微生物のＤＮＡ情報に基づいたメタン発酵の運転管理
【課題】有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率の低下を予測し、安定なメタン発酵を可能にするための運転管理法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、メタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する特定の真正細菌をそのＤＮＡ情報に基づいて検出及び定量することによるモニタリング方法、及び該方法に使用されるプライマーセットに関する。本発明によれば、特定の真正細菌の関与に基づいて、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、安定的なメタン発酵を達成させるための運転管理の方法を提供することができる。
【解決手段】本発明は、メタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する特定の真正細菌をそのＤＮＡ情報に基づいて検出及び定量することによるモニタリング方法、及び該方法に使用されるプライマーセットに関する。本発明によれば、特定の真正細菌の関与に基づいて、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、安定的なメタン発酵を達成させるための運転管理の方法を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法、及び該方法に使用されるプライマーセットに関する。より具体的には、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する特定の真正細菌をそのＤＮＡ情報に基づいて検出及び定量することを特徴とするメタン発酵の運転管理に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタン発酵は、有機性廃水を処理する方法の１つで、ランニングコストが安く、さらにバイオガスとしてエネルギー回収ができ、余剰汚泥発生量も少ないという特徴を有する優れた方法として知られている（非特許文献１参照）。メタン発酵法の歴史は古く、嫌気性微生物による高濃度有機性廃水や汚泥消化等の処理技術として開発されてきた。近年では、高濃度有機性廃水等に使われた第一世代に代わって、ＵＡＳＢ法（上向流嫌気性汚泥床法）の開発に伴う第二世代のメタン発酵法が実績を増やしている。ＵＡＳＢ法とは、０．５〜２ｍｍ程度に自己造粒した高密度グラニュール菌体（真正細菌及び古細菌を含む）を利用して、高濃度基質の高負荷高速運転を可能としたリアクターを利用する方法である（非特許文献１及び２参照）。グラニュール菌体は沈降性が良いことから、それまでの懸濁型メタン発酵に見られるような気液固分離の欠点を解決できる手法である。
【０００３】
メタン発酵は、多くの微生物の共生により有機物を分解し、その過程で生成する有機酸などをメタンに還元する方法であって、主として３段階で進行すると考えられている。複雑な有機物は、第１段階の酸生成過程（液化過程）で酸生成菌類の作用により、単糖類、アミノ酸などの低分子量の物質を経て、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、酪酸などの低級脂肪酸、乳酸及びエタノールなどになる。第２段階においては、酢酸以外の低級脂肪酸、乳酸及びエタノールは、水素生成細菌により水素及び酢酸に変換され、最終の第３段階において基質特異性の強いメタン生成古細菌群により、メタン及び二酸化炭素などに分解される。ここで、酢酸及びプロピオン酸などの低級脂肪酸はメタン発酵プロセスにおける主要な中間生成物であり、酸生成菌類及び水素生成細菌などの真正細菌がその役割を担っている（非特許文献３参照）。
【０００４】
メタン発酵においては、その原料となる有機性廃棄物の供給量（有機物負荷）が大きくなると、供給量に応じてメタンガスの発生量も増加するが、有機物負荷が過剰になると、メタン生成に関与する真正細菌及び古細菌の活性が著しく低下し、メタンガスが全く生成されなくなる（メタン発酵が失敗する）。有機物負荷の過剰によりメタン生成が行われなくなると、メタン発酵を復帰させることは非常に困難であるという問題点がある。この限界の負荷量をリアクター内への流速や有機物濃度などから決定することは困難であり、これまで限界の負荷量は熟練のオペレータの判断に任されていた。これまで、メタン発酵が失敗した後に有用な微生物が死滅又は減少するという報告がなされている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に開示された方法は、メタン発酵の失敗を後付け的に説明することはできても、メタン発酵の失敗を予測し、未然に予防することができない。また、メタン発酵が失敗するとき、又は失敗したときには、リアクター内のｐＨが低下している（ｐＨ低下はメタン発酵失敗の原因であり、結果である、すなわち負のフィードバックと考えられる）ということは経験的によく知られている。しかしながら、メタン発酵が失敗しなくても一時的にｐＨ低下が起こることも周知な現象である。よって、ｐＨ低下に基づいて、メタン発酵失敗の予兆とすることはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−３２５５８１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】松本豊、中崎清彦共著、『化学工学の進歩第３６集 環境調和型エネルギーシステム』（社団法人化学工学会編集）、「４．３ メタン発酵技術」（１４０〜１５６頁）、２００２年、槇書店
【非特許文献２】松尾幸彦他、『用水と廃水』、「ＵＡＳＢ法を用いたＰＥＧ排水の高速処理」、Ｖｏｌ．４３、Ｎｏ．１２、１０６０−１０６６（２００１）
【非特許文献３】重松亨ら、『生物工学会誌』、第８７巻、第１２号、５７０〜５９６頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、メタン発酵の運転管理を行う手法は開発されていない。したがって、本発明の目的は、特定微生物の関与に基づいて、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、安定的なメタン発酵を達成させるための運転管理の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記実情に鑑み、本発明者らは、メタン発酵が失敗するときに、いわゆる悪玉菌ともいうべき、かかる失敗を誘発する特定の微生物を同定することに成功し、該微生物の増殖をメタン発酵中にモニタリングすることにより、メタン発酵の運転管理を首尾よく行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法。
［２］前記真正細菌が、配列番号３に示される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、上記［１］に記載のモニタリング方法。
［３］有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記［１］又は［２］に記載のモニタリング方法。
［４］前記食品廃棄物がシロップ廃液である、上記［３］に記載のモニタリング方法。
［５］有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
であるプライマーセット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、有機性廃棄物の有効利用を目的としたメタン発酵において、メタン発酵が失敗に至る状態の変化を特定の微生物のＤＮＡ情報に基づいて客観的に予測することにより、メタン発酵の運転管理が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】バンドＢ６全長の塩基配列を示す。
【図２】Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を示す。
【図３】バンドＢ６を有する真正細菌を含む系統分布図を示す。
【図４】有機性廃棄物の供給量（ＴＯＣ濃度）を経時的に変化させたパターンを示す。
【図５】リアルタイムＰＣＲ法に使用したプライマーを用いた検量線を示す。
【図６】（Ａ）ＴＯＣ濃度を経時的に変化させた場合に、メタン発酵中に現れる微生物に固有の１６Ｓ ｒＲＮＡを示す。（Ｂ）ＴＯＣ濃度の変化に対応させたメタンガスの発生量を示す。（Ｃ）バンドＢ６の経時的なＤＮＡ濃度の相対的変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法に関する。
【００１３】
（１）メタン発酵効率の低下に関与する真正細菌の遺伝子のクローニング
本発明のモニタリング方法において標的とする真正細菌は、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３に近縁の真正細菌であって、固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する。本発明者らは、メタン発酵中に有機物負荷を徐々に増大させていくと、ある量（「限界負荷量」という。）を超えた時点からメタン発酵効率の低下が見られ、この限界負荷量の前後からある種の真正細菌が増加することを見出し、メタン発酵中のこの真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）（本明細書において、その部分塩基配列を「バンドＢ６」と呼ぶ。）量をリアルタイムＰＣＲで測定することにより、メタン発酵効率のモニタリングに成功し、本発明を完成させた（後述する実施例４参照、図６）。なお、バンドＢ６の塩基配列を図１に示す（配列番号３）。
【００１４】
バンドＢ６は、近縁のＡｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の部分塩基配列（配列番号４）の情報を利用することにより同定された（実施例３参照）。バンドＢ６を有する真正細菌、及び上記ＮＥ２３−３株はいずれも未同定であり、基準株（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）が存在しない。本発明のモニタリング方法においては、モニタリングの標的となる真正細菌の固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の一部であるバンドＢ６の部分配列（配列番号３のヌクレオチド１１８−２５５）を検出の対象とする。
【００１５】
本発明のモニタリング方法において使用されるバンドＢ６の同定は、例えば、以下のようにして行うことができる。簡単には、真正細菌から核酸を抽出後、ＰＣＲで増幅して、アガロースゲル電気泳動等の分子量により核酸断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。メタン発酵に関与する真正細菌は複数種含まれるため、最初に特定の真正細菌における固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を同定することが必要である。まず、グラニュール菌体に含まれる微生物群（「微生物叢」）の１６Ｓ ｒＲＮＡをＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によって分離及び検出する。具体的には、メタン発酵中のリアクター内溶液をサンプリングし、グラニュール状メタン菌を遠心分離によって回収した後、溶菌し、メタン菌に含まれるタンパク質及び脂質をクロロホルムの添加によって抽出・除去する。続いて、エタノールの添加により核酸のみを回収する。その後、真正細菌由来のＤＮＡを検出するために汎用されている以下のプライマーセット（以下、「プライマーセットＩ」と称する場合がある。）：
３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号５）（配列番号４のヌクレオチド３２４−３４０に対応）
５１７ｒ（リバース）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号６）（配列番号４のヌクレオチド５１８−５０２に対応）
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する。上記プライマーセットＩは、真正細菌を含む大部分の原核生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマー３５７ｆ及び５１７ｒは、それぞれヌクレオチド３４１−３５７及び５１７−５３４に対応する。なお、上記プライマー３５７ｆには、ＧＣクランプ（５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧ−３’）（配列番号７）が付加されている。また、核酸を増幅するための方法としては、ＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））に限定されず、当業者であれば、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））等を用いることができることは容易に理解される。なお、本発明のモニタリング方法では、メタン発酵効率をリアルタイムで測定する必要性からＰＣＲ法を利用することが好ましい。ＰＣＲ反応条件は、例えば、２本鎖ＤＮＡの熱変性を９０〜９８℃で５秒〜１０分間行い、アニーリングを５０〜７０℃で１０秒〜２分間行い、伸長反応を６０〜７５℃で１０秒〜１０分間行う。任意に、最終伸長反応を伸長反応と同じ温度で１０秒〜１５分間行う。熱変性−アニーリング−伸長反応のサイクルを５〜５０回行う。
【００１６】
次に、上記で核酸を増幅させたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離する。電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の分離は常法に従って容易に行うことができる。電気泳動で使用するゲルは、核酸を変性させるための変性剤を含み、核酸の分離に適した所定の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。また、電気泳動に使用される泳動溶液及び電圧等の泳動条件は適宜調整することができる。上記のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を使用することにより、各真正細菌に該当する核酸のバンドの濃淡から、可視的に真正細菌の経時的な増減をモニタリングすることができる。ここで、ゲル上のバンドの検出は、限定されないが、エチジウムブロマイド含有溶液を用いてゲルを染色することにより行う。
【００１７】
さらに、本発明のモニタリング方法で対象とされる真正細菌は、限界負荷量の前後において出現する細菌であり、上記の電気泳動上の経時的なバンドの濃淡の変化において限界負荷量の前後に出現したバンド（固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ断片）を切り出し、塩基配列を解析することにより、メタン発酵効率の低下に関与する真正細菌の遺伝子をクローニングすることができる。ゲルから切り出されたＤＮＡ断片には、目的以外のＤＮＡ断片が混在している可能性があるため、所望のＤＮＡ断片を得るためにさらに分離及び精製することが好ましい。一般に、ＰＣＲ産物をクローニングするため、ベクター（例えば、ｐＣＲ４、ｐＭＷ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＤＥＬ系などのプラスミドベクター、Ｍ１３ｍｐなどのファージベクター、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９系などのコスミドベクター）に、ＰＣＲ産物をライゲーションさせ、コンピテントセルに形質転換させる。ベクターにはさらにプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを適宜含めることができる。形質転換したコンピテントセルを培養してコロニーを形成させ、塩基配列の解読のためのサンプルとする。その後、所望のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するが、塩基配列の解読は、従来法を用いればよく、例えば、Ｓａｎｇｅｒ法、サイクルシークエンス法による自動シークエンサーを利用することができる。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法があるが、いずれの方法でもよい。
【００１８】
本発明のバンドＢ６のクローニングにおいては、所望のＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲによるＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用したＴＡクローニング法を用いることができる。ＴＡクローニング法は、３’→５’エキソヌクレア−ゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したクローニング法であり、まず、このＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ産物の平滑末端をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のｐｏｌＩ型酵素によって処理することによって、３’末端にアデニン又はチミンを付加させる。一方、ベクターにｄＴＴＰ又はｔａｑＤＮＡポリメラーゼを反応させることによってＴＡベクターを作製する。次に、上記のように処理した核酸断片とベクターをライゲーションさせて宿主細胞に形質転換し、所望のＤＮＡをクローニングする方法である。より具体的には、上記でゲルから切り出されたＤＮＡ断片をまず上記のプライマーセットＩを使用し、ＰＣＲにより増幅する。次に、得られたＰＣＲ産物をＴＡクローニング用のプラスミドに組込み、このプラスミドを大腸菌に形質転換する。次に、ＰＣＲ産物が組み込まれたプラスミドによって大腸菌に形質転換されたことを確認するために、アンピシリン等の抗生物質による選択を行う。その後、プラスミドＤＮＡを抽出し、プライマーセットＩを用いて所望のＰＣＲ産物を増幅させ、さらに、上記と同様にＤＧＧＥを行い、バンド位置を確認した後、バンドＢ６の部分塩基配列を決定することができる。本明細書においては、プライマーセットＩを用いて決定されたバンドＢ６の部分塩基配列（配列番号３のヌクレオチド１８−１７８）から、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いた相同性検索を行い、最も近縁な微生物として、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）を特定した（実施例３参照）。上述の通り、ＮＥ２３−３株は、未同定であり、基準株が存在しない。得られたバンドＢ６の部分塩基配列（配列番号３のヌクレオチド１８−１７８）とＮＥ２３−３株の部分塩基配列の一部（配列番号４のヌクレオチド３４１−５０１）とを比較すると、両者は一致していた。なお、プライマーセットＩは、引用文献（Ｐｅｄｒｏ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９２，１５９−１６４（２００１））に記載され、特に変更せずに使用した。また、後述するように、バンドＢ６の塩基配列としてヌクレオチド１−２５５を決定した（配列番号３、図１参照）。
【００１９】
（２）モニタリング方法
本発明によれば、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法が提供され、より具体的には、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法である。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「有機性廃棄物」とは、一般に、生物学的分解によって環境中に直接還元することができる廃棄物を指し、限定されないが、生ごみなどの食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥などが挙げられる。食品廃棄物には、一般廃棄物（事業系及び家庭系を問わない）及び産業廃棄物が含まれる。具体的には、食品廃棄物の例は、限定されないが、生ごみ、シロップ廃液、おから、排乳、コーヒーかす、茶かすなどが挙げられる。
【００２１】
本発明によれば、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌のバンドＢ６（１６Ｓ ｒＲＮＡ）量を測定するために使用されるバンドＢ６に特異的なプライマーセットを提供することができる。本発明においては、下記のプライマーセットＩＩ：
ＧＭＰ４７８Ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＧＧＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＣ−３’（配列番号１）（配列番号３のヌクレオチド１１８−１３９に対応）
ＧＭＰ５７５Ｒ（リバース）：５’−ＡＴＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＣＧＣＧＣ−３’（配列番号２）（配列番号３のヌクレオチド２５５−２３６に対応）
を設計し、メタン発酵効率のモニタリングに使用した。大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマーＧＭＰ４７８Ｆ及びＧＭＰ５７５Ｒは、それぞれヌクレオチド４５７−４７８及び５７５−５９４に対応する。本発明のモニタリング方法では、上記プライマーセットＩＩ以外に、各プライマーに実質的に同一な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。ここで、本明細書で使用するとき、語句「実質的に同一な塩基配列」とは、対応する上記プライマーの塩基配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の複数個、好ましくは５個、より好ましくは４個、さらに好ましくは３個、さらにより好ましくは２個、最も好ましくは１個が欠失、付加及び／又は置換されている塩基配列をいう。
【００２２】
プライマーの設計は以下の通りである。上述した通り、バンドＢ６は、プライマーセットＩ（プライマー３５７Ｆと５１７Ｒ）に含まれる塩基配列の情報からＡｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）に最も近縁であることが判明した（図３参照）。そこで、ＮＥ２３−３株の塩基配列情報（配列番号４、図２）に基づいて、ＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、ＮＥ２３−３株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをＦａｓｔＰＣＲ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｆａｓｔｐｃｒ．ｈｔｍｌ）の推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは８０〜１５０塩基（増幅効率を１００％にするため）、プライマー長さは１７〜２５塩基（長過ぎるとアニーリング効率が低下する）ＧＣ含量は４０〜６０％（４５〜５５％が望ましい）とし、偏りがないように、部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように注意する、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｇが連続しないように注意する、プライマー内部での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基相補する配列を避ける。プライマーの標的塩基配列への特異性を確認するため、所定のＰＣＲ反応条件下で定量的ＰＣＲ法（例えば、ＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法）を行い、増幅曲線分析及び融解曲線分析を行ってバンドＢ６に相当する微生物濃度を定量することができる。
【００２３】
上記で設計したプライマーセットＩＩの使用により、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）（一部にバンドＢ６遺伝子を含む）を検出し、例えば、リアルタイムＰＣＲ法によってバンドＢ６を経時的に定量することができる。なお、バンドＢ６を有する真正細菌（菌体）は、バンドＢ６の塩基配列を含む約１５００塩基の１６Ｓ領域を有するが、現時点では完全に配列決定されていない。また、このバンドＢ６は、メタン発酵効率の低下と関連付けて見出されたが、バンドＢ６を有する真正細菌は、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下の開始前、開始と同時、又は開始後に増殖してメタン発酵系に出現する細菌である。本発明のモニタリング方法においては、メタン発酵効率の低下を予測することを目的としているため、メタン発酵効率の低下に先駆けて（低下の開始前に）増殖するか又は該低下と同時に増殖するバンドＢ６を有する真正細菌を検出されることが望ましい。ここで、本明細書で使用するとき、「先駆けて」とは、メタン発酵効率の低下開始の少なくとも２〜３週間前、１週間前、数日前、１日前、１２時間前、６時間前、３時間前、１時間前、又は３０分前に、該真正細菌が増殖を開始するか又はバンドＢ６が検出される場合をいう。検出されるバンドＢ６は、遺伝子（ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）の形態であるか又はタンパク質の形態であってもよい。
【００２４】
本発明のモニタリング方法によれば、プライマーセットＩＩを用いたリアルタイムＰＣＲを行った後、バンドＢ６に対応する菌体を含んでいるメタン発酵過程で採取したグラニュールサンプルを連続希釈し、この希釈率に応じた菌体数に対するバンドＢ６の検量線を作成することができる。これにより、目的とする真正細菌の試料中での有無、その数量を精度よく知ることができる。また、本明細書で使用するとき、メタン発酵効率の「低下」とは、有機性廃棄物の限界負荷量を超えて添加された場合に、メタン発酵系に有機性廃棄物を添加することによって発生していたメタンガスの量が減少している、又は有機性廃棄物を添加したとしてもメタンガスが発生しないことを意味する。限界定負荷量を超えたことによるメタン発酵効率の低下は、メタンガスの発生量が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少した場合を指す。本発明のモニタリング方法を適用することにより、メタン発酵効率の低下に先駆けて又は低下と同時に増加するバンドＢ６量をリアルタイムで定量することにより、メタン発酵が失敗に至る状態の変化を予測することができるため、添加する有機性廃棄物の量を調節することによって、安定なメタン発酵が可能になる。また、本発明によれば、本発明のモニタリング方法を応用したバイオセンサーを提供することができる。より具体的には、前述のプライマーセットＩＩが電極に固定化されたバイオセンサーを用いることにより、リアクター内の発酵液中のバンドＢ６量を検出及び定量することにより、リアクターに供給する有機性廃棄物の量を調節することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００２５】
実施例１：ＵＡＳＢメタン発酵
メタン発酵にはＵＡＳＢ法を使用し、原料の有機性廃棄物としては、共同出願人である山梨缶詰株式会社の工場において缶詰製造過程で排出される平均２．２トン／日のシロップ廃液を用いた。使用したシロップ廃液は、主成分がスクロースであり、糖度が１５．２ブリックス、全有機炭素（ＴＯＣ）濃度が約７１ｇ／Ｌであった。メタン発酵には、外寸法φ２５００×Ｈ５０００ｍｍのＵＡＳＢ発酵槽を用いた。発酵液容積は２０ｍ３であった。実験開始時にビール工場のＵＡＳＢ発酵槽で形成されたグラニュール汚泥を１５ｍ３充填した。また、実験開始から２日間は馴致期間とし、シロップ廃液を供給せずに温度を４０℃に維持した。実験開始から２日以降にシロップ廃液の供給を始めるが、シロップ廃液をそのままＵＡＳＢ発酵槽へ投入すると負荷が高すぎるため、調整槽において水で適宣希釈し、ｐＨが７．５付近になるように苛性ソーダを用いて調整した。その後、温調槽で３９℃まで昇温した後にＵＡＳＢ発酵槽に導いた。水で希釈したシロップ廃液の濃度を段階的に変化させたが、およそ４〜５ヶ月後にはシロップ廃液を等量の水で希釈し、ＴＯＣ濃度が３５．５ｇ／Ｌとなるように負荷を増加させた（図４参照）。なお、１４５日目以降は再び負荷量を低下させた。また、運転開始４９日以降にはメタン発酵を担う微生物の活性を高める目的で金属塩ＣｏＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２をそれぞれ２０ｇずつ（供給するシロップ廃液の１ｐｐｍ程度に相当）を添加し、さらに、６４日以降にはＣ／Ｎ比が１５になるように調整槽にて尿素を添加した。ガス発生量は発酵槽上部に取り付けたガス出口の流量計（山武、気体用マスフローメーター、ＣＭＳ０５００）で計測し、ｐＨは槽内のｐＨメータ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ、ｐＨ１００）で計測した。なお、発生するガスは、１日１回、テドラーバッグに捕集し、その中に含まれるメタンガス濃度をガスクロマトグラフ分析装置（ヤナコ、Ｇ−１０１１、カラム ＭＳ１３Ｘ＋ＭＳ５Ａ）を用いて測定した。メタン発酵の設定温度を４０℃とし、グラニュールを含む発酵液サンプルを発酵槽下部から１７００ｍｍ、壁面から７５０ｍｍのサンプリング口から所定の時間間隔で、約２００ｍＬを採取して、微生物叢の解析に用いた。
【００２６】
実施例２：グラニュール粒子からのＤＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅
採取した発酵液サンプル中のグラニュールの約１ｇを滅菌したスパーテルですくい取り、３０ｍＬの滅菌水で洗浄してグラニュール表面に付着している微生物を除去した。その後、その０．３ｇを使用して、Ｉｓｏｉｌ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）によりＤＮＡを抽出した。次に、グラニュールから抽出したＤＮＡには、真正細菌及び古細菌に由来するＤＮＡが含まれるが、真正細菌に由来するＤＮＡを増幅させるために、前述のプライマーセットＩ（プライマー３５７ｆと５１７ｒ）を用いた。増幅条件を以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
使用したＰＣＲ増幅装置はＰＴＣ−１００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ ＣＯ．，Ｌｔｄ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）であった。また、ＰＣＲ反応液の組成を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
実施例３：バンドＢ６の分離及び同定
真正細菌からバンドＢ６を検出するためにＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法を用いた。ＤＧＧＥにはＴｈｅ Ｄｃｏｄｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）を使用した。まず、グラニュールから抽出した真正細菌由来のＤＮＡを増幅したＰＣＲ産物を変性剤の濃度勾配が３０％から６０％（変性剤１００％では７Ｍの尿素と４０％［ｗｔ／ｖｏｌ］のホルムアミドを含む）の厚さ０．８ｍｍのポリアクリルアミドゲル（１０％［ｗｔ／ｖｏｌ］アクリルアミドとビスアクリルアミドの割合は３７．５：１）を用いて、１．０×Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）溶液中で６０℃、２００Ｖ、３．５時間の条件で電気泳動を行った。なお、電気泳動の後、２００ｍＬの１．０×ＴＡＥ溶液と２０μＬのエチジウムブロマイド溶液を混合した溶液にゲルを浸し、３０分間染色した後、紫外線下で可視化した。
【００３１】
ＤＧＧＥ法で検出されたポリアクリルアミドゲル中のバンドからＤＮＡ断片を抽出・回収した。抽出したＤＮＡ断片から所望のＤＮＡ断片を分離及び精製するために、ＴＡクローニング法を用いた。まず、抽出されたＤＮＡ断片は、前述のプライマーセットＩを用いて、上記と同一の増幅条件を用いて増幅させた。得られたＰＣＲ増幅産物は、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｐｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いてプラスミドにライゲーション後、大腸菌に形質転換した。この形質転換した大腸菌を、アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地に塗沫し、カラーセレクションを行った。カラーセレクションによりＰＣＲ産物をライゲーションしたプラスミドを有することが確認された大腸菌については、まず、下記に示すプライマーセットＩＩＩ：
Ｍ１３ Ｆ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号８）
Ｍ１３ Ｒ（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号９）
を用いてＤＮＡを増幅し、その増幅産物について、さらにプライマーセットＩを用いてＰＣＲを行い、再度ＤＧＧＥを行ってバンドの出現位置を確認した。なお、プライマーセットＩＩＩを用いたＰＣＲ条件を以下の表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
その後、確認された所望のＤＮＡ断片はＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｐｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて精製した。精製したＰＣＲ増幅物はＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてシーケンス反応を行った。塩基配列はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。決定した塩基配列については、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）に登録されている配列に対して相同性検索を行い最も近縁な微生物名を決定した。
【００３４】
実施例４：リアルタイムＰＣＲ法を用いたＤＮＡ濃度の定量
一般に嫌気性菌は増殖が遅く、生成するコロニーも小さいので寒天平板上でのコロニーアピアランスによる識別が困難であることから、メタン発酵のような複数の微生物が共存する複合微生物の系で特定の微生物の濃度を選択的に定量するためには、その微生物に特徴的な遺伝子の配列を検出するリアルタイムＰＣＲ法を有効に使用することができる。そこで、バンドＢ６を特異的に検出するプライマーセットを設計し、これを用いてメタン発酵槽のグラニュール中の真正細菌に含まれるバンドＢ６を定量した。ここで使用するリアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅量をリアルタイムでモニタリングし、測定される蛍光強度の閾値と増幅曲線が交わるサイクル数（Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ））と、初期鋳型量、すなわち初期微生物濃度の間に直線関係があることを利用して、微生物濃度を定量する方法である。
【００３５】
（１）プライマーの設計
バンドＢ６は、前述のプライマー３５７Ｆと５１７Ｒに含まれる塩基配列の情報からＡｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）に最も近縁であることが判明した。ＮＥ２３−３株の塩基配列情報（図２）をもとにＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、ＮＥ２３−３株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列の中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをＦａｓｔＰＣＲ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｆａｓｔｐｃｒ．ｈｔｍｌ）の推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは８０〜１５０塩基（増幅効率を１００％にするため）、プライマー長さは１７〜２５塩基（長過ぎるとアニーリング効率が低下する）ＧＣ含量は４０〜６０％（４５〜５５％が望ましい）とし、偏りがないように、部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように注意する、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｇが連続しないように注意する、プライマー内部での３ 塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基相補する配列を避ける。設計したプライマー（プライマーセットＩＩ）の塩基配列は前述の通りである。
【００３６】
（２）設計したプライマーの特異性の検討
設計したプライマーセットＩＩが目的菌に選択的であることをＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、プライマーの塩基配列と目的菌以外の微生物群の塩基配列とを比較することで確認するとともに、実際のメタン発酵グラニュールサンプルに設計したプライマー（プライマーセットＩＩ）を作用させて、増幅される複数のＤＮＡ断片の塩基配列がすべて同一であることを確かめた（データ示さず）。増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列が同一であれば、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出する可能性は極めて小さくなる。まず、メタン発酵グラニュールサンプルにプライマーセットＩＩを加えてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。なお、ＰＣＲ条件を以下の表４に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】
次に、増幅したＤＮＡ断片をＴＡクローニング法により大腸菌に形質転換した。続いてＰＣＲ産物がライゲーションされたプラスミドを持つことが確認された大腸菌にプライマーセットＩＩＩ（前述）を加えて、ＰＣＲ増幅し、精製した。その後、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてシーケンス反応を行った。塩基配列はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。目的としたＰＣＲ産物がライゲーションされたプラスミドを持つことが確認された大腸菌コロニーが１２個得られた。これらのすべてについてＰＣＲ産物の塩基配列を解析したところ、塩基配列は完全に同一であり、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出している確率は極めて小さいことが判明した。また、このプライマーセットＩＩで増幅したＤＮＡ領域は、バンドＢ６の同定に用いたＤＮＡ領域と同じ遺伝子上に存在することを確かめた。
【００３９】
（３）設計したプライマーを用いた検量線の作成
メタン発酵グラニュールサンプルを適宜希釈して、設計したプライマーの定量性を確認した。メタン発酵グラニュールサンプルは発酵開始１２５日目のものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用い、ＰＣＲ反応液は、プライマーセットＩＩとＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、下記の表５のように調製した。
【００４０】
【表５】
【００４１】
増幅条件は最初に９５℃、１０秒の変性をおこなった後、９５℃、５秒（変性）、６０℃、２０秒（アニーリング／伸長）を４０サイクルとした（表６参照）。作製した検量線を図５に示す。検量線のＲ２値は０．９７６であり、定量に用いるのに十分な精度であった。
【００４２】
【表６】
【００４３】
（４）リアルタイムＰＣＲ法によるバンドＢ６に対応する微生物の定量
メタン発酵グラニュールサンプルからのＤＮＡ抽出物にリアルタイムＰＣＲ法を適用してバンドＢ６に対応する菌体濃度を測定した。用いたプライマーセットとＰＣＲ条件は、検量線を作成したときと同様とした。なお、菌体濃度はメタン発酵１２５日後の菌体濃度が最大になるときを１とした相対濃度で示した（図６参照）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法、及び該方法に使用されるプライマーセットに関する。より具体的には、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する特定の真正細菌をそのＤＮＡ情報に基づいて検出及び定量することを特徴とするメタン発酵の運転管理に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタン発酵は、有機性廃水を処理する方法の１つで、ランニングコストが安く、さらにバイオガスとしてエネルギー回収ができ、余剰汚泥発生量も少ないという特徴を有する優れた方法として知られている（非特許文献１参照）。メタン発酵法の歴史は古く、嫌気性微生物による高濃度有機性廃水や汚泥消化等の処理技術として開発されてきた。近年では、高濃度有機性廃水等に使われた第一世代に代わって、ＵＡＳＢ法（上向流嫌気性汚泥床法）の開発に伴う第二世代のメタン発酵法が実績を増やしている。ＵＡＳＢ法とは、０．５〜２ｍｍ程度に自己造粒した高密度グラニュール菌体（真正細菌及び古細菌を含む）を利用して、高濃度基質の高負荷高速運転を可能としたリアクターを利用する方法である（非特許文献１及び２参照）。グラニュール菌体は沈降性が良いことから、それまでの懸濁型メタン発酵に見られるような気液固分離の欠点を解決できる手法である。
【０００３】
メタン発酵は、多くの微生物の共生により有機物を分解し、その過程で生成する有機酸などをメタンに還元する方法であって、主として３段階で進行すると考えられている。複雑な有機物は、第１段階の酸生成過程（液化過程）で酸生成菌類の作用により、単糖類、アミノ酸などの低分子量の物質を経て、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、酪酸などの低級脂肪酸、乳酸及びエタノールなどになる。第２段階においては、酢酸以外の低級脂肪酸、乳酸及びエタノールは、水素生成細菌により水素及び酢酸に変換され、最終の第３段階において基質特異性の強いメタン生成古細菌群により、メタン及び二酸化炭素などに分解される。ここで、酢酸及びプロピオン酸などの低級脂肪酸はメタン発酵プロセスにおける主要な中間生成物であり、酸生成菌類及び水素生成細菌などの真正細菌がその役割を担っている（非特許文献３参照）。
【０００４】
メタン発酵においては、その原料となる有機性廃棄物の供給量（有機物負荷）が大きくなると、供給量に応じてメタンガスの発生量も増加するが、有機物負荷が過剰になると、メタン生成に関与する真正細菌及び古細菌の活性が著しく低下し、メタンガスが全く生成されなくなる（メタン発酵が失敗する）。有機物負荷の過剰によりメタン生成が行われなくなると、メタン発酵を復帰させることは非常に困難であるという問題点がある。この限界の負荷量をリアクター内への流速や有機物濃度などから決定することは困難であり、これまで限界の負荷量は熟練のオペレータの判断に任されていた。これまで、メタン発酵が失敗した後に有用な微生物が死滅又は減少するという報告がなされている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に開示された方法は、メタン発酵の失敗を後付け的に説明することはできても、メタン発酵の失敗を予測し、未然に予防することができない。また、メタン発酵が失敗するとき、又は失敗したときには、リアクター内のｐＨが低下している（ｐＨ低下はメタン発酵失敗の原因であり、結果である、すなわち負のフィードバックと考えられる）ということは経験的によく知られている。しかしながら、メタン発酵が失敗しなくても一時的にｐＨ低下が起こることも周知な現象である。よって、ｐＨ低下に基づいて、メタン発酵失敗の予兆とすることはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−３２５５８１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】松本豊、中崎清彦共著、『化学工学の進歩第３６集 環境調和型エネルギーシステム』（社団法人化学工学会編集）、「４．３ メタン発酵技術」（１４０〜１５６頁）、２００２年、槇書店
【非特許文献２】松尾幸彦他、『用水と廃水』、「ＵＡＳＢ法を用いたＰＥＧ排水の高速処理」、Ｖｏｌ．４３、Ｎｏ．１２、１０６０−１０６６（２００１）
【非特許文献３】重松亨ら、『生物工学会誌』、第８７巻、第１２号、５７０〜５９６頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、メタン発酵の運転管理を行う手法は開発されていない。したがって、本発明の目的は、特定微生物の関与に基づいて、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、安定的なメタン発酵を達成させるための運転管理の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記実情に鑑み、本発明者らは、メタン発酵が失敗するときに、いわゆる悪玉菌ともいうべき、かかる失敗を誘発する特定の微生物を同定することに成功し、該微生物の増殖をメタン発酵中にモニタリングすることにより、メタン発酵の運転管理を首尾よく行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法。
［２］前記真正細菌が、配列番号３に示される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、上記［１］に記載のモニタリング方法。
［３］有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記［１］又は［２］に記載のモニタリング方法。
［４］前記食品廃棄物がシロップ廃液である、上記［３］に記載のモニタリング方法。
［５］有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
であるプライマーセット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、有機性廃棄物の有効利用を目的としたメタン発酵において、メタン発酵が失敗に至る状態の変化を特定の微生物のＤＮＡ情報に基づいて客観的に予測することにより、メタン発酵の運転管理が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】バンドＢ６全長の塩基配列を示す。
【図２】Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を示す。
【図３】バンドＢ６を有する真正細菌を含む系統分布図を示す。
【図４】有機性廃棄物の供給量（ＴＯＣ濃度）を経時的に変化させたパターンを示す。
【図５】リアルタイムＰＣＲ法に使用したプライマーを用いた検量線を示す。
【図６】（Ａ）ＴＯＣ濃度を経時的に変化させた場合に、メタン発酵中に現れる微生物に固有の１６Ｓ ｒＲＮＡを示す。（Ｂ）ＴＯＣ濃度の変化に対応させたメタンガスの発生量を示す。（Ｃ）バンドＢ６の経時的なＤＮＡ濃度の相対的変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法に関する。
【００１３】
（１）メタン発酵効率の低下に関与する真正細菌の遺伝子のクローニング
本発明のモニタリング方法において標的とする真正細菌は、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３に近縁の真正細菌であって、固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する。本発明者らは、メタン発酵中に有機物負荷を徐々に増大させていくと、ある量（「限界負荷量」という。）を超えた時点からメタン発酵効率の低下が見られ、この限界負荷量の前後からある種の真正細菌が増加することを見出し、メタン発酵中のこの真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）（本明細書において、その部分塩基配列を「バンドＢ６」と呼ぶ。）量をリアルタイムＰＣＲで測定することにより、メタン発酵効率のモニタリングに成功し、本発明を完成させた（後述する実施例４参照、図６）。なお、バンドＢ６の塩基配列を図１に示す（配列番号３）。
【００１４】
バンドＢ６は、近縁のＡｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の部分塩基配列（配列番号４）の情報を利用することにより同定された（実施例３参照）。バンドＢ６を有する真正細菌、及び上記ＮＥ２３−３株はいずれも未同定であり、基準株（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）が存在しない。本発明のモニタリング方法においては、モニタリングの標的となる真正細菌の固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の一部であるバンドＢ６の部分配列（配列番号３のヌクレオチド１１８−２５５）を検出の対象とする。
【００１５】
本発明のモニタリング方法において使用されるバンドＢ６の同定は、例えば、以下のようにして行うことができる。簡単には、真正細菌から核酸を抽出後、ＰＣＲで増幅して、アガロースゲル電気泳動等の分子量により核酸断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。メタン発酵に関与する真正細菌は複数種含まれるため、最初に特定の真正細菌における固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を同定することが必要である。まず、グラニュール菌体に含まれる微生物群（「微生物叢」）の１６Ｓ ｒＲＮＡをＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によって分離及び検出する。具体的には、メタン発酵中のリアクター内溶液をサンプリングし、グラニュール状メタン菌を遠心分離によって回収した後、溶菌し、メタン菌に含まれるタンパク質及び脂質をクロロホルムの添加によって抽出・除去する。続いて、エタノールの添加により核酸のみを回収する。その後、真正細菌由来のＤＮＡを検出するために汎用されている以下のプライマーセット（以下、「プライマーセットＩ」と称する場合がある。）：
３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号５）（配列番号４のヌクレオチド３２４−３４０に対応）
５１７ｒ（リバース）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号６）（配列番号４のヌクレオチド５１８−５０２に対応）
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する。上記プライマーセットＩは、真正細菌を含む大部分の原核生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマー３５７ｆ及び５１７ｒは、それぞれヌクレオチド３４１−３５７及び５１７−５３４に対応する。なお、上記プライマー３５７ｆには、ＧＣクランプ（５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧ−３’）（配列番号７）が付加されている。また、核酸を増幅するための方法としては、ＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））に限定されず、当業者であれば、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））等を用いることができることは容易に理解される。なお、本発明のモニタリング方法では、メタン発酵効率をリアルタイムで測定する必要性からＰＣＲ法を利用することが好ましい。ＰＣＲ反応条件は、例えば、２本鎖ＤＮＡの熱変性を９０〜９８℃で５秒〜１０分間行い、アニーリングを５０〜７０℃で１０秒〜２分間行い、伸長反応を６０〜７５℃で１０秒〜１０分間行う。任意に、最終伸長反応を伸長反応と同じ温度で１０秒〜１５分間行う。熱変性−アニーリング−伸長反応のサイクルを５〜５０回行う。
【００１６】
次に、上記で核酸を増幅させたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離する。電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の分離は常法に従って容易に行うことができる。電気泳動で使用するゲルは、核酸を変性させるための変性剤を含み、核酸の分離に適した所定の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。また、電気泳動に使用される泳動溶液及び電圧等の泳動条件は適宜調整することができる。上記のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を使用することにより、各真正細菌に該当する核酸のバンドの濃淡から、可視的に真正細菌の経時的な増減をモニタリングすることができる。ここで、ゲル上のバンドの検出は、限定されないが、エチジウムブロマイド含有溶液を用いてゲルを染色することにより行う。
【００１７】
さらに、本発明のモニタリング方法で対象とされる真正細菌は、限界負荷量の前後において出現する細菌であり、上記の電気泳動上の経時的なバンドの濃淡の変化において限界負荷量の前後に出現したバンド（固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ断片）を切り出し、塩基配列を解析することにより、メタン発酵効率の低下に関与する真正細菌の遺伝子をクローニングすることができる。ゲルから切り出されたＤＮＡ断片には、目的以外のＤＮＡ断片が混在している可能性があるため、所望のＤＮＡ断片を得るためにさらに分離及び精製することが好ましい。一般に、ＰＣＲ産物をクローニングするため、ベクター（例えば、ｐＣＲ４、ｐＭＷ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＤＥＬ系などのプラスミドベクター、Ｍ１３ｍｐなどのファージベクター、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９系などのコスミドベクター）に、ＰＣＲ産物をライゲーションさせ、コンピテントセルに形質転換させる。ベクターにはさらにプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを適宜含めることができる。形質転換したコンピテントセルを培養してコロニーを形成させ、塩基配列の解読のためのサンプルとする。その後、所望のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するが、塩基配列の解読は、従来法を用いればよく、例えば、Ｓａｎｇｅｒ法、サイクルシークエンス法による自動シークエンサーを利用することができる。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法があるが、いずれの方法でもよい。
【００１８】
本発明のバンドＢ６のクローニングにおいては、所望のＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲによるＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用したＴＡクローニング法を用いることができる。ＴＡクローニング法は、３’→５’エキソヌクレア−ゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したクローニング法であり、まず、このＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ産物の平滑末端をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のｐｏｌＩ型酵素によって処理することによって、３’末端にアデニン又はチミンを付加させる。一方、ベクターにｄＴＴＰ又はｔａｑＤＮＡポリメラーゼを反応させることによってＴＡベクターを作製する。次に、上記のように処理した核酸断片とベクターをライゲーションさせて宿主細胞に形質転換し、所望のＤＮＡをクローニングする方法である。より具体的には、上記でゲルから切り出されたＤＮＡ断片をまず上記のプライマーセットＩを使用し、ＰＣＲにより増幅する。次に、得られたＰＣＲ産物をＴＡクローニング用のプラスミドに組込み、このプラスミドを大腸菌に形質転換する。次に、ＰＣＲ産物が組み込まれたプラスミドによって大腸菌に形質転換されたことを確認するために、アンピシリン等の抗生物質による選択を行う。その後、プラスミドＤＮＡを抽出し、プライマーセットＩを用いて所望のＰＣＲ産物を増幅させ、さらに、上記と同様にＤＧＧＥを行い、バンド位置を確認した後、バンドＢ６の部分塩基配列を決定することができる。本明細書においては、プライマーセットＩを用いて決定されたバンドＢ６の部分塩基配列（配列番号３のヌクレオチド１８−１７８）から、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いた相同性検索を行い、最も近縁な微生物として、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）を特定した（実施例３参照）。上述の通り、ＮＥ２３−３株は、未同定であり、基準株が存在しない。得られたバンドＢ６の部分塩基配列（配列番号３のヌクレオチド１８−１７８）とＮＥ２３−３株の部分塩基配列の一部（配列番号４のヌクレオチド３４１−５０１）とを比較すると、両者は一致していた。なお、プライマーセットＩは、引用文献（Ｐｅｄｒｏ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９２，１５９−１６４（２００１））に記載され、特に変更せずに使用した。また、後述するように、バンドＢ６の塩基配列としてヌクレオチド１−２５５を決定した（配列番号３、図１参照）。
【００１９】
（２）モニタリング方法
本発明によれば、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法が提供され、より具体的には、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法である。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「有機性廃棄物」とは、一般に、生物学的分解によって環境中に直接還元することができる廃棄物を指し、限定されないが、生ごみなどの食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥などが挙げられる。食品廃棄物には、一般廃棄物（事業系及び家庭系を問わない）及び産業廃棄物が含まれる。具体的には、食品廃棄物の例は、限定されないが、生ごみ、シロップ廃液、おから、排乳、コーヒーかす、茶かすなどが挙げられる。
【００２１】
本発明によれば、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌のバンドＢ６（１６Ｓ ｒＲＮＡ）量を測定するために使用されるバンドＢ６に特異的なプライマーセットを提供することができる。本発明においては、下記のプライマーセットＩＩ：
ＧＭＰ４７８Ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＧＧＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＣ−３’（配列番号１）（配列番号３のヌクレオチド１１８−１３９に対応）
ＧＭＰ５７５Ｒ（リバース）：５’−ＡＴＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＣＧＣＧＣ−３’（配列番号２）（配列番号３のヌクレオチド２５５−２３６に対応）
を設計し、メタン発酵効率のモニタリングに使用した。大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマーＧＭＰ４７８Ｆ及びＧＭＰ５７５Ｒは、それぞれヌクレオチド４５７−４７８及び５７５−５９４に対応する。本発明のモニタリング方法では、上記プライマーセットＩＩ以外に、各プライマーに実質的に同一な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。ここで、本明細書で使用するとき、語句「実質的に同一な塩基配列」とは、対応する上記プライマーの塩基配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の複数個、好ましくは５個、より好ましくは４個、さらに好ましくは３個、さらにより好ましくは２個、最も好ましくは１個が欠失、付加及び／又は置換されている塩基配列をいう。
【００２２】
プライマーの設計は以下の通りである。上述した通り、バンドＢ６は、プライマーセットＩ（プライマー３５７Ｆと５１７Ｒ）に含まれる塩基配列の情報からＡｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）に最も近縁であることが判明した（図３参照）。そこで、ＮＥ２３−３株の塩基配列情報（配列番号４、図２）に基づいて、ＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、ＮＥ２３−３株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをＦａｓｔＰＣＲ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｆａｓｔｐｃｒ．ｈｔｍｌ）の推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは８０〜１５０塩基（増幅効率を１００％にするため）、プライマー長さは１７〜２５塩基（長過ぎるとアニーリング効率が低下する）ＧＣ含量は４０〜６０％（４５〜５５％が望ましい）とし、偏りがないように、部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように注意する、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｇが連続しないように注意する、プライマー内部での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基相補する配列を避ける。プライマーの標的塩基配列への特異性を確認するため、所定のＰＣＲ反応条件下で定量的ＰＣＲ法（例えば、ＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法）を行い、増幅曲線分析及び融解曲線分析を行ってバンドＢ６に相当する微生物濃度を定量することができる。
【００２３】
上記で設計したプライマーセットＩＩの使用により、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）（一部にバンドＢ６遺伝子を含む）を検出し、例えば、リアルタイムＰＣＲ法によってバンドＢ６を経時的に定量することができる。なお、バンドＢ６を有する真正細菌（菌体）は、バンドＢ６の塩基配列を含む約１５００塩基の１６Ｓ領域を有するが、現時点では完全に配列決定されていない。また、このバンドＢ６は、メタン発酵効率の低下と関連付けて見出されたが、バンドＢ６を有する真正細菌は、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下の開始前、開始と同時、又は開始後に増殖してメタン発酵系に出現する細菌である。本発明のモニタリング方法においては、メタン発酵効率の低下を予測することを目的としているため、メタン発酵効率の低下に先駆けて（低下の開始前に）増殖するか又は該低下と同時に増殖するバンドＢ６を有する真正細菌を検出されることが望ましい。ここで、本明細書で使用するとき、「先駆けて」とは、メタン発酵効率の低下開始の少なくとも２〜３週間前、１週間前、数日前、１日前、１２時間前、６時間前、３時間前、１時間前、又は３０分前に、該真正細菌が増殖を開始するか又はバンドＢ６が検出される場合をいう。検出されるバンドＢ６は、遺伝子（ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）の形態であるか又はタンパク質の形態であってもよい。
【００２４】
本発明のモニタリング方法によれば、プライマーセットＩＩを用いたリアルタイムＰＣＲを行った後、バンドＢ６に対応する菌体を含んでいるメタン発酵過程で採取したグラニュールサンプルを連続希釈し、この希釈率に応じた菌体数に対するバンドＢ６の検量線を作成することができる。これにより、目的とする真正細菌の試料中での有無、その数量を精度よく知ることができる。また、本明細書で使用するとき、メタン発酵効率の「低下」とは、有機性廃棄物の限界負荷量を超えて添加された場合に、メタン発酵系に有機性廃棄物を添加することによって発生していたメタンガスの量が減少している、又は有機性廃棄物を添加したとしてもメタンガスが発生しないことを意味する。限界定負荷量を超えたことによるメタン発酵効率の低下は、メタンガスの発生量が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少した場合を指す。本発明のモニタリング方法を適用することにより、メタン発酵効率の低下に先駆けて又は低下と同時に増加するバンドＢ６量をリアルタイムで定量することにより、メタン発酵が失敗に至る状態の変化を予測することができるため、添加する有機性廃棄物の量を調節することによって、安定なメタン発酵が可能になる。また、本発明によれば、本発明のモニタリング方法を応用したバイオセンサーを提供することができる。より具体的には、前述のプライマーセットＩＩが電極に固定化されたバイオセンサーを用いることにより、リアクター内の発酵液中のバンドＢ６量を検出及び定量することにより、リアクターに供給する有機性廃棄物の量を調節することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００２５】
実施例１：ＵＡＳＢメタン発酵
メタン発酵にはＵＡＳＢ法を使用し、原料の有機性廃棄物としては、共同出願人である山梨缶詰株式会社の工場において缶詰製造過程で排出される平均２．２トン／日のシロップ廃液を用いた。使用したシロップ廃液は、主成分がスクロースであり、糖度が１５．２ブリックス、全有機炭素（ＴＯＣ）濃度が約７１ｇ／Ｌであった。メタン発酵には、外寸法φ２５００×Ｈ５０００ｍｍのＵＡＳＢ発酵槽を用いた。発酵液容積は２０ｍ３であった。実験開始時にビール工場のＵＡＳＢ発酵槽で形成されたグラニュール汚泥を１５ｍ３充填した。また、実験開始から２日間は馴致期間とし、シロップ廃液を供給せずに温度を４０℃に維持した。実験開始から２日以降にシロップ廃液の供給を始めるが、シロップ廃液をそのままＵＡＳＢ発酵槽へ投入すると負荷が高すぎるため、調整槽において水で適宣希釈し、ｐＨが７．５付近になるように苛性ソーダを用いて調整した。その後、温調槽で３９℃まで昇温した後にＵＡＳＢ発酵槽に導いた。水で希釈したシロップ廃液の濃度を段階的に変化させたが、およそ４〜５ヶ月後にはシロップ廃液を等量の水で希釈し、ＴＯＣ濃度が３５．５ｇ／Ｌとなるように負荷を増加させた（図４参照）。なお、１４５日目以降は再び負荷量を低下させた。また、運転開始４９日以降にはメタン発酵を担う微生物の活性を高める目的で金属塩ＣｏＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＣｌ２をそれぞれ２０ｇずつ（供給するシロップ廃液の１ｐｐｍ程度に相当）を添加し、さらに、６４日以降にはＣ／Ｎ比が１５になるように調整槽にて尿素を添加した。ガス発生量は発酵槽上部に取り付けたガス出口の流量計（山武、気体用マスフローメーター、ＣＭＳ０５００）で計測し、ｐＨは槽内のｐＨメータ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ、ｐＨ１００）で計測した。なお、発生するガスは、１日１回、テドラーバッグに捕集し、その中に含まれるメタンガス濃度をガスクロマトグラフ分析装置（ヤナコ、Ｇ−１０１１、カラム ＭＳ１３Ｘ＋ＭＳ５Ａ）を用いて測定した。メタン発酵の設定温度を４０℃とし、グラニュールを含む発酵液サンプルを発酵槽下部から１７００ｍｍ、壁面から７５０ｍｍのサンプリング口から所定の時間間隔で、約２００ｍＬを採取して、微生物叢の解析に用いた。
【００２６】
実施例２：グラニュール粒子からのＤＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅
採取した発酵液サンプル中のグラニュールの約１ｇを滅菌したスパーテルですくい取り、３０ｍＬの滅菌水で洗浄してグラニュール表面に付着している微生物を除去した。その後、その０．３ｇを使用して、Ｉｓｏｉｌ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）によりＤＮＡを抽出した。次に、グラニュールから抽出したＤＮＡには、真正細菌及び古細菌に由来するＤＮＡが含まれるが、真正細菌に由来するＤＮＡを増幅させるために、前述のプライマーセットＩ（プライマー３５７ｆと５１７ｒ）を用いた。増幅条件を以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
使用したＰＣＲ増幅装置はＰＴＣ−１００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ ＣＯ．，Ｌｔｄ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）であった。また、ＰＣＲ反応液の組成を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
実施例３：バンドＢ６の分離及び同定
真正細菌からバンドＢ６を検出するためにＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法を用いた。ＤＧＧＥにはＴｈｅ Ｄｃｏｄｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）を使用した。まず、グラニュールから抽出した真正細菌由来のＤＮＡを増幅したＰＣＲ産物を変性剤の濃度勾配が３０％から６０％（変性剤１００％では７Ｍの尿素と４０％［ｗｔ／ｖｏｌ］のホルムアミドを含む）の厚さ０．８ｍｍのポリアクリルアミドゲル（１０％［ｗｔ／ｖｏｌ］アクリルアミドとビスアクリルアミドの割合は３７．５：１）を用いて、１．０×Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）溶液中で６０℃、２００Ｖ、３．５時間の条件で電気泳動を行った。なお、電気泳動の後、２００ｍＬの１．０×ＴＡＥ溶液と２０μＬのエチジウムブロマイド溶液を混合した溶液にゲルを浸し、３０分間染色した後、紫外線下で可視化した。
【００３１】
ＤＧＧＥ法で検出されたポリアクリルアミドゲル中のバンドからＤＮＡ断片を抽出・回収した。抽出したＤＮＡ断片から所望のＤＮＡ断片を分離及び精製するために、ＴＡクローニング法を用いた。まず、抽出されたＤＮＡ断片は、前述のプライマーセットＩを用いて、上記と同一の増幅条件を用いて増幅させた。得られたＰＣＲ増幅産物は、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｐｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いてプラスミドにライゲーション後、大腸菌に形質転換した。この形質転換した大腸菌を、アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地に塗沫し、カラーセレクションを行った。カラーセレクションによりＰＣＲ産物をライゲーションしたプラスミドを有することが確認された大腸菌については、まず、下記に示すプライマーセットＩＩＩ：
Ｍ１３ Ｆ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号８）
Ｍ１３ Ｒ（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号９）
を用いてＤＮＡを増幅し、その増幅産物について、さらにプライマーセットＩを用いてＰＣＲを行い、再度ＤＧＧＥを行ってバンドの出現位置を確認した。なお、プライマーセットＩＩＩを用いたＰＣＲ条件を以下の表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
その後、確認された所望のＤＮＡ断片はＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｐｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて精製した。精製したＰＣＲ増幅物はＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてシーケンス反応を行った。塩基配列はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。決定した塩基配列については、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）に登録されている配列に対して相同性検索を行い最も近縁な微生物名を決定した。
【００３４】
実施例４：リアルタイムＰＣＲ法を用いたＤＮＡ濃度の定量
一般に嫌気性菌は増殖が遅く、生成するコロニーも小さいので寒天平板上でのコロニーアピアランスによる識別が困難であることから、メタン発酵のような複数の微生物が共存する複合微生物の系で特定の微生物の濃度を選択的に定量するためには、その微生物に特徴的な遺伝子の配列を検出するリアルタイムＰＣＲ法を有効に使用することができる。そこで、バンドＢ６を特異的に検出するプライマーセットを設計し、これを用いてメタン発酵槽のグラニュール中の真正細菌に含まれるバンドＢ６を定量した。ここで使用するリアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅量をリアルタイムでモニタリングし、測定される蛍光強度の閾値と増幅曲線が交わるサイクル数（Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ））と、初期鋳型量、すなわち初期微生物濃度の間に直線関係があることを利用して、微生物濃度を定量する方法である。
【００３５】
（１）プライマーの設計
バンドＢ６は、前述のプライマー３５７Ｆと５１７Ｒに含まれる塩基配列の情報からＡｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＥ２３−３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ２３１８０２）に最も近縁であることが判明した。ＮＥ２３−３株の塩基配列情報（図２）をもとにＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、ＮＥ２３−３株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列の中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをＦａｓｔＰＣＲ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｆａｓｔｐｃｒ．ｈｔｍｌ）の推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは８０〜１５０塩基（増幅効率を１００％にするため）、プライマー長さは１７〜２５塩基（長過ぎるとアニーリング効率が低下する）ＧＣ含量は４０〜６０％（４５〜５５％が望ましい）とし、偏りがないように、部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように注意する、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｇが連続しないように注意する、プライマー内部での３ 塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基相補する配列を避ける。設計したプライマー（プライマーセットＩＩ）の塩基配列は前述の通りである。
【００３６】
（２）設計したプライマーの特異性の検討
設計したプライマーセットＩＩが目的菌に選択的であることをＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、プライマーの塩基配列と目的菌以外の微生物群の塩基配列とを比較することで確認するとともに、実際のメタン発酵グラニュールサンプルに設計したプライマー（プライマーセットＩＩ）を作用させて、増幅される複数のＤＮＡ断片の塩基配列がすべて同一であることを確かめた（データ示さず）。増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列が同一であれば、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出する可能性は極めて小さくなる。まず、メタン発酵グラニュールサンプルにプライマーセットＩＩを加えてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。なお、ＰＣＲ条件を以下の表４に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】
次に、増幅したＤＮＡ断片をＴＡクローニング法により大腸菌に形質転換した。続いてＰＣＲ産物がライゲーションされたプラスミドを持つことが確認された大腸菌にプライマーセットＩＩＩ（前述）を加えて、ＰＣＲ増幅し、精製した。その後、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてシーケンス反応を行った。塩基配列はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。目的としたＰＣＲ産物がライゲーションされたプラスミドを持つことが確認された大腸菌コロニーが１２個得られた。これらのすべてについてＰＣＲ産物の塩基配列を解析したところ、塩基配列は完全に同一であり、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出している確率は極めて小さいことが判明した。また、このプライマーセットＩＩで増幅したＤＮＡ領域は、バンドＢ６の同定に用いたＤＮＡ領域と同じ遺伝子上に存在することを確かめた。
【００３９】
（３）設計したプライマーを用いた検量線の作成
メタン発酵グラニュールサンプルを適宜希釈して、設計したプライマーの定量性を確認した。メタン発酵グラニュールサンプルは発酵開始１２５日目のものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用い、ＰＣＲ反応液は、プライマーセットＩＩとＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、下記の表５のように調製した。
【００４０】
【表５】
【００４１】
増幅条件は最初に９５℃、１０秒の変性をおこなった後、９５℃、５秒（変性）、６０℃、２０秒（アニーリング／伸長）を４０サイクルとした（表６参照）。作製した検量線を図５に示す。検量線のＲ２値は０．９７６であり、定量に用いるのに十分な精度であった。
【００４２】
【表６】
【００４３】
（４）リアルタイムＰＣＲ法によるバンドＢ６に対応する微生物の定量
メタン発酵グラニュールサンプルからのＤＮＡ抽出物にリアルタイムＰＣＲ法を適用してバンドＢ６に対応する菌体濃度を測定した。用いたプライマーセットとＰＣＲ条件は、検量線を作成したときと同様とした。なお、菌体濃度はメタン発酵１２５日後の菌体濃度が最大になるときを１とした相対濃度で示した（図６参照）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法。
【請求項２】
前記真正細菌が、配列番号３に示される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、請求項１に記載のモニタリング方法。
【請求項３】
有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のモニタリング方法。
【請求項４】
前記食品廃棄物がシロップ廃液である、請求項３に記載のモニタリング方法。
【請求項５】
有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
であるプライマーセット。
【請求項１】
有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ量又は１６Ｓ ｒＲＮＡ量を測定することを含むモニタリング方法。
【請求項２】
前記真正細菌が、配列番号３に示される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、請求項１に記載のモニタリング方法。
【請求項３】
有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のモニタリング方法。
【請求項４】
前記食品廃棄物がシロップ廃液である、請求項３に記載のモニタリング方法。
【請求項５】
有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
であるプライマーセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２４９５５８（Ｐ２０１２−２４９５５８Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２３５２９（Ｐ２０１１−１２３５２９）
【出願日】平成２３年６月１日（２０１１．６．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 化学工学会第７６年会研究発表講演要旨集（発行所：公益社団法人 化学工学会 発行日：平成２３年２月２２日）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（５１１１３３６７９）山梨罐詰株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１日（２０１１．６．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 化学工学会第７６年会研究発表講演要旨集（発行所：公益社団法人 化学工学会 発行日：平成２３年２月２２日）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（５１１１３３６７９）山梨罐詰株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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