説明

新規HLA−DRB1遺伝子およびその用途

【課題】HLA−DR抗原のサブタイプのひとつであるDR14に含まれる新規アリルを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするHLA−DRB1アリル、または特定の塩基配列もしくはその相補配列を有するHLA−DRB1アリル。本発明による新規アリルについて、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてHLA−DRB1遺伝子の遺伝子型を解析したところ、既知のアリルと全く異なる陽性反応が示された。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト白血球抗原(Human Leukocyte Antigen、以下「HLA」と略すことがある)の新規アリル(allele)に関する。
【関連技術】
【0002】
HLAのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【0003】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でHLAの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。HLA型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにGVHD(移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease))が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とHLA型の関連も指摘されている。HLAのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【0004】
従来のHLAタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりHLA分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、HLAの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【0005】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法(例えば、非特許文献1参照)などがあるが、コスト面からHLAの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、HLA型を決める方法が利用されている(例えば、非特許文献2および3参照)。
【0006】
HLA−DR抗原のサブタイプのひとつであるDR14に含まれる遺伝子型は2008年10月の時点で、92種類が報告されているが、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【0007】
特許第2560160号(特許文献1)には、DRB1*1401およびDRB1*1402のような既知のアリルに加えて、新規なアリルとしてDRB1*1405が開示されている。しかしながら、ここには、DRB1*1404やそれに近似する配列は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特許第2560160号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献2】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献3】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献4】Allele Frequencies [online]、[平成20年10月10日検索]、インターネット <URL: http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/>.
【発明の概要】
【0010】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてHLA−DRB1の遺伝子型を解析したところ、既知のアリルと全く異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【0011】
従って、本発明の目的は、HLA−DR抗原のサブタイプのひとつであるDR14に含まれる新規アリルおよびそれに基づくタイピング方法を提供することにある。
【0012】
本発明は、配列番号1記載のアミノ酸配列をコードするHLA−DRB1新規アリルを提供するものであり、また本発明は、配列番号2記載の塩基配列またはその相補配列を有するHLA−DRB1新規アリルを提供するものである。
【0013】
すなわち、本発明によるHLA−DRB1遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号2の塩基配列またはその相補配列からなるものである。
【0014】
また本発明によるタンパク質は、本発明によるHLA−DRB1遺伝子でコードされたペプチドを有するものである。
【0015】
さらに本発明のHLA−DR抗原のタイピング方法は、遺伝子型の判定の際に、配列番号1のアミノ酸配列、配列番号2の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするものである。
【0016】
本発明によれば、従来に比べて、HLA−DR抗原のさらに詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性のより厳密な判定が可能となるのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいてより詳細なデータを得ることが可能となる。したがって本発明は、臓器移植時の適合性判定や、各種疾患に対する感受性判定に極めて有用であると言える。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】既知のアリル(DRB1*1403)とHLA新規アリル(DRB1*1403V(すなわち、DRB1*1485))との塩基配列の比較。
【図2】既知のアリル(DRB1*1403)とHLA新規アリル(DRB1*1403V(すなわち、DRB1*1485))とのアミノ酸配列の比較。
【図3】既知のアリル(DRB1*1403、DRB1*1405等)とHLA新規アリル(DRB1*1403V(すなわち、DRB1*1485))とのアミノ酸配列の比較。
【発明の具体的説明および実施例】
【0018】
HLA−DRB1新規アリルの特定とその用途
本発明によるHLA−DRB1新規アリル(HLA−DRB1遺伝子)は、下記のような実験手順に従って得られたものである。
【0019】
DNAタイピング法の1つであるPCR−SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide probe)法に基づき、Luminex社のxMAP測定技術(http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html)を用いてHLA遺伝子のタイピングが可能なWAKFlow HLAタイピング試薬(湧永製薬株式会社製)を用いて、HLA−DR抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出したDNA検体で既知の遺伝子型の反応性が示されなかった。
【0020】
WAKFlow HLAタイピング試薬(湧永製薬株式会社製)で得られた増幅産物を用いて、ダイレクトシークエンシング法(Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987)により、エクソン2の配列を確認した。シークエンス反応は、BigDye Terminator V1.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)を用い、Applied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)によりシークエンスデータの取得を行った。エクソン2のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、DRB1*1501の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。
よって、この検体がDRB1*1501と未知のアリルとのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【0021】
そこでこれら配列を詳細に調べるため、HLA−DRB1遺伝子のエクソン2領域をグループ特異的プライマーセット(Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002)により増幅し、アリルを単離した。HLA−DRB1遺伝子のイントロン1とイントロン2に設定したDR15グループ特異的プライマーセット(Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002)、およびDR14グループ特異的プライマーセット(Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002)を用いて、PCR反応によりこの領域を増幅し、得られた増幅産物を3%アガロースゲル電気泳動により分離し、500bp付近の断片を取り出して精製を行った。
【0022】
それぞれのグループ特異的増幅で得られた増幅産物を、BigDye Terminator V1.1 Cycle Sequencing KitおよびApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザを使用し、ダイレクトシークエンシング法(Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987)により両端のイントロン領域を含むエクソン2領域の配列を確認した。
【0023】
その結果、DR15グループ特異的プライマーセットで得られた増幅物の配列は、DRB1*1501と完全に一致し、また、DR14グループ特異的プライマーセットで得られた増幅産物の配列は、WAKFlow HLAタイピング試薬で得られた増幅産物を用いたダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列と一致した。
【0024】
新規配列を有する遺伝子の塩基配列を既知の配列と比較し、分析を行った結果、図1のようにDRB1*1403のエクソン2内に3箇所の変異を確認した。具体的には、塩基配列の第156〜158の塩基に変異が見られた。これらの変異は図2に示す52番目のアミノ酸がアスパラギン酸からセリンへと置き換わる非同義置換であった。また、52番目のアミノ酸はHLA−DR分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置していた。
【0025】
このことから、このアミノ酸はHLA−DR分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられた。なお、この点は、例えば、文献 Pedro A. Reche & Ellis L. Reinherz, J. Mol. Biol. (2003) 331, pp. 623-641においてこの点が記載されており、具体的には、該文献中に、HLA−DRB配列が黒三角による位置を特定しつつしめされており(文献の図4)、この場所がHLA分子の抗原ペプチドとの結合特性や特異性に関係することが明記されている。
したがって、DRB1*1403と本発明の変異をもつ遺伝子型(DRB1*1403V)とは、移植医療においては区別する必要があり、移植時の適合性判定などにおいて、HLA−DR抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものであることが明らかとなった。
【0026】
以上のようにして、本発明による新規アリル(DRB1*1403V)を特定した。
なお、本発明において見出された新規アリルは、WHO命名によれば「DRB1*1485」とされ、WHOにおいて正式に登録されている。このため本明細書においては、新規アリルを、「DRB1*1403V」または「DRB1*1485」のいずれかで表示する。
【0027】
本発明による新規アリルDRB1*1403Vについて、これと配列が近似すると予想されるDRB1*1405等との間でアミノ酸配列を比較したところ(図3)、DRB1*1405との間では、配列中6個所のアミノ酸が相違していることを確認している。具体的には、DRB1*1405における変異として特徴的である11番目のアミノ酸については、本発明によるアリルDRB1*1403Vでは変異が見られない一方で、本発明によるDRB1*1403Vにおいて特徴的な52番目のアミノ酸の変異については、DRB1*1405では変異は見られない。上記のようにこの52番目のアミノ酸の変異は、抗原ペプチドとの結合に重要であることから、この点で、DRB1*1403VとDRB1*1405とは大きく異なっていると言える。
【0028】
よって、本発明によるHLA−DRB1遺伝子は、前記したように、配列番号1のアミノ酸配列をコードしてなるものである。好ましくは、本発明による本発明によるHLA−DRB1遺伝子は、配列番号2の塩基配列またはその相補配列からなるものである。ここで相補配列は慣用の方法により得ることができる。
【0029】
タイピング方法
上記のように新規アリルの存在とその変異部位が明らかになったため、それら情報に基づいて、そのようなアリルを検出することができるHLA−DR抗原タイピング用DNAプローブを設計し、得ることができる。具体的には、配列番号1に示すアミノ酸配列とその変異部位(52番目のアミノ酸(配列番号1および図2))に関する情報や、配列番号2のエキソン2の塩基配列と変異部位(156〜158番目の塩基)に関する情報、さらには必要により公知のHLA−DRB1抗原の情報に従って、当業者であれば慣用の方法に従って、本発明によるプローブを容易に設計し、得ることができる。例えば、配列番号2の塩基配列のDNA断片にはハイブリダイズするが、DRB1*1403のDNA断片にはハイブリダイズしないものを選択することでも目的のプローブが得ることができる。ここでプローブの設計、合成等の手法については、例えば、"Molecular Cloning",3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(New York)等を参考にすることができる。
【0030】
従って、本発明においては、例えば、配列番号1のアミノ酸配列の一部であって、配列番号1の52番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列の部分領域をコードしてなる塩基配列に相補的な配列を有する、HLA−DR抗原タイピング用DNAプローブが提供されうる。
また本発明の別の態様によれば、配列番号2の塩基配列の一部であって、配列番号2の156〜158番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有する、HLA−DR抗原タイピング用DNAプローブが提供されうる。
【0031】
本発明において得られたプローブは必要に応じて、慣用の標識物質(例えば、放射性同位体、蛍光色素、発色色素、発酵色素等)により、慣用の方法に従って標識されていてもよい。
【0032】
本発明の別の態様によれば、本発明において得られたプローブを含むタイピング用試薬が提供される。該試薬には、HLA−DRの他の型を検出可能なプローブや、検体中のHLA−DRB1遺伝子を増幅可能なプライマー等を含むものであることができる。
【0033】
本発明の別の態様によれば、前記したように、HLA−DR抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号1のアミノ酸配列、配列番号2の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。
【0034】
ここで、「得られる配列変異情報」とは、図1および2にも示されているように既知のアリル(DRB1*1403)と本件新規アリル(DRB1*1403V)とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。具体的には、例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、DRB1*1403のアミノ酸配列上、52番目のアミノ酸がアスパラギン酸からセリンへと置き換わっている場合であり、塩基配列であれば、156〜158番目の塩基のDRB1*1403の場合に対する変異である。
【0035】
本発明によるHLA−DR抗原のタイピング法には、例えば、被験者のHLA−DRB1遺伝子が新規アリルを有するか否かを検出する工程が含まれる。このとき検出は、例えば、PCR−SSO法、PCR−RFLP(制限酵素断片長多型)法、PCR−SSCP(単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、ASO(allele specific oligonucleotid)ハイブリダイゼーション法、リバースPCR−SSO法、Luminex法(Luminex社)、PCR−MPH法(Polymerase Chain Reaction-based Microtiter Plate Hybridization)(湧永製薬株式会社)、TaqMan−PCR法、Invader法、RCA(rolling cycle amplification)法、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等、慣用の方法を利用して、タイピングを実施することができる。この場合、必要により、PCR法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅させた後、上述の方法を適宜適用してもよい。
【0036】
タイピング法の具体例を挙げると、被験者のゲノムDNAから調製した核酸試料を、本発明によるプローブとを反応させた後、特異的なハイブリッド形成を検出することによって、被験者のHLA−DRB1遺伝子が新規アリルを有するか否かを検出することができる。このとき、使用される核酸試料は、典型的には、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から抽出したゲノムDNAから慣用の方法に従って調製し得ることができる。また、ここでHLAタイピング法には、上記のPCR−SSO法、Luminex法などが適宜利用することができる。例えば、PCR−SSO法では、PCRで増幅させた核酸試料を膜やマイクロプレートなどの支持体に結合させた後、この支持体を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識化プローブと反応させる。非特異的結合成分を洗浄除去した後、標識量を指標として支持体に結合したプローブを検出することができる。Luminex法ではPCRの増幅産物と、蛍光ビーズに固相化したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを蛍光により検出することができる。
〔配列表〕

SEQUENCE LISTING

<110> Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.

<120> New HLA-DRB1 genes and their use

<130> 181434SQ

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(96)
<223> DRB1*1485


<400> 1

Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr
1 5 10 15


Glu Arg Val Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Phe His Asn Gln Glu Glu Asn
20 25 30


Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu
35 40 45


Gly Arg Pro Ser Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu
50 55 60


Asp Arg Arg Ala Leu Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val
65 70 75 80


Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Gly Glu Arg Gly Ala Gly Arg
85 90 95


<210> 2
<211> 270
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(270)
<223> DRB1*1485


<400> 2
cacgtttctt ggagtactct acgtctgagt gtcatttctt caatgggacg gagcgggtgc 60

ggttcctgga gagatacttc cataaccagg aggagaacgt gcgcttcgac agcgacgtgg 120

gggagtaccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgatgc cgagtactgg aacagccaga 180

aggacctcct ggaagacagg cgggccctgg tggacaccta ctgcagacac aactacgggg 240

ttggtgagag cttcacagtg cagcggcgag 270

【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号1のアミノ酸配列をコードしてなる、HLA−DRB1遺伝子。
【請求項2】
配列番号2の塩基配列またはその相補配列からなる、HLA−DRB1遺伝子。
【請求項3】
請求項1または2に記載のHLA−DRB1遺伝子でコードされたペプチドを有する、タンパク質。
【請求項4】
遺伝子型の判定の際に、配列番号1のアミノ酸配列、配列番号2の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする、HLA−DR抗原のタイピング方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2010−162020(P2010−162020A)
【公開日】平成22年7月29日(2010.7.29)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−282756(P2009−282756)
【出願日】平成21年12月14日(2009.12.14)
【出願人】(000250100)湧永製薬株式会社 (51)
【Fターム(参考)】