幹細胞を活性化するための方法およびデバイス
本明細書に記載の発明の実施形態には、幹細胞源中の間葉幹細胞を、骨を形成できる骨芽細胞に分化するように刺激する方法およびデバイスが含まれる。記載したデバイスおよび方法には、骨髄穿刺液、脂肪組織および／または精製した同種異系幹細胞などの幹細胞源を、活性化幹細胞の形成に有効なように活性剤に曝露することが含まれる。本発明は、哺乳動物において骨成長を促進するための移植組成物を調製する方法を提供し、この方法は、（ａ）幹細胞を１種または複数の活性剤と２４時間以下の間接触させて、活性化幹細胞を調製するステップ、（ｂ）活性化幹細胞から活性剤を分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成するステップ、および（ｃ）活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団と骨移植片代用物とを混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進する移植組成物を調製するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この特許出願は、２００８年１０月３１日に出願された、表題「ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ ＢＯＮＥ ＭＡＲＲＯＷ ＡＳＰＩＲＡＴＥ ＵＳＩＮＧ ＥＸ ＶＩＶＯ ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ ＢＹ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＢＯＮＥ ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ」の米国仮特許出願第６１／１１０，０９６号、および２００９年２月１３日に出願された、表題「ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＦＯＲＭＩＮＧ Ａ ＢＯＮＥ ＭＡＲＲＯＷ ＡＳＰＩＲＡＴＥ ＰＲＯＤＵＣＴ」の米国仮特許出願第６１／１５２，３３５号（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
分野
本明細書に記載の発明主題は、骨髄穿刺液（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｓｐｉｒａｔｅ）中の幹細胞を、エクスビボ刺激を用いて活性化することを含む、幹細胞を活性化するデバイスおよび方法に関する。該発明主題は、このような活性化幹細胞を含有する移植物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
最大限の骨形成を実現するには、骨芽細胞の表現型を既に示している細胞を移植することが望ましく、それは、そのような細胞が骨形成活性を示す見込みがあるためである。しかし、骨髄幹細胞の骨芽細胞へのインビトロ分化には、骨形成培地中での培養が必要であり（非特許文献１）、このような細胞の増殖は、インビトロで低下することになり得る。その上、骨形成培地の使用には、細胞に成分（例えば、増殖因子）を添加することが必要であり、そうした成分は、細胞と共に患者に投与した場合、意図しない副作用を示す恐れがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｉｓｗａｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９７年）６４巻：２９５〜３１２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野では、幹細胞、例えばヒト骨髄幹細胞から、骨原細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞をインビトロで産生する簡潔で信頼できる方法であって、所望の細胞が、骨原細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の生成に使用される因子から容易に分離される方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、哺乳動物において骨成長を促進するための移植組成物（ｉｍｐｌａｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を調製する方法であって、（ａ）幹細胞を１種または複数の活性剤と２４時間以下の間接触させて、活性化幹細胞を調製するステップ、（ｂ）活性化幹細胞から活性剤を分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成するステップ、および（ｃ）活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団と骨移植片代用物とを混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進する移植組成物を調製するステップを含み、少なくとも１種の活性剤が、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）への分化を促進する方法である。骨形成原細胞および／または骨形成前駆細胞は、骨原細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の場合もある。幾つかの実施形態では、幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から１時間接触させる。他の実施形態では、幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から０．５時間接触させる。幹細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児の皮膚、青年の皮膚（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ ｓｋｉｎ）または血液から、取得または単離することができる。幹細胞は、胚性、生後または成体の幹細胞でもよい。幾つかの実施形態では、幹細胞は、自家、同種異系または異種である。幹細胞は、間葉幹細胞を含むことができる。このような間葉幹細胞は、自家骨髄穿刺液を含むことができる。該骨髄穿刺液は、手術中に取り出すことができる。幹細胞を得た後、不要な液体を除去するために幹細胞を濃縮することができる。あるいは、幹細胞は、最初に得た組織または液体から分離することができる。
【０００７】
活性剤は、例えば、細胞の増殖および／または分化を調節でき、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンド、ホルモンおよびそれらの組合せからなる群より選択し得る。活性剤の例には、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｓｉｎ）、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびそれらの組合せ等の活性剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、活性剤は、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、活性剤は、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含み、更にＰＤＧＦを含むことができる。活性剤は、自家源に由来してもよい。活性剤は、溶液中で本方法に使用することができる。活性剤を溶液中で本方法で使用する場合、活性化幹細胞は、ろ過、ゲルろ過、接線流ろ過、免疫沈降、免疫吸収、カラムクロマトグラフィーまたはそれらの組合せを含む手順によって、ステップ（ｂ）に従って活性剤から分離される。他の実施形態では、活性剤は、固体支持体に結合されている。例えば、活性剤の少なくとも一部は、共有結合、吸着、非共有結合性相互作用および／またはそれらの組合せにより、固体支持体に直接的または間接的に結合することができる。幾つかの実施形態では、活性剤の少なくとも一部は、ペプチド、抗体、化学架橋剤、アルキレン鎖またはそれらの組合せを介して、固体支持体に結合されている。
【０００８】
骨移植片代用物は、カルシウム塩などの材料を含むことができる。このようなカルシウム塩は、例えば、リン酸一カルシウム一水和物、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、またはそれらの組合せを含むことができる。骨移植片代用物は、脱灰骨、リン酸ナトリウム塩、ポリマーまたはそれらの組合せを更に含むことができる。このようなポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、キサンタン（ｘａｎｔｈａｍ）ガム、ガーガム、アルギネート、またはそれらの組合せでもよい。幾つかの実施形態では、本方法は、幹細胞においてアルカリホスファターゼおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体サブユニットの発現を増加させる。このような方法は、患者に移植組成物を移植することを更に含むことができる。
【０００９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法により調製される移植組成物である。
【００１０】
本発明の別の態様は、被験体における骨の損傷、障害または状態を処置する方法であって、被験体における骨の損傷、障害または状態の部位へ、本明細書に記載の移植組成物を投与することを含む方法である。このような骨の損傷、障害または状態は、骨折、骨欠陥、骨移植、骨移植片、骨癌、関節置換、関節修復、骨癒合、骨面修復（ｂｏｎｅ ｆａｃｅｔ ｒｅｐａｉｒ）、骨変性、歯科インプラント、歯の修復（ｄｅｎｔａｌ ｒｅｐａｉｒ）、関節炎、骨再建、またはそれらの組合せでもよい。
【００１１】
本発明の別の態様は、固体支持体と、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞への分化を促進する少なくとも１種の活性剤とを含む、幹細胞活性化用のデバイスであって、（ｉ）幹細胞を少なくとも１種の活性剤と共にインキュベートするため、および（ｉｉ）インキュベートするステップ（ｉ）の後に、幹細胞から少なくとも１種の活性剤を分離するために適合しているデバイスである。例えば、少なくとも１種の活性剤は、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１２】
幾つかの実施形態では、少なくとも１種の活性剤は、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、少なくとも１種の活性剤は、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含み、更にＰＤＧＦを含むことができる。少なくとも１種の活性剤は、例えば、自家源に由来してもよい。活性剤（複数可）は、固体支持体内の溶液中にある、または固体支持体に結合することができる。活性剤は、例えば、少なくとも１種の活性剤と結合する抗体またはペプチドを介して、固体支持体に結合することができる。
【００１３】
固体支持体は、カラムマトリックス材料、フィルター、培養用のプレート、チューブもしくは皿、マイクロタイタープレート、ビーズ、ディスク、またはそれらの組合せを含むことができる。固体支持体は、容器でもよい。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、磁気粒子、ニトロセルロース、ガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはそれらの組合せを含むことができる。固体支持体は、少なくとも１種の活性剤を除去するために、親和性マトリックスも含むことができる。フィルターが固体支持体中に存在する場合、フィルターは、細胞および骨移植片代用物材料（ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）を保持するが、少なくとも１種の活性剤を通過させることができる。あるいは、フィルターは、少なくとも１種の活性剤を保持するが、幹細胞を通過させることができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、幹細胞と結合することも、幹細胞に対して有害な相互作用をすることもしない。他の実施形態では、固体支持体は、幹細胞と有害な相互作用をせずに、幹細胞と結合することができる。
【００１４】
該デバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を制御するために、タイマーを更に備えることができる。例えば、タイマーは、インキュベートするステップ（ｉ）の後に、幹細胞から少なくとも１種の活性剤を分離することを誘発することができる。幾つかの実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を２４時間以下に制御する。他の実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を５分間から１時間に制御する。
【００１５】
本発明の別の態様は、幹細胞源を取り扱うための第１の構成要素と、幹細胞源中の間葉幹細胞を骨芽細胞に分化するように刺激し、骨芽細胞を骨の修復および／または生成に有用な移植組成物中に組み込めるようにするのに有効に、幹細胞源を活性剤に曝露するための第２の構成要素を備える、骨形成用のデバイスである。幹細胞源は、自家骨髄穿刺液を含む骨髄穿刺液、脂肪組織および／または精製した同種異系幹細胞でもよい。
【００１６】
活性剤には、それだけに限らないが、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロールおよび／またはソニックヘッジホッグを挙げることができる。活性剤は、デバイスの固体支持体に直接結合するか、または例えばリンカーを介して固体支持体に繋留してもよい。一実施形態では、繋留部は、アルキレン鎖、ペプチド、抗体、化学架橋剤、およびそれらの組合せから選択される。
【００１７】
一実施形態では、活性剤は溶液中にあり、第２の構成要素は、間葉幹細胞から活性剤を除去するフィルター構成要素または親和性マトリックス（例えば、ペプチドもしくは抗体を有する）を更に含むことができる。
【００１８】
一実施形態では、骨髄穿刺液を活性化するデバイスを含む。このデバイスは、骨移植片代用物と、患者から取り出した骨髄穿刺液とを混合して、混合物を形成するための構成要素を備える。該デバイスは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に一時的に曝露するための構成要素も備える。
【００１９】
別の実施形態では、患者から取り出した骨髄穿刺液を取り扱うための構成要素を備えた、骨髄穿刺液を活性化するデバイスを含む。このデバイスは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、骨髄穿刺液を活性剤に曝露するための構成要素も備える。
【００２０】
骨移植片代用物と、患者から取り出した骨髄穿刺液とを混合して、混合物を形成するための構成要素を備えた、骨髄穿刺液を活性化する別のデバイスも記載している。該デバイスは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に曝露するための構成要素を更に備える。曝露した後、ＢＭＡは、繋留または固定活性剤から分離し、骨移植片代用物と混合することができる。
【００２１】
一実施形態では、幹細胞源（例えば、自家骨髄穿刺液を含めた骨髄穿刺液）を活性剤に曝露するステップであって、幹細胞源中の間葉幹細胞が、骨芽細胞に分化するように刺激されるステップを含む方法。一実施形態では、骨髄穿刺液は、手術中に取り出される、および／または患者から取り出されるときの形態で使用される。あるいは、骨髄穿刺液は、患者から取り出された後で更に濃縮することができる。この方法は、刺激または活性化された幹細胞（例えば、間葉幹細胞）と骨移植片合成代用物とを混合して、混合物を形成するステップも含むことができ、前記曝露するステップは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に一時的に曝露することを含む。
【００２２】
一実施形態では、活性剤は、基材と結合して、結合基材を形成する。この実施形態では、幹細胞源は、結合活性剤と、５分間から２４時間または５分間から１時間または１５分間から１時間などのある期間、インキュベートされる。一実施形態では、前記インキュベートするステップは、骨において骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体サブユニットの上方調節を起こす。
【００２３】
一実施形態では、幹細胞源を活性剤に曝露する前記ステップは、幹細胞の溶液中で行われ、該方法は、親和性マトリックスの形成および／またはろ過などで、幹細胞の溶液から活性剤を除去するステップを更に含むことができる。
【００２４】
別の実施形態では、骨形成を刺激できる前駆細胞を形成する方法が提供される。方法の操作には、骨髄穿刺液（ＢＭＡ）を活性剤と混合し、間葉幹細胞（ＭＳＣ）が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するために、活性剤を使用するステップが含まれる。このような方法は、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化または発現するように誘発することができる。該方法は、骨移植片代用物と、患者から取り出した骨髄穿刺液とを混合して、混合物を形成するステップ、および間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化または発現するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に一時的に曝露するステップも含むことができる。
【００２５】
幾つかの実施形態では、該方法は、刺激した間葉幹細胞を患者に移植するステップを更に含み、そのステップは、幹細胞源と共に活性剤を移植することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の実施形態において、初代ヒトＭＳＣにより発現されたアルカリホスファターゼのレベルを図示している。細胞は、線維芽細胞増殖因子（以後「ＦＧＦ−２」）（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理した後、分化培地中で培養した。次いで、細胞により発現されたアルカリホスファターゼのレベルは、実施例１に記載のアッセイを用いて測定した。
【図２】図２は、初代ヒト間葉細胞（以後「ＭＳＣ」）を２４時間活性剤に曝露した後の該細胞における、３種の骨形成タンパク質（以後「ＢＭＰ」）受容体ユニット、即ちＢＭＰＲ−１Ａ（「１Ａ」）、ＢＭＰＲ−１Ｂ（「１Ｂ」）およびＢＭＰＲ−ＩＩ（「ＩＩ」）の相対的なｍＲＮＡコピー数を図示している。使用した活性剤は、血小板由来増殖因子（以後「ＰＤＧＦ ＢＢ」）、線維芽細胞増殖因子（以後「ＦＧＦｂ」）およびトランスホーミング増殖因子（以後「ＴＧＦβ３」）であり、濃度１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌで、２４時間曝露した。細胞を採集し、ＢＭＰ受容体ユニット全３種、即ち１Ａ、１ＢおよびＩＩに対して、実施例１に記載のように定量的なポリメラーゼ連鎖反応（以後「ＰＣＲ」）を行った。
【図３】図３は、初代ＭＳＣを、濃度１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌを用いてＰＤＧＦ ＢＢ、ＦＧＦｂおよびＴＧＦβ３に１時間曝露した後における、ＢＭＰ受容体ユニット３種（即ち１Ａ、１ＢおよびＩＩ）の相対的なｍＲＮＡコピー数を図示している。細胞を採集し、ＢＭＰ受容体ユニット全３種（即ち１Ａ、１ＢおよびＩＩ）に対して、実施例１に記載のように定量的ＰＣＲを行った。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
当技術の現状では、骨髄穿刺液（以後「ＢＭＡ」）を手術中に患者から取り出し、骨移植片代用物と混合し、骨治癒を促進するために、手術部位に再移植する。しかし、骨髄穿刺液は、骨芽細胞を産生し得る結合組織前駆細胞をある程度含有し得るが、骨形成を実際に促進できる骨形成原細胞の個数および種類には、患者によって大きな変動がある。
【００２８】
本明細書には、ＢＭＡまたは幹細胞混合物における該前駆細胞の、細胞数の増加または骨形成能の増加のいずれかにより、幹細胞（例えばＢＭＡ）の性能を改善する方法、デバイスおよび移植物が記載されている。本明細書に記載の実施形態には、手短に言えば、手術中に、幹細胞を１種または複数の外因性活性剤にエクスビボで曝露することにより、骨成長を刺激できる前駆細胞を生成し、次いで、その活性剤（複数可）を幹細胞（即ち、活性剤で活性化された前駆細胞）から除去するための方法およびデバイスが含まれる。活性剤（複数可）は、例えば、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンドまたは他の因子でもよい。活性剤（複数可）は、自家源から捕捉でき、または商業源から取得でき、または製造することもできる（例えば、組換え手順により）。
【００２９】
幾つかの実施形態では、活性剤は、幹細胞混合物の前駆細胞において骨形成タンパク質、以後のＢＭＰの受容体サブユニット（複数可）の発現を増加させることができる。活性剤によるこの処理は、例えば、骨傷害または骨手術の部位における内因性ＢＭＰに応答する前駆細胞の能力の増強を補助する。活性剤によるこのような処理は、幹細胞の骨芽細胞経路に沿った分化を推進することもできる。幹細胞は、本明細書に記載のように、サイトカインによる長期間（例えば７日間）の処理によりこれまで活性化されているが、このような長期間の活性剤に対する幹細胞の曝露は、不要である。約１５分間から約３時間活性剤に曝露しただけの後で、幹細胞は、活性化され、骨形成能を示すことができる。
【００３０】
その上、幾つかの研究によれば、補助細胞集団の存在が、インビトロでの骨前駆細胞の増生に必要になり得そうであると示されている。したがって、高度に精製された骨前駆細胞は、骨形成サイトカインの混合物がたとえ存在していても、増殖できないこともあり得る。したがって、幹細胞の長期の培養は、有利でないこともあり得る。本明細書に記載の方法およびデバイスは、長期間の細胞培養を必要とせず、より迅速であり、そのため長期の細胞培養に伴う汚染の恐れおよび経費を回避している。
【００３１】
本明細書に記載のように、骨形成能を有する幹細胞の増強、活性化および／または分化は、デバイス上またはデバイス内に活性剤（複数可）を繋留することにより実現することができ、その結果、幹細胞混合物内に含まれる細胞を活性化し、例えば、デバイスから細胞を除去することにより、活性剤（複数可）から容易に分離することができる。細胞の移植前に細胞から活性剤を分離することにより、活性剤自体の意図せざる副作用（例えば、望ましくない応答の刺激または有害な免疫応答の誘発）の可能性が低下する。
【００３２】
幹細胞源
本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物は、都合よい任意源からの幹細胞を使用することができる。しかし、骨形成能を有するか、または骨形成能を有する細胞を生成するように処理（例えば、分化）できる幹細胞が、好ましい。
【００３３】
本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物に使用できる幹細胞源には、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、エクスビボ培養自家間葉幹細胞、市販の同種異系間葉幹細胞、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年の皮膚、ならびに血液が挙げられる。幾つかの実施形態では、幹細胞は、間葉幹細胞、または間葉幹細胞を含む細胞混合物（例えば、骨髄穿刺液）である。幹細胞は、自家、同種異系、または異種源からでもよい。幹細胞は、胚性、または生後源もしくは成体源からでもよい。
【００３４】
骨髄穿刺液は、本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物に有用な１つの幹細胞源である。このような骨髄穿刺液は、自家、同種異系、または異種源からでもよいが、幾つかの実施形態では、骨髄穿刺液は自家である。
【００３５】
骨髄穿刺液は、造血幹細胞、赤血球および白血球ならびにそれらの前駆体、間葉幹細胞および前駆細胞、間質細胞およびその前駆体、ならびに線維芽細胞、網状赤血球、脂肪細胞および内皮細胞を含み、「間質」と呼ばれる結合組織ネットワークを形成する一群の細胞の複雑な混合物を含有する。間質からの細胞は、細胞表面タンパク質を介した直接相互作用および増殖因子の分泌による造血細胞の分化を形態的に調節し、骨構造の基礎形成および支持に関与する。研究によれば、骨髄は、軟骨、骨および他の結合組織細胞に分化する能力を有する「前間質」細胞を含有することが示されている。Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ 「Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ」、Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ．、２４０巻：２７０頁、１９８９年。最近の研究によれば、多能性間質幹細胞または間葉幹細胞と呼ばれるこうした細胞は、活性化時に異なる数種類の細胞系（即ち、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など）に生成される能力を有することが示されている。しかし、間葉幹細胞は、雑多な他の細胞（即ち、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞など）と共に、骨髄穿刺液中に非常に微量に存在することが多い。それに加え、様々な結合組織へのその分化能は、穿刺液中にあって変動し得る生物活性因子の存在に依存するだけでなく、ある程度は供与者の年齢にも依存する。本明細書に記載の方法およびデバイスは、幹細胞試料中の細胞数、および幹細胞の骨芽細胞への分化能を改善することにより、こうした問題に対処する。
【００３６】
幾つかの実施形態では、幹細胞は間葉幹細胞を含む。間葉幹細胞は、当業者に利用可能な手順によって同定することができる。例えば、間葉幹細胞は、コロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵ−ｆ）、または間葉幹細胞が通常発現するマーカーを用いたフローサイトメトリーにより同定することができる。間葉幹細胞は、一般に、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ７３＋などのマーカーを発現するが、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−の表現型を示す。
【００３７】
骨髄細胞を使用する場合、こうした細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨または他の髄腔から得てもよい。幾つかの実施形態では、該幹細胞は自家体液（例えば、骨髄穿刺液）に由来する。骨髄穿刺液は、良好な間葉幹細胞源である。
【００３８】
該幹細胞は、幾つかの実施形態では、「無関係な」細胞を排除し、活性化ステップの効率を改善するために、または間葉幹細胞を予備選択して、移植物材料における骨形成を促進するために、遠心、サイズろ過、免疫磁気選別などの分離工程を受けることができる。細胞型の分離および／または間葉幹細胞の精製を行うことは必要とは言えないが、幾つかの実施形態では望ましいこともある。
【００３９】
細胞型の分離が所望の場合、例えば骨髄を含む生物試料は、遠心して、間葉幹細胞などの結合組織成長促進成分の多い画分を含め、密度に基づく各種の画分に試料の成分を分離することができる。次いで、結合組織成長促進成分の多い画分を単離することができる。それに加え、遠心する生物試料が、細胞培養培地物質を含有しないようにすることができる。幾つかの実施形態では、遠心する生物試料は、得られた単離、活性化された幹細胞を後に移植する患者からの組織材料（例えば、場合により血液または他の組織材料と組み合わさった骨髄材料）から、本質的になることができる。
【００４０】
活性剤
活性剤は、本明細書に記載の方法およびデバイスにおいて、幹細胞からの骨形成原細胞への形成および／または分化を促進するために使用される。このような活性剤は、例えば、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンド、ホルモン、ならびに増殖および分化を調節する他の分子でもよい。活性剤（複数可）は、自家源から捕捉でき、または商業源から取得でき、または製造することもできる（例えば、組換え手順により）。
【００４１】
使用できる活性剤の例には、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ、ＩＧＦ、インターロイキン、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−１１、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、フィブロネクチン、「ＲＧＤ」またはインテグリンのペプチドおよび／またはタンパク質、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、ＭＳＸ１、ＮＦＫＢ１、ＲＵＮＸ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＴＮＦ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＤＲ、ＡＨＳＧ、ＡＭＢＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＧＬＡＰ、ＥＮＡＭ、ＭＩＮＰＰ１、ＳＴＡＴＨ、ＴＵＦＴ１、ＢＭＰ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＳＯＸ９、ＡＬＰＬ、ＡＭＢＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＧＬＡＰ、ＣＡＬＣＲ、ＣＤＨ１１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＩＮＰＰ１、ＰＨＥＸ、ＲＵＮＸ２、ＳＴＡＴＨ、ＴＦＩＰ１１、ＴＵＦＴ１、ＢＧＬＡＰ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＭＰ、ＦＧＦＲ１、ＧＤＦ１０、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＭＳＸ１、ＡＮＸＡ５、ＣＡＬＣＲ、ＣＤＨ１１、ＣＯＭＰ、ＤＭＰ１、ＥＧＦ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ８、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＦＬＴ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦＡ、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＢＭＰ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ１、ＧＤＦ１０、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＡＨＳＧ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＴＳＫ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＰＨＥＸ、ＡＭＢＮ、ＡＭＥＬＹ、ＥＮＡＭ、ＳＴＡＴＨ、ＴＵＦＴ１、ＢＧＮ、ＣＯＭＰ、ＤＳＰＰ、ＧＤＦ１０、ＣＤＨ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＭ１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ３６、ＣＯＭＰ、ＳＣＡＲＢ１、ＡＭＨ、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＧＤＦ３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ６、ＩＮＨＡ（インヒビンａ）、ＩＮＨＢＡ（インヒビンＢＡ）、ＬＥＦＴＹ１、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ２、ＬＴＢＰ４、ＮＯＤＡＬ、ＡＣＶＲ１（ＡＬＫ２）、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲＬ１（ＡＬＫ１）、ＡＭＨＲ２、ＢＭＰＲ１Ａ（ＡＬＫ３）、ＢＭＰＲ１Ｂ（ＡＬＫ６）、ＢＭＰＲ２、ＩＴＧＢ５（インテグリンＢ５）、ＩＴＧＢ７（インテグリンＢ７）、ＬＴＢＰ１、ＮＲ０Ｂ１、ＳＴＡＴ１、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＧＦＢＲ１，（ＡＬＫ５）ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＷＡＦ１／ｐ２１ＣＩＰ１）、ＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＬＮＫ２Ｂ）、ＦＯＳ、ＧＳＣ（グーセコイド）、ＩＧＦＢＰ３、ＩＴＧＢ５（インテグリンＢ５）、ＩＴＧＢ７（インテグリンＢ７）、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＭＹＣ、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ−１）、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＳＣ２２Ｄ１（ＴＧＦＢ１Ｉ４）、ＴＧＩＦ１、ＤＬＸ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＪＵＮＢ、ＳＯＸ４、ＳＴＡＴ１、ＢＡＭＢＩ、ＢＭＰＥＲ、ＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＬＮＫ２Ｂ）、ＣＥＲ１（セルベルス）、ＣＨＲＤ（コルジン）、ＣＳＴ３、ＥＮＧ（Ｅｖｉ−１）、ＥＶＩ１、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＨＩＰＫ２、ＮＢＬ１（ＤＡＮ）、ＮＯＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＲＵＮＸ１（ＡＭＬ１）、ＳＭＵＲＦ１ならびに増殖および分化を調節する他の分子、ならびにこれらの因子の組合せが挙げられる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、活性剤には、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、酸性もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦａもしくはＦＧＦｂ）および／または線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）を含む）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリー（ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６および／またはＢＭＰ−７など）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）ファミリーの構成員（例えば、インスリン様増殖因子−Ｉおよび／またはＩＩ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、「ＲＧＤ」またはインテグリン配列、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質（Ｏｐ；Ｏｐ−１、Ｏｐ−２、Ｏｐ−３など）ならびに増殖および分化を調節する他の分子、ならびにこれらの因子の組合せが挙げられる。
【００４３】
完全タンパク質と同じ活性化応答を引き出すペプチド活性剤も、使用することができる。例えば、ＴＧＦ−β、ＦＧＦｂおよび／またはＰＤＧＦに類似の作用を有するタンパク質のアミノ酸断片またはペプチドを、使用することができる。本明細書に記載の活性剤のいずれかからの、または幹細胞の活性化に有用なことが知られているペプチド活性剤は、使用することができる。他の実施形態では、小分子活性剤が、幹細胞の活性化に使用することができる。
【００４４】
多くの実施形態では、ＴＧＦ−βファミリーの構成員が、本明細書に記載の方法およびデバイスにおける活性剤として含まれる。ＴＧＦ−βファミリーは、構造的に関連する一群のタンパク質を包含し、胚発生中に広範囲な分化過程に影響する。ＴＧＦβファミリーに含めることは、システイン残基７個の保存を含む、アミノ酸一次配列の相同性に基づく。このファミリーには、例えば、正常な雄性発生に必要（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５巻：１６７頁、１９９０年）なミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）、背部−腹部軸の形成および成虫原基の形態形成に必要（Ｐａｄｇｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５巻：８１〜８４頁、１９８７年）なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＤＰＰ）遺伝子産物、卵の植物極に局在している（Ｗｅｅｋｓら、Ｃｅｌｌ、５１巻：８６１〜８６７頁、１９８７年）Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１遺伝子産物、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において中胚葉および前部構造の形成を誘導できる（Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、６３巻：４８５頁、１９９０年）アクチビン（Ｍａｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１３５巻：９５７〜９６４頁、１９８６年）、ならびに軟骨および骨の新規な形成を誘導できる（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１３１９８頁、１９９０年）骨形成タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−２〜ＢＭＰ−１５など）が含まれる。ＴＧＦ−β遺伝子産物は、脂質形成、筋形成、軟骨形成、造血、および上皮細胞分化を含む、多様な分化過程に影響することができる（総説については、全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ４９巻：４３７頁、１９８７年を参照されたい）。
【００４５】
ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、大きな前駆体タンパク質として当初合成され、その後、Ｃ末端からおよそ１１０〜１４０個目のアミノ酸である、塩基性残基のクラスターでタンパク分解的切断を受ける。タンパク質のＣ末端領域は、全て構造的に関連しており、異なるファミリー構成員は、相同性の程度に基づいて別々のサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は、アミノ酸配列の同一性が７０％〜９０％の範囲にあるが、サブグループ間の相同性は、それより有意に低く、一般に僅か２０％〜５０％の範囲にある。各場合において、活性種は、Ｃ末端断片のジスルフィド連結二量体であるようである。研究されてきたファミリー構成員の大部分については、ホモ二量体種が生物活性であることが判明しているが、他のファミリー構成員については、インヒビン（Ｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：７７９頁、１９８６年）およびＴＧＦ−β（Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、Ｃｅｌｌ、４８巻：４０９頁、１９８７年）のように、ヘテロ二量体も検出されており、これらのものは、それぞれのホモ二量体とは異なる生物学的性質を有するようである。
【００４６】
ＴＧＦ−β遺伝子のスーパーファミリー構成員には、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β４（ニワトリ）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β５（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＰＰ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ１、ＯＰ−１／ＢＭＰ−７、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ６０Ａ、ＧＤＦ−１、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇｆ、ＢＭＰ−３、インヒビン−βＡ、インヒビン−βＢ、インヒビン−αおよびＭＩＳが挙げられる。これらの遺伝子は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｓｓａｇｕｅ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７巻：７５３〜７９１頁、１９９８年に考察されている。
【００４７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスおよび方法で使用されるＴＧＦ−βのファミリー構成員は、ＴＧＦ−β３である。
【００４８】
線維芽細胞増殖因子およびその受容体線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＳ）は、形態形成、血管形成および組織再建を含む多様な生物過程、ならびに多数の疾患の発症に関わる、進化的に保存されたポリペプチドのファミリーを含む（全体が参照により本明細書に明確に組み込まれるＯｒｎｉｔｚ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２巻：１０８頁、２０００年に総説されている）。このファミリーの様々な構成員は、間葉から上皮および神経外胚葉の起源に及ぶ、広範囲の細胞の増殖をインビトロおよびインビボで刺激する。ＦＧＦは、発生中に時間的および空間的に厳密なパターンで発現され、パターン化および四肢形成に重要な役割を有する（Ｏｒｎｉｔｚ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２巻：１０８頁、２０００年）。
【００４９】
ＦＧＦファミリーの全構成員は、アミノ酸約１２０個の相同性コアドメインを共有し、そこではアミノ酸２８残基が高度に保存され、６個は同一である。数種のＦＧＦに関する構造研究によって、各ストランドが、ファミリーを通して保存されているコア領域を含むβループに隣接した、逆平行βストランドが１２本同定された。コアドメインは、一次ＦＧＦＲおよびヘパリン結合部位を含む。受容体結合領域は、ヘパリン結合領域とは異なる（Ｏｒｎｉｔｚ ａｎｄ Ｉｔｏｈ、Ｇｅｎ． Ｂｉｏｌ． ２巻、３００５．１頁、２００１年）。
【００５０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスおよび方法で使用されるＦＧＦのファミリー構成員は、ＦＧＦ−２である。
【００５１】
ヒト血小板からの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、２種のポリペプチド配列、即ちＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦ−Ａのポリペプチドを含有する（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ， Ｈ． Ｎ． ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０巻：９６３〜９６５頁、１９８３年）。ＰＤＧＦ−Ｂは、７番染色体上に位置する遺伝子によりコードされ（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ， Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０巻：６９５〜６９９頁）、ＰＤＧＦ−Ａは、２２番染色体上に位置する（Ｄａｌｌａ−Ｆａｖｅｒａ， Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８巻：６８６〜６８８頁、１９８２年）ｓｉｓ癌遺伝子によりコードされる（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１巻：２７５〜２７７頁、１９８３年）。このｓｉｓ遺伝子は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチドと密接な関係がある、サル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）の形質転換タンパク質をコードする。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓも、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする（Ｒａｏ， Ｃ． Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３巻：２３９２〜２３９６頁、１９８６年）。ＰＤＧＦの２本のポリペプチド鎖は、別々の染色体に位置する異なる２種の遺伝子によりコードされるので、ヒトＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦ−Ａのジスルフィド連結ヘテロ二量体、またはホモ二量体２種の混合物（ＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体およびＰＤＧＦ−ＡＡホモ二量体）、またはヘテロ二量体およびホモ二量体２種の混合物からなり得る。
【００５２】
ＰＤＧＦは、商業的に、あるいは人間の組織もしくは細胞、例えば血小板から、固相ペプチド合成により、または組換えＤＮＡ技術により得てもよい。ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする遺伝子を含有する、サル肉腫ウィルスに感染した培養時の哺乳動物細胞は、ＰＤＧＦ−Ａポリペプチドを合成し、それをジスルフィド連結ホモ二量体にプロセシングすることができる（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３０５巻：６０５〜６０８頁、１９８３年）。それに加え、ＰＤＧＦ−Ａホモ二量体は、ヒトＰＤＧＦに対して生成した抗血清と反応し、分泌されたＰＤＧＦ−Ａホモ二量体の機能的性質は、血小板由来ＰＤＧＦのものと類似している。組換えＰＤＧＦ−Ｂホモ二量体は、発現ベクターを用いてマウス細胞にｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子のｃＤＮＡクローンを導入することにより、得ることができる。このような発現に用いるｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ｂクローンは、正常なヒトの培養上皮細胞から得られた（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２１６巻：７４８〜７５０頁、１９８５年）。
【００５３】
多くの活性剤が、骨形成幹細胞の活性化に有用であるが、本発明者らが作成したデータによれば、幾つかの実施形態では、ＴＧＦ−β３、ＦＧＦ−２および各種のＰＤＧＦが有用であることを示している。他の実施形態では、幹細胞を活性化するためのデバイスおよび方法は、活性剤として少なくともＴＧＦ−β３およびＦＧＦ−２を含む。
【００５４】
幾つかの実施形態では、活性剤は、幹細胞混合物の前駆細胞において骨形成タンパク質受容体サブユニット（複数可）の発現を増加させることができる。このような活性剤による処置は、例えば、骨傷害または骨手術の部位において内因性骨形成タンパク質に応答する、前駆細胞の能力の増強を補助する。活性剤によるこのような処置は、幹細胞の骨芽細胞経路に沿った分化も推進することができる。
【００５５】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨および軟骨の形成を誘導するだけでなく、多くの細胞型に広範囲の効果を及ぼす多機能サイトカインである（Ｈｏｇａｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０巻：１５８０〜１５９４頁（１９９６年）；Ｒｅｄｄｉら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． ８巻：１１〜２０頁（１９９７年））。ＢＭＰは、ＴＧＦβスーパーファミリーの構成員である。人間にはＢＭＰ遺伝子がおよそ１５〜２０個、ＢＭＰ受容体が３個、およびＢＭＰ拮抗剤として機能するＢＭＰ関連タンパク質が幾つもある（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｂｏｎｅ １９巻：５６９〜５７４頁（１９９６年））。ＢＭＰは、３個のＢＭＰ受容体であるＢＭＰＲ−１Ａ、ＩＢおよびＩＩを介するＳｍａｄシグナル伝達経路を通して機能する。ＢＭＰ二量体がＩＩ型受容体に結合すると、それは、Ｉ型受容体を複合化し、リン酸化して、後者はＳｍａｄ経路を活性化する。
【００５６】
初代骨芽細胞を外因性増殖因子に曝露することにより、こうした受容体の発現を調節することができる。Ｓｉｎｇｈａｔａｎａｄｇｉｔら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０９巻（３号）：９１２〜２２頁（２００６年））は、初代骨芽細胞のＴＧＦ−β１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＭＰ−２による処理、ならびにこうした増殖因子の細胞内受容体から細胞表面までに対する幾つかの効果を試験した。Ｙｅｈら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９０巻（３号）：３２２〜３１頁（２００２年）；Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９１巻（３号）：２９８〜３０９頁（２００２年））は、ＯＰ−１に曝露した後の胎児ラット頭蓋冠細胞において、受容体サブユニットｍＲＮＡの差次的調節パターンを観察した。Ｘｕら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２４巻（４号）：２６８〜７８頁（２００６年））は、ＴＧＦβ３のＢＭＰＲ−ＩＢに対する効果を試験した。各受容体に結合したＢＭＰのシグナル伝達に関わる因子は、一般に理解されているが、受容体サブユニットの調節および発現パターンは、十分に解明されていない。その上、研究者たちには、幹細胞（例えば、骨髄）を増殖因子で短期間処理した後、増殖因子を除去することにより、骨形成原細胞および／または骨形成前駆体の形成を刺激できるとは、認識されていない。
【００５７】
幹細胞の活性化
本明細書に例示するように、幹細胞は、活性剤に一時的に曝露することにより、骨形成的に活性化することができる。このような活性化幹細胞は、骨原細胞、骨芽細胞および／または骨芽細胞表現型細胞に分化する。その上、活性化幹細胞から活性剤を除去することにより、被験体への移植時に意図せざる副作用を有する恐れのある増殖因子およびサイトカインを含まない、細胞混合物が産生される。したがって、生物活性分子の混合物中で幹細胞を数日間培養する必要はないが、そのように培養すれば、処置を待つ患者の疼痛および不動状態が継続し、骨傷害を最初に修復した後に移植物挿入のために手術が追加され、培養細胞を汚染し、幹細胞集団または骨穿刺液中に望ましくない細胞型が増殖し、その上、培養の維持および傷害患者の介護に時間および経費が追加される事態になり得る。
【００５８】
その代わりに、幹細胞は、活性剤（複数可）との短期間のインキュベーションによって、移植および骨成長の刺激のために活性化することができる。したがって、例えば、患者が骨の傷害または状態の処置を認められたとき、患者が手術を受けている間に、自家または同種異系幹細胞（例えば、骨髄穿刺液）を活性化することができ、活性化幹細胞は、直ちに移植することができる（所望であれば、骨移植片代用物と共に）。
【００５９】
本明細書で使用する場合の語句「幹細胞の活性化」とは、幹細胞が、増殖に続いて骨形成原細胞に分化できる骨形成前駆細胞に分化するように、誘導されることを意味する。このような骨形成原細胞には、骨芽細胞および骨芽細胞前駆体が含まれる。骨形成原細胞は、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチンおよびＢＭＰ受容体などの骨特異マーカーの発現によって、認識することができる。
【００６０】
本明細書で示すように、幹細胞の活性化は、ほんの短期間、例えば、５分間から２４時間の範囲の期間でよい。幹細胞を活性剤に曝露する他の最適な時間枠は、１０分間から２時間または１５分間から１時間の範囲である。幾つかの実施形態では、幹細胞は、１種もしくは複数の活性剤と５分間から１時間接触される、または幹細胞は、１種もしくは複数の活性剤と５分間から０．５時間接触される。本明細書で例示するように、骨髄穿刺液を活性剤にほんの１時間曝露すると、アルカリホスファターゼおよびＢＭＰ受容体サブユニット（複数可）の発現が上方調節される。
【００６１】
したがって、本発明の一態様は、哺乳動物において骨成長を促進するための移植物を作製する方法である。この方法は、幹細胞を１種または複数の活性剤に２４時間以下（例えば、約５分間から２４時間、または約１０分間から２時間、または約１５分間から１時間）曝露して、活性化幹細胞を形成し、活性化幹細胞を１種または複数の活性剤から分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成し、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を骨移植片代用物と混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進するための移植物を作製することを伴う。
【００６２】
幹細胞は、幹細胞を骨形成または骨形成前駆体の表現型に活性化するために、十分な濃度の１種または複数の活性剤に曝露される。当業者であれば、このような濃度がどれだけであるかを、例えば、どれだけの濃度が、アルカリホスファターゼおよびＢＭＰ受容体サブユニット（複数可）の発現の増加または上方調節を起こすかを観測することにより、容易に決定することができる。活性剤の適当な濃度例には、濃度約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの活性剤（複数可）の使用が挙げられる。幾つかの実施形態では、活性剤は、濃度約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌで使用される。
【００６３】
本明細書に記載されるように、幹細胞は、都合よい任意源に由来することができる。しかし、骨形成能を有するか、または骨形成能を有する細胞を生成するように処理（例えば、分化）できる幹細胞が、好ましい。本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物に使用できる幹細胞源には、骨髄、脂肪組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年の皮膚、ならびに血液が挙げられる。幾つかの実施形態では、幹細胞は、間葉幹細胞、または間葉幹細胞を含む細胞混合物である。幹細胞は、自家、同種異系、または異種源由来でもよい。幹細胞は、胚性、生後または成体源由来でもよい。幾つかの実施形態では、幹細胞は、自家または同種異系の骨髄穿刺液である。
【００６４】
一般に、幹細胞を非幹細胞から分離すること、または活性化（骨形成）幹細胞を他の細胞型から精製することは、不要である。しかし、当業者が、幹細胞を非幹細胞から、または活性化骨形成幹細胞を非活性化幹細胞および他の細胞型から精製することを欲する場合、当業者は、都合よい任意の手順によりそうすることができる。例えば、骨髄を遠心して、密度に基づく各種の画分に穿刺液の成分を分離し、間葉幹細胞の多い画分を得ることができる。該細胞は、活性化骨形成幹細胞の細胞表面上に発現した因子（例えば、ＢＭＰ受容体）を認識し、それに結合する抗体を用いて、免疫精製を施すこともできる。
【００６５】
本明細書に示すように、幹細胞を活性化するために本明細書に記載の方法およびデバイスに使用する活性剤は、幹細胞の骨形成能を活性化できる任意の活性剤でもよい。その例は、本明細書に記載し、例示してある。
【００６６】
幹細胞は、活性化されるとき、骨形成前駆細胞に特有の因子を発現し始める。例えば本明細書に例示するように、初代ヒト間葉幹細胞が発現するアルカリホスファターゼ、骨芽細胞分化の初期マーカーの各レベルが増加する。例えば、非処理対照細胞と比較して、ＴＧＦβ３（三角）またはＦＧＦ−２（四角）で１時間だけ処理した間葉幹細胞において、アルカリホスファターゼの発現量の増加が経時的に認められ、処理細胞の方が強力な分化応答を示したことを示す図１を参照されたい。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法およびデバイスを用いた幹細胞の活性化は、ＢＭＰ受容体サブユニットのレベルも増加させることができる。本明細書に例示するように、初代間葉幹細胞における３種のＢＭＰ受容体ユニット（即ち、ＢＭＰＲ−１Ａ、ＢＭＰＲ−１ＢおよびＢＭＰＲ−ＩＩ）のｍＲＮＡコピー数は、活性剤（ＰＤＧＦ ＢＢ、ＦＧＦｂおよびＴＧＦβ３を１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）にほんの１時間（図３）または２４時間（図２）曝露した後、増加した。したがって、手術部位への移植前における、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）の活性剤によるほんの短期間の処理は、移植後の内因性ＢＭＰに対する応答をよりロバストにするために、該細胞を増強し得る。
【００６８】
活性化幹細胞は、曝露した１種または複数の活性剤から都合よい任意の方法で分離し、それにより活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成する。幹細胞集団は、幹細胞を含有する組成物（例えば、移植組成物）が、幹細胞組成物（または移植組成物）の投与を排除すると思われる、活性剤（複数可）の副作用を示さない場合、活性剤を実質的に含まない。したがって、活性剤の量が、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ未満、または１ｎｇ／ｍｌ未満、または０．１ｎｇ／ｍｌ未満、または０．０１ｎｇ／ｍｌ未満である限り、少量の活性剤は、活性化幹細胞集団（または移植組成物）中に残ってもよい。
【００６９】
細胞を小型および大型分子から分離する手順は、当業者に利用可能である。例えば、幹細胞は、細胞を媒体または塩水中に浮遊させ、遠心により細胞を収集することにより、洗浄することができる。このような洗浄を数回すれば、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団が産生される。別の例では、該細胞は、活性剤を保持するが細胞を通過させるカラムの中に、細胞を通過させることにより、活性剤から分離することができる。このようなカラムは、活性剤（複数可）を結合または保持するマトリックスを有することができ、例えば、そのカラムは、ゲルろ過カラム、アフィニティ精製カラムまたはイオン交換カラムでもよい。
【００７０】
したがって、活性剤（複数可）は、溶液として幹細胞源（即ち、骨髄穿刺液）に導入することができる。所与のインキュベーション時間後、活性化幹細胞は、ろ過、ゲルろ過、免疫沈降、免疫吸収、カラムクロマトグラフィーまたはそれらの組合せを含む手順により、活性剤から分離される。例えば、活性剤は、活性剤を固定化し、幹細胞からの活性剤の除去または分離を可能とするために、抗体または結合性のタンパク質もしくはペプチドを用いて除去することができる。幾つかの実施形態では、溶液中の活性剤は、溶液からの活性剤の術中除去を可能とするような分子量の適当なカットオフを有する、接線流ろ過などの術中ろ過工程を介して細胞から除去してもよい。
【００７１】
別の実施形態では、単離した幹細胞は、本明細書に記載のように、骨移植片代用物中に取り込んだ後、活性剤（複数可）に曝露される。活性剤は、都合よい任意の手順、例えば、幹細胞／骨移植片代用物の複合体を数回沈降させて、活性剤（複数可）を含有する上清液を除去することにより、幹細胞／骨移植片代用物の複合体から除去することができる。
【００７２】
幾つかの実施形態では、活性化幹細胞は、曝露した１種または複数の活性剤から、本明細書に記載のデバイスを用いることにより分離される。
【００７３】
幹細胞を活性化するデバイス
本発明の別の態様は、例えば、骨成長を刺激できる細胞（例えば、骨形成前駆細胞、骨芽細胞など）に分化するように、幹細胞を活性化するデバイスである。本明細書に記載の方法におけるデバイスの使用によって、幹細胞、幹細胞混合物および幹細胞組成物（例えば、移植組成物）と少なくとも１種の活性剤との、幹細胞の活性化に十分な時間のインキュベーションが可能になり、活性化幹細胞を少なくとも１種の活性剤から分離し、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞および／または活性化幹細胞組成物の産生が可能になる。
【００７４】
したがって例えば、本発明の一態様は、固体支持体、および固体支持体に結合した１種または複数の活性剤を含むデバイスである。活性剤（複数可）は、固体支持体に直接結合することができ（例えば、吸着もしくは共有結合により）、または活性剤（複数可）は、固体支持体に間接的に結合することができる（例えば、リンカー、抗体、ペプチド、アプタマー、アルキレン鎖、ビオチン−ストレプトアビジンなどを介して）。
【００７５】
固体支持体は、活性剤を直接または間接に結合することができ、幹細胞と結合または有害な相互作用をしない任意の材料でもよい。したがって、固体支持体は、カラムマトリックス材料料、フィルター、培養用のプレート、チューブまたは皿、マイクロタイタープレート（またはマイクロタイタープレートのウェル）、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、ディスク、および幹細胞に適合する他の材料でもよい。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、磁気粒子、ニトロセルロース、ガラス、グラスファイバー、ラテックスおよび他の基材などの多様な材料から作製することができる。所望であれば、固体支持体は、幹細胞の結合を阻害する、または固体支持体における材料の反応性を低下させる物質をコーティングすることができる。
【００７６】
活性剤（複数可）は、当業者に公知の各種技法を用いて固体支持体に結合し得るが、そうした技法は、特許および科学文献に十分に記載されている。本発明に関しては、用語「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」とは、吸着などの非共有結合的つながりも、共有結合（活性剤と支持体上の官能基との直接連結によってもよく、または間接的連結によってもよい）も指す。
【００７７】
幾つかの固体支持体材料（例えば、プラスチック）上への吸着は、適切な緩衝液中の活性剤を固体支持体と適切な長さの時間接触させることにより、実現し得る。接触時間は、温度と共に変化するが、通常約１時間から約１日の間である。一般に、例えば、プラスチックマイクロタイタープレート（ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなど）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲にある量の活性剤と接触させれば、十分量の活性剤を固定化するのに足りる。
【００７８】
活性剤の固体支持体への共有結合は、支持体にも、活性剤上にあるヒドロキシ基またはアミノ基などの官能基にも反応すると見込まれる二官能性試薬と、支持体を最初に反応させることにより、一般に実現し得る。例えば、活性剤は、適当なポリマー被膜を有する支持体に、ベンゾキノンを用いて、または支持体上のアルデヒド基と、該結合相手上のアミンおよび活性水素との縮合によって、共有結合し得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１年のＡ１２〜Ａ１３を参照されたい）。二官能性試薬は、架橋剤、官能基２個のリンカー、ペプチド、アルキレン鎖、アプタマー、または他の二官能性分子でもよい。
【００７９】
活性剤は、抗体などの結合剤を介して固体支持体に非共有結合してもよく、その場合抗体は、固体支持体に結合または吸着し、活性剤に非共有結合で結合する。あるいは、活性剤は、ビオチン−ストレプトアビジンを介して固体支持体に非共有結合してもよく、その場合ビオチンまたはストレプトアビジンのいずれかが固体支持体に結合する。ストレプトアビジンが固体支持体に結合する場合、ビオチンは活性剤に結合する。活性剤に連結されるビオチンは、ストレプトアビジンに結合することにより、活性剤を固体支持体上に固定化することになろう。
【００８０】
一例においては、活性剤が共有結合しているカラムマトリックスまたはフィルター材料が、含まれる。次いで、幹細胞（例えば、骨髄穿刺液）をしばらくの時間この基材に通すか、またはその中でインキュベートすることができるが、時間枠は、例えば５分間から２４時間の範囲、最適な時間枠は、１５分間から１時間の範囲である。
【００８１】
活性剤（複数可）に対するこの曝露は、ＢＭＰ受容体サブユニットおよびアルカリホスファターゼの発現を増加させることが示された。例えば、図２および３は、３種の活性剤（ＰＤＧＦ ＢＢ、ＦＧＦｂおよびＴＧＦ−β３）が、ＢＭＰＲ−ＩＢサブユニットを上方調節し、特定の濃度では、ＢＭＰＲ−ＩＡおよびＢＭＰＲ−ＩＩのサブユニットが、バックグランドより増加することを例示している。このような活性剤に対する曝露は、間葉幹細胞を活性化または誘発して、骨芽細胞の表現型を増強するのに役立つ。
【００８２】
その結果、活性剤には、ＦＧＦｂ、ＴＧＦ−β３および／またはＰＤＧＦ ＢＢがなり得る。他の実施形態では、固体支持体上の活性剤は、ＢＭＰポリペプチドを含むことができる。他の活性剤、例えば本明細書に列挙した活性剤のいずれかも、固体支持体上に結合することができる。活性剤は、自家源由来でも同種異系でもよく、または製造してもよい（例えば、組換え技術により）。
【００８３】
数種または多種の活性剤を同じ固体支持体上に結合することができる。例えば、ＢＭＰは、現在市販されているホモ二量体処方より、ヘテロ二量体（即ち、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−７の組合せ）の方が強力であることが一般に認められている。その結果、本明細書に記載のデバイスおよび方法の実施形態のために、活性剤を固体支持体に結合し、続いてＢＭＡから分離した後、再移植を行うことができる。したがって、本デバイスおよび本明細書に記載の方法に採用できる複数の活性剤を使用する可能性に関しては、融通性が加えられている。
【００８４】
幾つかの実施形態では、該デバイスは、移植組成物中の幹細胞を活性化するために、移植組成物を１種または複数の活性剤に選定時間（例えば、２４時間以下および／または本明細書に記載の他の時間）の間、曝露するように適合されている。このようなデバイスは、移植組成物の本明細書に記載の活性剤少なくとも１種とのインキュベーションを可能にし、次いで移植組成物からの活性剤（複数可）の分離を可能にするように適合されている。したがって、移植物材料（例えば、骨移植片代用物）および移植組成物内の幹細胞は、活性剤を除去する間、デバイス中に保持され得る。デバイスの使用によって、活性剤を実質的に含まない移植組成物が産生される。
【００８５】
したがって、該デバイスは、幹細胞および／または骨移植片代用物を活性剤（複数可）から分離する手段を備える。例えば、該デバイスは、幹細胞および／または骨移植片代用物などの大型材料を排除するが、溶液中の活性剤（複数可）は、フィルター材料の通過を可能とすることにより、幹細胞および／または骨移植片代用物を活性剤から分離する、フィルターを備えることができる。移植組成物と活性剤（複数可）とのインキュベーション後、移植組成物および活性剤（複数可）を保持するインキュベーション室から排水し、その室を適当な媒体（例えば、緩衝液、塩水、緩衝塩水、培地）で濯ぐことができる。したがって、該デバイスは、活性化幹細胞を含有し、活性剤（複数可）を実質的に含まない幹細胞組成物（例えば、移植組成物）を産生することができる。
【００８６】
本明細書に記載のデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を制御するために、タイマーを更に備えることができる。例えば、タイマーは、インキュベートするステップ（ｉ）の後に、幹細胞から少なくとも１種の活性剤を分離することを誘発することができる。したがって、例えば、タイマーは、少なくとも１種の活性剤を含有する溶液の排水または除去を開始することができる。それに加え、または代替として、タイマーは、幹細胞および／または骨移植片代用物材料料を洗浄するために、溶液の添加を開始することができる。幾つかの実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を２４時間以下に制御する。他の実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を５分間から１時間に制御する。
【００８７】
移植物
一実施形態では、本明細書に記載のように調製した活性化幹細胞（例えば、骨髄穿刺液）は、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）などの合成骨移植片代用物と更に組み合わせて、移植組成物を形成する。一例では、活性化幹細胞（例えば、活性化骨髄穿刺液）と合成骨移植片代用物との複合体が、組織移植片の代わりに使用される。幹細胞は、活性剤（複数可）への曝露によって幹細胞を活性化する前または後のいずれかに、合成骨移植片代用物と組み合わせることができる。しかし、幹細胞は、移植の前に、移植組成物中の幹細胞が活性化幹細胞となるように、活性剤（複数可）に曝露または接触される。
【００８８】
骨移植片代用物は、適切な条件下で生体骨中に配置したとき、または生体骨に並置したとき、骨形成性活性化幹細胞により新骨を形成する足場として役立つ固体材料とすることができる。採用することのできる骨移植片代用物の例は、各々の全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５，３８３，９３１号、第６，４６１，６３２号、第７，０４４，９７２号、第７，４９４，９５０号、および米国特許出願公開第２００６０００８５０４号に記載されている。
【００８９】
骨移植片代用物は、カルシウム塩含有成分を含むことができる。例えば、骨移植片代用物は、リン酸一カルシウム一水和物、α−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、脱灰骨、リン酸ナトリウム塩、および場合によりポリマーを含むことができる。該ポリマーは、吸収性ポリマーでもよい。幾つかの実施形態では、該ポリマーは、繊維長約１５ｍｍ以下、アスペクト比約５０：１から約１０００：１のホモポリマーもしくはコポリマー繊維、または両方を含む（および場合により連続強化繊維も含む）。
【００９０】
該ポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、キサンタンガム、ガーガムおよび／またはアルギネートでもよい。
【００９１】
採用することのできる骨移植片代用物の例には、制限することなく、β−ＴＣＰ（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓ製のｃｈｒｏｎＯＳ）、コラーゲン、バイオガラス（例えば、４５Ｓ５ ＢｉｏＧｌａｓｓ）、ＢｉｏＯｓｓ（リン酸カルシウム系骨移植片代用物）、Ｐｅｐｇｅｎ Ｐ−１５（天然型ヒドロキシアパタイトに結合した合成Ｐ−１５ペプチド）、およびＡｌｌｏＧｒａｆｔ（脱灰骨基質、同種異系移植片主体の骨移植片代用物）が挙げられる。
【００９２】
一般に、活性化幹細胞は、骨移植片代用物とインキュベートまたは混合して、移植組成物を形成する。幾つかの実施形態では、移植組成物はパテであり、他の実施形態では、移植組成物は、注射針の中を流れるのに十分に流動性である。例えば、移植組成物は、約０．３〜約０．０または約０．４１〜約０．５５の液体成分対固体成分の比を有することができる。
【００９３】
別の実施形態には、活性剤と幹細胞源（即ちＢＭＡ）とをエクスビボで短期間（即ち、５分間から６０分間）併用することによる、骨芽細胞経路に沿った幹細胞の刺激が含まれる。エクスビボでのインキュベーション後、幹細胞および活性剤の組合せは、一緒に移植する。
【００９４】
処置の方法
活性化幹細胞および骨移植片代用物を含有する移植組成物は、骨の傷害、障害および状態の修復および処置に有用である。このような骨の傷害、障害または状態は、骨量減少（骨減少症もしくは骨溶解症）、または骨損傷もしくは骨傷害を特徴とする。このような骨の傷害、障害および状態には、それだけに限らないが、骨折、骨欠陥、骨移植、骨移植片、骨癌、関節置換、関節修復、癒合、面修復、骨変性、歯科インプラントおよび修復、疾患（例えば関節炎）が原因の骨欠陥、再建術が原因の骨欠陥、ならびに骨および骨組織に伴う他の状態が挙げられる。骨欠陥の例には、それだけに限らないが、骨における間隙、変形または癒着不能骨折が挙げられる。骨変性の例には、それだけに限らないが、骨減少症または骨粗鬆症が挙げられる。一実施形態では、骨欠陥は小人症が原因である。該組成物は、関節の置換または修復にも有用であり、その場合の関節は、脊椎、膝、股、足根、指、肘、踵、仙腸関節、または他の可動性／非可動性関節である。
【００９５】
移植組成物は、該組成物を骨部位中に押し込むもしくは取り込むことにより、または移植組成物の注入により投与することができる。注入により投与する場合、シリンジは、約１２〜約１８のゲージの針を有し得るが、その際に用いる最大注入圧は、約４０ポンド以下である。一実施形態では、該組成物は連続強化繊維も含む。
【００９６】
以下の非限定的な実施例は、本発明のある種の態様を更に例示する。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
材料および方法
以下の材料および方法を用いて、本発明のある種の態様を展開した。
【００９８】
細胞の分化
継代３回のヒト間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を６×１０４細胞／３５ｍｍウェルの密度で基本培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中に播種し、３７℃で２日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで濯ぎ、新鮮基本培地中の増殖因子（ＦＧＦ−２またはＴＧＦβ３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）１００ｎｇ／ｍｌで１時間活性化し、ＰＢＳで濯ぎ、次いで新鮮基本培地または骨形成分化培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）のいずれか中、３７℃で７〜１４日間インキュベートした。
【００９９】
リアルタイムＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ＫｉｔおよびＱＩＡ ｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各種の活性剤で処理した細胞から調製した。総ＲＮＡは、対照として非処理細胞からも調製した。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ランダムヘキサマー（ｈｅｘａｍｅｒ）およびオリゴｄＴを用いて生成した。リアルタイム用のプライマーおよびプローブのセットは、以下の通りであった。
【０１００】
【化１】
試料は、β２ミクログロブリン内因性対照（ＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ）を用いた多重反応として、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ上で操作した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１０１】
アルカリホスファターゼアッセイ
継代３回のヒト間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を６×１０４細胞／３５ｍｍウェルの密度で基本培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中に播種し、３７℃で２日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで濯ぎ、新鮮基本培地中の増殖因子（ＦＧＦ−２またはＴＧＦβ３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）１００ｎｇ／ｍｌで１時間活性化し、ＰＢＳで濯ぎ、次いで新鮮基本培地または骨形成分化培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）のいずれか中、３７℃で７〜１４日間インキュベートした。アッセイ時に、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、溶解緩衝液１００μｌ／３５ｍｍウェル中で採集し、液体窒素中で２回凍結／融解した。アルカリホスファターゼ活性は、溶解物２０μｌと１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸２０μｌとの３分間のインキュベーション、および生成した発光の４０５ｎｍでの測定により決定した。アルカリホスファターゼ活性は、ＣｙＱｕａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＤＮＡ定量化で決定した際に、細胞含量に従って正規化した。
【０１０２】
固定化
初期試験のために、活性剤（例えば、増殖因子）を以下の通りマイクロタイターウェル上に固定化した。
【０１０３】
ビオチニル化抗増殖因子抗体（５００ｎｇ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートで、ＰＢＳ２００μｌ／ウェル中で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回濯ぎ、次いでＰＢＳ２００μｌ中で増加していく各量の増殖因子に３０分間結合した。ＰＢＳで３回濯いだ後、増殖因子の存在を、０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳ２００μｌ中で第２の非標識抗増殖因子抗体１μｇと３０分間インキュベーションすることにより、検出した。各ウェルは、ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳ２００μｌ中でホースラディシュペルオキシダーゼ複合第２抗体１μｇと３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回再び濯いだ。次いで、固定化した抗体−増殖因子−第２抗体は、強化化学発光基質２００μｌと１分間インキュベートした。固定化したホースラディシュペルオキシダーゼ複合第２抗体の量の定量化は、可視光波長における化学発光の測定により行った。
【０１０４】
活性アッセイ
幹細胞活性化ステップの前に、繋留活性剤の生物活性を決定するために、以下のアッセイを形成した。ＦＧＦ−２が関わる試験には、Ｓｗｉｓｓ Ａｌｂｉｎｏ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を４×１０５／３５ｍｍウェルの密度で１０％血清基本培地中に播種し、３７℃で１日間インキュベートし、ＰＢＳで３回濯ぎ、次いで３７℃で１日間、０．５％血清基本培地中で同調させた。ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および５０倍過剰量のビオチニル化抗ＦＧＦ２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、０．５％血清基本培地中で１５分間複合させた。同調細胞をＰＢＳで３回濯いだ後、ＦＧＦ２／ビオチニル化抗ＦＧＦ２抗体複合体で３７℃で３０分間処理した。アッセイの終点で、細胞をＰＢＳで３回濯ぎ、ＳＤＳ試料緩衝液中で採集し、９０℃で１０分間加熱した。生成した溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ホスホＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）抗体の１：１００００希釈液、次いでホースラディシュペルオキシダーゼ複合第２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）の１：１００００希釈液で順にプローブした。ホースラディシュペルオキシダーゼの活性は、強化化学発光基質に１分間曝露することにより決定し、ＣＣＤカメラで可視化し、ＩｍａｇｅＪ分析プログラムを用いた濃度測定で定量化した。
【０１０５】
ＴＧＦβ３の活性アッセイには、Ｍｖ１Ｌｕミンク肺細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、９６ウェルプレートで、４×１０３細胞／ウェルの密度で基本培地中に播種し、３７℃で１日間インキュベートした。ＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および５０倍過剰量のビオチニル化抗ＴＧＦβ３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、基本培地中で１５分間複合させた。ＰＢＳで３回濯いだ後、細胞をＴＧＦβ３／ビオチニル化抗ＴＧＦβ３抗体複合体で３７℃で３日間処理した。アッセイ時に、ＴＧＦβ３処理培地をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ＡＴＰ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で補充し、５分間インキュベートし、可視光波長における化学発光の測定により、細胞数を定量化した。
【０１０６】
（実施例２）
結果
初代ヒト間葉幹細胞は、骨芽細胞系統へ分化することができる。これは、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびβ−グリセロリン酸を含有するが、それだけに限らない骨形成混合液中で細胞を培養することにより、インビトロで実証される。こうした培養条件下では、細胞は、骨芽細胞分化マーカー、最も一般的には初期マーカーのアルカリホスファターゼの上方調節を示す。
【０１０７】
図１は、予想通り１０〜１２日目に、非処理間葉幹細胞（丸）のアルカリホスファターゼ活性の僅かな上方調節を示している。しかし、間葉幹細胞をＴＧＦβ３（三角）またはＦＧＦ−２（四角）で１時間、前処理した後、その作用剤を除去し、分化培地中で培養した場合、アルカリホスファターゼ活性のレベルは有意に２〜３倍に増加した。
【０１０８】
こうしたデータは、ＴＧＦβ３またはＦＧＦ−２のいずれかで０日目に間葉幹細胞をほんの１時間処理しただけで、骨芽細胞形成のマーカーが処理から１０日以後に上方調節されるように、骨芽細胞の分化に影響を及ぼせることを示している。
【０１０９】
間葉幹細胞は、インビトロおよびインビボの双方で骨形成タンパク質に応答し、骨芽細胞の表現型を誘導する。ＢＭＰは、３種のサブユニットＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢおよびＢＭＰＲ−ＩＩで構成される受容体複合体を介して作用する。ＭＳＣを選定した活性剤（ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ３およびＦＧＦ−２）で２４時間処理したとき、ＢＭＰＲ−ＩＢ遺伝子の相対的コピー数が、非処理細胞に対して有意に増加した。しかし、図３は、ほんの１時間の処理後に同様な応答が認められたことを示している。
【０１１０】
こうしたデータは、手術中の僅か１時間の時間枠が、ＢＭＰリガンドに対する受容体のレベルが非処理細胞に対して増加できるように、活性剤でＭＳＣを処理するのに十分であることを示す。間葉幹細胞上に増加レベルのＢＭＰ受容体が存在することにより、これらの細胞は、インビボでのＢＭＰ−２の骨形成応答のために増強され、その結果骨治癒がよりロバストになる。
【０１１１】
本明細書で参照または言及した全ての特許および刊行物は、本発明が関わる技術分野の業者の技術水準を示しており、参照した各特許または刊行物は、その全体が個別に参照により組み込まれたとした場合、またはその全体が本明細書に提示されたとした場合と同程度に、参照により本明細書に明確に組み込まれている。出願者らは、引用したこのようないずれの特許または刊行物からも、ありとあらゆる資料および情報を本明細書中に物理的に組み込む権利を留保している。
【０１１２】
本明細書に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表して、例示的であり、本発明の範囲を制限する意図はない。他の目的、態様および実施形態は、本明細書を考慮すれば当業者には思い付くことであると見込まれ、しかも特許請求の範囲に規定されるように、本発明の趣旨内に包含される。様々な置き換えおよび改変が、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに、本明細書に開示した本発明になし得ることは、当業者には容易に明らかとなろう。本明細書に適切に例示的に記載した本発明は、必須のものとして本明細書に具体的に開示されていない、１つもしくは複数の要素または１つもしくは複数の制限が全くない状態で、実施し得る。本明細書に適切に例示的に記載した方法およびプロセスは、ステップの異なる順に実施してもよく、本明細書または特許請求の範囲に示したステップの順に必ずしも制限されない。本明細書または付属する特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に否定されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば「１つの抗体」への言及は、このような抗体の複数（例えば、複数抗体の溶液または一連の抗体調製物）を包含することなどである。本特許は、本明細書に具体的に開示した特定の実施例もしくは実施形態または方法に限定される、と解釈しては決してならない。本特許は、如何なる審査官または特許庁の他の如何なる係官もしくは従業員が行った如何なる言明も、出願者らによる回答文書において具体的に、かつ制限または留保なく明確に採用されていない限り、このような言明に限定されると解釈しては決してならない。
【０１１３】
採用してきた用語および表現は、制限用語ではなく記述用語として使用しており、このような用語および表現の使用には、示し、記載した特徴の任意の同等事項またはその一部を除外する意図はなく、請求したような本発明の範囲内で、多様な改変が可能であると認識している。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示したが、本明細書に開示した概念の改変および変更は、当業者が頼りにし得るものであり、このような改変および変更が、本発明の付属する特許請求の範囲および言明に規定されるように、本発明の範囲内にあると見なされることは、理解されよう。
【０１１４】
本発明を、本明細書に広く、属レベルで説明してきた。属レベルの開示内に入るより狭い種および属未満のグループも、各々本発明の一部をなす。これには、取り除いた主題が本明細書に具体的に言及されているか否かに関わらず、属から任意の主題を取り除く但し書きまたは否定的な制限の付いた、本発明の属レベル記述も含まれる。
【０１１５】
他の実施形態も、以下の特許請求の範囲内に入る。それに加え、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループにより記載されている場合、本発明が、マーカッシュ群の任意の個別構成事項、または構成事項のサブグループによっても記載されることを、当業者は認識されよう。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この特許出願は、２００８年１０月３１日に出願された、表題「ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ ＢＯＮＥ ＭＡＲＲＯＷ ＡＳＰＩＲＡＴＥ ＵＳＩＮＧ ＥＸ ＶＩＶＯ ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ ＢＹ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＢＯＮＥ ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ」の米国仮特許出願第６１／１１０，０９６号、および２００９年２月１３日に出願された、表題「ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＦＯＲＭＩＮＧ Ａ ＢＯＮＥ ＭＡＲＲＯＷ ＡＳＰＩＲＡＴＥ ＰＲＯＤＵＣＴ」の米国仮特許出願第６１／１５２，３３５号（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
分野
本明細書に記載の発明主題は、骨髄穿刺液（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｓｐｉｒａｔｅ）中の幹細胞を、エクスビボ刺激を用いて活性化することを含む、幹細胞を活性化するデバイスおよび方法に関する。該発明主題は、このような活性化幹細胞を含有する移植物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
最大限の骨形成を実現するには、骨芽細胞の表現型を既に示している細胞を移植することが望ましく、それは、そのような細胞が骨形成活性を示す見込みがあるためである。しかし、骨髄幹細胞の骨芽細胞へのインビトロ分化には、骨形成培地中での培養が必要であり（非特許文献１）、このような細胞の増殖は、インビトロで低下することになり得る。その上、骨形成培地の使用には、細胞に成分（例えば、増殖因子）を添加することが必要であり、そうした成分は、細胞と共に患者に投与した場合、意図しない副作用を示す恐れがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｉｓｗａｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９７年）６４巻：２９５〜３１２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野では、幹細胞、例えばヒト骨髄幹細胞から、骨原細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞をインビトロで産生する簡潔で信頼できる方法であって、所望の細胞が、骨原細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の生成に使用される因子から容易に分離される方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、哺乳動物において骨成長を促進するための移植組成物（ｉｍｐｌａｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を調製する方法であって、（ａ）幹細胞を１種または複数の活性剤と２４時間以下の間接触させて、活性化幹細胞を調製するステップ、（ｂ）活性化幹細胞から活性剤を分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成するステップ、および（ｃ）活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団と骨移植片代用物とを混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進する移植組成物を調製するステップを含み、少なくとも１種の活性剤が、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）への分化を促進する方法である。骨形成原細胞および／または骨形成前駆細胞は、骨原細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の場合もある。幾つかの実施形態では、幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から１時間接触させる。他の実施形態では、幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から０．５時間接触させる。幹細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児の皮膚、青年の皮膚（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ ｓｋｉｎ）または血液から、取得または単離することができる。幹細胞は、胚性、生後または成体の幹細胞でもよい。幾つかの実施形態では、幹細胞は、自家、同種異系または異種である。幹細胞は、間葉幹細胞を含むことができる。このような間葉幹細胞は、自家骨髄穿刺液を含むことができる。該骨髄穿刺液は、手術中に取り出すことができる。幹細胞を得た後、不要な液体を除去するために幹細胞を濃縮することができる。あるいは、幹細胞は、最初に得た組織または液体から分離することができる。
【０００７】
活性剤は、例えば、細胞の増殖および／または分化を調節でき、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンド、ホルモンおよびそれらの組合せからなる群より選択し得る。活性剤の例には、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｓｉｎ）、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびそれらの組合せ等の活性剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、活性剤は、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、活性剤は、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含み、更にＰＤＧＦを含むことができる。活性剤は、自家源に由来してもよい。活性剤は、溶液中で本方法に使用することができる。活性剤を溶液中で本方法で使用する場合、活性化幹細胞は、ろ過、ゲルろ過、接線流ろ過、免疫沈降、免疫吸収、カラムクロマトグラフィーまたはそれらの組合せを含む手順によって、ステップ（ｂ）に従って活性剤から分離される。他の実施形態では、活性剤は、固体支持体に結合されている。例えば、活性剤の少なくとも一部は、共有結合、吸着、非共有結合性相互作用および／またはそれらの組合せにより、固体支持体に直接的または間接的に結合することができる。幾つかの実施形態では、活性剤の少なくとも一部は、ペプチド、抗体、化学架橋剤、アルキレン鎖またはそれらの組合せを介して、固体支持体に結合されている。
【０００８】
骨移植片代用物は、カルシウム塩などの材料を含むことができる。このようなカルシウム塩は、例えば、リン酸一カルシウム一水和物、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、またはそれらの組合せを含むことができる。骨移植片代用物は、脱灰骨、リン酸ナトリウム塩、ポリマーまたはそれらの組合せを更に含むことができる。このようなポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、キサンタン（ｘａｎｔｈａｍ）ガム、ガーガム、アルギネート、またはそれらの組合せでもよい。幾つかの実施形態では、本方法は、幹細胞においてアルカリホスファターゼおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体サブユニットの発現を増加させる。このような方法は、患者に移植組成物を移植することを更に含むことができる。
【０００９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法により調製される移植組成物である。
【００１０】
本発明の別の態様は、被験体における骨の損傷、障害または状態を処置する方法であって、被験体における骨の損傷、障害または状態の部位へ、本明細書に記載の移植組成物を投与することを含む方法である。このような骨の損傷、障害または状態は、骨折、骨欠陥、骨移植、骨移植片、骨癌、関節置換、関節修復、骨癒合、骨面修復（ｂｏｎｅ ｆａｃｅｔ ｒｅｐａｉｒ）、骨変性、歯科インプラント、歯の修復（ｄｅｎｔａｌ ｒｅｐａｉｒ）、関節炎、骨再建、またはそれらの組合せでもよい。
【００１１】
本発明の別の態様は、固体支持体と、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞への分化を促進する少なくとも１種の活性剤とを含む、幹細胞活性化用のデバイスであって、（ｉ）幹細胞を少なくとも１種の活性剤と共にインキュベートするため、および（ｉｉ）インキュベートするステップ（ｉ）の後に、幹細胞から少なくとも１種の活性剤を分離するために適合しているデバイスである。例えば、少なくとも１種の活性剤は、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１２】
幾つかの実施形態では、少なくとも１種の活性剤は、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、少なくとも１種の活性剤は、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含み、更にＰＤＧＦを含むことができる。少なくとも１種の活性剤は、例えば、自家源に由来してもよい。活性剤（複数可）は、固体支持体内の溶液中にある、または固体支持体に結合することができる。活性剤は、例えば、少なくとも１種の活性剤と結合する抗体またはペプチドを介して、固体支持体に結合することができる。
【００１３】
固体支持体は、カラムマトリックス材料、フィルター、培養用のプレート、チューブもしくは皿、マイクロタイタープレート、ビーズ、ディスク、またはそれらの組合せを含むことができる。固体支持体は、容器でもよい。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、磁気粒子、ニトロセルロース、ガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはそれらの組合せを含むことができる。固体支持体は、少なくとも１種の活性剤を除去するために、親和性マトリックスも含むことができる。フィルターが固体支持体中に存在する場合、フィルターは、細胞および骨移植片代用物材料（ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）を保持するが、少なくとも１種の活性剤を通過させることができる。あるいは、フィルターは、少なくとも１種の活性剤を保持するが、幹細胞を通過させることができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、幹細胞と結合することも、幹細胞に対して有害な相互作用をすることもしない。他の実施形態では、固体支持体は、幹細胞と有害な相互作用をせずに、幹細胞と結合することができる。
【００１４】
該デバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を制御するために、タイマーを更に備えることができる。例えば、タイマーは、インキュベートするステップ（ｉ）の後に、幹細胞から少なくとも１種の活性剤を分離することを誘発することができる。幾つかの実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を２４時間以下に制御する。他の実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を５分間から１時間に制御する。
【００１５】
本発明の別の態様は、幹細胞源を取り扱うための第１の構成要素と、幹細胞源中の間葉幹細胞を骨芽細胞に分化するように刺激し、骨芽細胞を骨の修復および／または生成に有用な移植組成物中に組み込めるようにするのに有効に、幹細胞源を活性剤に曝露するための第２の構成要素を備える、骨形成用のデバイスである。幹細胞源は、自家骨髄穿刺液を含む骨髄穿刺液、脂肪組織および／または精製した同種異系幹細胞でもよい。
【００１６】
活性剤には、それだけに限らないが、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロールおよび／またはソニックヘッジホッグを挙げることができる。活性剤は、デバイスの固体支持体に直接結合するか、または例えばリンカーを介して固体支持体に繋留してもよい。一実施形態では、繋留部は、アルキレン鎖、ペプチド、抗体、化学架橋剤、およびそれらの組合せから選択される。
【００１７】
一実施形態では、活性剤は溶液中にあり、第２の構成要素は、間葉幹細胞から活性剤を除去するフィルター構成要素または親和性マトリックス（例えば、ペプチドもしくは抗体を有する）を更に含むことができる。
【００１８】
一実施形態では、骨髄穿刺液を活性化するデバイスを含む。このデバイスは、骨移植片代用物と、患者から取り出した骨髄穿刺液とを混合して、混合物を形成するための構成要素を備える。該デバイスは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に一時的に曝露するための構成要素も備える。
【００１９】
別の実施形態では、患者から取り出した骨髄穿刺液を取り扱うための構成要素を備えた、骨髄穿刺液を活性化するデバイスを含む。このデバイスは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、骨髄穿刺液を活性剤に曝露するための構成要素も備える。
【００２０】
骨移植片代用物と、患者から取り出した骨髄穿刺液とを混合して、混合物を形成するための構成要素を備えた、骨髄穿刺液を活性化する別のデバイスも記載している。該デバイスは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に曝露するための構成要素を更に備える。曝露した後、ＢＭＡは、繋留または固定活性剤から分離し、骨移植片代用物と混合することができる。
【００２１】
一実施形態では、幹細胞源（例えば、自家骨髄穿刺液を含めた骨髄穿刺液）を活性剤に曝露するステップであって、幹細胞源中の間葉幹細胞が、骨芽細胞に分化するように刺激されるステップを含む方法。一実施形態では、骨髄穿刺液は、手術中に取り出される、および／または患者から取り出されるときの形態で使用される。あるいは、骨髄穿刺液は、患者から取り出された後で更に濃縮することができる。この方法は、刺激または活性化された幹細胞（例えば、間葉幹細胞）と骨移植片合成代用物とを混合して、混合物を形成するステップも含むことができ、前記曝露するステップは、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に一時的に曝露することを含む。
【００２２】
一実施形態では、活性剤は、基材と結合して、結合基材を形成する。この実施形態では、幹細胞源は、結合活性剤と、５分間から２４時間または５分間から１時間または１５分間から１時間などのある期間、インキュベートされる。一実施形態では、前記インキュベートするステップは、骨において骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体サブユニットの上方調節を起こす。
【００２３】
一実施形態では、幹細胞源を活性剤に曝露する前記ステップは、幹細胞の溶液中で行われ、該方法は、親和性マトリックスの形成および／またはろ過などで、幹細胞の溶液から活性剤を除去するステップを更に含むことができる。
【００２４】
別の実施形態では、骨形成を刺激できる前駆細胞を形成する方法が提供される。方法の操作には、骨髄穿刺液（ＢＭＡ）を活性剤と混合し、間葉幹細胞（ＭＳＣ）が、骨芽細胞の表現型を強化するように誘発するために、活性剤を使用するステップが含まれる。このような方法は、間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化または発現するように誘発することができる。該方法は、骨移植片代用物と、患者から取り出した骨髄穿刺液とを混合して、混合物を形成するステップ、および間葉幹細胞が、骨芽細胞の表現型を強化または発現するように誘発するのに有効に、その混合物を固定または繋留活性剤に一時的に曝露するステップも含むことができる。
【００２５】
幾つかの実施形態では、該方法は、刺激した間葉幹細胞を患者に移植するステップを更に含み、そのステップは、幹細胞源と共に活性剤を移植することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の実施形態において、初代ヒトＭＳＣにより発現されたアルカリホスファターゼのレベルを図示している。細胞は、線維芽細胞増殖因子（以後「ＦＧＦ−２」）（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理した後、分化培地中で培養した。次いで、細胞により発現されたアルカリホスファターゼのレベルは、実施例１に記載のアッセイを用いて測定した。
【図２】図２は、初代ヒト間葉細胞（以後「ＭＳＣ」）を２４時間活性剤に曝露した後の該細胞における、３種の骨形成タンパク質（以後「ＢＭＰ」）受容体ユニット、即ちＢＭＰＲ−１Ａ（「１Ａ」）、ＢＭＰＲ−１Ｂ（「１Ｂ」）およびＢＭＰＲ−ＩＩ（「ＩＩ」）の相対的なｍＲＮＡコピー数を図示している。使用した活性剤は、血小板由来増殖因子（以後「ＰＤＧＦ ＢＢ」）、線維芽細胞増殖因子（以後「ＦＧＦｂ」）およびトランスホーミング増殖因子（以後「ＴＧＦβ３」）であり、濃度１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌで、２４時間曝露した。細胞を採集し、ＢＭＰ受容体ユニット全３種、即ち１Ａ、１ＢおよびＩＩに対して、実施例１に記載のように定量的なポリメラーゼ連鎖反応（以後「ＰＣＲ」）を行った。
【図３】図３は、初代ＭＳＣを、濃度１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌを用いてＰＤＧＦ ＢＢ、ＦＧＦｂおよびＴＧＦβ３に１時間曝露した後における、ＢＭＰ受容体ユニット３種（即ち１Ａ、１ＢおよびＩＩ）の相対的なｍＲＮＡコピー数を図示している。細胞を採集し、ＢＭＰ受容体ユニット全３種（即ち１Ａ、１ＢおよびＩＩ）に対して、実施例１に記載のように定量的ＰＣＲを行った。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
当技術の現状では、骨髄穿刺液（以後「ＢＭＡ」）を手術中に患者から取り出し、骨移植片代用物と混合し、骨治癒を促進するために、手術部位に再移植する。しかし、骨髄穿刺液は、骨芽細胞を産生し得る結合組織前駆細胞をある程度含有し得るが、骨形成を実際に促進できる骨形成原細胞の個数および種類には、患者によって大きな変動がある。
【００２８】
本明細書には、ＢＭＡまたは幹細胞混合物における該前駆細胞の、細胞数の増加または骨形成能の増加のいずれかにより、幹細胞（例えばＢＭＡ）の性能を改善する方法、デバイスおよび移植物が記載されている。本明細書に記載の実施形態には、手短に言えば、手術中に、幹細胞を１種または複数の外因性活性剤にエクスビボで曝露することにより、骨成長を刺激できる前駆細胞を生成し、次いで、その活性剤（複数可）を幹細胞（即ち、活性剤で活性化された前駆細胞）から除去するための方法およびデバイスが含まれる。活性剤（複数可）は、例えば、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンドまたは他の因子でもよい。活性剤（複数可）は、自家源から捕捉でき、または商業源から取得でき、または製造することもできる（例えば、組換え手順により）。
【００２９】
幾つかの実施形態では、活性剤は、幹細胞混合物の前駆細胞において骨形成タンパク質、以後のＢＭＰの受容体サブユニット（複数可）の発現を増加させることができる。活性剤によるこの処理は、例えば、骨傷害または骨手術の部位における内因性ＢＭＰに応答する前駆細胞の能力の増強を補助する。活性剤によるこのような処理は、幹細胞の骨芽細胞経路に沿った分化を推進することもできる。幹細胞は、本明細書に記載のように、サイトカインによる長期間（例えば７日間）の処理によりこれまで活性化されているが、このような長期間の活性剤に対する幹細胞の曝露は、不要である。約１５分間から約３時間活性剤に曝露しただけの後で、幹細胞は、活性化され、骨形成能を示すことができる。
【００３０】
その上、幾つかの研究によれば、補助細胞集団の存在が、インビトロでの骨前駆細胞の増生に必要になり得そうであると示されている。したがって、高度に精製された骨前駆細胞は、骨形成サイトカインの混合物がたとえ存在していても、増殖できないこともあり得る。したがって、幹細胞の長期の培養は、有利でないこともあり得る。本明細書に記載の方法およびデバイスは、長期間の細胞培養を必要とせず、より迅速であり、そのため長期の細胞培養に伴う汚染の恐れおよび経費を回避している。
【００３１】
本明細書に記載のように、骨形成能を有する幹細胞の増強、活性化および／または分化は、デバイス上またはデバイス内に活性剤（複数可）を繋留することにより実現することができ、その結果、幹細胞混合物内に含まれる細胞を活性化し、例えば、デバイスから細胞を除去することにより、活性剤（複数可）から容易に分離することができる。細胞の移植前に細胞から活性剤を分離することにより、活性剤自体の意図せざる副作用（例えば、望ましくない応答の刺激または有害な免疫応答の誘発）の可能性が低下する。
【００３２】
幹細胞源
本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物は、都合よい任意源からの幹細胞を使用することができる。しかし、骨形成能を有するか、または骨形成能を有する細胞を生成するように処理（例えば、分化）できる幹細胞が、好ましい。
【００３３】
本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物に使用できる幹細胞源には、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、エクスビボ培養自家間葉幹細胞、市販の同種異系間葉幹細胞、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年の皮膚、ならびに血液が挙げられる。幾つかの実施形態では、幹細胞は、間葉幹細胞、または間葉幹細胞を含む細胞混合物（例えば、骨髄穿刺液）である。幹細胞は、自家、同種異系、または異種源からでもよい。幹細胞は、胚性、または生後源もしくは成体源からでもよい。
【００３４】
骨髄穿刺液は、本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物に有用な１つの幹細胞源である。このような骨髄穿刺液は、自家、同種異系、または異種源からでもよいが、幾つかの実施形態では、骨髄穿刺液は自家である。
【００３５】
骨髄穿刺液は、造血幹細胞、赤血球および白血球ならびにそれらの前駆体、間葉幹細胞および前駆細胞、間質細胞およびその前駆体、ならびに線維芽細胞、網状赤血球、脂肪細胞および内皮細胞を含み、「間質」と呼ばれる結合組織ネットワークを形成する一群の細胞の複雑な混合物を含有する。間質からの細胞は、細胞表面タンパク質を介した直接相互作用および増殖因子の分泌による造血細胞の分化を形態的に調節し、骨構造の基礎形成および支持に関与する。研究によれば、骨髄は、軟骨、骨および他の結合組織細胞に分化する能力を有する「前間質」細胞を含有することが示されている。Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ 「Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ」、Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ．、２４０巻：２７０頁、１９８９年。最近の研究によれば、多能性間質幹細胞または間葉幹細胞と呼ばれるこうした細胞は、活性化時に異なる数種類の細胞系（即ち、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など）に生成される能力を有することが示されている。しかし、間葉幹細胞は、雑多な他の細胞（即ち、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞など）と共に、骨髄穿刺液中に非常に微量に存在することが多い。それに加え、様々な結合組織へのその分化能は、穿刺液中にあって変動し得る生物活性因子の存在に依存するだけでなく、ある程度は供与者の年齢にも依存する。本明細書に記載の方法およびデバイスは、幹細胞試料中の細胞数、および幹細胞の骨芽細胞への分化能を改善することにより、こうした問題に対処する。
【００３６】
幾つかの実施形態では、幹細胞は間葉幹細胞を含む。間葉幹細胞は、当業者に利用可能な手順によって同定することができる。例えば、間葉幹細胞は、コロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵ−ｆ）、または間葉幹細胞が通常発現するマーカーを用いたフローサイトメトリーにより同定することができる。間葉幹細胞は、一般に、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ７３＋などのマーカーを発現するが、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−の表現型を示す。
【００３７】
骨髄細胞を使用する場合、こうした細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨または他の髄腔から得てもよい。幾つかの実施形態では、該幹細胞は自家体液（例えば、骨髄穿刺液）に由来する。骨髄穿刺液は、良好な間葉幹細胞源である。
【００３８】
該幹細胞は、幾つかの実施形態では、「無関係な」細胞を排除し、活性化ステップの効率を改善するために、または間葉幹細胞を予備選択して、移植物材料における骨形成を促進するために、遠心、サイズろ過、免疫磁気選別などの分離工程を受けることができる。細胞型の分離および／または間葉幹細胞の精製を行うことは必要とは言えないが、幾つかの実施形態では望ましいこともある。
【００３９】
細胞型の分離が所望の場合、例えば骨髄を含む生物試料は、遠心して、間葉幹細胞などの結合組織成長促進成分の多い画分を含め、密度に基づく各種の画分に試料の成分を分離することができる。次いで、結合組織成長促進成分の多い画分を単離することができる。それに加え、遠心する生物試料が、細胞培養培地物質を含有しないようにすることができる。幾つかの実施形態では、遠心する生物試料は、得られた単離、活性化された幹細胞を後に移植する患者からの組織材料（例えば、場合により血液または他の組織材料と組み合わさった骨髄材料）から、本質的になることができる。
【００４０】
活性剤
活性剤は、本明細書に記載の方法およびデバイスにおいて、幹細胞からの骨形成原細胞への形成および／または分化を促進するために使用される。このような活性剤は、例えば、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンド、ホルモン、ならびに増殖および分化を調節する他の分子でもよい。活性剤（複数可）は、自家源から捕捉でき、または商業源から取得でき、または製造することもできる（例えば、組換え手順により）。
【００４１】
使用できる活性剤の例には、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ、ＩＧＦ、インターロイキン、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−１１、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、フィブロネクチン、「ＲＧＤ」またはインテグリンのペプチドおよび／またはタンパク質、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、ＭＳＸ１、ＮＦＫＢ１、ＲＵＮＸ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＯＸ９、ＴＮＦ、ＴＷＩＳＴ１、ＶＤＲ、ＡＨＳＧ、ＡＭＢＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＧＬＡＰ、ＥＮＡＭ、ＭＩＮＰＰ１、ＳＴＡＴＨ、ＴＵＦＴ１、ＢＭＰ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＳＯＸ９、ＡＬＰＬ、ＡＭＢＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＧＬＡＰ、ＣＡＬＣＲ、ＣＤＨ１１、ＤＭＰ１、ＤＳＰＰ、ＥＮＡＭ、ＭＩＮＰＰ１、ＰＨＥＸ、ＲＵＮＸ２、ＳＴＡＴＨ、ＴＦＩＰ１１、ＴＵＦＴ１、ＢＧＬＡＰ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＭＰ、ＦＧＦＲ１、ＧＤＦ１０、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＭＳＸ１、ＡＮＸＡ５、ＣＡＬＣＲ、ＣＤＨ１１、ＣＯＭＰ、ＤＭＰ１、ＥＧＦ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ８、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ５Ａ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＧＦＢ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＦＬＴ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦＡ、ＳＭＡＤ３、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＢＭＰ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ１、ＧＤＦ１０、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＡＨＳＧ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＣＴＳＫ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ９、ＰＨＥＸ、ＡＭＢＮ、ＡＭＥＬＹ、ＥＮＡＭ、ＳＴＡＴＨ、ＴＵＦＴ１、ＢＧＮ、ＣＯＭＰ、ＤＳＰＰ、ＧＤＦ１０、ＣＤＨ１１、ＩＣＡＭ１、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＭ１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ３６、ＣＯＭＰ、ＳＣＡＲＢ１、ＡＭＨ、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＧＤＦ３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ６、ＩＮＨＡ（インヒビンａ）、ＩＮＨＢＡ（インヒビンＢＡ）、ＬＥＦＴＹ１、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ２、ＬＴＢＰ４、ＮＯＤＡＬ、ＡＣＶＲ１（ＡＬＫ２）、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲＬ１（ＡＬＫ１）、ＡＭＨＲ２、ＢＭＰＲ１Ａ（ＡＬＫ３）、ＢＭＰＲ１Ｂ（ＡＬＫ６）、ＢＭＰＲ２、ＩＴＧＢ５（インテグリンＢ５）、ＩＴＧＢ７（インテグリンＢ７）、ＬＴＢＰ１、ＮＲ０Ｂ１、ＳＴＡＴ１、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＧＦＢＲ１，（ＡＬＫ５）ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＷＡＦ１／ｐ２１ＣＩＰ１）、ＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＬＮＫ２Ｂ）、ＦＯＳ、ＧＳＣ（グーセコイド）、ＩＧＦＢＰ３、ＩＴＧＢ５（インテグリンＢ５）、ＩＴＧＢ７（インテグリンＢ７）、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＭＹＣ、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ−１）、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＳＣ２２Ｄ１（ＴＧＦＢ１Ｉ４）、ＴＧＩＦ１、ＤＬＸ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＪＵＮＢ、ＳＯＸ４、ＳＴＡＴ１、ＢＡＭＢＩ、ＢＭＰＥＲ、ＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＬＮＫ２Ｂ）、ＣＥＲ１（セルベルス）、ＣＨＲＤ（コルジン）、ＣＳＴ３、ＥＮＧ（Ｅｖｉ−１）、ＥＶＩ１、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＨＩＰＫ２、ＮＢＬ１（ＤＡＮ）、ＮＯＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＲＵＮＸ１（ＡＭＬ１）、ＳＭＵＲＦ１ならびに増殖および分化を調節する他の分子、ならびにこれらの因子の組合せが挙げられる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、活性剤には、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、酸性もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦａもしくはＦＧＦｂ）および／または線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）を含む）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリー（ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６および／またはＢＭＰ−７など）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）ファミリーの構成員（例えば、インスリン様増殖因子−Ｉおよび／またはＩＩ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、「ＲＧＤ」またはインテグリン配列、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質（Ｏｐ；Ｏｐ−１、Ｏｐ−２、Ｏｐ−３など）ならびに増殖および分化を調節する他の分子、ならびにこれらの因子の組合せが挙げられる。
【００４３】
完全タンパク質と同じ活性化応答を引き出すペプチド活性剤も、使用することができる。例えば、ＴＧＦ−β、ＦＧＦｂおよび／またはＰＤＧＦに類似の作用を有するタンパク質のアミノ酸断片またはペプチドを、使用することができる。本明細書に記載の活性剤のいずれかからの、または幹細胞の活性化に有用なことが知られているペプチド活性剤は、使用することができる。他の実施形態では、小分子活性剤が、幹細胞の活性化に使用することができる。
【００４４】
多くの実施形態では、ＴＧＦ−βファミリーの構成員が、本明細書に記載の方法およびデバイスにおける活性剤として含まれる。ＴＧＦ−βファミリーは、構造的に関連する一群のタンパク質を包含し、胚発生中に広範囲な分化過程に影響する。ＴＧＦβファミリーに含めることは、システイン残基７個の保存を含む、アミノ酸一次配列の相同性に基づく。このファミリーには、例えば、正常な雄性発生に必要（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５巻：１６７頁、１９９０年）なミュラー管抑制物質（ＭＩＳ）、背部−腹部軸の形成および成虫原基の形態形成に必要（Ｐａｄｇｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５巻：８１〜８４頁、１９８７年）なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＤＰＰ）遺伝子産物、卵の植物極に局在している（Ｗｅｅｋｓら、Ｃｅｌｌ、５１巻：８６１〜８６７頁、１９８７年）Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１遺伝子産物、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において中胚葉および前部構造の形成を誘導できる（Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、６３巻：４８５頁、１９９０年）アクチビン（Ｍａｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１３５巻：９５７〜９６４頁、１９８６年）、ならびに軟骨および骨の新規な形成を誘導できる（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１３１９８頁、１９９０年）骨形成タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−２〜ＢＭＰ−１５など）が含まれる。ＴＧＦ−β遺伝子産物は、脂質形成、筋形成、軟骨形成、造血、および上皮細胞分化を含む、多様な分化過程に影響することができる（総説については、全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅｌｌ ４９巻：４３７頁、１９８７年を参照されたい）。
【００４５】
ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、大きな前駆体タンパク質として当初合成され、その後、Ｃ末端からおよそ１１０〜１４０個目のアミノ酸である、塩基性残基のクラスターでタンパク分解的切断を受ける。タンパク質のＣ末端領域は、全て構造的に関連しており、異なるファミリー構成員は、相同性の程度に基づいて別々のサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は、アミノ酸配列の同一性が７０％〜９０％の範囲にあるが、サブグループ間の相同性は、それより有意に低く、一般に僅か２０％〜５０％の範囲にある。各場合において、活性種は、Ｃ末端断片のジスルフィド連結二量体であるようである。研究されてきたファミリー構成員の大部分については、ホモ二量体種が生物活性であることが判明しているが、他のファミリー構成員については、インヒビン（Ｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：７７９頁、１９８６年）およびＴＧＦ−β（Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、Ｃｅｌｌ、４８巻：４０９頁、１９８７年）のように、ヘテロ二量体も検出されており、これらのものは、それぞれのホモ二量体とは異なる生物学的性質を有するようである。
【００４６】
ＴＧＦ−β遺伝子のスーパーファミリー構成員には、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β４（ニワトリ）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β５（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＰＰ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ１、ＯＰ−１／ＢＭＰ−７、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ６０Ａ、ＧＤＦ−１、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇｆ、ＢＭＰ−３、インヒビン−βＡ、インヒビン−βＢ、インヒビン−αおよびＭＩＳが挙げられる。これらの遺伝子は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｓｓａｇｕｅ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７巻：７５３〜７９１頁、１９９８年に考察されている。
【００４７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスおよび方法で使用されるＴＧＦ−βのファミリー構成員は、ＴＧＦ−β３である。
【００４８】
線維芽細胞増殖因子およびその受容体線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＳ）は、形態形成、血管形成および組織再建を含む多様な生物過程、ならびに多数の疾患の発症に関わる、進化的に保存されたポリペプチドのファミリーを含む（全体が参照により本明細書に明確に組み込まれるＯｒｎｉｔｚ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２巻：１０８頁、２０００年に総説されている）。このファミリーの様々な構成員は、間葉から上皮および神経外胚葉の起源に及ぶ、広範囲の細胞の増殖をインビトロおよびインビボで刺激する。ＦＧＦは、発生中に時間的および空間的に厳密なパターンで発現され、パターン化および四肢形成に重要な役割を有する（Ｏｒｎｉｔｚ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２巻：１０８頁、２０００年）。
【００４９】
ＦＧＦファミリーの全構成員は、アミノ酸約１２０個の相同性コアドメインを共有し、そこではアミノ酸２８残基が高度に保存され、６個は同一である。数種のＦＧＦに関する構造研究によって、各ストランドが、ファミリーを通して保存されているコア領域を含むβループに隣接した、逆平行βストランドが１２本同定された。コアドメインは、一次ＦＧＦＲおよびヘパリン結合部位を含む。受容体結合領域は、ヘパリン結合領域とは異なる（Ｏｒｎｉｔｚ ａｎｄ Ｉｔｏｈ、Ｇｅｎ． Ｂｉｏｌ． ２巻、３００５．１頁、２００１年）。
【００５０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスおよび方法で使用されるＦＧＦのファミリー構成員は、ＦＧＦ−２である。
【００５１】
ヒト血小板からの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、２種のポリペプチド配列、即ちＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦ−Ａのポリペプチドを含有する（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ， Ｈ． Ｎ． ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０巻：９６３〜９６５頁、１９８３年）。ＰＤＧＦ−Ｂは、７番染色体上に位置する遺伝子によりコードされ（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ， Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０巻：６９５〜６９９頁）、ＰＤＧＦ−Ａは、２２番染色体上に位置する（Ｄａｌｌａ−Ｆａｖｅｒａ， Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８巻：６８６〜６８８頁、１９８２年）ｓｉｓ癌遺伝子によりコードされる（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１巻：２７５〜２７７頁、１９８３年）。このｓｉｓ遺伝子は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチドと密接な関係がある、サル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）の形質転換タンパク質をコードする。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓも、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする（Ｒａｏ， Ｃ． Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３巻：２３９２〜２３９６頁、１９８６年）。ＰＤＧＦの２本のポリペプチド鎖は、別々の染色体に位置する異なる２種の遺伝子によりコードされるので、ヒトＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦ−Ａのジスルフィド連結ヘテロ二量体、またはホモ二量体２種の混合物（ＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体およびＰＤＧＦ−ＡＡホモ二量体）、またはヘテロ二量体およびホモ二量体２種の混合物からなり得る。
【００５２】
ＰＤＧＦは、商業的に、あるいは人間の組織もしくは細胞、例えば血小板から、固相ペプチド合成により、または組換えＤＮＡ技術により得てもよい。ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする遺伝子を含有する、サル肉腫ウィルスに感染した培養時の哺乳動物細胞は、ＰＤＧＦ−Ａポリペプチドを合成し、それをジスルフィド連結ホモ二量体にプロセシングすることができる（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３０５巻：６０５〜６０８頁、１９８３年）。それに加え、ＰＤＧＦ−Ａホモ二量体は、ヒトＰＤＧＦに対して生成した抗血清と反応し、分泌されたＰＤＧＦ−Ａホモ二量体の機能的性質は、血小板由来ＰＤＧＦのものと類似している。組換えＰＤＧＦ−Ｂホモ二量体は、発現ベクターを用いてマウス細胞にｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子のｃＤＮＡクローンを導入することにより、得ることができる。このような発現に用いるｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−Ｂクローンは、正常なヒトの培養上皮細胞から得られた（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２１６巻：７４８〜７５０頁、１９８５年）。
【００５３】
多くの活性剤が、骨形成幹細胞の活性化に有用であるが、本発明者らが作成したデータによれば、幾つかの実施形態では、ＴＧＦ−β３、ＦＧＦ−２および各種のＰＤＧＦが有用であることを示している。他の実施形態では、幹細胞を活性化するためのデバイスおよび方法は、活性剤として少なくともＴＧＦ−β３およびＦＧＦ−２を含む。
【００５４】
幾つかの実施形態では、活性剤は、幹細胞混合物の前駆細胞において骨形成タンパク質受容体サブユニット（複数可）の発現を増加させることができる。このような活性剤による処置は、例えば、骨傷害または骨手術の部位において内因性骨形成タンパク質に応答する、前駆細胞の能力の増強を補助する。活性剤によるこのような処置は、幹細胞の骨芽細胞経路に沿った分化も推進することができる。
【００５５】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨および軟骨の形成を誘導するだけでなく、多くの細胞型に広範囲の効果を及ぼす多機能サイトカインである（Ｈｏｇａｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０巻：１５８０〜１５９４頁（１９９６年）；Ｒｅｄｄｉら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． ８巻：１１〜２０頁（１９９７年））。ＢＭＰは、ＴＧＦβスーパーファミリーの構成員である。人間にはＢＭＰ遺伝子がおよそ１５〜２０個、ＢＭＰ受容体が３個、およびＢＭＰ拮抗剤として機能するＢＭＰ関連タンパク質が幾つもある（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｂｏｎｅ １９巻：５６９〜５７４頁（１９９６年））。ＢＭＰは、３個のＢＭＰ受容体であるＢＭＰＲ−１Ａ、ＩＢおよびＩＩを介するＳｍａｄシグナル伝達経路を通して機能する。ＢＭＰ二量体がＩＩ型受容体に結合すると、それは、Ｉ型受容体を複合化し、リン酸化して、後者はＳｍａｄ経路を活性化する。
【００５６】
初代骨芽細胞を外因性増殖因子に曝露することにより、こうした受容体の発現を調節することができる。Ｓｉｎｇｈａｔａｎａｄｇｉｔら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０９巻（３号）：９１２〜２２頁（２００６年））は、初代骨芽細胞のＴＧＦ−β１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＢＭＰ−２による処理、ならびにこうした増殖因子の細胞内受容体から細胞表面までに対する幾つかの効果を試験した。Ｙｅｈら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９０巻（３号）：３２２〜３１頁（２００２年）；Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９１巻（３号）：２９８〜３０９頁（２００２年））は、ＯＰ−１に曝露した後の胎児ラット頭蓋冠細胞において、受容体サブユニットｍＲＮＡの差次的調節パターンを観察した。Ｘｕら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２４巻（４号）：２６８〜７８頁（２００６年））は、ＴＧＦβ３のＢＭＰＲ−ＩＢに対する効果を試験した。各受容体に結合したＢＭＰのシグナル伝達に関わる因子は、一般に理解されているが、受容体サブユニットの調節および発現パターンは、十分に解明されていない。その上、研究者たちには、幹細胞（例えば、骨髄）を増殖因子で短期間処理した後、増殖因子を除去することにより、骨形成原細胞および／または骨形成前駆体の形成を刺激できるとは、認識されていない。
【００５７】
幹細胞の活性化
本明細書に例示するように、幹細胞は、活性剤に一時的に曝露することにより、骨形成的に活性化することができる。このような活性化幹細胞は、骨原細胞、骨芽細胞および／または骨芽細胞表現型細胞に分化する。その上、活性化幹細胞から活性剤を除去することにより、被験体への移植時に意図せざる副作用を有する恐れのある増殖因子およびサイトカインを含まない、細胞混合物が産生される。したがって、生物活性分子の混合物中で幹細胞を数日間培養する必要はないが、そのように培養すれば、処置を待つ患者の疼痛および不動状態が継続し、骨傷害を最初に修復した後に移植物挿入のために手術が追加され、培養細胞を汚染し、幹細胞集団または骨穿刺液中に望ましくない細胞型が増殖し、その上、培養の維持および傷害患者の介護に時間および経費が追加される事態になり得る。
【００５８】
その代わりに、幹細胞は、活性剤（複数可）との短期間のインキュベーションによって、移植および骨成長の刺激のために活性化することができる。したがって、例えば、患者が骨の傷害または状態の処置を認められたとき、患者が手術を受けている間に、自家または同種異系幹細胞（例えば、骨髄穿刺液）を活性化することができ、活性化幹細胞は、直ちに移植することができる（所望であれば、骨移植片代用物と共に）。
【００５９】
本明細書で使用する場合の語句「幹細胞の活性化」とは、幹細胞が、増殖に続いて骨形成原細胞に分化できる骨形成前駆細胞に分化するように、誘導されることを意味する。このような骨形成原細胞には、骨芽細胞および骨芽細胞前駆体が含まれる。骨形成原細胞は、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチンおよびＢＭＰ受容体などの骨特異マーカーの発現によって、認識することができる。
【００６０】
本明細書で示すように、幹細胞の活性化は、ほんの短期間、例えば、５分間から２４時間の範囲の期間でよい。幹細胞を活性剤に曝露する他の最適な時間枠は、１０分間から２時間または１５分間から１時間の範囲である。幾つかの実施形態では、幹細胞は、１種もしくは複数の活性剤と５分間から１時間接触される、または幹細胞は、１種もしくは複数の活性剤と５分間から０．５時間接触される。本明細書で例示するように、骨髄穿刺液を活性剤にほんの１時間曝露すると、アルカリホスファターゼおよびＢＭＰ受容体サブユニット（複数可）の発現が上方調節される。
【００６１】
したがって、本発明の一態様は、哺乳動物において骨成長を促進するための移植物を作製する方法である。この方法は、幹細胞を１種または複数の活性剤に２４時間以下（例えば、約５分間から２４時間、または約１０分間から２時間、または約１５分間から１時間）曝露して、活性化幹細胞を形成し、活性化幹細胞を１種または複数の活性剤から分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成し、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を骨移植片代用物と混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進するための移植物を作製することを伴う。
【００６２】
幹細胞は、幹細胞を骨形成または骨形成前駆体の表現型に活性化するために、十分な濃度の１種または複数の活性剤に曝露される。当業者であれば、このような濃度がどれだけであるかを、例えば、どれだけの濃度が、アルカリホスファターゼおよびＢＭＰ受容体サブユニット（複数可）の発現の増加または上方調節を起こすかを観測することにより、容易に決定することができる。活性剤の適当な濃度例には、濃度約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの活性剤（複数可）の使用が挙げられる。幾つかの実施形態では、活性剤は、濃度約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌで使用される。
【００６３】
本明細書に記載されるように、幹細胞は、都合よい任意源に由来することができる。しかし、骨形成能を有するか、または骨形成能を有する細胞を生成するように処理（例えば、分化）できる幹細胞が、好ましい。本明細書に記載の方法、デバイスおよび移植物に使用できる幹細胞源には、骨髄、脂肪組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児および青年の皮膚、ならびに血液が挙げられる。幾つかの実施形態では、幹細胞は、間葉幹細胞、または間葉幹細胞を含む細胞混合物である。幹細胞は、自家、同種異系、または異種源由来でもよい。幹細胞は、胚性、生後または成体源由来でもよい。幾つかの実施形態では、幹細胞は、自家または同種異系の骨髄穿刺液である。
【００６４】
一般に、幹細胞を非幹細胞から分離すること、または活性化（骨形成）幹細胞を他の細胞型から精製することは、不要である。しかし、当業者が、幹細胞を非幹細胞から、または活性化骨形成幹細胞を非活性化幹細胞および他の細胞型から精製することを欲する場合、当業者は、都合よい任意の手順によりそうすることができる。例えば、骨髄を遠心して、密度に基づく各種の画分に穿刺液の成分を分離し、間葉幹細胞の多い画分を得ることができる。該細胞は、活性化骨形成幹細胞の細胞表面上に発現した因子（例えば、ＢＭＰ受容体）を認識し、それに結合する抗体を用いて、免疫精製を施すこともできる。
【００６５】
本明細書に示すように、幹細胞を活性化するために本明細書に記載の方法およびデバイスに使用する活性剤は、幹細胞の骨形成能を活性化できる任意の活性剤でもよい。その例は、本明細書に記載し、例示してある。
【００６６】
幹細胞は、活性化されるとき、骨形成前駆細胞に特有の因子を発現し始める。例えば本明細書に例示するように、初代ヒト間葉幹細胞が発現するアルカリホスファターゼ、骨芽細胞分化の初期マーカーの各レベルが増加する。例えば、非処理対照細胞と比較して、ＴＧＦβ３（三角）またはＦＧＦ−２（四角）で１時間だけ処理した間葉幹細胞において、アルカリホスファターゼの発現量の増加が経時的に認められ、処理細胞の方が強力な分化応答を示したことを示す図１を参照されたい。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法およびデバイスを用いた幹細胞の活性化は、ＢＭＰ受容体サブユニットのレベルも増加させることができる。本明細書に例示するように、初代間葉幹細胞における３種のＢＭＰ受容体ユニット（即ち、ＢＭＰＲ−１Ａ、ＢＭＰＲ−１ＢおよびＢＭＰＲ−ＩＩ）のｍＲＮＡコピー数は、活性剤（ＰＤＧＦ ＢＢ、ＦＧＦｂおよびＴＧＦβ３を１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）にほんの１時間（図３）または２４時間（図２）曝露した後、増加した。したがって、手術部位への移植前における、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）の活性剤によるほんの短期間の処理は、移植後の内因性ＢＭＰに対する応答をよりロバストにするために、該細胞を増強し得る。
【００６８】
活性化幹細胞は、曝露した１種または複数の活性剤から都合よい任意の方法で分離し、それにより活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成する。幹細胞集団は、幹細胞を含有する組成物（例えば、移植組成物）が、幹細胞組成物（または移植組成物）の投与を排除すると思われる、活性剤（複数可）の副作用を示さない場合、活性剤を実質的に含まない。したがって、活性剤の量が、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ未満、または１ｎｇ／ｍｌ未満、または０．１ｎｇ／ｍｌ未満、または０．０１ｎｇ／ｍｌ未満である限り、少量の活性剤は、活性化幹細胞集団（または移植組成物）中に残ってもよい。
【００６９】
細胞を小型および大型分子から分離する手順は、当業者に利用可能である。例えば、幹細胞は、細胞を媒体または塩水中に浮遊させ、遠心により細胞を収集することにより、洗浄することができる。このような洗浄を数回すれば、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団が産生される。別の例では、該細胞は、活性剤を保持するが細胞を通過させるカラムの中に、細胞を通過させることにより、活性剤から分離することができる。このようなカラムは、活性剤（複数可）を結合または保持するマトリックスを有することができ、例えば、そのカラムは、ゲルろ過カラム、アフィニティ精製カラムまたはイオン交換カラムでもよい。
【００７０】
したがって、活性剤（複数可）は、溶液として幹細胞源（即ち、骨髄穿刺液）に導入することができる。所与のインキュベーション時間後、活性化幹細胞は、ろ過、ゲルろ過、免疫沈降、免疫吸収、カラムクロマトグラフィーまたはそれらの組合せを含む手順により、活性剤から分離される。例えば、活性剤は、活性剤を固定化し、幹細胞からの活性剤の除去または分離を可能とするために、抗体または結合性のタンパク質もしくはペプチドを用いて除去することができる。幾つかの実施形態では、溶液中の活性剤は、溶液からの活性剤の術中除去を可能とするような分子量の適当なカットオフを有する、接線流ろ過などの術中ろ過工程を介して細胞から除去してもよい。
【００７１】
別の実施形態では、単離した幹細胞は、本明細書に記載のように、骨移植片代用物中に取り込んだ後、活性剤（複数可）に曝露される。活性剤は、都合よい任意の手順、例えば、幹細胞／骨移植片代用物の複合体を数回沈降させて、活性剤（複数可）を含有する上清液を除去することにより、幹細胞／骨移植片代用物の複合体から除去することができる。
【００７２】
幾つかの実施形態では、活性化幹細胞は、曝露した１種または複数の活性剤から、本明細書に記載のデバイスを用いることにより分離される。
【００７３】
幹細胞を活性化するデバイス
本発明の別の態様は、例えば、骨成長を刺激できる細胞（例えば、骨形成前駆細胞、骨芽細胞など）に分化するように、幹細胞を活性化するデバイスである。本明細書に記載の方法におけるデバイスの使用によって、幹細胞、幹細胞混合物および幹細胞組成物（例えば、移植組成物）と少なくとも１種の活性剤との、幹細胞の活性化に十分な時間のインキュベーションが可能になり、活性化幹細胞を少なくとも１種の活性剤から分離し、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞および／または活性化幹細胞組成物の産生が可能になる。
【００７４】
したがって例えば、本発明の一態様は、固体支持体、および固体支持体に結合した１種または複数の活性剤を含むデバイスである。活性剤（複数可）は、固体支持体に直接結合することができ（例えば、吸着もしくは共有結合により）、または活性剤（複数可）は、固体支持体に間接的に結合することができる（例えば、リンカー、抗体、ペプチド、アプタマー、アルキレン鎖、ビオチン−ストレプトアビジンなどを介して）。
【００７５】
固体支持体は、活性剤を直接または間接に結合することができ、幹細胞と結合または有害な相互作用をしない任意の材料でもよい。したがって、固体支持体は、カラムマトリックス材料料、フィルター、培養用のプレート、チューブまたは皿、マイクロタイタープレート（またはマイクロタイタープレートのウェル）、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、ディスク、および幹細胞に適合する他の材料でもよい。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、磁気粒子、ニトロセルロース、ガラス、グラスファイバー、ラテックスおよび他の基材などの多様な材料から作製することができる。所望であれば、固体支持体は、幹細胞の結合を阻害する、または固体支持体における材料の反応性を低下させる物質をコーティングすることができる。
【００７６】
活性剤（複数可）は、当業者に公知の各種技法を用いて固体支持体に結合し得るが、そうした技法は、特許および科学文献に十分に記載されている。本発明に関しては、用語「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」とは、吸着などの非共有結合的つながりも、共有結合（活性剤と支持体上の官能基との直接連結によってもよく、または間接的連結によってもよい）も指す。
【００７７】
幾つかの固体支持体材料（例えば、プラスチック）上への吸着は、適切な緩衝液中の活性剤を固体支持体と適切な長さの時間接触させることにより、実現し得る。接触時間は、温度と共に変化するが、通常約１時間から約１日の間である。一般に、例えば、プラスチックマイクロタイタープレート（ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなど）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲にある量の活性剤と接触させれば、十分量の活性剤を固定化するのに足りる。
【００７８】
活性剤の固体支持体への共有結合は、支持体にも、活性剤上にあるヒドロキシ基またはアミノ基などの官能基にも反応すると見込まれる二官能性試薬と、支持体を最初に反応させることにより、一般に実現し得る。例えば、活性剤は、適当なポリマー被膜を有する支持体に、ベンゾキノンを用いて、または支持体上のアルデヒド基と、該結合相手上のアミンおよび活性水素との縮合によって、共有結合し得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１年のＡ１２〜Ａ１３を参照されたい）。二官能性試薬は、架橋剤、官能基２個のリンカー、ペプチド、アルキレン鎖、アプタマー、または他の二官能性分子でもよい。
【００７９】
活性剤は、抗体などの結合剤を介して固体支持体に非共有結合してもよく、その場合抗体は、固体支持体に結合または吸着し、活性剤に非共有結合で結合する。あるいは、活性剤は、ビオチン−ストレプトアビジンを介して固体支持体に非共有結合してもよく、その場合ビオチンまたはストレプトアビジンのいずれかが固体支持体に結合する。ストレプトアビジンが固体支持体に結合する場合、ビオチンは活性剤に結合する。活性剤に連結されるビオチンは、ストレプトアビジンに結合することにより、活性剤を固体支持体上に固定化することになろう。
【００８０】
一例においては、活性剤が共有結合しているカラムマトリックスまたはフィルター材料が、含まれる。次いで、幹細胞（例えば、骨髄穿刺液）をしばらくの時間この基材に通すか、またはその中でインキュベートすることができるが、時間枠は、例えば５分間から２４時間の範囲、最適な時間枠は、１５分間から１時間の範囲である。
【００８１】
活性剤（複数可）に対するこの曝露は、ＢＭＰ受容体サブユニットおよびアルカリホスファターゼの発現を増加させることが示された。例えば、図２および３は、３種の活性剤（ＰＤＧＦ ＢＢ、ＦＧＦｂおよびＴＧＦ−β３）が、ＢＭＰＲ−ＩＢサブユニットを上方調節し、特定の濃度では、ＢＭＰＲ−ＩＡおよびＢＭＰＲ−ＩＩのサブユニットが、バックグランドより増加することを例示している。このような活性剤に対する曝露は、間葉幹細胞を活性化または誘発して、骨芽細胞の表現型を増強するのに役立つ。
【００８２】
その結果、活性剤には、ＦＧＦｂ、ＴＧＦ−β３および／またはＰＤＧＦ ＢＢがなり得る。他の実施形態では、固体支持体上の活性剤は、ＢＭＰポリペプチドを含むことができる。他の活性剤、例えば本明細書に列挙した活性剤のいずれかも、固体支持体上に結合することができる。活性剤は、自家源由来でも同種異系でもよく、または製造してもよい（例えば、組換え技術により）。
【００８３】
数種または多種の活性剤を同じ固体支持体上に結合することができる。例えば、ＢＭＰは、現在市販されているホモ二量体処方より、ヘテロ二量体（即ち、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−７の組合せ）の方が強力であることが一般に認められている。その結果、本明細書に記載のデバイスおよび方法の実施形態のために、活性剤を固体支持体に結合し、続いてＢＭＡから分離した後、再移植を行うことができる。したがって、本デバイスおよび本明細書に記載の方法に採用できる複数の活性剤を使用する可能性に関しては、融通性が加えられている。
【００８４】
幾つかの実施形態では、該デバイスは、移植組成物中の幹細胞を活性化するために、移植組成物を１種または複数の活性剤に選定時間（例えば、２４時間以下および／または本明細書に記載の他の時間）の間、曝露するように適合されている。このようなデバイスは、移植組成物の本明細書に記載の活性剤少なくとも１種とのインキュベーションを可能にし、次いで移植組成物からの活性剤（複数可）の分離を可能にするように適合されている。したがって、移植物材料（例えば、骨移植片代用物）および移植組成物内の幹細胞は、活性剤を除去する間、デバイス中に保持され得る。デバイスの使用によって、活性剤を実質的に含まない移植組成物が産生される。
【００８５】
したがって、該デバイスは、幹細胞および／または骨移植片代用物を活性剤（複数可）から分離する手段を備える。例えば、該デバイスは、幹細胞および／または骨移植片代用物などの大型材料を排除するが、溶液中の活性剤（複数可）は、フィルター材料の通過を可能とすることにより、幹細胞および／または骨移植片代用物を活性剤から分離する、フィルターを備えることができる。移植組成物と活性剤（複数可）とのインキュベーション後、移植組成物および活性剤（複数可）を保持するインキュベーション室から排水し、その室を適当な媒体（例えば、緩衝液、塩水、緩衝塩水、培地）で濯ぐことができる。したがって、該デバイスは、活性化幹細胞を含有し、活性剤（複数可）を実質的に含まない幹細胞組成物（例えば、移植組成物）を産生することができる。
【００８６】
本明細書に記載のデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を制御するために、タイマーを更に備えることができる。例えば、タイマーは、インキュベートするステップ（ｉ）の後に、幹細胞から少なくとも１種の活性剤を分離することを誘発することができる。したがって、例えば、タイマーは、少なくとも１種の活性剤を含有する溶液の排水または除去を開始することができる。それに加え、または代替として、タイマーは、幹細胞および／または骨移植片代用物材料料を洗浄するために、溶液の添加を開始することができる。幾つかの実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を２４時間以下に制御する。他の実施形態では、タイマーを備えたデバイスは、少なくとも１種の活性剤と共に幹細胞をインキュベートする時間を５分間から１時間に制御する。
【００８７】
移植物
一実施形態では、本明細書に記載のように調製した活性化幹細胞（例えば、骨髄穿刺液）は、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）などの合成骨移植片代用物と更に組み合わせて、移植組成物を形成する。一例では、活性化幹細胞（例えば、活性化骨髄穿刺液）と合成骨移植片代用物との複合体が、組織移植片の代わりに使用される。幹細胞は、活性剤（複数可）への曝露によって幹細胞を活性化する前または後のいずれかに、合成骨移植片代用物と組み合わせることができる。しかし、幹細胞は、移植の前に、移植組成物中の幹細胞が活性化幹細胞となるように、活性剤（複数可）に曝露または接触される。
【００８８】
骨移植片代用物は、適切な条件下で生体骨中に配置したとき、または生体骨に並置したとき、骨形成性活性化幹細胞により新骨を形成する足場として役立つ固体材料とすることができる。採用することのできる骨移植片代用物の例は、各々の全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５，３８３，９３１号、第６，４６１，６３２号、第７，０４４，９７２号、第７，４９４，９５０号、および米国特許出願公開第２００６０００８５０４号に記載されている。
【００８９】
骨移植片代用物は、カルシウム塩含有成分を含むことができる。例えば、骨移植片代用物は、リン酸一カルシウム一水和物、α−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、脱灰骨、リン酸ナトリウム塩、および場合によりポリマーを含むことができる。該ポリマーは、吸収性ポリマーでもよい。幾つかの実施形態では、該ポリマーは、繊維長約１５ｍｍ以下、アスペクト比約５０：１から約１０００：１のホモポリマーもしくはコポリマー繊維、または両方を含む（および場合により連続強化繊維も含む）。
【００９０】
該ポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、キサンタンガム、ガーガムおよび／またはアルギネートでもよい。
【００９１】
採用することのできる骨移植片代用物の例には、制限することなく、β−ＴＣＰ（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓ製のｃｈｒｏｎＯＳ）、コラーゲン、バイオガラス（例えば、４５Ｓ５ ＢｉｏＧｌａｓｓ）、ＢｉｏＯｓｓ（リン酸カルシウム系骨移植片代用物）、Ｐｅｐｇｅｎ Ｐ−１５（天然型ヒドロキシアパタイトに結合した合成Ｐ−１５ペプチド）、およびＡｌｌｏＧｒａｆｔ（脱灰骨基質、同種異系移植片主体の骨移植片代用物）が挙げられる。
【００９２】
一般に、活性化幹細胞は、骨移植片代用物とインキュベートまたは混合して、移植組成物を形成する。幾つかの実施形態では、移植組成物はパテであり、他の実施形態では、移植組成物は、注射針の中を流れるのに十分に流動性である。例えば、移植組成物は、約０．３〜約０．０または約０．４１〜約０．５５の液体成分対固体成分の比を有することができる。
【００９３】
別の実施形態には、活性剤と幹細胞源（即ちＢＭＡ）とをエクスビボで短期間（即ち、５分間から６０分間）併用することによる、骨芽細胞経路に沿った幹細胞の刺激が含まれる。エクスビボでのインキュベーション後、幹細胞および活性剤の組合せは、一緒に移植する。
【００９４】
処置の方法
活性化幹細胞および骨移植片代用物を含有する移植組成物は、骨の傷害、障害および状態の修復および処置に有用である。このような骨の傷害、障害または状態は、骨量減少（骨減少症もしくは骨溶解症）、または骨損傷もしくは骨傷害を特徴とする。このような骨の傷害、障害および状態には、それだけに限らないが、骨折、骨欠陥、骨移植、骨移植片、骨癌、関節置換、関節修復、癒合、面修復、骨変性、歯科インプラントおよび修復、疾患（例えば関節炎）が原因の骨欠陥、再建術が原因の骨欠陥、ならびに骨および骨組織に伴う他の状態が挙げられる。骨欠陥の例には、それだけに限らないが、骨における間隙、変形または癒着不能骨折が挙げられる。骨変性の例には、それだけに限らないが、骨減少症または骨粗鬆症が挙げられる。一実施形態では、骨欠陥は小人症が原因である。該組成物は、関節の置換または修復にも有用であり、その場合の関節は、脊椎、膝、股、足根、指、肘、踵、仙腸関節、または他の可動性／非可動性関節である。
【００９５】
移植組成物は、該組成物を骨部位中に押し込むもしくは取り込むことにより、または移植組成物の注入により投与することができる。注入により投与する場合、シリンジは、約１２〜約１８のゲージの針を有し得るが、その際に用いる最大注入圧は、約４０ポンド以下である。一実施形態では、該組成物は連続強化繊維も含む。
【００９６】
以下の非限定的な実施例は、本発明のある種の態様を更に例示する。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
材料および方法
以下の材料および方法を用いて、本発明のある種の態様を展開した。
【００９８】
細胞の分化
継代３回のヒト間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を６×１０４細胞／３５ｍｍウェルの密度で基本培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中に播種し、３７℃で２日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで濯ぎ、新鮮基本培地中の増殖因子（ＦＧＦ−２またはＴＧＦβ３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）１００ｎｇ／ｍｌで１時間活性化し、ＰＢＳで濯ぎ、次いで新鮮基本培地または骨形成分化培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）のいずれか中、３７℃で７〜１４日間インキュベートした。
【００９９】
リアルタイムＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ＫｉｔおよびＱＩＡ ｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各種の活性剤で処理した細胞から調製した。総ＲＮＡは、対照として非処理細胞からも調製した。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ランダムヘキサマー（ｈｅｘａｍｅｒ）およびオリゴｄＴを用いて生成した。リアルタイム用のプライマーおよびプローブのセットは、以下の通りであった。
【０１００】
【化１】
試料は、β２ミクログロブリン内因性対照（ＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ）を用いた多重反応として、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ上で操作した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１０１】
アルカリホスファターゼアッセイ
継代３回のヒト間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を６×１０４細胞／３５ｍｍウェルの密度で基本培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中に播種し、３７℃で２日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで濯ぎ、新鮮基本培地中の増殖因子（ＦＧＦ−２またはＴＧＦβ３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）１００ｎｇ／ｍｌで１時間活性化し、ＰＢＳで濯ぎ、次いで新鮮基本培地または骨形成分化培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）のいずれか中、３７℃で７〜１４日間インキュベートした。アッセイ時に、細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、溶解緩衝液１００μｌ／３５ｍｍウェル中で採集し、液体窒素中で２回凍結／融解した。アルカリホスファターゼ活性は、溶解物２０μｌと１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸２０μｌとの３分間のインキュベーション、および生成した発光の４０５ｎｍでの測定により決定した。アルカリホスファターゼ活性は、ＣｙＱｕａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＤＮＡ定量化で決定した際に、細胞含量に従って正規化した。
【０１０２】
固定化
初期試験のために、活性剤（例えば、増殖因子）を以下の通りマイクロタイターウェル上に固定化した。
【０１０３】
ビオチニル化抗増殖因子抗体（５００ｎｇ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートで、ＰＢＳ２００μｌ／ウェル中で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回濯ぎ、次いでＰＢＳ２００μｌ中で増加していく各量の増殖因子に３０分間結合した。ＰＢＳで３回濯いだ後、増殖因子の存在を、０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳ２００μｌ中で第２の非標識抗増殖因子抗体１μｇと３０分間インキュベーションすることにより、検出した。各ウェルは、ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳ２００μｌ中でホースラディシュペルオキシダーゼ複合第２抗体１μｇと３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回再び濯いだ。次いで、固定化した抗体−増殖因子−第２抗体は、強化化学発光基質２００μｌと１分間インキュベートした。固定化したホースラディシュペルオキシダーゼ複合第２抗体の量の定量化は、可視光波長における化学発光の測定により行った。
【０１０４】
活性アッセイ
幹細胞活性化ステップの前に、繋留活性剤の生物活性を決定するために、以下のアッセイを形成した。ＦＧＦ−２が関わる試験には、Ｓｗｉｓｓ Ａｌｂｉｎｏ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を４×１０５／３５ｍｍウェルの密度で１０％血清基本培地中に播種し、３７℃で１日間インキュベートし、ＰＢＳで３回濯ぎ、次いで３７℃で１日間、０．５％血清基本培地中で同調させた。ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および５０倍過剰量のビオチニル化抗ＦＧＦ２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、０．５％血清基本培地中で１５分間複合させた。同調細胞をＰＢＳで３回濯いだ後、ＦＧＦ２／ビオチニル化抗ＦＧＦ２抗体複合体で３７℃で３０分間処理した。アッセイの終点で、細胞をＰＢＳで３回濯ぎ、ＳＤＳ試料緩衝液中で採集し、９０℃で１０分間加熱した。生成した溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ホスホＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）抗体の１：１００００希釈液、次いでホースラディシュペルオキシダーゼ複合第２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）の１：１００００希釈液で順にプローブした。ホースラディシュペルオキシダーゼの活性は、強化化学発光基質に１分間曝露することにより決定し、ＣＣＤカメラで可視化し、ＩｍａｇｅＪ分析プログラムを用いた濃度測定で定量化した。
【０１０５】
ＴＧＦβ３の活性アッセイには、Ｍｖ１Ｌｕミンク肺細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、９６ウェルプレートで、４×１０３細胞／ウェルの密度で基本培地中に播種し、３７℃で１日間インキュベートした。ＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および５０倍過剰量のビオチニル化抗ＴＧＦβ３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、基本培地中で１５分間複合させた。ＰＢＳで３回濯いだ後、細胞をＴＧＦβ３／ビオチニル化抗ＴＧＦβ３抗体複合体で３７℃で３日間処理した。アッセイ時に、ＴＧＦβ３処理培地をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ＡＴＰ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で補充し、５分間インキュベートし、可視光波長における化学発光の測定により、細胞数を定量化した。
【０１０６】
（実施例２）
結果
初代ヒト間葉幹細胞は、骨芽細胞系統へ分化することができる。これは、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびβ−グリセロリン酸を含有するが、それだけに限らない骨形成混合液中で細胞を培養することにより、インビトロで実証される。こうした培養条件下では、細胞は、骨芽細胞分化マーカー、最も一般的には初期マーカーのアルカリホスファターゼの上方調節を示す。
【０１０７】
図１は、予想通り１０〜１２日目に、非処理間葉幹細胞（丸）のアルカリホスファターゼ活性の僅かな上方調節を示している。しかし、間葉幹細胞をＴＧＦβ３（三角）またはＦＧＦ−２（四角）で１時間、前処理した後、その作用剤を除去し、分化培地中で培養した場合、アルカリホスファターゼ活性のレベルは有意に２〜３倍に増加した。
【０１０８】
こうしたデータは、ＴＧＦβ３またはＦＧＦ−２のいずれかで０日目に間葉幹細胞をほんの１時間処理しただけで、骨芽細胞形成のマーカーが処理から１０日以後に上方調節されるように、骨芽細胞の分化に影響を及ぼせることを示している。
【０１０９】
間葉幹細胞は、インビトロおよびインビボの双方で骨形成タンパク質に応答し、骨芽細胞の表現型を誘導する。ＢＭＰは、３種のサブユニットＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢおよびＢＭＰＲ−ＩＩで構成される受容体複合体を介して作用する。ＭＳＣを選定した活性剤（ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ３およびＦＧＦ−２）で２４時間処理したとき、ＢＭＰＲ−ＩＢ遺伝子の相対的コピー数が、非処理細胞に対して有意に増加した。しかし、図３は、ほんの１時間の処理後に同様な応答が認められたことを示している。
【０１１０】
こうしたデータは、手術中の僅か１時間の時間枠が、ＢＭＰリガンドに対する受容体のレベルが非処理細胞に対して増加できるように、活性剤でＭＳＣを処理するのに十分であることを示す。間葉幹細胞上に増加レベルのＢＭＰ受容体が存在することにより、これらの細胞は、インビボでのＢＭＰ−２の骨形成応答のために増強され、その結果骨治癒がよりロバストになる。
【０１１１】
本明細書で参照または言及した全ての特許および刊行物は、本発明が関わる技術分野の業者の技術水準を示しており、参照した各特許または刊行物は、その全体が個別に参照により組み込まれたとした場合、またはその全体が本明細書に提示されたとした場合と同程度に、参照により本明細書に明確に組み込まれている。出願者らは、引用したこのようないずれの特許または刊行物からも、ありとあらゆる資料および情報を本明細書中に物理的に組み込む権利を留保している。
【０１１２】
本明細書に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表して、例示的であり、本発明の範囲を制限する意図はない。他の目的、態様および実施形態は、本明細書を考慮すれば当業者には思い付くことであると見込まれ、しかも特許請求の範囲に規定されるように、本発明の趣旨内に包含される。様々な置き換えおよび改変が、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに、本明細書に開示した本発明になし得ることは、当業者には容易に明らかとなろう。本明細書に適切に例示的に記載した本発明は、必須のものとして本明細書に具体的に開示されていない、１つもしくは複数の要素または１つもしくは複数の制限が全くない状態で、実施し得る。本明細書に適切に例示的に記載した方法およびプロセスは、ステップの異なる順に実施してもよく、本明細書または特許請求の範囲に示したステップの順に必ずしも制限されない。本明細書または付属する特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に否定されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば「１つの抗体」への言及は、このような抗体の複数（例えば、複数抗体の溶液または一連の抗体調製物）を包含することなどである。本特許は、本明細書に具体的に開示した特定の実施例もしくは実施形態または方法に限定される、と解釈しては決してならない。本特許は、如何なる審査官または特許庁の他の如何なる係官もしくは従業員が行った如何なる言明も、出願者らによる回答文書において具体的に、かつ制限または留保なく明確に採用されていない限り、このような言明に限定されると解釈しては決してならない。
【０１１３】
採用してきた用語および表現は、制限用語ではなく記述用語として使用しており、このような用語および表現の使用には、示し、記載した特徴の任意の同等事項またはその一部を除外する意図はなく、請求したような本発明の範囲内で、多様な改変が可能であると認識している。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示したが、本明細書に開示した概念の改変および変更は、当業者が頼りにし得るものであり、このような改変および変更が、本発明の付属する特許請求の範囲および言明に規定されるように、本発明の範囲内にあると見なされることは、理解されよう。
【０１１４】
本発明を、本明細書に広く、属レベルで説明してきた。属レベルの開示内に入るより狭い種および属未満のグループも、各々本発明の一部をなす。これには、取り除いた主題が本明細書に具体的に言及されているか否かに関わらず、属から任意の主題を取り除く但し書きまたは否定的な制限の付いた、本発明の属レベル記述も含まれる。
【０１１５】
他の実施形態も、以下の特許請求の範囲内に入る。それに加え、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループにより記載されている場合、本発明が、マーカッシュ群の任意の個別構成事項、または構成事項のサブグループによっても記載されることを、当業者は認識されよう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において骨成長を促進するための移植組成物を調製する方法であって、該方法は（ａ）幹細胞を１種または複数の活性剤と２４時間以下の間接触させて、活性化幹細胞を調製するステップ、（ｂ）該活性化幹細胞から該活性剤を分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成するステップ、および（ｃ）活性剤を実質的に含まない該活性化幹細胞集団と骨移植片代用物とを混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進する移植組成物を調製するステップを含み、少なくとも１種の活性剤が、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞への分化を促進する、方法。
【請求項２】
前記幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から１時間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から０．５時間接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児の皮膚、青年の皮膚または血液に由来する、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が、自家、同種異系または異種である、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が、胚性、生後または成体の幹細胞である、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が、間葉幹細胞を含む、請求項１から６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が、自家骨髄穿刺液を含む、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄穿刺液が、手術中に取り出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨髄穿刺液中の細胞が、単離または濃縮される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性剤が、細胞の増殖および／または分化を調節でき、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンド、ホルモンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１０までのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記活性剤が、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１１までのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記活性剤が、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１２までのいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記活性剤が、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含む、請求項１から１３までのいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記活性剤が、ＰＤＧＦを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性剤が、溶液中にある、請求項１から１５までのいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記活性剤が、固体支持体に結合されている、請求項１から１５までのいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記活性剤の少なくとも一部は、ペプチド、抗体、化学架橋剤またはそれらの組合せを介して、固体支持体に結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性化幹細胞が、ろ過、ゲルろ過、接線流ろ過、免疫沈降、免疫吸収、アフィニティクロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、またはそれらの組合せを含む手順によって、前記活性剤から分離される、請求項１から１８までのいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記骨移植片代用物が、カルシウム塩を含む、請求項１から１９までのいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記カルシウム塩が、リン酸一カルシウム一水和物、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、またはそれらの組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記骨移植片代用物が、脱灰骨、リン酸ナトリウム塩、ポリマー、またはそれらの組合せを更に含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、キサンタンガム、ガーガム、アルギネート、またはそれらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記幹細胞においてアルカリホスファターゼおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体サブユニットの発現を増加させる、請求項１から２３までのいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
患者に前記移植組成物を移植するステップを更に含む、請求項１から２４までのいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５までのいずれかの方法により調製された移植組成物。
【請求項２７】
被験体における骨の損傷、障害または状態を処置するための方法であって、該被験体における骨の損傷、障害または状態の部位へ、請求項２６に記載の移植組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記骨の損傷、障害または状態が、骨折、骨欠陥、骨移植、骨移植片、骨癌、関節置換、関節修復、骨癒合、骨面修復、骨変性、歯科インプラント、歯の修復、関節炎、骨再建、またはそれらの組合せを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固体支持体と、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞への分化を促進する少なくとも１種の活性剤とを含む、幹細胞を活性化するためのデバイスであって、（ｉ）該幹細胞を少なくとも１種の該活性剤と共にインキュベートするため、および（ｉｉ）インキュベートするステップ（ｉ）の後、少なくとも１種の該活性剤を該幹細胞から分離するために、適合しているデバイス。
【請求項３０】
少なくとも１種の前記活性剤が、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
少なくとも１種の前記活性剤が、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９または３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
少なくとも１種の前記活性剤が、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含む、請求項２９、３０または３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
少なくとも１種の前記活性剤が、ＰＤＧＦを更に含む、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
少なくとも１種の前記活性剤が、溶液中にある、請求項２９から３３までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３５】
少なくとも１種の前記活性剤が、前記固体支持体に結合している、請求項２９から３３までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３６】
前記固体支持体が、カラムマトリックス材料、フィルター、培養用のプレート、チューブもしくは皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ、ディスク、またはそれらの組合せを含む、請求項２９から３５までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３７】
前記固体支持体が、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、磁気粒子、ニトロセルロース、ガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはそれらの組合せを含む、請求項２９から３６までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３８】
前記固体支持体が、少なくとも１種の前記活性剤を除去するために、親和性マトリックスを含む、請求項２９から３７までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３９】
前記固体支持体が、少なくとも１種の活性剤に結合する、ストレプトアビジン、ビオチン、架橋剤、抗体またはペプチドを含む、請求項２９から３８までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４０】
前記固体支持体が、容器を含む、請求項２９から３９までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４１】
前記固体支持体が、フィルターを含む、請求項２９から４０までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４２】
前記フィルターが、細胞および骨移植片代用物材料を保持するが、少なくとも１種の前記活性剤を通過させる、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
前記フィルターが、少なくとも１種の前記活性剤を保持するが、前記幹細胞を通過させる、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記固体支持体材料が、幹細胞と結合することも、幹細胞に対して有害な相互作用をすることもしない、請求項２９から４３までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４５】
前記幹細胞が、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児の皮膚、青年の皮膚、または血液に由来する、請求項２９から４４までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４６】
前記幹細胞が、間葉幹細胞を含む、請求項２９から４５までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４７】
前記幹細胞が、自家骨髄穿刺液を含む、請求項２９から４６までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４８】
少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を制御するために、タイマーを更に備える、請求項２９から４７までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４９】
前記タイマーが、インキュベートするステップ（ｉ）の後に、前記幹細胞から少なくとも１種の前記活性剤を分離することを誘発する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記タイマーが、少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を２４時間以下に制御する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５１】
前記タイマーが、少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を５分間から１時間に制御する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５２】
前記タイマーが、少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を５分間から０．５時間に制御する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項１】
哺乳動物において骨成長を促進するための移植組成物を調製する方法であって、該方法は（ａ）幹細胞を１種または複数の活性剤と２４時間以下の間接触させて、活性化幹細胞を調製するステップ、（ｂ）該活性化幹細胞から該活性剤を分離して、活性剤を実質的に含まない活性化幹細胞集団を形成するステップ、および（ｃ）活性剤を実質的に含まない該活性化幹細胞集団と骨移植片代用物とを混合することにより、哺乳動物において骨成長を促進する移植組成物を調製するステップを含み、少なくとも１種の活性剤が、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞への分化を促進する、方法。
【請求項２】
前記幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から１時間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞を１種または複数の活性剤と５分間から０．５時間接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児の皮膚、青年の皮膚または血液に由来する、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が、自家、同種異系または異種である、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が、胚性、生後または成体の幹細胞である、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が、間葉幹細胞を含む、請求項１から６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が、自家骨髄穿刺液を含む、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄穿刺液が、手術中に取り出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨髄穿刺液中の細胞が、単離または濃縮される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性剤が、細胞の増殖および／または分化を調節でき、小分子、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、リガンド、ホルモンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１０までのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記活性剤が、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１１までのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記活性剤が、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１２までのいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記活性剤が、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含む、請求項１から１３までのいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記活性剤が、ＰＤＧＦを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性剤が、溶液中にある、請求項１から１５までのいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記活性剤が、固体支持体に結合されている、請求項１から１５までのいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記活性剤の少なくとも一部は、ペプチド、抗体、化学架橋剤またはそれらの組合せを介して、固体支持体に結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性化幹細胞が、ろ過、ゲルろ過、接線流ろ過、免疫沈降、免疫吸収、アフィニティクロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、またはそれらの組合せを含む手順によって、前記活性剤から分離される、請求項１から１８までのいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記骨移植片代用物が、カルシウム塩を含む、請求項１から１９までのいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記カルシウム塩が、リン酸一カルシウム一水和物、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、またはそれらの組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記骨移植片代用物が、脱灰骨、リン酸ナトリウム塩、ポリマー、またはそれらの組合せを更に含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、キサンタンガム、ガーガム、アルギネート、またはそれらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記幹細胞においてアルカリホスファターゼおよび／または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体サブユニットの発現を増加させる、請求項１から２３までのいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
患者に前記移植組成物を移植するステップを更に含む、請求項１から２４までのいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５までのいずれかの方法により調製された移植組成物。
【請求項２７】
被験体における骨の損傷、障害または状態を処置するための方法であって、該被験体における骨の損傷、障害または状態の部位へ、請求項２６に記載の移植組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記骨の損傷、障害または状態が、骨折、骨欠陥、骨移植、骨移植片、骨癌、関節置換、関節修復、骨癒合、骨面修復、骨変性、歯科インプラント、歯の修復、関節炎、骨再建、またはそれらの組合せを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固体支持体と、幹細胞の骨形成原細胞または骨形成前駆細胞への分化を促進する少なくとも１種の活性剤とを含む、幹細胞を活性化するためのデバイスであって、（ｉ）該幹細胞を少なくとも１種の該活性剤と共にインキュベートするため、および（ｉｉ）インキュベートするステップ（ｉ）の後、少なくとも１種の該活性剤を該幹細胞から分離するために、適合しているデバイス。
【請求項３０】
少なくとも１種の前記活性剤が、トランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、インターフェロン、腫瘍壊死因子、神経増殖因子（ＮＧＦ）、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチド、インテグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、骨原性タンパク質、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
少なくとも１種の前記活性剤が、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β３、ＰＳＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６、ＦＧＦ−８、ＩＬ−１１、シンバスタチン、デキサメタゾン、オキシステロール、ソニックヘッジホッグ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２９または３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
少なくとも１種の前記活性剤が、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦｂを含む、請求項２９、３０または３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
少なくとも１種の前記活性剤が、ＰＤＧＦを更に含む、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
少なくとも１種の前記活性剤が、溶液中にある、請求項２９から３３までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３５】
少なくとも１種の前記活性剤が、前記固体支持体に結合している、請求項２９から３３までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３６】
前記固体支持体が、カラムマトリックス材料、フィルター、培養用のプレート、チューブもしくは皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ、ディスク、またはそれらの組合せを含む、請求項２９から３５までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３７】
前記固体支持体が、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、磁気粒子、ニトロセルロース、ガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはそれらの組合せを含む、請求項２９から３６までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３８】
前記固体支持体が、少なくとも１種の前記活性剤を除去するために、親和性マトリックスを含む、請求項２９から３７までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項３９】
前記固体支持体が、少なくとも１種の活性剤に結合する、ストレプトアビジン、ビオチン、架橋剤、抗体またはペプチドを含む、請求項２９から３８までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４０】
前記固体支持体が、容器を含む、請求項２９から３９までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４１】
前記固体支持体が、フィルターを含む、請求項２９から４０までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４２】
前記フィルターが、細胞および骨移植片代用物材料を保持するが、少なくとも１種の前記活性剤を通過させる、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
前記フィルターが、少なくとも１種の前記活性剤を保持するが、前記幹細胞を通過させる、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記固体支持体材料が、幹細胞と結合することも、幹細胞に対して有害な相互作用をすることもしない、請求項２９から４３までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４５】
前記幹細胞が、骨髄、脂肪組織、筋肉組織、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児の皮膚、青年の皮膚、または血液に由来する、請求項２９から４４までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４６】
前記幹細胞が、間葉幹細胞を含む、請求項２９から４５までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４７】
前記幹細胞が、自家骨髄穿刺液を含む、請求項２９から４６までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４８】
少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を制御するために、タイマーを更に備える、請求項２９から４７までのいずれかに記載のデバイス。
【請求項４９】
前記タイマーが、インキュベートするステップ（ｉ）の後に、前記幹細胞から少なくとも１種の前記活性剤を分離することを誘発する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記タイマーが、少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を２４時間以下に制御する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５１】
前記タイマーが、少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を５分間から１時間に制御する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５２】
前記タイマーが、少なくとも１種の前記活性剤と共に前記幹細胞をインキュベートする時間を５分間から０．５時間に制御する、請求項４８に記載のデバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５０７２８５（Ｐ２０１２−５０７２８５Ａ）
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３４５２０（Ｐ２０１１−５３４５２０）
【出願日】平成２１年１０月３０日（２００９．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５９１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５１０３２
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０８１１１２７９）シンセス ゲーエムベーハー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月３０日（２００９．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５９１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５１０３２
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０８１１１２７９）シンセス ゲーエムベーハー (9)
【Ｆターム（参考）】
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