすべての配列は、ミトコンドリアＤ
ＮＡ遺伝子（HとL鎖）の配列と９９．８％同一であった。
【０１０９】
以下の例において示される結果は、前腫瘍及び腫瘍細胞と、アンチセンスミトコンドリ
アキメラＲＮＡの発現にかかわる正常な増殖細胞との間に大きな違いがあることを示す。
増殖する細胞はすべてセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
しかしながら、一方正常な増殖細胞もまたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現す
るが、これらの転写産物は、腫瘍細胞中では下方制御される。非増殖細胞又は休止細胞は
共にミトコンドリアキメラＲＮＡを発現しない。
従って、これらの異なる発現は、発癌の新規で有効なマーカーであることを示し、これ
はin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲもしくはＴＭ
Ａ又はこの分野の技術者に知られている他の技術により検出できる。
センスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの異なる発現の要約は、表１に示さ
れている。
【０１１０】
【表１】

【０１１１】
[実施例５]
腫瘍細胞系は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)を過剰発現し、またア
ンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4,5及び6)の発現を下方制御する。
in situハイブリダイゼーションは、培養中の腫瘍細胞系でセンスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡの発現を決定するのに用いられた。in situハイブリダイゼーションに対し、粘
着性腫瘍細胞は、８−ウエルのチャンバースライド(Lab-TekO, NUNC)中で、アメリカン組
織培養収集（AmericanTissue Culture Collection）(ATCC)により推奨された適切な培地
と条件を用いて３７℃で２４ないし４８時間培養された。
非粘着性細胞(e.g.HL-60, Jurkat and Ramos)に対しては、小さなフラスコ中で３７℃
で４８時間培養された。細胞は、３００×ｇで１０分間遠心分離により回収され、ＰＢＳ
の小さな容量中に再懸濁され、そして１０から２０ｕｌのアリコートは、あらかじめポリ
リシン又はマッスル（mussel）から精製された接着タンパク質でコートされたガラススラ
イド上に塗布された(Burzioet al, Curr. Opin. Biotechnol., 8:309-312, 1997)。細胞
は室温で３０分間乾燥された。
【０１１２】
前記細胞は、ＰＢＳで3回洗浄され、４％のパラホルムアルデヒドで室温下１０分間固
定された。スライドはその後ＰＢＳで５分間３度洗浄され、0．2Ｎ ＨＣｌで室温下１０
分間インキュベートされた。
該細胞は、更に３度、最初は室温下にＰＢＳで、その後２×ＳＳＣで１０分間（2×SSC
:0.3MのNaCl、30mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）洗浄された(Sambrook et al., 1989)。
プレハイブリダイゼーションは、4×SSC、１０％硫酸デキストラン、１５０μｇ／ｍｌ
酵母ｔＲＮＡ及びニシン精液ＤＮＡ、５０％のホルムアミド及び1×Denhardt溶液（0.2mg
/mlのFicollタイプ400、0、2mg/mlのポリビニルピロリジン、0.2mg/mlのBSA）を含む溶液
中で３７℃で３０分間行われた。ハイブリダイゼーションは、センスとアンチセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡを標的にする３．５ｐｍｏｌのプローブを含む同じプレハイブリ
ダイゼーション混合物中３７℃で１５時間行った。
前記プローブは、センスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの配列の異なる領
域をターゲットにする２０以上のデオキシヌクレオチドを含んでいた(SEQ ID NO 99〜197
及びSEQ IDNO 9〜98をそれぞれ参照)。プローブは、既に記述したように予めジゴキシゲ
ニン-11-dUTP(Roche)とターミナル・トランスフェラーゼ(Promega)を用いて３’末端でラ
ベル表示された(Villegaset al., DNA & Cell Biol., 19:579-588, 2000)。
過剰のプローブを除去するために、スライドは、室温で、最初2×SSCで１０分間及び1
×SSCで１０分間洗浄された。その後、サンプルは室温で0.2×SSCで４５℃３０分間、及
び最後に0.2×SSCで１０分間洗浄された。
【０１１３】
ハイブリダイゼーション後、細胞はブロッキング緩衝液中(1%BSA、0.3%トリトンX-100
in PBS)中で３０分間インキュベートされ、その後予めブロッキング緩衝液中で１：５０
０に希釈され、アルカリ性ホスファターゼに結合しているアンチ−ジゴキシゲニン単クロ
ーン抗体を用いて室温で２時間インキュベートされた。
最後に、スライドは、PBSで2度洗われた、そして呈色反応は以前に記載したようにＢＣ
ＩＰ／ＮＢＴ基質混合物(DAKO)を用いて実行された(Villegas et al., DNA & Cell Biol.
, 19:579-588,2000)。同様の操作は、フルオレスセインまたはローダミンに接合される
アンチ−ジゴキシゲニン抗体を使用して、ＦＩＳＨに対して行われた。
【０１１４】
図４Ａと４Ｂに示されるように、SEQ ID NO 63に対応するジゴキシゲニンでラベル表示
したプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは、ヒト腫瘍細胞がセンスミトコ
ンドリアキメラＲＮＡを過剰発現することを示す。
ジゴキシゲニンでラベル表示した、SEQ ID NO 64に対応するセンスプローブを用いたin
situハイブリダイゼーションは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下
方制御を示して、ネガティブであった(図４Ａ及びＢ)。同じ結果は、センスあるいはアン
チセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの他の領域を標的にするオリゴヌクレオチドプロー
ブで得られた。
【０１１５】
[実施例６]
ヒト生体中の腫瘍細胞はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)を過剰発現
し、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NOS 4、5及び6)を下方制御する。
ヒトの生体は、病理学者あるいはDAKOからの組織アレーから入手した
分析されたほとんどのサンプルはパラフィンに埋め込まれていたか、またはホルマリン
で固定されていた。他の組織サンプルは、Boiun固定剤で固定されていた、また他のサン
プルは、新鮮な凍結組織切片であった。
約４ないし８μｍの組織切片は、予めポリリシン又はムラサキイガイ(Aulacomya ater)
から精製された接着性ポリフェノール蛋白質でコートされたガラススライド上に固定され
た(Burzioet al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:309-312, 1997)。
パラフィンに包埋された組織切片は、６０℃で１時間インキュベートされた、そしてパ
ラフィンは、キシロールで各１５分間３度洗浄により除去された。
切片は、空気乾燥され、ＰＢＳで４回洗浄された。その後、切片は、０．２Ｎ ＨＣｌ
を用いて、室温で１０分間インキュベートされた、そしてＰＢＳで十分に洗浄された。後
で、サンプルは、実施例４に記述されたプロトコルに従って、ジゴキシゲニンでラベル表
示されたアンチセンスプローブを用いてin situハイブリダイゼーションに供された。パ
ラレルセクションはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの同じ領域に対応するセンスプロ
ーブでハイブリダイズされた。
【０１１６】
図５Ａに示すように、胸、子宮頚部、膀胱の腫瘍及び肺の癌は、転移産物の強い存在を
示して、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするアンチセンスプローブで強く染
色されることを示した。他方、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするプ
ローブを用いたinsituハイブリダイゼーションは、この転写産物（図５Ａ）の下方制御
を示してネガティブであった。
他の腫瘍細胞もまたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現し、そしてアンチセ
ンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する（図５Ｂ）。
【０１１７】
[実施例７]
正常増殖細胞はセンス及びアンチセンストコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
実施例５及び６に記述されたin situハイブリダイゼーションで同じプロトコルを使用
して、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現は、増殖細胞で決定した。
図６に示すように、ＨＦＫ細胞、精原細胞、脾臓細胞、及び増殖型マウス胚は、センス
ミトコンドリアキメラＲＮＡの過剰発現を示唆する、強いハイブリダイゼーションシグナ
ルを示した。
対照的に、脳、筋肉及び肝臓の細胞のような非増殖細胞は、センスミトコンドリアキメ
ラＲＮＡが発現しないか又はこれらの細胞で下方制御されることを示唆して、シグナルを
示さなかった。
【０１１８】
しかしながら、驚くべき結果は、in situハイブリダイゼーションがアンチセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡを標的にするプローブで行われたとき、強いシグナルも観察され
た（図６）。
並行して分析されたいくつかの制御は、これらのプローブのハイブリダイゼーションシ
グナルが技術上の原因によらないことを示した。
もしinsituハイブリダイゼーションがジゴキシゲニンで非ラベル表示されたものを除
いて、過剰（５０ないし１００倍）の同じプローブと共にラベル表示されたプローブで行
われたら、ハイブリダイゼーションシグナルは消失した。
ハイブリダイゼーションに先立ちサンプルがリボヌクレアーゼＡで一晩インキュベート
された場合、ハイブリダイゼーションシグナルは消失した。
また、ハイブリダイゼーションが４つのミスマッチを有するアンチセンスミトコンドリ
アキメラＲＮＡを標的にするラベル表示されたプローブで行われた場合、ハイブリダイゼ
ーションシグナルは観察されなかった。
【０１１９】
[実施例８]
フィトヘムアグルチニン(PHA)で刺激された正常なヒトのリンパ細胞は、センス及びア
ンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。健康なドナーから５ｍｌの血液
がＥＤＴＡで集められた。この血液は、０．９％ＮａＣｌの１容積で希釈され、該混合物
は、遠心分離機チューブ中の５ｍｌのHistopaque-1077(Sigma)に適用された。このチュー
ブは室温下で２０分間８００×ｇで遠心分離された。
分裂期の白血球が集められ、０．９％のＮａＣｌの２容積で薄められ、室温で１０分間、
２５０×ｇで遠心分離された。集められた細胞は、けん濁され、２００ｍＭグルタミン、
１０ｍＭ非必須アミノ酸、ペニシリン、子牛の胎児血清を欠いているストレプトマイシン
が追加されたＲＰＭＩ１６４０倍地で２度洗浄された。
最後の沈殿物は、１０％子牛の胎児血清を含む同じ培地で再けん濁され、１ｍｌ当たり
のヒトリンパ球の数は、ノイバウエルチャンバー中の顕微鏡で数えて決定された。
【０１２０】
ヒトのリンパ球は、上記の追加されたＲＰＭＩ１６４０倍地に１０％の子牛の胎児血清
を添加した９６ウエルのマイクロリッタープレート中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培
養された。１ウエル当たり約30,000のリンパ球は、１０ｕｇ／ｍｌの（細胞増殖を誘発す
る）ミトゲンＰＨＡ存在、非存在下で培養された(Yu et al., J. Biol. Chem., 266:7588
-7595, 1991)。
ＰＨＡで処理後４８ないし７２時間後、細胞は、Ｈ３−チミジン又はＢｒｄＵの取り込
みにより立証されたように活発にＤＮＡ合成にたずさわった(Yu et al., J. Biol. Chem.
,266:7588-7595, 1991)。また、ＰＨＡで刺激された48時間後に、リンパ球は、増殖細胞
核抗原又はＰＣＮＡ及びＫｉ−６７のように、細胞増殖の他のマーカーを過剰発現した(B
antis et al.,Cytopathology, 15:25-31, 2004) (図7)。
休止中又はコントロール・リンパ細胞は、これらの抗原を発現しなかった(図7)。
【０１２１】
刺激されたリンパ球がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する否かを決定するた
めに、細胞は、ジゴキシゲニンでラベル表示され、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを
標的にするオリゴヌクレオチドプローブでin situハイブリダイズされた。
使用されたinsituハイブリダイゼーションプロトコルは、実施例５に記載された。
この転写産物の過剰発現を示唆する、強いハイブリダイゼーションシグナルが得られた
(図7)。ハイブリダイゼーションシグナルは、腫瘍細胞又は他の正常増殖細胞で観察され
たシグナルと同程度であった(図７を図４ＡとＢ、図５ＡとＢと比較)。
ハイブリダイゼーションシグナルは、ＰＨＡなしでインキュベートされたコントロール
リンパ球には観察されなかった(図7)。
【０１２２】
このiｎsituハイブリダイゼーションがジゴキシゲニンでラベル表示され、アンチセン
スミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするセンスオリゴヌクレオチドを用いて行なわれ
た場合、同様に強いハイブリダイゼーションシグナルが得られた（図７）。
いくつかのコントロールは、ハイブリダイゼーションシグナルが技術上の原因よる可能
性を否定するために行なわれた。
ハイブリダイゼーションシグナルは、もしin situハイブリダイゼーションが過剰（５
０ないし１００倍）の（ジゴキシゲニンでラベル表示されていない）同一センスプローブ
と共にセンスラベル表示プローブで行なわれるときには、消失する。
ハイブリダイゼーションに先立ちサンプルをリボヌクレアーゼＡで一晩インキュベート
すると、ハイブリダイゼーションシグナルは、消失する。
更に、ハイブリダイゼーションが４つのミスマッチを有するセンスプローブで行なうと
、ハイブリダイゼーションシグナルは、観察されない。対照的に、刺激を受けていないリ
ンパ球のinsituハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションシグナルを示さな
い（図７）。
結論として、増殖するために刺激された正常なヒトリンパ細胞は、センスミトコンドリ
アキメラＲＮＡ及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの双方を過剰発現する。こ
れらの転写産物は、休止細胞中では発現しない。
【０１２３】
[実施例９]
センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常な及び腫瘍細胞中で異なる局在化を示す。
実施例５と６に記述したin situハイブリダイゼーションは、ヒトの生検の腫瘍細胞中
だけでなくいくつかの腫瘍細胞系においても、センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、細
胞質中で選択的に局在化される。しかしながら、ある腫瘍生検において、核中の転写産物
の明らかな局在化が見出された（図４Ａ、Ｂ）。
【０１２４】
驚くべき発見は、核中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化であった。
実施例５に記載したように実施されたin situハイブリダイゼーションは、ＨｅＬａと
ＳｉＨａ細胞の核中にポジティブなハイブリダイゼーションシグナルを示した（図８）。
ハイブリダイゼーションシグナルは、ＨＰＶ１６で形質転換されたＨＦＫの核中で強くな
った（図８）。核の局在化は、また胸腫瘍及び横紋筋肉腫からの腫瘍細胞中にも見出され
た（図８）。
【０１２５】
共−局在化（co-localization）の研究は、細胞質で局在化したセンスミトコンドリア
キメラＲＮＡがミトコンドリアの外側で後期エンドゾーム／リゾソームと結合することを
示した。もし共−局在化の研究が分子プローブ(Mitotrack)又は抗体アンチ−シトクロム
ｃ(Promega)もしくはアンチ−エンドヌクレアーゼＧ(Chemicon)のようなミトコンドリア
のマーカーで行なわれる場合、in situハイブリダイゼーションは、弱い共−局在化を示
した。
しかしながら、完全な共−局在化は、リソトラック(Lysotrack)(Molecular Probes)又
はアンチ-ランプ-２(anti-Lamp-2)(BD Pharmigen)もしくはアンチカプサイシンＤ(anti-
cathepsin D)(Zymed)のような後期エンドゾーム／リゾソームの免疫細胞学でハイブリダ
イゼーションシグナル中に見出された。
【０１２６】
ＨｅＬａ細胞は、実施例５に記述したようなジゴキシゲニンでラベル表示されたオリゴ
ヌクレオチドプローブでin situハイブリダイズされた。
ポスト−ハイブリダイゼーションと洗浄操作後、細胞は、ローダミン(Roche)でラベル
表示されたアンチ−ジゴキシゲニン及びフルオレスセイン(BD Pharmingen)でラベル表示
されたanti-Lamp-2antibodyでインキュベートされた。暗所で室温下に３時間インキュベ
ートした後、スライドは洗浄され、マウントされてツァィス共焦点顕微鏡で分析された。
リソトラック（Lysotrack）又はアンチ−カテプシンＤ抗体がリソソーム分画として用
いられたとき、ランプ-２（Lamp-2）の局在化によるハイブリダイゼーションシグナルの
明らかな共−局在化が得られた。同様のハイブリダイゼーションシグナルの共−局在化結
果が得られた。
我々が知っている限り、これは、ＲＮＡ（特にミトコンドリア転写産物）が細胞のリソ
ソームに結合されたことを示す最初の報告書である。
腫瘍細胞中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化の決定は、癌を有する患者に
対する重要な予後の値となる。一般に、正常な増殖細胞中でセンス及びアンチセンスミト
コンドリアキメラＲＮＡは、主に核中に局在化される。
【０１２７】
[実施例１０]
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを用いて腫瘍細胞をin vitro処理すると細胞死を誘発する。
ＨＬ-６０細胞は、ＡＴＣＣによって推奨された最適条件の下で培養される。
約30,000個の細胞が９６―ウエルのマイクロタイタープレートで培養された。
センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド
（２ｕＭ）が加えられた。細胞の浸透性を増すために、オリゴヌクレオチドは、リプフェ
クタミン（lipofectamin）もしくはオリゴフェクタミン（oligofectamin）(Invitrogen)
又はポリエチレンイミド（PEI）を有する混合物中に添加された( Exgen TM500, Fermenta
s)。細胞に特に非毒性であるＰＥＩがより好ましい、
細胞は、オリゴヌクレオチドで６時間インキュベートされる、そして細胞残存の割合は
、トリパンブルーへの浸透性で決定される。
オリゴヌクレオチドで６時間インキュベートした後、細胞の主要な割合が死滅した。
しかしながら、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオ
チドは、細胞死を誘発するのに更に有効であった(細胞死の１５％に対し約９０％)。
【０１２８】
他方、細胞がセンスもしくはアンチセンス１２ＳミトコンドリアＲＮＡ又はＮＤ１サブ
ニットのｍＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド、又はスクランブルオリゴヌクレオチ
ドもしくは４つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド(これらのすべてはコントロー
ルとして使用された)で処理されたとき、細胞死は生じなかった。
これらの研究に用いられたオリゴヌクレオチドは、５’末端で最初の５ヌクレオチドま
た３’末端で最初の５ヌクレオチドにホスフォロチオエートリンケージを含んでいる。平
均して、１０の中央のヌクレオチドは、ホスフォジエステル結合を含んでいる。これらの
オリゴヌクレオチドを備えた細胞の処理がＤＮＡ断片化を引き起こすかどうか確証するた
めに、HL-60細胞は、オリゴヌクレオチドで６時間、以前に記述されたと同じ条件下でイ
ンキュベートされた。
約30,000個のHL-60細胞が、９６ウエルのマイクロチッタープレート上で、２００ｕｌ
のＩＤＭＥＭプラス１０％の子牛胎児血清中で、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標
的とする又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする１ｕＭのオリゴヌク
レオチドと共に培養された。
【０１２９】
ＰＥＩを含む混合物中に添加されたオリゴヌクレオチドの化学は、前節に記載したのと
同様である。オリゴヌクレオチドで６時間定温放置した後、細胞は、TUNEL分析(DeadEnd
の比色定量のTUNELシステム、Promega)を用いてDNA断片化のために分析された。
表２に示されるように、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とするオリゴ
ヌクレオチドで処理後、約９６％の細胞がＤＮＡ断片化を示した。同様のＤＮＡ断片化率
は薬物スタウロスポリンで得られた。スクランブルオリゴヌクレオチド又はミスマッチを
有するオリゴヌクレオチドは効力を示さなかった。
対照的に、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドで処理
されると、約２０％の腫瘍細胞はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方
制御し、そしてその結果これらの細胞は、この転写産物の少ないコピー数をもたらす（表
２）。
従って、細胞死は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌク
レオチドでより効率的に誘発される。
これらの結果は、腫瘍細胞中のアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの少ないコピ
ー数は、治療目的になる、ことを強く示唆する。
【０１３０】
【表２】

【０１３１】
別の研究で、我々は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌ
クレオチドで細胞を処理するとカスパーゼ活性を誘発する、ことを決定した。
カスパーゼは、プログラムされた細胞死あるいはアポトーシスに活発に伴う、蛋白質分
解を生ずる酵素である。ＨＬ-６０は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的
にするオリゴヌクレオチド、又はスタウロスポリンを用いて、以前に記述された培養条件
下で６時間、インキュベートされた。
その後、フルオレセインで結合したＶＡＤ-ｆｍｋ(CaspaCe FITC-VAD-FMK、Promega)を
培養に加え、３７℃で３０分間インキュベートされた。 VAD-fmokは、カスパーゼの強い
抑制剤で、非常に高い親和性でプロテアーゼに結合する(Gracia-Calvo et al., J. Biol.
Chem.,273:32608-32613, 1998)。
細胞は、遠心分離によって洗われ、標本化されて蛍光顕微鏡で観察された。
ズ９に示すように、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌク
レオチドで処理したＨＬ-６０細胞は、スタウロスポリンで達成された活性化と同様のレ
ベルで、カスパーゼ活性を誘発した。１２ＳミトコンドリアＲＮＡを標的にしたアンチセ
ンスのオリゴヌクレオチドでは、カスパーゼ活性は得られなかった。
【０１３２】
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドで処理した
細胞は、またアポトーシスに一致する他の変化を示す。電子顕微鏡分析は、核断片化およ
びクロマチン凝縮を示した。核断片化もＤＡＰＩで核を染色することにより実証された。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするこれらのオリゴヌクレオチドで
処理後、細胞は、ＤＡＰＩ染色で示されたように(図９Ｅ及び９Ｆ)、核断片化を受ける。
【０１３３】
[実施例１１]
アンチセンストコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで処理されると、
他の癌細胞も細胞死を被る。
他の癌細胞は、実施例１０に記載したプロトコルに従い、アンチセンストコンドリアキ
メラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで処理された。この細胞は、ＡＴＣＣのリコメ
ンドに従い、それらの最適条件下でインキュベートし、そして２ｕＭオリゴヌクレオチド
がＰＥＩと共に実験の初期段階で添加された。
６時間後に、オリゴヌクレオチドの２回目の添加を同様の濃度で実行し、結果は、実験
の開始の後１５時間で決定された。細胞死は、ＤＡＰＩ染色と断片化された核の細胞数を
数えることにより決定された。表３に示すように、オリゴヌクレオチドで処理された細胞
の７０％以上がアポトーシスを被った。
薬剤処理に全くの耐性を示すことが知られている、黒色腫細胞、リンパ腫細胞および胸
癌細胞ＭＣＦ／７は、非常に高い割合でアポトーシスを被ることに気づくことは重要であ
る（表３）。
【０１３４】
【表３】

【０１３５】
アポトーシスを誘発する際にオリゴヌクレオチドに対するより有効な標的となる転写産
物の領域があるかを決定するために、次の実験を行った。アポトーシスの誘発は、アンチ
センストコンドリアキメラＲＮＡの５’末端から始まっておよそ各３０ヌクレオチドを標
的とした、約２０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するＨｅＬａ、Ｈ
Ｅ-６０及びＭＣＦ／７細胞において研究された。
時間０では、１ｕＭオリゴヌクレオチドがＰＥＩと共に加えられた、そしてこの処理は
６時間後に繰り返された。処理開始後１５時間でアポトーシスを被る細胞の割合は、ＤＡ
ＰＩ染色と断片化された核を有する細胞を数えることにより決定された。
殆どのオリゴヌクレオチドは、変わりうる程度のアポトーシスを誘発したが、アンチセ
ンスミトコンドリアキメラＲＮＡの単一鎖領域は、細胞死を誘発するよい標的であった。
推定二重鎖又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのループ構造を標的にするオリ
ゴヌクレオチドは、それほど有効ではない
【０１３６】
アポトーシスは、またトリパンブルー染色、ヨウ化プロピジウム染色、アネキシン（an
exine）免疫化学により決定することができる。 これらの技術において、細胞は、蛍光
顕微鏡又はフロー・サイトメトリーにより分析することができる。ＤＮＡ断片化は、TUNE
L、あるいはＤＮＡラダーを示す電気泳動によって測定されうる。
ウエスタンブロット分析もまた、カスパーゼ、poly(ADP Rib)合成等のような蛋白質の
プロセッシングを決定するために使用することができる。
【０１３７】
[実施例１２]
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで正常増殖また
は休止細胞の処理は、アポトーシスに効果がない。以前に記載したように、正常増殖細胞
は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡと同様にセンスミトコンドリアキメラＲＮ
Ａを過剰発現する。
他方、休止細胞は、これらの転写産物を発言しない。
それ故、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドが正
常細胞において細胞死を誘発するかを決定することは重要である。ヒトリンパ細胞は、実
施例８に記述したように１０ｕｇ／ｍｌのＰＨＡで４８時間刺激された。
並行して、コントロールリンパ細胞がＰＨＡなしで４８時間インキュベートされた。
４８時間の培養では、ＰＥＩ（実施例１０参照）と混合した１５ｕＭのオリゴヌクレオチ
ドは、刺激されそしてコントロールされたリンパ細胞に添加された、そして更に１５時間
インキュベートされた。オリゴヌクレオチドの濃度は、以前の実験（１−２ｕＭ）に用い
た濃度よりも１０フォールド高かった。
刺激されそしてコントロールされたリンパ細胞の他の例は、同じ期間の間、０．４ｕＭ
スタウロスポリンで処理された。実験の終わりに、細胞死は、トリパンブルー染色又はＤ
ＡＰＩ染色のいずれかにより測定された。
図１０に示すように、コントロールリンパ細胞またはオリゴヌクレオチドを含まない１
５時間のインキュベートでＰＨＡ刺激されたリンパ細胞は、異なる実験で７から１０％間
の変動で自然におこるアポトーシスと同様のレベルを示した。
【０１３８】
同様の結果は、オリゴヌクレオチドのより低い(1-2 ｕＭ)濃度で得られた。
更に、１５ｕＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで１５時間インキュベートしたコント
ロール及び刺激されたリンパ細胞は、同じ低レベルのアポトーシス（およそ１０％）を示
した(図１０)。
対照的に、コントロールリンパ細胞又はＰＨＡ刺激され、スタウロスポリンで１５時間
インキュベートされたリンパ細胞は、８０％以上の細胞がアポトーシスを被ることを示し
た（図１０）。これは非常に重要な結果である、なぜならヒトリンパ細胞のような正常休
止細胞又は正常増殖細胞がアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌ
クレオチドによりアポトーシスを誘発するのに抵抗性であるからである。言いかえれば、
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡで阻害することにより、腫瘍細胞中のアポトー
シスの誘発が癌に対する選択的治療アプローチとなるからである。
【０１３９】
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【化１】

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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【公開番号】特開２０１３−６６４７８（Ｐ２０１３−６６４７８Ａ）
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２６９５８７（Ｐ２０１２−２６９５８７）
【出願日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【分割の表示】特願２００６−５３３２６７（Ｐ２００６−５３３２６７）の分割
【原出願日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（３１０００８９４１）アンデス　バイオテクノロジーズ　ソシエダード　アノニマ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＮＤＥＳ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ　Ｓ．Ａ．
【住所又は居所原語表記】Ａｖｄａ．　Ｚａｎａｒｔｕ　１４８２，Ｎｕｎｏａ，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｃｈｉｌｅ
【Ｆターム（参考）】