摂動膜結合性化合物
【課題】細胞形質膜の正常な構造が乱されている細胞に選択的に結合する化合物を提供する。
【解決手段】式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物
（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびに前記塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、ＲはＣ１〜Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキルを表し、ｎおよびｍは、各々独立して、０、１、２、３または４の整数を表し、Ｍは非存在であり、かつＤは放射性同位体に置換される部分であり、前記部分はヒドロキシル基、ニトロ基、またはハロゲン原子から選択される）。
【解決手段】式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物
（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびに前記塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、ＲはＣ１〜Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキルを表し、ｎおよびｍは、各々独立して、０、１、２、３または４の整数を表し、Ｍは非存在であり、かつＤは放射性同位体に置換される部分であり、前記部分はヒドロキシル基、ニトロ基、またはハロゲン原子から選択される）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、正常な形質膜組織化の摂動および改変を受けている細胞、すなわち、細胞死を実行中の細胞、アポトーシス細胞または活性化された血小板に選択的に結合する化合物に関する。本発明は、さらに、この化合物を、医療行為において、診断用および治療用目的のために利用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
無傷の真核細胞の形質膜（外膜）は、高度に組織化された構造を特徴とする。この高レベルの膜組織化は、とりわけ、この膜を構成する特定の脂質の分子構造；膜を構成する種々の脂質種の比率；この膜の外側と内側リーフレット間でのリン脂質の分布によって；および膜タンパク質構成要素によって決定される。
【０００３】
形質膜組織化を高レベルに維持することは、正常な細胞生理機能の基本であるが、実質的な細胞形質膜の正常な組織化の摂動および改変（ＰＮＯＭ）は、数多くの生理学的および病理学的条件において起こり、複数の疾患の特徴となっている。かかる改変および摂動は、形態学的レベル（アポトーシスを実行中の細胞で観察される膜泡）および分子レベルの両方において明白であり得る。ＰＮＯＭには、とりわけ、膜リン脂質の無秩序化（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）および再分布が含まれ、これは、アミノリン脂質、主にホスファチジルセリン（ＰＳ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（これらは、通常、膜二重層の内側リーフレットにほぼ完全に限定される）の細胞表面への移動、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）のこの膜の外側リーフレットから内側リーフレットへの相互移動を伴う。この再分布を、本明細書では、細胞膜脂質の非対称性（ＣＭＬＡ）の喪失という。ＣＭＬＡ喪失に加え、ＰＮＯＭはまた、多くの場合、膜リン脂質パッキングレベルの低下および膜流動性の増大と関連している。
【０００４】
このような改変は、細胞表面を、いくつかの凝固因子複合体、例えば、テナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）およびプロトロンビナーゼタンパク質複合体などの会合のための触媒的基盤とするのに重要な役割を果たす。したがって、血小板活性化は、ＰＮＯＭ中の血小板膜と関連しており、これらの改変は、正常な血液凝固において、ならびに数多くの障害での異常な過剰血液凝固の起始および／または伝播において重要な要因を構成する。このような障害としては、とりわけ、動脈または静脈の血栓症または血栓塞栓症［例えば、脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病など］、不安定なアテローム性プラーク、鎌状赤血球症、βサラセミア、抗リン脂質抗体症候群［とりわけ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）において］、および膜微粒子の流出と関連する障害、例えば、心肺バイパスと関連する神経機能障害が挙げられる。
【０００５】
アポトーシスは、細胞膜の改変／摂動が起こっている別の主な状況である。アポトーシスは、細胞の自己崩壊すなわち「自殺」という固有のプログラムであり、どの真核細胞にも生来備わっている。刺激の誘発に応答し、細胞は、細胞収縮、細胞膜泡、クロマチンの凝縮および断片化、細胞の膜結合粒子のクラスター（アポトーシス体）への変換への終結という事象の高度に特徴的なカスケードを起こし、その後マクロファージに囲まれる。ＰＮＯＭは、アポトーシスの普遍的な現象であり、アポトーシスカスケードの初期（おそらく、細胞が死亡過程を遂行する時点）で起こり、また、マクロファージによるアポトーシス細胞の認識および除去における重要な要因であることが示されている。
【０００６】
最近、ＰＮＯＭとアポトーシス細胞の強力な凝血促進活性との間に強い相関性が導かれた。アポトーシス内皮細胞におけるＰＮＯＭ（例えば、アテローム性プラークにおいて起こるものなど）は、おそらく、血栓症の血管障害の病原において重要な役割を果たしている。
【０００７】
アポトーシスまたは血栓症は、各々、大部分の内科的障害において重要な役割を有するため、これらの生物学的プロセスの検出および関連細胞の標的化のためのツールがあることが望ましい。また、ＰＮＯＭ膜への選択的な結合のための化合物（これは、潜在的に、後に、かかるＰＮＯＭ膜を有するこのような細胞（ＰＮＯＭ細胞）内への侵入を行なう）は、したがって、障害または死亡過程を実行中の細胞（特に、アポトーシスにより）、または活性化を受けている血小板を検出し、イメージング用の薬剤または薬物をこれらに標的化するための重要なツールとしての機能を果たし得る。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明の一つの態様において、形質膜の正常な組織化の摂動を受けている細胞（ＰＮＯＭ細胞）に選択的に結合し得るが、形質膜の正常な組織化を維持している細胞（これを、以下、「正常細胞」と定義する）には、より低程度で結合する化合物を提供する。ＰＮＯＭ細胞は、本発明の一つの実施形態において、死亡過程を実行中の細胞である。本発明の一つの実施形態ではこの細胞はアポトーシス細胞であり、別の実施形態では、この細胞は、活性化された血小板であり得る。本発明は、さらに、ＰＮＯＭ細胞に選択的に結合するこれらの化合物を使用することによりＰＮＯＭ細胞を検出する方法に関する。本発明の別の実施形態では、式Ｉ〜ＸＩＶに示す構造で表される化合物を提供する。
【０００９】
用語「摂動膜結合性化合物（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ＰＭＢＣ）は、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的化するが、正常細胞には、より低程度で結合する化合物をいう。本発明によれば、ＰＭＢＣのＰＮＯＭ細胞への結合は、正常細胞への結合よりも少なくとも３０％多いのがよい。
【００１０】
用語「選択的に標的化すること」は、本発明では、化合物のＰＮＯＭ細胞への選択的な結合、すなわち、正常細胞への結合よりも少なくとも３０％多い程度でのＰＮＯＭ細胞への結合をいう。
【００１１】
用語「診断用摂動膜結合性化合物」（診断用ＰＭＢＣ）は、ＰＮＯＭ細胞に選択的に標的化することができる化合物をいい、この化合物はマーカーを含むか、またはこれに連結されており、このマーカーは、当業者に知られた手段によって検出可能である。
【００１２】
用語「治療用摂動膜結合性化合物」（治療用ＰＭＢＣ）は、上記規定のＰＭＢＣであって、薬物を含む、疾患の治療に有用なものをいう。
用語「固相支持体」は、本発明の内容においては、固相マトリックス、不溶性マトリックスまたは不溶性支持体をいう。本発明による固相支持体は、種々の構造、例えば、マイクロ粒状物、マイクロフィルターまたはマイクロキャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒａ）の積層体に形成されたものであり得る。
【００１３】
ＰＭＢＣは、本発明の一つの実施形態において、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的化するための薬剤の調製に使用される。
一つの態様において、本発明は、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的とする化合物（すなわち、ＰＭＢＣ）であって、式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
に示す構造で表される化合物、または式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を提供する（式中、ＲおよびＲ’基の各々は、独立して、各存在において、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せから選択される；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；ｘおよびｚは、各々、独立して存在し、０、１または２の整数であり、ここで、ｘおよびｚは同じまたは異なり得る；ｙは、０、１または２の整数であり、ここでｙ＝２のとき、置換基Ｒ’は、各存在において同じであっても異なっていてもよい；およびＤは、診断に用いるマーカー、水素、ヒドロキシル、Ｆまたは薬物であり、ここで、診断に用いるマーカーは、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆ原子は１８Ｆまたは１９Ｆのいずれかであり得る）または放射標識された金属キレートから選択され、イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である。
【００１５】
薬物は、特定の疾患の予防、改善または治療に医薬として有用な薬剤であり得、例えば、限定されないが、アポトーシスの阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤、抗酸化剤、 Ｂｃｌ−２系の調節剤）；細胞死の活性剤（例えば、抗癌薬）；または血液凝固の調節剤（これは、抗凝血薬、抗血栓剤または血栓溶解剤であり得る）であり得る。かかる場合において、この薬物は、好ましくは、抗血小板剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）、または凝固因子の阻害剤（例えば、トロンビンの阻害剤または第Ｘａ因子のなど阻害剤）；または抗炎症薬または免疫調節剤薬から選択される。本発明の一つの実施形態において、抗癌薬を腫瘍に、薬物をアポトーシス（腫瘍内で自発的にまたは治療に応答してのいずれかで起こる）の病巣に標的化することにより、抗癌治療の改善のための方法を提供する。本発明の別の実施形態において、凝固が抑制、低減または停止されるように、抗凝血薬を血栓に標的化することにより血栓症を治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、Ｄは、固相支持体であり得る。
本発明の別の実施形態において、ＰＮＯＭを選択的に標的とし、式（ＩＩ）：
【００１７】
【化２】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；Ｄは、水素またはである。診断に用いるマーカーは、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆ原子は１８Ｆまたは１９Ｆのいずれかであり得る）または放射標識された金属キレートであり得る；イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩ）：
【００１９】
【化３】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ３は、ヒドロキシルまたはＦである；Ｒ４は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０直鎖または分枝鎖アルキルであり、ｋは、０、１、２、３、４および５から選択される整数である）。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＶ）：
【００２１】
【化４】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２００である。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、式（Ｖ）：
【００２３】
【化５】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｖ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、−Ｆおよび−ＯＨであり、ｒは、４、５、６、７、８、９、１０の整数を表す）。ｒが４であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０１である。ｒが５であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ−ＭＬ−１０である。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＶＩ）：
【００２５】
【化６】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、水素、−Ｆおよび−ＯＨから選択される）。Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０４である。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩ：
【００２７】
【化７】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択され、Ｒ４は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキルから選択され、ｐは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す）。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩＩ：
【００２９】
【化８】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択される）。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＸ）：
【００３１】
【化９】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＸ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、ならびにＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキルから選択される；ｑは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す；およびＹは蛍光用マーカーである）。本発明の一つの実施形態では、Ｙは、ダンシルアミド基およびフルオレセインから選択される。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、式（Ｘ）：
【００３３】
【化１０】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｘ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２０３である。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩ）：
【００３５】
【化１１】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す）。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩ）：
【００３７】
【化１２】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩＩ）：
【００３９】
【化１３】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、Ｒは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｍは、０、１、２、３または４の整数を表す；Ｄは診断に用いるマーカーであり、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆは１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）または放射標識された金属キレートであり得、イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＶ）：
【００４１】
【化１４】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００４２】
本発明の別の態様において、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る患者において、アポトーシスまたは血液凝固の病巣に薬物を標的化するための医薬組成物であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造による化合物を含み、この化合物が薬物を含むか、またはこれに連結されている医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明の一つの態様において、医薬として有用な化合物を細胞集団内にあるＰＮＯＭ細胞に選択的に標的化する方法であって、細胞集団を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す構造で表される化合物と接触させ、それにより、医薬として有用な化合物を細胞集団内のＰＮＯＭ細胞に選択的に標的化させることを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明の別の態様において、細胞集団内のＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）細胞集団を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す構造で表される化合物、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物と接触させること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、この細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００４５】
本発明の別の態様において、患者または動物におけるＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）患者または動物に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を投与すること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定するために、検査対象の患者または動物のイメージングを行なうことを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、この細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００４６】
本発明の別の態様において、薬物を、患者または動物の血餅内のアポトーシスの病巣または活性化された血小板（ｏｒ）の病巣に標的化するための医薬組成物であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造の化合物（この化合物は、薬物を含むか、またはこれに連結されている）を含む医薬組成物を提供する。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、検査対象の被験体の腫瘍内の死亡過程を実行中の細胞の検出方法であって、（ｉ）検査対象の被験体に、化合物またはこの化合物を含むコンジュゲートを投与すること、ここで、この化合物は、式（Ｉ）：
【００４８】
【化１５】
に示す構造で表される化合物、または式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物であり、式中、ＲおよびＲ’基の一方は水素であり、ＲおよびＲ’基の他方は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；ｘおよびｚは、各々、独立して存在し、０、１または２の整数であり、ここで、ｘおよびｚは同じまたは異なり得る；ｙは、０、１または２の整数であり、ここでｙ＝２のとき、置換基Ｒ’は、各存在において同じであっても異なっていてもよい；およびＤは、診断に用いるマーカーである。診断に用いるマーカーは、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆ原子は１８Ｆまたは１９Ｆのいずれかであり得る）または放射標識された金属キレートであり得、イメージング用マーカーは、蛍光標識、放射能標識、Ｘ線用マーカー、ＭＲＩ用マーカー、ＰＥＴスキャン用マーカーおよび酵素反応を行なうことができ、検出可能な色をもたらす標識を含む群から選択される；および（ｉｉ）患者の検査対象の腫瘍に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、腫瘍内の細胞に結合した化合物の有意な量は、これらの腫瘍細胞が死亡過程を実行中であることを示す方法を提供する。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、検査対象の被験体の腫瘍内の死亡過程を実行中の細胞の検出方法であって、（ｉ）検査対象の被験体に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造の化合物を投与すること、ここで、この化合物は、イメージング用マーカーまたは標識された金属キレートを含むか、またはこれに連結されている；および（ｉｉ）腫瘍内の細胞に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、腫瘍内の細胞に結合した化合物の有意な量の検出は、これらの腫瘍細胞が死亡過程を実行中であることを示す方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態において、抗癌薬を、アポトーシス細胞の病巣を有する腫瘍に標的化する方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す化合物であって、細胞傷害剤を含むか、または細胞傷害剤に連結されているかのいずれかであるこの化合物を投与し、それにより、薬物の腫瘍内の細胞死の病巣への標的化を達成する工程を含む方法を提供する。
【００５１】
別の実施形態において、抗凝血薬または線維素溶解薬の血餅への標的化方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す化合物であって、抗凝血薬または線維素溶解薬のいずれかを含むこの化合物を投与し、それにより、薬物の血餅への標的化を達成する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の化合物：ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフの作用機序のスキームを示す。
【図２Ａ】ＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２００の選択的な結合（Ａ）およびＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２０５の選択的な結合（Ｂ）を示す。
【図２Ｂ】ＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２００の選択的な結合（Ａ）およびＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２０５の選択的な結合（Ｂ）を示す。
【図３Ａ】蛍光顕微鏡検査を示し、アポトーシスを実行中の培養ＨｅＬ細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合（図３Ａ）を示す。同じフルオロフォアを有するがＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフを欠く、対照化合物のｎ−ブチル−ダンシルアミド（ＢＤＡ）は、この選択性を示さなかった（図３Ｂ）。
【図３Ｂ】蛍光顕微鏡検査を示し、アポトーシスを実行中の培養ＨｅＬ細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合（図３Ａ）を示す。同じフルオロフォアを有するがＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフを欠く、対照化合物のｎ−ブチル−ダンシルアミド（ＢＤＡ）は、この選択性を示さなかった（図３Ｂ）。
【図４Ａ】マウスにおいてインビボで化学療法により誘導された細胞死を実行中の細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合の蛍光顕微鏡検査を示す：（Ａ）。黒色腫細胞のアポトーシス；（Ｂ）。胃腸管の上皮細胞のアポトーシス
【図４Ｂ】マウスにおいてインビボで化学療法により誘導された細胞死を実行中の細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合の蛍光顕微鏡検査を示す：（Ａ）。黒色腫細胞のアポトーシス；（Ｂ）。胃腸管の上皮細胞のアポトーシス
【図５Ａ】トリチウム標識ＮＳＴ２００によって検出された、癌細胞死に対する化学療法の効果を示す。
【図５Ｂ】トリチウム標識ＮＳＴ２００によって検出された、癌細胞死に対する化学療法の効果を示す。
【図５Ｃ】トリチウム標識ＮＳＴ２００によって検出された、癌細胞死に対する化学療法の効果を示す。
【図６】化学療法で処置した結腸癌を有するマウスにおけるＮＳＴ ２００によるオートラジオグラフィーを示す。
【図７】化学療法の前後での癌腫瘍と他の身体器官における取込みの比率を示す表を示す。
【図８Ａ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の結腸癌内への取込み、およびこれに対する化学療法の効果を示す（図８Ａ）。図８Ｂは、結腸重量の変化を示す。
【図８Ｂ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の結腸癌内への取込み、およびこれに対する化学療法の効果を示す（図８Ａ）。図８Ｂは、結腸重量の変化を示す。
【図９Ａ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の脳内のアポトーシス死の領域への標的化を示すオートラジオグラフィー画像解析（Ａ）およびＨ＆Ｅ染色（Ｂ）を示す。
【図９Ｂ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の脳内のアポトーシス死の領域への標的化を示すオートラジオグラフィー画像解析（Ａ）およびＨ＆Ｅ染色（Ｂ）を示す。
【図１０Ａ】ラット虚血再潅流腎のトリチウム標識ＮＳＴ２００によるオートラジオグラフィーを示す；；（Ａ）障害腎臓；（Ｂ）無傷の腎臓。
【図１０Ｂ】ラット虚血再潅流腎のトリチウム標識ＮＳＴ２００によるオートラジオグラフィーを示す；；（Ａ）障害腎臓；（Ｂ）無傷の腎臓。
【図１１】放射線造影剤誘導性急性遠位腎尿細管壊死のラットモデルにおけるトリチウム標識ＮＳＴ２０５によるオートラジオグラフィーを示す；（Ａ）障害腎臓；（Ｂ）無傷の腎臓。
【図１２】図１２は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の脳および脊髄におけるオートラジオグラフィーによる３Ｈ−２００イメージングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な実施形態
本発明は、形質膜の正常な組織化の摂動を受けている細胞（ＰＮＯＭ細胞）に対して選択的な結合を行うことができるが、形質膜の正常な組織化を維持している細胞には、より低程度で結合する化合物に関する。ＰＮＯＭ細胞は、死亡過程を実行中の細胞、アポトーシス細胞および活性化された血小板から選択される。本発明は、さらに、ＰＮＯＭ細胞に選択的に結合する化合物を用いることによりＰＮＯＭ細胞を検出する方法に関する。
【００５４】
本発明の化合物は、ＰＮＯＭ細胞の選択的標的化において活性であるという利点を有するとともに、比較的低い分子量および潜在的に有利な薬物動態プロフィールを特色とする。
【００５５】
本発明の一つの実施形態では、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的とする化合物（すなわち、ＰＭＢＣ）であって、式（Ｉ）：
【００５６】
【化１６】
に示す構造で表される化合物、または式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を提供する（式中、ＲおよびＲ’基の各々は、独立して、各存在において、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せから選択される；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；ｘおよびｚは、各々、独立して存在し、０、１または２の整数であり、ここで、ｘおよびｚは同じまたは異なり得る；ｙは、０、１または２の整数であり、ここでｙ＝２のとき、置換基Ｒ’は、各存在において同じであっても異なっていてもよい；およびＤは、診断に用いるマーカーであり、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えばＦ（ここで、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）または標識された金属キレートである；イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。別の実施形態では、Ｄは、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００５７】
薬物は、ある特定の疾患の予防、改善または治療のための医薬として有用な薬剤であり得、例えば、限定されないが、アポトーシスの阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤、抗酸化剤、Ｂｃｌ−２系の調節剤）；細胞死の活性剤（例えば、抗癌薬）；または血液凝固の調節剤（抗凝血薬、抗血栓剤または血栓溶解剤であり得る）であり得る。かかる場合において、薬物は、好ましくは、抗血小板剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）、または凝固因子の阻害剤（例えば、トロンビンの阻害剤または第Ｘａ因子のなど阻害剤）；または抗炎症薬または免疫調節剤薬から選択される。本発明の一つの実施形態において、腫瘍細胞の死滅を達成するため、薬物を、目的の領域（例えば、腫瘍内のアポトーシスの病巣）に標的化する方法を提供する。本発明の別の実施形態において、凝固が抑制、低減または停止されるように、血栓領域に抗凝血薬または線維素溶解薬を標的化する方法を提供する。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、Ｄは固相支持体であり得る。
本発明の別の実施形態において、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的とする化合物であって、式（ＩＩ）：
【００５９】
【化１７】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；Ｄは、水素、またはイメージング用マーカー（例えば１８Ｆなど）または標識された金属キレートから選択される診断に用いるマーカーである；イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩ）：
【００６１】
【化１８】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ３は、ヒドロキシルまたはＦである；Ｒ４は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０直鎖または分枝鎖アルキルであり、ｋは、０、１、２、３、４および５から選択される整数である）。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＶ）：
【００６３】
【化１９】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２００である。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、式（Ｖ）：
【００６５】
【化２０】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｖ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、−Ｆおよび−ＯＨであり、ｒは、４、５、６、７、８、９、１０の整数を表す）。ｒが４であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０１である。ｒが５であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ−ＭＬ−１０である。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＶＩ）：
【００６７】
【化２１】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、水素、−Ｆおよび−ＯＨから選択される）。Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０４である。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩ：
【００６９】
【化２２】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択され、Ｒ４は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキルから選択され、ｐは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す）。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩＩ：
【００７１】
【化２３】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択される）。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＸ）：
【００７３】
【化２４】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＸ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、ならびにＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキルから選択される；ｑは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す；およびＹは蛍光用マーカーである）。本発明の一つの実施形態では、Ｙは、ダンシルアミド基およびフルオレセインから選択される。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、式（Ｘ）：
【００７５】
【化２５】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｘ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２０３である。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩ）：
【００７７】
【化２６】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｘ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す）。
【００７８】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩ）：
【００７９】
【化２７】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩＩ）：
【００８１】
【化２８】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、Ｒは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｍは、０、１、２、３または４の整数を表す；Ｄは、水素、または診断に用いるマーカーであり、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆは１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）または放射標識された金属キレートであり得、イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００８２】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＶ）：
【００８３】
【化２９】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶで表される化合物の各々は、診断に用いるマーカー、例えば、限定されないが、Ｔｃ、Ｔｃ＝Ｏ、Ｉｎ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｘｅ、Ｔｌ、ＲｅおよびＲｅ＝Ｏ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、Ｍｎ（ＩＩ）、１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎ、７５Ｂｒ、Ｔｃ−９９ｍまたはＩｎ−１１１などを含むものであってもよく、またはこれに連結されたものであってもよい。
【００８５】
本発明の別の態様において、細胞集団内のＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）細胞集団を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造のいずれか１つで表される化合物、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物と接触させること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、これがＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００８６】
用語「細胞に結合した化合物の有意な量」は、本発明によれば、正常細胞に結合した量よりも少なくとも３０％多い量でＰＮＯＭ細胞に結合する本発明の化合物（診断に用いるマーカーを含むか、またはこれに結合している）の量をいう。別の実施形態では、その量は５０％多いこともあり得る。本発明の別の実施形態では、その量は７５％多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は１５０％多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は約２倍多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は少なくとも２倍より多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は少なくとも５倍多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は少なくとも１０倍多いこともあり得る。
【００８７】
ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによる放射性核種イメージングにより、患者において死亡過程を実行中の細胞の画像を得るための本発明の化合物の使用に関する本発明の一つの実施形態において、ＰＮＯＭ細胞に結合した化合物の量対正常細胞に結合した量の比の計算は、死亡過程の負担を有する組織から得られたシグナルの大きさまたは強度を、このプロセスの負担のない器官から得られた大きさ／強度と比較することにより行ない得る。
【００８８】
本発明の別の態様により、患者または動物におけるＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）患者または動物に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物化合物（ここで、この化合物は、イメージング用マーカー、例えば１８Ｆなどを含む）、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を投与すること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定するために、検査対象のヒトまたは動物のイメージングを行なうことを含み、ここで、細胞に結合したこの化合物の有意な量は、これがＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００８９】
本発明の化合物の作用機序は、一般式ＸＶを有し、かつＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフ：
【００９０】
【化３０】
（式中、Ｒはアルキルを表す）
と示す、すべての化合物が共有するモジュールの活性を、少なくともある程度含む。本発明の一つの実施形態において、Ｒはブチルである。
【００９１】
ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフは、アポトーシス細胞の形質膜に見られる構造的改変（これにより、これらの膜は健常細胞の膜と識別される）に対応させるために設計されたものである。膜改変のこの複合には、
（ｉ） 膜リン脂質の無秩序化（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）（ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および負に帯電したホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面上に露出した状態で）。細胞表面上でのＰＳの露出により、負の表面電位がもたらされ、プロトンの吸引によって膜界面に大きな塊（ｂｕｌｋ）が形成される；
（ｉｉ）膜の外側リーフレット内におけるアミノリン脂質（ＰＥおよびＰＳ）の割合の増加の結果、膜の外側リーフレットの界面におけるプロトン電流（界面プロトン電流、ＩＰＣ）の増強がもたらされる。この増強は、ＰＥおよびＰＳが外膜リーフレット内のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｅｙｌｉｎ）（ＳＭ）と置き換わるにつれて、プロトン転移反応に関与しやすい官能基の数の実質的な増加によるものである。ＰＥは第一級アミンを含み、一方、ＰＳは第一級アミンとカルボキシル基を含む。対照的に、ＰＣおよびＳＭは、各々、永久的な正電荷を有する第四級アンモニウムを含み、したがって、プロトン転移反応には関与し得ない；
（ｉｉｉ）加えて、アポトーシス膜は、膜構成要素のパッキングレベルの低下および膜流動性の増加を特徴とする；
が含まれる。
【００９２】
ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフの作用の様式の非限定的な仮定において、これは、上記の特徴を特色とする膜、すなわち、アポトーシス細胞の形質膜に接近すると選択的に活性化されるスイッチ部分を含む（図１）。作用モチーフは、負に帯電したカルボキシレート基を２個有し（マロン酸アルキルのｐＫａは約５．６および２．８である）、したがって、ほとんどの場合、生理学的条件で形式電荷−２を有するため、生理学的ｐＨでは可溶性である。しかしながら、アポトーシス膜に接近すると、表面の酸性がより強いため、および界面環境の誘電率の低下（これは、カルボキシル基のｐＫａ値を上昇させる作用をする）のため、プロトンは、マロネート部分（ｍｏｅｉｔｙ）に捕捉されている。
【００９３】
マロネート基によるプロトンの捕捉により、負電荷の１つが中和され、したがってこの分子はより疎水性となる（全体的な電荷−１を有する）。さらにまた、プロトンの捕捉によって非常に特有の状況がさらにもたらされ、それには、以下のものが含まれる。
（ｉ）酸−アニオン対が形成され、このとき、例外的に、強い水素結合が、プロトン付加されたカルボキシル基とプロトン付加されていないカルボキシル基との間に形成される。この水素結合は強力であり、対称的で、共鳴および互変異性化（ｔａｕｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって安定化されている。
（ｉｉ）これは、４個のカルボキシル原子の上部に負電荷の分布をもたらす、すなわち、部分的に非局在化させる。
（ｉｉｉ）強酸−アニオン水素結合はこの分子を剛性化し、バルキーで剛性の平坦な６員環を生成する。これは、部分的に非局在化した負電荷を有し、カルボキシル二重（ｂｏｕｂｌｅ）結合の上部にπ電子雲を含む。かかる成分（ｅｌｅｍｅｎｔ）は、本発明の化合物の作用機序の非限定的な仮定によれば、膜界面への比較的有利な浸透を行ない得る。しかしながら、そのバルキーな剛性構造は、緩くパッキングされた膜（ｅｍｅｂｒａｎｅ）、すなわち、アポトーシス膜（ｍｅｍｅｂｒａｎｅ）に選択的に結合し、高度にパッキングされた膜（例えば、健常細胞の形質膜）への結合を排除するよう指令する。したがって、このような立体構造の特徴は、アポトーシス膜への結合における選択性を促進する。
【００９４】
アポトーシス細胞の膜界面に１個のプロトンが付加されたマロネートが選択的に浸透すると、これは、増強された界面プロトン電流に供されることになり、増強された界面の水素結合網目内に組み込まれることになる。この条件下では、マロネート部分が第２のプロトンを獲得する可能性は著しく増加する。これにより、さらに、電荷の中和および隣接するリン脂質分子とのさらなる酸−アニオン対の形成がもたらされる。総合すると、これらの事象は、アポトーシス膜の界面へのこの分子の結合を安定化するために作用する。
【００９５】
プロトン付加されたマロネート部分の膜界面内への浸透および界面におけるその結合の安定化により、アルキル鎖Ｒが膜界面を横断し、その最適な結合環境、すなわち膜炭化水素コアに達することが可能になり、その結果、疎水性（ｈｙｄｏｒｐｈｏｂｉｃ）相互作用によって、化合物の結合の自由エネルギーの獲得にさらに寄与する。
【００９６】
ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフは、炭化水素リンカーを介したイメージング用マーカーまたは治療用薬物（式ＩのＤ部分）との結合により、有用な診断用または治療用目的に利用されている［式Ｉまたは２の（ＣＨ２）ｍ］。このアプローチによるＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフは、標的化部分（ｍｏｅｉｔｙ）としての機能を果たし、自身に結合しているイメージング用マーカーまたは薬物を、細胞死、特に（ｐａｒｉｃｕｌａｒｌｙ）アポトーシスの負担を有する細胞および組織、または血小板活性化および血栓症の負担を有する組織に選択的に標的化することを可能にする。
【００９７】
図１は、ＮＳＴ２００（式ＩＶ）を示し、生理学的条件におけるＰＮＯＭ膜への接近および結合の３つの段階を表す：
Ａ：この化合物は水溶液中に存在し、したがって、両カルボキシル基は脱プロトン化されている、すなわち負に帯電しており、この化合物は高度に可溶性である。
Ｂ：負に帯電したアポトーシス膜に接近すると、この化合物はプロトンを獲得する。アニオン−酸二量体が形成され、したがって、安定な６員環の共鳴安定化した環が生成する。これは膜界面に浸透する。このバルキーな剛性環構造は、その立体構造の特徴が、充分パッキングされた健常細胞の形質膜に対する結合よりも、緩くパッキングされたアポトーシス細胞の形質膜に対する結合にとってより有利であるため、選択性を補助する。
Ｃ：この化合物は、アポトーシス膜の膜界面内に浸透すると、この膜の界面で見られるこの界面の水素結合網目および増大された界面プロトン電流に供されることになる。結果として生じるプロトン化および水素結合形成は、さらに、この化合物への界面への結合（矢印）を安定化するために作用する。かかる浸透は、アルキル鎖が膜内でのその最適な位置に達するのをさらに可能にし、したがって、膜炭化水素コアとの疎水性相互作用の形成により、結合エネルギーにさらに寄与する。
【００９８】
本発明の化合物は、医薬として有用な薬剤を、ＰＮＯＭ細胞を含む組織および器官に選択的に標的化するために、本発明の３種類の異なるアプローチで使用され得る。
（ｉ）以下、「検出アプローチ」と称する第１のアプローチによれば、選択的な結合は、イメージング用マーカーをＰＮＯＭ細胞に標的化するために利用され得る。これは、インビボ、エキソビボまたはインビトロのいずれかで、かかる細胞が現れる疾患（以下に説明する）の診断のために診療において使用される。
（ｉｉ）以下、「治療用アプローチ」と称する第２のアプローチによれば、選択的な結合特性は、ＰＮＯＭ細胞が現れた身体内の器官および組織、例えば、細胞死、血栓形成または炎症の領域に対する治療用薬剤の選択的標的化に使用される。
（ｉｉｉ）「クリアランスアプローチ」と称する本発明の第３のアプローチによれば、ＰＮＯＭ細胞に対する本発明の化合物の選択的な結合は、この化合物の固相支持体との結合を介して、体液（例えば、血液）を、その凝血促進性により潜在的に有害であり得るＰＮＯＭ細胞から浄化するために利用される。
【００９９】
検出アプローチに従い、本発明は、イメージング用マーカー含むか、またはこれに連結されたＰＭＢＣを有効成分として含む、インビトロ、エキソビボまたはインビボのいずれかでＰＮＯＭ細胞を検出するための組成物に関する。かかるＰＭＢＣを、以下、「診断用ＰＭＢＣ」と示す。診断用ＰＭＢＣは、アッセイした試料中に存在するＰＮＯＭ細胞に対して選択的な結合を行なうことができる。次いで、この結合を、当該技術分野で知られた任意の手段で確認し得る。本発明の診断用ＰＭＢＣは、ＰＮＯＭ細胞に対して選択的な様式でのマーカー標的化（ＰＭＢＣによる）を可能にする。次いで、検出可能な標識を、当該技術分野で知られた任意の様式で、特定の標識（例えば、蛍光、放射能の放出、または呈色、ＭＲＩ、Ｘ線など）の使用に従って検出し得る。一つの実施形態では、診断用ＰＭＢＣは、共有または非共有（例えば、静電）結合によって検出可能な標識に連結されている。
【０１００】
一つの実施形態において、検出可能な標識は、金属イオンのそれぞれの放射性同位元素、Ｔｃ、オキソＴｃ、Ｉｎ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｘｅ、ＴｌおよびＲｅ、オキソＲｅ、ならびに共有結合した原子のいずれか：１２３Ｉおよび１３１Ｉ（放射性同位体スキャン用、例えばＳＰＥＣＴなど）；Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）（ＭＲＩ用）；ならびに１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎおよび７５Ｂｒ（陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン用）であり得る。
【０１０１】
一つの実施形態において、本発明のＰＭＢＣは、ＰＥＴスキャンによるアポトーシスの臨床用イメージングを目的としたものであり、ＰＭＢＣは１８Ｆ原子を含む。
イメージング用マーカーとして使用されるある種の放射性同位体（例えば、１８Ｆ）は半減期が短いため、臨床用ＰＥＴイメージングの目的のためのかかるマーカーの結合は、患者への診断用化合物の投与直前に行うのがよい。したがって、患者への投与前に、１８Ｆなどの放射性同位体に置換される部分を含むＰＭＢＣ−ＰＥＴ前駆物質を合成することは有用であり得る。一つの実施形態では、１８Ｆと置き換わる部分は、ヒドロキシル基、ニトロ基またはハロゲン原子（例えば、臭素または塩素など）から選択される。かかるＰＭＢＣ前駆物質ＰＭＢＣ−ＰＥＴ前駆物質もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１０２】
ＰＭＢＣ（このの構造の任意のＰＭＢＣであり得る）をＰＥＴイメージング用１８Ｆで標識するための方法は、１８Ｆ原子をＰＭＢＣに結合する工程；それにより、ＰＭＢＣをＰＥＴイメージング用の１８Ｆで放射性標識する工程を含む。任意選択で、１８Ｆ原子を結合する工程の前に、ＰＭＢＣの官能基を適切な保護基で保護してもよい。この保護基は、その後、任意選択で、１８Ｆ原子の結合工程の後で除去する。
【０１０３】
マーカー金属原子の場合（例えば、それぞれＭＲＩまたはＳＰＥＣＴの場合でＧｄ、９９ｍＴｃまたはオキソ９９ｍＴｃ）、ＰＭＢＣは、金属キレート化剤を含む。キレート化剤の金属配位性原子は、窒素、硫黄または酸素原子であり得る。本発明の一つの実施形態において、キレート化剤は、ジアミンジチオール、モノアミンモノアミド−ビスチオール（ＭＡＭＡ）、トリアミド−モノチオールおよびモノアミン−ジアミド−モノチオールである。かかる場合において、金属原子との錯体形成前のキレート化剤と結合しているか、またはこれを含むＰＭＢＣであるＰＭＢＣキレート前駆物質、金属原子を含有する錯体は、ともに本発明の範囲に含まれる。
【０１０４】
蛍光検出のため、診断用ＰＭＢＣは、当該技術分野で知られた任意の蛍光プローブから選択される蛍光基を含み得る。かかるプローブの例は、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニルアミド（ダンシルアミド）、およびフルオレセインである。
【０１０５】
本発明の化合物は、ＰＮＯＭ細胞の形成を特徴とする多種多様な病状の検出および診断に使用され得る。ＰＮＯＭ細胞を特徴とする病状の例は、以下のとおりである。
過剰アポトーシスの発生を特徴とする疾患、例えば、変性障害、神経変性障害（例えば、パーキンソン疾患、アルツハイマー疾患、ハンティングトン舞踏病）、ＡＩＤＳ、ＡＬＳ、プリオン病、骨髄異形成症候群、虚血性または毒性傷害、移植片拒絶反応の際の移植片の細胞減損；腫瘍、および 特に高度に悪性／攻撃的な腫瘍などは、多くの場合、過剰組織増殖に加えてアポトーシスの増強もまた特徴とする。
【０１０６】
本発明の実施例３ならびに図２は、死亡過程を実行中の脳細胞の検出における本発明の化合物の性能を例示する。細胞死の誘因は、虚血／再潅流とした。障害を受けた脳半球は、反対側の非障害半球と比べ、著しく高いレベルのトリチウム標識ＮＳＴ２００取込みを示した。
【０１０７】
過剰血液凝固を示す疾患、これは、ＰＮＯＭが、血小板活性化の際、および／または他の細胞内事象の活性化またはこれに対する障害（例えば、内皮細胞）の際に存在する。このような疾患としては、とりわけ、動脈または静脈の血栓症、血栓塞栓症、例えば、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体 症候群、全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【０１０８】
炎症性障害および／または免疫媒介性の病因または病原と関連する疾患、自己免疫障害（例えば、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデスなど）、結合組織障害（例えば、慢性関節リウマチ、強皮症など）；甲状腺炎；皮膚障害（例えば、天疱瘡または結節性紅斑）；自己免疫性血液障害；自己免疫性神経障害（例えば、重症筋無力症）；多発性硬化症；炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎など）；脈管炎。
【０１０９】
アテローム性プラーク、特に、不安定で、裂開を受けやすく、また裂開する傾向があるプラークもまた、ＰＮＯＭ細胞（例えば、アポトーシスマクロファージ、アポトーシス平滑筋細胞、アポトーシス内皮細胞、および活性化された血小板）を特徴とする。かかる活性化された血小板は血栓において見られ、多くの場合、不安定なアテローム性プラークと会合している。
【０１１０】
また、検出は、それぞれの疾患を有することがすでにわかっている場合において、疾患の重篤度を評価する目的で、および疾患過程および／または種々の治療モダリティに対する応答をモニターするために行なわれ得る。かかるモニタリングの非限定的な例は、抗癌治療に対する応答の評価である。ほとんどの抗腫瘍治療（例えば、化学療法または放射線療法など）は、アポトーシスの誘導によってその効果を発揮し、腫瘍細胞の治療誘導性アポトーシスの診断用ＰＭＢによる検出は、抗腫瘍薬剤に対する腫瘍の感受性の程度を教唆し得る。これは、抗癌治療の施行時点と、その効力の適正な評価時点との間の遅延期間を実質的に短縮し得る。
【０１１１】
さらにまた、検出は、抗癌治療の有害効果をモニターするためにも使用され得る。かかる有害効果の大部分は、正常であるが敏感な細胞（例えば、胃腸管上皮または骨髄造血系ものなど）における不適当な治療に誘導されたアポトーシスによるものである。
【０１１２】
加えて、検出は、固有のアポトーシス負荷（多くの場合、腫瘍攻撃的性のレベルと相関する）の特性付けを目的としたものであり得、また、転移部内で頻繁に起こる固有のアポトーシスの検出により転移の検出を補助し得る。
【０１１３】
同様に、本発明の診断用ＰＭＢＣは、アポトーシスが移植片拒絶の際の細胞減損に主要な役割を果たしているため、器官移植後の移植片生着のモニタリングに有用であり得る。
加えて、検出は、細胞保護治療に対する応答のモニタリングを目的としたものであり得、したがって、細胞死の評価の目安となり得ることにより、種々の疾患における細胞減損を抑制することができる薬物（例えば、上記のもの）のスクリーニングおよび開発を補助する。
【０１１４】
また、検出は、かかるプラークの不安定化（裂開、血栓症および塞栓形成を受けやすくなり、また裂開する傾向になる）が、いくつかの型のＰＮＯＭ細胞（アポトーシス細胞（アポトーシス性マクロファージ、平滑筋細胞および内皮細胞）、ａｎｄ 活性化された血小板を含む）の関与を特徴とするため、アテローム性プラークの検出に有用であり得る。
【０１１５】
このアプローチによれば、本発明は、全身、器官、組織、組織培養物から選択される細胞集団または任意の他の細胞集団におけるＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）細胞集団を、本発明の実施形態のいずれかによる診断用ＰＭＢＣと接触させること；および（ｉｉ）細胞集団に結合したＰＭＢＣの量を測定することを含み、ここで、この集団内の細胞に結合した化合物の有意な量の検出は、細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す、ＰＮＯＭ細胞の検出方法に関する。
【０１１６】
実施例の項に、トリチウム標識ＮＳＴ ２００、ＮＳＴ ２０３およびＮＳＴ ２０５がアポトーシス細胞に、対照の非アポトーシス細胞よりも高量で結合する能力の能力を示し、これは、アポトーシス細胞の選択的な結合および検出を行なう際の本発明の化合物の特性を示す。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、さらに、患者または動物においてインビボでのＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）診断用ＰＭＢＣを検査対象の患者または動物に投与すること、ここで、この投与は、非経口（例えば、静脈内）または経口投与などの当該技術分野で知られた任意の手段によって行なわれる；および（ｉｉ）検査対象の患者または動物のイメージングを、当該技術分野で知られた任意の方法（例えば、ＰＥＴスキャン、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ）によって行ない、細胞に結合した診断用ＰＭＢＣの量を検出および測定することを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す、ＰＮＯＭ細胞の検出方法に関する。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、本発明は、組織または細胞培養物試料中のＰＮＯＭ細胞のインビトロまたはエキソビボでの検出方法であって、（ｉ）試料を診断用ＰＭＢＣ（本発明において記載のＰＭＢＣ化合物のいずれかであり得る）と、診断用ＰＭＢＣのＰＮＯＭ細胞の生体膜との結合を可能にする条件下で接触させること；および（ｉｉ）細胞に結合した診断用ＰＭＢＣの量を検出すること、ここで、結合した診断用化合物の有意な量の存在は、組織または細胞培養物内におけるＰＮＯＭ細胞の存在を示す、検出方法に関する。
【０１１９】
インビトロまたはエキソビボ試験における検出工程は、例えば蛍光標識された本発明の化合物の場合、限定されないが、市販品として広く入手可能な装置にて細胞の可視化を可能にするフローサイトメトリー解析を使用するものであり得る。細胞を可視化するために蛍光を使用する一例では、単一の１５ｍＷアルゴンイオンレーザー光線（４８８ ｎｍ）を用いてＦＩＴＣ 蛍光を励起し、蛍光データを、５３０ｎｍ帯域通過フィルタを用いて収集し、ヒストグラムを作成する。蛍光細胞の割合は、例えば、Ｌｙｓｉｓ ＩＩソフトウェアまたは任意の他のソフトウェアを用いて算出し得る。この検出方法は、本発明の一つの実施形態において、抗癌薬などの治療用薬物のスクリーニングのために使用し得る。
【０１２０】
用語「有意な量」は、本発明によれば、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量が、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量よりも少なくとも３０％多いことを意味する。実際の量は、用いるイメージング方法および装置に応じて、および検査対象の器官または組織に応じて異なり得る。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量よりも少なくとも５０％多い。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量よりも少なくとも７５％多い。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも２倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも４倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＭ細胞に結合した量の少なくとも６倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも８倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも１０倍である。
【０１２１】
結合の作用は、とりわけ、結合の違いを測定する方法に依存する。本発明の方法は、ＰＮＯＭ細胞の存在を特徴とする疾患、例えば、限定されないが、上記のいずれかの疾患の診断に使用され得る。
【０１２２】
本発明の方法はまた、疾患または病状の治療のため、あるいはまた、先に説明したような基礎的な科学研究目的のために使用される種々の治療モダリティの効果のモニタリング
に使用され得る。
【０１２３】
「治療用アプローチ」と称する本発明の第２のアプローチによれば、本発明は、活性な薬物またはプロドラッグをＰＮＯＭ細胞に標的化するために使用される、ＰＭＢＣを含む医薬組成物に関する。治療用ＰＭＢＣは、本発明によれば、薬物を含むＰＭＢＣまたは医薬として有用な薬剤とコンジュゲートしたＰＭＢＣを意味する。用語「コンジュゲート」は、当該技術分野で知られた任意の手段によって互いに連結された２つの分子を意味する。
【０１２４】
医薬として有用な薬物と、ＰＭＢＣ（これは、治療用ＰＭＢＣに含まれているか、または連結されている）との会合は、共有結合、非共有結合（例えば、静電力）によるもの、または薬物を含み、かつその表面上に、この複合体をＰＮＯＭ細胞に標的化するＰＭＢＣを有する担体粒子（例えば、リポソームなど）の形成によるものであり得る。薬物が標的に達すると、これはその生理学的活性を、なおＰＭＢＣ−コンジュゲートの一部であるとき、ＰＭＢＣをその膜上に有する薬物含有リポソームの食作用によって、または任意の他の既知の機序によってＰＭＢＣ単位から解離した後（例えば、切断、破壊など、天然酵素の活性により）のいずれかで発揮できるはずである。
【０１２５】
薬物は、組成物が意図される具体的な疾患に応じて選択するのがよい。
本発明の医薬組成物、ならびに診断用組成物は、任意の公知の経路、とりわけ、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下、眼内、鼻腔内または局所投与、または大脳内投与によって投与され得る。担体は、所望の投与様式に応じて選択するのがよく、任意の公知の成分、例えば、溶媒；乳化剤（ｅｍｕｌｇａｔｏｒ）、賦形剤、タルク；香料；着色料などを含み得る。医薬組成物は、所望により、他の医薬的に活性な化合物（これは、疾患を治療するため、副作用を排除するため、または活性成分の活性を増大させるために使用される）もまた含み得る。
【０１２６】
この態様によれば、本発明は、さらにまた、ＰＮＯＭ細胞が現れる疾患の治療方法であって、かかる治療を必要とする個体に、有効量の治療用ＰＭＢＣを投与することを含み、この治療用ＰＭＢＣが、疾患の治療物質として活性である薬物または標的化領域において活性な薬物に変換されるプロドラッグを含む、この疾患の治療方法に関する。治療用ＰＭＢＣは、薬物を、ＰＮＯＭ細胞を含むに組織に選択的に標的化することを可能にし、したがって、その局所濃度を増大させ、標的部位でのその治療効果を潜在的に増強する。かかる医学的障害は上記規定のものである。
【０１２７】
別の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す化合物のいずれか１つおよび細胞傷害剤を含む治療用ＰＭＢＣの投与によって、腫瘍内のアポトーシス細胞を標的化し、それにより、癌細胞を死滅させる工程を含む、腫瘍内の癌細胞の死滅方法を提供する。一つの実施形態では、腫瘍細胞の死滅方法は「自己触媒機構」を伴い、この場合、腫瘍に標的化される細胞傷害性薬剤の量は順次用量とともに増加する。それは、各用量において、その細胞傷害性効果により腫瘍内のアポトーシス細胞の負荷が増強され、したがって、治療用ＰＭＢＣの次の用量での標的化のための部位がより多くもたらされるためである。かかるストラテジーは、抗癌治療の効力を増強し得、腫瘍根絶の機会を増大させ得る。
【０１２８】
治療用ＰＭＢＣの「有効量」という用語は、疾患の少なくとも１つの有害な徴候を測定可能なレベルまで減少させることができる量をいい、使用する薬物、投与様式、患者の年齢および体重、疾患の重篤度などに応じて選択するのがよい。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明の治療用ＰＭＢＣは、治療効果を有する放射性同位体を含むか、またはこれに連結されている。かかる放射性同位体の一例は、限定されないが、治療用目的に有用な、イットリウム９０、ヨウ素１３１、レニウム１８８、ホルミウム１６６、インジウム１１１、ルテチウム（Ｌｅｕｔｉｔｉｕｍ）１７７、または放射線を発する任意の他の放射性同位体である。
【０１３０】
別の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す化合物であって、抗凝血薬または線維素溶解薬に連結されたこの化合物のいずれか１つを含む治療用ＰＭＢＣを投与し、それにより、治療剤を、血餅内の活性化された血小板に標的化し、血栓形成を低減／抑制することによる、血餅の低減／抑制を提供する。
【０１３１】
この方法はまた、過剰血液凝固を示す疾患であって、ＰＮＯＭが血小板活性化の際、および／または他の細胞内事象の活性化またはこれに対する障害の際に存在する（例えば、内皮細胞）疾患治療または予防するためにも使用され得る。このような疾患としては、とりわけ、動脈または静脈の血栓症、血栓塞栓症、例えば、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【０１３２】
「クリアランスアプローチ」と称する本発明の第３のアプローチによれば、ＰＮＯＭ細胞に特異的に結合する本発明のＰＭＢＣの性質は、細胞の体液を浄化するために利用される。本発明の一つの実施形態において、体液は血液または血液製剤である。
【０１３３】
体外循環を必要とする多くの外科的または医学的介入には、血液成分の外因性人工的環境への曝露が付随する。これは、多くの場合、血液細胞の活性化およびこれに対する障害、全身性炎症、および深刻な臨床結果（例えば、脳血管内の微小塞栓の持続的存在（ｌｏｄｇｉｎｇ）時の神経機能障害など）を潜在的に有する血栓塞栓性の現象をもたらす。したがって、障害され活性化された細胞またはアポトーシス細胞を検出し、血液から除去することが望ましい。
【０１３４】
したがって、その態様の１つによれば、本発明は、固相支持体上に固定化されたＰＭＢＣに関する。固定化は、直接結合によるもの、共有結合または非共有結合のいずれかによるもの、またはスペーサーを介した結合によるものであり得る。固定化されたＰＭＢＣは、体液をＰＮＯＭ細胞から浄化することを意図するものである。
【０１３５】
本発明の別の実施形態によれば、固相支持体は、ＰＭＢＣが結合される複数のビーズを特色とする。好ましくは、ビーズは樹脂コートビーズである。あるいはまた、ビーズは磁気ビーズであり得る。
【０１３６】
固相支持体が複数のファイバーまたはマイクロキャピラリーを含み、個々の間および／または内部に体液が流れる場合、その内側および／または外側の面をＰＭＢＣで被覆する。
【０１３７】
固相支持体上に固定化された化合物は、濾過デバイスの一部を構成する。したがって、クリアランスアプローチによれば、本発明は、さらに、固相支持体上に固定化された化合物を内包するハウジング、ならびに流体供給口および流体排出口を備える濾過デバイスに関する。血液または血液製剤などの体液は、供給口を通してハウジング内に入り、ハウジングに内包された固定化ＰＭＢＣと接触し、これに接着する。したがって、体液には、摂動した膜を有する循環細胞、例えば損傷を受けた細胞または死滅中の細胞がなく、より大きな構造体、例えばＰＮＯＭ膜を有する塞栓がない。結果として、排出口から排出される流体は、ＰＮＯＭ細胞の含量が低下しており、本質的にこれをもたない。
【０１３８】
濾過デバイスは、体外循環装置の交換可能な部分、常置される部分、または付加的部分を構成し得る。したがって、本発明はまた、濾過デバイスを含む体外循環装置であって、この装置内部を循環する血液がこの装置も通る体外循環装置に関する。
【０１３９】
かかる装置の例は、心肺バイパス装置；血液透析装置；血漿交換装置および輸血装置（例えば、当該技術水準の輸血バッグ）である。
実施例
本発明を理解するため、およびこれを実際にどのように行い得るかがわかるように、以下の実施例：本発明の化合物の合成に関する実施例；および死亡過程を実行中の細胞に対する選択的な結合における本発明の化合物の性能に関する実施例を記載する。本発明の化合物の検出を可能にするため、これをトリチウムで放射標識し、損傷を受けた領域内への取込みを測定することにより、またはオートラジオグラフィー法によって検出した。一部の実施例では、化合物を蛍光標識、すなわちダンシルアミド基への結合によって標識し、蛍光顕微鏡検査によって検出した。アポトーシス細胞に対するこの化合物の結合の選択性は、インビトロで組織培養物において、およびインビボで細胞死を中大脳動脈の閉塞によって誘導した脳卒中のマウスモデル、腎虚血性または毒性傷害のマウスモデル、黒色腫のマウスモデル、結腸癌のマウスモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、多発性硬化症に関連するマウスモデルにおいて示された。
【０１４０】
（実施例１）
ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆ−４（２−ブチル−２（３−フルオロプロピル）−マロン酸）の合成；（スキーム１）：
ジ−ｔ−ブチルマロネート（５ｍＬ）を、１当量のＮａＨを含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で脱プロトン化し、１当量のヨウ化ｎ−ブチルを、水素発生が止まった後、添加した。反応混合物を５０℃まで１４時間加熱した。５．８ｇのジ−ｔ−ブチル、ブチルマロネート（２）を９５％収率で、カラムクロマトグラフィーを用いて得た。２（３．８ｇ）を、ＮａＯＣＨ３（０．０５当量、触媒量）およびアクロレイン（１．１当量）を含むトルエンで処理し、１．２６ｇのアルデヒド（３）を３０％収率で得た。化合物３を、次いで、ＮａＢＨ４（１．０５当量）を含むエタノール／水（８：１ｖ／ｖ）の混合物で２時間反応させた。処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）およびフラッシュクロマトグラフィー後、純粋なアルコール４を得た（９３％）。得られた生成物を、１．１当量の塩化メタンスルホニル（ＭｓＣｌ）および２．２当量のトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）で処理し、メシラート化合物５を９７％収率で得た。この生成物は本質的に純粋であり、さらに精製を行なわずに次の反応に直接持ち越した。
【０１４１】
ＫＦ（５当量）、クリプトフィックス（５当量）およびＫ２ＣＯ３（２．５当量）を２ｍＬのアセトニトリル中に含む混合物を、窒素気流下、４回ストリッピングして乾固した。次いで、メシラート化合物５（１６７ｍｇ）を含む２ｍＬのアセトニトリルを添加した。反応物を、１２０℃のサンドバス内で１０分間攪拌した。処理すると、粗製生成物の１Ｈ ＮＭＲにより、所望の生成物６とクリプトフィックスの混合物が示された。ｄｉ−ｔ−ブチルエステル６の脱保護を、（４７４ｍｇ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１７ｍＬ）を用い、１０℃で３０分間行ない、次いで、蒸発乾固した。残留物を、クロロホルムから２回エバポレートし、真空ラインにて乾燥し、ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆ−４の白色固形物（３１２ｍｇ、９９％）を得た。この化合物のＮＭＲデータは：ｌＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣ１３）δ４．４１（ｄｔ，Ｊｔ＝５．９Ｈｚ，Ｊｄ＝４７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９７−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．８９−１．８３（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．６０（ｍ，１Ｈ），１．５８−１．５２（ｍ，１Ｈ），１．３３（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．２５−１．１４（ｍ，２Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７５．８，８６．２，８４．１，５８．６，３４．１，３０．１，３０．０，２７．９，２７．３，２７．０，２４．５，１４．６；ｌ９ＦＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ−２２０．９；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ２１９（Ｍ−Ｈ）である。
【０１４２】
【化３１】
（実施例２）
ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆ：２−メチル−２（３−フルオロプロピル）−マロン酸の合成；（スキーム２）：
４−ブロモ−１−ブタノール（１）３ｇを、１．５当量の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランおよび０．１当量のｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）を含む１３５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で処理した。処理および精製後、１．４５ｇ（３３％）の生成物２を得た。１．０当量のジエチルメチルマロネートを、１当量のＮａＨで脱プロトン化し、１．０当量のブロミド２を、触媒量のＫＩとともに５０℃で添加した。完全な変換が１０時間に観察され、９０％収率が得られた。テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）のＰＰＴＳ含有エタノールでの脱保護は、５５℃で順調に進行した。処理後、定量的収率のアルコール４が得られ、メシル化反応に直接使用した（前述と同様）。得られたメシラート５を用い、クリプトフィックスの反応を、上記のようにして適用した。化合物６を６８％収率で得た。化合物６（２３３ｍｇ）を、２Ｎ ＮａＯＨ／ＥｔＯＨ（３０ｍＬ／５ｍＬ）で５０℃にて処理し、ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆを約９９％収率（１９０ｍｇ）で得た。この化合物のＮＭＲデータは、以下のとおりである。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１１．８９（ｂｓ，２Ｈ），４．４６（ｄｔ，Ｊｔ＝５．９Ｈｚ，Ｊｄ＝４７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９９−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，２Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１７８．６，８５．１，８２．９，５４．２，３５．５，３１．０，３０．８，２０．８，２０．７，２０．２；１９ＦＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ−２１９．０，ＭＳ（ＥＩ）．
【０１４３】
【化３２】
（実施例３）
トリチウム標識ＮＳＴ ２００およびＮＳＴ２０５の、ＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中である培養ジャーカット細胞への選択的結合
実験手順
培養ジャーカット細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、ｌｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび抗生物質（１００単位／ｍｌペニシリン；１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１２．５単位／ｍｌのナイスタチン）を加えたＲＰＭＩ培地（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中の懸濁液中で成長させた。アポトーシスの誘導前に、培地をＨＢＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ）と交換した。次いで、アポトーシスを、ＣＤ９５（０．１ｕｇ／１０７細胞／ｍｌ）での処置によって誘発した。その結果、著しい割合の細胞がアポトーシスとなった。非処置細胞を対照とした。次いで、対照細胞およびアポトーシス細胞の両方を４０分間、室温でインキュベートした後、３０分間氷上で、（２μＣｉ／１０７細胞／０．５ｍｌ）トリチウム標識ＮＳＴ ２００およびＮＳＴ ２０５とともにインキュベートした。
【０１４４】
細胞を２回洗浄した後、１ｍｌのＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）試薬（ＧＮＥ９１００、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、このペレットに添加した。１時間の６０℃でのインキュベーション後、抽出物をガラスシンチレーションバイアル内に移し、１０ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ ６０１３３２９、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各バイアルに添加した。放射能を、１時間の室温までの冷却および暗順応後に計測した。放射能の値を計算し、添加した放射標識したＮＳＴ ２００およびＮＳＴ ２０５の総量に対するパーセントで示した。
実験結果
図２Ａから明白にわかるように、アポトーシス細胞は、非アポトーシス細胞と比べ、著しく高いＮＳＴ２００の取込み（８倍を超える）を示した。この実験は、ＮＳＴ２００が、アポトーシス細胞に選択的に結合でき、その検出のためのマーカーとしての機能を果たし得ることを示す。同様に、図２Ｂからわかるように、アポトーシス細胞は、非アポトーシス細胞と比べ、高いＮＳＴ２０５の取込みを示し、この効果は、カスパーゼ阻害剤であるＺＶＡＤ（フルオロメチルケトンペプチド（ｐｅｐｔｉｄ）（Ｖ−バリン、Ａ−アラニン、Ｄ−アスパラギン酸塩）カスパーゼ阻害剤）を添加している間に完全に逆転した。
【０１４５】
（実施例４）
アポトーシスを実行中の培養ＨｅＬ細胞に対するＮＳＴ ２０３の選択的結合
ＨｅＬａ Ｓ３ 細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２）を、２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌのナイスタチンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。細胞を、５×１０６細胞／プレートの密度で１０ｃｍ３ 培養プレート上に、１０ｍｌの容量で播種し、成長培地を交換することなく９６時間、培養物をインキュベートすることにより熟成させた。その結果、著しい割合の細胞がアポトーシスとなった。細胞を、細胞スクレーパーを用いて回収し、１８Ｇニードルを有するシリンジに通すことにより単一の細胞に分離し、１０６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）中に再懸濁した。これは、単一の細胞の蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｅｎｃｅ）の可視化を可能にするダンシルアミド基を含むＮＳＴ ２０３の前に見られた。アポトーシス細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合を図３Ａに示す。図は、アポトーシス細胞集団内へのＮＳＴ ２０３の取込みを示す（緑、照り輝く（ｇｌｏｗｉｎｇ）色の細胞の代表を矢印で示す）。一方、非アポトーシス細胞では蛍光観察されない（青、照り輝いていない細胞、矢じりで示す）。
【０１４６】
対照的に、同じフルオロフォアを有するが、ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフを欠く対照化合物のｎ−ブチル−ダンシルアミド（ＢＤＡ）は、この選択性を示さず、したがって、アポトーシス細胞に対する選択的な結合におけるＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフの活性が示された（図３Ｂ）。したがって、ＮＳＴ２０３は、マーカーとしての機能を果たし得、アポトーシス細胞に対する選択的な結合を行なう。
【０１４７】
（実施例５）
マウスにおいてインビボで化学療法により誘導された死亡過程を実行中の黒色腫に対するＮＳＴ ２０３の選択的結合
実験手順
マウス（ｃ５７／ｂｌａｃｋ；８週齢雄マウス）に、マウス黒色腫由来Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５；１０５細胞／マウスを１００μｌの容量で）を、脇腹に左右対称に皮下注射した。注射の前、この細胞株は、４ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌのナイスタチンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、培養状態で維持した。１０日後、腫瘍直径が５〜７ｍｍの大きさに達したとき、マウスを、化学療法処置（Ｔａｘｏｌ ２０ｍｇ／Ｋｇをシクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｍｉｄｅ）３００ｍｇ／Ｋｇとともに、２００μｌの容量で腹腔内注射）に供した。２４時間後、ＮＳＴ−２０３を、２．８ｍｇ／マウス（１０％発色団含有トリス系バッファー中）の用量で静脈内注射した。２時間後、マウスを致死させ、腫瘍および他の器官を回収し、直ちに液体窒素中で凍結させた。腫瘍または他の器官によるＮＳＴ−２０３の取込みを、各組織由来の凍結切片の蛍光顕微鏡検査によって評価した。
実験結果
図４Ａは、腫瘍の蛍光顕微鏡検査を示す。アポトーシスを実行中の数多くの腫瘍細胞に対するＮＳＴ２０３の広範な結合を観察することができる。また、この化合物の細胞内蓄積（写真の右側）および高レベルの選択性も示されており、アポトーシス細胞内への著しい取込みを反映しているが、周囲の腫瘍生細胞は、非染色のままである（写真の左上側）。
【０１４８】
化学療法は、多くの場合、標的腫瘍組織だけでなく、非標的組織（例えば、胃腸管の上皮）においても細胞死を誘導する作用をする。図４Ｂは、アポトーシスを実行中のこれらの細胞を選択的に検出するＮＳＴ２０３の能力を示す（矢印参照）。腫瘍における所見と同様、胃腸管の生細胞は、ＮＳＴ２０３の取込みを示さず、したがって暗いままであった。
【０１４９】
したがって、この結果は、本発明の化合物であるＮＳＴ２０３が、死亡過程が化学療法により誘導されているアポトーシス細胞をインビボで特異的に標的化する能力を示す。アポトーシス細胞は、関与する組織とは無関係に、普遍的な様式で検出される。対照的に、この組織の生細胞は、かかる結合を示さない。
【０１５０】
（実施例６）
結腸癌のマウスモデルにおける化学療法に対する応答の３Ｈ−ＮＳＴ２００を用いたオートラジオグラフィー法によるイメージング
実験手順
結腸癌モデルを、Ｂａｌｂ／ｃ 雄マウスの腹部において確立した。第１２〜１４日に、腫瘍の大きさが直径６〜８ｍｍになったとき、結腸癌腫瘍を、２回用量のドキソルビシン（２０ｍｇ／ｋｇ、７２時間空ける）の点滴で処置した後、腫瘍内へのＮＳＴ２００の取込みを測定した。化学療法の４８時間後、対照非処置動物および化学療法処置動物の両方に、放射標識したＮＳＴ２００（８０μＣｉ／動物）を静脈内注射した。４時間後、動物を致死させた。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルムに露光した。フィルムを７週間の期間露光し、現像し、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血中心対反対側の半球とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。シグナルを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅオートラジオグラフィー標準にしたがって変換し、ｎＣｉ／ｍｇ単位で示した。
実験結果
非処置腫瘍はＮＳＴ２００の取込みを示さず、したがって、オートラジオグラフィーによって画像は検出され得なかった（図５Ａ）。しかしながら、化学療法により細胞死を誘導すると、ＮＳＴ ２００取込みの劇的な増加が起こり、これは、照射誘導性細胞死の大規模プロセスを示す（図５ＢおよびＣ）。ＮＳＴ ２００取込みは、腫瘍の表面上の多くの病巣において、暗くて強い斑の形態で検出され得る。ＮＳＴ−２００標識化は、腫瘍内の特定のアポトーシスの病巣領域に局在し、腫瘍全体に拡散していなかった。処置腫瘍の他の領域は標識されず、これは、腫瘍組織の生存を示す。この観察結果により、ＮＳＴ ２００が、死滅中の細胞に選択的に大量に蓄積され、生細胞には蓄積されない分子を標的化するのに好都合であることが強調された（図５Ｂ）。同じ腫瘍内であっても治療に対する応答が不均一な性質が図５Ｃに示されている。ＮＳＴ２００の取込みは、特に、細胞死の増大を示した腫瘍の大きな一領域に蓄積しているが、化学療法に対する応答を示さなかった他の腫瘍領域には蓄積されていない。
【０１５１】
（実施例７）
結腸癌モデル内への３Ｈ−ＮＳＴ ２００の取り込み：化学療法の効果
実験手順
結腸癌モデル
マウス結腸癌細胞（ＣＴ−２６）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３８）を、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ， ＵＫ）、２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌナイスタチン；および１０％加熱不活化ＦＣＳ中で維持した。試験は、８〜１０週齢の成体雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重２０〜２５ｇ）において行なった。
腫瘍の播種：
細胞をトリプシン処理し、ＨＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０． ５Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ ７．４）で２回洗浄し、次いで（ｔｈａｎ）遠心分離し（５分間、１０００ｒｐｍ、４℃）、（２％）メチルセルロースと生理食塩水（１：３）の混合物中２×１０６細胞／ｍｌに濃縮した。０．２ｍｌの容量の上記の溶液（４×１０５細胞／用量を含有）をマウス腹部の両側に皮下注射し、この間、マウスには麻酔した。麻酔用ストック溶液は、０．８５ｍｌケタミン（ｌＯＯｍｇ／ｍｌ）＋０．１５ｍｌキシラジン（２％）を１：１０に希釈して調製した。重量１０ｇあたりＯ．ｌｍｌの希釈溶液を、（ｉ．ｐ．）注射した。
腫瘍追跡：
マウスを、毎日、触診可能な腫瘍形成について検査した。腫瘍注射の７〜１０日間後、小さな腫瘍が現れた。
結腸癌腫瘍内への３Ｈ−ＮＳＴ２００ 取込みの評価
腫瘍内への３Ｈ−ＮＳＴ２００の取込みを、２回用量のドキソルビシン（２０ｍｇ／ｋｇ、７２時間空ける）の点滴での結腸癌腫瘍の処置後に測定した。２回目の投与の４８時間後、マウスに３Ｈ−ＮＳＴ２００（１０μＣｉ／動物）を静脈内注射した。４時間後、腫瘍を回収し、重量計測し、組織を処理した。腫瘍の溶解を、ＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）試薬（ＧＮＥ９１００， Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、１５０ｍｇの腫瘍組織に対して試薬１ｍｌの比率で用い、６０℃にて、２０ｍｌ容シンチレーションガラスバイアル内で行なった。２〜４時間後、各組織抽出物の１ｍｌをガラスシンチレーションバイアルに移した。着色消光の問題を低減するため、試料を０．４ｍｌの３０％Ｈ２０２で０．０６６Ｍ ＥＤＴＡの存在下で処理した。１５分間の室温でのインキュベーション時間後、抽出物を１時間６０℃でインキュベートした後、さらに１５分間室温でインキュベーションした。１０ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ、６０１３３２９、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各バイアルに添加した。バイアルを１時間室温でインキュベートし、次いで、βカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ２１００ＴＲ、液体シンチレーションアナライザー、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において解析した。すべての試料は、３連で測定した。注射した用量のパーセントの値（％ＩＤ／ｇ（組織））を各試料について計算した。
実験結果：
ドキソルビシン処置した結腸癌腫瘍対非処置対照腫瘍における３Ｈ−ＮＳＴ２００蓄積の定量分析により、処置の４８時間後に３Ｈ−ＮＳＴ２００の大量蓄積が示された。一方、対照群では、すべての腫瘍に、同様だが少量の３Ｈ−ＮＳＴ２００が蓄積し、化学療法処置腫瘍では、蓄積値は、腫瘍によってばらつきがあり、対照群と比べ、取込みの４０〜５０倍の増加を示した。処置群における取込みの平均値は１．２８％ＩＤ／ｇであり、これは、ｍｏｒｅ ｏｆ 対照群の平均値より１２．１倍大きかった（図６参照）。この広域の３Ｈ−ＮＳＴ２００蓄積値は、種々の腫瘍の抗癌処置に対する個々の応答を反映する。上記の実験は、３Ｈ−ＮＳＴ２００が、癌を検出する機能および癌細胞に対して細胞傷害剤の効果を検出する機能を果たし得ることを明白に示す。
【０１５２】
（実施例８）
結腸癌腫瘍を有するマウスにおける３Ｈ−ＮＳＴ２００の生体分布
実験手順
結腸癌モデルを、Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスの腹部において、前述の実施例に記載のようにして確立し、３Ｈ−ＮＳＴ２００（１０μＣｉ）を、ドキソルビシンで処理した動物に注射した。４時間後、動物を致死させ、種々の器官／組織を回収し、処理し、これらの内部での３Ｈ−ＮＳＴ２００の蓄積を測定した。各器官内における取込みを、注射した用量（ＩＤ）に対する％で示し、腫瘍と他の器官との取込みの比率を計算し、これを表に添付の図７として示す。
実験結果
ドキソルビシンによって誘導された腫瘍組織に対する障害は、実際、他の非標的器官（心臓および小腸を含む）に対する障害よりも大きかった。腫瘍対すべての器官における取込みの比率は、表において＞１であり、これは、腫瘍におけるアポトーシスの増加および標的対非標的組織における３Ｈ−ＮＳＴ２００の選択的蓄積を示す。
【０１５３】
（実施例９）
３Ｈ−ＮＳＴ２００は、ＢｉＣＮＵ処置腫瘍内で起こっている細胞死を腫瘍の大きさの縮小前に検出し得る
実験手順
結腸癌モデルを、Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスの腹部において、実施例１０に記載のようにして確立した。第１２〜１４日に、腫瘍の大きさが直径６〜８ｍｍになったとき、マウスにドキソルビシンを静脈内注射した。合計２回のドキソルビシンを、３日間の間隔を空けて与えた（各用量は２０ｍｇ／Ｋｇとした）。２回目のドキソルビシン注射の２日後、マウスに、１０μＣｉの３Ｈ−ＮＳＴ２００を０．２ｍｌの容量の生理食塩水にて点滴した。３Ｈ−ＮＳＴ２００注射の４時間、マウスを、ペンタールの過剰投与により致死させた。腫瘍をエッペンドルフチューブ内に回収し、重量計測し、−２０℃にて凍結させた。
【０１５４】
腫瘍の溶解を、ＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）試薬（ＧＮＥ９１００， Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、１５０ｍｇの腫瘍組織に対して試薬１ｍｌの比率で用い、６０℃にて、２０ｍｌ容シンチレーションガラスバイアル内で行なった。２〜４時間後、各組織抽出物の１ｍｌをガラスシンチレーションバイアルに移した。着色消光の問題を低減するため、試料を０．４ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２で０．０６６Ｍ ＥＤＴＡの存在下で処理した。１５分間の室温でのインキュベーション時間後、抽出物を１時間６０℃でインキュベートした後、さらに１５分間室温でインキュベーションした。１０ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ、６０１３３２９、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各バイアルに添加した。バイアルを１時間室温でインキュベートし、次いで、βカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ２１００ＴＲ、液体シンチレーションアナライザー、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において解析した。すべての試料は、３連で測定した。注射した用量のパーセントの値（％ＩＤ／ｇ（組織））を各試料について計算した。ＮＳＴ２００取込みと腫瘍容積間の比較を示す。各投与後のＮＳＴ２００の取込み値は腫瘍容積と相関しており、これを、式（腫瘍を球形と仮定する）Ｖ＝πＤ３／６（式中、Ｄは、平均腫瘍直径である）によって計算した。
実験結果
ドキソルビシン（５日間持続）での処置の間、腫瘍塊は縮小しなかった（図８Ａ参照）。対照的に、腫瘍は、成長し続け、その容積は、対照非処置腫瘍（処置腫瘍よりも５日間早く回収した）と比べ５０％増加を示す。この増加は、非有意であることがわかった。腫瘍容積のかかる非有意な変化は、２回用量のドキソルビシン処置後に起こり、３Ｈ−ＮＳＴ２００取込みの１８．５倍という劇的な増加が検出され、これは、３Ｈ−ＮＳＴ２００が、腫瘍塊の収縮が検出されない場合であっても、腫瘍内の細胞死を検知することできる感度のよいツールであることを示す（図８Ｂ参照）。
【０１５５】
（実施例１０）
マウスにおける中大脳動脈閉塞後のアポトーシス障害のオートラジオグラフィー法による検出のためのトリチウム標識ＮＳＴ２００の使用
実験手順
ｐ−ＭＣＡを、側頭骨（ｓｕｂｔｅｍｐｏｒａｌ）からのアプローチにより、顕著な虚血性障害の転帰を有するＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて誘導した。ｐ−ＭＣＡの２４時間後、動物の神経学的スコアを評価し（０−臨床的症状なし〜３−片麻痺、回転行動および緊張病）、放射標識されたＮＳＴ２００（８０μＣｉ／動物）を、連続２時間静脈内注射した後、動物を致死させた。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−３ｈ、ＲＰＮ５３５Ｂ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）に露光した。フィルムを７週間の期間露光し、現像し（ＧＢＸ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＆ Ｆｉｘｅｒ， Ｋｏｄａｋ， ＵＳＡ）、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血中心対反対側の半球とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。シグナルを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅオートラジオグラフィー標準（ＲＰＮ５１０ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）にしたがって変換し、ｎＣｉ／ｍｇ単位で示した。
実験結果
３Ｈ−ＮＳＴ ２００の蓄積（ａ）Ｈ＆Ｅ染色（ｂ）を示す図９からわかるように、オートラジオグラフィー画像解析により、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｔｏｃ）細胞死／壊死性細胞死の領域内での３Ｈ−ＮＳＴ２００による傷害の標的化の特異性が示された。この結果を、Ｈ＆Ｅ染色によってさらに確認した。したがって、３Ｈ−ＮＳＴ２００は、オートラジオグラフィー画像解析において、脳アポトーシス障害のマーカーとして使用することができる。
【０１５６】
（実施例１１）
３Ｈ−放射標識されたＮＳＴ ２００によるラット虚血再潅流腎（Ｉ／Ｒ）のオートラジオグラフィー
実験手順
ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（ｌＯｍｇ／ｋｇ）の組合せの腹腔内投与によって誘導した全身麻酔下のラットにおいて手術を行なった。腎虚血は、片側性左腎動脈を、小さな非外傷性血管用鉗子を用いて４５分間締めることにより誘導した。同じ動物の反対側の未処置腎臓を、偽手術された（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）対照由来の腎臓とした。再潅流は、鉗子を外すことにより開始した。腎再潅流の期間は２４時間とした。再潅流の過程の間、動物に１００μＣｉの３Ｈ−ＮＳＴ２０５を静脈内注射し、１時間後、両方の腎臓を切除し、液体窒素中で凍結し、−７０℃で使用まで保存した。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−３ｈ、ＲＰＮ５３５Ｂ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）に露光した。フィルムを７週間の期間露光し、現像し（ＧＢＸ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＆ Ｆｉｘｅｒ， Ｋｏｄａｋ， ＵＳＡ）、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血性腎臓対反対側の腎臓とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。シグナルを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅオートラジオグラフィー標準（ＲＰＮ５１０ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）にしたがって変換し、ｎＣｉ／ｍｇ単位で示した。
実験結果
図１０に示すように、ラット腎臓の虚血−再潅流傷害の間、アポトーシスが、皮髄領域と外髄（ＯＭ）の遠位細管において観察され、一方、重篤な壊死が、（ＯＭ）の近位直細管において見られた。皮質では障害はあまり観察されなかった。反対側の偽腎臓では、障害細管は観察されなかった。オートラジオグラフィー画像解析により、アポトーシス細胞死／壊死性細胞死の領域内での３Ｈ−ＮＳＴ２０５による傷害の標的化の特異性が示され、形態素解析によって確認した。対照的に、反対側の腎臓内への３Ｈ−ＮＳＴ２０５取込みは示されず、傷害腎臓内のみへの３Ｈ−ＮＳＴ２０５取込みの特異性が強調される。
【０１５７】
（実施例１２）
放射線造影剤誘導性急性遠位腎尿細管壊死（ＡＴＮ）のラットモデルにおける３Ｈ ＮＳＴ２０５によるオートラジオグラフィー
実験手順
選択的髄質低酸素細管障害を有する腎障害を、インドメタシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）、Ｎωニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）、および放射線造影剤であるイオタラム酸ナトリウム８０％（Ａｎｇｉｏ−Ｃｏｎｒａｙ， Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ）６ｍＬ／ｋｇ（ｉ．ａ．）の併用投与によって誘導した。別のラットにビヒクルを注射し、対照とした。損傷を与えた２４時間後、対照動物と実験動物の両方に、１００μＣｉの３Ｈ−ＮＳＴ２０５を静脈内注射し、１時間後、両方の腎臓を切除し、液体窒素中で凍結した。
実験結果
図１１からわかるように、腎臓の形態の解析により、広範囲の程度の髄質（すなわち、外髄の外側および内側細片）障害が明らかになった。３Ｈ−ＮＳＴ２０５のホーミングは、主に、外髄内に限定された。形態の損傷のない特定の領域では、３Ｈ−ＮＳＴ２０５取込みは観察されなかった。
【０１５８】
（実施例１３）
３Ｈ−２００による実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のイメージング；オートラジオグラフィー
実験手順
ＥＡＥを、Ｃ３Ｈ．ＳＷ／Ｃ５７／ｂｌ雌マウス（６〜８週齢）の免疫処置により誘導した。動物は、ラットミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５を包含するペプチドで免疫処置した。このペプチドは、固相手法を用いてペプチド合成装置にて合成した。マウスの脇腹の一部位に、７５μｌのＭＯＧペプチド含有完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および２００μｇのヒト結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むエマルジョン２００μｌを皮下注射した。同一のブースター（ｂｕｓｔｅｒ）を、１週間後に、他方の脇腹の一部位に注射した。脳炎誘発性抗原刺激の後、マウスを毎日観察し、ＥＡＥの臨床的兆候をスコアリングした（０＝臨床的症状なし〜５＝四肢の完全麻痺）。疾患の選択した病期において（症状発現前または末期）、１時間のインキュベーションのために、動物に、放射標識したＮＳＴ２００（１００μＣｉ／動物）を静脈内注射し、その後、動物を致死させた。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルムに露光した。フィルムを７〜９週間の期間露光し、現像し、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血中心対反対側の半球とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。
実験結果
多発性硬化症疾患のＥＡＥ動物モデルは、中枢神経系の白質を標的とする慢性障害性（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）自己免疫神経障害を擬態した。実験動物における白質の重篤な障害は、図１２に示すオートラジオグラフィーにおいて観察された。脳レベルでは、冠状部切片は、対照の非免疫処置マウスでは明るい染色であるのと比べ、脳の底部の錐体路の暗い染色、および脳全体で過剰の放射能−リガンド蓄積を示した。また、放射性同位元素標識した３Ｈ−２００の印象的な蓄積が、脊髄レベルでも観察された。脊髄の縦断面は、対照未処置動物の脊髄と比べ、免疫処置マウスの白質の側方路（ｌａｔｅｒａｌ ｔｒａｃｔ）の高レベルの標識化を示した。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、正常な形質膜組織化の摂動および改変を受けている細胞、すなわち、細胞死を実行中の細胞、アポトーシス細胞または活性化された血小板に選択的に結合する化合物に関する。本発明は、さらに、この化合物を、医療行為において、診断用および治療用目的のために利用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
無傷の真核細胞の形質膜（外膜）は、高度に組織化された構造を特徴とする。この高レベルの膜組織化は、とりわけ、この膜を構成する特定の脂質の分子構造；膜を構成する種々の脂質種の比率；この膜の外側と内側リーフレット間でのリン脂質の分布によって；および膜タンパク質構成要素によって決定される。
【０００３】
形質膜組織化を高レベルに維持することは、正常な細胞生理機能の基本であるが、実質的な細胞形質膜の正常な組織化の摂動および改変（ＰＮＯＭ）は、数多くの生理学的および病理学的条件において起こり、複数の疾患の特徴となっている。かかる改変および摂動は、形態学的レベル（アポトーシスを実行中の細胞で観察される膜泡）および分子レベルの両方において明白であり得る。ＰＮＯＭには、とりわけ、膜リン脂質の無秩序化（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）および再分布が含まれ、これは、アミノリン脂質、主にホスファチジルセリン（ＰＳ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（これらは、通常、膜二重層の内側リーフレットにほぼ完全に限定される）の細胞表面への移動、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）のこの膜の外側リーフレットから内側リーフレットへの相互移動を伴う。この再分布を、本明細書では、細胞膜脂質の非対称性（ＣＭＬＡ）の喪失という。ＣＭＬＡ喪失に加え、ＰＮＯＭはまた、多くの場合、膜リン脂質パッキングレベルの低下および膜流動性の増大と関連している。
【０００４】
このような改変は、細胞表面を、いくつかの凝固因子複合体、例えば、テナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）およびプロトロンビナーゼタンパク質複合体などの会合のための触媒的基盤とするのに重要な役割を果たす。したがって、血小板活性化は、ＰＮＯＭ中の血小板膜と関連しており、これらの改変は、正常な血液凝固において、ならびに数多くの障害での異常な過剰血液凝固の起始および／または伝播において重要な要因を構成する。このような障害としては、とりわけ、動脈または静脈の血栓症または血栓塞栓症［例えば、脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病など］、不安定なアテローム性プラーク、鎌状赤血球症、βサラセミア、抗リン脂質抗体症候群［とりわけ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）において］、および膜微粒子の流出と関連する障害、例えば、心肺バイパスと関連する神経機能障害が挙げられる。
【０００５】
アポトーシスは、細胞膜の改変／摂動が起こっている別の主な状況である。アポトーシスは、細胞の自己崩壊すなわち「自殺」という固有のプログラムであり、どの真核細胞にも生来備わっている。刺激の誘発に応答し、細胞は、細胞収縮、細胞膜泡、クロマチンの凝縮および断片化、細胞の膜結合粒子のクラスター（アポトーシス体）への変換への終結という事象の高度に特徴的なカスケードを起こし、その後マクロファージに囲まれる。ＰＮＯＭは、アポトーシスの普遍的な現象であり、アポトーシスカスケードの初期（おそらく、細胞が死亡過程を遂行する時点）で起こり、また、マクロファージによるアポトーシス細胞の認識および除去における重要な要因であることが示されている。
【０００６】
最近、ＰＮＯＭとアポトーシス細胞の強力な凝血促進活性との間に強い相関性が導かれた。アポトーシス内皮細胞におけるＰＮＯＭ（例えば、アテローム性プラークにおいて起こるものなど）は、おそらく、血栓症の血管障害の病原において重要な役割を果たしている。
【０００７】
アポトーシスまたは血栓症は、各々、大部分の内科的障害において重要な役割を有するため、これらの生物学的プロセスの検出および関連細胞の標的化のためのツールがあることが望ましい。また、ＰＮＯＭ膜への選択的な結合のための化合物（これは、潜在的に、後に、かかるＰＮＯＭ膜を有するこのような細胞（ＰＮＯＭ細胞）内への侵入を行なう）は、したがって、障害または死亡過程を実行中の細胞（特に、アポトーシスにより）、または活性化を受けている血小板を検出し、イメージング用の薬剤または薬物をこれらに標的化するための重要なツールとしての機能を果たし得る。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明の一つの態様において、形質膜の正常な組織化の摂動を受けている細胞（ＰＮＯＭ細胞）に選択的に結合し得るが、形質膜の正常な組織化を維持している細胞（これを、以下、「正常細胞」と定義する）には、より低程度で結合する化合物を提供する。ＰＮＯＭ細胞は、本発明の一つの実施形態において、死亡過程を実行中の細胞である。本発明の一つの実施形態ではこの細胞はアポトーシス細胞であり、別の実施形態では、この細胞は、活性化された血小板であり得る。本発明は、さらに、ＰＮＯＭ細胞に選択的に結合するこれらの化合物を使用することによりＰＮＯＭ細胞を検出する方法に関する。本発明の別の実施形態では、式Ｉ〜ＸＩＶに示す構造で表される化合物を提供する。
【０００９】
用語「摂動膜結合性化合物（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ＰＭＢＣ）は、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的化するが、正常細胞には、より低程度で結合する化合物をいう。本発明によれば、ＰＭＢＣのＰＮＯＭ細胞への結合は、正常細胞への結合よりも少なくとも３０％多いのがよい。
【００１０】
用語「選択的に標的化すること」は、本発明では、化合物のＰＮＯＭ細胞への選択的な結合、すなわち、正常細胞への結合よりも少なくとも３０％多い程度でのＰＮＯＭ細胞への結合をいう。
【００１１】
用語「診断用摂動膜結合性化合物」（診断用ＰＭＢＣ）は、ＰＮＯＭ細胞に選択的に標的化することができる化合物をいい、この化合物はマーカーを含むか、またはこれに連結されており、このマーカーは、当業者に知られた手段によって検出可能である。
【００１２】
用語「治療用摂動膜結合性化合物」（治療用ＰＭＢＣ）は、上記規定のＰＭＢＣであって、薬物を含む、疾患の治療に有用なものをいう。
用語「固相支持体」は、本発明の内容においては、固相マトリックス、不溶性マトリックスまたは不溶性支持体をいう。本発明による固相支持体は、種々の構造、例えば、マイクロ粒状物、マイクロフィルターまたはマイクロキャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒａ）の積層体に形成されたものであり得る。
【００１３】
ＰＭＢＣは、本発明の一つの実施形態において、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的化するための薬剤の調製に使用される。
一つの態様において、本発明は、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的とする化合物（すなわち、ＰＭＢＣ）であって、式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
に示す構造で表される化合物、または式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を提供する（式中、ＲおよびＲ’基の各々は、独立して、各存在において、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せから選択される；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；ｘおよびｚは、各々、独立して存在し、０、１または２の整数であり、ここで、ｘおよびｚは同じまたは異なり得る；ｙは、０、１または２の整数であり、ここでｙ＝２のとき、置換基Ｒ’は、各存在において同じであっても異なっていてもよい；およびＤは、診断に用いるマーカー、水素、ヒドロキシル、Ｆまたは薬物であり、ここで、診断に用いるマーカーは、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆ原子は１８Ｆまたは１９Ｆのいずれかであり得る）または放射標識された金属キレートから選択され、イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である。
【００１５】
薬物は、特定の疾患の予防、改善または治療に医薬として有用な薬剤であり得、例えば、限定されないが、アポトーシスの阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤、抗酸化剤、 Ｂｃｌ−２系の調節剤）；細胞死の活性剤（例えば、抗癌薬）；または血液凝固の調節剤（これは、抗凝血薬、抗血栓剤または血栓溶解剤であり得る）であり得る。かかる場合において、この薬物は、好ましくは、抗血小板剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）、または凝固因子の阻害剤（例えば、トロンビンの阻害剤または第Ｘａ因子のなど阻害剤）；または抗炎症薬または免疫調節剤薬から選択される。本発明の一つの実施形態において、抗癌薬を腫瘍に、薬物をアポトーシス（腫瘍内で自発的にまたは治療に応答してのいずれかで起こる）の病巣に標的化することにより、抗癌治療の改善のための方法を提供する。本発明の別の実施形態において、凝固が抑制、低減または停止されるように、抗凝血薬を血栓に標的化することにより血栓症を治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、Ｄは、固相支持体であり得る。
本発明の別の実施形態において、ＰＮＯＭを選択的に標的とし、式（ＩＩ）：
【００１７】
【化２】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；Ｄは、水素またはである。診断に用いるマーカーは、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆ原子は１８Ｆまたは１９Ｆのいずれかであり得る）または放射標識された金属キレートであり得る；イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩ）：
【００１９】
【化３】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ３は、ヒドロキシルまたはＦである；Ｒ４は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０直鎖または分枝鎖アルキルであり、ｋは、０、１、２、３、４および５から選択される整数である）。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＶ）：
【００２１】
【化４】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２００である。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、式（Ｖ）：
【００２３】
【化５】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｖ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、−Ｆおよび−ＯＨであり、ｒは、４、５、６、７、８、９、１０の整数を表す）。ｒが４であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０１である。ｒが５であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ−ＭＬ−１０である。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＶＩ）：
【００２５】
【化６】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、水素、−Ｆおよび−ＯＨから選択される）。Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０４である。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩ：
【００２７】
【化７】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択され、Ｒ４は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキルから選択され、ｐは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す）。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩＩ：
【００２９】
【化８】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択される）。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＸ）：
【００３１】
【化９】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＸ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、ならびにＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキルから選択される；ｑは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す；およびＹは蛍光用マーカーである）。本発明の一つの実施形態では、Ｙは、ダンシルアミド基およびフルオレセインから選択される。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、式（Ｘ）：
【００３３】
【化１０】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｘ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２０３である。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩ）：
【００３５】
【化１１】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す）。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩ）：
【００３７】
【化１２】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩＩ）：
【００３９】
【化１３】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、Ｒは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｍは、０、１、２、３または４の整数を表す；Ｄは診断に用いるマーカーであり、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆは１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）または放射標識された金属キレートであり得、イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＶ）：
【００４１】
【化１４】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００４２】
本発明の別の態様において、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る患者において、アポトーシスまたは血液凝固の病巣に薬物を標的化するための医薬組成物であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造による化合物を含み、この化合物が薬物を含むか、またはこれに連結されている医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明の一つの態様において、医薬として有用な化合物を細胞集団内にあるＰＮＯＭ細胞に選択的に標的化する方法であって、細胞集団を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す構造で表される化合物と接触させ、それにより、医薬として有用な化合物を細胞集団内のＰＮＯＭ細胞に選択的に標的化させることを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明の別の態様において、細胞集団内のＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）細胞集団を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す構造で表される化合物、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物と接触させること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、この細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００４５】
本発明の別の態様において、患者または動物におけるＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）患者または動物に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を投与すること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定するために、検査対象の患者または動物のイメージングを行なうことを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、この細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００４６】
本発明の別の態様において、薬物を、患者または動物の血餅内のアポトーシスの病巣または活性化された血小板（ｏｒ）の病巣に標的化するための医薬組成物であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造の化合物（この化合物は、薬物を含むか、またはこれに連結されている）を含む医薬組成物を提供する。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、検査対象の被験体の腫瘍内の死亡過程を実行中の細胞の検出方法であって、（ｉ）検査対象の被験体に、化合物またはこの化合物を含むコンジュゲートを投与すること、ここで、この化合物は、式（Ｉ）：
【００４８】
【化１５】
に示す構造で表される化合物、または式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物であり、式中、ＲおよびＲ’基の一方は水素であり、ＲおよびＲ’基の他方は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；ｘおよびｚは、各々、独立して存在し、０、１または２の整数であり、ここで、ｘおよびｚは同じまたは異なり得る；ｙは、０、１または２の整数であり、ここでｙ＝２のとき、置換基Ｒ’は、各存在において同じであっても異なっていてもよい；およびＤは、診断に用いるマーカーである。診断に用いるマーカーは、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆ原子は１８Ｆまたは１９Ｆのいずれかであり得る）または放射標識された金属キレートであり得、イメージング用マーカーは、蛍光標識、放射能標識、Ｘ線用マーカー、ＭＲＩ用マーカー、ＰＥＴスキャン用マーカーおよび酵素反応を行なうことができ、検出可能な色をもたらす標識を含む群から選択される；および（ｉｉ）患者の検査対象の腫瘍に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、腫瘍内の細胞に結合した化合物の有意な量は、これらの腫瘍細胞が死亡過程を実行中であることを示す方法を提供する。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、検査対象の被験体の腫瘍内の死亡過程を実行中の細胞の検出方法であって、（ｉ）検査対象の被験体に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造の化合物を投与すること、ここで、この化合物は、イメージング用マーカーまたは標識された金属キレートを含むか、またはこれに連結されている；および（ｉｉ）腫瘍内の細胞に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、腫瘍内の細胞に結合した化合物の有意な量の検出は、これらの腫瘍細胞が死亡過程を実行中であることを示す方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態において、抗癌薬を、アポトーシス細胞の病巣を有する腫瘍に標的化する方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す化合物であって、細胞傷害剤を含むか、または細胞傷害剤に連結されているかのいずれかであるこの化合物を投与し、それにより、薬物の腫瘍内の細胞死の病巣への標的化を達成する工程を含む方法を提供する。
【００５１】
別の実施形態において、抗凝血薬または線維素溶解薬の血餅への標的化方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶのいずれかに示す化合物であって、抗凝血薬または線維素溶解薬のいずれかを含むこの化合物を投与し、それにより、薬物の血餅への標的化を達成する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の化合物：ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフの作用機序のスキームを示す。
【図２Ａ】ＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２００の選択的な結合（Ａ）およびＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２０５の選択的な結合（Ｂ）を示す。
【図２Ｂ】ＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２００の選択的な結合（Ａ）およびＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中の培養ジャーカット細胞に対するトリチウム標識ＮＳＴ２０５の選択的な結合（Ｂ）を示す。
【図３Ａ】蛍光顕微鏡検査を示し、アポトーシスを実行中の培養ＨｅＬ細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合（図３Ａ）を示す。同じフルオロフォアを有するがＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフを欠く、対照化合物のｎ−ブチル−ダンシルアミド（ＢＤＡ）は、この選択性を示さなかった（図３Ｂ）。
【図３Ｂ】蛍光顕微鏡検査を示し、アポトーシスを実行中の培養ＨｅＬ細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合（図３Ａ）を示す。同じフルオロフォアを有するがＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフを欠く、対照化合物のｎ−ブチル−ダンシルアミド（ＢＤＡ）は、この選択性を示さなかった（図３Ｂ）。
【図４Ａ】マウスにおいてインビボで化学療法により誘導された細胞死を実行中の細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合の蛍光顕微鏡検査を示す：（Ａ）。黒色腫細胞のアポトーシス；（Ｂ）。胃腸管の上皮細胞のアポトーシス
【図４Ｂ】マウスにおいてインビボで化学療法により誘導された細胞死を実行中の細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合の蛍光顕微鏡検査を示す：（Ａ）。黒色腫細胞のアポトーシス；（Ｂ）。胃腸管の上皮細胞のアポトーシス
【図５Ａ】トリチウム標識ＮＳＴ２００によって検出された、癌細胞死に対する化学療法の効果を示す。
【図５Ｂ】トリチウム標識ＮＳＴ２００によって検出された、癌細胞死に対する化学療法の効果を示す。
【図５Ｃ】トリチウム標識ＮＳＴ２００によって検出された、癌細胞死に対する化学療法の効果を示す。
【図６】化学療法で処置した結腸癌を有するマウスにおけるＮＳＴ ２００によるオートラジオグラフィーを示す。
【図７】化学療法の前後での癌腫瘍と他の身体器官における取込みの比率を示す表を示す。
【図８Ａ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の結腸癌内への取込み、およびこれに対する化学療法の効果を示す（図８Ａ）。図８Ｂは、結腸重量の変化を示す。
【図８Ｂ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の結腸癌内への取込み、およびこれに対する化学療法の効果を示す（図８Ａ）。図８Ｂは、結腸重量の変化を示す。
【図９Ａ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の脳内のアポトーシス死の領域への標的化を示すオートラジオグラフィー画像解析（Ａ）およびＨ＆Ｅ染色（Ｂ）を示す。
【図９Ｂ】トリチウム標識ＮＳＴ２００の脳内のアポトーシス死の領域への標的化を示すオートラジオグラフィー画像解析（Ａ）およびＨ＆Ｅ染色（Ｂ）を示す。
【図１０Ａ】ラット虚血再潅流腎のトリチウム標識ＮＳＴ２００によるオートラジオグラフィーを示す；；（Ａ）障害腎臓；（Ｂ）無傷の腎臓。
【図１０Ｂ】ラット虚血再潅流腎のトリチウム標識ＮＳＴ２００によるオートラジオグラフィーを示す；；（Ａ）障害腎臓；（Ｂ）無傷の腎臓。
【図１１】放射線造影剤誘導性急性遠位腎尿細管壊死のラットモデルにおけるトリチウム標識ＮＳＴ２０５によるオートラジオグラフィーを示す；（Ａ）障害腎臓；（Ｂ）無傷の腎臓。
【図１２】図１２は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の脳および脊髄におけるオートラジオグラフィーによる３Ｈ−２００イメージングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な実施形態
本発明は、形質膜の正常な組織化の摂動を受けている細胞（ＰＮＯＭ細胞）に対して選択的な結合を行うことができるが、形質膜の正常な組織化を維持している細胞には、より低程度で結合する化合物に関する。ＰＮＯＭ細胞は、死亡過程を実行中の細胞、アポトーシス細胞および活性化された血小板から選択される。本発明は、さらに、ＰＮＯＭ細胞に選択的に結合する化合物を用いることによりＰＮＯＭ細胞を検出する方法に関する。
【００５４】
本発明の化合物は、ＰＮＯＭ細胞の選択的標的化において活性であるという利点を有するとともに、比較的低い分子量および潜在的に有利な薬物動態プロフィールを特色とする。
【００５５】
本発明の一つの実施形態では、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的とする化合物（すなわち、ＰＭＢＣ）であって、式（Ｉ）：
【００５６】
【化１６】
に示す構造で表される化合物、または式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を提供する（式中、ＲおよびＲ’基の各々は、独立して、各存在において、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せから選択される；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；ｘおよびｚは、各々、独立して存在し、０、１または２の整数であり、ここで、ｘおよびｚは同じまたは異なり得る；ｙは、０、１または２の整数であり、ここでｙ＝２のとき、置換基Ｒ’は、各存在において同じであっても異なっていてもよい；およびＤは、診断に用いるマーカーであり、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えばＦ（ここで、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）または標識された金属キレートである；イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。別の実施形態では、Ｄは、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００５７】
薬物は、ある特定の疾患の予防、改善または治療のための医薬として有用な薬剤であり得、例えば、限定されないが、アポトーシスの阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤、抗酸化剤、Ｂｃｌ−２系の調節剤）；細胞死の活性剤（例えば、抗癌薬）；または血液凝固の調節剤（抗凝血薬、抗血栓剤または血栓溶解剤であり得る）であり得る。かかる場合において、薬物は、好ましくは、抗血小板剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの拮抗薬、組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）、または凝固因子の阻害剤（例えば、トロンビンの阻害剤または第Ｘａ因子のなど阻害剤）；または抗炎症薬または免疫調節剤薬から選択される。本発明の一つの実施形態において、腫瘍細胞の死滅を達成するため、薬物を、目的の領域（例えば、腫瘍内のアポトーシスの病巣）に標的化する方法を提供する。本発明の別の実施形態において、凝固が抑制、低減または停止されるように、血栓領域に抗凝血薬または線維素溶解薬を標的化する方法を提供する。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、Ｄは固相支持体であり得る。
本発明の別の実施形態において、ＰＮＯＭ細胞を選択的に標的とする化合物であって、式（ＩＩ）：
【００５９】
【化１７】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｎおよびｍは、各々、０、１、２、３または４の整数を表す；ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい；Ｍは、非存在、水素、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｕ）（式中、Ｕは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキルを表す）から選択される；Ｄは、水素、またはイメージング用マーカー（例えば１８Ｆなど）または標識された金属キレートから選択される診断に用いるマーカーである；イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩ）：
【００６１】
【化１８】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ３は、ヒドロキシルまたはＦである；Ｒ４は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０直鎖または分枝鎖アルキルであり、ｋは、０、１、２、３、４および５から選択される整数である）。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＶ）：
【００６３】
【化１９】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２００である。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、式（Ｖ）：
【００６５】
【化２０】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｖ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、−Ｆおよび−ＯＨであり、ｒは、４、５、６、７、８、９、１０の整数を表す）。ｒが４であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０１である。ｒが５であり、Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ−ＭＬ−１０である。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＶＩ）：
【００６７】
【化２１】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｊは、水素、−Ｆおよび−ＯＨから選択される）。Ｊが−Ｆである場合、この化合物は、指定したＮＳＴ２０４である。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩ：
【００６９】
【化２２】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択され、Ｒ４は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキルから選択され、ｐは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す）。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、式ＶＩＩＩ：
【００７１】
【化２３】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＶＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物および溶媒和物ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｑは、テクネチウム、オキソテクネチウム、レニウムおよびオキソレニウムから選択される）。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＸ）：
【００７３】
【化２４】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＩＸ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖アルキル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、ならびにＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキルから選択される；ｑは、１、２、３、４および５から選択される整数を表す；およびＹは蛍光用マーカーである）。本発明の一つの実施形態では、Ｙは、ダンシルアミド基およびフルオレセインから選択される。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、式（Ｘ）：
【００７５】
【化２５】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｘ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含む）。この化合物は、指定したＮＳＴ２０３である。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩ）：
【００７７】
【化２６】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（Ｘ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｒは水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す）。
【００７８】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩ）：
【００７９】
【化２７】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＩＩ）：
【００８１】
【化２８】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、Ｒは、水素またはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６の直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖ヒドロキシアルキル、直鎖または分枝鎖フルオロアルキル、１つまたは２つの環で構成されるアリールまたはヘテロアリール、またはその組合せを表す；ｍは、０、１、２、３または４の整数を表す；Ｄは、水素、または診断に用いるマーカーであり、本発明の一つの実施形態では、イメージング用マーカー、例えば、Ｆ（Ｆは１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）または放射標識された金属キレートであり得、イメージング用マーカーは、着色、蛍光、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または放射性同位体スキャン、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）などによって検出され得る。あるいはまた、Ｄは、上記規定のような、ＰＮＯＭ細胞に標的化される薬物である）。
【００８２】
本発明の別の実施形態において、式（ＸＩＶ）：
【００８３】
【化２９】
に示す構造で表される化合物を提供する（式（ＸＩＶ）に示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびにこの塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、Ｆは、１８Ｆまたは１９Ｆであり得る）。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶで表される化合物の各々は、診断に用いるマーカー、例えば、限定されないが、Ｔｃ、Ｔｃ＝Ｏ、Ｉｎ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｘｅ、Ｔｌ、ＲｅおよびＲｅ＝Ｏ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、Ｍｎ（ＩＩ）、１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎ、７５Ｂｒ、Ｔｃ−９９ｍまたはＩｎ−１１１などを含むものであってもよく、またはこれに連結されたものであってもよい。
【００８５】
本発明の別の態様において、細胞集団内のＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）細胞集団を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造のいずれか１つで表される化合物、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物と接触させること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定することを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、これがＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００８６】
用語「細胞に結合した化合物の有意な量」は、本発明によれば、正常細胞に結合した量よりも少なくとも３０％多い量でＰＮＯＭ細胞に結合する本発明の化合物（診断に用いるマーカーを含むか、またはこれに結合している）の量をいう。別の実施形態では、その量は５０％多いこともあり得る。本発明の別の実施形態では、その量は７５％多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は１５０％多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は約２倍多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は少なくとも２倍より多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は少なくとも５倍多いこともあり得る。別の実施形態では、その量は少なくとも１０倍多いこともあり得る。
【００８７】
ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによる放射性核種イメージングにより、患者において死亡過程を実行中の細胞の画像を得るための本発明の化合物の使用に関する本発明の一つの実施形態において、ＰＮＯＭ細胞に結合した化合物の量対正常細胞に結合した量の比の計算は、死亡過程の負担を有する組織から得られたシグナルの大きさまたは強度を、このプロセスの負担のない器官から得られた大きさ／強度と比較することにより行ない得る。
【００８８】
本発明の別の態様により、患者または動物におけるＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）患者または動物に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物化合物（ここで、この化合物は、イメージング用マーカー、例えば１８Ｆなどを含む）、または式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す構造で表される化合物の医薬的に許容され得る塩、金属キレート、溶媒和物および水和物、ならびにこの塩の溶媒和物および水和物を投与すること；および（ｉｉ）細胞に結合した化合物の量を測定するために、検査対象のヒトまたは動物のイメージングを行なうことを含み、ここで、細胞に結合したこの化合物の有意な量は、これがＰＮＯＭ細胞であることを示す方法を提供する。
【００８９】
本発明の化合物の作用機序は、一般式ＸＶを有し、かつＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフ：
【００９０】
【化３０】
（式中、Ｒはアルキルを表す）
と示す、すべての化合物が共有するモジュールの活性を、少なくともある程度含む。本発明の一つの実施形態において、Ｒはブチルである。
【００９１】
ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフは、アポトーシス細胞の形質膜に見られる構造的改変（これにより、これらの膜は健常細胞の膜と識別される）に対応させるために設計されたものである。膜改変のこの複合には、
（ｉ） 膜リン脂質の無秩序化（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）（ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および負に帯電したホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面上に露出した状態で）。細胞表面上でのＰＳの露出により、負の表面電位がもたらされ、プロトンの吸引によって膜界面に大きな塊（ｂｕｌｋ）が形成される；
（ｉｉ）膜の外側リーフレット内におけるアミノリン脂質（ＰＥおよびＰＳ）の割合の増加の結果、膜の外側リーフレットの界面におけるプロトン電流（界面プロトン電流、ＩＰＣ）の増強がもたらされる。この増強は、ＰＥおよびＰＳが外膜リーフレット内のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｅｙｌｉｎ）（ＳＭ）と置き換わるにつれて、プロトン転移反応に関与しやすい官能基の数の実質的な増加によるものである。ＰＥは第一級アミンを含み、一方、ＰＳは第一級アミンとカルボキシル基を含む。対照的に、ＰＣおよびＳＭは、各々、永久的な正電荷を有する第四級アンモニウムを含み、したがって、プロトン転移反応には関与し得ない；
（ｉｉｉ）加えて、アポトーシス膜は、膜構成要素のパッキングレベルの低下および膜流動性の増加を特徴とする；
が含まれる。
【００９２】
ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフの作用の様式の非限定的な仮定において、これは、上記の特徴を特色とする膜、すなわち、アポトーシス細胞の形質膜に接近すると選択的に活性化されるスイッチ部分を含む（図１）。作用モチーフは、負に帯電したカルボキシレート基を２個有し（マロン酸アルキルのｐＫａは約５．６および２．８である）、したがって、ほとんどの場合、生理学的条件で形式電荷−２を有するため、生理学的ｐＨでは可溶性である。しかしながら、アポトーシス膜に接近すると、表面の酸性がより強いため、および界面環境の誘電率の低下（これは、カルボキシル基のｐＫａ値を上昇させる作用をする）のため、プロトンは、マロネート部分（ｍｏｅｉｔｙ）に捕捉されている。
【００９３】
マロネート基によるプロトンの捕捉により、負電荷の１つが中和され、したがってこの分子はより疎水性となる（全体的な電荷−１を有する）。さらにまた、プロトンの捕捉によって非常に特有の状況がさらにもたらされ、それには、以下のものが含まれる。
（ｉ）酸−アニオン対が形成され、このとき、例外的に、強い水素結合が、プロトン付加されたカルボキシル基とプロトン付加されていないカルボキシル基との間に形成される。この水素結合は強力であり、対称的で、共鳴および互変異性化（ｔａｕｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって安定化されている。
（ｉｉ）これは、４個のカルボキシル原子の上部に負電荷の分布をもたらす、すなわち、部分的に非局在化させる。
（ｉｉｉ）強酸−アニオン水素結合はこの分子を剛性化し、バルキーで剛性の平坦な６員環を生成する。これは、部分的に非局在化した負電荷を有し、カルボキシル二重（ｂｏｕｂｌｅ）結合の上部にπ電子雲を含む。かかる成分（ｅｌｅｍｅｎｔ）は、本発明の化合物の作用機序の非限定的な仮定によれば、膜界面への比較的有利な浸透を行ない得る。しかしながら、そのバルキーな剛性構造は、緩くパッキングされた膜（ｅｍｅｂｒａｎｅ）、すなわち、アポトーシス膜（ｍｅｍｅｂｒａｎｅ）に選択的に結合し、高度にパッキングされた膜（例えば、健常細胞の形質膜）への結合を排除するよう指令する。したがって、このような立体構造の特徴は、アポトーシス膜への結合における選択性を促進する。
【００９４】
アポトーシス細胞の膜界面に１個のプロトンが付加されたマロネートが選択的に浸透すると、これは、増強された界面プロトン電流に供されることになり、増強された界面の水素結合網目内に組み込まれることになる。この条件下では、マロネート部分が第２のプロトンを獲得する可能性は著しく増加する。これにより、さらに、電荷の中和および隣接するリン脂質分子とのさらなる酸−アニオン対の形成がもたらされる。総合すると、これらの事象は、アポトーシス膜の界面へのこの分子の結合を安定化するために作用する。
【００９５】
プロトン付加されたマロネート部分の膜界面内への浸透および界面におけるその結合の安定化により、アルキル鎖Ｒが膜界面を横断し、その最適な結合環境、すなわち膜炭化水素コアに達することが可能になり、その結果、疎水性（ｈｙｄｏｒｐｈｏｂｉｃ）相互作用によって、化合物の結合の自由エネルギーの獲得にさらに寄与する。
【００９６】
ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフは、炭化水素リンカーを介したイメージング用マーカーまたは治療用薬物（式ＩのＤ部分）との結合により、有用な診断用または治療用目的に利用されている［式Ｉまたは２の（ＣＨ２）ｍ］。このアプローチによるＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフは、標的化部分（ｍｏｅｉｔｙ）としての機能を果たし、自身に結合しているイメージング用マーカーまたは薬物を、細胞死、特に（ｐａｒｉｃｕｌａｒｌｙ）アポトーシスの負担を有する細胞および組織、または血小板活性化および血栓症の負担を有する組織に選択的に標的化することを可能にする。
【００９７】
図１は、ＮＳＴ２００（式ＩＶ）を示し、生理学的条件におけるＰＮＯＭ膜への接近および結合の３つの段階を表す：
Ａ：この化合物は水溶液中に存在し、したがって、両カルボキシル基は脱プロトン化されている、すなわち負に帯電しており、この化合物は高度に可溶性である。
Ｂ：負に帯電したアポトーシス膜に接近すると、この化合物はプロトンを獲得する。アニオン−酸二量体が形成され、したがって、安定な６員環の共鳴安定化した環が生成する。これは膜界面に浸透する。このバルキーな剛性環構造は、その立体構造の特徴が、充分パッキングされた健常細胞の形質膜に対する結合よりも、緩くパッキングされたアポトーシス細胞の形質膜に対する結合にとってより有利であるため、選択性を補助する。
Ｃ：この化合物は、アポトーシス膜の膜界面内に浸透すると、この膜の界面で見られるこの界面の水素結合網目および増大された界面プロトン電流に供されることになる。結果として生じるプロトン化および水素結合形成は、さらに、この化合物への界面への結合（矢印）を安定化するために作用する。かかる浸透は、アルキル鎖が膜内でのその最適な位置に達するのをさらに可能にし、したがって、膜炭化水素コアとの疎水性相互作用の形成により、結合エネルギーにさらに寄与する。
【００９８】
本発明の化合物は、医薬として有用な薬剤を、ＰＮＯＭ細胞を含む組織および器官に選択的に標的化するために、本発明の３種類の異なるアプローチで使用され得る。
（ｉ）以下、「検出アプローチ」と称する第１のアプローチによれば、選択的な結合は、イメージング用マーカーをＰＮＯＭ細胞に標的化するために利用され得る。これは、インビボ、エキソビボまたはインビトロのいずれかで、かかる細胞が現れる疾患（以下に説明する）の診断のために診療において使用される。
（ｉｉ）以下、「治療用アプローチ」と称する第２のアプローチによれば、選択的な結合特性は、ＰＮＯＭ細胞が現れた身体内の器官および組織、例えば、細胞死、血栓形成または炎症の領域に対する治療用薬剤の選択的標的化に使用される。
（ｉｉｉ）「クリアランスアプローチ」と称する本発明の第３のアプローチによれば、ＰＮＯＭ細胞に対する本発明の化合物の選択的な結合は、この化合物の固相支持体との結合を介して、体液（例えば、血液）を、その凝血促進性により潜在的に有害であり得るＰＮＯＭ細胞から浄化するために利用される。
【００９９】
検出アプローチに従い、本発明は、イメージング用マーカー含むか、またはこれに連結されたＰＭＢＣを有効成分として含む、インビトロ、エキソビボまたはインビボのいずれかでＰＮＯＭ細胞を検出するための組成物に関する。かかるＰＭＢＣを、以下、「診断用ＰＭＢＣ」と示す。診断用ＰＭＢＣは、アッセイした試料中に存在するＰＮＯＭ細胞に対して選択的な結合を行なうことができる。次いで、この結合を、当該技術分野で知られた任意の手段で確認し得る。本発明の診断用ＰＭＢＣは、ＰＮＯＭ細胞に対して選択的な様式でのマーカー標的化（ＰＭＢＣによる）を可能にする。次いで、検出可能な標識を、当該技術分野で知られた任意の様式で、特定の標識（例えば、蛍光、放射能の放出、または呈色、ＭＲＩ、Ｘ線など）の使用に従って検出し得る。一つの実施形態では、診断用ＰＭＢＣは、共有または非共有（例えば、静電）結合によって検出可能な標識に連結されている。
【０１００】
一つの実施形態において、検出可能な標識は、金属イオンのそれぞれの放射性同位元素、Ｔｃ、オキソＴｃ、Ｉｎ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｘｅ、ＴｌおよびＲｅ、オキソＲｅ、ならびに共有結合した原子のいずれか：１２３Ｉおよび１３１Ｉ（放射性同位体スキャン用、例えばＳＰＥＣＴなど）；Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）（ＭＲＩ用）；ならびに１８Ｆ、１５Ｏ、１８Ｏ、１１Ｃ、１３Ｃ、１２４Ｉ、１３Ｎおよび７５Ｂｒ（陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン用）であり得る。
【０１０１】
一つの実施形態において、本発明のＰＭＢＣは、ＰＥＴスキャンによるアポトーシスの臨床用イメージングを目的としたものであり、ＰＭＢＣは１８Ｆ原子を含む。
イメージング用マーカーとして使用されるある種の放射性同位体（例えば、１８Ｆ）は半減期が短いため、臨床用ＰＥＴイメージングの目的のためのかかるマーカーの結合は、患者への診断用化合物の投与直前に行うのがよい。したがって、患者への投与前に、１８Ｆなどの放射性同位体に置換される部分を含むＰＭＢＣ−ＰＥＴ前駆物質を合成することは有用であり得る。一つの実施形態では、１８Ｆと置き換わる部分は、ヒドロキシル基、ニトロ基またはハロゲン原子（例えば、臭素または塩素など）から選択される。かかるＰＭＢＣ前駆物質ＰＭＢＣ−ＰＥＴ前駆物質もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１０２】
ＰＭＢＣ（このの構造の任意のＰＭＢＣであり得る）をＰＥＴイメージング用１８Ｆで標識するための方法は、１８Ｆ原子をＰＭＢＣに結合する工程；それにより、ＰＭＢＣをＰＥＴイメージング用の１８Ｆで放射性標識する工程を含む。任意選択で、１８Ｆ原子を結合する工程の前に、ＰＭＢＣの官能基を適切な保護基で保護してもよい。この保護基は、その後、任意選択で、１８Ｆ原子の結合工程の後で除去する。
【０１０３】
マーカー金属原子の場合（例えば、それぞれＭＲＩまたはＳＰＥＣＴの場合でＧｄ、９９ｍＴｃまたはオキソ９９ｍＴｃ）、ＰＭＢＣは、金属キレート化剤を含む。キレート化剤の金属配位性原子は、窒素、硫黄または酸素原子であり得る。本発明の一つの実施形態において、キレート化剤は、ジアミンジチオール、モノアミンモノアミド−ビスチオール（ＭＡＭＡ）、トリアミド−モノチオールおよびモノアミン−ジアミド−モノチオールである。かかる場合において、金属原子との錯体形成前のキレート化剤と結合しているか、またはこれを含むＰＭＢＣであるＰＭＢＣキレート前駆物質、金属原子を含有する錯体は、ともに本発明の範囲に含まれる。
【０１０４】
蛍光検出のため、診断用ＰＭＢＣは、当該技術分野で知られた任意の蛍光プローブから選択される蛍光基を含み得る。かかるプローブの例は、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニルアミド（ダンシルアミド）、およびフルオレセインである。
【０１０５】
本発明の化合物は、ＰＮＯＭ細胞の形成を特徴とする多種多様な病状の検出および診断に使用され得る。ＰＮＯＭ細胞を特徴とする病状の例は、以下のとおりである。
過剰アポトーシスの発生を特徴とする疾患、例えば、変性障害、神経変性障害（例えば、パーキンソン疾患、アルツハイマー疾患、ハンティングトン舞踏病）、ＡＩＤＳ、ＡＬＳ、プリオン病、骨髄異形成症候群、虚血性または毒性傷害、移植片拒絶反応の際の移植片の細胞減損；腫瘍、および 特に高度に悪性／攻撃的な腫瘍などは、多くの場合、過剰組織増殖に加えてアポトーシスの増強もまた特徴とする。
【０１０６】
本発明の実施例３ならびに図２は、死亡過程を実行中の脳細胞の検出における本発明の化合物の性能を例示する。細胞死の誘因は、虚血／再潅流とした。障害を受けた脳半球は、反対側の非障害半球と比べ、著しく高いレベルのトリチウム標識ＮＳＴ２００取込みを示した。
【０１０７】
過剰血液凝固を示す疾患、これは、ＰＮＯＭが、血小板活性化の際、および／または他の細胞内事象の活性化またはこれに対する障害（例えば、内皮細胞）の際に存在する。このような疾患としては、とりわけ、動脈または静脈の血栓症、血栓塞栓症、例えば、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体 症候群、全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【０１０８】
炎症性障害および／または免疫媒介性の病因または病原と関連する疾患、自己免疫障害（例えば、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデスなど）、結合組織障害（例えば、慢性関節リウマチ、強皮症など）；甲状腺炎；皮膚障害（例えば、天疱瘡または結節性紅斑）；自己免疫性血液障害；自己免疫性神経障害（例えば、重症筋無力症）；多発性硬化症；炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎など）；脈管炎。
【０１０９】
アテローム性プラーク、特に、不安定で、裂開を受けやすく、また裂開する傾向があるプラークもまた、ＰＮＯＭ細胞（例えば、アポトーシスマクロファージ、アポトーシス平滑筋細胞、アポトーシス内皮細胞、および活性化された血小板）を特徴とする。かかる活性化された血小板は血栓において見られ、多くの場合、不安定なアテローム性プラークと会合している。
【０１１０】
また、検出は、それぞれの疾患を有することがすでにわかっている場合において、疾患の重篤度を評価する目的で、および疾患過程および／または種々の治療モダリティに対する応答をモニターするために行なわれ得る。かかるモニタリングの非限定的な例は、抗癌治療に対する応答の評価である。ほとんどの抗腫瘍治療（例えば、化学療法または放射線療法など）は、アポトーシスの誘導によってその効果を発揮し、腫瘍細胞の治療誘導性アポトーシスの診断用ＰＭＢによる検出は、抗腫瘍薬剤に対する腫瘍の感受性の程度を教唆し得る。これは、抗癌治療の施行時点と、その効力の適正な評価時点との間の遅延期間を実質的に短縮し得る。
【０１１１】
さらにまた、検出は、抗癌治療の有害効果をモニターするためにも使用され得る。かかる有害効果の大部分は、正常であるが敏感な細胞（例えば、胃腸管上皮または骨髄造血系ものなど）における不適当な治療に誘導されたアポトーシスによるものである。
【０１１２】
加えて、検出は、固有のアポトーシス負荷（多くの場合、腫瘍攻撃的性のレベルと相関する）の特性付けを目的としたものであり得、また、転移部内で頻繁に起こる固有のアポトーシスの検出により転移の検出を補助し得る。
【０１１３】
同様に、本発明の診断用ＰＭＢＣは、アポトーシスが移植片拒絶の際の細胞減損に主要な役割を果たしているため、器官移植後の移植片生着のモニタリングに有用であり得る。
加えて、検出は、細胞保護治療に対する応答のモニタリングを目的としたものであり得、したがって、細胞死の評価の目安となり得ることにより、種々の疾患における細胞減損を抑制することができる薬物（例えば、上記のもの）のスクリーニングおよび開発を補助する。
【０１１４】
また、検出は、かかるプラークの不安定化（裂開、血栓症および塞栓形成を受けやすくなり、また裂開する傾向になる）が、いくつかの型のＰＮＯＭ細胞（アポトーシス細胞（アポトーシス性マクロファージ、平滑筋細胞および内皮細胞）、ａｎｄ 活性化された血小板を含む）の関与を特徴とするため、アテローム性プラークの検出に有用であり得る。
【０１１５】
このアプローチによれば、本発明は、全身、器官、組織、組織培養物から選択される細胞集団または任意の他の細胞集団におけるＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）細胞集団を、本発明の実施形態のいずれかによる診断用ＰＭＢＣと接触させること；および（ｉｉ）細胞集団に結合したＰＭＢＣの量を測定することを含み、ここで、この集団内の細胞に結合した化合物の有意な量の検出は、細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す、ＰＮＯＭ細胞の検出方法に関する。
【０１１６】
実施例の項に、トリチウム標識ＮＳＴ ２００、ＮＳＴ ２０３およびＮＳＴ ２０５がアポトーシス細胞に、対照の非アポトーシス細胞よりも高量で結合する能力の能力を示し、これは、アポトーシス細胞の選択的な結合および検出を行なう際の本発明の化合物の特性を示す。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、さらに、患者または動物においてインビボでのＰＮＯＭ細胞の検出方法であって、（ｉ）診断用ＰＭＢＣを検査対象の患者または動物に投与すること、ここで、この投与は、非経口（例えば、静脈内）または経口投与などの当該技術分野で知られた任意の手段によって行なわれる；および（ｉｉ）検査対象の患者または動物のイメージングを、当該技術分野で知られた任意の方法（例えば、ＰＥＴスキャン、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ）によって行ない、細胞に結合した診断用ＰＭＢＣの量を検出および測定することを含み、ここで、細胞に結合した化合物の有意な量は、細胞がＰＮＯＭ細胞であることを示す、ＰＮＯＭ細胞の検出方法に関する。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、本発明は、組織または細胞培養物試料中のＰＮＯＭ細胞のインビトロまたはエキソビボでの検出方法であって、（ｉ）試料を診断用ＰＭＢＣ（本発明において記載のＰＭＢＣ化合物のいずれかであり得る）と、診断用ＰＭＢＣのＰＮＯＭ細胞の生体膜との結合を可能にする条件下で接触させること；および（ｉｉ）細胞に結合した診断用ＰＭＢＣの量を検出すること、ここで、結合した診断用化合物の有意な量の存在は、組織または細胞培養物内におけるＰＮＯＭ細胞の存在を示す、検出方法に関する。
【０１１９】
インビトロまたはエキソビボ試験における検出工程は、例えば蛍光標識された本発明の化合物の場合、限定されないが、市販品として広く入手可能な装置にて細胞の可視化を可能にするフローサイトメトリー解析を使用するものであり得る。細胞を可視化するために蛍光を使用する一例では、単一の１５ｍＷアルゴンイオンレーザー光線（４８８ ｎｍ）を用いてＦＩＴＣ 蛍光を励起し、蛍光データを、５３０ｎｍ帯域通過フィルタを用いて収集し、ヒストグラムを作成する。蛍光細胞の割合は、例えば、Ｌｙｓｉｓ ＩＩソフトウェアまたは任意の他のソフトウェアを用いて算出し得る。この検出方法は、本発明の一つの実施形態において、抗癌薬などの治療用薬物のスクリーニングのために使用し得る。
【０１２０】
用語「有意な量」は、本発明によれば、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量が、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量よりも少なくとも３０％多いことを意味する。実際の量は、用いるイメージング方法および装置に応じて、および検査対象の器官または組織に応じて異なり得る。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量よりも少なくとも５０％多い。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量よりも少なくとも７５％多い。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも２倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも４倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＭ細胞に結合した量の少なくとも６倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも８倍である。別の実施形態では、ＰＮＯＭ細胞に結合したＰＭＢＣの量は、非ＰＮＯＭ細胞に結合した量の少なくとも１０倍である。
【０１２１】
結合の作用は、とりわけ、結合の違いを測定する方法に依存する。本発明の方法は、ＰＮＯＭ細胞の存在を特徴とする疾患、例えば、限定されないが、上記のいずれかの疾患の診断に使用され得る。
【０１２２】
本発明の方法はまた、疾患または病状の治療のため、あるいはまた、先に説明したような基礎的な科学研究目的のために使用される種々の治療モダリティの効果のモニタリング
に使用され得る。
【０１２３】
「治療用アプローチ」と称する本発明の第２のアプローチによれば、本発明は、活性な薬物またはプロドラッグをＰＮＯＭ細胞に標的化するために使用される、ＰＭＢＣを含む医薬組成物に関する。治療用ＰＭＢＣは、本発明によれば、薬物を含むＰＭＢＣまたは医薬として有用な薬剤とコンジュゲートしたＰＭＢＣを意味する。用語「コンジュゲート」は、当該技術分野で知られた任意の手段によって互いに連結された２つの分子を意味する。
【０１２４】
医薬として有用な薬物と、ＰＭＢＣ（これは、治療用ＰＭＢＣに含まれているか、または連結されている）との会合は、共有結合、非共有結合（例えば、静電力）によるもの、または薬物を含み、かつその表面上に、この複合体をＰＮＯＭ細胞に標的化するＰＭＢＣを有する担体粒子（例えば、リポソームなど）の形成によるものであり得る。薬物が標的に達すると、これはその生理学的活性を、なおＰＭＢＣ−コンジュゲートの一部であるとき、ＰＭＢＣをその膜上に有する薬物含有リポソームの食作用によって、または任意の他の既知の機序によってＰＭＢＣ単位から解離した後（例えば、切断、破壊など、天然酵素の活性により）のいずれかで発揮できるはずである。
【０１２５】
薬物は、組成物が意図される具体的な疾患に応じて選択するのがよい。
本発明の医薬組成物、ならびに診断用組成物は、任意の公知の経路、とりわけ、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下、眼内、鼻腔内または局所投与、または大脳内投与によって投与され得る。担体は、所望の投与様式に応じて選択するのがよく、任意の公知の成分、例えば、溶媒；乳化剤（ｅｍｕｌｇａｔｏｒ）、賦形剤、タルク；香料；着色料などを含み得る。医薬組成物は、所望により、他の医薬的に活性な化合物（これは、疾患を治療するため、副作用を排除するため、または活性成分の活性を増大させるために使用される）もまた含み得る。
【０１２６】
この態様によれば、本発明は、さらにまた、ＰＮＯＭ細胞が現れる疾患の治療方法であって、かかる治療を必要とする個体に、有効量の治療用ＰＭＢＣを投与することを含み、この治療用ＰＭＢＣが、疾患の治療物質として活性である薬物または標的化領域において活性な薬物に変換されるプロドラッグを含む、この疾患の治療方法に関する。治療用ＰＭＢＣは、薬物を、ＰＮＯＭ細胞を含むに組織に選択的に標的化することを可能にし、したがって、その局所濃度を増大させ、標的部位でのその治療効果を潜在的に増強する。かかる医学的障害は上記規定のものである。
【０１２７】
別の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す化合物のいずれか１つおよび細胞傷害剤を含む治療用ＰＭＢＣの投与によって、腫瘍内のアポトーシス細胞を標的化し、それにより、癌細胞を死滅させる工程を含む、腫瘍内の癌細胞の死滅方法を提供する。一つの実施形態では、腫瘍細胞の死滅方法は「自己触媒機構」を伴い、この場合、腫瘍に標的化される細胞傷害性薬剤の量は順次用量とともに増加する。それは、各用量において、その細胞傷害性効果により腫瘍内のアポトーシス細胞の負荷が増強され、したがって、治療用ＰＭＢＣの次の用量での標的化のための部位がより多くもたらされるためである。かかるストラテジーは、抗癌治療の効力を増強し得、腫瘍根絶の機会を増大させ得る。
【０１２８】
治療用ＰＭＢＣの「有効量」という用語は、疾患の少なくとも１つの有害な徴候を測定可能なレベルまで減少させることができる量をいい、使用する薬物、投与様式、患者の年齢および体重、疾患の重篤度などに応じて選択するのがよい。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明の治療用ＰＭＢＣは、治療効果を有する放射性同位体を含むか、またはこれに連結されている。かかる放射性同位体の一例は、限定されないが、治療用目的に有用な、イットリウム９０、ヨウ素１３１、レニウム１８８、ホルミウム１６６、インジウム１１１、ルテチウム（Ｌｅｕｔｉｔｉｕｍ）１７７、または放射線を発する任意の他の放射性同位体である。
【０１３０】
別の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶに示す化合物であって、抗凝血薬または線維素溶解薬に連結されたこの化合物のいずれか１つを含む治療用ＰＭＢＣを投与し、それにより、治療剤を、血餅内の活性化された血小板に標的化し、血栓形成を低減／抑制することによる、血餅の低減／抑制を提供する。
【０１３１】
この方法はまた、過剰血液凝固を示す疾患であって、ＰＮＯＭが血小板活性化の際、および／または他の細胞内事象の活性化またはこれに対する障害の際に存在する（例えば、内皮細胞）疾患治療または予防するためにも使用され得る。このような疾患としては、とりわけ、動脈または静脈の血栓症、血栓塞栓症、例えば、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【０１３２】
「クリアランスアプローチ」と称する本発明の第３のアプローチによれば、ＰＮＯＭ細胞に特異的に結合する本発明のＰＭＢＣの性質は、細胞の体液を浄化するために利用される。本発明の一つの実施形態において、体液は血液または血液製剤である。
【０１３３】
体外循環を必要とする多くの外科的または医学的介入には、血液成分の外因性人工的環境への曝露が付随する。これは、多くの場合、血液細胞の活性化およびこれに対する障害、全身性炎症、および深刻な臨床結果（例えば、脳血管内の微小塞栓の持続的存在（ｌｏｄｇｉｎｇ）時の神経機能障害など）を潜在的に有する血栓塞栓性の現象をもたらす。したがって、障害され活性化された細胞またはアポトーシス細胞を検出し、血液から除去することが望ましい。
【０１３４】
したがって、その態様の１つによれば、本発明は、固相支持体上に固定化されたＰＭＢＣに関する。固定化は、直接結合によるもの、共有結合または非共有結合のいずれかによるもの、またはスペーサーを介した結合によるものであり得る。固定化されたＰＭＢＣは、体液をＰＮＯＭ細胞から浄化することを意図するものである。
【０１３５】
本発明の別の実施形態によれば、固相支持体は、ＰＭＢＣが結合される複数のビーズを特色とする。好ましくは、ビーズは樹脂コートビーズである。あるいはまた、ビーズは磁気ビーズであり得る。
【０１３６】
固相支持体が複数のファイバーまたはマイクロキャピラリーを含み、個々の間および／または内部に体液が流れる場合、その内側および／または外側の面をＰＭＢＣで被覆する。
【０１３７】
固相支持体上に固定化された化合物は、濾過デバイスの一部を構成する。したがって、クリアランスアプローチによれば、本発明は、さらに、固相支持体上に固定化された化合物を内包するハウジング、ならびに流体供給口および流体排出口を備える濾過デバイスに関する。血液または血液製剤などの体液は、供給口を通してハウジング内に入り、ハウジングに内包された固定化ＰＭＢＣと接触し、これに接着する。したがって、体液には、摂動した膜を有する循環細胞、例えば損傷を受けた細胞または死滅中の細胞がなく、より大きな構造体、例えばＰＮＯＭ膜を有する塞栓がない。結果として、排出口から排出される流体は、ＰＮＯＭ細胞の含量が低下しており、本質的にこれをもたない。
【０１３８】
濾過デバイスは、体外循環装置の交換可能な部分、常置される部分、または付加的部分を構成し得る。したがって、本発明はまた、濾過デバイスを含む体外循環装置であって、この装置内部を循環する血液がこの装置も通る体外循環装置に関する。
【０１３９】
かかる装置の例は、心肺バイパス装置；血液透析装置；血漿交換装置および輸血装置（例えば、当該技術水準の輸血バッグ）である。
実施例
本発明を理解するため、およびこれを実際にどのように行い得るかがわかるように、以下の実施例：本発明の化合物の合成に関する実施例；および死亡過程を実行中の細胞に対する選択的な結合における本発明の化合物の性能に関する実施例を記載する。本発明の化合物の検出を可能にするため、これをトリチウムで放射標識し、損傷を受けた領域内への取込みを測定することにより、またはオートラジオグラフィー法によって検出した。一部の実施例では、化合物を蛍光標識、すなわちダンシルアミド基への結合によって標識し、蛍光顕微鏡検査によって検出した。アポトーシス細胞に対するこの化合物の結合の選択性は、インビトロで組織培養物において、およびインビボで細胞死を中大脳動脈の閉塞によって誘導した脳卒中のマウスモデル、腎虚血性または毒性傷害のマウスモデル、黒色腫のマウスモデル、結腸癌のマウスモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、多発性硬化症に関連するマウスモデルにおいて示された。
【０１４０】
（実施例１）
ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆ−４（２−ブチル−２（３−フルオロプロピル）−マロン酸）の合成；（スキーム１）：
ジ−ｔ−ブチルマロネート（５ｍＬ）を、１当量のＮａＨを含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で脱プロトン化し、１当量のヨウ化ｎ−ブチルを、水素発生が止まった後、添加した。反応混合物を５０℃まで１４時間加熱した。５．８ｇのジ−ｔ−ブチル、ブチルマロネート（２）を９５％収率で、カラムクロマトグラフィーを用いて得た。２（３．８ｇ）を、ＮａＯＣＨ３（０．０５当量、触媒量）およびアクロレイン（１．１当量）を含むトルエンで処理し、１．２６ｇのアルデヒド（３）を３０％収率で得た。化合物３を、次いで、ＮａＢＨ４（１．０５当量）を含むエタノール／水（８：１ｖ／ｖ）の混合物で２時間反応させた。処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）およびフラッシュクロマトグラフィー後、純粋なアルコール４を得た（９３％）。得られた生成物を、１．１当量の塩化メタンスルホニル（ＭｓＣｌ）および２．２当量のトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）で処理し、メシラート化合物５を９７％収率で得た。この生成物は本質的に純粋であり、さらに精製を行なわずに次の反応に直接持ち越した。
【０１４１】
ＫＦ（５当量）、クリプトフィックス（５当量）およびＫ２ＣＯ３（２．５当量）を２ｍＬのアセトニトリル中に含む混合物を、窒素気流下、４回ストリッピングして乾固した。次いで、メシラート化合物５（１６７ｍｇ）を含む２ｍＬのアセトニトリルを添加した。反応物を、１２０℃のサンドバス内で１０分間攪拌した。処理すると、粗製生成物の１Ｈ ＮＭＲにより、所望の生成物６とクリプトフィックスの混合物が示された。ｄｉ−ｔ−ブチルエステル６の脱保護を、（４７４ｍｇ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１７ｍＬ）を用い、１０℃で３０分間行ない、次いで、蒸発乾固した。残留物を、クロロホルムから２回エバポレートし、真空ラインにて乾燥し、ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆ−４の白色固形物（３１２ｍｇ、９９％）を得た。この化合物のＮＭＲデータは：ｌＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣ１３）δ４．４１（ｄｔ，Ｊｔ＝５．９Ｈｚ，Ｊｄ＝４７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９７−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．８９−１．８３（ｍ，２Ｈ），１．６９−１．６０（ｍ，１Ｈ），１．５８−１．５２（ｍ，１Ｈ），１．３３（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．２５−１．１４（ｍ，２Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７５．８，８６．２，８４．１，５８．６，３４．１，３０．１，３０．０，２７．９，２７．３，２７．０，２４．５，１４．６；ｌ９ＦＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ−２２０．９；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ２１９（Ｍ−Ｈ）である。
【０１４２】
【化３１】
（実施例２）
ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆ：２−メチル−２（３−フルオロプロピル）−マロン酸の合成；（スキーム２）：
４−ブロモ−１−ブタノール（１）３ｇを、１．５当量の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランおよび０．１当量のｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）を含む１３５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で処理した。処理および精製後、１．４５ｇ（３３％）の生成物２を得た。１．０当量のジエチルメチルマロネートを、１当量のＮａＨで脱プロトン化し、１．０当量のブロミド２を、触媒量のＫＩとともに５０℃で添加した。完全な変換が１０時間に観察され、９０％収率が得られた。テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）のＰＰＴＳ含有エタノールでの脱保護は、５５℃で順調に進行した。処理後、定量的収率のアルコール４が得られ、メシル化反応に直接使用した（前述と同様）。得られたメシラート５を用い、クリプトフィックスの反応を、上記のようにして適用した。化合物６を６８％収率で得た。化合物６（２３３ｍｇ）を、２Ｎ ＮａＯＨ／ＥｔＯＨ（３０ｍＬ／５ｍＬ）で５０℃にて処理し、ＮＳＴ−ＭＬ−Ｆを約９９％収率（１９０ｍｇ）で得た。この化合物のＮＭＲデータは、以下のとおりである。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１１．８９（ｂｓ，２Ｈ），４．４６（ｄｔ，Ｊｔ＝５．９Ｈｚ，Ｊｄ＝４７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９９−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，２Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１７８．６，８５．１，８２．９，５４．２，３５．５，３１．０，３０．８，２０．８，２０．７，２０．２；１９ＦＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ−２１９．０，ＭＳ（ＥＩ）．
【０１４３】
【化３２】
（実施例３）
トリチウム標識ＮＳＴ ２００およびＮＳＴ２０５の、ＣＤ９５により誘導されたアポトーシスを実行中である培養ジャーカット細胞への選択的結合
実験手順
培養ジャーカット細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、ｌｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび抗生物質（１００単位／ｍｌペニシリン；１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１２．５単位／ｍｌのナイスタチン）を加えたＲＰＭＩ培地（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中の懸濁液中で成長させた。アポトーシスの誘導前に、培地をＨＢＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ）と交換した。次いで、アポトーシスを、ＣＤ９５（０．１ｕｇ／１０７細胞／ｍｌ）での処置によって誘発した。その結果、著しい割合の細胞がアポトーシスとなった。非処置細胞を対照とした。次いで、対照細胞およびアポトーシス細胞の両方を４０分間、室温でインキュベートした後、３０分間氷上で、（２μＣｉ／１０７細胞／０．５ｍｌ）トリチウム標識ＮＳＴ ２００およびＮＳＴ ２０５とともにインキュベートした。
【０１４４】
細胞を２回洗浄した後、１ｍｌのＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）試薬（ＧＮＥ９１００、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、このペレットに添加した。１時間の６０℃でのインキュベーション後、抽出物をガラスシンチレーションバイアル内に移し、１０ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ ６０１３３２９、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各バイアルに添加した。放射能を、１時間の室温までの冷却および暗順応後に計測した。放射能の値を計算し、添加した放射標識したＮＳＴ ２００およびＮＳＴ ２０５の総量に対するパーセントで示した。
実験結果
図２Ａから明白にわかるように、アポトーシス細胞は、非アポトーシス細胞と比べ、著しく高いＮＳＴ２００の取込み（８倍を超える）を示した。この実験は、ＮＳＴ２００が、アポトーシス細胞に選択的に結合でき、その検出のためのマーカーとしての機能を果たし得ることを示す。同様に、図２Ｂからわかるように、アポトーシス細胞は、非アポトーシス細胞と比べ、高いＮＳＴ２０５の取込みを示し、この効果は、カスパーゼ阻害剤であるＺＶＡＤ（フルオロメチルケトンペプチド（ｐｅｐｔｉｄ）（Ｖ−バリン、Ａ−アラニン、Ｄ−アスパラギン酸塩）カスパーゼ阻害剤）を添加している間に完全に逆転した。
【０１４５】
（実施例４）
アポトーシスを実行中の培養ＨｅＬ細胞に対するＮＳＴ ２０３の選択的結合
ＨｅＬａ Ｓ３ 細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２）を、２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌのナイスタチンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。細胞を、５×１０６細胞／プレートの密度で１０ｃｍ３ 培養プレート上に、１０ｍｌの容量で播種し、成長培地を交換することなく９６時間、培養物をインキュベートすることにより熟成させた。その結果、著しい割合の細胞がアポトーシスとなった。細胞を、細胞スクレーパーを用いて回収し、１８Ｇニードルを有するシリンジに通すことにより単一の細胞に分離し、１０６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）中に再懸濁した。これは、単一の細胞の蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｅｎｃｅ）の可視化を可能にするダンシルアミド基を含むＮＳＴ ２０３の前に見られた。アポトーシス細胞に対するＮＳＴ２０３の選択的な結合を図３Ａに示す。図は、アポトーシス細胞集団内へのＮＳＴ ２０３の取込みを示す（緑、照り輝く（ｇｌｏｗｉｎｇ）色の細胞の代表を矢印で示す）。一方、非アポトーシス細胞では蛍光観察されない（青、照り輝いていない細胞、矢じりで示す）。
【０１４６】
対照的に、同じフルオロフォアを有するが、ＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフを欠く対照化合物のｎ−ブチル−ダンシルアミド（ＢＤＡ）は、この選択性を示さず、したがって、アポトーシス細胞に対する選択的な結合におけるＮＳＴ−ＭＬ−作用モチーフの活性が示された（図３Ｂ）。したがって、ＮＳＴ２０３は、マーカーとしての機能を果たし得、アポトーシス細胞に対する選択的な結合を行なう。
【０１４７】
（実施例５）
マウスにおいてインビボで化学療法により誘導された死亡過程を実行中の黒色腫に対するＮＳＴ ２０３の選択的結合
実験手順
マウス（ｃ５７／ｂｌａｃｋ；８週齢雄マウス）に、マウス黒色腫由来Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５；１０５細胞／マウスを１００μｌの容量で）を、脇腹に左右対称に皮下注射した。注射の前、この細胞株は、４ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌのナイスタチンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、培養状態で維持した。１０日後、腫瘍直径が５〜７ｍｍの大きさに達したとき、マウスを、化学療法処置（Ｔａｘｏｌ ２０ｍｇ／Ｋｇをシクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｍｉｄｅ）３００ｍｇ／Ｋｇとともに、２００μｌの容量で腹腔内注射）に供した。２４時間後、ＮＳＴ−２０３を、２．８ｍｇ／マウス（１０％発色団含有トリス系バッファー中）の用量で静脈内注射した。２時間後、マウスを致死させ、腫瘍および他の器官を回収し、直ちに液体窒素中で凍結させた。腫瘍または他の器官によるＮＳＴ−２０３の取込みを、各組織由来の凍結切片の蛍光顕微鏡検査によって評価した。
実験結果
図４Ａは、腫瘍の蛍光顕微鏡検査を示す。アポトーシスを実行中の数多くの腫瘍細胞に対するＮＳＴ２０３の広範な結合を観察することができる。また、この化合物の細胞内蓄積（写真の右側）および高レベルの選択性も示されており、アポトーシス細胞内への著しい取込みを反映しているが、周囲の腫瘍生細胞は、非染色のままである（写真の左上側）。
【０１４８】
化学療法は、多くの場合、標的腫瘍組織だけでなく、非標的組織（例えば、胃腸管の上皮）においても細胞死を誘導する作用をする。図４Ｂは、アポトーシスを実行中のこれらの細胞を選択的に検出するＮＳＴ２０３の能力を示す（矢印参照）。腫瘍における所見と同様、胃腸管の生細胞は、ＮＳＴ２０３の取込みを示さず、したがって暗いままであった。
【０１４９】
したがって、この結果は、本発明の化合物であるＮＳＴ２０３が、死亡過程が化学療法により誘導されているアポトーシス細胞をインビボで特異的に標的化する能力を示す。アポトーシス細胞は、関与する組織とは無関係に、普遍的な様式で検出される。対照的に、この組織の生細胞は、かかる結合を示さない。
【０１５０】
（実施例６）
結腸癌のマウスモデルにおける化学療法に対する応答の３Ｈ−ＮＳＴ２００を用いたオートラジオグラフィー法によるイメージング
実験手順
結腸癌モデルを、Ｂａｌｂ／ｃ 雄マウスの腹部において確立した。第１２〜１４日に、腫瘍の大きさが直径６〜８ｍｍになったとき、結腸癌腫瘍を、２回用量のドキソルビシン（２０ｍｇ／ｋｇ、７２時間空ける）の点滴で処置した後、腫瘍内へのＮＳＴ２００の取込みを測定した。化学療法の４８時間後、対照非処置動物および化学療法処置動物の両方に、放射標識したＮＳＴ２００（８０μＣｉ／動物）を静脈内注射した。４時間後、動物を致死させた。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルムに露光した。フィルムを７週間の期間露光し、現像し、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血中心対反対側の半球とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。シグナルを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅオートラジオグラフィー標準にしたがって変換し、ｎＣｉ／ｍｇ単位で示した。
実験結果
非処置腫瘍はＮＳＴ２００の取込みを示さず、したがって、オートラジオグラフィーによって画像は検出され得なかった（図５Ａ）。しかしながら、化学療法により細胞死を誘導すると、ＮＳＴ ２００取込みの劇的な増加が起こり、これは、照射誘導性細胞死の大規模プロセスを示す（図５ＢおよびＣ）。ＮＳＴ ２００取込みは、腫瘍の表面上の多くの病巣において、暗くて強い斑の形態で検出され得る。ＮＳＴ−２００標識化は、腫瘍内の特定のアポトーシスの病巣領域に局在し、腫瘍全体に拡散していなかった。処置腫瘍の他の領域は標識されず、これは、腫瘍組織の生存を示す。この観察結果により、ＮＳＴ ２００が、死滅中の細胞に選択的に大量に蓄積され、生細胞には蓄積されない分子を標的化するのに好都合であることが強調された（図５Ｂ）。同じ腫瘍内であっても治療に対する応答が不均一な性質が図５Ｃに示されている。ＮＳＴ２００の取込みは、特に、細胞死の増大を示した腫瘍の大きな一領域に蓄積しているが、化学療法に対する応答を示さなかった他の腫瘍領域には蓄積されていない。
【０１５１】
（実施例７）
結腸癌モデル内への３Ｈ−ＮＳＴ ２００の取り込み：化学療法の効果
実験手順
結腸癌モデル
マウス結腸癌細胞（ＣＴ−２６）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３８）を、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ， ＵＫ）、２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌナイスタチン；および１０％加熱不活化ＦＣＳ中で維持した。試験は、８〜１０週齢の成体雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重２０〜２５ｇ）において行なった。
腫瘍の播種：
細胞をトリプシン処理し、ＨＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０． ５Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ ７．４）で２回洗浄し、次いで（ｔｈａｎ）遠心分離し（５分間、１０００ｒｐｍ、４℃）、（２％）メチルセルロースと生理食塩水（１：３）の混合物中２×１０６細胞／ｍｌに濃縮した。０．２ｍｌの容量の上記の溶液（４×１０５細胞／用量を含有）をマウス腹部の両側に皮下注射し、この間、マウスには麻酔した。麻酔用ストック溶液は、０．８５ｍｌケタミン（ｌＯＯｍｇ／ｍｌ）＋０．１５ｍｌキシラジン（２％）を１：１０に希釈して調製した。重量１０ｇあたりＯ．ｌｍｌの希釈溶液を、（ｉ．ｐ．）注射した。
腫瘍追跡：
マウスを、毎日、触診可能な腫瘍形成について検査した。腫瘍注射の７〜１０日間後、小さな腫瘍が現れた。
結腸癌腫瘍内への３Ｈ−ＮＳＴ２００ 取込みの評価
腫瘍内への３Ｈ−ＮＳＴ２００の取込みを、２回用量のドキソルビシン（２０ｍｇ／ｋｇ、７２時間空ける）の点滴での結腸癌腫瘍の処置後に測定した。２回目の投与の４８時間後、マウスに３Ｈ−ＮＳＴ２００（１０μＣｉ／動物）を静脈内注射した。４時間後、腫瘍を回収し、重量計測し、組織を処理した。腫瘍の溶解を、ＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）試薬（ＧＮＥ９１００， Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、１５０ｍｇの腫瘍組織に対して試薬１ｍｌの比率で用い、６０℃にて、２０ｍｌ容シンチレーションガラスバイアル内で行なった。２〜４時間後、各組織抽出物の１ｍｌをガラスシンチレーションバイアルに移した。着色消光の問題を低減するため、試料を０．４ｍｌの３０％Ｈ２０２で０．０６６Ｍ ＥＤＴＡの存在下で処理した。１５分間の室温でのインキュベーション時間後、抽出物を１時間６０℃でインキュベートした後、さらに１５分間室温でインキュベーションした。１０ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ、６０１３３２９、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各バイアルに添加した。バイアルを１時間室温でインキュベートし、次いで、βカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ２１００ＴＲ、液体シンチレーションアナライザー、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において解析した。すべての試料は、３連で測定した。注射した用量のパーセントの値（％ＩＤ／ｇ（組織））を各試料について計算した。
実験結果：
ドキソルビシン処置した結腸癌腫瘍対非処置対照腫瘍における３Ｈ−ＮＳＴ２００蓄積の定量分析により、処置の４８時間後に３Ｈ−ＮＳＴ２００の大量蓄積が示された。一方、対照群では、すべての腫瘍に、同様だが少量の３Ｈ−ＮＳＴ２００が蓄積し、化学療法処置腫瘍では、蓄積値は、腫瘍によってばらつきがあり、対照群と比べ、取込みの４０〜５０倍の増加を示した。処置群における取込みの平均値は１．２８％ＩＤ／ｇであり、これは、ｍｏｒｅ ｏｆ 対照群の平均値より１２．１倍大きかった（図６参照）。この広域の３Ｈ−ＮＳＴ２００蓄積値は、種々の腫瘍の抗癌処置に対する個々の応答を反映する。上記の実験は、３Ｈ−ＮＳＴ２００が、癌を検出する機能および癌細胞に対して細胞傷害剤の効果を検出する機能を果たし得ることを明白に示す。
【０１５２】
（実施例８）
結腸癌腫瘍を有するマウスにおける３Ｈ−ＮＳＴ２００の生体分布
実験手順
結腸癌モデルを、Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスの腹部において、前述の実施例に記載のようにして確立し、３Ｈ−ＮＳＴ２００（１０μＣｉ）を、ドキソルビシンで処理した動物に注射した。４時間後、動物を致死させ、種々の器官／組織を回収し、処理し、これらの内部での３Ｈ−ＮＳＴ２００の蓄積を測定した。各器官内における取込みを、注射した用量（ＩＤ）に対する％で示し、腫瘍と他の器官との取込みの比率を計算し、これを表に添付の図７として示す。
実験結果
ドキソルビシンによって誘導された腫瘍組織に対する障害は、実際、他の非標的器官（心臓および小腸を含む）に対する障害よりも大きかった。腫瘍対すべての器官における取込みの比率は、表において＞１であり、これは、腫瘍におけるアポトーシスの増加および標的対非標的組織における３Ｈ−ＮＳＴ２００の選択的蓄積を示す。
【０１５３】
（実施例９）
３Ｈ−ＮＳＴ２００は、ＢｉＣＮＵ処置腫瘍内で起こっている細胞死を腫瘍の大きさの縮小前に検出し得る
実験手順
結腸癌モデルを、Ｂａｌｂ／ｃ雄マウスの腹部において、実施例１０に記載のようにして確立した。第１２〜１４日に、腫瘍の大きさが直径６〜８ｍｍになったとき、マウスにドキソルビシンを静脈内注射した。合計２回のドキソルビシンを、３日間の間隔を空けて与えた（各用量は２０ｍｇ／Ｋｇとした）。２回目のドキソルビシン注射の２日後、マウスに、１０μＣｉの３Ｈ−ＮＳＴ２００を０．２ｍｌの容量の生理食塩水にて点滴した。３Ｈ−ＮＳＴ２００注射の４時間、マウスを、ペンタールの過剰投与により致死させた。腫瘍をエッペンドルフチューブ内に回収し、重量計測し、−２０℃にて凍結させた。
【０１５４】
腫瘍の溶解を、ＳＯＬＶＡＢＬＥ（商標）試薬（ＧＮＥ９１００， Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、１５０ｍｇの腫瘍組織に対して試薬１ｍｌの比率で用い、６０℃にて、２０ｍｌ容シンチレーションガラスバイアル内で行なった。２〜４時間後、各組織抽出物の１ｍｌをガラスシンチレーションバイアルに移した。着色消光の問題を低減するため、試料を０．４ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２で０．０６６Ｍ ＥＤＴＡの存在下で処理した。１５分間の室温でのインキュベーション時間後、抽出物を１時間６０℃でインキュベートした後、さらに１５分間室温でインキュベーションした。１０ｍｌのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ、６０１３３２９、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各バイアルに添加した。バイアルを１時間室温でインキュベートし、次いで、βカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ２１００ＴＲ、液体シンチレーションアナライザー、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において解析した。すべての試料は、３連で測定した。注射した用量のパーセントの値（％ＩＤ／ｇ（組織））を各試料について計算した。ＮＳＴ２００取込みと腫瘍容積間の比較を示す。各投与後のＮＳＴ２００の取込み値は腫瘍容積と相関しており、これを、式（腫瘍を球形と仮定する）Ｖ＝πＤ３／６（式中、Ｄは、平均腫瘍直径である）によって計算した。
実験結果
ドキソルビシン（５日間持続）での処置の間、腫瘍塊は縮小しなかった（図８Ａ参照）。対照的に、腫瘍は、成長し続け、その容積は、対照非処置腫瘍（処置腫瘍よりも５日間早く回収した）と比べ５０％増加を示す。この増加は、非有意であることがわかった。腫瘍容積のかかる非有意な変化は、２回用量のドキソルビシン処置後に起こり、３Ｈ−ＮＳＴ２００取込みの１８．５倍という劇的な増加が検出され、これは、３Ｈ−ＮＳＴ２００が、腫瘍塊の収縮が検出されない場合であっても、腫瘍内の細胞死を検知することできる感度のよいツールであることを示す（図８Ｂ参照）。
【０１５５】
（実施例１０）
マウスにおける中大脳動脈閉塞後のアポトーシス障害のオートラジオグラフィー法による検出のためのトリチウム標識ＮＳＴ２００の使用
実験手順
ｐ−ＭＣＡを、側頭骨（ｓｕｂｔｅｍｐｏｒａｌ）からのアプローチにより、顕著な虚血性障害の転帰を有するＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて誘導した。ｐ−ＭＣＡの２４時間後、動物の神経学的スコアを評価し（０−臨床的症状なし〜３−片麻痺、回転行動および緊張病）、放射標識されたＮＳＴ２００（８０μＣｉ／動物）を、連続２時間静脈内注射した後、動物を致死させた。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−３ｈ、ＲＰＮ５３５Ｂ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）に露光した。フィルムを７週間の期間露光し、現像し（ＧＢＸ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＆ Ｆｉｘｅｒ， Ｋｏｄａｋ， ＵＳＡ）、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血中心対反対側の半球とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。シグナルを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅオートラジオグラフィー標準（ＲＰＮ５１０ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）にしたがって変換し、ｎＣｉ／ｍｇ単位で示した。
実験結果
３Ｈ−ＮＳＴ ２００の蓄積（ａ）Ｈ＆Ｅ染色（ｂ）を示す図９からわかるように、オートラジオグラフィー画像解析により、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｔｏｃ）細胞死／壊死性細胞死の領域内での３Ｈ−ＮＳＴ２００による傷害の標的化の特異性が示された。この結果を、Ｈ＆Ｅ染色によってさらに確認した。したがって、３Ｈ−ＮＳＴ２００は、オートラジオグラフィー画像解析において、脳アポトーシス障害のマーカーとして使用することができる。
【０１５６】
（実施例１１）
３Ｈ−放射標識されたＮＳＴ ２００によるラット虚血再潅流腎（Ｉ／Ｒ）のオートラジオグラフィー
実験手順
ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（ｌＯｍｇ／ｋｇ）の組合せの腹腔内投与によって誘導した全身麻酔下のラットにおいて手術を行なった。腎虚血は、片側性左腎動脈を、小さな非外傷性血管用鉗子を用いて４５分間締めることにより誘導した。同じ動物の反対側の未処置腎臓を、偽手術された（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）対照由来の腎臓とした。再潅流は、鉗子を外すことにより開始した。腎再潅流の期間は２４時間とした。再潅流の過程の間、動物に１００μＣｉの３Ｈ−ＮＳＴ２０５を静脈内注射し、１時間後、両方の腎臓を切除し、液体窒素中で凍結し、−７０℃で使用まで保存した。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−３ｈ、ＲＰＮ５３５Ｂ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）に露光した。フィルムを７週間の期間露光し、現像し（ＧＢＸ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＆ Ｆｉｘｅｒ， Ｋｏｄａｋ， ＵＳＡ）、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血性腎臓対反対側の腎臓とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。シグナルを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅオートラジオグラフィー標準（ＲＰＮ５１０ Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｕ）にしたがって変換し、ｎＣｉ／ｍｇ単位で示した。
実験結果
図１０に示すように、ラット腎臓の虚血−再潅流傷害の間、アポトーシスが、皮髄領域と外髄（ＯＭ）の遠位細管において観察され、一方、重篤な壊死が、（ＯＭ）の近位直細管において見られた。皮質では障害はあまり観察されなかった。反対側の偽腎臓では、障害細管は観察されなかった。オートラジオグラフィー画像解析により、アポトーシス細胞死／壊死性細胞死の領域内での３Ｈ−ＮＳＴ２０５による傷害の標的化の特異性が示され、形態素解析によって確認した。対照的に、反対側の腎臓内への３Ｈ−ＮＳＴ２０５取込みは示されず、傷害腎臓内のみへの３Ｈ−ＮＳＴ２０５取込みの特異性が強調される。
【０１５７】
（実施例１２）
放射線造影剤誘導性急性遠位腎尿細管壊死（ＡＴＮ）のラットモデルにおける３Ｈ ＮＳＴ２０５によるオートラジオグラフィー
実験手順
選択的髄質低酸素細管障害を有する腎障害を、インドメタシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）、Ｎωニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）、および放射線造影剤であるイオタラム酸ナトリウム８０％（Ａｎｇｉｏ−Ｃｏｎｒａｙ， Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ）６ｍＬ／ｋｇ（ｉ．ａ．）の併用投与によって誘導した。別のラットにビヒクルを注射し、対照とした。損傷を与えた２４時間後、対照動物と実験動物の両方に、１００μＣｉの３Ｈ−ＮＳＴ２０５を静脈内注射し、１時間後、両方の腎臓を切除し、液体窒素中で凍結した。
実験結果
図１１からわかるように、腎臓の形態の解析により、広範囲の程度の髄質（すなわち、外髄の外側および内側細片）障害が明らかになった。３Ｈ−ＮＳＴ２０５のホーミングは、主に、外髄内に限定された。形態の損傷のない特定の領域では、３Ｈ−ＮＳＴ２０５取込みは観察されなかった。
【０１５８】
（実施例１３）
３Ｈ−２００による実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のイメージング；オートラジオグラフィー
実験手順
ＥＡＥを、Ｃ３Ｈ．ＳＷ／Ｃ５７／ｂｌ雌マウス（６〜８週齢）の免疫処置により誘導した。動物は、ラットミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５を包含するペプチドで免疫処置した。このペプチドは、固相手法を用いてペプチド合成装置にて合成した。マウスの脇腹の一部位に、７５μｌのＭＯＧペプチド含有完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および２００μｇのヒト結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むエマルジョン２００μｌを皮下注射した。同一のブースター（ｂｕｓｔｅｒ）を、１週間後に、他方の脇腹の一部位に注射した。脳炎誘発性抗原刺激の後、マウスを毎日観察し、ＥＡＥの臨床的兆候をスコアリングした（０＝臨床的症状なし〜５＝四肢の完全麻痺）。疾患の選択した病期において（症状発現前または末期）、１時間のインキュベーションのために、動物に、放射標識したＮＳＴ２００（１００μＣｉ／動物）を静脈内注射し、その後、動物を致死させた。１０μｍ凍結切片を調製し、風乾し、トリチウム感受性フィルムに露光した。フィルムを７〜９週間の期間露光し、現像し、デンシトメトリー測定によって解析した。３Ｈ−ＤＤＣ密度（光学密度／ｍｍ２）の測定を、虚血中心対反対側の半球とでのシグナルにおいて行い、ＴＩＮＡソフトウェアによって評価した。
実験結果
多発性硬化症疾患のＥＡＥ動物モデルは、中枢神経系の白質を標的とする慢性障害性（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）自己免疫神経障害を擬態した。実験動物における白質の重篤な障害は、図１２に示すオートラジオグラフィーにおいて観察された。脳レベルでは、冠状部切片は、対照の非免疫処置マウスでは明るい染色であるのと比べ、脳の底部の錐体路の暗い染色、および脳全体で過剰の放射能−リガンド蓄積を示した。また、放射性同位元素標識した３Ｈ−２００の印象的な蓄積が、脊髄レベルでも観察された。脊髄の縦断面は、対照未処置動物の脊髄と比べ、免疫処置マウスの白質の側方路（ｌａｔｅｒａｌ ｔｒａｃｔ）の高レベルの標識化を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）：
【化１】
に示す構造で表される化合物（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびに前記塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、ＲはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、またはＣ１６の直鎖または分枝鎖アルキルを表し、ｎおよびｍは、各々独立して、０、１、２、３または４の整数を表し、Ｍは非存在であり、かつＤは放射性同位体に置換される部分であり、前記部分はヒドロキシル基、ニトロ基、またはハロゲン原子から選択される）。
【請求項２】
Ｒが−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが−ＣＨ３である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
放射性同位体が１８Ｆである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物の各カルボキシル基が保護基によって保護されている請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
保護基がｔｅｒｔ−ブチルまたはエチルを含む請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
放射性同位体に置換される部分がメシラートを含む請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式（Ｖ）：
【化２】
（式中、ＪはＯＨを表し、ｒは４、５、６、７、または８の整数を表す）に示す構造で表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式（５）：
【化３】
に示す構造で表される化合物。
【請求項１０】
式（Ｖ）：
【化４】
（式中、ＪはＯＨを表し、ｒは４、５、６、７、または８の整数を表す）に示す構造で表される化合物を１８Ｆで放射標識する方法であって、式（Ｖ）で表される化合物に放射性同位体１８Ｆを結合させる工程からなる方法。
【請求項１１】
式（Ｖ）で表される化合物にメシラート部分を結合させる工程、およびそのメシラート部分を放射性同位体１８Ｆで置換する工程からなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物の各カルボキシル基を保護基で保護する工程を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
保護基はｔｅｒｔ−ブチルまたはエチルを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記部分を放射性同位体１８Ｆで置換する工程の後に保護基を除去する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
式（ＩＩ）：
【化１】
に示す構造で表される化合物（式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物および金属キレートならびに前記塩の溶媒和物および水和物を含み、式中、ＲはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、またはＣ１６の直鎖または分枝鎖アルキルを表し、ｎおよびｍは、各々独立して、０、１、２、３または４の整数を表し、Ｍは非存在であり、かつＤは放射性同位体に置換される部分であり、前記部分はヒドロキシル基、ニトロ基、またはハロゲン原子から選択される）。
【請求項２】
Ｒが−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが−ＣＨ３である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
放射性同位体が１８Ｆである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物の各カルボキシル基が保護基によって保護されている請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
保護基がｔｅｒｔ−ブチルまたはエチルを含む請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
放射性同位体に置換される部分がメシラートを含む請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式（Ｖ）：
【化２】
（式中、ＪはＯＨを表し、ｒは４、５、６、７、または８の整数を表す）に示す構造で表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式（５）：
【化３】
に示す構造で表される化合物。
【請求項１０】
式（Ｖ）：
【化４】
（式中、ＪはＯＨを表し、ｒは４、５、６、７、または８の整数を表す）に示す構造で表される化合物を１８Ｆで放射標識する方法であって、式（Ｖ）で表される化合物に放射性同位体１８Ｆを結合させる工程からなる方法。
【請求項１１】
式（Ｖ）で表される化合物にメシラート部分を結合させる工程、およびそのメシラート部分を放射性同位体１８Ｆで置換する工程からなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物の各カルボキシル基を保護基で保護する工程を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
保護基はｔｅｒｔ−ブチルまたはエチルを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記部分を放射性同位体１８Ｆで置換する工程の後に保護基を除去する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−１４０４２４（Ｐ２０１２−１４０４２４Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７９９８４（Ｐ２０１１−２７９９８４）
【出願日】平成２３年１２月２１日（２０１１．１２．２１）
【分割の表示】特願２００６−５４８５８３（Ｐ２００６−５４８５８３）の分割
【原出願日】平成１７年１月１６日（２００５．１．１６）
【出願人】（５０５４６７８６７）アポセンス リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＯＳＥＮＳＥ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２１日（２０１１．１２．２１）
【分割の表示】特願２００６−５４８５８３（Ｐ２００６−５４８５８３）の分割
【原出願日】平成１７年１月１６日（２００５．１．１６）
【出願人】（５０５４６７８６７）アポセンス リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＯＳＥＮＳＥ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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