哺乳動物組織材料の前処理方法
【課題】 異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）の検出や測定値に悪影響を及ぼすことがなく、少ない工程数で短時間の内にその前処理を完了することが可能な、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法を提供する。
【解決手段】 採取した哺乳動物組織材料に、界面活性剤とプロティナーゼＫとを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理する可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備える。また、分解酵素混液に、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を添加する。
【解決手段】 採取した哺乳動物組織材料に、界面活性剤とプロティナーゼＫとを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理する可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備える。また、分解酵素混液に、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を添加する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物組織材料の前処理方法に係り、特に、プリオン病発症の際など哺乳動物組織に蓄積する異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）につき、主にウェスタンブロット法（ＷＢ法）や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡを含むＥＩＡ法）等による検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物のプリオン病には、ヒトにおける代表的疾患としてクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の他、遺伝性プリオン病であるゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＧＳＳ）や、致死性家族性不眠症、クールー（Ｋｕｒｕ）などがある。ＣＪＤは、病因が不明の散発性ＣＪＤ、遺伝性の家族性ＣＪＤ、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）からの経口感染による変異型ＣＪＤ〔例えば、非特許文献１参照〕、ヒト下垂体の抽出製剤やヒト由来硬膜、角膜等を介する感染による医原性ＣＪＤなどに区分されるが、異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）が中枢神経系に蓄積する点では共通している。一方、変異型ＣＪＤでは、扁桃などのリンパ組織にもＰｒＰＳｃが認められている〔例えば、非特許文献２参照〕。ＢＳＥは、ヒツジやヤギのスクレイピー臓器などにより汚染した配合飼料からの感染によるものとされており、スクレイピーと同様に中枢神経系などに変性を認めＰｒＰＳｃが沈着するが、リンパ組織にＰｒＰＳｃの沈着が認められない点でスクレイピーとは異なっている〔例えば、非特許文献３参照〕。
【０００３】
ＢＳＥについては、これまで組織病理学的、臨床学的、疫学的方法を用いて検出が行われており、脳幹（延髄）組織を採取し、正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）ではプロティナーゼＫ（ＰＫ）により完全に分解されるが、ＰｒＰＳｃの凝集体ではＰＫで分解した後に残る「ＰｒＰ２７−３０」と呼ばれるフラグメントをプリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するＷＢ法やＥＬＩＳＡ法を用いる検査キットが市販されている〔例えば、非特許文献４参照〕。このような検査キットによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための試料調製法（延髄組織からの前処理法）は、各検査キット毎に異なり、それぞれ操作手順が示されている。例えば、Ａ社製検査キットの前処理手順では、延髄組織５００±４０ｍｇをホモジナイザーバッグに取り、１６％メタノール混合１５％陰イオン性界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液を加えて２分間ホモジナイズし、５〜１０分間静置した後、ホモジネート（脳乳剤）１８０μＬを遠心用マイクロプレートに移して１８〜３０℃、２７５０×ｇにて５分間遠心分離する。次に上清１００μＬを、ＰＫ溶液２０μＬをあらかじめ入れたアッセイプレートに採取し、３４℃、６０分間、ＰＫ消化処理した後、塩酸グアニジン溶液１５０μＬを加えて３４℃にて１５分間変性処理している。
【０００４】
Ｂ社製検査キットの前処理手順では、延髄組織３５０±４０ｍｇを１．４ｍＬのブドウ糖液とビーズの入った２ｍＬマイクロチューブに入れ、ビーズ式破砕機を用いて完全にホモジナイズする。得られたホモジネート５００μＬを別の２ｍＬマイクロチューブに採り、２Ｍ 尿素を含むＰＫ溶液５００μＬを加えて３７℃にて１０分間、反応させた後、２５０μＬの１−ブタノールを添加、撹拌し、２００００×ｇにて５分間遠心分離する。得られた沈殿物を５分間乾燥した後、６Ｍ尿素５０μＬを加えて１００℃、５分間変性処理を行い、希釈液で６倍希釈するようになっている。
【０００５】
また、以上のような前処理法の他に、例えば、脳組織及び脾臓組織をハサミで細かく切り刻んだ組織サンプルについて、界面活性剤〔（８％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２（商品名）、カルビオケミカル社製）、サーコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ（商品名）、シグマ社製：Ｃ１５Ｈ２５ＮＯ３ Ｎａ）〕と、１００ｍＭ塩化ナトリウムと、５ｍＭ塩化マグネシウムと、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５のトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とを加えて、脳組織を均一化することによって、均一化物（ホモジネート）を作製し（第１の工程）、次に、第２の工程において、分解（消化）処理するものがある（例えば、特許文献１参照）。消化処理する第２の工程では、第１の工程で得たホモジネートを、０．５ｍｇ／１００ｍｇコラゲナーゼ及び４０μｇ／１００ｍｇのＤＮａｓｅを用いて、温度３７℃、４〜１２時間、分解（消化）処理を行い、さらに、５０μｇ／１００ｍｇのＰＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）を用いて、温度３７℃、０．５〜２時間、消化処理を行っている。次いで第３の工程において、反応を停止した後、回転数１５，０００ｒｐｍ、室温で２０分間遠心分離を行い、５％ドデシル硫酸ナトリウムで１０分間加熱溶解させ、ＰｒＰＳｃ含有の濃縮物を得ている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−３２７９５号公報、（実施例、第１図〜第３図など）
【非特許文献１】Ｗｉｌｌ，Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ Ｖｏｌ．３４７、ｐｐ．９２１−９２５（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ Ｖｏｌ．３４９、ｐｐ．９９−１００（１９９７）
【非特許文献３】Ｏ′Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．Ｉ． ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．３８、ｐｐ．３２５４−３２５９（２０００）
【非特許文献４】能田健、永井英貴、平沢緑著、獣医畜産新報、５６巻、９号、７１９〜７２５頁、（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記Ａ社及びＢ社検査キットの前処理手順、並びに、特許文献１に記載のＰｒＰＳｃの濃縮法などによれば、採取した哺乳動物組織材料に含まれるＰｒＰＣが分解され、ＷＢ法やＥＬＩＳＡ法等によりＰｒＰＳｃを検出又は測定するために適し、可溶化されたＰｒＰＳｃを高回収率にて含有する試料を調製することはできるが、前処理の工程数が多く操作が煩雑であり、処理に長時間を要するという問題があった。特に、ＢＳＥ検査の場合では、２０分間程で解体処理された動物の各処理体を、それぞれの検査結果が判明するまで冷凍又は冷蔵保管するための大規模な保管設備が必要となっている。また、単に各工程における処理時間を短縮したり、工程数を減らした場合には、ＰｒＰＣの分解や夾雑蛋白などの非特異物質の除去が不充分となったり、ＰｒＰＳｃの回収率が低下するなど、ＰｒＰＳｃの検出や測定値に影響を及ぼすという問題が発生する。
【０００８】
本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、ＰｒＰＳｃの検定や測定値に悪影響を及ぼすことがなく、少ない工程数で短時間の内にその前処理を完了することが可能な、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明による哺乳動物組織材料の前処理方法は、異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）の検出又は測定用試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法であって；採取した哺乳動物組織材料に、界面活性剤とプロティナーゼＫ（ＰＫ）とを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施すことによって、哺乳動物組織材料を可溶化すると共に正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）を分解する可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備えることを特徴とする。
【００１０】
このような哺乳動物組織材料の前処理方法において、哺乳動物組織材料が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれた哺乳動物の延髄組織又は中枢神経組織であることが好ましく、また、分解酵素混液が、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含むことが好適である。さらに、界面活性剤が、両性界面活性剤を含むものであることが好ましく、さらにまた、界面活性剤が、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤との組み合わせからなることが良い。そして、両性界面活性剤が、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はこれらの塩から１以上選ばれたものであることが好適であり、また、陰イオン界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）、ココイルサルコシンナトリウム、ドデカノイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、コール酸ナトリウム（ＳＣｈｏｌ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣｈｏｌ）、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムから１以上選ばれたものであることが良く、さらに、分解酵素混液中の界面活性剤の配合割合を０．１乃至３０重量％とすることが好ましい。
【００１１】
以上のような哺乳動物組織材料の前処理方法において、可溶化ＰｒＰＣ分解工程におけるホモジナイズ処理は、容器内にビーズを入れたビーズ式破砕機によって行うことが好ましく、また、可溶化ＰｒＰＣ分解工程において、ホモジナイズ処理したのち、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度で加温することが好適であり、さらに、可溶化ＰｒＰＣ分解工程におけるホモジナイズ処理を２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度条件下にて実施することもできる。そして、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ａ）を含むことが好適であり、また、前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、蛋白沈殿化剤を加えて撹拌後遠心分離して得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ｂ）を含むこともでき、さらに、このような蛋白変性処理工程で得られた蛋白変性処理済液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることが好ましい。なお、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤を加えるＰＫ阻害剤添加工程を含むことができ、さらに、このようなＰＫ阻害剤添加工程で得られた処理液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることも良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、界面活性剤とＰＫとを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施すことによって、哺乳動物組織材料を可溶化すると共に正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）を分解することから、ＰｒＰＳｃの検出や測定に悪影響を及ぼすことなく処理工程を減じることができ、処理時間の短縮が可能である。また、哺乳動物組織材料は、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなどプリオン病に羅患する可能性のある如何なる哺乳動物における、如何なる組織材料にも適応できる。動物組織材料のうち、例えばウシでは、ＰｒＰＳｃが最も多く蓄積すると言われており、比較的その可溶化が困難な延髄組織であっても１５分間以内程度の短時間のうちに効率良く澄明な状態に可溶化することができる。界面活性剤とＰＫに加えてＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含む分解酵素混液を用い、ホモジナイズ処理を行うことで、より確実に哺乳動物組織材料を可溶化すると共にＰｒＰＣを分解することが可能である。分解酵素混液に添加する界面活性剤として、例えば、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はこれらの塩から１以上選ばれた両性界面活性剤を用いることで、中動物乃至大動物の組織材料であっても、より短時間の内に澄明な状態にまで哺乳動物組織材料を可溶化できることがある。また、界面活性剤として、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤との組み合わせとすることで、哺乳動物組織材料をさらに効率良く可溶化できる場合がある。
【００１３】
可溶化ＰｒＰＣ分解工程において、ホモジナイズ処理したのち、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度で加温（インキュベート）することで、より確実にＰｒＰＣを分解し、ＰｒＰＳｃの検出や測定の感度、精度をさらに高める場合がある。蛋白変性処理工程（Ａ）として、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する方法を採用した場合には、処理液量が増加することがなく、蛋白変性処理工程の後段において遠心分離、再溶解操作などの濃縮工程を省略可能である点で有利である。蛋白変性処理工程（Ｂ）として、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ブタノールを加えて撹拌後、遠心分離して得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する方法を採用した場合には、ＰｒＰＳｃの検出、測定用の試料中から、検出、測定の感度や精度を低下させる可能性のある非特異物質を予め減少或いは除去できることもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の哺乳動物における哺乳動物組織材料の前処理方法を実施するための最良の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１５】
〔第１の実施形態〕
第１の実施形態による哺乳動物組織材料の前処理方法は、図１に前処理方法のフローを示すように、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料を調製するために採取された哺乳動物組織材料に、分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備えている。本第１の実施形態の前処理方法に用いられる哺乳動物組織材料としては、マウス、ラット、ハムスターなどの小動物からヒトを含むウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、ネコなどの中動物乃至大動物に至る如何なる哺乳動物の組織材料であっても適用できる。例えば、ＢＳＥの検査では、ＰｒＰＳｃが最も多く蓄積すると言われるウシ延髄の閂部組織について、病理組織検査や免疫組織化学検査による確定診断が行われており、ＷＢ法やＥＩＡ法等によるスクリーニングには、閂部延髄組織の中央で二分した半分を用いてＰｒＰＳｃの検出又は測定用の試料を調製することが適当とされている。ウシ延髄組織は、その可溶化が比較的困難な組織材料の内の一つであるが、界面活性剤とＰＫとを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施すことによって、短時間内にほぼ澄明な状態にまでの組織材料可溶化とＰｒＰＣ分解が可能である。
【００１６】
本実施の形態における分解酵素混液に加える界面活性剤としては、両性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など如何なる界面活性剤であっても使用でき、複数の界面活性剤を併用しても良い。また、このような界面活性剤のうち、比較的親水性の高いものが好適であり、例えば、ＨＬＢ値（吉田時行ら編、工学図書株式会社１９８７年発行「新版 界面活性剤ハンドブック」ｐｐ．２３４〜２４５、及び、日本油化学協会編、丸善株式会社１９９０年発行「改訂三版 油脂化学便覧」、ｐｐ．４８９−４９３）が６以上、４０程度までの界面活性剤が良く、１０以上のＨＬＢ値を有するものを用いることで、より効率良く短時間の内に可溶化できる場合がある。なお、界面活性剤のうち両性界面活性剤を用いることが好ましく、また、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤とを併用しても良く、このような場合には、前処理対象の哺乳動物組織材料をより効率良く可溶化できることもある。ＰＫとしては、ＷＢ法や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡを含むＥＩＡ法）等による各種蛋白の検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理に通常用いられるようなＰＫであれば、如何なるＰＫであっても用いることができ、例えば、トリチラキウム アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のような真菌由来のＰＫ（ＥｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＫ：ＥＣ ３．４．２１．６４）の他、細菌、真菌、酵母、動物細胞などを宿主細胞としＰＫと同等以上のＰｒＰＣ分解活性を有する蛋白質を発現するように遺伝子組換された組換原核細胞又は組換真核細胞の産生物から得られるリコンビナントＰＫなども使用できる。
【００１７】
分解酵素混液としては、界面活性剤とＰＫに加えて、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含むものとすることができ、主成分として界面活性剤とＰＫとからなる分解酵素混液の場合に比して、より短時間の内に組織可溶化とＰｒＰＣの分解を可能とする点でより好ましい。また、分解酵素混液に界面活性剤とＰＫに加えて、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を添加する場合には、本実施形態の前処理法により得られるＰｒＰＳｃの検出、測定用の試料中から、検出、測定の感度や精度を低下させる可能性のある非特異物質などを予め減少又は除去できることもある。なお、この場合に加えるＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ：デオキシリボヌクレアーゼ）としては、特に限定されず、例えばエキソＤＮａｓｅ−Ｉ（ＥＣ ３．１．１１．１）、エキソＤＮａｓｅ−ＩＩＩ（ＥＣ ３．１．１１．３）、エキソＤＮａｓｅ−Ｖ（ＥＣ ３．１．１１．５）、エキソＤＮａｓｅ−ＶＩＩ（ＥＣ ３．１．１１．６）などのようなポリヌクレオチド鎖の末端から逐次切断するエキソ型（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、また、例えばウシ膵臓由来のＤＮａｓｅ−Ｉ（ＥＣ ３．１．２１．１）、エンドＤＮａｓｅ（ＥＣ ３．１．２１．２）のようなポリヌクレオチド鎖又はオリゴヌクレオチド鎖の内部結合を切断するエンド型（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などいずれのＤＮａｓｅであっても用いることができる。哺乳動物組織中に含まれるＤＮＡを短時間で小さなフラグメント鎖に分解可能である点では、エンド型ＤＮａｓｅが好ましく、また、分解酵素としての特異性が低く、２本鎖及び１本鎖ＤＮＡを切断分解可能であることからＤＮａｓｅ−Ｉがより好適に使用できる。また、例えば、ＤＮａｓｅ−Ｉとエキソ型又は他のエンド型等のＤＮａｓｅとを組み合わせて用いても良い。
【００１８】
ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ：リボヌクレアーゼ）としては、例えばＲＮａｓｅ−ＩＩ（ＥＣ． ３．１．１３．１）のようなポリヌクレオチド鎖の末端から逐次切断するエキソ型（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、また、例えばウシ膵臓由来のＲＮａｓｅ−Ａ（ＥＣ ３．１．２７．５）、ＲＮａｓｅ−Ｔ１（ＥＣ ３．１．２７．３）のようなポリヌクレオチド鎖の内部結合を切断するエンド型（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などいずれのＲＮａｓｅであっても用いることができるが、短時間で小さなフラグメント鎖に分解可能である点では、エンド型ＲＮａｓｅが好ましく、さらに、比較的広いｐＨ範囲において安定である点ではＲＮａｓｅ−Ａがより好適に使用できる。また、ＲＮａｓｅ−Ａとその他のＲＮａｓｅとの組み合わせとするなど、複数のＲＮａｓｅとしても良い。なお、ＤＮＡ分解酵素とＲＮＡ分解酵素とに加えて又は替えて、ＤＮＡ及びＲＮＡの両ヌクレオチド鎖におけるホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼを加えることもできる。このようなヌクレアーゼとしては、例えば、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｏｒｙｚａｅ）由来のエンドヌクレアーゼＳ１（ＥＣ ３．１．３０．１）、セラチア マルセッセンス（Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来のエンドヌクレアーゼ（ＥＣ ３．１．３０．２）、スタフィロコッカス オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のミクロコッカスエンドヌクレアーゼ（ＥＣ ３．１．３１．１）などを挙げることができる。
【００１９】
コラーゲンは、哺乳動物組織に含まれる蛋白質のうち３割前後を占める主要な蛋白質であるが、３重らせん構造を有することから一般的なプロテアーゼではこれを切断分解することが困難であり、また、例えばタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、・・・、ＸＩＩＩ、ＸＩＶコラーゲンなどと呼ばれコラーゲンファミリー蛋白質を構成する分子構造の異なるコラーゲン蛋白質が哺乳動物の各結合組織に特異的に分布する。このようなコラーゲンファミリー蛋白質の３重らせん構造を切断したり分解するコラーゲン分解酵素を分解酵素混液に加える場合には、本第１の実施形態の前処理法により得られるＰｒＰＳｃの検出、測定用の試料中から、検出、測定の感度や精度を低下させる可能性のある非特異蛋白やポリペプチドなどを予め減少又は除去できることもある。分解酵素混液に加える際のコラーゲン分解酵素としては、特に限定されず、コラーゲンファミリー蛋白質の内、１種類（タイプ）以上のコラーゲンを分解するものであれば如何なるコラーゲン分解酵素をも使用できる。主にメタロエンドペプチダーゼ（Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ：ＥＣ ３．４．２４．）に分類され、また、マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とも呼ばれるコラゲナーゼ類（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ゼラチナーゼ類（Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）、ストロメライシン類（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）などのコラーゲン分解酵素が好適に使用できる。前処理対象の動物組織材料に多く含まれるタイプのコラーゲンを分解するコラーゲン分解酵素を１種以上用いることが好ましく、複数タイプのコラーゲン蛋白質を分解することが可能なコラーゲン分解酵素を用いることがより好ましい。
【００２０】
このようなコラゲナーゼ類としては、例えば、クロストリディウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等細菌由来の各種コラゲナーゼ〔Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ：ＥＣ ３．４．２４．３（別名：コラゲナーゼＡ、コラゲナーゼＩ、ＭＭＰ−１、８、１８等を含む）〕、Ｉ〜ＩＩＩの各タイプを含む複数のコラーゲンを分解する脊椎動物由来の間質性コラゲナーゼ〔Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：ＥＣ ３．４．２４．７（別名：コラゲナーゼ−１、ＭＭＰ−１）〕、また、Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘの各タイプのコラーゲンを分解する好中球コラゲナーゼ〔Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：ＥＣ ３．４．２４．３４（別名コラゲナーゼ−２、ＭＭＰ−８等）〕、コラゲナーゼ−３〔ＥＣ ３．４．２４．− （別名ＭＭＰ−１３）〕、コラゲナーゼ−４〔ＥＣ ３．４．２４．− （別名ＭＭＰ−１８）〕などを挙げることができる。また、ゼラチナーゼ類としては、例えば、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘの各タイプのコラーゲンを分解するゼラチナーゼＡ〔ＥＣ ３．４．２４．２４（別名：タイプＩＶコラゲナーゼ、ＭＭＰ−２等）〕、また、ＩＶ及びＶタイプのコラーゲンを分解するゼラチナーゼＢ〔ＥＣ ３．４．２４．３５（別名：タイプＶコラゲナーゼ、ＭＭＰ−９等〕などを挙げることができる。ストロメライシン類としては、例えば、ＩＩＩ〜Ｖ、ＩＸなどの各タイプのコラーゲンを分解するストロメライシン−１〔ＥＣ ３．４．２４．１７（別名：ＭＭＰ−３）〕、ストロメライシン−２〔ＥＣ ３．４．２４．２２（別名：ＭＭＰ−１０）〕などが挙げられる。さらに、本実施形態においては、以上のようなコラーゲン分解酵素に加えて、動物組織材料を可溶化する際に一般的に用いられる蛋白分解酵素や脂質分解酵素などを分解酵素混液に添加することも可能である。
【００２１】
本第１の実施形態における分解酵素混液に両性界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えばアミドアルキルベタイン系、スルホベタイン系、カルボキシベタイン系、イミダゾリニウムベタイン系等のベタイン型、また、例えばアルキルアミノ酢酸系、アルキルアミノプロピオン酸系、アルキル・ジメチルアミノ酢酸系、アルキルアミノジプロピオン酸系等のアミノ酸型やアミノ脂肪酸型などの両性界面活性剤の他、例えば、コール酸アミドアルキル・ジメチルアンモニオプロパンスルホン酸系、アルキルアミドタウリン塩系、アルキルアミドプロピルアミンオキシド系、レシチン系など如何なる両性界面活性剤であっても良い。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。このような両性界面活性剤の具体例としては、例えば、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ：ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ：ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ商品名、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ：商品名レボン、三洋化成工業など）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製など）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製など）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）などを挙げることができる。なお、以上のような両性界面活性剤は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩やアミン塩、塩酸塩や酢酸塩などの塩であっても良く、また、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた両性界面活性剤であっても良い。
【００２２】
また、本第１の実施形態における分解酵素混液に陰イオン界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えば脂肪酸系、アルケニルコハク酸系、Ｎ−アシルサルコシン系、Ｎ−アシルグルタミン酸系等のカルボン酸型、また、例えば硫酸アルキル系、硫酸アルキルポリオキシエチレン系、硫酸モノアシルグリセリン系、アシルアミノ硫酸エステル系等の硫酸エステル型、また、例えばオレフィンスルホン酸系、アルカンスルホン酸系、スルホ脂肪酸系、Ｎ−アシルタウリン系、Ｎ−アシル−Ｎ−メチルタウリン酸系、ジアルキルスルホコハク酸系等のスルホン酸型、また、例えばリン酸アルキル系、リン酸アルキルポリオキシエチレン系等のリン酸エステル型などの他、コール酸系、デオキシコール酸系等如何なる陰イオン界面活性剤であっても良い。このような陰イオン界面活性剤の具体例としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）、ココイルサルコシンナトリウム、ドデカノイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、コール酸ナトリウム（ＳＣｈｏｌ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣｈｏｌ）、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムなどを挙げることができる。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。なお、以上のような陰イオン界面活性剤は、主にナトリウム塩として示したが、他のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩やアミン塩、塩酸塩や酢酸塩などの塩であっても良く、また、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた界面活性剤であっても良い。
【００２３】
また、分解酵素混液に陽イオン界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えばアルキルポリオキシエチレンアミン系、脂肪酸トリエタノールアミンエステル系、Ｎ−アシル−Ｎ′，Ｎ′−ジエチルエチレンジアミン系等のアミン・アミン塩型、また、例えばアルキルトリメチルアンモニウム系、ジアルキルジメチルアンモニウム系、アルキルジメチルベンジルアンモニウム系、アルキルピリジニウム系等の第４級アンモニウム塩型など如何なる陽イオン界面活性剤であっても良い。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。このような陽イオン界面活性剤の具体例としては、例えば、ラウリン酸トリエタノールアミンモノエステル、Ｎ−ラウロイル−Ｎ′，Ｎ′−ジエチルエチレンジアミン、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルジメチレンアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルジメチレンアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウム、セチルピリジニウムクロライド、グアニジンチオシアネートなどを挙げることができる。なお、以上のような陽イオン界面活性剤は、主に塩化物塩として示したが、臭化物塩など他のハロゲン化塩、塩酸塩、ギ酸塩、酢酸塩などの塩であっても良く、また、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた界面活性剤であっても良い。
【００２４】
本実施形態における分解酵素混液に非イオン界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えば脂肪酸ポリオキシエチレンエステル系、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンエステル系、アルキルポリオキシエチレンエーテル系、アルキルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル系、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル系、アルキルポリオキシエチレンアミン系、アルキルポリオキシエチレンアミド系、脂肪酸アルカノールアミド系、アミンオキシド系、脂肪酸ソルビタンエステル系、脂肪酸ポリグリセロールエステル系、脂肪酸ショ糖エステル系、アルキルポリグリコシド系、Ｎ−アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミン系等如何なる非イオン界面活性剤であっても良い。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。このような非イオン界面活性剤の具体例としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−オクチルフェノール（商品名ＮＰ４０；ｐ−Ｔｅｒｔ−Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビトールエステル（商品名Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビトールエステル（商品名Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレングリコール（９−１０）−ｐ−オクチルフェノール（商品名ＴｒｉｔｏｎＸ１００）、オクチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）などを挙げることができる。なお、以上のような非イオン界面活性剤は、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた非イオン界面活性剤であっても良い。
【００２５】
以上のような界面活性剤の分解酵素混液中における総配合割合としては、前処理対象の哺乳動物組織材料についてその可溶化困難性など組織材料の種類に応じて適宜増減すれば良く、特に限定されないが、０．１重量％以上、３０重量％以下とすることが好ましい。１重量％以上、２０重量％以下がより好ましく、３重量％以上、１５重量％以下とすることがさらに好ましい。０．１重量％未満では、組織材料の可溶化が不充分となることがあり、３０重量％を超えるとＰｒＰＳｃの測定値に影響を及ぼす場合がある。また、複数の界面活性剤を用いる際の配合割合についても、選択した界面活性剤に応じて適宜決定すれば良く、特に限定されない。分解酵素混液に加えるＰＫの量については、通常のＰｒＰＣ分解に使用される量に準じて適宜増減して添加することができ、本実施の形態においては、分解酵素混液１ｍＬ中の配合量を１０μｇ以上、３００μｇ以下とすることが好ましく、３０μｇ以上、２５０μｇ以下とすることがより好ましい。
【００２６】
このような分解酵素混液に、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を加える場合の添加量についても、特に限定されず、前処理対象の組織材料の種類や選択したＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、コラーゲン分解酵素の種類に応じて適宜決定することができる。本実施の形態においては、ＤＮＡ分解酵素の配合量は分解酵素混液１ｍＬ中に１μｇ以上、１０００μｇ以下とすることが好ましく、５μｇ以上、２００μｇ以下とすることがより好ましい。また、ＲＮＡ分解酵素の配合量としては、分解酵素混液１ｍＬ中に２μｇ以上、２０００μｇ以下とすることが好ましく、１０μｇ以上、４００μｇ以下とすることがより好ましい。コラーゲン分解酵素の配合量としては、分解酵素混液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ以上、５０ｍｇ以下とすることが好ましく、０．２５ｍｇ以上、１０ｍｇ以下とすることがより好ましい。さらに、以上のような分解酵素混液には、例えばメタノール、クロロホルム、メタノール・クロロホルム混液、１−ブタノール、２−ブタノールなどの有機溶媒を加えることができ、このような有機溶媒を添加する場合に、分解酵素混液中の配合割合としては、０．１重量％以上、１０重量％以下とすることが好ましい。また、例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩を分解酵素酵素混液に溶解可能な範囲で添加することができる。なお、上述のような分解酵素混液では、そのｐＨを所定範囲に調整することが好ましく、配合される界面活性剤やＰＫの他、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、コラーゲン分解酵素などの添加状態などに応じて適宜ｐＨ緩衝剤を選定し添加すれば良い。また、このような、分解酵素混液は、例えば、凍結乾燥したり、粉末状の各成分を配合して固体状に調製した部分と界面活性剤、ｐＨ緩衝液等の液状部分とに分離しておき、用時溶解して使用する形態とすることもできる。
【００２７】
本実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程では、前処理対象の哺乳動物組織材料に、上述のような分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す。分解酵素混液の使用量は、組織材料の動物種や組織種類に応じて適宜決定することができるが、ここでは、前処理対象の組織材料重量に対して、２倍重量以上、２０倍重量以下とすることが好ましく、３倍重量以上、１５倍重量以下がより好ましい。ホモジナイズ処理には、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のようなフッ素樹脂製の棒をその外径よりわずかに大きな内径を有する円筒容器内で回転させるポッターエルベジェム型、金属固定刃と回転刃により組織材料を破砕するタイプ（例えばポリトロン社製など）、閉鎖容器内に高速回転刃を取付けたブレンダー型（例えばＷａｒｉｎｇ社製など）、閉鎖可能な容器内に処理対象の組織材料などと共にビーズを入れ、振とう、回転などにより組織材料を破砕するビーズ式破砕機（和研薬株式会社製、安井機械社製など）、これらに超音波処理を組み合わせたタイプ等の各種ホモジナイザーを用いることができる他、２本連結した注射筒内で内筒を往復移動させることで組織を破砕しても良く、複数のタイプを併用することも可能である。本第１の実施形態においては、より短時間内で効率的に組織材料の可溶化ができる場合があること、また、ホモジナイズ処理中に組織材料が飛散する可能性が低い点で、ビーズ式破砕機を用いることが好ましい。このようなビーズ式破砕型のホモジナイザーを用いた場合のホモジナイズ処理は、１分間以上、１０分間以下行うことが好ましく、２分間以上、５分間以下とすることがより好ましい。また、ホモジナイザーによる処理後の処理液を、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の所定温度に保持した恒温器又はヒートブロック内にて加温することができる。加温時間は、１分間以上、１０分間以下とすることが好ましく、２分間以上、５分間以下がより好ましい。なお、ホモジナイズ処理を、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度条件下にて実施することもでき、ＰｒＰＳｃの検出や測定に悪影響を及ぼすことなく、より前処理時間を短縮できる場合もある。
【００２８】
上述のような本第１の実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液（ＰｒＰＣ分解済み液）は、哺乳動物組織材料が可溶化され正常プリオンが分解された状態となっている。次に、このＰｒＰＣ分解済み液について、図１に示すような蛋白変性処理工程（Ａ）を施す。本実施形態の蛋白変性処理工程（Ａ）では、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する。ＰＫ阻害剤としては、ＰＫ活性を阻害することが可能であれば、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、メタロエンドペプチダーゼ阻害剤など如何なるプロテアーゼ阻害剤をも使用可能であり、複数のプロテアーゼ阻害剤を併用することもできる。ここでは、セリンプロテアーゼ阻害剤を含むものを用いることがより好ましく、例えばフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ベンズアミジン（Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：例えば商品名；ＰＥＦＡＢＬＯＣ ＳＣ、ロシュダイアグノスティック社）のようなセリンプロテアーゼ阻害剤が好適に使用できる。ＰＫ阻害剤の添加量は、前段の可溶化ＰｒＰＣ分解工程において分解酵素混液に加えられたＰＫ量に応じて適宜決定すれば良いが、本実施形態では、ＰｒＰＣ分解済み液に添加後の濃度が０．１ｍＭ以上、１０ｍＭ以下となるように加えることが好ましく、０．５ｍＭ以上、５ｍＭ以下がより好ましい。また、粉末状の尿素を、添加後の濃度が４〜８Ｍ、より好ましくは５〜７Ｍとなるように添加した後、加熱することが良く、この加熱条件としては、例えば３０℃以上、１１０℃以下の温度にて、１分間以上、１０分間以下加熱することができる。５０℃以上、１００℃以下の温度にて、３分間以上、７分間以下の加熱条件とすることがより好ましい。
【００２９】
本第１の実施形態では、必要に応じ、上述のような蛋白変性処理工程（Ａ）により得られる蛋白変性処理済液に、希釈液を添加してＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とする尿素濃度調整工程を実施することができる（図１）。なお、前段の蛋白変性処理工程（Ａ）で得られた蛋白変性処理済液は、ＰｒＰＣが完全に分解され、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合には、「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントが含まれた状態となっており、プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための試料として、尿素濃度調整工程を省略し、蛋白変性処理済液をそのまま用いることも可能である。一方で、蛋白変性処理済液は尿素濃度などが高く、例えばＷＢ法やＥＬＩＳＡ法などを用いる測定系に影響を及ぼすことがあり、この場合に、この尿素濃度調整工程を実施すれば良い。希釈液としては、ＰｒＰＳｃを検出又は測定するための測定に適するように調製すれば良く、特に限定されない。例えば、水、生理食塩液の他、リン酸塩系（リン酸緩衝生理食塩液：ＰＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩系（Ｔｒｉｓ緩衝液）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン塩系（Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−エタンスルホン酸塩系（ＨＥＰＥＳ緩衝液）、３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸塩系（ＭＯＰＳ緩衝液）、グリシン−塩酸系、酢酸塩系等のｐＨ緩衝液、また、ＥＬＩＳＡ法等における非特異吸着を防止するアルブミンやスキムミルク等のブロッキング剤溶液などが好適に使用できる。さらに希釈液には、例えば、測定系の感度を高めたり、蛋白変性処理済液中に残存する組織材料由来の測定妨害物質又は界面活性剤やＰＫ阻害剤など尿素以外の配合成分による測定系への影響を防止するような物質を添加することもできる。また、希釈倍率についても、希釈液と同様に特に限定されない。本実施形態では、ＰｒＰＳｃを検出又は測定する一般的な測定系に影響を及ぼすことが少ない点で、希釈後の尿素濃度を０．０５Ｍ以上、３Ｍ以下とすることが好ましく、０．５Ｍ以上、２．５Ｍ以下とすることがより好ましく、１Ｍ以上、２Ｍ以下となるように希釈することがさらに良い。
【００３０】
〔第２の実施形態〕
第２の実施形態による哺乳動物組織材料の前処理方法は、図２に前処理方法のフローを示すように、第１の実施形態とは、主として蛋白変性処理工程が異なる。すなわち、第１の実施形態の場合と同様、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料を調製するために採取された哺乳動物組織材料に、分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備える。次に、本第２の実施形態では、第１の実施形態における蛋白変性処理工程（Ａ）に替わる蛋白変性処理工程（Ｂ）を実施することとなるが、蛋白変性処理工程（Ａ）との処理条件の差異を考慮した上で、第１の実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程について上記した処理条件に準じて行うことができる。本第２の実施形態による可溶化ＰｒＰＣ分解工程については、重複した詳細説明を省略するが、第１の実施形態の場合と同様に、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液（ＰｒＰＣ分解済み液）は、哺乳動物組織材料が可溶化されＰｒＰＣが分解された状態となっている。本第２の実施形態の蛋白変性処理工程（Ｂ）では、このＰｒＰＣ分解済み液について、図２に示すように、蛋白沈殿化剤を加えて撹拌した後、遠心分離して上清を除き、得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する。
【００３１】
蛋白沈殿化剤としては、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合に「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントなどを含む蛋白質を凝集、析出、沈殿化できれば如何なる蛋白沈殿化剤であっても良く、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールのような有機溶媒又は複数の有機溶媒混液、硫酸アンモニウムのような塩析効果を有する塩類、ＳｉＷ１１ のようなタングステン化合物、トリクロロ酢酸など特に限定されない。本第２の実施形態における蛋白沈殿化剤としては、ＥＬＩＳＡ法などの測定系に影響を及ぼす可能性のある測定妨害物質と成り得る哺乳動物組織材料由来の成分を沈殿物に混入共沈することを防ぐ場合もある点では、有機溶媒又は複数の有機溶媒混液が好ましく、ブタノールを含む有機溶媒がより好ましく、２−ブタノールがさらに好適である。また、このような蛋白沈殿化剤の添加量についても、選択した蛋白沈殿化剤の種類や、前段の可溶化ＰｒＰＣ分解工程において分解酵素混液に加えた界面活性剤の種類などに応じて適宜決定することができる。例えば、蛋白沈殿化剤として有機溶媒又は有機溶媒混液を用いる場合には、ＰｒＰＣ分解済み液１ｍＬに対して、０．１ｍＬ以上、２ｍＬ以下添加することが好ましく、０．２ｍＬ以上、１ｍＬ以下がより好ましい。
【００３２】
蛋白沈殿化剤を加えて撹拌後の遠心分離条件としては、上清が澄明な状態に沈殿物と分離可能であれば、如何なる遠心分離条件であっても良く、特に限定されない。例えば、１７０００×ｇでは、５分間で分離することができ、また、冷却型遠心分離装置を用いて遠心分離しても良い。上清を除去した後、沈殿物に尿素液を添加する。尿素液の尿素濃度としては、４〜８Ｍとすることが好ましく、５〜７Ｍとすることがより好ましい。このような尿素液の添加量は、前処理のために採取した哺乳動物組織材料の種類や量に応じて適宜決定することができ、特に限定されない。例えば、哺乳動物組織材料の採取量１００ｍｇにつき、２５μＬ〜２５０μＬ程度の尿素液を添加すれば良く、５０μＬ〜１５０μＬがより好ましい。蛋白変性処理工程（Ｂ）における加熱条件としては、例えば３０℃以上、１１０℃以下の温度にて、１分間以上、１０分間以下加熱することができる。５０℃以上、１００℃以下の温度にて、３分間以上、７分間以下の加熱条件とすることがより好ましい。
【００３３】
本第２の実施形態では、必要に応じ、上述のような蛋白変性処理工程（Ｂ）により得られる蛋白変性処理済液に、希釈液を添加してＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とする尿素濃度調整工程を実施することができる（図２）。蛋白変性処理工程（Ｂ）で得られた蛋白変性処理済液は、ＰｒＰＣが完全に分解され、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合には、「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントが含まれた状態となっている。したがって、プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための前処理済み試料として、尿素濃度調整工程を省略し、蛋白変性処理済液をそのまま用いることも可能である。一方で、蛋白変性処理済液は尿素濃度などが高く、例えばＷＢ法やＥＬＩＳＡ法などを用いる測定系に影響を及ぼすことがあり、このような場合に、この尿素濃度調整工程を実施すれば良い。本第２の実施形態による尿素濃度調整工程において、使用できる希釈液、希釈液にさらに添加可能な物質、希釈倍率などについては、第１の実施形態の場合と同様であり、重複を避けるため詳細説明を省略する。
【００３４】
〔第３の実施形態〕
第３の実施形態による哺乳動物組織材料の前処理方法は、図３に前処理方法のフローを示すように、第１の実施形態とは、主として、蛋白変性処理工程を具備せず、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液（ＰｒＰＣ分解済み液）にＰＫ阻害剤を添加する点で異なる。すなわち、第１の実施形態の場合と同様、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料を調製するために採取された哺乳動物組織材料に、分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備える。次に、本第３の実施形態では、蛋白変性処理工程（Ａ）に替えて、ＰｒＰＣ分解済み液に尿素を添加することなくＰＫ阻害剤を加えるＰＫ阻害剤添加工程を実施することとなるが、第１の実施形態における蛋白変性処理工程（Ａ）との処理条件の差異を考慮した上で、第１の実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程について上記した処理条件に準じて行うことができる。本第３の実施形態による可溶化ＰｒＰＣ分解工程については、重複した詳細説明を省略するが、第１の実施形態の場合と同様に、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られたＰｒＰＣ分解済み液は、哺乳動物組織材料が可溶化されＰｒＰＣが分解された状態となっている。
【００３５】
本第３の実施形態のＰＫ阻害剤添加工程において、ＰｒＰＣ分解済み液に加えるＰＫ阻害剤及びＰＫ阻害剤の添加量としては、第１の実施形態の蛋白変性処理工程（Ａ）においてＰｒＰＣ分解済み液に加える場合と同様のＰＫ阻害剤を用いることができ、ＰＫ阻害剤の添加量についても同様であり、重複した詳細説明を省略する。また、本第３の実施形態では、必要に応じ、上述のようなＰＫ阻害剤添加工程により得られる処理液（ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液）に、希釈液を添加してＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とする界面活性剤濃度調整工程を実施することができる（図３）。なお、前段のＰＫ阻害剤添加工程で得られた処理液は、ＰｒＰＣが完全に分解され、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合には、未変性の「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントが含まれた状態となっている。したがって未変性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための試料として、界面活性剤濃度調整工程を省略し、ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液をそのまま用いることも可能である。一方で、ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液は界面活性剤濃度などが高く、例えばＷＢ法やＥＬＩＳＡ法などを用いる測定系に影響を及ぼすことがあり、この場合に、界面活性剤濃度調整工程を実施すれば良い。本第３の実施形態による界面活性剤濃度調整工程において、使用できる希釈液、希釈液にさらに添加可能な物質などについては、第１の実施形態の尿素濃度調整工程における場合と同様であり、重複説明を省略する。なお、本第３の実施形態による界面活性剤濃度調整工程において、上述のような希釈液を用い、ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液を希釈する際の希釈倍率としては、ＰｒＰＳｃを検出又は測定するための測定に適するような希釈倍率とすれば良く、特に限定されない。本実施形態では、例えば、ＰｒＰＳｃを検出又は測定する一般的な測定系に影響を及ぼすことが少ない点で、２倍以上、１２０倍以下とすることが好ましく、２．４倍以上、１２倍以下とすることがより好ましく、３倍以上、６倍以下となるように希釈することがさらに良い。このような第３の実施形態の前処理方法によれば、ＰｒＰＳｃの検定や測定系において未変性の「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントに対する特異抗体を用いる必要があるものの、第１又は第２の実施形態に比して、より短時間の内に前処理を行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の哺乳動物組織材料の前処理方法について、実施例、試験例を示して具体的に説明するが、これによって本発明を限定するものではない。
【００３７】
〔実施例１〕（組織材料の可溶化）
正常マウスの中枢神経組織（脳内組織）及びウシ延髄組織をそれぞれ動物組織材料として、第１の実施形態に準じて組織可溶化の検討を行った。分解酵素混液には、３重量％のラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）及び１重量％のｐ−オクチルフェノール（ＮＰ４０）の界面活性剤とＰＫ（２００μｇ／ｍＬ）を添加したＰＢＳ溶液を用いた。組織材料採取量の５倍重量の分解酵素混液を加え、２本連結した注射筒内で内筒を往復移動させることで組織を破砕する方式にて、２分間ホモジナイズ処理した後、３７℃、５分間加温した。この状態で、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。続く、蛋白変性処理工程における尿素添加は６Ｍ濃度、加熱条件は、１００℃、５分間とした。尿素濃度調整工程では、ＰＢＳを希釈液として尿素濃度１Ｍに希釈した。この状態においても、マウス脳組織材料からの前処理済み液は澄明であったが、ウシ延髄組織材料からの前処理済み液は濁りが認められた。
【００３８】
〔実施例２〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、２−ブタノール及び界面活性剤として、ポリオキシエチレン（８０）ソルビトールエステル（商品名Ｔｗｅｅｎ２０）を追加し、表１に示すように配合を代えた以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
〔実施例３〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、塩化ナトリウムを添加し、また、ｐＨを表２に示すように組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４１】
【表２】
【００４２】
〔実施例４〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、１−ブタノール、塩化マグネシウム、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼ（ｐａｎｃｒｅａｌｉｐａｓｅ）などを加え、界面活性剤として、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）のみとし、表３に示すように配合を組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４３】
【表３】
【００４４】
〔実施例５〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼなどを加え、界面活性剤を、オクチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）とし、表４に示すように配合を組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４５】
【表４】
【００４６】
〔実施例６〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼなどを加え、界面活性剤を、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）及びオクチル−β−Ｄ−グルコシドとし、表５に示すように配合を組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４７】
【表５】
【００４８】
〔実施例７〕（組織材料の可溶化）
ウシ延髄組織を動物組織材料として、第２の実施形態に準じて組織可溶化の検討を行った。分解酵素混液には、２−ブタノール、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼなどを加え、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）及びオクチル−β−Ｄ−グルコシドの界面活性剤とＰＫ（２００μｇ／ｍＬ）を表６のように添加配合したＰＢＳ溶液を用いた。組織材料採取量の１０倍重量の分解酵素混液を加え、ビーズ式破砕機（商品名Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；和研薬株式会社製、又は、商品名マルチビーズショッカー；安井機械製）にて、２分間ホモジナイズ処理した後、ヒートブロック（ＴＡＩＴＥＣ製ドライサーモユニットＤＴＵ−１Ｂ又はアルミブロックＡＬ−１１３６Ｂ）を用い、３７℃〜４２℃、５分間加温（インキュベート）した。この状態で、ウシ延髄組織材料は澄明に可溶化されるが、室温に保存すると濁りが認められた。ＰＫ阻害剤として４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：商品名；ＰＥＦＡＢＬＯＣ ＳＣ、ロシュダイアグノスティック社製）を２ｍＭ相当濃度となるように加え、ＳｉＷ１１ ０．５重量％を添加した後、１５０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を除去し、得られた沈殿物に６Ｍ尿素液を組織材料採取重量に対して１．５〜３倍容量加えて、１００℃、５分間蛋白変性処理した。尿素濃度調整工程では、ＰＢＳを希釈液として尿素濃度１Ｍに希釈した。蛋白変性処理工程、及び尿素濃度調整工程後の処理液には濁りが認められ可溶化が不充分であった。また、可溶化が不充分な状態の尿素濃度調整工程処理液では、ウシｒ−ＰｒＰＣを添加してもＥＬＩＳＡ法により検出できなかった。なお、マウス脳組織材料を動物組織材料として用いた場合には、澄明に可溶化され検出可能であった。
【００４９】
【表６】
【００５０】
〔実施例８〕（組織材料の可溶化）
ウシ延髄組織を動物組織材料として、第１の実施形態に準じて組織可溶化の検討を行った。分解酵素混液には、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡを加え、両性界面活性剤［ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ：ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ商品名、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）又は、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチレート（ＤＤＭＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）］及び陰イオン界面活性剤［ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）］を組み合わせた界面活性剤とＰＫ（２００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ表７のように添加配合したＰＢＳ溶液を用いた。組織材料採取量の１０倍重量の分解酵素混液を加え、ビーズ式破砕機（商品名Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；和研薬株式会社製、又は、商品名マルチビーズショッカー；安井機械製）にて、２５００ｒｐｍ、２分間ホモジナイズ処理した後、ヒートブロック（ＴＡＩＴＥＣ社製ドライサーモユニットＤＴＵ−１Ｂ又はアルミブロックＡＬ−１１３６Ｂ）を用い、３７℃〜４２℃、５分間加温（インキュベート）した。ウシ延髄組織材料について可溶化ＰｒＰＣ分解工程を行った処理液は、ほぼ澄明に可溶化されていた。
【００５１】
【表７】
【００５２】
〔実施例９〕（組織材料の可溶化）
両性界面活性剤として、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ：ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン）を用いた以外は、実施例８の場合と同様にそれぞれ表８のように添加配合し、組織可溶化の検討を行った。実施例８の場合同様、ウシ延髄組織材料について可溶化ＰｒＰＣ分解工程を行った処理液は、ほぼ澄明に可溶化されていた。
【００５３】
【表８】
【００５４】
〔実施例１０〕（組織材料の可溶化）
両性界面活性剤として、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）を追加して用いた以外は、実施例８の場合と同様にそれぞれ表９のように添加配合し、組織可溶化の検討を行った。実施例８の場合同様、ウシ延髄組織材料について可溶化ＰｒＰＣ分解工程を行った処理液は、ほぼ澄明に可溶化されていた。
【００５５】
【表９】
【００５６】
〔実施例１１〕（ＥＬＩＳＡ測定用試料調製）
哺乳動物組織材料として正常ウシ延髄組織材料１００ｍｇ及びウシ延髄組織材料１００ｍｇにＰｒＰＳｃ感染マウスの脳乳剤５重量％を添加したＰｒＰＳｃ添加ウシ延髄組織材料をそれぞれ２ｍＬ容量のマイクロチューブに採取し、４重量％のｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸塩（ＤＤＭＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、０．０１重量％のＤＮａｓｅ−Ｉ、０．０１重量％のＲＮａｓｅ−Ａ、０．５重量％のコラゲナーゼＡ、０．００５重量％のＰＫを添加した５０ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ緩衝液１ｍＬとステンレスビーズを加え、ビーズ式破砕機（商品名；マルチビーズショッカー、安井機械社製）にて２５００ｒｐｍで２分間ホモジナイズ処理を行い、続いてアルミブロックヒーターで３７℃、３分間加温（インキュベート）し、可溶化ＰｒＰＣ分解工程処理液を得た。次に、ＰＫ阻害剤として４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：商品名；ＰＥＦＡＢＬＯＣ ＳＣ、ロシュダイアグノスティック社製）２５μＬを加えてアルミブロックヒーターで１００℃、２分間加熱した。この段階で得られた正常ウシ延髄組織材料由来の試料、０、１２０、１６０、１８０、１９０、２００μＬと、ＰｒＰＳｃ添加ウシ延髄組織材料由来の試料２００、８０、４０、２０、１０、０μＬをそれぞれ別のマイクロチューブにて混合し、５重量％、２重量％、１重量％、０．５重量％、０．２５重量％及び０％（ＰｒＰＳｃ不含）のＰｒＰＳｃ感染マウス脳乳剤混入試料を作製した。各試料に尿素７２ｍｇを添加し、１００℃、５分間加熱し蛋白変性処理工程を行う。良く攪拌してから精製水で１０倍に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）をそれぞれ０．４ｍＬ加えて前処理済みの測定試料を得た（尿素終濃度約２Ｍ）。
【００５７】
〔試験例１〕（ＥＬＩＳＡ測定）
あらかじめマウス抗ＰｒＰモノクローナル抗体を固相化した９６穴マイクロプレートを用いて試験を行った。実施例１１にて得られた各測定試料について、それぞれ２ウェルに各５０μＬを分注した（２重測定）。ＨＲＰ標識マウス抗ＰｒＰモノクローナル抗体溶液５０μＬをそれぞれ各ウェルに添加し、室温で１時間放置したのち、ＰＢＳＴで洗浄した。発色基質溶液（ＴＭＢＺ：３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを添加して室温で遮光して３０分間放置したのち、１Ｍ濃度の硫酸１００μＬを加えてマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。この結果、図４に示すようにＰｒＰＳｃ感染マウス脳乳剤の添加量に比例した吸光度の上昇が認められ、本発明による迅速前処理法が大動物の組織材料であってもＰｒＰＳｃの測定用の試料調製に有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の第１の実施形態による哺乳動物組織材料前処理方法のフロー図である。
【図２】本発明の第２の実施形態による哺乳動物組織材料前処理方法のフロー図である。
【図３】本発明の第３の実施形態による哺乳動物組織材料前処理方法のフロー図である。
【図４】本発明により得られた前処理試料につきＥＬＩＳＡ法によるＰｒＰＳｃ測定の一例を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物組織材料の前処理方法に係り、特に、プリオン病発症の際など哺乳動物組織に蓄積する異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）につき、主にウェスタンブロット法（ＷＢ法）や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡを含むＥＩＡ法）等による検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物のプリオン病には、ヒトにおける代表的疾患としてクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の他、遺伝性プリオン病であるゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＧＳＳ）や、致死性家族性不眠症、クールー（Ｋｕｒｕ）などがある。ＣＪＤは、病因が不明の散発性ＣＪＤ、遺伝性の家族性ＣＪＤ、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）からの経口感染による変異型ＣＪＤ〔例えば、非特許文献１参照〕、ヒト下垂体の抽出製剤やヒト由来硬膜、角膜等を介する感染による医原性ＣＪＤなどに区分されるが、異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）が中枢神経系に蓄積する点では共通している。一方、変異型ＣＪＤでは、扁桃などのリンパ組織にもＰｒＰＳｃが認められている〔例えば、非特許文献２参照〕。ＢＳＥは、ヒツジやヤギのスクレイピー臓器などにより汚染した配合飼料からの感染によるものとされており、スクレイピーと同様に中枢神経系などに変性を認めＰｒＰＳｃが沈着するが、リンパ組織にＰｒＰＳｃの沈着が認められない点でスクレイピーとは異なっている〔例えば、非特許文献３参照〕。
【０００３】
ＢＳＥについては、これまで組織病理学的、臨床学的、疫学的方法を用いて検出が行われており、脳幹（延髄）組織を採取し、正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）ではプロティナーゼＫ（ＰＫ）により完全に分解されるが、ＰｒＰＳｃの凝集体ではＰＫで分解した後に残る「ＰｒＰ２７−３０」と呼ばれるフラグメントをプリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するＷＢ法やＥＬＩＳＡ法を用いる検査キットが市販されている〔例えば、非特許文献４参照〕。このような検査キットによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための試料調製法（延髄組織からの前処理法）は、各検査キット毎に異なり、それぞれ操作手順が示されている。例えば、Ａ社製検査キットの前処理手順では、延髄組織５００±４０ｍｇをホモジナイザーバッグに取り、１６％メタノール混合１５％陰イオン性界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液を加えて２分間ホモジナイズし、５〜１０分間静置した後、ホモジネート（脳乳剤）１８０μＬを遠心用マイクロプレートに移して１８〜３０℃、２７５０×ｇにて５分間遠心分離する。次に上清１００μＬを、ＰＫ溶液２０μＬをあらかじめ入れたアッセイプレートに採取し、３４℃、６０分間、ＰＫ消化処理した後、塩酸グアニジン溶液１５０μＬを加えて３４℃にて１５分間変性処理している。
【０００４】
Ｂ社製検査キットの前処理手順では、延髄組織３５０±４０ｍｇを１．４ｍＬのブドウ糖液とビーズの入った２ｍＬマイクロチューブに入れ、ビーズ式破砕機を用いて完全にホモジナイズする。得られたホモジネート５００μＬを別の２ｍＬマイクロチューブに採り、２Ｍ 尿素を含むＰＫ溶液５００μＬを加えて３７℃にて１０分間、反応させた後、２５０μＬの１−ブタノールを添加、撹拌し、２００００×ｇにて５分間遠心分離する。得られた沈殿物を５分間乾燥した後、６Ｍ尿素５０μＬを加えて１００℃、５分間変性処理を行い、希釈液で６倍希釈するようになっている。
【０００５】
また、以上のような前処理法の他に、例えば、脳組織及び脾臓組織をハサミで細かく切り刻んだ組織サンプルについて、界面活性剤〔（８％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２（商品名）、カルビオケミカル社製）、サーコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ（商品名）、シグマ社製：Ｃ１５Ｈ２５ＮＯ３ Ｎａ）〕と、１００ｍＭ塩化ナトリウムと、５ｍＭ塩化マグネシウムと、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５のトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とを加えて、脳組織を均一化することによって、均一化物（ホモジネート）を作製し（第１の工程）、次に、第２の工程において、分解（消化）処理するものがある（例えば、特許文献１参照）。消化処理する第２の工程では、第１の工程で得たホモジネートを、０．５ｍｇ／１００ｍｇコラゲナーゼ及び４０μｇ／１００ｍｇのＤＮａｓｅを用いて、温度３７℃、４〜１２時間、分解（消化）処理を行い、さらに、５０μｇ／１００ｍｇのＰＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）を用いて、温度３７℃、０．５〜２時間、消化処理を行っている。次いで第３の工程において、反応を停止した後、回転数１５，０００ｒｐｍ、室温で２０分間遠心分離を行い、５％ドデシル硫酸ナトリウムで１０分間加熱溶解させ、ＰｒＰＳｃ含有の濃縮物を得ている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−３２７９５号公報、（実施例、第１図〜第３図など）
【非特許文献１】Ｗｉｌｌ，Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ Ｖｏｌ．３４７、ｐｐ．９２１−９２５（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ Ｖｏｌ．３４９、ｐｐ．９９−１００（１９９７）
【非特許文献３】Ｏ′Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．Ｉ． ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．３８、ｐｐ．３２５４−３２５９（２０００）
【非特許文献４】能田健、永井英貴、平沢緑著、獣医畜産新報、５６巻、９号、７１９〜７２５頁、（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記Ａ社及びＢ社検査キットの前処理手順、並びに、特許文献１に記載のＰｒＰＳｃの濃縮法などによれば、採取した哺乳動物組織材料に含まれるＰｒＰＣが分解され、ＷＢ法やＥＬＩＳＡ法等によりＰｒＰＳｃを検出又は測定するために適し、可溶化されたＰｒＰＳｃを高回収率にて含有する試料を調製することはできるが、前処理の工程数が多く操作が煩雑であり、処理に長時間を要するという問題があった。特に、ＢＳＥ検査の場合では、２０分間程で解体処理された動物の各処理体を、それぞれの検査結果が判明するまで冷凍又は冷蔵保管するための大規模な保管設備が必要となっている。また、単に各工程における処理時間を短縮したり、工程数を減らした場合には、ＰｒＰＣの分解や夾雑蛋白などの非特異物質の除去が不充分となったり、ＰｒＰＳｃの回収率が低下するなど、ＰｒＰＳｃの検出や測定値に影響を及ぼすという問題が発生する。
【０００８】
本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、ＰｒＰＳｃの検定や測定値に悪影響を及ぼすことがなく、少ない工程数で短時間の内にその前処理を完了することが可能な、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明による哺乳動物組織材料の前処理方法は、異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）の検出又は測定用試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法であって；採取した哺乳動物組織材料に、界面活性剤とプロティナーゼＫ（ＰＫ）とを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施すことによって、哺乳動物組織材料を可溶化すると共に正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）を分解する可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備えることを特徴とする。
【００１０】
このような哺乳動物組織材料の前処理方法において、哺乳動物組織材料が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれた哺乳動物の延髄組織又は中枢神経組織であることが好ましく、また、分解酵素混液が、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含むことが好適である。さらに、界面活性剤が、両性界面活性剤を含むものであることが好ましく、さらにまた、界面活性剤が、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤との組み合わせからなることが良い。そして、両性界面活性剤が、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はこれらの塩から１以上選ばれたものであることが好適であり、また、陰イオン界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）、ココイルサルコシンナトリウム、ドデカノイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、コール酸ナトリウム（ＳＣｈｏｌ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣｈｏｌ）、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムから１以上選ばれたものであることが良く、さらに、分解酵素混液中の界面活性剤の配合割合を０．１乃至３０重量％とすることが好ましい。
【００１１】
以上のような哺乳動物組織材料の前処理方法において、可溶化ＰｒＰＣ分解工程におけるホモジナイズ処理は、容器内にビーズを入れたビーズ式破砕機によって行うことが好ましく、また、可溶化ＰｒＰＣ分解工程において、ホモジナイズ処理したのち、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度で加温することが好適であり、さらに、可溶化ＰｒＰＣ分解工程におけるホモジナイズ処理を２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度条件下にて実施することもできる。そして、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ａ）を含むことが好適であり、また、前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、蛋白沈殿化剤を加えて撹拌後遠心分離して得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ｂ）を含むこともでき、さらに、このような蛋白変性処理工程で得られた蛋白変性処理済液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることが好ましい。なお、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤を加えるＰＫ阻害剤添加工程を含むことができ、さらに、このようなＰＫ阻害剤添加工程で得られた処理液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることも良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、界面活性剤とＰＫとを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施すことによって、哺乳動物組織材料を可溶化すると共に正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）を分解することから、ＰｒＰＳｃの検出や測定に悪影響を及ぼすことなく処理工程を減じることができ、処理時間の短縮が可能である。また、哺乳動物組織材料は、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコなどプリオン病に羅患する可能性のある如何なる哺乳動物における、如何なる組織材料にも適応できる。動物組織材料のうち、例えばウシでは、ＰｒＰＳｃが最も多く蓄積すると言われており、比較的その可溶化が困難な延髄組織であっても１５分間以内程度の短時間のうちに効率良く澄明な状態に可溶化することができる。界面活性剤とＰＫに加えてＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含む分解酵素混液を用い、ホモジナイズ処理を行うことで、より確実に哺乳動物組織材料を可溶化すると共にＰｒＰＣを分解することが可能である。分解酵素混液に添加する界面活性剤として、例えば、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はこれらの塩から１以上選ばれた両性界面活性剤を用いることで、中動物乃至大動物の組織材料であっても、より短時間の内に澄明な状態にまで哺乳動物組織材料を可溶化できることがある。また、界面活性剤として、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤との組み合わせとすることで、哺乳動物組織材料をさらに効率良く可溶化できる場合がある。
【００１３】
可溶化ＰｒＰＣ分解工程において、ホモジナイズ処理したのち、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度で加温（インキュベート）することで、より確実にＰｒＰＣを分解し、ＰｒＰＳｃの検出や測定の感度、精度をさらに高める場合がある。蛋白変性処理工程（Ａ）として、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する方法を採用した場合には、処理液量が増加することがなく、蛋白変性処理工程の後段において遠心分離、再溶解操作などの濃縮工程を省略可能である点で有利である。蛋白変性処理工程（Ｂ）として、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ブタノールを加えて撹拌後、遠心分離して得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する方法を採用した場合には、ＰｒＰＳｃの検出、測定用の試料中から、検出、測定の感度や精度を低下させる可能性のある非特異物質を予め減少或いは除去できることもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の哺乳動物における哺乳動物組織材料の前処理方法を実施するための最良の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１５】
〔第１の実施形態〕
第１の実施形態による哺乳動物組織材料の前処理方法は、図１に前処理方法のフローを示すように、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料を調製するために採取された哺乳動物組織材料に、分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備えている。本第１の実施形態の前処理方法に用いられる哺乳動物組織材料としては、マウス、ラット、ハムスターなどの小動物からヒトを含むウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、ネコなどの中動物乃至大動物に至る如何なる哺乳動物の組織材料であっても適用できる。例えば、ＢＳＥの検査では、ＰｒＰＳｃが最も多く蓄積すると言われるウシ延髄の閂部組織について、病理組織検査や免疫組織化学検査による確定診断が行われており、ＷＢ法やＥＩＡ法等によるスクリーニングには、閂部延髄組織の中央で二分した半分を用いてＰｒＰＳｃの検出又は測定用の試料を調製することが適当とされている。ウシ延髄組織は、その可溶化が比較的困難な組織材料の内の一つであるが、界面活性剤とＰＫとを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施すことによって、短時間内にほぼ澄明な状態にまでの組織材料可溶化とＰｒＰＣ分解が可能である。
【００１６】
本実施の形態における分解酵素混液に加える界面活性剤としては、両性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など如何なる界面活性剤であっても使用でき、複数の界面活性剤を併用しても良い。また、このような界面活性剤のうち、比較的親水性の高いものが好適であり、例えば、ＨＬＢ値（吉田時行ら編、工学図書株式会社１９８７年発行「新版 界面活性剤ハンドブック」ｐｐ．２３４〜２４５、及び、日本油化学協会編、丸善株式会社１９９０年発行「改訂三版 油脂化学便覧」、ｐｐ．４８９−４９３）が６以上、４０程度までの界面活性剤が良く、１０以上のＨＬＢ値を有するものを用いることで、より効率良く短時間の内に可溶化できる場合がある。なお、界面活性剤のうち両性界面活性剤を用いることが好ましく、また、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤とを併用しても良く、このような場合には、前処理対象の哺乳動物組織材料をより効率良く可溶化できることもある。ＰＫとしては、ＷＢ法や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡを含むＥＩＡ法）等による各種蛋白の検出又は測定用の試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理に通常用いられるようなＰＫであれば、如何なるＰＫであっても用いることができ、例えば、トリチラキウム アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のような真菌由来のＰＫ（ＥｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＫ：ＥＣ ３．４．２１．６４）の他、細菌、真菌、酵母、動物細胞などを宿主細胞としＰＫと同等以上のＰｒＰＣ分解活性を有する蛋白質を発現するように遺伝子組換された組換原核細胞又は組換真核細胞の産生物から得られるリコンビナントＰＫなども使用できる。
【００１７】
分解酵素混液としては、界面活性剤とＰＫに加えて、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含むものとすることができ、主成分として界面活性剤とＰＫとからなる分解酵素混液の場合に比して、より短時間の内に組織可溶化とＰｒＰＣの分解を可能とする点でより好ましい。また、分解酵素混液に界面活性剤とＰＫに加えて、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を添加する場合には、本実施形態の前処理法により得られるＰｒＰＳｃの検出、測定用の試料中から、検出、測定の感度や精度を低下させる可能性のある非特異物質などを予め減少又は除去できることもある。なお、この場合に加えるＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ：デオキシリボヌクレアーゼ）としては、特に限定されず、例えばエキソＤＮａｓｅ−Ｉ（ＥＣ ３．１．１１．１）、エキソＤＮａｓｅ−ＩＩＩ（ＥＣ ３．１．１１．３）、エキソＤＮａｓｅ−Ｖ（ＥＣ ３．１．１１．５）、エキソＤＮａｓｅ−ＶＩＩ（ＥＣ ３．１．１１．６）などのようなポリヌクレオチド鎖の末端から逐次切断するエキソ型（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、また、例えばウシ膵臓由来のＤＮａｓｅ−Ｉ（ＥＣ ３．１．２１．１）、エンドＤＮａｓｅ（ＥＣ ３．１．２１．２）のようなポリヌクレオチド鎖又はオリゴヌクレオチド鎖の内部結合を切断するエンド型（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などいずれのＤＮａｓｅであっても用いることができる。哺乳動物組織中に含まれるＤＮＡを短時間で小さなフラグメント鎖に分解可能である点では、エンド型ＤＮａｓｅが好ましく、また、分解酵素としての特異性が低く、２本鎖及び１本鎖ＤＮＡを切断分解可能であることからＤＮａｓｅ−Ｉがより好適に使用できる。また、例えば、ＤＮａｓｅ−Ｉとエキソ型又は他のエンド型等のＤＮａｓｅとを組み合わせて用いても良い。
【００１８】
ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ：リボヌクレアーゼ）としては、例えばＲＮａｓｅ−ＩＩ（ＥＣ． ３．１．１３．１）のようなポリヌクレオチド鎖の末端から逐次切断するエキソ型（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、また、例えばウシ膵臓由来のＲＮａｓｅ−Ａ（ＥＣ ３．１．２７．５）、ＲＮａｓｅ−Ｔ１（ＥＣ ３．１．２７．３）のようなポリヌクレオチド鎖の内部結合を切断するエンド型（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などいずれのＲＮａｓｅであっても用いることができるが、短時間で小さなフラグメント鎖に分解可能である点では、エンド型ＲＮａｓｅが好ましく、さらに、比較的広いｐＨ範囲において安定である点ではＲＮａｓｅ−Ａがより好適に使用できる。また、ＲＮａｓｅ−Ａとその他のＲＮａｓｅとの組み合わせとするなど、複数のＲＮａｓｅとしても良い。なお、ＤＮＡ分解酵素とＲＮＡ分解酵素とに加えて又は替えて、ＤＮＡ及びＲＮＡの両ヌクレオチド鎖におけるホスホジエステル結合を切断するヌクレアーゼを加えることもできる。このようなヌクレアーゼとしては、例えば、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｏｒｙｚａｅ）由来のエンドヌクレアーゼＳ１（ＥＣ ３．１．３０．１）、セラチア マルセッセンス（Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来のエンドヌクレアーゼ（ＥＣ ３．１．３０．２）、スタフィロコッカス オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のミクロコッカスエンドヌクレアーゼ（ＥＣ ３．１．３１．１）などを挙げることができる。
【００１９】
コラーゲンは、哺乳動物組織に含まれる蛋白質のうち３割前後を占める主要な蛋白質であるが、３重らせん構造を有することから一般的なプロテアーゼではこれを切断分解することが困難であり、また、例えばタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、・・・、ＸＩＩＩ、ＸＩＶコラーゲンなどと呼ばれコラーゲンファミリー蛋白質を構成する分子構造の異なるコラーゲン蛋白質が哺乳動物の各結合組織に特異的に分布する。このようなコラーゲンファミリー蛋白質の３重らせん構造を切断したり分解するコラーゲン分解酵素を分解酵素混液に加える場合には、本第１の実施形態の前処理法により得られるＰｒＰＳｃの検出、測定用の試料中から、検出、測定の感度や精度を低下させる可能性のある非特異蛋白やポリペプチドなどを予め減少又は除去できることもある。分解酵素混液に加える際のコラーゲン分解酵素としては、特に限定されず、コラーゲンファミリー蛋白質の内、１種類（タイプ）以上のコラーゲンを分解するものであれば如何なるコラーゲン分解酵素をも使用できる。主にメタロエンドペプチダーゼ（Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ：ＥＣ ３．４．２４．）に分類され、また、マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とも呼ばれるコラゲナーゼ類（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ゼラチナーゼ類（Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）、ストロメライシン類（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）などのコラーゲン分解酵素が好適に使用できる。前処理対象の動物組織材料に多く含まれるタイプのコラーゲンを分解するコラーゲン分解酵素を１種以上用いることが好ましく、複数タイプのコラーゲン蛋白質を分解することが可能なコラーゲン分解酵素を用いることがより好ましい。
【００２０】
このようなコラゲナーゼ類としては、例えば、クロストリディウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等細菌由来の各種コラゲナーゼ〔Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ：ＥＣ ３．４．２４．３（別名：コラゲナーゼＡ、コラゲナーゼＩ、ＭＭＰ−１、８、１８等を含む）〕、Ｉ〜ＩＩＩの各タイプを含む複数のコラーゲンを分解する脊椎動物由来の間質性コラゲナーゼ〔Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：ＥＣ ３．４．２４．７（別名：コラゲナーゼ−１、ＭＭＰ−１）〕、また、Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘの各タイプのコラーゲンを分解する好中球コラゲナーゼ〔Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：ＥＣ ３．４．２４．３４（別名コラゲナーゼ−２、ＭＭＰ−８等）〕、コラゲナーゼ−３〔ＥＣ ３．４．２４．− （別名ＭＭＰ−１３）〕、コラゲナーゼ−４〔ＥＣ ３．４．２４．− （別名ＭＭＰ−１８）〕などを挙げることができる。また、ゼラチナーゼ類としては、例えば、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘの各タイプのコラーゲンを分解するゼラチナーゼＡ〔ＥＣ ３．４．２４．２４（別名：タイプＩＶコラゲナーゼ、ＭＭＰ−２等）〕、また、ＩＶ及びＶタイプのコラーゲンを分解するゼラチナーゼＢ〔ＥＣ ３．４．２４．３５（別名：タイプＶコラゲナーゼ、ＭＭＰ−９等〕などを挙げることができる。ストロメライシン類としては、例えば、ＩＩＩ〜Ｖ、ＩＸなどの各タイプのコラーゲンを分解するストロメライシン−１〔ＥＣ ３．４．２４．１７（別名：ＭＭＰ−３）〕、ストロメライシン−２〔ＥＣ ３．４．２４．２２（別名：ＭＭＰ−１０）〕などが挙げられる。さらに、本実施形態においては、以上のようなコラーゲン分解酵素に加えて、動物組織材料を可溶化する際に一般的に用いられる蛋白分解酵素や脂質分解酵素などを分解酵素混液に添加することも可能である。
【００２１】
本第１の実施形態における分解酵素混液に両性界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えばアミドアルキルベタイン系、スルホベタイン系、カルボキシベタイン系、イミダゾリニウムベタイン系等のベタイン型、また、例えばアルキルアミノ酢酸系、アルキルアミノプロピオン酸系、アルキル・ジメチルアミノ酢酸系、アルキルアミノジプロピオン酸系等のアミノ酸型やアミノ脂肪酸型などの両性界面活性剤の他、例えば、コール酸アミドアルキル・ジメチルアンモニオプロパンスルホン酸系、アルキルアミドタウリン塩系、アルキルアミドプロピルアミンオキシド系、レシチン系など如何なる両性界面活性剤であっても良い。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。このような両性界面活性剤の具体例としては、例えば、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ：ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ：ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ商品名、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ：商品名レボン、三洋化成工業など）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製など）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製など）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）などを挙げることができる。なお、以上のような両性界面活性剤は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩やアミン塩、塩酸塩や酢酸塩などの塩であっても良く、また、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた両性界面活性剤であっても良い。
【００２２】
また、本第１の実施形態における分解酵素混液に陰イオン界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えば脂肪酸系、アルケニルコハク酸系、Ｎ−アシルサルコシン系、Ｎ−アシルグルタミン酸系等のカルボン酸型、また、例えば硫酸アルキル系、硫酸アルキルポリオキシエチレン系、硫酸モノアシルグリセリン系、アシルアミノ硫酸エステル系等の硫酸エステル型、また、例えばオレフィンスルホン酸系、アルカンスルホン酸系、スルホ脂肪酸系、Ｎ−アシルタウリン系、Ｎ−アシル−Ｎ−メチルタウリン酸系、ジアルキルスルホコハク酸系等のスルホン酸型、また、例えばリン酸アルキル系、リン酸アルキルポリオキシエチレン系等のリン酸エステル型などの他、コール酸系、デオキシコール酸系等如何なる陰イオン界面活性剤であっても良い。このような陰イオン界面活性剤の具体例としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）、ココイルサルコシンナトリウム、ドデカノイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、コール酸ナトリウム（ＳＣｈｏｌ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣｈｏｌ）、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムなどを挙げることができる。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。なお、以上のような陰イオン界面活性剤は、主にナトリウム塩として示したが、他のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩やアミン塩、塩酸塩や酢酸塩などの塩であっても良く、また、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた界面活性剤であっても良い。
【００２３】
また、分解酵素混液に陽イオン界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えばアルキルポリオキシエチレンアミン系、脂肪酸トリエタノールアミンエステル系、Ｎ−アシル−Ｎ′，Ｎ′−ジエチルエチレンジアミン系等のアミン・アミン塩型、また、例えばアルキルトリメチルアンモニウム系、ジアルキルジメチルアンモニウム系、アルキルジメチルベンジルアンモニウム系、アルキルピリジニウム系等の第４級アンモニウム塩型など如何なる陽イオン界面活性剤であっても良い。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。このような陽イオン界面活性剤の具体例としては、例えば、ラウリン酸トリエタノールアミンモノエステル、Ｎ−ラウロイル−Ｎ′，Ｎ′−ジエチルエチレンジアミン、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルジメチレンアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルジメチレンアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウム、セチルピリジニウムクロライド、グアニジンチオシアネートなどを挙げることができる。なお、以上のような陽イオン界面活性剤は、主に塩化物塩として示したが、臭化物塩など他のハロゲン化塩、塩酸塩、ギ酸塩、酢酸塩などの塩であっても良く、また、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた界面活性剤であっても良い。
【００２４】
本実施形態における分解酵素混液に非イオン界面活性剤を添加する場合に用いる界面活性剤としては、特に限定されず、例えば脂肪酸ポリオキシエチレンエステル系、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンエステル系、アルキルポリオキシエチレンエーテル系、アルキルポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル系、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル系、アルキルポリオキシエチレンアミン系、アルキルポリオキシエチレンアミド系、脂肪酸アルカノールアミド系、アミンオキシド系、脂肪酸ソルビタンエステル系、脂肪酸ポリグリセロールエステル系、脂肪酸ショ糖エステル系、アルキルポリグリコシド系、Ｎ−アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミン系等如何なる非イオン界面活性剤であっても良い。また、同系或いは異系の２以上を併用することもできる。このような非イオン界面活性剤の具体例としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−オクチルフェノール（商品名ＮＰ４０；ｐ−Ｔｅｒｔ−Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビトールエステル（商品名Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビトールエステル（商品名Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレングリコール（９−１０）−ｐ−オクチルフェノール（商品名ＴｒｉｔｏｎＸ１００）、オクチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）などを挙げることができる。なお、以上のような非イオン界面活性剤は、適当な濃度の水溶液、生理食塩液など希薄な塩溶液、ｐＨ緩衝液溶液などに溶解又は希釈させた非イオン界面活性剤であっても良い。
【００２５】
以上のような界面活性剤の分解酵素混液中における総配合割合としては、前処理対象の哺乳動物組織材料についてその可溶化困難性など組織材料の種類に応じて適宜増減すれば良く、特に限定されないが、０．１重量％以上、３０重量％以下とすることが好ましい。１重量％以上、２０重量％以下がより好ましく、３重量％以上、１５重量％以下とすることがさらに好ましい。０．１重量％未満では、組織材料の可溶化が不充分となることがあり、３０重量％を超えるとＰｒＰＳｃの測定値に影響を及ぼす場合がある。また、複数の界面活性剤を用いる際の配合割合についても、選択した界面活性剤に応じて適宜決定すれば良く、特に限定されない。分解酵素混液に加えるＰＫの量については、通常のＰｒＰＣ分解に使用される量に準じて適宜増減して添加することができ、本実施の形態においては、分解酵素混液１ｍＬ中の配合量を１０μｇ以上、３００μｇ以下とすることが好ましく、３０μｇ以上、２５０μｇ以下とすることがより好ましい。
【００２６】
このような分解酵素混液に、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を加える場合の添加量についても、特に限定されず、前処理対象の組織材料の種類や選択したＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、コラーゲン分解酵素の種類に応じて適宜決定することができる。本実施の形態においては、ＤＮＡ分解酵素の配合量は分解酵素混液１ｍＬ中に１μｇ以上、１０００μｇ以下とすることが好ましく、５μｇ以上、２００μｇ以下とすることがより好ましい。また、ＲＮＡ分解酵素の配合量としては、分解酵素混液１ｍＬ中に２μｇ以上、２０００μｇ以下とすることが好ましく、１０μｇ以上、４００μｇ以下とすることがより好ましい。コラーゲン分解酵素の配合量としては、分解酵素混液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ以上、５０ｍｇ以下とすることが好ましく、０．２５ｍｇ以上、１０ｍｇ以下とすることがより好ましい。さらに、以上のような分解酵素混液には、例えばメタノール、クロロホルム、メタノール・クロロホルム混液、１−ブタノール、２−ブタノールなどの有機溶媒を加えることができ、このような有機溶媒を添加する場合に、分解酵素混液中の配合割合としては、０．１重量％以上、１０重量％以下とすることが好ましい。また、例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等の無機塩を分解酵素酵素混液に溶解可能な範囲で添加することができる。なお、上述のような分解酵素混液では、そのｐＨを所定範囲に調整することが好ましく、配合される界面活性剤やＰＫの他、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、コラーゲン分解酵素などの添加状態などに応じて適宜ｐＨ緩衝剤を選定し添加すれば良い。また、このような、分解酵素混液は、例えば、凍結乾燥したり、粉末状の各成分を配合して固体状に調製した部分と界面活性剤、ｐＨ緩衝液等の液状部分とに分離しておき、用時溶解して使用する形態とすることもできる。
【００２７】
本実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程では、前処理対象の哺乳動物組織材料に、上述のような分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す。分解酵素混液の使用量は、組織材料の動物種や組織種類に応じて適宜決定することができるが、ここでは、前処理対象の組織材料重量に対して、２倍重量以上、２０倍重量以下とすることが好ましく、３倍重量以上、１５倍重量以下がより好ましい。ホモジナイズ処理には、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のようなフッ素樹脂製の棒をその外径よりわずかに大きな内径を有する円筒容器内で回転させるポッターエルベジェム型、金属固定刃と回転刃により組織材料を破砕するタイプ（例えばポリトロン社製など）、閉鎖容器内に高速回転刃を取付けたブレンダー型（例えばＷａｒｉｎｇ社製など）、閉鎖可能な容器内に処理対象の組織材料などと共にビーズを入れ、振とう、回転などにより組織材料を破砕するビーズ式破砕機（和研薬株式会社製、安井機械社製など）、これらに超音波処理を組み合わせたタイプ等の各種ホモジナイザーを用いることができる他、２本連結した注射筒内で内筒を往復移動させることで組織を破砕しても良く、複数のタイプを併用することも可能である。本第１の実施形態においては、より短時間内で効率的に組織材料の可溶化ができる場合があること、また、ホモジナイズ処理中に組織材料が飛散する可能性が低い点で、ビーズ式破砕機を用いることが好ましい。このようなビーズ式破砕型のホモジナイザーを用いた場合のホモジナイズ処理は、１分間以上、１０分間以下行うことが好ましく、２分間以上、５分間以下とすることがより好ましい。また、ホモジナイザーによる処理後の処理液を、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の所定温度に保持した恒温器又はヒートブロック内にて加温することができる。加温時間は、１分間以上、１０分間以下とすることが好ましく、２分間以上、５分間以下がより好ましい。なお、ホモジナイズ処理を、２０℃以上、７０℃以下、より好ましくは３５℃以上、５５℃以下の温度条件下にて実施することもでき、ＰｒＰＳｃの検出や測定に悪影響を及ぼすことなく、より前処理時間を短縮できる場合もある。
【００２８】
上述のような本第１の実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液（ＰｒＰＣ分解済み液）は、哺乳動物組織材料が可溶化され正常プリオンが分解された状態となっている。次に、このＰｒＰＣ分解済み液について、図１に示すような蛋白変性処理工程（Ａ）を施す。本実施形態の蛋白変性処理工程（Ａ）では、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する。ＰＫ阻害剤としては、ＰＫ活性を阻害することが可能であれば、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、メタロエンドペプチダーゼ阻害剤など如何なるプロテアーゼ阻害剤をも使用可能であり、複数のプロテアーゼ阻害剤を併用することもできる。ここでは、セリンプロテアーゼ阻害剤を含むものを用いることがより好ましく、例えばフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ベンズアミジン（Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：例えば商品名；ＰＥＦＡＢＬＯＣ ＳＣ、ロシュダイアグノスティック社）のようなセリンプロテアーゼ阻害剤が好適に使用できる。ＰＫ阻害剤の添加量は、前段の可溶化ＰｒＰＣ分解工程において分解酵素混液に加えられたＰＫ量に応じて適宜決定すれば良いが、本実施形態では、ＰｒＰＣ分解済み液に添加後の濃度が０．１ｍＭ以上、１０ｍＭ以下となるように加えることが好ましく、０．５ｍＭ以上、５ｍＭ以下がより好ましい。また、粉末状の尿素を、添加後の濃度が４〜８Ｍ、より好ましくは５〜７Ｍとなるように添加した後、加熱することが良く、この加熱条件としては、例えば３０℃以上、１１０℃以下の温度にて、１分間以上、１０分間以下加熱することができる。５０℃以上、１００℃以下の温度にて、３分間以上、７分間以下の加熱条件とすることがより好ましい。
【００２９】
本第１の実施形態では、必要に応じ、上述のような蛋白変性処理工程（Ａ）により得られる蛋白変性処理済液に、希釈液を添加してＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とする尿素濃度調整工程を実施することができる（図１）。なお、前段の蛋白変性処理工程（Ａ）で得られた蛋白変性処理済液は、ＰｒＰＣが完全に分解され、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合には、「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントが含まれた状態となっており、プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための試料として、尿素濃度調整工程を省略し、蛋白変性処理済液をそのまま用いることも可能である。一方で、蛋白変性処理済液は尿素濃度などが高く、例えばＷＢ法やＥＬＩＳＡ法などを用いる測定系に影響を及ぼすことがあり、この場合に、この尿素濃度調整工程を実施すれば良い。希釈液としては、ＰｒＰＳｃを検出又は測定するための測定に適するように調製すれば良く、特に限定されない。例えば、水、生理食塩液の他、リン酸塩系（リン酸緩衝生理食塩液：ＰＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩系（Ｔｒｉｓ緩衝液）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン塩系（Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−エタンスルホン酸塩系（ＨＥＰＥＳ緩衝液）、３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸塩系（ＭＯＰＳ緩衝液）、グリシン−塩酸系、酢酸塩系等のｐＨ緩衝液、また、ＥＬＩＳＡ法等における非特異吸着を防止するアルブミンやスキムミルク等のブロッキング剤溶液などが好適に使用できる。さらに希釈液には、例えば、測定系の感度を高めたり、蛋白変性処理済液中に残存する組織材料由来の測定妨害物質又は界面活性剤やＰＫ阻害剤など尿素以外の配合成分による測定系への影響を防止するような物質を添加することもできる。また、希釈倍率についても、希釈液と同様に特に限定されない。本実施形態では、ＰｒＰＳｃを検出又は測定する一般的な測定系に影響を及ぼすことが少ない点で、希釈後の尿素濃度を０．０５Ｍ以上、３Ｍ以下とすることが好ましく、０．５Ｍ以上、２．５Ｍ以下とすることがより好ましく、１Ｍ以上、２Ｍ以下となるように希釈することがさらに良い。
【００３０】
〔第２の実施形態〕
第２の実施形態による哺乳動物組織材料の前処理方法は、図２に前処理方法のフローを示すように、第１の実施形態とは、主として蛋白変性処理工程が異なる。すなわち、第１の実施形態の場合と同様、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料を調製するために採取された哺乳動物組織材料に、分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備える。次に、本第２の実施形態では、第１の実施形態における蛋白変性処理工程（Ａ）に替わる蛋白変性処理工程（Ｂ）を実施することとなるが、蛋白変性処理工程（Ａ）との処理条件の差異を考慮した上で、第１の実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程について上記した処理条件に準じて行うことができる。本第２の実施形態による可溶化ＰｒＰＣ分解工程については、重複した詳細説明を省略するが、第１の実施形態の場合と同様に、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液（ＰｒＰＣ分解済み液）は、哺乳動物組織材料が可溶化されＰｒＰＣが分解された状態となっている。本第２の実施形態の蛋白変性処理工程（Ｂ）では、このＰｒＰＣ分解済み液について、図２に示すように、蛋白沈殿化剤を加えて撹拌した後、遠心分離して上清を除き、得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する。
【００３１】
蛋白沈殿化剤としては、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合に「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントなどを含む蛋白質を凝集、析出、沈殿化できれば如何なる蛋白沈殿化剤であっても良く、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールのような有機溶媒又は複数の有機溶媒混液、硫酸アンモニウムのような塩析効果を有する塩類、ＳｉＷ１１ のようなタングステン化合物、トリクロロ酢酸など特に限定されない。本第２の実施形態における蛋白沈殿化剤としては、ＥＬＩＳＡ法などの測定系に影響を及ぼす可能性のある測定妨害物質と成り得る哺乳動物組織材料由来の成分を沈殿物に混入共沈することを防ぐ場合もある点では、有機溶媒又は複数の有機溶媒混液が好ましく、ブタノールを含む有機溶媒がより好ましく、２−ブタノールがさらに好適である。また、このような蛋白沈殿化剤の添加量についても、選択した蛋白沈殿化剤の種類や、前段の可溶化ＰｒＰＣ分解工程において分解酵素混液に加えた界面活性剤の種類などに応じて適宜決定することができる。例えば、蛋白沈殿化剤として有機溶媒又は有機溶媒混液を用いる場合には、ＰｒＰＣ分解済み液１ｍＬに対して、０．１ｍＬ以上、２ｍＬ以下添加することが好ましく、０．２ｍＬ以上、１ｍＬ以下がより好ましい。
【００３２】
蛋白沈殿化剤を加えて撹拌後の遠心分離条件としては、上清が澄明な状態に沈殿物と分離可能であれば、如何なる遠心分離条件であっても良く、特に限定されない。例えば、１７０００×ｇでは、５分間で分離することができ、また、冷却型遠心分離装置を用いて遠心分離しても良い。上清を除去した後、沈殿物に尿素液を添加する。尿素液の尿素濃度としては、４〜８Ｍとすることが好ましく、５〜７Ｍとすることがより好ましい。このような尿素液の添加量は、前処理のために採取した哺乳動物組織材料の種類や量に応じて適宜決定することができ、特に限定されない。例えば、哺乳動物組織材料の採取量１００ｍｇにつき、２５μＬ〜２５０μＬ程度の尿素液を添加すれば良く、５０μＬ〜１５０μＬがより好ましい。蛋白変性処理工程（Ｂ）における加熱条件としては、例えば３０℃以上、１１０℃以下の温度にて、１分間以上、１０分間以下加熱することができる。５０℃以上、１００℃以下の温度にて、３分間以上、７分間以下の加熱条件とすることがより好ましい。
【００３３】
本第２の実施形態では、必要に応じ、上述のような蛋白変性処理工程（Ｂ）により得られる蛋白変性処理済液に、希釈液を添加してＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とする尿素濃度調整工程を実施することができる（図２）。蛋白変性処理工程（Ｂ）で得られた蛋白変性処理済液は、ＰｒＰＣが完全に分解され、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合には、「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントが含まれた状態となっている。したがって、プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための前処理済み試料として、尿素濃度調整工程を省略し、蛋白変性処理済液をそのまま用いることも可能である。一方で、蛋白変性処理済液は尿素濃度などが高く、例えばＷＢ法やＥＬＩＳＡ法などを用いる測定系に影響を及ぼすことがあり、このような場合に、この尿素濃度調整工程を実施すれば良い。本第２の実施形態による尿素濃度調整工程において、使用できる希釈液、希釈液にさらに添加可能な物質、希釈倍率などについては、第１の実施形態の場合と同様であり、重複を避けるため詳細説明を省略する。
【００３４】
〔第３の実施形態〕
第３の実施形態による哺乳動物組織材料の前処理方法は、図３に前処理方法のフローを示すように、第１の実施形態とは、主として、蛋白変性処理工程を具備せず、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液（ＰｒＰＣ分解済み液）にＰＫ阻害剤を添加する点で異なる。すなわち、第１の実施形態の場合と同様、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料を調製するために採取された哺乳動物組織材料に、分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理を施す可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備える。次に、本第３の実施形態では、蛋白変性処理工程（Ａ）に替えて、ＰｒＰＣ分解済み液に尿素を添加することなくＰＫ阻害剤を加えるＰＫ阻害剤添加工程を実施することとなるが、第１の実施形態における蛋白変性処理工程（Ａ）との処理条件の差異を考慮した上で、第１の実施形態における可溶化ＰｒＰＣ分解工程について上記した処理条件に準じて行うことができる。本第３の実施形態による可溶化ＰｒＰＣ分解工程については、重複した詳細説明を省略するが、第１の実施形態の場合と同様に、可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られたＰｒＰＣ分解済み液は、哺乳動物組織材料が可溶化されＰｒＰＣが分解された状態となっている。
【００３５】
本第３の実施形態のＰＫ阻害剤添加工程において、ＰｒＰＣ分解済み液に加えるＰＫ阻害剤及びＰＫ阻害剤の添加量としては、第１の実施形態の蛋白変性処理工程（Ａ）においてＰｒＰＣ分解済み液に加える場合と同様のＰＫ阻害剤を用いることができ、ＰＫ阻害剤の添加量についても同様であり、重複した詳細説明を省略する。また、本第３の実施形態では、必要に応じ、上述のようなＰＫ阻害剤添加工程により得られる処理液（ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液）に、希釈液を添加してＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とする界面活性剤濃度調整工程を実施することができる（図３）。なお、前段のＰＫ阻害剤添加工程で得られた処理液は、ＰｒＰＣが完全に分解され、前処理前の哺乳動物組織材料にＰｒＰＳｃが蓄積していた場合には、未変性の「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントが含まれた状態となっている。したがって未変性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることによりＰｒＰＳｃを検出又は測定するための試料として、界面活性剤濃度調整工程を省略し、ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液をそのまま用いることも可能である。一方で、ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液は界面活性剤濃度などが高く、例えばＷＢ法やＥＬＩＳＡ法などを用いる測定系に影響を及ぼすことがあり、この場合に、界面活性剤濃度調整工程を実施すれば良い。本第３の実施形態による界面活性剤濃度調整工程において、使用できる希釈液、希釈液にさらに添加可能な物質などについては、第１の実施形態の尿素濃度調整工程における場合と同様であり、重複説明を省略する。なお、本第３の実施形態による界面活性剤濃度調整工程において、上述のような希釈液を用い、ＰＫ阻害剤が添加されたＰｒＰＣ分解済み液を希釈する際の希釈倍率としては、ＰｒＰＳｃを検出又は測定するための測定に適するような希釈倍率とすれば良く、特に限定されない。本実施形態では、例えば、ＰｒＰＳｃを検出又は測定する一般的な測定系に影響を及ぼすことが少ない点で、２倍以上、１２０倍以下とすることが好ましく、２．４倍以上、１２倍以下とすることがより好ましく、３倍以上、６倍以下となるように希釈することがさらに良い。このような第３の実施形態の前処理方法によれば、ＰｒＰＳｃの検定や測定系において未変性の「ＰｒＰ２７−３０」フラグメントに対する特異抗体を用いる必要があるものの、第１又は第２の実施形態に比して、より短時間の内に前処理を行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の哺乳動物組織材料の前処理方法について、実施例、試験例を示して具体的に説明するが、これによって本発明を限定するものではない。
【００３７】
〔実施例１〕（組織材料の可溶化）
正常マウスの中枢神経組織（脳内組織）及びウシ延髄組織をそれぞれ動物組織材料として、第１の実施形態に準じて組織可溶化の検討を行った。分解酵素混液には、３重量％のラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）及び１重量％のｐ−オクチルフェノール（ＮＰ４０）の界面活性剤とＰＫ（２００μｇ／ｍＬ）を添加したＰＢＳ溶液を用いた。組織材料採取量の５倍重量の分解酵素混液を加え、２本連結した注射筒内で内筒を往復移動させることで組織を破砕する方式にて、２分間ホモジナイズ処理した後、３７℃、５分間加温した。この状態で、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。続く、蛋白変性処理工程における尿素添加は６Ｍ濃度、加熱条件は、１００℃、５分間とした。尿素濃度調整工程では、ＰＢＳを希釈液として尿素濃度１Ｍに希釈した。この状態においても、マウス脳組織材料からの前処理済み液は澄明であったが、ウシ延髄組織材料からの前処理済み液は濁りが認められた。
【００３８】
〔実施例２〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、２−ブタノール及び界面活性剤として、ポリオキシエチレン（８０）ソルビトールエステル（商品名Ｔｗｅｅｎ２０）を追加し、表１に示すように配合を代えた以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
〔実施例３〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、塩化ナトリウムを添加し、また、ｐＨを表２に示すように組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４１】
【表２】
【００４２】
〔実施例４〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、１−ブタノール、塩化マグネシウム、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼ（ｐａｎｃｒｅａｌｉｐａｓｅ）などを加え、界面活性剤として、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）のみとし、表３に示すように配合を組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４３】
【表３】
【００４４】
〔実施例５〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼなどを加え、界面活性剤を、オクチル−β−Ｄ−グルコシド（Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）とし、表４に示すように配合を組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４５】
【表４】
【００４６】
〔実施例６〕（組織材料の可溶化）
分解酵素混液に、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼなどを加え、界面活性剤を、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）及びオクチル−β−Ｄ−グルコシドとし、表５に示すように配合を組み合わせ変更した以外は、実施例１と同様の条件にて検討を行った。何れの条件においても実施例１の場合と同様に、マウス脳組織材料は澄明に可溶化されたが、ウシ延髄組織材料は濁りが認められた。
【００４７】
【表５】
【００４８】
〔実施例７〕（組織材料の可溶化）
ウシ延髄組織を動物組織材料として、第２の実施形態に準じて組織可溶化の検討を行った。分解酵素混液には、２−ブタノール、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡ、ウシ膵臓由来リパーゼなどを加え、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）及びオクチル−β−Ｄ−グルコシドの界面活性剤とＰＫ（２００μｇ／ｍＬ）を表６のように添加配合したＰＢＳ溶液を用いた。組織材料採取量の１０倍重量の分解酵素混液を加え、ビーズ式破砕機（商品名Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；和研薬株式会社製、又は、商品名マルチビーズショッカー；安井機械製）にて、２分間ホモジナイズ処理した後、ヒートブロック（ＴＡＩＴＥＣ製ドライサーモユニットＤＴＵ−１Ｂ又はアルミブロックＡＬ−１１３６Ｂ）を用い、３７℃〜４２℃、５分間加温（インキュベート）した。この状態で、ウシ延髄組織材料は澄明に可溶化されるが、室温に保存すると濁りが認められた。ＰＫ阻害剤として４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：商品名；ＰＥＦＡＢＬＯＣ ＳＣ、ロシュダイアグノスティック社製）を２ｍＭ相当濃度となるように加え、ＳｉＷ１１ ０．５重量％を添加した後、１５０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を除去し、得られた沈殿物に６Ｍ尿素液を組織材料採取重量に対して１．５〜３倍容量加えて、１００℃、５分間蛋白変性処理した。尿素濃度調整工程では、ＰＢＳを希釈液として尿素濃度１Ｍに希釈した。蛋白変性処理工程、及び尿素濃度調整工程後の処理液には濁りが認められ可溶化が不充分であった。また、可溶化が不充分な状態の尿素濃度調整工程処理液では、ウシｒ−ＰｒＰＣを添加してもＥＬＩＳＡ法により検出できなかった。なお、マウス脳組織材料を動物組織材料として用いた場合には、澄明に可溶化され検出可能であった。
【００４９】
【表６】
【００５０】
〔実施例８〕（組織材料の可溶化）
ウシ延髄組織を動物組織材料として、第１の実施形態に準じて組織可溶化の検討を行った。分解酵素混液には、ＤＮａｓｅ−Ｉ、ＲＮａｓｅ−Ａ、コラゲナーゼＡを加え、両性界面活性剤［ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ：ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ商品名、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）又は、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチレート（ＤＤＭＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）］及び陰イオン界面活性剤［ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）］を組み合わせた界面活性剤とＰＫ（２００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ表７のように添加配合したＰＢＳ溶液を用いた。組織材料採取量の１０倍重量の分解酵素混液を加え、ビーズ式破砕機（商品名Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；和研薬株式会社製、又は、商品名マルチビーズショッカー；安井機械製）にて、２５００ｒｐｍ、２分間ホモジナイズ処理した後、ヒートブロック（ＴＡＩＴＥＣ社製ドライサーモユニットＤＴＵ−１Ｂ又はアルミブロックＡＬ−１１３６Ｂ）を用い、３７℃〜４２℃、５分間加温（インキュベート）した。ウシ延髄組織材料について可溶化ＰｒＰＣ分解工程を行った処理液は、ほぼ澄明に可溶化されていた。
【００５１】
【表７】
【００５２】
〔実施例９〕（組織材料の可溶化）
両性界面活性剤として、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ：ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン）を用いた以外は、実施例８の場合と同様にそれぞれ表８のように添加配合し、組織可溶化の検討を行った。実施例８の場合同様、ウシ延髄組織材料について可溶化ＰｒＰＣ分解工程を行った処理液は、ほぼ澄明に可溶化されていた。
【００５３】
【表８】
【００５４】
〔実施例１０〕（組織材料の可溶化）
両性界面活性剤として、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）を追加して用いた以外は、実施例８の場合と同様にそれぞれ表９のように添加配合し、組織可溶化の検討を行った。実施例８の場合同様、ウシ延髄組織材料について可溶化ＰｒＰＣ分解工程を行った処理液は、ほぼ澄明に可溶化されていた。
【００５５】
【表９】
【００５６】
〔実施例１１〕（ＥＬＩＳＡ測定用試料調製）
哺乳動物組織材料として正常ウシ延髄組織材料１００ｍｇ及びウシ延髄組織材料１００ｍｇにＰｒＰＳｃ感染マウスの脳乳剤５重量％を添加したＰｒＰＳｃ添加ウシ延髄組織材料をそれぞれ２ｍＬ容量のマイクロチューブに採取し、４重量％のｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸塩（ＤＤＭＡＢ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、０．０１重量％のＤＮａｓｅ−Ｉ、０．０１重量％のＲＮａｓｅ−Ａ、０．５重量％のコラゲナーゼＡ、０．００５重量％のＰＫを添加した５０ｍＭ、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ緩衝液１ｍＬとステンレスビーズを加え、ビーズ式破砕機（商品名；マルチビーズショッカー、安井機械社製）にて２５００ｒｐｍで２分間ホモジナイズ処理を行い、続いてアルミブロックヒーターで３７℃、３分間加温（インキュベート）し、可溶化ＰｒＰＣ分解工程処理液を得た。次に、ＰＫ阻害剤として４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：商品名；ＰＥＦＡＢＬＯＣ ＳＣ、ロシュダイアグノスティック社製）２５μＬを加えてアルミブロックヒーターで１００℃、２分間加熱した。この段階で得られた正常ウシ延髄組織材料由来の試料、０、１２０、１６０、１８０、１９０、２００μＬと、ＰｒＰＳｃ添加ウシ延髄組織材料由来の試料２００、８０、４０、２０、１０、０μＬをそれぞれ別のマイクロチューブにて混合し、５重量％、２重量％、１重量％、０．５重量％、０．２５重量％及び０％（ＰｒＰＳｃ不含）のＰｒＰＳｃ感染マウス脳乳剤混入試料を作製した。各試料に尿素７２ｍｇを添加し、１００℃、５分間加熱し蛋白変性処理工程を行う。良く攪拌してから精製水で１０倍に希釈したブロックエース（大日本製薬社製）をそれぞれ０．４ｍＬ加えて前処理済みの測定試料を得た（尿素終濃度約２Ｍ）。
【００５７】
〔試験例１〕（ＥＬＩＳＡ測定）
あらかじめマウス抗ＰｒＰモノクローナル抗体を固相化した９６穴マイクロプレートを用いて試験を行った。実施例１１にて得られた各測定試料について、それぞれ２ウェルに各５０μＬを分注した（２重測定）。ＨＲＰ標識マウス抗ＰｒＰモノクローナル抗体溶液５０μＬをそれぞれ各ウェルに添加し、室温で１時間放置したのち、ＰＢＳＴで洗浄した。発色基質溶液（ＴＭＢＺ：３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを添加して室温で遮光して３０分間放置したのち、１Ｍ濃度の硫酸１００μＬを加えてマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。この結果、図４に示すようにＰｒＰＳｃ感染マウス脳乳剤の添加量に比例した吸光度の上昇が認められ、本発明による迅速前処理法が大動物の組織材料であってもＰｒＰＳｃの測定用の試料調製に有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の第１の実施形態による哺乳動物組織材料前処理方法のフロー図である。
【図２】本発明の第２の実施形態による哺乳動物組織材料前処理方法のフロー図である。
【図３】本発明の第３の実施形態による哺乳動物組織材料前処理方法のフロー図である。
【図４】本発明により得られた前処理試料につきＥＬＩＳＡ法によるＰｒＰＳｃ測定の一例を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）の検出又は測定用試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法であって、
採取した哺乳動物組織材料に、界面活性剤とプロティナーゼＫ（ＰＫ）とを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理する可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備えることを特徴とする哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項２】
前記哺乳動物組織材料が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれた哺乳動物の延髄組織又は中枢神経組織であることを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項３】
前記分解酵素混液が、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が、両性界面活性剤を含むものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤との組み合わせからなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤が、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はこれらの塩から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項４又は５に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項７】
前記陰イオン界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）、ココイルサルコシンナトリウム、ドデカノイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、コール酸ナトリウム（ＳＣｈｏｌ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣｈｏｌ）、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムから１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項５に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項８】
前記分解酵素混液中の界面活性剤の配合割合を０．１乃至３０重量％とすることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項９】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程におけるホモジナイズ処理は、容器内にビーズを入れたビーズ式破砕機によって行うことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１０】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程において、ホモジナイズ処理したのち、２０℃以上、７０℃以下の温度で加温（インキュベート）することを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１１】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ａ）を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１２】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、蛋白沈殿化剤を加えて撹拌後遠心分離して得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ｂ）を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１３】
前記請求項１１又は１２に記載の蛋白変性処理工程で得られた蛋白変性処理済液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることを特徴とする哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１４】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤を加えるＰＫ阻害剤添加工程を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１５】
前記請求項１４に記載のＰＫ阻害剤添加工程で得られた処理液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることを特徴とする哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１】
異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）の検出又は測定用試料を調製するための哺乳動物組織材料の前処理方法であって、
採取した哺乳動物組織材料に、界面活性剤とプロティナーゼＫ（ＰＫ）とを含んでなる分解酵素混液を加えてホモジナイズ処理する可溶化ＰｒＰＣ分解工程を備えることを特徴とする哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項２】
前記哺乳動物組織材料が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれた哺乳動物の延髄組織又は中枢神経組織であることを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項３】
前記分解酵素混液が、ＤＮＡ分解酵素及び／又はＲＮＡ分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が、両性界面活性剤を含むものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、両性界面活性剤と陰イオン界面活性剤との組み合わせからなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤が、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はこれらの塩から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項４又は５に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項７】
前記陰イオン界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳａｒｃ）、ココイルサルコシンナトリウム、ドデカノイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、コール酸ナトリウム（ＳＣｈｏｌ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣｈｏｌ）、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムから１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項５に記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項８】
前記分解酵素混液中の界面活性剤の配合割合を０．１乃至３０重量％とすることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項９】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程におけるホモジナイズ処理は、容器内にビーズを入れたビーズ式破砕機によって行うことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１０】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程において、ホモジナイズ処理したのち、２０℃以上、７０℃以下の温度で加温（インキュベート）することを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１１】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤と粉末状尿素とを添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ａ）を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１２】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、蛋白沈殿化剤を加えて撹拌後遠心分離して得られる沈殿物につき、尿素液を添加して加熱する蛋白変性処理工程（Ｂ）を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１３】
前記請求項１１又は１２に記載の蛋白変性処理工程で得られた蛋白変性処理済液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることを特徴とする哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１４】
前記可溶化ＰｒＰＣ分解工程で得られた処理液に、ＰＫ阻害剤を加えるＰＫ阻害剤添加工程を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の哺乳動物組織材料の前処理方法。
【請求項１５】
前記請求項１４に記載のＰＫ阻害剤添加工程で得られた処理液に、希釈液を添加して、ＰｒＰＳｃの検出又は測定用試料とすることを特徴とする哺乳動物組織材料の前処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−９７５０８（Ｐ２００７−９７５０８Ａ）
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９３０１１（Ｐ２００５−２９３０１１）
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【出願人】（０００１１８４９７）伊藤ハム株式会社 (57)
【出願人】（５０２１００４１５）マイクロ化学技研株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【出願人】（０００１１８４９７）伊藤ハム株式会社 (57)
【出願人】（５０２１００４１５）マイクロ化学技研株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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