抗体遺伝子送達およびそのための組換えＡＡＶ
【課題】ＨＩＶ−１感染に対して有効な予防的および治療的処置を提供すること。
【解決手段】本発明は、一般に、遺伝子送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用に関し、より具体的には、哺乳動物における標的細胞に抗体遺伝子を送達するためのｒＡＡＶの使用に関する。ＨＩＶ−１ウイルスを中和する抗体をコードするｒＡＡＶの投与を例示する。能動免疫ストラテジーおよび受動免疫ストラテジーの両方に関する有意な障害に起因して、本発明は、上述のＨＩＶ−１ ｇｐ１６０に対するヒトモノクローナル中和抗体およびＡＡＶ固有の遺伝子送達特性の存在を利用するアプローチを用いる。
【解決手段】本発明は、一般に、遺伝子送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用に関し、より具体的には、哺乳動物における標的細胞に抗体遺伝子を送達するためのｒＡＡＶの使用に関する。ＨＩＶ−１ウイルスを中和する抗体をコードするｒＡＡＶの投与を例示する。能動免疫ストラテジーおよび受動免疫ストラテジーの両方に関する有意な障害に起因して、本発明は、上述のＨＩＶ−１ ｇｐ１６０に対するヒトモノクローナル中和抗体およびＡＡＶ固有の遺伝子送達特性の存在を利用するアプローチを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年４月９日に出願された米国仮出願番号６０／３７１，５０１の一部継続である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般には遺伝子送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用に関し、より具体的には、哺乳動物における標的細胞への抗体遺伝子を送達するためのｒＡＡＶの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製不全のパルボウイルスであり、その１本鎖ＤＮＡゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）の１４５ヌクレオチドを含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）に示されており、Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：３３８５−３３９２（１９９４）によって訂正されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージングおよび宿主細胞の染色体組込みを指示するシス作動性配列は、ＩＴＲの範囲に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（ｐ５、ｐ１９およびｐ４０（その相対的なマップ位置にちなんで名付けられる））は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７）の差次的なスプライシングと相まって、この２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）の産生を生じる。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、この遺伝子は、３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする。選択的スプライシングおよびコンセンサスでない翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位がＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）において総説されている。
【０００４】
野生型のＡＡＶがヒト細胞に感染すると、ウイルスゲノムが１９番染色体に組み込まれ、細胞の不顕性感染を生じ得る。細胞がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）に感染するまで、感染性ウイルスの産生は生じない。アデノウイルスの場合、遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡがヘルパー機能を提供する。ヘルパーウイルスに感染すると、ＡＡＶプロウイルスがレスキューおよび増幅され、ＡＡＶとアデノウイルスの両方が産生される。
【０００５】
ＡＡＶは、免疫原性ペプチド／ポリペプチドを発現するためのワクチンベクターとして、および、例えば、遺伝子治療において、外因性のＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして、ＡＡＶを魅力的にする独特の特性を保有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の天然の感染は、静的であり、無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボにおいて多くの異なる組織を標的化する可能性を提供する。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞にゆっくりと形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として、本質的にはこれらの細胞の寿命の間持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローニングされたＤＮＡとして感染性であり、このことは、組換えゲノムの構築物を実現可能にする。さらに、ＡＡＶの複製、ゲノムのキャプシド形成および組み込みを指向するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内側約４．３ｋｂ（複製キャプシドタンパク質および構造キャプシドタンパク質（ｒｅｐ−ｃａｐ）をコードする）のいくらかまたは全てが、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む、遺伝子カセットのような外来ＤＮＡで置換され得る。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、ＡＡＶが非常に安定かつ頑強なウイルスであるということである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するのに用いられる条件（５６〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ｒＡＡＶベクターの定温保存をより重要でなくする。ＡＡＶは、凍結乾燥さえされ得る。最後に、ＡＡＶが感染した細胞は、多重感染に抵抗性でない。
【０００６】
ＨＩＶ−１は、米国において後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であると考えられている。世界保健機構によって評価されたように、４千万人以上が現在ＨＩＶに感染しており、２千万人がすでにＡＩＤＳで死亡している。従って、ＨＩＶ感染は、世界規模の流行病であると考えられる。
【０００７】
現在認識されている２つのＨＩＶ株（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）が存在する。ＨＩＶ−１は、世界中でＡＩＤＳの主要な原因である。ＨＩＶ−１は、ゲノム配列変化に基づいてクレードに分類されている。例えば、クレードＢは、北米、ヨーロッパ、南米の一部およびインドで最も優勢であり；クレードＣは、サハラ以南のアフリカにおいて最も優勢であり；そして、クレードＥは、東南アジアにおいて最も優勢である。ＨＩＶ−１感染は、主に、性的感染、母子感染、または汚染された血液もしくは血液製剤への曝露を通じて生じる。
【０００８】
現在認識されている２つのＨＩＶ株（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）が存在する。ＨＩＶ−１は、世界中でＡＩＤＳの主要な原因である。ＨＩＶ−１は、ゲノム配列変化に基づいてクレードに分類されている。例えば、クレードＢは、北米、ヨーロッパ、南米の一部およびインドで最も優勢であり；クレードＣは、サハラ以南のアフリカにおいて最も優勢であり；そして、クレードＥは、東南アジアにおいて最も優勢である。ＨＩＶ−１感染は、主に、性的感染、母子感染、または汚染された血液もしくは血液製剤への曝露を通じて生じる。
【０００９】
ＨＩＶ−１は、ウイルス構造タンパク質および酵素の内部コア、ならびにウイルスの複製に必要とされるタンパク質、および２つの同一の直鎖状ＲＮＡのゲノムを取り囲む脂質エンベロープからなる。脂質エンベロープにおいて、ウイルス糖タンパク質４１（ｇｐ４１）が、ウイルス表面から延びて、感受性細胞の表面上レセプターと相互作用する別のウイルスエンベロープ糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）を係留する。ＨＩＶ−１ゲノムは、約１０，０００ヌクレオチドのサイズであり、９つの遺伝子を含む。ＨＩＶ−ゲノムは、全てのレトロウイルスに共通の３つの遺伝子（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子）を含む。ｇａｇ遺伝子は、コア構造タンパク質をコードし、ｅｎｖ遺伝子はｇｐ１２０およびｇｐ４１エンベロープタンパク質をコードし、そして、ｐｏｌ遺伝子はウイルスの酵素である逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼおよびプロテアーゼ（ｐｒｏ）をコードする。ゲノムは、ウイルスの複製に必須の２つの他の遺伝子である、ウイルスプロモータートランスアクチベーターをコードするｔａｔ遺伝子および、また、遺伝子の転写を促進するｒｅｖ遺伝子を含む。最後に、ｎｅｆ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子は、レンチウイルスに固有であり、Ｔｒｏｎｏ，Ｃｅｌｌ，８２：１８９−１９２（１９９５）に記載される機能のポリペプチドをコードする。
【００１０】
ＨＩＶ−１がヒト細胞に感染するプロセスは、ウイルスの表面上タンパク質と細胞の表面上タンパク質との相互作用を含む。一般的な理解は、ＨＩＶ感染の最初の段階が、ＨＩＶ−１の糖タンパク質（ｇｐ）１２０の細胞ＣＤ４タンパク質への結合であるということである。この相互作用は、ウイルスｇｐ１２０に立体構造の変化を生じさせ、他の細胞表面タンパク質（例えば、ＣＣＲ５タンパク質またはＣＸＣＲ４タンパク質）に結合し、ウイルスの細胞との引き続く融合を可能にする。従って、ＣＤ４は、ＨＩＶ−１に対する主要なレセプターとして記載されており、一方で、他の細胞表面タンパク質がＨＩＶ−１に対するコレセプターとして記載されている。
【００１１】
ＨＩＶ−１感染は、ウイルス感染とＡＩＤＳの発症との間の無症候性の期間により特徴付けられる。ＡＩＤＳへの進行速度は、感染した個人間で異なる。ＡＩＤＳは、ＣＤ４陽性細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞および単球／マクロファージ）が感染され、そして消耗されると発症する。ＡＩＤＳは、日和見感染症、悪性腫瘍の危険の増加および細胞媒介性免疫の欠失に代表的な他の症状として顕性化する。Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの小児、青年および成人の疾患の臨床分類は、ＳｌｅａｓｍａｎおよびＧｏｏｄｅｎｏｗ，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１（２）：Ｓ５８２−Ｓ５９２（２００３）の表Ｉに示される。
【００１２】
ＡＩＤＳへの進行の可能性の予測は、ウイルス負荷（ウイルスの複製）のモニタリング、および感染した個体におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の測定を包含する。ウイルス負荷が高いほど、個人はよりＡＩＤＳを発症する可能性が高い。ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が低いほど、個人がＡＩＤＳを発症する可能性が高い。
【００１３】
現在、抗レトロウイルス薬物療法（ＡＲＴ）は、ＨＩＶ感染を処置するか、または１個人から別の個人へのＨＩＶ−１の伝染を防ぐ唯一の手段である。せいぜい、ＡＲＴを用いてさえ、ＨＩＶ−１感染は、一生の薬物療法を必要とする慢性状態であり、疾患へのゆっくりとした進行がなお存在し得る。ウイルスが不顕性の保有者において持続し得るため、ＡＲＴは、ＨＩＶ−１を根絶しない。さらに、処置レジメンは、毒性であり得、毎日複数の薬物を使用しなければならない。従って、ＨＩＶ−１感染に対する有効なワクチンおよび処置を開発する緊急の必要性が存在する。
【００１４】
過去数年にわたって、ＨＩＶ感染に対する安全かつ有効なワクチンに向って進歩がなされており、複数のアプローチが動物モデルおよびヒトにおいてとられている。ワクチン候補物の多くは、測定可能かつ有意な抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発した。対照的に、ワクチン候補の多くは、ＨＩＶ−１の重要な単離体を広く中和する血清抗体を誘導できない。従って、このような抗体がＨＩＶ−１感染および疾患に対する重要な保護であると考える場合、現在のＨＩＶ−１ワクチン候補物の設計には重大なギャップが残る。
【００１５】
エンベロープ免疫原でのワクチン接種後の中和抗体の誘導の欠落を説明するために、いくつかの仮説が提示される。まず、誘発された抗エンベロープ抗体のほとんどが、成熟したオリゴマーエンベロープ複合体を認識せず、むしろプロセシングされていないｇｐ１６０前駆体または単量体のｇｐ１２０に結合する。このことは、部分的に、成熟したエンベロープスパイクの三量体構造に起因し、この構造は、低い固有免疫原性の分子を生じる。露出された表面ドメインの伸長性のグリコシル化は、スパイクの重要な部分を非免疫原性にし、分子のいわゆる「静的表面」を生じる。第２に、三量体部分のコンパクトな構造は、三量体のコアの内部に位置されるタンパク質エピトープの抗体認識と立体的に干渉する。重要なことには、これらの同じエピトープが、プロセシングされていないｇｐ１６０前駆体または単量体のｇｐ１２０タンパク質上に容易に露出され、タンパク質の非中和化表面にマッピングされる。結果として、広範なクレードにまたがる様式で主要なウイルス単離体を中和する、ヒトモノクローナル抗体を単離することは、非常に困難である。実際、種々の技術を用いる努力にも拘らず、わずか６つのこのような抗体（Ｚｗｉｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：１２１９８−１２２０８，２００１に記載されるｂ１２、２Ｇ１２、２Ｆ５、Ｚ１３および４Ｅ１０、ならびにＭｏｕｌａｒｄら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９１３−６９１８，２００２に記載されるＸ５）が同定されている。このような抗体がＨＩＶ−１に感染したヒトにおいて稀であるという事実は、従来のワクチン接種法を用いて広範に反応性な抗体を誘発するのに、病気（と定義されるが実質的には障壁である）を強調するようにして働く。
【００１６】
この問題のための１つの可能な解決策は、所望の中和活性を有する抗体調製物（モノクローナルまたはポリクローナル）を予防的に投与することであり得る。ＨＩＶ−１に関して、非ヒト霊長類における研究は、受動的に投与された中和抗体がＳＩＶ／ＳＨＩＶ／ＨＩＶ感染に対して有意な保護を提供し得ることを示唆する。この型の「受動免疫」スキームは、重篤な呼吸器合胞体ウイルス感染の危険性がある幼児の標的化された集団に対すて大規模に首尾良く適用されている。しかし、このようなＨＩＶ感染に対するストラテジーは、重大な欠陥を有する。無期限にわたって、頻繁に多数の人に抗体調製物を投与することは、非常にコストがかかり、非実用的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＶ−１感染に対して有効な予防的および治療的処置の開発への必要性を認識する。能動免疫ストラテジーおよび受動免疫ストラテジーの両方に関する有意な障害に起因して、本発明は、上述のＨＩＶ−１ ｇｐ１６０に対するヒトモノクローナル中和抗体およびＡＡＶ固有の遺伝子送達特性の存在を利用するアプローチを用いる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノム。
（項目２）
項目１に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムを含むポリヌクレオチド。
（項目３）
項目１に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムを含むパッケージング細胞。
（項目４）
項目１に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムを含む精製ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２。
（項目５）
項目４に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を含む組成物。
（項目６）
細胞においてＩｇＧ１ｂ１２抗体を産生する方法であって、細胞を項目４に記載の精製ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の有効量で形質転換して該細胞におけるＩｇＧ１ｂ１２抗体の発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目７）
動物においてＩｇＧ１ｂ１２抗体を産生する方法であって、項目５に記載の組成物の有効量を患者に投与して、該動物におけるＩｇＧ１ｂ１２抗体の発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目８）
前記動物が人間である、項目７に記載の方法。
（項目９）
ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノム。
（項目１０）
項目９に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含むポリヌクレオチド。
（項目１１）
項目９に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含むパッケージング細胞。
（項目１２）
項目９に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含む精製ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５。
（項目１３）
項目１２に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５を含む組成物。
（項目１４）
細胞においてＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドを産生する方法であって、細胞を項目１２に記載の精製ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５の有効量で形質転換して該細胞におけるＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目１５）
動物においてＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドを産生する方法であって、項目１３に記載の組成物の有効量を患者に投与して、該動物におけるＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目１６）
前記動物が人間である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドをコードする精製ｒＡＡＶ。
（項目１８）
１つ以上の項目１７に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
（項目１９）
細胞において抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドを産生する方法であって、細胞を項目１７に記載の精製ｒＡＡＶの有効量で形質転換して該細胞における抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目２０）
動物において抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドを産生する方法であって、項目１８に記載の組成物の有効量を患者に投与して、該動物における抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目２１）
前記動物が人間である、項目２０に記載の方法。
【００１８】
第１の局面において、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。このｒＡＡＶゲノムは、標的細胞において機能的である、転写制御ＤＮＡ、特にプロモーターのＤＮＡおよびポリアデニル化シグナル配列のＤＮＡに作動可能に連結されている１つ以上の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。この遺伝子カセットはまた、イントロン配列を含み、哺乳動物細胞において発現される場合にＲＮＡ転写物のプロセシングを促進し得る。本発明のｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを欠失する。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。
【００１９】
特に、本発明は、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする二重プロモーターの遺伝子カセットを意図する。１つの実施形態において、遺伝子カセットは、以下を含む：（１）形質導入される細胞において活性な２つの恒常性プロモーター、（２）プロモーターエレメントまたは重鎖および軽鎖コード配列の迅速な置換を可能にするいくつかの固有の制限酵素部位、（３）インフレームの抗体遺伝子クローニングを促進する固有の制限部位、（４）可能性のあるプロモーター干渉を減らすための、第１の発現カセットに対する強力な転写終止部位３’、ならびに（５）２つのプロモーターのうちの１つの転写制御下にて、各々挿入される目的のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチド配列。
【００２０】
本発明は、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質）および細菌タンパク質、ならびに抗体の供給が有効な処置である慢性疾患状態に関する他のタンパク質（例えば、疾患状態が生じるときにのみ発現されるタンパク質、または疾患状態の非存在下での発現と比べて発現がアップレギュレートされるタンパク質）に指向する抗体を発現するｒＡＡＶゲノムを意図する。慢性疾患状態の例としては、以下が挙げられる：癌、炎症性疾患（例えば、慢性関節性リウマチおよび炎症性腸疾患）、およびプリオン関連疾患（例えば、狂牛病、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、致死性家族性不眠症、クールーおよびＡｌｐｅｒｓ症候群）。主要なＨＩＶ−１単離体（例えば、モノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２、２Ｆ５、Ｚ１３、４５Ｅ１０、Ｆ１０５およびＸ５）を中和するモノクローナル抗体をコードするゲノムが特に意図される。これらの抗体は、Ｚｗｉｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：１２１９８−１２２０８，２００１；Ｂａｂａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２００−２０６，２０００；およびＭｏｕｌａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９１３−６９１８，２００２）に多様に記載されている。Ｚ１３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＹ０３５８４５およびＡＹ０３５８４６（配列番号１８および１９）に示され、２Ｆ５の重鎖ＤＮＡおよび軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２２および２３ならびに配列番号２４および２５に記載される。ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン、ｂ１２重鎖コード配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位、ＨＴＬＶ１型の長い末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列の一部を用いて改変されたヒト伸長因子−１αプロモーター、Ｉ１１７イントロン、ｂ１２軽鎖コード配列ならびにＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む二重プロモーターの遺伝子カセットが本明細書中で具体的に例示される。この遺伝子カセットを含むｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムに指向する。ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン、Ｘ５重鎖可変領域コード配列、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー、Ｘ５軽鎖可変領域コード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む遺伝子カセットがまた、本明細書中で具体的に例示される。この遺伝子カセットを含むｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムに指向する。
【００２１】
本発明は、ｒＡＡＶゲノムによってコードされる抗体ポリペプチドを意図し、この抗体ポリペプチドは、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）またはそのサブクラスのインタクトな免疫グロブリン分子、四量体、二量体、単鎖抗体、二官能性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全に新規の組換え抗体、化学的手段または生物学的手段によって新規に合成された抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２’、ならびに他の免疫活性部分、フラグメント、セグメントおよび他のより小さい部分抗体構造もしくはより大きい部分抗体構造であり得、これらの全てが十分な結合活性を有し、従って、本発明の方法において治療的に有用である。さらに、本発明は、「ヒト化」抗体の使用を意図するので、例えば、フレームワークおよび／または相補性決定領域の同一性のいくらかの変化（すなわち、抗体の抗原特異性を決定するのに重要な上記抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲまたは超可変領域）が、両方とも許容および予想される。従って、本発明に従って、本発明において有用な抗体ポリペプチドのアミノ酸配列は、感染（急性および慢性の感染）および慢性疾患を処置する、公知の効用のこれらの抗体からのいくらかの配列変化を示し得る。このような配列変化は、５％程度であり得、それによって、本明細書中で有用な抗体配列が、既知の効用の抗体と少なくとも９５％の同一性を有する。上記のように、抗体ポリペプチドは、任意の抗体クラスであり得る（または任意の抗体クラス由来であり得る）。抗体クラスは、処置される感染および／または疾患状態ならびに抗体ポリペプチドの所望の作用および作用部位を考慮して、当業者により選択され得る（か、または改変され得る）。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡベクターを提供する。このベクターは、感染性のウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムのアセンブリのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）での感染に許容性の細胞に輸送される。パッケージングされているＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該分野の技術水準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分が単一の細胞（本明細書中でパッケージング細胞と称する）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスがｒＡＡＶゲノムＩＴＲ以外の異なるＡＡＶ血清型由来であり得る、任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。
【００２３】
パッケージング細胞の作製方法は、ＡＡＶ粒子産生のための全ての必要な成分を安定に発現する細胞株を作製することである。例えば、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから単離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択マーカー（例えば、ネオマイシン体制遺伝子）を含むプラスミド（または複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込む。次いで、パッケージング細胞株にヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）を感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適することである。適切な方法の他の例は、プラスミドよりむしろ、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、パッケージング細胞内にｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を組み込む。
【００２４】
従って、本発明は、感染性のｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。１つの実施形態において、パッケージング細胞は、癌細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株））に安定に形質導入され得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、低い継代の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換したヒト胎性腎臓細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎性線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎性線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎性肺細胞）のような形質転換された癌細胞でない細胞である。
【００２５】
別の局面において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ（すなわち、感染性のキャプシド化されたｒＡＡＶ粒子）を提供する。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２である。別の実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５である。ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によってのような、当該分野で標準的な方法によって精製され得る。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。これらの組成物を用いて、ウイルス感染（急性および慢性のウイルス感染）、特にＡＩＤＳ、細菌感染（急性、亜急性および慢性の細菌感染）および他の慢性疾患状態を、処置および／または予防し得る。１つの実施形態において、本発明の組成物は、目的の抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、異なる目的の抗体ポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。中和ＨＩＶ−１について特に、いくつかの抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドプチドの発現および分泌を生じるｒＡＡＶ混合物の投与は、ウイルスの中和を増加させ得る。投与は先行し、同時にかまたは引き続いてＡＲＴが施され得る。
【００２７】
本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中にｒＡＡＶを含む。この組成物はまた、賦形剤およびアジュバントのような他の成分を含み得る。受容可能なキャリア、賦形剤およびアジュバントは、レシピエントに対して無毒性であり、好ましくは、使用される投薬量および濃度では不活性である。このようなものとしては、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または他の有機酸緩衝液）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖、二糖および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンが挙げられる）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与の様式、処置の目標、標的化される個体および細胞型に依存して変化し、当該分野の標準的な方法によって決定され得る。
【００２９】
インビボまたはインビトロで標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法は、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む有効量の組成物を、ｒＡＡＶの投与を必要とする動物（人間を含む）に投与する工程を包含する。この用量がウイルスによる感染または慢性疾患状態の発症の前に投与される場合、投与は予防的である。この量がウイルスによる感染または慢性疾患状態の発症の後に投与される場合、投与は治療的である。有効量とは、処置される感染または疾患状態に関する少なくとも１つの症状を緩和（排除または減少）し得るのに十分な用量である。１つの実施形態において、症状の緩和は、疾患状態へのウイルス感染の進行を妨げる。別の実施形態において、症状の緩和は、疾患状態への進行または疾患状態の進行（ウイルス感染によるものであってもなくても）を防ぐ。ウイルス感染（急性および慢性のウイルス感染を含む）、細菌感染（急性、亜急性および慢性感染を含む）および処置される患者の慢性疾患状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨＩＶ−１感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス感染、呼吸器合胞体ウイルス感染、骨髄炎、結核、慢性関節性リウマチ、炎症性大腸疾患、伝染性海綿状脳症（例えば、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病およびクールー）、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、致死性家族性不眠症、Ａｌｐｅｒｓ症候群および癌。この方法において、感染または疾患状態に関連するタンパク質またはペプチドと特異的に反応する抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶが投与される。有効量の組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、脳内、骨内、眼内、経直腸または経膣によってであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分の投与経路および血清型（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびキャプシドタンパク質）は、処置される感染および／または疾患状態、ならびに抗体ポリペプチドを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。
【００３０】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織内に輸送する任意の物理的な方法を用いて達成され得る。簡単にｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることが、筋肉組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが示されており、（ＤＮＡを分解する組成物が通常の様式でベクターを妨害するが）ベクターと同時に投与され得るキャリアまたは他の成分についての制限は知られていない。ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉のような目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。薬学的組成物は、注射用処方物としてか、または局所用処方物として経皮輸送によって筋肉へと送達されるように調製され得る。筋肉内注射および経皮輸送の両方についての多数の処方物がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用され得る。ｒＡＡＶは、投与および扱いを容易にするために任意の薬学的に受容可能なキャリアと共に使用され得る。
【００３１】
筋肉内注射の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油のようなアジュバント中、または、プロピレングリコール水溶液中の溶液、ならびに滅菌水性溶剤が使用され得る。このような水性溶剤は、必要な場合緩衝化され得、そして、液体賦形剤がまず生理食塩水もしくはグルコースで等張にされる。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬学的に受容可能な塩が、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適度に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶの分散物はまた、グリセロ−ル、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中、ならびに油中に調製され得る。保存および使用の通常の条件下にて、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。この関係で、使用される滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に入手可能である。
【００３２】
注射用途に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌分散物、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散物の即席の調製物のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、この形態は、滅菌でなければならず、かつ、容易に注入能が存在する程度に流動性でなければならない。この形態は、製造および保存の条件下において安定でなければならず、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオ−ル（例えば、グリセロ−ル、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）を使用することによって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗生物質おおよび抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物の延長した吸収は、吸収遅延剤（例えば、一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
【００３３】
滅菌注射溶剤は、上記で列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中で必要量のｒＡＡＶを組み込むことによって調製され、この後、必要に応じて、フィルター滅菌される。一般に、分散物は、滅菌活性成分を塩基性の分散媒体および上に列挙したもののうち必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製され得る。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、本発明の好ましい方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分の粉末＋前もって滅菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分を得る。
【００３４】
ｒＡＡＶの形質導入はまた、インビトロで実行され得る。１つの実施形態において、所望の標的筋肉細胞が被験体から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、そして、被験体へと再び戻される。あるいは、これらの細胞が被験体において不適切な免疫応答を惹起しない場合、同系または異種の筋肉細胞が使用され得る。
【００３５】
形質導入された細胞を被験体に形質導入および再導入する適切な方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、細胞は、例えば、適切な培地中で、ｒＡＡＶを筋肉細胞と合わせることによってインビトロで形質導入され得、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲのような従来の技術を用いてか、または選択マーカーを用いて、目的のＤＮＡを保有する細胞についてスクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、薬学的組成物中に処方され得、そして、この組成物は、種々の技術によって（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射および腹腔内注射によって、または、例えば、カテーテルを用いて平滑筋および心筋内に注射することによって）被験体に導入され得る。
【００３６】
本発明のｒＡＡＶを用いる細胞の形質導入は、抗体ポリペプチドの持続的な発現を生じる。従って、本発明は、動物、好ましくは人間に対して抗体ポリペプチドを発現するｒＡＡＶの送達方法を提供する。これらの方法は、組織（筋肉、肝臓および脳を含むがこれらに限定されない）を本発明の１つ以上のｒＡＡＶを用いて形質導入する工程を包含する。形質導入は、組織的特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行われ得る。例えば、本発明の１つの実施形態は、筋肉特異的制御エレメント（これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクチン由来の制御エレメントおよびｍｙｏＤ遺伝子ファミリー由来のようなミオシン遺伝子ファミリー由来の制御エレメント（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６１−７６６，１９９１を参照のこと）、単球特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２（ＣｓｅｒｊｅｓｉおよびＯｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：４８５４−４８６２，１９９１）、ヒト骨格アクチン遺伝子由来の制御エレメント（Ｍｕｓｃａｔら．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：４０８９−４０９９，１９８７）、心臓アクチン遺伝子由来の制御エレメント、筋肉クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎら．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：３３９３−３３９９，１９８９を参照のこと）およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、骨格速収縮（ｆａｓｔ−ｔｗｉｔｃｈ）トロポニンＣ遺伝子、遅収縮（ｓｌｏｗ−ｔｗｉｔｃｈ）心臓トロポニンＣ遺伝子および遅収縮トロポニンＩ遺伝子：虚血（ｈｙｐｏｚｉａ）誘導性核因子由来の制御エレメント（Ｓｅｍｅｎｚａら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５６８０−５６８４，１９９１）、ステロイド誘導性エレメントおよび糖質コルチコイド応答性エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（ＭａｄｅｒおよびＷｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３−５６０７，１９９３を参照のこと）ならびに他の制御エレメント）によって指向される筋肉細胞および筋肉組織を形質導入する方法を提供する。
【００３７】
筋肉組織は、インビボでの遺伝子送達および遺伝子治療の魅力的な標的である。なぜならば、筋肉組織は、生命の維持に必要な器官でなく、かつアクセスしやすいからである。本発明の方法におけるｒＡＡＶの筋肉細胞および組織への送達を実施するために、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ誘導体の使用が、筋肉組織からのより有効な抗体の分泌を促進するために企図される。本発明により企図される単鎖抗体は、ＨＩＶ−１中和単鎖抗体Ｘ５であり、この抗体のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０および２１に示される。さらに、代替的な血清型（例えば、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−５）に基づくｒＡＡＶは、ＡＡＶ−２よりも効率的に骨格筋細胞を形質導入し得る。
【００３８】
ｒＡＡＶは、高い効率で筋肉細胞または筋肉組織を形質導入し、種々の導入遺伝子の長期間の発現を指示することが示されている。このシステムの柔軟性のために、軽鎖および重鎖抗体遺伝子が単一のｒＡＡＶに組み込まれ得、次いで、抗体を発現するｒＡＡＶがインビボで筋肉を形質導入するのに使用され得ることが企図される。本発明は、形質導入した筋繊維由来の生物学的に活性な抗体ポリペプチドプチドの持続性の発現を企図する。
【００３９】
「筋肉細胞」または「筋肉組織」は、例えば、消化管、膀胱および血管ならびに心臓からの任意の種類の筋肉（骨格筋、平滑筋を含む）由来の細胞または細胞群を意味し、体の任意の領域から切除される。このような筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞および心筋芽細胞）は、分化していても未分化であってもよい。筋肉組織が容易に循環系にアクセス可能であるので、インビボで筋肉細胞および組織により産生および分泌されたタンパク質は、理論的には、全身送達のために血流に入り、それによって、筋肉からの持続性の治療レベルのタンパク質分泌を提供する。
【００４０】
用語「形質導入」は、インビボまたはインビトロのいずれかで、レシピエントの細胞による機能的な抗体ポリペプチドの発現を生じる本発明の複製不全ｒＡＡＶを介する、レシピエントの細胞への抗体ポリペプチドＤＮＡの送達をいうのに使用される。
【００４１】
ＨＩＶ−１に指向する抗体が、ウイルスのレセプターへの結合を阻害することによってウイルスを中和し得ることが知られている。本発明は、ウイルスを中和する抗体ポリペプチドをコードする本発明のｒＡＡＶの有効量をそれを必要とする患者に投与する方法を提供する。本発明に従う中和は、当該分野で公知のインビトロまたはインビボのアッセイによって測定される、主要なウイルス単離体の感染の減少である。複数のアッセイが当該分野で公知である。中和は、以下のうちの１つ以上を包含し得る：ウイルスの細胞上のレセプターとの相互作用をブロッキングするウイルスの表面上の抗原への抗体の結合、補体媒介性のウイルスの溶解および／またはファゴサイトーシスを生じるウイルスの表面上の抗原への抗体の結合、Ｆｃ媒介性のエフェクター系の活性化を生じるウイルスに感染した細胞表面上の抗原への抗体の結合、ならびに抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性の細胞傷害性による感染細胞の溶解／排除、ウイルスの複製の阻害を生じるウイルスに感染した細胞表面上の抗原への抗体の結合、感染細胞からのウイルスの放出の阻害を生じるウイルスに感染した細胞表面上の抗原への抗体の結合、ならびにウイルスの細胞−細胞伝達の阻害を生じる細胞表面上の抗原への抗体の結合。細胞内免疫による中和がまた企図される。さらに、細菌の中和が企図される。
【００４２】
中和は、患者からのウイルスもしくは細菌の排除を生じ得（すなわち、殺菌）、または、ウイルスもしくは細菌によって生じる疾患状態の進行を遅延し得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＨＩＶ−１中和抗体ポリペプチドをコードする本発明のｒＡＡＶの有効量の投与を含み、ＨＩＶ−１に感染した患者のＡＩＤＳへの進行を防ぐ。好ましい方法は、個体において以下のうちの１つ以上を生じる：ウイルス負荷の減少、低ウイルス負荷の維持、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の安定化、日和見感染症の発症または重篤度の減少、悪性腫瘍の発症の減少および細胞媒介性免疫の欠損に代表的な症状の発症または重篤度の減少。上述のものは、当該技術に従って、各々、ＡＩＤＳを進行しているかまたはＡＩＤＳに進行する傾向にある個体と比較される。
本明細書中に記載されるように（実施例５を参照のこと）、有意なレベルのＨＩＶ−１中和活性が、抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２を発現する本発明のｒＡＡＶベクターの単回筋肉内投与後６ヶ月にわたるマウスの血清において見出される。このアプローチは、「免疫」の前に抗体の親和性および特異性を前もって決定させ、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する活性な体液性免疫応答の必要性を回避する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦ１ａ／ＬＣと命名された二重プロモーターのｒＡＡＶゲノムを示す。固有の制限部位を、図の上部に表示する。ゲノム成分を以下のように表示する：「ＨＣ」および「ＬＣ」は、それぞれ重鎖抗体遺伝子および軽鎖抗体遺伝子を示し、「ＣＭＶｐ」はヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサーを示し、そして「Ｉ」はＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロンを示す。抗体リーダー配列を「Ｌ」で表示し、そして「ｐＡ」は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を示す。二次転写ユニットは、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーターを含み、そして、ＨＴＬＶ １型末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の部分を用いて、ＤＮＡおよびＲＮＡの安定性を増強するように改変されている。このプロモーターはまた、Ｉ１１７イントロンを含み、これは、プラスミドｐＧＴ６２ＬａｃＺ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ Ｉｎｃ．）由来である。軽鎖ポリアデニル化部位はＳＶ４０由来である。
【図２】図２は、ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー（「ＣＭＶ」と表す）、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン（「ＳＶ４０ ｓｄ／ｓａ」）、Ｘ５重鎖可変領域コード配列（「ＶＨ」）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー（「ｌｉｎｋｅｒ」）、Ｘ５軽鎖可変領域コード配列（「ＶＬ」）およびＳＶ４０ポリアデニル化部位（「ＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ」）を含む遺伝子カセットを含むｒＡＡＶ／Ｘ５ゲノムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
（詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を例示する。実施例１は、抗体ポリペプチド発現のための二重プロモーターのｒＡＡＶの構築を記載し、実施例２は、ｒＡＡＶ産生を記載し、実施例３は、ｒＡＡＶを形質導入したマウスにおける循環ＩｇＧ１の産生を記載し、実施例４は、筋肉由来のＩｇＧ１ｂ１２によるＨＩＶ−１の中和活性を記載し、そして、実施例５は、筋肉におけるｒＡＡＶの残留性およびＩｇＧ１ｂ１２の産生を記載する。実施例６は、抗体ポリペプチド発現のための単一プロモーターのｒＡＡＶの構築を記載し、実施例７はマカクへのｒＡＡＶ投与を記載し、そして、実施例８は、ヒトへのｒＡＡＶ投与を記載する。実施例９は、ウイルス感染に有用なもの以外の抗体ポッリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む、本発明において有用なｒＡＡＶを記載する。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
（抗体発現のための二重プロモーターのｒＡＡＶの構築）
標的筋肉細胞内に効率のよい抗体発現を達成するために、二重プロモーターのｒＡＡＶを構築して、同じ形質導入した細胞内に重鎖および軽鎖タンパク質の、最適な同時発現を生じた。図１に示すように、得られた二重プロモーターのｒＡＶＶは以下の特徴を有した：（１）ｒＡＡＶベクター（ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびヒトＥＦ１−αプロモーター）において、骨格筋内で活性な２つの構成的プロモーター；（２）ベクターに組み込まれ、プロモーターエレメントまたは重鎖および軽鎖コード配列の迅速な置換を可能にする、いくつかの固有の８塩基対制限酵素部位；（３）ＩｇＧ１ｂ１２の重鎖および軽鎖のリーダーペプチド配列に指向性の変異誘発を行い、インフレームの抗体遺伝子クローニングを促進する固有の制限部位（重鎖リーダーについてＭｌｕＩ、そして軽鎖リーダーについてＢｓｓＨＩＩ）を導入した；（４）ＲＴ−ＰＣＲによりＩｇＧ１ｂ１２重鎖イントロンを取り除き、ベクターサイズを減らし、野生型ＡＡＶのパッケージング制限内に残す；ならびに（５）可能性のあるプロモーター干渉を減少するための第１の発現カセットの３’側の強力な転写終止部位。最近、安定な産生細胞株アプローチ（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１，１９９５）を用いて、高力価のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ベクター産生を可能にするために、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２プラスミドベクター配列を、以前に記載されたように、またＡＡＶ−２ ｒｅｐ−ｃａｐヘルパー配列およびネオマイシン耐性遺伝子を有する、３部からなる長いプラスミド（ｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１，１９９５）にクローニングした。次いで、この３部からなるプラスミドを用いて、最適なＨｅＬａベースのｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２産生細胞株（ＣＥ７１）を作製した。
【００４６】
ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２の軽鎖および重鎖に対するコード配列は、プラスミドｐＤＲ１２由来であり、本明細書中でそれぞれ配列番号１４および１６にて示す。ＩｇＧ１ｂ１２の重鎖および軽鎖に対する得られたアミノ酸配列を、本明細書中で、それぞれ配列番号１５および１７として示す。ＩｇＧ１ｂ１２およびプラスミドｐＤＲ１２の単離は、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７，１９９１およびＳｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０２４−１０２７（１９９４）に記載されている。
【００４７】
続いて、二重プロモーターのｒＡＡＶクローニングプラスミドｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を以下のようにして構築した。まず、プラスミドｐＣＭＶ／β（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＰｓｔＩで消化して２．７ｋｂのベクタープラスミドＤＮＡフラグメントを単離し、自己同士で再度連結し、アンピシリン耐性ベクター（ｐＢ）を作製した。次いで、ＰＣＲを用いて、プラスミドｐＣＭＶ／Ｐ由来のｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０イントロン（８０８ｂｐ）を増幅し、ＰＣＲを以下のプライマーを用いて実施した：ＣＭＶ 順方向：ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧ（配列番号１）；ＣＭＶ 逆方向：ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＡＧ（配列番号２）。
【００４８】
得られたフラグメントをプラスミドｐＢの固有のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣＭＶを作製した。これらのプライマーを、ＥｃｏＲＩ部位が５’末端および３’末端で固有のＰａｃＩおよびＳｒｆＩ部位に隣接するように設計した。その後、ＰＣＲを用いて、プラスミドｐＧＴ６２ｌａｃＺ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）を鋳型として、それぞれ以下のプライマーを用いて、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（１９０ｂｐ）およびＥＦ１−αプロモーター（７７０ｂｐ）を、別々に増幅した：ＢＧＨ 順方向：ＴＴＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴ（配列番号３）；ＢＧＨ 逆方向：ＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＣ（配列番号４）；ＥＦ１ 順方向：ＴＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡ（配列番号５）；ＥＦ１ 逆方向：ＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＣ（配列番号６）。その後、得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩで消化し、再度連結して、ＢＧＨ 順方向プライマーおよびＥＦ１−α逆方向 プライマー（配列番号３および６）を用いて、第２ラウンドのＰＣＲを行い、単一のＤＮＡフラグメントを生成した。これらのプライマーは、それぞれ、５’のＳｒｆＩ部位ならびに３’のＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｗａＩおよびＰｓｔＩ部位を組み込んだ。この９６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを固有のＳｒｆＩおよびＰｓｔＩ部位でプラスミドｐＣＭＶに一方向でクローニングした。得られたプラスミド（ｐＣＭＶ／ＥＦ１）は、ここで、ＢＧＨポリアデニル化部位を有するＣＭＶプロモーターおよび、引き続くＥＦ１−αプロモーターを保有した。
【００４９】
ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（プラスミドｐＧＴ６２ｌａｃＺから単離した）を含む２７０塩基対のＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＣＭＶ／ＥＦ１のＥｃｏＲＩ／Ｓｗａ Ｉ部位に直接クローニングして、ｐＣＭＶ／ＥＦ１ａを得た。プラスミドｐＤＲ１２および単離した総ＲＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換して、ＩｇＧ１ｂ１２重鎖ｃＤＮＡ（１，４６３ｂｐ）を単離した。ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供し、以下のプライマーを用いてｐＺｅｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした：重鎖ｃＤＮＡ 順方向：ＴＡＣＴＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号８）；重鎖ｃＤＮＡ 逆方向：ＴＡＣＴＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号９）。これらのプライマーは、隣接するＳｒｆＩ部位を組み込み、この部位は、プラスミドｐＣＭＶ／ＥＦ１ａの固有のＳｒｆＩ部位へのＩｇＧ１ｂ１２重鎖のクローニングを容易にした。プラスミドｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦｌａを得た。ＩｇＧ１ｂ１２κ軽鎖遺伝子をプラスミドｐＤＲ１２から直接ＰＣＲで増幅し、７２０ｂｐの生成物を以下のプライマーを用いてプラスミドｐＺｅｒｏにクローニングした：軽鎖 順方向：ＣＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧ（配列番号９）；軽鎖 逆方向：ＣＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴ（配列番号１０）。軽鎖プライマーは、隣接するＡｖｒＩＩ制限部位を組み込み、この部位は、κ軽鎖をプラスミドｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦ１ａのＡｖｒＩＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦ１ａ／ＬＣを生じるのに使用された。
【００５０】
次いで、部位指向性の変異誘発を用いて重鎖リーダーペプチド配列に固有のＭｌｕＩ制限部位を導入し、同じストラテジーを用いて軽鎖リーダーペプチド配列にＢｓｓＨＩ部位を導入した。次いで、二重発現カセットを４．５ｋｂのＰａｃＩ／ＳｒｆＩ ＤＮＡフラグメントとして単離し、プラスミドｐＡＡＶ／３−ｇａｌ／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋ（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３２９−１３４１，１９９５）のＡＡＶ ＩＴＲの間にクローニングし、ｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋを作製した。この３部からなるプラスミドは、ネイティブのｒｅｐ−ｃａｐ ＡＡＶヘルパー配列ならびに安定な細胞株選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を含む。
【００５１】
プラスミドｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋおよびｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２のヒトＩｇＧ抗体を産生する能力は、いくつかの形質転換した細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７およびＣ２Ｃ１２）を用いてインビトロでまず確認された。当該分野で標準の方法を用いたプラスミドトランスフェクションまたはｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２形質導入の後、細胞培養上清を、製造業者の指示に従って、１ヒトＩｇＧサブタイプ１ ＥＬＩＳＡ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いて分析した。このアッセイの感度は、２．９ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧである。このアッセイは、細胞培養上清が検出可能なレベルのヒトＩｇＧを含むことを決定した。
【００５２】
（実施例２）
（ｒＡＡＶ産生）
ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を産生して、当該分野で公知の方法を用いて精製した（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１０３１−１０３９，１９９９；Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３２９−１３４１，１９９５）。簡単には、産生細胞株（ＣＥ７１）を単離し、その後、ＨｅＬａ細胞をプラスミド ｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋでトランスフェクションし、引き続いてＧ４１８（７００μｇ／ｍｌ）で薬剤選択した。２００個の別々の細胞株をスクリーニングし、その後、野生型のアデノウイルス５型（ｍｏｉ＝２０）を感染させ、ＣＥ７１を、細胞あたりの最も高いＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）を産生するものとして同定した（１０４ ＤＲＰ／細胞）。大規模のベクター産生のために、１０１０個のＣＥ７１細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｃｕｂｅ接着細胞バイオリアクター中で増殖させ、引き続いて、野生型のＡｄ５（ｍｏｉ＝２０）で感染させた。アデノウイルスのＣＰＥ（７２時間）の発生の後、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を、以前に詳述されたようにヘパリンクロマトグラフィーを用いて粗ＣＥ７１細胞溶解物から精製した（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１０３１−１０３９，１９９９）。Ｃｌａｒｋら、１９９９に詳述されるように、Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｔａｑｍａｎ配列決定検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するリアルタイムＰＣＲ法によって精製したｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２について、ＤＲＰの力価を決定した。ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の定量に使用したプライマーおよび蛍光プローブセットは以下の通りである；ＣＭＶ 順方向プライマー：５’−ＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡ−３’（配列番号１１）、ＣＭＶ 逆方向プライマー：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧ−３（配列番号１２）’、およびプローブ、５−ＦＡＭ−ＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号１３）。
【００５３】
感染性のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の力価は、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ストックの限界希釈およびアデノウイルスの存在下でのｒｅｐ−ｃａｐ発現細胞株（Ｃ１２）の感染を使用して決定した。終点力価決定を、以前に記載されたように、Ｃ１２細胞において複製するｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムの定量的ＰＣＲ検出に基づいて行った（Ｃｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２，１９９６）。これらの実験に用いたｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の算出したＤＲＰ 対 ＩＵ比は２８：１であった。
【００５４】
（実施例３）
（ｒＡＡＶで形質導入したマウスにおける循環ＩｇＧ１の産生）
免疫不全のＲａｇＩマウスの、両方の大腿四頭筋にｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を接種した。Ｒａｇｌマウスを用いて抗ヒトＩｇＧ応答を回避した。
【００５５】
全ての実験をＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って実施した。６週齢のＲａｇ−１マウス（Ｃ．１２９Ｓ７（Ｂ６）−Ｒａｇ１ｔｍｌＭｏｍ）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、ミクロアイソレーターバリアの入れ物内に収容した。この研究は、１６匹の動物からなった：６匹は５×１０１１のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）を受け；６匹は、５×１０１０のＤＲＰを受け；２匹はβ−グルクロニダーゼを発現する無関係のｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ／ＧＵＳ、４×１０１１ＤＲＰ）を受け；そして、２匹にはＰＢＳ賦形剤を与えた（ベクターＤＮＡ分析のみのために使用した）。
【００５６】
チレタミンＨＣｌ／ゾレザパムＨＣｌ（Ｔｅｌａｚｏｌ，Ｆｔ．Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）を筋肉内注射してマウスを麻酔にかけた。大腿にわたって５ｍｍの皮膚切開を行い、５０μｌのウイルス顕濁液またはＰＢＳを、２８ゲージ針を用いて、筋肉の長軸に沿って大腿四頭筋に注射した。注射手順に起因する副作用は、いずれのマウスにおいても特筆すべきものでなかった。麻酔下で後眼窩洞から血液サンプルを採取した。屠殺するときに、大腿四頭筋全体を摘出して、横断面に沿って二等分し、非架橋固定液（Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ，Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）で半分を固定してパラフィンで包埋し、他の半分を、後のＤＮＡ分析のために液体窒素で急速凍結した。脛骨の外側の筋肉をコントロール組織として採取した。
【００５７】
全ての生存している１１匹のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２マウスにおいて、接種後６週間でヒトＩｇＧ１を検出した；１匹は無関係の原因で２週間で死亡した。平均すると、高用量のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を受けた動物は、低用量を受けた動物よりも７〜２８倍高いＩｇＧ１を有した。最大ＩｇＧ１濃度は、注射後１２週で観察され、次いで、先の３ヶ月にわたってプラトーに達した。高用量の動物の血清の大部分は、常に４〜５μｇ／ｍｌの間のヒトＩｇＧ１を有し、最大レベルは８μｇ／ｍｌを超えた。低用量の群において、抗体レベルは、ベクターの接種後２０週間、増加し続け、０．５〜１．０μｇ／ｍｌの範囲の循環抗体レベルを有した。
【００５８】
いくつかの血清をまた、抗ＨＩＶ ｇｐ１２０終点ＥＬＩＳＡ力価を決定するためにアッセイした。抗ＨＩＶ ｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡを、以下のようにして実行した。Ｉｍｍｕｌｏｎ ４免疫アッセイプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、４℃で１６時間、炭酸塩緩衝液（ＢｕｐＨ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中に希釈したチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で産生した組換えＨＩＶ−１ＬＡｌ ｇｐ１２０でコートした（１００ｎｇ／ウェル）。抗原を除去し、ウェルをＢｌｏｔｔｏ（１×ＰＢＳ中５％のスキム乾燥ミルク ｐＨ７．４）中１％の正常ヤギ血清を用いて、２５℃で１時間ブロッキングした。マウス血清をＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００に希釈して、３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００に浸漬することで５回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ ＨＲＰ結合体化２次抗体（１：５，０００）を１時間添加した（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。比色定量（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質である３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、３０分後に１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止した。両方のＥＬＩＳＡアッセイを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＨＴＳ ７０００プレートリーダーにて４５０ｎｍで読んだ。終点力価をＯＤ４５０値を得る血清希釈の逆数を取って導き、この値は、対応する抗原を含まないコントロールのウェルよりも少なくとも２倍高かった。
【００５９】
１６週で４倍より高い用量を受けた動物から採取した血清の限界希釈は、終点力価が１：８００〜１：３，２００の範囲であることを明らかにした。これらのデータは、筋肉がｇｐ１２０結合特異性を保持するＩｇＧ１ｂ１２を分泌することと一致した。
【００６０】
（実施例４）
（筋肉由来のＩｇＧ１ｂ１２はＨＩＶ−１を中和する）
ＩｇＧ１およびｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡのデータがインビボでの抗体発現を確認したが、これらのアッセイは、分泌されたＩｇＧ１ｂ１２がＨＩＶ−１を中和する能力を保持するかどうかには取り組んでいなかった。したがって、６匹の高用量の動物からの２０週の血清サンプルを、ＭＴ−２細胞殺傷アッセイを用いてＴＣＬＡ株ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに対する中和活性について分析した。これらのアッセイは、Ｆｉｎｔｅｒニュートラルレッドを利用し、Ｈｅｒｚｏｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５８０４−５８０９，１９９７に記載されるように生存細胞を定量した。力価を５０％の細胞がウイルス誘導性の殺傷から保護される血清希釈の逆数として報告した。この５０％終点は、このアッセイにおけるｐ２４ Ｇａｇ抗原合成の９０％以上の減少に一致する（Ｂｕｒｅｓら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：２０１９−２０３５，２０００を参照のこと）。ＳＨＩＶ−８９．６の中和を、マイトジェンで刺激したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、Ｂｕｒｅｓら（前出）に記載されるｐ２７ Ｇａｇ抗原合成の減少を用いて測定した。ウイルスストックをＨ９細胞（ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ）またはヒトＰＢＭＣ（ＳＨＩＶ−８９．６）のいずれかで作製した。
【００６１】
６匹中５匹の動物からの血清は、以下の表１に記載するように検出可能な中和活性を有した。
【００６２】
（表１．ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに対する血清の中和力価）
【００６３】
【表１】
ａ 各マウスに、四頭筋に単一用量（５×１０１１ＤＲＰ）のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を与えた。
【００６４】
ｂ 抗体媒介性の中和を、ＭＴ−２細胞殺傷性アッセイにおいて測定した。力価は、５０％の細胞がウイルス誘導性の殺傷から保護される血清希釈の逆数であり、これは、ｐ２４ Ｇａｇ抗原合成の９０％以上の減少に一致する。
【００６５】
ｃ 観察された中和力価を達成するために必要な精製ＩｇＧ１ｂ１２の濃度。
【００６６】
ｄ 血清におけるヒトＩｇＧ１の実際の濃度。
【００６７】
これらのデータを拡張するために、ほぼ最初の（ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ）ＨＩＶ−１単離体（ＨＩＶ８９．６ｅｎｖを含むＳＨＩＶ−８９．６）を中和する、マウス血清の能力もまた試験した。注射後１６、２０および２４週に、中和活性を血清プールで観察した（表２）；用量が有限であるので、血清をプールした。これらのデータは、筋肉起源のＩｇＧ１ｂ１２がＴＣＬＡおよび最初のＨＩＶ−１単離体の両方を中和する予想された能力を保持することを示した。
【００６８】
（表２．ＳＨＩＶ ８９．６に対する血清の中和力価）
【００６９】
【表２】
ａ マウスＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３、ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３由来の血清からなる、前免疫（時間０）されたプール。これらの同じマウス由来の血清を、示された回収日（注射後１６週、２０週または２４週）でプールした。全てのプールを１：４希釈でアッセイした。
【００７０】
ｂ ｐ２７抗原における減少％を血清の不在下でのｐ２７合成の量に対して計算した。
【００７１】
（実施例５）
（筋肉におけるｒＡＡＶベクターの残存性およびタンパク質生成）
筋肉が抗体産生部位であったという証拠を得るために、接種後２４週で摘出した筋肉組織において、ｒＡＡＶゲノムの残存性およびヒトＩｇＧタンパク質の発現をアッセイした。ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ベクターＤＮＡの残存性を、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて分析した。各動物からの約５０％の左右の四頭筋をゲノムＤＮＡ単離のために用い、ＣＭＶプロモーターに特異的なＰＣＲプライマー／プローブ対を用いるＴａｑｍａｎ ＰＣＲに供した。表３に示すように、全ての接種された筋肉組織は、かなりのレベルのベクターＤＮＡを保有し、これは、核あたり０．４〜１０コピーの間の範囲であった。平均すると、高用量を受けていた動物からの筋肉は、低用量の動物からの筋肉と比較して、筋肉あたり５倍多いベクターＤＮＡを保有した。
【００７２】
（表３． マウスの筋肉におけるベクターＤＮＡの残存性）
【００７３】
【表３】
ａ 用量はＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）として測定される；材料および方法を参照のこと。
【００７４】
ｂ 値は、ｒＡＡＶ注射後の四頭筋において観察される核あたりのｒＡＡＶゲノムの平均を示す。６０ｎｇの筋肉ＤＮＡ（１０，０００核当量）を、ＣＭＶプライマー／プローブセット（配列番号１および２）を用いる定量的Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲによって分析した。全てのサンプルを、注射後２４週で摘出した。
【００７５】
接種された筋肉内のインサイチュ抗体発現を示すために、ヒトＩｇＧ１についての免疫ペルオキシダーゼ染色を、パラフィン包埋した筋肉組織について行った。ヒトＩｇＧ１重鎖（Ｆｃ特異的）検出のための筋肉組織を、連続薄切し（６μｍ）、連続的なエタノール浴を伴うＡｍｅｒｉｃｌｅａｒ中にて脱パラフィンし、引き続いて、１×ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。まず、組織切片を製造業者の指示書に従って、Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｃｉｔｒａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を用いて処理し、次いで、Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｃｋ試薬（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を用いて１０分間ブロッキングした。１：１００希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ抗血清（ＤＡＫＯ，Ａ０４２４）を切片とともに４℃で１８時間インキュベートした。十分に洗浄した後、ビオチン化抗ウサギ二次抗体（１：１００希釈；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、３０分間インキュベートした。製造業者の指示書に従ってアビジン／ビオチン−ペルオキシダーゼ結合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて抗原を可視化した。ＡＥＣペルオキシダーゼ基質（ＤＡＫＯ）中で５分間切片をインキュベートして発色させた。
【００７６】
全ての高用量動物は、分泌されたタンパク質のＥＲ／ゴルジ局在化に一致する特定の筋繊維の明らかな、しばしば点状の免疫染色を示した。コントロールのｒＡＡＶ／ＧＵＳ四頭筋組織は、ヒトＩｇＧ１の存在についてネガティブであった（動物ＲＦ１、ＲＦ２）。
【００７７】
（実施例６）
（抗体発現のための単一プロモーターのｒＡＡＶの構築）
ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン、Ｘ５重鎖可変領域コード配列、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー、Ｘ５軽鎖可変領域コード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む遺伝子カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含むｒＡＡＶゲノムを、標準のＤＮＡ操作技術を用いて構築した。この遺伝子カセットは、１本鎖のＸ５抗体ポリペプチド（ＳｃＦｖＸ５）をコードした。図２を参照のこと。ＡＡＶ ＩＴＲを、ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８，１２４８０１２５４，２００１に記載されるように改変し、ｒＡＡＶゲノムを２本鎖の自己相補性ＤＮＡとしてウイルス粒子にパッケージングさせた。
【００７８】
遺伝子カセットのＳｃＦｖＸ５を産生する能力を、インビトロにてＨｅＬａ細胞を用いて確認した。この遺伝子カセットを、裸のＤＮＡとしてＨｅＬａ細胞に一過的にトランスフェクトした。ＳｃＦｖＸ５をトランスフェクトされた細胞によって産生し、当該分野の標準的な方法によってＨＩＶ−１ ｇｐ１２０に結合することを示した。
【００７９】
ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを、ＡＡＶ血清型１キャプシドにパッケージングすること以外は、本質的に上記の実施例２に記載した方法によってパッケージングし、次いで、精製した。得られたｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５を、上記実施例３、４および５に記載したマウスモデルにおいて、および、以下の実施例６に記載するマカクモデルにおいて試験し得る。
【００８０】
（実施例７）
（マカクへのｒＡＡＶ投与）
マカクサルのＳＩＶでの感染は、ＡＩＤＳ様疾患を誘導し得る。これらの感染された動物は、ヒトのＨＩＶ−１での感染およびヒトにおけるＡＩＤＳの発症についてのモデルとして使用され得る。特に、ＳＩＶウイルスに感染したマカクは、ヒトのＡＩＤＳに特徴的な症状（例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の枯渇、日和見感染症、神経性疾患および悪性腫瘍などの発症）を発症する。さらに、ＳＩＶは、投与経路（例えば、経直腸および経膣）によって動物に感染し得、ヒトにおいてＨＩＶの伝染を再生する。例えば、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＳＴＤ ＆ ＡＩＤＳ，９（補遺１）：３−７（１９９８）を参照のこと。従って、ＳＩＶ／マカクモデルは、ＡＩＤＳワクチンの開発および単為生殖に関する主要な動物モデルである。例えば、Ｈｏら、Ｃｅｌｌ，１１０：１３５−１３８（２００２）（サルの実験で用いられたストラテジーの成功が、「多数の候補ワクチンを治験に駆り立てた」ことを考察している）を参照のこと。ｇｒａｎｔｓ１．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｒａｎｔｓ／ｇｕｉｄｅ／ｒｆａ−ｆｉｌｅｓ／ＲＦＡ−ＭＨ−９９−００９．ｈｔｍｌ（１９９９年１月２９日）（「ヒトのＡＩＤＳが神経病を発症させることの根底にあるメカニズムを解読および理解を補助するためのＡＩＤＳのＳＩＶモデルの重要性」を考察している）もまた参照のこと。
【００８１】
さらに、サルにおけるチャレンジ研究が、免疫不全ウイルスおよび／またはウイルスの感染から生じる疾患に対する保護を確立するため、そして、ワクチンまたはワクチンの概念がヒトにおける用途に対しての見込みを有するか否かを確立する手段として使用され得る。Ｓｃｈｕｌｔｚ、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１４（３）：Ｓ２６１−Ｓ２６３（１９９８）を参照のこと。
【００８２】
従って、マカクモデルは、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２および／または他のＨＩＶ−１中和抗体をコードするｒＡＡＶの投与の有利な効果を確証するために使用され得る。例えば、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２は、チャレンジＨＩＶ−１ウイルス（例えば、ＳＩＶｓｍ／Ｅ６６０（通常用いられるチャレンジウイルス以外の、よりストリンジェントなチャレンジを提示するマカクにおいてよりＡＩＤＳ様疾患を誘導するウイルス株））での感染の前、または感染後に、マカクへ１回以上の筋肉内注射によって投与される。中和抗体レベルをＰｏｌａｃｉｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（１０）：８２０１−８２１５（１９９９）に記載されるように、種々の時点で測定する。
【００８３】
ｒＡＡＶの投与は、ＳＩＶに曝露したマカクにおいて、以下のうちの１つ以上を生じる：ウイルス負荷の減少、低ウイルス負荷の維持、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の安定化、日和見感染症の発症または重篤度の減少、悪性腫瘍の発症の減少、および細胞媒介性免疫の欠損に代表的な症状の発症または重篤度の減少。上述のものは、当該技術に従って、各々、ＡＩＤＳ様疾患が進行しているか、またはＡＩＤＳ様疾患を進行する傾向にあるマカクと比較する。
【００８４】
（実施例８）
（ヒトへのＨＩＶ−１抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶの投与）
ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５、他のＨＩＶ−１抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ（または、以下の２つ以上の混合物）を、ＨＩＶ−１による感染に感受性の個体または、ＨＩＶ−１により感染した個体に投与され、ＡＩＤＳの進行を防ぐかまたは遅延する。
【００８５】
例えば、１回以上のｒＡＡＶの筋肉内注射が個体に投与される。ｒＡＡＶによってコードされる抗体ポリペプチドの産生レベルを、当該分野の標準的な技術によってモニタリングする。ＡＩＤＳに進行する可能性を、当該分野で標準的な技術による、ＨＩＶ−１ウイルス負荷およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の測定によりモニタリングする。ウイルス負荷が高いほど、個体はＡＩＤＳを発症する傾向が高い。ＣＤ４陽性Ｔ細胞のカウントが少ないほど、個体がＡＩＤＳを発症する傾向が高い。
【００８６】
ｒＡＡＶの投与は、ＨＩＶ−１に感染した場合の個体において、以下のうちの１つ以上を生じる：ウイルス負荷の減少、低ウイルス負荷の維持、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の安定化、日和見感染症の発症または重篤度の減少、悪性腫瘍の発症の減少、および細胞媒介性免疫の欠失の代表的な状態の発症または重篤度の減少。上述のものを、当該技術に従って、各々、ＡＩＤＳが進行しているかまたはＡＩＤＳに進行する傾向にある個体と比較する。
【００８７】
（実施例９）
（他の抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ）
他のｒＡＡＶ（例えば、同種移植拒絶のための抗体ポリペプチドＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ
ＯＫＴ３、ＰＣＴＡ補助剤としてのＲｅｏＰｒｏ、非ホジキンリンパ腫のためのＲｉｔｕｘａｎ、臓器拒絶のためのＳｉｍｕｌｅｃｔ、慢性関節性リウマチおよびクローン病のためのＲｅｍｉｃａｄｅ、臓器拒絶のためのＺｅｎａｐａｘ、ＲＳＶ感染のためのＳｙｎａｇｉｓ、転移性乳癌のためのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、急性骨髄性白血病のためのＭｙｌｏｔａｒｇ、慢性リンパ球白血病のためのＣａｍｐａｔｈ、非ホジキンリンパ腫のためのＺｅｖａｌｉｎおよび慢性関節性リウマチのためのＨｕｍｉｒａをコードするｒＡＡＶ）を、本明細書中に記載される方法に従って、作製および使用し得る。これらは、記された感染または疾患状態のためのヒトの用途に適用され得る。
【００８８】
本発明は、特定の実施形態観点から記載されているが、変更および改変が想起されることが当業者に理解される。従って、添付の特許請求の範囲に見えるような限定のみが、本発明に対して決定され得るべきである。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年４月９日に出願された米国仮出願番号６０／３７１，５０１の一部継続である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般には遺伝子送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用に関し、より具体的には、哺乳動物における標的細胞への抗体遺伝子を送達するためのｒＡＡＶの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製不全のパルボウイルスであり、その１本鎖ＤＮＡゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）の１４５ヌクレオチドを含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）に示されており、Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：３３８５−３３９２（１９９４）によって訂正されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージングおよび宿主細胞の染色体組込みを指示するシス作動性配列は、ＩＴＲの範囲に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（ｐ５、ｐ１９およびｐ４０（その相対的なマップ位置にちなんで名付けられる））は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７）の差次的なスプライシングと相まって、この２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）の産生を生じる。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、この遺伝子は、３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする。選択的スプライシングおよびコンセンサスでない翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位がＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）において総説されている。
【０００４】
野生型のＡＡＶがヒト細胞に感染すると、ウイルスゲノムが１９番染色体に組み込まれ、細胞の不顕性感染を生じ得る。細胞がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）に感染するまで、感染性ウイルスの産生は生じない。アデノウイルスの場合、遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡがヘルパー機能を提供する。ヘルパーウイルスに感染すると、ＡＡＶプロウイルスがレスキューおよび増幅され、ＡＡＶとアデノウイルスの両方が産生される。
【０００５】
ＡＡＶは、免疫原性ペプチド／ポリペプチドを発現するためのワクチンベクターとして、および、例えば、遺伝子治療において、外因性のＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして、ＡＡＶを魅力的にする独特の特性を保有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の天然の感染は、静的であり、無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボにおいて多くの異なる組織を標的化する可能性を提供する。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞にゆっくりと形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として、本質的にはこれらの細胞の寿命の間持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローニングされたＤＮＡとして感染性であり、このことは、組換えゲノムの構築物を実現可能にする。さらに、ＡＡＶの複製、ゲノムのキャプシド形成および組み込みを指向するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内側約４．３ｋｂ（複製キャプシドタンパク質および構造キャプシドタンパク質（ｒｅｐ−ｃａｐ）をコードする）のいくらかまたは全てが、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む、遺伝子カセットのような外来ＤＮＡで置換され得る。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、ＡＡＶが非常に安定かつ頑強なウイルスであるということである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するのに用いられる条件（５６〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ｒＡＡＶベクターの定温保存をより重要でなくする。ＡＡＶは、凍結乾燥さえされ得る。最後に、ＡＡＶが感染した細胞は、多重感染に抵抗性でない。
【０００６】
ＨＩＶ−１は、米国において後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であると考えられている。世界保健機構によって評価されたように、４千万人以上が現在ＨＩＶに感染しており、２千万人がすでにＡＩＤＳで死亡している。従って、ＨＩＶ感染は、世界規模の流行病であると考えられる。
【０００７】
現在認識されている２つのＨＩＶ株（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）が存在する。ＨＩＶ−１は、世界中でＡＩＤＳの主要な原因である。ＨＩＶ−１は、ゲノム配列変化に基づいてクレードに分類されている。例えば、クレードＢは、北米、ヨーロッパ、南米の一部およびインドで最も優勢であり；クレードＣは、サハラ以南のアフリカにおいて最も優勢であり；そして、クレードＥは、東南アジアにおいて最も優勢である。ＨＩＶ−１感染は、主に、性的感染、母子感染、または汚染された血液もしくは血液製剤への曝露を通じて生じる。
【０００８】
現在認識されている２つのＨＩＶ株（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）が存在する。ＨＩＶ−１は、世界中でＡＩＤＳの主要な原因である。ＨＩＶ−１は、ゲノム配列変化に基づいてクレードに分類されている。例えば、クレードＢは、北米、ヨーロッパ、南米の一部およびインドで最も優勢であり；クレードＣは、サハラ以南のアフリカにおいて最も優勢であり；そして、クレードＥは、東南アジアにおいて最も優勢である。ＨＩＶ−１感染は、主に、性的感染、母子感染、または汚染された血液もしくは血液製剤への曝露を通じて生じる。
【０００９】
ＨＩＶ−１は、ウイルス構造タンパク質および酵素の内部コア、ならびにウイルスの複製に必要とされるタンパク質、および２つの同一の直鎖状ＲＮＡのゲノムを取り囲む脂質エンベロープからなる。脂質エンベロープにおいて、ウイルス糖タンパク質４１（ｇｐ４１）が、ウイルス表面から延びて、感受性細胞の表面上レセプターと相互作用する別のウイルスエンベロープ糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）を係留する。ＨＩＶ−１ゲノムは、約１０，０００ヌクレオチドのサイズであり、９つの遺伝子を含む。ＨＩＶ−ゲノムは、全てのレトロウイルスに共通の３つの遺伝子（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子）を含む。ｇａｇ遺伝子は、コア構造タンパク質をコードし、ｅｎｖ遺伝子はｇｐ１２０およびｇｐ４１エンベロープタンパク質をコードし、そして、ｐｏｌ遺伝子はウイルスの酵素である逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼおよびプロテアーゼ（ｐｒｏ）をコードする。ゲノムは、ウイルスの複製に必須の２つの他の遺伝子である、ウイルスプロモータートランスアクチベーターをコードするｔａｔ遺伝子および、また、遺伝子の転写を促進するｒｅｖ遺伝子を含む。最後に、ｎｅｆ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子およびｖｉｆ遺伝子は、レンチウイルスに固有であり、Ｔｒｏｎｏ，Ｃｅｌｌ，８２：１８９−１９２（１９９５）に記載される機能のポリペプチドをコードする。
【００１０】
ＨＩＶ−１がヒト細胞に感染するプロセスは、ウイルスの表面上タンパク質と細胞の表面上タンパク質との相互作用を含む。一般的な理解は、ＨＩＶ感染の最初の段階が、ＨＩＶ−１の糖タンパク質（ｇｐ）１２０の細胞ＣＤ４タンパク質への結合であるということである。この相互作用は、ウイルスｇｐ１２０に立体構造の変化を生じさせ、他の細胞表面タンパク質（例えば、ＣＣＲ５タンパク質またはＣＸＣＲ４タンパク質）に結合し、ウイルスの細胞との引き続く融合を可能にする。従って、ＣＤ４は、ＨＩＶ−１に対する主要なレセプターとして記載されており、一方で、他の細胞表面タンパク質がＨＩＶ−１に対するコレセプターとして記載されている。
【００１１】
ＨＩＶ−１感染は、ウイルス感染とＡＩＤＳの発症との間の無症候性の期間により特徴付けられる。ＡＩＤＳへの進行速度は、感染した個人間で異なる。ＡＩＤＳは、ＣＤ４陽性細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞および単球／マクロファージ）が感染され、そして消耗されると発症する。ＡＩＤＳは、日和見感染症、悪性腫瘍の危険の増加および細胞媒介性免疫の欠失に代表的な他の症状として顕性化する。Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの小児、青年および成人の疾患の臨床分類は、ＳｌｅａｓｍａｎおよびＧｏｏｄｅｎｏｗ，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１（２）：Ｓ５８２−Ｓ５９２（２００３）の表Ｉに示される。
【００１２】
ＡＩＤＳへの進行の可能性の予測は、ウイルス負荷（ウイルスの複製）のモニタリング、および感染した個体におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の測定を包含する。ウイルス負荷が高いほど、個人はよりＡＩＤＳを発症する可能性が高い。ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が低いほど、個人がＡＩＤＳを発症する可能性が高い。
【００１３】
現在、抗レトロウイルス薬物療法（ＡＲＴ）は、ＨＩＶ感染を処置するか、または１個人から別の個人へのＨＩＶ−１の伝染を防ぐ唯一の手段である。せいぜい、ＡＲＴを用いてさえ、ＨＩＶ−１感染は、一生の薬物療法を必要とする慢性状態であり、疾患へのゆっくりとした進行がなお存在し得る。ウイルスが不顕性の保有者において持続し得るため、ＡＲＴは、ＨＩＶ−１を根絶しない。さらに、処置レジメンは、毒性であり得、毎日複数の薬物を使用しなければならない。従って、ＨＩＶ−１感染に対する有効なワクチンおよび処置を開発する緊急の必要性が存在する。
【００１４】
過去数年にわたって、ＨＩＶ感染に対する安全かつ有効なワクチンに向って進歩がなされており、複数のアプローチが動物モデルおよびヒトにおいてとられている。ワクチン候補物の多くは、測定可能かつ有意な抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発した。対照的に、ワクチン候補の多くは、ＨＩＶ−１の重要な単離体を広く中和する血清抗体を誘導できない。従って、このような抗体がＨＩＶ−１感染および疾患に対する重要な保護であると考える場合、現在のＨＩＶ−１ワクチン候補物の設計には重大なギャップが残る。
【００１５】
エンベロープ免疫原でのワクチン接種後の中和抗体の誘導の欠落を説明するために、いくつかの仮説が提示される。まず、誘発された抗エンベロープ抗体のほとんどが、成熟したオリゴマーエンベロープ複合体を認識せず、むしろプロセシングされていないｇｐ１６０前駆体または単量体のｇｐ１２０に結合する。このことは、部分的に、成熟したエンベロープスパイクの三量体構造に起因し、この構造は、低い固有免疫原性の分子を生じる。露出された表面ドメインの伸長性のグリコシル化は、スパイクの重要な部分を非免疫原性にし、分子のいわゆる「静的表面」を生じる。第２に、三量体部分のコンパクトな構造は、三量体のコアの内部に位置されるタンパク質エピトープの抗体認識と立体的に干渉する。重要なことには、これらの同じエピトープが、プロセシングされていないｇｐ１６０前駆体または単量体のｇｐ１２０タンパク質上に容易に露出され、タンパク質の非中和化表面にマッピングされる。結果として、広範なクレードにまたがる様式で主要なウイルス単離体を中和する、ヒトモノクローナル抗体を単離することは、非常に困難である。実際、種々の技術を用いる努力にも拘らず、わずか６つのこのような抗体（Ｚｗｉｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：１２１９８−１２２０８，２００１に記載されるｂ１２、２Ｇ１２、２Ｆ５、Ｚ１３および４Ｅ１０、ならびにＭｏｕｌａｒｄら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９１３−６９１８，２００２に記載されるＸ５）が同定されている。このような抗体がＨＩＶ−１に感染したヒトにおいて稀であるという事実は、従来のワクチン接種法を用いて広範に反応性な抗体を誘発するのに、病気（と定義されるが実質的には障壁である）を強調するようにして働く。
【００１６】
この問題のための１つの可能な解決策は、所望の中和活性を有する抗体調製物（モノクローナルまたはポリクローナル）を予防的に投与することであり得る。ＨＩＶ−１に関して、非ヒト霊長類における研究は、受動的に投与された中和抗体がＳＩＶ／ＳＨＩＶ／ＨＩＶ感染に対して有意な保護を提供し得ることを示唆する。この型の「受動免疫」スキームは、重篤な呼吸器合胞体ウイルス感染の危険性がある幼児の標的化された集団に対すて大規模に首尾良く適用されている。しかし、このようなＨＩＶ感染に対するストラテジーは、重大な欠陥を有する。無期限にわたって、頻繁に多数の人に抗体調製物を投与することは、非常にコストがかかり、非実用的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＶ−１感染に対して有効な予防的および治療的処置の開発への必要性を認識する。能動免疫ストラテジーおよび受動免疫ストラテジーの両方に関する有意な障害に起因して、本発明は、上述のＨＩＶ−１ ｇｐ１６０に対するヒトモノクローナル中和抗体およびＡＡＶ固有の遺伝子送達特性の存在を利用するアプローチを用いる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノム。
（項目２）
項目１に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムを含むポリヌクレオチド。
（項目３）
項目１に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムを含むパッケージング細胞。
（項目４）
項目１に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムを含む精製ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２。
（項目５）
項目４に記載のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を含む組成物。
（項目６）
細胞においてＩｇＧ１ｂ１２抗体を産生する方法であって、細胞を項目４に記載の精製ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の有効量で形質転換して該細胞におけるＩｇＧ１ｂ１２抗体の発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目７）
動物においてＩｇＧ１ｂ１２抗体を産生する方法であって、項目５に記載の組成物の有効量を患者に投与して、該動物におけるＩｇＧ１ｂ１２抗体の発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目８）
前記動物が人間である、項目７に記載の方法。
（項目９）
ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノム。
（項目１０）
項目９に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含むポリヌクレオチド。
（項目１１）
項目９に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含むパッケージング細胞。
（項目１２）
項目９に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含む精製ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５。
（項目１３）
項目１２に記載のｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５を含む組成物。
（項目１４）
細胞においてＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドを産生する方法であって、細胞を項目１２に記載の精製ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５の有効量で形質転換して該細胞におけるＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目１５）
動物においてＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドを産生する方法であって、項目１３に記載の組成物の有効量を患者に投与して、該動物におけるＳｃＦｖＸ５抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目１６）
前記動物が人間である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドをコードする精製ｒＡＡＶ。
（項目１８）
１つ以上の項目１７に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
（項目１９）
細胞において抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドを産生する方法であって、細胞を項目１７に記載の精製ｒＡＡＶの有効量で形質転換して該細胞における抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目２０）
動物において抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドを産生する方法であって、項目１８に記載の組成物の有効量を患者に投与して、該動物における抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドの発現を誘発する工程を包含する、方法。
（項目２１）
前記動物が人間である、項目２０に記載の方法。
【００１８】
第１の局面において、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。このｒＡＡＶゲノムは、標的細胞において機能的である、転写制御ＤＮＡ、特にプロモーターのＤＮＡおよびポリアデニル化シグナル配列のＤＮＡに作動可能に連結されている１つ以上の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。この遺伝子カセットはまた、イントロン配列を含み、哺乳動物細胞において発現される場合にＲＮＡ転写物のプロセシングを促進し得る。本発明のｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを欠失する。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。
【００１９】
特に、本発明は、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする二重プロモーターの遺伝子カセットを意図する。１つの実施形態において、遺伝子カセットは、以下を含む：（１）形質導入される細胞において活性な２つの恒常性プロモーター、（２）プロモーターエレメントまたは重鎖および軽鎖コード配列の迅速な置換を可能にするいくつかの固有の制限酵素部位、（３）インフレームの抗体遺伝子クローニングを促進する固有の制限部位、（４）可能性のあるプロモーター干渉を減らすための、第１の発現カセットに対する強力な転写終止部位３’、ならびに（５）２つのプロモーターのうちの１つの転写制御下にて、各々挿入される目的のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチド配列。
【００２０】
本発明は、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質）および細菌タンパク質、ならびに抗体の供給が有効な処置である慢性疾患状態に関する他のタンパク質（例えば、疾患状態が生じるときにのみ発現されるタンパク質、または疾患状態の非存在下での発現と比べて発現がアップレギュレートされるタンパク質）に指向する抗体を発現するｒＡＡＶゲノムを意図する。慢性疾患状態の例としては、以下が挙げられる：癌、炎症性疾患（例えば、慢性関節性リウマチおよび炎症性腸疾患）、およびプリオン関連疾患（例えば、狂牛病、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、致死性家族性不眠症、クールーおよびＡｌｐｅｒｓ症候群）。主要なＨＩＶ−１単離体（例えば、モノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２、２Ｆ５、Ｚ１３、４５Ｅ１０、Ｆ１０５およびＸ５）を中和するモノクローナル抗体をコードするゲノムが特に意図される。これらの抗体は、Ｚｗｉｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：１２１９８−１２２０８，２００１；Ｂａｂａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２００−２０６，２０００；およびＭｏｕｌａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９１３−６９１８，２００２）に多様に記載されている。Ｚ１３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＡＹ０３５８４５およびＡＹ０３５８４６（配列番号１８および１９）に示され、２Ｆ５の重鎖ＤＮＡおよび軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２２および２３ならびに配列番号２４および２５に記載される。ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン、ｂ１２重鎖コード配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位、ＨＴＬＶ１型の長い末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列の一部を用いて改変されたヒト伸長因子−１αプロモーター、Ｉ１１７イントロン、ｂ１２軽鎖コード配列ならびにＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む二重プロモーターの遺伝子カセットが本明細書中で具体的に例示される。この遺伝子カセットを含むｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムに指向する。ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン、Ｘ５重鎖可変領域コード配列、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー、Ｘ５軽鎖可変領域コード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む遺伝子カセットがまた、本明細書中で具体的に例示される。この遺伝子カセットを含むｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムに指向する。
【００２１】
本発明は、ｒＡＡＶゲノムによってコードされる抗体ポリペプチドを意図し、この抗体ポリペプチドは、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）またはそのサブクラスのインタクトな免疫グロブリン分子、四量体、二量体、単鎖抗体、二官能性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全に新規の組換え抗体、化学的手段または生物学的手段によって新規に合成された抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２’、ならびに他の免疫活性部分、フラグメント、セグメントおよび他のより小さい部分抗体構造もしくはより大きい部分抗体構造であり得、これらの全てが十分な結合活性を有し、従って、本発明の方法において治療的に有用である。さらに、本発明は、「ヒト化」抗体の使用を意図するので、例えば、フレームワークおよび／または相補性決定領域の同一性のいくらかの変化（すなわち、抗体の抗原特異性を決定するのに重要な上記抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲまたは超可変領域）が、両方とも許容および予想される。従って、本発明に従って、本発明において有用な抗体ポリペプチドのアミノ酸配列は、感染（急性および慢性の感染）および慢性疾患を処置する、公知の効用のこれらの抗体からのいくらかの配列変化を示し得る。このような配列変化は、５％程度であり得、それによって、本明細書中で有用な抗体配列が、既知の効用の抗体と少なくとも９５％の同一性を有する。上記のように、抗体ポリペプチドは、任意の抗体クラスであり得る（または任意の抗体クラス由来であり得る）。抗体クラスは、処置される感染および／または疾患状態ならびに抗体ポリペプチドの所望の作用および作用部位を考慮して、当業者により選択され得る（か、または改変され得る）。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡベクターを提供する。このベクターは、感染性のウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムのアセンブリのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）での感染に許容性の細胞に輸送される。パッケージングされているＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該分野の技術水準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分が単一の細胞（本明細書中でパッケージング細胞と称する）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、ヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスがｒＡＡＶゲノムＩＴＲ以外の異なるＡＡＶ血清型由来であり得る、任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。
【００２３】
パッケージング細胞の作製方法は、ＡＡＶ粒子産生のための全ての必要な成分を安定に発現する細胞株を作製することである。例えば、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから単離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択マーカー（例えば、ネオマイシン体制遺伝子）を含むプラスミド（または複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込む。次いで、パッケージング細胞株にヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）を感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適することである。適切な方法の他の例は、プラスミドよりむしろ、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、パッケージング細胞内にｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を組み込む。
【００２４】
従って、本発明は、感染性のｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。１つの実施形態において、パッケージング細胞は、癌細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株））に安定に形質導入され得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、低い継代の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換したヒト胎性腎臓細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎性線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎性線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎性肺細胞）のような形質転換された癌細胞でない細胞である。
【００２５】
別の局面において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ（すなわち、感染性のキャプシド化されたｒＡＡＶ粒子）を提供する。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２である。別の実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５である。ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によってのような、当該分野で標準的な方法によって精製され得る。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。これらの組成物を用いて、ウイルス感染（急性および慢性のウイルス感染）、特にＡＩＤＳ、細菌感染（急性、亜急性および慢性の細菌感染）および他の慢性疾患状態を、処置および／または予防し得る。１つの実施形態において、本発明の組成物は、目的の抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、異なる目的の抗体ポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。中和ＨＩＶ−１について特に、いくつかの抗ＨＩＶ−１抗体ポリペプチドプチドの発現および分泌を生じるｒＡＡＶ混合物の投与は、ウイルスの中和を増加させ得る。投与は先行し、同時にかまたは引き続いてＡＲＴが施され得る。
【００２７】
本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中にｒＡＡＶを含む。この組成物はまた、賦形剤およびアジュバントのような他の成分を含み得る。受容可能なキャリア、賦形剤およびアジュバントは、レシピエントに対して無毒性であり、好ましくは、使用される投薬量および濃度では不活性である。このようなものとしては、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または他の有機酸緩衝液）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖、二糖および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンが挙げられる）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与の様式、処置の目標、標的化される個体および細胞型に依存して変化し、当該分野の標準的な方法によって決定され得る。
【００２９】
インビボまたはインビトロで標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法は、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む有効量の組成物を、ｒＡＡＶの投与を必要とする動物（人間を含む）に投与する工程を包含する。この用量がウイルスによる感染または慢性疾患状態の発症の前に投与される場合、投与は予防的である。この量がウイルスによる感染または慢性疾患状態の発症の後に投与される場合、投与は治療的である。有効量とは、処置される感染または疾患状態に関する少なくとも１つの症状を緩和（排除または減少）し得るのに十分な用量である。１つの実施形態において、症状の緩和は、疾患状態へのウイルス感染の進行を妨げる。別の実施形態において、症状の緩和は、疾患状態への進行または疾患状態の進行（ウイルス感染によるものであってもなくても）を防ぐ。ウイルス感染（急性および慢性のウイルス感染を含む）、細菌感染（急性、亜急性および慢性感染を含む）および処置される患者の慢性疾患状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨＩＶ−１感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス感染、呼吸器合胞体ウイルス感染、骨髄炎、結核、慢性関節性リウマチ、炎症性大腸疾患、伝染性海綿状脳症（例えば、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ病およびクールー）、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、致死性家族性不眠症、Ａｌｐｅｒｓ症候群および癌。この方法において、感染または疾患状態に関連するタンパク質またはペプチドと特異的に反応する抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶが投与される。有効量の組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、脳内、骨内、眼内、経直腸または経膣によってであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分の投与経路および血清型（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびキャプシドタンパク質）は、処置される感染および／または疾患状態、ならびに抗体ポリペプチドを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。
【００３０】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織内に輸送する任意の物理的な方法を用いて達成され得る。簡単にｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることが、筋肉組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが示されており、（ＤＮＡを分解する組成物が通常の様式でベクターを妨害するが）ベクターと同時に投与され得るキャリアまたは他の成分についての制限は知られていない。ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉のような目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。薬学的組成物は、注射用処方物としてか、または局所用処方物として経皮輸送によって筋肉へと送達されるように調製され得る。筋肉内注射および経皮輸送の両方についての多数の処方物がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用され得る。ｒＡＡＶは、投与および扱いを容易にするために任意の薬学的に受容可能なキャリアと共に使用され得る。
【００３１】
筋肉内注射の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油のようなアジュバント中、または、プロピレングリコール水溶液中の溶液、ならびに滅菌水性溶剤が使用され得る。このような水性溶剤は、必要な場合緩衝化され得、そして、液体賦形剤がまず生理食塩水もしくはグルコースで等張にされる。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬学的に受容可能な塩が、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適度に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶの分散物はまた、グリセロ−ル、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中、ならびに油中に調製され得る。保存および使用の通常の条件下にて、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。この関係で、使用される滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に入手可能である。
【００３２】
注射用途に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌分散物、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散物の即席の調製物のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、この形態は、滅菌でなければならず、かつ、容易に注入能が存在する程度に流動性でなければならない。この形態は、製造および保存の条件下において安定でなければならず、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオ−ル（例えば、グリセロ−ル、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）を使用することによって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗生物質おおよび抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射用組成物の延長した吸収は、吸収遅延剤（例えば、一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
【００３３】
滅菌注射溶剤は、上記で列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中で必要量のｒＡＡＶを組み込むことによって調製され、この後、必要に応じて、フィルター滅菌される。一般に、分散物は、滅菌活性成分を塩基性の分散媒体および上に列挙したもののうち必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製され得る。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、本発明の好ましい方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分の粉末＋前もって滅菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分を得る。
【００３４】
ｒＡＡＶの形質導入はまた、インビトロで実行され得る。１つの実施形態において、所望の標的筋肉細胞が被験体から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、そして、被験体へと再び戻される。あるいは、これらの細胞が被験体において不適切な免疫応答を惹起しない場合、同系または異種の筋肉細胞が使用され得る。
【００３５】
形質導入された細胞を被験体に形質導入および再導入する適切な方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、細胞は、例えば、適切な培地中で、ｒＡＡＶを筋肉細胞と合わせることによってインビトロで形質導入され得、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲのような従来の技術を用いてか、または選択マーカーを用いて、目的のＤＮＡを保有する細胞についてスクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、薬学的組成物中に処方され得、そして、この組成物は、種々の技術によって（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射および腹腔内注射によって、または、例えば、カテーテルを用いて平滑筋および心筋内に注射することによって）被験体に導入され得る。
【００３６】
本発明のｒＡＡＶを用いる細胞の形質導入は、抗体ポリペプチドの持続的な発現を生じる。従って、本発明は、動物、好ましくは人間に対して抗体ポリペプチドを発現するｒＡＡＶの送達方法を提供する。これらの方法は、組織（筋肉、肝臓および脳を含むがこれらに限定されない）を本発明の１つ以上のｒＡＡＶを用いて形質導入する工程を包含する。形質導入は、組織的特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行われ得る。例えば、本発明の１つの実施形態は、筋肉特異的制御エレメント（これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクチン由来の制御エレメントおよびｍｙｏＤ遺伝子ファミリー由来のようなミオシン遺伝子ファミリー由来の制御エレメント（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６１−７６６，１９９１を参照のこと）、単球特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２（ＣｓｅｒｊｅｓｉおよびＯｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：４８５４−４８６２，１９９１）、ヒト骨格アクチン遺伝子由来の制御エレメント（Ｍｕｓｃａｔら．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：４０８９−４０９９，１９８７）、心臓アクチン遺伝子由来の制御エレメント、筋肉クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎら．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：３３９３−３３９９，１９８９を参照のこと）およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、骨格速収縮（ｆａｓｔ−ｔｗｉｔｃｈ）トロポニンＣ遺伝子、遅収縮（ｓｌｏｗ−ｔｗｉｔｃｈ）心臓トロポニンＣ遺伝子および遅収縮トロポニンＩ遺伝子：虚血（ｈｙｐｏｚｉａ）誘導性核因子由来の制御エレメント（Ｓｅｍｅｎｚａら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５６８０−５６８４，１９９１）、ステロイド誘導性エレメントおよび糖質コルチコイド応答性エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（ＭａｄｅｒおよびＷｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３−５６０７，１９９３を参照のこと）ならびに他の制御エレメント）によって指向される筋肉細胞および筋肉組織を形質導入する方法を提供する。
【００３７】
筋肉組織は、インビボでの遺伝子送達および遺伝子治療の魅力的な標的である。なぜならば、筋肉組織は、生命の維持に必要な器官でなく、かつアクセスしやすいからである。本発明の方法におけるｒＡＡＶの筋肉細胞および組織への送達を実施するために、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ誘導体の使用が、筋肉組織からのより有効な抗体の分泌を促進するために企図される。本発明により企図される単鎖抗体は、ＨＩＶ−１中和単鎖抗体Ｘ５であり、この抗体のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０および２１に示される。さらに、代替的な血清型（例えば、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−５）に基づくｒＡＡＶは、ＡＡＶ−２よりも効率的に骨格筋細胞を形質導入し得る。
【００３８】
ｒＡＡＶは、高い効率で筋肉細胞または筋肉組織を形質導入し、種々の導入遺伝子の長期間の発現を指示することが示されている。このシステムの柔軟性のために、軽鎖および重鎖抗体遺伝子が単一のｒＡＡＶに組み込まれ得、次いで、抗体を発現するｒＡＡＶがインビボで筋肉を形質導入するのに使用され得ることが企図される。本発明は、形質導入した筋繊維由来の生物学的に活性な抗体ポリペプチドプチドの持続性の発現を企図する。
【００３９】
「筋肉細胞」または「筋肉組織」は、例えば、消化管、膀胱および血管ならびに心臓からの任意の種類の筋肉（骨格筋、平滑筋を含む）由来の細胞または細胞群を意味し、体の任意の領域から切除される。このような筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞および心筋芽細胞）は、分化していても未分化であってもよい。筋肉組織が容易に循環系にアクセス可能であるので、インビボで筋肉細胞および組織により産生および分泌されたタンパク質は、理論的には、全身送達のために血流に入り、それによって、筋肉からの持続性の治療レベルのタンパク質分泌を提供する。
【００４０】
用語「形質導入」は、インビボまたはインビトロのいずれかで、レシピエントの細胞による機能的な抗体ポリペプチドの発現を生じる本発明の複製不全ｒＡＡＶを介する、レシピエントの細胞への抗体ポリペプチドＤＮＡの送達をいうのに使用される。
【００４１】
ＨＩＶ−１に指向する抗体が、ウイルスのレセプターへの結合を阻害することによってウイルスを中和し得ることが知られている。本発明は、ウイルスを中和する抗体ポリペプチドをコードする本発明のｒＡＡＶの有効量をそれを必要とする患者に投与する方法を提供する。本発明に従う中和は、当該分野で公知のインビトロまたはインビボのアッセイによって測定される、主要なウイルス単離体の感染の減少である。複数のアッセイが当該分野で公知である。中和は、以下のうちの１つ以上を包含し得る：ウイルスの細胞上のレセプターとの相互作用をブロッキングするウイルスの表面上の抗原への抗体の結合、補体媒介性のウイルスの溶解および／またはファゴサイトーシスを生じるウイルスの表面上の抗原への抗体の結合、Ｆｃ媒介性のエフェクター系の活性化を生じるウイルスに感染した細胞表面上の抗原への抗体の結合、ならびに抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性の細胞傷害性による感染細胞の溶解／排除、ウイルスの複製の阻害を生じるウイルスに感染した細胞表面上の抗原への抗体の結合、感染細胞からのウイルスの放出の阻害を生じるウイルスに感染した細胞表面上の抗原への抗体の結合、ならびにウイルスの細胞−細胞伝達の阻害を生じる細胞表面上の抗原への抗体の結合。細胞内免疫による中和がまた企図される。さらに、細菌の中和が企図される。
【００４２】
中和は、患者からのウイルスもしくは細菌の排除を生じ得（すなわち、殺菌）、または、ウイルスもしくは細菌によって生じる疾患状態の進行を遅延し得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＨＩＶ−１中和抗体ポリペプチドをコードする本発明のｒＡＡＶの有効量の投与を含み、ＨＩＶ−１に感染した患者のＡＩＤＳへの進行を防ぐ。好ましい方法は、個体において以下のうちの１つ以上を生じる：ウイルス負荷の減少、低ウイルス負荷の維持、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の安定化、日和見感染症の発症または重篤度の減少、悪性腫瘍の発症の減少および細胞媒介性免疫の欠損に代表的な症状の発症または重篤度の減少。上述のものは、当該技術に従って、各々、ＡＩＤＳを進行しているかまたはＡＩＤＳに進行する傾向にある個体と比較される。
本明細書中に記載されるように（実施例５を参照のこと）、有意なレベルのＨＩＶ−１中和活性が、抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２を発現する本発明のｒＡＡＶベクターの単回筋肉内投与後６ヶ月にわたるマウスの血清において見出される。このアプローチは、「免疫」の前に抗体の親和性および特異性を前もって決定させ、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する活性な体液性免疫応答の必要性を回避する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦ１ａ／ＬＣと命名された二重プロモーターのｒＡＡＶゲノムを示す。固有の制限部位を、図の上部に表示する。ゲノム成分を以下のように表示する：「ＨＣ」および「ＬＣ」は、それぞれ重鎖抗体遺伝子および軽鎖抗体遺伝子を示し、「ＣＭＶｐ」はヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサーを示し、そして「Ｉ」はＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロンを示す。抗体リーダー配列を「Ｌ」で表示し、そして「ｐＡ」は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を示す。二次転写ユニットは、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーターを含み、そして、ＨＴＬＶ １型末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の部分を用いて、ＤＮＡおよびＲＮＡの安定性を増強するように改変されている。このプロモーターはまた、Ｉ１１７イントロンを含み、これは、プラスミドｐＧＴ６２ＬａｃＺ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ Ｉｎｃ．）由来である。軽鎖ポリアデニル化部位はＳＶ４０由来である。
【図２】図２は、ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー（「ＣＭＶ」と表す）、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン（「ＳＶ４０ ｓｄ／ｓａ」）、Ｘ５重鎖可変領域コード配列（「ＶＨ」）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー（「ｌｉｎｋｅｒ」）、Ｘ５軽鎖可変領域コード配列（「ＶＬ」）およびＳＶ４０ポリアデニル化部位（「ＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ」）を含む遺伝子カセットを含むｒＡＡＶ／Ｘ５ゲノムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
（詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を例示する。実施例１は、抗体ポリペプチド発現のための二重プロモーターのｒＡＡＶの構築を記載し、実施例２は、ｒＡＡＶ産生を記載し、実施例３は、ｒＡＡＶを形質導入したマウスにおける循環ＩｇＧ１の産生を記載し、実施例４は、筋肉由来のＩｇＧ１ｂ１２によるＨＩＶ−１の中和活性を記載し、そして、実施例５は、筋肉におけるｒＡＡＶの残留性およびＩｇＧ１ｂ１２の産生を記載する。実施例６は、抗体ポリペプチド発現のための単一プロモーターのｒＡＡＶの構築を記載し、実施例７はマカクへのｒＡＡＶ投与を記載し、そして、実施例８は、ヒトへのｒＡＡＶ投与を記載する。実施例９は、ウイルス感染に有用なもの以外の抗体ポッリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む、本発明において有用なｒＡＡＶを記載する。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
（抗体発現のための二重プロモーターのｒＡＡＶの構築）
標的筋肉細胞内に効率のよい抗体発現を達成するために、二重プロモーターのｒＡＡＶを構築して、同じ形質導入した細胞内に重鎖および軽鎖タンパク質の、最適な同時発現を生じた。図１に示すように、得られた二重プロモーターのｒＡＶＶは以下の特徴を有した：（１）ｒＡＡＶベクター（ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびヒトＥＦ１−αプロモーター）において、骨格筋内で活性な２つの構成的プロモーター；（２）ベクターに組み込まれ、プロモーターエレメントまたは重鎖および軽鎖コード配列の迅速な置換を可能にする、いくつかの固有の８塩基対制限酵素部位；（３）ＩｇＧ１ｂ１２の重鎖および軽鎖のリーダーペプチド配列に指向性の変異誘発を行い、インフレームの抗体遺伝子クローニングを促進する固有の制限部位（重鎖リーダーについてＭｌｕＩ、そして軽鎖リーダーについてＢｓｓＨＩＩ）を導入した；（４）ＲＴ−ＰＣＲによりＩｇＧ１ｂ１２重鎖イントロンを取り除き、ベクターサイズを減らし、野生型ＡＡＶのパッケージング制限内に残す；ならびに（５）可能性のあるプロモーター干渉を減少するための第１の発現カセットの３’側の強力な転写終止部位。最近、安定な産生細胞株アプローチ（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１，１９９５）を用いて、高力価のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ベクター産生を可能にするために、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２プラスミドベクター配列を、以前に記載されたように、またＡＡＶ−２ ｒｅｐ−ｃａｐヘルパー配列およびネオマイシン耐性遺伝子を有する、３部からなる長いプラスミド（ｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１，１９９５）にクローニングした。次いで、この３部からなるプラスミドを用いて、最適なＨｅＬａベースのｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２産生細胞株（ＣＥ７１）を作製した。
【００４６】
ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１ｂ１２の軽鎖および重鎖に対するコード配列は、プラスミドｐＤＲ１２由来であり、本明細書中でそれぞれ配列番号１４および１６にて示す。ＩｇＧ１ｂ１２の重鎖および軽鎖に対する得られたアミノ酸配列を、本明細書中で、それぞれ配列番号１５および１７として示す。ＩｇＧ１ｂ１２およびプラスミドｐＤＲ１２の単離は、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７，１９９１およびＳｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０２４−１０２７（１９９４）に記載されている。
【００４７】
続いて、二重プロモーターのｒＡＡＶクローニングプラスミドｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を以下のようにして構築した。まず、プラスミドｐＣＭＶ／β（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＰｓｔＩで消化して２．７ｋｂのベクタープラスミドＤＮＡフラグメントを単離し、自己同士で再度連結し、アンピシリン耐性ベクター（ｐＢ）を作製した。次いで、ＰＣＲを用いて、プラスミドｐＣＭＶ／Ｐ由来のｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０イントロン（８０８ｂｐ）を増幅し、ＰＣＲを以下のプライマーを用いて実施した：ＣＭＶ 順方向：ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧ（配列番号１）；ＣＭＶ 逆方向：ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＡＧ（配列番号２）。
【００４８】
得られたフラグメントをプラスミドｐＢの固有のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣＭＶを作製した。これらのプライマーを、ＥｃｏＲＩ部位が５’末端および３’末端で固有のＰａｃＩおよびＳｒｆＩ部位に隣接するように設計した。その後、ＰＣＲを用いて、プラスミドｐＧＴ６２ｌａｃＺ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）を鋳型として、それぞれ以下のプライマーを用いて、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（１９０ｂｐ）およびＥＦ１−αプロモーター（７７０ｂｐ）を、別々に増幅した：ＢＧＨ 順方向：ＴＴＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴ（配列番号３）；ＢＧＨ 逆方向：ＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＣ（配列番号４）；ＥＦ１ 順方向：ＴＴＡＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡ（配列番号５）；ＥＦ１ 逆方向：ＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＣ（配列番号６）。その後、得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩで消化し、再度連結して、ＢＧＨ 順方向プライマーおよびＥＦ１−α逆方向 プライマー（配列番号３および６）を用いて、第２ラウンドのＰＣＲを行い、単一のＤＮＡフラグメントを生成した。これらのプライマーは、それぞれ、５’のＳｒｆＩ部位ならびに３’のＡｖｒＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｗａＩおよびＰｓｔＩ部位を組み込んだ。この９６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを固有のＳｒｆＩおよびＰｓｔＩ部位でプラスミドｐＣＭＶに一方向でクローニングした。得られたプラスミド（ｐＣＭＶ／ＥＦ１）は、ここで、ＢＧＨポリアデニル化部位を有するＣＭＶプロモーターおよび、引き続くＥＦ１−αプロモーターを保有した。
【００４９】
ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（プラスミドｐＧＴ６２ｌａｃＺから単離した）を含む２７０塩基対のＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＣＭＶ／ＥＦ１のＥｃｏＲＩ／Ｓｗａ Ｉ部位に直接クローニングして、ｐＣＭＶ／ＥＦ１ａを得た。プラスミドｐＤＲ１２および単離した総ＲＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換して、ＩｇＧ１ｂ１２重鎖ｃＤＮＡ（１，４６３ｂｐ）を単離した。ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供し、以下のプライマーを用いてｐＺｅｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした：重鎖ｃＤＮＡ 順方向：ＴＡＣＴＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号８）；重鎖ｃＤＮＡ 逆方向：ＴＡＣＴＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号９）。これらのプライマーは、隣接するＳｒｆＩ部位を組み込み、この部位は、プラスミドｐＣＭＶ／ＥＦ１ａの固有のＳｒｆＩ部位へのＩｇＧ１ｂ１２重鎖のクローニングを容易にした。プラスミドｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦｌａを得た。ＩｇＧ１ｂ１２κ軽鎖遺伝子をプラスミドｐＤＲ１２から直接ＰＣＲで増幅し、７２０ｂｐの生成物を以下のプライマーを用いてプラスミドｐＺｅｒｏにクローニングした：軽鎖 順方向：ＣＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧ（配列番号９）；軽鎖 逆方向：ＣＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴ（配列番号１０）。軽鎖プライマーは、隣接するＡｖｒＩＩ制限部位を組み込み、この部位は、κ軽鎖をプラスミドｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦ１ａのＡｖｒＩＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣＭＶ／ＨＣ／ＥＦ１ａ／ＬＣを生じるのに使用された。
【００５０】
次いで、部位指向性の変異誘発を用いて重鎖リーダーペプチド配列に固有のＭｌｕＩ制限部位を導入し、同じストラテジーを用いて軽鎖リーダーペプチド配列にＢｓｓＨＩ部位を導入した。次いで、二重発現カセットを４．５ｋｂのＰａｃＩ／ＳｒｆＩ ＤＮＡフラグメントとして単離し、プラスミドｐＡＡＶ／３−ｇａｌ／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋ（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３２９−１３４１，１９９５）のＡＡＶ ＩＴＲの間にクローニングし、ｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋを作製した。この３部からなるプラスミドは、ネイティブのｒｅｐ−ｃａｐ ＡＡＶヘルパー配列ならびに安定な細胞株選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を含む。
【００５１】
プラスミドｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋおよびｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２のヒトＩｇＧ抗体を産生する能力は、いくつかの形質転換した細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７およびＣ２Ｃ１２）を用いてインビトロでまず確認された。当該分野で標準の方法を用いたプラスミドトランスフェクションまたはｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２形質導入の後、細胞培養上清を、製造業者の指示に従って、１ヒトＩｇＧサブタイプ１ ＥＬＩＳＡ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いて分析した。このアッセイの感度は、２．９ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧである。このアッセイは、細胞培養上清が検出可能なレベルのヒトＩｇＧを含むことを決定した。
【００５２】
（実施例２）
（ｒＡＡＶ産生）
ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を産生して、当該分野で公知の方法を用いて精製した（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１０３１−１０３９，１９９９；Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３２９−１３４１，１９９５）。簡単には、産生細胞株（ＣＥ７１）を単離し、その後、ＨｅＬａ細胞をプラスミド ｐＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２／ｒｅｐ−ｃａｐ／ｎｅｏｔｋでトランスフェクションし、引き続いてＧ４１８（７００μｇ／ｍｌ）で薬剤選択した。２００個の別々の細胞株をスクリーニングし、その後、野生型のアデノウイルス５型（ｍｏｉ＝２０）を感染させ、ＣＥ７１を、細胞あたりの最も高いＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）を産生するものとして同定した（１０４ ＤＲＰ／細胞）。大規模のベクター産生のために、１０１０個のＣＥ７１細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｃｕｂｅ接着細胞バイオリアクター中で増殖させ、引き続いて、野生型のＡｄ５（ｍｏｉ＝２０）で感染させた。アデノウイルスのＣＰＥ（７２時間）の発生の後、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を、以前に詳述されたようにヘパリンクロマトグラフィーを用いて粗ＣＥ７１細胞溶解物から精製した（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１０３１−１０３９，１９９９）。Ｃｌａｒｋら、１９９９に詳述されるように、Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｔａｑｍａｎ配列決定検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するリアルタイムＰＣＲ法によって精製したｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２について、ＤＲＰの力価を決定した。ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の定量に使用したプライマーおよび蛍光プローブセットは以下の通りである；ＣＭＶ 順方向プライマー：５’−ＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡ−３’（配列番号１１）、ＣＭＶ 逆方向プライマー：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧ−３（配列番号１２）’、およびプローブ、５−ＦＡＭ−ＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号１３）。
【００５３】
感染性のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の力価は、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ストックの限界希釈およびアデノウイルスの存在下でのｒｅｐ−ｃａｐ発現細胞株（Ｃ１２）の感染を使用して決定した。終点力価決定を、以前に記載されたように、Ｃ１２細胞において複製するｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ゲノムの定量的ＰＣＲ検出に基づいて行った（Ｃｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２，１９９６）。これらの実験に用いたｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２の算出したＤＲＰ 対 ＩＵ比は２８：１であった。
【００５４】
（実施例３）
（ｒＡＡＶで形質導入したマウスにおける循環ＩｇＧ１の産生）
免疫不全のＲａｇＩマウスの、両方の大腿四頭筋にｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を接種した。Ｒａｇｌマウスを用いて抗ヒトＩｇＧ応答を回避した。
【００５５】
全ての実験をＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って実施した。６週齢のＲａｇ−１マウス（Ｃ．１２９Ｓ７（Ｂ６）−Ｒａｇ１ｔｍｌＭｏｍ）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、ミクロアイソレーターバリアの入れ物内に収容した。この研究は、１６匹の動物からなった：６匹は５×１０１１のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）を受け；６匹は、５×１０１０のＤＲＰを受け；２匹はβ−グルクロニダーゼを発現する無関係のｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ／ＧＵＳ、４×１０１１ＤＲＰ）を受け；そして、２匹にはＰＢＳ賦形剤を与えた（ベクターＤＮＡ分析のみのために使用した）。
【００５６】
チレタミンＨＣｌ／ゾレザパムＨＣｌ（Ｔｅｌａｚｏｌ，Ｆｔ．Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）を筋肉内注射してマウスを麻酔にかけた。大腿にわたって５ｍｍの皮膚切開を行い、５０μｌのウイルス顕濁液またはＰＢＳを、２８ゲージ針を用いて、筋肉の長軸に沿って大腿四頭筋に注射した。注射手順に起因する副作用は、いずれのマウスにおいても特筆すべきものでなかった。麻酔下で後眼窩洞から血液サンプルを採取した。屠殺するときに、大腿四頭筋全体を摘出して、横断面に沿って二等分し、非架橋固定液（Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ，Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）で半分を固定してパラフィンで包埋し、他の半分を、後のＤＮＡ分析のために液体窒素で急速凍結した。脛骨の外側の筋肉をコントロール組織として採取した。
【００５７】
全ての生存している１１匹のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２マウスにおいて、接種後６週間でヒトＩｇＧ１を検出した；１匹は無関係の原因で２週間で死亡した。平均すると、高用量のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を受けた動物は、低用量を受けた動物よりも７〜２８倍高いＩｇＧ１を有した。最大ＩｇＧ１濃度は、注射後１２週で観察され、次いで、先の３ヶ月にわたってプラトーに達した。高用量の動物の血清の大部分は、常に４〜５μｇ／ｍｌの間のヒトＩｇＧ１を有し、最大レベルは８μｇ／ｍｌを超えた。低用量の群において、抗体レベルは、ベクターの接種後２０週間、増加し続け、０．５〜１．０μｇ／ｍｌの範囲の循環抗体レベルを有した。
【００５８】
いくつかの血清をまた、抗ＨＩＶ ｇｐ１２０終点ＥＬＩＳＡ力価を決定するためにアッセイした。抗ＨＩＶ ｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡを、以下のようにして実行した。Ｉｍｍｕｌｏｎ ４免疫アッセイプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、４℃で１６時間、炭酸塩緩衝液（ＢｕｐＨ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中に希釈したチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で産生した組換えＨＩＶ−１ＬＡｌ ｇｐ１２０でコートした（１００ｎｇ／ウェル）。抗原を除去し、ウェルをＢｌｏｔｔｏ（１×ＰＢＳ中５％のスキム乾燥ミルク ｐＨ７．４）中１％の正常ヤギ血清を用いて、２５℃で１時間ブロッキングした。マウス血清をＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００に希釈して、３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００に浸漬することで５回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ ＨＲＰ結合体化２次抗体（１：５，０００）を１時間添加した（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。比色定量（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質である３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、３０分後に１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止した。両方のＥＬＩＳＡアッセイを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＨＴＳ ７０００プレートリーダーにて４５０ｎｍで読んだ。終点力価をＯＤ４５０値を得る血清希釈の逆数を取って導き、この値は、対応する抗原を含まないコントロールのウェルよりも少なくとも２倍高かった。
【００５９】
１６週で４倍より高い用量を受けた動物から採取した血清の限界希釈は、終点力価が１：８００〜１：３，２００の範囲であることを明らかにした。これらのデータは、筋肉がｇｐ１２０結合特異性を保持するＩｇＧ１ｂ１２を分泌することと一致した。
【００６０】
（実施例４）
（筋肉由来のＩｇＧ１ｂ１２はＨＩＶ−１を中和する）
ＩｇＧ１およびｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡのデータがインビボでの抗体発現を確認したが、これらのアッセイは、分泌されたＩｇＧ１ｂ１２がＨＩＶ−１を中和する能力を保持するかどうかには取り組んでいなかった。したがって、６匹の高用量の動物からの２０週の血清サンプルを、ＭＴ−２細胞殺傷アッセイを用いてＴＣＬＡ株ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに対する中和活性について分析した。これらのアッセイは、Ｆｉｎｔｅｒニュートラルレッドを利用し、Ｈｅｒｚｏｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５８０４−５８０９，１９９７に記載されるように生存細胞を定量した。力価を５０％の細胞がウイルス誘導性の殺傷から保護される血清希釈の逆数として報告した。この５０％終点は、このアッセイにおけるｐ２４ Ｇａｇ抗原合成の９０％以上の減少に一致する（Ｂｕｒｅｓら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６：２０１９−２０３５，２０００を参照のこと）。ＳＨＩＶ−８９．６の中和を、マイトジェンで刺激したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、Ｂｕｒｅｓら（前出）に記載されるｐ２７ Ｇａｇ抗原合成の減少を用いて測定した。ウイルスストックをＨ９細胞（ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ）またはヒトＰＢＭＣ（ＳＨＩＶ−８９．６）のいずれかで作製した。
【００６１】
６匹中５匹の動物からの血清は、以下の表１に記載するように検出可能な中和活性を有した。
【００６２】
（表１．ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに対する血清の中和力価）
【００６３】
【表１】
ａ 各マウスに、四頭筋に単一用量（５×１０１１ＤＲＰ）のｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を与えた。
【００６４】
ｂ 抗体媒介性の中和を、ＭＴ−２細胞殺傷性アッセイにおいて測定した。力価は、５０％の細胞がウイルス誘導性の殺傷から保護される血清希釈の逆数であり、これは、ｐ２４ Ｇａｇ抗原合成の９０％以上の減少に一致する。
【００６５】
ｃ 観察された中和力価を達成するために必要な精製ＩｇＧ１ｂ１２の濃度。
【００６６】
ｄ 血清におけるヒトＩｇＧ１の実際の濃度。
【００６７】
これらのデータを拡張するために、ほぼ最初の（ｐｒｉｍａｒｙ−ｌｉｋｅ）ＨＩＶ−１単離体（ＨＩＶ８９．６ｅｎｖを含むＳＨＩＶ−８９．６）を中和する、マウス血清の能力もまた試験した。注射後１６、２０および２４週に、中和活性を血清プールで観察した（表２）；用量が有限であるので、血清をプールした。これらのデータは、筋肉起源のＩｇＧ１ｂ１２がＴＣＬＡおよび最初のＨＩＶ−１単離体の両方を中和する予想された能力を保持することを示した。
【００６８】
（表２．ＳＨＩＶ ８９．６に対する血清の中和力価）
【００６９】
【表２】
ａ マウスＲＡ１、ＲＡ２、ＲＡ３、ＲＢ１、ＲＢ２、およびＲＢ３由来の血清からなる、前免疫（時間０）されたプール。これらの同じマウス由来の血清を、示された回収日（注射後１６週、２０週または２４週）でプールした。全てのプールを１：４希釈でアッセイした。
【００７０】
ｂ ｐ２７抗原における減少％を血清の不在下でのｐ２７合成の量に対して計算した。
【００７１】
（実施例５）
（筋肉におけるｒＡＡＶベクターの残存性およびタンパク質生成）
筋肉が抗体産生部位であったという証拠を得るために、接種後２４週で摘出した筋肉組織において、ｒＡＡＶゲノムの残存性およびヒトＩｇＧタンパク質の発現をアッセイした。ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２ベクターＤＮＡの残存性を、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて分析した。各動物からの約５０％の左右の四頭筋をゲノムＤＮＡ単離のために用い、ＣＭＶプロモーターに特異的なＰＣＲプライマー／プローブ対を用いるＴａｑｍａｎ ＰＣＲに供した。表３に示すように、全ての接種された筋肉組織は、かなりのレベルのベクターＤＮＡを保有し、これは、核あたり０．４〜１０コピーの間の範囲であった。平均すると、高用量を受けていた動物からの筋肉は、低用量の動物からの筋肉と比較して、筋肉あたり５倍多いベクターＤＮＡを保有した。
【００７２】
（表３． マウスの筋肉におけるベクターＤＮＡの残存性）
【００７３】
【表３】
ａ 用量はＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）として測定される；材料および方法を参照のこと。
【００７４】
ｂ 値は、ｒＡＡＶ注射後の四頭筋において観察される核あたりのｒＡＡＶゲノムの平均を示す。６０ｎｇの筋肉ＤＮＡ（１０，０００核当量）を、ＣＭＶプライマー／プローブセット（配列番号１および２）を用いる定量的Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲによって分析した。全てのサンプルを、注射後２４週で摘出した。
【００７５】
接種された筋肉内のインサイチュ抗体発現を示すために、ヒトＩｇＧ１についての免疫ペルオキシダーゼ染色を、パラフィン包埋した筋肉組織について行った。ヒトＩｇＧ１重鎖（Ｆｃ特異的）検出のための筋肉組織を、連続薄切し（６μｍ）、連続的なエタノール浴を伴うＡｍｅｒｉｃｌｅａｒ中にて脱パラフィンし、引き続いて、１×ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。まず、組織切片を製造業者の指示書に従って、Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｃｉｔｒａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を用いて処理し、次いで、Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｃｋ試薬（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を用いて１０分間ブロッキングした。１：１００希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ抗血清（ＤＡＫＯ，Ａ０４２４）を切片とともに４℃で１８時間インキュベートした。十分に洗浄した後、ビオチン化抗ウサギ二次抗体（１：１００希釈；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、３０分間インキュベートした。製造業者の指示書に従ってアビジン／ビオチン−ペルオキシダーゼ結合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて抗原を可視化した。ＡＥＣペルオキシダーゼ基質（ＤＡＫＯ）中で５分間切片をインキュベートして発色させた。
【００７６】
全ての高用量動物は、分泌されたタンパク質のＥＲ／ゴルジ局在化に一致する特定の筋繊維の明らかな、しばしば点状の免疫染色を示した。コントロールのｒＡＡＶ／ＧＵＳ四頭筋組織は、ヒトＩｇＧ１の存在についてネガティブであった（動物ＲＦ１、ＲＦ２）。
【００７７】
（実施例６）
（抗体発現のための単一プロモーターのｒＡＡＶの構築）
ヒトＣＭＶの最初期のプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０小Ｔ−抗原イントロン、Ｘ５重鎖可変領域コード配列、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー、Ｘ５軽鎖可変領域コード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む遺伝子カセットに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含むｒＡＡＶゲノムを、標準のＤＮＡ操作技術を用いて構築した。この遺伝子カセットは、１本鎖のＸ５抗体ポリペプチド（ＳｃＦｖＸ５）をコードした。図２を参照のこと。ＡＡＶ ＩＴＲを、ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８，１２４８０１２５４，２００１に記載されるように改変し、ｒＡＡＶゲノムを２本鎖の自己相補性ＤＮＡとしてウイルス粒子にパッケージングさせた。
【００７８】
遺伝子カセットのＳｃＦｖＸ５を産生する能力を、インビトロにてＨｅＬａ細胞を用いて確認した。この遺伝子カセットを、裸のＤＮＡとしてＨｅＬａ細胞に一過的にトランスフェクトした。ＳｃＦｖＸ５をトランスフェクトされた細胞によって産生し、当該分野の標準的な方法によってＨＩＶ−１ ｇｐ１２０に結合することを示した。
【００７９】
ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを、ＡＡＶ血清型１キャプシドにパッケージングすること以外は、本質的に上記の実施例２に記載した方法によってパッケージングし、次いで、精製した。得られたｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５を、上記実施例３、４および５に記載したマウスモデルにおいて、および、以下の実施例６に記載するマカクモデルにおいて試験し得る。
【００８０】
（実施例７）
（マカクへのｒＡＡＶ投与）
マカクサルのＳＩＶでの感染は、ＡＩＤＳ様疾患を誘導し得る。これらの感染された動物は、ヒトのＨＩＶ−１での感染およびヒトにおけるＡＩＤＳの発症についてのモデルとして使用され得る。特に、ＳＩＶウイルスに感染したマカクは、ヒトのＡＩＤＳに特徴的な症状（例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の枯渇、日和見感染症、神経性疾患および悪性腫瘍などの発症）を発症する。さらに、ＳＩＶは、投与経路（例えば、経直腸および経膣）によって動物に感染し得、ヒトにおいてＨＩＶの伝染を再生する。例えば、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＳＴＤ ＆ ＡＩＤＳ，９（補遺１）：３−７（１９９８）を参照のこと。従って、ＳＩＶ／マカクモデルは、ＡＩＤＳワクチンの開発および単為生殖に関する主要な動物モデルである。例えば、Ｈｏら、Ｃｅｌｌ，１１０：１３５−１３８（２００２）（サルの実験で用いられたストラテジーの成功が、「多数の候補ワクチンを治験に駆り立てた」ことを考察している）を参照のこと。ｇｒａｎｔｓ１．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｒａｎｔｓ／ｇｕｉｄｅ／ｒｆａ−ｆｉｌｅｓ／ＲＦＡ−ＭＨ−９９−００９．ｈｔｍｌ（１９９９年１月２９日）（「ヒトのＡＩＤＳが神経病を発症させることの根底にあるメカニズムを解読および理解を補助するためのＡＩＤＳのＳＩＶモデルの重要性」を考察している）もまた参照のこと。
【００８１】
さらに、サルにおけるチャレンジ研究が、免疫不全ウイルスおよび／またはウイルスの感染から生じる疾患に対する保護を確立するため、そして、ワクチンまたはワクチンの概念がヒトにおける用途に対しての見込みを有するか否かを確立する手段として使用され得る。Ｓｃｈｕｌｔｚ、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１４（３）：Ｓ２６１−Ｓ２６３（１９９８）を参照のこと。
【００８２】
従って、マカクモデルは、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２および／または他のＨＩＶ−１中和抗体をコードするｒＡＡＶの投与の有利な効果を確証するために使用され得る。例えば、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２は、チャレンジＨＩＶ−１ウイルス（例えば、ＳＩＶｓｍ／Ｅ６６０（通常用いられるチャレンジウイルス以外の、よりストリンジェントなチャレンジを提示するマカクにおいてよりＡＩＤＳ様疾患を誘導するウイルス株））での感染の前、または感染後に、マカクへ１回以上の筋肉内注射によって投与される。中和抗体レベルをＰｏｌａｃｉｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（１０）：８２０１−８２１５（１９９９）に記載されるように、種々の時点で測定する。
【００８３】
ｒＡＡＶの投与は、ＳＩＶに曝露したマカクにおいて、以下のうちの１つ以上を生じる：ウイルス負荷の減少、低ウイルス負荷の維持、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の安定化、日和見感染症の発症または重篤度の減少、悪性腫瘍の発症の減少、および細胞媒介性免疫の欠損に代表的な症状の発症または重篤度の減少。上述のものは、当該技術に従って、各々、ＡＩＤＳ様疾患が進行しているか、またはＡＩＤＳ様疾患を進行する傾向にあるマカクと比較する。
【００８４】
（実施例８）
（ヒトへのＨＩＶ−１抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶの投与）
ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５、他のＨＩＶ−１抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ（または、以下の２つ以上の混合物）を、ＨＩＶ−１による感染に感受性の個体または、ＨＩＶ−１により感染した個体に投与され、ＡＩＤＳの進行を防ぐかまたは遅延する。
【００８５】
例えば、１回以上のｒＡＡＶの筋肉内注射が個体に投与される。ｒＡＡＶによってコードされる抗体ポリペプチドの産生レベルを、当該分野の標準的な技術によってモニタリングする。ＡＩＤＳに進行する可能性を、当該分野で標準的な技術による、ＨＩＶ−１ウイルス負荷およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の測定によりモニタリングする。ウイルス負荷が高いほど、個体はＡＩＤＳを発症する傾向が高い。ＣＤ４陽性Ｔ細胞のカウントが少ないほど、個体がＡＩＤＳを発症する傾向が高い。
【００８６】
ｒＡＡＶの投与は、ＨＩＶ−１に感染した場合の個体において、以下のうちの１つ以上を生じる：ウイルス負荷の減少、低ウイルス負荷の維持、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の安定化、日和見感染症の発症または重篤度の減少、悪性腫瘍の発症の減少、および細胞媒介性免疫の欠失の代表的な状態の発症または重篤度の減少。上述のものを、当該技術に従って、各々、ＡＩＤＳが進行しているかまたはＡＩＤＳに進行する傾向にある個体と比較する。
【００８７】
（実施例９）
（他の抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ）
他のｒＡＡＶ（例えば、同種移植拒絶のための抗体ポリペプチドＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ
ＯＫＴ３、ＰＣＴＡ補助剤としてのＲｅｏＰｒｏ、非ホジキンリンパ腫のためのＲｉｔｕｘａｎ、臓器拒絶のためのＳｉｍｕｌｅｃｔ、慢性関節性リウマチおよびクローン病のためのＲｅｍｉｃａｄｅ、臓器拒絶のためのＺｅｎａｐａｘ、ＲＳＶ感染のためのＳｙｎａｇｉｓ、転移性乳癌のためのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、急性骨髄性白血病のためのＭｙｌｏｔａｒｇ、慢性リンパ球白血病のためのＣａｍｐａｔｈ、非ホジキンリンパ腫のためのＺｅｖａｌｉｎおよび慢性関節性リウマチのためのＨｕｍｉｒａをコードするｒＡＡＶ）を、本明細書中に記載される方法に従って、作製および使用し得る。これらは、記された感染または疾患状態のためのヒトの用途に適用され得る。
【００８８】
本発明は、特定の実施形態観点から記載されているが、変更および改変が想起されることが当業者に理解される。従って、添付の特許請求の範囲に見えるような限定のみが、本発明に対して決定され得るべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における抗体ポリペプチドを生産する方法において使用するためのｒＡＡＶ組成物であって、該方法は、該動物の筋肉、肝臓または脳の細胞を、該抗体ポリペプチドの発現を惹起するに有効な量の該ｒＡＡＶ組成物で形質導入する工程を包含し、ここで、該ｒＡＡＶ組成物は、抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含むか、または、２つもしくはそれより多くの異なる抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶの混合物を含む、ｒＡＡＶ組成物。
【請求項２】
前記動物は、ヒトである、請求項１に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項３】
抗体ポリペプチドは、ウイルスタンパク質に対して指向される、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項４】
前記ウイルスタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルスタンパク質である、請求項３に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項５】
前記ｒＡＡＶ組成物が、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を含む、請求項４に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項６】
前記ｒＡＡＶ組成物が、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含む、請求項５に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項７】
抗体ポリペプチドは、細菌タンパク質に対して指向される、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項８】
抗体ポリペプチドは、慢性疾患状態に関連するタンパク質に対して指向される、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項１】
動物における抗体ポリペプチドを生産する方法において使用するためのｒＡＡＶ組成物であって、該方法は、該動物の筋肉、肝臓または脳の細胞を、該抗体ポリペプチドの発現を惹起するに有効な量の該ｒＡＡＶ組成物で形質導入する工程を包含し、ここで、該ｒＡＡＶ組成物は、抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含むか、または、２つもしくはそれより多くの異なる抗体ポリペプチドをコードするｒＡＡＶの混合物を含む、ｒＡＡＶ組成物。
【請求項２】
前記動物は、ヒトである、請求項１に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項３】
抗体ポリペプチドは、ウイルスタンパク質に対して指向される、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項４】
前記ウイルスタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルスタンパク質である、請求項３に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項５】
前記ｒＡＡＶ組成物が、ｒＡＡＶ／ＩｇＧ１ｂ１２を含む、請求項４に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項６】
前記ｒＡＡＶ組成物が、ｒＡＡＶ／ＳｃＦｖＸ５ゲノムを含む、請求項５に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項７】
抗体ポリペプチドは、細菌タンパク質に対して指向される、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ組成物。
【請求項８】
抗体ポリペプチドは、慢性疾患状態に関連するタンパク質に対して指向される、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−６８４６（Ｐ２０１０−６８４６Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８７８３（Ｐ２００９−２３８７８３）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【分割の表示】特願２００３−５８４２６８（Ｐ２００３−５８４２６８）の分割
【原出願日】平成１５年４月９日（２００３．４．９）
【出願人】（５０２２００８３０）ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【分割の表示】特願２００３−５８４２６８（Ｐ２００３−５８４２６８）の分割
【原出願日】平成１５年４月９日（２００３．４．９）
【出願人】（５０２２００８３０）ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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