抗ＮＯＴＣＨ−１抗体
本発明は、Ｎｏｔｃｈ１と特異的に結合するモノクローナル抗体を対象とする。一実施形態では、この抗体は、少なくとも第１のエピトープおよび第２のエピトープと結合し、第１のエピトープはＮｏｔｃｈ１負の調節領域（ＮＲＲ）のＬｉｎＡドメイン内にあり、第２のエピトープはＮｏｔｃｈ１ＮＲＲのＨＤ−Ｃドメイン内にある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が全体で本明細書中に参照により組み込まれる、２００９年６月１８日に出願の米国仮特許出願第６１／２１８，１９３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、Ｎｏｔｃｈ−１の活性と拮抗する抗体、そのような抗体を生成する方法、そのような抗体をアッセイする方法、および癌の処置においてそのような抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は膜貫通受容体タンパク質である。哺乳動物ではそのようなｎｏｔｃｈ受容体が４つ存在する。受容体成熟中、哺乳動物ｎｏｔｃｈ受容体の細胞外ドメインはフューリン様(furin-like)プロテアーゼによってＳ１部位で切断されて、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメインによって一緒に保たれる細胞外サブユニットおよび膜貫通サブユニットが得られる。細胞外サブユニットと会合しているＨＤドメインの部分はＨＤ−Ｎと呼ばれ、ＨＤの他の部分である膜貫通サブユニットの細胞外部分は、ＨＤ−Ｃと呼ばれる。細胞外サブユニットは、１つの大きな表皮成長因子（ＥＧＦ）様反復領域および３つのＬｉｎ１２反復を含有する。ＥＧＦ反復領域のリガンド結合は、ＨＤ−Ｃドメイン内のＳ２部位でのＡＤＡＭ型メタロプロテアーゼによるタンパク質分解による切断を誘導し、これは、続く部位Ｓ３でのγ−セクレターゼによる切断を誘発し、ｎｏｔｃｈの細胞内部分を膜から放出させて、これが核内に移行して遺伝子転写を調節することを可能にする。（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。
【０００４】
リガンドに誘導される活性化の前、ｎｏｔｃｈは、３つのＬｉｎ１２反復およびＨＤドメインからなる保存的な負の調節領域（ＮＲＲ）によって休止メタロプロテアーゼ耐性コンフォメーションに維持されている。（Ｖａｒｄａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、４１：７０６１〜７０６７、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００４、２４：９２６５〜９２７３、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。また、ｎｏｔｃｈタンパク質のＮＲＲは、Ｓ１部位でのタンパク質分解的切断後にＬｉｎ１２反復およびＮ末端のＨＤドメイン（ＨＤ−Ｎ）のみからなると定義される場合もある。（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３。）ＮＲＲドメインは、ｎｏｔｃｈ経路のリガンド非依存性タンパク質分解を防止する。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ経路は、ハエおよび脊椎動物における神経発生に影響を与えるものを含めた、多様な発生的および生理的なプロセス中に機能する。一般に、ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、側方抑制、系統決定、および細胞群間の境界の確立に関与している。（Ｂｒａｙ，Ｓ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００６、６７８〜６８８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ｎｏｔｃｈ活性は、癌を含めた様々なヒト疾患にも関連している。たとえば、ｎｏｔｃｈ１の突然変異は、５０％を超えるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病で検出された。（Ｒａｄｔｋｅ，Ｆ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｃａｎｃｅｒ、２００３、７５６〜７６７）。癌の処置に使用するための、ｎｏｔｃｈ−１シグナル伝達経路を調節する治療剤の同定が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ−１と結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、少なくとも第１のエピトープおよび第２のエピトープと結合し、第１のエピトープがＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎ−Ａドメイン内にあり、第２のエピトープがＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメイン内にある、抗体または抗原結合部分を提供する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ−１はヒトＮｏｔｃｈ−１である。
【０００８】
本実施形態の一態様では、第１のエピトープが主要エピトープである。好ましくは、第１のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、６０％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらにより好ましくは９０％を超える損失をもたらす。
【０００９】
別の態様では、第２のエピトープが主要エピトープである。好ましくは、第２のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、６０％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらにより好ましくは９０％を超える損失をもたらす。
【００１０】
別の態様では、第１のエピトープおよび第２のエピトープの両方が主要エピトープである。好ましくは、第１のエピトープおよび第２のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、６０％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらにより好ましくは９０％を超える損失をもたらす。
【００１１】
本実施形態の別の態様では、Ｎｏｔｃｈ−１はヒトＮｏｔｃｈ−１である。本実施形態の別の態様では、Ｎｏｔｃｈ−１はマウスＮｏｔｃｈ−１である。
【００１２】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、さらに１〜４個のエピトープと結合し、前記さらなるエピトープのそれぞれは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎ−ＡドメインまたはＨＤ−Ｃドメインのいずれか内にある。
【００１３】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分が結合する主要エピトープは第１のエピトープおよび第２のエピトープのみである。より詳細には、第１のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎＡドメインの１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑから選択される１〜４個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである。好ましくは、第１のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎＡドメインの１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑから選択される４個のアミノ酸残基からなる主要エピトープである。また、より詳細には、第２のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメインの１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌから選択される１〜５個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである。好ましくは、第２のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメインの１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌから選択される１〜５個のアミノ酸残基からなる主要エピトープである。さらにより詳細には、第１のエピトープまたは第２のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、または９５％を超える損失をもたらす。
【００１４】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、ヒト化、ヒト、またはキメラである。好ましくは、抗体または抗原結合部分は、ヒト化抗体またはその抗原結合部分である。より好ましくは、抗体または抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。
【００１５】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、マウス抗体またはその抗原結合部分である。
【００１６】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、１×１０−５Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する。好ましくは、抗体または抗原結合部分は、１×１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下、または１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９に示すアミノ酸配列、または配列番号１９の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０に示すアミノ酸配列、または配列番号２０の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を有する、重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１８】
本実施形態の一態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１２個の可能なアミノ酸残基の改変（本実施形態中で上述のとおり）のうち、６個までの改変を除いて、改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。好ましくは、５個までの改変を除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、４個までの改変を除いて、３個までの改変を除いて、２個までの改変を除いて、または１個の改変を除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。さらにより好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸残基の改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。
【００１９】
本実施形態の別の態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はいずれも改変されていない。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）配列番号１２に示すアミノ酸配列、または配列番号１２の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２１】
本実施形態の一態様では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１２個の可能なアミノ酸残基の改変（本実施形態中で上述）のうち、改変のうちの６個までを除いて、改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。好ましくは、５個までの改変を除いて、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、４個までの改変を除いて、３個までの改変を除いて、２個までの改変を除いて、または１個の改変を除いて、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。さらにより好ましくは、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。
【００２２】
本実施形態の別の態様では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はいずれも改変されていない。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）配列番号１８、または配列番号１８の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９、または配列番号１９の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号２０、または配列番号２０の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１３、または配列番号１３の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）配列番号１４、または配列番号１４の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２４】
本実施形態の一態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の２４個の可能なアミノ酸残基の改変（本実施形態中で上述）のうち、改変のうちの１２個までを除いて、改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。好ましくは、改変のうちの１１個までを除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、１０個までの改変を除いて、９個までの改変を除いて、８個までの改変を除いて、７個までの改変を除いて、６個までの改変を除いて、５個までの改変を除いて、４個までの改変を除いて、３個までの改変を除いて、２個までの改変を除いて、または１個の改変を除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。さらにより好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。
【００２５】
本実施形態の別の態様では、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲはいずれも改変されていない。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ−１との結合について、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体と交差競合または競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ−１との結合について、
（ｉ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲのそれぞれの１〜４個のアミノ残基が改変されていてもよい抗体と交差競合または競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲの改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲはいずれも改変されていない。
【００２８】
ＣＤＲ領域の決定は、十分に当分野の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組合せであってもよいことが理解される（「組み合わせたＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔ ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。言い換えれば、複数のＣＤＲを用いる実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組合せＣＤＲ、またはその組合せのうちのいずれかであり得る。
【００２９】
実施形態の一態様では、抗体はヒト化抗体である。実施形態の別の態様では、抗体は完全ヒト抗体である。実施形態の別の態様では、抗体はキメラ抗体である。
【００３０】
実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、１×１０−５Ｍ未満、好ましくは１×１０−６Ｍ未満、好ましくは５×１０−７Ｍ未満、好ましくは２×１０−７Ｍ未満、好ましくは１×１０−７Ｍ未満、またはさらにより好ましくは１×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する。
【００３１】
実施形態の別の態様では、抗体はマウス抗体である。本実施形態の別の態様では、抗体は、ヒト化、ヒト、またはキメラである。好ましくは、抗体はヒト化されている。より好ましくは、抗体は完全ヒト抗体である。
【００３２】
本実施形態の別の態様では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト完全長抗体である。本実施形態の別の態様では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト化抗体である。さらに別の実施形態では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のキメラ抗体である。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分のうちのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分のうちのいずれかを組換えにより産生する細胞系を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分のうちの任意のものの重鎖または軽鎖のいずれかをコードしているオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、対象に、治療上有効な量の本発明の抗体もしくは抗原結合部分、またはその医薬組成物を投与するステップを含む、癌を処置する方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、癌の処置に使用するための、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分を提供する。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、癌を処置する医薬品を調製するための、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１に記載する、ヒトＮｏｔｃｈ１免疫原プラスミドＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）のｃＤＮＡのＰＣＲ合成を例示する図である。
【図２】やはり実施例１に記載する、別のヒトＮｏｔｃｈ１免疫原プラスミドＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）のｃＤＮＡのＰＣＲ合成を例示する図である。
【図３】実施例３に示す、２つのモノクローナル抗体：ｍＡｂ Ｎ２４８ＡおよびｍＡｂ−ＣのＮｏｔｃｈ−１依存性ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を例示する図である。
【図４】ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡがＪａｇｇｅｄ−１誘導性Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を阻害することが示されることを例示する図である。Ｈｅｌａ／Ｊａｇｇｅｄ１細胞およびＮ１ｄＰ−ｃ１６細胞をルシフェラーゼレポーターアッセイのために同時培養した。ＭＩｇＧは対照マウス抗体である。Ｙ軸の数値はルシフェラーゼレポーター活性の読取り値である。
【図５】ヒトＮｏｔｃｈ１とヒトＮｏｔｃｈ２との間のＥＧＦ、Ｌｉｎ−Ａ、Ｌｉｎ−Ｂ、Ｌｉｎ−Ｃ、ＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインの配列アラインメントを示す図である。
【図６Ａ】ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞においてＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ１細胞内ドメイン）のレベルがｍＡｂ Ｎ２４８Ａによって低下されたことを例示する、ウエスタンブロット画像である。
【図６Ｂ】ＨＰＢ−Ａｌｌ細胞の成長がｍＡｂ Ｎ２４８Ａによって阻害されることを例示する図である。
【図７】ｍＡｂ Ｎ２４８ＡがそれぞれＨｅｓ１ｍＲＮＡ（Ａ）およびＨｅｓ４ｍＲＮＡ（Ｂ）の発現を遮断することを例示する図である。
【図８】ｍＡｂ Ｎ２４８ＡによるＨＰＢ−ＡＬＬ異種移植腫瘍の成長阻害を例示する図である。腫瘍が１５０〜３００ｍｍ３まで成長した後、図に示したようにマウスにｍＡｂを投薬した。それぞれの群は、ランダム化された腫瘍の大きさを有する１０匹のマウスを含有する。
【図９】マウスにおける５ｍｇ／ｋｇの単一用量注射後の、血漿ｍＡｂ Ｎ２４８Ａ濃度の変化を例示する図である。それぞれのデータ点は３匹のマウスに基づいて計算した。Ｔ１／２は、マウス血清中でのＮ２４８Ａの半減期である。
【図１０】マウスにおける５ｍｇ／ｋｇの単一用量注射後の、ＨＢＰ−ＡＬＬ異種移植腫瘍におけるＮＩＣＤの阻害を例示する図である。対照抗体Ｄ１６Ａで処置した腫瘍のウエスタンブロットバンドを１００％の強度として設定し、これは０％の阻害に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、高い親和性でＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体ならびにヒト／マウスのキメラ抗体に関する。本開示は、単離された抗体、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む免疫コンジュゲートおよび二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫コンジュゲート（ｉｍｍｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。また、本開示は、Ｎｏｔｃｈ−１の活性化を阻害するため、および異常細胞成長（たとえば癌）などのＮｏｔｃｈ−１の過剰活性化または過剰発現に関連する疾患を処置するため等の、抗体を使用する方法にも関する。したがって、本開示はまた、癌などの様々な種類の異常細胞成長を処置するための、抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合部分を使用する方法も提供する。
【００４１】
定義。
用語「Ｎｏｔｃｈ−１」または「Ｎｏｔｃｈ１」とは、互換性があるように使用され、ヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。たとえば、ネイティブヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質は、リーダーペプチド、大きな表皮成長因子（ＥＧＦ）様反復領域、３つのＬｉｎ１２反復、Ｎ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｎ）、Ｃ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｃ）、膜貫通（ＴＭ）配列および細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）から構成される。完全長ヒトＮｏｔｃｈ−１のＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１７６１７．２である。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「Ｎｏｔｃｈ−１負の調節領域」または「Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲ」とは、別段に示さない限りは、３つのＬｉｎ１２ドメイン、およびＮｏｔｃｈ−１の３つのＬｉｎ１２ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するアミノ酸配列または複数の配列からなる、Ｎｏｔｃｈ−１の任意のネイティブまたは合成のポリペプチド領域をいう。一実施形態では、「Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲ」には、３つのＬｉｎ１２ドメインならびに２つのヘテロ二量体化ドメインＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃが含まれ、Ｎｏｔｃｈ−１のＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインは、共有結合しており、未だフューリン様プロテアーゼによって切断されていない（Ｓ１切断前）。別の実施形態では、「Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲ」には、３つのＬｉｎ１２ドメインならびに２つのヘテロ二量体化ドメインＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃが含まれ、ＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインは非共有的に結合している（Ｓ１切断後）。本実施形態の一態様では、ＨＤ−Ｃドメイン内のＳ２部位は、未だＡＤＡＭ型メタロプロテアーゼによって切断されていない。本実施形態の別の特定の態様では、ＨＤ−Ｃドメイン内のＳ２部位は、ＡＤＡＭ型メタロプロテアーゼによって切断されつつある、または既に切断されている。（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。
【００４３】
用語「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫性もしくは病理学的な炎症の場合は、正常なヒト細胞もしくは組織の、選択的な損傷、破壊、または人体からの排除をもたらす、たとえば、上記細胞または肝臓によって産生されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体が含まれる）の作用をいう。
【００４４】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係性をいう。本明細書中で使用する語句「細胞表面受容体」には、たとえば、シグナルを受信し、細胞の原形質膜を横切ってそのようなシグナルを伝達することができる、分子および分子の複合体が含まれる。本開示の「細胞表面受容体」の一例はＮｏｔｃｈ−１受容体である。
【００４５】
本明細書中で言及する用語「抗体」には、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその単鎖が含まれる。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）鎖および２本の軽鎖（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分をいう。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分することができる。ＣＤＲ領域は、どちらも当業者に周知のＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａの付番方式を用いて決定することができる。たとえば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）を参照されたい。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１構成成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
【００４６】
本明細書中で使用する用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）とは、抗原（たとえばＮｏｔｃｈ−１）と特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つまたは複数の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われることができることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、これらが、ＶＬおよびＶＨ領域が対合した一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、結合させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、たとえば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３を参照）。そのような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を含めた任意の適切な技法を用いて得られる場合があり、断片は、インタクトな抗体と同じように、有用性についてスクリーニングし得る。
【００４７】
本明細書中で使用する「単離された抗体」とは、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図する（たとえば、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体は、Ｎｏｔｃｈ−１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＮｏｔｃｈ−１分子などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４９】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体をいうことを意図する。さらなるフレームワーク領域の改変がヒトフレームワーク配列内でなされてもよい。
【００５０】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体をいうことを意図する。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」には、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれることを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体またはその抗原結合部分には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入された突然変異）が含まれ得る。しかし、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体が含まれることを意図しない。
【００５２】
用語「ヒトモノクローナル抗体」または「完全ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合させた、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞が含まれる、ハイブリドーマによって産生される。
【００５３】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の任意の改変された形態、たとえば、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートをいう。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「組換えヒト抗体」には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック動物もしくは染色体導入動物（たとえばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（以下に詳述）から単離された抗体、（ｂ）たとえばトランスフェクトーマから、ヒト抗体を発現するように形質転換させた宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離したすべてのヒト抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。特定の実施形態では、しかし、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合はｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する配列である一方で、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないものである場合がある。
【００５５】
抗体に関して本明細書中で使用する用語「競合する」とは、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分との結合について競合する場合をいい、第１の抗体とその同族エピトープとの結合は、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下において検出可能に減少している。第２の抗体とそのエピトープとの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少しているという代替は、可能であるが、必ずしもそうでなくてもよい。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体とそのエピトープとの結合を、その第２の抗体が第１の抗体とその各自のエピトープとの結合を阻害することなしに、阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、他の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ、より高い、またはより低い度合であるかに関わらず検出可能に阻害する場合は、抗体は、その各自のエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」と言われる。たとえば、交差競合抗体は、本明細書中に開示した抗体が結合するエピトープ、またはエピトープの一部分と結合することができる。競合および交差競合抗体のどちらの使用も本開示によって包含されている。そのような競合または交差競合が起こる機構に関わらず（たとえば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその一部分との結合など）、当業者には、本明細書中に提供する教示に基づいて、そのような競合および／または交差競合抗体が包含されており、本明細書中に開示する方法に有用であり得ることを理解されよう。
【００５６】
本明細書中で使用する「主要エピトープ」とは、エピトープのアミノ酸残基のうちの任意の１つをアラニンまたは非保存的置換によって置き換えた場合に、そのエピトープが属する抗原に対する抗体の結合親和性が５０％を超えて減少する、エピトープをいう。
【００５７】
本明細書中で使用する「アイソタイプ」または「クラス」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（たとえば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）をいう。抗体の定常ドメインは抗原との結合に関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、所定のヒト抗体または免疫グロブリンを５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。様々な免疫グロブリンクラスの構造および三次元立体配置は周知である。様々なヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが、補体を活性化させることが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいてＡＤＣＣを媒介することが知られている。
【００５８】
本明細書中で使用する「サブクラス」とは、重鎖定常領域遺伝子のアイソタイプ内のさらなる特定、たとえば、ＩｇＧアイソタイプ内のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスなどをいう。
【００５９】
本明細書中で使用する用語「化合物」または「医薬化合物」には、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート、および二重特異性分子が含まれる。
【００６０】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」とは、本明細書中で用語「抗原と特異的に結合する抗体」と互換性があるように使用される。
【００６１】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明するために使用する。たとえば、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲであってもよい。さらに、ＦｃＲはＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであることができ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体が含まれ、これには、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：２０３〜２３４（１９９７）を参照）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４（１９９４）、ならびにｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１（１９９５）に総説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲが、本明細書中で用語「ＦｃＲ」によって包含される。また、この用語には、母系ＩｇＧを胎児に移行することを司っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９（１９９４））。
【００６２】
本明細書中で使用する「ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する」抗体とは、１×１０−５Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する抗体をいうことを意図する。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｎ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のｏｎ速度、すなわち会合速度をいうことを意図し、他方で、本明細書中で使用する用語「ｋｏｆｆ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のオフ速度、すなわち解離速度をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、ｋｏｆｆ対ｋｏｎの比（すなわちｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から得られる平衡解離定数をいうことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する一方法は、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いた表面プラズモン共鳴を用いることによるものである。
【００６４】
本明細書中で使用する用語、抗体に対する「高い親和性」とは、１×１０−６Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「対象」には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
【００６６】
ヒトＮｏｔｃｈ−１受容体
ヒトＮｏｔｃｈ１ｃＤＮＡは、リーダーペプチド、３６個のＥＧＦ様反復、負の調節領域（ＮＲＲ）、膜貫通（ＴＭ）配列および細胞内ドメインからなる２５５６個のアミノ酸残基のタンパク質をコードしている。（Ｖａｒｄａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、４１：７０６１〜７０６７、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００４、２４：９２６５〜９２７３、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲは、アミノ酸残基１４４７から始まり、１７３４で終わる。Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲは、ＬＮＲ−Ａ（Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１４４７〜１４８３）、ＬＮＲ−Ｂ（Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１４８４〜１５２５）、ＬＮＲ−Ｃ（Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１５２６〜１５６５）、Ｎ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｎ、Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１５６６〜１６６５）およびＣ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｃ、Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１６６６〜１７３４）からなる。
【００６７】
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特長または特性によって特徴づけられる。たとえば、抗体は、１×１０−５Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性、たとえば１×１０−６Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下のＫＤ、さらにより好ましくは１×１０−８Ｍ以下のＫＤで、Ｎｏｔｃｈ−１と結合する。
【００６８】
Ｎｏｔｃｈ−１に対する抗体の結合能力を評価するためのアッセイには、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析が含まれる。また、抗体の結合動力学（たとえば結合親和性）も、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によってなど、当分野で知られているアッセイによって評価することができる。
【００６９】
モノクローナル抗体ｍＡｂ Ｎ２４８Ａ。
本開示の１つの例示的な抗体は、実施例１〜３および８に記載のように作製、単離、試験および構造的に特徴づけた、マウスモノクローナル抗体Ｎ２４８Ａである。表１は、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの様々な領域のアミノ酸配列および本明細書中に開示する他の配列を記載している。
【００７０】
【表１−１】
【００７１】
【表１−２】
【００７２】
【表１−３】
【００７３】
【表１−４】
【００７４】
【表１−５】
【００７５】
実施例４に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは０．３３×１０−６Ｍ未満のＫＤを有する。
【００７６】
実施例５に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが少なくとも２つの区別可能なＮｏｔｃｈ−１エピトープと結合することが示され、一方のエピトープはＬｉｎ−Ａドメイン内にあり、他方のエピトープはＨＤ−Ｃドメイン内にある。
【００７７】
実施例６に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは、細胞培養物においてＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）および乳癌細胞の成長をどちらも阻害する。
【００７８】
実施例７に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＴ細胞リンパ芽球性白血病も阻害する。
【００７９】
Ｎｏｔｃｈ−１Ｌｉｎ−ＡドメインおよびＮｏｔｃｈ−１ＨＤ−Ｃドメイン中の少なくとも２つの区別されたエピトープと結合する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
高い親和性でＮｏｔｃｈ−１Ｌｉｎ−ＡおよびＨＤ−Ｃドメインと結合する抗体はＮｏｔｃｈ−１シグナル伝達を低下させ、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで生物活性を実証して、癌細胞の成長、特にＴ−ＡＬＬ癌細胞の成長を阻害し得ることが、本発明の企図内にある。そのような抗体は、当業者に知られている一般的な方法に従って生成し得る。一実施形態では、そのような抗体は、実施例１および２に示すように、マウスをＮｏｔｃｈ−１ＬｉｎＡドメインおよびＮｏｔｃｈ−１ＨＤ−Ｃドメインを含む免疫原で免疫化し、次いで、実施例２に示すように、そのようにして作製された抗体のハイブリドーマクローニング、およびＥＬＩＳＡアッセイによるクローニングした抗体のアッセイを行うことによって、生成することができる。ＥＬＩＳＡアッセイに従って選択された抗体のＮｏｔｃｈ−１結合親和性は、実施例４に示すように、表面プラズマ共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器で測定することができる。
【００８０】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、Ｎｏｔｃｈ−１ＬｉｎＡドメインおよびＮｏｔｃｈ−１ＨＤ−Ｃドメインと結合する抗体であって、上記段落に記載のもの以外の、当分野で知られている任意の他の方法によって生成することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、本明細書中にさらに記載するように、一般に、抗体の刺激および産生の確立された従来の技術に沿うものである。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般的な技法は、当分野で知られているおよび／または本明細書中に記載されている。
【００８１】
ハイブリドーマ技術によって作製した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれからの抗体産生細胞を、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞系を生じるための基礎として役割を果たすように操作できることが、本発明の企図内にある。典型的には、宿主動物に、本明細書中に記載のものを含めた一定量の免疫原を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内で接種する。
【００８２】
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１（１９８２）によって改変されたものを用いて調製することができる。それだけには限定されないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏからのものを含めた入手可能な骨髄腫系を、ハイブリダイゼーションに使用し得る。一般に、この技法は、ポリエチレングリコールなどのフソゲンを用いて、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞とリンパ球細胞とを融合させることを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、ハイブリダイズしていない親細胞を排除するために、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的成長培地中で成長させる。血清を添加したまたは添加していない、本明細書中に記載する培地のうちのいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用できる。細胞融合技法の別の代替方法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して対象発明のＮｏｔｃｈ−１モノクローナル抗体を生成することができる。所望する場合はハイブリドーマを拡大およびサブクローニングし、従来の免疫アッセイ手順（たとえば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって上清を抗免疫原活性についてアッセイする。
【００８３】
抗体源として使用し得るハイブリドーマには、Ｎｏｔｃｈ−１に特異的なモノクローナル抗体またはその一部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞が包含される。
【００８４】
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで既知の手順を用いて成長させ得る。所望する場合は、モノクローナル抗体は、培養培地または体液から、硫安塩析、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって単離し得る。望ましくない活性が存在する場合は、これは、たとえば、固相に付着させた免疫原から作製された吸着剤上に調製物を流し、所望の抗体を免疫原から溶出または放出させることによって、除去することができる。宿主動物を、ヒトＮｏｔｃｈ−１、または、二官能性もしくは誘導化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である］を用いて、免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤とコンジュゲートさせた標的アミノ酸配列を含有する断片を用いて免疫化することで、抗体（たとえばモノクローナル抗体）の集団を得ることができる。
【００８５】
宿主動物における免疫化によって作製した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体のヒト化。
宿主動物における免疫化によって作製された本発明の抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、その生物活性および医薬上の特性を増加させるために、多くの様式で操作できることが、本発明の企図内にある。そのような操作の一方法はヒト化である。
【００８６】
モノクローナル抗体をヒト化するためには４つの一般的なステップが存在する。これらは、（１）開始抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセス中に使用するかを判断するステップ、（３）実際のヒト化方法／技法のステップ、ならびに（４）ヒト化抗体を形質移入および発現させるステップである。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，８０７，７１５号、第５，８６６，６９２号、第６，３３１，４１５号、第５，５３０，１０１号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、および第６，１８０，３７０号を参照されたい。
【００８７】
非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されており、げっ歯類または改変げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常ドメインと融合したその関連するＣＤＲを有するキメラ抗体が含まれる。たとえば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３〜２９９（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：４２２０〜４２２４（１９８９）、Ｓｈａｗら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：４５３４〜４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：３５７７〜３５８３（１９８７）を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させる前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）内に移植したげっ歯類ＣＤＲを記載している。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）を参照されたい。別の参考文献は、組換え操作したげっ歯類フレームワーク領域によって支持されるげっ歯類ＣＤＲを記載している。たとえば欧州特許公開第０５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的応用の持続期間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望まない免疫学的応答を最小限にするために設計されている。たとえば、抗体定常領域は、これが免疫学的に不活性である（たとえば補体溶解を誘発しない）ように操作することができる。たとえば、ＰＣＴ公開ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号、英国特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。利用し得る抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：２４７１〜２４７６（１９９１）ならびに米国特許第６，１８０，３７７号、第６，０５４，２９７号、第５，９９７，８６７号、第５，８６６，６９２号、第６，２１０，６７１号、第６，３５０，８６１号、およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／２７１６０号にも開示されている。
【００８８】
ヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
完全ヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている市販のマウスを用いることによって得られ得ることが、本発明の企図内にある。また、より望ましい（たとえば完全ヒト抗体）またはより強力な免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に使用し得る。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｆｒｅｍｏｎｔ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【００８９】
また、完全ヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、ファージディスプレイ技術の一般的な方法に従って組換えによって得られ得ることも、本発明の企図内にある。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、および第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）を参照されたい。
【００９０】
代替として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３（１９９０））を用いて、ヒト抗体および抗体断片を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、免疫化していないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生じさせることができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームでＭ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要または副コートタンパク質遺伝子のいずれか中にクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として表示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択も、これらの特性を示す抗体をコードしている遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な様式で行うことができる。総説には、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５６４〜５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから単離した。免疫化していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原が含まれる）の多様なアレイに対する抗体は、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２：７２５〜７３４（１９９３）によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い確率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入した変化の一部はより高い親和性を与え、高親和性の表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が、続く抗原免疫誘発中に優先的に複製および分化される。この天然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技法を用いることによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫化していないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体のレパートリー（レパートリー）で連続的に置き換えることによって、向上させることができる。この技法により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能となる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「最大のライブラリ（ｔｈｅ ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても知られる）を作製するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６（１９９３）によって記載されている。
【００９１】
また、遺伝子シャフリングを用いてヒト抗体をげっ歯類抗体から誘導することもでき、ヒト抗体は開始げっ歯類抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリント」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えて、げっ歯類−ヒトのキメラを作出する。抗原に対する選択により、機能的抗原結合部位を修復することができるヒト可変領域の単離がもたらされる、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリント）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにプロセスを繰り返した場合、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基をまったく有さない完全ヒト抗体を提供する。
【００９２】
上記論考はヒト化抗体およびヒト抗体に関するが、論じた一般的な原理は、抗体を、たとえば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシにおいて使用するためにあつらえることに適用可能である。本明細書中に記載の抗体をヒト化する１つまたは複数の態様、たとえば、ＣＤＲ移植、フレームワーク突然変異およびＣＤＲ突然変異を組み合わせ得る。
【００９３】
組換えによって作製した、操作および改変した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
一般に、抗体は、所望の抗体のＤＮＡ配列を発現ベクター内に配置し、次いで、それだけには限定されないが、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞を含めた宿主細胞中での形質移入および発現によって、組換えによって作製し得る。ＰＣＴ特許公開ＷＯ８７／０４４６２号。トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック乳細胞などの他の宿主細胞も使用し得る。たとえば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２７５６（２００１）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３：６５（１９９５）、ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７（１９９９）を参照されたい。
【００９４】
また、抗体は、組換えによって改変もし得る。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域のＤＮＡをマウス抗体ＤＮＡの相同的なマウス配列、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１（１９８４）の代わりに、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部を共有結合させることによって使用してもよい。同様の様式で、本明細書中の抗Ｎｏｔｃｈ−１モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製することができる。
【００９５】
また、抗体可変領域は、ＣＤＲ移植によっても改変することができる。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原の相互作用を司っているため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植した、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列が含まれる発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１００２９〜１００３３、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および６，１８０，３７０号を参照）
【００９６】
したがって、本開示の別の態様は、それぞれ配列番号１８、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号１２、１３および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、そのような抗体は、モノクローナル抗体Ｎ２４８ＡのＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含有する一方で、これらの抗体からの異なるフレームワーク配列を含有し得る。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列が含まれる公的ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。
【００９７】
別の種類の可変領域の改変は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基と突然変異させることによって、目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（たとえば親和性）を向上させることである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行って突然変異（複数可）を導入することができ、抗体結合、または他の目的の機能的特性に対する効果は、本明細書中に記載のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのアッセイで評価することができる。典型的には、保存的改変（以下に論じる）が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個以下、２、３、４または５個の残基が変更される。
【００９８】
保存的置換および抗体親和性成熟は、後の段落でより詳細に論じる。
【００９９】
抗体が結合する抗原エピトープのマッピング。
抗原上のモノクローナル抗体の結合エピトープは、抗原−抗体の相互作用の種類に応じて、いくつかの方法によってマッピングし得る。
【０１００】
抗体が、抗原中の連続的なアミノ酸残基からなる、その結合が抗原のコンホメーション変化によって通常は影響を受けない単一のエピトープと結合する場合、結合エピトープは直鎖エピトープと呼ばれる。直鎖結合エピトープを同定するために、ペプチド走査方法を一般的に使用し（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３１５巻、第１〜２号、１１〜１８ページ、２００６年８月を参照）、これは、抗原配列の全長にわたる、一連の重複する１０〜１５量体ペプチドを合成することを要する。ペプチドを２つ組のドット方式でタンパク質架橋結合膜上にアレイ配置する。ペプチドアレイに対する抗体の結合親和性をＥＬＩＳＡと同様に分析する。ペプチドをアレイ配置した膜を、非特異的結合を遮断するために５％のウシ胎児血清を含む１×ＰＢＳＴ中で最初にインキュベーションし、その後、試験抗体または非特異的な対照抗体と共にインキュベーションし、次いで、ＨＲＰで標識した二次抗体と共にインキュベーションする。抗体の結合強度は、化学発光イメージング機器を用いて読み取る。
【０１０１】
代替として、直鎖結合エピトープは、酵母細胞表面上に表示された抗原タンパク質ドメインを用いて（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３６５（１）、１９６〜２００、２００７年１月を参照）、または細菌細胞表面上に表示された抗原タンパク質断片を用いて（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２２６（２）、３４７〜３５３、２００３年９月を参照、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、５（１２）、１０３９〜１０４５、２００８年１１月も参照）、次いでフローサイトメトリー分別、すなわちＦＡＣＳで同定し得る。
【０１０２】
質量分析と組み合わせた、ペプチド抗原および抗体複合体の限定タンパク質分解が、直鎖結合エピトープを位置決定するための別の手法を提供し得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５２４、８７〜１０１、２００９を参照）。抗原および抗体を混合し、結合複合体を形成するために適した条件でインキュベーションし、これを、制御された温度および時間のもとでプロテアーゼによって消化する。その後、結合した反応混合物をプロテインＡ親和性カラムに通して、抗原エピトープ断片と結合した抗体を保持させ、これを、カラムから溶出させた後に、質量分析によって分析する。
【０１０３】
コンホメーションエピトープのマッピングは、抗体とそのネイティブなコンホメーションの抗原との相互作用に依存する。いくつかの技法が、コンホメーションエピトープの決定において有用であることが報告されている。一般的に使用される方法の１つはアミノ酸突然変異誘発である。抗体と結合することが推測される抗原タンパク質中の個々のアミノ酸残基を突然変異させ、その後、突然変異した抗原タンパク質を発現させ、抗体結合分析に供して、結合親和性が損なわれたかどうかを決定する。しかし、完全抗原タンパク質配列にわたる系統的なアミノ酸突然変異誘発は労力がかかる。抗体と相互作用する抗原タンパク質の領域を絞り込むために、密に関連するタンパク質ドメインによる個々の抗原ドメインの置換が有用な方法である場合がある（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．、２７４（１４）９６１７〜９６２６、１９９９年４月を参照）。
【０１０４】
ショットガン突然変異誘発マッピングが、従来のアミノ酸突然変異誘発の欠点を克服するために開発された（Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１３１、６９５２〜６９５４、２００９を参照）。この方法では、抗原ｃＤＮＡから作製した包括的な突然変異ライブラリを利用し、それぞれのプラスミドクローンは独特の点突然変異を含有し、突然変異ライブラリ全体が抗原コード領域のすべてのアミノ酸をカバーする。プラスミドクローンのライブラリをＨＥＫ−２９３Ｔまたは他のヒト細胞中に形質移入させ、その後、細胞を、３８４ウェルマイクロプレート中にアレイ配置させる。細胞をマイクロプレート上に固定した後に抗体の結合活性をアッセイする。アミノ酸の突然変異が反応性の損失をもたらす場合、これは抗体結合エピトープとして同定される。
【０１０５】
抗原−抗体の複合体の共結晶化、Ｘ線回折および構造解析により、抗原−抗体の相互作用の方向の可視化が与えられる。アミノ酸突然変異誘発と組み合わせた場合、この技術は抗体結合エピトープの強力な証拠および鮮明な描写を提供するであろう。しかし、共結晶化および構造解析が技術的に難しく、大量の精製した抗原および抗体を必要とし、時間のかかる試行錯誤プロセスとなる場合がある。
【０１０６】
１つのエピトープまたは指定したエピトープの組と結合する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体を作製するために、抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体を作製し、その後、当分野で一般に知られている上記マッピング方法に従って、これらの抗体のそれぞれが結合するエピトープまたはエピトープの組を決定することができる。その後、特定のエピトープまたは特定のエピトープの組と結合する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体を選択することができる。
【０１０７】
保存的置換
既に論じたように、抗体は、抗体のアミノ酸残基のうちの１つもしくは複数の保存的置換によって、または抗体のアミノ酸への、アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加によって、組換えにより改変されてもよい。
【０１０８】
アミノ酸配列の挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮまたはＣ末端と血液循環中の抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドとの融合が含まれる。
【０１０９】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその代わりに挿入されている。最も関心が持たれる置換突然変異誘発の部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換を表２に示す。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合は、表２中で「例示的な置換」と命名した、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載した、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングし得る。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換領域中の、たとえばシートもしくはヘリックスコンホメーションとしてのポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持におけるその効果が顕著に異なる置換を選択することによって、達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）極性、荷電なし：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１１２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することによって行う。
【０１１３】
また、抗体の適正のコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、一般にセリンで置換して、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止し得る。逆に、システイン結合（複数可）を、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、その安定性を向上させるために抗体に付加し得る。
【０１１４】
親和性成熟した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体
本発明には、親和性成熟した実施形態が含まれる。たとえば、親和性成熟した抗体は、当分野で知られている手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０５８１８４号）。
【０１１５】
以下の方法を、抗体の親和性の調整およびＣＤＲの特徴づけに使用し得る。「ライブラリ走査突然変異誘発」と呼ばれる、抗体のＣＤＲを特徴づけるおよび／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更させる（向上させるなど）一方法。一般に、ライブラリ走査突然変異誘発は以下のように動作する。当分野で認識されている方法を用いて、ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸位置を２種類以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０種類など）のアミノ酸で置き換える。これによりクローンの小ライブラリが作製され（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置について１つずつ）、そのそれぞれが２つ以上のメンバーの複雑さを有する（それぞれの位置で２種類以上のアミノ酸を置換する場合）。一般に、ライブラリには、ネイティブ（非置換）のアミノ酸を含むクローンも含まれる。それぞれのライブラリからの少数のクローン、たとえば約２０〜８０個のクローン（ライブラリの複雑さに依存する）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングし、増加した、同じ、減少した結合を有する、または結合しない候補を同定する。
【０１１６】
一部の実施形態では、当分野で認識されている突然変異誘発方法を用いて、ＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置を、一部の実施形態では、１回に１個、２０種類すべての天然アミノ酸で置き換える。これによりクローンの小ライブラリが作製され（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置について１つずつ）、そのそれぞれが２０個のメンバーの複雑さを有する（それぞれの位置で２０種類すべてのアミノ酸を置換する場合）。
【０１１７】
一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリは、同じＣＤＲ中または２つ以上のＣＤＲ中であり得る２つ以上の位置での置換を含む。したがって、ライブラリは、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリは、２つ以上のＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリは、２、３、４、５または６個のＣＤＲ中に見つかる３、４、５、またはそれより多くの位置での置換を含み得る。置換は、冗長性の低いコドンを用いて調製し得る。たとえば、Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ、１３７（１）：１０９〜１８）の表２を参照されたい。それぞれのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであり得る。
【０１１８】
向上した結合を有する候補を配列決定し、それにより、「向上した」置換とも呼ばれる、向上した親和性をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定し得る。また、結合する候補も配列決定し、それにより、結合を保持するＣＤＲ置換も同定し得る。
【０１１９】
複数回のスクリーニングを実施し得る。たとえば、それぞれが１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を含む、向上した結合を有する候補は、それぞれの向上したＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が向上した結合を示したＣＤＲ中のアミノ酸位置）で少なくとも元のおよび置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリの設計にも有用である。このライブラリの調製、およびスクリーニングまたは選択を以下にさらに記述する。
【０１２０】
また、ライブラリ走査突然変異誘発は、向上した結合、同じ結合、減少した結合を有する、または結合しないクローンの頻度が、抗体−抗原の複合体の安定性のためにそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限りは、ＣＤＲを特徴づけるための手段も提供する。たとえば、ＣＤＲのある位置が、２０種類すべてのアミノ酸に変化させたときに結合を保持している場合、その位置は、抗原結合に必要である可能性が低い位置として同定される。逆に、あるＣＤＲの位置が、置換の少ないパーセンテージのみで結合を保持している場合は、その位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリ走査突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（２０種類すべてのアミノ酸が含まれる）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないまたは少数のアミノ酸にのみ変化させることができるＣＤＲ中の位置に関する情報をもたらす。
【０１２１】
向上した親和性を有する候補は、向上したアミノ酸、その位置での元のアミノ酸が含まれ、所望されるライブラリの複雑さ次第で、または所望のスクリーニングもしくは選択の方法を用いて許容される、その位置での追加の置換がさらに含まれ得る、第２のライブラリ中で合わせ得る。さらに、所望する場合は、隣接アミノ酸位置を、少なくとも２種類以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接アミノ酸のランダム化は、突然変異体ＣＤＲにおけるさらなるコンホメーションの柔軟性を可能にする場合があり、これは、立ち代って、より多数の向上させる突然変異の導入を可能または容易にし得る。また、ライブラリは、第１の回目のスクリーニングで向上した親和性を示さなかった位置での置換も含み得る。
【０１２２】
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いたスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた当分野で知られている選択のための任意の方法を用いた選択を含めた、当分野で知られている任意の方法を用いて、第２のライブラリを、向上したおよび／または変更された結合親和性を有するライブラリメンバーについてスクリーニングまたは選択する。
【０１２３】
抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体の翻訳後修飾
また、抗体は、それだけには限定されないが、様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含めた翻訳後修飾によって修飾されることもできる。抗体は、その定常領域中の保存的な位置でグリコシル化される。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８、ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）、ならびにコンホメーションに影響を与える場合がある、糖タンパク質の部分間の分子内相互作用に影響を与え、糖タンパク質の三次元表面を提示した（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）。また、オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて所定の糖タンパク質を特定の分子に標的化する役割も果たし得る。また、抗体のグリコシル化は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。具体的には、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節性発現を有するＣＨＯ細胞が、向上したＡＤＣＣ活性を有することが報告されている（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。
【０１２４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結のいずれかである。Ｎ−連結とは、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への付着をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン［式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ−連結グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
【０１２５】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ−連結グリコシル化部位用）。また、変更は、元の抗体の配列に１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を付加する、またはそれによって置換することによっても行い得る（Ｏ−連結グリコシル化部位用）。
【０１２６】
また、抗体のグリコシル化パターンは、根底にあるヌクレオチド配列を変更させずに変更し得る。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、たとえば抗体の発現に使用する細胞種がネイティブ細胞であることは稀なため、抗体のグリコシル化パターンが変動することを予測することができる（たとえばＨｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０１２７】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を与える要因には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖の産生に関与している特定の酵素の導入または過剰発現を含めた様々な方法が、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するために提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、第５，５１０，２６１号および第５．２７８、２９９号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化を、糖タンパク質から、たとえば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて、酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種類の多糖のプロセッシングが欠損しているように遺伝子操作することができる。これらおよび類似の技法は当分野で周知である。
【０１２８】
翻訳後修飾の他の方法には、それだけには限定されないが、酵素的手段、酸化置換およびキレート化を含めた、当分野で知られているカップリング技法の使用が含まれる。修飾は、たとえば、免疫アッセイ用の標識を付着させるために使用することができる。
【０１２９】
改変された定常領域を有する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体
本発明の一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性である、たとえば、補体媒介性の溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化させない、または、補体媒介性の溶解の始動、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の刺激もしくはミクログリアの活性化のうちの任意の１つもしくは複数において低下した活性を有する（改変されていない抗体と比較して）定常領域などの、改変された定常領域を含む。定常領域の様々な改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成し得る。たとえば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜３２４（１９９５）、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９、１５７：４９６３〜４９６９（１９９６）、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４（２０００）、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１（１９８９）、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号、および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように改変されている。他の実施形態では、抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸の付番は野生型ＩｇＧ２配列を参照）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４。さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のためにアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。一部の実施形態では、定常領域は、グリコシル化されたアミノ酸残基または定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるフランキング残基を突然変異させることによって、Ｎ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。たとえば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７をＡ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させ得る。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１（１９８９）、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のために酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去することなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞中での発現によって、脱グリコシル化されていてよい。
【０１３０】
Ｆｃ領域内の改変を典型的に使用して、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性などの抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させることができる。さらに、本開示の抗体は、やはり抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、化学修飾し得るか（たとえば１つもしくは複数の化学部分を抗体に付着させることができる）、そのグリコシル化パターンを変更させるために改変し得る。これらの態様のそれぞれは、以下にさらに詳述されている。Ｆｃ領域中の残基の付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標のものである。
【０１３１】
一事例では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されている、たとえば増加または減少しているように改変されている。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、たとえば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変更されている。
【０１３２】
別の事例では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために突然変異されている。より詳細には、抗体が、ネイティブのＦｃ−ヒンジドメインのＳｐＡ結合と比較して、損なわれたブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の結合を有するように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３のドメイン界面領域内に導入する。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳述されている。
【０１３３】
別の事例では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために改変されている。様々な手法が可能である。たとえば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの突然変異のうちの１つまたは複数を導入することができる。あるいは、米国特許第５，８６９，０４６号および６，１２１，０２２号に記載のように、生物学的半減期を増加させるために、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採った回収受容体結合エピトープが含有されるように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変更することができる。
【０１３４】
さらに他の事例では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって変更する。たとえば、抗体がエフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持しているように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性を変更させるエフェクターリガンドは、たとえば、補体のＦｃ受容体またはＣ１構成成分であってもよい。この手法は、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳述されている。
【０１３５】
別の事例では、抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。この手法は、米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳述されている。
【０１３６】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つまたは複数のアミノ酸残基を変更させることによって、補体を固定する抗体の能力を変更させる。この手法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【０１３７】
さらに別の例では、Ｆｃ領域は、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の位置の１つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するおよび／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる抗体の能力を増加させるために改変されている。この手法は、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、向上した結合を有する変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：６５９１〜６６０４（２００１）を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を向上させることが示された。さらに、Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの組合せの突然変異体が、ＦｃγＲＩＩＩの結合を向上させることが示された。
【０１３８】
さらに別の例では、抗体のグリコシル化は改変されている。たとえば、脱グリコシル化された抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、たとえば抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。そのような炭水化物の改変は、たとえば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。たとえば、１つまたは複数の可変領域のフレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらすことによって、その部位でのグリコシル化を排除する、１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのようなアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのような手法は、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳述されている。
【０１３９】
さらに、またはそれに代わって、低下した量のフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体などの変更された種類のグリコシル化を有する抗体または増加した二分ＧｌｃＮＡｃ構造を有する抗体を作製することができる。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物の改変は、たとえば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当分野で記載されており、本開示の組換え抗体を発現させることによって、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生させるための宿主細胞として使用することができる。たとえば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞系中で発現された抗体がその炭水化物上にフコースを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置き換えベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製した（米国特許公開第２００４−０１１０７０４号、およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、８７：６１４〜２２（２００４）を参照）。別の例として、欧州特許公開ＥＰ１，１７６，１９５号は、アルファ１，６結合関連の酵素を低下または排除することによって、そのような細胞系中で発現させた抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードしている機能を破壊したＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載している。また、ＥＰ１，１７６，１９５号は、抗体のＦｃ領域と結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加することに関して低い酵素活性を有する、または酵素活性を有さない細胞系、たとえばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）−連結炭水化物に付着させる能力が低下しており、また、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化ももたらす、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞を記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３〜２６７４０（２００２）も参照）。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作した細胞系中で発現される抗体が、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらす増加した二分ＧｌｃＮＡｃ構造を示すように、糖タンパク質を改変するグリコシルトランスフェラーゼ（たとえばベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作した細胞系を記載している（Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０（１９９９）も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断除去し得る。たとえば、フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏら、（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：５５１６〜２３（１９７５））。
【０１４０】
本開示によって企図される本明細書中の抗体の別の改変はｐｅｇ化である。抗体は、たとえば、抗体の生物学的（たとえば血清）半減期を増加させるためにｐｅｇ化することができる。抗体をｐｅｇ化するためには、抗体またはその断片を、典型的にはＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着される条件下で反応させる。典型的には、ｐｅｇ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）と用いたアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施する。本明細書中で使用する用語「ポリエチレングリコール」には、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されている、ＰＥＧの任意の形態が包含されることを意図する。特定の事例では、ｐｅｇ化する抗体は脱グリコシル化されている抗体である。タンパク質をｐｅｇ化する方法は当分野で知られており、本開示の抗体に適用することができる。たとえば、欧州特許ＥＰ０１５４３１６Ｂ１号およびＥＰ０４０１３８４Ｂ１号を参照されたい。
【０１４１】
他の抗体の改変には、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように改変された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全体または一部に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の顕著な補体依存性溶解、または細胞媒介性破壊を誘発せずに、標的分子と結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で改変された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症性および他の有害な反応を回避するために、慢性抗体療法における使用に特に適している。
【０１４２】
融合タンパク質
また、本発明には、本発明の抗体またはポリペプチドからの１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含される。一実施形態では、本発明の抗体の可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、本発明の抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む。本発明の目的のために、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体およびそれがネイティブ分子中で付着していない別のアミノ酸配列、たとえば、異種配列または別の領域からの相同配列を含有する。例示的な異種配列には、それだけには限定されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。
【０１４３】
融合ポリペプチドは、当分野で知られている方法、たとえば、合成または組換えによって作出することができる。
【０１４４】
二重特異性分子
本開示の抗体またはその抗原結合部分を、誘導体化するか、または別の機能的分子、たとえば、別のペプチドもしくはタンパク質（たとえば、ある受容体に対する別の抗体もしくはリガンド）と連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。本開示の抗体は、実際には、誘導体化するか、複数の他の機能的分子と連結させて、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多特異性分子を作製することができる。そのような多特異性分子も本明細書中で使用する用語「二重特異性分子」によって包含されることを意図する。本開示の二重特異性分子を作出するためには、二重特異性分子がもたらされるように、本開示の抗体を、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体などの１つまたは複数の他の結合分子と機能的に連結させることができる（たとえば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有会合または別の方法によって）。
【０１４５】
抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体をコードしているポリヌクレオチド
また、本発明は、本発明の抗体およびペプチドをコードしている単離したポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【０１４６】
一態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本発明の抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本発明の抗体またはポリペプチドのうちのいずれかをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれかを作製する方法を提供する。
【０１４８】
また、任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコードまたは非コード配列が、必ずしもではないが本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずしもではないが、他の分子および／または支持物質と連結していてもよい。
【０１４９】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体もしくはその一部分をコードしている内在配列）を含み得るか、またはそのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、ネイティブの免疫反応性分子と比較して、コードされているポリペプチドの免疫反応性が消失しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載のように評価し得る。変異体は、好ましくは、ネイティブ抗体またはその一部分をコードしているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０１５０】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最大一致についてアラインメントした際に同じである場合に、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較ウィンドウにわたって比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」とは、２つの配列を最適にアラインメントした後に、配列を同数の連続的な位置の参照配列と比較し得る、少なくとも約２０個の連続的な位置、通常は３０〜約７５個、または４０〜約５０個のセグメントをいう。
【０１５１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を少なくとも２０個の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントについて、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、参照配列中の合計数（すなわちウィンドウの大きさ）で除算し、結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算する。
【０１５２】
また、またはあるいは、変異体は、ネイティブ遺伝子またはその一部分もしくは相補体に実質的に相同的であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中等度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）とハイブリダイズすることができる。
【０１５３】
適切な「中等度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、終夜でのハイブリダイズ、次いで、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄が含まれる。
【０１５４】
本明細書中で使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いるもの、（２）ハイブリダイゼーション中に、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と共に、４２℃で、ホルムアミド、たとえば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドなどの変性剤を用いるもの、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン、４２℃、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％のホルムアミドでの洗浄、次いで、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものである。当業者には、必要に応じてプローブの長さなどの要因に順応するために、温度、イオン強度などを調整する方法が認識されるであろう。
【０１５５】
当業者には、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が多く存在することが理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性しか保有しない。それにも関わらず、コドン使用頻度の相違が原因で変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内にある。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として変更される、内在性の遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもではないが、変更された構造または機能を有し得る。対立遺伝子は、標準の技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定し得る。
【０１５６】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。
【０１５７】
組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するためには、本明細書中でさらに記述するように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、立ち代って、ベクターを複製および増幅のための適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入し得る。細胞は、外因性ポリヌクレオチドを直接取り込み、エンドサイトーシス、形質移入、Ｆ接合または電気穿孔によって導入することによって形質転換させる。導入された後、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持されるか、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれることができる。そのようにして増幅したポリヌクレオチドは、当分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。
【０１５８】
代替として、ＰＣＲによりＤＮＡ配列の複製が可能となる。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０１５９】
ＲＮＡは、単離したＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡへと転写される際に、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、上記に記載の当業者に周知の方法を用いて、ＲＮＡを単離することができる。
【０１６０】
適切なクローニングベクターは、標準の技法に従って構築し得るか、または当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは使用を意図する宿主細胞に応じて変動し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を保有し得る、および／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえばｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手可能である。
【０１６１】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターが含まれる。ベクター構成成分には、一般に、それだけには限定されないが、シグナル配列、複製起点、１つもしくは複数のマーカー遺伝子、適切な転写性制御要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）のうちの１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、およびストップコドンなどの１つまたは複数の翻訳制御要素も通常は必要である。
【０１６２】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた形質移入、微粒子銃、リポフェクション、および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含めたいくつかの適切な手段のうちのいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、多くの場合、宿主細胞の特長に依存する。
【０１６３】
また、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中に存在する場合は対応する内在性抗体または目的のタンパク質よりも約５倍以上、より好ましくは、１０倍以上、さらにより好ましくは、２０倍以上のレベルでｃＤＮＡを発現する。宿主細胞をＮｏｔｃｈ−１またはＮｏｔｃｈ−１ドメインとの特異的結合についてスクリーニングすることは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって達成する。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０１６４】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容できる担体と一緒に配合した、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（複数可）のうちの１つまたは組合せを含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。そのような組成物には、本開示１つもしくは組合せの（たとえば２つ以上の異なる）抗体、または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性分子が含まれ得る。たとえば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合する、または相補的活性を有する、抗体（または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性抗体）の組合せを含むことができる。
【０１６５】
また、本開示の医薬組成物は、組合せ療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、組合せ療法には、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた、本開示の抗Ｎｏｔｃｈ１抗体が含まれることができる。組合せ療法で使用することができる治療剤の例は、以下の本開示の抗体の使用のセクション中にさらに詳述されている。
【０１６６】
本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」には、生理的に適合性のある任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。典型的には、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射またはインフュージョンによる）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕａｇｅ）、または二重特異性分子は、酸および化合物を失活させ得る他の天然条件の作用から化合物を保護するために、物質でコーティングし得る。
【０１６７】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、中性の形態（双極性イオン形態が含まれる）または正もしくは負荷電の種として存在し得る。一部の事例では、抗体は、対イオンと複合して、薬学的に許容できる塩を形成し得る。したがって、本開示の医薬化合物には、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩が含まれ得る。
【０１６８】
「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物（たとえば抗体）の所望の生物活性を保持しており、かつ望ましくない毒性効果を与えない塩をいう（たとえばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６：１〜１９を参照）。たとえば、用語「薬学的に許容できる塩」には、１つまたは複数の抗体および１つまたは複数の対イオンを含む複合体が含まれ、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０１６９】
そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどの無毒性の無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０１７０】
さらに、薬学的に許容できる無機塩基には金属イオンが含まれる。金属イオンには、それだけには限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理学的に許容できる金属イオンが含まれる。無機塩基に由来する塩には、その通常の原子価のアルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。
【０１７１】
本開示の抗体の薬学的に許容できる酸付加塩は、それだけには限定されないが、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、ショウノウ酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンジゾ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リシン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモン酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、ショウノウスルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸を含めた酸から調製することができる。
【０１７２】
薬学的に許容できる有機塩基には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四級アンモニウム陽イオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コレート、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、およびトロメタモールが含まれる。
【０１７３】
また、本開示の医薬組成物には薬学的に許容できる抗酸化剤も含まれ得る。薬学的に許容できる抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油可溶性抗酸化剤、ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が含まれる。
【０１７４】
本開示の医薬組成物中で用い得る適切な水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。
【０１７５】
また、これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順、上記によって、ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、確実にし得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物内に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射用医薬形態の長期的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらし得る。
【０１７６】
薬学的に許容できる担体には、無菌的な水溶液または分散液ならびに無菌的な注射用液剤または分散液を即時調製するための無菌的な粉末が含まれる。医薬上活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合以外は、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。また、補助的活性化合物も組成物内に組み込むことができる。
【０１７７】
治療的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌的かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則的な構造として配合することができる。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適正の流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１７８】
無菌注射用液剤は、所要量の活性化合物を適切な溶媒中、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、次いで滅菌精密濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記に列挙したものからの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル内に取り込ませることによって調製する。無菌的な注射用液剤を調製するための無菌的な粉末の場合、調製方法には、それだけには限定されないが、以前に滅菌濾過したその溶液からの活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が含まれる。
【０１７９】
担体物質と組み合わせて単一剤形を生じることができる活性成分の量は、処置する対象および具体的な投与様式に応じて変動する。担体物質と組み合わせて単一剤形を生じることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、この量は、１００パーセントのうち、薬学的に許容できる担体と組み合わせて約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲となる。
【０１８０】
最適な所望の応答（たとえば治療反応）を提供するために投薬レジメンを調整する。たとえば、単一のボーラスを投与し得るか、いくつかの分割した用量を経時的に投与し得るか、または治療状況の急迫によって指示されるように用量を比例的に低下もしくは増加させ得る。投与の容易性および投薬の均質性のために、非経口組成物を単位剤形で配合することが特に有利である。本明細書中で使用する単位剤形とは、処置する対象の単位用量として適した物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、所要の医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するための、そのような活性化合物を化合する分野に固有の制限によって指示され、それに直接依存する。
【０１８１】
抗体の投与には、用量は宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇの範囲である。たとえば、用量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇもしくは１０ｍｇ／体重１ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。例示的な処置レジームは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与を必要とする。本開示の抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合部分の投薬レジメンには、たとえば、静脈内投与による１ｍｇ／体重１ｋｇまたは３ｍｇ／体重１ｋｇが含まれ、抗体は、（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後に３カ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重１ｋｇを１回、次いで１ｍｇ／体重１ｋｇを３週間毎の投薬スケジュールのうちの１つを用いて与える。
【０１８２】
一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与するそれぞれの抗体の用量は示した範囲内にある。抗体は、通常、複数回で投与する。単一投薬の間の間隔は、たとえば、週に１回、月に１回、３カ月毎または年に１回とすることができる。また、間隔は、患者中の標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって指示されるように、不規則であることもできる。一部の方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成されるように、用量を調整する。
【０１８３】
代替として、抗体は持続放出配合物として投与することができ、その場合、より低い頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投与の用量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに応じて変動する場合がある。予防的な応用では、比較的低い用量を比較的低い頻度の間隔で長期的に投与する。一部の患者は、その残りの寿命の間、処置を受け続ける。治療的な応用では、比較的短い間隔の比較的高い用量が、疾患の進行が低減または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要な場合がある。それ以降、患者に予防的レジームを投与することができる。
【０１８４】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療反応を達成するために有効な活性成分の量を得るために、変動させ得る。選択される用量レベルは、用いる本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄率、処置の持続期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、重量、状態、全体的な健康および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含めた、様々な薬物動態学要因に依存する。
【０１８５】
本開示の抗Ｎｏｔｃｈ抗体の「治療上有効な用量」は、好ましくは、疾患の症状の重篤度の減少、疾患症状のない期間頻度および持続期間の増加、または疾患の罹患が原因の機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。たとえば、Ｎｏｔｃｈ−１−陽性腫瘍の処置には、「治療上有効な用量」は、非処置の対象と比較して、細胞成長または腫瘍増殖を好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているアッセイによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの阻害などの、化合物の阻害する能力を検査することによって、評価することができる。治療上有効な量の治療的化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、または対象における症状を他の形で改善することができる。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重篤度、および選択した特定の組成物または投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定できるであろう。
【０１８６】
本開示の組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当分野で知られている様々な方法のうちの１つまたは複数を用いて投与することができる。当業者によって理解されるように、経路および／または投与様式は所望の結果に応じて変動する。本開示の抗体またはその抗原結合部分のための投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、たとえば注射または注入によるものが含まれる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを意味し、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【０１８７】
代替として、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、局所、表皮または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの、非経口でない経路を介して投与することができる。
【０１８８】
活性化合物は、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達系を含めた徐放性配合物など、化合物を迅速な放出に対して保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような配合物を調製するための多くの方法が、特許取得されている、または当業者に一般に知られている。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１８９】
本開示の使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、Ｎｏｔｃｈ−１媒介性の障害の診断および処置に関与する、数々のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの診断的および治療的な利用性を有する。たとえば、様々な障害を処置、予防および診断するために、これらの分子を、培養中の細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで、またはヒト対象にたとえばｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。本明細書中で使用する用語「対象」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれることが意図される。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい対象には、Ｎｏｔｃｈ−１活性によって媒介される障害を有するヒト患者が含まれる。この方法は、異常なＮｏｔｃｈ−１発現または活性化に関連する障害を有するヒト患者の処置に特に適している。Ｎｏｔｃｈ−１に対する抗体を別の薬剤と一緒に投与する場合、２つはいずれの順序で、または同時に投与することができる。
【０１９０】
Ｎｏｔｃｈ−１に対する本開示の抗体の特異的結合を考慮して、本開示の抗体は、細胞の表面上のＮｏｔｃｈ−１発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、免疫親和性精製によってＮｏｔｃｈ−１を精製するために使用することができる。
【０１９１】
さらに、本開示の抗体、抗体組成物および方法は、異常細胞成長、たとえば癌を有する対象を処置するために使用することができる。特定の一実施形態では、癌はＴ−ＡＬＬである。別の特定の実施形態では、癌は乳癌である。
【０１９２】
本発明の抗体によって処置し得る他の種類の異常細胞成長には、たとえば、中皮腫、肝胆道（肝管および胆管）、原発性もしくは続発性のＣＮＳ腫瘍、原発性もしくは続発性の脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部もしくは頚部の癌、皮膚もしくは眼内の黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃腸管系（胃、結腸直腸、および十二指腸）、乳癌、子宮癌、輸卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、慢性もしくは急性の白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓もしくは輸尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または前述の癌のうちの１つもしくは複数の組合せが含まれる。
【０１９３】
本開示の抗体組成物（たとえば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性および二重特異性分子ならびに免疫コンジュゲート）またはその抗原結合部分をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する適切な経路は当分野で周知であり、当業者によって選択されることができる。たとえば、抗体組成物は、注射（たとえば、静脈内または皮下）によって投与することができる。使用する分子の適切な用量は、対象の年齢および重量ならびに抗体組成物の濃度および／または配合に依存する。
【０１９４】
既に記載のように、本開示のヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合部分は、１つまたは他の複数の治療剤、たとえば、細胞毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と共に同時投与することができる。抗体は、薬剤と連結させることができるか（免疫複合体として）、または薬剤とは分離して投与することができる。後者の場合（別々の投与）、抗体は、薬剤の前、後、もしくはそれと同時に投与することができるか、または他の既知の治療、たとえば抗癌治療、たとえば放射線と同時投与することができる。そのような治療剤には、とりわけ、それ自体では患者に対して毒性または準毒性なレベルでのみ有効な、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは、４週間に１回の１００ｍｇ／用量として静脈内投与することができ、ａｄｒｉａｍｙｃｉｎは、２１日に１回の６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として静脈内投与する。本開示のヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤との同時投与は、異なる機構を介して作動する２つの抗癌剤を提供し、これにより、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果が得られる。そのような同時投与は、薬物に対する耐性の発生、または、腫瘍細胞の、抗体に対するそれらの反応性を失わせる抗原性の変化が原因の問題を解決することができる。
【０１９５】
キット
また、本開示の抗体組成物（たとえば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多特異性分子、または免疫コンジュゲート）および使用説明書を含むキットも、本開示の範囲内にある。キットは、１つもしくは複数の追加の試薬、たとえば、免疫抑制性試薬、細胞毒性剤もしくは放射性毒性剤、または本開示の１つもしくは複数の追加の抗体もしくはその抗原結合部分（たとえば、第１のヒト抗体とは明確に異なる、Ｎｏｔｃｈ−１抗原中のエピトープと結合する相補的活性を有するヒト抗体）をさらに含有することができる。
【０１９６】
したがって、本開示の抗体組成物で処置した患者に、ヒト抗体の治療効果を増強または増大させる、細胞毒性剤または放射性毒性剤などの別の治療剤をさらに投与することができる（本開示のヒト抗体を投与する前、それと同時に、またはその後）。
【０１９７】
本開示は、さらに限定すると解釈されるべきでない以下の実施例によって、さらに例示される。本出願中で言及するすべての図ならびにすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、明白に本明細書中に参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１９８】
（実施例１）
Ｎｏｔｃｈ１免疫原の作製および発現
Ｎｏｔｃｈ１免疫原発現構築体の作製
免疫原構築体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するための多重鎖形成ＰＣＲ（図１）によって作製した。図１中に例示するように、Ｎｏｔｃｈ１免疫原のｃＤＮＡを、複数重複ＰＣＲによって、Ｎｏｔｃｈ１完全長ｃＤＮＡクローンを鋳型として（ＯｒｉＧｅｎｅ、カタログ番号ＴＣ３０８８８３、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ試薬システムを使用し、製造者のプロトコルに従って（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）合成した。Ｎ末端リーダーペプチド、ＥＧＦ様反復３５〜３６、ＮＲＲ、（Ｌｉｎ Ａ、ＢおよびＣドメインならびにＨＤドメインが含まれる）ならびに細胞内配列の小さな一部分を含有する、組換えＮｏｔｃｈ１免疫原のｃＤＮＡを、Ｎｏｔｃｈ１免疫原をＦｃ配列のＮ末端と融合させたＦｃ融合タンパク質ベクター中にクローニングした。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）と呼ばれるＮｏｔｃｈ１免疫原プラスミドは、図１１中の配列２（配列番号２）に示す免疫原タンパク質をコードしている図１１中の配列１（配列番号１）に示されるｃＤＮＡ挿入物を含有する。
【０１９９】
並行して、膜貫通（ＴＭ）配列（配列４中の最後の２４個のアミノ酸残基）を使用してＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）の細胞内配列（配列２中の最後の４４個のアミノ酸残基）を置き換えた以外はＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）と同じ配列を含有する、図２中に示す同様のプラスミドを構築した。このＰＣＲ増幅したＮｏｔｃｈ１免疫原のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このプラスミドはＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）と呼ぶ。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）の核酸配列およびアミノ酸配列は、図１２中に配列３（配列番号３）および４（配列番号４）として示す。
【０２００】
Ｎｏｔｃｈ１免疫原タンパク質の発現および精製
Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）中で、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および製造者のプロトコルを使用した一過性の形質移入によって発現させ、ウエスタンブロット分析によって確認した。手短に述べると、１×１０７個の細胞を、３０ミリリットル（ｍｌ）の２９３−Ｆ細胞成長培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する組織培養振盪フラスコ中に播種した。０．５ｍｌの馴化培地のアリコートを形質移入後の２日目から７日目まで２４時間毎に取ることによって、分泌されたタンパク質を分析した。２０マイクロリットル（ｕｌ）の馴化培地および２×タンパク質試料ローディング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を合わせ、１００℃で５分間加熱した。試料を電気泳動によって４〜１２％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。タンパク質を、ドライブロット装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲルからブロット膜へと移し、その後、膜を、ＰＢＳＴ（０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中の５％の無脂肪乾燥乳溶液で１時間ブロッキングした。Ｎ１−ＭＲＲＨＤ−ＴＭ（−）／Ｆｃ融合タンパク質の検出は、ヒトγＦｃに特異的な、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、テキサス州Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）とのインキュベーションによって行った。膜をＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で展開させた。タンパク質発現の時間経過の研究により、５〜６日間の培養物の馴化培地が最多の分泌されたＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃ融合タンパク質を含有していたことが示された。したがって、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質の発現を１０リットルの培養体積にスケールアップし、プロテインＧ親和性カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってタンパク質を精製した。
【０２０１】
Ｎｏｔｃｈ１免疫原を発現する細胞系の確立
Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）をマウス細胞系、Ｌ−９２９（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）中に安定に形質移入させ、細胞表面膜固定タンパク質として発現させた。安定な細胞系はＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた形質移入によって確立され、細胞を、個々のコロニーが目に見えるまで約９〜１５日間、１ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）に対して選択し、クローン増殖のために拾った。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）／Ｖ５タンパク質の発現レベルは、それぞれの安定な形質移入クローンから作製したタンパク質抽出物を用いたウエスタンブロットによって評価した。より詳細には、それぞれのクローンの細胞を培養容器から取り出し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ですすぎ、上述のようにウエスタンブロット分析に供した。タンパク質は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって検出した。最も高いレベルのＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）タンパク質を発現する細胞クローンを、免疫化および細胞に基づく抗体結合アッセイの使用のために選択した。
【０２０２】
（実施例２）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂの作製
免疫化およびハイブリドーマクローニング
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＮｏｔｃｈ１免疫原、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）、および長い免疫化プロトコルを用いて免疫化した。第１の免疫化は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）乳濁液中に混合した２０マイクログラム（μｇ）の抗原を用いた皮下（ｓｃ）注射、次いで、それぞれが不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）乳濁液中に混合した２０μｇの抗原を送達する３回の隔週のｓｃ注射によって与えた。４回目の抗原注射の１週間後に血清を採取して、抗体の力価をＥＬＩＳＡによって確認した。高い応答力価を有するマウスを安楽死させ、ハイブリドーマクローニングのために脾臓を外科的に取り出した。
【０２０３】
脾臓細胞の単一の細胞懸濁液は、脾臓を、１００ミクロンのステンレス鋼製スクリーン、その後、細胞濾過器に押し通し、３０ｍｌのＲＰＭＩで２回洗浄することによって調製した。脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）と３対１の比で混合し、５０％のＰＥＧ−１５００を加えて穏やかに攪拌することによって、細胞融合を促進した。細胞の混合物を遠心分離によって沈殿させ、ＲＰＭＩで穏やかに洗浄し、次いで、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞を、２０％のＦＣＳ、標準のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）、２５％の脾臓馴化培地、２ｍＭのグルタミン酸ならびに１００ｕｇ／ｍｌのＰｅｎ−Ｓｔｒｉｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁させ、９６ウェルプレートに分注し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で８〜２０日間培養して、ＨＡＴ耐性ハイブリドーマクローンを確立させた。それぞれのハイブリドーマクローンからの馴化培地をＥＬＩＳＡスクリーニングに供した。
【０２０４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥＬＩＳＡスクリーニング
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、２組で調製したＮｕｎｃ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）を用いて行った。陽性試験プレートは、それぞれウェルにおいて１００ｎｇのＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質で終夜コーティングし、陰性対照プレートは１００ｎｇのヒトＦｃタンパク質でコーティングした。ハイブリドーマクローンからの馴化培地を、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質と結合するその能力についてスクリーニングした。１００マイクロリットルのそれぞれのハイブリドーマ上清をコーティングしたプレートに加え、室温で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＦｃ抗体を加えて、抗原と結合したｍＡｂを検出した。過剰のＨＲＰを、ＰＢＳＴを用いた３回の洗浄によって、それぞれの洗浄に２００μｌ／ウェルで洗い流した。その後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−［３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸］）溶液をＨＲＰ発色のための基質として加えた。反応を停止させ、プレートをプレートリーダーによって４０５ｎｍで走査した。陽性ウェルを、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質でコーティングしたプレートを用いて再度スクリーニングし、ヒトＦｃでコーティングしたプレートを用いて、上述と同じようにカウンタースクリーニングした。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質のみと結合するがヒトＦｃとは結合しないハイブリドーマｍＡｂが真のＮｏｔｃｈ１結合抗体であり、これらを選択して機能的スクリーニングに進んだ。
【０２０５】
（実施例３）
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂの同定および特徴づけ
ルシフェラーゼレポーターアッセイ細胞系の確立
ルシフェラーゼレポーターアッセイを一般的に使用して、様々な設定におけるＮｏｔｃｈ１受容体媒介性シグナル伝達および転写活性を評価した（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３、Ｏｓｉｐｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００８、２７（３７）：５０１９〜５０３２）。リガンド誘導性のＮｏｔｃｈ１活性化およびｍＡｂ阻害をアッセイするために、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を増強させるためのツール細胞系を開発した。細胞内ドメインからなるＮｏｔｃｈ受容体の活性型が核へと転位置され、ＣＳＬ［ＣＢＦ１、Ｓｕ（Ｈ）およびＬＡＧ−１から命名］結合因子１と複合体を形成し、これが遺伝子プロモーター領域中のＣＳＬ結合モチーフと呼ばれるコア配列と結合して、下流の遺伝子転写を活性化させることは、十分に確立されている（Ｂｒａｙ、２００６）。これらの発見に基づいて、Ｎｏｔｃｈ１媒介性ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製した。手短に述べると、Ｔｕｎら（Ｔｕｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９４、２２（６）：９６５〜９７１）によって記載されている８個のＣＳＬ結合モチーフのコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）を、ｐＴＡ−Ｌｕｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）の複数のクローニング部位中に挿入した。ハイグロマイシン選択マーカー（次の段落を参照）をルシフェラーゼ遺伝子の下流に付加した。これにより、ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＣＳＬｕｃが得られた。
【０２０６】
完全長Ｎｏｔｃｈ１発現構築体をＯｒｉＧｅｎｅ（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から入手し、配列決定によってＮＭ＿０１７６１７．２（ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）と同一であると確認された。ＳＶ４０プロモーターを有するハイグロマイシン選択マーカーをｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲ合成し、標準のＰＣＲ結合方法によってｐｃＤＮＡ５／ＲＦＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの成長ホルモン３’ポリＡシグナル伝達配列に接続した。完成したハイグロマイシンマーカーをＮｏｔｃｈ１発現プラスミドのＣｌａ Ｉ部位中に挿入した。このプラスミドをＮｏｔｃｈ１／Ｈｙｇと新たに命名した。Ｎｏｔｃｈ１活性を増強させるために、部位特異的突然変異誘発によってＰＥＤＴドメイン（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３ら）をＮｏｔｃｈ１／Ｈｙｇから欠失させた（Ｇｅｎｅｗｉｚ、ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）。生じたプラスミドをＮｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴと命名した。ヒトＪａｇｇｅｄ１ｃＤＮＡプラスミドをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から入手した。Ｊａｇｇｅｄ１コード領域をＰＣＲ合成し、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に挿入した。
【０２０７】
Ｎｏｔｃｈ１依存性アッセイ細胞系は、ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、Ｎｏｔｃｈ１／ｈｙｇおよびＣＳＬｕｃプラスミドをＵ２−ＯＳ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−９６、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）細胞内に同時形質移入することによって、またはＮｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴおよびＣＳＬｕｃを２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）細胞内に同時形質移入することによって作製した。安定に形質移入された細胞をＤＭＥＭ成長培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の２００〜８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンに対してクローン選択し、細胞クローンを実施例１に記載のようにウエスタンブロット分析によって、および以下のセクションに記載のルシフェラーゼレポーターアッセイによってスクリーニングした。比較的高いレベルのＮｏｔｃｈ１発現（ウエスタンブロットに基づく）およびデルタ様−４（Ｄｌｌ４）誘導性のルシフェラーゼ活性を有する細胞系を、機能的アッセイで使用するために選択した。２つのそのような細胞系の例は、Ｕ２−ＯＳ／Ｎｏｔｃｈ１−ＣＳＬｕｃ（ニックネームＮ１ＣＵ３）および２９３／Ｎｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴ−ＣＳＬｕｃ（ニックネームＮ１ｄＰ−ｃ１６）である。同様の手順によって、ヒトＪａｇｇｅｄ１を安定に発現する細胞系を親細胞系であるＨｅｌａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）から作製した。細胞系はＨｅｌａ／ＪＡＧ１として命名した。
【０２０８】
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ハイブリドーマクローンのルシフェラーゼレポーターアッセイおよび同定
Ｎｏｔｃｈ１阻害性ハイブリドーマクローンを同定するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてＮ１ＣＵ３細胞におけるＤｌｌ４誘導性のＮｏｔｃｈ１活性を評価した。９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５０〜１００ナノグラム（ｎｇ）の組換えＤｌｌ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）／ウェルでコーティングした。Ｎ１ＣＵ３細胞を、５０，０００個の細胞／ウェルで、Ｄｌｌ４またはＢＳＡでコーティングしたプレートに播種し、３０〜５０ｕｌのハイブリドーマクローンからの馴化培地を同時に加え、２４〜４０時間培養した。培養の終了後、すべての培地を除去した後に細胞を１×Ｐａｓｓｉｖｅ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）で直接溶解し、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを用いて製造者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）に従って、およびＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ Ｐｌｕｓ ＬＢ９６Ｖルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツＢａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ）を用いて、ルシフェラーゼレポーター活性をアッセイした。Ｄｌｌ４誘導性のＮｏｔｃｈレポーター活性に対する統計的に有意な阻害を有するハイブリドーマ上清を、タンパク質Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）による、製造者のプロトコルに従った親和性精製に供した。精製したｍＡｂをルシフェラーゼレポーターアッセイによってさらに分析し、Ｎｏｔｃｈ１依存性シグナル伝達に対する阻害機能が再度確認された。
【０２０９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイによる抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂの特徴づけ
Ｎｏｔｃｈ１媒介性シグナル伝達を阻害するｍＡｂのうち、１つのｍＡｂ（Ｎ２４８Ａ）が最も強力な阻害活性を示し、これは、いくつかの異なるルシフェラーゼレポーターアッセイによって詳細に特徴づけられた。図３は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘導するためにＤｌｌ４を培養プレートの表面上にコーティングした際に、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが、Ｄｌｌ４リガンド誘導性のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の阻害において、コンパニオンｍＡｂであるｍＡｂ−Ｃよりもはるかに高い効力を有していたことを示す。２９３／Ｎｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴ−ＣＳＬｕｃ細胞をこのアッセイで使用した。Ｙ軸の数値はルシフェラーゼレポーター活性の読取り値である。
【０２１０】
ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが他のＮｏｔｃｈリガンド誘導性のシグナル伝達を阻害することができるかどうかを評価するために、Ｈｅｌａ／Ｊａｇｇｅｄ１細胞およびＮ１ｄＰ−ｃ１６細胞を同時培養し、上述のルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは実際にＪａｇｇｅｄ１誘導性のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を完全に阻害した（図４）。
【０２１１】
（実施例４）
抗体の結合親和性の決定
Ｎｏｔｃｈ１抗原に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの物理的結合親和性は、研究グレードのセンサーチップ（チップ型：ＣＭ５）を備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器上で、ＨＢＳＰランニング緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ、現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）＋１ｍＭのＣａＣｌ２を用いて測定した。標準のＮ−ヒドロキシスクシンイミド／エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）化学を用いて、タンパク質Ａを飽和レベルでチップ上にアミンカップリングさせた。３つすべてのフローセルにおいて、４０、１３、４ｕｇ／ｍｌで、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）Ｆｃタンパク質（実施例１に記載）をタンパク質Ａによってチップ表面に捕捉させた。抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ Ｎ２４８Ａを３倍系列で希釈し、１分間１００μｌ／分で注入した。解離を２０分間監視した。１００ｍＭのリン酸で２回の３０秒間パルスを用いて、それぞれの滴定の最後の注入の後にチップを再生した。緩衝液サイクルによりデータの二重参照のためのブランクが提供され、その後、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．４．１を用いてこれを単純な結合モデルに大域的に当てはめた。親和性は動力学速度定数の商から推定した（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。データは、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡがＫｏｎ＝５．１９ｅ−５（Ｍｓ）、Ｋｏｆｆ＜１．７ｅ−４（１／ｓ）およびＫＤ＜０．３３ｎＭを有することを示している。密なＫＤは速いＫｏｎおよび非常に遅いＫｏｆｆの両方によって寄与され、これは、本発明者らのアッセイによって解明されたものよりも遅い（５％ルール、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００のマニュアルを参照）。
【０２１２】
（実施例５）
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂ結合エピトープの分析
ヒトＮｏｔｃｈ２とのドメインスワップによるｍＡｂ結合エピトープのマッピング
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂによる作用機構を理解するために、Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂの結合エピトープをドメインスワップおよびＥＬＩＳＡ結合アッセイによって分析した。Ｎｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質を６つのドメイン、すなわち、ＥＧＦ（ＥＧＦ３５〜３６が含まれる）、Ｌｉｎ１２−Ａ（またはＬｉｎ−Ａ）、Ｌｉｎ−Ｂ、Ｌｉｎ−Ｃ、ヘテロ二量体化ドメイン−Ｎ（またはＨＤ−Ｎ）およびＨＤ−Ｃ（図５）に分割した。ドメインのそれぞれを、ＰＣＲ合成によって、一連のキメラＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃ発現構築体において、ヒトＮｏｔｃｈ２に対応するものでスワップした。実施例１に上述したように、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてドメインスワッププラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）中に形質移入させた。３日間培養した後、馴化培地をウエスタンブロット分析およびＮｏｔｃｈ１ｍＡｂによるＥＬＩＳＡ結合アッセイに供した。ウエスタンブロット（方法は実施例１と同様）により、６個のうちの５個のドメインスワップ構築体が良好に発現されたが、Ｌｉｎ−Ｂ／Ｎｏｔｃｈ２のスワップは発現が少なかったことが示された。
【０２１３】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、１００マイクロリットルの上記抗原プラスミドで形質移入した細胞培養物からの馴化培地を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに載せ、プレートを室温で４時間または４℃で終夜インキュベーションした。その後、条件培地をコーティングしたプレートから除去した。一次抗体の結合には、１００マイクロリットルのＰＢＳ中の３００ｎｇのそれぞれのｍＡｂ（表３）をコーティングしたウェルに加えた。ＥＬＩＳＡ手順の残りは、実施例２に記載のものと同じである。ｍＡｂ Ｎ９９ａ、Ｎ３２６ＡおよびＮ４４０Ａは、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａと同じ手順によって作製および単離した、Ｎｏｔｃｈ−１と結合するモノクローナル抗体であった。表３に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａとキメラ抗原との結合は、Ｌｉｎ−ＡまたはＨＤ−Ｃドメインを対応するＮｏｔｃｈ２ドメインでスワップした場合に完全に消滅した。他方で、ＥＧＦ、Ｌｉｎ−ＣまたはＨＤ−Ｃドメインのスワップはその結合に影響を与えなかった。ｍＡｂ Ｎ３２６ＡおよびＮ４４０Ａは、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａとは明確に異なっていた。これら２つのｍＡｂは、その結合活性にＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインを必要とする。Ｎ９９Ａは、その結合にＬｉｎ−ＡおよびＨＤ−Ｃドメインが必要であるという点で、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａとやや似ている。しかし、ＨＤ−ＮドメインのスワップはＮ９９Ａの結合活性も低下させた。これらのデータは、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが少なくとも２つの区別可能な結合エピトープの組を、１つはＬｉｎ−Ａドメイン中、他方はＨＤ−Ｃドメイン中に有するという結論を支持していしていた。Ｌｉｎ−Ｂドメイン中に別のエピトープが存在するかどうかは、別の実験で解明した。同様に、他の３つのすべてのＮｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂは、２つの識別可能な結合エピトープの組を、一方はＨＤ−Ｃドメイン中、他方はＮｏｔｃｈ１Ｎ末端サブユニットのドメイン中に有する。最近公開されたＮｏｔｃｈ１（Ｇｏｒｄｏｎ，ＷＲら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、第１１３巻、４３８１〜４３９０）およびＮｏｔｃｈ２（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）のＮＲＲ領域の結晶構造に基づいて、３つのＬｉｎ１２ドメインはＨＤドメインの周りに巻きついており、ＡＤＡＭプロテアーゼによるランダム切断および活性化を遮断しており、したがって、受容体を不活性またはサイレントな状態に維持する。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは２つの明確に異なるエピトープの組でＮｏｔｃｈ１と結合し、それにより、Ｎｏｔｃｈ１がサイレントコンホメーションに固定され、したがって、受容体がそのリガンドによって活性化されることが妨げられる。
【０２１４】
ほとんどが点突然変異であり、一部が小さな欠失および挿入であるＮｏｔｃｈ１遺伝子突然変異が、Ｔ−ＡＬＬの５０％を超えるもので報告されている（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３、Ｍａｌｅｃｋｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００６、２６（１２）：４６４２〜４６５１）。突然変異は、２つの領域、すなわち、一方は細胞内部分のＣ末端中、他方はＨＤ−Ｎドメイン中にクラスタリングされている。これらの発見は、ＨＤ−ＮドメインスワップはｍＡｂ Ｎ２４８ＡとＮｏｔｃｈ１との結合に影響を与えなかった一方で、他の３つの結合には影響が与えられたことから、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが、Ｔ−ＡＬＬにおいて表３に記載した他の３つのｍＡｂよりも良好な治療的有用性を有するであろうという考えを支持する（表３を参照）。
【０２１５】
【表３】
【０２１６】
Ｎ２４８ＡはヒトＮｏｔｃｈ１と結合するが、マウスＮｏｔｃｈ１とは結合しない
Ｎ２４８Ａ１の結合エピトープを位置決定するために、本発明者らは、ヌクレオチド１〜９９およびヌクレオチド４３２７〜５１６９のマウスＮｏｔｃｈ１ｃＤＮＡコード領域（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００８７１４）を含有するマウスＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ発現プラスミドを作製し、一過性の形質移入およびＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った（方法は実施例１および５の前のセクションに記載）。結果により、Ｎ２４８Ａ１はマウスＮｏｔｃｈ１と結合せず、ヒトＮｏｔｃｈ１のみと結合することが示された（表４）。本発明者らは、ヒトＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ配列（ヌクレオチド１〜１２９および４３３８〜５２０２、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１７６１７）をフレームワークとして使用し、ヒトＬｉｎ−Ａ、Ｌｉｎ−ＢまたはＨＤ−Ｃドメインを対応するマウスドメインで系統的に交換して、ドメインスワップキメラＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ発現構築体をさらに作製した。このヒト／マウスドメインスワップタンパク質をベイトとして使用したＥＬＩＳＡ結合アッセイにより、Ｌｉｎ−Ａドメインをマウス配列に交換した場合にＮ２４８Ａ１とヒトＮｏｔｃｈ１抗原との結合が消滅するが、Ｌｉｎ−ＢまたはＨＤ−Ｃドメインの交換は結合に影響を与えなかったことが実証された。対照的に、他の対照ｍＡｂ、２２Ｆ７は、Ｌｉｎ−Ｂをマウス配列に交換した場合にのみ結合を失う。したがって、Ｎ２４８Ａ１がヒトＮｏｔｃｈ１のみと結合し、マウスとは結合しないかどうかを決定する結合エピトープは、Ｌｉｎ−Ａドメイン中に位置する。
【０２１７】
【表４】
【０２１８】
Ｌｉｎ−Ａドメイン中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープの同定
Ｌｉｎ−Ａドメイン中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープを同定するために、本発明者らは、ヒトおよびマウスのＬｉｎ−Ａドメインの間で異なる２個のアミノ酸を突然変異した、すなわち、１４５７Ｅ／Ａおよび１４６５Ｓ／Ｎ（表５）。ＥＬＩＳＡの結果により、突然変異１４５７Ｅ／Ａは結合に影響を与えなかったが、突然変異１４６５Ｓ／Ｎは結合を消滅させることが示され、マウスＬｉｎ−Ａ中のアミノ酸Ａｓｎ（Ｎ）がＮ２４８Ａ１とマウスＮｏｔｃｈ１との結合の遮断を担っている唯一のアミノ酸残基であることが示された。１４６５Ｓの周辺のいくつかのアミノ酸を、順次アラニンへと突然変異させた（表５）。１４６３Ｖ／Ａ、１４６６Ｌ／Ａまたは１４６７Ｑ／Ａの突然変異もＮ２４８Ａ１結合を消滅させた。しかし、対照ｍＡｂ Ａ２は突然変異１４６３Ｖ／Ａまたは１４６５Ｓ／Ｎによって影響を受けなかった（表５）。これらの実験により、Ｌｉｎ−Ａ中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープが１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑを含むことが実証された。
【０２１９】
【表５】
【０２２０】
ＨＤ−Ｃドメイン中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープの同定
Ｎｏｔｃｈ１配列からのアミノ酸のクラスターをＮｏｔｃｈ２配列へと順次スワップすることによって、一連の５つのサブドメインスワップキメラ抗原を作製した（表６）。ＥＬＩＳＡの結果により、サブドメインスワップ−１はＮ２４８Ａ１結合を有意に低下させた一方で、他の４つのサブドメインスワップ抗原はＮ２４８Ａ１結合に影響を与えないことが示された。他方で、並行対照ｍＡｂ １９Ｈ７は、サブドメインスワップ１、３および５に対して有意な結合親和性の低下を示した（表６）。すべてのサブドメインスワップ抗原の馴化培地中での発現および分泌は、ウエスタンブロット分析によって確認した（方法は上記）。サブドメインスワップ５以外のすべてのサブドメインスワップ抗原は、ヒトＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ（ｈｕＮ１−ＮＲＲＨＤ）タンパク質以上の発現を有する。サブドメインスワップ５は、ウエスタンブロットバンドの強度の比較に基づいてｈｕＮ１−ＮＲＲＨＤの約５０％のレベルで発現された（データ示さず）。これらの実験により、表６中に強調表示するように、ＨＤ−Ｃ中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープには５個のアミノ酸、１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌ（ヒトＮｏｔｃｈ１をコードしているｃＤＮＡ配列、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１７６１７）が含まれることが示された。
【０２２１】
【表６】
【０２２２】
（実施例６）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂは細胞培養物中の癌細胞の成長を阻害する
ｍＡｂ Ｎ２４８Ａによる、ＨＰＢ−ＡＬＬ白血病細胞の成長の阻害およびＮＩＣＤの低下
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞系、ＨＰＢ−ＡＬＬは、幼児期Ｔ−ＡＬＬから誘導され（Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９７８、２１（２）：１６６〜７０）、ＤＳＭＺ（ドイツＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）から入手した。この細胞系は、増強されたガンマセクレターゼ切断の結果、高レベルの、Ｎｏｔｃｈ１の活性型であるＮｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をもたらすＮｏｔｃｈ１突然変異を保有する。成長阻害アッセイには、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を、９６ウェルプレートに、１０，０００個の細胞／ウェルで、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で播種した。連続希釈したｍＡｂ Ｎ２４８ＡまたはＤ１６Ａを最初に加え、細胞を３７℃で７日間培養した。培養の終了後、０．１ｍｇ／ｍｌのリザズリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を細胞に加え、プレートを３７℃で４時間インキュベーションした。蛍光シグナルを、二重フィルターを介して励起＝５６０ｎｍおよび発光＝５９０ｎｍを用いて読み取った。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）においてＳ字形用量応答（変動勾配）を用いて計算した。
【０２２３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＩＣＤ分析には、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を６ウェルプレートに２×１０６個の細胞／ウェルで播種し、１０％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａまたは対照抗体Ｄ１６Ａを、図６中に示す可変濃度で培養物に加えた。細胞を、抗体の存在下、３７℃で２４時間培養した。その後、これらを収集し、冷１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）に溶解した。１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離することによって、タンパク質を細胞溶解液から抽出した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いてタンパク質濃度を決定した。それぞれの試料中のＮＩＣＤのレベルはウエスタンブロット分析によって決定した。
【０２２４】
それぞれのウエスタンブロット分析において、約５０μｇの溶解物をポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）による電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に移し、ウサギ抗ＮＩＣＤ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）およびマウスαアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いた免疫ブロット分析に供した。ＩＲＤｙｅ６８０または８００とコンジュゲートさせた二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州Ｌｉｎｃｏｌｎ）を使用してウエスタンブロットバンドを可視化した。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州Ｌｉｎｃｏｌｎ）を用いて画像を分析した。
【０２２５】
結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞成長の阻害がＮＩＣＤレベルの低下と相関していることが実証された。２４時間の処置で、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡはＮＩＣＤレベルを用量依存的に低下させ、最大の低下は３０μｇ／ｍＬで観察された。７日間の処置の後、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは細胞成長の有意な阻害を引き起こした。細胞成長阻害のＩＣ５０値は約０．７８μｇ／ｍｌまたは約５．２ｎＭである。
【０２２６】
乳癌細胞増殖の阻害
Ｎｏｔｃｈ１の発現が乳癌において異常に増加しており（Ｒｅｅｄｉｊｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、６５（１８）：８５３０〜８５３７、Ｋｌｉｎａｋｉｓら、２００６、Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、２００７、６（４）：４１８〜４２９）、これは低い生存率に関連する（Ｒｅｅｄｉｊｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、６５（１８）：８５３０〜８５３７）ことが十分に文書で示されている。乳腺組織中で活性型のＮｏｔｃｈ１を発現するトランスジェニックマウスでは、ほぼすべてのマウスが１年で乳癌を発生した（Ｈｕら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６、１６８（３）：９７３〜９９０）。Ｎｏｔｃｈ１媒介性シグナル伝達を阻害することで乳癌細胞の増殖が遮断されるという仮説を試験するために、いくつかの乳癌細胞系を、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ Ｎ２４８Ａ抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）または対照マウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）の存在下で培養した。すべての細胞を、１％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２〜３日間培養した。生細胞をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量し、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ Ｐｌｕｓ ＬＢ９６Ｖルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツＢａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ）によって走査した。同じパネルの乳癌細胞において、細胞表面上のＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１の発現をＦＡＣＳによって分析した。結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａによる乳癌細胞の増殖阻害がＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１の発現レベルにおおまかに相関していることが実証された。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは、比較的高いレベルのＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して最も強い阻害を発揮する。興味深いことに、ＢＴ４７５細胞由来のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性細胞系、ＢＴ４７５ＨＲは、親ＢＴ４７５細胞系と比較して増加したＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１の発現を示した。ｍＡｂ Ｎ２４８ＡはＢＴ４７５ＨＲの細胞増殖を阻害した一方で、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは阻害しなかった。データにより、Ｎｏｔｃｈ１の発現が増加した、または現在の薬物であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎに対する耐性を有するｍＡｂ Ｎ２４８Ａの、乳癌の治療処置における潜在的な有用性が示された。
【０２２７】
表７．抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａの腫瘍細胞増殖阻害アッセイ。発現指数は、乳癌細胞を抗Ｎｏｔｃｈ１または抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体で免疫染色した後の、ＦＡＣＳの倍率増加の相乗平均を表す。相対的細胞増殖指数は、薬剤を加えずに並行で培養した対照細胞のパーセンテージを表す。ＢＴ−４７４ＨＲは、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ）から誘導したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性細胞系である。
【０２２８】
【表７】
【０２２９】
Ｎ２４８Ａによる乳癌細胞の増殖阻害がＮｏｔｃｈシグナル伝達の遮断によって媒介されることを確認するために、２つの周知のＮｏｔｃｈの下流の標的遺伝子の発現を定量的逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）によって評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＮ２４８Ａまたは対照ｍＡｂの存在下で２日間培養し、その後、収集し、ＲＮＡｅａｓｙ試薬キットおよびプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが実際にＨＥＳ１およびＨＥＳ４の発現を遮断したことが実証され（図７）、Ｎ２４８Ａによる作用機構が確認された。
【０２３０】
（実施例７）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂはマウス異種移植腫瘍モデルにおいてＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を阻害する
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂによるＴ−ＡＬＬ腫瘍成長の阻害
マウスモデルＴ−ＡＬＬ異種移植モデルを確立するために、免疫力が低下した無胸腺症の雌のヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（平均は２０グラム、６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）から入手し、国際実験動物管理公認協会（ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の指針に従って、特定病原体除去の状態で飼育した。動物には、無菌のげっ歯類飼料および水を自由に与えた。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、承認された施設の実験動物の飼育および使用のプロトコルの下で実施した。
【０２３１】
ＨＢＰ−ＡＬＬ細胞は、宿主マウス中に移植する前に新鮮な培養物から収集し、１回洗浄し、無菌の無血清培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液を適切な密度に調整し、腫瘍取り込みを促進するために５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を添加した。２００μＬ中の合計５〜１０×１０６個の細胞をマウスの後側腹部の領域内に皮下移植し、指定した大きさまで成長させた後、それぞれの実験のために抗体を投与した。
【０２３２】
抗腫瘍有効性研究には、１５０〜３００ｍｍ３の大きさのＨＰＢ−Ａｌｌ腫瘍を保有する動物をランダム化し、Ｎ２４８Ａをそれぞれ１ｍｇ、３ｍｇおよび１０ｍｇ／キログラム（ｋｇ）で投与されるか、または対照抗体Ｄ１６Ａを５ｍｇ／ｋｇで投与される、４つの群に分けた。ｍＡｂを週に１回、２週間の間皮下注射した。動物の体重および腫瘍の測定値を２〜３日毎に得た。腫瘍体積（ｍｍ３）は、ノギスで測定し、式：長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．４を用いて計算した。研究の最終日における薬物で処置したおよびビヒクルで処置したマウスの腫瘍体積を使用して、パーセント（％）阻害値を１００−｛１−［（処置最終日−処置１日目）／（対照最終日−対照１日目）］｝として計算した。すべての腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）実験において、８〜１０匹のマウス／用量群を使用した。スチューデントｔ検定を使用してＰを決定した。
【０２３３】
図８中に示すように、Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａは、このモデルにおいて、１１日間の処置、すなわち２回の週に１回の用量の後に、強力な抗腫瘍活性を実証した。１０ｍｇ／ｋｇ群対対照ｍＡｂ群における平均腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は７７％を超えており、これは統計的観点から非常に有意である（Ｐ＜０．０１）。ＴＧＩは粗く用量依存性であったが、例外として、２つのより低い用量群、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇは、区別するには近接しすぎていた。この観察の正確な原因は不明確であるが、このモデルの腫瘍の大きさの変動性が高いことが原因である可能性が高い。Ｎ２４８Ａは、ヒトＮｏｔｃｈ１に特異的な阻害剤として、どの処置群においても有意な重量損失、罹患率または死亡率を引き起こさずに、マウスにおいて良好に耐容された。
【０２３４】
マウスにおけるＮｏｔｃｈ１ｍＡｂの薬物動態学および薬力学（ＰＫ／ＰＤ）
ＰＫ／ＰＤ研究には、３００〜８００ｍｍ３の範囲の大きさの腫瘍を保有するマウスに、単一用量のＮ２４８Ａを５ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。Ｎ２４８Ａを投与した後、６、１６時間、および１、２、３、５日間の時点でマウスを安楽死させた。シリンジを用いて血液試料を左心室から採取し、ヘパリン硫酸でプライミングしたチューブに移した。その一方で、腫瘍を切除によって取り出し、スナップ凍結し、冷１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）中でホモジナイズした。タンパク質を腫瘍溶解物から抽出し、それぞれの腫瘍試料中のＮＩＣＤのレベルを、上述のウエスタンブロット分析を用いて決定した。血液試料を遠心分離に供して血清を血液細胞から分離した。Ｎ２４８Ａの血清レベルを、実施例２に記載のようにＥＬＩＳＡ方法によって評価した。最初に、ＥＬＩＳＡプレートを、Ｎｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃ抗原を捕捉するヒトＦｃに特異的なｍＡｂでコーティングした。立ち代って、Ｎｏｔｃｈ１抗原は血清中のＮｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａと結合する。
【０２３５】
ＰＫ曲線により、Ｎ２４８Ａ ｍＡｂはマウス血清中で注射の２４時間後に最大濃度（約２３５ｎＭ）に達成したことが示された。推定される半減期は約４．５日間である（図９）。Ｎｏｔｃｈ１活性化の直接マーカー（すなわちＮＩＣＤ）の評価により、Ｎ２４８Ａで処置したマウスから収集した腫瘍試料が強力なＮＩＣＤの低下を有しており、これは投薬の５日後まで持続したことが示された（図１０）。対照的に、対照ｍＡｂ、Ｄ１６ＡはＮＩＣＤレベルを低下させなかった（データ示さず）。５ｍｇ／ｋｇのＮ２４８ＡのＮＩＣＤの最大阻害は約８０％であった。
【０２３６】
（実施例８）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａのクローニングおよび配列
ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの可変領域の配列を決定した。抗体ＩｇＧサブタイプを、Ｉｓｏｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を用いて最初に評価した。結果により、Ｎ２４８ＡがＩｇＧ１重鎖およびラムダ軽鎖を有することが示された。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａのクローニングおよび配列決定には、１×１０６個のハイブリドーマ細胞を収集し、溶解して、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ試薬キットおよび製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を用いて全細胞性ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ鋳型上で合成した。軽鎖および重鎖の可変領域のｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、第１鎖ｃＤＮＡから、マウスラムダ鎖コード配列の５’末端に相補的な縮重順方向プライマーおよび可変領域の３’末端に隣接する定常領域に一致する逆方向プライマーを用いて、またはマウスＩｇＧ１重鎖コード配列の５’末端に相補的な縮重順方向プライマーおよび対応するＩｇＧ１定常領域逆方向プライマーを用いて、増幅した。ＰＣＲサイクリング条件は、９６℃で１分間を１サイクル、次いで、９５℃で２０秒間、５０℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間を４０サイクルであった。生じたＰＣＲ産物をｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、従来の方法によって配列決定、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅソフトウェア（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分析した。クローニングした抗体の配列は、質量分析によって決定される、精製したハイブリドーマに由来する抗体から得られたＮ末端配列との直接比較によって確認した（カリフォルニア大学Ｄａｖｉｓ、分子構造学施設（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ））。コンパイルした配列の結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａ重鎖の可変領域は１２１個のアミノ酸残基を含有し、軽鎖は１０９個のアミノ酸残基を含有することが実証された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いたＮ２４８Ａ ｍＡｂのＶＨ配列およびＶＬ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の描写がもたらされた。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、図１５中に配列１５〜２０として示す（配列番号１５〜２０）。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、図１４中に配列９〜１４として示す（配列番号９〜１４）。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、図１３中に配列５〜８として示す（配列番号５〜８）。
【受託番号】
【０２３７】
ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２
ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１
ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６
ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８
ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２
ＡＴＣＣ ＢＴ−４７４
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が全体で本明細書中に参照により組み込まれる、２００９年６月１８日に出願の米国仮特許出願第６１／２１８，１９３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、Ｎｏｔｃｈ−１の活性と拮抗する抗体、そのような抗体を生成する方法、そのような抗体をアッセイする方法、および癌の処置においてそのような抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は膜貫通受容体タンパク質である。哺乳動物ではそのようなｎｏｔｃｈ受容体が４つ存在する。受容体成熟中、哺乳動物ｎｏｔｃｈ受容体の細胞外ドメインはフューリン様(furin-like)プロテアーゼによってＳ１部位で切断されて、ヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメインによって一緒に保たれる細胞外サブユニットおよび膜貫通サブユニットが得られる。細胞外サブユニットと会合しているＨＤドメインの部分はＨＤ−Ｎと呼ばれ、ＨＤの他の部分である膜貫通サブユニットの細胞外部分は、ＨＤ−Ｃと呼ばれる。細胞外サブユニットは、１つの大きな表皮成長因子（ＥＧＦ）様反復領域および３つのＬｉｎ１２反復を含有する。ＥＧＦ反復領域のリガンド結合は、ＨＤ−Ｃドメイン内のＳ２部位でのＡＤＡＭ型メタロプロテアーゼによるタンパク質分解による切断を誘導し、これは、続く部位Ｓ３でのγ−セクレターゼによる切断を誘発し、ｎｏｔｃｈの細胞内部分を膜から放出させて、これが核内に移行して遺伝子転写を調節することを可能にする。（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。
【０００４】
リガンドに誘導される活性化の前、ｎｏｔｃｈは、３つのＬｉｎ１２反復およびＨＤドメインからなる保存的な負の調節領域（ＮＲＲ）によって休止メタロプロテアーゼ耐性コンフォメーションに維持されている。（Ｖａｒｄａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、４１：７０６１〜７０６７、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００４、２４：９２６５〜９２７３、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。また、ｎｏｔｃｈタンパク質のＮＲＲは、Ｓ１部位でのタンパク質分解的切断後にＬｉｎ１２反復およびＮ末端のＨＤドメイン（ＨＤ−Ｎ）のみからなると定義される場合もある。（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３。）ＮＲＲドメインは、ｎｏｔｃｈ経路のリガンド非依存性タンパク質分解を防止する。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ経路は、ハエおよび脊椎動物における神経発生に影響を与えるものを含めた、多様な発生的および生理的なプロセス中に機能する。一般に、ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、側方抑制、系統決定、および細胞群間の境界の確立に関与している。（Ｂｒａｙ，Ｓ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００６、６７８〜６８８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ｎｏｔｃｈ活性は、癌を含めた様々なヒト疾患にも関連している。たとえば、ｎｏｔｃｈ１の突然変異は、５０％を超えるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病で検出された。（Ｒａｄｔｋｅ，Ｆ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｃａｎｃｅｒ、２００３、７５６〜７６７）。癌の処置に使用するための、ｎｏｔｃｈ−１シグナル伝達経路を調節する治療剤の同定が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ−１と結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、少なくとも第１のエピトープおよび第２のエピトープと結合し、第１のエピトープがＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎ−Ａドメイン内にあり、第２のエピトープがＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメイン内にある、抗体または抗原結合部分を提供する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ−１はヒトＮｏｔｃｈ−１である。
【０００８】
本実施形態の一態様では、第１のエピトープが主要エピトープである。好ましくは、第１のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、６０％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらにより好ましくは９０％を超える損失をもたらす。
【０００９】
別の態様では、第２のエピトープが主要エピトープである。好ましくは、第２のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、６０％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらにより好ましくは９０％を超える損失をもたらす。
【００１０】
別の態様では、第１のエピトープおよび第２のエピトープの両方が主要エピトープである。好ましくは、第１のエピトープおよび第２のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、６０％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらにより好ましくは９０％を超える損失をもたらす。
【００１１】
本実施形態の別の態様では、Ｎｏｔｃｈ−１はヒトＮｏｔｃｈ−１である。本実施形態の別の態様では、Ｎｏｔｃｈ−１はマウスＮｏｔｃｈ−１である。
【００１２】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、さらに１〜４個のエピトープと結合し、前記さらなるエピトープのそれぞれは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎ−ＡドメインまたはＨＤ−Ｃドメインのいずれか内にある。
【００１３】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分が結合する主要エピトープは第１のエピトープおよび第２のエピトープのみである。より詳細には、第１のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎＡドメインの１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑから選択される１〜４個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである。好ましくは、第１のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎＡドメインの１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑから選択される４個のアミノ酸残基からなる主要エピトープである。また、より詳細には、第２のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメインの１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌから選択される１〜５個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである。好ましくは、第２のエピトープは、ヒトＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメインの１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌから選択される１〜５個のアミノ酸残基からなる主要エピトープである。さらにより詳細には、第１のエピトープまたは第２のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換は、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する抗体または抗原結合部分の結合親和性の、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、または９５％を超える損失をもたらす。
【００１４】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、ヒト化、ヒト、またはキメラである。好ましくは、抗体または抗原結合部分は、ヒト化抗体またはその抗原結合部分である。より好ましくは、抗体または抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。
【００１５】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、マウス抗体またはその抗原結合部分である。
【００１６】
本実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、１×１０−５Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する。好ましくは、抗体または抗原結合部分は、１×１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下、または１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９に示すアミノ酸配列、または配列番号１９の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０に示すアミノ酸配列、または配列番号２０の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を有する、重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１８】
本実施形態の一態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１２個の可能なアミノ酸残基の改変（本実施形態中で上述のとおり）のうち、６個までの改変を除いて、改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。好ましくは、５個までの改変を除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、４個までの改変を除いて、３個までの改変を除いて、２個までの改変を除いて、または１個の改変を除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。さらにより好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸残基の改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。
【００１９】
本実施形態の別の態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はいずれも改変されていない。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）配列番号１２に示すアミノ酸配列、または配列番号１２の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されている、その変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２１】
本実施形態の一態様では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１２個の可能なアミノ酸残基の改変（本実施形態中で上述）のうち、改変のうちの６個までを除いて、改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。好ましくは、５個までの改変を除いて、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、４個までの改変を除いて、３個までの改変を除いて、２個までの改変を除いて、または１個の改変を除いて、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。さらにより好ましくは、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。
【００２２】
本実施形態の別の態様では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はいずれも改変されていない。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）配列番号１８、または配列番号１８の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９、または配列番号１９の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号２０、または配列番号２０の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１２、または配列番号１２の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１３、または配列番号１３の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）配列番号１４、または配列番号１４の１〜４個の残基が改変されている、好ましくは３個の残基のみが改変されている、より好ましくは２個の残基のみが改変されている、さらにより好ましくは１個の残基のみが改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２４】
本実施形態の一態様では、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の２４個の可能なアミノ酸残基の改変（本実施形態中で上述）のうち、改変のうちの１２個までを除いて、改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。好ましくは、改変のうちの１１個までを除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、１０個までの改変を除いて、９個までの改変を除いて、８個までの改変を除いて、７個までの改変を除いて、６個までの改変を除いて、５個までの改変を除いて、４個までの改変を除いて、３個までの改変を除いて、２個までの改変を除いて、または１個の改変を除いて、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。さらにより好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の前記改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。
【００２５】
本実施形態の別の態様では、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲはいずれも改変されていない。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ−１との結合について、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体と交差競合または競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ−１との結合について、
（ｉ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲのそれぞれの１〜４個のアミノ残基が改変されていてもよい抗体と交差競合または競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲの改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である。より好ましくは、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲはいずれも改変されていない。
【００２８】
ＣＤＲ領域の決定は、十分に当分野の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組合せであってもよいことが理解される（「組み合わせたＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔ ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。言い換えれば、複数のＣＤＲを用いる実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組合せＣＤＲ、またはその組合せのうちのいずれかであり得る。
【００２９】
実施形態の一態様では、抗体はヒト化抗体である。実施形態の別の態様では、抗体は完全ヒト抗体である。実施形態の別の態様では、抗体はキメラ抗体である。
【００３０】
実施形態の別の態様では、抗体または抗原結合部分は、１×１０−５Ｍ未満、好ましくは１×１０−６Ｍ未満、好ましくは５×１０−７Ｍ未満、好ましくは２×１０−７Ｍ未満、好ましくは１×１０−７Ｍ未満、またはさらにより好ましくは１×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する。
【００３１】
実施形態の別の態様では、抗体はマウス抗体である。本実施形態の別の態様では、抗体は、ヒト化、ヒト、またはキメラである。好ましくは、抗体はヒト化されている。より好ましくは、抗体は完全ヒト抗体である。
【００３２】
本実施形態の別の態様では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト完全長抗体である。本実施形態の別の態様では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト化抗体である。さらに別の実施形態では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のキメラ抗体である。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分のうちのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分のうちのいずれかを組換えにより産生する細胞系を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分のうちの任意のものの重鎖または軽鎖のいずれかをコードしているオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、対象に、治療上有効な量の本発明の抗体もしくは抗原結合部分、またはその医薬組成物を投与するステップを含む、癌を処置する方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、癌の処置に使用するための、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分を提供する。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、癌を処置する医薬品を調製するための、本明細書中に開示する抗体または抗原結合部分の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１に記載する、ヒトＮｏｔｃｈ１免疫原プラスミドＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）のｃＤＮＡのＰＣＲ合成を例示する図である。
【図２】やはり実施例１に記載する、別のヒトＮｏｔｃｈ１免疫原プラスミドＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）のｃＤＮＡのＰＣＲ合成を例示する図である。
【図３】実施例３に示す、２つのモノクローナル抗体：ｍＡｂ Ｎ２４８ＡおよびｍＡｂ−ＣのＮｏｔｃｈ−１依存性ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を例示する図である。
【図４】ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡがＪａｇｇｅｄ−１誘導性Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を阻害することが示されることを例示する図である。Ｈｅｌａ／Ｊａｇｇｅｄ１細胞およびＮ１ｄＰ−ｃ１６細胞をルシフェラーゼレポーターアッセイのために同時培養した。ＭＩｇＧは対照マウス抗体である。Ｙ軸の数値はルシフェラーゼレポーター活性の読取り値である。
【図５】ヒトＮｏｔｃｈ１とヒトＮｏｔｃｈ２との間のＥＧＦ、Ｌｉｎ−Ａ、Ｌｉｎ−Ｂ、Ｌｉｎ−Ｃ、ＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインの配列アラインメントを示す図である。
【図６Ａ】ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞においてＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ１細胞内ドメイン）のレベルがｍＡｂ Ｎ２４８Ａによって低下されたことを例示する、ウエスタンブロット画像である。
【図６Ｂ】ＨＰＢ−Ａｌｌ細胞の成長がｍＡｂ Ｎ２４８Ａによって阻害されることを例示する図である。
【図７】ｍＡｂ Ｎ２４８ＡがそれぞれＨｅｓ１ｍＲＮＡ（Ａ）およびＨｅｓ４ｍＲＮＡ（Ｂ）の発現を遮断することを例示する図である。
【図８】ｍＡｂ Ｎ２４８ＡによるＨＰＢ−ＡＬＬ異種移植腫瘍の成長阻害を例示する図である。腫瘍が１５０〜３００ｍｍ３まで成長した後、図に示したようにマウスにｍＡｂを投薬した。それぞれの群は、ランダム化された腫瘍の大きさを有する１０匹のマウスを含有する。
【図９】マウスにおける５ｍｇ／ｋｇの単一用量注射後の、血漿ｍＡｂ Ｎ２４８Ａ濃度の変化を例示する図である。それぞれのデータ点は３匹のマウスに基づいて計算した。Ｔ１／２は、マウス血清中でのＮ２４８Ａの半減期である。
【図１０】マウスにおける５ｍｇ／ｋｇの単一用量注射後の、ＨＢＰ−ＡＬＬ異種移植腫瘍におけるＮＩＣＤの阻害を例示する図である。対照抗体Ｄ１６Ａで処置した腫瘍のウエスタンブロットバンドを１００％の強度として設定し、これは０％の阻害に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、高い親和性でＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体ならびにヒト／マウスのキメラ抗体に関する。本開示は、単離された抗体、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む免疫コンジュゲートおよび二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫コンジュゲート（ｉｍｍｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。また、本開示は、Ｎｏｔｃｈ−１の活性化を阻害するため、および異常細胞成長（たとえば癌）などのＮｏｔｃｈ−１の過剰活性化または過剰発現に関連する疾患を処置するため等の、抗体を使用する方法にも関する。したがって、本開示はまた、癌などの様々な種類の異常細胞成長を処置するための、抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合部分を使用する方法も提供する。
【００４１】
定義。
用語「Ｎｏｔｃｈ−１」または「Ｎｏｔｃｈ１」とは、互換性があるように使用され、ヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。たとえば、ネイティブヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質は、リーダーペプチド、大きな表皮成長因子（ＥＧＦ）様反復領域、３つのＬｉｎ１２反復、Ｎ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｎ）、Ｃ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｃ）、膜貫通（ＴＭ）配列および細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）から構成される。完全長ヒトＮｏｔｃｈ−１のＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１７６１７．２である。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「Ｎｏｔｃｈ−１負の調節領域」または「Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲ」とは、別段に示さない限りは、３つのＬｉｎ１２ドメイン、およびＮｏｔｃｈ−１の３つのＬｉｎ１２ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するアミノ酸配列または複数の配列からなる、Ｎｏｔｃｈ−１の任意のネイティブまたは合成のポリペプチド領域をいう。一実施形態では、「Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲ」には、３つのＬｉｎ１２ドメインならびに２つのヘテロ二量体化ドメインＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃが含まれ、Ｎｏｔｃｈ−１のＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインは、共有結合しており、未だフューリン様プロテアーゼによって切断されていない（Ｓ１切断前）。別の実施形態では、「Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲ」には、３つのＬｉｎ１２ドメインならびに２つのヘテロ二量体化ドメインＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃが含まれ、ＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインは非共有的に結合している（Ｓ１切断後）。本実施形態の一態様では、ＨＤ−Ｃドメイン内のＳ２部位は、未だＡＤＡＭ型メタロプロテアーゼによって切断されていない。本実施形態の別の特定の態様では、ＨＤ−Ｃドメイン内のＳ２部位は、ＡＤＡＭ型メタロプロテアーゼによって切断されつつある、または既に切断されている。（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。
【００４３】
用語「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫性もしくは病理学的な炎症の場合は、正常なヒト細胞もしくは組織の、選択的な損傷、破壊、または人体からの排除をもたらす、たとえば、上記細胞または肝臓によって産生されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体が含まれる）の作用をいう。
【００４４】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係性をいう。本明細書中で使用する語句「細胞表面受容体」には、たとえば、シグナルを受信し、細胞の原形質膜を横切ってそのようなシグナルを伝達することができる、分子および分子の複合体が含まれる。本開示の「細胞表面受容体」の一例はＮｏｔｃｈ−１受容体である。
【００４５】
本明細書中で言及する用語「抗体」には、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその単鎖が含まれる。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）鎖および２本の軽鎖（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分をいう。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分することができる。ＣＤＲ領域は、どちらも当業者に周知のＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａの付番方式を用いて決定することができる。たとえば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）を参照されたい。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１構成成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
【００４６】
本明細書中で使用する用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）とは、抗原（たとえばＮｏｔｃｈ−１）と特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つまたは複数の断片をいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われることができることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、これらが、ＶＬおよびＶＨ領域が対合した一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、結合させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、たとえば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３を参照）。そのような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を含めた任意の適切な技法を用いて得られる場合があり、断片は、インタクトな抗体と同じように、有用性についてスクリーニングし得る。
【００４７】
本明細書中で使用する「単離された抗体」とは、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことを意図する（たとえば、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体は、Ｎｏｔｃｈ−１以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、Ｎｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＮｏｔｃｈ−１分子などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４９】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体をいうことを意図する。さらなるフレームワーク領域の改変がヒトフレームワーク配列内でなされてもよい。
【００５０】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体をいうことを意図する。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」には、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれることを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合は、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体またはその抗原結合部分には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入された突然変異）が含まれ得る。しかし、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体が含まれることを意図しない。
【００５２】
用語「ヒトモノクローナル抗体」または「完全ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域がどちらもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合させた、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞が含まれる、ハイブリドーマによって産生される。
【００５３】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の任意の改変された形態、たとえば、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートをいう。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「組換えヒト抗体」には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック動物もしくは染色体導入動物（たとえばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（以下に詳述）から単離された抗体、（ｂ）たとえばトランスフェクトーマから、ヒト抗体を発現するように形質転換させた宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離したすべてのヒト抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。特定の実施形態では、しかし、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合はｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する配列である一方で、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないものである場合がある。
【００５５】
抗体に関して本明細書中で使用する用語「競合する」とは、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分との結合について競合する場合をいい、第１の抗体とその同族エピトープとの結合は、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下において検出可能に減少している。第２の抗体とそのエピトープとの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少しているという代替は、可能であるが、必ずしもそうでなくてもよい。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体とそのエピトープとの結合を、その第２の抗体が第１の抗体とその各自のエピトープとの結合を阻害することなしに、阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、他の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ、より高い、またはより低い度合であるかに関わらず検出可能に阻害する場合は、抗体は、その各自のエピトープ（複数可）の結合について互いに「交差競合する」と言われる。たとえば、交差競合抗体は、本明細書中に開示した抗体が結合するエピトープ、またはエピトープの一部分と結合することができる。競合および交差競合抗体のどちらの使用も本開示によって包含されている。そのような競合または交差競合が起こる機構に関わらず（たとえば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその一部分との結合など）、当業者には、本明細書中に提供する教示に基づいて、そのような競合および／または交差競合抗体が包含されており、本明細書中に開示する方法に有用であり得ることを理解されよう。
【００５６】
本明細書中で使用する「主要エピトープ」とは、エピトープのアミノ酸残基のうちの任意の１つをアラニンまたは非保存的置換によって置き換えた場合に、そのエピトープが属する抗原に対する抗体の結合親和性が５０％を超えて減少する、エピトープをいう。
【００５７】
本明細書中で使用する「アイソタイプ」または「クラス」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（たとえば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）をいう。抗体の定常ドメインは抗原との結合に関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、所定のヒト抗体または免疫グロブリンを５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。様々な免疫グロブリンクラスの構造および三次元立体配置は周知である。様々なヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが、補体を活性化させることが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいてＡＤＣＣを媒介することが知られている。
【００５８】
本明細書中で使用する「サブクラス」とは、重鎖定常領域遺伝子のアイソタイプ内のさらなる特定、たとえば、ＩｇＧアイソタイプ内のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスなどをいう。
【００５９】
本明細書中で使用する用語「化合物」または「医薬化合物」には、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート、および二重特異性分子が含まれる。
【００６０】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」とは、本明細書中で用語「抗原と特異的に結合する抗体」と互換性があるように使用される。
【００６１】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明するために使用する。たとえば、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲであってもよい。さらに、ＦｃＲはＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであることができ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体が含まれ、これには、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：２０３〜２３４（１９９７）を参照）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４（１９９４）、ならびにｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１（１９９５）に総説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲが、本明細書中で用語「ＦｃＲ」によって包含される。また、この用語には、母系ＩｇＧを胎児に移行することを司っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９（１９９４））。
【００６２】
本明細書中で使用する「ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する」抗体とは、１×１０−５Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する抗体をいうことを意図する。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｎ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のｏｎ速度、すなわち会合速度をいうことを意図し、他方で、本明細書中で使用する用語「ｋｏｆｆ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のオフ速度、すなわち解離速度をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、ｋｏｆｆ対ｋｏｎの比（すなわちｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から得られる平衡解離定数をいうことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する一方法は、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いた表面プラズモン共鳴を用いることによるものである。
【００６４】
本明細書中で使用する用語、抗体に対する「高い親和性」とは、１×１０−６Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「対象」には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
【００６６】
ヒトＮｏｔｃｈ−１受容体
ヒトＮｏｔｃｈ１ｃＤＮＡは、リーダーペプチド、３６個のＥＧＦ様反復、負の調節領域（ＮＲＲ）、膜貫通（ＴＭ）配列および細胞内ドメインからなる２５５６個のアミノ酸残基のタンパク質をコードしている。（Ｖａｒｄａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３、４１：７０６１〜７０６７、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００４、２４：９２６５〜９２７３、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）。Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲは、アミノ酸残基１４４７から始まり、１７３４で終わる。Ｎｏｔｃｈ−１ＮＲＲは、ＬＮＲ−Ａ（Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１４４７〜１４８３）、ＬＮＲ−Ｂ（Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１４８４〜１５２５）、ＬＮＲ−Ｃ（Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１５２６〜１５６５）、Ｎ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｎ、Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１５６６〜１６６５）およびＣ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−Ｃ、Ｎｏｔｃｈ−１アミノ酸残基１６６６〜１７３４）からなる。
【００６７】
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特長または特性によって特徴づけられる。たとえば、抗体は、１×１０−５Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性、たとえば１×１０−６Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下のＫＤ、さらにより好ましくは１×１０−８Ｍ以下のＫＤで、Ｎｏｔｃｈ−１と結合する。
【００６８】
Ｎｏｔｃｈ−１に対する抗体の結合能力を評価するためのアッセイには、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析が含まれる。また、抗体の結合動力学（たとえば結合親和性）も、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によってなど、当分野で知られているアッセイによって評価することができる。
【００６９】
モノクローナル抗体ｍＡｂ Ｎ２４８Ａ。
本開示の１つの例示的な抗体は、実施例１〜３および８に記載のように作製、単離、試験および構造的に特徴づけた、マウスモノクローナル抗体Ｎ２４８Ａである。表１は、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの様々な領域のアミノ酸配列および本明細書中に開示する他の配列を記載している。
【００７０】
【表１−１】
【００７１】
【表１−２】
【００７２】
【表１−３】
【００７３】
【表１−４】
【００７４】
【表１−５】
【００７５】
実施例４に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは０．３３×１０−６Ｍ未満のＫＤを有する。
【００７６】
実施例５に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが少なくとも２つの区別可能なＮｏｔｃｈ−１エピトープと結合することが示され、一方のエピトープはＬｉｎ−Ａドメイン内にあり、他方のエピトープはＨＤ−Ｃドメイン内にある。
【００７７】
実施例６に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは、細胞培養物においてＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）および乳癌細胞の成長をどちらも阻害する。
【００７８】
実施例７に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＴ細胞リンパ芽球性白血病も阻害する。
【００７９】
Ｎｏｔｃｈ−１Ｌｉｎ−ＡドメインおよびＮｏｔｃｈ−１ＨＤ−Ｃドメイン中の少なくとも２つの区別されたエピトープと結合する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
高い親和性でＮｏｔｃｈ−１Ｌｉｎ−ＡおよびＨＤ−Ｃドメインと結合する抗体はＮｏｔｃｈ−１シグナル伝達を低下させ、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで生物活性を実証して、癌細胞の成長、特にＴ−ＡＬＬ癌細胞の成長を阻害し得ることが、本発明の企図内にある。そのような抗体は、当業者に知られている一般的な方法に従って生成し得る。一実施形態では、そのような抗体は、実施例１および２に示すように、マウスをＮｏｔｃｈ−１ＬｉｎＡドメインおよびＮｏｔｃｈ−１ＨＤ−Ｃドメインを含む免疫原で免疫化し、次いで、実施例２に示すように、そのようにして作製された抗体のハイブリドーマクローニング、およびＥＬＩＳＡアッセイによるクローニングした抗体のアッセイを行うことによって、生成することができる。ＥＬＩＳＡアッセイに従って選択された抗体のＮｏｔｃｈ−１結合親和性は、実施例４に示すように、表面プラズマ共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器で測定することができる。
【００８０】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、Ｎｏｔｃｈ−１ＬｉｎＡドメインおよびＮｏｔｃｈ−１ＨＤ−Ｃドメインと結合する抗体であって、上記段落に記載のもの以外の、当分野で知られている任意の他の方法によって生成することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、本明細書中にさらに記載するように、一般に、抗体の刺激および産生の確立された従来の技術に沿うものである。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般的な技法は、当分野で知られているおよび／または本明細書中に記載されている。
【００８１】
ハイブリドーマ技術によって作製した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれからの抗体産生細胞を、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞系を生じるための基礎として役割を果たすように操作できることが、本発明の企図内にある。典型的には、宿主動物に、本明細書中に記載のものを含めた一定量の免疫原を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内で接種する。
【００８２】
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１（１９８２）によって改変されたものを用いて調製することができる。それだけには限定されないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏからのものを含めた入手可能な骨髄腫系を、ハイブリダイゼーションに使用し得る。一般に、この技法は、ポリエチレングリコールなどのフソゲンを用いて、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞とリンパ球細胞とを融合させることを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、ハイブリダイズしていない親細胞を排除するために、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的成長培地中で成長させる。血清を添加したまたは添加していない、本明細書中に記載する培地のうちのいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用できる。細胞融合技法の別の代替方法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して対象発明のＮｏｔｃｈ−１モノクローナル抗体を生成することができる。所望する場合はハイブリドーマを拡大およびサブクローニングし、従来の免疫アッセイ手順（たとえば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって上清を抗免疫原活性についてアッセイする。
【００８３】
抗体源として使用し得るハイブリドーマには、Ｎｏｔｃｈ−１に特異的なモノクローナル抗体またはその一部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞が包含される。
【００８４】
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで既知の手順を用いて成長させ得る。所望する場合は、モノクローナル抗体は、培養培地または体液から、硫安塩析、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって単離し得る。望ましくない活性が存在する場合は、これは、たとえば、固相に付着させた免疫原から作製された吸着剤上に調製物を流し、所望の抗体を免疫原から溶出または放出させることによって、除去することができる。宿主動物を、ヒトＮｏｔｃｈ−１、または、二官能性もしくは誘導化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である］を用いて、免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤とコンジュゲートさせた標的アミノ酸配列を含有する断片を用いて免疫化することで、抗体（たとえばモノクローナル抗体）の集団を得ることができる。
【００８５】
宿主動物における免疫化によって作製した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体のヒト化。
宿主動物における免疫化によって作製された本発明の抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、その生物活性および医薬上の特性を増加させるために、多くの様式で操作できることが、本発明の企図内にある。そのような操作の一方法はヒト化である。
【００８６】
モノクローナル抗体をヒト化するためには４つの一般的なステップが存在する。これらは、（１）開始抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセス中に使用するかを判断するステップ、（３）実際のヒト化方法／技法のステップ、ならびに（４）ヒト化抗体を形質移入および発現させるステップである。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，８０７，７１５号、第５，８６６，６９２号、第６，３３１，４１５号、第５，５３０，１０１号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、および第６，１８０，３７０号を参照されたい。
【００８７】
非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されており、げっ歯類または改変げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常ドメインと融合したその関連するＣＤＲを有するキメラ抗体が含まれる。たとえば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３〜２９９（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：４２２０〜４２２４（１９８９）、Ｓｈａｗら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：４５３４〜４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：３５７７〜３５８３（１９８７）を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させる前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）内に移植したげっ歯類ＣＤＲを記載している。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）を参照されたい。別の参考文献は、組換え操作したげっ歯類フレームワーク領域によって支持されるげっ歯類ＣＤＲを記載している。たとえば欧州特許公開第０５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的応用の持続期間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望まない免疫学的応答を最小限にするために設計されている。たとえば、抗体定常領域は、これが免疫学的に不活性である（たとえば補体溶解を誘発しない）ように操作することができる。たとえば、ＰＣＴ公開ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号、英国特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。利用し得る抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：２４７１〜２４７６（１９９１）ならびに米国特許第６，１８０，３７７号、第６，０５４，２９７号、第５，９９７，８６７号、第５，８６６，６９２号、第６，２１０，６７１号、第６，３５０，８６１号、およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／２７１６０号にも開示されている。
【００８８】
ヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
完全ヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている市販のマウスを用いることによって得られ得ることが、本発明の企図内にある。また、より望ましい（たとえば完全ヒト抗体）またはより強力な免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に使用し得る。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｆｒｅｍｏｎｔ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【００８９】
また、完全ヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体は、ファージディスプレイ技術の一般的な方法に従って組換えによって得られ得ることも、本発明の企図内にある。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、および第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）を参照されたい。
【００９０】
代替として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３（１９９０））を用いて、ヒト抗体および抗体断片を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、免疫化していないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生じさせることができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームでＭ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要または副コートタンパク質遺伝子のいずれか中にクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として表示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択も、これらの特性を示す抗体をコードしている遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な様式で行うことができる。総説には、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５６４〜５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから単離した。免疫化していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原が含まれる）の多様なアレイに対する抗体は、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２：７２５〜７３４（１９９３）によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い確率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入した変化の一部はより高い親和性を与え、高親和性の表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が、続く抗原免疫誘発中に優先的に複製および分化される。この天然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技法を用いることによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫化していないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体のレパートリー（レパートリー）で連続的に置き換えることによって、向上させることができる。この技法により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能となる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「最大のライブラリ（ｔｈｅ ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても知られる）を作製するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６（１９９３）によって記載されている。
【００９１】
また、遺伝子シャフリングを用いてヒト抗体をげっ歯類抗体から誘導することもでき、ヒト抗体は開始げっ歯類抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリント」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えて、げっ歯類−ヒトのキメラを作出する。抗原に対する選択により、機能的抗原結合部位を修復することができるヒト可変領域の単離がもたらされる、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリント）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにプロセスを繰り返した場合、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基をまったく有さない完全ヒト抗体を提供する。
【００９２】
上記論考はヒト化抗体およびヒト抗体に関するが、論じた一般的な原理は、抗体を、たとえば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシにおいて使用するためにあつらえることに適用可能である。本明細書中に記載の抗体をヒト化する１つまたは複数の態様、たとえば、ＣＤＲ移植、フレームワーク突然変異およびＣＤＲ突然変異を組み合わせ得る。
【００９３】
組換えによって作製した、操作および改変した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体。
一般に、抗体は、所望の抗体のＤＮＡ配列を発現ベクター内に配置し、次いで、それだけには限定されないが、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞を含めた宿主細胞中での形質移入および発現によって、組換えによって作製し得る。ＰＣＴ特許公開ＷＯ８７／０４４６２号。トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック乳細胞などの他の宿主細胞も使用し得る。たとえば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２７５６（２００１）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３：６５（１９９５）、ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７（１９９９）を参照されたい。
【００９４】
また、抗体は、組換えによって改変もし得る。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域のＤＮＡをマウス抗体ＤＮＡの相同的なマウス配列、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１（１９８４）の代わりに、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部を共有結合させることによって使用してもよい。同様の様式で、本明細書中の抗Ｎｏｔｃｈ−１モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製することができる。
【００９５】
また、抗体可変領域は、ＣＤＲ移植によっても改変することができる。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原の相互作用を司っているため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植した、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列が含まれる発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１００２９〜１００３３、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および６，１８０，３７０号を参照）
【００９６】
したがって、本開示の別の態様は、それぞれ配列番号１８、１９および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号１２、１３および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、そのような抗体は、モノクローナル抗体Ｎ２４８ＡのＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含有する一方で、これらの抗体からの異なるフレームワーク配列を含有し得る。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列が含まれる公的ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。
【００９７】
別の種類の可変領域の改変は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基と突然変異させることによって、目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（たとえば親和性）を向上させることである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行って突然変異（複数可）を導入することができ、抗体結合、または他の目的の機能的特性に対する効果は、本明細書中に記載のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのアッセイで評価することができる。典型的には、保存的改変（以下に論じる）が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個以下、２、３、４または５個の残基が変更される。
【００９８】
保存的置換および抗体親和性成熟は、後の段落でより詳細に論じる。
【００９９】
抗体が結合する抗原エピトープのマッピング。
抗原上のモノクローナル抗体の結合エピトープは、抗原−抗体の相互作用の種類に応じて、いくつかの方法によってマッピングし得る。
【０１００】
抗体が、抗原中の連続的なアミノ酸残基からなる、その結合が抗原のコンホメーション変化によって通常は影響を受けない単一のエピトープと結合する場合、結合エピトープは直鎖エピトープと呼ばれる。直鎖結合エピトープを同定するために、ペプチド走査方法を一般的に使用し（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３１５巻、第１〜２号、１１〜１８ページ、２００６年８月を参照）、これは、抗原配列の全長にわたる、一連の重複する１０〜１５量体ペプチドを合成することを要する。ペプチドを２つ組のドット方式でタンパク質架橋結合膜上にアレイ配置する。ペプチドアレイに対する抗体の結合親和性をＥＬＩＳＡと同様に分析する。ペプチドをアレイ配置した膜を、非特異的結合を遮断するために５％のウシ胎児血清を含む１×ＰＢＳＴ中で最初にインキュベーションし、その後、試験抗体または非特異的な対照抗体と共にインキュベーションし、次いで、ＨＲＰで標識した二次抗体と共にインキュベーションする。抗体の結合強度は、化学発光イメージング機器を用いて読み取る。
【０１０１】
代替として、直鎖結合エピトープは、酵母細胞表面上に表示された抗原タンパク質ドメインを用いて（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３６５（１）、１９６〜２００、２００７年１月を参照）、または細菌細胞表面上に表示された抗原タンパク質断片を用いて（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２２６（２）、３４７〜３５３、２００３年９月を参照、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、５（１２）、１０３９〜１０４５、２００８年１１月も参照）、次いでフローサイトメトリー分別、すなわちＦＡＣＳで同定し得る。
【０１０２】
質量分析と組み合わせた、ペプチド抗原および抗体複合体の限定タンパク質分解が、直鎖結合エピトープを位置決定するための別の手法を提供し得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５２４、８７〜１０１、２００９を参照）。抗原および抗体を混合し、結合複合体を形成するために適した条件でインキュベーションし、これを、制御された温度および時間のもとでプロテアーゼによって消化する。その後、結合した反応混合物をプロテインＡ親和性カラムに通して、抗原エピトープ断片と結合した抗体を保持させ、これを、カラムから溶出させた後に、質量分析によって分析する。
【０１０３】
コンホメーションエピトープのマッピングは、抗体とそのネイティブなコンホメーションの抗原との相互作用に依存する。いくつかの技法が、コンホメーションエピトープの決定において有用であることが報告されている。一般的に使用される方法の１つはアミノ酸突然変異誘発である。抗体と結合することが推測される抗原タンパク質中の個々のアミノ酸残基を突然変異させ、その後、突然変異した抗原タンパク質を発現させ、抗体結合分析に供して、結合親和性が損なわれたかどうかを決定する。しかし、完全抗原タンパク質配列にわたる系統的なアミノ酸突然変異誘発は労力がかかる。抗体と相互作用する抗原タンパク質の領域を絞り込むために、密に関連するタンパク質ドメインによる個々の抗原ドメインの置換が有用な方法である場合がある（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．、２７４（１４）９６１７〜９６２６、１９９９年４月を参照）。
【０１０４】
ショットガン突然変異誘発マッピングが、従来のアミノ酸突然変異誘発の欠点を克服するために開発された（Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１３１、６９５２〜６９５４、２００９を参照）。この方法では、抗原ｃＤＮＡから作製した包括的な突然変異ライブラリを利用し、それぞれのプラスミドクローンは独特の点突然変異を含有し、突然変異ライブラリ全体が抗原コード領域のすべてのアミノ酸をカバーする。プラスミドクローンのライブラリをＨＥＫ−２９３Ｔまたは他のヒト細胞中に形質移入させ、その後、細胞を、３８４ウェルマイクロプレート中にアレイ配置させる。細胞をマイクロプレート上に固定した後に抗体の結合活性をアッセイする。アミノ酸の突然変異が反応性の損失をもたらす場合、これは抗体結合エピトープとして同定される。
【０１０５】
抗原−抗体の複合体の共結晶化、Ｘ線回折および構造解析により、抗原−抗体の相互作用の方向の可視化が与えられる。アミノ酸突然変異誘発と組み合わせた場合、この技術は抗体結合エピトープの強力な証拠および鮮明な描写を提供するであろう。しかし、共結晶化および構造解析が技術的に難しく、大量の精製した抗原および抗体を必要とし、時間のかかる試行錯誤プロセスとなる場合がある。
【０１０６】
１つのエピトープまたは指定したエピトープの組と結合する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体を作製するために、抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体を作製し、その後、当分野で一般に知られている上記マッピング方法に従って、これらの抗体のそれぞれが結合するエピトープまたはエピトープの組を決定することができる。その後、特定のエピトープまたは特定のエピトープの組と結合する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体を選択することができる。
【０１０７】
保存的置換
既に論じたように、抗体は、抗体のアミノ酸残基のうちの１つもしくは複数の保存的置換によって、または抗体のアミノ酸への、アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加によって、組換えにより改変されてもよい。
【０１０８】
アミノ酸配列の挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮまたはＣ末端と血液循環中の抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドとの融合が含まれる。
【０１０９】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその代わりに挿入されている。最も関心が持たれる置換突然変異誘発の部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換を表２に示す。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合は、表２中で「例示的な置換」と命名した、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載した、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングし得る。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換領域中の、たとえばシートもしくはヘリックスコンホメーションとしてのポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持におけるその効果が顕著に異なる置換を選択することによって、達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）極性、荷電なし：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１１２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することによって行う。
【０１１３】
また、抗体の適正のコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、一般にセリンで置換して、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止し得る。逆に、システイン結合（複数可）を、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、その安定性を向上させるために抗体に付加し得る。
【０１１４】
親和性成熟した抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体
本発明には、親和性成熟した実施形態が含まれる。たとえば、親和性成熟した抗体は、当分野で知られている手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０５８１８４号）。
【０１１５】
以下の方法を、抗体の親和性の調整およびＣＤＲの特徴づけに使用し得る。「ライブラリ走査突然変異誘発」と呼ばれる、抗体のＣＤＲを特徴づけるおよび／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更させる（向上させるなど）一方法。一般に、ライブラリ走査突然変異誘発は以下のように動作する。当分野で認識されている方法を用いて、ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸位置を２種類以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０種類など）のアミノ酸で置き換える。これによりクローンの小ライブラリが作製され（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置について１つずつ）、そのそれぞれが２つ以上のメンバーの複雑さを有する（それぞれの位置で２種類以上のアミノ酸を置換する場合）。一般に、ライブラリには、ネイティブ（非置換）のアミノ酸を含むクローンも含まれる。それぞれのライブラリからの少数のクローン、たとえば約２０〜８０個のクローン（ライブラリの複雑さに依存する）を、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングし、増加した、同じ、減少した結合を有する、または結合しない候補を同定する。
【０１１６】
一部の実施形態では、当分野で認識されている突然変異誘発方法を用いて、ＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置を、一部の実施形態では、１回に１個、２０種類すべての天然アミノ酸で置き換える。これによりクローンの小ライブラリが作製され（一部の実施形態では、分析するそれぞれのアミノ酸位置について１つずつ）、そのそれぞれが２０個のメンバーの複雑さを有する（それぞれの位置で２０種類すべてのアミノ酸を置換する場合）。
【０１１７】
一部の実施形態では、スクリーニングするライブラリは、同じＣＤＲ中または２つ以上のＣＤＲ中であり得る２つ以上の位置での置換を含む。したがって、ライブラリは、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリは、２つ以上のＣＤＲ中の２つ以上の位置での置換を含み得る。ライブラリは、２、３、４、５または６個のＣＤＲ中に見つかる３、４、５、またはそれより多くの位置での置換を含み得る。置換は、冗長性の低いコドンを用いて調製し得る。たとえば、Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ、１３７（１）：１０９〜１８）の表２を参照されたい。それぞれのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであり得る。
【０１１８】
向上した結合を有する候補を配列決定し、それにより、「向上した」置換とも呼ばれる、向上した親和性をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定し得る。また、結合する候補も配列決定し、それにより、結合を保持するＣＤＲ置換も同定し得る。
【０１１９】
複数回のスクリーニングを実施し得る。たとえば、それぞれが１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を含む、向上した結合を有する候補は、それぞれの向上したＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が向上した結合を示したＣＤＲ中のアミノ酸位置）で少なくとも元のおよび置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリの設計にも有用である。このライブラリの調製、およびスクリーニングまたは選択を以下にさらに記述する。
【０１２０】
また、ライブラリ走査突然変異誘発は、向上した結合、同じ結合、減少した結合を有する、または結合しないクローンの頻度が、抗体−抗原の複合体の安定性のためにそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限りは、ＣＤＲを特徴づけるための手段も提供する。たとえば、ＣＤＲのある位置が、２０種類すべてのアミノ酸に変化させたときに結合を保持している場合、その位置は、抗原結合に必要である可能性が低い位置として同定される。逆に、あるＣＤＲの位置が、置換の少ないパーセンテージのみで結合を保持している場合は、その位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリ走査突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（２０種類すべてのアミノ酸が含まれる）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないまたは少数のアミノ酸にのみ変化させることができるＣＤＲ中の位置に関する情報をもたらす。
【０１２１】
向上した親和性を有する候補は、向上したアミノ酸、その位置での元のアミノ酸が含まれ、所望されるライブラリの複雑さ次第で、または所望のスクリーニングもしくは選択の方法を用いて許容される、その位置での追加の置換がさらに含まれ得る、第２のライブラリ中で合わせ得る。さらに、所望する場合は、隣接アミノ酸位置を、少なくとも２種類以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接アミノ酸のランダム化は、突然変異体ＣＤＲにおけるさらなるコンホメーションの柔軟性を可能にする場合があり、これは、立ち代って、より多数の向上させる突然変異の導入を可能または容易にし得る。また、ライブラリは、第１の回目のスクリーニングで向上した親和性を示さなかった位置での置換も含み得る。
【０１２２】
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いたスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた当分野で知られている選択のための任意の方法を用いた選択を含めた、当分野で知られている任意の方法を用いて、第２のライブラリを、向上したおよび／または変更された結合親和性を有するライブラリメンバーについてスクリーニングまたは選択する。
【０１２３】
抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体の翻訳後修飾
また、抗体は、それだけには限定されないが、様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含めた翻訳後修飾によって修飾されることもできる。抗体は、その定常領域中の保存的な位置でグリコシル化される。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８、ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）、ならびにコンホメーションに影響を与える場合がある、糖タンパク質の部分間の分子内相互作用に影響を与え、糖タンパク質の三次元表面を提示した（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）。また、オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて所定の糖タンパク質を特定の分子に標的化する役割も果たし得る。また、抗体のグリコシル化は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。具体的には、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節性発現を有するＣＨＯ細胞が、向上したＡＤＣＣ活性を有することが報告されている（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。
【０１２４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結のいずれかである。Ｎ−連結とは、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への付着をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン［式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ−連結グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
【０１２５】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ−連結グリコシル化部位用）。また、変更は、元の抗体の配列に１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を付加する、またはそれによって置換することによっても行い得る（Ｏ−連結グリコシル化部位用）。
【０１２６】
また、抗体のグリコシル化パターンは、根底にあるヌクレオチド配列を変更させずに変更し得る。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、たとえば抗体の発現に使用する細胞種がネイティブ細胞であることは稀なため、抗体のグリコシル化パターンが変動することを予測することができる（たとえばＨｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０１２７】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を与える要因には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖の産生に関与している特定の酵素の導入または過剰発現を含めた様々な方法が、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するために提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、第５，５１０，２６１号および第５．２７８、２９９号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化を、糖タンパク質から、たとえば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて、酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種類の多糖のプロセッシングが欠損しているように遺伝子操作することができる。これらおよび類似の技法は当分野で周知である。
【０１２８】
翻訳後修飾の他の方法には、それだけには限定されないが、酵素的手段、酸化置換およびキレート化を含めた、当分野で知られているカップリング技法の使用が含まれる。修飾は、たとえば、免疫アッセイ用の標識を付着させるために使用することができる。
【０１２９】
改変された定常領域を有する抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体
本発明の一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性である、たとえば、補体媒介性の溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化させない、または、補体媒介性の溶解の始動、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の刺激もしくはミクログリアの活性化のうちの任意の１つもしくは複数において低下した活性を有する（改変されていない抗体と比較して）定常領域などの、改変された定常領域を含む。定常領域の様々な改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成し得る。たとえば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜３２４（１９９５）、Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９、１５７：４９６３〜４９６９（１９９６）、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４（２０００）、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１（１９８９）、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号、および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように改変されている。他の実施形態では、抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸の付番は野生型ＩｇＧ２配列を参照）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４。さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のためにアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。一部の実施形態では、定常領域は、グリコシル化されたアミノ酸残基または定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるフランキング残基を突然変異させることによって、Ｎ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。たとえば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７をＡ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させ得る。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１（１９８９）、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のために脱グリコシル化されている。定常領域は、Ｎ−連結グリコシル化のために酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去することなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞中での発現によって、脱グリコシル化されていてよい。
【０１３０】
Ｆｃ領域内の改変を典型的に使用して、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性などの抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させることができる。さらに、本開示の抗体は、やはり抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、化学修飾し得るか（たとえば１つもしくは複数の化学部分を抗体に付着させることができる）、そのグリコシル化パターンを変更させるために改変し得る。これらの態様のそれぞれは、以下にさらに詳述されている。Ｆｃ領域中の残基の付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標のものである。
【０１３１】
一事例では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されている、たとえば増加または減少しているように改変されている。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、たとえば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変更されている。
【０１３２】
別の事例では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために突然変異されている。より詳細には、抗体が、ネイティブのＦｃ−ヒンジドメインのＳｐＡ結合と比較して、損なわれたブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の結合を有するように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３のドメイン界面領域内に導入する。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳述されている。
【０１３３】
別の事例では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために改変されている。様々な手法が可能である。たとえば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの突然変異のうちの１つまたは複数を導入することができる。あるいは、米国特許第５，８６９，０４６号および６，１２１，０２２号に記載のように、生物学的半減期を増加させるために、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採った回収受容体結合エピトープが含有されるように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変更することができる。
【０１３４】
さらに他の事例では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって変更する。たとえば、抗体がエフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持しているように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性を変更させるエフェクターリガンドは、たとえば、補体のＦｃ受容体またはＣ１構成成分であってもよい。この手法は、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳述されている。
【０１３５】
別の事例では、抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消滅した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。この手法は、米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳述されている。
【０１３６】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つまたは複数のアミノ酸残基を変更させることによって、補体を固定する抗体の能力を変更させる。この手法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【０１３７】
さらに別の例では、Ｆｃ領域は、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の位置の１つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するおよび／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる抗体の能力を増加させるために改変されている。この手法は、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、向上した結合を有する変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：６５９１〜６６０４（２００１）を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を向上させることが示された。さらに、Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの組合せの突然変異体が、ＦｃγＲＩＩＩの結合を向上させることが示された。
【０１３８】
さらに別の例では、抗体のグリコシル化は改変されている。たとえば、脱グリコシル化された抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、たとえば抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更することができる。そのような炭水化物の改変は、たとえば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。たとえば、１つまたは複数の可変領域のフレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらすことによって、その部位でのグリコシル化を排除する、１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのようなアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのような手法は、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳述されている。
【０１３９】
さらに、またはそれに代わって、低下した量のフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体などの変更された種類のグリコシル化を有する抗体または増加した二分ＧｌｃＮＡｃ構造を有する抗体を作製することができる。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物の改変は、たとえば、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変更されたグリコシル化機構を有する細胞は当分野で記載されており、本開示の組換え抗体を発現させることによって、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生させるための宿主細胞として使用することができる。たとえば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞系中で発現された抗体がその炭水化物上にフコースを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置き換えベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製した（米国特許公開第２００４−０１１０７０４号、およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、８７：６１４〜２２（２００４）を参照）。別の例として、欧州特許公開ＥＰ１，１７６，１９５号は、アルファ１，６結合関連の酵素を低下または排除することによって、そのような細胞系中で発現させた抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードしている機能を破壊したＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載している。また、ＥＰ１，１７６，１９５号は、抗体のＦｃ領域と結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加することに関して低い酵素活性を有する、または酵素活性を有さない細胞系、たとえばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）−連結炭水化物に付着させる能力が低下しており、また、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化ももたらす、変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞を記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３〜２６７４０（２００２）も参照）。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作した細胞系中で発現される抗体が、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらす増加した二分ＧｌｃＮＡｃ構造を示すように、糖タンパク質を改変するグリコシルトランスフェラーゼ（たとえばベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作した細胞系を記載している（Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０（１９９９）も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断除去し得る。たとえば、フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏら、（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：５５１６〜２３（１９７５））。
【０１４０】
本開示によって企図される本明細書中の抗体の別の改変はｐｅｇ化である。抗体は、たとえば、抗体の生物学的（たとえば血清）半減期を増加させるためにｐｅｇ化することができる。抗体をｐｅｇ化するためには、抗体またはその断片を、典型的にはＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着される条件下で反応させる。典型的には、ｐｅｇ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）と用いたアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施する。本明細書中で使用する用語「ポリエチレングリコール」には、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されている、ＰＥＧの任意の形態が包含されることを意図する。特定の事例では、ｐｅｇ化する抗体は脱グリコシル化されている抗体である。タンパク質をｐｅｇ化する方法は当分野で知られており、本開示の抗体に適用することができる。たとえば、欧州特許ＥＰ０１５４３１６Ｂ１号およびＥＰ０４０１３８４Ｂ１号を参照されたい。
【０１４１】
他の抗体の改変には、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号に記載のように改変された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全体または一部に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の顕著な補体依存性溶解、または細胞媒介性破壊を誘発せずに、標的分子と結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で改変された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症性および他の有害な反応を回避するために、慢性抗体療法における使用に特に適している。
【０１４２】
融合タンパク質
また、本発明には、本発明の抗体またはポリペプチドからの１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含される。一実施形態では、本発明の抗体の可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続的なアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、本発明の抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む。本発明の目的のために、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体およびそれがネイティブ分子中で付着していない別のアミノ酸配列、たとえば、異種配列または別の領域からの相同配列を含有する。例示的な異種配列には、それだけには限定されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。
【０１４３】
融合ポリペプチドは、当分野で知られている方法、たとえば、合成または組換えによって作出することができる。
【０１４４】
二重特異性分子
本開示の抗体またはその抗原結合部分を、誘導体化するか、または別の機能的分子、たとえば、別のペプチドもしくはタンパク質（たとえば、ある受容体に対する別の抗体もしくはリガンド）と連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。本開示の抗体は、実際には、誘導体化するか、複数の他の機能的分子と連結させて、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多特異性分子を作製することができる。そのような多特異性分子も本明細書中で使用する用語「二重特異性分子」によって包含されることを意図する。本開示の二重特異性分子を作出するためには、二重特異性分子がもたらされるように、本開示の抗体を、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体などの１つまたは複数の他の結合分子と機能的に連結させることができる（たとえば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有会合または別の方法によって）。
【０１４５】
抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体をコードしているポリヌクレオチド
また、本発明は、本発明の抗体およびペプチドをコードしている単離したポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【０１４６】
一態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本発明の抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本発明の抗体またはポリペプチドのうちのいずれかをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれかを作製する方法を提供する。
【０１４８】
また、任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコードまたは非コード配列が、必ずしもではないが本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずしもではないが、他の分子および／または支持物質と連結していてもよい。
【０１４９】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体もしくはその一部分をコードしている内在配列）を含み得るか、またはそのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、ネイティブの免疫反応性分子と比較して、コードされているポリペプチドの免疫反応性が消失しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載のように評価し得る。変異体は、好ましくは、ネイティブ抗体またはその一部分をコードしているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０１５０】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最大一致についてアラインメントした際に同じである場合に、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較ウィンドウにわたって比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」とは、２つの配列を最適にアラインメントした後に、配列を同数の連続的な位置の参照配列と比較し得る、少なくとも約２０個の連続的な位置、通常は３０〜約７５個、または４０〜約５０個のセグメントをいう。
【０１５１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を少なくとも２０個の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントについて、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、参照配列中の合計数（すなわちウィンドウの大きさ）で除算し、結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算する。
【０１５２】
また、またはあるいは、変異体は、ネイティブ遺伝子またはその一部分もしくは相補体に実質的に相同的であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中等度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）とハイブリダイズすることができる。
【０１５３】
適切な「中等度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、終夜でのハイブリダイズ、次いで、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄が含まれる。
【０１５４】
本明細書中で使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いるもの、（２）ハイブリダイゼーション中に、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と共に、４２℃で、ホルムアミド、たとえば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドなどの変性剤を用いるもの、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストラン、４２℃、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％のホルムアミドでの洗浄、次いで、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものである。当業者には、必要に応じてプローブの長さなどの要因に順応するために、温度、イオン強度などを調整する方法が認識されるであろう。
【０１５５】
当業者には、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が多く存在することが理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性しか保有しない。それにも関わらず、コドン使用頻度の相違が原因で変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内にある。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として変更される、内在性の遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもではないが、変更された構造または機能を有し得る。対立遺伝子は、標準の技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定し得る。
【０１５６】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。
【０１５７】
組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するためには、本明細書中でさらに記述するように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、立ち代って、ベクターを複製および増幅のための適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入し得る。細胞は、外因性ポリヌクレオチドを直接取り込み、エンドサイトーシス、形質移入、Ｆ接合または電気穿孔によって導入することによって形質転換させる。導入された後、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持されるか、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれることができる。そのようにして増幅したポリヌクレオチドは、当分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。
【０１５８】
代替として、ＰＣＲによりＤＮＡ配列の複製が可能となる。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０１５９】
ＲＮＡは、単離したＤＮＡを適切なベクター中で使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡへと転写される際に、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、上記に記載の当業者に周知の方法を用いて、ＲＮＡを単離することができる。
【０１６０】
適切なクローニングベクターは、標準の技法に従って構築し得るか、または当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは使用を意図する宿主細胞に応じて変動し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を保有し得る、および／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえばｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手可能である。
【０１６１】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターが含まれる。ベクター構成成分には、一般に、それだけには限定されないが、シグナル配列、複製起点、１つもしくは複数のマーカー遺伝子、適切な転写性制御要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）のうちの１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、およびストップコドンなどの１つまたは複数の翻訳制御要素も通常は必要である。
【０１６２】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた形質移入、微粒子銃、リポフェクション、および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含めたいくつかの適切な手段のうちのいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、多くの場合、宿主細胞の特長に依存する。
【０１６３】
また、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中に存在する場合は対応する内在性抗体または目的のタンパク質よりも約５倍以上、より好ましくは、１０倍以上、さらにより好ましくは、２０倍以上のレベルでｃＤＮＡを発現する。宿主細胞をＮｏｔｃｈ−１またはＮｏｔｃｈ−１ドメインとの特異的結合についてスクリーニングすることは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって達成する。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０１６４】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容できる担体と一緒に配合した、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（複数可）のうちの１つまたは組合せを含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。そのような組成物には、本開示１つもしくは組合せの（たとえば２つ以上の異なる）抗体、または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性分子が含まれ得る。たとえば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合する、または相補的活性を有する、抗体（または免疫コンジュゲートもしくは二重特異性抗体）の組合せを含むことができる。
【０１６５】
また、本開示の医薬組成物は、組合せ療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、組合せ療法には、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた、本開示の抗Ｎｏｔｃｈ１抗体が含まれることができる。組合せ療法で使用することができる治療剤の例は、以下の本開示の抗体の使用のセクション中にさらに詳述されている。
【０１６６】
本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」には、生理的に適合性のある任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。典型的には、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射またはインフュージョンによる）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕａｇｅ）、または二重特異性分子は、酸および化合物を失活させ得る他の天然条件の作用から化合物を保護するために、物質でコーティングし得る。
【０１６７】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、中性の形態（双極性イオン形態が含まれる）または正もしくは負荷電の種として存在し得る。一部の事例では、抗体は、対イオンと複合して、薬学的に許容できる塩を形成し得る。したがって、本開示の医薬化合物には、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩が含まれ得る。
【０１６８】
「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物（たとえば抗体）の所望の生物活性を保持しており、かつ望ましくない毒性効果を与えない塩をいう（たとえばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６：１〜１９を参照）。たとえば、用語「薬学的に許容できる塩」には、１つまたは複数の抗体および１つまたは複数の対イオンを含む複合体が含まれ、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０１６９】
そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどの無毒性の無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０１７０】
さらに、薬学的に許容できる無機塩基には金属イオンが含まれる。金属イオンには、それだけには限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理学的に許容できる金属イオンが含まれる。無機塩基に由来する塩には、その通常の原子価のアルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。
【０１７１】
本開示の抗体の薬学的に許容できる酸付加塩は、それだけには限定されないが、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、ショウノウ酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンジゾ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リシン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモン酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、ショウノウスルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸を含めた酸から調製することができる。
【０１７２】
薬学的に許容できる有機塩基には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四級アンモニウム陽イオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コレート、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、およびトロメタモールが含まれる。
【０１７３】
また、本開示の医薬組成物には薬学的に許容できる抗酸化剤も含まれ得る。薬学的に許容できる抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油可溶性抗酸化剤、ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が含まれる。
【０１７４】
本開示の医薬組成物中で用い得る適切な水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。
【０１７５】
また、これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順、上記によって、ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、確実にし得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物内に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射用医薬形態の長期的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらし得る。
【０１７６】
薬学的に許容できる担体には、無菌的な水溶液または分散液ならびに無菌的な注射用液剤または分散液を即時調製するための無菌的な粉末が含まれる。医薬上活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合以外は、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。また、補助的活性化合物も組成物内に組み込むことができる。
【０１７７】
治療的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌的かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則的な構造として配合することができる。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適正の流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１７８】
無菌注射用液剤は、所要量の活性化合物を適切な溶媒中、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、次いで滅菌精密濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記に列挙したものからの所要の他の成分を含有する無菌的なビヒクル内に取り込ませることによって調製する。無菌的な注射用液剤を調製するための無菌的な粉末の場合、調製方法には、それだけには限定されないが、以前に滅菌濾過したその溶液からの活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が含まれる。
【０１７９】
担体物質と組み合わせて単一剤形を生じることができる活性成分の量は、処置する対象および具体的な投与様式に応じて変動する。担体物質と組み合わせて単一剤形を生じることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、この量は、１００パーセントのうち、薬学的に許容できる担体と組み合わせて約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲となる。
【０１８０】
最適な所望の応答（たとえば治療反応）を提供するために投薬レジメンを調整する。たとえば、単一のボーラスを投与し得るか、いくつかの分割した用量を経時的に投与し得るか、または治療状況の急迫によって指示されるように用量を比例的に低下もしくは増加させ得る。投与の容易性および投薬の均質性のために、非経口組成物を単位剤形で配合することが特に有利である。本明細書中で使用する単位剤形とは、処置する対象の単位用量として適した物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、所要の医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するための、そのような活性化合物を化合する分野に固有の制限によって指示され、それに直接依存する。
【０１８１】
抗体の投与には、用量は宿主の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇの範囲である。たとえば、用量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇもしくは１０ｍｇ／体重１ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。例示的な処置レジームは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与を必要とする。本開示の抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合部分の投薬レジメンには、たとえば、静脈内投与による１ｍｇ／体重１ｋｇまたは３ｍｇ／体重１ｋｇが含まれ、抗体は、（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後に３カ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／体重１ｋｇを１回、次いで１ｍｇ／体重１ｋｇを３週間毎の投薬スケジュールのうちの１つを用いて与える。
【０１８２】
一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与するそれぞれの抗体の用量は示した範囲内にある。抗体は、通常、複数回で投与する。単一投薬の間の間隔は、たとえば、週に１回、月に１回、３カ月毎または年に１回とすることができる。また、間隔は、患者中の標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって指示されるように、不規則であることもできる。一部の方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成されるように、用量を調整する。
【０１８３】
代替として、抗体は持続放出配合物として投与することができ、その場合、より低い頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投与の用量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに応じて変動する場合がある。予防的な応用では、比較的低い用量を比較的低い頻度の間隔で長期的に投与する。一部の患者は、その残りの寿命の間、処置を受け続ける。治療的な応用では、比較的短い間隔の比較的高い用量が、疾患の進行が低減または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要な場合がある。それ以降、患者に予防的レジームを投与することができる。
【０１８４】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療反応を達成するために有効な活性成分の量を得るために、変動させ得る。選択される用量レベルは、用いる本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄率、処置の持続期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、重量、状態、全体的な健康および以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含めた、様々な薬物動態学要因に依存する。
【０１８５】
本開示の抗Ｎｏｔｃｈ抗体の「治療上有効な用量」は、好ましくは、疾患の症状の重篤度の減少、疾患症状のない期間頻度および持続期間の増加、または疾患の罹患が原因の機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。たとえば、Ｎｏｔｃｈ−１−陽性腫瘍の処置には、「治療上有効な用量」は、非処置の対象と比較して、細胞成長または腫瘍増殖を好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているアッセイによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの阻害などの、化合物の阻害する能力を検査することによって、評価することができる。治療上有効な量の治療的化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、または対象における症状を他の形で改善することができる。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重篤度、および選択した特定の組成物または投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定できるであろう。
【０１８６】
本開示の組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当分野で知られている様々な方法のうちの１つまたは複数を用いて投与することができる。当業者によって理解されるように、経路および／または投与様式は所望の結果に応じて変動する。本開示の抗体またはその抗原結合部分のための投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、たとえば注射または注入によるものが含まれる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを意味し、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。
【０１８７】
代替として、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、局所、表皮または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの、非経口でない経路を介して投与することができる。
【０１８８】
活性化合物は、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達系を含めた徐放性配合物など、化合物を迅速な放出に対して保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような配合物を調製するための多くの方法が、特許取得されている、または当業者に一般に知られている。たとえばＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１８９】
本開示の使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物および方法は、Ｎｏｔｃｈ−１媒介性の障害の診断および処置に関与する、数々のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの診断的および治療的な利用性を有する。たとえば、様々な障害を処置、予防および診断するために、これらの分子を、培養中の細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで、またはヒト対象にたとえばｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。本明細書中で使用する用語「対象」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれることが意図される。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい対象には、Ｎｏｔｃｈ−１活性によって媒介される障害を有するヒト患者が含まれる。この方法は、異常なＮｏｔｃｈ−１発現または活性化に関連する障害を有するヒト患者の処置に特に適している。Ｎｏｔｃｈ−１に対する抗体を別の薬剤と一緒に投与する場合、２つはいずれの順序で、または同時に投与することができる。
【０１９０】
Ｎｏｔｃｈ−１に対する本開示の抗体の特異的結合を考慮して、本開示の抗体は、細胞の表面上のＮｏｔｃｈ−１発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、免疫親和性精製によってＮｏｔｃｈ−１を精製するために使用することができる。
【０１９１】
さらに、本開示の抗体、抗体組成物および方法は、異常細胞成長、たとえば癌を有する対象を処置するために使用することができる。特定の一実施形態では、癌はＴ−ＡＬＬである。別の特定の実施形態では、癌は乳癌である。
【０１９２】
本発明の抗体によって処置し得る他の種類の異常細胞成長には、たとえば、中皮腫、肝胆道（肝管および胆管）、原発性もしくは続発性のＣＮＳ腫瘍、原発性もしくは続発性の脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部もしくは頚部の癌、皮膚もしくは眼内の黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃腸管系（胃、結腸直腸、および十二指腸）、乳癌、子宮癌、輸卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、慢性もしくは急性の白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓もしくは輸尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または前述の癌のうちの１つもしくは複数の組合せが含まれる。
【０１９３】
本開示の抗体組成物（たとえば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性および二重特異性分子ならびに免疫コンジュゲート）またはその抗原結合部分をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する適切な経路は当分野で周知であり、当業者によって選択されることができる。たとえば、抗体組成物は、注射（たとえば、静脈内または皮下）によって投与することができる。使用する分子の適切な用量は、対象の年齢および重量ならびに抗体組成物の濃度および／または配合に依存する。
【０１９４】
既に記載のように、本開示のヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合部分は、１つまたは他の複数の治療剤、たとえば、細胞毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と共に同時投与することができる。抗体は、薬剤と連結させることができるか（免疫複合体として）、または薬剤とは分離して投与することができる。後者の場合（別々の投与）、抗体は、薬剤の前、後、もしくはそれと同時に投与することができるか、または他の既知の治療、たとえば抗癌治療、たとえば放射線と同時投与することができる。そのような治療剤には、とりわけ、それ自体では患者に対して毒性または準毒性なレベルでのみ有効な、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは、４週間に１回の１００ｍｇ／用量として静脈内投与することができ、ａｄｒｉａｍｙｃｉｎは、２１日に１回の６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として静脈内投与する。本開示のヒト抗Ｎｏｔｃｈ−１抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤との同時投与は、異なる機構を介して作動する２つの抗癌剤を提供し、これにより、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果が得られる。そのような同時投与は、薬物に対する耐性の発生、または、腫瘍細胞の、抗体に対するそれらの反応性を失わせる抗原性の変化が原因の問題を解決することができる。
【０１９５】
キット
また、本開示の抗体組成物（たとえば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多特異性分子、または免疫コンジュゲート）および使用説明書を含むキットも、本開示の範囲内にある。キットは、１つもしくは複数の追加の試薬、たとえば、免疫抑制性試薬、細胞毒性剤もしくは放射性毒性剤、または本開示の１つもしくは複数の追加の抗体もしくはその抗原結合部分（たとえば、第１のヒト抗体とは明確に異なる、Ｎｏｔｃｈ−１抗原中のエピトープと結合する相補的活性を有するヒト抗体）をさらに含有することができる。
【０１９６】
したがって、本開示の抗体組成物で処置した患者に、ヒト抗体の治療効果を増強または増大させる、細胞毒性剤または放射性毒性剤などの別の治療剤をさらに投与することができる（本開示のヒト抗体を投与する前、それと同時に、またはその後）。
【０１９７】
本開示は、さらに限定すると解釈されるべきでない以下の実施例によって、さらに例示される。本出願中で言及するすべての図ならびにすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、明白に本明細書中に参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１９８】
（実施例１）
Ｎｏｔｃｈ１免疫原の作製および発現
Ｎｏｔｃｈ１免疫原発現構築体の作製
免疫原構築体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するための多重鎖形成ＰＣＲ（図１）によって作製した。図１中に例示するように、Ｎｏｔｃｈ１免疫原のｃＤＮＡを、複数重複ＰＣＲによって、Ｎｏｔｃｈ１完全長ｃＤＮＡクローンを鋳型として（ＯｒｉＧｅｎｅ、カタログ番号ＴＣ３０８８８３、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ試薬システムを使用し、製造者のプロトコルに従って（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）合成した。Ｎ末端リーダーペプチド、ＥＧＦ様反復３５〜３６、ＮＲＲ、（Ｌｉｎ Ａ、ＢおよびＣドメインならびにＨＤドメインが含まれる）ならびに細胞内配列の小さな一部分を含有する、組換えＮｏｔｃｈ１免疫原のｃＤＮＡを、Ｎｏｔｃｈ１免疫原をＦｃ配列のＮ末端と融合させたＦｃ融合タンパク質ベクター中にクローニングした。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）と呼ばれるＮｏｔｃｈ１免疫原プラスミドは、図１１中の配列２（配列番号２）に示す免疫原タンパク質をコードしている図１１中の配列１（配列番号１）に示されるｃＤＮＡ挿入物を含有する。
【０１９９】
並行して、膜貫通（ＴＭ）配列（配列４中の最後の２４個のアミノ酸残基）を使用してＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）の細胞内配列（配列２中の最後の４４個のアミノ酸残基）を置き換えた以外はＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）と同じ配列を含有する、図２中に示す同様のプラスミドを構築した。このＰＣＲ増幅したＮｏｔｃｈ１免疫原のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このプラスミドはＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）と呼ぶ。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）の核酸配列およびアミノ酸配列は、図１２中に配列３（配列番号３）および４（配列番号４）として示す。
【０２００】
Ｎｏｔｃｈ１免疫原タンパク質の発現および精製
Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）中で、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および製造者のプロトコルを使用した一過性の形質移入によって発現させ、ウエスタンブロット分析によって確認した。手短に述べると、１×１０７個の細胞を、３０ミリリットル（ｍｌ）の２９３−Ｆ細胞成長培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する組織培養振盪フラスコ中に播種した。０．５ｍｌの馴化培地のアリコートを形質移入後の２日目から７日目まで２４時間毎に取ることによって、分泌されたタンパク質を分析した。２０マイクロリットル（ｕｌ）の馴化培地および２×タンパク質試料ローディング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を合わせ、１００℃で５分間加熱した。試料を電気泳動によって４〜１２％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。タンパク質を、ドライブロット装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲルからブロット膜へと移し、その後、膜を、ＰＢＳＴ（０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中の５％の無脂肪乾燥乳溶液で１時間ブロッキングした。Ｎ１−ＭＲＲＨＤ−ＴＭ（−）／Ｆｃ融合タンパク質の検出は、ヒトγＦｃに特異的な、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、テキサス州Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）とのインキュベーションによって行った。膜をＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で展開させた。タンパク質発現の時間経過の研究により、５〜６日間の培養物の馴化培地が最多の分泌されたＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃ融合タンパク質を含有していたことが示された。したがって、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質の発現を１０リットルの培養体積にスケールアップし、プロテインＧ親和性カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってタンパク質を精製した。
【０２０１】
Ｎｏｔｃｈ１免疫原を発現する細胞系の確立
Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）をマウス細胞系、Ｌ−９２９（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）中に安定に形質移入させ、細胞表面膜固定タンパク質として発現させた。安定な細胞系はＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた形質移入によって確立され、細胞を、個々のコロニーが目に見えるまで約９〜１５日間、１ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）に対して選択し、クローン増殖のために拾った。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）／Ｖ５タンパク質の発現レベルは、それぞれの安定な形質移入クローンから作製したタンパク質抽出物を用いたウエスタンブロットによって評価した。より詳細には、それぞれのクローンの細胞を培養容器から取り出し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ですすぎ、上述のようにウエスタンブロット分析に供した。タンパク質は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって検出した。最も高いレベルのＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（＋）タンパク質を発現する細胞クローンを、免疫化および細胞に基づく抗体結合アッセイの使用のために選択した。
【０２０２】
（実施例２）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂの作製
免疫化およびハイブリドーマクローニング
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＮｏｔｃｈ１免疫原、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）、および長い免疫化プロトコルを用いて免疫化した。第１の免疫化は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）乳濁液中に混合した２０マイクログラム（μｇ）の抗原を用いた皮下（ｓｃ）注射、次いで、それぞれが不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）乳濁液中に混合した２０μｇの抗原を送達する３回の隔週のｓｃ注射によって与えた。４回目の抗原注射の１週間後に血清を採取して、抗体の力価をＥＬＩＳＡによって確認した。高い応答力価を有するマウスを安楽死させ、ハイブリドーマクローニングのために脾臓を外科的に取り出した。
【０２０３】
脾臓細胞の単一の細胞懸濁液は、脾臓を、１００ミクロンのステンレス鋼製スクリーン、その後、細胞濾過器に押し通し、３０ｍｌのＲＰＭＩで２回洗浄することによって調製した。脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）と３対１の比で混合し、５０％のＰＥＧ−１５００を加えて穏やかに攪拌することによって、細胞融合を促進した。細胞の混合物を遠心分離によって沈殿させ、ＲＰＭＩで穏やかに洗浄し、次いで、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞を、２０％のＦＣＳ、標準のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）、２５％の脾臓馴化培地、２ｍＭのグルタミン酸ならびに１００ｕｇ／ｍｌのＰｅｎ−Ｓｔｒｉｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁させ、９６ウェルプレートに分注し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で８〜２０日間培養して、ＨＡＴ耐性ハイブリドーマクローンを確立させた。それぞれのハイブリドーマクローンからの馴化培地をＥＬＩＳＡスクリーニングに供した。
【０２０４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥＬＩＳＡスクリーニング
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、２組で調製したＮｕｎｃ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）を用いて行った。陽性試験プレートは、それぞれウェルにおいて１００ｎｇのＮ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質で終夜コーティングし、陰性対照プレートは１００ｎｇのヒトＦｃタンパク質でコーティングした。ハイブリドーマクローンからの馴化培地を、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質と結合するその能力についてスクリーニングした。１００マイクロリットルのそれぞれのハイブリドーマ上清をコーティングしたプレートに加え、室温で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＦｃ抗体を加えて、抗原と結合したｍＡｂを検出した。過剰のＨＲＰを、ＰＢＳＴを用いた３回の洗浄によって、それぞれの洗浄に２００μｌ／ウェルで洗い流した。その後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−［３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸］）溶液をＨＲＰ発色のための基質として加えた。反応を停止させ、プレートをプレートリーダーによって４０５ｎｍで走査した。陽性ウェルを、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質でコーティングしたプレートを用いて再度スクリーニングし、ヒトＦｃでコーティングしたプレートを用いて、上述と同じようにカウンタースクリーニングした。Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質のみと結合するがヒトＦｃとは結合しないハイブリドーマｍＡｂが真のＮｏｔｃｈ１結合抗体であり、これらを選択して機能的スクリーニングに進んだ。
【０２０５】
（実施例３）
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂの同定および特徴づけ
ルシフェラーゼレポーターアッセイ細胞系の確立
ルシフェラーゼレポーターアッセイを一般的に使用して、様々な設定におけるＮｏｔｃｈ１受容体媒介性シグナル伝達および転写活性を評価した（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３、Ｏｓｉｐｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００８、２７（３７）：５０１９〜５０３２）。リガンド誘導性のＮｏｔｃｈ１活性化およびｍＡｂ阻害をアッセイするために、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を増強させるためのツール細胞系を開発した。細胞内ドメインからなるＮｏｔｃｈ受容体の活性型が核へと転位置され、ＣＳＬ［ＣＢＦ１、Ｓｕ（Ｈ）およびＬＡＧ−１から命名］結合因子１と複合体を形成し、これが遺伝子プロモーター領域中のＣＳＬ結合モチーフと呼ばれるコア配列と結合して、下流の遺伝子転写を活性化させることは、十分に確立されている（Ｂｒａｙ、２００６）。これらの発見に基づいて、Ｎｏｔｃｈ１媒介性ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製した。手短に述べると、Ｔｕｎら（Ｔｕｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９４、２２（６）：９６５〜９７１）によって記載されている８個のＣＳＬ結合モチーフのコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）を、ｐＴＡ−Ｌｕｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）の複数のクローニング部位中に挿入した。ハイグロマイシン選択マーカー（次の段落を参照）をルシフェラーゼ遺伝子の下流に付加した。これにより、ルシフェラーゼレポータープラスミド、ＣＳＬｕｃが得られた。
【０２０６】
完全長Ｎｏｔｃｈ１発現構築体をＯｒｉＧｅｎｅ（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から入手し、配列決定によってＮＭ＿０１７６１７．２（ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）と同一であると確認された。ＳＶ４０プロモーターを有するハイグロマイシン選択マーカーをｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲ合成し、標準のＰＣＲ結合方法によってｐｃＤＮＡ５／ＲＦＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの成長ホルモン３’ポリＡシグナル伝達配列に接続した。完成したハイグロマイシンマーカーをＮｏｔｃｈ１発現プラスミドのＣｌａ Ｉ部位中に挿入した。このプラスミドをＮｏｔｃｈ１／Ｈｙｇと新たに命名した。Ｎｏｔｃｈ１活性を増強させるために、部位特異的突然変異誘発によってＰＥＤＴドメイン（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３ら）をＮｏｔｃｈ１／Ｈｙｇから欠失させた（Ｇｅｎｅｗｉｚ、ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）。生じたプラスミドをＮｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴと命名した。ヒトＪａｇｇｅｄ１ｃＤＮＡプラスミドをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から入手した。Ｊａｇｇｅｄ１コード領域をＰＣＲ合成し、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に挿入した。
【０２０７】
Ｎｏｔｃｈ１依存性アッセイ細胞系は、ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、Ｎｏｔｃｈ１／ｈｙｇおよびＣＳＬｕｃプラスミドをＵ２−ＯＳ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−９６、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）細胞内に同時形質移入することによって、またはＮｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴおよびＣＳＬｕｃを２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）細胞内に同時形質移入することによって作製した。安定に形質移入された細胞をＤＭＥＭ成長培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の２００〜８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンに対してクローン選択し、細胞クローンを実施例１に記載のようにウエスタンブロット分析によって、および以下のセクションに記載のルシフェラーゼレポーターアッセイによってスクリーニングした。比較的高いレベルのＮｏｔｃｈ１発現（ウエスタンブロットに基づく）およびデルタ様−４（Ｄｌｌ４）誘導性のルシフェラーゼ活性を有する細胞系を、機能的アッセイで使用するために選択した。２つのそのような細胞系の例は、Ｕ２−ＯＳ／Ｎｏｔｃｈ１−ＣＳＬｕｃ（ニックネームＮ１ＣＵ３）および２９３／Ｎｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴ−ＣＳＬｕｃ（ニックネームＮ１ｄＰ−ｃ１６）である。同様の手順によって、ヒトＪａｇｇｅｄ１を安定に発現する細胞系を親細胞系であるＨｅｌａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）から作製した。細胞系はＨｅｌａ／ＪＡＧ１として命名した。
【０２０８】
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ハイブリドーマクローンのルシフェラーゼレポーターアッセイおよび同定
Ｎｏｔｃｈ１阻害性ハイブリドーマクローンを同定するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてＮ１ＣＵ３細胞におけるＤｌｌ４誘導性のＮｏｔｃｈ１活性を評価した。９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５０〜１００ナノグラム（ｎｇ）の組換えＤｌｌ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）／ウェルでコーティングした。Ｎ１ＣＵ３細胞を、５０，０００個の細胞／ウェルで、Ｄｌｌ４またはＢＳＡでコーティングしたプレートに播種し、３０〜５０ｕｌのハイブリドーマクローンからの馴化培地を同時に加え、２４〜４０時間培養した。培養の終了後、すべての培地を除去した後に細胞を１×Ｐａｓｓｉｖｅ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）で直接溶解し、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを用いて製造者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）に従って、およびＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ Ｐｌｕｓ ＬＢ９６Ｖルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツＢａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ）を用いて、ルシフェラーゼレポーター活性をアッセイした。Ｄｌｌ４誘導性のＮｏｔｃｈレポーター活性に対する統計的に有意な阻害を有するハイブリドーマ上清を、タンパク質Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）による、製造者のプロトコルに従った親和性精製に供した。精製したｍＡｂをルシフェラーゼレポーターアッセイによってさらに分析し、Ｎｏｔｃｈ１依存性シグナル伝達に対する阻害機能が再度確認された。
【０２０９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイによる抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂの特徴づけ
Ｎｏｔｃｈ１媒介性シグナル伝達を阻害するｍＡｂのうち、１つのｍＡｂ（Ｎ２４８Ａ）が最も強力な阻害活性を示し、これは、いくつかの異なるルシフェラーゼレポーターアッセイによって詳細に特徴づけられた。図３は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘導するためにＤｌｌ４を培養プレートの表面上にコーティングした際に、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが、Ｄｌｌ４リガンド誘導性のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の阻害において、コンパニオンｍＡｂであるｍＡｂ−Ｃよりもはるかに高い効力を有していたことを示す。２９３／Ｎｏｔｃｈ１−ｄＰＥＳＴ−ＣＳＬｕｃ細胞をこのアッセイで使用した。Ｙ軸の数値はルシフェラーゼレポーター活性の読取り値である。
【０２１０】
ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが他のＮｏｔｃｈリガンド誘導性のシグナル伝達を阻害することができるかどうかを評価するために、Ｈｅｌａ／Ｊａｇｇｅｄ１細胞およびＮ１ｄＰ−ｃ１６細胞を同時培養し、上述のルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは実際にＪａｇｇｅｄ１誘導性のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を完全に阻害した（図４）。
【０２１１】
（実施例４）
抗体の結合親和性の決定
Ｎｏｔｃｈ１抗原に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの物理的結合親和性は、研究グレードのセンサーチップ（チップ型：ＣＭ５）を備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器上で、ＨＢＳＰランニング緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ、現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）＋１ｍＭのＣａＣｌ２を用いて測定した。標準のＮ−ヒドロキシスクシンイミド／エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）化学を用いて、タンパク質Ａを飽和レベルでチップ上にアミンカップリングさせた。３つすべてのフローセルにおいて、４０、１３、４ｕｇ／ｍｌで、Ｎ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）Ｆｃタンパク質（実施例１に記載）をタンパク質Ａによってチップ表面に捕捉させた。抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ Ｎ２４８Ａを３倍系列で希釈し、１分間１００μｌ／分で注入した。解離を２０分間監視した。１００ｍＭのリン酸で２回の３０秒間パルスを用いて、それぞれの滴定の最後の注入の後にチップを再生した。緩衝液サイクルによりデータの二重参照のためのブランクが提供され、その後、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．４．１を用いてこれを単純な結合モデルに大域的に当てはめた。親和性は動力学速度定数の商から推定した（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。データは、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡがＫｏｎ＝５．１９ｅ−５（Ｍｓ）、Ｋｏｆｆ＜１．７ｅ−４（１／ｓ）およびＫＤ＜０．３３ｎＭを有することを示している。密なＫＤは速いＫｏｎおよび非常に遅いＫｏｆｆの両方によって寄与され、これは、本発明者らのアッセイによって解明されたものよりも遅い（５％ルール、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００のマニュアルを参照）。
【０２１２】
（実施例５）
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂ結合エピトープの分析
ヒトＮｏｔｃｈ２とのドメインスワップによるｍＡｂ結合エピトープのマッピング
Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂによる作用機構を理解するために、Ｎｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂの結合エピトープをドメインスワップおよびＥＬＩＳＡ結合アッセイによって分析した。Ｎｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃタンパク質を６つのドメイン、すなわち、ＥＧＦ（ＥＧＦ３５〜３６が含まれる）、Ｌｉｎ１２−Ａ（またはＬｉｎ−Ａ）、Ｌｉｎ−Ｂ、Ｌｉｎ−Ｃ、ヘテロ二量体化ドメイン−Ｎ（またはＨＤ−Ｎ）およびＨＤ−Ｃ（図５）に分割した。ドメインのそれぞれを、ＰＣＲ合成によって、一連のキメラＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃ発現構築体において、ヒトＮｏｔｃｈ２に対応するものでスワップした。実施例１に上述したように、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてドメインスワッププラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）中に形質移入させた。３日間培養した後、馴化培地をウエスタンブロット分析およびＮｏｔｃｈ１ｍＡｂによるＥＬＩＳＡ結合アッセイに供した。ウエスタンブロット（方法は実施例１と同様）により、６個のうちの５個のドメインスワップ構築体が良好に発現されたが、Ｌｉｎ−Ｂ／Ｎｏｔｃｈ２のスワップは発現が少なかったことが示された。
【０２１３】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、１００マイクロリットルの上記抗原プラスミドで形質移入した細胞培養物からの馴化培地を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに載せ、プレートを室温で４時間または４℃で終夜インキュベーションした。その後、条件培地をコーティングしたプレートから除去した。一次抗体の結合には、１００マイクロリットルのＰＢＳ中の３００ｎｇのそれぞれのｍＡｂ（表３）をコーティングしたウェルに加えた。ＥＬＩＳＡ手順の残りは、実施例２に記載のものと同じである。ｍＡｂ Ｎ９９ａ、Ｎ３２６ＡおよびＮ４４０Ａは、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａと同じ手順によって作製および単離した、Ｎｏｔｃｈ−１と結合するモノクローナル抗体であった。表３に示すように、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａとキメラ抗原との結合は、Ｌｉｎ−ＡまたはＨＤ−Ｃドメインを対応するＮｏｔｃｈ２ドメインでスワップした場合に完全に消滅した。他方で、ＥＧＦ、Ｌｉｎ−ＣまたはＨＤ−Ｃドメインのスワップはその結合に影響を与えなかった。ｍＡｂ Ｎ３２６ＡおよびＮ４４０Ａは、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａとは明確に異なっていた。これら２つのｍＡｂは、その結合活性にＨＤ−ＮおよびＨＤ−Ｃドメインを必要とする。Ｎ９９Ａは、その結合にＬｉｎ−ＡおよびＨＤ−Ｃドメインが必要であるという点で、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａとやや似ている。しかし、ＨＤ−ＮドメインのスワップはＮ９９Ａの結合活性も低下させた。これらのデータは、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが少なくとも２つの区別可能な結合エピトープの組を、１つはＬｉｎ−Ａドメイン中、他方はＨＤ−Ｃドメイン中に有するという結論を支持していしていた。Ｌｉｎ−Ｂドメイン中に別のエピトープが存在するかどうかは、別の実験で解明した。同様に、他の３つのすべてのＮｏｔｃｈ１拮抗性ｍＡｂは、２つの識別可能な結合エピトープの組を、一方はＨＤ−Ｃドメイン中、他方はＮｏｔｃｈ１Ｎ末端サブユニットのドメイン中に有する。最近公開されたＮｏｔｃｈ１（Ｇｏｒｄｏｎ，ＷＲら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、第１１３巻、４３８１〜４３９０）およびＮｏｔｃｈ２（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、第１４巻、２９５〜３００）のＮＲＲ領域の結晶構造に基づいて、３つのＬｉｎ１２ドメインはＨＤドメインの周りに巻きついており、ＡＤＡＭプロテアーゼによるランダム切断および活性化を遮断しており、したがって、受容体を不活性またはサイレントな状態に維持する。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは２つの明確に異なるエピトープの組でＮｏｔｃｈ１と結合し、それにより、Ｎｏｔｃｈ１がサイレントコンホメーションに固定され、したがって、受容体がそのリガンドによって活性化されることが妨げられる。
【０２１４】
ほとんどが点突然変異であり、一部が小さな欠失および挿入であるＮｏｔｃｈ１遺伝子突然変異が、Ｔ−ＡＬＬの５０％を超えるもので報告されている（Ｗｅｎｇ，Ａ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４、９２６５〜９２７３、Ｍａｌｅｃｋｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００６、２６（１２）：４６４２〜４６５１）。突然変異は、２つの領域、すなわち、一方は細胞内部分のＣ末端中、他方はＨＤ−Ｎドメイン中にクラスタリングされている。これらの発見は、ＨＤ−ＮドメインスワップはｍＡｂ Ｎ２４８ＡとＮｏｔｃｈ１との結合に影響を与えなかった一方で、他の３つの結合には影響が与えられたことから、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが、Ｔ−ＡＬＬにおいて表３に記載した他の３つのｍＡｂよりも良好な治療的有用性を有するであろうという考えを支持する（表３を参照）。
【０２１５】
【表３】
【０２１６】
Ｎ２４８ＡはヒトＮｏｔｃｈ１と結合するが、マウスＮｏｔｃｈ１とは結合しない
Ｎ２４８Ａ１の結合エピトープを位置決定するために、本発明者らは、ヌクレオチド１〜９９およびヌクレオチド４３２７〜５１６９のマウスＮｏｔｃｈ１ｃＤＮＡコード領域（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００８７１４）を含有するマウスＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ発現プラスミドを作製し、一過性の形質移入およびＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った（方法は実施例１および５の前のセクションに記載）。結果により、Ｎ２４８Ａ１はマウスＮｏｔｃｈ１と結合せず、ヒトＮｏｔｃｈ１のみと結合することが示された（表４）。本発明者らは、ヒトＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ配列（ヌクレオチド１〜１２９および４３３８〜５２０２、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１７６１７）をフレームワークとして使用し、ヒトＬｉｎ−Ａ、Ｌｉｎ−ＢまたはＨＤ−Ｃドメインを対応するマウスドメインで系統的に交換して、ドメインスワップキメラＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ発現構築体をさらに作製した。このヒト／マウスドメインスワップタンパク質をベイトとして使用したＥＬＩＳＡ結合アッセイにより、Ｌｉｎ−Ａドメインをマウス配列に交換した場合にＮ２４８Ａ１とヒトＮｏｔｃｈ１抗原との結合が消滅するが、Ｌｉｎ−ＢまたはＨＤ−Ｃドメインの交換は結合に影響を与えなかったことが実証された。対照的に、他の対照ｍＡｂ、２２Ｆ７は、Ｌｉｎ−Ｂをマウス配列に交換した場合にのみ結合を失う。したがって、Ｎ２４８Ａ１がヒトＮｏｔｃｈ１のみと結合し、マウスとは結合しないかどうかを決定する結合エピトープは、Ｌｉｎ−Ａドメイン中に位置する。
【０２１７】
【表４】
【０２１８】
Ｌｉｎ−Ａドメイン中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープの同定
Ｌｉｎ−Ａドメイン中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープを同定するために、本発明者らは、ヒトおよびマウスのＬｉｎ−Ａドメインの間で異なる２個のアミノ酸を突然変異した、すなわち、１４５７Ｅ／Ａおよび１４６５Ｓ／Ｎ（表５）。ＥＬＩＳＡの結果により、突然変異１４５７Ｅ／Ａは結合に影響を与えなかったが、突然変異１４６５Ｓ／Ｎは結合を消滅させることが示され、マウスＬｉｎ−Ａ中のアミノ酸Ａｓｎ（Ｎ）がＮ２４８Ａ１とマウスＮｏｔｃｈ１との結合の遮断を担っている唯一のアミノ酸残基であることが示された。１４６５Ｓの周辺のいくつかのアミノ酸を、順次アラニンへと突然変異させた（表５）。１４６３Ｖ／Ａ、１４６６Ｌ／Ａまたは１４６７Ｑ／Ａの突然変異もＮ２４８Ａ１結合を消滅させた。しかし、対照ｍＡｂ Ａ２は突然変異１４６３Ｖ／Ａまたは１４６５Ｓ／Ｎによって影響を受けなかった（表５）。これらの実験により、Ｌｉｎ−Ａ中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープが１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑを含むことが実証された。
【０２１９】
【表５】
【０２２０】
ＨＤ−Ｃドメイン中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープの同定
Ｎｏｔｃｈ１配列からのアミノ酸のクラスターをＮｏｔｃｈ２配列へと順次スワップすることによって、一連の５つのサブドメインスワップキメラ抗原を作製した（表６）。ＥＬＩＳＡの結果により、サブドメインスワップ−１はＮ２４８Ａ１結合を有意に低下させた一方で、他の４つのサブドメインスワップ抗原はＮ２４８Ａ１結合に影響を与えないことが示された。他方で、並行対照ｍＡｂ １９Ｈ７は、サブドメインスワップ１、３および５に対して有意な結合親和性の低下を示した（表６）。すべてのサブドメインスワップ抗原の馴化培地中での発現および分泌は、ウエスタンブロット分析によって確認した（方法は上記）。サブドメインスワップ５以外のすべてのサブドメインスワップ抗原は、ヒトＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲＨＤ（ｈｕＮ１−ＮＲＲＨＤ）タンパク質以上の発現を有する。サブドメインスワップ５は、ウエスタンブロットバンドの強度の比較に基づいてｈｕＮ１−ＮＲＲＨＤの約５０％のレベルで発現された（データ示さず）。これらの実験により、表６中に強調表示するように、ＨＤ−Ｃ中のＮ２４８Ａ１の結合エピトープには５個のアミノ酸、１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌ（ヒトＮｏｔｃｈ１をコードしているｃＤＮＡ配列、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１７６１７）が含まれることが示された。
【０２２１】
【表６】
【０２２２】
（実施例６）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂは細胞培養物中の癌細胞の成長を阻害する
ｍＡｂ Ｎ２４８Ａによる、ＨＰＢ−ＡＬＬ白血病細胞の成長の阻害およびＮＩＣＤの低下
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞系、ＨＰＢ−ＡＬＬは、幼児期Ｔ−ＡＬＬから誘導され（Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９７８、２１（２）：１６６〜７０）、ＤＳＭＺ（ドイツＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）から入手した。この細胞系は、増強されたガンマセクレターゼ切断の結果、高レベルの、Ｎｏｔｃｈ１の活性型であるＮｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をもたらすＮｏｔｃｈ１突然変異を保有する。成長阻害アッセイには、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を、９６ウェルプレートに、１０，０００個の細胞／ウェルで、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で播種した。連続希釈したｍＡｂ Ｎ２４８ＡまたはＤ１６Ａを最初に加え、細胞を３７℃で７日間培養した。培養の終了後、０．１ｍｇ／ｍｌのリザズリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を細胞に加え、プレートを３７℃で４時間インキュベーションした。蛍光シグナルを、二重フィルターを介して励起＝５６０ｎｍおよび発光＝５９０ｎｍを用いて読み取った。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）においてＳ字形用量応答（変動勾配）を用いて計算した。
【０２２３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＩＣＤ分析には、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を６ウェルプレートに２×１０６個の細胞／ウェルで播種し、１０％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａまたは対照抗体Ｄ１６Ａを、図６中に示す可変濃度で培養物に加えた。細胞を、抗体の存在下、３７℃で２４時間培養した。その後、これらを収集し、冷１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）に溶解した。１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離することによって、タンパク質を細胞溶解液から抽出した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いてタンパク質濃度を決定した。それぞれの試料中のＮＩＣＤのレベルはウエスタンブロット分析によって決定した。
【０２２４】
それぞれのウエスタンブロット分析において、約５０μｇの溶解物をポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）による電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に移し、ウサギ抗ＮＩＣＤ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）およびマウスαアクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いた免疫ブロット分析に供した。ＩＲＤｙｅ６８０または８００とコンジュゲートさせた二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州Ｌｉｎｃｏｌｎ）を使用してウエスタンブロットバンドを可視化した。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州Ｌｉｎｃｏｌｎ）を用いて画像を分析した。
【０２２５】
結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞成長の阻害がＮＩＣＤレベルの低下と相関していることが実証された。２４時間の処置で、ｍＡｂ Ｎ２４８ＡはＮＩＣＤレベルを用量依存的に低下させ、最大の低下は３０μｇ／ｍＬで観察された。７日間の処置の後、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは細胞成長の有意な阻害を引き起こした。細胞成長阻害のＩＣ５０値は約０．７８μｇ／ｍｌまたは約５．２ｎＭである。
【０２２６】
乳癌細胞増殖の阻害
Ｎｏｔｃｈ１の発現が乳癌において異常に増加しており（Ｒｅｅｄｉｊｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、６５（１８）：８５３０〜８５３７、Ｋｌｉｎａｋｉｓら、２００６、Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、２００７、６（４）：４１８〜４２９）、これは低い生存率に関連する（Ｒｅｅｄｉｊｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、６５（１８）：８５３０〜８５３７）ことが十分に文書で示されている。乳腺組織中で活性型のＮｏｔｃｈ１を発現するトランスジェニックマウスでは、ほぼすべてのマウスが１年で乳癌を発生した（Ｈｕら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６、１６８（３）：９７３〜９９０）。Ｎｏｔｃｈ１媒介性シグナル伝達を阻害することで乳癌細胞の増殖が遮断されるという仮説を試験するために、いくつかの乳癌細胞系を、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ Ｎ２４８Ａ抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）または対照マウス免疫グロブリンＧ（ｍＩｇＧ）の存在下で培養した。すべての細胞を、１％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２〜３日間培養した。生細胞をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量し、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ Ｐｌｕｓ ＬＢ９６Ｖルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツＢａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ）によって走査した。同じパネルの乳癌細胞において、細胞表面上のＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１の発現をＦＡＣＳによって分析した。結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａによる乳癌細胞の増殖阻害がＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１の発現レベルにおおまかに相関していることが実証された。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａは、比較的高いレベルのＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して最も強い阻害を発揮する。興味深いことに、ＢＴ４７５細胞由来のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性細胞系、ＢＴ４７５ＨＲは、親ＢＴ４７５細胞系と比較して増加したＮｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ１の発現を示した。ｍＡｂ Ｎ２４８ＡはＢＴ４７５ＨＲの細胞増殖を阻害した一方で、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは阻害しなかった。データにより、Ｎｏｔｃｈ１の発現が増加した、または現在の薬物であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎに対する耐性を有するｍＡｂ Ｎ２４８Ａの、乳癌の治療処置における潜在的な有用性が示された。
【０２２７】
表７．抗Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａの腫瘍細胞増殖阻害アッセイ。発現指数は、乳癌細胞を抗Ｎｏｔｃｈ１または抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体で免疫染色した後の、ＦＡＣＳの倍率増加の相乗平均を表す。相対的細胞増殖指数は、薬剤を加えずに並行で培養した対照細胞のパーセンテージを表す。ＢＴ−４７４ＨＲは、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ）から誘導したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性細胞系である。
【０２２８】
【表７】
【０２２９】
Ｎ２４８Ａによる乳癌細胞の増殖阻害がＮｏｔｃｈシグナル伝達の遮断によって媒介されることを確認するために、２つの周知のＮｏｔｃｈの下流の標的遺伝子の発現を定量的逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）によって評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＮ２４８Ａまたは対照ｍＡｂの存在下で２日間培養し、その後、収集し、ＲＮＡｅａｓｙ試薬キットおよびプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａが実際にＨＥＳ１およびＨＥＳ４の発現を遮断したことが実証され（図７）、Ｎ２４８Ａによる作用機構が確認された。
【０２３０】
（実施例７）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂはマウス異種移植腫瘍モデルにおいてＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を阻害する
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂによるＴ−ＡＬＬ腫瘍成長の阻害
マウスモデルＴ−ＡＬＬ異種移植モデルを確立するために、免疫力が低下した無胸腺症の雌のヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（平均は２０グラム、６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）から入手し、国際実験動物管理公認協会（ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の指針に従って、特定病原体除去の状態で飼育した。動物には、無菌のげっ歯類飼料および水を自由に与えた。すべてのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、承認された施設の実験動物の飼育および使用のプロトコルの下で実施した。
【０２３１】
ＨＢＰ−ＡＬＬ細胞は、宿主マウス中に移植する前に新鮮な培養物から収集し、１回洗浄し、無菌の無血清培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液を適切な密度に調整し、腫瘍取り込みを促進するために５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を添加した。２００μＬ中の合計５〜１０×１０６個の細胞をマウスの後側腹部の領域内に皮下移植し、指定した大きさまで成長させた後、それぞれの実験のために抗体を投与した。
【０２３２】
抗腫瘍有効性研究には、１５０〜３００ｍｍ３の大きさのＨＰＢ−Ａｌｌ腫瘍を保有する動物をランダム化し、Ｎ２４８Ａをそれぞれ１ｍｇ、３ｍｇおよび１０ｍｇ／キログラム（ｋｇ）で投与されるか、または対照抗体Ｄ１６Ａを５ｍｇ／ｋｇで投与される、４つの群に分けた。ｍＡｂを週に１回、２週間の間皮下注射した。動物の体重および腫瘍の測定値を２〜３日毎に得た。腫瘍体積（ｍｍ３）は、ノギスで測定し、式：長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．４を用いて計算した。研究の最終日における薬物で処置したおよびビヒクルで処置したマウスの腫瘍体積を使用して、パーセント（％）阻害値を１００−｛１−［（処置最終日−処置１日目）／（対照最終日−対照１日目）］｝として計算した。すべての腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）実験において、８〜１０匹のマウス／用量群を使用した。スチューデントｔ検定を使用してＰを決定した。
【０２３３】
図８中に示すように、Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａは、このモデルにおいて、１１日間の処置、すなわち２回の週に１回の用量の後に、強力な抗腫瘍活性を実証した。１０ｍｇ／ｋｇ群対対照ｍＡｂ群における平均腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は７７％を超えており、これは統計的観点から非常に有意である（Ｐ＜０．０１）。ＴＧＩは粗く用量依存性であったが、例外として、２つのより低い用量群、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇは、区別するには近接しすぎていた。この観察の正確な原因は不明確であるが、このモデルの腫瘍の大きさの変動性が高いことが原因である可能性が高い。Ｎ２４８Ａは、ヒトＮｏｔｃｈ１に特異的な阻害剤として、どの処置群においても有意な重量損失、罹患率または死亡率を引き起こさずに、マウスにおいて良好に耐容された。
【０２３４】
マウスにおけるＮｏｔｃｈ１ｍＡｂの薬物動態学および薬力学（ＰＫ／ＰＤ）
ＰＫ／ＰＤ研究には、３００〜８００ｍｍ３の範囲の大きさの腫瘍を保有するマウスに、単一用量のＮ２４８Ａを５ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。Ｎ２４８Ａを投与した後、６、１６時間、および１、２、３、５日間の時点でマウスを安楽死させた。シリンジを用いて血液試料を左心室から採取し、ヘパリン硫酸でプライミングしたチューブに移した。その一方で、腫瘍を切除によって取り出し、スナップ凍結し、冷１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）中でホモジナイズした。タンパク質を腫瘍溶解物から抽出し、それぞれの腫瘍試料中のＮＩＣＤのレベルを、上述のウエスタンブロット分析を用いて決定した。血液試料を遠心分離に供して血清を血液細胞から分離した。Ｎ２４８Ａの血清レベルを、実施例２に記載のようにＥＬＩＳＡ方法によって評価した。最初に、ＥＬＩＳＡプレートを、Ｎｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＴＭ（−）／Ｆｃ抗原を捕捉するヒトＦｃに特異的なｍＡｂでコーティングした。立ち代って、Ｎｏｔｃｈ１抗原は血清中のＮｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａと結合する。
【０２３５】
ＰＫ曲線により、Ｎ２４８Ａ ｍＡｂはマウス血清中で注射の２４時間後に最大濃度（約２３５ｎＭ）に達成したことが示された。推定される半減期は約４．５日間である（図９）。Ｎｏｔｃｈ１活性化の直接マーカー（すなわちＮＩＣＤ）の評価により、Ｎ２４８Ａで処置したマウスから収集した腫瘍試料が強力なＮＩＣＤの低下を有しており、これは投薬の５日後まで持続したことが示された（図１０）。対照的に、対照ｍＡｂ、Ｄ１６ＡはＮＩＣＤレベルを低下させなかった（データ示さず）。５ｍｇ／ｋｇのＮ２４８ＡのＮＩＣＤの最大阻害は約８０％であった。
【０２３６】
（実施例８）
Ｎｏｔｃｈ１ｍＡｂ、Ｎ２４８Ａのクローニングおよび配列
ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの可変領域の配列を決定した。抗体ＩｇＧサブタイプを、Ｉｓｏｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を用いて最初に評価した。結果により、Ｎ２４８ＡがＩｇＧ１重鎖およびラムダ軽鎖を有することが示された。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａのクローニングおよび配列決定には、１×１０６個のハイブリドーマ細胞を収集し、溶解して、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ試薬キットおよび製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を用いて全細胞性ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ鋳型上で合成した。軽鎖および重鎖の可変領域のｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、第１鎖ｃＤＮＡから、マウスラムダ鎖コード配列の５’末端に相補的な縮重順方向プライマーおよび可変領域の３’末端に隣接する定常領域に一致する逆方向プライマーを用いて、またはマウスＩｇＧ１重鎖コード配列の５’末端に相補的な縮重順方向プライマーおよび対応するＩｇＧ１定常領域逆方向プライマーを用いて、増幅した。ＰＣＲサイクリング条件は、９６℃で１分間を１サイクル、次いで、９５℃で２０秒間、５０℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間を４０サイクルであった。生じたＰＣＲ産物をｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、従来の方法によって配列決定、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅソフトウェア（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分析した。クローニングした抗体の配列は、質量分析によって決定される、精製したハイブリドーマに由来する抗体から得られたＮ末端配列との直接比較によって確認した（カリフォルニア大学Ｄａｖｉｓ、分子構造学施設（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ））。コンパイルした配列の結果により、ｍＡｂ Ｎ２４８Ａ重鎖の可変領域は１２１個のアミノ酸残基を含有し、軽鎖は１０９個のアミノ酸残基を含有することが実証された。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いたＮ２４８Ａ ｍＡｂのＶＨ配列およびＶＬ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の描写がもたらされた。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、図１５中に配列１５〜２０として示す（配列番号１５〜２０）。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、図１４中に配列９〜１４として示す（配列番号９〜１４）。ｍＡｂ Ｎ２４８Ａの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、図１３中に配列５〜８として示す（配列番号５〜８）。
【受託番号】
【０２３７】
ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２
ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１
ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６
ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８
ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２
ＡＴＣＣ ＢＴ−４７４
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、少なくとも第１のエピトープおよび第２のエピトープと結合し、第１のエピトープがヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎ−Ａドメイン内にあり、第２のエピトープがヒトＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメイン内にある、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
第１のエピトープおよび第２のエピトープの両方と結合し、前記抗体または抗原結合部分が結合する主要エピトープが第１のエピトープおよび第２のエピトープのみである、請求項１に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項３】
第１のエピトープが、１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑから選択される１〜４個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである、請求項２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項４】
第２のエピトープが、１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌから選択される１〜５個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである、請求項１、２および３のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項５】
第１のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換が、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する前記抗体または抗原結合部分の結合親和性の８０％を超える損失をもたらす、請求項３または請求項４に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項６】
ヒト化、ヒト、またはキメラである、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項７】
マウス抗体である、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項８】
１×１０−４Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項６に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項９】
（ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９に示すアミノ酸配列、または配列番号１９の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０に示すアミノ酸配列、または配列番号２０の１〜４個の残基が改変されているその変異体を有する、重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である、請求項９に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１１】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がいずれも改変されていない請求項９に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号１２に示すアミノ酸配列、または配列番号１２の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である、請求項１２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１４】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がいずれも改変されていない、請求項１２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１５】
（ｉ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲのそれぞれの１〜４個のアミノ残基が改変されていてもよい、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲの改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である、請求項１５に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１７】
前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲがいずれも改変されていない、請求項１５に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１８】
マウス抗体またはマウス抗体の抗原結合部分である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１９】
ヒト化、ヒト、またはキメラである、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２０】
１×１０−５Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２１】
２×１０−５Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２２】
１×１０−６Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２３】
２×１０−６Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２４】
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト完全長抗体である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項２５】
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト化抗体である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項２６】
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のキメラ抗体である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１から２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分を組換えにより産生する細胞系。
【請求項２９】
請求項１から２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分の重鎖または軽鎖のいずれかをコードしているオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
対象に、治療上有効な量の請求項１から２６のいずれかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、またはその医薬組成物を投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項３１】
癌の処置に使用するための、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、またはその医薬組成物。
【請求項１】
ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、少なくとも第１のエピトープおよび第２のエピトープと結合し、第１のエピトープがヒトＮｏｔｃｈ−１のＬｉｎ−Ａドメイン内にあり、第２のエピトープがヒトＮｏｔｃｈ−１のＨＤ−Ｃドメイン内にある、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
第１のエピトープおよび第２のエピトープの両方と結合し、前記抗体または抗原結合部分が結合する主要エピトープが第１のエピトープおよび第２のエピトープのみである、請求項１に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項３】
第１のエピトープが、１４６３Ｖ、１４６５Ｓ、１４６６Ｌおよび１４６７Ｑから選択される１〜４個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである、請求項２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項４】
第２のエピトープが、１７０５Ｇ、１７０６Ａ、１７０７Ｌ、１７０９Ｓおよび１７１０Ｌから選択される１〜５個のアミノ酸残基を含む主要エピトープである、請求項１、２および３のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項５】
第１のエピトープのアミノ酸残基のうちのいずれかの非保存的置換が、ヒトＮｏｔｃｈ−１に対する前記抗体または抗原結合部分の結合親和性の８０％を超える損失をもたらす、請求項３または請求項４に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項６】
ヒト化、ヒト、またはキメラである、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項７】
マウス抗体である、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項８】
１×１０−４Ｍ以下のＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項６に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項９】
（ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列、または配列番号１８の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９に示すアミノ酸配列、または配列番号１９の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０に示すアミノ酸配列、または配列番号２０の１〜４個の残基が改変されているその変異体を有する、重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である、請求項９に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１１】
重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がいずれも改変されていない請求項９に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号１２に示すアミノ酸配列、または配列番号１２の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３に示すアミノ酸配列、または配列番号１３の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号１４に示すアミノ酸配列、または配列番号１４の１〜４個の残基が改変されているその変異体を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である、請求項１２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１４】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がいずれも改変されていない、請求項１２に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１５】
（ｉ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲのそれぞれの１〜４個のアミノ残基が改変されていてもよい、ヒトＮｏｔｃｈ−１と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲの改変のうちのいずれかが、そのアミノ酸残基の保存的置換である、請求項１５に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１７】
前記軽鎖ＣＤＲおよび前記重鎖ＣＤＲがいずれも改変されていない、請求項１５に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１８】
マウス抗体またはマウス抗体の抗原結合部分である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１９】
ヒト化、ヒト、またはキメラである、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２０】
１×１０−５Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２１】
２×１０−５Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２２】
１×１０−６Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２３】
２×１０−６Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤでヒトＮｏｔｃｈ−１と結合する、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２４】
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト完全長抗体である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項２５】
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト化抗体である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項２６】
サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のキメラ抗体である、請求項８から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１から２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分を組換えにより産生する細胞系。
【請求項２９】
請求項１から２６のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分の重鎖または軽鎖のいずれかをコードしているオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
対象に、治療上有効な量の請求項１から２６のいずれかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、またはその医薬組成物を投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項３１】
癌の処置に使用するための、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、またはその医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５３０４８７（Ｐ２０１２−５３０４８７Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５６１６（Ｐ２０１２−５１５６１６）
【出願日】平成２２年６月１６日（２０１０．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５２７１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６５５０
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【出願人】（５０５１２９４１５）ライナット ニューロサイエンス コーポレイション (33)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１６日（２０１０．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５２７１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６５５０
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【出願人】（５０５１２９４１５）ライナット ニューロサイエンス コーポレイション (33)
【Ｆターム（参考）】
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