説明

抗原結合タンパク質

本発明は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合タンパク質であって、該重鎖はCH1−CH2−CH3のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、該軽鎖はCLのN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン重鎖のC末端に連結され、および/または、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖のC末端に連結される抗原結合タンパク質、ならびにそのようなタンパク質の製造方法、およびその使用に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗原結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
【発明の概要】
【0003】
本発明は特に、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合タンパク質に関し、該重鎖はCH1−CH2−CH3のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、該軽鎖はCLのN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、該免疫グロブリン重鎖のC末端に連結され、および/または、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖のC末端に連結される。
【0004】
また、本発明は、本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖をコードしたポリヌクレオチド配列、および本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合タンパク質の軽鎖をコードしたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、等価のポリペプチド配列に相当するコード配列を示すが、このポリヌクレオチド配列を、開始コドン、適切なシグナル配列および停止コドンと共に発現ベクターに挿入することができることは理解されるであろう。
【0005】
本発明はさらに組み換え型の形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を提供し、この宿主細胞は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖、および軽鎖をコードした1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。
【0006】
さらに、本発明は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の産生方法を提供し、この方法は、本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質をコードするベクターを含む宿主細胞を、例えば無血清培地中で培養するステップを含む。
【0007】
本発明はさらに本明細書記載の抗原結合タンパク質および製薬上許容可能なキャリアを含む医薬品組成物を提供する。
【0008】
本発明はさらに、免疫疾患、例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患の治療における、そのような抗原結合タンパク質またはそのような抗原結合タンパク質を含む医薬組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】DMS4030を示す。
【図2】実施例3の結果を示す。
【図3】実施例4の結果を示す。
【図4】実施例5の結果を示す。
【図5】実施例5の結果を示す。
【0010】
定義
本明細書で使用される用語「抗原結合タンパク質」は、抗体、抗体断片および抗原に結合することができる他のタンパク質構築物である。
【0011】
本明細書で使用される用語「抗体足場」は、CH1−CH2−CH3からなる免疫グロブリン重鎖およびCLを有する免疫グロブリン軽鎖を含む足場を示す。
【0012】
本明細書で使用される用語CH1は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン1を示す。
【0013】
本明細書で使用される用語CH2は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン2を示す。
【0014】
本明細書で使用される用語CH3は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン3を示す。
【0015】
本明細書で使用される用語CLは、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインを示す。
【0016】
「ドメイン」は、他のタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。通常、ドメインは領域タンパク質の多様な機能特性の原因であり、多くの場合、残りのタンパク質および/またはドメインの機能を失うことなく、付加、除去または他のタンパク質に移動可能である。「単一抗体可変領域」は、抗体可変ドメインの配列特性を含む、折り畳まれたポリペプチド領域である。従って、これは完全抗体可変ドメイン、および、例えば、1つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特性を有しない配列、または切断されたまたはNやC末端延長部を含む抗体可変ドメイン、並びに少なくとも全長領域の結合活性と特異性を保持している可変ドメインの折り畳まれた断片、により置換された場合、等の修飾可変ドメインを含む。
【0017】
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、別の可変領域またはドメインに独立に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン(V,VHH,V)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の、別の可変領域または可変ドメインと共にある種のフォーマット(例えば、ホモまたはヘテロ多量体)で存在できる。この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによって抗原結合が要求されていない(すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは新たな可変ドメインとは独立に抗原に結合する)。本明細書で使われる場合、「ドメイン抗体」または「dAb」は、抗原に結合が可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、他の種、例えばげっ歯類(例はWO00/29004で開示),テンジクザメおよびラクダVHH免疫グロブリン単一可変ドメイン、等由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダVHHはラクダ,ラマ,アルパカ,ヒトコブラクダ,およびグアナコ等の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは元々軽鎖の欠けた重鎖抗体を産生する。このVHH領域は、当業者に利用可能な標準的な方法によりヒト化されてもよく、この領域も本発明による「ドメイン抗体」と考えられる。本明細書で使われる「V」はラクダVHHドメインを含む。NARVは、テンジクザメを含む軟骨魚類で特定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、これらの領域は、新規抗原受容体可変領域(通常、V(NAR)またはNARVと省略)としても知られる。詳細は、Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)および US20050043519A参照。
【0018】
用語「エピトープ結合ドメイン」は、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。これは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばヒトdAb(ドメイン抗体)、ラクダまたはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、またはその天然リガンド以外のリガンドへの結合を得るためにタンパク質工学による操作が行われた非Igドメイン、例えば、下記を含む群から選択された足場の誘導体であるドメインあってもよい:CTLA−4(Evibody);リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZ−領域(アフィボディ,SpA),A−領域(アビマー/マキシボディ(Maxibody));熱ショックタンパク質、例えばGroELとGroES;トランスフェリン(トランスボディ(Trans−body));アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C−タイプレクチン領域(テトラネクチン);ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilin);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチン(アドネクチン(アドネクチン));このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
【0019】
CTLA−4(細胞毒性Tリンパ球関連抗原4)は主にCD4+T細胞上に発現するCD28ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Igフォールドを有する。抗体のCDRに対応するループは、異種の配列と置換して異なる結合特性を出すことができる。異なる結合特異性有するように操作されたCTLA−4分子は、Evibodyとして知られている。詳細は、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照のこと。
【0020】
リポカリンは細胞外タンパク質ファミリー で、ステロイド, ビリン, レチノイドおよび脂質、等の小さな疎水性の 分子を輸送する。これらは、円錐形構造の開口端に多くのループがある強固なβ−シート二次構造を有し、これは別の標的抗原に結合するように操作できる。アンチカリンはサイズが160−180アミノ酸で、リポカリン由来である。詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 およびUS20070224633を参照のこと。
【0021】
アフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインA由来の足場で、抗原結合するように操作できる。このドメインは約58アミノ酸のらせん状束からなる。ライブラリは表面残基の無作為化により生成されている。詳細は、Protein Eng.Des.Sel.17, 455-462 (2004) および EP1641818A1を参照のこと。
【0022】
アビマーは、A−ドメイン足場ファミリー由来の多ドメインタンパク質である。約35アミノ酸の未変性ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、A−ドメインファミリー中の天然変異の混ぜ合わせにより生成されている。詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照のこと。
【0023】
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループに挿入する操作により別の標的抗原に結合させることができる。操作したトランスフェリン足場の例には、トランスボディがある。詳細は、J. Biol.Chem 274, 24066-24073 (1999)参照。
【0024】
設計アンキリンリピートタンパク質(DARPin)は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリン由来である。アンキリンの一回の繰り返しは33残基のチーフで、2つのα−らせんとβ−回転を含む。これらは、各繰り返し中の一つ目のα−らせんとβ−回転の残基を無秩序化することにより標的抗原に結合するよう操作できる。これらの結合面を、分子の数を増やすことにより増加させることができる(親和性成熟の方法)。詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)とJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) および US20040132028A1参照。
【0025】
フィブロネクチンは、抗原に結合させるように操作できる足場である。アドネクチンは、ヒトIII型フィブロネクチン(FN3)における15繰り返し単位の内の10番目のドメインの天然アミノ酸配列骨格からなる。β−サンドイッチの一端のループは操作によりアドネクチンに特異的に目的治療標的を認識させることができる。詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 および US6818418B1参照。
【0026】
ペプチドアプタマーはコンビナトリアル認識分子で、定常性足場タンパク質で構成され、このタンパク質の典型的例には、活性部位に挿入された制限付き可変ペプチドループを含むチオレドキシン(TrxA)がある。詳細は、Expert Opin.Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)参照。
【0027】
ミクロボディは、長さ25−50アミノ酸の自然発生のマイクロタンパク質由来で、3−4システインブリッジを含む。マイクロタンパク質の例には、KalataB1、コノトキシンおよびノッティン(knottin)がある。マイクロタンパク質は、ループを有し、これをマイクロタンパク質全体の折り畳みに影響を与えないで25アミノ酸まで含有するように操作できる。操作されたノッティンドメインの詳細については、WO2008098796参照。
【0028】
他のエピトープ結合ドメインには、別の標的抗原の結合特性を操作するための足場として使われてきたタンパク質、例えばヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン(affilin),ヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitzタイプドメイン,Ras−結合タンパク質AF−6のPDZドメイン、サソリ毒(カリブドトキシン),C−タイプレクチンドメイン(テトラネクチン)がある(これらは、Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)の7章Non-抗体足場sおよびProtein Science 15:14-27 (2006)でレビューされている)。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメイン由来であってもよい。
【0029】
本発明の一実施形態では、抗原結合性部位は、少なくとも、Kd値1mMで抗原に結合し、例えばBiacore(登録商標)、例えば、方法4または4で記載されるBiacore(登録商標)法で測定してKd値10nM,1nM,500pM,200pM,100pM,で各抗原に結合する。
【0030】
本明細書で使われる用語「抗原結合性部位」は、抗原に特異的に結合可能なタンパク質上の部位を指し、単一ドメイン,例えばエピトープ結合ドメインであっても、抗原に結合することができる受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインの部分であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合タンパク質を提供し、ここで、重鎖はCH1−CH2−CH3のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、軽鎖はCLのN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン重鎖のC末端に連結され、および/または、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖のC末端に連結される。
【0032】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は2つの同一の重鎖および2つの同一の軽鎖を有し、これらの重鎖および軽鎖は細胞内で発現されると、会合して、抗体様ヘテロ四量体構造を形成する。
【0033】
本発明の抗原結合タンパク質は抗体足場を含む。これは、任意のアイソタイプの抗体、例えばIgG1,IgG2,IgG3,IgG4またはIgG4PEから選択され得る。
【0034】
本発明の一実施形態では、少なくとも1つのエピトープ結合ドメインは免疫グロブリン単一可変ドメインである。別の実施形態では、重鎖のN末端および軽鎖のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインは免疫グロブリン単一可変ドメインである。さらに別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはすべて、免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【0035】
本発明の一実施形態では、少なくとも1つのエピトープ結合ドメインは非Igドメインである。別の実施形態では、重鎖のN末端および軽鎖のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン単一可変ドメインであり、重鎖のC末端および/または軽鎖のC末端に連結されたエピトープ結合ドメインは非Igドメインである。別の実施形態では、重鎖のN末端および軽鎖のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインは、非Igドメインであり、重鎖のC末端および/または軽鎖のC末端に連結されたエピトープ結合ドメインは免疫グロブリン単一可変ドメインである。さらに別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはすべて、非Igドメインである。
【0036】
いずれかの本明細書記載の抗原結合タンパク質は1つまたは複数の抗原を中和することができることは、理解されるであろう。
【0037】
本発明の抗原結合タンパク質に関連して本明細書で使われる用語「中和する」およびその文法的変形体は、本発明の抗原結合タンパク質の存在下、このような抗原結合タンパク質の無い場合の標的の活性に比較して、全体的または部分的に標的の生物活性が低下することを意味する。これに限定されないが、中和が、1つまたは複数のリガンドのブロッキング、受容体を活性化するリガンドの阻害、受容体の発現低下、またはエフェクター機能への作用、によるものであってもよい。
【0038】
中和のレベルはいくつかの方法、例えば、下記実施例において設定されるアッセイ法のいずれかを使用することにより、例えば、リガンドの受容体への結合の阻害を測定するアッセイ法において測定可能である。この測定法は、例えば実施例3に記載のように実施され得る。このアッセイでは、VEGFR2の中和は、中和する抗原結合タンパク質の存在下でリガンドとその受容体間の結合の減少を評価することにより測定される。
【0039】
中和を評価する他の方法で、例えば中和する抗原結合タンパク質の存在下、リガンドとその受容体間の結合低下を評価することにより測定する方法は、当業者には既知であり、例えばBiacore(登録商標)アッセイがある。
【0040】
本発明の別の態様では、少なくとも実質的に本明細書で例示されている抗原結合タンパク質と等価な中和活性を有する抗原結合タンパク質が提供される。
【0041】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はVEGFに対し特異性を有し、例えばVEGFに結合する少なくとも1つのエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンチカリン、またはVEGFに結合するアドネクチンを含む。
【0042】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はVEGFR2に対し特異性を有し、例えば、VEGFR2に結合する少なくとも1つのエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはVEGFR2に結合するアドネクチンを含む。
【0043】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はTNFαに対し特異性を有し、例えばTNFαに結合する少なくとも1つのエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはTNFαに結合するアドネクチンを含む。
【0044】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はIL−13に対し特異性を有し、例えばIL−13に結合する少なくとも1つのエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはIL−13に結合するアドネクチンを含む。
【0045】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はHER2に対し特異性を有し、例えばHER2に結合する少なくとも1つのエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはHER2に結合するアドネクチンを含む。
【0046】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は唯一1つの抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明はTNFαに結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
【0047】
別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は1を超える抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明は、VEGF,TNFαおよびEGFRから選択される2つ以上の抗原に結合することができる抗原結合タンパク質、例えば、VEGFおよびEGFRに結合することができる抗原結合タンパク質、またはVEGFおよびTNFαに結合することができる抗原結合タンパク質、またはTNFαおよびEGFRに結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
【0048】
さらなる実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は少なくとも3つの抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明は、VEGF,TNFαおよびEGFRに結合することができる抗原結合タンパク質、例えば、配列番号7,8および9で設定されたエピトープ結合ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。
【0049】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、VEGFおよびEGFRに同時に、またはTNFαおよびVEGFに同時に、またはTNFαおよびEGFRに、またはTNFαおよびVEGFおよびEGFRに同時に結合することができる。
【0050】
本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質が、例えば実施例6に記載されたような適切なアッセイを使った化学量論的解析により測定して、同時に2つ以上の抗原に結合可能であってもよいことは理解されよう。
【0051】
そのような抗原結合タンパク質の例としては、VEGFに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインまたは抗VEGFアンチカリン、例えば配列番号7で設定されたdAb、または配列番号41で設定されたアンチカリンを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
【0052】
そのような抗原結合タンパク質の例としては、VEGFR2に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号39で設定されたアドネクチンを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
【0053】
そのような抗原結合タンパク質の例としては、EGFRに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗EGFR免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号8で設定されたdAbを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
【0054】
そのような抗原結合タンパク質の例としては、EGFRに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗Il1R1免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号9で設定されたdAbを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
【0055】
そのような抗原結合タンパク質の例としては、TNFαに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗TNFαアドネクチン、例えば配列番号40で設定されたアドネクチンを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
【0056】
同じまたは異なる抗原特異性を有するエピトープ結合ドメインは、そのC末端またはN末端に結合される。
【0057】
本発明の一実施形態では、本明細書記載の発明に従った、ADCCおよび/または補体活性化またはエフェクター機能を低減するように定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。このような一実施形態では、重鎖定常領域は、IgG2またはIgG4アイソタイプの本来の無効化定常領域または変異IgG1定常領域を含んでもよい。適切な修飾の例は、EP0307434に記載されている。一例では、位置235および237(EUインデックスナンバリング)のアラニン残基の置換が含まれる。
【0058】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Fc機能、例えばADCCおよびCDC活性の1つまたは両方を有する。
【0059】
本発明の抗原結合タンパク質は、何らかのエフェクター機能を有しうる。例えば、抗体足場がエフェクター機能を有する抗体由来のFc領域を含む場合、例えば、抗体足場がIgG1由来のCH2およびCH3を含む場合である。エフェクター機能のレベルは、既知の技術、例えば、CH2ドメインの変異により、例えば、IgG1 CH2ドメインが239および332および330から選択された位置に1つまたは複数の変異を有する場合、例えば、変異がS239DおよびI332EおよびA330Lから選択され、その抗体が強化されたエフェクター機能を有するようにする技術、および/または、例えば、本発明の抗原結合タンパク質のグリコシレーションプロファイルを変えてFc領域のフコシル化を減少させる技術、等の技術により変えることができる。
【0060】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、免疫グロブリン単一可変ドメインであるエピトープ結合ドメインを含み、例えば、エピトープ結合ドメインがヒトVまたはヒトVであっても、ラクダVHHまたはサメ免疫グロブリン単一可ドメイン(NARV)であってもよい。
【0061】
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、下記の群から選択された非Ig足場の誘導体であるエピトープ結合ドメインを含む。CTLA−4(Evibody);リポカリン;プロテインA由来分子例えばプロテインAのZドメイン(アフィボディ,SpA),Aドメイン(アビマー/マキシボディ);GroELやGroES等の熱ショックタンパク質;トランスフェリン(トランスボディ);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C−タイプレクチンドメイン(テトラネクチン);ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilin);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチン(アドネクチン);このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
【0062】
本発明の一実施形態では、6つのエピトープ結合ドメイン、例えば、抗体足場の各重鎖のN末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、抗体足場の各軽鎖のN末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、および抗体足場の各重鎖のC末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、または例えば抗体足場の各重鎖のN末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、抗体足場の各軽鎖のN末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、および抗体足場の各軽鎖のC末端に連結された1つのエピトープ結合ドメインが存在する。
【0063】
本発明の別の実施形態では、8つのエピトープ結合ドメイン、例えば、抗体足場の各重鎖のN末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、抗体足場の各軽鎖のN末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、抗体足場の各重鎖のC末端に連結された1つのエピトープ結合ドメイン、および抗体足場の各軽鎖のC末端に連結された1つのエピトープ結合ドメインが存在する。
【0064】
2つのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよく、抗原結合タンパク質中に存在する4つ、または全てのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよい。
【0065】
本発明の抗体足場は、リンカーを使ってエピトープ結合ドメインに連結してもよい。適切なリンカーの例は、長さで1アミノ酸〜150アミノ酸,または1アミノ酸〜140アミノ酸,例えば、1アミノ酸〜130アミノ酸,または1〜120アミノ酸,または1〜80アミノ酸,または1〜50アミノ酸,または1〜20アミノ酸,または1〜10アミノ酸,または5〜18アミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。このような配列は、それ自身の三次構造を有してもよく、例えば、本発明のリンカーが単一可変ドメインを含んでもよい。一実施形態では、リンカーのサイズは、単一可変ドメインと同等である。適切なリンカーは、サイズが1〜20オングストロームであってもよく、例えば、15オングストローム未満,または10オングストローム未満,または5オングストローム未満であってもよい。
【0066】
本発明の一実施形態では、少なくとも1つのエピトープ結合ドメインは抗体足場に直接に結合し、この足場は、1〜150アミノ酸、例えば、1〜50アミノ酸、例えば1〜20アミノ酸、例えば1〜10アミノ酸からなるリンカーを有している。このようなリンカーは、配列番号10〜38、または配列番号42〜44で示されるもののいずれか1つから選択することができ、または、これらリンカーの複合であってもよい。
【0067】
本発明の抗原結合タンパク質で使用するリンカーは、単体でも他のリンカー、1つまたは複数のGS残基のセット、例えば、「GSTVAAPS」(配列番号44)または「TVAAPSGS」(配列番号11)または「GSTVAAPSGS」(配列番号18)であってもよい。
【0068】
一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(PAS)(GS)」により抗体足場に連結している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(GGGGS)(GS)」により抗体足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(TVAAPS)(GS)」により抗体足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(GS)(TVAAPSGS)」により抗体足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(PAVPPP)(GS)」により抗体足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(TVSDVP)(GS)」により抗体足場に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(TGLDSP)(GS)」により抗体足場に結合している。この全ての実施形態で、n=1〜10,およびm=0〜4である。
【0069】
このようなリンカーに例には、(PAS)(GS)ここでn=1およびm=1(配列番号24),(PAS)(GS)ここでn=2およびm=1(配列番号25),(PAS)(GS)ここでn=3およびm=1(配列番号26),(PAS)(GS)ここでn=4およびm=1,(PAS)(GS)ここでn=2およびm=0,(PAS)(GS)ここでn=3およびm=0,(PAS)(GS)ここでn=4およびm=0がある。
【0070】
このようなリンカーに例には、(GGGGS)(GS)ここでn=1およびm=1,(GGGGS)(GS)ここでn=2およびm=1,(GGGGS)(GS)ここでn=3およびm=1,(GGGGS)(GS)ここでn=4およびm=1,(GGGGS)(GS)ここでn=2およびm=0(配列番号:28),(GGGGS)(GS)ここでn=3およびm=0(配列番号:29),(GGGGS)(GS)ここでn=4およびm=0がある。
【0071】
このようなリンカーに例には、(TVAAPS)(GS)ここでn=1およびm=1,(TVAAPS)(GS)ここでn=2およびm=1,(TVAAPS)(GS)ここでn=3およびm=1,(TVAAPS)(GS)ここでn=4およびm=1,(TVAAPS)(GS)ここでn=2およびm=0,(TVAAPS)(GS)ここでn=3およびm=0,(TVAAPS)(GS)ここでn=4およびm=0がある。
【0072】
このようなリンカーに例には、(GS)(TVAAPSGS)ここでn=1およびm=1(配列番号:18),(GS)(TVAAPSGS)ここでn=2およびm=1(配列番号:19),(GS)(TVAAPSGS)ここでn=3およびm=1(配列番号:20),または(GS)(TVAAPSGS)ここでn=4およびm=1(配列番号:21),(GS)(TVAAPSGS)ここでn=5およびm=1(配列番号:22),(GS)(TVAAPSGS)ここでn=6およびm=1(配列番号:23),(GS)(TVAAPSGS)ここでn=1およびm=0(配列番号:11),(GS)(TVAAPSGS)ここでn=2およびm=10,(GS)(TVAAPSGS)ここでn=3およびm=0,または(GS)(TVAAPSGS)ここでn=0がある。
【0073】
このようなリンカーに例には、(PAVPPP)(GS)ここでn=1およびm=1(配列番号14),(PAVPPP)(GS)ここでn=2およびm=1,(PAVPPP)(GS)ここでn=3およびm=1,(PAVPPP)(GS)ここでn=4およびm=1,(PAVPPP)(GS)ここでn=2およびm=0,(PAVPPP)(GS)ここでn=3およびm=0,(PAVPPP)(GS)ここでn=4およびm=0がある。
【0074】
このようなリンカーに例には、(TVSDVP)(GS)ここでn=1およびm=1(配列番号15),(TVSDVP)(GS)ここでn=2およびm=1,(TVSDVP)(GS)ここでn=3およびm=1,(TVSDVP)(GS)ここでn=4およびm=1,(TVSDVP)(GS)ここでn=2およびm=0,(TVSDVP)(GS)ここでn=3およびm=0,(TVSDVP)(GS)ここでn=4およびm=0がある。
【0075】
このようなリンカーに例には、(TGLDSP)(GS)ここでn=1およびm=1(配列番号16),(TGLDSP)(GS)ここでn=2およびm=1,(TGLDSP)(GS)ここでn=3およびm=1,(TGLDSP)(GS)ここでn=4およびm=1,(TGLDSP)(GS)ここでn=2およびm=0,(TGLDSP)(GS)ここでn=3およびm=0,(TGLDSP)(GS)ここでn=4およびm=0がある。
【0076】
別の実施形態では、エピトープ結合ドメインおよび抗体足場の間にはリンカーが存在しない。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「TVAAPS」により抗体足場に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「TVAAPSGS」により抗体足場に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「GS」により抗体足場に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ASTKGPT」により抗体足場に結合する。
【0077】
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ヒト血清アルブミンに結合可能な少なくとも1つのエピトープ結合ドメインを含む。
【0078】
また、本発明は医薬に使用するための抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、血管新生経路の阻害および炎症促進性サイトカインのブロックを受けやすい疾患の治療において、例えば、免疫疾患,例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス,多発性硬化症,クローン病,乾癬,または関節炎疾患,例えば関節リウマチの治療薬製造に使用するために有用であり得る。
【0079】
本発明は、免疫疾患,例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス,多発性硬化症,クローン病,乾癬,または関節炎疾患、例えば関節リウマチの患者を治療する方法を提供し、これは、本発明の治療量の抗原結合タンパク質の投与を含む。
【0080】
本発明の抗原結合タンパク質は、免疫疾患,例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス,多発性硬化症,クローン病,乾癬,または関節炎疾患、例えば関節リウマチの治療のために使用することができる。
【0081】
本発明に使われるエピトープ結合ドメインは、別の可変領域またはドメインと独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインであり、これは、ドメイン抗体であっても、または下記の群から選択された足場の誘導体であるドメインであってもよい。CTLA−4(Evibody);リポカイン;プロテインA誘導分子、例えばプロテインAのZドメイン(アフィボディ,SpA),Aドメイン(アビマー/マキシボディ);熱ショックタンパク質、例えばGroELおよびGroES;トランスフェリン(トランスボディ);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;Cタイプレクチンドメイン(テトラネクチン);ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン(affilin);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチン(アドネクチン);このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われた。一実施形態では、これはドメイン抗体であってもよく、また他の適切なドメイン、例えば、CTLA−4,リポカリン,SpA,アフィボディ,アビマー,GroEL,トランスフェリン,GroESおよびフィブロネクチンからなる群から選択されたドメインであってもよい。一実施形態では、これは免疫グロブリン単一可変ドメイン、アフィボディ,アンキリンリピートタンパク質(DARPin)およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、アフィボディ,アンキリンリピートタンパク質(DARPin)およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、ドメイン抗体、例えば、ヒト,ラクダまたはサメ(NARV)ドメイン抗体から選択されたドメイン抗体であってもよい。
【0082】
エピトープ結合ドメインは、1つまたは複数の位置で抗体足場に連結可能である。この位置には、抗体足場のC末端およびN末端が含まれる。例えば、抗体足場のFc部に直接連結してもよく、あるいは、抗体足場の受容体または細胞表面タンパク質部分の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインに連結してもよい。受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインが、Fc部のN末端に連結する場合、エピトープ結合ドメインは、Fc部のC末端あるいは受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインのN末端に直接連結してもよい。
【0083】
一実施形態では、第1のエピトープ結合ドメインが抗体足場に連結し、第2のエピトープ結合ドメインが第1のエピトープ結合ドメインに連結し、例えば、第1のエピトープ結合ドメインが抗体足場のC末端に連結してもよく、そのエピトープ結合ドメインがそのC末端の位置で第2のエピトープ結合ドメインに連結でき、または例えば、第1のエピトープ結合ドメインは、抗体足場のN末端に連結してもよく、その第1のエピトープ結合ドメインはそのN末端の位置で第2のエピトープ結合ドメインにさらに連結してもよい。エピトープ結合ドメインがドメイン抗体である場合は、一部のドメイン抗体が足場内の特定の位置に適合することがある。
【0084】
nsのN末端が抗体定常ドメインに融合している抗原結合タンパク質の場合は、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびFc部の間のペプチドリンカーは、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原に結合するのを支援することができる。事実、免疫グロブリン単一可変ドメインのN末端は、抗原結合活性に関わる相補性決定領域(CDR)の近傍に配置される。従って、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインおよびFc部の間のスペーサーとして作用し、これにより免疫グロブリン単一可変ドメインCDRをより容易に抗原に近づけることができ、従って高い親和性での結合が可能となる。
【0085】
免疫グロブリン単一可変ドメインがIgGに結合する環境は、融合しようとする抗体鎖によって異なる:
Fc部のC末端で融合する場合は、各免疫グロブリン単一可変ドメインはFc部のC3ドメインの近くに配置されることが期待される。これはFc受容体(例えば、FcγRI,II,IIIおよびFcRn)へのFc結合特性に影響することは期待できない。理由は、これらの受容体が、C2ドメイン(FcγRI,IIおよびIIIクラスの受容体の場合)またはC2およびC3ドメイン間のヒンジ(例えば、FcRn受容体の場合)と結合しているからである。このような抗原結合タンパク質の別の特徴は、両免疫グロブリン単一可変ドメインが相互に空間的に接近していることが期待され、適切なリンカーにより与えられた柔軟性があるという条件下、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインはホモ二量体でさえ形成でき、従って、Fc部の「ジップド(zipped)」四次構造化を促進し、このタンパク質の安定性を高めることができる。
【0086】
このような構造の考察は、エピトープ結合ドメインに結合する最も適切な位置、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗体足場上の位置の選択の助けとなり得る。
【0087】
免疫グロブリン単一可変ドメインの溶液中結合状態と方法の理解も有益である。インビトロでdAbは単量体での存在が多く、溶液中ではホモ二量体か多量体が多いという根拠が蓄積されてきた(Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365)。これはIgドメインと一緒のインビボで観察された多量体発生、例えば、ベンスジョーンズタンパク質(免疫グロブリン軽鎖の二量体 (Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301)およびamyloid fibers (James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8)、を強く想起させる。
【0088】
例えば、溶液中では二量体化する傾向のドメイン抗体を抗体足場のN末端よりもFc部のC末端に結合させることが望ましいという可能性もある。理由は、Fc部のC末端への結合により本発明の抗原結合タンパク質との関連で、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインをより容易に二量体化させると思われるためである。
【0089】
本発明の抗原結合タンパク質は、単一抗原に特異的な抗原結合性部位を含んでもよく、2つ以上の抗原または単一抗原上の2つ以上のエピトープに対し特異的な抗原結合性部位を有してもよく、また、抗原結合性部位のそれぞれが同じまたは異なる抗原上の別々のエピトープに対し特異的であってもよい。
【0090】
また、本発明は医薬に使用するための、例えば免疫疾患,例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス,多発性硬化症,クローン病,乾癬,または関節炎疾患,例えば関節リウマチの治療薬製造に使用するための抗原結合タンパク質を提供する。
【0091】
特に、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫疾患,例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス,多発性硬化症,クローン病,乾癬,または関節炎疾患,例えば関節リウマチの治療に有用であり得る。
【0092】
本発明は、免疫疾患,例えば自己免疫疾患,または癌,または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス,多発性硬化症,クローン病,乾癬,または関節炎疾患、例えば関節リウマチの患者を治療する方法を提供し、これは、本発明の治療量の抗原結合タンパク質の投与を含む。
【0093】
本発明の抗原結合タンパク質は、本発明の抗原結合タンパク質のためのコード配列を含む発現ベクターを有する宿主細胞のトランスフェクションにより産生可能である。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞に対する複製および発現、および/または分泌を制御できる通常の制御配列の操作環境にこれらの抗原結合タンパク質に対するコード配列を置くことにより産生可能である。調節配列には、プロモータ配列,例えば、CMVプロモータ,および他の既知抗体から得られたシグナル配列が含まれる。
【0094】
選択された宿主細胞は、ベクターを使って通常の技術によりトランスフェクトされ、組換えまたは合成重鎖を含む本発明のトランスフェクトした宿主細胞が作られる。このトランスフェクトされた細胞は、次に通常の技術により培養され本発明の操作された抗原結合性タンパク質が産生される。抗原結合タンパク質は適切なアッセイ、例えば、ELISAやRIA、により培養物からスクリーニングされる。同様の通常の技術を採用して、他の抗原結合タンパク質を構築することが可能である。
【0095】
本方法で採用されたクローニングおよびサブクローニングステップのための適切なベクター、および、本発明の組成物の作成は当業者により選択されうる。例えば、通常のクローニングベクターのpUCシリーズを使用可能である。1つのベクター、pUC19、は市販品で、Amersham(バッキンガムシャー州,英国)またはPharmacia(ウプサラ、スウェーデン)、等のサプライハウスから入手可能である。さらに、容易に複製可能で、多くのクローニングサイトと選択可能な遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を有し、容易に操作できる、いずれのベクターもクローニングの目的に使用可能である。従って、クローニングベクターの選択は本発明における制約因子ではない。
【0096】
また、発現ベクターを、異種のDNA塩基配列の発現、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)、を増幅するための適切な遺伝子により特徴づけることができる。他のベクター配列には、ポリAシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン(BGH)由来の配列、およびβ‐グロビンプロモータ配列(betaglopro)が含まれる。本明細書で使える発現ベクターは、当業者にはよく知られた技術により合成してもよい。
【0097】
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン,選択遺伝子,エンハンサー,プロモータ,シグナル配列、等、は市販または天然の入手源から入手してもよく、また、選択宿主中の組換えDNAの生成物の発現および/または分泌の誘導に使用される既知手順により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌の発現に関する技術分野で既知の多くのタイプがある他の適切な発現ベクターもこの目的に選択してもよい。
【0098】
また、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドをトランスフェクトされた細胞株を包含する。これらクローニングベクターのクローニングと他の操作に有用な宿主細胞もまた従来からあるものである。しかし、種々の大腸菌株由来の細胞は、本発明の抗原結合タンパク質作成におけるクローニングベクターや他のステップの複製に使うことができる。
【0099】
本発明の抗原結合タンパク質の発現のための適切な宿主細胞または細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、NS0,Sp2/0,CHO(例えば、DG44),COS,HEK,繊維芽細胞(例えば、3T3),および骨髄細胞、例えば、これはCHOまたは骨髄細胞中で発現してもよい、が含まれる。ヒト細胞を使って、分子をグリコシレーションパターンで修飾させてもよい。あるいは、他の真核細胞株を採用してもよい。哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換,培養,増幅,スクリーニングと生成物産生および精製の方法は、当業者には既知である。例えば、前述のSambrook et alを参照。
【0100】
細菌細胞は、組換えFabの発現のため、または本発明の他の実施形態のために適切な宿主細胞として有用であり得る(例えば、Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)参照)。しかし、細菌細胞で発現したタンパク質は、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれた形式または非グリコシル化形式になる傾向があるため,細菌細胞中で産生されたいずれの組換え抗原結合タンパク質も抗原結合能力の保持の観点でスクリーニングしなければならなくなる。細菌細胞で発現された分子が正しく折り畳まれた形式で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主となるだろう。あるいは、別の実施形態で、分子が細菌宿主中で発現され、引き続き再折り畳みされることが可能である。例えば、発現に使われる種々の大腸菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。種々の枯草菌、ストレプトマイセス,他の桿菌等の株もまたこの方法に採用できる。
【0101】
所望の場合は、当業者に既知の酵母細胞株もまた、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエと鱗翅類、およびウイルス発現システムと同様に、宿主細胞として入手可能である。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)、および本明細書に引用の文献を参照のこと。
【0102】
ベクターが作成される一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要なトランスフェクト方法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を産生するために必要な培養方法、は全て従来からの技術であってもよい。典型的には,本発明の培養方法は無血清培養方法で,通常細胞を無血清懸濁液中で培養する。同様に、本発明の抗原結合タンパク質を一度産生した後、細胞培養内容物を当分野の標準的手法、例えば、硫安塩析法,アフィニティーカラム,カラムクロマトグラフイー,ゲル電気泳動法、等、により精製してもよい。このような技術は、当該分野の技術の範囲内にあり本発明を制限するものではない。例えば、改変抗体の調製に関しては、WO 99/58679 および WO 96/16990に記載されている。
【0103】
抗原結合タンパク質のさらに別の発現法では、トランスジェニック動物中での発現を使用してもよい。この例は、U.S. Patent No.4,873,316に記載されている。これは、動物カゼインプロモータを使った発現システムであり、このプロモータは、遺伝子導入で哺乳動物に取り込んだ場合、雌のミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させる。
【0104】
本発明のさらなる態様では、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法を提供し、この方法は本発明の抗原結合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養し、これにより産生された抗原結合タンパク質を回収するステップを含む。
【0105】
本発明に従って、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、
(a)抗原結合性タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含むベクターを提供するステップと;
(b)哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO)を前記ベクターで形質転換するステップと;
(c)抗原結合タンパク質を前記宿主細胞から前記培地へ分泌を促す条件下で、ステップ(c)の宿主細胞を培養するステップと;
(d)分泌されたステップ(d)の抗原結合タンパク質を回収するステップと、
を含む。
【0106】
所望の方法で発現された後、抗原結合タンパク質のインビトロ活性を適切なアッセイにより調査する。現在よく使われるELISAアッセイ方式を採用し、標的に対する抗原結合タンパク質の定性および定量結合評価を行う。さらに、他のインビトロアッセイを使って、通常のクリアランス機序にも関わらす体の中に残留している抗原結合タンパク質を評価するため実施されるヒトの臨床試験の前に中和性能を確認する。
【0107】
治療の用量と持続時間は、ヒトの循環系における本発明の分子の相対的持続時間に関係し、治療条件と患者の全体的健康状態に依存して当業者により調節可能である。最大の治療効果を得るためには、長期間にわたる(例えば、4〜6ヶ月間)反復投薬(例えば、週一回または2週間に一回)が、必要となる可能性があることが想定される。
【0108】
本発明の治療薬の投与方法は、宿主に薬剤を送達する任意の適切なルートであってよい。本発明の抗原結合タンパク質,および医薬品組成物は、非経口投与、すなわち、皮下(s.c.),髄腔内,腹腔内,筋肉内(i.m.),静脈内(i.v.),または鼻腔内の投与に特に有用である。
【0109】
本発明の治療薬は、有効量の本発明の抗原結合タンパク質を製薬上許容可能なキャリア中の有効成分として含む医薬品組成物として調製されてもよい。本発明の予防薬としては、抗原結合タンパク質を含む水性懸濁液または水溶液は、生理的pHに緩衝され注射の準備ができた形としてもよい。非経口投与用組成物は、通常、本発明の抗原結合タンパク質の溶液、または製薬上許容可能なキャリア、例えば水性キャリア、に溶解したそのカクテルを含む。種々の水性キャリアは、例えば、0.9%食塩水,0.3%グリシン,等を用いてもよい。これらの溶液は、無菌状態で、通常、粒子状物質の無い状態にされる。これらの溶液は、通常のよく知られた滅菌技術(例えば、濾過)により無菌にされる。組成物は、適切な生理学的条件に必要とされる、例えば、pH調節剤および緩衝剤等のような製薬上許容可能な補助物質を含んでもよい。このような製剤処方での本発明の抗原結合タンパク質の濃度は、広く変動可能で、すなわち、重量%で約0.5%未満から,通常、約1%または少なくとも約1%、そして15〜20%までになり、また、選択された具体的な投与方法に従って流体容量,粘性、等に基づき一次的に選択される。
【0110】
従って、本発明の筋肉内注射用医薬品組成物は、1mLの無菌緩衝水、および約1ng〜約100mg、例えば、約50ng〜約30mg、または、約5mg〜約25mg,の本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。同様に、本発明の点滴静注用医薬品組成物は、約250mlの無菌リンゲル液,および約1〜約30mg、または約5mg〜約25mgの1ml当たりのリンゲル液中の本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。非経口投与組成物を調製する実際の方法は既知で、当業者には明らかであり、さらに詳細は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, イーストン,ペンシルベニア州、に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合タンパク質製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci. Tech. today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M. C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers, M. J."Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S."Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922, Ha, E Wang W, Wang Y. j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)、を参照のこと。この全内容は参照により本明細書に組み込まれ、具体的に参照される。
一実施形態では、医薬品として用いる場合、本発明の治療薬はユニット剤形として存在する。適切な治療有効量は当業者には容易に決定可能である。適切な用量は患者の体重により計算され、例えば、0.01〜20mg/kg,例えば0.1〜20mg/kg,例えば1〜20mg/kg,例えば10〜20mg/kgまたは例えば1〜15mg/kg,例えば10〜15mg/kgの範囲であってもよい。本発明の有効ヒト治療条件の使用に関して、適切な用量は0.01〜1000mg,例えば0.1〜1000mg,例えば0.1〜500mg,例えば500mg,例えば0.1〜100mg,または0.1〜80mg,または0.1〜60mg,または0.1〜40mg,または例えば1〜100mg,または1〜50mg,の範囲内の本発明の抗原結合タンパク質であってもよく、これらは非経口、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内投与できる。このような用量は、必要なら、医師により選択された適切な時間間隔で反復してもよい。
【0111】
本明細書記載の抗原結合タンパク質は、貯蔵のための冷凍乾燥が可能で、使用に先立ち適切なキャリア中で再構成できる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示され、既知技術の凍結乾燥と再構成技術を用いることができる。
【0112】
当技術分野で既知のいくつかの方法を使って本発明に使われるエピトープ結合ドメインを見つけることが可能である。
【0113】
用語「ライブラリ」は、ポリペプチドまたは核酸の不均一混合物を指す。ライブラリは、それぞれ単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーからなる。この点で、「ライブラリ」は「レパートリー」と同義である。ライブラリメンバー間の配列の差異は、ライブラリ中に存在する多様性の原因である。ライブラリはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、また、核酸のライブラリで形質転換された生命体または細胞の形、例えば、細菌、ウイルス、動物、または植物、等の形であってもよい。一実施例では、それぞれの生命体または細胞は1つのみまたは限られた数のライブラリメンバーを含む。都合のいいことに、核酸によってコードされたポリペプチドを発現させるために核酸が発現ベクターの中に組み込まれる。一態様では、従って、ライブラリは宿主生物の集合体の形を取ることができ、各生命体は、発現して対応するポリペプチドメンバーを産生することが可能な核酸型の単一ライブラリメンバーを含んだ1つまたは複数の発現ベクターのコピーを含む。従って、この宿主生物の集合体は多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
【0114】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Kabatの定義(“配列s of Proteins of Immunological Interest”, 米国保健社会福祉省)の配列中に保存された抗体領域に対応する単一抗体フレームワーク配列、またはChothiaとLeskの定義(Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917)によるヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。これは、単一フレームワークでも、これらのフレームワークの集合体であってもよく、たとえ高頻度可変領域にのみある変異だったにしても、実質的にいかなる結合特異性の誘導も許容することが認められてきた。
【0115】
本明細書で定義されたアミノ酸およびヌクレオチド配列の整合性と相同性,類似性または同一性は、一実施形態中で調製され、デフォルトのパラメーターを使ってBLAST2 配列アルゴリズムにより測定されている(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))。
【0116】
ディスプレイシステム(例えば、核酸のコード化機能、および、核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイシステム)が、本明細書記載の方法中で、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインまたは他のエピトープ結合ドメインの選択において、使われた場合、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅するまたは増やすことは、好都合なことが多い。これは、本明細書記載の方法や他の適切な方法を使って追加のラウンドのために、あるいは、追加のレパートリー(例えば、親和性成熟レパートリー)を調製するために、十分な量の核酸および/またはペプチドまたはポリペプチドを得る効率的な手段を提供する。従って、一部の実施形態では、エピトープ結合ドメイン選択方法は、ディスプレイシステム(例えば、ファージディスプレイのような、核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイ)の使用を含み、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅するまたは増やすことをさらに含む。核酸は、任意の適切な方法、例えば、ファージ増幅,細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応、を使って増幅可能である。
【0117】
一実施例では、この方法は核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたポリペプチドの物理的、化学的、および/または機能的特性にリンクしたディスプレイシステムを用いる。このようなディスプレイシステムは、複数の複写可能な遺伝子パッケージ(genetic package)、例えば、バクテリオファージまたは細胞(細菌)、を含むことができる。ディスプレイシステムは、ライブラリ、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリ、を含んでもよい。バクテリオファージディスプレイはディスプレイシステムの一例である。
【0118】
多くの適切なバクテリオファージディスプレイシステム(例えば、一価のディスプレイおよび多価のディスプレイシステム)が記載されてきた(例えばGriffiths et al., U.S. Patent No. 6,555,313 B1(参照により本明細書に組み込まれる);Johnson et al., U.S. Patent No. 5,733,743 (参照により本明細書に組み込まれる); McCafferty et al., U.S. Patent No. 5,969,108 (参照により本明細書に組み込まれる); Mulligan-Kehoe, U.S. Patent No. 5,702,892 (参照により本明細書に組み込まれる); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)、参照)。バクテリオファージディスプレイシステムで提示されたペプチドまたはポリペプチドは、いずれの適切なバクテリオファージ、例えば、線状ファージ(例えば、fd,M13,F1),溶菌ファージ(例えば、T4,T7,ラムダ),またはRNAファージ(例えば、MS2)、上にも提示可能である。
【0119】
通常、適切なファージコートタンパク質(例えば、fd pIIIタンパク質)との融合タンパク質としてペプチドまたはファージポリポリペプチドのレパートリーを提示するファージライブラリは、産生されるか提供される。融合タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドファージコートタンパク質の先端、または所望なら内部の位置、にペプチドまたはポリペプチドを提示できる。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドは、pIIIのアミノ末端からドメイン1まで存在可能である(pIIIのドメイン1はN1とも呼ばれる)。提示されたポリペプチドは、直接pIIIに(例えば、pIIIのドメイン1のN末端)またはリンカーを使ってpIIIに融合可能である。所望なら,融合体はタグ(例えば、mycエピトープ,Hisタグ)をさらに含むこともできる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として提示されたペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリは、任意の適切な方法を用いて産生可能である。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドをコードしたファージベクターライブラリやファージミドベクターを、適切な宿主細菌中に導入し、生成した細菌を培養してファージを産生する(例えば、適切なヘルパーファージを使って、または必要ならプラスミドを補完して)。ファージライブラリは、培養物から任意の適切な方法、例えば、沈降法および遠心分離法、により回収可能である。
【0120】
ディスプレイシステムは任意の所望量の多様性を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むこともできる。例えば、このレパートリーは生命体、生命体のグループ、所望組織または所望細胞型、により発現された自然発生のポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むことも、または、無秩序のまたは無秩序化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むこともできる。希望するなら、このポリペプチドは、共通のコアまたは足場を共有することができる。例えば、レパートリーまたはライブラリ中の全ポリペプチドが、プロテインA,プロテインL,プロテインG,フィブロネクチンドメイン,アンチカリン(Anticalin),CTLA4,所望の酵素(例えば、ポリメラーゼ,セルラーゼ),または免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド,例えば、抗体または抗体断片(例えば、抗体可変ドメイン)から選択された足場をベースにすることも可能である。このようなレパートリーやライブラリ中のポリペプチドは、無秩序または無秩序化されたアミノ酸配列の規定領域および共通アミノ酸配列の領域を含むことができる。特定の実施形態では、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドが所望のタイプ、例えば、所望の酵素(例えば、ポリメラーゼ)または所望の抗体の抗原結合性断片(例えば、ヒトVまたはヒトV)、である。一部の実施形態では、ポリペプチドディスプレイシステムはポリペプチドのレパートリーを含み、その中の各ポリペプチドは抗体可変ドメインを含む。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドはV,VまたはFv(例えば、単鎖Fv)を含んでもよい。
【0121】
アミノ酸配列の多様性を、任意の適切な方法を使って、ペプチドまたはポリペプチドまたは足場の任意の所望の領域に導入可能である。例えば、アミノ酸配列の多様性を、標的部位、例えば、任意の適切な変異誘発性(例えば、低忠実性PCR,オリゴヌクレオチド媒介または部位特異的変異,NNKコドンを使った多様化)または任意の他の適切な方法を使って、多様化ポリペプチドをコードした核酸ライブラリを調製することにより、抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメイン、に導入可能である。所望なら、多様化すべきポリペプチドの領域を無秩序化できる。レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、概して選択できる問題であり、均一なポリペプチドサイズは必要ではない。レパートリー中のポリペプチドは、少なくとも三次構造(少なくとも1つのドメインを形成する)を有することができる。
【0122】
選択/単離/回収
エピトープ結合ドメインまたはドメインの集合体は、適切な方法を使って、レパートリーまたはライブラリ(例えば、ディスプレイシステム中の)から選択、単離、および/または回収可能である。例えば,ドメインは選択可能な特性(例えば、物理的特性,化学的特性,機能特性)に基づいて選択または単離される。適切な選択可能な特性には、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物活性,例えば,一般的リガンド(例えば、スーパー抗原)に対する結合性,標的リガンド(例えば、抗原,エピトープ,基質)に対する結合性,抗体に対する結合性(例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現したエピトープ経由),および触媒能力が含まれる(例えば、Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655参照)。
【0123】
一部の実施形態では、実質的に全てのドメインが共通の選択可能特性を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリまたはレパートリーからプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択および/または単離される。例えば、ドメインを、実質的に全てのドメインに共通の一般的リガンドに結合する,共通の標的リガンドに結合する,共通の抗体に結合する(または結合される),または共通の触媒能力を有するライブラリまたはレパートリーから選択することができる。この選択のタイプは、所望の生物活性を有する親のペプチドまたはポリペプチドに基づいたレパートリーまたはドメインを調製する際、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を行う場合、に特に有用である。
【0124】
共通の一般的リガンドに対する結合性に基づいた選択では、元のライブラリまたはレパートリーの成分である全てまたは実質的に全てのドメイを含むドメインのコレクションまたは集合体が得られる。例えば,標的リガンドまたは一般的リガンドに結合しているドメイン、例えばプロテインA,プロテインLまたは抗体は、パニングまたは適切な親和性マトリックスを使って選択、単離、および/または回収ができる。パニングは、リガンド(例えば、一般的リガンド,標的リガンド)の溶液を適切な容器(例えば、チューブ,ペトリ皿)に加え、リガンドを容器の壁表面上に沈着または被覆させることにより成し遂げられる。過剰リガンドを洗い流し、ドメインを容器に加え、この容器をペプチドまたはポリペプチドが固定化したリガンドと結合するための適切な条件下で維持する。非結合ドメインは、洗い流され、結合ドメインは、任意の適切な方法、例えば、削り取りやpHを下げることによって回収できる。
【0125】
適切なリガンド親和性マトリックスは、通常、固体担体またはビーズ(例えば、アガロース)を含み、これに対しリガンドが共有結合的または非共有結合的に連結される。親和性マトリックスは、ドメインがマトリックス上のリガンドに結合するための適切な条件下、バッチプロセス,カラムプロセスまたは任意の他の適切なプロセスを使って、ペプチドまたはポリペプチド(例えば、プロテアーゼとインキュベートされたレパートリー)と結合させることができる。親和性マトリックスと結合しないドメインを洗い流すことができ、結合したドメインを、低pHバッファー,マイルドな変性剤(例えば、尿素)、またはリガンドとの結合で競合するペプチドまたはドメインで溶出、等の任意の適切な方法で溶出し、回収する。一実施例では、ビオチン化した標的リガンドは、レパートリー中のドメインが標的リガンドに結合するために適切な条件下、レパートリーと結合する。結合ドメインは、固定化したアビジンストレプトアビジン(例えば、ビーズ上の)を使って回収される。
【0126】
一部の実施形態では、一般的または標的リガンドは、抗体またはその抗体の抗原結合性断片である。ライブラリまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中で実質的に保存されたペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴と結合する抗体または抗原結合断片は、特に一般的リガンドとして有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの単離,選択および/または回収のためのリガンドとしての使用に適切な抗体と抗原結合性断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の適切な方法で調製できる。
【0127】
ライブラリ/レパートリー
プロテアーゼエピトープ結合ドメインをコードする、および/または、これを含むライブラリは、任意の適切な方法を使って調製または入手可能である。ライブラリは、目的のドメインまたは足場(例えば、ライブラリから選択されたドメイン)に基づくドメインをコードするように設計することも、または、本明細書記載の方法を使って別のライブラリから選択することも可能である。例えば,ドメインが豊富なライブラリは、適切なポリペプチドディスプレイシステムを使って調整可能である。
【0128】
所望のタイプのドメインのレパートリーをコードしたライブラリは、任意の適切な方法を使って容易に産生可能である。例えば,所望のタイプのポリペプチド(例えば、免疫グロブリン可変ドメイン)をコードした核酸配列を得ることができ、それぞれが1つまたは複数の変異を含む核酸のコレクションが調製できる。例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(PCR)システムを使って核酸を増幅することにより、化学的変異誘発により(Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) 、または細菌突然変異誘発株を使って(Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996)) 調整可能である。
【0129】
他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にすることができる。選択位置を変異させる方法も当業者にはよく知られており、これには、例えば、PCRを使う場合または使わない場合の、不適正なオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば,合成抗体ライブラリは、抗原結合ループに対する変異を標的にして作られてきた。無秩序または半無秩序抗体H3およびL3領域を、生殖細胞系列免疫グロブリンV遺伝子セグメントに付加して、変異フレームワーク領域を有する大ライブラリが構築されている(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra)。このような多様化は、拡張され、一部または全ての他の抗原結合ループを含むまでになっている(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra)。他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にでき、例えば,2段階PCR戦略では1回目のPCR生成物を「メガプライマー(mega−primer)」として用いる(例えば、Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)参照)。標的の多様化は、例えば、SOE PCRを使っても達成できる(例えば、Horton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989) 参照)。
【0130】
選択位置での配列多様性は、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を変え、多くのアミノ酸(例えば20全部またはそのサブセット)をその位置に組み込むことにより得ることができる。IUPAC命名法を使って説明するが、最も用途の広いコドンは、NNKであり、これはTAG停止コドンと同様に全アミノ酸をコードする。NNKコドンは、必要な多様性を導入するために使用可能である。同じ目的を有する他のコドンNNNも使用でき、これは追加の停止コドンTGAとTAAを作り出す。このような標的化手法は、標的領域中の全配列空間を調査対象にすることができる。
【0131】
一部のライブラリは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるドメイン(例えば、抗体またはその一部)を含む。例えば、ライブラリは既知の主鎖構造を有するドメインを含むことができる。(例えば、Tomlinson et al.,WO99/20749参照)。ライブラリは適切なプラスミドまたはベクター中で調製できる。本明細書で使われるベクターは、異種のDNAを細胞の中に導入し、それの発現および/または複製をするために使われる離散した要素を指す。任意の適切なベクターを使うことができ、これにはプラスミド(例えば、細菌性プラスミド),ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれる。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異生成のために使うことができ、または、発現ベクターライブラリの発現を促進するために使うことができる。ベクターおよびプラスミドは、通常1つまたは複数のクローニング部位(例えば、ポリリンカー)、複製開始点、および少なくとも1つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。発現ベクターは、ポリペプチドの転写と翻訳促進エレメント、例えば、エンハンサー,プロモータ,転写終結信号,シグナル配列,等をさらに含むことができる。これらのエレメントは、このような発現ベクターが、発現に適切な条件下維持された場合(例えば、適切な宿主細胞中で)、ポリペプチドが発現し、産生されるようにポリペプチドをコードしたクローン化挿入断片に作動可能なようにリンクされた状態に配置することが可能である。
【0132】
クローニングおよび発現ベクターは、通常、1つまたは複数の選択宿主細胞中でベクターに複製させる核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクター中では,この配列は、ベクターに宿主染色体DNAとは独立に複製させ、複製開始点または自己複製配列を含む配列である。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製開始点は、大抵のグラム陰性細菌に対し適切で、2ミクロンプラスミド開始点は、酵母に適切であり、また種々のウイルス開始点(例えば、SV40,アデノウイルス)は、哺乳動物細胞中に入れるクローニングベクターに有用である。これらがコス細胞のような高レベル複製が可能な哺乳動物細胞で使われるのでなければ、通常、複製開始点は哺乳類の発現ベクターには必要でない。
【0133】
クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。このようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードしている。従って、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、その倍地中で生存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質と他の毒素、例えば、アンピシリン,ネオマイシン,メトトレキサートまたはテトラサイクリン,に耐性を付与し、栄養要求性欠如を補完し,または成長培地中で得られない重要な栄養素を補給する、タンパク質をコードしている。
【0134】
適切な発現ベクターは多くの要素を含むことができる。例えば、複製開始点,選択可能マーカー遺伝子,1つまたは複数の発現調節エレメント,例えば、転写調節エレメント(例えば、プロモータ,エンハンサー,ターミネーター)および/または1つまたは複数の翻訳信号,シグナル配列またはリーダー配列,等を含むことができる。発現調節エレメントおよび信号またはリーダー配列は、もしあれば、ベクターまたは他のソースから供給を受けることができる。例えば,抗体鎖をコードしたクローン化核酸の転写および/または翻訳調節配列は、直接発現に使用可能である。
【0135】
プロモータは、所望の宿主細胞中の発現のために組み込んでもよい。プロモータは、構成的であっても誘導可能であってもよい。例えば,プロモータは、核酸の転写を命令するように、抗体、抗体鎖またはその一部をコードした核酸に作動可能なようにリンクされてもよい。種々の適切な原核生物用プロモータ(例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータシステム,アルカリフォスファターゼ,トリプトファン(trp)プロモータシステム,大腸菌用のlac,T3,T7プロモータ)および真核生物(例えば、シミアンウイルス40初期または後期プロモータ,ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモータ,サイトメガロウイルスプロモータ,アデノウイルス後期プロモータ,EG−1aプロモータ)宿主が入手可能である。
【0136】
さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保持している宿主細胞の選択に用いる選択可能マーカー,および,複製可能な発現ベクターの場合には、複製開始点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードした遺伝子は、共通の選択可能マーカーであり、原核生物(例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性),テトラサイクリン耐性用Tet遺伝子)および真核細胞(例えば、ネオマイシン(G418またはジェネテシン),gpt(ミコフェノール酸),アンピシリン,またはヒグロマイシン耐性遺伝子)で使用可能である。ジヒドロ葉還元酵素標識遺伝子は、種々の宿主中でメトトレキサートにより選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードした遺伝子(例えば、LEU2,URA3,HIS3)は、酵母中の選択マーカーとして使われることが多い。ウイルス(例えば、バキュロウイルス)またはファージベクター,および宿主細胞のゲノムに統合可能なベクター,例えば、レトロウイルスベクター、の使用もまた意図されている。
【0137】
原核生物(例えば、大腸菌等の細菌細胞)または哺乳動物細胞中での発現に適切な発現ベクターには、例えば,pETベクター(例えば、pET−12a,pET−36,pET−37,pET−39,pET−40,Novagen他),ファージベクター(例えば、pCANTAB5E,Pharmacia),pRIT2T(プロテインA融合ベクター,Pharmacia),pCDM8,pCDNA1.1/amp,pcDNA3.1,pRc/RSV,pEF−1(Invitrogen,Carlsbad,CA),pCMV−SCRIPT,pFB,pSG5,pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)),pSVSPORT(Gibco BRL,Rockville,MD),pEF−Bos(Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) 等、が挙げられる。種々の発現宿主,例えば、原核細胞(大腸菌),昆虫細胞(ショウジョウバエSchnieder S2細胞,Sf9),酵母(P.methanolica,P.pastoris,S.cerevisiae)および哺乳動物細胞(例えば、COS細胞)での使用に適切な発現ベクターが入手可能である。
【0138】
ベクターの一部の実施例は、ポリペプチドライブラリメンバーに相当するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、一般的および/または標的リガンドによる選択は、ポリペプチドライブラリメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖と発現により行われる。上述のように、具体的な選択ディスプレイシステムは、バクテリオファージディスプレイである。従って、ファージまたはファージミドベクターは使用可能である。例えば、ベクターは大腸菌複製開始点(二本鎖複製用)および、ファージ複製起点(一本鎖DNAの産生用)を有するファージミドベクターであってもよい。このようなベクターの操作および発現は、当業者にはよく知られている (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra)。簡単に述べれば、ベクターは、ファージミドおよび発現カセット上流のラックプロモータに選択性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、適切なリーダー配列,多重クローニング部位,1つまたは複数のペプチドタグ,1つまたは複数のTAG停止コドンおよびファージタンパク質pIIIを含むことができる。従って、大腸菌の種々の抑制因子および非抑制因子株を使って、また、グルコース,イソ−プロピルチオ−β−Dガラクトシド(IPTG)またはVCSM13等のヘルパーファージを添加して、ベクターは、発現のないプラスミドとして複製することができ、大量のポリペプチドライブラリメンバーのみ、または産物ファージ(この内の一部はポリペプチド−pIII融合体で、その表面に少なくとも1つのコピーを含む)、を産生することができる。
【0139】
抗体可変ドメインは、標的リガンド結合部位および/または一般的リガンド結合部位を含んでもよい。特定の実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインA,プロテインLまたはプロテインG等のスーパー抗原のための結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン,例えば、ヒトVH(例えば、V1a,V1b,V2,V3,V4,V5,V6),ヒトVλ(例えば、Vλl,Vλll,Vλlll,VλlV,VλV,VλVIまたはVκ1)またはヒトVK(例えば、Vκ2,Vκ3,Vκ4,Vκ5,Vκ6,Vκ7,Vκ8,Vκ9またはVκ10)に基づくものであってもよい。
【0140】
またさらなる技術カテゴリーには、レパートリーの人工区分への選別が含まれ、これは遺伝子とその遺伝子産物との結びつきを利用する。例えば,所望の遺伝子産物をコードした核酸が、油中水乳剤を使って形成されたマイクロカプセル中で選択可能となる選択システムが、WO99/02671, WO00/40712 および Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードした遺伝因子がマイクロカプセル中に区分けされ、次に、転写、および/または翻訳されてそれぞれの遺伝子産物(RNAまたはタンパク質)をマイクロカプセル内に産生する。引き続き、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子因子が選別される。この手法によって、種々の方法で所望の活性を検出することにより目的の遺伝子産物を選択できる。
【0141】
エピトープ結合ドメインの解析
ELISAを含む当業者に周知の方法によって、ドメインのその特異的抗原又はエピトープに対する結合を試験することができる。一例として、結合は、モノクローナル抗体を用いたELISAを用いて試験される。
【0142】
ファージELISAは、任意の適切な手順に従い実施することができ:例示的なプロトコルを下記に記載する。
【0143】
それぞれの回の選別で生産したファージの集団を、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定するために、選択した抗原又はエピトープに対する結合によりELISAによってスクリーニングすることができる。これら集団由来の、単一の感染させたバクテリアのコロニーからのファージをその後、「モノクローナル」ファージ抗体を同定するためにELISAによってスクリーニングすることができる。抗原又はエピトープに結合する可溶性抗体断片のスクリーニングもまた所望され、これもまた、例えばC−又はN−末端タグに対する試薬を用いたELISAによって実施することができる(例えばWinter et al.(1994)Ann.Rev.Immunology 12,433〜55及びそこで引用された文献を参照のこと)。
【0144】
PCR産物のゲル電気泳動(Marks et al.1991,上記;Nissim et al.1994,上記)、プロービング(Tomlinson et al.,1992 J.Mol.Biol.227,776)又はベクターDNAのシークエンスにより、選択したファージモノクローナル抗体の多様性を評価することができる。
【0145】
dAbの構造
dAbが、本明細書に記載したファージディスプレイ技術に用いるために選択したV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは普遍的なフレームワーク領域を含み、そのため、本明細書で定義したような特定の一般的リガンドによって認識されるようになる可能性がある。普遍的なフレームワーク、一般的リガンドなどの使用については国際公開第99/20749に記載されている。
【0146】
V遺伝子レパートリーが使用される場合には、ポリペプチド配列における多様性が可変ドメインの構造的ループ内に局在する場合もある。それぞれの可変ドメインとその相補対との相互作用を高めるために、DNAシャッフリング又は変異生成によって、いずれの可変ドメインのポリペプチド配列をも変化させてもよい。DNAシャッフリングは当業者に周知であり、かつ、例えばStemmer,1994,Nature,370:389〜391及び米国特許第6,297,053号に記載され、この両方は引用することにより本明細書に組み入れられる。突然変異生成のその他の方法もまた当業者に周知である。
【0147】
dAb構築物作成における使用のための足場
i.主鎖構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバーは、ポリペプチド鎖については類似した折り畳み部分を共有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関しては高度に多様化しているが、配列の比較及び結晶学的な構造は予想に反して、6つの抗体の抗原結合ループのうちの5つ(H1、H2、L1、L2、L3)が限られた数の主鎖構造、又は標準的な構造をとることを明らかにした(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.,196:901;Chothia et al.(1989)Nature,342:877)。ループ長及び鍵となる残基の解析はさらに、大部分のヒト抗体に見られるH1、H2、L1、L2及びL3の主鎖構造の予測を可能にした(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.,227:799;Tomlinson et al.(1995)EMBO J.,14:4628;Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.,264:220)。H3領域は、(Dセグメントの使用により)配列、長さ及び構造においてはより多様であるが、ループ及び抗体フレームワークの鍵となる位置における特定の残基の長さ及び存在又は残基の型に依存して、短いループ長においてはH3領域もまた限られた数の主鎖構造を形成する(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.,263:800;Shirai et al.(1996)FEBS Letters,399:1)。
【0148】
dAbはVドメインライブラリ及び/又はVドメインライブラリなどのドメインライブラリから有利に構築される。1つの態様においては、特定のループ長及び鍵となる残基がメンバーの主鎖構造を保証するように選択されてドメインライブラリが設計されることが知られている。都合の良いことに、これらは天然に見られる、上記で議論されたような機能を果たさない可能性を最小限にするための、免疫グロブリンスーパーファミリーの実際の構造である。生殖細胞系V遺伝子セグメントは、抗体又はT細胞受容体ライブラリを構築するための、1つの好適な基礎となるフレームワークとして機能するが、その他の配列もまた役立つ。変異も低頻度で生じ得るが、機能性メンバーの少数が、その機能に影響を及ぼさない程度に変化した主鎖構造を有する可能性がある程度である。
【0149】
標準的な構造の理論もまた、リガンドによってコードされる異なる主鎖構造の数の評価、リガンド配列に基づく主鎖構造の予測、及び標準的な構造に影響を及ぼさない多様化のための残基の選択のために役立つ。ヒトVκドメインにおいては、L1ループは4つの標準的な構造のうちの1つをとることができ、L2ループは単一の標準的な構造を有し、ヒトVκドメインの90%がL3ループにおける5つの標準的な構造のうちの1つをとることができることが知られている(Tomlinson et al.(1995)上記);従って、Vκドメインのみにおいては、異なる種類の主鎖構造を作り出すために、異なる標準的な構造が結合することが可能である。VλドメインがL1、L2及びL3ループの異なる種類の標準的な構造をコードするし、Vκ及びVλドメインがH1及びH2ループの複数の標準的な構造をコードする任意のVドメインと対合することが可能な場合には、これら5つのループで見られる標準的な構造な組み合わせの数は非常に多くなる。このことは、様々な種類の結合特異性を生産するためには、主鎖構造の多様性の生成が必須である可能性を意味する。しかしながら、予想に反し、見いだされた単一の既知の主鎖構造に基づいて抗体ライブラリを構築することにより、実質的に全ての抗原を標的とするための十分な多様性の生成のためには主鎖構造における多様性は必要とされない。さらに驚くべきことに、単一の主鎖構造はコンセンサス構造である必要もなく、単一の天然に生じる構造を全ライブラリの基礎として用いることが可能である。従って、一つの特定の態様においては、dAbは単一の既知の主鎖構造を有する。
【0150】
選択された単一の主鎖構造が、問題となる免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子間ではありふれたものになってもよい。その構造をとる十分な数の天然に生じる分子が観察される場合、その構造はありふれたものとなる。従って、1つの態様においては、天然に生じる免疫グロブリンドメインのそれぞれの結合ループの異なる主鎖構造は個別に検討され、その後、異なるループにおける所望の主鎖構造の組み合わせを有する、天然に生じる可変ドメインが選択される。何も得られかった場合には、最も近似した等価物を選択することができる。異なるループにおける所望の主鎖構造の組み合わせは、所望の主鎖構造をコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより作出することができる。一例として、選択した生殖細胞系遺伝子セグメントは、天然にしばしば発現し、特に、それらは全ての天然の生殖細胞系遺伝子セグメント中で最も頻繁に発現するものであってもよい。
【0151】
ライブラリの設計においては、6つの抗原結合ループそれぞれの異なる主鎖構造の頻度を個別に検討してもよい。H1、H2、L1、L2及びL3においては、20%から100%の範囲で天然に生じる分子の抗原結合ループを構成する、指定された構造が選択される。典型的には、その観察される頻度は35%を超え(すなわち35%から100%の間)、そして理想的には、50%を超える、又は65%を超えさえもする。H3ループの大部分が標準的な構造を有さないため、標準的な構造を示す、それらのループ間でありふれた主鎖構造を選択することが好ましい。ループのそれぞれにおいては、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に観察される構造がされに選択される。ヒト抗体においては、それぞれのループにおける、最も一般的な標準的な構造(CS)は以下の通りである:H1−CS1(発現レパートリーの79%)、H2−CS3(46%)、L1−VκのCS2(39%)、L2−CS1(100%)、L3−VκのCS1(36%)(計算はκ:λ率が70:30であるとみなす。Hoodet al.(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,48:133)。標準的な構造を有するH3ループについては、94番の残基から101番の残基である、塩橋を有する7つの残基のCDR3の長さ(Kabat et al.(1991)配列s of proteins of immunological interest,U.S.Department of Health及びヒト Services)が最も一般的であることが見いだされた。EMBLデータライブラリには、この構造を形成するために必要とされる長さのH3及び鍵となる残基を有するヒト抗体配列が少なくとも16あり、及びタンパク質データバンク中には、抗体モデリングの基礎として使用可能な少なくとも2つの結晶学的な構造が存在する(2cgr及び1tet)。最も頻繁に発現する生殖細胞系遺伝子セグメントの標準的な構造の組み合わせは、Vセグメント3−23(DP−47)、JセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12(DPK9)及びJκセグメントJκ1である。VセグメントDP45及びDP38もまた適している。これらのセグメントをさらに、所望の単一の主鎖構造を有するライブラリを構築するための基礎として、組み合わせることによって使用することができる。
【0152】
また別の方法としては、単離において、それぞれの結合ループの天然に生じる異なる主鎖構造に基づいて単一の主鎖構造を選択する代わりに、天然に生じる主鎖構造の組み合わせが単一の主鎖構造を選択するための基礎として使用される。抗体の場合には、例えば、任意の2つ、3つ、4つ、5つ、6つの抗原結合ループの天然に生じる標準的な構造の組み合わせを決定することができる。ここで、選択される構造は天然に生じる抗体においてありふれたものであってもよく、かつ、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に見られるものであってもよい。従って、ヒト抗体においては、例えば、5つの抗原結合ループであるH1、H2、L1、L2及びL3の天然の組み合わせについて検討する場合には、最も頻繁にみられる標準的な構造の組み合わせを決定し、その後、単一の主鎖構造を選択するための基礎として、H3ループにおける最も一般的な構造と組み合わせる。
【0153】
標準的な配列の多様化
選択された複数の既知の主鎖構造又は単一の既知の主鎖構造を有することから、構造的及び/又は機能的多様性を有するレパートリーを生成するために、分子の結合部位を多様にすることにより、dAbを構築することができる。このことは、それらがそれらの構造及び/又それらの機能において十分な多様性を有するように変異が生成され、幅のある活性を提供することができることを意味する。
【0154】
所望の多様性は、典型的には、1つ以上の位置において選択した分子を多様化することにより生成される。変化させる位置は、ランダムに選ぶこともでき、又は選択してもよい。多様化はその後、非常に膨大な数の変異を生成する、在住アミノ酸を任意のアミノ酸又は、天然若しくは合成のそのアナログにより置換すること、又は限定数の変異を生成する、在住のアミノ酸を1つ以上の定義されたアミノ酸サブセットにより置換する、ランダム化によって達成できる。
【0155】
それらの変異を導入する様々な方法が報告されている。分子をコードする遺伝子中にランダムな突然変異を導入するためには、変異性PCR(Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.,226:889)、化学的突然変異生成(Deng et al.(1994)J.Biol.Chem.,269:9533)又はバクテリアの突然変異誘発遺伝子株(Low et al.(1996)J.Mol.Biol.,260:359)を用いることができる。選択した位置に変異を導入するための方法も当該分野においては周知であり、これらにはPCRの使用を介した又は介さない、ミスマッチオリゴヌクレオチド又は変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば、複数の合成抗体ライブラリが抗原結合ループに対するターゲティング突然変異によって作出された。ヒト破傷風トキソイド結合FabのH3領域が、新しい種類の結合特性を作出するためにランダム化された(Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457)。変異のないフレームワーク領域を有する巨大ライブラリを生産するために、H3及びL3領域のランダム化又はセミランダム化が生殖細胞系V遺伝子セグメントに付加された(Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.,227:381;Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457;Nissim et al.(1994)EMBOJ.,13:692;Griffiths et al.(1994)EMBOJ.,13:3245;De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.,248:97)。それらの変異は、いくつか又は全てのその他の抗原結合ループを含むように拡大された(Crameri et al.(1996)Nature Med.,2:100;Riechmann et al.(1995)Bio/Technology,13:475;Morphosys,国際公開第97/08320号,上記)。
【0156】
ループランダム化はH3のみに対しては約1015を超える構造を作出し、その他の5つのループについても類似した数の変異を生成する可能性があるため、全ての可能な組み合わせを発現するライブラリを構築するために現在の形質転換技術を用いること、又は無細胞系を用いることさえも適してはいない。例えば、これまでに構築された最も巨大なライブラリのうちの1つにおいては、この設計のライブラリにおいて可能な多様性のただ1つの画分である、6x1010の異なる抗体が生成された(Griffiths et al.(1994)上記)。
【0157】
1つの実施形態においては、分子の所望の機能を作出する又は変化させることに直接含まれるそれらの残基のみが多様化される。多くの分子においては、その機能は標的に結合することであり、さらに、分子の全体のパッキング又は選択した主鎖構造の維持に重要な残基を変化させることを避けるために、多様性は標的結合部位に集中させる必要がある。
【0158】
1つの態様においては、抗原結合部位におけるそれらの残基のみが多様化されたdAbライブラリが使用される。これらの残基は特にヒト抗体レパートリーにおいて多様であり、かつ、高品質な抗体/抗原複合体と結合することが知られている。例えば、L2においては、天然に生じる抗体の50及び53番目の位置が変化すると抗原と結合することが観察されることが知られている。反対に、ライブラリにおいては2つが変化したのに対し、標準的な方法では、Kabat et al.(1991、上記)によって定義された複数の7残基である、相当する相補性決定領域(CDR1)における全ての残基を多様化させただろう。このことは、幅のある抗原結合特性を作出するためには、機能的な多様性に関する十分な改良が必要とされることを示す。
【0159】
天然においては、抗体の多様性は、ナイーブ初代レパートリーを作出するための生殖細胞系V、D及びJ遺伝子セグメントの体細胞組換え(いわゆる生殖細胞系及び接合多様性)、並びに生じた再構成V遺伝子の体細胞超変異の、2つの過程の結果である。ヒト抗体配列の解析により、初代レパートリーにおける多様性が抗原結合部位の中心に集中していること、一方で体細胞超変異は初代レパートリーにおいて高度に保存される抗原結合部位の末端の領域にまで多様性を広げることが示された(Tomlinson et al.(1996)J.Mol.Biol.,256:813を参照のこと)。この相補性はおそらく配列間隔を検索するための効果的な方法として発展し、そして明かに抗体に特有ではあるが、その他のポリペプチドレパートリーに対しても容易に適用することができる。多様化した残基は、標的への結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位における異なる(重複を含む)残基のサブセットは、必要に応じて選択の異なる段階において多様化される。
【0160】
抗体レパートリーの例においては、初代「ナイーブ」レパートリーは抗原結合部位のいくつかの、しかし全てではない、残基が多様化された場合に作出される。この文脈で本明細書で使用される場合、「ナイーブ」又は「ダミー」という用語は、予め決められた標的を有しない抗体分子を意味する。これらの分子は、多様な抗原刺激に曝されていない胎児及び新生児患者の場合と同様に、免疫多様化を受けていない患者の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる分子に類似する。このレパートリーはその後、抗原又はエピトープの種類によって選択される。必要に応じて、さらなる多様性をその後、最初のレパートリーにおいて多様化された領域の外側に導入することができる。この成熟したレパートリーを改変した機能、特異性又は親和性によって選択することができる。
【0161】
本明細書において記載された配列は、実質的に同一な配列、例えば少なくとも90%同一な配列、本明細書で記載された配列と例えば少なくとも91%、又は少なくとも92%、又は少なくとも93%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%同一な配列を含むことを理解されたい。
【0162】
核酸については、「実質的な同一性」という用語は、2つの核酸又はその示された配列を、最適にアライン又は比較した場合に、適切なヌクレオチドの挿入又は欠損を含めて、少なくとも約80%のヌクレオチドが、通常は少なくとも約90%から95%、または少なくとも約98%から99.5%のヌクレオチドが同一であることを示す。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。
【0163】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列については、「同一」という用語は、適切な挿入又は欠損を含めて最適にアライン及び比較した場合の2つの核酸又はアミノ酸配列の同一性の度合いを意味する。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でDNAセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。
【0164】
2つの配列間の同一性のパーセンテージは、その2つの配列を最適にアライメントするために導入することが必要とされるギャップ及びそれぞれのギャップの長さを考慮した、その配列が共有している同一の位置の数の関数である(すなわち、%同一性=同一の位置の数/全位置の数x100)。2つの配列間の配列の比較及び同一性のパーセンテージの決定は、以下の限定しない実施例に記載した数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【0165】
2つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセンテージは、NWSgapdna.CMPマトリックス並びに40、50、60、70、又は80のギャップウェート及び1、2、3、4、5、又は6の長さウェートを使用してGCGソフトウェア中のGAPプログラムを用いて決定することができる。2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージもまたALIGNprogram(version 2.0)に組み込まれたE.Meyers及びW.Miller(Comput.Appl.Biosci.、4:11〜17(1988))のアルゴリズムを用い、PAM120ウェート残基表、12のギャップ長ペナルティ及び4のギャップペナルティを使用して決定することができる。加えて、2つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージはGCGソフトウェア中のGAPプログラム中に組み込まれたNeedleman及びWunsch(J.Mol.Biol.48:444〜453(1970))のアルゴリズムを用い、Blossum62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか及び16、14、12、10、8、6、又は4のギャップウェートと1、2、3、4、5、又は6の長さウェートを使用して決定することができる。
【0166】
一例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号1の参照配列と100%同一であってもよく、又は特定の整数までのヌクレオチド変異を、参照配列と比較して、含んでいてもよい。それらの変異は、少なくとも1つのヌクレオチド欠損、転移およびトランスバージョンを含む置換、又は挿入からなる群より選択される。ここで前記変異は、参照配列若しくは参照配列中の1つ以上の隣接したグループのヌクレオチド中に個別に散在して、参照ヌクレオチド配列の5’または3’末端又はそれら末端位置の間の任意の位置に生じてもよい。ヌクレオチド変異の数は、配列番号1中のヌクレオチドの総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ(100で割る)とを掛け、その後、配列番号1中の前記ヌクレオチドの総数から得られた数値を引くことによって決定する、又は:
【数1】

【0167】
であり、
式中nnはヌクレオチド変異の数、xnは配列番号1中のヌクレオチドの総数、及びyは、50%の場合には0.50、60%の場合には0.60、70%の場合には0.70、80%の場合には0.80、85%の場合には0.85、90%の場合には0.90、95%の場合には0.95、97%の場合には0.97または100%の場合には1.00であり、ならびにここでxn及びyの数値がいずれの整数でもない場合には、xnから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。配列番号1のポリヌクレオチド配列の変異は、このコード配列においてナンセンス,ミスセンスまたはフレームシフト変異を生成させ、よって、このような変異後のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを変異させ得る。
【0168】
同様に、別の例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号2によってコードされる参照配列と100%同一であってもよく、又は同一性のパーセンテージが100%未満になるような特定の整数までのアミノ酸変異を、参照配列と比較して、含んでいてもよい。それらの変異は、少なくとも1つのアミノ酸欠損、保存置換及び非保存置換を含む置換、又は挿入からなる群より選択される。ここで前記変異は、参照配列若しくは参照配列中の1つ以上の隣接したグループのアミノ酸中に個別に散在して、参照ポリペプチド配列のアミノ−又はカルボキシ−末端又はそれら末端位置の間の任意の位置に生じてもよい。指定された同一性のパーセンテージにおけるアミノ酸変異の数は、配列番号2によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ(100で割る)とを掛け、その後、配列番号2によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の数から得られた数値を引くことによって決定する、又は:
【数2】

【0169】
であり、
式中naはアミノ酸変異の数、xaは配列番号2によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数、及びyは、例えば70%の場合には0.70、80%の場合には0.80、85%の場合には0.85などであり、並びにここでxa及びyの数値がいずれの整数でもない場合には、xaから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。
【実施例】
【0170】
実施例1−トリプルターゲティング抗原結合タンパク質の設計および構築
3つの異なる標的に結合することができるIgGをベースにした分子を構築した。分子は、抗体可変ドメインの代わりに独立して選択された2つの異なる標的に対するドメイン抗体(dAb)およびIgG重鎖のC末端に配置された第3のdAbを有する抗体足場を含んだ。
【0171】
本明細書で例示されるトリプルターゲティング抗原結合タンパク質を、DMS4030と指定する。DMS4030は、従来のIgG構造内のVH dAb(DOM15−26−593)を介してVEGFに結合し、一方、IgG内のVL dAb(DOM4−130−202)はIL1−R1に結合する。IgGのC末端に付加されたdAbはEGFRに結合する(DOM16−39−542)。
【0172】
実施例2−DMS4030のクローニングおよび発現
DMS4030分子を生産するために、DMS4010を作成するために使用した重鎖発現プラスミド(pDMS4010−HC)をBamHIおよびNheIで消化させ、セツキシマブVHドメインを除去した。DOM15−26−593 dAbをPCRにより、プライマーDT169およびDT093を用いて増幅させ、BamHIおよびNheIをそれぞれ、dAb ORFの5’および3’末端に付加した。
【0173】
DT093 GAATTATGGCTAGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGT
DT169 GAATTATGGGATCCACCGGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTG
PCR産物をBamHIおよびNheIで消化させ、精製した断片を、切断されたpDMS4010−HCに連結させ、pDMS4030−HCを作成させた。
【0174】
プラスミドの配列を確認した後、pDMS4030−HCプラスミド、およびどこかで記載されているCkドメインとの関連でDOM4−130−54 dAbをコードする軽鎖発現プラスミド(DMS2094)の両方を用いたHEK296/6E細胞の一過性トランスフェクションより、DMS4030分子を発現させた。トランスフェクションは、標準条件下で実施し、5日後、組換えタンパク質をプロテインAクロマトグラフィーにより清澄上清から回収した。精製物質を、10mM Naクエン酸塩pH6,10%(w/v)PEG−300,5%スクロース(w/v)中で製剤化し、4℃で維持した。
【0175】
DMS4030は、約46mg/lで発現したと推定し、SDS−PAGEにより決定した物質の品質は、同様に発現、精製された従来のmAbsに相当した。これは、図1で見ることができる。
【0176】
分子活性を、3つの結合活性すべての独立したアッセイにより決定した。
【0177】
実施例3−VEGF効力
VEGF効力を、VEGF受容体結合アッセイ(RBA)により評価した。このアッセイは、VEGF165のVEGF R2(VEGF受容体)への結合および試験分子がこの相互作用をブロックする能力を測定する。ELISAプレートを一晩中、VEGF受容体(R&D Systems,Cat No:357−KD−050)(0.2M炭酸ナトリウム重炭酸塩、pH9.4中、0.5μg/ml最終濃度)でコーティングし、洗浄し、PBS中の2% BSAでブロックした。VEGF(R&D Systems,Cat No:293−VE−050)および試験分子(0.05% Tween 20(商標)PBS中0.1%BSAにおいて希釈)を、1時間プレインキュベートし、その後、プレートに添加した(3ng/ml VEGF最終濃度)。VEGFのVEGF受容体への結合を、ビオチン化抗VEGF抗体(0.5μg/ml最終濃度)(R&D Systems,Cat No:BAF293)およびペルオキシダーゼ結合型抗ビオチン二次抗体(1:5000希釈)(Stratech,Cat No:200−032−096)を用いて検出し、等量の1M HClで反応を停止させた後、発色基質(Sure Blue TMBペルオキシダーゼ基質,KPL)を用いてOD450で可視化させた。
【0178】
このアッセイの結果は図2で見ることができ、この図は、DMS4030は、このプレートに基づくアッセイでは、90pMのEC50でVEGFのVEGFR2への結合をブロックすることができることを示すが、この数字は、70%最大阻害に到達したにすぎない曲線に基づいて計算したものである。
【0179】
実施例4−IL1−R1バイオアッセイ
DMS4030のIL1−R1を介するシグナル伝達をブロックする能力を、MRC−5細胞におけるIL−8放出アッセイにおいて評価した。試験分子のヒトIL1−Rに結合するヒトIL−1aを防止し、IL−8分泌を中和する能力を、ヒト肺線維芽細胞MRC−5細胞を用いて決定した。MRC−5細胞(ATCC,カタログ番号CCL−171)をトリプシン処理し、その後、試験試料と共に1時間懸濁液としてインキュベートした。IL−1a(200pg/ml最終濃度)(R&D Systems Cat No:200−LA)をその後添加した。一晩インキュベートした後IL−8放出を、IL−8定量ELISAキッド(R&D Systems)を使用して、抗IL−8でコーティングしたELISAプレート、ビオチン化抗IL−8及びストレプトアビジン−HRPを用いて決定した。アッセイ読み取りは、450nmでの比色吸光度であり、未知のIL−8濃度が、アッセイに含まれるIL−8標準曲線を用いて内挿される。
【0180】
このアッセイの結果は図3において見ることができ、この図は、DMS4030が、74pMのEC50で中和した自然のIL1−Rアンタゴニスト(IL1−Ra)と比べ、4pMのEC50値で、IL8のIL1刺激放出を完全に阻害できることが示されたことを示す。
【0181】
実施例5−EGFRキナーゼアッセイ
DMS4030を、EGFR陽性A431細胞においてEGF刺激EGFRリン酸化を阻害する能力に対し、対照抗EGFRmAb(Erbitux)と比較した。EGFとの相互作用による、A431細胞の表面上で発現されたEGFRの活性化は受容体のチロシンキナーゼリン酸化を引き起こす。EGFRチロシンキナーゼリン酸化の減少を測定し、試験分子の効力を決定した。A431細胞を一晩96ウェル組織培養プレートに付着させ、その後、試験分子を添加し、1時間放置し、その後、10分間、EGF(300ng/ml)(R&D Systemsカタログ番号236−EG)と共にインキュベートした。細胞を溶解させ、溶解調製物を、抗EGFR抗体(1μg/ml)(R&D Systems,カタログ番号AF231)でコーティングしたELISAプレートに移行させた。溶解細胞溶液中に存在するリン酸化および非リン酸化EGFRの両方を捕捉させた。洗浄後、未結合物質リン酸化EGFRを、HRP結合型抗ホスホロチロシン抗体(1:2000希釈)(Upstate Biotechnology,カタログ番号16−105)を用いて特異的に検出した。結合を、発色基質を用いてOD450で可視化させた。
【0182】
このアッセイの結果は図4において見ることができ、この図は、DMS4030が、抗EGFR mAbに対する100%阻害(EC50 7pM)と比べ、48pMのEC50値で、EGFRリン酸化を最大約60%まで、阻害したことを示す。
【0183】
DMS4030分子の生物物理学的特性を、SECプロファイルの決定により評価した。DMS4030をSuperdex−200 10/30HRカラム(Akta Express FPLCシステムに取り付けた)上に適用し、PBS中、0.5ml/分で前平衡化し、流した。DMS4030に対するSECプロファイルを図5に示すが、ブロードな単一の主ピークが存在し、いくつかの低分子量の汚染物質が、主ピーク後に現れている。
【0184】
実施例6
抗原結合タンパク質の化学量論性評価(Biacore(商標)を用いる)
この実施例は予測上のものである。これは本発明の抗原結合タンパク質を試験することができる追加のアッセイを実施するためのガイダンスを提供する。
【0185】
抗ヒトIgGを、最初にアミンカップリングによってCM5バイオセンサーチップ上に固定化する。単一の濃度の抗原(例えば、TNFαまたはVEGF)を通過させた後に、抗原結合タンパク質をこの表面上に捕捉する。この濃度は、結合表面及び観察される結合シグナルを最大のR−maxに達するまで飽和させるのに十分な濃度である。化学量をその後、下記の式を用いて算出する:
化学量=Rmax*Mw(リガンド)/Mw(被分析物)*R(固定化又は補足されたリガンド)。
【0186】
同時に1つ以上の被分析物の結合について化学量を算出する場合には、飽和抗原濃度の異なる抗原を順番に通過させ、その後上述の通りに化学量を算出する。この試験はBiacore3000を利用し、HBS−EPランニングバッファーを用いて25℃で行うことができる。
【0187】
配列
【表1】

【0188】
配列番号1(pDMS4030−HC(pDOM15−26−593−DOM16−39−542))
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCAAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGTGGATCGGCAACCTGCTGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCTTCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCCAACCCTGCCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAA
配列番号2(pDMS4030−HC(pDOM15−26−593−DOM16−39−542))
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKR
配列番号3(pDMS4030−LC(pDOM39−DOM4−130−54))
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGATATTTACCTGAATTTAGACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCAATTTTGGTTCCGAGTTGCAAAGTGGTGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCTACGTACTACTGTCAACCGTCTTTTTACTTCCCTTATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
配列番号4(pDMS4030−LC(pDOM39−DOM4−130−54)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYLNLDWYQQKPGKAPKLLINFGSELQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQPSFYFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号5(mAb重鎖定常領域)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号6(mAb軽鎖定常領域)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号7(DOM15−26−593)
EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS
配列番号8(DOM16−39−542)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKR
配列番号9(DOM4−130−54)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYLNLDWYQQKPGKAPKLLINFGSELQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQPSFYFPYTFGQGTKVEIKR
配列番号10
GS
配列番号11
TVAAPSGS
配列番号12
PAS
配列番号13
GGGGS
配列番号14
PAVPPP
配列番号15
TVSDVP
配列番号16
TGLDSP
配列番号17
TVAAPS
配列番号18
GSTVAAPSGS
配列番号19
GSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号20
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号21
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号22
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号23
GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS
配列番号24
PASGS
配列番号25
PASPASGS
配列番号26
PASPASPASGS
配列番号27
GGGGS
配列番号28
GGGGSGGGGS
配列番号29
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号30
PAVPPPGS
配列番号31
PAVPPPPAVPPPGS
配列番号32
PAVPPPPAVPPPPAVPPPGS
配列番号33
TVSDVPGS
配列番号34
TVSDVPTVSDVPGS
配列番号35
TVSDVPTVSDVPTVSDVPGS
配列番号36
TGLDSPGS
配列番号37
TGLDSPTGLDSPGS
配列番号38
TGLDSPTGLDSPTGLDSPGS
配列番号39(抗VEGFR2アドネクチン)
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
配列番号40(抗TNFαアドネクチン)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDTHNAYNGYYRITYGETGGNSPVREFTVPHPEVTATISGLKPGVDDTITVYAVTNHHMPLRIFGPISINHRT
配列番号41(抗VEGFアンチカリン)
DGGGIRRSMSGTWYLKAMTVDREFPEMNLESVTPMTLTLLKGHNLEAKVTMLISGRCQEVKAVLGRTKERKKYTADGGKHVAYIIPSAVRDHVIFYSEGQLHGKPVRGVKLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETCSPG
配列番号42
TVAAPSTVAAPSGS
配列番号43
TVAAPSTVAAPSTVAAPSGS
配列番号44
GSTVAAPS。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む抗原結合タンパク質であって、該重鎖はCH1−CH2−CH3のN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、該軽鎖はCLのN末端に連結されたエピトープ結合ドメインを含み、1つまたは複数のエピトープ結合ドメインは、該免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖の1つまたは両方のC末端に連結される、抗原結合タンパク質。
【請求項2】
エピトープ結合ドメインが重鎖のC末端に連結される、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項3】
エピトープ結合ドメインが、軽鎖のC末端に連結される、請求項1または2に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項4】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項5】
該免疫グロブリン単一可変ドメインがヒトdAbである、請求項4に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項6】
該免疫グロブリン単一可変ドメインがラクダ科VHH免疫グロブリン単一可変ドメインまたはサメ免疫グロブリン単一可変ドメイン(NARV)である、請求項4に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項7】
少なくとも1つのエピトープ結合性ドメインが、CTLA−4(Evibody);リポカリン;プロテインAのZドメイン(Affibody、SpA)、Aドメイン(Avimer/Maxibody)などのプロテインA由来分子;GroEl及びGroESなどの熱ショックタンパク質;トランスフェリン(trans−body);アンキリンリピートタンパク質(DARPin);ペプチドアプタマー;C型レクチンドメイン(Tetranectin);ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン(affilins);PDZドメイン;ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ(scorpiontoxinkunitz)型ドメイン;並びにフィブロネクチン(アドネクチン)より選択される足場に由来する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項8】
該結合タンパク質が2以上の抗原に対する特異性を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項9】
該結合タンパク質が3つの抗原に対する特異性を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項10】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがVEGFまたはVEGFR2に結合可能な、請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項11】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがTNFαに結合可能な、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項12】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがIL1R1に結合可能な、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項13】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインが1〜150のアミノ酸を含むリンカーを介してmAb足場に連結される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項14】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインが1〜20のアミノ酸を含むリンカーを介してmAb足場に連結される、請求項14に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項15】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインが配列番号10〜38で設定されたもののいずれか1つ、又はそれらの任意の複合もしくは組み合わせより選択されたリンカーを介して該mAb足場に連結される、請求項15に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項16】
少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがヒト血清アルブミンに結合する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項17】
請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項18】
請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を含む、形質転換又はトランスフェクトされた組換え宿主細胞。
【請求項19】
請求項18に記載の宿主細胞を培養し、抗原結合タンパク質を単離する工程を含む、請求項1〜16に記載の抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項20】
請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項21】
医薬において使用するための請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項22】
治療量の、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の投与を含む、免疫疾患,自己免疫疾患,癌,炎症性疾患,または関節炎疾患の患者を治療する方法。
【請求項23】
免疫疾患,自己免疫疾患,癌,炎症性疾患,または関節炎疾患の治療のための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【公表番号】特表2012−527878(P2012−527878A)
【公表日】平成24年11月12日(2012.11.12)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−512355(P2012−512355)
【出願日】平成22年5月26日(2010.5.26)
【国際出願番号】PCT/EP2010/057233
【国際公開番号】WO2010/136485
【国際公開日】平成22年12月2日(2010.12.2)
【出願人】(397009934)グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】GLAXO GROUP LIMITED
【住所又は居所原語表記】Glaxo Wellcome House,Berkeley Avenue Greenford,Middlesex UB6 0NN,Great Britain
【Fターム(参考)】