抗スクレロスチン抗体
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、高い親和性及び強力な中和特性を有することを特徴とする、ヒト化及びキメラ抗体の提供に関する。本発明の抗体は、骨量、骨塩密度及び骨強度の増強、並びにヒト被験者の様々な障害（例えば骨粗鬆症）の治療に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野、特にスクレロスチンに対する抗体の分野に関する。より具体的には、本発明はヒトスクレロスチンと特異的に結合する高親和性抗体、並びに、ヒト被験者における、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つの増加により利益を受ける様々な障害又は症状の治療への、当該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は骨塩密度（ＢＭＤ）が低下し、骨の微細構造が崩壊し、骨粗鬆症の際の骨は骨折の危険性が高くなる疾患である。骨粗鬆症は依然として、特に高齢者における長期にわたる障害及び死亡率の大きな原因である。骨粗鬆症の有効な治療法として、生活様式の改善や薬物療法が存在するが、現在利用可能な治療方法は、数的に、及び有効性において限られたものであり、また望ましくない副作用をしばしば生じさせ、ゆえに患者への許容性は普遍的なものとはいえない。カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン置換療法剤及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭｓ）など多くの骨吸収抑制剤により、更なる骨損失が防止されるが、骨が失われた後では、それらは骨を再構築しない。ヒトＰＴＨ（１−３４）の形態のタンパク質同化剤を、骨量及び骨塩密度の上昇、及び骨構造の再構築に利用できる。しかしながらこの治療薬は通常、１年以上の期間にわたり、毎日皮下注射する必要があり、患者がそれを遵守することは困難となる。
【０００３】
スクレロスチン（ＳＯＳＴ遺伝子産物）は、骨内の骨細胞において強発現している。スクレロスチンは、骨形成に対する強力な負の調節因子としての役割を有するため、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つの増加により利益を受ける障害又は症状（例えば骨粗鬆症）への治療的介入のための望ましい標的である。したがって、抗スクレロスチン抗体は、かかる障害又は症状を治療する同化アプローチにおいて有用であると考えられる。特許文献１：国際公開第２００６／１１９１０７号パンフレットは、ＣＤＲの全てが完全にマウスのものである（すなわち、抗体中のマウス由来のＣＤＲが変化していない）、特定のヒト化抗スクレロスチン抗体のアミノ酸配列を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１１９１０７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒトスクレロスチンと強い結合親和性で結合し、スクレロスチン生物活性アッセイにおいて低いＩＣ５０値を示す、代替的な抗スクレロスチン抗体へのニーズが存在する。かかる抗体は、特に骨粗鬆症において治療的に有効性が高いと予測され、ＰＴＨ（１−３４）又は低い結合親和性（すなわち高いＫＤ）又は高いＩＣ５０値を示す抗スクレロスチン抗体の場合よりも少ない頻度での投与が可能である。また、ヒトスクレロスチンに特異的な抗体であって、当該抗体を投与されたヒト被験者における、当該抗体に対する免疫反応の危険性が少なく、又は不安定性の危険性が少なく、一方で、ヒトスクレロスチンに対する高い結合親和性を有し、生物活性アッセイにおいて低いＩＣ５０値を示す抗体特性が維持されている、前記抗体へのニーズも存在する。本発明の抗スクレロスチン抗体は、これらのニーズを満たし、関連する利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の抗体は、キメラ若しくはヒト化モノクローナル抗体であって、本願明細書において、開示される特異的なポリペプチド配列を含み、ヒトスクレロスチンと高い結合親和性で特異的に結合し、哺乳動物（好ましくはヒト）の骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるために使用できる。
【０００７】
一実施形態では、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲは、変異型抗体（すなわち本発明のヒト化若しくはキメラ抗体）の産生の基となる親抗体（すなわち齧歯動物（例えばマウス）中で産生させた抗体）に存在する、そのＣＤＲの位置におけるアミノ酸配列と異なる。本発明の抗体のＣＤＲ配列におけるかかる１つ以上のアミノ酸置換により、親抗体の場合にみられるものより大きなヒトスクレロスチンとの結合親和性（すなわち低いＫＤ）、スクレロスチン生物活性アッセイにおける低いＩＣ５０、又はその両方が生じるのが好ましい。本発明の抗体のＣＤＲ配列を、親抗体に存在するＣＤＲからアミノ酸置換したものとすることにより、当該抗体を投与されたヒトにおいて、当該抗体に対する免疫反応を低下させることができる。更に、本発明の抗体のＣＤＲ配列を、親抗体に存在するＣＤＲからアミノ酸置換したものとすることにより、当該抗体の不安定性の危険性を減少させることができる。例えば、アスパラギン残基を異なるアミノ酸で置換することにより、脱アミド化の危険性を減少させることができる。
【０００８】
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ領域を含んでなる：
（ｉ）配列番号２０で表されるＨＣＤＲ１、配列番号２１で表されるＨＣＤＲ２、配列番号２２で表されるＨＣＤＲ３、配列番号２３で表されるＬＣＤＲ１、配列番号２４で表されるＬＣＤＲ２、及び配列番号２５で表されるＬＣＤＲ３、
（ｉｉ）配列番号２６で表されるＨＣＤＲ１、配列番号２７で表されるＨＣＤＲ２、配列番号２８で表されるＨＣＤＲ３、配列番号２９で表されるＬＣＤＲ１、配列番号３０で表されるＬＣＤＲ２、及び配列番号３１で表されるＬＣＤＲ３、並びに、
（ｉｉｉ）配列番号３２で表されるＨＣＤＲ１、配列番号３３で表されるＨＣＤＲ２、配列番号３４で表されるＨＣＤＲ３、配列番号３５で表されるＬＣＤＲ１、配列番号３６で表されるＬＣＤＲ２、及び配列番号３７で表されるＬＣＤＲ３。
【０００９】
他の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）ポリペプチド及び軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」）ポリペプチドを含んでなり、
（ｉ）上記ＨＣＶＲは配列番号１４のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＶＲは配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、
（ｉｉ）上記ＨＣＶＲは配列番号１５のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＶＲは配列番号１８のアミノ酸配列を有するか、又は、
（ｉｉｉ）上記ＨＣＶＲは配列番号１６のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＶＲは配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含んでなり、
（ｉ）上記重鎖ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有し、上記軽鎖ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を有するか、
（ｉｉ）上記重鎖ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有し、上記軽鎖ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列有するか、又は、
（ｉｉｉ）上記重鎖ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有し、上記軽鎖ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列有する。
【００１１】
一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で定義される（好ましくは配列番号により定義される）ように、ヒトスクレロスチンとの結合親和性（ＫＤ）が２５℃で約１０ｐＭ以下であるものとして更に特徴付けられる。本発明の好適な抗体は、カニクイザルスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１００ｐＭ以下である。本発明のより好適な抗体は、ヒトスクレロスチンとの結合親和性が２５℃で約１０ｐＭ以下であり、かつ、カニクイザルスクレロスチンとの結合親和性が２５℃で約１００ｐＭ以下である。
【００１２】
他の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で定義される（好ましくは配列番号により定義される）ように、ヒトスクレロスチンを使用する骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が５０ｎＭ以下であることによって特徴付けられる。好ましくは、これらの抗体はまた、ヒトスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１０ｐＭ以下である。好ましくは、これらの抗体は、ヒトスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１０ｐＭ以下であり、かつ、カニクイザルスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１００ｐＭ以下である。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、本発明の抗体と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。好ましくは、上記医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤との均一若しくは実質的に均一な混合物を含んでなる。
【００１４】
本発明の実施形態は、薬剤の調製への本発明の抗体の使用にも関する。更なる本発明の実施形態は、動物、好ましくは哺乳動物の種、好ましくはヒト被験者における、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるための方法への、本発明の抗体の使用に関する。
【００１５】
更に本発明は、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させる方法であって、それを必要とするヒト被験者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含んでなる方法の提供に関する。
【００１６】
本発明の一実施形態は、ヒト被験者における、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つの増加により利益を受ける疾患、症状又は障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、骨関節炎に関連する痛み、歯周病及び多発性骨髄腫など）を治療する方法の提供に関する。
【００１７】
更なる本発明の実施形態は、生物学的サンプル中のスクレロスチンタンパク質を検出するための方法であって、本発明の抗体を、前記抗体がスクレロスチンタンパク質と結合できるのに十分な条件及び時間において、生物学的サンプルとインキュベートするステップと、前記結合を検出するステップと、を含んでなる方法の提供に関する。かかる検出アッセイに用いられる好適な抗体は、以下を有する：
配列番号４０で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号４１で表される軽鎖ポリペプチドか、
配列番号４２で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号４３で表される軽鎖ポリペプチドか、
配列番号２で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号５で表される軽鎖ポリペプチドか、
配列番号３で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号６で表される軽鎖ポリペプチドか、
又は、配列番号４で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号７で表される軽鎖ポリペプチド。
【００１８】
更に本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸分子、上記核酸を含んでなるベクター（任意に、当該ベクターによって形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に連結される）、上記ベクターを含んでなる宿主細胞、上記宿主細胞を培養して上記核酸を発現させ、任意に上記宿主細胞の培地から抗体を回収するステップを含んでなる、本発明の抗体を生産する工程、の提供に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで、少なくとも１つのヒトスクレロスチン生物活性を中和するか又はアンタゴナイズし、更にヒトスクレロスチンとの強い結合親和性を示す抗体の提供に関する。
【００２０】
用語「スクレロスチン」は、本願明細書で使用する場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する全長のヒトタンパク質、又は、シグナル配列が削除された成熟型タンパク質のことを指す。
【００２１】
「抗体」という用語は、本発明の抗スクレロスチン抗体（又は簡単に「本発明の抗体」）に関して本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体のことを指す。特に明記しない限り、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」は、キメラ抗体又はヒト化抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体は、例えば組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えばＣＤＲ移植）又はそれらの技術若しくは当該技術分野で公知の他の技術を組合せることにより調製できる。「モノクローナル抗体」とは、単一コピー又はクローン（例えば原核生物、真核生物又はファージのクローン）に由来する抗体を指し、それらを調製するための方法を指すものではない。
【００２２】
「モノクローナル抗体」、「本発明の抗体」若しくは単に「抗体」とは、完全抗体（完全な又は全長のＦｃ領域を含む）、又は抗原結合部分（例えばキメラ若しくはヒト化抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片若しくはＦ（ａｂ’）２断片）を含んでなる抗体の部分若しくは断片であってもよい。特に好適な本発明の抗体の抗原結合断片は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、哺乳動物のスクレロスチンに特徴的な１つ以上の生物活性を阻害又は中和する能力を保持している。例えば、一実施形態では、本発明の抗体の抗原結合部分は、成熟型ヒトスクレロスチンと、その１つ以上のリガンドとの相互作用を阻害することができ、及び／又は、ヒトスクレロスチンの受容体により媒介される１つ以上の機能を阻害できる。
【００２３】
更に、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」、「本発明の抗体」又は単に「抗体」は、ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲをコードするＤＮＡをリンカー配列と結合させることによって得られる単鎖Ｆｖ断片であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ ２６９−３１５，１９９４を参照のこと）。本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原結合断片又は部分が特定されたか否かに関係なく、特に明記しない限り、単鎖形態並びにかかる断片又は部分を包含するものと理解されている。タンパク質がスクレロスチンと特異的に結合する能力を保持する限り、それは用語「抗体」の中に含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で利用可能な技術（例えば競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ又はＫＩＮＥＸＡ（登録商標）アッセイ）で測定した場合、特異的な結合対のうちの１つのメンバーが、１つ以上のその特異的な結合パートナー以外の分子と顕著に結合しない状況のことを意味する。上記用語はまた、例えば、本発明の抗体の抗原結合ドメインが多くの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、その場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗体は、当該エピトープを有する様々な抗原に結合することが可能である。「エピトープ」という用語は、抗体中の１つ以上の抗原結合領域において、その抗体により認識及び結合される分子の部分のことを指す。
【００２５】
本発明の抗体に関する「生物学的活性」という用語には、限定されないが、エピトープ又は抗原との結合親和性、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるスクレロスチンの生物活性を中和する又はアンタゴナイズする能力、骨特異的アルカリホスファターゼアッセイ（例えば本願明細書の実施例２にて説明される）又は他のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイにおけるＩＣ５０、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性、並びに（例えばヒト被験者に投与した場合）抗体の免疫原性などが包含される。上記の特性又は性質は、限定されないが、以下のような当業者に公知の技術を使用することにより観察又は測定することができる：ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴分析、限定されないｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和アッセイ、受容体結合、並びに、ヒト、霊長類又は必要と考えられる他の給源などの様々給源に由来する組織切片を用いた免疫組織化学。
【００２６】
スクレロスチンに関する「生物学的活性」という用語には、限定されないが、他のタンパク質（例えば受容体又はＴＧＦ−βファミリー）に対するスクレロスチンの特異的な結合、受容体により媒介されるヒトスクレロスチンの１つ以上の機能、シグナル伝達、免疫原性、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの他のタンパク質のレベル又は活性への影響（例えば実施例２を参照のこと）、スクレロスチンの発現レベル及び組織における分布が包含される。
【００２７】
本発明の抗体の生物活性に関して、本明細書で用いられる用語「阻害」又は「中和」とは、（例えば本願明細書の実施例２で測定されるような）スクレロスチンの生物活性を実質的にアンタゴナイズし、抑止し、防止し、制限し、遅延させ、崩壊させ、除去し、停止させ、低下させ、又は逆転させる能力のことを意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「Ｋａｂａｔの番号付け」は、当該技術分野で公知であり、抗体中の他の重鎖及び軽鎖領域のアミノ酸残基よりも可変的（すなわち超可変的）なアミノ酸残基への番号付けシステムのことを指す（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。抗体の可変領域中のＣＤＲの位置決めは、Ｋａｂａｔ番号付け、又は単に「Ｋａｂａｔ」に従い行う。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、それが他のポリヌクレオチドとの機能的な関連を有するとき、「作動可能に連結されている」という。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、それらが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コーディング配列に作動可能に連結されているという。
【００３０】
用語「被験者」及び「患者」（本願明細書において同義的に使用される）とは、哺乳動物（好ましくはヒト）のことを指す。具体的な実施形態では、上記被験者は更に、スクレロスチンのレベルの減少又はスクレロスチンの生物活性の減少により利益を受ける疾患、障害又は症状を有することを特徴とする。
【００３１】
「ベクター」という用語は、作動可能に連結された他の核酸を輸送できる核酸分子のことを指し、限定されないがプラスミド及びウィルスベクターなどが挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自己複製ができ、一方、他のベクターは、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに挿入され、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらに作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。典型的なベクターは公知技術である。
【００３２】
本願明細書における「細胞」、「宿主細胞」、及び「培養細胞」は同義的に使用され、それらの表現には、本発明に係るあらゆる単離されたポリヌクレオチド、又は本発明のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ又は抗体をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の組換えベクターの受容体である、個々の細胞又は培養細胞が包含される。宿主細胞には、本発明のモノクローナル抗体又はその軽鎖若しくは重鎖を発現する１つ以上の組換えベクター又はポリヌクレオチドにより形質転換、形質導入又は感染された細胞が包含される。
【００３３】
全長抗体の各重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（本願明細書の「ＨＣＶＲ」）及び重鎖定常領域から構成される。全長抗体の各軽鎖は、Ｎ末端軽鎖可変領域（本願明細書の「ＬＣＶＲ」）及び軽鎖定常領域から構成される。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は更に、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と称される超可変領域に再分類することができ、より保存された、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称される領域と共に分散している。抗体が、特定の抗原又はエピトープと結合する機能的能力は、主に抗体の可変領域に存在する６つのＣＤＲによる影響を受ける。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、３つのＣＤＲ（ＨＣＶＲにはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びにＬＣＶＲにはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）と、４つのＦＲとから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向けて配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲは、抗原との間で特異的な相互作用を形成する大部分の残基を含む。可変領域内のＣＤＲの位置決めは、Ｋａｂａｔに従い行う。
【００３４】
軽鎖は、κ又はλに分類され、周知の特定の定常領域を有することを特徴とする。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεに分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定し、またこれらの幾つかはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に更に分類できる。各重鎖タイプは、当該技術分野で公知の配列を有する特定の定常領域を有することを特徴とする。軽鎖定常領域κ及び重鎖定常領域ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４は、本発明の抗体における好適な定常領域である。より好ましくは、上記重鎖定常領域は、配列番号３９のポリヌクレオチドによってコードされるような、配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。キメラ抗体は、非ヒト由来（好ましくはラット又はマウス）の定常領域を有してもよい。
【００３５】
本発明の「抗原結合領域」又は「抗原結合部分」とは、可変領域内の抗体分子の部分であって、抗原と相互作用し、抗体に、抗原に対するその特異性及び親和性を付与するアミノ酸残基を含む部分のことを指す。この抗体部分は、抗原結合残基の適当な形態を維持するのに必要なフレームワークアミノ酸残基を含んでなる。
【００３６】
本発明の好適な抗体は、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含んでなる。本発明の他の好適な抗体は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含んでなる。本発明のより好適な抗体は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含んでなる。これらの好適な抗体のＣＤＲは、下記の表１に記載の位置に存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる可変領域に位置する。
【００３７】
本発明の好適な抗体は、配列番号１７、１８又は１９のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含んでなる。本発明の他の好適なモノクローナル抗体は、配列番号１４、１５又は１６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含んでなる。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号１７のＬＣＶＲと、配列番号１４のＨＣＶＲとを含んでなる。本発明の他の抗体は、配列番号１９のＬＣＶＲと、配列番号１６のＨＣＶＲとを含んでなる。本発明のより好適な抗体は、配列番号１８のＬＣＶＲと、配列番号１５のＨＣＶＲとを含んでなる。かかるＬＣＶＲは、好ましくは軽鎖定常領域（好ましくはヒト由来）に、好ましくはκ鎖に連結する。かかるＨＣＶＲは、好ましくは重鎖定常領域（好ましくはヒト由来）に、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４に、最も好ましくは配列番号３８の配列を含んでなる重鎖定常領域に、作動可能に連結する。
【００３８】
本発明の１つの好適な抗体は、配列番号２の重鎖ポリペプチドと、配列番号５の軽鎖ポリペプチドとを含んでなる。配列番号２の重鎖ポリペプチドは、例えば配列番号８のポリヌクレオチド配列によってコードされてもよく、配列番号５の軽鎖ポリペプチドは、例えば配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００３９】
本発明の他の好適な抗体は、配列番号４の重鎖ポリペプチドと、配列番号７の軽鎖ポリペプチドとを含んでなる。配列番号４の重鎖ポリペプチドは、例えば配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされてもよく、配列番号７の軽鎖ポリペプチドは、例えば配列番号１３のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００４０】
本発明の他の好適な抗体は、配列番号３の重鎖ポリペプチドと、配列番号６の軽鎖ポリペプチドとを含んでなる。配列番号３の重鎖ポリペプチドは、配列番号９のポリヌクレオチド配列によってコードされてもよく、配列番号６の軽鎖ポリペプチドは、配列番号１２のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００４１】
本発明の好適なヒト化抗体は、本明細書において８６、８８及び８９と称される。それらの配列の配列番号を、下記の表１に列挙する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される（表１参照））は更に、ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１０ｐＭ未満、８ｐＭ未満、６ｐＭ未満又は４ｐＭ未満、より好ましくは約２．２ｐＭ未満であることを特徴とする。また、かかる抗体は更に、カニクイザルスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満又は８０ｐＭ未満、より好ましくは約７５ｐＭ未満であることにより限定されるのが好ましい。
【００４４】
好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される）は更に、ヒトスクレロスチン（本願明細書の実施例２を参照）を使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約５０ｎＭ以下、約４０、３５又は３０ｎＭ以下、より好ましくは約２５ｎＭ、更に好ましくは約２０ｎＭ以下（例えば２０．２ｎＭ）であることを特徴とする。
【００４５】
より好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される）は更に、ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１０ｐＭ未満、８ｐＭ未満、６ｐＭ未満又は４ｐＭ未満、より好ましくは約２．２ｐＭ未満であることを特徴とし、かつ、ヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約５０ｎＭ以下、約４０、３５又は３０ｎＭ以下、より好ましくは約２５ｎＭ以下、更に好ましくは約２０ｎＭ以下（例えば２０．２ｎＭ）であることを特徴とする。
【００４６】
更に好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される）は更に、ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１０ｐＭ未満、８ｐＭ未満、６ｐＭ未満又は４ｐＭ未満、より好ましくは約２．２ｐＭ未満であることを特徴とし、かつ、ヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約５０ｎＭ以下、約４０、３５又は３０ｎＭ以下、より好ましくは約２５ｎＭ以下、更に好ましくは約２０ｎＭ以下（例えば２０．２ｎＭ）であることを特徴とし、かつ、カニクイザルスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約７５ｎＭ以下であることを特徴とする。
【００４７】
抗体の発現：
本発明はまた、本発明の抗スクレロスチン抗体を発現する宿主細胞の提供に関する。本発明の抗体を産生する宿主細胞系の作製及び単離は、当該技術分野で公知の標準的な技術を使用して実施できる。
【００４８】
当該技術分野で公知の多種多様な宿主発現系（原核生物（細菌）発現系、真核生物発現系（例えば酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物細胞及び他の動物細胞、トランスジェニック動物及びハイブリドーマ細胞）、並びにファージディスプレイ発現系など）を用いて、本発明の抗体を発現することができる。
【００４９】
本発明の抗体は、宿主細胞において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することができる。抗体を組換え発現させるために、宿主細胞を、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つ以上の組換え発現ベクターを用いて形質変換、形質導入又は感染等を行い、軽鎖及び／又は重鎖を宿主細胞において発現させる。重鎖及び軽鎖を、１個のベクター中に作動可能に連結している別個のプロモータから独立に発現させてもよく、又は、重鎖及び軽鎖を、各々が作動可能に連結している別個のプロモータから、２個のベクターで独立に発現させてもよい（すなわち、１つは重鎖を発現し、１つは軽鎖を発現する）。任意に、重鎖及び軽鎖を異なる宿主細胞において発現させてもよい。
【００５０】
更に、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗スクレロスチン抗体の軽鎖及び／又は重鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしてもよい。抗スクレロスチン抗体の軽鎖及び／又は重鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対してインフレームに作動可能に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。上記シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチド又は異種シグナルペプチドであってもよい。好ましくは、上記組換え抗体は、宿主細胞を培養する際の培地に分泌され、そこから当該抗体を回収又は精製することができる。
【００５１】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、それを、重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子に使用可能な状態で連結することによって、全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト、並びに他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、従来技術において周知である。例えば標準的なＰＣＲ増幅によって、これらの領域を含むＤＮＡ断片を得ることができる。重鎖定常領域は、Ｋａｂａｔ（上記）にて説明したように、あらゆるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）又はサブクラスの定常領域、並びにあらゆるアロタイプ変異体であってもよい。好適な重鎖定常領域は、配列番号３８のポリペプチドを含む。
【００５２】
ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子に使用可能な状態で連結することによって、ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長の軽鎖遺伝子（同様にＦａｂ軽鎖遺伝子に）に変換することができる。ヒト、並びに他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、従来技術において周知である。これらの領域を含むＤＮＡ断片を、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であってもよい。
【００５３】
本発明に用いられる好適な哺乳動物由来の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞及びＣＯＳ細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０、ＣＲＬ−１６５１）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）である。本発明に用いられる更なる宿主細胞としては、他の哺乳動物細胞、酵母細胞及び原核細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入した場合、宿主細胞における抗体の発現を可能にするのに十分な時間、又は、好ましくは宿主細胞を増殖させる培地中に抗体が分泌されるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体が産生される。標準的な精製方法を使用して、宿主細胞及び／又は培地から抗体を回収することができる。
【００５４】
発現させた後、本発明の免疫グロブリンの全長抗体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の形態のものを、当該技術における標準的方法（硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマト、親和性クロマト、逆相クロマト、疎水性相互作用カラムクロマト、ゲル電気泳動など）に従って精製できる。少なくとも約９０％、９２％、９４％又は９６％の均質性を有する、実質的に純粋な免疫グロブリンが好適であり、医薬用途においては９８〜９９％以上の均質性が最も好ましい。精製（部分的に、又は所望の均質性を有する態様で）した後、本願明細書に記載のとおり、無菌の抗体を治療用途に使用してもよい。
【００５５】
ヒト化抗体：
好ましくは、治療用の本発明の抗体は、哺乳動物由来のフレームワーク及び定常領域の配列を有し（抗体中に存在する範囲内において）、それを治療用途に使用することにより、当該哺乳動物における治療用抗体に対する免疫反応が生じる可能性を減少させることができる。ヒト化抗体は、特に興味深い。なぜなら、それらは治療用途にとり有用であり、また、ヒト被験者に投与したとき、マウス由来の抗体、又はマウス由来の部分を含む抗体によってしばしば観察されるような、ヒト抗マウス抗体反応の可能性を低下させるからである。注入されたヒト化抗体は、例えばマウス抗体の場合よりも、天然のヒト抗体の場合と類似する半減期を有するのが好ましい。それにより、被験者への投与量をより少量とし、かつ、投与頻度をより少なくすることができる。
【００５６】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１つの部分がヒト由来である抗体を意味する。例えば、上記ヒト化抗体は、非ヒト由来（例えばマウス由来）の抗体部分と、ヒト由来の抗体部分とを含んでもよく、それらは、例えば従来公知の技術により化学的に（例えば合成的）に結合してもよく、又は遺伝子工学技術を使用して隣接するポリペプチドとして調製してもよい。
【００５７】
好ましくは、「ヒト化抗体」は、親抗体（すなわち非ヒト抗体、好ましくはマウスモノクローナル抗体）から派生するか又は由来するＣＤＲを有し、一方、フレームワーク及び定常領域（それが存在する限りにおいて）（又はその実質的な若しくは相当な部分（すなわち少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％））は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン領域で生じる核酸配列情報（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ参照）、又はその組み換え若しくは変異形態によりコードされる。なお、前記抗体がヒト細胞において産生されるか否かを問わない。好ましくは、ヒト化抗体の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲは、例えば改良された特異性、親和性又は中和特性など所望の特性を得るため、当該ヒト化抗体が由来する非ヒト親抗体のＣＤＲを基に最適化される。この所望の特性は、スクリーニングアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ）により同定することができる。好ましくは、本発明の抗体の最適化されたＣＤＲは、親抗体に存在するものと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。本発明のヒト化抗体８８及び８９のＣＤＲの特定のアミノ酸置換により、親抗体７８８及び７８９（本願明細書の実施例５及び６を参照）のそれらと比較して、抗体の不安定性（例えばＣＤＲ Ａｓｎ残基の除去）が減少するか、又は、ヒト被験者に投与されたとき当該抗体の免疫原性（例えば、ＩＭＭＵＮＯＦＩＬＴＥＲ（商標）技術により予測される）が減少する。
【００５８】
ヒト化抗体は、好ましくは非ヒト抗体に由来する最小配列を含む。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、あるいは親抗体から導入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列においても存在しない残基を含んでいてもよい。ヒト化抗体を、当該技術分野でルーチン的に使用されているｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異導入に供し、それにより、ヒト化組換え抗体のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの配列に関連するものに由来するが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系レパートリ中には天然に存在しえない配列となる。ヒト化組換え抗体のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲフレームワーク領域のかかるアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系配列と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％以上、好ましくは少なくとも９９％、又は最も好ましくは１００％の相同性を有すると考えられる。
【００５９】
他の好ましい実施形態では、本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系の軽鎖フレームワーク配列（国際公開第２００５／００５６０４号パンフレットを参照）及びヒト生殖細胞系の重鎖フレームワーク配列（国際公開第２００５／００５６０４号パンフレットを参照）を含む。好適なヒト生殖細胞系の軽鎖フレームワーク領域は、以下からなる群から選択されるヒトκ軽鎖遺伝子である：Ａ１１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ１、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２及びＯ８。好適なヒト生殖細胞系の重鎖フレームワーク領域は、以下からなる群から選択されるヒト重鎖である：ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＨ３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１（国際公開第２００６／０４６９３５号パンフレットを参照）。
【００６０】
ヒト化抗体を産生させるための利用可能な多くの方法が当該技術分野に存在する。例えばヒト化抗体は、スクレロスチン（好ましくはヒトスクレロスチン）に特異的に結合する親抗体（例えばマウス抗体又はハイブリドーマによって産生される抗体）のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードする核酸配列を得るステップと、前記ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（非ヒト）のＣＤＲを同定するステップと、かかるＣＤＲをコードする核酸配列を、選択されたヒトフレームワークをコードする核酸配列と融合させるステップと、により調製してもよい。任意に、フレームワーク領域に当該ＣＤＲ領域を融合させる前に、突然変異をランダムに又は特定の部位で導入し、ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換する、ことにより、ＣＤＲ領域を最適化してもよい。あるいは、ヒトフレームワーク領域への挿入の後で、当業者に利用可能な方法を使用してＣＤＲ領域を最適化してもよい。
【００６１】
ＣＤＲをコードする配列を、選択されたヒトフレームワークをコードする配列に融合させた後、それにより得られるヒト化重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列をコードするＤＮＡ配列を次に発現させ、スクレロスチンと結合するヒト化抗体を調製する。ヒト化ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを、全長の抗スクレロスチン抗体分子の一部として、すなわちヒト定常ドメイン配列との融合タンパク質として発現させてもよい。しかしながら、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列を、定常ドメインの配列がない状態で発現させ、ヒト化抗スクレロスチンＦｖを生じさせてもよい。
【００６２】
更に、マウス抗体をヒト化する使用可能な方法を記載した参考文献として、例えばＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９，１９９１及びＷｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８））などが挙げられる。
【００６３】
診断への使用：
本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンの発現を伴う障害又は疾患の診断に使用できる。同様の方法で、本発明の抗体は、スクレロスチンに関連する症状の治療を受けている被験者において、スクレロスチンレベルをモニターするためのアッセイにおいて使用できる。かかる用途には、生物学的サンプル（例えばヒト体液、又は細胞若しくは組織抽出物（本願明細書の実施例１を参照））中のスクレロスチンを検出するために本発明の抗体及び標識を利用する方法が含まれる。本発明の抗体は、修飾の有無にかかわらず使用でき、検出可能な部分を共有結合若しくは非共有結合させることにより標識してもよい。
【００６４】
生物学的サンプル中のスクレロスチンレベルを測定するための様々な従来のプロトコル（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳなど）が公知であり、その使用により、変化した若しくは異常なスクレロスチンの発現レベルを診断するための基礎が提供される。サンプル中で検出される通常の若しくは標準的なスクレロスチンレベルは、任意の周知技術を使用して、例えば、スクレロスチンポリペプチドを含んでなるサンプルと、例えば、本発明の抗体とを、抗原：抗体複合体を形成するのに適切な条件下で結合させることにより決定される。上記抗体を、直接的若しくは間接的に、検出可能な物質で標識し、それにより、結合した若しくは未結合の抗体の検出が促進される。好適な検出可能な物質としては、様々な酵素、補綴基（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐｓ）、蛍光材料、発光材料及び放射性物質などが挙げられる。形成されたスタンダード複合体の量を、様々な方法（例えば光度測定手段）により測定する。サンプルに存在するスクレロスチンポリペプチドの量を、次にスタンダードの数値と比較する。
【００６５】
治療への使用：
スクレロスチンは、骨形成の負の調節因子として機能する（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：３１９−３２７，２００５を参照）。成人において、スクレロスチンｍＲＮＡは主に骨細胞において検出されるが、低い濃度で軟骨においても検出されることが、出願人によって明らかになった。
【００６６】
本発明の抗スクレロスチンモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物は、それを必要とするヒト被験者に有効量で投与して使用することにより、椎骨若しくは非椎骨又はその両方において、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させることができる。本発明の抗スクレロスチンモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物は、それを必要とするヒト被験者に有効量で投与して使用することにより、椎骨及び／又は非椎骨の骨折の発生率を低下させることができる。骨折の発生率を低下させることには、無処置のコントロール個体群と比較して、ヒト被験者における骨折の可能性又は実際の発生率を低下させることが含まれる。
【００６７】
更に、本発明の抗体は、スクレロスチンの存在が望ましくない病理学的効果の原因となるか若しくはそれに寄与するか、又は、スクレロスチンレベル若しくはスクレロスチン生物活性の減少がヒト被験者の治療にとり利益となる、症状、疾患又は障害の治療において有用であると考えられる。かかる症状、疾患又は障害としては、限定されないが、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、骨関節炎に関連する痛み、歯周病又は多発性骨髄腫などが挙げられる。被験者は、男性でも女性でもよい。好ましくは、ヒト被験者は椎骨及び／又は非椎骨の骨折の危険性を有し、好ましくは、ヒト被験者は骨粗鬆症の危険性を有するか又はそれに罹患している。ヒト被験者は好ましくは女性であり、より好ましくは、閉経後の骨粗鬆症の危険性を有するか又はそれに罹患している女性である。本発明の方法は、いかなる段階の骨粗鬆症の被験者においても有用であると考えられる。
【００６８】
更に本発明には、上記の障害の少なくとも１つの治療用薬剤の製造への、本発明の抗体の使用が包含される。
【００６９】
用語「治療」及び「治療する」とは、本願明細書に記載の障害の進行を減速させ、中断させ、抑制し、制御し、又は停止させうる全てのプロセスのことを指すが、必ずしも全ての障害の徴候を完全に除去することを意味するわけではない。本明細書の用語「治療」とは、哺乳動物（特にヒト）の疾患又は症状の治療のために、本発明の化合物を投与することを含み、また、（ａ）疾患の更なる進行を阻害すること（すなわちその進行を抑止すること）、及び（ｂ）疾患を緩和する（すなわち疾患又は障害を後退させる）か、又はその徴候若しくは合併症を軽減することを含む。投与計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように調整されてもよい。例えば、単一のボーラス投与を行ってもよく、幾つかの回数に分割して投与してもよく、又は、治療状況の緊急性に応じて、投与量を比例的に減少又は増加させてもよい。
【００７０】
医薬組成物：
本発明の抗体を、被験者への投与に適する医薬組成物中に組み込むことができる。本発明の抗体は、ヒト被験者に対して、それ単独で、又は薬理学的に許容できる担体及び／又は希釈剤との組み合わせで、単回若しくは複数回投与することができる。かかる医薬組成物は、選択された投与形態で適切に設計され、また、必要に応じて、分散助剤、バッファ、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの、薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び／又は賦形剤を使用する。前記組成物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５（当業者にとり公知の、製剤技術を解説した文献）に開示されるような、従来技術に従って設計できる。医薬組成物のための適切な担体としては、本発明のモノクローナル抗体と組み合わせたときに、その分子の活性を保持し、被験者の免疫系がそれに反応しない、あらゆる材料が挙げられる。
【００７１】
本発明の抗スクレロスチンモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物は、本願明細書に記載されているような病理（例えば骨粗鬆症、骨関節炎又は他の骨変性障害）の危険性を有するか又はそれらの病理を示す被験者に対して、標準的な投与技術を使用して投与することができる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、好ましくは「有効量」の本発明の抗体を含有する。有効量とは、所望の治療効果を得るのに必要な量（投与量、及び期間、及び投与手段に関する）のことを指す。抗体の有効量は、例えば、疾患の状態、個人の年齢、性別及び体重、並びに個人における所望の反応を誘発する抗体若しくは抗体部分の能力などの要因に応じて変化しうる。また有効量とは、抗体によるあらゆる毒性若しくは有害な効果を、治療的に有益な効果が上回るときの量を指すこともある。
【００７３】
有効量とは、治療効果を被験者に付与するのに必要となる有効成分の、少なくとも最小の投与量であるが、毒性量よりも少ない量のことを指す。換言すると、本発明の抗体の有効量又は治療的有効量とは、哺乳動物（好ましくはヒト）において、
（ｉ）骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるか、
（ｉｉ）スクレロスチンの存在が、望ましくない病理学的効果を生じさせるか又はそれに寄与する症状、障害若しくは疾患を治療するか、又は、
（ｉｉｉ）スクレロスチンレベル若しくはスクレロスチン生物活性の減少が、哺乳動物（好ましくはヒト）において、限定されないが、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、慢性関節リウマチ、歯周病若しくは多発性骨髄腫などにとって有益な治療効果をもたらす量のことを指す。
【００７４】
医学分野において周知のように、被験者への投与量は、患者の身体のサイズ、体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与時間及び投与経路、健康状態及び併用して投与を受けている他の薬剤など、多くの要因に依存する。投与量は更に、疾患の種類及び重篤度に応じて変化しうる。典型的な投与量は、例えば０．００１〜１０００μｇ、好ましくは１〜１００μｇの範囲であってもよいが、特に上記の要因を考慮して、この典型的な範囲以下又は以上の投与量としてもよい。非経口投与の場合、投与量は１日あたり、総体重に対して約０．１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。疾患の進行を定期的に評価してモニターし、それに応じて投与量を調整してもよい。
【００７５】
示唆されたこれらの抗体の量は、多くの場合、治療における裁量の範囲内にある。適当な投与量及びスケジューリングを選択する際の鍵となる要因は、得られた効果である。この点に関して考慮されるべき要因としては、治療しようとする具体的な障害、個々の患者の臨床症状、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の具体的なタイプ、投与方法、投与計画、及び医師にとり周知の他の要因、などが挙げられる。
【００７６】
本発明の抗体の投与経路は、吸入、非経口、経口又は局所経路であってもよい。好ましくは、本発明の抗体を、非経口投与に適する医薬組成物中に組み込むことができる。本明細書で用いられる非経口投与薬という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内又は腹膜内投与が包含される。静脈内、腹膜内又は皮下への注射による非経口送達が好適である。皮下注射が最も好適である。かかる注射のための適切な担体は公知技術である。
【００７７】
医薬組成物は、製造条件及び提供される容器（例えば密封バイアル、シリンジ又は他の送達装置（例えばペン））の貯蔵条件において典型的に無菌で、かつ安定でなければならない。従って、医薬組成物を、製剤後にフィルター滅菌するか、又は微生物学的に許容できるものに調製するのが好適である。
【００７８】
以下の例は、説明の便宜上提供するものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ＥＬＩＳＡアッセイ：
【００８０】
このアッセイを用いて、ヒト血清サンプル中のスクレロスチンを、０．４ｎｇ／ｍＬの下方検出限界で検出し、定量した。抗体８６は捕捉抗体であり、一方、抗体８８は検出抗体である（抗体配列については表１を参照）。
【００８１】
９６ウェルプレートの内側ウェルを、０．５Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６（「コーティングバッファ」））中に０．５μｇ／ｍＬの濃度の全長抗スクレロスチンモノクローナル抗体８６を含有する溶液１００μＬでコーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。プレートは、次にＴＢＳＴ「洗浄バッファ」（０．４Ｍのトリス−ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ社、＃３７５２８）中のカゼインブロッキングバッファを２００μＬずつウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを次に、洗浄バッファで二回洗浄し、ブロッキング溶液を除去した。
【００８２】
標準曲線を作成するため、０．３５ｍｇ／ｍＬの濃度でヒトスクレロスチンを含むカゼインブロッキングバッファを調製し、ＰＢＳ中のカゼインブロッキングバッファ中に５％プールされたヒト血清で、２倍連続希釈（１．２５ｎｇ／ｍｌ〜０ｎｇ／ｍｌまで）を調製した。上記ヒト血清を、抗スクレロスチンモノクローナル抗体８６でコーティングした磁気ビーズのカラムに通し、血清中に内在的に存在しうるあらゆるスクレロスチンを除去した。
【００８３】
１００μＬのサンプル（カゼインブロッキングバッファ中の５％の血清）又はスタンダードを２倍希釈でウェルに添加し、当該プレートを更に室温で２時間インキュベートした。次にウェルを洗浄バッファで５回洗浄した。
【００８４】
Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＬＣビオチンキットによってビオチン化した、１００μＬの検出抗体（全長の抗スクレロスチンモノクローナル抗体８８）をウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次に洗浄バッファで４回洗浄した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度となるように、ＰＢＳ中のカゼインブロッキングバッファで１：２０００に希釈し、次に、ウェルあたり１００μＬを添加し、室温で１時間インキュベートし、次に洗浄バッファで７回洗浄した。ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ社 Ｐ８８０６）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で２０分間反応を継続させた。次に、１Ｎ ＨＣｌを１００μＬ／ウェルで添加し、反応を終了させた。プレートの４９０ｎｍにおけるＯＤを測定した。
【００８５】
実施例２：中和−骨特異的アルカリホスファターゼアッセイ
骨特異的アルカリホスファターゼは、骨芽細胞活性の生化学的な指標である。本願明細書に記載する骨特異的アルカリホスファターゼアッセイは、多分化能を有するマウス細胞系（Ｃ２Ｃ１２）において、ＢＭＰ−４及びＷｎｔ３ａの刺激によるアルカリホスファターゼ濃度を低下させるスクレロスチンの能力に基づくものであり、一方、スクレロスチン活性を中和する抗体は、このアッセイにおいて、アルカリホスファターゼ活性を投与量依存的に増加させる。Ｗｎｔ３ａ及びＢＭＰ−４は、骨原性成長因子である。
【００８６】
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １７７２）を、５％の牛胎仔血清を添加したＭＥＭ培地中に懸濁し、９６ウェル組織培養プレートに、ウェルあたり３０００〜５０００細胞でプレーティングし、次に５％のＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。試験に供する抗体を、０．５×Ｗｎｔ３ａ馴化培地で様々な最終濃度に希釈した。培地を次に組織培養プレート上の細胞から除去し、プレミックスした抗体−ＢＭＰ４−スクレロスチン溶液（ヒト若しくはカニクイザル）を、ウェルあたり１５０μＬで添加し、抗体の最終濃度を３０μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬとし、ＢＭＰ−４を２５ｎｇ／ｍＬの最終濃度とし、スクレロスチンタンパク質を１．０μｇ／ｍＬの最終濃度とし、馴化培地を０．５×濃度とした。プレートを次に、５％のＣＯ２、３７℃で７２時間インキュベートした。培地を培養プレート上の細胞から除去し、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、次に細胞プレートを、−８０℃及び３７℃で３回、凍結・解凍を繰り返した。
【００８７】
Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、Ｌ−Ｗｎｔ−３Ａ細胞及びコントロールＬ細胞（それぞれＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７及びＣＲＬ−２６４８）を、４日間、コンフルエント細胞の１：２０継代で、１０％のＦＢＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させることにより調製した。回収した培地を、０．２μｍナイロン製メンブランで濾過し、−２０℃で長期保存又は４℃で短期保存した。
【００８８】
アルカリホスファターゼ活性は、アルカリホスファターゼ基質（１−ステップＰＮＰＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社＃３７６２１）をウェルあたり１５０μＬで添加することにより測定した。細胞のプレートを次に室温で６０分間インキュベートし、その際、４０５ｎｍのＯＤを測定してアルカリホスファターゼ活性を解析した。下記の表２に記載の抗体中和ＩＣ５０値は、２つの別々の実験結果を平均した値である。ＩＣ５０の算出は、４−パラメータのシグモイド曲線により、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄを使用して実施した。
【００８９】
【表２】
【００９０】
実施例３：親和性結合：
抗スクレロスチン抗体と、ヒト、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）又はラットのいずれかのスクレロスチンとの間の平衡結合試験を、ＫＤ制御された条件で、ＫｉｎＥｘＡ ３０００計測器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）により実施した。この技術では、ＫＤ以下の濃度に固定された抗体を、様々な濃度のスクレロスチンタンパク質と混合し、平衡化させた。遊離の、未結合の、溶液中に残留する抗体のフラクションを、短時間、この平衡化された混合物をスクレロスチンコーティングしたビーズに曝露した後、蛍光標識二次的抗体で検出した。典型的には、試験に供する抗スクレロスチン抗体２ｐＭを、２〜５０ｎＭから開始される様々な濃度のヒト、ｃｙｎｏ若しくはラットのスクレロスチンと混合し、試験に供する抗体を２ｐＭ含む結合バッファ（１×リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．０２％のアジ化ナトリウム及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）で３倍連続希釈を調製した。これらの溶液を、２５℃で２日にわたり平衡化させた。未結合の抗体の量を、ヒトスクレロスチンコーティングしたアザラクトンビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して標識した。これらのビーズを、一晩回転させながら、ｐＨ９．０〜９．６の５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファ中で、５０ｍｃｇ／ｍＬのヒトスクレロスチンと、乾燥させたアザラクトンビーズ５０ｍｇとを反応させることにより調製した。次にビーズを沈殿させ、上清をブロッキング溶液（１Ｍトリス（ｐＨ８．０）＋１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）で置換し、１時間回転させた。このビーズストックを、結合バッファ中で２０倍希釈し、３日以内に使用した。室温（約２５℃）で平衡化させたＫｉｎＥｘＡ３０００計測器を結合試験に用いた。典型的には、平衡化された抗体／スクレロスチン溶液６．２５ｍＬを０．２５ｍＬ／分の流速で、プレパックされたヒトスクレロスチン−アザラクトンビーズカラムに通し、次にランニングバッファ（１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有、ｐＨ７．４）で洗浄した。注入された標識二次的抗体（Ｃｙ５標識ヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体）により生じる蛍光を測定することによって、これらのビーズに結合した遊離抗スクレロスチン抗体のフラクションを解析した。各条件においてサンプルを２回反復して解析し、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、１：１結合モデルにデータをフィットさせてＫＤを決定した。２５℃における平均ＫＤ値を、下記の表３に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例４：Ｉｎ ｖｉｖｏカルセインアッセイ：
ラットカルセインアッセイにより、短期間（１０日）での骨形成及び骨形成に及ぼす本発明の抗体の効果を、直接評価することができる。カルセインは蛍光色素標識であり、新しい骨形成の間、骨基質中に取り込まれる。カルセインの定量値は、薬理物質により誘導される骨形成の程度を反映する。６ヵ月齢のメスのスピローグ−ドーリーラットを使用した（ｎ＝６／投与群）。ラットに対して、皮下注射で、ＰＢＳビヒクル中の１ｍｇ／ｋｇ若しくは６ｍｇ／ｋｇの抗体による３日毎（０、３及び６日目）の投与、又は１０μｇ／ｋｇ ＰＴＨによる毎日の投与、又は陰性コントロールとして６ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧによる投与を行った。カルセインを７日目に皮下注射し、更にラットを１０日目にと殺した。脛骨を採集し、切片を作製し、小柱骨（遠位骨幹端）の形成又は皮質骨（脛骨骨幹）の形成を評価し、また脱ミネラル化及び全カルセインの蛍光色素測定を行った。下記の表４に示される値は、ヒトＩｇＧコントロールを１．０としたときの平均値である。そのデータは、本発明の抗体の投与により小柱及び皮質における骨形成が生じることを証明するものである。
【００９３】
【表４】
【００９４】
実施例５：変形性股関節症：
ＳＯＳＴの発現は、主に骨組織に限定される。しかしながら出願人は、リアルタイムＰＣＲで測定した結果、顕著なＳＯＳＴ発現を示す他の組織として、軟骨が挙げられると本願明細書において結論づけた。ＳＯＳＴの軟骨発現は、健常者若しくは関節炎の患者の軟骨から分離されるＲＮＡのアレイを使用することによっても観察される。更に、そのアレイにおいて、ＳＯＳＴの発現は、骨関節炎の重篤度に比例して増加し（軽度の骨関節炎の場合の軟骨における発現はコントロールより大きく、重度の場合には軽度の場合よりも大きく、また外科的に重症である場合（膝関節置換手術のために除去した場合）には他の全ての場合よりも大きい）、すなわち骨関節炎とＳＯＳＴ発現との相関を示すものである。スクレロスチンに特異的な抗体は、骨関節炎の治療に使用できる。
【００９５】
ラットＦｃ領域上にラット可変領域を有する抗スクレロスチンキメラ抗体（配列番号４２の重鎖及び配列番号４３の軽鎖を有する抗体７８９）を用い、骨関節炎のＭＩＡモデルの関節痛を防止する能力を試験した。この抗体の可変領域を、ヒト化抗体８９（配列番号１６のＨＣＶＲ及び配列番号１９のＬＣＶＲ）の調製用の親配列とした。ヒト化抗体８９及びキメラ抗体７８９は、両方とも、同じエピトープと結合する。この骨関節炎モデルは、直接膝関節へのモノヨードアセテート（ＭＩＡ）の注入を利用して、炎症性及びサイトカイン媒介の痛み及び軟骨破壊プロセスを伴うＯＡ様のプロセスを誘導するものである。ラットの反対側の膝に生理食塩水のみを注射し、２つの後肢の加重耐久性の相違として痛みを測定した。
【００９６】
ＭＩＡ実験＃１は、「予防モード」の若いオスのルイスラット（生後７〜８週齢）を用いて、抗スクレロスチン抗体をＭＩＡ注射前に投与するものである。ＭＩＡ注入の前日、ラットに、１０ｍｇ／ｋｇの抗スクレロスチン抗体、又は１０ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ、又はＰＢＳ（群あたりｎ＝６）を注射（ｉ．ｐ．）した。翌日、ラットを麻酔し、右膝に、０．９％の無菌の生理食塩水に溶解させた０．３ｍｇのヨード酢酸一ナトリウムを５０μＬで注射した。左膝に、生理食塩水のみを注射した。プラスチック製のチューブシースで覆われた２８Ｇの針を有するインシュリンシリンジを使用して、膝蓋骨の靭帯を通して５ｍｍだけ貫通させ、膝関節に注射した。
【００９７】
痛みの測定は、ＭＩＡ注射の２日及び７日後（抗体注射の３日及び８日後）に行った。７日目における痛み測定の後、第２の抗体又はコントロールの注射を行った。更なる痛みの測定を、ＭＩＡの１０日及び１４日後（抗体の第２の注射後３日及び７日）に行った。
【００９８】
鎮痛評価装置を用いて、注射された肢の荷重耐久性の違いとして痛みを測定した。圧力センサ上に後肢を乗せる形で、パースペックス製のボックスにラットを置いた。ラットが確実に静止したら、１秒間の読み取りを行い、更に２回の読み取りを行い、それらの平均値を算出した。ＭＩＡ注射された肢に荷重される重量から、生理食塩水を注入された肢の値を減算し、荷重耐性の差を算出した。
【００９９】
統計学的に有意な痛みの減少が、ＩｇＧ（及びＰＢＳ）のコントロールと比較し、抗スクレロスチン抗体によるＭＩＡ投与の後、７、１０及び１４日目に観察された（下記の表５参照）。それらの値は、ＭＩＡを注射された肢と生理食塩水を注射された肢との荷重耐性の相違（平均±標準偏差）である。
【０１００】
第２のＭＩＡ実験を、高齢ラット（生後２７週間目）及びＭＩＡ注射した後で抗体を投与した「処置モード」に関して実施した。ラットに、上記と同様にＭＩＡ又はコントロール生理食塩水を注射し、次に６日後に１０ｍｇ／ｋｇの抗スクレロスチン抗体、コントロールＩｇＧ又はＰＢＳをｉ．ｐ．で注射した（群あたりｎ＝６）。ＭＩＡの８日及び１５日後（抗体投与後２日及び９日後）に、上記の通りの痛み測定を実施した。ＭＩＡの１６日後、抗スクレロスチン抗体及びコントロールの第２の投与を行い、２１日（第２の抗体投与の５日後）に、痛み測定値を再度収集した。
【０１０１】
抗スクレロスチン抗体の投与後の初期の時点（ＭＩＡ後８日）においては、痛みに対する抗体の効果はなかったが、７日後においては、ＭＩＡ注射された肢と、生理食塩水を注射された肢との重量（ｇ）の測定値の相違として、痛みを減少させる傾向が示された。抗スクレロスチン抗体により痛みが緩和される傾向は、第２の抗体投与の５日後にも観察された。キメラ抗体７８９は、１５及び２１日目で、それぞれｐ値が０．０６及び０．０８であり、ＩｇＧコントロールとは異なっていた。これらの結果から、確立されたＭＩＡ疾患プロセスから生じる関節炎が、抗スクレロスチン中和抗体の投与により抑制されることが証明された。
【０１０２】
実施例６：ＯＶＸラット試験：
卵巣切除（ＯＶＸ）ラットは、閉経後骨粗鬆症モデルとして周知である。この試験では、ＯＶＸラットにおける、ラット可変領域及びラットＦｃを含んでなる本発明の抗スクレロスチン抗体の効果を解析した。
【０１０３】
６ヵ月齢のメスのスピローグ−ドーリーラットを卵巣摘出し、投与前の１ヵ月間、骨損失を生じさせた。ラットの１つの群（ｎ＝８）は、卵巣切除を受けていないが、卵巣摘出ラットとの骨比較のための擬似（ｓｈａｍ）手術を受けた。全てのＯＶＸラットを、各処置群（各々ｎ＝７）にランダム化し、ＰＴＨ（１−３８）、ＩｇＧコントロール（１０ｍｇ／ｋｇ）又は１０ｍｇ／ｋｇのキメラ抗スクレロスチン抗体（配列番号４０の重鎖及び配列番号４１の軽鎖を有する抗体７８８：［この抗体の可変領域は、ヒト化抗体８８の調製用の親配列である］、配列番号４２の重鎖及び配列番号４３の軽鎖を有する抗体７８９）のいずれかで、合計５８日間にわたり処置した。全ての抗体を３日毎に１回皮下投与し、一方、ＰＴＨ（１−３８）は１０ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与した。安楽死させた後、大腿骨及び脊柱を摘出し、遠位大腿骨（小柱骨）及び骨幹中部（皮質骨）、並びに第５腰椎を、ＣＴスキャナを使用して、定量的コンピュータ断層撮影（ＣＴ）分析により解析した。再生可能な測定のために鋳造粘土に骨を配置し、大腿骨のスキャンを、骨端から２ｍｍ（大腿骨遠位部）、又は骨端から１０ｍｍ（大腿骨骨幹中部）において実施した。
【０１０４】
脊椎骨のランドマーク「Ｖ」構造からのＬ−５スキャンにより、椎骨の測定を実施した。ＳＹＳ−Ｃ３２０−Ｖ １．５ソフトウェアパッケージを用いてデータを算出した。大腿骨の骨幹、Ｌ−５脊柱及び大腿骨頸部の生体機械的特性を、Ｔｕｒｎｅｒ ＣＨ，Ｂｕｒｒ ＤＢ，Ｂａｓｉｃ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ：ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ．Ｂｏｎｅ １４（４）：５９５−６０８，１９９３に従い、検死後に測定した。骨幹中部の機械的特性は、無傷の左の大腿骨を用いて、１５ｍｍ間隔で２つの支持体の中間への荷重による３点屈曲試験により測定した。荷重位置が、末梢部の膝窩空間から約７．５ｍｍとなるように大腿骨を配置し、中央−横軸周辺で屈曲を生じさせた。３７℃の生理食塩水の浴槽中で標本を試験した。荷重−変位（Ｌｏａｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）曲線を、材料試験機（モデル：１／Ｓ、ＭＴＳ社、ミネアポリス、ＭＮ）を使用して、１０ｍｍ／分のクロスヘッド速度で記録し、ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＭＴＳ社）を使用して解析し、ピーク負荷を算出した。後部プロセスを取り除いた後、Ｌ−５脊柱の機械的特性を分析し、中心の端はダイヤモンドウエハ調製用ソー（Ｂｕｅｋｌｅｒ Ｉｓｏｍｅｔ社製、エヴァンストン、ＩＬ）を使用して平行にした。材料試験装置を使用して椎骨標本をロードして圧縮し、ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＭＴＳ社）を使用して分析した。大腿骨頸部の測定の場合、大腿骨を近位側を上に向けて取付チャック上に垂直に置き、大腿骨頭部の中間点において、下方へ荷重をかけた。ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＭＴＳ社）を用いて分析した。平均値及び平均値の標準誤差を、下記の表５及び６に示す。それらのデータから、キメラ抗体７８８及び７８９が、ＯＶＸラットの骨密度（「ＢＭＤ」）、骨塩量（「ＢＭＣ」）及び骨強度（ピーク負荷）を増加させることが証明された。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野、特にスクレロスチンに対する抗体の分野に関する。より具体的には、本発明はヒトスクレロスチンと特異的に結合する高親和性抗体、並びに、ヒト被験者における、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つの増加により利益を受ける様々な障害又は症状の治療への、当該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は骨塩密度（ＢＭＤ）が低下し、骨の微細構造が崩壊し、骨粗鬆症の際の骨は骨折の危険性が高くなる疾患である。骨粗鬆症は依然として、特に高齢者における長期にわたる障害及び死亡率の大きな原因である。骨粗鬆症の有効な治療法として、生活様式の改善や薬物療法が存在するが、現在利用可能な治療方法は、数的に、及び有効性において限られたものであり、また望ましくない副作用をしばしば生じさせ、ゆえに患者への許容性は普遍的なものとはいえない。カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン置換療法剤及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭｓ）など多くの骨吸収抑制剤により、更なる骨損失が防止されるが、骨が失われた後では、それらは骨を再構築しない。ヒトＰＴＨ（１−３４）の形態のタンパク質同化剤を、骨量及び骨塩密度の上昇、及び骨構造の再構築に利用できる。しかしながらこの治療薬は通常、１年以上の期間にわたり、毎日皮下注射する必要があり、患者がそれを遵守することは困難となる。
【０００３】
スクレロスチン（ＳＯＳＴ遺伝子産物）は、骨内の骨細胞において強発現している。スクレロスチンは、骨形成に対する強力な負の調節因子としての役割を有するため、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つの増加により利益を受ける障害又は症状（例えば骨粗鬆症）への治療的介入のための望ましい標的である。したがって、抗スクレロスチン抗体は、かかる障害又は症状を治療する同化アプローチにおいて有用であると考えられる。特許文献１：国際公開第２００６／１１９１０７号パンフレットは、ＣＤＲの全てが完全にマウスのものである（すなわち、抗体中のマウス由来のＣＤＲが変化していない）、特定のヒト化抗スクレロスチン抗体のアミノ酸配列を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１１９１０７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒトスクレロスチンと強い結合親和性で結合し、スクレロスチン生物活性アッセイにおいて低いＩＣ５０値を示す、代替的な抗スクレロスチン抗体へのニーズが存在する。かかる抗体は、特に骨粗鬆症において治療的に有効性が高いと予測され、ＰＴＨ（１−３４）又は低い結合親和性（すなわち高いＫＤ）又は高いＩＣ５０値を示す抗スクレロスチン抗体の場合よりも少ない頻度での投与が可能である。また、ヒトスクレロスチンに特異的な抗体であって、当該抗体を投与されたヒト被験者における、当該抗体に対する免疫反応の危険性が少なく、又は不安定性の危険性が少なく、一方で、ヒトスクレロスチンに対する高い結合親和性を有し、生物活性アッセイにおいて低いＩＣ５０値を示す抗体特性が維持されている、前記抗体へのニーズも存在する。本発明の抗スクレロスチン抗体は、これらのニーズを満たし、関連する利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の抗体は、キメラ若しくはヒト化モノクローナル抗体であって、本願明細書において、開示される特異的なポリペプチド配列を含み、ヒトスクレロスチンと高い結合親和性で特異的に結合し、哺乳動物（好ましくはヒト）の骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるために使用できる。
【０００７】
一実施形態では、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲは、変異型抗体（すなわち本発明のヒト化若しくはキメラ抗体）の産生の基となる親抗体（すなわち齧歯動物（例えばマウス）中で産生させた抗体）に存在する、そのＣＤＲの位置におけるアミノ酸配列と異なる。本発明の抗体のＣＤＲ配列におけるかかる１つ以上のアミノ酸置換により、親抗体の場合にみられるものより大きなヒトスクレロスチンとの結合親和性（すなわち低いＫＤ）、スクレロスチン生物活性アッセイにおける低いＩＣ５０、又はその両方が生じるのが好ましい。本発明の抗体のＣＤＲ配列を、親抗体に存在するＣＤＲからアミノ酸置換したものとすることにより、当該抗体を投与されたヒトにおいて、当該抗体に対する免疫反応を低下させることができる。更に、本発明の抗体のＣＤＲ配列を、親抗体に存在するＣＤＲからアミノ酸置換したものとすることにより、当該抗体の不安定性の危険性を減少させることができる。例えば、アスパラギン残基を異なるアミノ酸で置換することにより、脱アミド化の危険性を減少させることができる。
【０００８】
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲ領域を含んでなる：
（ｉ）配列番号２０で表されるＨＣＤＲ１、配列番号２１で表されるＨＣＤＲ２、配列番号２２で表されるＨＣＤＲ３、配列番号２３で表されるＬＣＤＲ１、配列番号２４で表されるＬＣＤＲ２、及び配列番号２５で表されるＬＣＤＲ３、
（ｉｉ）配列番号２６で表されるＨＣＤＲ１、配列番号２７で表されるＨＣＤＲ２、配列番号２８で表されるＨＣＤＲ３、配列番号２９で表されるＬＣＤＲ１、配列番号３０で表されるＬＣＤＲ２、及び配列番号３１で表されるＬＣＤＲ３、並びに、
（ｉｉｉ）配列番号３２で表されるＨＣＤＲ１、配列番号３３で表されるＨＣＤＲ２、配列番号３４で表されるＨＣＤＲ３、配列番号３５で表されるＬＣＤＲ１、配列番号３６で表されるＬＣＤＲ２、及び配列番号３７で表されるＬＣＤＲ３。
【０００９】
他の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）ポリペプチド及び軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」）ポリペプチドを含んでなり、
（ｉ）上記ＨＣＶＲは配列番号１４のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＶＲは配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、
（ｉｉ）上記ＨＣＶＲは配列番号１５のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＶＲは配列番号１８のアミノ酸配列を有するか、又は、
（ｉｉｉ）上記ＨＣＶＲは配列番号１６のアミノ酸配列を有し、上記ＬＣＶＲは配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含んでなり、
（ｉ）上記重鎖ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有し、上記軽鎖ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を有するか、
（ｉｉ）上記重鎖ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有し、上記軽鎖ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列有するか、又は、
（ｉｉｉ）上記重鎖ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有し、上記軽鎖ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列有する。
【００１１】
一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で定義される（好ましくは配列番号により定義される）ように、ヒトスクレロスチンとの結合親和性（ＫＤ）が２５℃で約１０ｐＭ以下であるものとして更に特徴付けられる。本発明の好適な抗体は、カニクイザルスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１００ｐＭ以下である。本発明のより好適な抗体は、ヒトスクレロスチンとの結合親和性が２５℃で約１０ｐＭ以下であり、かつ、カニクイザルスクレロスチンとの結合親和性が２５℃で約１００ｐＭ以下である。
【００１２】
他の実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で定義される（好ましくは配列番号により定義される）ように、ヒトスクレロスチンを使用する骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が５０ｎＭ以下であることによって特徴付けられる。好ましくは、これらの抗体はまた、ヒトスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１０ｐＭ以下である。好ましくは、これらの抗体は、ヒトスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１０ｐＭ以下であり、かつ、カニクイザルスクレロスチンとのＫＤが２５℃で約１００ｐＭ以下である。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、本発明の抗体と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。好ましくは、上記医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤との均一若しくは実質的に均一な混合物を含んでなる。
【００１４】
本発明の実施形態は、薬剤の調製への本発明の抗体の使用にも関する。更なる本発明の実施形態は、動物、好ましくは哺乳動物の種、好ましくはヒト被験者における、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるための方法への、本発明の抗体の使用に関する。
【００１５】
更に本発明は、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させる方法であって、それを必要とするヒト被験者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含んでなる方法の提供に関する。
【００１６】
本発明の一実施形態は、ヒト被験者における、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つの増加により利益を受ける疾患、症状又は障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、骨関節炎に関連する痛み、歯周病及び多発性骨髄腫など）を治療する方法の提供に関する。
【００１７】
更なる本発明の実施形態は、生物学的サンプル中のスクレロスチンタンパク質を検出するための方法であって、本発明の抗体を、前記抗体がスクレロスチンタンパク質と結合できるのに十分な条件及び時間において、生物学的サンプルとインキュベートするステップと、前記結合を検出するステップと、を含んでなる方法の提供に関する。かかる検出アッセイに用いられる好適な抗体は、以下を有する：
配列番号４０で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号４１で表される軽鎖ポリペプチドか、
配列番号４２で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号４３で表される軽鎖ポリペプチドか、
配列番号２で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号５で表される軽鎖ポリペプチドか、
配列番号３で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号６で表される軽鎖ポリペプチドか、
又は、配列番号４で表される重鎖ポリペプチド及び配列番号７で表される軽鎖ポリペプチド。
【００１８】
更に本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸分子、上記核酸を含んでなるベクター（任意に、当該ベクターによって形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に連結される）、上記ベクターを含んでなる宿主細胞、上記宿主細胞を培養して上記核酸を発現させ、任意に上記宿主細胞の培地から抗体を回収するステップを含んでなる、本発明の抗体を生産する工程、の提供に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで、少なくとも１つのヒトスクレロスチン生物活性を中和するか又はアンタゴナイズし、更にヒトスクレロスチンとの強い結合親和性を示す抗体の提供に関する。
【００２０】
用語「スクレロスチン」は、本願明細書で使用する場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する全長のヒトタンパク質、又は、シグナル配列が削除された成熟型タンパク質のことを指す。
【００２１】
「抗体」という用語は、本発明の抗スクレロスチン抗体（又は簡単に「本発明の抗体」）に関して本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体のことを指す。特に明記しない限り、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」は、キメラ抗体又はヒト化抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体は、例えば組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えばＣＤＲ移植）又はそれらの技術若しくは当該技術分野で公知の他の技術を組合せることにより調製できる。「モノクローナル抗体」とは、単一コピー又はクローン（例えば原核生物、真核生物又はファージのクローン）に由来する抗体を指し、それらを調製するための方法を指すものではない。
【００２２】
「モノクローナル抗体」、「本発明の抗体」若しくは単に「抗体」とは、完全抗体（完全な又は全長のＦｃ領域を含む）、又は抗原結合部分（例えばキメラ若しくはヒト化抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片若しくはＦ（ａｂ’）２断片）を含んでなる抗体の部分若しくは断片であってもよい。特に好適な本発明の抗体の抗原結合断片は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、哺乳動物のスクレロスチンに特徴的な１つ以上の生物活性を阻害又は中和する能力を保持している。例えば、一実施形態では、本発明の抗体の抗原結合部分は、成熟型ヒトスクレロスチンと、その１つ以上のリガンドとの相互作用を阻害することができ、及び／又は、ヒトスクレロスチンの受容体により媒介される１つ以上の機能を阻害できる。
【００２３】
更に、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」、「本発明の抗体」又は単に「抗体」は、ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲをコードするＤＮＡをリンカー配列と結合させることによって得られる単鎖Ｆｖ断片であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ ２６９−３１５，１９９４を参照のこと）。本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原結合断片又は部分が特定されたか否かに関係なく、特に明記しない限り、単鎖形態並びにかかる断片又は部分を包含するものと理解されている。タンパク質がスクレロスチンと特異的に結合する能力を保持する限り、それは用語「抗体」の中に含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で利用可能な技術（例えば競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ又はＫＩＮＥＸＡ（登録商標）アッセイ）で測定した場合、特異的な結合対のうちの１つのメンバーが、１つ以上のその特異的な結合パートナー以外の分子と顕著に結合しない状況のことを意味する。上記用語はまた、例えば、本発明の抗体の抗原結合ドメインが多くの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、その場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗体は、当該エピトープを有する様々な抗原に結合することが可能である。「エピトープ」という用語は、抗体中の１つ以上の抗原結合領域において、その抗体により認識及び結合される分子の部分のことを指す。
【００２５】
本発明の抗体に関する「生物学的活性」という用語には、限定されないが、エピトープ又は抗原との結合親和性、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるスクレロスチンの生物活性を中和する又はアンタゴナイズする能力、骨特異的アルカリホスファターゼアッセイ（例えば本願明細書の実施例２にて説明される）又は他のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイにおけるＩＣ５０、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性、並びに（例えばヒト被験者に投与した場合）抗体の免疫原性などが包含される。上記の特性又は性質は、限定されないが、以下のような当業者に公知の技術を使用することにより観察又は測定することができる：ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴分析、限定されないｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和アッセイ、受容体結合、並びに、ヒト、霊長類又は必要と考えられる他の給源などの様々給源に由来する組織切片を用いた免疫組織化学。
【００２６】
スクレロスチンに関する「生物学的活性」という用語には、限定されないが、他のタンパク質（例えば受容体又はＴＧＦ−βファミリー）に対するスクレロスチンの特異的な結合、受容体により媒介されるヒトスクレロスチンの１つ以上の機能、シグナル伝達、免疫原性、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの他のタンパク質のレベル又は活性への影響（例えば実施例２を参照のこと）、スクレロスチンの発現レベル及び組織における分布が包含される。
【００２７】
本発明の抗体の生物活性に関して、本明細書で用いられる用語「阻害」又は「中和」とは、（例えば本願明細書の実施例２で測定されるような）スクレロスチンの生物活性を実質的にアンタゴナイズし、抑止し、防止し、制限し、遅延させ、崩壊させ、除去し、停止させ、低下させ、又は逆転させる能力のことを意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「Ｋａｂａｔの番号付け」は、当該技術分野で公知であり、抗体中の他の重鎖及び軽鎖領域のアミノ酸残基よりも可変的（すなわち超可変的）なアミノ酸残基への番号付けシステムのことを指す（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。抗体の可変領域中のＣＤＲの位置決めは、Ｋａｂａｔ番号付け、又は単に「Ｋａｂａｔ」に従い行う。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、それが他のポリヌクレオチドとの機能的な関連を有するとき、「作動可能に連結されている」という。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、それらが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コーディング配列に作動可能に連結されているという。
【００３０】
用語「被験者」及び「患者」（本願明細書において同義的に使用される）とは、哺乳動物（好ましくはヒト）のことを指す。具体的な実施形態では、上記被験者は更に、スクレロスチンのレベルの減少又はスクレロスチンの生物活性の減少により利益を受ける疾患、障害又は症状を有することを特徴とする。
【００３１】
「ベクター」という用語は、作動可能に連結された他の核酸を輸送できる核酸分子のことを指し、限定されないがプラスミド及びウィルスベクターなどが挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自己複製ができ、一方、他のベクターは、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに挿入され、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらに作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。典型的なベクターは公知技術である。
【００３２】
本願明細書における「細胞」、「宿主細胞」、及び「培養細胞」は同義的に使用され、それらの表現には、本発明に係るあらゆる単離されたポリヌクレオチド、又は本発明のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ又は抗体をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の組換えベクターの受容体である、個々の細胞又は培養細胞が包含される。宿主細胞には、本発明のモノクローナル抗体又はその軽鎖若しくは重鎖を発現する１つ以上の組換えベクター又はポリヌクレオチドにより形質転換、形質導入又は感染された細胞が包含される。
【００３３】
全長抗体の各重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（本願明細書の「ＨＣＶＲ」）及び重鎖定常領域から構成される。全長抗体の各軽鎖は、Ｎ末端軽鎖可変領域（本願明細書の「ＬＣＶＲ」）及び軽鎖定常領域から構成される。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は更に、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と称される超可変領域に再分類することができ、より保存された、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称される領域と共に分散している。抗体が、特定の抗原又はエピトープと結合する機能的能力は、主に抗体の可変領域に存在する６つのＣＤＲによる影響を受ける。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、３つのＣＤＲ（ＨＣＶＲにはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びにＬＣＶＲにはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）と、４つのＦＲとから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向けて配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲは、抗原との間で特異的な相互作用を形成する大部分の残基を含む。可変領域内のＣＤＲの位置決めは、Ｋａｂａｔに従い行う。
【００３４】
軽鎖は、κ又はλに分類され、周知の特定の定常領域を有することを特徴とする。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεに分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定し、またこれらの幾つかはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に更に分類できる。各重鎖タイプは、当該技術分野で公知の配列を有する特定の定常領域を有することを特徴とする。軽鎖定常領域κ及び重鎖定常領域ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４は、本発明の抗体における好適な定常領域である。より好ましくは、上記重鎖定常領域は、配列番号３９のポリヌクレオチドによってコードされるような、配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。キメラ抗体は、非ヒト由来（好ましくはラット又はマウス）の定常領域を有してもよい。
【００３５】
本発明の「抗原結合領域」又は「抗原結合部分」とは、可変領域内の抗体分子の部分であって、抗原と相互作用し、抗体に、抗原に対するその特異性及び親和性を付与するアミノ酸残基を含む部分のことを指す。この抗体部分は、抗原結合残基の適当な形態を維持するのに必要なフレームワークアミノ酸残基を含んでなる。
【００３６】
本発明の好適な抗体は、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含んでなる。本発明の他の好適な抗体は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び３７のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含んでなる。本発明のより好適な抗体は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含んでなる。これらの好適な抗体のＣＤＲは、下記の表１に記載の位置に存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる可変領域に位置する。
【００３７】
本発明の好適な抗体は、配列番号１７、１８又は１９のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含んでなる。本発明の他の好適なモノクローナル抗体は、配列番号１４、１５又は１６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含んでなる。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号１７のＬＣＶＲと、配列番号１４のＨＣＶＲとを含んでなる。本発明の他の抗体は、配列番号１９のＬＣＶＲと、配列番号１６のＨＣＶＲとを含んでなる。本発明のより好適な抗体は、配列番号１８のＬＣＶＲと、配列番号１５のＨＣＶＲとを含んでなる。かかるＬＣＶＲは、好ましくは軽鎖定常領域（好ましくはヒト由来）に、好ましくはκ鎖に連結する。かかるＨＣＶＲは、好ましくは重鎖定常領域（好ましくはヒト由来）に、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４に、最も好ましくは配列番号３８の配列を含んでなる重鎖定常領域に、作動可能に連結する。
【００３８】
本発明の１つの好適な抗体は、配列番号２の重鎖ポリペプチドと、配列番号５の軽鎖ポリペプチドとを含んでなる。配列番号２の重鎖ポリペプチドは、例えば配列番号８のポリヌクレオチド配列によってコードされてもよく、配列番号５の軽鎖ポリペプチドは、例えば配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００３９】
本発明の他の好適な抗体は、配列番号４の重鎖ポリペプチドと、配列番号７の軽鎖ポリペプチドとを含んでなる。配列番号４の重鎖ポリペプチドは、例えば配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされてもよく、配列番号７の軽鎖ポリペプチドは、例えば配列番号１３のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００４０】
本発明の他の好適な抗体は、配列番号３の重鎖ポリペプチドと、配列番号６の軽鎖ポリペプチドとを含んでなる。配列番号３の重鎖ポリペプチドは、配列番号９のポリヌクレオチド配列によってコードされてもよく、配列番号６の軽鎖ポリペプチドは、配列番号１２のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００４１】
本発明の好適なヒト化抗体は、本明細書において８６、８８及び８９と称される。それらの配列の配列番号を、下記の表１に列挙する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される（表１参照））は更に、ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１０ｐＭ未満、８ｐＭ未満、６ｐＭ未満又は４ｐＭ未満、より好ましくは約２．２ｐＭ未満であることを特徴とする。また、かかる抗体は更に、カニクイザルスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満又は８０ｐＭ未満、より好ましくは約７５ｐＭ未満であることにより限定されるのが好ましい。
【００４４】
好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される）は更に、ヒトスクレロスチン（本願明細書の実施例２を参照）を使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約５０ｎＭ以下、約４０、３５又は３０ｎＭ以下、より好ましくは約２５ｎＭ、更に好ましくは約２０ｎＭ以下（例えば２０．２ｎＭ）であることを特徴とする。
【００４５】
より好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される）は更に、ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１０ｐＭ未満、８ｐＭ未満、６ｐＭ未満又は４ｐＭ未満、より好ましくは約２．２ｐＭ未満であることを特徴とし、かつ、ヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約５０ｎＭ以下、約４０、３５又は３０ｎＭ以下、より好ましくは約２５ｎＭ以下、更に好ましくは約２０ｎＭ以下（例えば２０．２ｎＭ）であることを特徴とする。
【００４６】
更に好ましくは、本発明の抗体（６つの全てのＣＤＲ、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ、全ての重鎖、全ての軽鎖、又は全ての重鎖及び全ての軽鎖は、本願明細書の配列番号により示されるような特定の配列により限定される）は更に、ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で、約１０ｐＭ未満、８ｐＭ未満、６ｐＭ未満又は４ｐＭ未満、より好ましくは約２．２ｐＭ未満であることを特徴とし、かつ、ヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約５０ｎＭ以下、約４０、３５又は３０ｎＭ以下、より好ましくは約２５ｎＭ以下、更に好ましくは約２０ｎＭ以下（例えば２０．２ｎＭ）であることを特徴とし、かつ、カニクイザルスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおいて、ＩＣ５０が約７５ｎＭ以下であることを特徴とする。
【００４７】
抗体の発現：
本発明はまた、本発明の抗スクレロスチン抗体を発現する宿主細胞の提供に関する。本発明の抗体を産生する宿主細胞系の作製及び単離は、当該技術分野で公知の標準的な技術を使用して実施できる。
【００４８】
当該技術分野で公知の多種多様な宿主発現系（原核生物（細菌）発現系、真核生物発現系（例えば酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物細胞及び他の動物細胞、トランスジェニック動物及びハイブリドーマ細胞）、並びにファージディスプレイ発現系など）を用いて、本発明の抗体を発現することができる。
【００４９】
本発明の抗体は、宿主細胞において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することができる。抗体を組換え発現させるために、宿主細胞を、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つ以上の組換え発現ベクターを用いて形質変換、形質導入又は感染等を行い、軽鎖及び／又は重鎖を宿主細胞において発現させる。重鎖及び軽鎖を、１個のベクター中に作動可能に連結している別個のプロモータから独立に発現させてもよく、又は、重鎖及び軽鎖を、各々が作動可能に連結している別個のプロモータから、２個のベクターで独立に発現させてもよい（すなわち、１つは重鎖を発現し、１つは軽鎖を発現する）。任意に、重鎖及び軽鎖を異なる宿主細胞において発現させてもよい。
【００５０】
更に、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗スクレロスチン抗体の軽鎖及び／又は重鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしてもよい。抗スクレロスチン抗体の軽鎖及び／又は重鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対してインフレームに作動可能に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。上記シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチド又は異種シグナルペプチドであってもよい。好ましくは、上記組換え抗体は、宿主細胞を培養する際の培地に分泌され、そこから当該抗体を回収又は精製することができる。
【００５１】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、それを、重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子に使用可能な状態で連結することによって、全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト、並びに他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、従来技術において周知である。例えば標準的なＰＣＲ増幅によって、これらの領域を含むＤＮＡ断片を得ることができる。重鎖定常領域は、Ｋａｂａｔ（上記）にて説明したように、あらゆるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）又はサブクラスの定常領域、並びにあらゆるアロタイプ変異体であってもよい。好適な重鎖定常領域は、配列番号３８のポリペプチドを含む。
【００５２】
ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子に使用可能な状態で連結することによって、ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長の軽鎖遺伝子（同様にＦａｂ軽鎖遺伝子に）に変換することができる。ヒト、並びに他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、従来技術において周知である。これらの領域を含むＤＮＡ断片を、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であってもよい。
【００５３】
本発明に用いられる好適な哺乳動物由来の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞及びＣＯＳ細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０、ＣＲＬ−１６５１）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）である。本発明に用いられる更なる宿主細胞としては、他の哺乳動物細胞、酵母細胞及び原核細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入した場合、宿主細胞における抗体の発現を可能にするのに十分な時間、又は、好ましくは宿主細胞を増殖させる培地中に抗体が分泌されるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体が産生される。標準的な精製方法を使用して、宿主細胞及び／又は培地から抗体を回収することができる。
【００５４】
発現させた後、本発明の免疫グロブリンの全長抗体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の形態のものを、当該技術における標準的方法（硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマト、親和性クロマト、逆相クロマト、疎水性相互作用カラムクロマト、ゲル電気泳動など）に従って精製できる。少なくとも約９０％、９２％、９４％又は９６％の均質性を有する、実質的に純粋な免疫グロブリンが好適であり、医薬用途においては９８〜９９％以上の均質性が最も好ましい。精製（部分的に、又は所望の均質性を有する態様で）した後、本願明細書に記載のとおり、無菌の抗体を治療用途に使用してもよい。
【００５５】
ヒト化抗体：
好ましくは、治療用の本発明の抗体は、哺乳動物由来のフレームワーク及び定常領域の配列を有し（抗体中に存在する範囲内において）、それを治療用途に使用することにより、当該哺乳動物における治療用抗体に対する免疫反応が生じる可能性を減少させることができる。ヒト化抗体は、特に興味深い。なぜなら、それらは治療用途にとり有用であり、また、ヒト被験者に投与したとき、マウス由来の抗体、又はマウス由来の部分を含む抗体によってしばしば観察されるような、ヒト抗マウス抗体反応の可能性を低下させるからである。注入されたヒト化抗体は、例えばマウス抗体の場合よりも、天然のヒト抗体の場合と類似する半減期を有するのが好ましい。それにより、被験者への投与量をより少量とし、かつ、投与頻度をより少なくすることができる。
【００５６】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１つの部分がヒト由来である抗体を意味する。例えば、上記ヒト化抗体は、非ヒト由来（例えばマウス由来）の抗体部分と、ヒト由来の抗体部分とを含んでもよく、それらは、例えば従来公知の技術により化学的に（例えば合成的）に結合してもよく、又は遺伝子工学技術を使用して隣接するポリペプチドとして調製してもよい。
【００５７】
好ましくは、「ヒト化抗体」は、親抗体（すなわち非ヒト抗体、好ましくはマウスモノクローナル抗体）から派生するか又は由来するＣＤＲを有し、一方、フレームワーク及び定常領域（それが存在する限りにおいて）（又はその実質的な若しくは相当な部分（すなわち少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％））は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン領域で生じる核酸配列情報（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ参照）、又はその組み換え若しくは変異形態によりコードされる。なお、前記抗体がヒト細胞において産生されるか否かを問わない。好ましくは、ヒト化抗体の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲは、例えば改良された特異性、親和性又は中和特性など所望の特性を得るため、当該ヒト化抗体が由来する非ヒト親抗体のＣＤＲを基に最適化される。この所望の特性は、スクリーニングアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ）により同定することができる。好ましくは、本発明の抗体の最適化されたＣＤＲは、親抗体に存在するものと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。本発明のヒト化抗体８８及び８９のＣＤＲの特定のアミノ酸置換により、親抗体７８８及び７８９（本願明細書の実施例５及び６を参照）のそれらと比較して、抗体の不安定性（例えばＣＤＲ Ａｓｎ残基の除去）が減少するか、又は、ヒト被験者に投与されたとき当該抗体の免疫原性（例えば、ＩＭＭＵＮＯＦＩＬＴＥＲ（商標）技術により予測される）が減少する。
【００５８】
ヒト化抗体は、好ましくは非ヒト抗体に由来する最小配列を含む。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、あるいは親抗体から導入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列においても存在しない残基を含んでいてもよい。ヒト化抗体を、当該技術分野でルーチン的に使用されているｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異導入に供し、それにより、ヒト化組換え抗体のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの配列に関連するものに由来するが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系レパートリ中には天然に存在しえない配列となる。ヒト化組換え抗体のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲフレームワーク領域のかかるアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系配列と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％以上、好ましくは少なくとも９９％、又は最も好ましくは１００％の相同性を有すると考えられる。
【００５９】
他の好ましい実施形態では、本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系の軽鎖フレームワーク配列（国際公開第２００５／００５６０４号パンフレットを参照）及びヒト生殖細胞系の重鎖フレームワーク配列（国際公開第２００５／００５６０４号パンフレットを参照）を含む。好適なヒト生殖細胞系の軽鎖フレームワーク領域は、以下からなる群から選択されるヒトκ軽鎖遺伝子である：Ａ１１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ１、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２及びＯ８。好適なヒト生殖細胞系の重鎖フレームワーク領域は、以下からなる群から選択されるヒト重鎖である：ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＨ３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１（国際公開第２００６／０４６９３５号パンフレットを参照）。
【００６０】
ヒト化抗体を産生させるための利用可能な多くの方法が当該技術分野に存在する。例えばヒト化抗体は、スクレロスチン（好ましくはヒトスクレロスチン）に特異的に結合する親抗体（例えばマウス抗体又はハイブリドーマによって産生される抗体）のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードする核酸配列を得るステップと、前記ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（非ヒト）のＣＤＲを同定するステップと、かかるＣＤＲをコードする核酸配列を、選択されたヒトフレームワークをコードする核酸配列と融合させるステップと、により調製してもよい。任意に、フレームワーク領域に当該ＣＤＲ領域を融合させる前に、突然変異をランダムに又は特定の部位で導入し、ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換する、ことにより、ＣＤＲ領域を最適化してもよい。あるいは、ヒトフレームワーク領域への挿入の後で、当業者に利用可能な方法を使用してＣＤＲ領域を最適化してもよい。
【００６１】
ＣＤＲをコードする配列を、選択されたヒトフレームワークをコードする配列に融合させた後、それにより得られるヒト化重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列をコードするＤＮＡ配列を次に発現させ、スクレロスチンと結合するヒト化抗体を調製する。ヒト化ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを、全長の抗スクレロスチン抗体分子の一部として、すなわちヒト定常ドメイン配列との融合タンパク質として発現させてもよい。しかしながら、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列を、定常ドメインの配列がない状態で発現させ、ヒト化抗スクレロスチンＦｖを生じさせてもよい。
【００６２】
更に、マウス抗体をヒト化する使用可能な方法を記載した参考文献として、例えばＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９，１９９１及びＷｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８））などが挙げられる。
【００６３】
診断への使用：
本発明の抗体は、ヒトスクレロスチンの発現を伴う障害又は疾患の診断に使用できる。同様の方法で、本発明の抗体は、スクレロスチンに関連する症状の治療を受けている被験者において、スクレロスチンレベルをモニターするためのアッセイにおいて使用できる。かかる用途には、生物学的サンプル（例えばヒト体液、又は細胞若しくは組織抽出物（本願明細書の実施例１を参照））中のスクレロスチンを検出するために本発明の抗体及び標識を利用する方法が含まれる。本発明の抗体は、修飾の有無にかかわらず使用でき、検出可能な部分を共有結合若しくは非共有結合させることにより標識してもよい。
【００６４】
生物学的サンプル中のスクレロスチンレベルを測定するための様々な従来のプロトコル（例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳなど）が公知であり、その使用により、変化した若しくは異常なスクレロスチンの発現レベルを診断するための基礎が提供される。サンプル中で検出される通常の若しくは標準的なスクレロスチンレベルは、任意の周知技術を使用して、例えば、スクレロスチンポリペプチドを含んでなるサンプルと、例えば、本発明の抗体とを、抗原：抗体複合体を形成するのに適切な条件下で結合させることにより決定される。上記抗体を、直接的若しくは間接的に、検出可能な物質で標識し、それにより、結合した若しくは未結合の抗体の検出が促進される。好適な検出可能な物質としては、様々な酵素、補綴基（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐｓ）、蛍光材料、発光材料及び放射性物質などが挙げられる。形成されたスタンダード複合体の量を、様々な方法（例えば光度測定手段）により測定する。サンプルに存在するスクレロスチンポリペプチドの量を、次にスタンダードの数値と比較する。
【００６５】
治療への使用：
スクレロスチンは、骨形成の負の調節因子として機能する（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：３１９−３２７，２００５を参照）。成人において、スクレロスチンｍＲＮＡは主に骨細胞において検出されるが、低い濃度で軟骨においても検出されることが、出願人によって明らかになった。
【００６６】
本発明の抗スクレロスチンモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物は、それを必要とするヒト被験者に有効量で投与して使用することにより、椎骨若しくは非椎骨又はその両方において、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させることができる。本発明の抗スクレロスチンモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物は、それを必要とするヒト被験者に有効量で投与して使用することにより、椎骨及び／又は非椎骨の骨折の発生率を低下させることができる。骨折の発生率を低下させることには、無処置のコントロール個体群と比較して、ヒト被験者における骨折の可能性又は実際の発生率を低下させることが含まれる。
【００６７】
更に、本発明の抗体は、スクレロスチンの存在が望ましくない病理学的効果の原因となるか若しくはそれに寄与するか、又は、スクレロスチンレベル若しくはスクレロスチン生物活性の減少がヒト被験者の治療にとり利益となる、症状、疾患又は障害の治療において有用であると考えられる。かかる症状、疾患又は障害としては、限定されないが、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、骨関節炎に関連する痛み、歯周病又は多発性骨髄腫などが挙げられる。被験者は、男性でも女性でもよい。好ましくは、ヒト被験者は椎骨及び／又は非椎骨の骨折の危険性を有し、好ましくは、ヒト被験者は骨粗鬆症の危険性を有するか又はそれに罹患している。ヒト被験者は好ましくは女性であり、より好ましくは、閉経後の骨粗鬆症の危険性を有するか又はそれに罹患している女性である。本発明の方法は、いかなる段階の骨粗鬆症の被験者においても有用であると考えられる。
【００６８】
更に本発明には、上記の障害の少なくとも１つの治療用薬剤の製造への、本発明の抗体の使用が包含される。
【００６９】
用語「治療」及び「治療する」とは、本願明細書に記載の障害の進行を減速させ、中断させ、抑制し、制御し、又は停止させうる全てのプロセスのことを指すが、必ずしも全ての障害の徴候を完全に除去することを意味するわけではない。本明細書の用語「治療」とは、哺乳動物（特にヒト）の疾患又は症状の治療のために、本発明の化合物を投与することを含み、また、（ａ）疾患の更なる進行を阻害すること（すなわちその進行を抑止すること）、及び（ｂ）疾患を緩和する（すなわち疾患又は障害を後退させる）か、又はその徴候若しくは合併症を軽減することを含む。投与計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように調整されてもよい。例えば、単一のボーラス投与を行ってもよく、幾つかの回数に分割して投与してもよく、又は、治療状況の緊急性に応じて、投与量を比例的に減少又は増加させてもよい。
【００７０】
医薬組成物：
本発明の抗体を、被験者への投与に適する医薬組成物中に組み込むことができる。本発明の抗体は、ヒト被験者に対して、それ単独で、又は薬理学的に許容できる担体及び／又は希釈剤との組み合わせで、単回若しくは複数回投与することができる。かかる医薬組成物は、選択された投与形態で適切に設計され、また、必要に応じて、分散助剤、バッファ、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの、薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び／又は賦形剤を使用する。前記組成物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５（当業者にとり公知の、製剤技術を解説した文献）に開示されるような、従来技術に従って設計できる。医薬組成物のための適切な担体としては、本発明のモノクローナル抗体と組み合わせたときに、その分子の活性を保持し、被験者の免疫系がそれに反応しない、あらゆる材料が挙げられる。
【００７１】
本発明の抗スクレロスチンモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物は、本願明細書に記載されているような病理（例えば骨粗鬆症、骨関節炎又は他の骨変性障害）の危険性を有するか又はそれらの病理を示す被験者に対して、標準的な投与技術を使用して投与することができる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、好ましくは「有効量」の本発明の抗体を含有する。有効量とは、所望の治療効果を得るのに必要な量（投与量、及び期間、及び投与手段に関する）のことを指す。抗体の有効量は、例えば、疾患の状態、個人の年齢、性別及び体重、並びに個人における所望の反応を誘発する抗体若しくは抗体部分の能力などの要因に応じて変化しうる。また有効量とは、抗体によるあらゆる毒性若しくは有害な効果を、治療的に有益な効果が上回るときの量を指すこともある。
【００７３】
有効量とは、治療効果を被験者に付与するのに必要となる有効成分の、少なくとも最小の投与量であるが、毒性量よりも少ない量のことを指す。換言すると、本発明の抗体の有効量又は治療的有効量とは、哺乳動物（好ましくはヒト）において、
（ｉ）骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるか、
（ｉｉ）スクレロスチンの存在が、望ましくない病理学的効果を生じさせるか又はそれに寄与する症状、障害若しくは疾患を治療するか、又は、
（ｉｉｉ）スクレロスチンレベル若しくはスクレロスチン生物活性の減少が、哺乳動物（好ましくはヒト）において、限定されないが、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、慢性関節リウマチ、歯周病若しくは多発性骨髄腫などにとって有益な治療効果をもたらす量のことを指す。
【００７４】
医学分野において周知のように、被験者への投与量は、患者の身体のサイズ、体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与時間及び投与経路、健康状態及び併用して投与を受けている他の薬剤など、多くの要因に依存する。投与量は更に、疾患の種類及び重篤度に応じて変化しうる。典型的な投与量は、例えば０．００１〜１０００μｇ、好ましくは１〜１００μｇの範囲であってもよいが、特に上記の要因を考慮して、この典型的な範囲以下又は以上の投与量としてもよい。非経口投与の場合、投与量は１日あたり、総体重に対して約０．１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。疾患の進行を定期的に評価してモニターし、それに応じて投与量を調整してもよい。
【００７５】
示唆されたこれらの抗体の量は、多くの場合、治療における裁量の範囲内にある。適当な投与量及びスケジューリングを選択する際の鍵となる要因は、得られた効果である。この点に関して考慮されるべき要因としては、治療しようとする具体的な障害、個々の患者の臨床症状、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の具体的なタイプ、投与方法、投与計画、及び医師にとり周知の他の要因、などが挙げられる。
【００７６】
本発明の抗体の投与経路は、吸入、非経口、経口又は局所経路であってもよい。好ましくは、本発明の抗体を、非経口投与に適する医薬組成物中に組み込むことができる。本明細書で用いられる非経口投与薬という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内又は腹膜内投与が包含される。静脈内、腹膜内又は皮下への注射による非経口送達が好適である。皮下注射が最も好適である。かかる注射のための適切な担体は公知技術である。
【００７７】
医薬組成物は、製造条件及び提供される容器（例えば密封バイアル、シリンジ又は他の送達装置（例えばペン））の貯蔵条件において典型的に無菌で、かつ安定でなければならない。従って、医薬組成物を、製剤後にフィルター滅菌するか、又は微生物学的に許容できるものに調製するのが好適である。
【００７８】
以下の例は、説明の便宜上提供するものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ＥＬＩＳＡアッセイ：
【００８０】
このアッセイを用いて、ヒト血清サンプル中のスクレロスチンを、０．４ｎｇ／ｍＬの下方検出限界で検出し、定量した。抗体８６は捕捉抗体であり、一方、抗体８８は検出抗体である（抗体配列については表１を参照）。
【００８１】
９６ウェルプレートの内側ウェルを、０．５Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６（「コーティングバッファ」））中に０．５μｇ／ｍＬの濃度の全長抗スクレロスチンモノクローナル抗体８６を含有する溶液１００μＬでコーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。プレートは、次にＴＢＳＴ「洗浄バッファ」（０．４Ｍのトリス−ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ社、＃３７５２８）中のカゼインブロッキングバッファを２００μＬずつウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを次に、洗浄バッファで二回洗浄し、ブロッキング溶液を除去した。
【００８２】
標準曲線を作成するため、０．３５ｍｇ／ｍＬの濃度でヒトスクレロスチンを含むカゼインブロッキングバッファを調製し、ＰＢＳ中のカゼインブロッキングバッファ中に５％プールされたヒト血清で、２倍連続希釈（１．２５ｎｇ／ｍｌ〜０ｎｇ／ｍｌまで）を調製した。上記ヒト血清を、抗スクレロスチンモノクローナル抗体８６でコーティングした磁気ビーズのカラムに通し、血清中に内在的に存在しうるあらゆるスクレロスチンを除去した。
【００８３】
１００μＬのサンプル（カゼインブロッキングバッファ中の５％の血清）又はスタンダードを２倍希釈でウェルに添加し、当該プレートを更に室温で２時間インキュベートした。次にウェルを洗浄バッファで５回洗浄した。
【００８４】
Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＬＣビオチンキットによってビオチン化した、１００μＬの検出抗体（全長の抗スクレロスチンモノクローナル抗体８８）をウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次に洗浄バッファで４回洗浄した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度となるように、ＰＢＳ中のカゼインブロッキングバッファで１：２０００に希釈し、次に、ウェルあたり１００μＬを添加し、室温で１時間インキュベートし、次に洗浄バッファで７回洗浄した。ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ社 Ｐ８８０６）を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で２０分間反応を継続させた。次に、１Ｎ ＨＣｌを１００μＬ／ウェルで添加し、反応を終了させた。プレートの４９０ｎｍにおけるＯＤを測定した。
【００８５】
実施例２：中和−骨特異的アルカリホスファターゼアッセイ
骨特異的アルカリホスファターゼは、骨芽細胞活性の生化学的な指標である。本願明細書に記載する骨特異的アルカリホスファターゼアッセイは、多分化能を有するマウス細胞系（Ｃ２Ｃ１２）において、ＢＭＰ−４及びＷｎｔ３ａの刺激によるアルカリホスファターゼ濃度を低下させるスクレロスチンの能力に基づくものであり、一方、スクレロスチン活性を中和する抗体は、このアッセイにおいて、アルカリホスファターゼ活性を投与量依存的に増加させる。Ｗｎｔ３ａ及びＢＭＰ−４は、骨原性成長因子である。
【００８６】
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １７７２）を、５％の牛胎仔血清を添加したＭＥＭ培地中に懸濁し、９６ウェル組織培養プレートに、ウェルあたり３０００〜５０００細胞でプレーティングし、次に５％のＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。試験に供する抗体を、０．５×Ｗｎｔ３ａ馴化培地で様々な最終濃度に希釈した。培地を次に組織培養プレート上の細胞から除去し、プレミックスした抗体−ＢＭＰ４−スクレロスチン溶液（ヒト若しくはカニクイザル）を、ウェルあたり１５０μＬで添加し、抗体の最終濃度を３０μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬとし、ＢＭＰ−４を２５ｎｇ／ｍＬの最終濃度とし、スクレロスチンタンパク質を１．０μｇ／ｍＬの最終濃度とし、馴化培地を０．５×濃度とした。プレートを次に、５％のＣＯ２、３７℃で７２時間インキュベートした。培地を培養プレート上の細胞から除去し、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、次に細胞プレートを、−８０℃及び３７℃で３回、凍結・解凍を繰り返した。
【００８７】
Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、Ｌ−Ｗｎｔ−３Ａ細胞及びコントロールＬ細胞（それぞれＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６４７及びＣＲＬ−２６４８）を、４日間、コンフルエント細胞の１：２０継代で、１０％のＦＢＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させることにより調製した。回収した培地を、０．２μｍナイロン製メンブランで濾過し、−２０℃で長期保存又は４℃で短期保存した。
【００８８】
アルカリホスファターゼ活性は、アルカリホスファターゼ基質（１−ステップＰＮＰＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社＃３７６２１）をウェルあたり１５０μＬで添加することにより測定した。細胞のプレートを次に室温で６０分間インキュベートし、その際、４０５ｎｍのＯＤを測定してアルカリホスファターゼ活性を解析した。下記の表２に記載の抗体中和ＩＣ５０値は、２つの別々の実験結果を平均した値である。ＩＣ５０の算出は、４−パラメータのシグモイド曲線により、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄを使用して実施した。
【００８９】
【表２】
【００９０】
実施例３：親和性結合：
抗スクレロスチン抗体と、ヒト、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）又はラットのいずれかのスクレロスチンとの間の平衡結合試験を、ＫＤ制御された条件で、ＫｉｎＥｘＡ ３０００計測器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）により実施した。この技術では、ＫＤ以下の濃度に固定された抗体を、様々な濃度のスクレロスチンタンパク質と混合し、平衡化させた。遊離の、未結合の、溶液中に残留する抗体のフラクションを、短時間、この平衡化された混合物をスクレロスチンコーティングしたビーズに曝露した後、蛍光標識二次的抗体で検出した。典型的には、試験に供する抗スクレロスチン抗体２ｐＭを、２〜５０ｎＭから開始される様々な濃度のヒト、ｃｙｎｏ若しくはラットのスクレロスチンと混合し、試験に供する抗体を２ｐＭ含む結合バッファ（１×リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．０２％のアジ化ナトリウム及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）で３倍連続希釈を調製した。これらの溶液を、２５℃で２日にわたり平衡化させた。未結合の抗体の量を、ヒトスクレロスチンコーティングしたアザラクトンビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して標識した。これらのビーズを、一晩回転させながら、ｐＨ９．０〜９．６の５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファ中で、５０ｍｃｇ／ｍＬのヒトスクレロスチンと、乾燥させたアザラクトンビーズ５０ｍｇとを反応させることにより調製した。次にビーズを沈殿させ、上清をブロッキング溶液（１Ｍトリス（ｐＨ８．０）＋１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）で置換し、１時間回転させた。このビーズストックを、結合バッファ中で２０倍希釈し、３日以内に使用した。室温（約２５℃）で平衡化させたＫｉｎＥｘＡ３０００計測器を結合試験に用いた。典型的には、平衡化された抗体／スクレロスチン溶液６．２５ｍＬを０．２５ｍＬ／分の流速で、プレパックされたヒトスクレロスチン−アザラクトンビーズカラムに通し、次にランニングバッファ（１×リン酸緩衝生理食塩水、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有、ｐＨ７．４）で洗浄した。注入された標識二次的抗体（Ｃｙ５標識ヤギ抗ヒトＦａｂ’２抗体）により生じる蛍光を測定することによって、これらのビーズに結合した遊離抗スクレロスチン抗体のフラクションを解析した。各条件においてサンプルを２回反復して解析し、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、１：１結合モデルにデータをフィットさせてＫＤを決定した。２５℃における平均ＫＤ値を、下記の表３に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例４：Ｉｎ ｖｉｖｏカルセインアッセイ：
ラットカルセインアッセイにより、短期間（１０日）での骨形成及び骨形成に及ぼす本発明の抗体の効果を、直接評価することができる。カルセインは蛍光色素標識であり、新しい骨形成の間、骨基質中に取り込まれる。カルセインの定量値は、薬理物質により誘導される骨形成の程度を反映する。６ヵ月齢のメスのスピローグ−ドーリーラットを使用した（ｎ＝６／投与群）。ラットに対して、皮下注射で、ＰＢＳビヒクル中の１ｍｇ／ｋｇ若しくは６ｍｇ／ｋｇの抗体による３日毎（０、３及び６日目）の投与、又は１０μｇ／ｋｇ ＰＴＨによる毎日の投与、又は陰性コントロールとして６ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧによる投与を行った。カルセインを７日目に皮下注射し、更にラットを１０日目にと殺した。脛骨を採集し、切片を作製し、小柱骨（遠位骨幹端）の形成又は皮質骨（脛骨骨幹）の形成を評価し、また脱ミネラル化及び全カルセインの蛍光色素測定を行った。下記の表４に示される値は、ヒトＩｇＧコントロールを１．０としたときの平均値である。そのデータは、本発明の抗体の投与により小柱及び皮質における骨形成が生じることを証明するものである。
【００９３】
【表４】
【００９４】
実施例５：変形性股関節症：
ＳＯＳＴの発現は、主に骨組織に限定される。しかしながら出願人は、リアルタイムＰＣＲで測定した結果、顕著なＳＯＳＴ発現を示す他の組織として、軟骨が挙げられると本願明細書において結論づけた。ＳＯＳＴの軟骨発現は、健常者若しくは関節炎の患者の軟骨から分離されるＲＮＡのアレイを使用することによっても観察される。更に、そのアレイにおいて、ＳＯＳＴの発現は、骨関節炎の重篤度に比例して増加し（軽度の骨関節炎の場合の軟骨における発現はコントロールより大きく、重度の場合には軽度の場合よりも大きく、また外科的に重症である場合（膝関節置換手術のために除去した場合）には他の全ての場合よりも大きい）、すなわち骨関節炎とＳＯＳＴ発現との相関を示すものである。スクレロスチンに特異的な抗体は、骨関節炎の治療に使用できる。
【００９５】
ラットＦｃ領域上にラット可変領域を有する抗スクレロスチンキメラ抗体（配列番号４２の重鎖及び配列番号４３の軽鎖を有する抗体７８９）を用い、骨関節炎のＭＩＡモデルの関節痛を防止する能力を試験した。この抗体の可変領域を、ヒト化抗体８９（配列番号１６のＨＣＶＲ及び配列番号１９のＬＣＶＲ）の調製用の親配列とした。ヒト化抗体８９及びキメラ抗体７８９は、両方とも、同じエピトープと結合する。この骨関節炎モデルは、直接膝関節へのモノヨードアセテート（ＭＩＡ）の注入を利用して、炎症性及びサイトカイン媒介の痛み及び軟骨破壊プロセスを伴うＯＡ様のプロセスを誘導するものである。ラットの反対側の膝に生理食塩水のみを注射し、２つの後肢の加重耐久性の相違として痛みを測定した。
【００９６】
ＭＩＡ実験＃１は、「予防モード」の若いオスのルイスラット（生後７〜８週齢）を用いて、抗スクレロスチン抗体をＭＩＡ注射前に投与するものである。ＭＩＡ注入の前日、ラットに、１０ｍｇ／ｋｇの抗スクレロスチン抗体、又は１０ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ、又はＰＢＳ（群あたりｎ＝６）を注射（ｉ．ｐ．）した。翌日、ラットを麻酔し、右膝に、０．９％の無菌の生理食塩水に溶解させた０．３ｍｇのヨード酢酸一ナトリウムを５０μＬで注射した。左膝に、生理食塩水のみを注射した。プラスチック製のチューブシースで覆われた２８Ｇの針を有するインシュリンシリンジを使用して、膝蓋骨の靭帯を通して５ｍｍだけ貫通させ、膝関節に注射した。
【００９７】
痛みの測定は、ＭＩＡ注射の２日及び７日後（抗体注射の３日及び８日後）に行った。７日目における痛み測定の後、第２の抗体又はコントロールの注射を行った。更なる痛みの測定を、ＭＩＡの１０日及び１４日後（抗体の第２の注射後３日及び７日）に行った。
【００９８】
鎮痛評価装置を用いて、注射された肢の荷重耐久性の違いとして痛みを測定した。圧力センサ上に後肢を乗せる形で、パースペックス製のボックスにラットを置いた。ラットが確実に静止したら、１秒間の読み取りを行い、更に２回の読み取りを行い、それらの平均値を算出した。ＭＩＡ注射された肢に荷重される重量から、生理食塩水を注入された肢の値を減算し、荷重耐性の差を算出した。
【００９９】
統計学的に有意な痛みの減少が、ＩｇＧ（及びＰＢＳ）のコントロールと比較し、抗スクレロスチン抗体によるＭＩＡ投与の後、７、１０及び１４日目に観察された（下記の表５参照）。それらの値は、ＭＩＡを注射された肢と生理食塩水を注射された肢との荷重耐性の相違（平均±標準偏差）である。
【０１００】
第２のＭＩＡ実験を、高齢ラット（生後２７週間目）及びＭＩＡ注射した後で抗体を投与した「処置モード」に関して実施した。ラットに、上記と同様にＭＩＡ又はコントロール生理食塩水を注射し、次に６日後に１０ｍｇ／ｋｇの抗スクレロスチン抗体、コントロールＩｇＧ又はＰＢＳをｉ．ｐ．で注射した（群あたりｎ＝６）。ＭＩＡの８日及び１５日後（抗体投与後２日及び９日後）に、上記の通りの痛み測定を実施した。ＭＩＡの１６日後、抗スクレロスチン抗体及びコントロールの第２の投与を行い、２１日（第２の抗体投与の５日後）に、痛み測定値を再度収集した。
【０１０１】
抗スクレロスチン抗体の投与後の初期の時点（ＭＩＡ後８日）においては、痛みに対する抗体の効果はなかったが、７日後においては、ＭＩＡ注射された肢と、生理食塩水を注射された肢との重量（ｇ）の測定値の相違として、痛みを減少させる傾向が示された。抗スクレロスチン抗体により痛みが緩和される傾向は、第２の抗体投与の５日後にも観察された。キメラ抗体７８９は、１５及び２１日目で、それぞれｐ値が０．０６及び０．０８であり、ＩｇＧコントロールとは異なっていた。これらの結果から、確立されたＭＩＡ疾患プロセスから生じる関節炎が、抗スクレロスチン中和抗体の投与により抑制されることが証明された。
【０１０２】
実施例６：ＯＶＸラット試験：
卵巣切除（ＯＶＸ）ラットは、閉経後骨粗鬆症モデルとして周知である。この試験では、ＯＶＸラットにおける、ラット可変領域及びラットＦｃを含んでなる本発明の抗スクレロスチン抗体の効果を解析した。
【０１０３】
６ヵ月齢のメスのスピローグ−ドーリーラットを卵巣摘出し、投与前の１ヵ月間、骨損失を生じさせた。ラットの１つの群（ｎ＝８）は、卵巣切除を受けていないが、卵巣摘出ラットとの骨比較のための擬似（ｓｈａｍ）手術を受けた。全てのＯＶＸラットを、各処置群（各々ｎ＝７）にランダム化し、ＰＴＨ（１−３８）、ＩｇＧコントロール（１０ｍｇ／ｋｇ）又は１０ｍｇ／ｋｇのキメラ抗スクレロスチン抗体（配列番号４０の重鎖及び配列番号４１の軽鎖を有する抗体７８８：［この抗体の可変領域は、ヒト化抗体８８の調製用の親配列である］、配列番号４２の重鎖及び配列番号４３の軽鎖を有する抗体７８９）のいずれかで、合計５８日間にわたり処置した。全ての抗体を３日毎に１回皮下投与し、一方、ＰＴＨ（１−３８）は１０ｍｇ／ｋｇで１日１回皮下投与した。安楽死させた後、大腿骨及び脊柱を摘出し、遠位大腿骨（小柱骨）及び骨幹中部（皮質骨）、並びに第５腰椎を、ＣＴスキャナを使用して、定量的コンピュータ断層撮影（ＣＴ）分析により解析した。再生可能な測定のために鋳造粘土に骨を配置し、大腿骨のスキャンを、骨端から２ｍｍ（大腿骨遠位部）、又は骨端から１０ｍｍ（大腿骨骨幹中部）において実施した。
【０１０４】
脊椎骨のランドマーク「Ｖ」構造からのＬ−５スキャンにより、椎骨の測定を実施した。ＳＹＳ−Ｃ３２０−Ｖ １．５ソフトウェアパッケージを用いてデータを算出した。大腿骨の骨幹、Ｌ−５脊柱及び大腿骨頸部の生体機械的特性を、Ｔｕｒｎｅｒ ＣＨ，Ｂｕｒｒ ＤＢ，Ｂａｓｉｃ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｂｏｎｅ：ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ．Ｂｏｎｅ １４（４）：５９５−６０８，１９９３に従い、検死後に測定した。骨幹中部の機械的特性は、無傷の左の大腿骨を用いて、１５ｍｍ間隔で２つの支持体の中間への荷重による３点屈曲試験により測定した。荷重位置が、末梢部の膝窩空間から約７．５ｍｍとなるように大腿骨を配置し、中央−横軸周辺で屈曲を生じさせた。３７℃の生理食塩水の浴槽中で標本を試験した。荷重−変位（Ｌｏａｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）曲線を、材料試験機（モデル：１／Ｓ、ＭＴＳ社、ミネアポリス、ＭＮ）を使用して、１０ｍｍ／分のクロスヘッド速度で記録し、ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＭＴＳ社）を使用して解析し、ピーク負荷を算出した。後部プロセスを取り除いた後、Ｌ−５脊柱の機械的特性を分析し、中心の端はダイヤモンドウエハ調製用ソー（Ｂｕｅｋｌｅｒ Ｉｓｏｍｅｔ社製、エヴァンストン、ＩＬ）を使用して平行にした。材料試験装置を使用して椎骨標本をロードして圧縮し、ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＭＴＳ社）を使用して分析した。大腿骨頸部の測定の場合、大腿骨を近位側を上に向けて取付チャック上に垂直に置き、大腿骨頭部の中間点において、下方へ荷重をかけた。ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＭＴＳ社）を用いて分析した。平均値及び平均値の標準誤差を、下記の表５及び６に示す。それらのデータから、キメラ抗体７８８及び７８９が、ＯＶＸラットの骨密度（「ＢＭＤ」）、骨塩量（「ＢＭＣ」）及び骨強度（ピーク負荷）を増加させることが証明された。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、
ｉ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２、配列番号２２のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号２６のＨＣＤＲ１、配列番号２７のＨＣＤＲ２、配列番号２８のＨＣＤＲ３、配列番号２９のＬＣＤＲ１、配列番号３０のＬＣＤＲ２及び配列番号３１のＬＣＤＲ３；並びに
ｉｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、配列番号３４のＨＣＤＲ３、配列番号３５のＬＣＤＲ１、配列番号３６のＬＣＤＲ２及び配列番号３７のＬＣＤＲ３；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含む抗体であって、前記抗体が、
ｉ）ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で１０ｐＭ以下、
ｉｉ）カニクイザルスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で１００ｐＭ以下、及び、
ｉｉｉ）ヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおけるＩＣ５０が５０ｎＭ以下、のうちの少なくとも１つを特徴とする抗体。
【請求項２】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、かつ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでなる抗体であって、
ｉ）重鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、
ｉｉ）重鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が配列番号１８のアミノ酸配列を有するか、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項３】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、かつ重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体であって、
ｉ）重鎖ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を有するか、
ｉｉ）重鎖ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は、
ｉｉｉ）重鎖ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項４】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、かつ、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体。
【請求項５】
前記抗体のヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で１０ｐＭ以下である、請求項２から４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体のヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で２．２ｐＭ以下である、請求項２から４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体のヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおけるＩＣ５０が５０ｎＭ以下である、請求項２から６のいずれか１項記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される重鎖定常領域を含んでなる、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項９】
薬剤の調製に用いられる、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト被験者において、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させる方法に用いられる、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト被験者における骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるための薬剤の調製への、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１２】
ヒト被験者の骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、慢性関節リウマチ、歯周病及び多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療用薬剤の調製への、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１３】
ヒト被験者の骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させる方法であって、それを必要とするヒト被験者に有効量の請求項１から８のいずれか１項記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１４】
ヒト被験者の骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、骨関節炎に関連する痛み、歯周病及び多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とするヒト被験者に有効量の請求項１から８のいずれか１項記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１５】
ヒト被験者の骨粗鬆症を治療する方法であって、それを必要とするヒト被験者に、配列番号３の重鎖ポリペプチドと配列番号６の軽鎖ポリペプチドを含んでなる、有効量の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１６】
請求項１から８のいずれか１項記載の抗体と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
生物学的サンプル中のスクレロスチンタンパク質を検出する方法であって、
ｉ）配列番号４０の重鎖ポリペプチドと配列番号４１の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、
ｉｉ）配列番号４２の重鎖ポリペプチドと配列番号４３の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、
ｉｉｉ）配列番号２の重鎖ポリペプチドと配列番号５の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、
ｉｖ）配列番号３の重鎖ポリペプチドと配列番号６の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、及び
ｖ）配列番号４の重鎖ポリペプチドと配列番号７の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体からなる群から選択される抗体と、生物学的サンプルとを、前記抗体がスクレロスチンタンパク質と結合し、かつ前記結合を検出するのに十分な条件及び時間で、インキュベートするステップを含んでなる方法。
【請求項１】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、
ｉ）配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣＤＲ２、配列番号２２のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号２６のＨＣＤＲ１、配列番号２７のＨＣＤＲ２、配列番号２８のＨＣＤＲ３、配列番号２９のＬＣＤＲ１、配列番号３０のＬＣＤＲ２及び配列番号３１のＬＣＤＲ３；並びに
ｉｉｉ）配列番号３２のＨＣＤＲ１、配列番号３３のＨＣＤＲ２、配列番号３４のＨＣＤＲ３、配列番号３５のＬＣＤＲ１、配列番号３６のＬＣＤＲ２及び配列番号３７のＬＣＤＲ３；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲを含む抗体であって、前記抗体が、
ｉ）ヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で１０ｐＭ以下、
ｉｉ）カニクイザルスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で１００ｐＭ以下、及び、
ｉｉｉ）ヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおけるＩＣ５０が５０ｎＭ以下、のうちの少なくとも１つを特徴とする抗体。
【請求項２】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、かつ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでなる抗体であって、
ｉ）重鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有するか、
ｉｉ）重鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が配列番号１８のアミノ酸配列を有するか、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項３】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、かつ重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体であって、
ｉ）重鎖ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を有するか、
ｉｉ）重鎖ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を有するか、又は、
ｉｉｉ）重鎖ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項４】
ヒトスクレロスチンと特異的に結合し、かつ、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドと配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体。
【請求項５】
前記抗体のヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で１０ｐＭ以下である、請求項２から４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体のヒトスクレロスチンに対するＫＤが２５℃で２．２ｐＭ以下である、請求項２から４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体のヒトスクレロスチンを使用した骨特異的アルカリホスファターゼアッセイにおけるＩＣ５０が５０ｎＭ以下である、請求項２から６のいずれか１項記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常領域及び配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される重鎖定常領域を含んでなる、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項９】
薬剤の調製に用いられる、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト被験者において、骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させる方法に用いられる、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト被験者における骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させるための薬剤の調製への、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１２】
ヒト被験者の骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、慢性関節リウマチ、歯周病及び多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療用薬剤の調製への、請求項１から８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１３】
ヒト被験者の骨量、骨塩密度、骨塩量及び骨強度の少なくとも１つを増加させる方法であって、それを必要とするヒト被験者に有効量の請求項１から８のいずれか１項記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１４】
ヒト被験者の骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、骨関節炎に関連する痛み、歯周病及び多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とするヒト被験者に有効量の請求項１から８のいずれか１項記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１５】
ヒト被験者の骨粗鬆症を治療する方法であって、それを必要とするヒト被験者に、配列番号３の重鎖ポリペプチドと配列番号６の軽鎖ポリペプチドを含んでなる、有効量の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１６】
請求項１から８のいずれか１項記載の抗体と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
生物学的サンプル中のスクレロスチンタンパク質を検出する方法であって、
ｉ）配列番号４０の重鎖ポリペプチドと配列番号４１の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、
ｉｉ）配列番号４２の重鎖ポリペプチドと配列番号４３の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、
ｉｉｉ）配列番号２の重鎖ポリペプチドと配列番号５の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、
ｉｖ）配列番号３の重鎖ポリペプチドと配列番号６の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体、及び
ｖ）配列番号４の重鎖ポリペプチドと配列番号７の軽鎖ポリペプチドを含んでなる抗体からなる群から選択される抗体と、生物学的サンプルとを、前記抗体がスクレロスチンタンパク質と結合し、かつ前記結合を検出するのに十分な条件及び時間で、インキュベートするステップを含んでなる方法。
【公表番号】特表２０１０−５２４８４６（Ｐ２０１０−５２４８４６Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５４６３７（Ｐ２００９−５５４６３７）
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５６５２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５７３２
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５６５２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５７３２
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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