本発明は、増大した折り畳み安定性を有する変異体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を提供する。複数のこれらポリペプチドを含むライブラリーもまた提供される。加えて、これらのポリペプチド及びライブラリーを作製し使用する組成物及び方法が提供される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体可変ドメインが天然に生じる抗体可変ドメインと比較して一又は複数のアミノ酸変異を含み、該一又は複数のアミノ酸変異が抗体可変ドメインの安定性を増大させる単離抗体可変ドメイン。
【請求項２】
抗体可変ドメインが重鎖抗体可変ドメインである請求項１に記載の抗体可変ドメイン。
【請求項３】
単離重鎖抗体可変ドメインがＶＨ３サブグループのものである請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４】
単離重鎖抗体可変ドメインの増大した安定性が、単離重鎖抗体可変ドメインの凝集の減少によって測定される請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５】
単離重鎖抗体可変ドメインの増大した安定性が、単離重鎖抗体可変ドメインのＴ_ｍの増加によって測定される請求項２に記載の単離された重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項６】
該一又は複数のアミノ酸変異が、軽鎖可変ドメインとの相互作用の原因である単離重鎖抗体可変ドメイン部分の親水性を増大させる請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項７】
該一又は複数のアミノ酸変異が、アミノ酸位置３５、３７、４５、４７、及び９３−１０２の変異から選択される請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項８】
アミノ酸位置３５がアラニンであり、アミノ酸位置４５がバリンであり、アミノ酸位置４７がメチオニンであり、アミノ酸位置９３がスレオニンであり、アミノ酸位置９４がセリンであり、アミノ酸位置９５がリジンであり、アミノ酸残基９６がリジンであり、アミノ酸残基９７がリジンであり、アミノ酸残基９８がセリンであり、アミノ酸位置９９がセリンであり、アミノ酸位置１００がプロリンであり、アミノ酸位置１００ａがイソロイシンである請求項７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項９】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号２８及び５４を含むアミノ酸配列を有している請求項８に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１０】
アミノ酸位置３５がグリシンであり、アミノ酸位置４５がチロシンであり、アミノ酸位置９３がアルギニンであり、アミノ酸位置９４がスレオニンであり、アミノ酸位置９５がフェニルアラニンであり、アミノ酸位置９６がスレオニンであり、アミノ酸位置９７がスレオニンであり、アミノ酸位置９８がアスパラギンであり、アミノ酸位置９９がセリンであり、アミノ酸位置１００がリジンであり、アミノ酸位置１００ａがリジンである請求項９に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１１】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号２６及び５２を含むアミノ酸配列を有している請求項１０に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１２】
アミノ酸位置３５がセリンであり、アミノ酸位置３７がアラニンであり、アミノ酸位置４５がメチオニンであり、アミノ酸位置４７がセリンであり、アミノ酸位置９３がバリンであり、アミノ酸位置９４がスレオニンであり、アミノ酸位置９５がグリシンであり、アミノ酸位置９６がアスパラギンであり、アミノ酸位置９７アルギニンであり、アミノ酸位置９８がスレオニンであり、アミノ酸位置９９がロイシンであり、アミノ酸位置１００がリジンであり、アミノ酸位置１００ａがリジンである請求項７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１３】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号３１及び５７を含むアミノ酸配列を有している請求項１２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１４】
アミノ酸位置３５がセリンであり、アミノ酸位置４５がアルギニンであり、アミノ酸位置４７がグルタミン酸であり、アミノ酸位置９３がイソロイシンであり、アミノ酸位置９５がリジンであり、アミノ酸位置９６がロイシンであり、アミノ酸位置９７がスレオニンであり、アミノ酸位置９８がアスパラギンであり、アミノ酸位置９９がアルギニンであり、アミノ酸位置１００がセリンであり、アミノ酸位置１００ａがアルギニンである請求項７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１５】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号３９及び６５を含むアミノ酸配列を有している請求項１４に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１６】
アミノ酸位置３５のアミノ酸が小アミノ酸である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１７】
小アミノ酸がグリシン、アラニン、及びセリンから選択される請求項１６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１８】
アミノ酸位置３７のアミノ酸が疎水性アミノ酸である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項１９】
疎水性アミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン、及びチロシンから選択される請求項１８に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２０】
アミノ酸位置４５のアミノ酸が疎水性アミノ酸である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２１】
疎水性アミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン、及びチロシンから選択される請求項２０に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２２】
アミノ酸位置３５がグリシン及びアラニンから選択され、アミノ酸位置４７がトリプトファン及びメチオニンから選択される請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２３】
アミノ酸位置３５がセリンであり、アミノ酸位置４７がフェニルアラニン及びグルタミン酸から選択される請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２４】
該一又は複数のアミノ酸変異がアミノ酸位置３５、３７、３９、４４、４５、４７、５０、９１、９３−１００ｂ、１０３、及び１０５の変異から選択される請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２５】
アミノ酸位置３５がグリシンであり、アミノ酸位置３９がアルギニンであり、アミノ酸位置４５がグルタミン酸であり、アミノ酸位置５０がセリンであり、アミノ酸位置９３がアルギニンであり、アミノ酸位置９４がセリンであり、アミノ酸位置９５がロイシンであり、アミノ酸位置９６がスレオニンであり、アミノ酸位置９７がスレオニンであり、アミノ酸位置９９がセリンであり、アミノ酸位置１００がリジンであり、アミノ酸位置１００ａがスレオニンでありアミノ酸位置１０３がアルギニンである請求項２４に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２６】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号１３９及び２１５を含むアミノ酸配列を有している請求項２５に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２７】
アミノ酸位置３９、４５、及び５０の何れかのアミノ酸が親水性アミノ酸である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２８】
アミノ酸位置３９、４５、及び５０のアミノ酸の各々が親水性アミノ酸である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項２９】
アミノ酸位置３９がアルギニンであり、アミノ酸位置４５がグルタミン酸であり、アミノ酸位置５０がセリンである請求項２８に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３０】
アミノ酸位置３９、４５、及び５０のアミノ酸の各々が親水性アミノ酸である請求項２２又は２３に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３１】
アミノ酸位置３９がアルギニンであり、アミノ酸位置４５がグルタミン酸であり、アミノ酸位置５０がセリンである請求項２２又は２３に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３２】
アミノ酸位置３７、４４、及び９１が野生型である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３３】
単離重鎖抗体可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ３の各アミノ酸位置の置換に許容性である請求項６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３４】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号２６を含むアミノ酸配列を有している請求項３３に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３５】
単離重鎖抗体可変ドメインが配列番号１３９を含むアミノ酸配列を有している請求項３３に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３６】
該一又は複数のアミノ酸変異がアミノ酸位置３５、３７、３９、４４、４５、４７、５０、及び９１の変異から選択される請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３７】
アミノ酸位置３５のアミノ酸がグリシン、アラニン、セリン、及びグルタミン酸から選択され；アミノ酸位置３９のアミノ酸がグルタミン酸であり；アミノ酸位置５０のアミノ酸がグリシン及びアルギニンから選択され、アミノ酸位置３７、４４、４７、及び９１のアミノ酸が野生型である請求項３６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３８】
アミノ酸位置３５のアミノ酸がグリシンであり、アミノ酸位置３７のアミノ酸が疎水性アミノ酸であり；アミノ酸位置３９のアミノ酸がアルギニンであり；アミノ酸位置４４のアミノ酸が小アミノ酸であり；アミノ酸位置４５のアミノ酸がグルタミン酸であり；アミノ酸位置４７のアミノ酸がロイシン、バリン、及びアラニンから選択され；アミノ酸位置５０のアミノ酸がセリン及びアルギニンから選択され；アミノ酸位置９１のアミノ酸が疎水性アミノ酸である請求項３６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項３９】
配列番号２６を含むアミノ酸を有する請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４０】
配列番号１３９を含むアミノ酸を有する請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４１】
アミノ酸位置３５に変異を更に含む請求項４０に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４２】
アミノ酸位置３５のアミノ酸がグリシン、セリン及びアスパラギン酸から選択される請求項４１に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４３】
アミノ酸位置３９に変異を更に含む請求項４０に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４４】
アミノ酸位置３９のアミノ酸がアスパラギン酸である請求項４３に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４５】
アミノ酸位置４７に変異を更に含む請求項４０に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４６】
アミノ酸位置４７のアミノ酸がアラニン、グルタミン酸、ロイシン、スレオニン、及びバリンから選択される請求項４５に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４７】
アミノ酸位置４７と別のアミノ酸位置に変異を更に含む請求項４０に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４８】
アミノ酸位置４７のアミノ酸がグルタミン酸であり、アミノ酸位置３５のアミノ酸がセリンである請求項４７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項４９】
アミノ酸位置４７のアミノ酸がロイシンであり、アミノ酸位置３７のアミノ酸がセリン及びスレオニンから選択される請求項４７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５０】
アミノ酸位置４７のアミノ酸がロイシンであり、アミノ酸位置３９のアミノ酸がセリン、スレオニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から選択される請求項４７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５１】
アミノ酸位置３７のアミノ酸がロイシンであり、アミノ酸位置４５のアミノ酸がセリン、スレオニン、及びヒスチジンから選択される請求項４７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５２】
アミノ酸位置３７のアミノ酸がロイシンであり、アミノ酸位置１０３のアミノ酸がセリン及びスレオニンから選択される請求項４７に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５３】
アミノ酸位置３５のアミノ酸がグリシンであり；アミノ酸位置３９のアミノ酸がアルギニンであり；アミノ酸位置４５のアミノ酸がグルタミン酸であり；アミノ酸位置４７のアミノ酸がロイシンであり；アミノ酸位置５０のアミノ酸がセリンである請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５４】
アミノ酸位置３７にセリンを更に含む請求項５３に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５５】
アミノ酸位置３５のアミノ酸がグリシンであり；アミノ酸位置３９のアミノ酸がアルギニンであり；アミノ酸位置４５のアミノ酸がグルタミン酸であり；アミノ酸位置４７のアミノ酸がロイシンであり；アミノ酸位置５０のアミノ酸がアルギニンである請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５６】
アミノ酸位置３７のアミノ酸がセリンであり；アミノ酸位置４７のアミノ酸がロイシンであり；アミノ酸位置５０のアミノ酸がアルギニンであり；アミノ酸位置１０３のアミノ酸がセリン及びアルギニンから選択される請求項２に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５７】
アミノ酸位置１０３のアミノ酸がセリンである請求項５６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５８】
アミノ酸位置１０３のアミノ酸がアルギニンである請求項５６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項５９】
アミノ酸位置３５、３９、又は４５に一又は複数の変異を更に含む請求項５６から５８の何れか一項に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項６０】
アミノ酸位置３５のアミノ酸がグリシンであり、アミノ酸位置３９のアミノ酸がアルギニンであり、アミノ酸位置４５のアミノ酸がグルタミン酸である請求項５９に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項６１】
請求項１から６０の単離重鎖抗体可変ドメインの何れかをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項６０に記載のポリヌクレオチドを含む複製可能な発現ベクター。
【請求項６３】
請求項６２に記載の複製可能な発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
複数のベクターが複数の抗体可変ドメインをコードする請求項６３に記載のベクターライブラリー。
【請求項６５】
少なくとも一の単離重鎖抗体可変ドメインを含み、該少なくとも一の単離重鎖抗体可変ドメインが請求項１から６０の何れか一項に記載の抗体可変ドメインから選択される組成物。
【請求項６６】
単離重鎖抗体可変ドメインが請求項１から６０の何れか一項に記載の抗体可変ドメインから選択される、複数の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項６７】
各単離重鎖抗体可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一の相補性決定領域（ＣＤＲ）に一又は複数のアミノ酸を含む請求項６６に記載の単離重鎖抗体可変ドメイン。
【請求項６８】
複数の単離重鎖抗体可変ドメインを生成させる方法であって、野生型重鎖抗体可変ドメインと比較して重鎖抗体可変ドメインの一又は複数のフレームワーク領域を変異させることを含み、該一又は複数のアミノ酸変異が単離重鎖抗体可変ドメインの安定性を増大させる方法。
【請求項６９】
単離重鎖抗体可変ドメインの安定性を増大させる方法であって、野生型重鎖抗体可変ドメインと比較して単離重鎖抗体可変ドメインの一又は複数のフレームワークアミノ酸を変異させることを含み、該一又は複数のフレームワークアミノ酸変異が単離重鎖抗体可変ドメインの安定性を増大させる方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１８】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２５Ｃ】

【図２５Ｄ】

【図２５Ｅ】

【図２５Ｆ】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２６Ｄ】

【図２６Ｅ】

【図２６Ｆ】

【図２６Ｇ】

【図２６Ｈ】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２７Ｄ】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２８Ｃ】

【図２９Ａ】

【図２９Ｂ】

【図２９Ｃ】

【図３０Ａ】

【図３０Ｂ】

【図３０Ｃ】

【公表番号】特表２００９−５３６５２７（Ｐ２００９−５３６５２７Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１０１４５（Ｐ２００９−５１０１４５）
【出願日】平成１９年５月８日（２００７．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８４６９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３４０５０
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】