微小胞膜タンパク質及びその応用
【課題】新規な微小胞膜タンパク質及びその利用、微小胞の分離、分析、又は病気の診断や治療に結びつけるためのリン酸化ＣＳＥ１Ｌ（細胞アポトーシス感受性タンパク質）又はＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法を提供する。
【解決手段】細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＳＥ１Ｌ）に対する抗体、又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体。抗体が、リン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体。（ａ）被験体からテスト生体液サンプルを得る工程；（ｂ）１以上の健常者からコントロールサンプルを得る工程；（ｃ）テスト生体液サンプル及びコントロールサンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体と接触させる工程；（ｄ）テスト生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；及び（ｅ）コントロールサンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；を含む被験体の癌を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【解決手段】細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＳＥ１Ｌ）に対する抗体、又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体。抗体が、リン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体。（ａ）被験体からテスト生体液サンプルを得る工程；（ｂ）１以上の健常者からコントロールサンプルを得る工程；（ｃ）テスト生体液サンプル及びコントロールサンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体と接触させる工程；（ｄ）テスト生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；及び（ｅ）コントロールサンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；を含む被験体の癌を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１１年８月１８日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０１１／０７８５５９号の優先権を主張するもので、その公開された全ての記載を包含するものである。
【０００２】
本発明は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌとその応用に関するものであり、特に、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）の単離、分析、又は病気の診断や治療へ結びつけることである。
【背景技術】
【０００３】
これまでの研究は、微小胞（微粒子）が、細胞の中のプロテアーゼ、ｍＲＮＡｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、膜受容体、細胞小器官を含む細胞活性分子の移動によって、細胞間連絡に関与しており、その結果、癌の転移を含む様々な病気の進行を含む基礎生理学的役割を果たしていることを示している（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。微小胞は、潜在的なバイオマーカーとして挙げられることが増えてきていることから、多くの関心が微小胞に寄せられている。微小胞は、小さな細胞膜由来の粒子で、外に向かっての出芽や細胞膜分裂によって細胞外環境に放出される。微小胞の大きさは、典型的には、１００ｎｍ〜１５μｍといわれている（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。微小胞の発生／排出は、腫瘍に生じる共通の特徴である（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； ｖａｎ Ｄｏｏｒｍａａｌ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。腫瘍から放出された微小胞は、ＥＣＭ−分解プロテアーゼが豊富で、その結果、癌細胞の浸潤や転移に大きな役割を果たす（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）は、腫瘍浸潤において微小胞の排出を媒介することが分かっている（Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。
【０００４】
ＣＳＥ１Ｌ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ １−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＣＡＳ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ：細胞アポトーシス感受性タンパク質、ジーンバンクＮｏ．３３２８６）とも呼ばれているが、癌の中で高く発現しており、癌侵潤や癌転移に関係している（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９５； Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｔａｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ＣＳＥ１Ｌは、すでに細胞チロシンリン酸化タンパク質、つまり、ＭＥＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ又は細胞外シグナル調整キナーゼ）によってリン酸化したタンパク質として知られている。そして、これはＣＳＥ１Ｌの核移動に関係している（Ｓｃｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【０００５】
ＥＲＫシグナル伝達経路は、癌細胞の増殖、生存、浸潤及び転移に関与している（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＥＲＫ経路の異常活性化は、ヒト腫瘍の多くの種類に共通した基本的な特徴であることが明らかになっている（Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。Ｒａｓ−ＥＲＫ経路は、癌治療用の分子標的薬の開発の潜在的標的である（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。
【０００６】
ＵＳ６６６４０５７は、癌に関係しているヒト染色体２０ｑ１３．２における新規の単位複製配列の識別を開示している。ＵＳ６０７２０３１は、細胞アポトーシス感受性タンパク質のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が、正常細胞及び癌細胞にあるＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現と増幅の検出に用いられることが開示されている。生きている細胞に導入されたアンチセンスＣＳＥ１Ｌ遺伝子配列は、ＣＳＥ１Ｌタンパク質の活性化を阻害するため、細胞のアポトーシスを防止又は阻害する。ＵＳ５７５９７８２は、細胞アポトーシス感受性タンパク質のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が、正常細胞及び癌細胞にあるＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現と増幅の検出に用いられることが開示されている。生きている細胞に導入されたアンチセンスＣＳＥ１Ｌ遺伝子配列は、ＣＳＥ１Ｌタンパク質の活性化を阻害するため、細胞のアポトーシスを防止又は阻害する。ＵＳ６２０７３８０は、尿路組織のポリペプチドとポリヌクレオチドの分析が、各個人に対する尿路の病気及び状況の素因の測定、検出、診断、進行具合の診断、監視、予測、生体内撮像、予防又は治療に有用であることを開示している。これらの配列は、ケラチン／サイトケラチン、ＣＳＥ１Ｌ、又はｍａｔ−８ ポリペプチド及びポリヌクレオチド由来である。ＵＳ６，２０７，３８０は、尿路組織中のケラチン/サイトケラチン、ＣＳＥ１Ｌ、又はｍａｔ−８にコードされたポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体を開示しており、それら分子は、尿路疾患の治療に有用である。つまり、ＵＳ６，２０７，３８０は、尿路疾患の治療のため、尿路組織中のケラチン/サイトケラチン、ＣＳＥ１Ｌ、又はｍａｔ−８に特異的に結合する抗体の使用を開示している。ＵＳ６２３２０８６は、正常細胞及び癌細胞にあるＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現と増幅の検出に用いることができるＣＳＥ１Ｌタンパク質のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を開示している。ＵＳ６１５６５６４は、ヒトの増殖細胞の検出方法を開示しており、その方法は、ヒト細胞サンプル中のヒトＣＳＥ１Ｌタンパク質のレベルの測定及び通常の非増殖ヒト細胞中のヒトＣＳＥ１Ｌタンパク質レベルより少なくとも２倍のレベルのヒトＣＳＥ１Ｌタンパク質の検出を含んでいる。ＵＳ６４４０７３７は、ヒトＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現を調整するためのアンチセンス化合物、組成物及び方法を開示している。ＵＳ２００８００８１３３９は、前立腺癌診断のためのバイオマーカーとして、体液中に存在するＣＳＥ１Ｌ自己抗体（抗原又は腫瘍関連マーカーではない。）を含む多くの自己抗体の測定について開示している。ＵＳ２００５０２６０６３９は、膵臓癌の検出及び診断のため、体液又は体細胞から単離された循環腫瘍細胞中のＣＳＥ１Ｌを含む、膵臓癌関連遺伝子の発現レベルを測定することが開示されている。ＷＯ２００９／０５２５７３は、ｃＤＮＡ遺伝子チップの結果に基づき、消化管癌の腺腫状況の発現を分析するため、血中サンプル又は細胞の循環腫瘍細胞からＣＳＥ１Ｌ転写物（例えば、ＣＳＥ１Ｌ ｍＲＮＡ）を含む多くのＲＮＡ転写物を単離することが開示している。ＵＳ２０１００１２００７４は、転移性癌診断のため、体液中のＣＳＥ１Ｌ又はＣＳＥ１Ｌタンパク質レベルの測定について開示している。ＵＳ２０１１００５３１５７は、医学的疾患及び状況の診断、予後及び治療のため、微小胞（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）中のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びミクロＲＮＡを含む核酸の測定を開示している。ＵＳ２０１１００５３１５７は、被験体からの生物学サンプルから単離された微小胞のＤＮＡ又はＲＮＡバイオマーカーを検出することによって、被験体の疾病その他の医学的状況の診断、予後、監視及び評価を助ける方法；核酸又はタンパク質を含む微小胞を投与することで前記核酸又はタンパク質をターゲットへ伝達する方法；微小胞フリー又は微小胞が濃縮された液体画分を患者に導入することで体液輸注を行う方法、を開示している。ＷＯ２００９０２１３２２及びＵＳ２０１００２５５５１４は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＥＴ、ｃＫｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ｗｎｔ、βカテニン、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、及び微小胞のＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−１及びＣＤ２７６等の癌に関連する細胞の受容体を構成する発癌性タンパク質を検出することによって、癌の診断及び予後の方法、癌の進行及び又は被検者中の抗癌治療の治療効果の監視方法を開示している。上記先行技術は、細胞レベルでのＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現、又は体液中のＣＳＥ１Ｌタンパク質レベルを検出している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の観点は、微小胞の単離、分析、又は病気の診断や治療へ結びつけるため、ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体を含む新規な方法を提供することである。本発明の一つの観点は、被験体の疾患の存在又は進行状況の診断方法を提供することで、該方法は、（ａ）被験体からの生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；（ｂ）コントロールとして、健常者ドナーからの生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；及び（ｃ）被験体及び健常者ドナーの生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルの差異に基づき被験体の疾患の存在又は進行状況の診断、することを含んでいる。
【０００８】
本発明の他の観点は、被験体の癌の存在又は進行状況の診断方法を提供することで、該方法は、（ａ）被験体からの生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；（ｂ）コントロールとして、健常者ドナーからの生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；及び（ｃ）被験体及び健常者ドナーの生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルの差異に基づき被験体の癌の存在又は進行状況の診断、することを含んでいる。
【０００９】
本発明の更に他の観点は、生体液サンプルから微小胞を単離する方法を提供することで、該方法は、（ａ）生体液サンプルをＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体に接触、；（ｂ）抗体と結合した微小胞を単離、することを含んでいる。
【００１０】
本発明の更なる他の観点は、生体液サンプル中の微小胞の存在を検出する方法を提供することで、該方法は、（ａ）生体液サンプルをＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体に接触；（ｂ）微小胞への抗体結合を検出、することを含んでいる。
【００１１】
本発明の他の観点は、病気の予防又は治療のため、微小胞に結合するＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体の管理を含む方法を提供することである。特に望ましい病気は癌である。
【００１２】
本発明の他の観点は、病気の診断又は治療のため、微小胞に結合するＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体を含む医薬組成物を提供することである。特に望ましい病気は癌である。
【００１３】
本発明の他の目的、特徴及び効果は、発明の詳細な説明及び図面から、当業者であれば明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞中のＲａｓ及びＣＳＥ１Ｌレベルの免疫ブロット法による解析結果を示している。
【図２】図２は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションが、細胞中の微小胞の発生を誘導することを示している。
【図３】図３は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションが、ＣＳＥ１Ｌ分泌物を増加することを示している。
【図４】図４は、ＣＳＥ１Ｌは、リン酸化タンパク質であることを示している。
【図５】図５は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションが、ＣＳＥ１Ｌのリン酸化を増加し、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは癌血清中に存在していることを示している。
【図６】図６は、結腸直腸中のリン酸ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌの高い発現、及びリン酸ＥＲＫの相対染色度が腫瘍中のＣＳＥ１Ｌと一致することを示している。
【図７】図７は、ＣＳＥ１Ｌが、細胞のｖ−Ｈ−ｒａｓ−誘発の微小胞発生を媒介することを示している。
【図８】図８は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓによって誘発された腫瘍細胞の浸潤を媒介することを示している。
【図９】図９は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓ誘発癌細胞の転移を媒介することを示している。
【図１０】図１０は、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞膜に局在し、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は腫瘍を標的にすることができることを示している。
【図１１】図１１は、抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌと反応することを示している。
【図１２】図１２は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、微小胞に局在することを示している。
【図１３】図１３は、癌血清サンプルから単離された微小胞には、通常細胞から単離された微小胞より、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率が高いことを示している。
【図１４】図１４は、結腸直腸癌患者の血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率が高いことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
微小胞（微粒子又はエキソソームと呼ばれることもある)は、細胞から剥がれた原形質膜の断片である。微小胞は、体液や細胞培養中に見られる。微小胞は、体液中又は細胞培養馴化培地に、自由な微小胞として放出されることができる;微小胞はまた、放出されずに、細胞膜結合微小胞として、細胞膜に連結していてもよい（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ここで述べられる方法及び組成物は、自由な微小胞にも、細胞膜結合微小胞にも適用可能である。典型的な微小胞は、１００ｎｍ〜１５μｍである。ここで述べられる方法及び組成物は、全てのサイズの微小胞に適用可能である。
【００１６】
本発明の一つの観点は、ＣＳＥ１Ｌが微小胞の作成を媒介すること、ＣＳＥ１Ｌが微小胞膜に局在すること、ＣＳＥ１Ｌがセリン／スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質であること、及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌが癌患者の血清中に存在すること、を新たに見出したことに基づいている。
【００１７】
本発明の他の新知見は、ＣＳＥ１ＬがＥＲＫ伝達経路に連鎖していること、ＣＳＥ１ＬがＥＲＫ活性化でリン酸化されること、リン酸化されたＣＳＥ１Ｌが癌患者の血清に存在すること、血清中のリン酸化されたＣＳＥ１Ｌの分析は、血清中のＣＳＥ１Ｌの分析より、癌診断に優れていることである（実施例１４）。ＥＲＫ経路の異常活性化は、ヒト腫瘍の多くに共通する本質的な特徴である（Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。それ故、血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのレベルは、健常者ドナーと比較して、癌患者の方が必ず高い。また、血清中のリン酸化されたＣＳＥ１Ｌの分析は、血清中のＣＳＥ１Ｌの分析より感度が高い為、癌診断に優れている。このように、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、癌診断において臨床的有用性がある。
【００１８】
本発明の他の新知見は、ＣＳＥ１ＬがＲａｓ−ＥＲＫ伝達及び癌転移に関連していることである。Ｒａｓ−ＥＲＫ経路は、癌の分子標的薬の開発の潜在的標的である（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＣＳＥ１ＬがＲａｓ−ＥＲＫ伝達及び癌転移に関連している。そして、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、癌患者の血清中に存在している。それ故、血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、分子標的薬の治療と併用して、患者の選定、監視及び管理のための臨床的有用性がある。
【００１９】
本発明の他の新知見は、ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在し、そして、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は、腫瘍を標的とすることができることである。脱落中の微小胞は腫瘍細胞の膜上に広がっており、脱落した微小胞は腫瘍細胞の周囲の細胞外環境に留まる。それ故、微小胞膜タンパク質は、癌治療の潜在的標的となり得る。したがって、微小胞膜中のＣＳＥ１Ｌの局在は、ＣＳＥ１Ｌは癌の治療標的になり得る。
【００２０】
本発明のある観点は、微小胞が腫瘍細胞から放出され、体液中を循環していることを見出したことに基づいている。微小胞の数は、腫瘍の成長に伴い増加する。体液中の微小胞の濃度は、腫瘍量に比例する。腫瘍量が多くなれば、体液中の微小胞の濃度も高くなる。
【００２１】
本発明の他の驚くべき発見は、通常の被験体（健常者ドナー）の体液中にはＣＳＥ１Ｌが存在するが、癌患者の体液中にはリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在することである。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、通常の被験体（健常者ドナー）の体液中には検出されない（実施例５）。もし、タンパク質が細胞から分泌され、タンパク質がリン酸化形態と脱リン酸化形態を持つなら、タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化の両方の形態は、細胞外に分泌される必要は無いと報告されている（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９９４； Ｆｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． １９９７）。それ故、本発明の他の驚くべき発見は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは分泌タンパク質で、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは癌患者の体液中には存在するが、健常者ドナーの体液中には検出されないことである。
【００２２】
本発明のある観点は、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、微小胞膜タンパク質であるとの他の驚くべき発見に基づいている。
【００２３】
本発明の他の観点は、体液からの微小胞の単離又は分析のための方法又はキットに関し、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜タンパク質であるとの知見に基づく。そして、微小胞は、多くの病気の進行を含め、生理学的/病理学的に本質的な役割を果たす。ＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法又はキットは、体液又は培養馴化培地等の生物学的サンプルからの微小胞の捕獲、精製、単離又は分析に用いることができる。微小胞の単離又は分析のためのＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法又はキットは、例えば、超遠心分離、免疫沈降、親和性精製、精密ろ過、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ），酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ）、マイクロアレイ、バイオチップ、クロマトグラフィー、ウエスタンブロット法、マイクロ流体システム、マイクロ流体チップ、及び免疫学的結合を含む他の技術にも適用可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施例は、微小胞の検出又は分析は、光学的方法を用いて実施され、あらゆる光学的方法が用いられる。好ましい光学的方法は、顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、内部反射蛍光顕微鏡法、偏光解析法/反射率測定法、光散乱又は表面プラズモン顕微鏡法が挙げられる。
【００２５】
本発明のある観点は、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、微小胞膜タンパク質であり、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体等のＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤は、実施例１０に示されているように、腫瘍を標的とすることができるとの驚くべき発見に基づいている。
【００２６】
ＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法又はキットは、治療薬又は細胞毒性薬で接合し、ＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む医薬組成物又はキットも、同様に、病気治療に用いられる。
【００２７】
本発明の一つの観点は、生物学的サンプルからの液体又は微小胞の中のＣＳＥ１Ｌ量又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ量を測定することで、被験体の病気を診断又は監視するための方法又はキットに関する。決定は、最初に微小胞を単離することなく、又は最初に微小胞を単離した生物学的サンプルを用いて行うことができる。
【００２８】
本発明の他の観点は、被験体の体液から微小胞を単離するステップ、微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌを分析するステップを含む、被験体の病気又は他の医学的状態の診断又は監視をするための方法又はキットに関する。ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、定量的及び／又は定性的に分析され、分析結果は、病気又は医学的状態を有する又は有しない１以上のコントロール検体から得られる結果と比較される。被験体の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又は微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの含有量を、コントロールの含有量と比較して差異がある場合は、被験体の進行（例えば、腫瘍サイズ及び腫瘍悪性度の変化）、病気又は他の医学的状態の感受性の有無を示す。
【００２９】
本発明の他の観点は、被験体の体液を収集するステップ、体液中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌを分析するステップを含む、被験体の病気又は他の医学的状態の診断又は監視をするための方法又はキットに関する。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、定量的及び／又は定性的に分析され、分析結果は、病気又は医学的状態を有する又は有しない１以上のコントロール検体から得られる結果と比較される。被験体のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの含有量を、コントロールの含有量と比較して差異がある場合は、被験体の進行（例えば、腫瘍サイズ及び腫瘍悪性度の変化）、病気又は他の医学的状態の感受性の有無を示す。
【００３０】
微小胞は、例えば、凝固疾患、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、糖尿病、血液病、炎症性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、伝染性疾患及び癌等、多くの病気の進行を含め、生理学的/病理学的に本質的な役割を果たす（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６）。本発明における疾患又は他の医学的状態には、凝固疾患、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、糖尿病、血液病、炎症性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、伝染性疾患及び癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明は、癌の診断及び治療方法についても開示する。動物の“癌”とは、癌を引き起こす細胞に典型的な特性を所有する細胞が存在することを意味し、例えば、コントロールできない増殖、不死、転移能、急激な成長及び増殖、並びに、ある特有の形態学的状態及び細胞マーカーが挙げられる。状況によっては、癌細胞は腫瘍の形態であるが、癌細胞は動物内で単独で存在、又は白血病細胞のように独立した細胞として血流中を循環している場合もある。本発明の癌は、全ての種類の癌を含むものであり、例えば、肺癌(非小細胞肺癌等)、結腸直腸癌、大腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び胃癌等の消化器及び胃腸の癌；食道癌;胆嚢癌;肝臓癌; 膵（臓）癌;虫垂癌;乳癌;卵巣癌;腎（臓）癌(例えば、腎細胞癌);中枢神経系癌;皮膚癌；リンパ腫;絨毛腫；絨毛癌；頭頸部癌;骨肉腫;血液癌等が挙げられる。本発明における“腫瘍”は、１以上の癌の細胞を含むことを意味する。
【００３２】
本発明は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質を特異的に認識する抗体の結合による、リン酸化ＣＳＥ１Ｌの検出を開示する。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、セリンリン酸化ＣＳＥ１Ｌ、スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌ、又はチロシンリン酸化ＣＳＥ１Ｌであってもよい。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ′抗体、（Ｆａｂ′）２抗体、又は完全ヒト抗体が挙げられる。
【００３３】
本発明の“生体液サンプル”とは、被験体の体の任意の場所から採取された液体のサンプルを意味し、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、髄液、唾液、胸膜液、細針吸引物、乳頭吸引液、呼吸器官・腸・尿生殖路の液、母乳、涙液、唾液、リンパ系の液、精液、内臓系の液、脳脊髄液、腹水、羊水、腫瘍嚢胞液等が挙げられる。“生体液サンプル”には、培養馴化培地及び培養馴化培地中の細胞が挙げられる。特に好ましい生体液サンプルは、血液、尿、馴化培地である。生体液サンプル中の微小胞は、生体液サンプル中に存在する細胞の膜に関連する微小胞を意味する。馴化培地とは、ボトルから出したばかりの培地ではなく、細胞がしばらくの間培養された培地を意味する。
【００３４】
"被験体"との用語は、微小胞を有する可能性のある全ての動物を意味する。動物は哺乳類を含み、好ましくはヒトである。
【００３５】
“通常の被験体”とは、癌又は他の病気が無い被験体を意味する。
【００３６】
“テスト”被験体は、テストされる被験体を意味する。
【００３７】
“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”との用語は、生命体又は生体の外部環境を意味し、通常は、試験管培養等の人工的な環境が挙げられる。
【００３８】
“医学的状態”との用語は、生命体の体内の病気の状態を意味する。
【００３９】
“免疫学的技術”とは、抗体に基づいた検出技術を含む全ての分析を意味し、例えば、ドットプロット法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、直接及び競合ＥＬＩＳＡ法、放射性免疫分析法等の技術が挙げられる。
【００４０】
ドットプロット法は、先ず、サンプルが、ペーパー、ガラスファイバー、プラスチックシート上に付着、固定され、次いで、タンパク質の存在が、例えば、直接又は間接的にラベルされた抗体とのハイブリダイゼーション等、可視化シグナルを作成する多様な方法で決定される分析手順のことを意味する。
【００４１】
“抗体”との用語は、（ａ）免疫グロブリンポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドの免疫学的有効性分（例えば、免疫グロブリンファミリーのペプチド、又はそれら断片で、それらは、特異抗原（例えば、ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ）に免疫学的に結合する抗原結合部位）、又は（ｂ）そのような免疫グロブリンポリペプチド又は抗原（例えば、ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ）に免疫学的に結合する断片の特徴を保持した置換誘導体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を意味する。
【００４２】
抗体は、従来から知られている方法により作成され、例えば、モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、ファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせ等を含む広く知られた技術から調整することができる。
【００４３】
微小胞とＣＳＥ１Ｌ抗体又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体との結合反応は、免疫測定法により検出することができる。典型的な免疫測定法は、微小胞又は抗体が固定化され、未反応成分が除去された後、検出が行われる。細胞、微小胞又は抗体の固定化方法は知られており、例えば、それらは、化学結合又は物理的吸着により固相の上に直接固定化される。あるいは、本発明の抗体がビオチン化される時、アビジン、ストレプトアビジン、又は同種のものを吸着した固相上に、間接的に抗体を固定することも可能である。抗体が磁性粒子に結合している時は、抗体のみならず、抗体に結合している微小胞は、磁石を用いて速やか且つ簡単に検出及び分離される。あるいは、多特異的な抗体のように、多重抗原を認識する抗体を使用した時、抗体は、微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに結合し、そして、他の抗原は抗体に結合することができる。あるいは、抗体は、タンパク質Ａ又はＧ又は同種のものを介して固相上に固定化される。
【００４４】
抗体の固定化のタイミングは特に限定はされず、抗体がサンプルに接触する前、後、又は同時に固定化される。任意の固相が、抗体の固定化に用いられる。それら固相は、膜形成性の、微粒子状の、又は繊維状のキャリヤで、それらは、ガラス；ポリスチレン等の有機ポリマー；及びシリカゲル、アルミナ及び活性炭等の無機材料から作成される。例えば、本発明の抗体は、プレート、皿、試験管又はビーズのような反応容器の内壁上に固定される。
【００４５】
微小胞を検出するための本発明の抗体を用いた微小胞の検出又は定量するための免疫学的方法は、例えば、蛍光抗体法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ ｅｄ． （１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）、ＥＬＩＳＡｓ、ＲＩＡｓ、免疫細胞学的染色及び免疫組織学的染色等の免疫組織化学的染色（ｔｈｅ ＡＢＣ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＣＳＡ ｍｅｔｈｏｄ； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ ｅｄ． （１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明において、“平均値”とは、一つ以上のサンプル中に存在するＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌのレベル又は濃度を決定することで計算し、次いで、レベルの平均値を計算することで求められるものである。平均値は、複数の個々の値を合計し、次いで、複数の数で割ることで求められる。本発明において、“微小胞のＣＳＥ１Ｌの平均量”とは、1以上のコントロール生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌタンパク質の平均含有量を意味する。本発明において、“微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量”とは、1以上のコントロール生体液サンプル中の微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質の平均含有量を意味する。本発明において、“コントロール生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量”とは、1以上のコントロール生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質の平均含有量を意味する。本発明において、“増加量（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｏｕｎｔ）”とは、コントロールサンプルと比較して、テストサンプルの量でプラスに増加した量を意味する。増加は、典型的には少なくとも１０％以上で、又は少なくとも２０％以上、又は５０％、１００％、２倍、少なくとも５倍、１０倍、２０倍であってもよい。
【００４７】
本発明における“カットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｏｒ ｃｕｔ−ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）”とは、疾患や病態を患っている被験体を、疾患や病態を患っていない被験体から区別する閾値を意味する。カットオフ値は、診断ツールとして利用される統計的に求められた最適数値で、試験値の手段及び標準偏差（ＳＤ）は、患者のカテゴリーから読み出されたグループ値から計算される。患者の試験値がこのカットオフ値より低い時は、患者は陰性（癌が無い）で、試験値がカットオフ値より大きい又は等しい時は、患者は陽性（癌がある）と考えられる。
【００４８】
本発明の“医薬組成物”とは、１以上の製剤原料及び添加剤との混合物を意味する。
【００４９】
本発明の“医薬品賦形剤、希釈剤又はキャリヤ”は、一般的な医薬品賦形剤、希釈剤又はキャリヤを含み、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油の乳液、及び多様なタイプの湿潤剤が挙げられる。また、この用語は、ＵＳ連邦政府の規制当局が認可している又はヒトを含む動物に使用可能であるとして米国薬局方が公表している物質を含む。
【００５０】
本発明における“キット”は、使用されるためにパッケージされている化合物、組成物、混合物、計器、装置を含む、1以上のアイテムを意味するが、これらに限定されるものではない。キットには、説明書が含まれていてもよい。
【００５１】
本発明において、他の特定されていない技術又は科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者が一般的に理解する意味と同様である。本発明で述べられている方法及び材料に類似した全ての方法及び材料も、本発明において使用することができ、その中で、特に好ましい方法及び材料が以下に記載されている。ここに使用されるように、用語の各々は、このセクションの中で関連する意味を有する。本発明は、特別な手順、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、変更できるものである。また、ここに使用される専門用語は、特別の実施例について記載するためにのみ用いられており、本発明の範囲を制限するものではない。発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義される。
【００５２】
タンパク質及びその遺伝子は周知である。ＣＳＥ１Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ３３２８６）は以下のとおりである。
SEQ ID NO: 1
1 gtcgcgccat tttgccgggg tttgaatgtg aggcggagcg gcggcaggag cggatagtgc
61 cagctacggt ccgcggctgg ggttccctcc tccgtttctg tatccccacg agatcctata
121 gcaatggaac tcagcgatgc aaatctgcaa acactaacag aatatttaaa gaaaacactt
181 gatcctgatc ctgccatccg acgtccagct gagaaatttc ttgaatctgt tgaaggaaat
241 cagaattatc cactgttgct tttgacatta ctggagaagt cccaggataa tgttatcaaa
301 gtatgtgctt cagtaacatt caaaaactat attaaaagga actggagaat tgttgaagat
361 gaaccaaaca aaatttgtga agccgatcga gtggccatta aagccaacat agtgcacttg
421 atgcttagca gcccagagca aattcagaag cagttaagtg atgcaattag cattattggc
481 agagaagatt ttccacagaa atggcctgac ttgctgacag aaatggtgaa tcgctttcag
541 agtggagatt tccatgttat taatggagtc ctccgtacag cacattcatt atttaaaaga
601 taccgtcatg aatttaagtc aaacgagtta tggactgaaa ttaagcttgt tctggatgcc
661 tttgctttgc ctttgactaa tctttttaag gccactattg aactctgcag tacccatgca
721 aatgatgcct ctgccctgag gattctgttt tcttccctga tcctgatctc aaaattgttc
781 tatagtttaa actttcagga tctccctgaa ttttgggaag gtaatatgga aacttggatg
841 aataatttcc atactctctt aacattggat aataagcttt tacaaactga tgatgaagag
901 gaagccggct tattggagct cttaaaatcc cagatttgtg ataatgccgc actctatgca
961 caaaagtacg atgaagaatt ccagcgatac ctgcctcgtt ttgttacagc catctggaat
1021 ttactagtta caacgggtca agaggttaaa tatgatttgt tggtaagtaa tgcaattcaa
1081 tttctggctt cagtttgtga gagacctcat tataagaatc tatttgagga ccagaacacg
1141 ctgacaagta tctgtgaaaa ggttattgtg cctaacatgg aatttagagc tgctgatgaa
1201 gaagcatttg aagataattc tgaggagtac ataaggagag atttggaagg atctgatatt
1261 gatactagac gcagggctgc ttgtgatctg gtacgaggat tatgcaagtt ttttgaggga
1321 cctgtgacag gaatcttctc tggttatgtt aattccatgc tgcaggaata cgcaaaaaat
1381 ccatctgtca actggaaaca caaagatgca gccatctacc tagtgacatc tttggcatca
1441 aaagcccaaa cacagaagca tggaattaca caagcaaatg aacttgtaaa cctaactgag
1501 ttctttgtga atcacatcct ccctgattta aaatcagcta atgtgaatga atttcctgtc
1561 cttaaagctg acggtatcaa atatattatg atttttagaa atcaagtgcc aaaagaacat
1621 cttttagtct cgattcctct cttgattaat catcttcaag ctggaagtat tgttgttcat
1681 acttacgcag ctcatgctct tgaacggctc tttactatgc gagggcctaa caatgccact
1741 ctctttacag ctgcagaaat cgcaccgttt gttgagattc tgctaacaaa ccttttcaaa
1801 gctctcacac ttcctggctc ttcagaaaat gaatatatta tgaaagctat catgagaagt
1861 ttttctctcc tacaagaagc cataatcccc tacatcccta ctctcatcac tcagcttaca
1921 cagaagctat tagctgttag taagaaccca agcaaacctc actttaatca ctacatgttt
1981 gaagcaatat gtttatccat aagaataact tgcaaagcta accctgctgc tgttgtaaat
2041 tttgaggagg ctttgttttt ggtgtttact gaaatcttac aaaatgatgt gcaagaattt
2101 attccatacg tctttcaagt gatgtctttg cttctggaaa cacacaaaaa tgacatcccg
2161 tcttcctata tggccttatt tcctcatctc cttcagccag tgctttggga aagaacagga
2221 aatattcctg ctctagtgag gcttcttcaa gcattcttag aacgcggttc aaacacaata
2281 gcaagtgctg cagctgacaa aattcctggg ttactaggtg tctttcagaa gctgattgca
2341 tccaaagcaa atgaccacca aggtttttat cttctaaaca gtataataga gcacatgcct
2401 cctgaatcag ttgaccaata taggaaacaa atcttcattc tgctattcca gagacttcag
2461 aattccaaaa caaccaagtt tatcaagagt tttttagtct ttattaattt gtattgcata
2521 aaatatgggg cactagcact acaagaaata tttgatggta tacaaccaaa aatgtttgga
2581 atggttttgg aaaaaattat tattcctgaa attcagaagg tatctggaaa tgtagagaaa
2641 aagatctgtg cggttggcat aaccaactta ctaacagaat gtcccccaat gatggacact
2701 gagtatacca aactgtggac tccattatta cagtctttga ttggtctttt tgagttaccc
2761 gaagatgata ccattcctga tgaggaacat tttattgaca tagaagatac accaggatat
2821 cagactgcct tctcacagtt ggcatttgct gggaaaaaag agcatgatcc tgtaggtcaa
2881 atggtgaata accccaaaat tcacctggca cagtcacttc acatgttgtc taccgcctgt
2941 ccaggaaggg ttccatcaat ggtgagcacc agcctgaatg cagaagcgct ccagtatctc
3001 caagggtacc ttcaggcagc cagtgtgaca ctgctttaaa ctgcattttt ctaatgggct
3061 aaacccagat ggtttcctag gaaatcacag gcttctgagc acagctgcat taaaacaaag
3121 gaagttttcc ttttgaactt gtcacga
【００５３】
ＣＳＥ１Ｌタンパク質（タンパク質ＩＤ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ５０３６７．１）のアミノ酸配列は以下のとおりである。
SEQ ID NO: 2
MELSDANLQTLTEYLKKTLDPDPAIRRPAEKFLESVEGNQNYPL
LLLTLLEKSQDNVIKVCASVTFKNYIKRNWRIVEDEPNKICEADRVAIKANIVHLMLS
SPEQIQKQLSDAISIIGREDFPQKWPDLLTEMVNRFQSGDFHVINGVLRTAHSLFKRY
RHEFKSNELWTEIKLVLDAFALPLTNLFKATIELCSTHANDASALRILFSSLILISKL
FYSLNFQDLPEFWEGNMETWMNNFHTLLTLDNKLLQTDDEEEAGLLELLKSQICDNAA
LYAQKYDEEFQRYLPRFVTAIWNLLVTTGQEVKYDLLVSNAIQFLASVCERPHYKNLF
EDQNTLTSICEKVIVPNMEFRAADEEAFEDNSEEYIRRDLEGSDIDTRRRAACDLVRG
LCKFFEGPVTGIFSGYVNSMLQEYAKNPSVNWKHKDAAIYLVTSLASKAQTQKHGITQ
ANELVNLTEFFVNHILPDLKSANVNEFPVLKADGIKYIMIFRNQVPKEHLLVSIPLLI
NHLQAGSIVVHTYAAHALERLFTMRGPNNATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKALTLPGS
SENEYIMKAIMRSFSLLQEAIIPYIPTLITQLTQKLLAVSKNPSKPHFNHYMFEAICL
SIRITCKANPAAVVNFEEALFLVFTEILQNDVQEFIPYVFQVMSLLLETHKNDIPSSY
MALFPHLLQPVLWERTGNIPALVRLLQAFLERGSNTIASAAADKIPGLLGVFQKLIAS
KANDHQGFYLLNSIIEHMPPESVDQYRKQIFILLFQRLQNSKTTKFIKSFLVFINLYC
IKYGALALQEIFDGIQPKMFGMVLEKIIIPEIQKVSGNVEKKICAVGITNLLTECPPM
MDTEYTKLWTPLLQSLIGLFELPEDDTIPDEEHFIDIEDTPGYQTAFSQLAFAGKKEH
DPVGQMVNNPKIHLAQSLHMLSTACPGRVPSMVSTSLNAEALQYLQGYLQAASVTLL
【００５４】
リン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質（タンパク質ＩＤ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ５０３６７．１）に特異的な抗体を作成するために用いられるリン酸化タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりである。
LTpEYpLKKTLDPDPAC(Ｔｐはリン酸スレオニンを表し、Ｙｐはホスホチロシンを表す)
【実施例】
【００５５】
＜テスト材料と方法＞
【００５６】
〔抗体〕
実験で用いられた抗体は、抗−ｐ２１／ｒａｓ（ＥＰ１１２５Ｙ）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗−ＣＳＥ１Ｌ（３Ｄ８）及び抗−ＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３（リン酸 Ｔ２０２／２０４，Ｇ１５−Ｂ）（Ａｂｎｏｖａ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）；抗−ＣＳＥ１Ｌ（２４）、抗−ホスホチロシン（ＰＹ２０）、及び抗−ホスホセリン／スレオニン（２２Ａ／ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗−β−チューブリン（Ｄ６６）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；抗−β−アクチン（Ａｂ−５）及び抗−ＧＦＰ（Ａｂ−１）（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗−ＭＭＰ−２（Ｈ−７６）及び抗−ホスホスレオニン（Ｈ２）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（又は５６８）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）に結合しているヤギ抗−マウス（又は抗−ウサギ）ＩｇＧ２次抗体。
【００５７】
〔プラスミド〕
ネオマイシン選択マーカーを有するｖ−Ｈ−Ｒａｓ（ｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ）発現ベクターは、Ｄｒ．Ｃｈａｎｎｉｎｇ Ｊ Ｄｅｒから提供を受けた。ネオマイシン選択マーカーを有する哺乳類のＣＳＥ１Ｌ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌ）は、ＣＳＥ１Ｌ ｃＤＮＡ（Ａｐａ Ｉ、ｐＧＥＭ−ＣＳＥ１Ｌ ｖｅｃｔｏｒのＩ断片ではない。）を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＡｐａＩ及びＩでないサイトに挿入することで作成される。ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ プラスミド（ｓｃ−２９９０９−ＳＨ）は、ＣＳＥ１Ｌの発現をノックダウンするように設計されている。また、いかなる細胞情報の特異的分解を導かない暗号化したｓｈＲＮＡ配列をエンコードする、コントロールｓｈＲＮＡプラスミド（ｓｃ−１０８０６０）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に注文した。ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミド及びコントロールｓｈＲＮＡプラスミドは、ピューロマイシン選択マーカーを有する。
【００５８】
〔細胞及びＤＮＡトランスフェクション〕
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞は、熱不活性化ウシ胎仔血清を１０％、ペニシリンを１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシンを１００ｍｇ／ｍｌ、及びグルタミン酸塩を２ｍｍｏｌ／Ｌ添加したダルベッコ改変イーグル培地で、５％ＣＯ2の加湿条件下、３７℃で培養した。Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を得るため、リオフェクチンプラス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の手順書にしたがい、Ｂ１６Ｆ１０細胞に、コントロールｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１エンプティベクター＋コントロールｓｈＲＮＡプラスミド、ｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ＋コントロールｓｈＲＮＡプラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌ＋コントロールｓｈＲＮＡプラスミド、及びｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ＋ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミドが導入された。形質転換された細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で３週間、次いで、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで３週間処理することで選択された。多剤抵抗性を有するコロニー（＞５０）は、集められ集団培養された。形質転換した細胞は、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地中に保管された。実験には、Ｇ４１８及びピューロマイシンを含まない培地で培養された細胞を用いた。
【００５９】
〔免疫ブロット法〕
細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、氷冷した放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファー［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ–ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２５ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、５ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、及び５ｍＭ フッ化ナトリウム］に溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定した。タンパク質サンプルは、各々５０μｇを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せた。タンパク質は、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に転写された。膜は、ブロッキングバッファー［１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ–ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０］を用い、室温で１時間ブロックされた。ブロットは、１次抗体と４℃で一晩インキュベートされ、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合している２次抗体と１時間インキュベートされた。タンパク質レベルは、Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ)を用い、手順書に従って測定した。
ビオチン結合抗体で免疫ブロットするため、ビオチン結合抗体は、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２ ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の手順書に従って、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体をビオチニル化することによって調整された。次いで、免疫ブロットは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジンと反応し、タンパク質量はＦｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅによって検出される。
【００６０】
〔免疫蛍光測定法及び微小胞のスコアリング〕
ガラスカバースライド（１２×１２ｍｍ）上で４日間成長した細胞は、１０００ｒｐｍで１０分間、サイトスピンすることでスライド上に密着した。細胞は、ＰＢＳで洗浄され、４％パラホルムアルデヒドで固定され、メタノールで透過処理され、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックされた。サンプルは、一次抗体で１時間インキュベートされた。サンプル、次いでＰＢＳで３回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（又は５６８）に結合している２次抗体とインキュベートされ、倒立蛍光顕微鏡で測定された。各実施条件で、表面に微小胞を示した細胞が確認された。３００の細胞がそれぞれの実施で観察され、３つの独立した実施のデータが、ブロットされた。標準偏差棒が示される。
【００６１】
〔細胞増殖分析〕
同じ数の細胞（１×１０４細胞／ｄｉｓｈ）が、１００ｍｍの培養皿に播種された。培地は、３日毎に新しいものに交換された。細胞数は、細胞播種後、２４時間毎に、トリパンブルー色素排除分析法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）によりカウントされた。カウントの際には、３つのプレートの細胞数がカウントされ、それぞれのプレートは１回のみカウントした。
【００６２】
〔馴化培地〕
細胞は、対数増殖期中期から後期に入ったあたりの状態（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖され、ＰＢＳで洗浄され、ウシ胎仔血清を含まない培地に変更された。４８時間のインキュベーション後、馴化培地は回収され、細胞数がカウントされた。浮遊している可能性のある細胞を除く為、培地は１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、その後、上澄みが回収された。
【００６３】
〔微小胞の調整〕
微小胞は、サイズ排除クロマトグラフィー及び超遠心分離法により、馴化培地又は血清から調整された。馴化培地又は血清は、ＰＢＳで平衡化されたセファロース２Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に入れられた。フラクション（１ｍｌ）が集められ、タンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することでモニターした。＞５０ミリオンｋＤａのタンパク質を含む空隙容量ピーク材料は、４℃、１０５，０００ｇで１時間遠心分離された。ペレットは微小胞を含み、５０μｌのＰＢＳに再縣濁された。
【００６４】
〔 免疫沈降〕
プラスチック皿で成長した細胞は、ＰＢＳで洗浄され、免疫沈降溶解バッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％ デオキシコール酸、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２５ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、５ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、５ｍＭ フッ化ナトリウム］で、４°Ｃ、２０分間インキュベートした。細胞は掻き集められ、ピペッティングにより破壊された。細胞溶解物は、１２，０００ｇ、４℃、１０分間の遠心分離で、不溶性物質が除去され、タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質分析ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。細胞溶解物（５００μｇ）は、免疫沈降バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］中の一次抗体と、４°Ｃ、３時間、インキュベーとされ、次いで、タンパク質Ａ／Ｇスラリーに、アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）が添加され、更に、２時間インキュベーとされた。免疫沈降物は、溶解バッファーで３回洗浄され、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに置かれ、抗体で免疫ブロットされた。マウス抗−ＧＦＰ抗体が、コントロール反応として用いられた。血清サンプルの免疫沈降のため、血清は、アガロース結合抗−リン酸スレオニン抗体（Ｈ２）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含むＰＢＳバッファーで、４℃で、緩やかな旋回をかけながら一晩インキュベーとされた。免疫沈降物は、免疫沈降溶解バッファーで３回洗浄され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられ、次いで、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体と免疫ブロットされた。コントロール免疫沈降は、アガロース結合通常マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて実施された。
【００６５】
〔 ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質の生成〕
ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質は、ＥＮＤＥＸＴ技術手順書（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）に記載されている方法に従って、小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて生成した。簡単に説明すると、ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌベクター中のＣＳＥ１Ｌのオープン・リーディング・フレームが制限酵素で切断され、小麦胚芽発現ベクターｐＰＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローンされた。ＣＳＥ１Ｌ ｍＲＮＡの転写は、２μｇのサブクローンプラスミドを、転写プレミックス溶液（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むチューブに加えることで行われた。混合液は、転写反応のため、３７℃で６時間インキュベートされた。翻訳反応のため、１０μｌのｍＲＮＡ混合物が、１０μｌの小麦胚芽抽出溶液（ＷＥＰＲＯ ３２４０，ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えられた。翻訳混合物（２０μｌ）は、下層に翻訳混合物を含む２層を形成するために、ＳＵＢ−ＡＭＩＸ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むウェルの底に移された。２６℃で１６時間のインキュベーション後、混合物は、ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質の精製のために用いられた。ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質は、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ及びＢｕｌｋ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製を行った。精製されたＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質は、トロンビンで開裂され、ＧＳＴは、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて除去された。
【００６６】
〔組織マイクロアレイ及び免疫組織化学〕
パラフィンブロック中の癌組織から取り出された組織及び非癌組織から取り出された組織が、縦方向に切断され、組織マイクロアレイを作成するため、ＢｉｏｓｙｎＭａｔｒｉｃ Ｈａｎｄｍａｄｅ Ｋｉｔ（Ｆｏｒｍｏｓａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ）のマニュアル方法を用いて、新しいパラフィンブロック中に配置された。現発癌の形態学的な代表領域の存在を確認するため、組織セクション（４−μｍ）が、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。免疫組織化学が、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｄ８）又は抗−ＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３（リン酸Ｔ２０２／２０４）抗体の５０倍希釈物を用いて実施された。免疫組織化学検出は、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の標識ストレプトアビジン−ビオチン法を用いて、手順書とおりに実施した。切片は、ジアミノベンジジンと反応させられ、蒸留水で洗浄され、マイヤーヘマトキシリンで対比染色された。
【００６７】
〔マトリゲル基底膜浸潤性分析（Ｍａｔｒｉｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）〕
マトリゲル基底膜浸潤性分析は、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び孔サイズが８μｍのポリビニルピロリドン−フリー ポリカーボネート フィルター（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−ｆｒｅｅ ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｆｉｌｔｅｒｓ）（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行われた。フィルターは、４℃で一晩、３７℃で更に２時間、マトリゲル（１：１０ ｉｎ ＤＭＥＭ）でコートされた。フィルターは、ＤＭＥＭで３回洗浄され、ミクロ走行性チャンバー（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｃｈａｍｂｅｒｓ）に置かれた。細胞は、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡで洗浄され、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ培地中に再縣濁され、次いで、血清−フリーＤＭＥＭ培地で洗浄された。細胞（３×１０５）は、ＤＭＥＭ（２００μｌ）に縣濁され、走行性チャンバーの上方コンパートメントに置かれた。ＦＢＳを２０％含む培地（３００μｌ）が、化学誘引物質源として走行性チャンバーの下方コンパートメントに置かれた。培養インキュベーターで１２時間のインキュベート後、フィルターの上面の細胞は、綿棒で完全に拭き取られた。フィルターの下面の細胞は、メタノールで固定され、Ｌｉｕ’ｓ Ａ及び Ｌｉｕ’ｓ Ｂ試薬で染色され、そして、顕微鏡でカウントされた。ミクロ走行性チャンバーに浸入した細胞も、同様にカウントされた。分析は、３回繰り返され、各々の分析は、夫々の細胞ライン用フィルターの複製を４回繰り返して行われた。各複製のため、選択されたフィールドから任意の１０の腫瘍細胞が決められ、カウントが平均化された。
【００６８】
〔免疫金電子顕微鏡法（Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）〕
細胞は、ＰＢＳで洗浄され、Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ６．８）中、１５分間、０．５％グルタルアルデヒド及び２％パラホルムアルデヒド混合物で固定され、次いで、２％パラホルムアルデヒドを含むＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ６．８）中、４℃で１４日間固定された。サンプルは、８０％エタノールで脱水処理され、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ ＨＭ２０樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の濃縮物に浸透した。Ｌｏｗｉｃｒｙｌ ＨＭ２０樹脂のポリマー化は、２４時間、ＵＶ照射（波長ピーク３６０ｎｍ）することで行った。極薄切片は、切断及び２％ネオプレン（Ｏｈｋｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でコートされたニッケル格子上に固定された。１００％エタノールに３分間浸漬後、サンプルは、６５℃の０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に２４時間浸漬した。サンプルは、ＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄され、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１５分間、ブロックされた。サンプルは、ＰＢＳに希釈された一次抗体（１：３０）の混合物とインキュベートされ、ＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄され、１８−ｎｍ（又は１２−ｎｍ）の金標識２次抗体と反応し、次いで、ＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄した。サンプルは、酢酸ウラニルで染色され、透過型電子顕微鏡（日立社製 Ｈ−７０００、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察された。
【００６９】
〔ゼラチン酵素電気泳動分析（Ｇｅｌａｔｉｎ ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ Ａｓｓａｙ）〕
細胞数が標準化された馴化培地から採取された微小胞は、１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。ゲルは、ＳＤＳを除去するため、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３０分間洗浄され、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含むバッファーで、３７℃で２４時間、インキュベートした。ゲルは、クマシーブルー Ｒ−２５０（０．１２５％ Ｃｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０、５０％ メタノール、１０％ 酢酸）で３０分間染色され、脱色液（２０％ メタノール、１０％ 酢酸、７０％ ｄｄＨ２Ｏ）で、鮮明なバンドが視認できるまで脱色した。
【００７０】
〔動物の転移実験〕
６〜７週（Ｎ＝１８）及び１４〜１５週（Ｎ＝２６）のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）が、標準状態の動物飼育室（２２℃；湿度５０％、１２時間の明暗周期）で飼育された。実験は、４つのグループ（Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞が注入されたマウス）で行われ、異なる週齢のマウスも同様に４つのグループに分配された。それぞれのマウスには、生きている細胞（１００μｌＰＢＳ中に３×１０４細胞／ｍｏｕｓｅ）が、尾静脈注射された。実験は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞がそれぞれ注射された１１、１４、８及び１１匹のマウスで行われた。注射後３週間で、マウスは解剖された。肺中の腫瘍細胞数は、肉眼検査及び顕微鏡検査で行われた。マウスのケアと実験は、台湾中央研究院（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ， Ｔａｉｗａｎ）の動物ケア委員会のガイドラインに従って実施した。１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の注射後、３週間後までに、それぞれ、３、１０、４、１匹のマウスが死亡したので、それらは、統計から除外した。また、１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を注射したマウスの内、それそれ、１、１、０、３匹のマウスは肺に腫瘍細胞が成長しなかったので、統計から除外した。
【００７１】
〔患者と腫瘍サンプル〕
結腸直腸癌のサンプルは、中華キリスト病院（Ｃｈａｎｇｈｕａ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において、ＩＲＢ−承認ガイドラインを用い、診察時にインフォームド・コンセントを行い、且つ未治療の１１５の連続した患者から得られた。すべての患者は、関与の前に、施設内倫理委員会が承認したガイドラインを用いてインフォームド・コンセントを行い説明事項について理解した。腫瘍は、段階に分けられ、対がん米国合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）の癌ステージマニュアルに従って、分類された。コントロールの健常者の血清サンプルは、６０人の健常個体（平均年齢６１．０±８．７歳、年齢範囲２２〜７１歳）から得られた。血清サンプルは、血液が凝固するよう少なくとも３０分は室温で放置した。懸濁の可能性のある細胞及び血清中の細胞破片を除去するため、サンプルは、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、上澄みは回収された後、−８０℃で保存した。表１は、患者の基本特性を示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
ａ平均±ＳＤ．ｂグレード１:十分分化（ｗｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、グレード２：適度に分化（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、グレード３：低分化（ｐｏｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）。cＮ０:リンパ節部分転移無し、Ｎ１：１〜３か所のリンパ節転移、Ｎ２：４か所以上のリンパ節転移、dＭ０:遠隔転移無し、Ｍ１：遠隔転移あり
【００７４】
〔Ｉｎ ｖｉｖｏ 腫瘍イメージング〕
抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（ｃｌｏｎｅ２４）及び抗−マウスＩｇＧが、Ｑｄｏｔ８００抗体複合体キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、キット添付マニュアルに従って量子ドットに抱合された。Ｑｄｏｔは、Ｎ−コハク酸イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）で活性化され、抗体はジチオスレイトールで還元された。還元された抗体は、活性化されたＱｄｏｔｓと共有結合し、複合化反応は、β―メルカプトエタノールで抑えられた。複合体は、限外ろ過により濃縮されサイズ除去クロマトグラフィーにより精製された。複合体の濃縮物は、蛍光分光計により決定された。
週齢６〜７のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、生きているＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞（１００μｌＰＢＳ中に３×１０４細胞／ｍｏｕｓｅ）が背面皮膚に注射された。腫瘍細胞の接種から３週間後、マウスの腫瘍は、量子ドット−接合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体又は量子ドット−接合抗−マウスＩｇＧ（１００μｌのＰＢＳ中５００ｐｍｏｌｅ／ｍｏｕｓｅ）と共に、尾静脈に注入された。マウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２００イメージング・システム（励起：５２５／５０ｎｍ；発光：８３２／６５ｎｍ）を用い、注入後、０、１及び４時間経過時に観察した。ＮＩＲ蛍光画像は、カメラで撮影された。
【００７５】
〔リン酸化−ＣＳＥ１Ｌに特異的な抗体の作製〕
リン酸タンパク質、ＬＴｐＥＹｐＬＫＫＴＬＤＰＤＰＡＣ(Ｔｐは、リン酸スレオニン及びＹｐはリン酸チロシンを意味する）、及び非リン酸タンパク質、ＬＴＥＹＬＫＫＴＬＤＰＤＰＡＣは、固相法を用いて合成された。リン酸化されたタンパク質は、Ｎ−末端システインのチオールを介して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合した。ニュージーランドウサギが、タンパク質で５回免疫を与えられた。免疫血清は、最後の免疫付与から１週間後に回収された。ＩｇＧフラクションは、プロテインＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製された。抗体は、リン酸化タンパク質アフィニティーカラムで精製され、次いで、非リン酸特異的抗体を除去するため、非リン酸タンパク質クロス吸着を行った。力価と抗体特異性は、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット法でテストされた。
【００７６】
〔ドットブロット〕
精製された微小胞懸濁液（５μｌ）が、９６ウェルのドットブロットマニフォールド装置（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の夫々のウェルに滴下された。膜は、ブロッキングバッファー［１％ＢＳＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０］を用い室温で１時間、ブロックされた。ブロットは、４℃で一晩、一次抗体とインキュベートされ、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した２次抗体と１時間インキュベーションされた。タンパク質レベルは、Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、キットの添付マニュアルに従って検出した。
【００７７】
〔ＥＬＡＳＡ〕
血清サンプルは、９６−ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｂ ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて４℃で一晩、複製した。サンプルは吸引され１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックされた。ブロッキングバッファーが除去され、次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄された。ウェルは、ビオチン結合抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体又はビオチン結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で１時間、インキュベートされた。ビオチン結合抗体又はビオチン結合抗体は、ビオチンラベル キット−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、抗体をビオチン化することで準備した。ウェルは、次いでＰＢＳＴで洗浄され、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）と反応され、次いで、基質試薬（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベーションした。校正のため、ＰＢＳを含む３つのブランクウェルが、バックグランド値の測定に用いられ、ＰＢＳを含む、且つ他のＥＬＩＳＡ試薬のすべてと反応した３つのブランクウェルがコントロールウェルとして用いられた。４５０ｎｍにおける吸光度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、３０分以内に測定した。コントロールウェルのもっとも高いＯＤ値より高いサンプルウェルのＯＤ値は、ＳＥ１Ｌ陽性、又はリン酸化ＣＳＥ１陽性と考えられる。
【００７８】
〔統計的分析〕
データは、ＳＰＳＳ １４．０統計ソフトを用いて分析された。統計学的差異は、フィッシャーの正確確率検定で両側検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）を行い分析した。α−ｌｅｖｅｌ≦０．０１は、統計学的に意義があると考えられた。
【００７９】
＜実施例１＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓが導入された安定細胞の作製、ＣＳＥ１Ｌ、及びｖ−Ｈ−ｒａｓ ｐｌｕｓ ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ発現プラスミド〕
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞にｖ−Ｈ−ｒａｓコーディング領域を運ぶレトロウィルス発現ベクターであるｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓが導入された；ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞を得るための人ＣＳＥ１Ｌコーディング領域を運ぶレトロウィルス発現ベクター；Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を得るためのｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ ｐｌｕｓ ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミド。コントロールとして、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞に、如何なる細胞メッセージも伝えないごちゃ混ぜになったｓｈＲＮＡ配列をコードするコントロールｓｈＲＮＡプラスミド（ｐｓｈＥＶ）が導入された；Ｂ１６Ｆ１０細胞に、Ｂ１６−ｄＥＶ細胞を得るためコントロールベクターｐｓｈＥＶ及びｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１が導入された。免疫ブロットの結果は、ＲａｓレベルはＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞で増加したことを示した；ＣＳＥ１Ｌレベルは、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞で増加し、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞で減少したことを示した（図１）。
【００８０】
図１は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞中の、Ｒａｓ及びＣＳＥ１Ｌのレベルのイムノブロット解析を示してい。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に、コントロールの空のベクター、ｖ−Ｈ−ｒａｓ、ＣＳＥ１Ｌ、及びｖ−Ｈ−ｒａｓ ｐｌｕｓ ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ発現プラスミドを導入したもの、すなわち、それぞれ図示されている、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞から調整された細胞溶解物中のＲａｓ及びＣＳＥ１Ｌのレベルは、抗−ＣＳＥ１Ｌ及び抗−Ｒａｓ抗体との免疫ブロットにより分析された。β−アクチンレベルがコントロールとして分析された。
【００８１】
＜実施例２＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する腫瘍細胞微小胞の生成〕
ｒａｓ腫瘍遺伝子は、細胞形質転換の重要な伝達物質で、多様な種類の人癌に存在する；ＥＲＫは、多様な種類の細胞外刺激やＲａｓ及びＥｒｂＢ等のプロトオンコジーンファミリーに応答して活性化され、分子標的治療の重要なターゲットである（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。顕微鏡検査では、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞表面は多くの気泡状の微小胞で覆われているが、Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６−ｄＥＶコントロール細胞では確認されなかった（図２Ａ）。細胞外小胞の形成は、しばしば、偽足（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉａ）又は突起伸長（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）と一体となっている（Ｂｉａｎｃｏ ｅｔ ａｌ． ２００５）。微小胞の成長の存在は、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞の偽足又は細胞質の底部に観察された（図２Ｂ）。脱落微小胞は、メタロプロテイナーゼで濃縮されていた（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００２）。メタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）基質は、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞中の微小胞に局在する（図２Ｃ）。ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、微小空胞ＭＭＰ−２及びＰＤ９８０５９レベルを増加した。それは潜在的なＥＲＫ活性阻害因子、微小胞中でｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した増加したＭＭＰ−２の弱毒化の治療の可能性を意味する（図２Ｄ）。ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色は、細胞中にアポトーシスに関するクロマチン凝縮／分解のサインが無いことを示している。つまり、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞膜の微小胞の存在は微小胞の生成に関与しており、ＥＲＫはｖ−Ｈ−ｒａｓによって誘導される微小胞の形成に関与している。
【００８２】
図２は、Ｖ−Ｈ−ｒａｓが細胞中で微小胞の発生を誘導していることを示している。（Ａ）ガラスカバースライド上で４日間成長したＢ１６Ｆ１０、Ｂ１６−ｄＥＶ、及びＢ１６−Ｒａｓ細胞の反転顕微鏡写真。（Ｂ）Ｂ１６−Ｒａｓ細胞の偽足（矢印）の底部及び細胞膜（矢印）での微小胞の成長の存在。（Ｃ）抗−ＭＭＰ−２抗体による免疫蛍光は、ＭＭＰ−２がＢ１６−Ｒａｓ細胞中の微小胞（矢印）に位置していたことを示した。（Ｄ）ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で４８時間処理された、血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−Ｒａｓ細胞の細胞数が標準化された馴化培地から採取された微小胞の微小空胞ＭＭＰ−２のレベル。
【００８３】
＜実施例３＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションがＣＳＥ１Ｌ分泌物を増加〕
免疫ブロットの結果は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションがＣＳＥ１Ｌ分泌物を増加することを示した。また、ＰＤ９８０５９処理は、Ｂ１６Ｆ１０細胞のｖ−Ｈ−ｒａｓ−誘導ＣＳＥ１Ｌ分泌物の増加を弱めた（図３）。ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクション及びＰＤ９８０５９処理は、細胞中のＣＳＥ１Ｌ発現に明らかに影響したとはいえなかった（図３）。したがって、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、ＣＳＥ１Ｌ分泌物を刺激し、このことはＥＲＫ活性に関係した。
【００８４】
図３は、ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で４８時間処理された血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−Ｒａｓ細胞の細胞数が標準化された馴化培地から採取された細胞の溶解物及び馴化培地のＣＳＥ１Ｌレベルを示しており、ビオチン結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジンを用いた免疫ブロット解析の結果である。
【００８５】
＜実施例４＞
〔ＣＳＥ１Ｌは、セリン／スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質〕
ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質が、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成された。免疫ブロットは、合成されたＣＳＥ１Ｌタンパク質は、抗−リン酸セリン／スレオニン及び抗−ホスホチロシン抗体と反応した（図４）。したがって、ＣＳＥ１Ｌは、セリン／スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質である。
【００８６】
図４は、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成されたＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌタンパク質、並びにリン酸セリン／スレオニン、ホスホチロシン及びＣＳＥ１Ｌに対する抗体を用いた、ＣＳＥ１Ｌのリン酸化反応の免疫ブロット解析を示している。ＣＳＥ１Ｌタンパク質は、トロンビンを含むＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質の開裂により得られた。レーン２は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及びＡ／Ｇ ｐｌｕｓ−ａｇａｒｏｓｅで処理されたＢ１６−ｄＥＶの上澄みを回収することで生成したＣＳＥ１Ｌが枯渇した細胞溶解物である。
【００８７】
＜実施例５＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションはＣＳＥ１Ｌリン酸化を増加し、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは癌血清中に存在〕
Ｂ１６−ｄＥＶ細胞、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、及びＰＤ９８０５９で処理されたＢ１６−Ｒａｓ細胞から精製された細胞溶解物中のＣＳＥ１Ｌタンパク質は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）結合抗−リン酸スレオニン抗体で免疫ブロットされた。結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞へのｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、ＣＳＥ１Ｌのスレオニンのリン酸化反応を増加し、そして、ＰＤ９８０５９処理は、ＣＳＥ１Ｌ中でｖ−Ｈ−ｒａｓによるスレオニンのリン酸化反応を抑制すること示している（図５Ａ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌはリン酸化タンパク質で、Ｒａｓ−ＥＲＫ信号によりリン酸化される。血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓから回収された細胞の細胞数が標準化された馴化培地中、及びＰＤ９８０５９で処理されたＢ１６−Ｒａｓ細胞のＣＳＥ１Ｌタンパク質は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は、ＨＲＰ結合抗−リン酸スレオニン抗体で免疫ブロットされた。結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞へのｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌの分泌物を増加し、そして、ＰＤ９８０５９処理は、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞から馴化培地中に、ｖ−Ｈ−ｒａｓ増加によるスレオニンリン酸化反応物を分泌することを抑制することを示している（図５Ｂ）。
結腸直腸癌患者及び健常者ドナーの血清中のスレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌのレベルが分析された。結腸直腸癌患者（Ｎ＝３６）又は健常者ドナー（Ｎ＝３６）から採取された血清スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質は、アガロースゲル結合抗−リン酸化スレオニン抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で免疫ブロットされた。結果は、癌血清サンプルからの免疫沈降物中にはスレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在することを示したが、健常者ドナーの血清サンプルには存在していなかった（図５Ｃ）。血清ＣＳＥ１Ｌレベルは、健常者ドナーのサンプルより癌患者のサンプルの方が高かったが、違いは、スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌのアッセイで見られたように顕著ではなかった。
【００８８】
図５は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションがＣＳＥ１Ｌのリン酸化を促進すること、及びリン酸化したＣＳＥ１Ｌは癌血清中に存在することを示す。（Ａ）ＤＭＳＯ及び５０μＭのＰＤ９８０５９で２４時間処理されたＢ１６−ｄＥＶ細胞及びＢ１６−Ｒａｓ細胞中の細胞質スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルが、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫沈降及びＨＲＰ結合抗−リン酸スレオニン抗体との免疫ブロットにより分析された。免疫ブロットは、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で再検査された。コントロールの免疫沈降物は、マウス抗−ＧＦＰ抗体を用いて行われた。（Ｂ）ＤＭＳＯ又は５０μＭのＰＤ９８０５９で２４時間処理された血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ細胞及びＢ１６−Ｒａｓ細胞数を調整した馴化培地中の分泌スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルは、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫沈降及びＨＲＰ結合抗−リン酸スレオニン抗体との免疫ブロットにより分析された。（Ｃ）血清スレオニンリン酸ＣＳＥ１Ｌは、結腸直腸癌患者（３６人、夫々１０μｌ）又は３６人の健常者ドナー（夫々１０μｌ）から得られた血清プールのアガロース結合抗−リン酸スレオニン抗体との免疫沈降、及び抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫ブロットで分析された。コントロールの免疫沈降物は、アガロース結合健常マウスＩｇＧを用いて行われた。（Ｄ）結腸直腸癌患者及び健常者ドナーから得られた血清プールのＣＳＥ１Ｌレベルは、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫ブロットで分析された（２４クローン）。
【００８９】
＜実施例６＞
〔結腸直腸癌におけるリン酸化−ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌの高発現、及び腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度の一致〕
【００９０】
１１５の結腸直腸癌の標本の組織マイクロアレイ免疫組織化学検査の結果は、リン酸−ＥＲＫ（１００％、１１５／１１５）の及びＣＳＥ１Ｌ（９９．１％、１１４／１１５）の強い染色を示した（図６Ａ）。健常な組織は、弱いリン酸−ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌ染色しか示さなかった（図６Ａ）。腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度の一致は、結腸直腸癌の進行においてＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫは近い関係にあることを示している（図６Ｂ）。
【００９１】
図６は、結腸直腸癌においてＣＳＥ１Ｌ及びリン酸−ＥＲＫは高い発現をしており、腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度は一致することを示している。（Ａ）結腸直腸癌のリン酸−ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌの発現は、１１５の癌標本の組織マイクロアレイ免疫組織化学検査により分析された。左パネル：非腫瘍組織；右パネル：結腸直腸癌組織。４００倍の拡大写真。（Ｂ）隣接した連続結腸直腸癌組織切片の免疫組織化学検査により分析された腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度の代表的イメージ。矢印は、腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度が一致していることを示している。倍率は４０倍。
【００９２】
＜実施例７＞
〔ＣＳＥ１Ｌが細胞中のｖ−Ｈ−ｒａｓ−誘導の微小胞の発生を媒介する〕
顕微鏡検査は、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞及びＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミドが導入されたＢ１６−Ｒａｓ細胞の表面には微小胞が存在していないことを示している（図７Ａ）。Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の細胞質又は偽足の底部にも微小胞の蓄積はなかった（図７Ａ）。顕微鏡検査は、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の表面には微小胞が存在していることを示している（図７Ｂ）。ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞と違い、ＣＳＥ１Ｌは、細胞あたり、ほとんど微小胞を誘導しせず、小胞は細胞の表面突起（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）の先端に多く存在し、また、サイズも大きかった（図７Ｂ）。これらの違いは意味がある、なぜなら、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションはＥＲＫ活性を刺激して、ＥＲＫは微小胞の生成と放出を媒介するからである。ＣＳＥ１Ｌの過剰発現は微小胞の生成を刺激するに過ぎない；そのため、ＣＳＥ１Ｌに誘導された微小胞は、細胞膜に蓄積し大きなサイズになる。先行研究は、小胞は原形質膜で形成され、糸状偽足に沿って、糸状偽足の先端に移動することを示している（Ｂｉａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．２００５）。ＣＳＥ１Ｌは、偽足の底部に位置したＭＭＰ−２の豊富な発育過程の微小胞で着色された（図７Ｃ）。ＣＳＥ１Ｌは、また、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞の脱落した微小胞の後に位置した発育過程の微小胞の細胞質で着色された（図７Ｃ）。更に、ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞の成長を阻害した（図７Ａ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞生成の調節遺伝子であり、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞の生成を媒介する。
【００９３】
図７は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞の生成を媒介することを示している。（Ａ）ガラスカバースライド上で４日間成長したＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の反転顕微鏡写真。（Ｂ）ガラスカバースライド上で４日間成長したＢ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞成長の代表イメージ。（Ｃ）偽足（矢印）の底部に位置した発育過程の微小胞、又は脱落した微小胞（矢印）の後の細胞質におけるＣＳＥ１Ｌ及びＭＭＰ−２染色の代表イメージ。
【００９４】
＜実施例８＞
〔ＣＳＥ１Ｌはｖ−Ｈ−ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を媒介する〕
ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で処理又は処理されていない血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞から採取した微小胞のゼラチン酵素電気泳動分析の結果は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性を増加した、及びＰＤ９８０５９処理は微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性におけるｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する増加を弱めることができた（図８Ａ）。ＣＳＥ１Ｌの過剰発現は、微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性を増加した、そして、ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ トランスフェクションは微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性におけるｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する増加を弱めることができた（図８Ａ）。マトリゲル・ベースの浸潤分析は、ｖ−Ｈ−Ｒａｓ トランスフェクション及びＣＳＥ１Ｌの過剰発現とも、Ｂ１６Ｆ１０細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を増加させ、ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡトランスフェクションはｖ−Ｈ−Ｒａｓが誘導した細胞の浸潤能力が増加することを弱めた（図８Ｂ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を媒介する。
【００９５】
図８は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を媒介することを示す。（Ａ）ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で処理又は処理されていない血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞から採取した微小胞のＭＭＰ−２のゼラチン酵素電気泳動分析の結果。（Ｂ）マトリゲル・ベース浸潤により分析されたＢ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤能力。侵入性細胞の平均±ＳＤ数は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞のフィールドあたり、それぞれ、１０９．４±１２．６、４０６．８±２３．９、３１１．２５±３２．４、４６．７５±８．７であった。
【００９６】
＜実施例９＞
〔ＣＳＥ１Ｌはｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した癌細胞の転移を媒介する〕
ＭＭＰ−２は、腫瘍浸潤で本質的な役割を果たす（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００２）。免疫蛍光は、ＣＳＥ１ＬはＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞表面の微小胞のＭＭＰ−２と共局在化されていることを示している（図９Ａ）。また、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞に選択的に蓄積されていた（図９Ａ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる動物実験では、ＣＳＥ１Ｌの過剰発現及びｖ−Ｈ−Ｒａｓトランスフェクションは、それぞれ、３６１．５％（Ｐ＜０．０１）及び２４６．１％（Ｐ＜０．０１）のＢ１６Ｆ１０細胞の肺腫瘍転移を示した；ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡトランスフェクションはｖ−Ｈ−Ｒａｓが誘導した腫瘍の肺転移を１００％（Ｐ＜０．０１）に弱めた；Ｂ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の成長速度は類似しているにもかかわらず（図９Ｂ及びＣ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞の転移を媒介する。
【００９７】
図９は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した癌細胞の転移を媒介することを示す。（Ａ）代表的な免疫蛍光は、免疫蛍光で分析されたＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ及びＭＭＰ−２の共存を示す。また、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞に選択的に蓄積されていた（矢印）。ＭＭＰ−２分布が、比較のために使われた。（Ｂ）ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した細胞の転移を媒介する。上段は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞が注入されたＣ５７ＢＬ／６マウスの肺腫瘍の写真である。肺腫瘍の平均±ＳＤ数は、Ｂ１６−ｄＥＶ（Ｎ＝７）、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ（Ｎ＝３）、Ｂ１６−Ｒａｓ（Ｎ＝４），Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞（Ｎ＝７）が注入されたマウス１匹あたり、それぞれ、１３．７±４．８、４７±１５．８、３２．２±８．５、７±３．６であった。Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を注入後、３週間でそれぞれ３、１０、４、１匹のマウスが死亡したので統計処理から除いた。Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を注入後、それぞれ、１、１、０、３匹のマウスには肺腫瘍が成長しなかったので、同様に統計処理から除いた。（Ｃ）Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の成長曲線を示す。グラフは、３つの独立した分析結果を示す。
【００９８】
＜実施例１０＞
〔ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在化し抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は腫瘍をターゲットとすることができる〕
免疫蛍光の結果は、ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在化することを示した（図１０Ａ）。免疫金電子顕微鏡検査は、ＣＳＥ１Ｌ及びＭＭＰ−２は小胞に局在化し、そしてＣＳＥ１Ｌは小胞膜に主に局在化することを更に示した（図１０Ｂ）。脱落した微小胞は腫瘍細胞膜の上で広範囲に広がり、脱落微小胞は、腫瘍細胞の周りの細胞外環境に留まっている可能性がある；それゆえ、微小胞膜タンパク質は、癌治療の潜在的ターゲットとなる可能性がある。微小胞膜中のＣＳＥ１Ｌの局在化は、ＣＳＥ１Ｌが癌治療の潜在的ターゲットとなり得ることを示している。腫瘍のあるＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｑｄｏｔ８００ナノクリスタル結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体、又はコントロールとしてＱｄｏｔ８００ナノクリスタル結合抗マウスＩｇＧが尾静脈注射された。ｉｎ ｖｉｖｏイメージの結果は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体結合量子ドットを注入したマウスの腫瘍中には重要な近赤外（ＮＩＲ）蛍光信号の存在を示したが、コントロールのＩｇＧ結合量子ドットを注入したマウスの腫瘍中では観察されなかったことを示した（図１０Ｃ）。つまり、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は、腫瘍をターゲットとすることがでる。
【００９９】
図１０は、ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在化し、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は腫瘍をターゲットとすることができる。（Ａ）免疫蛍光の結果、ＣＳＥ１ＬはＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の微小胞膜（矢印）に局在化していた。（Ｂ）Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の微小胞へのＣＳＥ１Ｌ（１８−ｎｍ金、矢印）及びＭＭＰ−２（１２−ｎｍ金、矢印）の免疫金電子顕微鏡による分布検査。２５０，０００倍。（Ｃ）合成画像は、量子ドット結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（右、Ｎ＝３）又は量子ドット結合抗−マウスＩｇＧ（左、Ｎ＝３）を注入して４時間後の、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞から派生した腫瘍異種移植片を運んでいるＣ５７ＢＬ／６匹のマウスのＮＩＲ蛍光信号を示す。ＮＩＲイメージは、同じ状況の下で得られ、処理された。
【０１００】
＜実施例１１＞
〔抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体はリン酸化されたＣＳＥ１Ｌと反応する〕
リン酸ＣＳＥ１Ｌに特異的な抗体は、ＣＳＥ１Ｌの推定リン酸化領域と一致するようになっている合成リンペプチドをニュージーランド・ウサギに免疫接種することで作製した。抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体の力価は、間接的なＥＬＩＳＡによって測定された（表２）。免疫ブロットの結果は、抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体はリン酸化したＣＳＥ１Ｌと反応することを示した（図１１）。
【０１０１】
表２は、精製された抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体の親和性の力価は、間接的なＥＬＩＳＡによって測定された。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
図１１は、抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体は、リン酸化されたＣＳＥ１Ｌと反応することを示す。抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体の特異的特徴は、ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で１２時間処理されたＢ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−Ｒａｓ細胞からの細胞溶解物（５０μｇ）を免疫ブロットすることで行われた。抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（ｃｌｏｎｅ２４）及び動物の免疫前の血清が、コントロールとして用いられた。
【０１０４】
＜実施例１２＞
〔リン酸化ＣＳＥ１Ｌは微小胞に局在する〕
リン酸化ＣＳＥ１Ｌが微小胞に局在するか否かが分析された。抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いた免疫蛍光は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌが微小胞（矢印）に局在化していることを示した（図１２）。
【０１０５】
図１２は、抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いた免疫蛍光分析により、リン酸化ＣＳＥ１Ｌが、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の微小胞（矢印）に局在化していることを示している。
【０１０６】
＜実施例１３＞
〔癌血清から分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌの存在〕
微小胞が、結腸直腸癌の患者及び健常者ドナーの血清から分離された。分離された微小胞は、９６ウェルドットブロットマニホールド（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）に入れられ、血清微小胞のＣＳＥ１Ｌの存在は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いたドットブロットにより分析された。ブロットの強さは、ＩＳ−１０００デジタル画像処理システムを用いて定量化された（Ｋａｉｓｅｒ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）。結果は、癌血清サンプルから分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値を示した（図１３Ａ）。また、癌血清サンプルから分離された微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値を示すことも結果より明らかとなった（図１３Ｂ）。ＣＳＥ１Ｌは、癌患者から分離された血清微小胞の９６．５％（１１１／１１５）で検出され、健常者ドナーから分離された血清微小胞では６．６％（４／６０）検出された。Ｐ−値は、癌グループと健常者グループで＜０．０１であった。標準として合成されたＣＳＥ１Ｌを使って、癌患者からの血清微小胞のＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥２１ｎｇ／ｍｌと決定された。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、癌患者から分離された血清微小胞の９８．２％（１１３／１１５）で検出され、健常者ドナーから分離された血清微小胞では３．３％（２／６０）検出された。Ｐ−値は、癌グループと健常者グループで＜０．０１であった。標準として合成されたリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質を使って、癌患者からの血清微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥１５ｎｇ／ｍｌと決定された。
【０１０７】
図１３は、癌血清サンプルから分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値であることを示している。血清から分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌ（Ａ）及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌ（Ｂ）の罹患率は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いたドットブロットにより分析された。＊は、健常者ドナーと比較して、統計学的に有意であることを示す。
【０１０８】
＜実施例１４＞
〔癌患者の血清のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのより高い罹患率、及び癌診断には血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの分析がＣＳＥ１Ｌの分析より優れていること〕
結果は、癌血清から分離された微小胞にリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在していることを示している（実施例１３）。免疫沈降の結果は、癌血清サンプルからの免疫沈降物にはリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在するが、健常者の血清サンプル中には存在しないことを示している（図５Ｃ）。結腸直腸癌患者の血清中のＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率が分析された。ＥＬＩＳＡの結果は、癌血清の９２．１％（１０６／１１５）はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−陽性であったのに対し、健常者ドナーの血清では、わずか１．６％（１／６０）がリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−陽性であった（図１４）。Ｐ−値は、癌グループと健常者グループで＜０．０１であった。標準として合成されたリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質を使って、癌患者からの血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥３ｎｇ／ｍｌと決定された。ＥＬＩＳＡの結果は、癌血清の６５．２％（７５／１１５）はＣＳＥ１Ｌ−陽性であったのに対し、健常者ドナーの血清では、１３％（８／６０）がＣＳＥ１Ｌ−陽性であった。標準として合成されたＣＳＥ１Ｌを使って、癌患者からの血清中のＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥８ｎｇ／ｍｌと決定された。癌検出のためのリン酸化ＣＳＥ１Ｌ血清の感度と選択性は、それぞれ、９２．１％と９８．３％であった。
癌検出のためのＣＳＥ１Ｌ血清の感度と選択性は、それぞれ、６５．２％と８６．６％であった。したがって、リン酸化ＣＳＥ１Ｌ血清の分析は、ＣＳＥ１Ｌ血清の分析より癌診断に優れている。
【０１０９】
図１４は、結腸直腸癌患者の血清のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのより高い罹患率を示している。健常者ドナーと結腸直腸癌患者の血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率がＥＬＩＳＡにより決定された。＊は、健常者ドナーと比較して、統計学的に有意であることを示す。
【０１１０】
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１１． Ｓｉｍａｋ Ｊ， Ｇｅｌｄｅｒｍａｎ ＭＰ． Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｍｅｄ Ｒｅｖ ２００６；２０：１−２６．
１２． Ｔａｉ ＣＪ， Ｈｓｕ ＣＨ， Ｓｈｅｎ ＳＣ， Ｌｅｅ ＷＲ， Ｊｉａｎｇ ＭＣ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ （ＣＳＥ１Ｌ／ＣＡＳ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０；２９：１１０．
１３． Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ Ｇ， Ｄ’Ａｓｃｅｎｚｏ Ｓ， Ｂｏｒｓｏｔｔｉ Ｐ， Ｇｉａｖａｚｚｉ Ｒ， Ｐａｖａｎ Ａ， Ｄｏｌｏ Ｖ． Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ＭＭＰ−２， ＭＭＰ−９， ａｎｄ ＭＴ１−ＭＭＰ ａｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２；１６０：６７３−６８０．
１４． Ｔｕｎｇ ＭＣ， Ｔｓａｉ ＣＳ， Ｔｕｎｇ ＪＮ， Ｔｓａｏ ＴＹ， Ｃｈｅｎ ＨＣ， Ｙｅｈ ＫＴ， Ｌｉａｏ ＣＦ， Ｊｉａｎｇ ＭＣ． Ｈｉｇｈｅｒ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＣＳＥ１Ｌ／ＣＡＳ ｉｎ ｓｅｒａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００９；１８：１５７０−１５７７．
１５． ｖａｎ Ｄｏｏｒｍａａｌ ＦＦ， Ｋｌｅｉｎｊａｎ Ａ， Ｄｉ Ｎｉｓｉｏ Ｍ， Ｂüｌｌｅｒ ＨＲ， Ｎｉｅｕｗｌａｎｄ Ｒ． Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｎｅｔｈ Ｊ Ｍｅｄ ２００９；６７：２６６−２７３．
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１１年８月１８日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０１１／０７８５５９号の優先権を主張するもので、その公開された全ての記載を包含するものである。
【０００２】
本発明は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌとその応用に関するものであり、特に、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）の単離、分析、又は病気の診断や治療へ結びつけることである。
【背景技術】
【０００３】
これまでの研究は、微小胞（微粒子）が、細胞の中のプロテアーゼ、ｍＲＮＡｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、膜受容体、細胞小器官を含む細胞活性分子の移動によって、細胞間連絡に関与しており、その結果、癌の転移を含む様々な病気の進行を含む基礎生理学的役割を果たしていることを示している（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。微小胞は、潜在的なバイオマーカーとして挙げられることが増えてきていることから、多くの関心が微小胞に寄せられている。微小胞は、小さな細胞膜由来の粒子で、外に向かっての出芽や細胞膜分裂によって細胞外環境に放出される。微小胞の大きさは、典型的には、１００ｎｍ〜１５μｍといわれている（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。微小胞の発生／排出は、腫瘍に生じる共通の特徴である（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； ｖａｎ Ｄｏｏｒｍａａｌ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。腫瘍から放出された微小胞は、ＥＣＭ−分解プロテアーゼが豊富で、その結果、癌細胞の浸潤や転移に大きな役割を果たす（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）は、腫瘍浸潤において微小胞の排出を媒介することが分かっている（Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。
【０００４】
ＣＳＥ１Ｌ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ １−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＣＡＳ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ：細胞アポトーシス感受性タンパク質、ジーンバンクＮｏ．３３２８６）とも呼ばれているが、癌の中で高く発現しており、癌侵潤や癌転移に関係している（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９５； Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｔａｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ＣＳＥ１Ｌは、すでに細胞チロシンリン酸化タンパク質、つまり、ＭＥＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ又は細胞外シグナル調整キナーゼ）によってリン酸化したタンパク質として知られている。そして、これはＣＳＥ１Ｌの核移動に関係している（Ｓｃｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【０００５】
ＥＲＫシグナル伝達経路は、癌細胞の増殖、生存、浸潤及び転移に関与している（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＥＲＫ経路の異常活性化は、ヒト腫瘍の多くの種類に共通した基本的な特徴であることが明らかになっている（Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。Ｒａｓ−ＥＲＫ経路は、癌治療用の分子標的薬の開発の潜在的標的である（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。
【０００６】
ＵＳ６６６４０５７は、癌に関係しているヒト染色体２０ｑ１３．２における新規の単位複製配列の識別を開示している。ＵＳ６０７２０３１は、細胞アポトーシス感受性タンパク質のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が、正常細胞及び癌細胞にあるＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現と増幅の検出に用いられることが開示されている。生きている細胞に導入されたアンチセンスＣＳＥ１Ｌ遺伝子配列は、ＣＳＥ１Ｌタンパク質の活性化を阻害するため、細胞のアポトーシスを防止又は阻害する。ＵＳ５７５９７８２は、細胞アポトーシス感受性タンパク質のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が、正常細胞及び癌細胞にあるＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現と増幅の検出に用いられることが開示されている。生きている細胞に導入されたアンチセンスＣＳＥ１Ｌ遺伝子配列は、ＣＳＥ１Ｌタンパク質の活性化を阻害するため、細胞のアポトーシスを防止又は阻害する。ＵＳ６２０７３８０は、尿路組織のポリペプチドとポリヌクレオチドの分析が、各個人に対する尿路の病気及び状況の素因の測定、検出、診断、進行具合の診断、監視、予測、生体内撮像、予防又は治療に有用であることを開示している。これらの配列は、ケラチン／サイトケラチン、ＣＳＥ１Ｌ、又はｍａｔ−８ ポリペプチド及びポリヌクレオチド由来である。ＵＳ６，２０７，３８０は、尿路組織中のケラチン/サイトケラチン、ＣＳＥ１Ｌ、又はｍａｔ−８にコードされたポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体を開示しており、それら分子は、尿路疾患の治療に有用である。つまり、ＵＳ６，２０７，３８０は、尿路疾患の治療のため、尿路組織中のケラチン/サイトケラチン、ＣＳＥ１Ｌ、又はｍａｔ−８に特異的に結合する抗体の使用を開示している。ＵＳ６２３２０８６は、正常細胞及び癌細胞にあるＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現と増幅の検出に用いることができるＣＳＥ１Ｌタンパク質のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を開示している。ＵＳ６１５６５６４は、ヒトの増殖細胞の検出方法を開示しており、その方法は、ヒト細胞サンプル中のヒトＣＳＥ１Ｌタンパク質のレベルの測定及び通常の非増殖ヒト細胞中のヒトＣＳＥ１Ｌタンパク質レベルより少なくとも２倍のレベルのヒトＣＳＥ１Ｌタンパク質の検出を含んでいる。ＵＳ６４４０７３７は、ヒトＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現を調整するためのアンチセンス化合物、組成物及び方法を開示している。ＵＳ２００８００８１３３９は、前立腺癌診断のためのバイオマーカーとして、体液中に存在するＣＳＥ１Ｌ自己抗体（抗原又は腫瘍関連マーカーではない。）を含む多くの自己抗体の測定について開示している。ＵＳ２００５０２６０６３９は、膵臓癌の検出及び診断のため、体液又は体細胞から単離された循環腫瘍細胞中のＣＳＥ１Ｌを含む、膵臓癌関連遺伝子の発現レベルを測定することが開示されている。ＷＯ２００９／０５２５７３は、ｃＤＮＡ遺伝子チップの結果に基づき、消化管癌の腺腫状況の発現を分析するため、血中サンプル又は細胞の循環腫瘍細胞からＣＳＥ１Ｌ転写物（例えば、ＣＳＥ１Ｌ ｍＲＮＡ）を含む多くのＲＮＡ転写物を単離することが開示している。ＵＳ２０１００１２００７４は、転移性癌診断のため、体液中のＣＳＥ１Ｌ又はＣＳＥ１Ｌタンパク質レベルの測定について開示している。ＵＳ２０１１００５３１５７は、医学的疾患及び状況の診断、予後及び治療のため、微小胞（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）中のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びミクロＲＮＡを含む核酸の測定を開示している。ＵＳ２０１１００５３１５７は、被験体からの生物学サンプルから単離された微小胞のＤＮＡ又はＲＮＡバイオマーカーを検出することによって、被験体の疾病その他の医学的状況の診断、予後、監視及び評価を助ける方法；核酸又はタンパク質を含む微小胞を投与することで前記核酸又はタンパク質をターゲットへ伝達する方法；微小胞フリー又は微小胞が濃縮された液体画分を患者に導入することで体液輸注を行う方法、を開示している。ＷＯ２００９０２１３２２及びＵＳ２０１００２５５５１４は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＥＴ、ｃＫｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ｗｎｔ、βカテニン、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、及び微小胞のＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−１及びＣＤ２７６等の癌に関連する細胞の受容体を構成する発癌性タンパク質を検出することによって、癌の診断及び予後の方法、癌の進行及び又は被検者中の抗癌治療の治療効果の監視方法を開示している。上記先行技術は、細胞レベルでのＣＳＥ１Ｌ遺伝子の発現、又は体液中のＣＳＥ１Ｌタンパク質レベルを検出している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の観点は、微小胞の単離、分析、又は病気の診断や治療へ結びつけるため、ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体を含む新規な方法を提供することである。本発明の一つの観点は、被験体の疾患の存在又は進行状況の診断方法を提供することで、該方法は、（ａ）被験体からの生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；（ｂ）コントロールとして、健常者ドナーからの生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；及び（ｃ）被験体及び健常者ドナーの生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルの差異に基づき被験体の疾患の存在又は進行状況の診断、することを含んでいる。
【０００８】
本発明の他の観点は、被験体の癌の存在又は進行状況の診断方法を提供することで、該方法は、（ａ）被験体からの生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；（ｂ）コントロールとして、健常者ドナーからの生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルを測定；及び（ｃ）被験体及び健常者ドナーの生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルの差異に基づき被験体の癌の存在又は進行状況の診断、することを含んでいる。
【０００９】
本発明の更に他の観点は、生体液サンプルから微小胞を単離する方法を提供することで、該方法は、（ａ）生体液サンプルをＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体に接触、；（ｂ）抗体と結合した微小胞を単離、することを含んでいる。
【００１０】
本発明の更なる他の観点は、生体液サンプル中の微小胞の存在を検出する方法を提供することで、該方法は、（ａ）生体液サンプルをＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体に接触；（ｂ）微小胞への抗体結合を検出、することを含んでいる。
【００１１】
本発明の他の観点は、病気の予防又は治療のため、微小胞に結合するＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体の管理を含む方法を提供することである。特に望ましい病気は癌である。
【００１２】
本発明の他の観点は、病気の診断又は治療のため、微小胞に結合するＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体を含む医薬組成物を提供することである。特に望ましい病気は癌である。
【００１３】
本発明の他の目的、特徴及び効果は、発明の詳細な説明及び図面から、当業者であれば明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞中のＲａｓ及びＣＳＥ１Ｌレベルの免疫ブロット法による解析結果を示している。
【図２】図２は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションが、細胞中の微小胞の発生を誘導することを示している。
【図３】図３は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションが、ＣＳＥ１Ｌ分泌物を増加することを示している。
【図４】図４は、ＣＳＥ１Ｌは、リン酸化タンパク質であることを示している。
【図５】図５は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションが、ＣＳＥ１Ｌのリン酸化を増加し、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは癌血清中に存在していることを示している。
【図６】図６は、結腸直腸中のリン酸ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌの高い発現、及びリン酸ＥＲＫの相対染色度が腫瘍中のＣＳＥ１Ｌと一致することを示している。
【図７】図７は、ＣＳＥ１Ｌが、細胞のｖ−Ｈ−ｒａｓ−誘発の微小胞発生を媒介することを示している。
【図８】図８は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓによって誘発された腫瘍細胞の浸潤を媒介することを示している。
【図９】図９は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓ誘発癌細胞の転移を媒介することを示している。
【図１０】図１０は、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞膜に局在し、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は腫瘍を標的にすることができることを示している。
【図１１】図１１は、抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌと反応することを示している。
【図１２】図１２は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、微小胞に局在することを示している。
【図１３】図１３は、癌血清サンプルから単離された微小胞には、通常細胞から単離された微小胞より、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率が高いことを示している。
【図１４】図１４は、結腸直腸癌患者の血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率が高いことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
微小胞（微粒子又はエキソソームと呼ばれることもある)は、細胞から剥がれた原形質膜の断片である。微小胞は、体液や細胞培養中に見られる。微小胞は、体液中又は細胞培養馴化培地に、自由な微小胞として放出されることができる;微小胞はまた、放出されずに、細胞膜結合微小胞として、細胞膜に連結していてもよい（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２００９； Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ここで述べられる方法及び組成物は、自由な微小胞にも、細胞膜結合微小胞にも適用可能である。典型的な微小胞は、１００ｎｍ〜１５μｍである。ここで述べられる方法及び組成物は、全てのサイズの微小胞に適用可能である。
【００１６】
本発明の一つの観点は、ＣＳＥ１Ｌが微小胞の作成を媒介すること、ＣＳＥ１Ｌが微小胞膜に局在すること、ＣＳＥ１Ｌがセリン／スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質であること、及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌが癌患者の血清中に存在すること、を新たに見出したことに基づいている。
【００１７】
本発明の他の新知見は、ＣＳＥ１ＬがＥＲＫ伝達経路に連鎖していること、ＣＳＥ１ＬがＥＲＫ活性化でリン酸化されること、リン酸化されたＣＳＥ１Ｌが癌患者の血清に存在すること、血清中のリン酸化されたＣＳＥ１Ｌの分析は、血清中のＣＳＥ１Ｌの分析より、癌診断に優れていることである（実施例１４）。ＥＲＫ経路の異常活性化は、ヒト腫瘍の多くに共通する本質的な特徴である（Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。それ故、血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのレベルは、健常者ドナーと比較して、癌患者の方が必ず高い。また、血清中のリン酸化されたＣＳＥ１Ｌの分析は、血清中のＣＳＥ１Ｌの分析より感度が高い為、癌診断に優れている。このように、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、癌診断において臨床的有用性がある。
【００１８】
本発明の他の新知見は、ＣＳＥ１ＬがＲａｓ−ＥＲＫ伝達及び癌転移に関連していることである。Ｒａｓ−ＥＲＫ経路は、癌の分子標的薬の開発の潜在的標的である（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＣＳＥ１ＬがＲａｓ−ＥＲＫ伝達及び癌転移に関連している。そして、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、癌患者の血清中に存在している。それ故、血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、分子標的薬の治療と併用して、患者の選定、監視及び管理のための臨床的有用性がある。
【００１９】
本発明の他の新知見は、ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在し、そして、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は、腫瘍を標的とすることができることである。脱落中の微小胞は腫瘍細胞の膜上に広がっており、脱落した微小胞は腫瘍細胞の周囲の細胞外環境に留まる。それ故、微小胞膜タンパク質は、癌治療の潜在的標的となり得る。したがって、微小胞膜中のＣＳＥ１Ｌの局在は、ＣＳＥ１Ｌは癌の治療標的になり得る。
【００２０】
本発明のある観点は、微小胞が腫瘍細胞から放出され、体液中を循環していることを見出したことに基づいている。微小胞の数は、腫瘍の成長に伴い増加する。体液中の微小胞の濃度は、腫瘍量に比例する。腫瘍量が多くなれば、体液中の微小胞の濃度も高くなる。
【００２１】
本発明の他の驚くべき発見は、通常の被験体（健常者ドナー）の体液中にはＣＳＥ１Ｌが存在するが、癌患者の体液中にはリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在することである。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、通常の被験体（健常者ドナー）の体液中には検出されない（実施例５）。もし、タンパク質が細胞から分泌され、タンパク質がリン酸化形態と脱リン酸化形態を持つなら、タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化の両方の形態は、細胞外に分泌される必要は無いと報告されている（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９９４； Ｆｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． １９９７）。それ故、本発明の他の驚くべき発見は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは分泌タンパク質で、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは癌患者の体液中には存在するが、健常者ドナーの体液中には検出されないことである。
【００２２】
本発明のある観点は、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、微小胞膜タンパク質であるとの他の驚くべき発見に基づいている。
【００２３】
本発明の他の観点は、体液からの微小胞の単離又は分析のための方法又はキットに関し、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜タンパク質であるとの知見に基づく。そして、微小胞は、多くの病気の進行を含め、生理学的/病理学的に本質的な役割を果たす。ＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法又はキットは、体液又は培養馴化培地等の生物学的サンプルからの微小胞の捕獲、精製、単離又は分析に用いることができる。微小胞の単離又は分析のためのＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法又はキットは、例えば、超遠心分離、免疫沈降、親和性精製、精密ろ過、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ），酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ）、マイクロアレイ、バイオチップ、クロマトグラフィー、ウエスタンブロット法、マイクロ流体システム、マイクロ流体チップ、及び免疫学的結合を含む他の技術にも適用可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施例は、微小胞の検出又は分析は、光学的方法を用いて実施され、あらゆる光学的方法が用いられる。好ましい光学的方法は、顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、内部反射蛍光顕微鏡法、偏光解析法/反射率測定法、光散乱又は表面プラズモン顕微鏡法が挙げられる。
【００２５】
本発明のある観点は、ＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、微小胞膜タンパク質であり、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体等のＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤は、実施例１０に示されているように、腫瘍を標的とすることができるとの驚くべき発見に基づいている。
【００２６】
ＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む方法又はキットは、治療薬又は細胞毒性薬で接合し、ＣＳＥ１Ｌ−結合剤又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−結合剤を含む医薬組成物又はキットも、同様に、病気治療に用いられる。
【００２７】
本発明の一つの観点は、生物学的サンプルからの液体又は微小胞の中のＣＳＥ１Ｌ量又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ量を測定することで、被験体の病気を診断又は監視するための方法又はキットに関する。決定は、最初に微小胞を単離することなく、又は最初に微小胞を単離した生物学的サンプルを用いて行うことができる。
【００２８】
本発明の他の観点は、被験体の体液から微小胞を単離するステップ、微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌを分析するステップを含む、被験体の病気又は他の医学的状態の診断又は監視をするための方法又はキットに関する。ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌは、定量的及び／又は定性的に分析され、分析結果は、病気又は医学的状態を有する又は有しない１以上のコントロール検体から得られる結果と比較される。被験体の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又は微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの含有量を、コントロールの含有量と比較して差異がある場合は、被験体の進行（例えば、腫瘍サイズ及び腫瘍悪性度の変化）、病気又は他の医学的状態の感受性の有無を示す。
【００２９】
本発明の他の観点は、被験体の体液を収集するステップ、体液中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌを分析するステップを含む、被験体の病気又は他の医学的状態の診断又は監視をするための方法又はキットに関する。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、定量的及び／又は定性的に分析され、分析結果は、病気又は医学的状態を有する又は有しない１以上のコントロール検体から得られる結果と比較される。被験体のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの含有量を、コントロールの含有量と比較して差異がある場合は、被験体の進行（例えば、腫瘍サイズ及び腫瘍悪性度の変化）、病気又は他の医学的状態の感受性の有無を示す。
【００３０】
微小胞は、例えば、凝固疾患、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、糖尿病、血液病、炎症性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、伝染性疾患及び癌等、多くの病気の進行を含め、生理学的/病理学的に本質的な役割を果たす（Ｓｉｍａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６）。本発明における疾患又は他の医学的状態には、凝固疾患、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、糖尿病、血液病、炎症性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、伝染性疾患及び癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明は、癌の診断及び治療方法についても開示する。動物の“癌”とは、癌を引き起こす細胞に典型的な特性を所有する細胞が存在することを意味し、例えば、コントロールできない増殖、不死、転移能、急激な成長及び増殖、並びに、ある特有の形態学的状態及び細胞マーカーが挙げられる。状況によっては、癌細胞は腫瘍の形態であるが、癌細胞は動物内で単独で存在、又は白血病細胞のように独立した細胞として血流中を循環している場合もある。本発明の癌は、全ての種類の癌を含むものであり、例えば、肺癌(非小細胞肺癌等)、結腸直腸癌、大腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び胃癌等の消化器及び胃腸の癌；食道癌;胆嚢癌;肝臓癌; 膵（臓）癌;虫垂癌;乳癌;卵巣癌;腎（臓）癌(例えば、腎細胞癌);中枢神経系癌;皮膚癌；リンパ腫;絨毛腫；絨毛癌；頭頸部癌;骨肉腫;血液癌等が挙げられる。本発明における“腫瘍”は、１以上の癌の細胞を含むことを意味する。
【００３２】
本発明は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質を特異的に認識する抗体の結合による、リン酸化ＣＳＥ１Ｌの検出を開示する。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、セリンリン酸化ＣＳＥ１Ｌ、スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌ、又はチロシンリン酸化ＣＳＥ１Ｌであってもよい。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ′抗体、（Ｆａｂ′）２抗体、又は完全ヒト抗体が挙げられる。
【００３３】
本発明の“生体液サンプル”とは、被験体の体の任意の場所から採取された液体のサンプルを意味し、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、髄液、唾液、胸膜液、細針吸引物、乳頭吸引液、呼吸器官・腸・尿生殖路の液、母乳、涙液、唾液、リンパ系の液、精液、内臓系の液、脳脊髄液、腹水、羊水、腫瘍嚢胞液等が挙げられる。“生体液サンプル”には、培養馴化培地及び培養馴化培地中の細胞が挙げられる。特に好ましい生体液サンプルは、血液、尿、馴化培地である。生体液サンプル中の微小胞は、生体液サンプル中に存在する細胞の膜に関連する微小胞を意味する。馴化培地とは、ボトルから出したばかりの培地ではなく、細胞がしばらくの間培養された培地を意味する。
【００３４】
"被験体"との用語は、微小胞を有する可能性のある全ての動物を意味する。動物は哺乳類を含み、好ましくはヒトである。
【００３５】
“通常の被験体”とは、癌又は他の病気が無い被験体を意味する。
【００３６】
“テスト”被験体は、テストされる被験体を意味する。
【００３７】
“ｉｎ ｖｉｔｒｏ”との用語は、生命体又は生体の外部環境を意味し、通常は、試験管培養等の人工的な環境が挙げられる。
【００３８】
“医学的状態”との用語は、生命体の体内の病気の状態を意味する。
【００３９】
“免疫学的技術”とは、抗体に基づいた検出技術を含む全ての分析を意味し、例えば、ドットプロット法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、直接及び競合ＥＬＩＳＡ法、放射性免疫分析法等の技術が挙げられる。
【００４０】
ドットプロット法は、先ず、サンプルが、ペーパー、ガラスファイバー、プラスチックシート上に付着、固定され、次いで、タンパク質の存在が、例えば、直接又は間接的にラベルされた抗体とのハイブリダイゼーション等、可視化シグナルを作成する多様な方法で決定される分析手順のことを意味する。
【００４１】
“抗体”との用語は、（ａ）免疫グロブリンポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドの免疫学的有効性分（例えば、免疫グロブリンファミリーのペプチド、又はそれら断片で、それらは、特異抗原（例えば、ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ）に免疫学的に結合する抗原結合部位）、又は（ｂ）そのような免疫グロブリンポリペプチド又は抗原（例えば、ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ）に免疫学的に結合する断片の特徴を保持した置換誘導体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を意味する。
【００４２】
抗体は、従来から知られている方法により作成され、例えば、モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、ファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせ等を含む広く知られた技術から調整することができる。
【００４３】
微小胞とＣＳＥ１Ｌ抗体又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体との結合反応は、免疫測定法により検出することができる。典型的な免疫測定法は、微小胞又は抗体が固定化され、未反応成分が除去された後、検出が行われる。細胞、微小胞又は抗体の固定化方法は知られており、例えば、それらは、化学結合又は物理的吸着により固相の上に直接固定化される。あるいは、本発明の抗体がビオチン化される時、アビジン、ストレプトアビジン、又は同種のものを吸着した固相上に、間接的に抗体を固定することも可能である。抗体が磁性粒子に結合している時は、抗体のみならず、抗体に結合している微小胞は、磁石を用いて速やか且つ簡単に検出及び分離される。あるいは、多特異的な抗体のように、多重抗原を認識する抗体を使用した時、抗体は、微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに結合し、そして、他の抗原は抗体に結合することができる。あるいは、抗体は、タンパク質Ａ又はＧ又は同種のものを介して固相上に固定化される。
【００４４】
抗体の固定化のタイミングは特に限定はされず、抗体がサンプルに接触する前、後、又は同時に固定化される。任意の固相が、抗体の固定化に用いられる。それら固相は、膜形成性の、微粒子状の、又は繊維状のキャリヤで、それらは、ガラス；ポリスチレン等の有機ポリマー；及びシリカゲル、アルミナ及び活性炭等の無機材料から作成される。例えば、本発明の抗体は、プレート、皿、試験管又はビーズのような反応容器の内壁上に固定される。
【００４５】
微小胞を検出するための本発明の抗体を用いた微小胞の検出又は定量するための免疫学的方法は、例えば、蛍光抗体法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ ｅｄ． （１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）、ＥＬＩＳＡｓ、ＲＩＡｓ、免疫細胞学的染色及び免疫組織学的染色等の免疫組織化学的染色（ｔｈｅ ＡＢＣ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＣＳＡ ｍｅｔｈｏｄ； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ ｅｄ． （１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明において、“平均値”とは、一つ以上のサンプル中に存在するＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌのレベル又は濃度を決定することで計算し、次いで、レベルの平均値を計算することで求められるものである。平均値は、複数の個々の値を合計し、次いで、複数の数で割ることで求められる。本発明において、“微小胞のＣＳＥ１Ｌの平均量”とは、1以上のコントロール生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌタンパク質の平均含有量を意味する。本発明において、“微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量”とは、1以上のコントロール生体液サンプル中の微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質の平均含有量を意味する。本発明において、“コントロール生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量”とは、1以上のコントロール生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質の平均含有量を意味する。本発明において、“増加量（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｏｕｎｔ）”とは、コントロールサンプルと比較して、テストサンプルの量でプラスに増加した量を意味する。増加は、典型的には少なくとも１０％以上で、又は少なくとも２０％以上、又は５０％、１００％、２倍、少なくとも５倍、１０倍、２０倍であってもよい。
【００４７】
本発明における“カットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｏｒ ｃｕｔ−ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）”とは、疾患や病態を患っている被験体を、疾患や病態を患っていない被験体から区別する閾値を意味する。カットオフ値は、診断ツールとして利用される統計的に求められた最適数値で、試験値の手段及び標準偏差（ＳＤ）は、患者のカテゴリーから読み出されたグループ値から計算される。患者の試験値がこのカットオフ値より低い時は、患者は陰性（癌が無い）で、試験値がカットオフ値より大きい又は等しい時は、患者は陽性（癌がある）と考えられる。
【００４８】
本発明の“医薬組成物”とは、１以上の製剤原料及び添加剤との混合物を意味する。
【００４９】
本発明の“医薬品賦形剤、希釈剤又はキャリヤ”は、一般的な医薬品賦形剤、希釈剤又はキャリヤを含み、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油の乳液、及び多様なタイプの湿潤剤が挙げられる。また、この用語は、ＵＳ連邦政府の規制当局が認可している又はヒトを含む動物に使用可能であるとして米国薬局方が公表している物質を含む。
【００５０】
本発明における“キット”は、使用されるためにパッケージされている化合物、組成物、混合物、計器、装置を含む、1以上のアイテムを意味するが、これらに限定されるものではない。キットには、説明書が含まれていてもよい。
【００５１】
本発明において、他の特定されていない技術又は科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者が一般的に理解する意味と同様である。本発明で述べられている方法及び材料に類似した全ての方法及び材料も、本発明において使用することができ、その中で、特に好ましい方法及び材料が以下に記載されている。ここに使用されるように、用語の各々は、このセクションの中で関連する意味を有する。本発明は、特別な手順、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、変更できるものである。また、ここに使用される専門用語は、特別の実施例について記載するためにのみ用いられており、本発明の範囲を制限するものではない。発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義される。
【００５２】
タンパク質及びその遺伝子は周知である。ＣＳＥ１Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ３３２８６）は以下のとおりである。
SEQ ID NO: 1
1 gtcgcgccat tttgccgggg tttgaatgtg aggcggagcg gcggcaggag cggatagtgc
61 cagctacggt ccgcggctgg ggttccctcc tccgtttctg tatccccacg agatcctata
121 gcaatggaac tcagcgatgc aaatctgcaa acactaacag aatatttaaa gaaaacactt
181 gatcctgatc ctgccatccg acgtccagct gagaaatttc ttgaatctgt tgaaggaaat
241 cagaattatc cactgttgct tttgacatta ctggagaagt cccaggataa tgttatcaaa
301 gtatgtgctt cagtaacatt caaaaactat attaaaagga actggagaat tgttgaagat
361 gaaccaaaca aaatttgtga agccgatcga gtggccatta aagccaacat agtgcacttg
421 atgcttagca gcccagagca aattcagaag cagttaagtg atgcaattag cattattggc
481 agagaagatt ttccacagaa atggcctgac ttgctgacag aaatggtgaa tcgctttcag
541 agtggagatt tccatgttat taatggagtc ctccgtacag cacattcatt atttaaaaga
601 taccgtcatg aatttaagtc aaacgagtta tggactgaaa ttaagcttgt tctggatgcc
661 tttgctttgc ctttgactaa tctttttaag gccactattg aactctgcag tacccatgca
721 aatgatgcct ctgccctgag gattctgttt tcttccctga tcctgatctc aaaattgttc
781 tatagtttaa actttcagga tctccctgaa ttttgggaag gtaatatgga aacttggatg
841 aataatttcc atactctctt aacattggat aataagcttt tacaaactga tgatgaagag
901 gaagccggct tattggagct cttaaaatcc cagatttgtg ataatgccgc actctatgca
961 caaaagtacg atgaagaatt ccagcgatac ctgcctcgtt ttgttacagc catctggaat
1021 ttactagtta caacgggtca agaggttaaa tatgatttgt tggtaagtaa tgcaattcaa
1081 tttctggctt cagtttgtga gagacctcat tataagaatc tatttgagga ccagaacacg
1141 ctgacaagta tctgtgaaaa ggttattgtg cctaacatgg aatttagagc tgctgatgaa
1201 gaagcatttg aagataattc tgaggagtac ataaggagag atttggaagg atctgatatt
1261 gatactagac gcagggctgc ttgtgatctg gtacgaggat tatgcaagtt ttttgaggga
1321 cctgtgacag gaatcttctc tggttatgtt aattccatgc tgcaggaata cgcaaaaaat
1381 ccatctgtca actggaaaca caaagatgca gccatctacc tagtgacatc tttggcatca
1441 aaagcccaaa cacagaagca tggaattaca caagcaaatg aacttgtaaa cctaactgag
1501 ttctttgtga atcacatcct ccctgattta aaatcagcta atgtgaatga atttcctgtc
1561 cttaaagctg acggtatcaa atatattatg atttttagaa atcaagtgcc aaaagaacat
1621 cttttagtct cgattcctct cttgattaat catcttcaag ctggaagtat tgttgttcat
1681 acttacgcag ctcatgctct tgaacggctc tttactatgc gagggcctaa caatgccact
1741 ctctttacag ctgcagaaat cgcaccgttt gttgagattc tgctaacaaa ccttttcaaa
1801 gctctcacac ttcctggctc ttcagaaaat gaatatatta tgaaagctat catgagaagt
1861 ttttctctcc tacaagaagc cataatcccc tacatcccta ctctcatcac tcagcttaca
1921 cagaagctat tagctgttag taagaaccca agcaaacctc actttaatca ctacatgttt
1981 gaagcaatat gtttatccat aagaataact tgcaaagcta accctgctgc tgttgtaaat
2041 tttgaggagg ctttgttttt ggtgtttact gaaatcttac aaaatgatgt gcaagaattt
2101 attccatacg tctttcaagt gatgtctttg cttctggaaa cacacaaaaa tgacatcccg
2161 tcttcctata tggccttatt tcctcatctc cttcagccag tgctttggga aagaacagga
2221 aatattcctg ctctagtgag gcttcttcaa gcattcttag aacgcggttc aaacacaata
2281 gcaagtgctg cagctgacaa aattcctggg ttactaggtg tctttcagaa gctgattgca
2341 tccaaagcaa atgaccacca aggtttttat cttctaaaca gtataataga gcacatgcct
2401 cctgaatcag ttgaccaata taggaaacaa atcttcattc tgctattcca gagacttcag
2461 aattccaaaa caaccaagtt tatcaagagt tttttagtct ttattaattt gtattgcata
2521 aaatatgggg cactagcact acaagaaata tttgatggta tacaaccaaa aatgtttgga
2581 atggttttgg aaaaaattat tattcctgaa attcagaagg tatctggaaa tgtagagaaa
2641 aagatctgtg cggttggcat aaccaactta ctaacagaat gtcccccaat gatggacact
2701 gagtatacca aactgtggac tccattatta cagtctttga ttggtctttt tgagttaccc
2761 gaagatgata ccattcctga tgaggaacat tttattgaca tagaagatac accaggatat
2821 cagactgcct tctcacagtt ggcatttgct gggaaaaaag agcatgatcc tgtaggtcaa
2881 atggtgaata accccaaaat tcacctggca cagtcacttc acatgttgtc taccgcctgt
2941 ccaggaaggg ttccatcaat ggtgagcacc agcctgaatg cagaagcgct ccagtatctc
3001 caagggtacc ttcaggcagc cagtgtgaca ctgctttaaa ctgcattttt ctaatgggct
3061 aaacccagat ggtttcctag gaaatcacag gcttctgagc acagctgcat taaaacaaag
3121 gaagttttcc ttttgaactt gtcacga
【００５３】
ＣＳＥ１Ｌタンパク質（タンパク質ＩＤ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ５０３６７．１）のアミノ酸配列は以下のとおりである。
SEQ ID NO: 2
MELSDANLQTLTEYLKKTLDPDPAIRRPAEKFLESVEGNQNYPL
LLLTLLEKSQDNVIKVCASVTFKNYIKRNWRIVEDEPNKICEADRVAIKANIVHLMLS
SPEQIQKQLSDAISIIGREDFPQKWPDLLTEMVNRFQSGDFHVINGVLRTAHSLFKRY
RHEFKSNELWTEIKLVLDAFALPLTNLFKATIELCSTHANDASALRILFSSLILISKL
FYSLNFQDLPEFWEGNMETWMNNFHTLLTLDNKLLQTDDEEEAGLLELLKSQICDNAA
LYAQKYDEEFQRYLPRFVTAIWNLLVTTGQEVKYDLLVSNAIQFLASVCERPHYKNLF
EDQNTLTSICEKVIVPNMEFRAADEEAFEDNSEEYIRRDLEGSDIDTRRRAACDLVRG
LCKFFEGPVTGIFSGYVNSMLQEYAKNPSVNWKHKDAAIYLVTSLASKAQTQKHGITQ
ANELVNLTEFFVNHILPDLKSANVNEFPVLKADGIKYIMIFRNQVPKEHLLVSIPLLI
NHLQAGSIVVHTYAAHALERLFTMRGPNNATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKALTLPGS
SENEYIMKAIMRSFSLLQEAIIPYIPTLITQLTQKLLAVSKNPSKPHFNHYMFEAICL
SIRITCKANPAAVVNFEEALFLVFTEILQNDVQEFIPYVFQVMSLLLETHKNDIPSSY
MALFPHLLQPVLWERTGNIPALVRLLQAFLERGSNTIASAAADKIPGLLGVFQKLIAS
KANDHQGFYLLNSIIEHMPPESVDQYRKQIFILLFQRLQNSKTTKFIKSFLVFINLYC
IKYGALALQEIFDGIQPKMFGMVLEKIIIPEIQKVSGNVEKKICAVGITNLLTECPPM
MDTEYTKLWTPLLQSLIGLFELPEDDTIPDEEHFIDIEDTPGYQTAFSQLAFAGKKEH
DPVGQMVNNPKIHLAQSLHMLSTACPGRVPSMVSTSLNAEALQYLQGYLQAASVTLL
【００５４】
リン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質（タンパク質ＩＤ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ５０３６７．１）に特異的な抗体を作成するために用いられるリン酸化タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりである。
LTpEYpLKKTLDPDPAC(Ｔｐはリン酸スレオニンを表し、Ｙｐはホスホチロシンを表す)
【実施例】
【００５５】
＜テスト材料と方法＞
【００５６】
〔抗体〕
実験で用いられた抗体は、抗−ｐ２１／ｒａｓ（ＥＰ１１２５Ｙ）（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗−ＣＳＥ１Ｌ（３Ｄ８）及び抗−ＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３（リン酸 Ｔ２０２／２０４，Ｇ１５−Ｂ）（Ａｂｎｏｖａ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）；抗−ＣＳＥ１Ｌ（２４）、抗−ホスホチロシン（ＰＹ２０）、及び抗−ホスホセリン／スレオニン（２２Ａ／ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗−β−チューブリン（Ｄ６６）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；抗−β−アクチン（Ａｂ−５）及び抗−ＧＦＰ（Ａｂ−１）（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗−ＭＭＰ−２（Ｈ−７６）及び抗−ホスホスレオニン（Ｈ２）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（又は５６８）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）に結合しているヤギ抗−マウス（又は抗−ウサギ）ＩｇＧ２次抗体。
【００５７】
〔プラスミド〕
ネオマイシン選択マーカーを有するｖ−Ｈ−Ｒａｓ（ｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ）発現ベクターは、Ｄｒ．Ｃｈａｎｎｉｎｇ Ｊ Ｄｅｒから提供を受けた。ネオマイシン選択マーカーを有する哺乳類のＣＳＥ１Ｌ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌ）は、ＣＳＥ１Ｌ ｃＤＮＡ（Ａｐａ Ｉ、ｐＧＥＭ−ＣＳＥ１Ｌ ｖｅｃｔｏｒのＩ断片ではない。）を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＡｐａＩ及びＩでないサイトに挿入することで作成される。ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ プラスミド（ｓｃ−２９９０９−ＳＨ）は、ＣＳＥ１Ｌの発現をノックダウンするように設計されている。また、いかなる細胞情報の特異的分解を導かない暗号化したｓｈＲＮＡ配列をエンコードする、コントロールｓｈＲＮＡプラスミド（ｓｃ−１０８０６０）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に注文した。ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミド及びコントロールｓｈＲＮＡプラスミドは、ピューロマイシン選択マーカーを有する。
【００５８】
〔細胞及びＤＮＡトランスフェクション〕
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞は、熱不活性化ウシ胎仔血清を１０％、ペニシリンを１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシンを１００ｍｇ／ｍｌ、及びグルタミン酸塩を２ｍｍｏｌ／Ｌ添加したダルベッコ改変イーグル培地で、５％ＣＯ2の加湿条件下、３７℃で培養した。Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を得るため、リオフェクチンプラス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の手順書にしたがい、Ｂ１６Ｆ１０細胞に、コントロールｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１エンプティベクター＋コントロールｓｈＲＮＡプラスミド、ｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ＋コントロールｓｈＲＮＡプラスミド、ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌ＋コントロールｓｈＲＮＡプラスミド、及びｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ＋ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミドが導入された。形質転換された細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で３週間、次いで、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで３週間処理することで選択された。多剤抵抗性を有するコロニー（＞５０）は、集められ集団培養された。形質転換した細胞は、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地中に保管された。実験には、Ｇ４１８及びピューロマイシンを含まない培地で培養された細胞を用いた。
【００５９】
〔免疫ブロット法〕
細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、氷冷した放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファー［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ–ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２５ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、５ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、及び５ｍＭ フッ化ナトリウム］に溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定した。タンパク質サンプルは、各々５０μｇを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せた。タンパク質は、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に転写された。膜は、ブロッキングバッファー［１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ–ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０］を用い、室温で１時間ブロックされた。ブロットは、１次抗体と４℃で一晩インキュベートされ、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合している２次抗体と１時間インキュベートされた。タンパク質レベルは、Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ)を用い、手順書に従って測定した。
ビオチン結合抗体で免疫ブロットするため、ビオチン結合抗体は、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２ ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の手順書に従って、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体をビオチニル化することによって調整された。次いで、免疫ブロットは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジンと反応し、タンパク質量はＦｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅによって検出される。
【００６０】
〔免疫蛍光測定法及び微小胞のスコアリング〕
ガラスカバースライド（１２×１２ｍｍ）上で４日間成長した細胞は、１０００ｒｐｍで１０分間、サイトスピンすることでスライド上に密着した。細胞は、ＰＢＳで洗浄され、４％パラホルムアルデヒドで固定され、メタノールで透過処理され、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックされた。サンプルは、一次抗体で１時間インキュベートされた。サンプル、次いでＰＢＳで３回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（又は５６８）に結合している２次抗体とインキュベートされ、倒立蛍光顕微鏡で測定された。各実施条件で、表面に微小胞を示した細胞が確認された。３００の細胞がそれぞれの実施で観察され、３つの独立した実施のデータが、ブロットされた。標準偏差棒が示される。
【００６１】
〔細胞増殖分析〕
同じ数の細胞（１×１０４細胞／ｄｉｓｈ）が、１００ｍｍの培養皿に播種された。培地は、３日毎に新しいものに交換された。細胞数は、細胞播種後、２４時間毎に、トリパンブルー色素排除分析法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）によりカウントされた。カウントの際には、３つのプレートの細胞数がカウントされ、それぞれのプレートは１回のみカウントした。
【００６２】
〔馴化培地〕
細胞は、対数増殖期中期から後期に入ったあたりの状態（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖され、ＰＢＳで洗浄され、ウシ胎仔血清を含まない培地に変更された。４８時間のインキュベーション後、馴化培地は回収され、細胞数がカウントされた。浮遊している可能性のある細胞を除く為、培地は１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、その後、上澄みが回収された。
【００６３】
〔微小胞の調整〕
微小胞は、サイズ排除クロマトグラフィー及び超遠心分離法により、馴化培地又は血清から調整された。馴化培地又は血清は、ＰＢＳで平衡化されたセファロース２Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に入れられた。フラクション（１ｍｌ）が集められ、タンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することでモニターした。＞５０ミリオンｋＤａのタンパク質を含む空隙容量ピーク材料は、４℃、１０５，０００ｇで１時間遠心分離された。ペレットは微小胞を含み、５０μｌのＰＢＳに再縣濁された。
【００６４】
〔 免疫沈降〕
プラスチック皿で成長した細胞は、ＰＢＳで洗浄され、免疫沈降溶解バッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％ デオキシコール酸、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２５ｍＭ β−グリセロリン酸エステル、５ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、５ｍＭ フッ化ナトリウム］で、４°Ｃ、２０分間インキュベートした。細胞は掻き集められ、ピペッティングにより破壊された。細胞溶解物は、１２，０００ｇ、４℃、１０分間の遠心分離で、不溶性物質が除去され、タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質分析ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。細胞溶解物（５００μｇ）は、免疫沈降バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］中の一次抗体と、４°Ｃ、３時間、インキュベーとされ、次いで、タンパク質Ａ／Ｇスラリーに、アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）が添加され、更に、２時間インキュベーとされた。免疫沈降物は、溶解バッファーで３回洗浄され、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに置かれ、抗体で免疫ブロットされた。マウス抗−ＧＦＰ抗体が、コントロール反応として用いられた。血清サンプルの免疫沈降のため、血清は、アガロース結合抗−リン酸スレオニン抗体（Ｈ２）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含むＰＢＳバッファーで、４℃で、緩やかな旋回をかけながら一晩インキュベーとされた。免疫沈降物は、免疫沈降溶解バッファーで３回洗浄され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられ、次いで、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体と免疫ブロットされた。コントロール免疫沈降は、アガロース結合通常マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて実施された。
【００６５】
〔 ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質の生成〕
ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質は、ＥＮＤＥＸＴ技術手順書（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）に記載されている方法に従って、小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて生成した。簡単に説明すると、ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌベクター中のＣＳＥ１Ｌのオープン・リーディング・フレームが制限酵素で切断され、小麦胚芽発現ベクターｐＰＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローンされた。ＣＳＥ１Ｌ ｍＲＮＡの転写は、２μｇのサブクローンプラスミドを、転写プレミックス溶液（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むチューブに加えることで行われた。混合液は、転写反応のため、３７℃で６時間インキュベートされた。翻訳反応のため、１０μｌのｍＲＮＡ混合物が、１０μｌの小麦胚芽抽出溶液（ＷＥＰＲＯ ３２４０，ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に加えられた。翻訳混合物（２０μｌ）は、下層に翻訳混合物を含む２層を形成するために、ＳＵＢ−ＡＭＩＸ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むウェルの底に移された。２６℃で１６時間のインキュベーション後、混合物は、ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質の精製のために用いられた。ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質は、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ及びＢｕｌｋ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製を行った。精製されたＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質は、トロンビンで開裂され、ＧＳＴは、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて除去された。
【００６６】
〔組織マイクロアレイ及び免疫組織化学〕
パラフィンブロック中の癌組織から取り出された組織及び非癌組織から取り出された組織が、縦方向に切断され、組織マイクロアレイを作成するため、ＢｉｏｓｙｎＭａｔｒｉｃ Ｈａｎｄｍａｄｅ Ｋｉｔ（Ｆｏｒｍｏｓａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ）のマニュアル方法を用いて、新しいパラフィンブロック中に配置された。現発癌の形態学的な代表領域の存在を確認するため、組織セクション（４−μｍ）が、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。免疫組織化学が、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｄ８）又は抗−ＭＡＰＫ１／ＭＡＰＫ３（リン酸Ｔ２０２／２０４）抗体の５０倍希釈物を用いて実施された。免疫組織化学検出は、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の標識ストレプトアビジン−ビオチン法を用いて、手順書とおりに実施した。切片は、ジアミノベンジジンと反応させられ、蒸留水で洗浄され、マイヤーヘマトキシリンで対比染色された。
【００６７】
〔マトリゲル基底膜浸潤性分析（Ｍａｔｒｉｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）〕
マトリゲル基底膜浸潤性分析は、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び孔サイズが８μｍのポリビニルピロリドン−フリー ポリカーボネート フィルター（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−ｆｒｅｅ ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｆｉｌｔｅｒｓ）（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行われた。フィルターは、４℃で一晩、３７℃で更に２時間、マトリゲル（１：１０ ｉｎ ＤＭＥＭ）でコートされた。フィルターは、ＤＭＥＭで３回洗浄され、ミクロ走行性チャンバー（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｃｈａｍｂｅｒｓ）に置かれた。細胞は、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡで洗浄され、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ培地中に再縣濁され、次いで、血清−フリーＤＭＥＭ培地で洗浄された。細胞（３×１０５）は、ＤＭＥＭ（２００μｌ）に縣濁され、走行性チャンバーの上方コンパートメントに置かれた。ＦＢＳを２０％含む培地（３００μｌ）が、化学誘引物質源として走行性チャンバーの下方コンパートメントに置かれた。培養インキュベーターで１２時間のインキュベート後、フィルターの上面の細胞は、綿棒で完全に拭き取られた。フィルターの下面の細胞は、メタノールで固定され、Ｌｉｕ’ｓ Ａ及び Ｌｉｕ’ｓ Ｂ試薬で染色され、そして、顕微鏡でカウントされた。ミクロ走行性チャンバーに浸入した細胞も、同様にカウントされた。分析は、３回繰り返され、各々の分析は、夫々の細胞ライン用フィルターの複製を４回繰り返して行われた。各複製のため、選択されたフィールドから任意の１０の腫瘍細胞が決められ、カウントが平均化された。
【００６８】
〔免疫金電子顕微鏡法（Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）〕
細胞は、ＰＢＳで洗浄され、Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ６．８）中、１５分間、０．５％グルタルアルデヒド及び２％パラホルムアルデヒド混合物で固定され、次いで、２％パラホルムアルデヒドを含むＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ６．８）中、４℃で１４日間固定された。サンプルは、８０％エタノールで脱水処理され、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ ＨＭ２０樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の濃縮物に浸透した。Ｌｏｗｉｃｒｙｌ ＨＭ２０樹脂のポリマー化は、２４時間、ＵＶ照射（波長ピーク３６０ｎｍ）することで行った。極薄切片は、切断及び２％ネオプレン（Ｏｈｋｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でコートされたニッケル格子上に固定された。１００％エタノールに３分間浸漬後、サンプルは、６５℃の０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に２４時間浸漬した。サンプルは、ＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄され、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１５分間、ブロックされた。サンプルは、ＰＢＳに希釈された一次抗体（１：３０）の混合物とインキュベートされ、ＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄され、１８−ｎｍ（又は１２−ｎｍ）の金標識２次抗体と反応し、次いで、ＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄した。サンプルは、酢酸ウラニルで染色され、透過型電子顕微鏡（日立社製 Ｈ−７０００、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察された。
【００６９】
〔ゼラチン酵素電気泳動分析（Ｇｅｌａｔｉｎ ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ Ａｓｓａｙ）〕
細胞数が標準化された馴化培地から採取された微小胞は、１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。ゲルは、ＳＤＳを除去するため、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３０分間洗浄され、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含むバッファーで、３７℃で２４時間、インキュベートした。ゲルは、クマシーブルー Ｒ−２５０（０．１２５％ Ｃｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０、５０％ メタノール、１０％ 酢酸）で３０分間染色され、脱色液（２０％ メタノール、１０％ 酢酸、７０％ ｄｄＨ２Ｏ）で、鮮明なバンドが視認できるまで脱色した。
【００７０】
〔動物の転移実験〕
６〜７週（Ｎ＝１８）及び１４〜１５週（Ｎ＝２６）のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）が、標準状態の動物飼育室（２２℃；湿度５０％、１２時間の明暗周期）で飼育された。実験は、４つのグループ（Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞が注入されたマウス）で行われ、異なる週齢のマウスも同様に４つのグループに分配された。それぞれのマウスには、生きている細胞（１００μｌＰＢＳ中に３×１０４細胞／ｍｏｕｓｅ）が、尾静脈注射された。実験は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞がそれぞれ注射された１１、１４、８及び１１匹のマウスで行われた。注射後３週間で、マウスは解剖された。肺中の腫瘍細胞数は、肉眼検査及び顕微鏡検査で行われた。マウスのケアと実験は、台湾中央研究院（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ， Ｔａｉｗａｎ）の動物ケア委員会のガイドラインに従って実施した。１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の注射後、３週間後までに、それぞれ、３、１０、４、１匹のマウスが死亡したので、それらは、統計から除外した。また、１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を注射したマウスの内、それそれ、１、１、０、３匹のマウスは肺に腫瘍細胞が成長しなかったので、統計から除外した。
【００７１】
〔患者と腫瘍サンプル〕
結腸直腸癌のサンプルは、中華キリスト病院（Ｃｈａｎｇｈｕａ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において、ＩＲＢ−承認ガイドラインを用い、診察時にインフォームド・コンセントを行い、且つ未治療の１１５の連続した患者から得られた。すべての患者は、関与の前に、施設内倫理委員会が承認したガイドラインを用いてインフォームド・コンセントを行い説明事項について理解した。腫瘍は、段階に分けられ、対がん米国合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）の癌ステージマニュアルに従って、分類された。コントロールの健常者の血清サンプルは、６０人の健常個体（平均年齢６１．０±８．７歳、年齢範囲２２〜７１歳）から得られた。血清サンプルは、血液が凝固するよう少なくとも３０分は室温で放置した。懸濁の可能性のある細胞及び血清中の細胞破片を除去するため、サンプルは、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、上澄みは回収された後、−８０℃で保存した。表１は、患者の基本特性を示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
ａ平均±ＳＤ．ｂグレード１:十分分化（ｗｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、グレード２：適度に分化（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、グレード３：低分化（ｐｏｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）。cＮ０:リンパ節部分転移無し、Ｎ１：１〜３か所のリンパ節転移、Ｎ２：４か所以上のリンパ節転移、dＭ０:遠隔転移無し、Ｍ１：遠隔転移あり
【００７４】
〔Ｉｎ ｖｉｖｏ 腫瘍イメージング〕
抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（ｃｌｏｎｅ２４）及び抗−マウスＩｇＧが、Ｑｄｏｔ８００抗体複合体キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、キット添付マニュアルに従って量子ドットに抱合された。Ｑｄｏｔは、Ｎ−コハク酸イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）で活性化され、抗体はジチオスレイトールで還元された。還元された抗体は、活性化されたＱｄｏｔｓと共有結合し、複合化反応は、β―メルカプトエタノールで抑えられた。複合体は、限外ろ過により濃縮されサイズ除去クロマトグラフィーにより精製された。複合体の濃縮物は、蛍光分光計により決定された。
週齢６〜７のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスは、生きているＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞（１００μｌＰＢＳ中に３×１０４細胞／ｍｏｕｓｅ）が背面皮膚に注射された。腫瘍細胞の接種から３週間後、マウスの腫瘍は、量子ドット−接合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体又は量子ドット−接合抗−マウスＩｇＧ（１００μｌのＰＢＳ中５００ｐｍｏｌｅ／ｍｏｕｓｅ）と共に、尾静脈に注入された。マウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２００イメージング・システム（励起：５２５／５０ｎｍ；発光：８３２／６５ｎｍ）を用い、注入後、０、１及び４時間経過時に観察した。ＮＩＲ蛍光画像は、カメラで撮影された。
【００７５】
〔リン酸化−ＣＳＥ１Ｌに特異的な抗体の作製〕
リン酸タンパク質、ＬＴｐＥＹｐＬＫＫＴＬＤＰＤＰＡＣ(Ｔｐは、リン酸スレオニン及びＹｐはリン酸チロシンを意味する）、及び非リン酸タンパク質、ＬＴＥＹＬＫＫＴＬＤＰＤＰＡＣは、固相法を用いて合成された。リン酸化されたタンパク質は、Ｎ−末端システインのチオールを介して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合した。ニュージーランドウサギが、タンパク質で５回免疫を与えられた。免疫血清は、最後の免疫付与から１週間後に回収された。ＩｇＧフラクションは、プロテインＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製された。抗体は、リン酸化タンパク質アフィニティーカラムで精製され、次いで、非リン酸特異的抗体を除去するため、非リン酸タンパク質クロス吸着を行った。力価と抗体特異性は、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット法でテストされた。
【００７６】
〔ドットブロット〕
精製された微小胞懸濁液（５μｌ）が、９６ウェルのドットブロットマニフォールド装置（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の夫々のウェルに滴下された。膜は、ブロッキングバッファー［１％ＢＳＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０］を用い室温で１時間、ブロックされた。ブロットは、４℃で一晩、一次抗体とインキュベートされ、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した２次抗体と１時間インキュベーションされた。タンパク質レベルは、Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、キットの添付マニュアルに従って検出した。
【００７７】
〔ＥＬＡＳＡ〕
血清サンプルは、９６−ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ＭａｘｉＳｏｒｂ ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて４℃で一晩、複製した。サンプルは吸引され１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックされた。ブロッキングバッファーが除去され、次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄された。ウェルは、ビオチン結合抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体又はビオチン結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で１時間、インキュベートされた。ビオチン結合抗体又はビオチン結合抗体は、ビオチンラベル キット−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、抗体をビオチン化することで準備した。ウェルは、次いでＰＢＳＴで洗浄され、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）と反応され、次いで、基質試薬（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベーションした。校正のため、ＰＢＳを含む３つのブランクウェルが、バックグランド値の測定に用いられ、ＰＢＳを含む、且つ他のＥＬＩＳＡ試薬のすべてと反応した３つのブランクウェルがコントロールウェルとして用いられた。４５０ｎｍにおける吸光度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、３０分以内に測定した。コントロールウェルのもっとも高いＯＤ値より高いサンプルウェルのＯＤ値は、ＳＥ１Ｌ陽性、又はリン酸化ＣＳＥ１陽性と考えられる。
【００７８】
〔統計的分析〕
データは、ＳＰＳＳ １４．０統計ソフトを用いて分析された。統計学的差異は、フィッシャーの正確確率検定で両側検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）を行い分析した。α−ｌｅｖｅｌ≦０．０１は、統計学的に意義があると考えられた。
【００７９】
＜実施例１＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓが導入された安定細胞の作製、ＣＳＥ１Ｌ、及びｖ−Ｈ−ｒａｓ ｐｌｕｓ ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ発現プラスミド〕
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞にｖ−Ｈ−ｒａｓコーディング領域を運ぶレトロウィルス発現ベクターであるｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓが導入された；ｐｃＤＮＡ−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞を得るための人ＣＳＥ１Ｌコーディング領域を運ぶレトロウィルス発現ベクター；Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を得るためのｐＺＩＰ−ｖ−Ｈ−ｒａｓ ｐｌｕｓ ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミド。コントロールとして、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞に、如何なる細胞メッセージも伝えないごちゃ混ぜになったｓｈＲＮＡ配列をコードするコントロールｓｈＲＮＡプラスミド（ｐｓｈＥＶ）が導入された；Ｂ１６Ｆ１０細胞に、Ｂ１６−ｄＥＶ細胞を得るためコントロールベクターｐｓｈＥＶ及びｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１が導入された。免疫ブロットの結果は、ＲａｓレベルはＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞で増加したことを示した；ＣＳＥ１Ｌレベルは、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞で増加し、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞で減少したことを示した（図１）。
【００８０】
図１は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞中の、Ｒａｓ及びＣＳＥ１Ｌのレベルのイムノブロット解析を示してい。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に、コントロールの空のベクター、ｖ−Ｈ−ｒａｓ、ＣＳＥ１Ｌ、及びｖ−Ｈ−ｒａｓ ｐｌｕｓ ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ発現プラスミドを導入したもの、すなわち、それぞれ図示されている、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞から調整された細胞溶解物中のＲａｓ及びＣＳＥ１Ｌのレベルは、抗−ＣＳＥ１Ｌ及び抗−Ｒａｓ抗体との免疫ブロットにより分析された。β−アクチンレベルがコントロールとして分析された。
【００８１】
＜実施例２＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する腫瘍細胞微小胞の生成〕
ｒａｓ腫瘍遺伝子は、細胞形質転換の重要な伝達物質で、多様な種類の人癌に存在する；ＥＲＫは、多様な種類の細胞外刺激やＲａｓ及びＥｒｂＢ等のプロトオンコジーンファミリーに応答して活性化され、分子標的治療の重要なターゲットである（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００７）。顕微鏡検査では、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞表面は多くの気泡状の微小胞で覆われているが、Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６−ｄＥＶコントロール細胞では確認されなかった（図２Ａ）。細胞外小胞の形成は、しばしば、偽足（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉａ）又は突起伸長（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）と一体となっている（Ｂｉａｎｃｏ ｅｔ ａｌ． ２００５）。微小胞の成長の存在は、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞の偽足又は細胞質の底部に観察された（図２Ｂ）。脱落微小胞は、メタロプロテイナーゼで濃縮されていた（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００２）。メタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）基質は、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞中の微小胞に局在する（図２Ｃ）。ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、微小空胞ＭＭＰ−２及びＰＤ９８０５９レベルを増加した。それは潜在的なＥＲＫ活性阻害因子、微小胞中でｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した増加したＭＭＰ−２の弱毒化の治療の可能性を意味する（図２Ｄ）。ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色は、細胞中にアポトーシスに関するクロマチン凝縮／分解のサインが無いことを示している。つまり、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞膜の微小胞の存在は微小胞の生成に関与しており、ＥＲＫはｖ−Ｈ−ｒａｓによって誘導される微小胞の形成に関与している。
【００８２】
図２は、Ｖ−Ｈ−ｒａｓが細胞中で微小胞の発生を誘導していることを示している。（Ａ）ガラスカバースライド上で４日間成長したＢ１６Ｆ１０、Ｂ１６−ｄＥＶ、及びＢ１６−Ｒａｓ細胞の反転顕微鏡写真。（Ｂ）Ｂ１６−Ｒａｓ細胞の偽足（矢印）の底部及び細胞膜（矢印）での微小胞の成長の存在。（Ｃ）抗−ＭＭＰ−２抗体による免疫蛍光は、ＭＭＰ−２がＢ１６−Ｒａｓ細胞中の微小胞（矢印）に位置していたことを示した。（Ｄ）ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で４８時間処理された、血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−Ｒａｓ細胞の細胞数が標準化された馴化培地から採取された微小胞の微小空胞ＭＭＰ−２のレベル。
【００８３】
＜実施例３＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションがＣＳＥ１Ｌ分泌物を増加〕
免疫ブロットの結果は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションがＣＳＥ１Ｌ分泌物を増加することを示した。また、ＰＤ９８０５９処理は、Ｂ１６Ｆ１０細胞のｖ−Ｈ−ｒａｓ−誘導ＣＳＥ１Ｌ分泌物の増加を弱めた（図３）。ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクション及びＰＤ９８０５９処理は、細胞中のＣＳＥ１Ｌ発現に明らかに影響したとはいえなかった（図３）。したがって、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、ＣＳＥ１Ｌ分泌物を刺激し、このことはＥＲＫ活性に関係した。
【００８４】
図３は、ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で４８時間処理された血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−Ｒａｓ細胞の細胞数が標準化された馴化培地から採取された細胞の溶解物及び馴化培地のＣＳＥ１Ｌレベルを示しており、ビオチン結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジンを用いた免疫ブロット解析の結果である。
【００８５】
＜実施例４＞
〔ＣＳＥ１Ｌは、セリン／スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質〕
ＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質が、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成された。免疫ブロットは、合成されたＣＳＥ１Ｌタンパク質は、抗−リン酸セリン／スレオニン及び抗−ホスホチロシン抗体と反応した（図４）。したがって、ＣＳＥ１Ｌは、セリン／スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質である。
【００８６】
図４は、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成されたＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌタンパク質、並びにリン酸セリン／スレオニン、ホスホチロシン及びＣＳＥ１Ｌに対する抗体を用いた、ＣＳＥ１Ｌのリン酸化反応の免疫ブロット解析を示している。ＣＳＥ１Ｌタンパク質は、トロンビンを含むＧＳＴ−ＣＳＥ１Ｌ融合タンパク質の開裂により得られた。レーン２は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及びＡ／Ｇ ｐｌｕｓ−ａｇａｒｏｓｅで処理されたＢ１６−ｄＥＶの上澄みを回収することで生成したＣＳＥ１Ｌが枯渇した細胞溶解物である。
【００８７】
＜実施例５＞
〔ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションはＣＳＥ１Ｌリン酸化を増加し、リン酸化ＣＳＥ１Ｌは癌血清中に存在〕
Ｂ１６−ｄＥＶ細胞、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞、及びＰＤ９８０５９で処理されたＢ１６−Ｒａｓ細胞から精製された細胞溶解物中のＣＳＥ１Ｌタンパク質は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）結合抗−リン酸スレオニン抗体で免疫ブロットされた。結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞へのｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、ＣＳＥ１Ｌのスレオニンのリン酸化反応を増加し、そして、ＰＤ９８０５９処理は、ＣＳＥ１Ｌ中でｖ−Ｈ−ｒａｓによるスレオニンのリン酸化反応を抑制すること示している（図５Ａ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌはリン酸化タンパク質で、Ｒａｓ−ＥＲＫ信号によりリン酸化される。血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓから回収された細胞の細胞数が標準化された馴化培地中、及びＰＤ９８０５９で処理されたＢ１６−Ｒａｓ細胞のＣＳＥ１Ｌタンパク質は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は、ＨＲＰ結合抗−リン酸スレオニン抗体で免疫ブロットされた。結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞へのｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌの分泌物を増加し、そして、ＰＤ９８０５９処理は、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞から馴化培地中に、ｖ−Ｈ−ｒａｓ増加によるスレオニンリン酸化反応物を分泌することを抑制することを示している（図５Ｂ）。
結腸直腸癌患者及び健常者ドナーの血清中のスレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌのレベルが分析された。結腸直腸癌患者（Ｎ＝３６）又は健常者ドナー（Ｎ＝３６）から採取された血清スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質は、アガロースゲル結合抗−リン酸化スレオニン抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で免疫ブロットされた。結果は、癌血清サンプルからの免疫沈降物中にはスレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在することを示したが、健常者ドナーの血清サンプルには存在していなかった（図５Ｃ）。血清ＣＳＥ１Ｌレベルは、健常者ドナーのサンプルより癌患者のサンプルの方が高かったが、違いは、スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌのアッセイで見られたように顕著ではなかった。
【００８８】
図５は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションがＣＳＥ１Ｌのリン酸化を促進すること、及びリン酸化したＣＳＥ１Ｌは癌血清中に存在することを示す。（Ａ）ＤＭＳＯ及び５０μＭのＰＤ９８０５９で２４時間処理されたＢ１６−ｄＥＶ細胞及びＢ１６−Ｒａｓ細胞中の細胞質スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルが、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫沈降及びＨＲＰ結合抗−リン酸スレオニン抗体との免疫ブロットにより分析された。免疫ブロットは、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体で再検査された。コントロールの免疫沈降物は、マウス抗−ＧＦＰ抗体を用いて行われた。（Ｂ）ＤＭＳＯ又は５０μＭのＰＤ９８０５９で２４時間処理された血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ細胞及びＢ１６−Ｒａｓ細胞数を調整した馴化培地中の分泌スレオニンリン酸化ＣＳＥ１Ｌレベルは、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫沈降及びＨＲＰ結合抗−リン酸スレオニン抗体との免疫ブロットにより分析された。（Ｃ）血清スレオニンリン酸ＣＳＥ１Ｌは、結腸直腸癌患者（３６人、夫々１０μｌ）又は３６人の健常者ドナー（夫々１０μｌ）から得られた血清プールのアガロース結合抗−リン酸スレオニン抗体との免疫沈降、及び抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫ブロットで分析された。コントロールの免疫沈降物は、アガロース結合健常マウスＩｇＧを用いて行われた。（Ｄ）結腸直腸癌患者及び健常者ドナーから得られた血清プールのＣＳＥ１Ｌレベルは、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体との免疫ブロットで分析された（２４クローン）。
【００８９】
＜実施例６＞
〔結腸直腸癌におけるリン酸化−ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌの高発現、及び腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度の一致〕
【００９０】
１１５の結腸直腸癌の標本の組織マイクロアレイ免疫組織化学検査の結果は、リン酸−ＥＲＫ（１００％、１１５／１１５）の及びＣＳＥ１Ｌ（９９．１％、１１４／１１５）の強い染色を示した（図６Ａ）。健常な組織は、弱いリン酸−ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌ染色しか示さなかった（図６Ａ）。腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度の一致は、結腸直腸癌の進行においてＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫは近い関係にあることを示している（図６Ｂ）。
【００９１】
図６は、結腸直腸癌においてＣＳＥ１Ｌ及びリン酸−ＥＲＫは高い発現をしており、腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度は一致することを示している。（Ａ）結腸直腸癌のリン酸−ＥＲＫ及びＣＳＥ１Ｌの発現は、１１５の癌標本の組織マイクロアレイ免疫組織化学検査により分析された。左パネル：非腫瘍組織；右パネル：結腸直腸癌組織。４００倍の拡大写真。（Ｂ）隣接した連続結腸直腸癌組織切片の免疫組織化学検査により分析された腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度の代表的イメージ。矢印は、腫瘍中のＣＳＥ１Ｌとリン酸−ＥＲＫの相関染色強度が一致していることを示している。倍率は４０倍。
【００９２】
＜実施例７＞
〔ＣＳＥ１Ｌが細胞中のｖ−Ｈ−ｒａｓ−誘導の微小胞の発生を媒介する〕
顕微鏡検査は、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞及びＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡプラスミドが導入されたＢ１６−Ｒａｓ細胞の表面には微小胞が存在していないことを示している（図７Ａ）。Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の細胞質又は偽足の底部にも微小胞の蓄積はなかった（図７Ａ）。顕微鏡検査は、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の表面には微小胞が存在していることを示している（図７Ｂ）。ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞と違い、ＣＳＥ１Ｌは、細胞あたり、ほとんど微小胞を誘導しせず、小胞は細胞の表面突起（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）の先端に多く存在し、また、サイズも大きかった（図７Ｂ）。これらの違いは意味がある、なぜなら、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションはＥＲＫ活性を刺激して、ＥＲＫは微小胞の生成と放出を媒介するからである。ＣＳＥ１Ｌの過剰発現は微小胞の生成を刺激するに過ぎない；そのため、ＣＳＥ１Ｌに誘導された微小胞は、細胞膜に蓄積し大きなサイズになる。先行研究は、小胞は原形質膜で形成され、糸状偽足に沿って、糸状偽足の先端に移動することを示している（Ｂｉａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．２００５）。ＣＳＥ１Ｌは、偽足の底部に位置したＭＭＰ−２の豊富な発育過程の微小胞で着色された（図７Ｃ）。ＣＳＥ１Ｌは、また、Ｂ１６−Ｒａｓ細胞の脱落した微小胞の後に位置した発育過程の微小胞の細胞質で着色された（図７Ｃ）。更に、ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞の成長を阻害した（図７Ａ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞生成の調節遺伝子であり、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞の生成を媒介する。
【００９３】
図７は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する微小胞の生成を媒介することを示している。（Ａ）ガラスカバースライド上で４日間成長したＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の反転顕微鏡写真。（Ｂ）ガラスカバースライド上で４日間成長したＢ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞成長の代表イメージ。（Ｃ）偽足（矢印）の底部に位置した発育過程の微小胞、又は脱落した微小胞（矢印）の後の細胞質におけるＣＳＥ１Ｌ及びＭＭＰ−２染色の代表イメージ。
【００９４】
＜実施例８＞
〔ＣＳＥ１Ｌはｖ−Ｈ−ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を媒介する〕
ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で処理又は処理されていない血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞から採取した微小胞のゼラチン酵素電気泳動分析の結果は、ｖ−Ｈ−ｒａｓトランスフェクションは、微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性を増加した、及びＰＤ９８０５９処理は微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性におけるｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する増加を弱めることができた（図８Ａ）。ＣＳＥ１Ｌの過剰発現は、微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性を増加した、そして、ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡ トランスフェクションは微小胞ＭＭＰ−２の酵素電気泳動の活性におけるｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導する増加を弱めることができた（図８Ａ）。マトリゲル・ベースの浸潤分析は、ｖ−Ｈ−Ｒａｓ トランスフェクション及びＣＳＥ１Ｌの過剰発現とも、Ｂ１６Ｆ１０細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を増加させ、ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡトランスフェクションはｖ−Ｈ−Ｒａｓが誘導した細胞の浸潤能力が増加することを弱めた（図８Ｂ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を媒介する。
【００９５】
図８は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤を媒介することを示す。（Ａ）ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で処理又は処理されていない血清飢餓Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞から採取した微小胞のＭＭＰ−２のゼラチン酵素電気泳動分析の結果。（Ｂ）マトリゲル・ベース浸潤により分析されたＢ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浸潤能力。侵入性細胞の平均±ＳＤ数は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞のフィールドあたり、それぞれ、１０９．４±１２．６、４０６．８±２３．９、３１１．２５±３２．４、４６．７５±８．７であった。
【００９６】
＜実施例９＞
〔ＣＳＥ１Ｌはｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した癌細胞の転移を媒介する〕
ＭＭＰ−２は、腫瘍浸潤で本質的な役割を果たす（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００２）。免疫蛍光は、ＣＳＥ１ＬはＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞表面の微小胞のＭＭＰ−２と共局在化されていることを示している（図９Ａ）。また、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞に選択的に蓄積されていた（図９Ａ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる動物実験では、ＣＳＥ１Ｌの過剰発現及びｖ−Ｈ−Ｒａｓトランスフェクションは、それぞれ、３６１．５％（Ｐ＜０．０１）及び２４６．１％（Ｐ＜０．０１）のＢ１６Ｆ１０細胞の肺腫瘍転移を示した；ＣＳＥ１Ｌ ｓｈＲＮＡトランスフェクションはｖ−Ｈ−Ｒａｓが誘導した腫瘍の肺転移を１００％（Ｐ＜０．０１）に弱めた；Ｂ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の成長速度は類似しているにもかかわらず（図９Ｂ及びＣ）。つまり、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−Ｒａｓにより誘導された腫瘍細胞の転移を媒介する。
【００９７】
図９は、ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した癌細胞の転移を媒介することを示す。（Ａ）代表的な免疫蛍光は、免疫蛍光で分析されたＢ１６−Ｒａｓ及びＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ及びＭＭＰ−２の共存を示す。また、ＣＳＥ１Ｌは、微小胞に選択的に蓄積されていた（矢印）。ＭＭＰ−２分布が、比較のために使われた。（Ｂ）ＣＳＥ１Ｌは、ｖ−Ｈ−ｒａｓが誘導した細胞の転移を媒介する。上段は、Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ及びＢ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞が注入されたＣ５７ＢＬ／６マウスの肺腫瘍の写真である。肺腫瘍の平均±ＳＤ数は、Ｂ１６−ｄＥＶ（Ｎ＝７）、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ（Ｎ＝３）、Ｂ１６−Ｒａｓ（Ｎ＝４），Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞（Ｎ＝７）が注入されたマウス１匹あたり、それぞれ、１３．７±４．８、４７±１５．８、３２．２±８．５、７±３．６であった。Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を注入後、３週間でそれぞれ３、１０、４、１匹のマウスが死亡したので統計処理から除いた。Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞を注入後、それぞれ、１、１、０、３匹のマウスには肺腫瘍が成長しなかったので、同様に統計処理から除いた。（Ｃ）Ｂ１６−ｄＥＶ、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ、Ｂ１６−Ｒａｓ、Ｂ１６−Ｒａｓ／抗−ＣＳＥ１Ｌ細胞の成長曲線を示す。グラフは、３つの独立した分析結果を示す。
【００９８】
＜実施例１０＞
〔ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在化し抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は腫瘍をターゲットとすることができる〕
免疫蛍光の結果は、ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在化することを示した（図１０Ａ）。免疫金電子顕微鏡検査は、ＣＳＥ１Ｌ及びＭＭＰ−２は小胞に局在化し、そしてＣＳＥ１Ｌは小胞膜に主に局在化することを更に示した（図１０Ｂ）。脱落した微小胞は腫瘍細胞膜の上で広範囲に広がり、脱落微小胞は、腫瘍細胞の周りの細胞外環境に留まっている可能性がある；それゆえ、微小胞膜タンパク質は、癌治療の潜在的ターゲットとなる可能性がある。微小胞膜中のＣＳＥ１Ｌの局在化は、ＣＳＥ１Ｌが癌治療の潜在的ターゲットとなり得ることを示している。腫瘍のあるＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｑｄｏｔ８００ナノクリスタル結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体、又はコントロールとしてＱｄｏｔ８００ナノクリスタル結合抗マウスＩｇＧが尾静脈注射された。ｉｎ ｖｉｖｏイメージの結果は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体結合量子ドットを注入したマウスの腫瘍中には重要な近赤外（ＮＩＲ）蛍光信号の存在を示したが、コントロールのＩｇＧ結合量子ドットを注入したマウスの腫瘍中では観察されなかったことを示した（図１０Ｃ）。つまり、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は、腫瘍をターゲットとすることがでる。
【００９９】
図１０は、ＣＳＥ１Ｌは微小胞膜に局在化し、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体は腫瘍をターゲットとすることができる。（Ａ）免疫蛍光の結果、ＣＳＥ１ＬはＢ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の微小胞膜（矢印）に局在化していた。（Ｂ）Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の微小胞へのＣＳＥ１Ｌ（１８−ｎｍ金、矢印）及びＭＭＰ−２（１２−ｎｍ金、矢印）の免疫金電子顕微鏡による分布検査。２５０，０００倍。（Ｃ）合成画像は、量子ドット結合抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（右、Ｎ＝３）又は量子ドット結合抗−マウスＩｇＧ（左、Ｎ＝３）を注入して４時間後の、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞から派生した腫瘍異種移植片を運んでいるＣ５７ＢＬ／６匹のマウスのＮＩＲ蛍光信号を示す。ＮＩＲイメージは、同じ状況の下で得られ、処理された。
【０１００】
＜実施例１１＞
〔抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体はリン酸化されたＣＳＥ１Ｌと反応する〕
リン酸ＣＳＥ１Ｌに特異的な抗体は、ＣＳＥ１Ｌの推定リン酸化領域と一致するようになっている合成リンペプチドをニュージーランド・ウサギに免疫接種することで作製した。抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体の力価は、間接的なＥＬＩＳＡによって測定された（表２）。免疫ブロットの結果は、抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体はリン酸化したＣＳＥ１Ｌと反応することを示した（図１１）。
【０１０１】
表２は、精製された抗−リン酸−ＣＳＥ１Ｌ抗体の親和性の力価は、間接的なＥＬＩＳＡによって測定された。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
図１１は、抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体は、リン酸化されたＣＳＥ１Ｌと反応することを示す。抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体の特異的特徴は、ＤＭＳＯ又は５０μＭＰＤ９８０５９で１２時間処理されたＢ１６−ｄＥＶ及びＢ１６−Ｒａｓ細胞からの細胞溶解物（５０μｇ）を免疫ブロットすることで行われた。抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体（ｃｌｏｎｅ２４）及び動物の免疫前の血清が、コントロールとして用いられた。
【０１０４】
＜実施例１２＞
〔リン酸化ＣＳＥ１Ｌは微小胞に局在する〕
リン酸化ＣＳＥ１Ｌが微小胞に局在するか否かが分析された。抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いた免疫蛍光は、リン酸化ＣＳＥ１Ｌが微小胞（矢印）に局在化していることを示した（図１２）。
【０１０５】
図１２は、抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いた免疫蛍光分析により、リン酸化ＣＳＥ１Ｌが、Ｂ１６−ＣＳＥ１Ｌ細胞の微小胞（矢印）に局在化していることを示している。
【０１０６】
＜実施例１３＞
〔癌血清から分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌの存在〕
微小胞が、結腸直腸癌の患者及び健常者ドナーの血清から分離された。分離された微小胞は、９６ウェルドットブロットマニホールド（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）に入れられ、血清微小胞のＣＳＥ１Ｌの存在は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いたドットブロットにより分析された。ブロットの強さは、ＩＳ−１０００デジタル画像処理システムを用いて定量化された（Ｋａｉｓｅｒ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）。結果は、癌血清サンプルから分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値を示した（図１３Ａ）。また、癌血清サンプルから分離された微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値を示すことも結果より明らかとなった（図１３Ｂ）。ＣＳＥ１Ｌは、癌患者から分離された血清微小胞の９６．５％（１１１／１１５）で検出され、健常者ドナーから分離された血清微小胞では６．６％（４／６０）検出された。Ｐ−値は、癌グループと健常者グループで＜０．０１であった。標準として合成されたＣＳＥ１Ｌを使って、癌患者からの血清微小胞のＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥２１ｎｇ／ｍｌと決定された。リン酸化ＣＳＥ１Ｌは、癌患者から分離された血清微小胞の９８．２％（１１３／１１５）で検出され、健常者ドナーから分離された血清微小胞では３．３％（２／６０）検出された。Ｐ−値は、癌グループと健常者グループで＜０．０１であった。標準として合成されたリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質を使って、癌患者からの血清微小胞のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥１５ｎｇ／ｍｌと決定された。
【０１０７】
図１３は、癌血清サンプルから分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値であることを示している。血清から分離された微小胞のＣＳＥ１Ｌ（Ａ）及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌ（Ｂ）の罹患率は、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び抗−リン酸ＣＳＥ１Ｌ抗体を用いたドットブロットにより分析された。＊は、健常者ドナーと比較して、統計学的に有意であることを示す。
【０１０８】
＜実施例１４＞
〔癌患者の血清のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのより高い罹患率、及び癌診断には血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの分析がＣＳＥ１Ｌの分析より優れていること〕
結果は、癌血清から分離された微小胞にリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在していることを示している（実施例１３）。免疫沈降の結果は、癌血清サンプルからの免疫沈降物にはリン酸化ＣＳＥ１Ｌが存在するが、健常者の血清サンプル中には存在しないことを示している（図５Ｃ）。結腸直腸癌患者の血清中のＣＳＥ１Ｌ及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率が分析された。ＥＬＩＳＡの結果は、癌血清の９２．１％（１０６／１１５）はリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−陽性であったのに対し、健常者ドナーの血清では、わずか１．６％（１／６０）がリン酸化ＣＳＥ１Ｌ−陽性であった（図１４）。Ｐ−値は、癌グループと健常者グループで＜０．０１であった。標準として合成されたリン酸化ＣＳＥ１Ｌタンパク質を使って、癌患者からの血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥３ｎｇ／ｍｌと決定された。ＥＬＩＳＡの結果は、癌血清の６５．２％（７５／１１５）はＣＳＥ１Ｌ−陽性であったのに対し、健常者ドナーの血清では、１３％（８／６０）がＣＳＥ１Ｌ−陽性であった。標準として合成されたＣＳＥ１Ｌを使って、癌患者からの血清中のＣＳＥ１Ｌのカット―オフ値は、≥８ｎｇ／ｍｌと決定された。癌検出のためのリン酸化ＣＳＥ１Ｌ血清の感度と選択性は、それぞれ、９２．１％と９８．３％であった。
癌検出のためのＣＳＥ１Ｌ血清の感度と選択性は、それぞれ、６５．２％と８６．６％であった。したがって、リン酸化ＣＳＥ１Ｌ血清の分析は、ＣＳＥ１Ｌ血清の分析より癌診断に優れている。
【０１０９】
図１４は、結腸直腸癌患者の血清のリン酸化ＣＳＥ１Ｌのより高い罹患率を示している。健常者ドナーと結腸直腸癌患者の血清中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの罹患率がＥＬＩＳＡにより決定された。＊は、健常者ドナーと比較して、統計学的に有意であることを示す。
【０１１０】
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８． Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ−Ｃｈａｒｉ Ｖ， Ｃｌａｎｃｙ ＪＷ， Ｓｅｄｇｗｉｃｋ Ａ， Ｄ’Ｓｏｕｚａ−Ｓｃｈｏｒｅｙ Ｃ． Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ： ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ２０１０；１２３：１６０３−１６１１．
９． Ｒｏｂｅｒｔｓ ＰＪ， Ｄｅｒ ＣＪ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００７；２６：３２９１−３３１０．
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１１． Ｓｉｍａｋ Ｊ， Ｇｅｌｄｅｒｍａｎ ＭＰ． Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｍｅｄ Ｒｅｖ ２００６；２０：１−２６．
１２． Ｔａｉ ＣＪ， Ｈｓｕ ＣＨ， Ｓｈｅｎ ＳＣ， Ｌｅｅ ＷＲ， Ｊｉａｎｇ ＭＣ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ （ＣＳＥ１Ｌ／ＣＡＳ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０；２９：１１０．
１３． Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ Ｇ， Ｄ’Ａｓｃｅｎｚｏ Ｓ， Ｂｏｒｓｏｔｔｉ Ｐ， Ｇｉａｖａｚｚｉ Ｒ， Ｐａｖａｎ Ａ， Ｄｏｌｏ Ｖ． Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ＭＭＰ−２， ＭＭＰ−９， ａｎｄ ＭＴ１−ＭＭＰ ａｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２；１６０：６７３−６８０．
１４． Ｔｕｎｇ ＭＣ， Ｔｓａｉ ＣＳ， Ｔｕｎｇ ＪＮ， Ｔｓａｏ ＴＹ， Ｃｈｅｎ ＨＣ， Ｙｅｈ ＫＴ， Ｌｉａｏ ＣＦ， Ｊｉａｎｇ ＭＣ． Ｈｉｇｈｅｒ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＣＳＥ１Ｌ／ＣＡＳ ｉｎ ｓｅｒａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００９；１８：１５７０−１５７７．
１５． ｖａｎ Ｄｏｏｒｍａａｌ ＦＦ， Ｋｌｅｉｎｊａｎ Ａ， Ｄｉ Ｎｉｓｉｏ Ｍ， Ｂüｌｌｅｒ ＨＲ， Ｎｉｅｕｗｌａｎｄ Ｒ． Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｎｅｔｈ Ｊ Ｍｅｄ ２００９；６７：２６６−２７３．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＳＥ１Ｌ）に対する抗体、又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体。
【請求項２】
抗体が、リン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ａ） 被験体からテスト生体液サンプルを得る工程；
（ｂ） １以上の健常者からコントロールサンプルを得る工程；
（ｃ） テスト生体液サンプル及びコントロールサンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１に記載されている抗体と接触させる工程；
（ｄ） テスト生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；及び
（ｅ） コントロールサンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；
を含む被験体の癌を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、
工程（ｄ）で測定されたテスト生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を、ステップ（ｅ）で測定されたコントロールサンプルのＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量と比較し、ＣＳＥ１Ｌの増加又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの存在が被験体に癌が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項４】
ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量が前記サンプルのドットブロット分析により測定されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＳＥ１Ｌの量が、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び微小胞との結合による分析で測定され；リン酸化ＣＳＥ１Ｌの量が、抗−リン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体及び微小胞との結合による分析で測定されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
被験体が人であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
（ａ） 被験体からテスト生体液サンプルを得る工程；
（ｂ） １以上の健常者からコントロール生体液サンプルを得る工程；
（ｃ） テスト生体液サンプル及びコントロール生体液サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項２に記載されている抗体と接触させる工程；及び
（ｄ） テスト生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量及びコントロールサンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；
を含む被験体の癌を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、
テスト生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量をコントロール生体液サンプルのリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量と比較し、リン酸化ＣＳＥ１Ｌの増加が被験体に癌が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項８】
リン酸化ＣＳＥ１Ｌの量は、前記サンプルを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定したものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リン酸化ＣＳＥ１Ｌの量は、抗−リン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌを結合して分析したものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
被験体が人であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ） 被験体から生体液サンプルを得る工程；
（ｂ）生体液サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１に記載されている抗体と接触させる工程；及び
（ｃ）抗体に結合している微小胞を分離する工程；
を含む生体液サンプルから微小胞を分離するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１２】
抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体又は抗−リン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体、及び医薬品賦形剤、希釈剤またはキャリヤを含む医薬組成物。
【請求項１３】
生体液サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１に記載されている抗体と接触させる工程；及び抗体の結合を検出する工程を含む生体液サンプル中の微小胞の存在を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌへの抗体の結合が生体液サンプル中の微小胞の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１の抗体を含む微小胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出及び／又は分離するためのキット。
【請求項１５】
請求項２の抗体を含む生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌをｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するためのキット。
【請求項１】
細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＳＥ１Ｌ）に対する抗体、又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体。
【請求項２】
抗体が、リン酸化ＣＳＥ１Ｌに対する抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ａ） 被験体からテスト生体液サンプルを得る工程；
（ｂ） １以上の健常者からコントロールサンプルを得る工程；
（ｃ） テスト生体液サンプル及びコントロールサンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１に記載されている抗体と接触させる工程；
（ｄ） テスト生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；及び
（ｅ） コントロールサンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；
を含む被験体の癌を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、
工程（ｄ）で測定されたテスト生体液サンプル中の微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を、ステップ（ｅ）で測定されたコントロールサンプルのＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量と比較し、ＣＳＥ１Ｌの増加又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの存在が被験体に癌が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項４】
ＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量が前記サンプルのドットブロット分析により測定されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＳＥ１Ｌの量が、抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体及び微小胞との結合による分析で測定され；リン酸化ＣＳＥ１Ｌの量が、抗−リン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体及び微小胞との結合による分析で測定されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
被験体が人であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
（ａ） 被験体からテスト生体液サンプルを得る工程；
（ｂ） １以上の健常者からコントロール生体液サンプルを得る工程；
（ｃ） テスト生体液サンプル及びコントロール生体液サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項２に記載されている抗体と接触させる工程；及び
（ｄ） テスト生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量及びコントロールサンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量を測定する工程；
を含む被験体の癌を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、
テスト生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌの量をコントロール生体液サンプルのリン酸化ＣＳＥ１Ｌの平均量と比較し、リン酸化ＣＳＥ１Ｌの増加が被験体に癌が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項８】
リン酸化ＣＳＥ１Ｌの量は、前記サンプルを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定したものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リン酸化ＣＳＥ１Ｌの量は、抗−リン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体及びリン酸化ＣＳＥ１Ｌを結合して分析したものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
被験体が人であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ） 被験体から生体液サンプルを得る工程；
（ｂ）生体液サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１に記載されている抗体と接触させる工程；及び
（ｃ）抗体に結合している微小胞を分離する工程；
を含む生体液サンプルから微小胞を分離するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１２】
抗−ＣＳＥ１Ｌ抗体又は抗−リン酸化ＣＳＥ１Ｌ抗体、及び医薬品賦形剤、希釈剤またはキャリヤを含む医薬組成物。
【請求項１３】
生体液サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１に記載されている抗体と接触させる工程；及び抗体の結合を検出する工程を含む生体液サンプル中の微小胞の存在を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、微小胞のＣＳＥ１Ｌ又はリン酸化ＣＳＥ１Ｌへの抗体の結合が生体液サンプル中の微小胞の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１の抗体を含む微小胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出及び／又は分離するためのキット。
【請求項１５】
請求項２の抗体を含む生体液サンプル中のリン酸化ＣＳＥ１Ｌをｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１３−４９６６２（Ｐ２０１３−４９６６２Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１０９６９８（Ｐ２０１２−１０９６９８）
【出願日】平成２４年５月１１日（２０１２．５．１１）
【出願人】（５１２１２４６６９）
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧ，Ｍｉｎｇ−Ｃｈｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】２Ｆ．，Ｎｏ．５，Ａｌｌｅｙ ３１，Ｌａｎｅ ６１ Ｓｅｃ．１， Ｇｕａｎｇｆｕ Ｒｄ．， Ｓａｎｃｈｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ ２４１， Ｔａｉｗａｎ Ｃｈｉｎａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０９６９８（Ｐ２０１２−１０９６９８）
【出願日】平成２４年５月１１日（２０１２．５．１１）
【出願人】（５１２１２４６６９）
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧ，Ｍｉｎｇ−Ｃｈｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】２Ｆ．，Ｎｏ．５，Ａｌｌｅｙ ３１，Ｌａｎｅ ６１ Ｓｅｃ．１， Ｇｕａｎｇｆｕ Ｒｄ．， Ｓａｎｃｈｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ ２４１， Ｔａｉｗａｎ Ｃｈｉｎａ
【Ｆターム（参考）】
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