昆虫及びクモの防除のためのＲＮＡｉ
【課題】昆虫及び／又はクモの防除のための非化合物に基づく新しいアプローチを提供する。
【解決手段】昆虫及び／又はクモ害虫の個体数を効果的に制御することができるＲＮＡｉのための標的ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。また、昆虫にＲＮＡｉを仲介するための二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、宿主細胞、及びＲＮＡｉを用いて昆虫及び／又はクモを防除するための組成物。昆虫及び／又はクモの個体数の制御におけるその構築物、ベクター、宿主細胞、及び組成物の使用、並びにＲＮＡｉに基づき昆虫及び／又はクモ害虫を防除する方法における使用に適したキット。
【解決手段】昆虫及び／又はクモ害虫の個体数を効果的に制御することができるＲＮＡｉのための標的ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。また、昆虫にＲＮＡｉを仲介するための二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、宿主細胞、及びＲＮＡｉを用いて昆虫及び／又はクモを防除するための組成物。昆虫及び／又はクモの個体数の制御におけるその構築物、ベクター、宿主細胞、及び組成物の使用、並びにＲＮＡｉに基づき昆虫及び／又はクモ害虫を防除する方法における使用に適したキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫種における二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在性遺伝子サイレンシングの分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、本明細書において初めて同定された新規な標的に対応するｄｓＲＮＡの発現のために設計された遺伝子構築物に関する。これらの構築物は、詳しくはｄｓＲＮＡ介在性昆虫害虫防除に、特に屋内昆虫又は屋内クモ、例えばゴキブリの防除に有用である。
【背景技術】
【０００２】
害虫防除、詳しくは昆虫及び／又はクモの防除、特に屋内昆虫、外部寄生虫、並びにゴキブリ、ノミ、アリ、シロアリ、ハサミムシ、カ、ハエ、及びイエコオロギなどの公衆の保健衛生（例えば都市の保護）に関連する昆虫の防除は重要な分野である。ゴキブリやハエなどの昆虫は、不潔で、管理の行き届いていない場所に生息するという公衆の共通の認識があることから、家庭、職場、飲食店、病院、又は倉庫などの場所における昆虫の存在は疑いようもない悩みの種である。
【０００３】
これらの昆虫は悩みの種になるばかりでなく、食物や食器も汚し、織物製品や紙製品を台無しにし、それらが触れた表面に汚れや不快臭を付ける。さらに、これらの昆虫は、細菌の保菌動物として健康上のリスクを引き起こすおそれがある。例えばゴキブリは、食中毒を引き起こす細菌（サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．））を伝染させるおそれがある。チャバネゴキブリは、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、連鎖球菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、肝炎ウイルス、及び大腸菌型細菌などの病原性生物を伝染させることができると考えられている。チャバネゴキブリは、腸チフス及び赤痢の蔓延にも関係付けられてきた。一部の者、特に喘息をもつ者は、これらのゴキブリが産生するアレルゲンに感受性がある。
【０００４】
家屋害虫と闘うために開発され、市販されている様々な化学殺虫剤及び捕獲装置がある。しかし、これらの手段の効力が増大することは、通常は健康上のリスクが増大することと結びついている。殺虫剤は食物を汚染するおそれがあり、これは、台所、飲食店、又は食物貯蔵庫などの場所ではほとんど避けることができず、混入はヒトに健康上のリスクを引き起こすおそれがある。
【０００５】
この汚染問題の解決は、より毒性の低い殺虫剤を使用することであった。しかし、より毒性の低い殺虫剤を適用すると、昆虫が時を経て抵抗性になる確率が増加する。
【０００６】
殺虫剤は、例えばアセチルコリン受容体などのある種の昆虫タンパク質に結合することにより作用し、そのタンパク質の不活性化又は過剰活性化のいずれかにより害虫種を死滅させる。殺虫剤はある濃度で安全であるように開発されてきたが、高用量又は長期間取り込むとヒトの健康に影響を及ぼすおそれがあり、実際に影響を及ぼす。農業用化学物質とは逆に、屋内昆虫の殺虫剤は、食物が貯蔵又は調理される場所に適用されるため、食物汚染及びヒトとの接触を避けることはできない。
【０００７】
化学害虫防除剤の１つの代替となるものは、生物学的薬剤を利用することである。過去数年間で、ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」による多細胞生物遺伝子のダウンレギュレーション（「遺伝子サイレンシング」とも呼ばれる）が確立した技法となった。
【０００８】
一般にＲＮＡｉは、ダウンレギュレーションされる遺伝子（「標的遺伝子」）のヌクレオチド配列（の少なくとも一部）に対応するヌクレオチド配列を含む（一般にアニーリングした２つの相補的ＲＮＡ一本鎖又はヘアピン構築物のいずれかとしての）二本鎖ＲＮＡ断片、すなわち「ｄｓＲＮＡ」と生物を接触させることを含む。とりわけ国際出願の国際公開第９９／３２６１９号パンフレット（Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、国際出願の国際公開第９９／５３０５０号パンフレット（ＣＳＩＲＯ）、国際出願の国際公開第００／０１８４６号パンフレット（Ｄｅｖｇｅｎ）、及びＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、８０６〜８１１頁、１９９８年２月が参照される。
【０００９】
線虫では、ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡ断片自体をそれとして、又はｄｓＲＮＡ断片を含む細菌株又は線虫による摂食時にｄｓＲＮＡ断片を発現することのできるか細菌株のいずれかをその線虫に給餌することにより行うことができる。このいわゆる「給餌によるＲＮＡｉ」について、とりわけ出願人による国際出願の国際公開第００／０１８４６号パンフレット、及び線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用している上記に引用した国際公開第９９／３２６１９号パンフレットが参照される。
【００１０】
多数のｄｓＲＮＡ構築物が当技術分野において記載されている。古典的ｄｓＲＮＡは、ダウンレギュレーションする必要のある標的配列に相補的な配列に隣接する２つの収束性のプロモーターを有するＤＮＡ構築物から産生される（例えば国際公開第００／０１８４６号パンフレット（Ｄｅｖｇｅｎ）参照）。ｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングの技術が進歩するにつれて、新しい構築物が設計され、様々な目的のためにｄｓＲＮＡが改良された。
【００１１】
ｄｓＲＮＡをさらに効率的に産生するために、ステム−ループ−ステム構造すなわち「ヘアピン」が開発された。例えば、国際公開第９９／５３０５０号パンフレットという文書（ＣＳＩＲＯ）に記載されているように、このヘアピンは１つの一本鎖ＲＮＡ転写物からｄｓＲＮＡを形成させる。このＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ転写物を折り畳み、塩基対を形成させてｄｓＲＮＡのステム部分にする非相補的ループ構造により分離されたセンス版及びアンチセンス版の相補的配列を含む。
【００１２】
ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングは、例えば臨床適用（国際公開第２００４／００１０１３号パンフレット）及び植物におけるｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングなどの多数の異なる領域に適用を見出している。植物では、遺伝子サイレンシングに有用なｄｓＲＮＡ構築物は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に開裂するように、及びそれにプロセシングされるようにも設計された。
【００１３】
ＲＮＡｉは、植物寄生線虫から植物を保護する手段として、すなわち植物（例えば植物全体、又は植物の部分、組織、若しくは細胞）に、植物寄生線虫の成長、生殖、及び／又は生存に不可欠な植物寄生線虫標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ断片を形成する１つ又は複数のヌクレオチド配列を発現させることによる手段としてもまた提案された。当該技法の説明については、本出願人による国際出願の国際公開第００／０１８４６号パンフレット、米国特許第６５０６５５９号（国際公開第９９／３２６１９号パンフレットに基づく）、並びに国際出願の国際公開第０１／９６５８４号パンフレット、国際公開第０１／３７６５４号パンフレット、及び国際公開第０３／０５２１１０号パンフレットを参照することができる。
【００１４】
Ｅｌｂａｓｈｉｒら（Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４９４〜４９８、２００１）は、長さ２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ断片（低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡとも名付けられている）を使用して、哺乳動物細胞における効果的なＲＮＡｉ介在性遺伝子サイレンシングを実証した。
【００１５】
国際公開第０３／００４６４４号パンフレットは、一般論として節足動物へのｄｓＲＮＡの送達を記載しており、このパンフレットは参照により本明細書に組み込まれている。国際公開第０３／００４６４４号パンフレットは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるＲＮＡｉを使用したレポーター遺伝子ＧＵＳ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のダウンレギュレーション及びオオタバコガ（Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａ）におけるｖＡＴＰアーゼ遺伝子のダウンレギュレーションを詳述している。
【００１６】
国際公開第０１／３４８１５号パンフレットは、ｄｓＲＮＡを産生するバキュロウイルス発現ベクター及び害虫防除へのこれらのベクターの使用に関する。
【００１７】
ＲＮＡｉの技法は、ここ数年、植物、線虫、及び哺乳動物細胞の技術分野で一般に公知であったが、昆虫及び／又はクモにおける遺伝子発現をダウンレギュレーションするためのＲＮＡｉの使用については現在のところほとんど知られていない。さらに、屋内昆虫、外部寄生虫並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモなどの害虫種を防除するためのＲＮＡｉの適用についてはほとんど知られていない。
【００１８】
ｄｓＲＮＡ介在性害虫防除に適し、効率的な構築物は、以下の条件の少なくとも一部を満たすべきである。
（１）ｄｓＲＮＡは有害生物により取り込まれなければならない、
（２）ｄｓＲＮＡは有害生物中で良好な安定性を有さなければならない、
（３）ｄｓＲＮＡは有害生物に有効で、その生存率、成長、及び／若しくは発育を制御しなければならない、及び／又は
（４）ｄｓＲＮＡは最大の安全性及び最小の環境影響を保証しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
今回、上に言及した条件を満たすｄｓＲＮＡ構築物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、昆虫及び／又はクモの防除のための、化合物に基づかない新規な取り組みを記載する。活性成分はヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、それを（例えばベイト剤又はゲル塗布剤の形の）殺虫又は殺クモ製剤として使用することができる。ｄｓＲＮＡの配列は不可欠な昆虫遺伝子の部分と一致し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により昆虫標的のダウンレギュレーションを引き起こす。ｍＲＮＡのダウンレギュレーションの結果として、ｄｓＲＮＡは対応する昆虫タンパク質の発現を阻害することによって、その昆虫及び／又はクモの死滅、成長停止、又は生殖不能を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】人工ペレット餌でのチャバネゴキブリの死滅率。ペレット中のｄｓＲＮＡの濃度は１％ｗ／ｗであった。イミダクロプリドの濃度は１％ｗ／ｗであった。
【図２】人工ペレット餌でのチャバネゴキブリの死滅率。ペレット中のｄｓＲＮＡ（配列番号９に表す配列を有するＢｇ００１及び配列番号６８に表す配列を有するＢｇ００１コンカテマー２）の濃度は１％ｗ／ｗであった。この実験では、ヘキサフルムロン（１％ｗ／ｗ）を陽性対照として、溶媒を陰性対照として試験した。
【図３】室温で８ヶ月間のＬＢ培地（ＬＢ）及び無Ｒｎアーゼ水（ＭＱ）中のＢｇ０３２ ｄｓＲＮＡの安定性。
【図４】１週間第１齢若虫にｄｓＲＮＡ（Ｂｇ００１）を適用したときにゴキブリの死滅率が受ける効果。この実験では、種々雑多のｄｓＲＮＡ及び溶媒を陰性対照として試験した。ペレット中のｄｓＲＮＡの濃度は１％ｗ／ｗであった。
【図５Ａ】本発明の配列
【図５Ｂ】本発明の配列
【図５Ｃ】本発明の配列
【図５Ｄ】本発明の配列
【図５Ｅ】本発明の配列
【図５Ｆ】本発明の配列
【図５Ｇ】本発明の配列
【図５Ｈ】本発明の配列
【図５Ｉ】本発明の配列
【図５Ｊ】本発明の配列
【図５Ｋ】本発明の配列
【発明を実施するための形態】
【００２２】
標的
本発明者らは、昆虫又はクモ害虫の個体数を効果的に制御することができるＲＮＡｉのための新規な標的を初めて同定した。
【００２３】
疑いを避けるために、標的は、本明細書において、昆虫及び／又はクモがその正常な生理学的機能及び生化学的機能を維持するためにタンパク質産物が必要とされる遺伝子と定義される。標的遺伝子の発現阻害は、その昆虫及び／又はクモが摂食、成長、又は生存する能力を制限する。本発明の実施に採用することができる昆虫及び／又はクモの遺伝子の例には、必須遺伝子、発育、代謝、又は神経伝達などの過程に関与する遺伝子、並びに産物が現存する殺虫剤及び／又はクモの標的である遺伝子がある。本発明の好ましい実施形態では、標的は、転写、翻訳、細胞骨格、細胞周期、代謝（同化又は異化）、エンドサイトーシス、細胞内及び細胞間輸送、カルシウム結合、核内移行及び核外移行、ヌクレオチド結合、シグナルペプチダーゼ−タンパク質結合、プロテアソーム、小胞輸送、神経伝達、水分平衡、イオン平衡、スプライシング、有糸分裂、減数分裂、染色体の組織化、安定性又は完全性、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、翻訳後タンパク質修飾、電子伝達、アポトーシス、膜の完全性、並びに細胞接着などの細胞機能に必要な経路の部分である。
【００２４】
本発明で同定された新規な標的遺伝子は、以下のものを含む。
Ａ）構造タンパク質、例えばトロポミオシン１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２６０８９７）（配列番号４１及び４２）、アクチン５Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ００４２４８）（配列番号５７及び５８）、並びに同一又は他の昆虫及び／又はクモ種において同一の生物学的機能を有する相同又は非相同タンパク質、
Ｂ）代謝酵素、例えばＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７３６７９）（配列番号４９及び５０）、並びに同一又は他の昆虫及び／又はクモ種において同一の生物学的機能を有する相同又は非相同タンパク質、
Ｃ）Ｖ−ＡＴＰアーゼなどのイオン／ｐＨのホメオスタシスに関与する酵素、並びに同一又は他の昆虫及び／又はクモ種において同一の生物学的機能を有する相同又は非相同タンパク質、
Ｄ）例えば
リボソームタンパク質Ｓ４ホモログ（配列番号１及び２）
リボソームタンパク質Ｓ９ホモログ（配列番号１１及び１２）
リボソームタンパク質Ｌ９ホモログ（配列番号２１及び２２）
リボソームタンパク質Ｌ１９ホモログ（配列番号３１及び３２）
などの転写／翻訳機構に関与する酵素。
【００２５】
したがって、第１の態様によると、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供され、このオーソロガスなヌクレオチド配列は、配列番号１、１１、２１、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましいオーソロガスな配列は、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ（ｒｅｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｍｉｔｅ）、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／若しくはクモ由来の配列を含むか、又は本発明の方法により使用された場合はその配列を包含する。さらに好ましいオーソロガスな配列は、非限定的にチャバネゴキブリ種（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｓｐｐ．）（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（Ｂｌａｔｔａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（Ｓｕｐｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）；非限定的にトフシアリ種（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）（例えばオオアリ種（カーペンターアント（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ａｎｔ）））、ケアリ種（ｌａｓｉｕｓ ｓｐｐ．）（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（Ｍｙｒｍｉｃａ ｓｐｐ．）（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（Ｆｏｒｍｉｃａ ｓｐｐ）（ウッドアント（ｗｏｏｄ ａｎｔ））、シリアゲアリ種（Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．）（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント（Ａｃｒｏｂａｔ Ａｎｔ）））、イリドミルメクス種（Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｓｐｐ．）（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（Ｐｈｅｉｄｏｌｅ ｓｐｐ．）（オオズアリ）、及びダシムチラ種（Ｄａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ）；非限定的にアミテルメス種（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばアミテルメス−フロリデンシス（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ）（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト（Ｆｌｏｒｉｄａ ｄａｒｋ−ｗｉｎｇｅｄ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ）））、レティキュリテルメス種（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）（イースタンサブテラネアンテルマイト（ｅａｓｔｅｒｎ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ））、レティキュリテルメス−ヘスペルス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）（ウエスタンサブテラネアンテルマイト（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））、イエシロアリ種（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばネオテルメス−コネキサス（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｃｏｎｎｅｘｕｓ）（フォレストツリーテルマイト（Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））などのシロアリ（シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）及び／又はシロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ））に由来する。
【００２６】
別の態様によると、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を含むか、その配列から本質的になるか、又はその配列からなる核酸分子が提供される。
【００２７】
配列番号４、６、７、１６、２７、２６、２７、３６、及び３７の全ては、選択的及び特異的に本発明の新規な配列を同定するために利用された特異的プライマーのヌクレオチド配列を表す。
【００２８】
この新規に同定した遺伝子の全ては、チャバネゴキブリの転写／翻訳機構の構成要素を表す。ＲＮＡｉによりこれらの遺伝子の発現を阻害することによって、又は新規に同定した標的遺伝子の発現を阻害することによって、重要な害虫を防除することができる。
【００２９】
これらの新規な標的遺伝子のオーソログもまた、他の昆虫及び／又はクモ種の防除においてダウンレギュレーションのさらなる標的となることが当業者により予測されており、そう了解されよう。したがって、本発明の新規な核酸分子のオーソログもまた考慮される。
【００３０】
タンパク質配列又はヌクレオチド配列は、「有意な」レベルの配列類似性又は同一性を示すならば、相同である可能性が高い。真に相同な配列は、共通の祖先遺伝子からの分岐により関係している。配列ホモログは２つの種類に属しうる。すなわち、（ｉ）ホモログが異なる種に存在する場合、そのホモログはオーソログとして知られている。例えばマウス及びヒトのα−グロビン遺伝子はオーソログである。（ｉｉ）パラログは単一種内の相同遺伝子である。例えばマウスのα−グロビン遺伝子及びβ−グロビン遺伝子はパラログである。本明細書では「オーソログ」は上に言及した両方の種類のホモログを意味する。
【００３１】
一実施形態では、オーソログは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、４９、又は５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約４０％、５０％、又は６０％のヌクレオチド配列同一性を有するものである。好ましくはオーソログは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、４９、又は５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するものである。
【００３２】
別の実施形態によると、本発明は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに表すヌクレオチド配列を含むか、その配列から本質的になるか、又はその配列からなる遺伝子の、昆虫又はクモオーソログである標的遺伝子を包含する。例としてオーソログは、配列番号７１から２００のいずれかに表すヌクレオチド配列、又はその少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６個、若しくは２７個のヌクレオチドの断片を含むことがある。昆虫若しくはクモのオーソロガスな遺伝子、又は本発明の配列の１つのヌクレオチド１７個の断片を少なくとも含む配列の非限定的なリストを表４及び５に示す。表４及び５に表示する配列は、本発明の一部を形成すると意図される。したがってオーソログは、表４及び５に示す配列のいずれかを含むか、その配列から本質的になるか、又はその配列からなる。
【００３３】
別の態様によると、本発明は、それ故に昆虫及び／又はクモの侵襲又は感染を防除するための本明細書に記載した方法のいずれかを包含し、その方法は、昆虫及び／又はクモを二本鎖ＲＮＡと接触させるステップを含み、その二本鎖ＲＮＡはアニーリングされた相補鎖を含み、その二本鎖ＲＮＡの１つは、配列番号７１から２００に表す配列のいずれかの、少なくとも１７、１８、１９、２０、又は２１個のヌクレオチドの断片を含む標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、それによってその二本鎖ＲＮＡは昆虫及び／又はクモにより取り込まれ、それによって成長を制御するか、死滅させるか、又はその昆虫及び／若しくはクモによる侵襲若しくは感染を防止する。前記昆虫及び／又はクモは、本明細書に記載した任意の標的生物／種を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることがある。
【００３４】
本発明に包含される関連核酸分子は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子とのハイブリダイゼーションによって定義することもまたできる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下であり、なおさらに好ましくは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下である。中程度及び高ストリンジェンシーの当該条件は、当業者によく知られているであろう。例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含む溶液中で４２℃で、又は５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む溶液中で６５℃でインキュベーションするハイブリダイゼーション反応、並びに０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で６５℃での洗浄は、適切な高ストリンジェンシー条件となる。
【００３５】
本発明は、これらの新規な標的遺伝子及びそのオーソログのタンパク質産物もまた提供する。
【００３６】
したがって、第２の態様によると、配列番号２、１２、２２、若しくは３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むタンパク質、又はさらなる昆虫及び／若しくはクモ種由来の保存されたアミノ酸配列を有するオーソロガスなタンパク質を提供する。
【００３７】
上に言及したように、新規な標的遺伝子のオーソログは、他の昆虫及び／又はクモ種の防除におけるダウンレギュレーションのためのさらなる標的となろうこともまた予測されている。したがって、本発明の新規なタンパク質分子のオーソログもまた考慮されている。
【００３８】
一実施形態では、オーソログは、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を有するものである。好ましくは、オーソログは、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているヌクレオチドもまた提供する。本発明のこの態様に包含される核酸分子には、同一のタンパク質分子をコードする点で機能的に同等な核酸分子もまた含まれる。したがって、遺伝暗号の縮重により可能な全ての核酸分子が、本発明のこの態様の範囲内に入ると意図される。
【００４０】
標的生物／標的種
本発明に使用する「標的種」は、害虫となる任意の昆虫又はクモであってもよい。この用語は、任意の発育期にある昆虫又はクモにもまた関する。昆虫は、生きていない外骨格を有することから、昆虫は一定速度で成長することはできず、それどころか定期的に自分の外骨格を脱ぎ捨てることにより段階的に成長する。この過程は脱皮（ｍｏｕｌｔｉｎｇ又はｅｃｄｙｓｉｓ）と呼ばれる。脱皮と脱皮の間の段階は「齢」と呼ばれ、この段階は本発明により標的とすることができる。また、昆虫の卵や生きた子もまた本発明により標的とすることができる。有翅昆虫亜綱における変態を含む、発育周期の全ての段階は、本発明によるＲＮＡｉによって標的とすることができる。したがって、幼虫、蛹、若虫などの発育段階などの個別の段階を全て標的とすることができる。
【００４１】
標的種は、動物界、さらに詳しくは節足動物門、そして昆虫綱（Ｃｌａｓｓ Ｉｎｓｅｃｔａ）又はクモ綱（Ｃｌａｓｓ Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属する任意の生物又は種を意味する任意の昆虫又はクモであってもよい。本発明の方法は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングに感受性であり、それらの周辺環境から二本鎖ＲＮＡをインターナリゼーションすることができる全ての昆虫及びクモに適用することができる。
【００４２】
本発明の一実施形態では、昆虫又はクモは、以下の目に属することがある：ダニ目（Ａｃａｒｉ）、クモ網、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ゴキブリ目（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）、コウチュウ目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、トビムシ目（Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）、ハサミムシ目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、カマキリ目（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、ハサミコムシ目（Ｄｉｐｌｕｒａ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、シロアリモドキ目（Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ）、カゲロウ目（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ）、ガロアムシ目（Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｏｄｅａ）、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、カメムシ亜目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）、ヨコバイ亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、シリアゲムシ目（Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ）、アメミカゲロウ目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、トンボ目（Ｏｄｏｎａｔａ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、ナナフシ目（Ｐｈａｓｍｉｄａ）、シラミ目（Ｐｈｉｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、カワゲラ目（Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）、カマアシムシ目（Ｐｒｏｔｕｒａ）、チャタテムシ目（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｓｉｐｈｕｎｃｕｌａｔａ）、シミ目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）、腹吻亜目（Ｓｔｅｒｎｏｒｒｈｙｎｃｈａ）、ネジレバネ目（Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、トビケラ目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）、ジュズヒゲムシ目（Ｚｏｒａｐｔｅｒａ）、及びシミ亜目（Ｚｙｇｅｎｔｏｍａ）。
【００４３】
好ましいが、非限定的な本発明の実施形態では、昆虫又はクモは、以下からなる群から選択される。
（１） ダニ目：マダニ亜目（Ｉｘｏｄｉｄａ）（マダニ）を含むダニ
（２） クモ綱：クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）（クモ）及びメクラグモ目（Ｏｐｉｌｉｏｎｅｓ）（メクラグモ）、例には、Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ（クロゴケグモ）及びＬｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓｅ（ドクイトグモ）がある。
（３） シラミ目：Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ（ヒトジラミ）などのシラミ
（４） ゴキブリ目：チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、及びチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のものを含むゴキブリ。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
（５） コウチュウ目：コウチュウ、例には、ヒラタキクイムシの科（ナガシンクイムシ上科（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ））；デンドロクトヌス種（Ｄｅｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ｓｐｐ．）（ブラックツルペンチンビートル（Ｂｌａｃｋ Ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅ Ｂｅｅｔｌｅ）、サザンパインビートル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｉｎｅ Ｂｅｅｔｌｅ）、ＩＰＳエングレーバービートル（ＩＰＳ Ｅｎｇｒａｖｅｒ Ｂｅｅｔｌｅ））；マルカツオブシムシ（アントレヌス種（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ）、アタゲヌス種（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ）；オールドハウスボーラー（Ｏｌｄ Ｈｏｕｓｅ Ｂｏｒｅｒ）（カミキリムシ科：ヒロトルペス−バジュルス（Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ））；シバンムシ（Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ）；トリボリウム種（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｓｐｐ）（コクヌストモドキ）；Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｇｒａｎａｒｉｕｍ（ヒメアカカツオブシムシ）；Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓａｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ（ノコギリヒラタムシ）など（シミ）がある。
（６） ハサミムシ目：ハサミムシ科
（７） ハエ目：カ（カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ））及びハエ（ハエ亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ））、例は、ハマダラカ種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．）などのハマダラカ亜科（Ａｎｏｐｈｅｌｉｎａｅ）及びアエデス−フルブス（Ａｅｄｅｓ ｆｕｌｖｕｓ）などのカ亜科（Ｃｕｌｉｃｉｎａｅ）；タバヌス−プンクティファ（Ｔａｂａｎｕｓ ｐｕｎｃｔｉｆｅｒ）（ホースフライ（Ｈｏｒｓｅ Ｆｌｙ））、Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ（ツェツェバエ）などのアブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）、ドレインフライ（ｄｒａｉｎ ｆｌｉｅｓ）（チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ））、及びＭｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）などの弁翅亜節（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）、ニクバエ（ニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ））など。
（８） カメムシ亜目：Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ（トコジラミ）などのカメムシ
（９） ハチ目：アリ（アリ科（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ））、ミツバチ（ミツバチ上科（Ａｐｏｉｄｅａ））を含むハチ（ハチ亜目（Ａｐｏｃｒｉｔａ）：Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ）、Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ）、オオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｓｐｐ）（オオアリ）、（ｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ）、（ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ）（トビイロシワアリ）、Ｍｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ）、ヤマアリ種（ウッドアント）、クレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント）、Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（アリガタバチ）など
（１０） シロアリ目：シロアリ、例には：アミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、イースタンサブテラネアンテルマイト（レティキュリテルメス−フラビペス）、Ｒ．ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、ネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））、及びシロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）がある。
（１１） チョウ目：ガ、例には：Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）などのヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａｅ）及びマルハキバガ科（Ｏｅｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、並びにＰｙｒａｌｉｓ ｆａｒｉｎａｌｉｓ（カシノシマメイガ）などのメイガ科（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ）がある。
（１２） チャタテムシ目：ブックライス（チャタテムシ）
（１３） ノミ目：ヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）などのノミ
（１４） 腹吻亜目：アブラムシ（アブラムシ科（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ））
（１５） シミ亜目：シミ、例は：マダラシミ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）及びセイヨウシミ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）である。
【００４４】
好ましい標的昆虫又はクモには、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。さらに好ましい標的は、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、ネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）である。さらに好ましい標的はゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【００４５】
ＲＮＡ構築物
「相補的」とは、ＲＮＡ鎖が、特定の配列がＤＮＡ配列である場合はその配列のＲＮＡ同等物、又はそのＤＮＡ配列の相補体のＲＮＡ同等物に相当することを意味する。
【００４６】
本発明は、遺伝子発現のＲＮＡｉ介在性ダウンレギュレーションのための追加の標的に関する。本明細書において同定した全ての標的に関して、本発明のさらなる態様では二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物が提供され、その少なくとも１方の鎖は、
（ｉ）配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１；のいずれか１つに定義する標的核酸分子、或いは
（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。上記のように、オーソログは、配列番号１、４、６、７、１１、１６、１７、２１、２６、２７、３１、３６、３７、４１、４３、４４、４９、５１、５２及び５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％のヌクレオチド配列同一性を有することがある。好ましくは、オーソログは、配列番号１、４、６、７、１１、１６、１７、２１、２６、２７、３１、３６、３７、４１、４３、４４、４９、５１、５２及び５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するものである。
【００４７】
前述のように、本明細書においてチャバネゴキブリで同定した標的のオーソログは、屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫を含むその他の昆虫並びに／又はクモ種における有望な標的と見なされる。
【００４８】
さらに好ましい標的は、ゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリから得られる。最も好ましい標的は、新規な標的が同定されたチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【００４９】
効果的な遺伝子サイレンシングには約２１ｂｐの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の形成が理想的であると以前に報告された。しかし、出願人の出願では、ある種の有害生物に効率的に取り込まれるための最短長のｄｓＲＮＡは、好ましくは少なくとも約８０〜１００ｂｐであることが示された。自由生活性線虫Ｃ．エレガンス又は植物寄生線虫サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）などの無脊椎動物では、おそらくこれらの長鎖ｄｓＲＮＡの方が無脊椎動物による取り込みが効率的であることから、これらの長鎖断片の方が遺伝子サイレンシングに有効であるという見通しが立てられている。
【００５０】
２７塩基長の平滑末端ＲＮＡ、又は２９ｂｐのステム及びヌクレオチド２個の３’突出を有する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかからなる合成ＲＮＡ二本鎖は、従来型の２１塩基長ｓｉＲＮＡよりも強力にＲＮＡ干渉を誘導することもまた最近示唆された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、２００５年２月２日、１８１、及びＫｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、２００５年２月２日、２２２〜２２９、及びＳｉｏｌａｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、２００５年２月２日、２２７〜２３１参照、これらの参照はその全体が本明細書に組み込まれている）。したがって、上に同定した標的に基づき、２７塩基長の平滑末端ＲＮＡ、又は２９ｂｐのステム及びヌクレオチド２個の３’突出を有する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかである分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
したがって一実施形態では、ＲＮＡ構築物は少なくとも約１７ｂｐ、好ましくは少なくとも約２１ｂｐ、さらに好ましくは約２０〜１５００ｂｐ、なおさらに好ましくは約８０〜１０００ｂｐ、最も好ましくは約１７〜２７ｂｐ又は約８０〜２５０ｂｐの長さを有する二本鎖ＲＮＡ領域、例えば約１７ｂｐ、１８ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐ、２７ｂｐ、５０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、９００ｂｐ、１００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ又は１５００ｂｐの二本鎖ＲＮＡ領域を有する。
【００５２】
二本鎖ＲＮＡの長さの上限は、ｉ）ｄｓＲＮＡが昆虫及び／又はクモにより取り込まれる必要性、並びにｉｉ）ｄｓＲＮＡが関連する細胞内でプロセシングされて、ＲＮＡｉを指令する断片になる必要性に依存することがある。選択された長さは、ＲＮＡの合成法及び細胞へのＲＮＡ送達様式にもまた影響されうる。好ましくは、本発明の方法に使用される二本鎖ＲＮＡは、長さ１００００ｂｐ未満、さらに好ましくは１０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下、さらに好ましくは３００ｂｐ以下、さらに好ましくは１００ｂｐ以下であろう。
【００５３】
害虫防除に関する有効性は、単一のＲＮＡ構築物を用いて複数の標的遺伝子を標的とすることにより増大することがある。したがって、二本鎖ＲＮＡが介在する複数のＲＮＡ干渉が、可能なことには全て同時に、又は可能なことにはカスケード的に起こると思われることから、害虫が生存し抵抗性を獲得する見込みは低い。
【００５４】
本発明の方法は、複数の標的遺伝子のダウンレギュレーション又は阻害を実現するために、又は単一の標的遺伝子のより強力な阻害を実現するために、同一の昆虫及び／又はクモに２つ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物を同時又は連続的に与えることを包含する。
【００５５】
さらなる実施形態によると、本発明によるＲＮＡ構築物は、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含み、その鎖の少なくとも１つは、本明細書に記載した任意のヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記ヌクレオチド配列の相補性は、（ｉ）配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれかに示す核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列、又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオルトロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、ここで、配列同一率は同一の長さにわたり計算される。
【００５６】
「同一の長さにわたり」により、％同一率を配列間で計算する場合に、両配列での対応する一続きのヌクレオチドにわたりこれを行うことを意味する。
【００５７】
或いは、複数の標的配列に対して作用する１つの二本鎖ＲＮＡを与えることにより複数の標的遺伝子がダウンレギュレーションされる。或いは、標的遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ断片の１つを超えるコピーの存在により、単一の標的をより効率的に阻害することができる。したがって、本発明の一実施形態では、二本鎖ＲＮＡ構築物は、複数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、昆虫及び／又はクモ標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。本発明によると、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ領域は、同一又は異なる標的遺伝子に相補的であってもよく、及び／又はｄｓＲＮＡ領域は同一又は異なる昆虫及び／又はクモ種由来の標的遺伝子に相補的であってもよい。
【００５８】
したがって、本発明は、本発明の単離された二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物を提供し、それは、少なくとも２つの二本鎖ＲＮＡ領域を含み、そのそれぞれの少なくとも１方の鎖は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含むか、本質的にその配列からなるか、又はその配列からなり、ここで、そのオーソロガスなヌクレオチド配列は、配列番号１、１１、２１、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号４１、４３、４４、４９、５１、５２、及び５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を含む核酸分子の少なくとも関連する部分と少なくとも７０％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましくは前記二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか、好ましくは配列番号６５から７０のいずれかから独立して選択される１つ又は少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むか、本質的にその配列からなるか、又はその配列からなる。
【００５９】
したがって、本発明の一実施形態では、ＲＮＡ構築物は複数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、昆虫及び／又はクモ種由来の標的遺伝子のヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。本発明によると、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ領域は、同一又は異なる標的遺伝子に相補的であってもよく、ｄｓＲＮＡ領域は同一又は異なる昆虫種由来の標的に相補的であってもよい。
【００６０】
ｄｓＲＮＡ領域は、以下のように組み合わせることができる。
ａ）単一の法的遺伝子を標的とする複数のｄｓＲＮＡ領域を組み合わせる場合、それらの領域はＲＮＡ構築物中に本来の順序（すなわち標的遺伝子に断片が出現する順序）で組み合わせることができる、
ｂ）或いは、断片の本来の順序を無視することにより、断片を混ぜ合わせて、ランダム又は故意に任意の順序に組み合わせてＲＮＡ構築物にすることができる。
ｃ）或いは、１つの単一断片をＲＮＡ構築物中に数回、例えば１から１０回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回繰り返すことができ、また
ｄ）（単一又は異なる標的遺伝子を標的とする）ｄｓＲＮＡ領域をセンス又はアンチセンス方向に組み合わせることができる。
【００６１】
加えて、組み合わせる標的遺伝子は、以下の種類の１つ又は複数の遺伝子（該当するその全ての可能な組合せを含む）から選択してもよい。
ｅ）「必須」遺伝子又は「病原性遺伝子」は、１つ又は複数の標的昆虫及び／又はクモに重要で、サイレンシングした場合に致死的又は重大な（例えば、運動、摂食、麻痺、飲水、生殖能力、生殖、成長の）表現型を招く遺伝子を包含する。強い致死的標的遺伝子の選択は強力なＲＮＡｉ効果を招く。本発明のＲＮＡ構築物において、同一又は異なる（非常に効果的な）致死的遺伝子を標的とする複数のｄｓＲＮＡ領域を組み合わせて、昆虫及び／又はクモの防除に果たすＲＮＡｉの効果の効力、有効性、又は速度をさらに増大させることができる。
ｆ）「弱小遺伝子」は、本明細書に記載した細胞経路の１つに特に興味深い機能を有するが、独立してサイレンシングすると表現型に弱小作用を招く標的遺伝子を包含する。本発明のＲＮＡ構築物では、単一又は異なる弱小遺伝子を標的とする複数のｄｓＲＮＡ領域を組み合わせて、より強いＲＮＡｉ効果を得ることができる。
ｇ）「昆虫及び／又はクモ特異的」遺伝子は、生物情報学の相同性検索、例えばＢＬＡＳＴ検索により決定することのできる非有害生物における実質的な相同的対応物を有さない遺伝子及び遺伝子の部分を包含する。昆虫及び／若しくはクモ特異的標的遺伝子又はその部分の選択は、種特異的ＲＮＡｉ効果を招き、非標的生物に効果を有さないか、又は実質的な（有害）効果を有さない。
ｈ）「保存された遺伝子」は、標的生物及び非標的生物の間で（アミノ酸レベルで）保存されている遺伝子を包含する。非標的種に及ぼす可能性のある効果を減らすために、そのような効果的であるが保存された遺伝子を分析し、これらの保存された遺伝子の可変領域由来の標的配列を選択して、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ領域による標的とする。ここで、保存性はヌクレオチド配列のレベルで評価される。このように、当該可変領域は、保存された標的遺伝子のうち、ヌクレオチド配列レベルで最小に保存された部分を包含する。
ｉ）「保存された経路の」遺伝子は、同一の生物学的経路若しくは細胞過程に関与する遺伝子を包含するか、又は異なる昆虫及び／若しくはクモ種において同一の機能を有して、特異的及び強力なＲＮＡｉ効果と効率的な害虫防除とを招く遺伝子を包含する。
ｊ）或いは、本発明によるＲＮＡ構築物は、異なる生物学的経路由来の複数の遺伝子を標的とし、広範囲の細胞性ＲＮＡｉ効果とより効率的な昆虫及び／又はクモの防除とを招く。
【００６２】
好ましくは、全ての二本鎖ＲＮＡ領域は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的な、少なくとも１方の鎖を含む。しかし、二本鎖ＲＮＡ領域の１つが、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的な、少なくとも１方の鎖を含む場合は、残りの二本鎖ＲＮＡ領域は、昆虫及び／又はクモ種由来の（公知の標的遺伝子を含む）任意の標的遺伝子の部分に相補的な少なくとも１方の鎖を含むことがある。
【００６３】
本発明は、本明細書に記載した任意のＲＮＡ構築物もまた提供し、その構築物は、少なくとも１つの追加の機能的配列と、場合によってはリンカーとを含む。一実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ領域は１つ又は複数のリンカーで連結している。別の実施形態では、そのリンカーはＲＮＡ構築物の側に存在し、ｄｓＲＮＡ領域を対象の別の領域と分離している。ｄｓＲＮＡ構築物用の種々のリンカーの種類は、本発明により提供される。
【００６４】
「条件的に自己開裂するリンカー」は、ある条件下でプロセシングされることができるＲＮＡ配列である。条件的に自己開裂する適切なリンカーの一例は、低ｐＨ条件下で自己開裂するＲＮＡ配列である。当該ＲＮＡ配列の適切な例は、Ｊａｙａｓｅｎａ及びＧｏｌｄ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７年９月３０日；９４（２０）：１０６１２〜７）により記載されており、この文書は参照により本明細書に組み込まれている。
【００６５】
条件的に自己開裂する適切なリンカーの別の例は、高ｐＨ条件下で自己開裂するＲＮＡ配列である。当該ＲＮＡ配列の適切な例は、Ｂｏｒｄａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３年５月１５日；３１（１０）：２５９５〜６００）により記載されており、この文書は参照により本明細書に組み込まれている。この配列は、ハンマーヘッド型リボザイムＨＨ１６の触媒中心に由来する。
【００６６】
本発明の一態様では、リンカーは有害生物中で短鎖ｄｓＲＮＡ領域の結合を切断するために使用してもよい。好都合にはこの状態で、リンカー配列は特定の状況での長鎖ｄｓＲＮＡ領域から短鎖ｄｓＲＮＡ領域への分割を促進し、これらの状況で別々のｄｓＲＮＡ領域の放出を招き、これらの短鎖ｄｓＲＮＡ領域による効率的な遺伝子サイレンシングに至ることができる。
【００６７】
本発明の別の態様では、リンカーは、ＲＮＡ構築対中の部位に存在し、ｄｓＲＮＡ領域を対象の別の配列と分離し、その別の配列はある追加の機能をＲＮＡ構築物に用意することが好ましい。ＲＮＡ構築物に組み込むことのできる他の（対象の）機能的配列の非限定的な例は、例えば（ｉ）ｄｓＲＮＡ構築物の大規模産生を容易にする追加の配列、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡの安定性を増加／減少させる追加の配列、（ｉｉｉ）組成物中のタンパク質又は他の分子に結合して害虫種による取り込みを容易にする追加の配列、（ｉｖ）アプタマーであり、害虫種の腸内の受容体又は分子に結合して、その害虫種による取り込み、エンドサイトーシス、及び／又はトランスサイトーシスを容易にする追加の配列、（ｖ）ｄｓＲＮＡ領域のプロセシングを触媒する追加の配列である。
【００６８】
特定の実施形態によると、例えば昆虫及び／又はクモなどの害虫種は腸系を有し、リンカーはその昆虫及び／又はクモの腸内で自己開裂する。腸内ｐＨは強酸性から強塩基性まで多様である。
【００６９】
或いは、リンカーはエンドソーム内で自己開裂する。本発明の構築物がエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスを介して有害生物に取り込まれ、その結果、害虫種のエンドソーム内で区画化される場合にこれは好都合なことがある。エンドソームは低ｐＨ環境を有し、リンカーの開裂に至ることもある。
【００７０】
疎水性条件下で自己開裂する上に言及したリンカーは、細胞壁を通過して１つの細胞から別の細胞に移動させるために使用するときの、例えば昆虫及び／又はクモの有害生物の細胞壁を貫通させるときの本発明のｄｓＲＮＡ構築物に特に有用である。
【００７１】
イントロンもまたリンカーとして使用することができる。本明細書に使用する「イントロン」は、メッセンジャーＲＮＡの任意の非コードＲＮＡ配列であってもよい。本発明の構築物に特に適したイントロン配列は、（１）Ｕが豊富で（３５〜４５％）、（２）塩基対がランダムに選択されうるか、又は公知のイントロン配列に基づきうる（約５０から約５００ｂｐまで多様な）平均長１００ｂｐを有し、（３）５’末端が−ＡＧ：ＧＴ−若しくは−ＣＧ：ＧＴ−で開始し、及び／又は（４）３’末端に−ＡＧ：ＧＣ−若しくは−ＡＧ：ＡＡを有する。
【００７２】
約１塩基対から約１００００塩基対までの範囲の非相補的ＲＮＡ配列もまたリンカーとして使用することができる。
【００７３】
上記のように、本発明のｄｓＲＮＡ領域は、昆虫及び／又はクモ害虫を効果的に防除するためにＲＮＡｉが起こることができる程度の相補性であるという条件下で、標的遺伝子の部分のみに対応してもよい。使用する構築物を含むｄｓＲＮＡ領域が標的遺伝子をダウンレギュレーションすることができる限り、適切な標的遺伝子の全長配列が公知であることは本発明に必須ではない。
【００７４】
例えば、昆虫及び／又はクモ由来の（ＥＳＴなどの）部分遺伝子配列が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００に記載した配列の１つのオーソログである限り、前記部分配列に基づくｄｓＲＮＡ断片を使用することが可能である。配列相同性又は相補性の程度は、使用するｄｓＲＮＡ断片の長さにわたり決定される。
【００７５】
さらに、本発明において結果として生じるｄｓＲＮＡ断片が標的遺伝子を依然としてダウンレギュレーションすることができる限り、（例えば欠失、挿入、又は置換により）１つ又は複数のヌクレオチド位置が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００に記載した配列を含む核酸分子と異なるｄｓＲＮＡ断片を使用することもまた可能である。
【００７６】
好ましくは、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ断片は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列を含む標的核酸分子のいずれか１つのヌクレオチド配列の関連する部分と、少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％又は８７．５％の配列同一性、もっとさらに好ましくは約９０％の配列同一性、もっとさらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む相補性又は相同性レベルを有する。
【００７７】
配列同一性を決定する方法は、当技術分野において日常的であり、それには、Ｂｌａｓｔソフトウェア及びＧＡＰ分析（ＧＣＧプログラム）の使用がある。ｄｓＲＮＡの少なくとも１方の鎖と標的遺伝子との高レベルの配列同一性（相補性）は、効果的なＲＮＡｉ、故に害虫防除を仲介するために必要である。
【００７８】
しかし、本発明のｄｓＲＮＡ領域が哺乳動物オーソログの配列に比べて害虫標的の配列に選択的であることも同様に好都合である。食物が存在する台所などの環境で害虫を防除しなければならず、その環境の中でヒトや他の哺乳動物が、その害虫を防除するために設計された組成物に曝露されるおそれがある場合に、このことは本発明に特に関連性がある。害虫種に有毒であるのと等しく哺乳動物にも有毒なおそれのある化学薬剤よりも、選択的な生物学的薬剤の方が好ましい。
【００７９】
さらに、本発明のＲＮＡ構築物などの生物学的薬剤については、分子が経時的に生分解され、故に（公知の殺虫剤などの）化学薬剤よりもヒトの利用者に環境上及び健康上のリスクを与えることが少ないものであることは好都合である。
【００８０】
したがって、好ましい実施形態によると、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示す核酸分子のヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ構築物中の二本鎖ＲＮＡの少なくとも１方の鎖は、哺乳動物種由来の対応する（オーソロガスな）ヌクレオチド配列と約５％未満、約１０％未満、約１２．５％未満、約１５％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満の配列同一性を有する。一実施形態では、２１個の連続するヌクレオチドにわたり哺乳動物の配列との配列同一性はない。別の実施形態では、２４個の連続するヌクレオチドにわたり哺乳動物種由来の対応するヌクレオチド配列と約１０％未満又は約１２．５％未満の配列同一性がある。好ましくは、哺乳動物種はヒトである。
【００８１】
一実施形態では、（配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示す核酸分子のヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ構築物中の二本鎖ＲＮＡの）少なくとも１方の鎖は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は１３００個のヌクレオチドを含む。
【００８２】
少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも約１７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は約１３００個のヌクレオチドを含む少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物もまた提供される。
【００８３】
ＤＮＡ構築物及び発現構築物並びに宿主細胞
さらなる態様では、本発明は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００に表す、本発明の新規な標的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物もまた提供する。
【００８４】
本発明は、さらに本発明のＲＮＡ構築物をコードしている領域を含むＤＮＡ構築物に関する。
【００８５】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物のいずれかを含む発現構築物もまた提供する。
【００８６】
発現構築物は、適切な条件下で、上に言及したｄｓＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を（転写により）提供することができる構築物である。
【００８７】
ｄｓＲＮＡを発現するための遺伝子構築物は当技術分野において周知であり、例えば、国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第００／０１８４６号パンフレット、及び国際公開第０１／８８１２１号パンフレット（全てＤｅｖｇｅｎ）；国際公開第００／４４９１４号パンフレット及び国際公開第０１／７０９４９号パンフレット、並びにすでに上に言及した従来技術に記載された構築物が参照される。そこに言及されたように、当該構築物はＤＮＡ又はＲＮＡであってよく（好ましくはＤＮＡであり）、（細菌の形質転換及び細菌での発現に適した発現ベクターなどの）適切な発現ベクター又は他の発現系の形態であってもよい。例えば、その構築物は、細菌での産生に適した、又は昆虫及び／若しくはクモの形質転換に適した細菌系又はウイルス系に（例えば形質転換により）存在してもよく、その遺伝子構築物を含むこれら及び他の宿主細胞は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００８８】
本発明による発現構築物は、ｄｓＲＮＡ断片自体をコードしている配列以外に、通常は適切な調節エレメント（プロモーター、ターミネーター、及びエンハンサーなど）及び本質的に公知の当該遺伝子構築物の他のエレメントを含むものであり、例えばハイブリダイゼーションして所望のｄｓＲＮＡ領域を形成する２つの別々の相補的ＲＮＡ鎖としてｄｓＲＮＡ領域を発現してもよく、また自己ハイブリダイゼーションして、所望のｄｓＲＮＡ領域を含む「ステム−ループ」又は「ヘアピン」構造を形成する２つの相補鎖を含む単一のＲＮＡの形態でｄｓＲＮＡ領域を発現してもよい。全ての当該構築物を本発明に適切に使用することができ、本発明は、使用する構築物が昆虫及び／又はクモ害虫での効果的なＲＮＡｉを仲介することができるｄｓＲＮＡの発現に適する限り、前記構築物の種類に関して特に限定されない。
【００８９】
構築物自体もまた本質的に公知な方法で構築してもよく、これについてもう一度上記の従来技術の参考文献並びにＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７）が参照される。
【００９０】
ｄｓＲＮＡ領域は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター（例えば特異的化合物、細菌などに加える損傷などによって誘導されるプロモーター）の制御下の細菌宿主で好ましくは発現されてもよい。構成的又は誘導性プロモーターは、（例えば、細菌の生活環の特異的部分に）非特異的又は特異的であってもよい。
【００９１】
細菌宿主細胞は、生物学的害虫防除剤として利用する前に不活性化する必要がありうる。これは、加熱又は例えばフェノール若しくはホルムアルデヒドを用いた処理などにより、当技術分野に公知の任意の技法により行うことができる。或いは、昆虫及び／又はクモ害虫に本発明のｄｓＲＮＡ領域を送達するために、適切に変更されたバキュロウイルスなどの不活性化ウイルスを利用してもよい。
【００９２】
発現構築物は、細菌細胞での使用に好ましくは適したプロモーター又は他の制御エレメント、ターミネーター、翻訳エンハンサー又は転写エンハンサー、挿入因子、シグナル配列、選択マーカーなどの、ヌクレオチド配列又は遺伝子構築物用の本質的に公知の全ての他のエレメントをさらに含んでもよい。構築物のこれらのさらなるエレメントをコードする配列もまた、適切な生物学的起源から単離してもよいし、合成的に用意してもよい。
【００９３】
適切なプロモーターのいくつかの特定であるが非限定的な例には、ＲＮＡ ＰｏｌＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ由来のプロモーター、並びに上に引用した従来技術、例えば国際公開第００／０１８４６号パンフレットにおいて言及されたプロモーター及び他の調節エレメントもまたあるが、それに限定されるわけではない。本発明は、さらに一本鎖ＲＮＡの発現を指令することができる細菌プロモーターを提供し、そのＲＮＡは、発現するとループを含むヘアピン型二次構造を形成することができ、二本鎖ＲＮＡ領域が利用される。
【００９４】
細菌宿主又はウイルス宿主に構築物を導入するための形質転換技法の、特異的であるが非限定的な例には、形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクションなどがある。
【００９５】
したがって本発明は、（ａ）本明細書に記載したＲＮＡ構築物をコードしているヌクレオチドと、（ｂ）（ａ）のヌクレオチドの発現を駆動することができる１つ又は複数の制御配列と、場合によっては（ｃ）転写終結配列とを含む発現構築物を提供する。
【００９６】
発現構築物は、市販されていることがあるプラスミド又はベクターに挿入してもよい。本発明の一実施形態によると、発現構築物は、細菌への形質転換に適し、形質転換された細菌細胞における本発明によるＲＮＡ構築物の維持及び発現に適した細菌発現ベクターである。これによって、国際公開第０１／０１８４６号パンフレットに出願人により記載されたプラスミド及びベクターが参照され、その参照はその全体が本明細書に組み込まれている。その代わりとなるのは、国際公開第０１／３４８１５号パンフレットに記載されたウイルスなどの、昆虫種に感染することができるウイルス細胞を使用することであり、このパンフレットの参照は、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００９７】
本明細書に使用する用語「制御配列」は、広い状況の中でとらえるべきであり、それらの制御配列が結合され、及び／又は作動可能に連結される配列の発現を駆動及び／又は調節することができる調節ヌクレオチド配列を表す。本発明の一実施形態によると、制御配列は細菌又はウイルス中で作動可能であり、好ましくは、制御配列は細菌配列由来である。用語「制御配列」は、細胞、組織、又は器官での核酸分子の発現を活性化するか、又は高めることのできるプロモーター又は配列を包含する。
【００９８】
場合により、１つ又は複数の転写終結配列もまた発現構築物に組み込んでもよい。用語「転写終結配列」は、一次転写物の３’プロセシング及びポリアデニル化並びに転写終結のシグナルを発する、転写ユニット末端での制御配列を包含する。転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーなどの追加の調節エレメントを発現構築物に組み込んでもよい。
【００９９】
本発明の発現構築物は、特異的細胞型での維持及び／又は複製に必要な複製起点をさらに含んでもよい。
【０１００】
一例は、細胞中のエピソーム性遺伝子エレメント（例えばプラスミド又はコスミド分子）として細菌細胞中に維持するために発現構築物が必要な場合である。好ましい複製起点には、ｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１ ｏｒｉがあるが、それに限定されるわけではない。
【０１０１】
発現構築物は、場合によっては選択マーカー遺伝子を含んでもよい。本明細書に使用する用語「選択マーカー遺伝子」は、本発明の発現構築物をトランスフェクトされているか、又はそれを用いて形質転換された細胞においてその遺伝子が発現し、細胞の同定及び／又は選択を容易にする、細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含む。適切な選択マーカーの例には、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシン耐性遺伝子、及びクロラムフェニコール（ＣＡＴ）遺伝子がある。他の選択マーカー遺伝子、例えばｍａｎＡは、代謝の形質を与える。可視マーカー遺伝子もまた使用することができ、それには例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。
【０１０２】
したがって上に記載するように、本発明は、本発明のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞であるが、例えばウイルスであってもよい。昆虫及び／又はクモに特異的に感染するバキュロウイルスなどのウイルスを利用してもよい。このウイルスは哺乳動物には感染しないものであるため、望ましくないＲＮＡｉ作用は起こらないものであることから、このことは、哺乳動物、特にヒトに対する安全性を保証する。
【０１０３】
ヒト又は他の哺乳動物との接触が見込まれる（上記のように台所などの）環境で、害虫にＲＮＡｉを仲介するための送達剤として細菌細胞又はウイルスを使用する場合、その送達剤として使用する前にその細菌細胞又はウイルスを好ましくは不活性化すべきである。不活性化は、例えば熱処理、フェノール又はホルムアルデヒド処理などの任意の手段により実現することができる。
【０１０４】
本発明のＲＮＡ構築物を作製する方法もまた提供される。この方法は、本発明のＤＮＡ構築物を転写させて前記ＲＮＡ構築物を産生させる条件下で、
ａ．前記ＤＮＡ構築物若しくは本発明の発現構築物を無細胞成分と接触させるステップ、又は
ｂ．前記ＤＮＡ構築物若しくは本発明の発現構築物を細胞に適用するステップを含む。
【０１０５】
したがって、転写に必要な構成要素が用意されているｉｎ ｖｉｔｒｏ法が提供される。当業者であればこれらの構成要素をすぐに利用でき、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現キットが市販されている。
【０１０６】
或いは、宿主細胞中で発現を駆動してもよい。好ましくは、細胞は細菌細胞であるが、例えばウイルスであってもよい。
【０１０７】
さらに本発明のさらなる態様では、本発明の宿主細胞は本発明のｄｓＲＮＡ分子及びＲＮＡ構築物の産生のための供給源として使用してもよい。例えば、本発明のＲＮＡ構築物を有効量で産生させるために、（前記の）本発明の発現構築物を含む細菌宿主細胞を適切な条件（例えば３７℃又は４２℃）で培養することができる。細菌の大規模発酵工程及び回収工程は当技術分野において周知であり、商業的に利用されている。抗生物質耐性宿主株を利用する場合は、場合によりアンピシリン、カルベニシリン、又はクロラムフェニコールなどの適切な抗生物質を補充した例えばＬＢ培地などの任意の適切な培地の中で細菌培養を行うことができる。
【０１０８】
したがって、結果として得られた細菌培養物は、本発明のＲＮＡ構築物を大量に産生する。細菌自体は、本明細書に記載した適切な害虫防除剤組成物に製剤してもよいし、例えば標的昆虫又はクモによる摂食により取り込ませるために、本発明のＲＮＡ構築物の直接の（食物）供給源として使用してもよい。
【０１０９】
同様に一実施形態では、細菌を上記のように破壊するか、又は別の方法で不活性化することにより、ｄｓＲＮＡの供給源として使用することができる。例えば浸透圧ショックなどの任意の適切な手段を使用して、例えば細胞を破裂又は溶解させることができ、細菌の溶解物又は他の適切な細胞画分又は抽出物を本発明の組成物に利用することができる。
【０１１０】
一実施形態では、細菌抽出物又は溶解物を適切に精製して、実質的に純粋なＲＮＡ構築物を含有する抽出物を残すことができる。好ましくは、実質的に全ての細菌構成要素が最終的なｄｓＲＮＡ含有抽出物から除去され、続いての抽出物を実質的に本発明の組成物の任意の１つに製剤することができる。適切な精製ステップは当技術分野において周知であり、それには非限定的な例として適切な濾過ステップ、例えば電荷又は分子量に基づく分離が含まれていてもよい。対象のｄｓＲＮＡ分子を精製するために、適切なハイブリダイゼーション反応もまた採用してもよい。
【０１１１】
ＲＮＡ構築物は、選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法及び他のものを含む標準的な技法により実質的な純度に精製することができる（例えばＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記；及びＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。
【０１１２】
二本鎖ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ構築物及びＤＮＡ構築物は、典型的には天然塩基を組み込んでいるものである。しかし、変異体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、「ＲＮＡ」及び「ＤＮＡ」の範囲は、それぞれ天然ヌクレオチドと同様に塩基対を形成しＲＮＡｉを仲介することができるか、又は転写されてＲＮＡを産生することができる周知の糖修飾塩基を含む合成アナログを包含する。例えば、非天然塩基、化学修飾塩基、若しくは誘導体化塩基を組み込んだヌクレオチドアナログ、又は修飾された主鎖を有するヌクレオチドアナログが想定される。これは、本発明の構築物に組み込むことができるリンカーにも等しく当てはまる。特に、用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、非天然塩基を含有するｄｓＲＮＡを包含すると解釈すべきである。非天然若しくは塩基を含むか、又は化学修飾された主鎖を有する二本鎖ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ構築物の安定性の増加又は減少に関して追加の利点を与えることがある。
【０１１３】
害虫防除剤組成物
なおさらなる態様では、本発明は、本発明のＲＮＡ構築物、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物、及び／又は本発明の発現構築物、及び／又は本発明の宿主細胞を、適切な担体、賦形剤、又は希釈剤と共に含む害虫防除剤組成物に関する。
【０１１４】
最も好ましい実施形態によると、その組成物は、昆虫及び／又はクモによる摂食に適した形態である。
【０１１５】
その組成物は、昆虫及び／又はクモに適用するために適した任意の物理的形態であってもよい。その組成物は、例えば固体形態（粉末、ペレット、又はベイト剤など）、液体形態（スプレーなど）、又はゲル形態であってもよい。
【０１１６】
その組成物は、その組成物を長期保存したときにｄｓＲＮＡを安定化するか、及び／又はｄｓＲＮＡの分解を防止するように作用するさらなる構成要素を含有してもよい。
【０１１７】
その組成物は、なおさらには腸管細胞又は腸細胞によるｄｓＲＮＡの取り込みを高めるか、又は促進する構成要素を含有してもよい。これらには、例えば一般的に細胞へのＲＮＡの取り込みを促進する化学薬剤、例えばリポフェクタミンなどがありうる。
【０１１８】
本発明の「組成物」は、１つの容器に二本鎖ＲＮＡと、別の容器にＲＮＡ含有実体（ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ構築物、発現構築物、又は宿主細胞など）に適した希釈剤又は担体とを含む「パーツのキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）」として供給してもよいことが考慮されている。本発明は、二本鎖ＲＮＡをさらなる構成要素なしに単独で供給することにも関する。これらの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、濃縮水溶液などの濃縮された形態で供給してもよい。ｄｓＲＮＡは凍結形態で、又はフリーズドライ形態すなわち凍結乾燥形態でも供給してもよい。後者の方が長期保存では安定であり、使用直前に解凍及び／又は適切な希釈剤で再構成することができる。
【０１１９】
特定の一実施形態では、組成物は、昆虫及び／又はクモによる侵襲から支持体を保護するために、その支持体に適用することができるコーティング、ペースト、又は粉末のことがある。この実施形態では、組成物を使用して昆虫及び／又はクモによる侵襲、又はそれにより起こる損傷に感受性の任意の支持体又は材料、例えば食料及び他の生鮮材料、並びに木などの支持体を保護することができる。この実施形態に好ましい標的昆虫及び／又はクモ種には、先に定義した（「標的生物／標的種」参照）本発明の害虫、すなわち屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫があるが、それに限定されるわけではない。最も好ましい標的種はゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１２０】
この実施形態では、組成物は、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ含有実体（例えば上記のＲＮＡ構築物）と、意図された使用に適した少なくとも１つの担体、希釈剤、又は賦形剤とを含むものであり、ここで、二本鎖ＲＮＡ領域はアニーリングした相補鎖を含み、その二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は防除される昆虫及び／又はクモ由来の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する。
【０１２１】
賦形剤の性質及び組成物の物理的形態は、処理が望まれる支持体の性質に応じて変動することがある。例えば組成物は、処理される材料又は支持体に刷毛で塗られるか、噴霧されるか、又は押印される液体であってもよいし、処理される材料又は支持体に適用されるコーティング又は粉末であってもよい。したがって一実施形態では、組成物は適切な表面の上のコーティングの形態であり、そのコーティングは、それと接触する昆虫及び／又はクモに接着し、ついには摂食される。
【０１２２】
一実施形態では、組成物はベイト剤の形態である。ベイト剤は昆虫及び／又はクモを誘引して、組成物と接触するように設計されている。それと接触すると、組成物は、次に例えば摂食により昆虫及び／又はクモによりインターナリゼーションされ、ＲＮＡｉを仲介し、故に昆虫及び／又はクモを死滅させる。前記ベイト剤は、タンパク質性食物、例えば魚粉などの食品を含んでもよい。ホウ酸もまたベイト剤として使用することができる。ベイト剤は、標的とされる種に依存することがある。例えば、チャバネゴキブリは自分が入手できるほぼ全ての食品を食べるものである。誘引剤もまた使用することができる。誘引剤は、例えば男性フェロモン又は女性フェロモンなどのフェロモンであってもよい。例として、「Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｅｒｅｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」（Ｈｏｗｓｅら、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、１９９８）という書籍に言及されているフェロモンを本発明に使用することができる。誘引剤は、昆虫及び／又はクモをベイト剤に誘引するように作用し、特定の昆虫及び／又はクモを標的とすることができるし、全範囲の昆虫を誘引することもできる。ベイト剤は固体、ペースト、ペレット、又は粉末形態などの任意の適切な形態であってもよい。
【０１２３】
ベイト剤は、昆虫及び／又はクモによりコロニーに運び込まれることもある。次に、ベイト剤はコロニーの他のメンバーの食物源として作用し、故に多数の昆虫及び／又はクモ、可能性があることには昆虫及び／又はクモ害虫のコロニー全体を効果的に防除することができる。害虫へのＲＮＡｉ介在性効果の遅延作用がベイト剤をコロニーに運び込ませ、故に昆虫及び／又はクモへの曝露に最大の影響をもたらすことから、これは、本発明の二本鎖ＲＮＡの使用に関連する利点である。
【０１２４】
追加的に、昆虫及び／又はクモと接触する組成物は、昆虫及び／又はクモのクチクラに残存することができる。昆虫及び／若しくはクモ自体の個別の掃除、又は昆虫及び／若しくはクモの相互の掃除のいずれかである掃除の際に組成物は摂食され、故に昆虫及び／又はクモに組成物の効果を仲介することができる。これは、組成物が例えば数日間でありうる期間に外部環境条件に曝露された場合でもｄｓＲＮＡが無傷のままであり、ＲＮＡｉを仲介することが十分にできるほど安定であることを必要とする。
【０１２５】
ベイト剤は、適切な「ハウジング」又は「トラップ」の中に用意してもよい。当該ハウジング及びトラップは市販されており、現存するトラップを本発明の組成物を包含するように適合させることができる。昆虫及び／又はクモの進入を誘う任意のハウジング又はトラップが本発明の範囲内に含まれる。ハウジング又はトラップは、例えば箱型であってもよく、予め成形された状態で用意してもよいし、例えば折り畳むことのできる厚紙で形成していてもよい。ハウジング又はトラップに適切な材料には、プラスチック及び厚紙があり、特に段ボールがある。当該ハウジング又はトラップに適切な寸法は、例えば幅７〜１５ｃｍ、長さ１５〜２０ｃｍ、及び高さ１〜５ｃｍである。一度中に入った昆虫及び／又はクモの運動を制限するために、トラップの内面を粘着物で覆うことができる。ハウジング又はトラップは、内部でベイト剤を定位置にしておくことができる適切な窪みを有してもよい。進入した後で昆虫は容易にトラップを離れることができないが、ハウジングは、昆虫及び／又はクモが摂食し、捕食者を避けて安全を確保できる好ましい環境をそれらに用意する「摂食場所」として働くことから、トラップはハウジングと区別される。
【０１２６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、昆虫及び／又はクモのための本発明の組成物を有するハウジング又はトラップを提供し、それは、本明細書に記載した組成物の任意の特徴を組み込んでいてもよい。
【０１２７】
さらなる代替の実施形態では、組成物はスプレーの形態で用意してもよい。したがって、ヒトである使用者は、害虫に組成物を直接噴霧することができる。次に、組成物は昆虫及び／又はクモにインターナリゼーションされ、そこから組成物はＲＮＡ干渉を仲介し、故に昆虫及び／又はクモを防除することができる。スプレーは好ましくは加圧／エーロゾル化スプレー又はポンプスプレーである。粒子は、昆虫及び／又はクモに、例えば昆虫及び／又はクモの外骨格に接着するために適した径のことがあり、そこから吸収されることができる。粒子径は、市販されている装置のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒの使用などの公知の手段により測定することができる。
【０１２８】
なおさらなる実施形態では、担体は、昆虫及び／又はクモのクチクラに接着する静電荷電した粉末又は粒子である。昆虫及び／又はクモに接着し、故に本発明のＲＮＡ構築物を送達することができる適切な粉末及び粒子は、共に参照により本明細書に組み込まれている国際公開第９４／００９８０号パンフレット及び国際公開第９７／３３４７２号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１２９】
或いは、担体は昆虫のクチクラに接着する磁気粒子を含んでもよい。昆虫及び／又はクモに接着することができ、故に本発明のＲＮＡ構築物を送達することができる適切な磁気粒子は、参照が本明細書に組み込まれている国際公開第００／０１２３６号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１３０】
好ましいなおさらなる実施形態では、組成物の担体は、最初は磁化していないが、昆虫及び／又はクモの体により提供される電界にさらされると磁気的に分極することができる金属粒子を含む。この作用様式は国際公開第２００４／０４９８０７号パンフレットに詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３１】
昆虫及び／又はクモと接触するこれらの組成物は、昆虫及び／又はクモのクチクラに残存することができる。昆虫及び／若しくはクモ自体の個別の掃除又は昆虫及び／若しくはクモの相互の掃除のいずれかである掃除の際に組成物は摂食され、故に昆虫及び／又はクモに組成物の効果を仲介することができる。これは、組成物が例えば数日間でありうる期間に外部環境条件に曝露された場合でもｄｓＲＮＡが無傷のままであり、ＲＮＡｉを仲介することが十分にできるほど安定であることを必要とする。
【０１３２】
好ましくは、組成物は昆虫及び／又はクモ害虫への二本鎖ＲＮＡの取り込みを増大させる担体を組み込んでおり（上の「標的生物／標的種」参照）、それは好ましくは昆虫及び／又はクモであり、好ましくはゴキブリの種である。当該担体は、好ましくは水中油型乳剤、ミセル、コレステロール、リポポリアミン、及びリポソームのうち１つ又は複数を含む脂質系担体であってもよい。本発明の構築物の取り込みを促進するその他の薬剤は当業者に周知であり、それには、ポリカチオン、デキストラン、及びＣＳ０９６、ＣＳ１０２などの（トリス）カチオン系脂質がある。市販されているリポソームにはＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）及びＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）などがある。いくつかの適切な担体は、「トランスフェクション促進剤」の名称で国際公開第０３／００４６４４号パンフレットに挙げられており、提供された各例は、これによって参照により組み込まれている。
【０１３３】
さらに好ましい実施形態では、担体はヌクレオチド凝縮剤である。好ましくは、ヌクレオチド凝縮剤はスペルミジン若しくは硫酸プロタミン、又はその誘導体を含む。
【０１３４】
本発明の組成物をさらなる害虫防除剤を含めたさらなる活性成分と一緒に組み合わせることができる。したがって組成物は、１つの容器に二本鎖ＲＮＡ含有組成物と、別の容器に化学害虫防除剤又は生物学的害虫防除剤でありうる１つ又は複数の適切な害虫防除剤とを含む「パーツのキット」として用意してもよい。或いは組成物は、安定で、相互に一緒に使用する混合物として用意してもよい。
【０１３５】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子に相補的に作用することができる適切な活性成分には、非限定的に以下のものがある：クロルピリホス、アレスリン、レスメトリン、テトラブロモエチル、ジメトール−シクロプロパンカルボン酸（ｄｉｍｅｔｈｏｌ−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（一般に液体組成物に入れられる）、及びヒドラメチルノン、アベルメクチン、クロルピリホス、スルフラミド（ｓｕｌｆｕｒａｍｉｄ）、ヒドロプレン、フィプロニル（ＧＡＢＡ受容体）、メチルカルバミド酸イソプロピルフェニル、インドキサカルブ（ＰＡＲＡ）、ノビフルムロン（キチン合成阻害剤）、イミプロトリン（ＰＡＲＡ）、アバメクチン（グルタミン酸依存性塩素チャネル）、イミダクロプリド（アセチルコリン受容体）（これらは一般にベイト組成物に入れられる）。
【０１３６】
好ましい実施形態では、活性成分は、保健環境の問題から見て好ましい殺虫剤及び／又は殺クモ剤、例えばヒドラメチルノン及びアベルメクチンなどであることが公知である。
【０１３７】
別の実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、細菌細胞又は真菌細胞などの適切な宿主細胞に発現し、その細胞は害虫種により取り込まれるか、又は食べられる。さらなる実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、好ましくはそのｄｓＲＮＡを発現している細菌細胞又は真菌細胞である細胞から単離又は精製され、そのｄｓＲＮＡは害虫種に害虫防除剤として又は害虫防除製剤に入れて用意される。細菌又は真菌宿主細胞などの宿主細胞を操作して、本発明の任意のｄｓＲＮＡ又はＲＮＡ構築物を産生させることができる。好ましくは細菌細胞であるこれらの宿主細胞は、害虫種により摂食されるか、又は別の方法でインターナリゼーションされうる。取り込まれたときにｄｓＲＮＡはＲＮＡｉ応答を開始することができ、標的ｍＲＮＡの分解及び害虫の脆弱化又は死滅に至る。
【０１３８】
したがって、さらに特定の実施形態では、前記二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物は、細菌などの原核生物、又は酵母、宿主細胞、若しくは宿主生物などの真核生物により発現される。これらの細胞又は生物は、昆虫及び／又はクモによる取り込みを容易にするために適した任意の製剤の中に用意することができる。
【０１３９】
本発明の使用及び方法
なおさらなる態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉により昆虫及び／又はクモを防除するための本発明のＲＮＡ構築物、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物、及び／又は本発明の発現構築物、及び／又は本発明の組成物、及び／又は本発明のハウジング若しくはトラップの使用に関する。その使用は、本明細書に同定された新規な標的とオーソロガスな標的遺伝子を有する全ての発育段階のいくつかの昆虫及び／又はクモに適用することができ、それらには、屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。最も好ましい標的種はゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１４０】
好ましくは、ＲＮＡｉを介し害虫と闘い、結果としてその害虫は、死滅し、麻痺し、成長が遅延し、摂食が阻害され、及び／又はその生殖が妨害される。
【０１４１】
相補的な態様では、本発明は昆虫及び／又はクモ（害虫）を防除する方法もまた提供し、その方法は、昆虫及び／又はクモに上に定義したｄｓＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物、及び／又は上に定義した発現構築物、及び／又は上に定義した宿主細胞、及び／又は上に定義した組成物、及び／又は上に定義したハウジング若しくはトラップを適用するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１４２】
適用は、例えば昆虫及び／又はクモに摂食させることを伴うことがあるし、昆虫及び／又はクモに（上記及び／又は上に定義した様々な提示形態の）ｄｓＲＮＡを接触させることを伴うこともある。直接接触に適した手段には、本発明の組成物に関して上に定義及び記載したベイト剤、粘着性ストリップ、帯磁及び荷電した粉末及び粒子、スプレー、ゲル、軟膏、表面処理などがある。任意の適用手段が、標的遺伝子発現の効果的な二本鎖ＲＮＡ介在性干渉をもたらすことによって昆虫及び／又はクモを防除するならば、その適用手段は本発明の範囲内に含まれる。
【０１４３】
複数の標的に対する構築物を含む複数の二本鎖ＲＮＡ領域を用意することが好都合なことがある。それは、このことが昆虫及び／又はクモの防除の有効性を増大させ、昆虫及び／又はクモが抵抗性を獲得する確率も減少させるからである。
【０１４４】
したがって、本発明の一実施形態では、複数の別々のＲＮＡｉ事象を仲介するために、上に定義した複数のＲＮＡ構築物、及び／又は上に定義したＤＮＡ構築物、及び／又は上に定義した発現構築物、及び／又は上に定義した宿主細胞、及び／又は上に定義した組成物、及び／又は上に定義したハウジング若しくはトラップが害虫に提供／適用される。
【０１４５】
複数の標的は、全てが同時に標的とされることがあるし、連続的に標的とされることもある。したがって、一実施形態では、昆虫及び／又はクモが抵抗性を獲得する確率を減らすために複数のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物、及び／又は宿主細胞、及び／又は組成物、及び／又はハウジング若しくはトラップが、連続的に供給／適用される。
【０１４６】
本発明の方法は、本明細書において同定された新規な標的とオーソロガスな標的遺伝子を有する、全ての発育段階のいくつかの昆虫及び／又はクモに適用することができる。標的昆虫には、屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。最も好ましい標的種はゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１４７】
好ましくは、ＲＮＡｉにより昆虫及び／又はクモ害虫と闘い、結果としてその害虫は、死滅し、麻痺し、成長が遅延し、摂食が阻害され、及び／又はその生殖が妨害される。
【０１４８】
一実施形態では、宿主細胞は、本発明のＲＮＡ構築物を産生するように操作された細菌細胞であってもよい。
【０１４９】
なおさらなる態様では、本発明は、ゴキブリに少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を提供／適用することを含む、ゴキブリ害虫を防除する方法を提供し、その二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、ゴキブリリボソームタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。ゴキブリリボソームタンパク質は、ゴキブリの侵襲の効果的な防除を仲介することができるＲＮＡｉについての新規な標的となる。
【０１５０】
好ましくは、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも約１７、１８、１９、２０、２１個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は約１３００個のヌクレオチドを含む。
【０１５１】
なおさらなる態様では、本発明はゴキブリ害虫を防除する方法を提供し、その方法は、ゴキブリに少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を提供／適用するステップを含み、その二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、トロポミオシン、ＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ遺伝子、又はアクチン５Ｃ遺伝子をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。ゴキブリトロポミオシン、ＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ、及びアクチン５Ｃタンパク質はＲＮＡｉについての新規な標的となり、それはゴキブリ侵襲の効果的な防除を仲介することができる。
【０１５２】
好ましくは、少なくとも１つの二本鎖領域の少なくとも１方の鎖は、配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも約１７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は約１３００個のヌクレオチドを含む。
【０１５３】
本発明の方法は、本明細書に同定した新規な標的とオーソロガスな標的遺伝子を有する、全ての発育段階のいくつかの昆虫及び／又はクモに適用することができる。標的昆虫には、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。より好ましい標的種は、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）、ゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。さらに好ましい標的はゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１５４】
好ましくは、ＲＮＡｉにより昆虫及び／又はクモ害虫と闘い、結果的にその害虫は、死滅し、麻痺し、成長が遅延し、摂食が阻害され、及び／又はその生殖が妨害される。
【０１５５】
本発明のキット
本発明は、本発明の方法に使用するためのキットもまた提供する。これらのキットは、本発明のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物、及び／又は宿主細胞、及び／又は組成物、及び／又はハウジング若しくはトラップを組み入れていてもよく、その全てはｄｓＲＮＡ領域を送達して特異的標的遺伝子に対するＲＮＡｉをもたらす。
【０１５６】
好ましくは、キットは、そのキットの構成要素の使用説明書もまた含むものである。本発明のキットに見られるか、又は本発明のキットの構成要素により産生される二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫（害虫）遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１５７】
好ましくは、（上記の）さらに効果的な害虫防除をもたらすために、キットは、それぞれが異なる標的遺伝子又は昆虫及び／若しくはクモ種でＲＮＡｉを仲介する複数の構成要素を備える。したがって、キットは複数のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物、及び／又は組成物を備えることがあり、各二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫及び／又はクモ（害虫）遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１５８】
好ましくは、キットの構成要素を連続的に適用し、効果的な害虫駆除を仲介する。しかし、最大の影響に必要ならば、一部又は全ての構成要素を同時に適用してもよい。
【０１５９】
キットは、公知の害虫防除剤を追加的に備えてもよく、その害虫防除剤は、本発明の部分を形成している構成要素と一緒に、又は別々に用意することができる。
【０１６０】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子に相補的に作用しうる適切な有効成分には、非限定的に以下のものがある：クロルピリホス、アレスリン、レスメトリン、テトラブロモエチル、ジメトール−シクロプロパンカルボン酸（一般に液体組成物に入れられる）、及びヒドラメチルノン、アベルメクチン、クロルピリホス、スルフラミド、ヒドロプレン、フィプロニル（ＧＡＢＡ受容体）、メチルカルバミド酸イソプロピルフェニル、インドキサカルブ（ＰＡＲＡ）、ノビフルムロン（キチン合成阻害剤）、イミプロトリン（ＰＡＲＡ）、アバメクチン（グルタミン酸依存性塩素チャネル）、イミダクロプリド（アセチルコリン受容体）（これらは一般にベイト組成物に入れられる）。
【０１６１】
好ましい実施形態では、活性成分は、衛生環境の問題から見て「好ましい」殺虫剤及び／又は殺クモ剤、例えばヒドラメチルノン及びアベルメクチンなどであることが知られている。
【０１６２】
したがって、本発明のキットは、広範囲の害虫を防除する選択肢を与えるために同時に複数の種に向けることもまたできる。二本鎖ＲＮＡ分子を（適切な構築物の部分などとして）キットに含めて、例えば同一の標的の種間オーソログを含む複数の標的のＲＮＡｉを仲介することができる。
【０１６３】
キットは、適切な緩衝液及びパッケージなどもまた含み、その中の構成要素の安定性及び保存を確実にすることができる。
【０１６４】
本発明の技術的な長所
従来の化学殺虫剤の使用に比べて、本発明に関連する多数の大きな長所がある。
（１）ｄｓＲＮＡを仲介しているＲＮＡｉは、効果的に発現をダウンレギュレーションすることにより害虫を防除するために、高度のヌクレオチド配列同一性で標的と一致しなければならない。したがって、特異性は、１方の鎖が標的配列と高い相同性を有するが、その鎖がヒトなどの哺乳動物種でのオーソロガスな配列と低い相同性だけを有する二本鎖ＲＮＡ分子を設計することにより実現することができる。この特異性は、従来の化学殺虫剤で実現できるものよりも大きい。
（２）害虫の防除に使用することができる新しいセットの標的が同定された。これらの標的は以前に同定されていないため、害虫種に獲得された抵抗性はないはずである。
（３）新規な標的に対するＲＮＡｉに使用する二本鎖ＲＮＡは、ＤＭＳＯなどの公知の化学合成害虫防除剤に比べて生分解性の産物である。この構築物が生分解性であることから、この構築物は環境面でさらに健全になる。
（４）ＲＮＡｉは、害虫を死滅させる点で必ずしも即時効果を与えるわけではなく、それどころかその効果は効果的に仲介されるが、二本鎖ＲＮＡがその標的と会合するには時間が必要である。ＲＮＡｉの効果は、（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓからのキチン合成阻害剤である）ノビフルムロンのようにその後にそして接触直後でなしに害虫の死滅を招くことができる。したがって、害虫が殺虫剤及び／又は殺クモ剤の近くで大量の死んだ害虫に出くわして害虫の間にショック効果が広がるという機会が少ないことから、ＲＮＡｉを使用すると、昆虫及び／又はクモなどの害虫の大規模な侵襲を比較的容易に防除することができる。
（５）同時に複数の標的を使用することは、害虫の個体数のさらに有効な防除をもたらし、抵抗性を獲得する確率を減らすことができる。標的はいくつかの害虫種に共通で、広範囲の処置を与えることがある。
（６）従来の害虫防除剤とは対照的に、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡ構築物、組成物、並びに宿主細胞の性質が比較的安全であることから、関連する場所を処理するために職業的な援助は必要ないであろう。
（７）二本鎖ＲＮＡ領域含有構築物が、標的害虫集団以外の遺伝子発現に有害作用もごく小さな作用も有さないように設計されていることから、ヒトの活動性の混乱は最小限しか必要ないであろう。
【０１６５】
以下の実験の部を参照すると、本発明がさらに理解されよう。
［表の説明］
表１：新規に同定した昆虫標的遺伝子の例。割り当てられた遺伝子機能はＦｌｙＢａｓｅオーソログに基づく。
表２：チャバネゴキブリ標的配列に相補的なｄｓＲＮＡ断片。
表３：うまく脱皮して成虫期になったゴキブリの数に及ぼすｄｓＲＮＡ処置の効果を生きた昆虫の率で表したもの（平均±標準誤差、ｎ＝４）。
表４：選択された標的遺伝子配列＊。配列＊の少なくとも１７ｂｐの断片は、昆虫種での特異的にオーソロガスな配列に存在する（ＧＩ番号で表す）。
表５：選択された標的遺伝子配列＊。配列＊の少なくとも１７ｂｐの断片は、クモ種での特異的にオーソロガスな配列に存在する（ＧＩ番号で表す）。
【０１６６】
【表１】
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
【表３】
【０１６９】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【表４−６】
【表４−７】
【表４−８】
【表４−９】
【表４−１０】
【表４−１１】
【表４−１２】
【表４−１３】
【表４−１４】
【表４−１５】
【表４−１６】
【表４−１７】
【０１７０】
【表５−１】
【表５−２】
【実施例】
【０１７１】
〔実施例１：ファミリーＰＣＲによるチャバネゴキブリＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、及びＢｇ００５遺伝子の部分配列のクローニング〕
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号１５５９６−０２６／１５５９６−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、高品質の無傷のＲＮＡをチャバネゴキブリ（入手源：Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ヨーク）から単離した。このＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、製造業者が指示したＤｎアーゼ処理により除去した。市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、カタログ番号１８０８００４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、ｃＤＮＡを作製した。
【０１７２】
Ｂｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、及びＢｇ００５遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（カタログ番号Ｎ８０８０２４０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者が指示したように使用して、縮重プライマーを用いた一連のＰＣＲ反応を行った。
【０１７３】
Ｂｇ００１については、縮重プライマーｏＧＢＫＡ００２及びｏＧＢＫＡ０２０（本明細書においてそれぞれ配列番号３及び配列番号４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５７℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号１で表し、Ｂｇ００１遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号２で表す。
【０１７４】
Ｂｇ００３について、縮重プライマーｏＧＢＫＣ００１及びｏＧＢＫＣ０１０（本明細書においてそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号１１で表し、Ｂｇ００３遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号１２で表す。
【０１７５】
Ｂｇ００４について、縮重プライマーｏＧＢＫＤ００１及びｏＧＢＫＤ００６（本明細書においてそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号２１で表し、Ｂｇ００４遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号２２で表す。
【０１７６】
Ｂｇ００５について、縮重プライマーｏＧＢＫＥ００２及びｏＧＢＫＥ００９（本明細書においてそれぞれ配列番号３３及び配列番号３４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５２℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号３１で表し、Ｂｇ００５遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号３２と表す。
【０１７７】
〔実施例２：ＥＳＴ配列によるチャバネゴキブリＢｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の部分配列のクローニング〕
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号１５５９６−０２６／１５５９６−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、高品質の無傷のＲＮＡをチャバネゴキブリ（入手源：Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ヨーク）から単離した。このＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、製造業者が指示したようにＤＮアーゼ処理により除去した。市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、カタログ番号１８０８００４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、ｃＤＮＡを作製した。
【０１７８】
Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２及びＢｇ０３３遺伝子由来の部分ｃＤＮＡ配列を同定するために、公共データベースＧｅｎｂａｎｋ由来の公共データベースＧｅｎｂａｎｋのそれぞれ受託番号ＡＦ２６０８９７、Ｘ７３６７９、及びＡＹ００４２４８に各遺伝子あたり１つのＥＳＴを見出した。
【０１７９】
Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Ｐｅｒｆｅｃｔｓｈｏｔ（商標）ＥｘＴａｑ（カタログ番号ＲＲ００５Ａ、タカラバイオ株式会社）を製造業者が指示したように使用して、ＥＳＴに基づく特異的プライマーを用いた一連のＰＣＲ反応を行った。
【０１８０】
Ｂｇ０３１について、特異的プライマーｏＧＢＬＡ００１及びｏＧＢＬＡ００２（本明細書においてそれぞれ配列番号４３及び配列番号４４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号４１で表し、Ｂｇ０３１遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号４２で表す。
【０１８１】
Ｂｇ０３２について、特異的プライマーｏＧＢＬＢ００３及びｏＧＢＬＢ００４（本明細書においてそれぞれ配列番号５１及び配列番号５２で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号４９で表し、Ｂｇ０３２遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号５０で表す。
【０１８２】
Ｂｇ０３３について、特異的プライマーｏＧＢＬＣ００１及びｏＧＢＬＣ００４（本明細書においてそれぞれ配列番号５９及び配列番号６０で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号５７で表し、Ｂｇ０３３遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号５８で表す。
【０１８３】
〔実施例３：チャバネゴキブリＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子のｄｓＲＮＡ産生〕
市販のキットＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｐ１７００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に２つの異なる一本鎖５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターテンプレートを２つの異なるＰＣＲ反応で作製した。各反応物はＴ７プロモーターに対して異なる方向で標的配列を含む。
【０１８４】
Ｂｇ００１について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００１及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１０（本明細書においてそれぞれ５及び配列番号６で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応に使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００９及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００２（本明細書においてそれぞれ配列番号７及び配列番号８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応で使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号９で表す。
【０１８５】
Ｂｇ００３について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００３及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１２（本明細書においてそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６と表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ０１１及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００４（本明細書においてそれぞれ１７及び配列番号１８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応で使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号１９で表す。
【０１８６】
Ｂｇ００４について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００５及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１４（本明細書においてそれぞれ配列番号２５及び配列番号２６で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ０１３及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００６（本明細書においてそれぞれ配列番号２７及び配列番号２８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号２９で表す。
【０１８７】
Ｂｇ００５について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１６（本明細書においてそれぞれ配列番号３５及び配列番号３６で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ０１５及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号３７及び配列番号３８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号３９で表す。
【０１８８】
Ｂｇ０３１について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＡ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＡ００２（本明細書においてそれぞれ配列番号４５及び配列番号４４で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＡ００１及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＡ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号４３及び配列番号４６で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号４７で表す。
【０１８９】
Ｂｇ０３２について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＢ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＢ００４（本明細書においてそれぞれ配列番号５３及び配列番号５２で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＢ００３及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＢ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号５１及び配列番号５４で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号５５で表す。
【０１９０】
Ｂｇ０３３について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＣ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＣ００４（本明細書においてそれぞれ６１及び配列番号６０で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＣ００１及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＣ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号５９及び配列番号６２で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号６３で表す。
【０１９１】
〔実施例４：チャバネゴキブリＢｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａに対する活性についてｄｓＲＮＡ標的をスクリーニングする実験室内試験〕
蒸留水に溶かした１〜１０μｇ／μｌ ｄｓＲＮＡ原液を調製した。各ｄｓＲＮＡ溶液を適切な濃度に希釈し、それを細かく磨り潰した実験室動物用餌（ラット及びマウス標準食、Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ、ハル、英国）（全ての酵素を不活性化するために予め熱処理したもの）と混合した。この混合物又は製剤を等重量（０．３ｇ）の小さなペレットに成形し、終濃度０．１％から２％ｗ／ｗ ｄｓＲＮＡにして、室温で一晩乾燥させた。
【０１９２】
新たに孵化したチャバネゴキブリＢ．ｇｅｒｍａｎｉｃａの若虫をプラスチック蓋のついた容器（２９±２℃、相対湿度最低４０％、１２：１２明暗光周期）に１０匹ずつ入れた。動物を２４時間絶食させてからペレットを提示した。成虫になるまで週に２回、ゴキブリの生存、瀕死、又は死滅を評定した。週に１回、ペレットを新たに調製したペレットと交換した。ｄｓＲＮＡ含有ペレットである製剤を陰性対照（溶媒）及び陽性対照（１又は２％イミダクロプリド（市販のゴキブリ用ベイト剤に通常使用されている））と比較した。図１に示すように、Ｂｇ００１、Ｂｇ００３、及びＢｇ００５で処置したときは初回投与の２４日以内に、Ｂｇ００４で処置したときは２９日以内に、それぞれゴキブリの少なくとも８０％は死滅した。
【０１９３】
〔実施例５：効率に関する種々の断片の実験
ヒトと実質的な相同性を有さないチャバネゴキブリＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の断片の同定〕
本明細書においてそれぞれ配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４９、及び配列番号５７に表すＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の部分配列を分析し、非標的生物と実質的な相同性を有さない断片を見出した。特に、ｄｓＲＮＡは生物中でｓｉＲＮＡ分子に細切されるものであることから、非標的種と相同性を有するであろうｓｉＲＮＡ配列を求めて配列をスキャンした。当該ｓｉＲＮＡは非標的生物に有害作用を起こすおそれがあるため、最終産物に組み入れるｄｓＲＮＡ断片に入れるのは避けることが好ましい。選択された断片は、例えばベイト剤に存在してゴキブリの摂食によりベイト剤から取り込まれる場合、ＲＮＡ干渉によるゴキブリ防除に適する。この分析について、非標的生物はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）であった。非標的生物に存在しない２１個の隣接するヌクレオチド（ｂｅｓｔ１＿ｈｕｍａｎ＿２１＿０）、又は３つのミスマッチを許した２４個の隣接するヌクレオチド（ｂｅｓｔ１／２／３＿ｈｕｍａｎ＿２４＿３）の断片を同定した。これを本明細書において「フリーフラッグ（ｆｒｅｅｆｒａｇ）」と名付ける。第１の選択基準で非標的生物の配列を有さないＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２及びＢｇ０３３の最長配列を配列番号で示し、本明細書において「フリーフラッグ」と名付ける。これらのＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３のフリーフラッグは、本明細書においてそれぞれ配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、及び配列番号６４で表す。本発明での使用に適した他のフリーフラッグ配列の数例の長さ及び配列を表２に示す。正確な配列は、この表から容易に推定することができる。表に記載した全てのフリーフラッグ配列は、本発明の配列群に属する。
【０１９４】
当業者は、様々な長さのより多くの当該フリーフラッグが、本明細書に提示したチャバネゴキブリ配列、並びに本発明による他の害虫配列中の対応する遺伝子及びタンパク質のオーソログである配列で同定されることがあり、したがって、本発明がこれらのさらに同定することのできるフリーフラッグに及ぶことを認識しているであろう。
【０１９５】
〔実施例６：最適の断片の選択；効率についてのコンカテマーの試験〕
各標的遺伝子についてコンカテマーを設計した。コンカテマーは５０から１００ｂｐのｄｓ断片の合成タンデム反復である。本実施例では、タンパク質ファミリー中で相同性を有する領域から、そしてヌクレオチドレベルで最良の予測されるｓｉＲＮＡを含む領域及び４０から６０％のＧＣ含量、可能であれば好ましくは約５０％のＧＣ含量を有する領域から最良の可能性のある断片を選択することによってコンカテマーを設計した。
【０１９６】
Ｂｇ００１について、５０ｂｐ断片、すなわち配列番号６５及び６６に表す断片の５回繰り返しからなる２つのコンカテマーを設計し、本明細書においてそれぞれ配列番号６７及び配列番号６８で表すＢｇ００１コンカテマー１及びＢｇ００１コンカテマー２を得た。さらに、１００ｂｐの繰り返し、すなわち配列番号６９に表す繰り返しの３回繰り返しからなる１つのコンカテマーを設計し、本明細書において配列番号７０で表すＢｇ００１コンカテマー３を得た。ベクターにクローニングするためにＸｂａＩ及びＳｍａＩ隣接部位を付加し、ｄｓＲＮＡを産生させた。コンカテマーを含むこれらのｄｓＲＮＡ構築物をゴキブリの実験室内試験で試験した。
【０１９７】
図２に示すさらなる実験で、Ｂｇ００１及びＢｇ００１コンカテマー２で処置したときの死滅率は陰性対照（溶媒）に比べて有意に高かった。
【０１９８】
死滅率以外に、処置は発育に有意な効果を示した。例えば表３に示すように、４８日目にはＢｇ００１で処置されて生存しているゴキブリのうち３３．３％だけが脱皮して成虫期段階になったが、Ｂｇ００１コンカテマー２で処置されたゴキブリはこの期間に１匹もそうならなかった。
【０１９９】
〔実施例７：種々の製剤の試験〕
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多数の異なる種において配列特異的に標的遺伝子の発現を阻害する、潜在的に非常に強力な手段である。しかし、ＲＮＡｉが貴重で効果的であるためには、所与の任意の標的遺伝子を、非特異的ノックダウン及び有毒な副作用なしに特異的にサイレンシングすることが不可欠である。ｄｓＲＮＡの適用は、細胞内でのこれらの化合物の作用部位にこれらの化合物を効果的に送達できないことによって妨害されてきた。特異性を失わずに相互作用の強度及び安定性を高めるためのｄｓＲＮＡの化学修飾の進歩が継続中である。この実験では、チャバネゴキブリの標的遺伝子にｄｓＲＮＡを送達するためのいくつかの概念について評価する。
【０２００】
エンドサイトーシを容易にすることによりｄｓＲＮＡの細胞内取込みを増大させること、又は脂質及びリポソームなどの送達剤を使用して生物学的環境におけるｄｓＲＮＡの安定性を増大させることによって、ＲＮＡｉに誘導される効果を向上することができる。ｓｉＲＮＡ−はアニオン性ホスホジエステル主鎖を有し、この理由からカチオン性リポソーム／脂質介在性ｓｉＲＮＡ送達（ｓｉＦｅｃｔｉｏｎ）が検討される。これらのカチオン性リポソーム／脂質に基づく系は、リポフェクタミン及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチル−アンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロールを含めたいくつかの市販製品から選択され、ゴキブリの実験室内試験でｄｓＲＮＡ製剤を試験する。検討するパラメーターには混合の脂質：ｄｓＲＮＡ比、カチオン性リポソーム／脂質−ｄｓＲＮＡ複合体の形成度、粒子径、送達様式、及び用量反応効果がある。
【０２０１】
〔実施例８：ｄｓＲＮＡの安定性試験〕
遺伝子サイレンシングのためのｄｓＲＮＡ適用は、分子の生物学的安定性、特異性、及び送達の改善に依存するものである。
【０２０２】
一部の標的種の腸内のｐＨを模倣するために、作製したｄｓＲＮＡの安定性をｐＨ７及びｐＨ９のＴＲＩＺＭＡ緩衝液及びｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝液で試験した。ｄｓＲＮＡを数日間インキュベートし、その一定分量を異なる時間間隔で２０％ポリアクリルアミドゲル上において分析した。ゲルの結果に基づき、ｄｓＲＮＡの安定性に及ぼすｐＨの影響は観察できなかった。
【０２０３】
作製したｄｓＲＮＡの安定性を、無ＲＮアーゼ水及びＬＢ培地中で室温で８ヶ月間にわたり時間の関数として試験した。一定分量を毎週及び／又は毎月採取し、−２０℃で保存してから２０％ポリアクリルアミドゲル上において分析した。図３に示すようにポリアクリルアミドゲルでｄｓＲＮＡの有意な分解を観察することはできなかった。
【０２０４】
〔実施例９：チャバネゴキブリＢｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａの初期若虫期での死滅率に及ぼす単回投与ｄｓＲＮＡを試験するための実験室内試験〕
蒸留水に溶かした１０μｇ／μｌ ｄｓＲＮＡ原液を調製し、それを細かく磨り潰した実験室動物用餌（ラット及びマウス標準食、Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ、ハル、英国）（全ての酵素を不活性化するために予め熱処理したもの）と混合した。この混合物又は製剤を等重量（０．３ｇ）の小さなペレットに成形し、終濃度１％ｗ／ｗ ｄｓＲＮＡにして、室温で一晩乾燥させた。
【０２０５】
新たに孵化したチャバネゴキブリＢ．ｇｅｒｍａｎｉｃａの若虫をプラスチック蓋のついた容器（２９±２℃、相対湿度最低４０％、１２：１２明暗光周期）に１０匹ずつ入れた。動物を２４時間絶食させてからペレットを提示した。１週間後にこの初回用量を未処置のペレットと交換した。成虫になるまで週に２回、ゴキブリの生存、瀕死、又は死滅を評定した。図４に示すように、Ｂｇ００１ ｄｓＲＮＡ含有ペレットは、２つの陰性対照（溶媒及び種々雑多なｄｓＲＮＡ）に比べて有意に高い死滅率を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫種における二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在性遺伝子サイレンシングの分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、本明細書において初めて同定された新規な標的に対応するｄｓＲＮＡの発現のために設計された遺伝子構築物に関する。これらの構築物は、詳しくはｄｓＲＮＡ介在性昆虫害虫防除に、特に屋内昆虫又は屋内クモ、例えばゴキブリの防除に有用である。
【背景技術】
【０００２】
害虫防除、詳しくは昆虫及び／又はクモの防除、特に屋内昆虫、外部寄生虫、並びにゴキブリ、ノミ、アリ、シロアリ、ハサミムシ、カ、ハエ、及びイエコオロギなどの公衆の保健衛生（例えば都市の保護）に関連する昆虫の防除は重要な分野である。ゴキブリやハエなどの昆虫は、不潔で、管理の行き届いていない場所に生息するという公衆の共通の認識があることから、家庭、職場、飲食店、病院、又は倉庫などの場所における昆虫の存在は疑いようもない悩みの種である。
【０００３】
これらの昆虫は悩みの種になるばかりでなく、食物や食器も汚し、織物製品や紙製品を台無しにし、それらが触れた表面に汚れや不快臭を付ける。さらに、これらの昆虫は、細菌の保菌動物として健康上のリスクを引き起こすおそれがある。例えばゴキブリは、食中毒を引き起こす細菌（サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．））を伝染させるおそれがある。チャバネゴキブリは、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、連鎖球菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、肝炎ウイルス、及び大腸菌型細菌などの病原性生物を伝染させることができると考えられている。チャバネゴキブリは、腸チフス及び赤痢の蔓延にも関係付けられてきた。一部の者、特に喘息をもつ者は、これらのゴキブリが産生するアレルゲンに感受性がある。
【０００４】
家屋害虫と闘うために開発され、市販されている様々な化学殺虫剤及び捕獲装置がある。しかし、これらの手段の効力が増大することは、通常は健康上のリスクが増大することと結びついている。殺虫剤は食物を汚染するおそれがあり、これは、台所、飲食店、又は食物貯蔵庫などの場所ではほとんど避けることができず、混入はヒトに健康上のリスクを引き起こすおそれがある。
【０００５】
この汚染問題の解決は、より毒性の低い殺虫剤を使用することであった。しかし、より毒性の低い殺虫剤を適用すると、昆虫が時を経て抵抗性になる確率が増加する。
【０００６】
殺虫剤は、例えばアセチルコリン受容体などのある種の昆虫タンパク質に結合することにより作用し、そのタンパク質の不活性化又は過剰活性化のいずれかにより害虫種を死滅させる。殺虫剤はある濃度で安全であるように開発されてきたが、高用量又は長期間取り込むとヒトの健康に影響を及ぼすおそれがあり、実際に影響を及ぼす。農業用化学物質とは逆に、屋内昆虫の殺虫剤は、食物が貯蔵又は調理される場所に適用されるため、食物汚染及びヒトとの接触を避けることはできない。
【０００７】
化学害虫防除剤の１つの代替となるものは、生物学的薬剤を利用することである。過去数年間で、ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」による多細胞生物遺伝子のダウンレギュレーション（「遺伝子サイレンシング」とも呼ばれる）が確立した技法となった。
【０００８】
一般にＲＮＡｉは、ダウンレギュレーションされる遺伝子（「標的遺伝子」）のヌクレオチド配列（の少なくとも一部）に対応するヌクレオチド配列を含む（一般にアニーリングした２つの相補的ＲＮＡ一本鎖又はヘアピン構築物のいずれかとしての）二本鎖ＲＮＡ断片、すなわち「ｄｓＲＮＡ」と生物を接触させることを含む。とりわけ国際出願の国際公開第９９／３２６１９号パンフレット（Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、国際出願の国際公開第９９／５３０５０号パンフレット（ＣＳＩＲＯ）、国際出願の国際公開第００／０１８４６号パンフレット（Ｄｅｖｇｅｎ）、及びＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、８０６〜８１１頁、１９９８年２月が参照される。
【０００９】
線虫では、ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡ断片自体をそれとして、又はｄｓＲＮＡ断片を含む細菌株又は線虫による摂食時にｄｓＲＮＡ断片を発現することのできるか細菌株のいずれかをその線虫に給餌することにより行うことができる。このいわゆる「給餌によるＲＮＡｉ」について、とりわけ出願人による国際出願の国際公開第００／０１８４６号パンフレット、及び線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用している上記に引用した国際公開第９９／３２６１９号パンフレットが参照される。
【００１０】
多数のｄｓＲＮＡ構築物が当技術分野において記載されている。古典的ｄｓＲＮＡは、ダウンレギュレーションする必要のある標的配列に相補的な配列に隣接する２つの収束性のプロモーターを有するＤＮＡ構築物から産生される（例えば国際公開第００／０１８４６号パンフレット（Ｄｅｖｇｅｎ）参照）。ｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングの技術が進歩するにつれて、新しい構築物が設計され、様々な目的のためにｄｓＲＮＡが改良された。
【００１１】
ｄｓＲＮＡをさらに効率的に産生するために、ステム−ループ−ステム構造すなわち「ヘアピン」が開発された。例えば、国際公開第９９／５３０５０号パンフレットという文書（ＣＳＩＲＯ）に記載されているように、このヘアピンは１つの一本鎖ＲＮＡ転写物からｄｓＲＮＡを形成させる。このＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ転写物を折り畳み、塩基対を形成させてｄｓＲＮＡのステム部分にする非相補的ループ構造により分離されたセンス版及びアンチセンス版の相補的配列を含む。
【００１２】
ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングは、例えば臨床適用（国際公開第２００４／００１０１３号パンフレット）及び植物におけるｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングなどの多数の異なる領域に適用を見出している。植物では、遺伝子サイレンシングに有用なｄｓＲＮＡ構築物は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に開裂するように、及びそれにプロセシングされるようにも設計された。
【００１３】
ＲＮＡｉは、植物寄生線虫から植物を保護する手段として、すなわち植物（例えば植物全体、又は植物の部分、組織、若しくは細胞）に、植物寄生線虫の成長、生殖、及び／又は生存に不可欠な植物寄生線虫標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ断片を形成する１つ又は複数のヌクレオチド配列を発現させることによる手段としてもまた提案された。当該技法の説明については、本出願人による国際出願の国際公開第００／０１８４６号パンフレット、米国特許第６５０６５５９号（国際公開第９９／３２６１９号パンフレットに基づく）、並びに国際出願の国際公開第０１／９６５８４号パンフレット、国際公開第０１／３７６５４号パンフレット、及び国際公開第０３／０５２１１０号パンフレットを参照することができる。
【００１４】
Ｅｌｂａｓｈｉｒら（Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４９４〜４９８、２００１）は、長さ２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ断片（低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡとも名付けられている）を使用して、哺乳動物細胞における効果的なＲＮＡｉ介在性遺伝子サイレンシングを実証した。
【００１５】
国際公開第０３／００４６４４号パンフレットは、一般論として節足動物へのｄｓＲＮＡの送達を記載しており、このパンフレットは参照により本明細書に組み込まれている。国際公開第０３／００４６４４号パンフレットは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるＲＮＡｉを使用したレポーター遺伝子ＧＵＳ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のダウンレギュレーション及びオオタバコガ（Ｈ．ａｒｍｉｇｅｒａ）におけるｖＡＴＰアーゼ遺伝子のダウンレギュレーションを詳述している。
【００１６】
国際公開第０１／３４８１５号パンフレットは、ｄｓＲＮＡを産生するバキュロウイルス発現ベクター及び害虫防除へのこれらのベクターの使用に関する。
【００１７】
ＲＮＡｉの技法は、ここ数年、植物、線虫、及び哺乳動物細胞の技術分野で一般に公知であったが、昆虫及び／又はクモにおける遺伝子発現をダウンレギュレーションするためのＲＮＡｉの使用については現在のところほとんど知られていない。さらに、屋内昆虫、外部寄生虫並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモなどの害虫種を防除するためのＲＮＡｉの適用についてはほとんど知られていない。
【００１８】
ｄｓＲＮＡ介在性害虫防除に適し、効率的な構築物は、以下の条件の少なくとも一部を満たすべきである。
（１）ｄｓＲＮＡは有害生物により取り込まれなければならない、
（２）ｄｓＲＮＡは有害生物中で良好な安定性を有さなければならない、
（３）ｄｓＲＮＡは有害生物に有効で、その生存率、成長、及び／若しくは発育を制御しなければならない、及び／又は
（４）ｄｓＲＮＡは最大の安全性及び最小の環境影響を保証しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
今回、上に言及した条件を満たすｄｓＲＮＡ構築物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、昆虫及び／又はクモの防除のための、化合物に基づかない新規な取り組みを記載する。活性成分はヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、それを（例えばベイト剤又はゲル塗布剤の形の）殺虫又は殺クモ製剤として使用することができる。ｄｓＲＮＡの配列は不可欠な昆虫遺伝子の部分と一致し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により昆虫標的のダウンレギュレーションを引き起こす。ｍＲＮＡのダウンレギュレーションの結果として、ｄｓＲＮＡは対応する昆虫タンパク質の発現を阻害することによって、その昆虫及び／又はクモの死滅、成長停止、又は生殖不能を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】人工ペレット餌でのチャバネゴキブリの死滅率。ペレット中のｄｓＲＮＡの濃度は１％ｗ／ｗであった。イミダクロプリドの濃度は１％ｗ／ｗであった。
【図２】人工ペレット餌でのチャバネゴキブリの死滅率。ペレット中のｄｓＲＮＡ（配列番号９に表す配列を有するＢｇ００１及び配列番号６８に表す配列を有するＢｇ００１コンカテマー２）の濃度は１％ｗ／ｗであった。この実験では、ヘキサフルムロン（１％ｗ／ｗ）を陽性対照として、溶媒を陰性対照として試験した。
【図３】室温で８ヶ月間のＬＢ培地（ＬＢ）及び無Ｒｎアーゼ水（ＭＱ）中のＢｇ０３２ ｄｓＲＮＡの安定性。
【図４】１週間第１齢若虫にｄｓＲＮＡ（Ｂｇ００１）を適用したときにゴキブリの死滅率が受ける効果。この実験では、種々雑多のｄｓＲＮＡ及び溶媒を陰性対照として試験した。ペレット中のｄｓＲＮＡの濃度は１％ｗ／ｗであった。
【図５Ａ】本発明の配列
【図５Ｂ】本発明の配列
【図５Ｃ】本発明の配列
【図５Ｄ】本発明の配列
【図５Ｅ】本発明の配列
【図５Ｆ】本発明の配列
【図５Ｇ】本発明の配列
【図５Ｈ】本発明の配列
【図５Ｉ】本発明の配列
【図５Ｊ】本発明の配列
【図５Ｋ】本発明の配列
【発明を実施するための形態】
【００２２】
標的
本発明者らは、昆虫又はクモ害虫の個体数を効果的に制御することができるＲＮＡｉのための新規な標的を初めて同定した。
【００２３】
疑いを避けるために、標的は、本明細書において、昆虫及び／又はクモがその正常な生理学的機能及び生化学的機能を維持するためにタンパク質産物が必要とされる遺伝子と定義される。標的遺伝子の発現阻害は、その昆虫及び／又はクモが摂食、成長、又は生存する能力を制限する。本発明の実施に採用することができる昆虫及び／又はクモの遺伝子の例には、必須遺伝子、発育、代謝、又は神経伝達などの過程に関与する遺伝子、並びに産物が現存する殺虫剤及び／又はクモの標的である遺伝子がある。本発明の好ましい実施形態では、標的は、転写、翻訳、細胞骨格、細胞周期、代謝（同化又は異化）、エンドサイトーシス、細胞内及び細胞間輸送、カルシウム結合、核内移行及び核外移行、ヌクレオチド結合、シグナルペプチダーゼ−タンパク質結合、プロテアソーム、小胞輸送、神経伝達、水分平衡、イオン平衡、スプライシング、有糸分裂、減数分裂、染色体の組織化、安定性又は完全性、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、翻訳後タンパク質修飾、電子伝達、アポトーシス、膜の完全性、並びに細胞接着などの細胞機能に必要な経路の部分である。
【００２４】
本発明で同定された新規な標的遺伝子は、以下のものを含む。
Ａ）構造タンパク質、例えばトロポミオシン１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２６０８９７）（配列番号４１及び４２）、アクチン５Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ００４２４８）（配列番号５７及び５８）、並びに同一又は他の昆虫及び／又はクモ種において同一の生物学的機能を有する相同又は非相同タンパク質、
Ｂ）代謝酵素、例えばＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７３６７９）（配列番号４９及び５０）、並びに同一又は他の昆虫及び／又はクモ種において同一の生物学的機能を有する相同又は非相同タンパク質、
Ｃ）Ｖ−ＡＴＰアーゼなどのイオン／ｐＨのホメオスタシスに関与する酵素、並びに同一又は他の昆虫及び／又はクモ種において同一の生物学的機能を有する相同又は非相同タンパク質、
Ｄ）例えば
リボソームタンパク質Ｓ４ホモログ（配列番号１及び２）
リボソームタンパク質Ｓ９ホモログ（配列番号１１及び１２）
リボソームタンパク質Ｌ９ホモログ（配列番号２１及び２２）
リボソームタンパク質Ｌ１９ホモログ（配列番号３１及び３２）
などの転写／翻訳機構に関与する酵素。
【００２５】
したがって、第１の態様によると、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供され、このオーソロガスなヌクレオチド配列は、配列番号１、１１、２１、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましいオーソロガスな配列は、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ（ｒｅｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｍｉｔｅ）、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／若しくはクモ由来の配列を含むか、又は本発明の方法により使用された場合はその配列を包含する。さらに好ましいオーソロガスな配列は、非限定的にチャバネゴキブリ種（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｓｐｐ．）（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（Ｂｌａｔｔａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（Ｓｕｐｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）；非限定的にトフシアリ種（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）（例えばオオアリ種（カーペンターアント（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ａｎｔ）））、ケアリ種（ｌａｓｉｕｓ ｓｐｐ．）（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（Ｍｙｒｍｉｃａ ｓｐｐ．）（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（Ｆｏｒｍｉｃａ ｓｐｐ）（ウッドアント（ｗｏｏｄ ａｎｔ））、シリアゲアリ種（Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．）（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント（Ａｃｒｏｂａｔ Ａｎｔ）））、イリドミルメクス種（Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｓｐｐ．）（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（Ｐｈｅｉｄｏｌｅ ｓｐｐ．）（オオズアリ）、及びダシムチラ種（Ｄａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ）；非限定的にアミテルメス種（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばアミテルメス−フロリデンシス（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ）（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト（Ｆｌｏｒｉｄａ ｄａｒｋ−ｗｉｎｇｅｄ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ）））、レティキュリテルメス種（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）（イースタンサブテラネアンテルマイト（ｅａｓｔｅｒｎ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ））、レティキュリテルメス−ヘスペルス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）（ウエスタンサブテラネアンテルマイト（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））、イエシロアリ種（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばネオテルメス−コネキサス（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｃｏｎｎｅｘｕｓ）（フォレストツリーテルマイト（Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））などのシロアリ（シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）及び／又はシロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ））に由来する。
【００２６】
別の態様によると、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を含むか、その配列から本質的になるか、又はその配列からなる核酸分子が提供される。
【００２７】
配列番号４、６、７、１６、２７、２６、２７、３６、及び３７の全ては、選択的及び特異的に本発明の新規な配列を同定するために利用された特異的プライマーのヌクレオチド配列を表す。
【００２８】
この新規に同定した遺伝子の全ては、チャバネゴキブリの転写／翻訳機構の構成要素を表す。ＲＮＡｉによりこれらの遺伝子の発現を阻害することによって、又は新規に同定した標的遺伝子の発現を阻害することによって、重要な害虫を防除することができる。
【００２９】
これらの新規な標的遺伝子のオーソログもまた、他の昆虫及び／又はクモ種の防除においてダウンレギュレーションのさらなる標的となることが当業者により予測されており、そう了解されよう。したがって、本発明の新規な核酸分子のオーソログもまた考慮される。
【００３０】
タンパク質配列又はヌクレオチド配列は、「有意な」レベルの配列類似性又は同一性を示すならば、相同である可能性が高い。真に相同な配列は、共通の祖先遺伝子からの分岐により関係している。配列ホモログは２つの種類に属しうる。すなわち、（ｉ）ホモログが異なる種に存在する場合、そのホモログはオーソログとして知られている。例えばマウス及びヒトのα−グロビン遺伝子はオーソログである。（ｉｉ）パラログは単一種内の相同遺伝子である。例えばマウスのα−グロビン遺伝子及びβ−グロビン遺伝子はパラログである。本明細書では「オーソログ」は上に言及した両方の種類のホモログを意味する。
【００３１】
一実施形態では、オーソログは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、４９、又は５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約４０％、５０％、又は６０％のヌクレオチド配列同一性を有するものである。好ましくはオーソログは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、４９、又は５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するものである。
【００３２】
別の実施形態によると、本発明は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに表すヌクレオチド配列を含むか、その配列から本質的になるか、又はその配列からなる遺伝子の、昆虫又はクモオーソログである標的遺伝子を包含する。例としてオーソログは、配列番号７１から２００のいずれかに表すヌクレオチド配列、又はその少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６個、若しくは２７個のヌクレオチドの断片を含むことがある。昆虫若しくはクモのオーソロガスな遺伝子、又は本発明の配列の１つのヌクレオチド１７個の断片を少なくとも含む配列の非限定的なリストを表４及び５に示す。表４及び５に表示する配列は、本発明の一部を形成すると意図される。したがってオーソログは、表４及び５に示す配列のいずれかを含むか、その配列から本質的になるか、又はその配列からなる。
【００３３】
別の態様によると、本発明は、それ故に昆虫及び／又はクモの侵襲又は感染を防除するための本明細書に記載した方法のいずれかを包含し、その方法は、昆虫及び／又はクモを二本鎖ＲＮＡと接触させるステップを含み、その二本鎖ＲＮＡはアニーリングされた相補鎖を含み、その二本鎖ＲＮＡの１つは、配列番号７１から２００に表す配列のいずれかの、少なくとも１７、１８、１９、２０、又は２１個のヌクレオチドの断片を含む標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、それによってその二本鎖ＲＮＡは昆虫及び／又はクモにより取り込まれ、それによって成長を制御するか、死滅させるか、又はその昆虫及び／若しくはクモによる侵襲若しくは感染を防止する。前記昆虫及び／又はクモは、本明細書に記載した任意の標的生物／種を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることがある。
【００３４】
本発明に包含される関連核酸分子は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子とのハイブリダイゼーションによって定義することもまたできる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下であり、なおさらに好ましくは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下である。中程度及び高ストリンジェンシーの当該条件は、当業者によく知られているであろう。例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含む溶液中で４２℃で、又は５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む溶液中で６５℃でインキュベーションするハイブリダイゼーション反応、並びに０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で６５℃での洗浄は、適切な高ストリンジェンシー条件となる。
【００３５】
本発明は、これらの新規な標的遺伝子及びそのオーソログのタンパク質産物もまた提供する。
【００３６】
したがって、第２の態様によると、配列番号２、１２、２２、若しくは３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むタンパク質、又はさらなる昆虫及び／若しくはクモ種由来の保存されたアミノ酸配列を有するオーソロガスなタンパク質を提供する。
【００３７】
上に言及したように、新規な標的遺伝子のオーソログは、他の昆虫及び／又はクモ種の防除におけるダウンレギュレーションのためのさらなる標的となろうこともまた予測されている。したがって、本発明の新規なタンパク質分子のオーソログもまた考慮されている。
【００３８】
一実施形態では、オーソログは、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を有するものである。好ましくは、オーソログは、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているヌクレオチドもまた提供する。本発明のこの態様に包含される核酸分子には、同一のタンパク質分子をコードする点で機能的に同等な核酸分子もまた含まれる。したがって、遺伝暗号の縮重により可能な全ての核酸分子が、本発明のこの態様の範囲内に入ると意図される。
【００４０】
標的生物／標的種
本発明に使用する「標的種」は、害虫となる任意の昆虫又はクモであってもよい。この用語は、任意の発育期にある昆虫又はクモにもまた関する。昆虫は、生きていない外骨格を有することから、昆虫は一定速度で成長することはできず、それどころか定期的に自分の外骨格を脱ぎ捨てることにより段階的に成長する。この過程は脱皮（ｍｏｕｌｔｉｎｇ又はｅｃｄｙｓｉｓ）と呼ばれる。脱皮と脱皮の間の段階は「齢」と呼ばれ、この段階は本発明により標的とすることができる。また、昆虫の卵や生きた子もまた本発明により標的とすることができる。有翅昆虫亜綱における変態を含む、発育周期の全ての段階は、本発明によるＲＮＡｉによって標的とすることができる。したがって、幼虫、蛹、若虫などの発育段階などの個別の段階を全て標的とすることができる。
【００４１】
標的種は、動物界、さらに詳しくは節足動物門、そして昆虫綱（Ｃｌａｓｓ Ｉｎｓｅｃｔａ）又はクモ綱（Ｃｌａｓｓ Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属する任意の生物又は種を意味する任意の昆虫又はクモであってもよい。本発明の方法は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングに感受性であり、それらの周辺環境から二本鎖ＲＮＡをインターナリゼーションすることができる全ての昆虫及びクモに適用することができる。
【００４２】
本発明の一実施形態では、昆虫又はクモは、以下の目に属することがある：ダニ目（Ａｃａｒｉ）、クモ網、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ゴキブリ目（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）、コウチュウ目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、トビムシ目（Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）、ハサミムシ目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、カマキリ目（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、ハサミコムシ目（Ｄｉｐｌｕｒａ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、シロアリモドキ目（Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ）、カゲロウ目（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ）、ガロアムシ目（Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｏｄｅａ）、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、カメムシ亜目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）、ヨコバイ亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、シリアゲムシ目（Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ）、アメミカゲロウ目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、トンボ目（Ｏｄｏｎａｔａ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、ナナフシ目（Ｐｈａｓｍｉｄａ）、シラミ目（Ｐｈｉｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、カワゲラ目（Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）、カマアシムシ目（Ｐｒｏｔｕｒａ）、チャタテムシ目（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｓｉｐｈｕｎｃｕｌａｔａ）、シミ目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）、腹吻亜目（Ｓｔｅｒｎｏｒｒｈｙｎｃｈａ）、ネジレバネ目（Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、トビケラ目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）、ジュズヒゲムシ目（Ｚｏｒａｐｔｅｒａ）、及びシミ亜目（Ｚｙｇｅｎｔｏｍａ）。
【００４３】
好ましいが、非限定的な本発明の実施形態では、昆虫又はクモは、以下からなる群から選択される。
（１） ダニ目：マダニ亜目（Ｉｘｏｄｉｄａ）（マダニ）を含むダニ
（２） クモ綱：クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）（クモ）及びメクラグモ目（Ｏｐｉｌｉｏｎｅｓ）（メクラグモ）、例には、Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ（クロゴケグモ）及びＬｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓｅ（ドクイトグモ）がある。
（３） シラミ目：Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ（ヒトジラミ）などのシラミ
（４） ゴキブリ目：チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、及びチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のものを含むゴキブリ。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
（５） コウチュウ目：コウチュウ、例には、ヒラタキクイムシの科（ナガシンクイムシ上科（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ））；デンドロクトヌス種（Ｄｅｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ｓｐｐ．）（ブラックツルペンチンビートル（Ｂｌａｃｋ Ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅ Ｂｅｅｔｌｅ）、サザンパインビートル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐｉｎｅ Ｂｅｅｔｌｅ）、ＩＰＳエングレーバービートル（ＩＰＳ Ｅｎｇｒａｖｅｒ Ｂｅｅｔｌｅ））；マルカツオブシムシ（アントレヌス種（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ）、アタゲヌス種（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ）；オールドハウスボーラー（Ｏｌｄ Ｈｏｕｓｅ Ｂｏｒｅｒ）（カミキリムシ科：ヒロトルペス−バジュルス（Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ））；シバンムシ（Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ）；トリボリウム種（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｓｐｐ）（コクヌストモドキ）；Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｇｒａｎａｒｉｕｍ（ヒメアカカツオブシムシ）；Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓａｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ（ノコギリヒラタムシ）など（シミ）がある。
（６） ハサミムシ目：ハサミムシ科
（７） ハエ目：カ（カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ））及びハエ（ハエ亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ））、例は、ハマダラカ種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．）などのハマダラカ亜科（Ａｎｏｐｈｅｌｉｎａｅ）及びアエデス−フルブス（Ａｅｄｅｓ ｆｕｌｖｕｓ）などのカ亜科（Ｃｕｌｉｃｉｎａｅ）；タバヌス−プンクティファ（Ｔａｂａｎｕｓ ｐｕｎｃｔｉｆｅｒ）（ホースフライ（Ｈｏｒｓｅ Ｆｌｙ））、Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ（ツェツェバエ）などのアブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）、ドレインフライ（ｄｒａｉｎ ｆｌｉｅｓ）（チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ））、及びＭｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）などの弁翅亜節（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）、ニクバエ（ニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ））など。
（８） カメムシ亜目：Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ（トコジラミ）などのカメムシ
（９） ハチ目：アリ（アリ科（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ））、ミツバチ（ミツバチ上科（Ａｐｏｉｄｅａ））を含むハチ（ハチ亜目（Ａｐｏｃｒｉｔａ）：Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ）、Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ）、オオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｓｐｐ）（オオアリ）、（ｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ）、（ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ）（トビイロシワアリ）、Ｍｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ）、ヤマアリ種（ウッドアント）、クレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント）、Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（アリガタバチ）など
（１０） シロアリ目：シロアリ、例には：アミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、イースタンサブテラネアンテルマイト（レティキュリテルメス−フラビペス）、Ｒ．ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、ネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））、及びシロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）がある。
（１１） チョウ目：ガ、例には：Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）などのヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａｅ）及びマルハキバガ科（Ｏｅｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、並びにＰｙｒａｌｉｓ ｆａｒｉｎａｌｉｓ（カシノシマメイガ）などのメイガ科（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ）がある。
（１２） チャタテムシ目：ブックライス（チャタテムシ）
（１３） ノミ目：ヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）などのノミ
（１４） 腹吻亜目：アブラムシ（アブラムシ科（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ））
（１５） シミ亜目：シミ、例は：マダラシミ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）及びセイヨウシミ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）である。
【００４４】
好ましい標的昆虫又はクモには、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。さらに好ましい標的は、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、ネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）である。さらに好ましい標的はゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【００４５】
ＲＮＡ構築物
「相補的」とは、ＲＮＡ鎖が、特定の配列がＤＮＡ配列である場合はその配列のＲＮＡ同等物、又はそのＤＮＡ配列の相補体のＲＮＡ同等物に相当することを意味する。
【００４６】
本発明は、遺伝子発現のＲＮＡｉ介在性ダウンレギュレーションのための追加の標的に関する。本明細書において同定した全ての標的に関して、本発明のさらなる態様では二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物が提供され、その少なくとも１方の鎖は、
（ｉ）配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１；のいずれか１つに定義する標的核酸分子、或いは
（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。上記のように、オーソログは、配列番号１、４、６、７、１１、１６、１７、２１、２６、２７、３１、３６、３７、４１、４３、４４、４９、５１、５２及び５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％のヌクレオチド配列同一性を有することがある。好ましくは、オーソログは、配列番号１、４、６、７、１１、１６、１７、２１、２６、２７、３１、３６、３７、４１、４３、４４、４９、５１、５２及び５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するものである。
【００４７】
前述のように、本明細書においてチャバネゴキブリで同定した標的のオーソログは、屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫を含むその他の昆虫並びに／又はクモ種における有望な標的と見なされる。
【００４８】
さらに好ましい標的は、ゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリから得られる。最も好ましい標的は、新規な標的が同定されたチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【００４９】
効果的な遺伝子サイレンシングには約２１ｂｐの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の形成が理想的であると以前に報告された。しかし、出願人の出願では、ある種の有害生物に効率的に取り込まれるための最短長のｄｓＲＮＡは、好ましくは少なくとも約８０〜１００ｂｐであることが示された。自由生活性線虫Ｃ．エレガンス又は植物寄生線虫サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）などの無脊椎動物では、おそらくこれらの長鎖ｄｓＲＮＡの方が無脊椎動物による取り込みが効率的であることから、これらの長鎖断片の方が遺伝子サイレンシングに有効であるという見通しが立てられている。
【００５０】
２７塩基長の平滑末端ＲＮＡ、又は２９ｂｐのステム及びヌクレオチド２個の３’突出を有する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかからなる合成ＲＮＡ二本鎖は、従来型の２１塩基長ｓｉＲＮＡよりも強力にＲＮＡ干渉を誘導することもまた最近示唆された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、２００５年２月２日、１８１、及びＫｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、２００５年２月２日、２２２〜２２９、及びＳｉｏｌａｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、２００５年２月２日、２２７〜２３１参照、これらの参照はその全体が本明細書に組み込まれている）。したがって、上に同定した標的に基づき、２７塩基長の平滑末端ＲＮＡ、又は２９ｂｐのステム及びヌクレオチド２個の３’突出を有する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡのいずれかである分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
したがって一実施形態では、ＲＮＡ構築物は少なくとも約１７ｂｐ、好ましくは少なくとも約２１ｂｐ、さらに好ましくは約２０〜１５００ｂｐ、なおさらに好ましくは約８０〜１０００ｂｐ、最も好ましくは約１７〜２７ｂｐ又は約８０〜２５０ｂｐの長さを有する二本鎖ＲＮＡ領域、例えば約１７ｂｐ、１８ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐ、２７ｂｐ、５０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、９００ｂｐ、１００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ又は１５００ｂｐの二本鎖ＲＮＡ領域を有する。
【００５２】
二本鎖ＲＮＡの長さの上限は、ｉ）ｄｓＲＮＡが昆虫及び／又はクモにより取り込まれる必要性、並びにｉｉ）ｄｓＲＮＡが関連する細胞内でプロセシングされて、ＲＮＡｉを指令する断片になる必要性に依存することがある。選択された長さは、ＲＮＡの合成法及び細胞へのＲＮＡ送達様式にもまた影響されうる。好ましくは、本発明の方法に使用される二本鎖ＲＮＡは、長さ１００００ｂｐ未満、さらに好ましくは１０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下、さらに好ましくは３００ｂｐ以下、さらに好ましくは１００ｂｐ以下であろう。
【００５３】
害虫防除に関する有効性は、単一のＲＮＡ構築物を用いて複数の標的遺伝子を標的とすることにより増大することがある。したがって、二本鎖ＲＮＡが介在する複数のＲＮＡ干渉が、可能なことには全て同時に、又は可能なことにはカスケード的に起こると思われることから、害虫が生存し抵抗性を獲得する見込みは低い。
【００５４】
本発明の方法は、複数の標的遺伝子のダウンレギュレーション又は阻害を実現するために、又は単一の標的遺伝子のより強力な阻害を実現するために、同一の昆虫及び／又はクモに２つ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物を同時又は連続的に与えることを包含する。
【００５５】
さらなる実施形態によると、本発明によるＲＮＡ構築物は、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含み、その鎖の少なくとも１つは、本明細書に記載した任意のヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記ヌクレオチド配列の相補性は、（ｉ）配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれかに示す核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列、又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオルトロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、ここで、配列同一率は同一の長さにわたり計算される。
【００５６】
「同一の長さにわたり」により、％同一率を配列間で計算する場合に、両配列での対応する一続きのヌクレオチドにわたりこれを行うことを意味する。
【００５７】
或いは、複数の標的配列に対して作用する１つの二本鎖ＲＮＡを与えることにより複数の標的遺伝子がダウンレギュレーションされる。或いは、標的遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ断片の１つを超えるコピーの存在により、単一の標的をより効率的に阻害することができる。したがって、本発明の一実施形態では、二本鎖ＲＮＡ構築物は、複数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、昆虫及び／又はクモ標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。本発明によると、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ領域は、同一又は異なる標的遺伝子に相補的であってもよく、及び／又はｄｓＲＮＡ領域は同一又は異なる昆虫及び／又はクモ種由来の標的遺伝子に相補的であってもよい。
【００５８】
したがって、本発明は、本発明の単離された二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物を提供し、それは、少なくとも２つの二本鎖ＲＮＡ領域を含み、そのそれぞれの少なくとも１方の鎖は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含むか、本質的にその配列からなるか、又はその配列からなり、ここで、そのオーソロガスなヌクレオチド配列は、配列番号１、１１、２１、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号４１、４３、４４、４９、５１、５２、及び５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を含む核酸分子の少なくとも関連する部分と少なくとも７０％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましくは前記二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか、好ましくは配列番号６５から７０のいずれかから独立して選択される１つ又は少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むか、本質的にその配列からなるか、又はその配列からなる。
【００５９】
したがって、本発明の一実施形態では、ＲＮＡ構築物は複数のｄｓＲＮＡ領域を含み、各ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、昆虫及び／又はクモ種由来の標的遺伝子のヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。本発明によると、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ領域は、同一又は異なる標的遺伝子に相補的であってもよく、ｄｓＲＮＡ領域は同一又は異なる昆虫種由来の標的に相補的であってもよい。
【００６０】
ｄｓＲＮＡ領域は、以下のように組み合わせることができる。
ａ）単一の法的遺伝子を標的とする複数のｄｓＲＮＡ領域を組み合わせる場合、それらの領域はＲＮＡ構築物中に本来の順序（すなわち標的遺伝子に断片が出現する順序）で組み合わせることができる、
ｂ）或いは、断片の本来の順序を無視することにより、断片を混ぜ合わせて、ランダム又は故意に任意の順序に組み合わせてＲＮＡ構築物にすることができる。
ｃ）或いは、１つの単一断片をＲＮＡ構築物中に数回、例えば１から１０回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回繰り返すことができ、また
ｄ）（単一又は異なる標的遺伝子を標的とする）ｄｓＲＮＡ領域をセンス又はアンチセンス方向に組み合わせることができる。
【００６１】
加えて、組み合わせる標的遺伝子は、以下の種類の１つ又は複数の遺伝子（該当するその全ての可能な組合せを含む）から選択してもよい。
ｅ）「必須」遺伝子又は「病原性遺伝子」は、１つ又は複数の標的昆虫及び／又はクモに重要で、サイレンシングした場合に致死的又は重大な（例えば、運動、摂食、麻痺、飲水、生殖能力、生殖、成長の）表現型を招く遺伝子を包含する。強い致死的標的遺伝子の選択は強力なＲＮＡｉ効果を招く。本発明のＲＮＡ構築物において、同一又は異なる（非常に効果的な）致死的遺伝子を標的とする複数のｄｓＲＮＡ領域を組み合わせて、昆虫及び／又はクモの防除に果たすＲＮＡｉの効果の効力、有効性、又は速度をさらに増大させることができる。
ｆ）「弱小遺伝子」は、本明細書に記載した細胞経路の１つに特に興味深い機能を有するが、独立してサイレンシングすると表現型に弱小作用を招く標的遺伝子を包含する。本発明のＲＮＡ構築物では、単一又は異なる弱小遺伝子を標的とする複数のｄｓＲＮＡ領域を組み合わせて、より強いＲＮＡｉ効果を得ることができる。
ｇ）「昆虫及び／又はクモ特異的」遺伝子は、生物情報学の相同性検索、例えばＢＬＡＳＴ検索により決定することのできる非有害生物における実質的な相同的対応物を有さない遺伝子及び遺伝子の部分を包含する。昆虫及び／若しくはクモ特異的標的遺伝子又はその部分の選択は、種特異的ＲＮＡｉ効果を招き、非標的生物に効果を有さないか、又は実質的な（有害）効果を有さない。
ｈ）「保存された遺伝子」は、標的生物及び非標的生物の間で（アミノ酸レベルで）保存されている遺伝子を包含する。非標的種に及ぼす可能性のある効果を減らすために、そのような効果的であるが保存された遺伝子を分析し、これらの保存された遺伝子の可変領域由来の標的配列を選択して、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ領域による標的とする。ここで、保存性はヌクレオチド配列のレベルで評価される。このように、当該可変領域は、保存された標的遺伝子のうち、ヌクレオチド配列レベルで最小に保存された部分を包含する。
ｉ）「保存された経路の」遺伝子は、同一の生物学的経路若しくは細胞過程に関与する遺伝子を包含するか、又は異なる昆虫及び／若しくはクモ種において同一の機能を有して、特異的及び強力なＲＮＡｉ効果と効率的な害虫防除とを招く遺伝子を包含する。
ｊ）或いは、本発明によるＲＮＡ構築物は、異なる生物学的経路由来の複数の遺伝子を標的とし、広範囲の細胞性ＲＮＡｉ効果とより効率的な昆虫及び／又はクモの防除とを招く。
【００６２】
好ましくは、全ての二本鎖ＲＮＡ領域は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的な、少なくとも１方の鎖を含む。しかし、二本鎖ＲＮＡ領域の１つが、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的な、少なくとも１方の鎖を含む場合は、残りの二本鎖ＲＮＡ領域は、昆虫及び／又はクモ種由来の（公知の標的遺伝子を含む）任意の標的遺伝子の部分に相補的な少なくとも１方の鎖を含むことがある。
【００６３】
本発明は、本明細書に記載した任意のＲＮＡ構築物もまた提供し、その構築物は、少なくとも１つの追加の機能的配列と、場合によってはリンカーとを含む。一実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ領域は１つ又は複数のリンカーで連結している。別の実施形態では、そのリンカーはＲＮＡ構築物の側に存在し、ｄｓＲＮＡ領域を対象の別の領域と分離している。ｄｓＲＮＡ構築物用の種々のリンカーの種類は、本発明により提供される。
【００６４】
「条件的に自己開裂するリンカー」は、ある条件下でプロセシングされることができるＲＮＡ配列である。条件的に自己開裂する適切なリンカーの一例は、低ｐＨ条件下で自己開裂するＲＮＡ配列である。当該ＲＮＡ配列の適切な例は、Ｊａｙａｓｅｎａ及びＧｏｌｄ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７年９月３０日；９４（２０）：１０６１２〜７）により記載されており、この文書は参照により本明細書に組み込まれている。
【００６５】
条件的に自己開裂する適切なリンカーの別の例は、高ｐＨ条件下で自己開裂するＲＮＡ配列である。当該ＲＮＡ配列の適切な例は、Ｂｏｒｄａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３年５月１５日；３１（１０）：２５９５〜６００）により記載されており、この文書は参照により本明細書に組み込まれている。この配列は、ハンマーヘッド型リボザイムＨＨ１６の触媒中心に由来する。
【００６６】
本発明の一態様では、リンカーは有害生物中で短鎖ｄｓＲＮＡ領域の結合を切断するために使用してもよい。好都合にはこの状態で、リンカー配列は特定の状況での長鎖ｄｓＲＮＡ領域から短鎖ｄｓＲＮＡ領域への分割を促進し、これらの状況で別々のｄｓＲＮＡ領域の放出を招き、これらの短鎖ｄｓＲＮＡ領域による効率的な遺伝子サイレンシングに至ることができる。
【００６７】
本発明の別の態様では、リンカーは、ＲＮＡ構築対中の部位に存在し、ｄｓＲＮＡ領域を対象の別の配列と分離し、その別の配列はある追加の機能をＲＮＡ構築物に用意することが好ましい。ＲＮＡ構築物に組み込むことのできる他の（対象の）機能的配列の非限定的な例は、例えば（ｉ）ｄｓＲＮＡ構築物の大規模産生を容易にする追加の配列、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡの安定性を増加／減少させる追加の配列、（ｉｉｉ）組成物中のタンパク質又は他の分子に結合して害虫種による取り込みを容易にする追加の配列、（ｉｖ）アプタマーであり、害虫種の腸内の受容体又は分子に結合して、その害虫種による取り込み、エンドサイトーシス、及び／又はトランスサイトーシスを容易にする追加の配列、（ｖ）ｄｓＲＮＡ領域のプロセシングを触媒する追加の配列である。
【００６８】
特定の実施形態によると、例えば昆虫及び／又はクモなどの害虫種は腸系を有し、リンカーはその昆虫及び／又はクモの腸内で自己開裂する。腸内ｐＨは強酸性から強塩基性まで多様である。
【００６９】
或いは、リンカーはエンドソーム内で自己開裂する。本発明の構築物がエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスを介して有害生物に取り込まれ、その結果、害虫種のエンドソーム内で区画化される場合にこれは好都合なことがある。エンドソームは低ｐＨ環境を有し、リンカーの開裂に至ることもある。
【００７０】
疎水性条件下で自己開裂する上に言及したリンカーは、細胞壁を通過して１つの細胞から別の細胞に移動させるために使用するときの、例えば昆虫及び／又はクモの有害生物の細胞壁を貫通させるときの本発明のｄｓＲＮＡ構築物に特に有用である。
【００７１】
イントロンもまたリンカーとして使用することができる。本明細書に使用する「イントロン」は、メッセンジャーＲＮＡの任意の非コードＲＮＡ配列であってもよい。本発明の構築物に特に適したイントロン配列は、（１）Ｕが豊富で（３５〜４５％）、（２）塩基対がランダムに選択されうるか、又は公知のイントロン配列に基づきうる（約５０から約５００ｂｐまで多様な）平均長１００ｂｐを有し、（３）５’末端が−ＡＧ：ＧＴ−若しくは−ＣＧ：ＧＴ−で開始し、及び／又は（４）３’末端に−ＡＧ：ＧＣ−若しくは−ＡＧ：ＡＡを有する。
【００７２】
約１塩基対から約１００００塩基対までの範囲の非相補的ＲＮＡ配列もまたリンカーとして使用することができる。
【００７３】
上記のように、本発明のｄｓＲＮＡ領域は、昆虫及び／又はクモ害虫を効果的に防除するためにＲＮＡｉが起こることができる程度の相補性であるという条件下で、標的遺伝子の部分のみに対応してもよい。使用する構築物を含むｄｓＲＮＡ領域が標的遺伝子をダウンレギュレーションすることができる限り、適切な標的遺伝子の全長配列が公知であることは本発明に必須ではない。
【００７４】
例えば、昆虫及び／又はクモ由来の（ＥＳＴなどの）部分遺伝子配列が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００に記載した配列の１つのオーソログである限り、前記部分配列に基づくｄｓＲＮＡ断片を使用することが可能である。配列相同性又は相補性の程度は、使用するｄｓＲＮＡ断片の長さにわたり決定される。
【００７５】
さらに、本発明において結果として生じるｄｓＲＮＡ断片が標的遺伝子を依然としてダウンレギュレーションすることができる限り、（例えば欠失、挿入、又は置換により）１つ又は複数のヌクレオチド位置が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００に記載した配列を含む核酸分子と異なるｄｓＲＮＡ断片を使用することもまた可能である。
【００７６】
好ましくは、ＲＮＡ構築物中のｄｓＲＮＡ断片は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列を含む標的核酸分子のいずれか１つのヌクレオチド配列の関連する部分と、少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも約８５％又は８７．５％の配列同一性、もっとさらに好ましくは約９０％の配列同一性、もっとさらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む相補性又は相同性レベルを有する。
【００７７】
配列同一性を決定する方法は、当技術分野において日常的であり、それには、Ｂｌａｓｔソフトウェア及びＧＡＰ分析（ＧＣＧプログラム）の使用がある。ｄｓＲＮＡの少なくとも１方の鎖と標的遺伝子との高レベルの配列同一性（相補性）は、効果的なＲＮＡｉ、故に害虫防除を仲介するために必要である。
【００７８】
しかし、本発明のｄｓＲＮＡ領域が哺乳動物オーソログの配列に比べて害虫標的の配列に選択的であることも同様に好都合である。食物が存在する台所などの環境で害虫を防除しなければならず、その環境の中でヒトや他の哺乳動物が、その害虫を防除するために設計された組成物に曝露されるおそれがある場合に、このことは本発明に特に関連性がある。害虫種に有毒であるのと等しく哺乳動物にも有毒なおそれのある化学薬剤よりも、選択的な生物学的薬剤の方が好ましい。
【００７９】
さらに、本発明のＲＮＡ構築物などの生物学的薬剤については、分子が経時的に生分解され、故に（公知の殺虫剤などの）化学薬剤よりもヒトの利用者に環境上及び健康上のリスクを与えることが少ないものであることは好都合である。
【００８０】
したがって、好ましい実施形態によると、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示す核酸分子のヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ構築物中の二本鎖ＲＮＡの少なくとも１方の鎖は、哺乳動物種由来の対応する（オーソロガスな）ヌクレオチド配列と約５％未満、約１０％未満、約１２．５％未満、約１５％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満の配列同一性を有する。一実施形態では、２１個の連続するヌクレオチドにわたり哺乳動物の配列との配列同一性はない。別の実施形態では、２４個の連続するヌクレオチドにわたり哺乳動物種由来の対応するヌクレオチド配列と約１０％未満又は約１２．５％未満の配列同一性がある。好ましくは、哺乳動物種はヒトである。
【００８１】
一実施形態では、（配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示す核酸分子のヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ構築物中の二本鎖ＲＮＡの）少なくとも１方の鎖は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は１３００個のヌクレオチドを含む。
【００８２】
少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも約１７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は約１３００個のヌクレオチドを含む少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物もまた提供される。
【００８３】
ＤＮＡ構築物及び発現構築物並びに宿主細胞
さらなる態様では、本発明は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００に表す、本発明の新規な標的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物もまた提供する。
【００８４】
本発明は、さらに本発明のＲＮＡ構築物をコードしている領域を含むＤＮＡ構築物に関する。
【００８５】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物のいずれかを含む発現構築物もまた提供する。
【００８６】
発現構築物は、適切な条件下で、上に言及したｄｓＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を（転写により）提供することができる構築物である。
【００８７】
ｄｓＲＮＡを発現するための遺伝子構築物は当技術分野において周知であり、例えば、国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第００／０１８４６号パンフレット、及び国際公開第０１／８８１２１号パンフレット（全てＤｅｖｇｅｎ）；国際公開第００／４４９１４号パンフレット及び国際公開第０１／７０９４９号パンフレット、並びにすでに上に言及した従来技術に記載された構築物が参照される。そこに言及されたように、当該構築物はＤＮＡ又はＲＮＡであってよく（好ましくはＤＮＡであり）、（細菌の形質転換及び細菌での発現に適した発現ベクターなどの）適切な発現ベクター又は他の発現系の形態であってもよい。例えば、その構築物は、細菌での産生に適した、又は昆虫及び／若しくはクモの形質転換に適した細菌系又はウイルス系に（例えば形質転換により）存在してもよく、その遺伝子構築物を含むこれら及び他の宿主細胞は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００８８】
本発明による発現構築物は、ｄｓＲＮＡ断片自体をコードしている配列以外に、通常は適切な調節エレメント（プロモーター、ターミネーター、及びエンハンサーなど）及び本質的に公知の当該遺伝子構築物の他のエレメントを含むものであり、例えばハイブリダイゼーションして所望のｄｓＲＮＡ領域を形成する２つの別々の相補的ＲＮＡ鎖としてｄｓＲＮＡ領域を発現してもよく、また自己ハイブリダイゼーションして、所望のｄｓＲＮＡ領域を含む「ステム−ループ」又は「ヘアピン」構造を形成する２つの相補鎖を含む単一のＲＮＡの形態でｄｓＲＮＡ領域を発現してもよい。全ての当該構築物を本発明に適切に使用することができ、本発明は、使用する構築物が昆虫及び／又はクモ害虫での効果的なＲＮＡｉを仲介することができるｄｓＲＮＡの発現に適する限り、前記構築物の種類に関して特に限定されない。
【００８９】
構築物自体もまた本質的に公知な方法で構築してもよく、これについてもう一度上記の従来技術の参考文献並びにＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７）が参照される。
【００９０】
ｄｓＲＮＡ領域は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター（例えば特異的化合物、細菌などに加える損傷などによって誘導されるプロモーター）の制御下の細菌宿主で好ましくは発現されてもよい。構成的又は誘導性プロモーターは、（例えば、細菌の生活環の特異的部分に）非特異的又は特異的であってもよい。
【００９１】
細菌宿主細胞は、生物学的害虫防除剤として利用する前に不活性化する必要がありうる。これは、加熱又は例えばフェノール若しくはホルムアルデヒドを用いた処理などにより、当技術分野に公知の任意の技法により行うことができる。或いは、昆虫及び／又はクモ害虫に本発明のｄｓＲＮＡ領域を送達するために、適切に変更されたバキュロウイルスなどの不活性化ウイルスを利用してもよい。
【００９２】
発現構築物は、細菌細胞での使用に好ましくは適したプロモーター又は他の制御エレメント、ターミネーター、翻訳エンハンサー又は転写エンハンサー、挿入因子、シグナル配列、選択マーカーなどの、ヌクレオチド配列又は遺伝子構築物用の本質的に公知の全ての他のエレメントをさらに含んでもよい。構築物のこれらのさらなるエレメントをコードする配列もまた、適切な生物学的起源から単離してもよいし、合成的に用意してもよい。
【００９３】
適切なプロモーターのいくつかの特定であるが非限定的な例には、ＲＮＡ ＰｏｌＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ由来のプロモーター、並びに上に引用した従来技術、例えば国際公開第００／０１８４６号パンフレットにおいて言及されたプロモーター及び他の調節エレメントもまたあるが、それに限定されるわけではない。本発明は、さらに一本鎖ＲＮＡの発現を指令することができる細菌プロモーターを提供し、そのＲＮＡは、発現するとループを含むヘアピン型二次構造を形成することができ、二本鎖ＲＮＡ領域が利用される。
【００９４】
細菌宿主又はウイルス宿主に構築物を導入するための形質転換技法の、特異的であるが非限定的な例には、形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクションなどがある。
【００９５】
したがって本発明は、（ａ）本明細書に記載したＲＮＡ構築物をコードしているヌクレオチドと、（ｂ）（ａ）のヌクレオチドの発現を駆動することができる１つ又は複数の制御配列と、場合によっては（ｃ）転写終結配列とを含む発現構築物を提供する。
【００９６】
発現構築物は、市販されていることがあるプラスミド又はベクターに挿入してもよい。本発明の一実施形態によると、発現構築物は、細菌への形質転換に適し、形質転換された細菌細胞における本発明によるＲＮＡ構築物の維持及び発現に適した細菌発現ベクターである。これによって、国際公開第０１／０１８４６号パンフレットに出願人により記載されたプラスミド及びベクターが参照され、その参照はその全体が本明細書に組み込まれている。その代わりとなるのは、国際公開第０１／３４８１５号パンフレットに記載されたウイルスなどの、昆虫種に感染することができるウイルス細胞を使用することであり、このパンフレットの参照は、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００９７】
本明細書に使用する用語「制御配列」は、広い状況の中でとらえるべきであり、それらの制御配列が結合され、及び／又は作動可能に連結される配列の発現を駆動及び／又は調節することができる調節ヌクレオチド配列を表す。本発明の一実施形態によると、制御配列は細菌又はウイルス中で作動可能であり、好ましくは、制御配列は細菌配列由来である。用語「制御配列」は、細胞、組織、又は器官での核酸分子の発現を活性化するか、又は高めることのできるプロモーター又は配列を包含する。
【００９８】
場合により、１つ又は複数の転写終結配列もまた発現構築物に組み込んでもよい。用語「転写終結配列」は、一次転写物の３’プロセシング及びポリアデニル化並びに転写終結のシグナルを発する、転写ユニット末端での制御配列を包含する。転写エンハンサー又は翻訳エンハンサーなどの追加の調節エレメントを発現構築物に組み込んでもよい。
【００９９】
本発明の発現構築物は、特異的細胞型での維持及び／又は複製に必要な複製起点をさらに含んでもよい。
【０１００】
一例は、細胞中のエピソーム性遺伝子エレメント（例えばプラスミド又はコスミド分子）として細菌細胞中に維持するために発現構築物が必要な場合である。好ましい複製起点には、ｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１ ｏｒｉがあるが、それに限定されるわけではない。
【０１０１】
発現構築物は、場合によっては選択マーカー遺伝子を含んでもよい。本明細書に使用する用語「選択マーカー遺伝子」は、本発明の発現構築物をトランスフェクトされているか、又はそれを用いて形質転換された細胞においてその遺伝子が発現し、細胞の同定及び／又は選択を容易にする、細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含む。適切な選択マーカーの例には、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ホスフィノスリシン耐性遺伝子、及びクロラムフェニコール（ＣＡＴ）遺伝子がある。他の選択マーカー遺伝子、例えばｍａｎＡは、代謝の形質を与える。可視マーカー遺伝子もまた使用することができ、それには例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。
【０１０２】
したがって上に記載するように、本発明は、本発明のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞であるが、例えばウイルスであってもよい。昆虫及び／又はクモに特異的に感染するバキュロウイルスなどのウイルスを利用してもよい。このウイルスは哺乳動物には感染しないものであるため、望ましくないＲＮＡｉ作用は起こらないものであることから、このことは、哺乳動物、特にヒトに対する安全性を保証する。
【０１０３】
ヒト又は他の哺乳動物との接触が見込まれる（上記のように台所などの）環境で、害虫にＲＮＡｉを仲介するための送達剤として細菌細胞又はウイルスを使用する場合、その送達剤として使用する前にその細菌細胞又はウイルスを好ましくは不活性化すべきである。不活性化は、例えば熱処理、フェノール又はホルムアルデヒド処理などの任意の手段により実現することができる。
【０１０４】
本発明のＲＮＡ構築物を作製する方法もまた提供される。この方法は、本発明のＤＮＡ構築物を転写させて前記ＲＮＡ構築物を産生させる条件下で、
ａ．前記ＤＮＡ構築物若しくは本発明の発現構築物を無細胞成分と接触させるステップ、又は
ｂ．前記ＤＮＡ構築物若しくは本発明の発現構築物を細胞に適用するステップを含む。
【０１０５】
したがって、転写に必要な構成要素が用意されているｉｎ ｖｉｔｒｏ法が提供される。当業者であればこれらの構成要素をすぐに利用でき、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現キットが市販されている。
【０１０６】
或いは、宿主細胞中で発現を駆動してもよい。好ましくは、細胞は細菌細胞であるが、例えばウイルスであってもよい。
【０１０７】
さらに本発明のさらなる態様では、本発明の宿主細胞は本発明のｄｓＲＮＡ分子及びＲＮＡ構築物の産生のための供給源として使用してもよい。例えば、本発明のＲＮＡ構築物を有効量で産生させるために、（前記の）本発明の発現構築物を含む細菌宿主細胞を適切な条件（例えば３７℃又は４２℃）で培養することができる。細菌の大規模発酵工程及び回収工程は当技術分野において周知であり、商業的に利用されている。抗生物質耐性宿主株を利用する場合は、場合によりアンピシリン、カルベニシリン、又はクロラムフェニコールなどの適切な抗生物質を補充した例えばＬＢ培地などの任意の適切な培地の中で細菌培養を行うことができる。
【０１０８】
したがって、結果として得られた細菌培養物は、本発明のＲＮＡ構築物を大量に産生する。細菌自体は、本明細書に記載した適切な害虫防除剤組成物に製剤してもよいし、例えば標的昆虫又はクモによる摂食により取り込ませるために、本発明のＲＮＡ構築物の直接の（食物）供給源として使用してもよい。
【０１０９】
同様に一実施形態では、細菌を上記のように破壊するか、又は別の方法で不活性化することにより、ｄｓＲＮＡの供給源として使用することができる。例えば浸透圧ショックなどの任意の適切な手段を使用して、例えば細胞を破裂又は溶解させることができ、細菌の溶解物又は他の適切な細胞画分又は抽出物を本発明の組成物に利用することができる。
【０１１０】
一実施形態では、細菌抽出物又は溶解物を適切に精製して、実質的に純粋なＲＮＡ構築物を含有する抽出物を残すことができる。好ましくは、実質的に全ての細菌構成要素が最終的なｄｓＲＮＡ含有抽出物から除去され、続いての抽出物を実質的に本発明の組成物の任意の１つに製剤することができる。適切な精製ステップは当技術分野において周知であり、それには非限定的な例として適切な濾過ステップ、例えば電荷又は分子量に基づく分離が含まれていてもよい。対象のｄｓＲＮＡ分子を精製するために、適切なハイブリダイゼーション反応もまた採用してもよい。
【０１１１】
ＲＮＡ構築物は、選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法及び他のものを含む標準的な技法により実質的な純度に精製することができる（例えばＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記；及びＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。
【０１１２】
二本鎖ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ構築物及びＤＮＡ構築物は、典型的には天然塩基を組み込んでいるものである。しかし、変異体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、「ＲＮＡ」及び「ＤＮＡ」の範囲は、それぞれ天然ヌクレオチドと同様に塩基対を形成しＲＮＡｉを仲介することができるか、又は転写されてＲＮＡを産生することができる周知の糖修飾塩基を含む合成アナログを包含する。例えば、非天然塩基、化学修飾塩基、若しくは誘導体化塩基を組み込んだヌクレオチドアナログ、又は修飾された主鎖を有するヌクレオチドアナログが想定される。これは、本発明の構築物に組み込むことができるリンカーにも等しく当てはまる。特に、用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、非天然塩基を含有するｄｓＲＮＡを包含すると解釈すべきである。非天然若しくは塩基を含むか、又は化学修飾された主鎖を有する二本鎖ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ構築物の安定性の増加又は減少に関して追加の利点を与えることがある。
【０１１３】
害虫防除剤組成物
なおさらなる態様では、本発明は、本発明のＲＮＡ構築物、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物、及び／又は本発明の発現構築物、及び／又は本発明の宿主細胞を、適切な担体、賦形剤、又は希釈剤と共に含む害虫防除剤組成物に関する。
【０１１４】
最も好ましい実施形態によると、その組成物は、昆虫及び／又はクモによる摂食に適した形態である。
【０１１５】
その組成物は、昆虫及び／又はクモに適用するために適した任意の物理的形態であってもよい。その組成物は、例えば固体形態（粉末、ペレット、又はベイト剤など）、液体形態（スプレーなど）、又はゲル形態であってもよい。
【０１１６】
その組成物は、その組成物を長期保存したときにｄｓＲＮＡを安定化するか、及び／又はｄｓＲＮＡの分解を防止するように作用するさらなる構成要素を含有してもよい。
【０１１７】
その組成物は、なおさらには腸管細胞又は腸細胞によるｄｓＲＮＡの取り込みを高めるか、又は促進する構成要素を含有してもよい。これらには、例えば一般的に細胞へのＲＮＡの取り込みを促進する化学薬剤、例えばリポフェクタミンなどがありうる。
【０１１８】
本発明の「組成物」は、１つの容器に二本鎖ＲＮＡと、別の容器にＲＮＡ含有実体（ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ構築物、発現構築物、又は宿主細胞など）に適した希釈剤又は担体とを含む「パーツのキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）」として供給してもよいことが考慮されている。本発明は、二本鎖ＲＮＡをさらなる構成要素なしに単独で供給することにも関する。これらの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、濃縮水溶液などの濃縮された形態で供給してもよい。ｄｓＲＮＡは凍結形態で、又はフリーズドライ形態すなわち凍結乾燥形態でも供給してもよい。後者の方が長期保存では安定であり、使用直前に解凍及び／又は適切な希釈剤で再構成することができる。
【０１１９】
特定の一実施形態では、組成物は、昆虫及び／又はクモによる侵襲から支持体を保護するために、その支持体に適用することができるコーティング、ペースト、又は粉末のことがある。この実施形態では、組成物を使用して昆虫及び／又はクモによる侵襲、又はそれにより起こる損傷に感受性の任意の支持体又は材料、例えば食料及び他の生鮮材料、並びに木などの支持体を保護することができる。この実施形態に好ましい標的昆虫及び／又はクモ種には、先に定義した（「標的生物／標的種」参照）本発明の害虫、すなわち屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫があるが、それに限定されるわけではない。最も好ましい標的種はゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１２０】
この実施形態では、組成物は、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ含有実体（例えば上記のＲＮＡ構築物）と、意図された使用に適した少なくとも１つの担体、希釈剤、又は賦形剤とを含むものであり、ここで、二本鎖ＲＮＡ領域はアニーリングした相補鎖を含み、その二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は防除される昆虫及び／又はクモ由来の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する。
【０１２１】
賦形剤の性質及び組成物の物理的形態は、処理が望まれる支持体の性質に応じて変動することがある。例えば組成物は、処理される材料又は支持体に刷毛で塗られるか、噴霧されるか、又は押印される液体であってもよいし、処理される材料又は支持体に適用されるコーティング又は粉末であってもよい。したがって一実施形態では、組成物は適切な表面の上のコーティングの形態であり、そのコーティングは、それと接触する昆虫及び／又はクモに接着し、ついには摂食される。
【０１２２】
一実施形態では、組成物はベイト剤の形態である。ベイト剤は昆虫及び／又はクモを誘引して、組成物と接触するように設計されている。それと接触すると、組成物は、次に例えば摂食により昆虫及び／又はクモによりインターナリゼーションされ、ＲＮＡｉを仲介し、故に昆虫及び／又はクモを死滅させる。前記ベイト剤は、タンパク質性食物、例えば魚粉などの食品を含んでもよい。ホウ酸もまたベイト剤として使用することができる。ベイト剤は、標的とされる種に依存することがある。例えば、チャバネゴキブリは自分が入手できるほぼ全ての食品を食べるものである。誘引剤もまた使用することができる。誘引剤は、例えば男性フェロモン又は女性フェロモンなどのフェロモンであってもよい。例として、「Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｅｒｅｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」（Ｈｏｗｓｅら、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、１９９８）という書籍に言及されているフェロモンを本発明に使用することができる。誘引剤は、昆虫及び／又はクモをベイト剤に誘引するように作用し、特定の昆虫及び／又はクモを標的とすることができるし、全範囲の昆虫を誘引することもできる。ベイト剤は固体、ペースト、ペレット、又は粉末形態などの任意の適切な形態であってもよい。
【０１２３】
ベイト剤は、昆虫及び／又はクモによりコロニーに運び込まれることもある。次に、ベイト剤はコロニーの他のメンバーの食物源として作用し、故に多数の昆虫及び／又はクモ、可能性があることには昆虫及び／又はクモ害虫のコロニー全体を効果的に防除することができる。害虫へのＲＮＡｉ介在性効果の遅延作用がベイト剤をコロニーに運び込ませ、故に昆虫及び／又はクモへの曝露に最大の影響をもたらすことから、これは、本発明の二本鎖ＲＮＡの使用に関連する利点である。
【０１２４】
追加的に、昆虫及び／又はクモと接触する組成物は、昆虫及び／又はクモのクチクラに残存することができる。昆虫及び／若しくはクモ自体の個別の掃除、又は昆虫及び／若しくはクモの相互の掃除のいずれかである掃除の際に組成物は摂食され、故に昆虫及び／又はクモに組成物の効果を仲介することができる。これは、組成物が例えば数日間でありうる期間に外部環境条件に曝露された場合でもｄｓＲＮＡが無傷のままであり、ＲＮＡｉを仲介することが十分にできるほど安定であることを必要とする。
【０１２５】
ベイト剤は、適切な「ハウジング」又は「トラップ」の中に用意してもよい。当該ハウジング及びトラップは市販されており、現存するトラップを本発明の組成物を包含するように適合させることができる。昆虫及び／又はクモの進入を誘う任意のハウジング又はトラップが本発明の範囲内に含まれる。ハウジング又はトラップは、例えば箱型であってもよく、予め成形された状態で用意してもよいし、例えば折り畳むことのできる厚紙で形成していてもよい。ハウジング又はトラップに適切な材料には、プラスチック及び厚紙があり、特に段ボールがある。当該ハウジング又はトラップに適切な寸法は、例えば幅７〜１５ｃｍ、長さ１５〜２０ｃｍ、及び高さ１〜５ｃｍである。一度中に入った昆虫及び／又はクモの運動を制限するために、トラップの内面を粘着物で覆うことができる。ハウジング又はトラップは、内部でベイト剤を定位置にしておくことができる適切な窪みを有してもよい。進入した後で昆虫は容易にトラップを離れることができないが、ハウジングは、昆虫及び／又はクモが摂食し、捕食者を避けて安全を確保できる好ましい環境をそれらに用意する「摂食場所」として働くことから、トラップはハウジングと区別される。
【０１２６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、昆虫及び／又はクモのための本発明の組成物を有するハウジング又はトラップを提供し、それは、本明細書に記載した組成物の任意の特徴を組み込んでいてもよい。
【０１２７】
さらなる代替の実施形態では、組成物はスプレーの形態で用意してもよい。したがって、ヒトである使用者は、害虫に組成物を直接噴霧することができる。次に、組成物は昆虫及び／又はクモにインターナリゼーションされ、そこから組成物はＲＮＡ干渉を仲介し、故に昆虫及び／又はクモを防除することができる。スプレーは好ましくは加圧／エーロゾル化スプレー又はポンプスプレーである。粒子は、昆虫及び／又はクモに、例えば昆虫及び／又はクモの外骨格に接着するために適した径のことがあり、そこから吸収されることができる。粒子径は、市販されている装置のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒの使用などの公知の手段により測定することができる。
【０１２８】
なおさらなる実施形態では、担体は、昆虫及び／又はクモのクチクラに接着する静電荷電した粉末又は粒子である。昆虫及び／又はクモに接着し、故に本発明のＲＮＡ構築物を送達することができる適切な粉末及び粒子は、共に参照により本明細書に組み込まれている国際公開第９４／００９８０号パンフレット及び国際公開第９７／３３４７２号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１２９】
或いは、担体は昆虫のクチクラに接着する磁気粒子を含んでもよい。昆虫及び／又はクモに接着することができ、故に本発明のＲＮＡ構築物を送達することができる適切な磁気粒子は、参照が本明細書に組み込まれている国際公開第００／０１２３６号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１３０】
好ましいなおさらなる実施形態では、組成物の担体は、最初は磁化していないが、昆虫及び／又はクモの体により提供される電界にさらされると磁気的に分極することができる金属粒子を含む。この作用様式は国際公開第２００４／０４９８０７号パンフレットに詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３１】
昆虫及び／又はクモと接触するこれらの組成物は、昆虫及び／又はクモのクチクラに残存することができる。昆虫及び／若しくはクモ自体の個別の掃除又は昆虫及び／若しくはクモの相互の掃除のいずれかである掃除の際に組成物は摂食され、故に昆虫及び／又はクモに組成物の効果を仲介することができる。これは、組成物が例えば数日間でありうる期間に外部環境条件に曝露された場合でもｄｓＲＮＡが無傷のままであり、ＲＮＡｉを仲介することが十分にできるほど安定であることを必要とする。
【０１３２】
好ましくは、組成物は昆虫及び／又はクモ害虫への二本鎖ＲＮＡの取り込みを増大させる担体を組み込んでおり（上の「標的生物／標的種」参照）、それは好ましくは昆虫及び／又はクモであり、好ましくはゴキブリの種である。当該担体は、好ましくは水中油型乳剤、ミセル、コレステロール、リポポリアミン、及びリポソームのうち１つ又は複数を含む脂質系担体であってもよい。本発明の構築物の取り込みを促進するその他の薬剤は当業者に周知であり、それには、ポリカチオン、デキストラン、及びＣＳ０９６、ＣＳ１０２などの（トリス）カチオン系脂質がある。市販されているリポソームにはＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）及びＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）などがある。いくつかの適切な担体は、「トランスフェクション促進剤」の名称で国際公開第０３／００４６４４号パンフレットに挙げられており、提供された各例は、これによって参照により組み込まれている。
【０１３３】
さらに好ましい実施形態では、担体はヌクレオチド凝縮剤である。好ましくは、ヌクレオチド凝縮剤はスペルミジン若しくは硫酸プロタミン、又はその誘導体を含む。
【０１３４】
本発明の組成物をさらなる害虫防除剤を含めたさらなる活性成分と一緒に組み合わせることができる。したがって組成物は、１つの容器に二本鎖ＲＮＡ含有組成物と、別の容器に化学害虫防除剤又は生物学的害虫防除剤でありうる１つ又は複数の適切な害虫防除剤とを含む「パーツのキット」として用意してもよい。或いは組成物は、安定で、相互に一緒に使用する混合物として用意してもよい。
【０１３５】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子に相補的に作用することができる適切な活性成分には、非限定的に以下のものがある：クロルピリホス、アレスリン、レスメトリン、テトラブロモエチル、ジメトール−シクロプロパンカルボン酸（ｄｉｍｅｔｈｏｌ−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（一般に液体組成物に入れられる）、及びヒドラメチルノン、アベルメクチン、クロルピリホス、スルフラミド（ｓｕｌｆｕｒａｍｉｄ）、ヒドロプレン、フィプロニル（ＧＡＢＡ受容体）、メチルカルバミド酸イソプロピルフェニル、インドキサカルブ（ＰＡＲＡ）、ノビフルムロン（キチン合成阻害剤）、イミプロトリン（ＰＡＲＡ）、アバメクチン（グルタミン酸依存性塩素チャネル）、イミダクロプリド（アセチルコリン受容体）（これらは一般にベイト組成物に入れられる）。
【０１３６】
好ましい実施形態では、活性成分は、保健環境の問題から見て好ましい殺虫剤及び／又は殺クモ剤、例えばヒドラメチルノン及びアベルメクチンなどであることが公知である。
【０１３７】
別の実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、細菌細胞又は真菌細胞などの適切な宿主細胞に発現し、その細胞は害虫種により取り込まれるか、又は食べられる。さらなる実施形態によると、ｄｓＲＮＡは、好ましくはそのｄｓＲＮＡを発現している細菌細胞又は真菌細胞である細胞から単離又は精製され、そのｄｓＲＮＡは害虫種に害虫防除剤として又は害虫防除製剤に入れて用意される。細菌又は真菌宿主細胞などの宿主細胞を操作して、本発明の任意のｄｓＲＮＡ又はＲＮＡ構築物を産生させることができる。好ましくは細菌細胞であるこれらの宿主細胞は、害虫種により摂食されるか、又は別の方法でインターナリゼーションされうる。取り込まれたときにｄｓＲＮＡはＲＮＡｉ応答を開始することができ、標的ｍＲＮＡの分解及び害虫の脆弱化又は死滅に至る。
【０１３８】
したがって、さらに特定の実施形態では、前記二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ構築物は、細菌などの原核生物、又は酵母、宿主細胞、若しくは宿主生物などの真核生物により発現される。これらの細胞又は生物は、昆虫及び／又はクモによる取り込みを容易にするために適した任意の製剤の中に用意することができる。
【０１３９】
本発明の使用及び方法
なおさらなる態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉により昆虫及び／又はクモを防除するための本発明のＲＮＡ構築物、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物、及び／又は本発明の発現構築物、及び／又は本発明の組成物、及び／又は本発明のハウジング若しくはトラップの使用に関する。その使用は、本明細書に同定された新規な標的とオーソロガスな標的遺伝子を有する全ての発育段階のいくつかの昆虫及び／又はクモに適用することができ、それらには、屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。最も好ましい標的種はゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１４０】
好ましくは、ＲＮＡｉを介し害虫と闘い、結果としてその害虫は、死滅し、麻痺し、成長が遅延し、摂食が阻害され、及び／又はその生殖が妨害される。
【０１４１】
相補的な態様では、本発明は昆虫及び／又はクモ（害虫）を防除する方法もまた提供し、その方法は、昆虫及び／又はクモに上に定義したｄｓＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物、及び／又は上に定義した発現構築物、及び／又は上に定義した宿主細胞、及び／又は上に定義した組成物、及び／又は上に定義したハウジング若しくはトラップを適用するステップを含み、ここで二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１４２】
適用は、例えば昆虫及び／又はクモに摂食させることを伴うことがあるし、昆虫及び／又はクモに（上記及び／又は上に定義した様々な提示形態の）ｄｓＲＮＡを接触させることを伴うこともある。直接接触に適した手段には、本発明の組成物に関して上に定義及び記載したベイト剤、粘着性ストリップ、帯磁及び荷電した粉末及び粒子、スプレー、ゲル、軟膏、表面処理などがある。任意の適用手段が、標的遺伝子発現の効果的な二本鎖ＲＮＡ介在性干渉をもたらすことによって昆虫及び／又はクモを防除するならば、その適用手段は本発明の範囲内に含まれる。
【０１４３】
複数の標的に対する構築物を含む複数の二本鎖ＲＮＡ領域を用意することが好都合なことがある。それは、このことが昆虫及び／又はクモの防除の有効性を増大させ、昆虫及び／又はクモが抵抗性を獲得する確率も減少させるからである。
【０１４４】
したがって、本発明の一実施形態では、複数の別々のＲＮＡｉ事象を仲介するために、上に定義した複数のＲＮＡ構築物、及び／又は上に定義したＤＮＡ構築物、及び／又は上に定義した発現構築物、及び／又は上に定義した宿主細胞、及び／又は上に定義した組成物、及び／又は上に定義したハウジング若しくはトラップが害虫に提供／適用される。
【０１４５】
複数の標的は、全てが同時に標的とされることがあるし、連続的に標的とされることもある。したがって、一実施形態では、昆虫及び／又はクモが抵抗性を獲得する確率を減らすために複数のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物、及び／又は宿主細胞、及び／又は組成物、及び／又はハウジング若しくはトラップが、連続的に供給／適用される。
【０１４６】
本発明の方法は、本明細書において同定された新規な標的とオーソロガスな標的遺伝子を有する、全ての発育段階のいくつかの昆虫及び／又はクモに適用することができる。標的昆虫には、屋内昆虫及び／又はクモ、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。最も好ましい標的種はゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１４７】
好ましくは、ＲＮＡｉにより昆虫及び／又はクモ害虫と闘い、結果としてその害虫は、死滅し、麻痺し、成長が遅延し、摂食が阻害され、及び／又はその生殖が妨害される。
【０１４８】
一実施形態では、宿主細胞は、本発明のＲＮＡ構築物を産生するように操作された細菌細胞であってもよい。
【０１４９】
なおさらなる態様では、本発明は、ゴキブリに少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を提供／適用することを含む、ゴキブリ害虫を防除する方法を提供し、その二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、ゴキブリリボソームタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。ゴキブリリボソームタンパク質は、ゴキブリの侵襲の効果的な防除を仲介することができるＲＮＡｉについての新規な標的となる。
【０１５０】
好ましくは、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも約１７、１８、１９、２０、２１個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は約１３００個のヌクレオチドを含む。
【０１５１】
なおさらなる態様では、本発明はゴキブリ害虫を防除する方法を提供し、その方法は、ゴキブリに少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を提供／適用するステップを含み、その二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖は、トロポミオシン、ＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ遺伝子、又はアクチン５Ｃ遺伝子をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。ゴキブリトロポミオシン、ＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ、及びアクチン５Ｃタンパク質はＲＮＡｉについての新規な標的となり、それはゴキブリ侵襲の効果的な防除を仲介することができる。
【０１５２】
好ましくは、少なくとも１つの二本鎖領域の少なくとも１方の鎖は、配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも約１７個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、４０個のヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、６０個のヌクレオチド、７０個のヌクレオチド、８０個のヌクレオチド、９０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、３５０個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、４５０個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、５５０個のヌクレオチド、６００個のヌクレオチド、６５０個のヌクレオチド、７００個のヌクレオチド、９００個のヌクレオチド、１０００個のヌクレオチド、１１００個のヌクレオチド、１２００個のヌクレオチド、又は約１３００個のヌクレオチドを含む。
【０１５３】
本発明の方法は、本明細書に同定した新規な標的とオーソロガスな標的遺伝子を有する、全ての発育段階のいくつかの昆虫及び／又はクモに適用することができる。標的昆虫には、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに非限定的な例としてハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミなどの公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモが含まれる。より好ましい標的種は、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）、ゴキブリ、例えばチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含むチャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）を含むワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を含むトウヨウゴキブリ属、並びにチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含むスペラ属のゴキブリである。さらに好ましい標的はゴキブリである。最も好ましい標的はチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）である。
【０１５４】
好ましくは、ＲＮＡｉにより昆虫及び／又はクモ害虫と闘い、結果的にその害虫は、死滅し、麻痺し、成長が遅延し、摂食が阻害され、及び／又はその生殖が妨害される。
【０１５５】
本発明のキット
本発明は、本発明の方法に使用するためのキットもまた提供する。これらのキットは、本発明のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物、及び／又は宿主細胞、及び／又は組成物、及び／又はハウジング若しくはトラップを組み入れていてもよく、その全てはｄｓＲＮＡ領域を送達して特異的標的遺伝子に対するＲＮＡｉをもたらす。
【０１５６】
好ましくは、キットは、そのキットの構成要素の使用説明書もまた含むものである。本発明のキットに見られるか、又は本発明のキットの構成要素により産生される二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫（害虫）遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１５７】
好ましくは、（上記の）さらに効果的な害虫防除をもたらすために、キットは、それぞれが異なる標的遺伝子又は昆虫及び／若しくはクモ種でＲＮＡｉを仲介する複数の構成要素を備える。したがって、キットは複数のＲＮＡ構築物、及び／又はＤＮＡ構築物、及び／又は発現構築物、及び／又は組成物を備えることがあり、各二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫及び／又はクモ（害虫）遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１５８】
好ましくは、キットの構成要素を連続的に適用し、効果的な害虫駆除を仲介する。しかし、最大の影響に必要ならば、一部又は全ての構成要素を同時に適用してもよい。
【０１５９】
キットは、公知の害虫防除剤を追加的に備えてもよく、その害虫防除剤は、本発明の部分を形成している構成要素と一緒に、又は別々に用意することができる。
【０１６０】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子に相補的に作用しうる適切な有効成分には、非限定的に以下のものがある：クロルピリホス、アレスリン、レスメトリン、テトラブロモエチル、ジメトール−シクロプロパンカルボン酸（一般に液体組成物に入れられる）、及びヒドラメチルノン、アベルメクチン、クロルピリホス、スルフラミド、ヒドロプレン、フィプロニル（ＧＡＢＡ受容体）、メチルカルバミド酸イソプロピルフェニル、インドキサカルブ（ＰＡＲＡ）、ノビフルムロン（キチン合成阻害剤）、イミプロトリン（ＰＡＲＡ）、アバメクチン（グルタミン酸依存性塩素チャネル）、イミダクロプリド（アセチルコリン受容体）（これらは一般にベイト組成物に入れられる）。
【０１６１】
好ましい実施形態では、活性成分は、衛生環境の問題から見て「好ましい」殺虫剤及び／又は殺クモ剤、例えばヒドラメチルノン及びアベルメクチンなどであることが知られている。
【０１６２】
したがって、本発明のキットは、広範囲の害虫を防除する選択肢を与えるために同時に複数の種に向けることもまたできる。二本鎖ＲＮＡ分子を（適切な構築物の部分などとして）キットに含めて、例えば同一の標的の種間オーソログを含む複数の標的のＲＮＡｉを仲介することができる。
【０１６３】
キットは、適切な緩衝液及びパッケージなどもまた含み、その中の構成要素の安定性及び保存を確実にすることができる。
【０１６４】
本発明の技術的な長所
従来の化学殺虫剤の使用に比べて、本発明に関連する多数の大きな長所がある。
（１）ｄｓＲＮＡを仲介しているＲＮＡｉは、効果的に発現をダウンレギュレーションすることにより害虫を防除するために、高度のヌクレオチド配列同一性で標的と一致しなければならない。したがって、特異性は、１方の鎖が標的配列と高い相同性を有するが、その鎖がヒトなどの哺乳動物種でのオーソロガスな配列と低い相同性だけを有する二本鎖ＲＮＡ分子を設計することにより実現することができる。この特異性は、従来の化学殺虫剤で実現できるものよりも大きい。
（２）害虫の防除に使用することができる新しいセットの標的が同定された。これらの標的は以前に同定されていないため、害虫種に獲得された抵抗性はないはずである。
（３）新規な標的に対するＲＮＡｉに使用する二本鎖ＲＮＡは、ＤＭＳＯなどの公知の化学合成害虫防除剤に比べて生分解性の産物である。この構築物が生分解性であることから、この構築物は環境面でさらに健全になる。
（４）ＲＮＡｉは、害虫を死滅させる点で必ずしも即時効果を与えるわけではなく、それどころかその効果は効果的に仲介されるが、二本鎖ＲＮＡがその標的と会合するには時間が必要である。ＲＮＡｉの効果は、（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓからのキチン合成阻害剤である）ノビフルムロンのようにその後にそして接触直後でなしに害虫の死滅を招くことができる。したがって、害虫が殺虫剤及び／又は殺クモ剤の近くで大量の死んだ害虫に出くわして害虫の間にショック効果が広がるという機会が少ないことから、ＲＮＡｉを使用すると、昆虫及び／又はクモなどの害虫の大規模な侵襲を比較的容易に防除することができる。
（５）同時に複数の標的を使用することは、害虫の個体数のさらに有効な防除をもたらし、抵抗性を獲得する確率を減らすことができる。標的はいくつかの害虫種に共通で、広範囲の処置を与えることがある。
（６）従来の害虫防除剤とは対照的に、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡ構築物、組成物、並びに宿主細胞の性質が比較的安全であることから、関連する場所を処理するために職業的な援助は必要ないであろう。
（７）二本鎖ＲＮＡ領域含有構築物が、標的害虫集団以外の遺伝子発現に有害作用もごく小さな作用も有さないように設計されていることから、ヒトの活動性の混乱は最小限しか必要ないであろう。
【０１６５】
以下の実験の部を参照すると、本発明がさらに理解されよう。
［表の説明］
表１：新規に同定した昆虫標的遺伝子の例。割り当てられた遺伝子機能はＦｌｙＢａｓｅオーソログに基づく。
表２：チャバネゴキブリ標的配列に相補的なｄｓＲＮＡ断片。
表３：うまく脱皮して成虫期になったゴキブリの数に及ぼすｄｓＲＮＡ処置の効果を生きた昆虫の率で表したもの（平均±標準誤差、ｎ＝４）。
表４：選択された標的遺伝子配列＊。配列＊の少なくとも１７ｂｐの断片は、昆虫種での特異的にオーソロガスな配列に存在する（ＧＩ番号で表す）。
表５：選択された標的遺伝子配列＊。配列＊の少なくとも１７ｂｐの断片は、クモ種での特異的にオーソロガスな配列に存在する（ＧＩ番号で表す）。
【０１６６】
【表１】
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
【表３】
【０１６９】
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【表４−６】
【表４−７】
【表４−８】
【表４−９】
【表４−１０】
【表４−１１】
【表４−１２】
【表４−１３】
【表４−１４】
【表４−１５】
【表４−１６】
【表４−１７】
【０１７０】
【表５−１】
【表５−２】
【実施例】
【０１７１】
〔実施例１：ファミリーＰＣＲによるチャバネゴキブリＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、及びＢｇ００５遺伝子の部分配列のクローニング〕
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号１５５９６−０２６／１５５９６−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、高品質の無傷のＲＮＡをチャバネゴキブリ（入手源：Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ヨーク）から単離した。このＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、製造業者が指示したＤｎアーゼ処理により除去した。市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、カタログ番号１８０８００４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、ｃＤＮＡを作製した。
【０１７２】
Ｂｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、及びＢｇ００５遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（カタログ番号Ｎ８０８０２４０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者が指示したように使用して、縮重プライマーを用いた一連のＰＣＲ反応を行った。
【０１７３】
Ｂｇ００１については、縮重プライマーｏＧＢＫＡ００２及びｏＧＢＫＡ０２０（本明細書においてそれぞれ配列番号３及び配列番号４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５７℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号１で表し、Ｂｇ００１遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号２で表す。
【０１７４】
Ｂｇ００３について、縮重プライマーｏＧＢＫＣ００１及びｏＧＢＫＣ０１０（本明細書においてそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号１１で表し、Ｂｇ００３遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号１２で表す。
【０１７５】
Ｂｇ００４について、縮重プライマーｏＧＢＫＤ００１及びｏＧＢＫＤ００６（本明細書においてそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号２１で表し、Ｂｇ００４遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号２２で表す。
【０１７６】
Ｂｇ００５について、縮重プライマーｏＧＢＫＥ００２及びｏＧＢＫＥ００９（本明細書においてそれぞれ配列番号３３及び配列番号３４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５２℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号３１で表し、Ｂｇ００５遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号３２と表す。
【０１７７】
〔実施例２：ＥＳＴ配列によるチャバネゴキブリＢｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の部分配列のクローニング〕
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号１５５９６−０２６／１５５９６−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、高品質の無傷のＲＮＡをチャバネゴキブリ（入手源：Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ヨーク）から単離した。このＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡは、製造業者が指示したようにＤＮアーゼ処理により除去した。市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、カタログ番号１８０８００４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロックヴィル、メリーランド州、米国）を製造業者の説明書通りに使用して、ｃＤＮＡを作製した。
【０１７８】
Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２及びＢｇ０３３遺伝子由来の部分ｃＤＮＡ配列を同定するために、公共データベースＧｅｎｂａｎｋ由来の公共データベースＧｅｎｂａｎｋのそれぞれ受託番号ＡＦ２６０８９７、Ｘ７３６７９、及びＡＹ００４２４８に各遺伝子あたり１つのＥＳＴを見出した。
【０１７９】
Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の部分を含むｃＤＮＡ配列を単離するために、Ｐｅｒｆｅｃｔｓｈｏｔ（商標）ＥｘＴａｑ（カタログ番号ＲＲ００５Ａ、タカラバイオ株式会社）を製造業者が指示したように使用して、ＥＳＴに基づく特異的プライマーを用いた一連のＰＣＲ反応を行った。
【０１８０】
Ｂｇ０３１について、特異的プライマーｏＧＢＬＡ００１及びｏＧＢＬＡ００２（本明細書においてそれぞれ配列番号４３及び配列番号４４で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号４１で表し、Ｂｇ０３１遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号４２で表す。
【０１８１】
Ｂｇ０３２について、特異的プライマーｏＧＢＬＢ００３及びｏＧＢＬＢ００４（本明細書においてそれぞれ配列番号５１及び配列番号５２で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号４９で表し、Ｂｇ０３２遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号５０で表す。
【０１８２】
Ｂｇ０３３について、特異的プライマーｏＧＢＬＣ００１及びｏＧＢＬＣ００４（本明細書においてそれぞれ配列番号５９及び配列番号６０で表す）を、以下の条件下で２つの独立したＰＣＲ反応に使用した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクル、続いて７２℃で７分間。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（カタログ番号Ｋ４５７５−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。両ＰＣＲ産物の配列決定によって生じたコンセンサス配列を、本明細書において配列番号５７で表し、Ｂｇ０３３遺伝子の部分配列と呼ぶ。対応する部分アミノ酸配列を本明細書において配列番号５８で表す。
【０１８３】
〔実施例３：チャバネゴキブリＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子のｄｓＲＮＡ産生〕
市販のキットＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｐ１７００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ミリグラム量のｄｓＲＮＡを合成した。最初に２つの異なる一本鎖５’Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターテンプレートを２つの異なるＰＣＲ反応で作製した。各反応物はＴ７プロモーターに対して異なる方向で標的配列を含む。
【０１８４】
Ｂｇ００１について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００１及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１０（本明細書においてそれぞれ５及び配列番号６で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応に使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００９及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００２（本明細書においてそれぞれ配列番号７及び配列番号８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応で使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号９で表す。
【０１８５】
Ｂｇ００３について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００３及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１２（本明細書においてそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６と表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ０１１及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００４（本明細書においてそれぞれ１７及び配列番号１８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応で使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号１９で表す。
【０１８６】
Ｂｇ００４について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００５及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１４（本明細書においてそれぞれ配列番号２５及び配列番号２６で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ０１３及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００６（本明細書においてそれぞれ配列番号２７及び配列番号２８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号２９で表す。
【０１８７】
Ｂｇ００５について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ０１６（本明細書においてそれぞれ配列番号３５及び配列番号３６で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＤ０１５及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＤ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号３７及び配列番号３８で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用してアンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号３９で表す。
【０１８８】
Ｂｇ０３１について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＡ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＡ００２（本明細書においてそれぞれ配列番号４５及び配列番号４４で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＡ００１及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＡ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号４３及び配列番号４６で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号４７で表す。
【０１８９】
Ｂｇ０３２について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＢ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＢ００４（本明細書においてそれぞれ配列番号５３及び配列番号５２で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＢ００３及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＢ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号５１及び配列番号５４で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号５５で表す。
【０１９０】
Ｂｇ０３３について、特異的Ｔ７ ＦＷプライマーｏＧＢＬＣ００７及び特異的ＲＶプライマーｏＧＢＬＣ００４（本明細書においてそれぞれ６１及び配列番号６０で表す）を以下の条件のＰＣＲ反応で使用して、センスＴ７テンプレートを作製した：９５℃で４分間、続いて９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間。特異的ＦＷプライマーｏＧＢＬＣ００１及び特異的Ｔ７ ＲＶプライマーｏＧＢＬＣ００８（本明細書においてそれぞれ配列番号５９及び配列番号６２で表す）を上記と同条件のＰＣＲ反応に使用して、アンチセンスＴ７テンプレートを作製した。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析し、ＮａＣｌＯ４沈殿により精製した。作製したＴ７ ＦＷ及びＲＶテンプレートを混合して転写させ、結果として得られたＲＮＡ鎖をアニーリングし、Ｄｎアーゼ及びＲｎアーゼ処理し、製造業者の説明書通りに酢酸ナトリウムにより精製した。結果として得られたｄｓＲＮＡのセンス鎖を、本明細書において配列番号６３で表す。
【０１９１】
〔実施例４：チャバネゴキブリＢｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａに対する活性についてｄｓＲＮＡ標的をスクリーニングする実験室内試験〕
蒸留水に溶かした１〜１０μｇ／μｌ ｄｓＲＮＡ原液を調製した。各ｄｓＲＮＡ溶液を適切な濃度に希釈し、それを細かく磨り潰した実験室動物用餌（ラット及びマウス標準食、Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ、ハル、英国）（全ての酵素を不活性化するために予め熱処理したもの）と混合した。この混合物又は製剤を等重量（０．３ｇ）の小さなペレットに成形し、終濃度０．１％から２％ｗ／ｗ ｄｓＲＮＡにして、室温で一晩乾燥させた。
【０１９２】
新たに孵化したチャバネゴキブリＢ．ｇｅｒｍａｎｉｃａの若虫をプラスチック蓋のついた容器（２９±２℃、相対湿度最低４０％、１２：１２明暗光周期）に１０匹ずつ入れた。動物を２４時間絶食させてからペレットを提示した。成虫になるまで週に２回、ゴキブリの生存、瀕死、又は死滅を評定した。週に１回、ペレットを新たに調製したペレットと交換した。ｄｓＲＮＡ含有ペレットである製剤を陰性対照（溶媒）及び陽性対照（１又は２％イミダクロプリド（市販のゴキブリ用ベイト剤に通常使用されている））と比較した。図１に示すように、Ｂｇ００１、Ｂｇ００３、及びＢｇ００５で処置したときは初回投与の２４日以内に、Ｂｇ００４で処置したときは２９日以内に、それぞれゴキブリの少なくとも８０％は死滅した。
【０１９３】
〔実施例５：効率に関する種々の断片の実験
ヒトと実質的な相同性を有さないチャバネゴキブリＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の断片の同定〕
本明細書においてそれぞれ配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４９、及び配列番号５７に表すＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３遺伝子の部分配列を分析し、非標的生物と実質的な相同性を有さない断片を見出した。特に、ｄｓＲＮＡは生物中でｓｉＲＮＡ分子に細切されるものであることから、非標的種と相同性を有するであろうｓｉＲＮＡ配列を求めて配列をスキャンした。当該ｓｉＲＮＡは非標的生物に有害作用を起こすおそれがあるため、最終産物に組み入れるｄｓＲＮＡ断片に入れるのは避けることが好ましい。選択された断片は、例えばベイト剤に存在してゴキブリの摂食によりベイト剤から取り込まれる場合、ＲＮＡ干渉によるゴキブリ防除に適する。この分析について、非標的生物はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）であった。非標的生物に存在しない２１個の隣接するヌクレオチド（ｂｅｓｔ１＿ｈｕｍａｎ＿２１＿０）、又は３つのミスマッチを許した２４個の隣接するヌクレオチド（ｂｅｓｔ１／２／３＿ｈｕｍａｎ＿２４＿３）の断片を同定した。これを本明細書において「フリーフラッグ（ｆｒｅｅｆｒａｇ）」と名付ける。第１の選択基準で非標的生物の配列を有さないＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２及びＢｇ０３３の最長配列を配列番号で示し、本明細書において「フリーフラッグ」と名付ける。これらのＢｇ００１、Ｂｇ００３、Ｂｇ００４、Ｂｇ００５、Ｂｇ０３１、Ｂｇ０３２、及びＢｇ０３３のフリーフラッグは、本明細書においてそれぞれ配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、及び配列番号６４で表す。本発明での使用に適した他のフリーフラッグ配列の数例の長さ及び配列を表２に示す。正確な配列は、この表から容易に推定することができる。表に記載した全てのフリーフラッグ配列は、本発明の配列群に属する。
【０１９４】
当業者は、様々な長さのより多くの当該フリーフラッグが、本明細書に提示したチャバネゴキブリ配列、並びに本発明による他の害虫配列中の対応する遺伝子及びタンパク質のオーソログである配列で同定されることがあり、したがって、本発明がこれらのさらに同定することのできるフリーフラッグに及ぶことを認識しているであろう。
【０１９５】
〔実施例６：最適の断片の選択；効率についてのコンカテマーの試験〕
各標的遺伝子についてコンカテマーを設計した。コンカテマーは５０から１００ｂｐのｄｓ断片の合成タンデム反復である。本実施例では、タンパク質ファミリー中で相同性を有する領域から、そしてヌクレオチドレベルで最良の予測されるｓｉＲＮＡを含む領域及び４０から６０％のＧＣ含量、可能であれば好ましくは約５０％のＧＣ含量を有する領域から最良の可能性のある断片を選択することによってコンカテマーを設計した。
【０１９６】
Ｂｇ００１について、５０ｂｐ断片、すなわち配列番号６５及び６６に表す断片の５回繰り返しからなる２つのコンカテマーを設計し、本明細書においてそれぞれ配列番号６７及び配列番号６８で表すＢｇ００１コンカテマー１及びＢｇ００１コンカテマー２を得た。さらに、１００ｂｐの繰り返し、すなわち配列番号６９に表す繰り返しの３回繰り返しからなる１つのコンカテマーを設計し、本明細書において配列番号７０で表すＢｇ００１コンカテマー３を得た。ベクターにクローニングするためにＸｂａＩ及びＳｍａＩ隣接部位を付加し、ｄｓＲＮＡを産生させた。コンカテマーを含むこれらのｄｓＲＮＡ構築物をゴキブリの実験室内試験で試験した。
【０１９７】
図２に示すさらなる実験で、Ｂｇ００１及びＢｇ００１コンカテマー２で処置したときの死滅率は陰性対照（溶媒）に比べて有意に高かった。
【０１９８】
死滅率以外に、処置は発育に有意な効果を示した。例えば表３に示すように、４８日目にはＢｇ００１で処置されて生存しているゴキブリのうち３３．３％だけが脱皮して成虫期段階になったが、Ｂｇ００１コンカテマー２で処置されたゴキブリはこの期間に１匹もそうならなかった。
【０１９９】
〔実施例７：種々の製剤の試験〕
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多数の異なる種において配列特異的に標的遺伝子の発現を阻害する、潜在的に非常に強力な手段である。しかし、ＲＮＡｉが貴重で効果的であるためには、所与の任意の標的遺伝子を、非特異的ノックダウン及び有毒な副作用なしに特異的にサイレンシングすることが不可欠である。ｄｓＲＮＡの適用は、細胞内でのこれらの化合物の作用部位にこれらの化合物を効果的に送達できないことによって妨害されてきた。特異性を失わずに相互作用の強度及び安定性を高めるためのｄｓＲＮＡの化学修飾の進歩が継続中である。この実験では、チャバネゴキブリの標的遺伝子にｄｓＲＮＡを送達するためのいくつかの概念について評価する。
【０２００】
エンドサイトーシを容易にすることによりｄｓＲＮＡの細胞内取込みを増大させること、又は脂質及びリポソームなどの送達剤を使用して生物学的環境におけるｄｓＲＮＡの安定性を増大させることによって、ＲＮＡｉに誘導される効果を向上することができる。ｓｉＲＮＡ−はアニオン性ホスホジエステル主鎖を有し、この理由からカチオン性リポソーム／脂質介在性ｓｉＲＮＡ送達（ｓｉＦｅｃｔｉｏｎ）が検討される。これらのカチオン性リポソーム／脂質に基づく系は、リポフェクタミン及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチル−アンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロールを含めたいくつかの市販製品から選択され、ゴキブリの実験室内試験でｄｓＲＮＡ製剤を試験する。検討するパラメーターには混合の脂質：ｄｓＲＮＡ比、カチオン性リポソーム／脂質−ｄｓＲＮＡ複合体の形成度、粒子径、送達様式、及び用量反応効果がある。
【０２０１】
〔実施例８：ｄｓＲＮＡの安定性試験〕
遺伝子サイレンシングのためのｄｓＲＮＡ適用は、分子の生物学的安定性、特異性、及び送達の改善に依存するものである。
【０２０２】
一部の標的種の腸内のｐＨを模倣するために、作製したｄｓＲＮＡの安定性をｐＨ７及びｐＨ９のＴＲＩＺＭＡ緩衝液及びｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝液で試験した。ｄｓＲＮＡを数日間インキュベートし、その一定分量を異なる時間間隔で２０％ポリアクリルアミドゲル上において分析した。ゲルの結果に基づき、ｄｓＲＮＡの安定性に及ぼすｐＨの影響は観察できなかった。
【０２０３】
作製したｄｓＲＮＡの安定性を、無ＲＮアーゼ水及びＬＢ培地中で室温で８ヶ月間にわたり時間の関数として試験した。一定分量を毎週及び／又は毎月採取し、−２０℃で保存してから２０％ポリアクリルアミドゲル上において分析した。図３に示すようにポリアクリルアミドゲルでｄｓＲＮＡの有意な分解を観察することはできなかった。
【０２０４】
〔実施例９：チャバネゴキブリＢｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａの初期若虫期での死滅率に及ぼす単回投与ｄｓＲＮＡを試験するための実験室内試験〕
蒸留水に溶かした１０μｇ／μｌ ｄｓＲＮＡ原液を調製し、それを細かく磨り潰した実験室動物用餌（ラット及びマウス標準食、Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ、ハル、英国）（全ての酵素を不活性化するために予め熱処理したもの）と混合した。この混合物又は製剤を等重量（０．３ｇ）の小さなペレットに成形し、終濃度１％ｗ／ｗ ｄｓＲＮＡにして、室温で一晩乾燥させた。
【０２０５】
新たに孵化したチャバネゴキブリＢ．ｇｅｒｍａｎｉｃａの若虫をプラスチック蓋のついた容器（２９±２℃、相対湿度最低４０％、１２：１２明暗光周期）に１０匹ずつ入れた。動物を２４時間絶食させてからペレットを提示した。１週間後にこの初回用量を未処置のペレットと交換した。成虫になるまで週に２回、ゴキブリの生存、瀕死、又は死滅を評定した。図４に示すように、Ｂｇ００１ ｄｓＲＮＡ含有ペレットは、２つの陰性対照（溶媒及び種々雑多なｄｓＲＮＡ）に比べて有意に高い死滅率を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記オーソロガスなヌクレオチド配列が、配列番号１、１１、２１、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子。
【請求項２】
少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物であって、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、（ｉ）請求項１に記載の核酸分子、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ構築物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域が少なくとも１７ｂｐの長さを有する、請求項２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列の相補性が、（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有し、前記配列同一性の率が同一の長さにわたり計算される、請求項２又は３に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項５】
（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と相補的なヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１方の鎖が、２４個の隣接するヌクレオチドにわたり哺乳動物種由来の対応するヌクレオチド配列と１２．５％未満の配列同一性を有する、請求項２〜４のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項６】
配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか、例えば配列番号６５から７０のいずれかから独立して選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、請求項２〜５のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項７】
（ｉ）請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むか、又は（ｉｉ）請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物をコードしている領域を含むＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ構築物を含む発現構築物。
【請求項９】
請求項７に記載のヌクレオチドの発現を駆動することができる１つ又は複数の制御配列と、場合によっては転写終結配列とをさらに含む、請求項８に記載の発現構築物。
【請求項１０】
請求項２〜６のいずれかに記載のＲＮＡ構築物、請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物を含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞を適切な担体と一緒に含む害虫防除組成物。
【請求項１２】
前記担体が、静電荷電した粉末若しくは粒子及び／又は磁気粒子、好ましくは最初帯磁していないが、前記昆虫又はクモの体が与える電界にさらされると磁気的に分極することができる金属粒子を含み、前記粉末又は粒子が、前記昆虫又はクモのクチクラに接着し、昆虫又はクモにより摂食されることができる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の組成物を含む、昆虫及び／又はクモのためのハウジング又はトラップ。
【請求項１４】
ＲＮＡ干渉により昆虫及び／又はクモを防除するための、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップの使用。
【請求項１５】
昆虫及び／又はクモを防除する方法であって、昆虫及び／又はクモに、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを適用するステップを含み、前記二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉によって少なくとも１つの昆虫及び／又はクモ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる方法。
【請求項１６】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが前記昆虫及び／又はクモに適用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記昆虫及び／又はクモが抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが連続的に適用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記昆虫及び／又はクモが、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモ、好ましくはハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ（ｔｒｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｍｉｔｅ）、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミを含む、請求項１４に記載の使用又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記昆虫及び／又はクモが、非限定的にチャバネゴキブリ種（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｓｐｐ．）（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（Ｂｌａｔｔａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（Ｓｕｐｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）；非限定的にトフシアリ種（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｓｐｐ）（例えばオオアリ種（カーペンターアント（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ａｎｔ）））、ケアリ種（ｌａｓｉｕｓ ｓｐｐ．）（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（Ｍｙｒｍｉｃａ ｓｐｐ．）（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（Ｆｏｒｍｉｃａ ｓｐｐ）（ウッドアント（ｗｏｏｄ ａｎｔ））、シリアゲアリ種（Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．）（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｌｉｎｅｏｌａｔａ）（アクロバットアント（Ａｃｒｏｂａｔ Ａｎｔ）））、イリドミルメクス種（Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｓｐｐ．）（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（Ｐｈｅｉｄｏｌｅ ｓｐｐ．）（オオズアリ）、及びダシムチラ種（Ｄａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ）；非限定的にアミテルメス種（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばアミテルメス−フロリデンシス（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ）（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト（Ｆｌｏｒｉｄａ ｄａｒｋ−ｗｉｎｇｅｄ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ）））、レティキュリテルメス種（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）（イースタンサブテラネアンテルマイト（ｅａｓｔｅｒｎ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ））、レティキュリテルメス−ヘスペルス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）（ウエスタンサブテラネアンテルマイト（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））、イエシロアリ種（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、ネオテルメス種（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばネオテルメス−コネキサス（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｃｏｎｎｅｘｕｓ）（フォレストツリーテルマイト（Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））などのシロアリ（シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）及び／又はシロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ））を含み、最も好ましくはチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含む、請求項１８に記載の使用又は方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを使用説明書と一緒に備え、前記二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができるキット。
【請求項２１】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを備え、各二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記害虫が抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが連続的に使用される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
ゴキブリ害虫を防除する方法であって、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物をゴキブリに与えるステップを含み、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、ゴキブリリボソームタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの追加のｄｓＲＮＡ領域を含み、前記ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、昆虫及び／又はクモ種由来のさらなる遺伝子のヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２６】
少なくとも１つの追加の機能的配列と、場合によってはリンカーとをさらに含む、請求項２〜６又は２５のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記追加の機能的配列が、（ｉ）前記ＲＮＡ構築物の大規模産生を容易にする配列と、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡの安定性を増加又は減少させる配列と、（ｉｉｉ）タンパク質又は他の分子を結合させて、昆虫及び／若しくはクモによる前記ＲＮＡ構築物の取り込みを容易にする配列と、（ｉｖ）昆虫の腸内で受容体又は分子に結合し、前記昆虫及び／又はクモによる取り込み、エンドサイトーシス、及び／又はトランスサイトーシスを容易にするアプタマーである配列とを含む群から選択される、請求項２６に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記リンカーが、条件的に自己開裂するＲＮＡ配列であり、好ましくはｐＨ感受性リンカー又は疎水性感受性リンカーである、請求項２６又は２７に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２９】
前記リンカーがイントロンである、請求項２６又は２７に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３０】
前記ヌクレオチド配列の相補性が、（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有し、前記配列同一性の率が同一の長さにわたり計算される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３１】
（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子及び／又はクモと相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１方の鎖が、哺乳動物種由来の対応するヌクレオチド配列と２４個の隣接するヌクレオチドにわたり１２．５％未満の配列同一性を有する、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３２】
少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含む、請求項３〜６又は２５〜２８のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３３】
前記哺乳動物種がヒトである、請求項３１又は３２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３４】
少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物であって、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含むＲＮＡ構築物。
【請求項３５】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物をコードしている領域を含むＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
請求項３５に記載のＤＮＡ構築物を含む発現構築物。
【請求項３７】
請求項２５〜３４のいずれかに記載のＲＮＡ構築物、請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項３６に記載の発現構築物を含む宿主細胞。
【請求項３８】
細菌細胞である、請求項１０又は３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
不活性化細菌細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
請求項２〜６又は２５〜３４のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を作製する方法であって、請求項７又は３５に記載のＤＮＡ構築物を転写させて前記ＲＮＡ構築物を産生させる条件下で、ａ．前記ＤＮＡ構築物又は請求項８、９、若しくは３６のいずれかに記載の発現構築物を無細胞成分と接触させるステップ、又はｂ．前記ＤＮＡ構築物又は請求項８、９、若しくは３６のいずれかに記載の発現構築物を細胞に適用するステップを含む方法。
【請求項４１】
前記細胞が細菌細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞を適切な担体と一緒に含む害虫防除組成物。
【請求項４３】
昆虫及び／又はクモよる摂食に適した形態である、請求項１０、１１、又は４３のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
ペレット若しくは粉末などの固体形態、液体形態、又はゲル形態である、請求項４２又は４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ベイト剤の形態である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ベイト剤が、タンパク質性食物などの少なくとも１つの食品、又はホウ酸及び／若しくは誘引剤、例えばフェロモンをさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
昆虫及び／又はクモが前記組成物を摂食するために進入することができるハウジング又はトラップに用意されている、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
スプレー、好ましくは加圧／エーロゾル化スプレー又はポンプスプレーの形態である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
昆虫及び／又はクモが接触すると、前記昆虫及び／又はクモに接着する、適切な表面上のコーティングの形態である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記担体が、静電荷電した粉末若しくは粒子及び／又は磁気粒子、好ましくは最初帯磁していないが、前記昆虫及び／又はクモの体がもたらす電界にさらされると磁気的に分極することができ、前記昆虫及び／又はクモのクチクラに接着する金属粒子を含む、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記担体が、前記害虫への前記二本鎖ＲＮＡの取り込みを増大させる、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記担体が、好ましくは水中油型エマルジョン、コレステロール、ミセル、リポポリアミン、及びリポソームのうち１つ又は複数を含む脂質系担体である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記担体が、ヌクレオチド凝縮剤、好ましくはスペルミジン又は硫酸プロタミンを含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
さらなる害虫防除剤と組み合わせた、請求項１１、１２、又は４２〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
請求項４２〜４６又は５４のいずれか一項に記載の組成物を含む、昆虫及び／又はクモ用のハウジング又はトラップ。
【請求項５６】
ＲＮＡ干渉により昆虫及び／又はクモを防除するための、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項５５に記載のハウジング若しくはトラップの使用。
【請求項５７】
前記昆虫及び／又はクモが、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモ、好ましくはハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミを含む、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記昆虫及び／又はクモが、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばＩａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）を含み、最も好ましくはチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含む、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記昆虫及び／又はクモが、成長が遅延するか、麻痺するか、生殖不能になるか、又は死滅する、請求項１４、１８、又は５６〜５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
昆虫及び／又はクモを防除する方法であって、昆虫及び／又はクモに、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを適用することを含み、前記二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫及び／又はクモ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる方法。
【請求項６１】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが適用される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記害虫が抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが連続的に適用される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記昆虫及び／又はクモが、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモ、好ましくはハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミを含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記昆虫及び／又はクモが、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）を含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記昆虫及び／又はクモが、成長が遅延するか、麻痺するか、生殖不能になるか、又は死滅する、請求項１５〜１６又は６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを使用説明書と一緒に備え、前記二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができるキット。
【請求項６７】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物を備え、各二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる、請求項６４に記載のキット。
【請求項６８】
前記害虫が抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物が連続的に使用される、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
ゴキブリ害虫を防除する方法であって、ゴキブリに少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を適用するステップを含み、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、トロポミオシン、ＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ遺伝子、又はアクチン５Ｃ遺伝子をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの二本鎖領域の少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ゴキブリ害虫が、チャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ属、及びスペラ属を含む属の群に属する種から選択される、請求項２３、２４、６９、又は７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記ゴキブリ害虫が、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、及びチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含む群から選択される、請求項２３、２４、又は６９〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むタンパク質、又はさらなる昆虫及び／若しくはクモ種由来の保存されたアミノ酸配列を有するオーソロガスなタンパク質。
【請求項７４】
オーソログが、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項７３に記載のタンパク質。
【請求項７５】
請求項２〜６又は２５〜３４のいずれかのＲＮＡ構築物を作製する方法であって、前記ＲＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で、請求項１０又は３７〜３９のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項７６】
前記ＲＮＡ構築物の精製をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０及び１８１のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫若しくはクモ種由来のオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記オーソロガスなヌクレオチド配列が、配列番号１、１１、２１、及び３１のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸分子。
【請求項２】
少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物であって、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、（ｉ）請求項１に記載の核酸分子、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子のいずれか１つのヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ構築物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域が少なくとも１７ｂｐの長さを有する、請求項２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列の相補性が、（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有し、前記配列同一性の率が同一の長さにわたり計算される、請求項２又は３に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項５】
（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と相補的なヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１方の鎖が、２４個の隣接するヌクレオチドにわたり哺乳動物種由来の対応するヌクレオチド配列と１２．５％未満の配列同一性を有する、請求項２〜４のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項６】
配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか、例えば配列番号６５から７０のいずれかから独立して選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、請求項２〜５のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項７】
（ｉ）請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むか、又は（ｉｉ）請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物をコードしている領域を含むＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ構築物を含む発現構築物。
【請求項９】
請求項７に記載のヌクレオチドの発現を駆動することができる１つ又は複数の制御配列と、場合によっては転写終結配列とをさらに含む、請求項８に記載の発現構築物。
【請求項１０】
請求項２〜６のいずれかに記載のＲＮＡ構築物、請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物を含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞を適切な担体と一緒に含む害虫防除組成物。
【請求項１２】
前記担体が、静電荷電した粉末若しくは粒子及び／又は磁気粒子、好ましくは最初帯磁していないが、前記昆虫又はクモの体が与える電界にさらされると磁気的に分極することができる金属粒子を含み、前記粉末又は粒子が、前記昆虫又はクモのクチクラに接着し、昆虫又はクモにより摂食されることができる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の組成物を含む、昆虫及び／又はクモのためのハウジング又はトラップ。
【請求項１４】
ＲＮＡ干渉により昆虫及び／又はクモを防除するための、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップの使用。
【請求項１５】
昆虫及び／又はクモを防除する方法であって、昆虫及び／又はクモに、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを適用するステップを含み、前記二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉によって少なくとも１つの昆虫及び／又はクモ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる方法。
【請求項１６】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが前記昆虫及び／又はクモに適用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記昆虫及び／又はクモが抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが連続的に適用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記昆虫及び／又はクモが、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモ、好ましくはハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ（ｔｒｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｍｉｔｅ）、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミを含む、請求項１４に記載の使用又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記昆虫及び／又はクモが、非限定的にチャバネゴキブリ種（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｓｐｐ．）（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（Ｂｌａｔｔａ ｓｐｐ．）（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（Ｓｕｐｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）；非限定的にトフシアリ種（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｓｐｐ）（例えばオオアリ種（カーペンターアント（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ａｎｔ）））、ケアリ種（ｌａｓｉｕｓ ｓｐｐ．）（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（Ｍｙｒｍｉｃａ ｓｐｐ．）（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（Ｆｏｒｍｉｃａ ｓｐｐ）（ウッドアント（ｗｏｏｄ ａｎｔ））、シリアゲアリ種（Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．）（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（Ｃｒｅｍａｔｏｇａｓｔｅｒ ｌｉｎｅｏｌａｔａ）（アクロバットアント（Ａｃｒｏｂａｔ Ａｎｔ）））、イリドミルメクス種（Ｉｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｓｐｐ．）（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（Ｐｈｅｉｄｏｌｅ ｓｐｐ．）（オオズアリ）、及びダシムチラ種（Ｄａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｓｐｐ．）（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄｅａ）；非限定的にアミテルメス種（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばアミテルメス−フロリデンシス（Ａｍｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ）（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト（Ｆｌｏｒｉｄａ ｄａｒｋ−ｗｉｎｇｅｄ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ）））、レティキュリテルメス種（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）（イースタンサブテラネアンテルマイト（ｅａｓｔｅｒｎ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｔｅｒｍｉｔｅ））、レティキュリテルメス−ヘスペルス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）（ウエスタンサブテラネアンテルマイト（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））、イエシロアリ種（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、ネオテルメス種（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）（例えばネオテルメス−コネキサス（Ｎｅｏｔｅｒｍｅｓ ｃｏｎｎｅｘｕｓ）（フォレストツリーテルマイト（Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ Ｔｅｒｍｉｔｅ）））などのシロアリ（シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）及び／又はシロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ））を含み、最も好ましくはチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含む、請求項１８に記載の使用又は方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを使用説明書と一緒に備え、前記二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができるキット。
【請求項２１】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを備え、各二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記害虫が抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２〜６のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項７又は８に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項９に記載の発現構築物、及び／又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び／又は請求項１１又は１２に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが連続的に使用される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
ゴキブリ害虫を防除する方法であって、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物をゴキブリに与えるステップを含み、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、ゴキブリリボソームタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの追加のｄｓＲＮＡ領域を含み、前記ｄｓＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、昆虫及び／又はクモ種由来のさらなる遺伝子のヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２６】
少なくとも１つの追加の機能的配列と、場合によってはリンカーとをさらに含む、請求項２〜６又は２５のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記追加の機能的配列が、（ｉ）前記ＲＮＡ構築物の大規模産生を容易にする配列と、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡの安定性を増加又は減少させる配列と、（ｉｉｉ）タンパク質又は他の分子を結合させて、昆虫及び／若しくはクモによる前記ＲＮＡ構築物の取り込みを容易にする配列と、（ｉｖ）昆虫の腸内で受容体又は分子に結合し、前記昆虫及び／又はクモによる取り込み、エンドサイトーシス、及び／又はトランスサイトーシスを容易にするアプタマーである配列とを含む群から選択される、請求項２６に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記リンカーが、条件的に自己開裂するＲＮＡ配列であり、好ましくはｐＨ感受性リンカー又は疎水性感受性リンカーである、請求項２６又は２７に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項２９】
前記リンカーがイントロンである、請求項２６又は２７に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３０】
前記ヌクレオチド配列の相補性が、（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫及び／若しくはクモ種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子と少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有し、前記配列同一性の率が同一の長さにわたり計算される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３１】
（ｉ）請求項１又は請求項２に記載の核酸分子のヌクレオチド配列の部分と、或いは（ｉｉ）配列番号４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれか１つに示すヌクレオチド配列又は昆虫種由来のそのオーソロガスなヌクレオチド配列を含む核酸分子及び／又はクモと相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１方の鎖が、哺乳動物種由来の対応するヌクレオチド配列と２４個の隣接するヌクレオチドにわたり１２．５％未満の配列同一性を有する、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３２】
少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含む、請求項３〜６又は２５〜２８のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３３】
前記哺乳動物種がヒトである、請求項３１又は３２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３４】
少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物であって、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含むＲＮＡ構築物。
【請求項３５】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物をコードしている領域を含むＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
請求項３５に記載のＤＮＡ構築物を含む発現構築物。
【請求項３７】
請求項２５〜３４のいずれかに記載のＲＮＡ構築物、請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項３６に記載の発現構築物を含む宿主細胞。
【請求項３８】
細菌細胞である、請求項１０又は３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
不活性化細菌細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
請求項２〜６又は２５〜３４のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を作製する方法であって、請求項７又は３５に記載のＤＮＡ構築物を転写させて前記ＲＮＡ構築物を産生させる条件下で、ａ．前記ＤＮＡ構築物又は請求項８、９、若しくは３６のいずれかに記載の発現構築物を無細胞成分と接触させるステップ、又はｂ．前記ＤＮＡ構築物又は請求項８、９、若しくは３６のいずれかに記載の発現構築物を細胞に適用するステップを含む方法。
【請求項４１】
前記細胞が細菌細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞を適切な担体と一緒に含む害虫防除組成物。
【請求項４３】
昆虫及び／又はクモよる摂食に適した形態である、請求項１０、１１、又は４３のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
ペレット若しくは粉末などの固体形態、液体形態、又はゲル形態である、請求項４２又は４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ベイト剤の形態である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ベイト剤が、タンパク質性食物などの少なくとも１つの食品、又はホウ酸及び／若しくは誘引剤、例えばフェロモンをさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
昆虫及び／又はクモが前記組成物を摂食するために進入することができるハウジング又はトラップに用意されている、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
スプレー、好ましくは加圧／エーロゾル化スプレー又はポンプスプレーの形態である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
昆虫及び／又はクモが接触すると、前記昆虫及び／又はクモに接着する、適切な表面上のコーティングの形態である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記担体が、静電荷電した粉末若しくは粒子及び／又は磁気粒子、好ましくは最初帯磁していないが、前記昆虫及び／又はクモの体がもたらす電界にさらされると磁気的に分極することができ、前記昆虫及び／又はクモのクチクラに接着する金属粒子を含む、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記担体が、前記害虫への前記二本鎖ＲＮＡの取り込みを増大させる、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記担体が、好ましくは水中油型エマルジョン、コレステロール、ミセル、リポポリアミン、及びリポソームのうち１つ又は複数を含む脂質系担体である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記担体が、ヌクレオチド凝縮剤、好ましくはスペルミジン又は硫酸プロタミンを含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
さらなる害虫防除剤と組み合わせた、請求項１１、１２、又は４２〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
請求項４２〜４６又は５４のいずれか一項に記載の組成物を含む、昆虫及び／又はクモ用のハウジング又はトラップ。
【請求項５６】
ＲＮＡ干渉により昆虫及び／又はクモを防除するための、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項５５に記載のハウジング若しくはトラップの使用。
【請求項５７】
前記昆虫及び／又はクモが、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモ、好ましくはハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミを含む、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記昆虫及び／又はクモが、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばＩａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）を含み、最も好ましくはチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）を含む、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記昆虫及び／又はクモが、成長が遅延するか、麻痺するか、生殖不能になるか、又は死滅する、請求項１４、１８、又は５６〜５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
昆虫及び／又はクモを防除する方法であって、昆虫及び／又はクモに、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを適用することを含み、前記二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉により少なくとも１つの昆虫及び／又はクモ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる方法。
【請求項６１】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが適用される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記害虫が抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップが連続的に適用される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記昆虫及び／又はクモが、屋内昆虫、外部寄生虫、並びに公衆の保健衛生に関連する昆虫及び／又はクモ、好ましくはハエ、ハダニ、アザミウマ、ダニ、赤色ニワトリダニ、アリ、ゴキブリ、シロアリ、イエコオロギを含むコオロギ、シミ、チャタテムシ、コウチュウ、ハサミムシ、カ、及びノミを含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記昆虫及び／又はクモが、非限定的にチャバネゴキブリ種（例えばＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ））、ワモンゴキブリ種（例えばＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ）及びＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ（コワモンゴキブリ））、トウヨウゴキブリ種（例えばＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（トウヨウゴキブリ））、及びスペラ種（例えばＳｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ（チャオビゴキブリ）などのゴキブリ（ゴキブリ亜目）；非限定的にトフシアリ種（例えばＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ））、ヒメアリ種（例えばＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ））、オオアリ種（例えばオオアリ種（カーペンターアント））、ケアリ種（例えばｌａｓｉｕｓ ｎｉｇｅｒ（トビイロケアリ））、シワアリ種（例えばＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ））、クシケアリ種（例えばＭｙｒｍｉｃａ ｒｕｂｒａ（キイロクシケアリ））、ヤマアリ種（ウッドアント）、シリアゲアリ種（例えばクレマトガスタ−リネオラタ（アクロバットアント））、イリドミルメクス種（例えばＩｒｉｄｏｍｙｒｍｅｘ ｈｕｍｉｌｉｓ（アルゼンチンアリ））、オオズアリ種（オオズアリ）、及びダシムチラ種（例えばＤａｓｙｍｕｔｉｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（アリガタバチ））などのアリ（アリ上科）；非限定的にアミテルメス種（例えばアミテルメス−フロリデンシス（フロリダダークウィングドサブテラネアンテルマイト））、レティキュリテルメス種（例えばレティキュリテルメス−フラビペス（イースタンサブテラネアンテルマイト）、レティキュリテルメス−ヘスペルス（ウエスタンサブテラネアンテルマイト））、イエシロアリ種（例えばＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（イエシロアリ））、インシシテルメス種（例えばＩｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｍｉｎｏｒ（アメリカカンザイシロアリ））、及びネオテルメス種（例えばネオテルメス−コネキサス（フォレストツリーテルマイト））などのシロアリ（シロアリ目及び／又はシロアリ科）を含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記昆虫及び／又はクモが、成長が遅延するか、麻痺するか、生殖不能になるか、又は死滅する、請求項１５〜１６又は６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物、及び／又は請求項１３に記載のハウジング若しくはトラップを使用説明書と一緒に備え、前記二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができるキット。
【請求項６７】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物を備え、各二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉により少なくとも１つの害虫遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができる、請求項６４に記載のキット。
【請求項６８】
前記害虫が抵抗性を獲得する確率を減らすために、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の複数のＲＮＡ構築物、及び／又は請求項３５に記載のＤＮＡ構築物、及び／又は請求項３６に記載の発現構築物、及び／又は請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞、及び／又は請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の組成物が連続的に使用される、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
ゴキブリ害虫を防除する方法であって、ゴキブリに少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ領域を含むＲＮＡ構築物を適用するステップを含み、前記二本鎖ＲＮＡ領域の少なくとも１方の鎖が、トロポミオシン、ＨＭＧコエンザイムＡシンターゼ遺伝子、又はアクチン５Ｃ遺伝子をコードしているヌクレオチド配列の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの二本鎖領域の少なくとも１方の鎖が、配列番号１、４、６、７、９、１０、６５から７０、７１から７９、１１、１６、１７、１９、２０、８０から８７、２１、２６、２７、２９、３０、８８から９３、３１、３６、３７、３９、４０、９４から１０８、１８０、１８１、４１、４３、４４、４７、４８、１０９から１４７、１８２から１８７、４９、５１、５２、５５、５６、１４８から１５０、５７、６３、６４、１５１から１７９、及び１８８から２００のいずれかに示すヌクレオチド配列又はその相補体を含む任意の核酸分子の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１個、又はそれを超えるヌクレオチドを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ゴキブリ害虫が、チャバネゴキブリ属、ワモンゴキブリ属、トウヨウゴキブリ属、及びスペラ属を含む属の群に属する種から選択される、請求項２３、２４、６９、又は７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記ゴキブリ害虫が、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、及びコワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｕｓｔｒａｌｉａｓｉａｅ）、トウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、及びチャオビゴキブリ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）を含む群から選択される、請求項２３、２４、又は６９〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むタンパク質、又はさらなる昆虫及び／若しくはクモ種由来の保存されたアミノ酸配列を有するオーソロガスなタンパク質。
【請求項７４】
オーソログが、配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに示すアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項７３に記載のタンパク質。
【請求項７５】
請求項２〜６又は２５〜３４のいずれかのＲＮＡ構築物を作製する方法であって、前記ＲＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で、請求項１０又は３７〜３９のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項７６】
前記ＲＮＡ構築物の精製をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図５Ｊ】
【図５Ｋ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図５Ｊ】
【図５Ｋ】
【公開番号】特開２０１３−１３４０８（Ｐ２０１３−１３４０８Ａ）
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６４０６４（Ｐ２０１２−１６４０６４）
【出願日】平成２４年７月２４日（２０１２．７．２４）
【分割の表示】特願２００８−５１４２３１（Ｐ２００８−５１４２３１）の分割
【原出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（５００５６３３７１）デフヘン・ナムローゼ・フェンノートシャップ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＶＧＥＮ ｎｖ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月２４日（２０１２．７．２４）
【分割の表示】特願２００８−５１４２３１（Ｐ２００８−５１４２３１）の分割
【原出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（５００５６３３７１）デフヘン・ナムローゼ・フェンノートシャップ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＶＧＥＮ ｎｖ
【Ｆターム（参考）】
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