核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置
【課題】トンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析において、高い識別能で核酸の塩基配列を高精度に読み取ることが可能な核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を提供する。
【解決手段】電流測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスにおいて、トンネル電流方式固体ナノポアの電極表面に核酸塩基分子や有機化合物等を化学修飾することにより、核酸を構成する４種の塩基のうち少なくとも１種に対する識別能を向上させることを特徴とする。
【解決手段】電流測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスにおいて、トンネル電流方式固体ナノポアの電極表面に核酸塩基分子や有機化合物等を化学修飾することにより、核酸を構成する４種の塩基のうち少なくとも１種に対する識別能を向上させることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノサイズのポアが設けられた薄膜によりＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の配列解析等を行うデバイス及び分析装置に関する。特にポアに化学修飾分子付電極を有するナノポアを用いた核酸分析デバイス及びそれを用いた分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
次々世代ＤＮＡシーケンサを実現するアプローチとしてナノポアを用いる方式が注目を集めている。ＤＮＡを標識することなく、換言すると酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることがナノポア方式の大きな特長と考えられている。ナノポアはその形成法により大別して２種類に分類される。その一つはナノサイズの孔（以下「ナノポア」という）を形成するチャンネルタンパク質を２分子膜に埋設したいわゆるバイオナノポアであり、もう一つは半導体材料に微細加工を施してナノポアを形成するいわゆる固体ナノポアである。
【０００３】
また、このようなナノポアを用いるＤＮＡの解析法として、現在２種類の方法が提案されている。第１の手法は、封鎖電流方式である。すなわち、ナノポアが形成された薄膜の両側に液槽を設け、それぞれの液槽に電解質溶液と電極を設け、電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。イオン電流の大きさは一次近似としてナノポアの断面積に比例する。ＤＮＡがナノポアを通過すると、ＤＮＡがナノポアを封鎖し、有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この減少量を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、ＤＮＡの１本鎖と２本鎖との差異が識別できる。またバイオポアの一形態において、封鎖電流の大きさからＤＮＡの塩基の種類が判別可能と報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
ただし、バイオポアに用いる２分子膜は有機低分子が弱い力で集合して形成される繊細な薄膜であり、機械的な安定性に課題があると考えられる。またチャンネルタンパク質が２分子膜へ組み込まれる工程が自然現象に依存するため、チャンネルの数の制御や再現性に課題がある。一方、固体ナノポアは薄膜として半導体基板などを用いるため、バイオポアより構造の安定性の点で有利と考えられる。またナノポアを機械的に形成するため、工業的な生産が可能という利点もある。また薄膜材料として半導体基板以外にもグラフェン（Ｇｒａｐｈｅｎｅ）を利用してそれに設けた固体ナノポアを通過する生体分子を分析する装置及び方法も報告されている（特許文献１）。しかし固体ナノポアにおいては、封鎖電流によるＤＮＡ鎖の４種類の塩基識別は報告されていない。
【０００５】
第２の手法は、トンネル電流方式である。すなわち、ナノポアに面して電極対を対向して設け、電極間に電圧をかけることにより、ナノポアを通過するＤＮＡと電極間のトンネル電流を測定し、トンネル電流の大きさからＤＮＡを解析する方式が提案されている（特許文献２）。理論研究より、トンネル電流の大きさから統計的に塩基識別ができるという報告があるものの（非特許文献２）、実験的にＤＮＡ鎖の４種類の塩基を識別した報告はない。
【０００６】
以上のように、次々世代ＤＮＡシーケンサとして、ナノポア方式が期待されており、工業的生産性の観点では半導体材料に微細加工を施して形成できる固体ナノポアが有望であるものの、封鎖電流方式およびトンネル電流方式の何れの方式においても４種の塩基識別は実現されていない。
【０００７】
トンネル電流方式の関連技術として、走査プローブ顕微鏡を用い、プローブ先端と基板表面の両方に４−メルカプト安息香酸を修飾することによって複数種のＤＮＡヌクレオシドに対する識別能が向上するとの報告がある（非特許文献３）。また、走査プローブ顕微鏡のプローブ先端に核酸塩基分子を修飾することにより相補的な核酸塩基に対する識別能が向上すると報告されている（非特許文献４）。ＤＮＡの場合、アデニン（以下、Ａと表記）とチミン（以下、Ｔと表記）、シトシン（以下、Ｃと表記）とグアニン（以下、Ｇと表記）が相補的な核酸塩基となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／０３５６４７号
【特許文献２】米国特許ＵＳ６６２７０６７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Clarke，J．et al．，Nat． Nanotech．（2009年）第4巻第265−270頁
【非特許文献２】Lagerqvist，J．et al．， Nano Lett．（2006年）第6巻第779−782頁
【非特許文献３】Chang，S．et al．，Nano Lett．（2010年）第10巻第1070−1075頁
【非特許文献４】Ohshiro，T．et al．，PNAS （2006年）第103巻第10−14頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
固体ナノポアを用いて、トンネル電流方式により核酸塩基を解析する方法は、塩基識別を実現できる可能性は示唆されているものの（非特許文献２、非特許文献３）、従来の方法（特許文献２）では、塩基の識別能が低く、核酸の塩基配列を高精度に読み取ることが困難である。
【００１１】
そこで、本発明の課題は、固体ナノポアを用いたトンネル電流方式による核酸塩基の解析方法において、高い識別能で核酸の塩基配列を高精度に読み取ることが可能な核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を提供することである。
【００１２】
併せて、本解析方法により、酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることから、低コストに解析でき、更に、試薬に制限されていた読出し塩基長が長くなるため、従来よりも高スループットな解析技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本願発明の核酸分析デバイスの主な特徴は、以下の通りである。
【００１４】
（１）電流測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、固体基板と、固体基板を貫通して設けられ試料が通過するナノポアと、固体基板に配置され、それぞれの一端面がナノポアに面して設けられた少なくとも２つの電極とを備え、少なくとも１つの電極のナノポアに面する一端面には、核酸を構成する４種の塩基のうち少なくとも１種に対する識別能を向上させるための化学修飾分子が付与され、ナノポアに試料を進入させながら、少なくとも２つの電極間に電圧を印加して進入した試料中の核酸を構成する塩基に電流を流すことにより、核酸の分析を行うことを特徴とする。
【００１５】
また、本願発明の核酸分析装置の主な特徴は、以下の通りである。
【００１６】
（２）上記（１）に記載の核酸分析デバイスを有し、分析対象とする核酸を含有する試料溶液を導入する導入口と該試料溶液を排出する排出口を具備してなる第１の溶液槽と、溶液を導入する導入口と該溶液を排出する排出口を具備してなる第２の溶液槽と、第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に配置された核酸分析デバイスを有するナノポアを通じて、核酸を第１の溶液槽から第２の溶液槽へ移動させる核酸駆動手段と、第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に電圧を印加する第１電圧源と、ナノポアを介して第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に流れる電流を検出する第１電流計と、核酸分析デバイスに設けられた電極間に電圧を印加する第２電圧源と、核酸分析デバイスに設けられた電極間に流れる電流を検出する第２電流計と、少なくとも核酸駆動手段を制御する制御手段と、少なくとも第１および第２電流計で検出されたデータを取得して処理するデータ処理手段とを備え、 前記第２電圧源を用いて、ナノポアに進入した試料溶液中の核酸を構成する塩基に電流を流し、第２電流計を用いてその電流を計測することにより試料溶液中の核酸を分析することを特徴とする。
【００１７】
すなわち、本願発明の特徴は、トンネル電流方式固体ナノポアの電極表面に核酸塩基分子や有機化合物等を化学修飾することにより、特定または複数の核酸塩基に対する識別能を上げることにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、固体ナノポアを用いたトンネル電流方式による核酸塩基の解析方法において、塩基識別能が高く、塩基配列を高精度に読み取ることが可能な核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を提供できる。
【００１９】
また、酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることから、低コストに解析でき、更に、試薬に制限されていた読出し塩基長が長くなるため、従来よりも高スループットな解析技術を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】第１の実施例に係わる、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアの構造の概略図である。
【図１Ｂ】第１の実施例に係わる、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアの構造（化学修飾分子付与の場合）の概略図である。
【図２】第２の実施例に係わる、同一平面上に３〜６つの化学修飾分子付電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアの構造の概略図である。
【図３】第３の実施例に係わる、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極のみに化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ａ】第４の実施例に係わる、同一平面上に３つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ｂ】第４の実施例に係わる、同一平面上に４つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ｃ】第４の実施例に係わる、同一平面上に５つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ｄ】第４の実施例に係わる、同一平面上に６つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図５】第５の実施例に係わる、８つの化学修飾分子付電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、同一平面状の電極数が２つ、電極の層を４層である構造の概略図である。
【図６Ａ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｂ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｃ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｄ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｅ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｆ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｇ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｈ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｉ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｊ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ａ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｂ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｃ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｄ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｅ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｆ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｇ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｈ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｉ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｊ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｋ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図８】第８の実施例に係わる、２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一構成の概略図である。
【図９】第８の実施例に係わる、ＤＮＡ鎖がナノポアを通過時に計測されるトンネル電流値の時間変化のグラフである。
【図１０】第９の実施例に係わる、４つの電極対を有するトンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一構成の概略図である。
【図１１】第９の実施例に係わる、ＤＮＡ鎖が４つの電極対を有するナノポアを通過時に計測される４つのトンネル電流値の時間変化のグラフである。
【図１２】第１０の実施例に係わる、５つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析デバイスにおいて、電極の１つを共通電極とし、４つの電極対を構成した一例を説明する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
まず、以下に実施の形態を述べる。
本発明はトンネル電流方式固体ナノポアを用いて核酸塩基を解析するためのデバイス及びそのデバイスを用いた装置に関する。従って、本発明に係る核酸分析デバイスは、固体基板と、前記固体基板に設けられた少なくとも１つのポアと、前記個体基板に配置された少なくとも２つの電極を備える。
【００２２】
固体基板は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料含む）から形成することができる。電気的絶縁体材料の例としては、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレンが挙げられる。固体基板のサイズ及び厚さは、ナノポアを設けることができるものであれば特に限定されるものではない。固体基板は、当技術分野で公知の方法で作製することができ、あるいは市販品として入手することも可能である。例えば、固体基板は、リソグラフィ及びエッチング、レーザーアブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、蒸着、化学気相成長（ＣＶＤ）、電子ビーム若しくは収束イオンビームなどの技術を用いて作製することができる。固体基板は、表面への他の分子の吸着を避けるために、コーティングされていても良い。
【００２３】
固体基板は、ナノポアを設けるための薄膜部分を有することが好ましい。即ち、ナノポアを形成するのに適した材料及び厚さの薄膜部分を固体基板に設けることによって、ナノポアを簡便かつ効率的に固体基板上に形成することができる。そのような薄膜部分は、固体基板と同じ材料であっても良いし、或いは別の電気的絶縁体材料から形成されても良い。ナノポア形成の点から、薄膜部分の材料は、例えばシリコン、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸窒化シリコン（ＳｉＯＮ）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが好ましい。また薄膜部分は、単層であっても複層であっても良く、複層である場合には、後述する電極が薄膜部分の層に挟まれて配置されても良い。固体基板の薄膜部分の厚さは、５ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５０ｎｍである。薄膜部分は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（ＬＰＣＶＤ）により、固体基板上に形成することができる。
【００２４】
固体基板には、少なくとも１つのナノポアが設けられる。本発明において「ナノポア」とは、ナノメートル（ｎｍ）サイズの孔であり、固体基板、好ましくは固体基板の薄膜部分の表裏を貫通する孔である。
【００２５】
また、本発明において「開口」とは、ナノポア形成のために個体基板、または固体基板薄膜部分に開けられた貫通孔であって、当該孔の基板表面側および裏面側に表出している部分を指すものとする。上記開口の形状は、ナノポアが有する側壁と個体基板もしくは固体基板薄膜部分の表面、あるいは裏面とが交差して形成される輪郭形状をなすものとする。
核酸の特性解析時に、試料溶液中の核酸塩基やイオンなどは一方の開口からナノポアに進入し、同じ又は反対側の開口からナノポア外に出る。
【００２６】
ナノポアのサイズ（即ち、開口のサイズである。ただし、後述するように化学修飾分子を有する電極を用いた場合には、実効ナノポアのサイズとは異なる場合がある。）は、解析対象の種類によって適切なサイズを選択することができる。ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の直径は約１．５ｎｍであり、ｓｓＤＮＡを解析するためのナノポア径の適切な範囲は１．５ｎｍ〜１０ｎｍ程度、好ましくは１．５ｎｍ〜２．５ｎｍ程度である。ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の直径は２．６ｎｍであり、ｄｓＤＮＡを解析するためのナノポアの径の適切な範囲は３ｎｍ〜１０ｎｍ程度、好ましくは３ｎｍ〜５ｎｍ程度である。ナノポアの深さは、固体基板又は固体基板の薄膜部分の厚さを調整することにより変えることができる。
【００２７】
ナノポアの深さは、核酸塩基を構成するモノマー単位の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上の大きさとする。例えば、核酸塩基３個以上の大きさとした場合は、約１ｎｍ以上となる。これにより、核酸塩基の形状と移動速度を制御しながらナノポアに進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。
【００２８】
またナノポアの形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
【００２９】
ナノポアは、固体基板に少なくとも１つ設けることができ、複数のナノポアを設ける場合には、規則的に配列することが好ましい。ナノポアは、当技術分野での公知の方法により、例えば電子ビームやイオンビームを照射することにより、リソグラフィ技術などを使用することにより、固体基板に形成することができる。
【００３０】
固体基板には、少なくとも２つの電極が配置される。材料としては、例えば金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、銅、鉄、アルミ、チタン、ニッケル、タンタル、タングステン、コバルト、クロム、モリブデン、ニオブなどの金属や、窒化チタン、窒化タンタル、窒化タングステン、窒化ニオブ、窒化クロムなどの金属窒化物やタングステンシリサイド、チタンシリサイド、コバルトシリサイド、ニッケルシリサイドなどのシリサイドや、グラファイトやグラフェン、カーボンナノチューブなどのカーボン材料、シリコンやゲルマニウムなどの半導体、上記の混合物などが挙げられる。
【００３１】
電極はナノポアに面して設けられており、鋭角の端部を有して、端部をナノポアに面することが望ましい。その端部の角度は１０〜８０度、好ましくは１０〜４５度とする。なお、電極端部の頂点部分は厳密な意味での点でなくともよく、好ましくは１．５ｎｍ〜５ｎｍ以下、より好ましくは１．５ｎｍ〜２．５ｎｍ程度の曲率半径を有する丸みを帯びた形状であってもよい。鋭角の端部以外の電極の形状や大きさは、特に制限されるものでなく、使用する固体基板及びナノポアの大きさ、使用する電源などに応じて適宜選択することができる。
【００３２】
鋭角の端部の電極の厚さは、採用する材料に応じて、０．１ｎｍ〜１０ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ〜５ｎｍとする。より好ましくは０．１ｎｍ〜２ｎｍとする。鋭角の端部の電極の厚さが小さいほど、トンネル電流の伝導する空間を限定することができ、高分解能での解析が可能となる。鋭角の端部以外の電極の厚さは、特に制限されるものでなく、電極材料の抵抗率などに応じて適宜選択することができる。
【００３３】
電極は、その端部がナノポアに面して配置されていることが好ましい。より具体的には、電極をナノポア中心軸に対して直交する面内に、かつ薄膜の端部をナノポアに面して配置する。電極の端部はナノポアに面して設けられている限り、固体基板や薄膜部分の表面上に配置されてもよいし、あるいは固体基板や薄膜部分の内部に配置されてもよい。例えば、固体基板や薄膜部分を電気的絶縁体とし、その内部に電極を配置し、断面を絶縁体−電極−絶縁体の積層構造としてもよいし、更に絶縁体−電極−絶縁体−・・・−電極−絶縁体−と電極の層を複数積層した構造としてもよい。
【００３４】
電極は１つのナノポアに対して２つ以上が配置されており、電極数が多いほど核酸塩基に対する識別能が向上する。配置された２つ以上の電極のうち、少なくとも１つには化学修飾分子を付与する。化学修飾分子を付与する電極を複数とする場合は、全て同じ化学修飾分子としても良いし、全て異なる化学修飾分子としても良い。所望の感度が得られるよう、化学修飾分子付電極の数と化学修飾分子の種類の数を適宜決定する。
【００３５】
電極は、当技術分野で公知の方法により作製し、固体基板や薄膜部分の表面や内部に配置することができる。例えば、薄膜部分内部にチタン電極を配置する場合は、薄膜上に所望の厚さのチタンをスパッタリングにより堆積させた後、リソグラフィとドライエッチングによりチタン膜を所望の形状にパターニングし、その上から薄膜材料を堆積することにより実現できる。
【００３６】
電極端部には化学修飾分子を付与し、特定または複数の核酸塩基に対する識別能を上げる。化学修飾分子の厚さは２ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ以下、より好ましくは０．５ｎｍ以下とする。例えば、Ａに対する識別能を上げるためにはＴを修飾した電極を用い、Ｃに対してはＧを修飾した電極を用い、Ｔに対してはＡを修飾した電極を用い、Ｇに対してはＣを修飾した電極を用い、ウラシルに対してはＡを修飾した電極を用いる。核酸分子以外の化学修飾分子としては、例えば４−メルカプト安息香酸のような有機化合物を用いても良い。電極への核酸分子や有機化合物の化学修飾分子は、電極材料と核酸分子や有機化合物の電気的性質や化学的性質を利用して行う。例えば、核酸塩基のチオール誘導体を用いることで、金電極に核酸分子の化学修飾を行うことができる。有機化合物の化学修飾は自己組織化単分子膜の形成プロセスにより行うことが望ましい。複数の電極に対して、異なる化学修飾分子を付与する場合は、電極への電圧印加や表面状態の違い等によって化学修飾される電極の選択性を変えたり、不要な化学修飾分子の付与された電極に電流を流して不要な化学修飾分子を除去したりするなどして行う。
【００３７】
従来構造のトンネル電流方式固体ナノポアの電極端部に化学修飾分子を付与した場合、実効的な電極間距離と実効的なナノポアの径および実効的なナノポアの面積が減少し、ＤＮＡが通過できなくなる恐れがある。詳細は実施例１にも示すが、例えば、２つの対向した電極を有する、ナノポア径と電極間距離とが２ｎｍと等しい１本鎖解析向け円形ナノポアの１つの電極先端に１ｎｍ厚の化学修飾分子を付与した場合、化学修飾部先端と対向する化学修飾分子の無い電極先端との間の距離は１ｎｍとなるため、１本鎖ＤＮＡが通過できない可能性が高い。また、通過できたとしても、電極間からずれた位置を通過した場合は感度が低下するため好ましくない。
【００３８】
そこで、化学修飾後の実効的なナノポアの大きさが解析対象の種類に応じて適切なサイズとなるように化学修飾前のナノポアの大きさや形状、電極間距離、薄膜部分や電極の構造を調整する。具体的には、例えば、化学修飾分子の厚み分ナノポア径と電極間距離を大きくしておくことが挙げられる。従来構造のトンネル電流方式固体ナノポアの場合、電極先端と開口の縁はほぼ一致しているため、電極先端の化学修飾分子は、その厚さ分だけ開口の縁から突き出すことになる。化学修飾部の機械的、化学的強度が低い場合、ナノポアに入ってくる試料や試料溶液が化学修飾部に衝突することによって機能の劣化や化学修飾分子の剥離が起こる可能性がある。これを避ける手段としては、例えば、ナノポア径は解析対象の種類に応じた適切なサイズとしておき、電極先端と開口の縁との間に化学修飾分子を付与できるように電極のみを化学修飾分子の厚さ分後退させることが挙げられる。
【００３９】
本発明の分析装置は、核酸の移動速度を制御する機構、即ち試料移動機構を備えることが好ましい。試料移動機構は、例えば電極間の電流計測に同期して、核酸の中のモノマーを１単位ずつ、分析デバイスのナノポア中に進入させる。そのような機構としては、例えば電気泳動により核酸を駆動する試料駆動装置（任意関数発生器、電極等）を使用することができる。このような試料移動機構によって、核酸中のモノマーが順次ナノポアに進入し、離脱するように核酸の移動を制御することができ、ここのモノマーに対応するトンネル電流を経時的に取得することができる。
【００４０】
また、核酸の移動速度を制御する方法として、核酸を含む試料溶液の粘性を高める方法がある。例えば分析デバイス周囲の温度を制御して、試料溶液の温度を低下させ、試料溶液の粘性を高くすることによって、核酸のブラウン運動が抑えられる。あるいは、試料溶液に測定対象以外の生体ポリマーを添加することにより、試料溶液の粘性を高くできると同時に、核酸の立体構造を直鎖状にすることができるため、核酸の形状と移動速度を制御することが可能となる。その際、測定対象以外の生体ポリマーとしては、好ましくはナノポアの内径よりも大きいサイズのポリマー、より好ましくは３次元的にクロスリンクされたポリマーを用いることにより、測定対象以外の生体ポリマーはナノポアに進入することができず、測定対象でない生体ポリマーによるトンネル電流変化を排除することが可能となる。
【００４１】
核酸の移動速度を制御する別の方法は、本発明の分析デバイスの上部及び下部に存在するそれぞれの試料溶液に圧力差を印加する方法である。例えば、核酸が電気泳動によってナノポアを通過しようとする力と反対向きの力を核酸に印加することにより、核酸がナノポアを通過する速度を低下させることができる。
【００４２】
核酸の形状及び／又は移動速度を制御しながら分析デバイスのナノポアに進入させることにより、核酸の主軸とナノポアの中心軸とは概ね一致する。試料移動機構により核酸を駆動することにより、核酸はナノポアを通過し、核酸を構成するモノマーは順次、ナノポア側壁に形成された電極間を通過する。すなわち核酸の主軸方向に沿って配列するモノマーが順次電極間を通過し、その際電極間のトンネル電流が変化する。この変化量がモノマーの種類によって異なるため、トンネル電流を計測することにより、モノマーの識別を順次行うことができる。
【００４３】
本発明においては、上述した本発明の核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を用いて、核酸の特性解析を行うことができる。本発明において、「核酸」とは、単位構造の低分子（単量体、モノマー）が複数連結した多量体（オリゴマー）や高分子（ポリマー）のうち、生体に存在するもの及び生体に存在するものから誘導されるものを意味する。具体的には、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡとからなるハイブリッド核酸などが含まれる。なお、核酸には、自然には存在しない配列や構成要素が含まれるポリマーが含まれ、例えば、ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｔ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）などの配列又は任意の配列を有する人為的に合成されたポリマー分子も含まれる。また、核酸には、当技術分野で公知の核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）によって調整された核酸や、ベクターにクローニングされている核酸も含まれる。これらの核酸を含む試料の調整方法は、当技術分野で周知であり、当業者であれば、核酸の種類に応じて適宜調整方法を選択することができる。
【００４４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。理解し易くするために、分析対象をｓｓＤＮＡとする。実施例１から５は、核酸分析デバイスの構成を説明し、実施例６から７は核酸分析デバイスの製造方法を説明し、実施例８から９では核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の構成を説明する。但し、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【００４５】
＜実施例１＞
本発明によるｓｓＤＮＡ向け核酸分析デバイスの構成の一例を図１Ａおよび１Ｂを用いて説明する。ここでは、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポア（以下、２電極付ナノポアとする）において、２つの電極に対して化学修飾分子を付与した場合の構造を上面図と断面図を用いて説明する。電極１０２は絶縁膜１０３により挟んだ構造とする。上面図では、電極１０２の形状を示すために絶縁膜１０３を非表示とするが、絶縁膜１０３の開口１０１は示す。また、電極１０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００４６】
まず、図１Ａに化学修飾分子の無い従来構造の２電極付ナノポアを比較のために示す。開口１０１の形状は円形で、ｓｓＤＮＡを分析するためにナノポア径と電極間距離を２ｎｍとした。図１Ｂは本発明により、化学修飾分子１０４を電極１０２の表面に付与した構造である。化学修飾分子１０４の厚さは１ｎｍ以下である。図１Ａの従来構造の２電極付ナノポアの２つの電極１０２に化学修飾分子１０４を付与したものが図１Ｂ（ａ）である。
ここで、図１Ｂにおいて、上面図には（ａ１）、断面図には（ａ２）の記号を付しているが、上面図あるいは断面図の区別を特に必要としない場合は、（ａ）と表記する。以下の図面の表記においても、同様な表記を採用するものとする。
【００４７】
図１Ｂ（ａ）の場合、電極１０２の先端の化学修飾分子１０４は、その厚さ分だけ開口１０１の縁から突き出すため、実効的なナノポア１０５の面積が減少し、分析対象であるｓｓＤＮＡが通過できない可能性がある。
【００４８】
そこで、図１Ｂ（ｂ）のように、化学修飾分子１０４の厚さ分だけナノポア径及び電極間距離を大きくし、化学修飾部の間の距離がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにする。しかし、図１Ｂ（ｂ）のように開口１０１の形状が円形の場合、上面図における縦方向の実効的なナノポア１０５のサイズは２ｎｍより大きく、ｓｓＤＮＡの分析に適したサイズよりも大きくなるため、精度良く塩基配列を読み出せない可能性がある。
【００４９】
そこで、図１Ｂ（ｃ）のように、化学修飾後の実効的なナノポア１０５の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにする。具体的には、開口１０１の形状を楕円とし、長径方向に対向する化学修飾分子付電極を配置し、化学修飾部の間の距離と短径を２ｎｍとする。この構造により、精度良く塩基配列を読み出すことができる。
しかし、図１Ｂ（ｃ）の構造の場合、化学修飾分子１０４が開口１０１の縁から突き出した構造をしているため、化学修飾部の機械的、化学的強度が低い場合、ナノポア１０５に入ってくる試料や試料溶液が化学修飾部に衝突することによって機能の劣化や化学修飾分子１０４の剥離が起こる可能性がある。その場合は、開口１０１をｓｓＤＮＡの分析に適した直径２ｎｍの円形とし、電極１０２の先端と開口１０１の縁との間に化学修飾分子１０４を付与できるように電極１０２のみを化学修飾分子１０４の厚さ分程度後退させる。図１Ｂ（ｄ）のように後退させると、化学修飾後も化学修飾分子１０４が開口１０１の縁から突き出さないため、長時間の使用による化学修飾分子１０４の機能の劣化や剥離を抑制できる。
【００５０】
図１Ｂ（ｄ）の構造は精度と信頼性・耐久性を両立させた構造であるが、構造がやや複雑なため、比較的製造コストが高い。求められるコストと精度と信頼性・耐久性に応じて構造を選ぶと良い。
【００５１】
本実施例における各電極先端の化学修飾分子１０４は、同じであっても、異なっても良い。また、開口１０１の形状は、円や楕円でなくとも、それに類する多角形としても良い。
【００５２】
＜実施例２＞
実施例１では同一平面上に２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアに化学修飾分子を付与した実施例を示したが、ここでは、同一平面上に２つよりも多くの電極を備えるトンネル電流方式固体ナノポアに化学修飾分子を付与した実施例を図２を用いて説明する。図２に同一平面上に３〜６つの電極２０２を有する固体ナノポアの上面図を示す。電極２０２は絶縁膜により挟んだ構造とする。電極２０２の形状を示すために絶縁膜を非表示とするが、開口２０１は示す。また、電極２０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００５３】
図２（ａ１）、（ａ２）が３電極を有する固体ナノポア、図２（ｂ１）、（ｂ２）が４電極を有する固体ナノポア、図２（ｃ１）、（ｃ２）が５電極を有する固体ナノポア、図２（ｄ１）、（ｄ２）が６電極を有する固体ナノポアのそれぞれ上面図および断面図である。
【００５４】
図２（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）は化学修飾分子２０４が開口２０１よりも突き出た構造をしており、図２（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）は図１Ｂ（ｄ）と同様に化学修飾分子２０４が電極２０２の先端と開口２０１の縁の間にあり、開口２０１より突き出ていない。前者は化学修飾後の実効的なナノポア２０５の径をｓｓＤＮＡに適した２ｎｍとし、後者はナノポア径を２ｎｍとする。前者は比較的製造コストが低い一方で信頼性・耐久性が低い可能性があり、後者は逆の特徴を持つ。
【００５５】
＜実施例３＞
実施例１〜２では、２つ以上の電極の内、全ての電極に化学修飾分子を付与したが、全ての電極に付与せずに一部の電極のみに付与しても良い。ここでは、２電極付ナノポアにおいて、２つの電極の内、１つの電極のみに化学修飾分子を付与した場合の実施例を図３を用いて説明する。図３に同一平面上に２つの電極を有する２電極付ナノポアの上面図と断面図を示す。電極３０２は絶縁膜３０３により挟んだ構造とする。電極３０２の形状を示すために絶縁膜３０３を非表示とするが、開口３０１は示す。また、電極３０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００５６】
図３（ａ）は開口３０１の形状が円形で、電極３０２の先端と開口３０１の縁が一致し、２つの電極３０２の片方に化学修飾分子３０４を付与することにより、化学修飾部先端と化学修飾分子の無い電極先端間の距離をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとした２電極付ナノポアである。この構造は、図１Ｂ（ｂ）の化学修飾部を１つ外して、円形の開口１０１の直径を小さくした構造に相当し、実施例１で説明したように、精度良く塩基配列を読み出せない可能性と信頼性・耐久性が低い可能性がある。
【００５７】
図３（ｂ）は電極３０２の先端と開口３０１の縁が一致し、片方の電極に化学修飾分子３０４を付与することにより、実効的なナノポア３０５の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにナノポアを形成した２電極付ナノポアである。具体的には、開口３０１の形状を楕円とし、長径方向に対向する電極３０２を配置し、２つの電極３０２の片方にのみ化学修飾分子３０４を付与し、化学修飾部先端と化学修飾分子の無い電極先端間の距離と短径を２ｎｍとする。この構造は、図１Ｂ（ｃ）の化学修飾部を１つ外して、楕円形の開口１０１の長径を小さくした構造に相当し、実施例１で説明したように、精度良く塩基配列を読み出せる一方、信頼性・耐久性が低い可能性がある。
【００５８】
図３（ｃ）は開口３０１の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍで、２つの電極３０２は共に開口３０１の縁よりも化学修飾分子３０４の厚さ分後退しており、２つの電極３０２の片方のみに化学修飾分子３０４が付与されている２電極付ナノポアである。電極３０２を開口３０１の縁よりも後退した構造を作製する場合、複数の電極３０２に対してそれぞれ異なる寸法だけ後退した構造を作製することは困難であるため、全ての電極３０２を開口３０１の縁よりも化学修飾分子３０４の厚さ分後退させた構造とする。この構造は、図１Ｂ（ｄ）の化学修飾部を１つ外した構造に相当し、実施例１で説明したように、精度と信頼性・耐久性を両立させた構造であるが、構造がやや複雑なため、比較的製造コストが高い。
【００５９】
＜実施例４＞
実施例３では、２電極付ナノポアにおいて、２つの電極の片方のみに化学修飾分子を付与した実施例を示したが、ここでは、同一平面上に２つよりも多くの電極を備えるトンネル電流方式固体ナノポアにおいて、１つ以上の電極に化学修飾分子を付与するが、全ての電極に化学修飾分子を付与しない場合の具体例として、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した実施例を図４Ａ〜４Ｄを用いて説明する。
【００６０】
図４Ａ〜図４Ｄに同一平面上に３〜６つの電極４０２を有する固体ナノポアの上面図を示す。電極４０２は絶縁膜により挟んだ構造とする。電極４０２の形状を示すために絶縁膜を非表示とするが、開口４０１は示す。また、電極４０１は配線に接続されるが、図では省略する。図４Ａが３電極を有する固体ナノポア、図４Ｂが４電極を有する固体ナノポア、図４Ｃが５電極を有する固体ナノポア、図４Ｄが６電極を有する固体ナノポアである。図４Ａ（ａ１）、４Ｂ（ｂ１）、４Ｃ（ｃ１）、４Ｄ（ｄ１）は、図３（ａ）と同様に開口４０１が円形で、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出た構造をしており、図４Ａ（ａ２）、４Ｂ（ｂ２）、４Ｃ（ｃ２）、４Ｄ（ｄ２）は、図３（ｂ）と同様に開口４０１が楕円形またはそれに類する形状で、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出た構造をしており、図４Ａ（ａ３）、４Ｂ（ｂ３）、４Ｃ（ｃ３）、４Ｄ（ｄ３）は、図３（ｃ）と同様に開口４０１が円形で、化学修飾分子４０４は電極４０２の先端と開口４０１の縁の間にあり、開口４０１には突き出ていない。
【００６１】
開口４０１が円形で、電極４０２の先端と開口４０１の縁が一致し、化学修飾分子４０４が開口４０１より突き出た構造の場合、図４Ａ（ａ１）、４Ｂ（ｂ１）、４Ｃ（ｃ１）、４Ｄ（ｄ１）に示すように、化学修飾分子の無い電極の先端が、他の化学修飾分子付電極の化学修飾部先端より離れてしまい、化学修飾部先端と化学修飾分子の無い電極の先端の位置で決まる実効的なナノポア４０５のサイズがｓｓＤＮＡの分析に適したサイズよりも大きくなり、精度良く塩基配列を読み出せない可能性がある。また、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性もある。
【００６２】
これに対して、図４Ａ（ａ２）、４Ｂ（ｂ２）、４Ｃ（ｃ２）、４Ｄ（ｄ２）に示すように、開口４０１の形状を楕円またはそれに類する形状とし、実効的なナノポア４０５の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにナノポアを形成し、電極４０２を配置すると、精度を向上することができる。しかし、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性がある。図４Ａ（ａ２）、４Ｂ（ｂ２）、４Ｃ（ｃ２）、４Ｄ（ｄ２）は、化学修飾分子の無い電極が１つの場合であるが、この構造の場合、化学修飾分子の無い電極の数に応じて開口４０１の形状や電極４０２の配置を調整し、実効的なナノポア４０５の大きさを分析対象に適した大きさにする必要がある。
【００６３】
一方、図４Ａ（ａ３）、４Ｂ（ｂ３）、４Ｃ（ｃ３）、４Ｄ（ｄ３）に示すように、開口４０１の形状が円形で、直径をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとし、化学修飾分子４０４が電極４０２の先端と円形の開口４０１の縁との間にあり、開口４０１には突き出ない構造の場合、図３（ｃ）の構造と同様に、精度と信頼性・耐久性を両立させることができるが、比較的製造コストが高い。また、この構造の場合、開口４０１の形状や、電極４０２の配置が化学修飾分子の無い電極の数に依らない。
【００６４】
＜実施例５＞
実施例１〜４では、同一平面上に２つ以上の電極を有し、電極の層が１層であるトンネル電流方式固体ナノポアの電極に対して化学修飾分子を付与した場合の構造を説明した。同一平面上の電極数が多いほど、製造の難易度が上がり、歩留まりが低下する恐れがあるため、同一平面上の電極数は４以下とし、金属の層と絶縁膜の積層数を増やすことにより電極数を増やした方が歩留まりが高い場合がある。ここでは、同一平面上の電極数を２つとし、電極の層を４層としたトンネル電流方式固体ナノポアの全ての電極に対して化学修飾分子を付与した場合の構造を図５を用いて説明する。
【００６５】
図５に同一平面上に２つの電極５０２を有し、電極５０２の層が４層である８電極付ナノポアの上面図と断面図を示す。各電極５０２は絶縁膜５０３により分離された構造とする。電極５０２の形状を示すために絶縁膜５０３を非表示とするが、開口５０１は示す。また、電極５０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００６６】
図５（ａ）は開口５０１の形状が円形で、電極５０２の先端と開口５０１の縁が一致し、電極５０２に化学修飾分子５０４を付与することにより、化学修飾部先端間の距離をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとした８電極付ナノポアである。上面図が図１Ｂ（ｂ）のそれと同様であるため、図１Ｂ（ｂ）の電極付ナノポアと同様に、化学修飾部先端間の距離が２ｎｍであっても、上面図における縦方向の実効的なナノポア５０５のサイズは２ｎｍより大きく、ｓｓＤＮＡの分析に適したサイズよりも大きくなるため、精度良く塩基配列を読み出せない可能性がある。また、化学修飾分子５０４が開口５０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性もある。
【００６７】
これに対して図５（ｂ）は図１Ｂ（ｃ）と同様に、開口５０１の形状を楕円とし、長径方向に対向する化学修飾付電極を配置し、化学修飾部の間の距離と短径を２ｎｍとした８電極付ナノポアである。実効的なナノポア５０５のサイズがｓｓＤＮＡの分析に適したサイズであるため、精度良く塩基配列を読み出すことができる。しかし、化学修飾分子５０４が開口５０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性がある。
【００６８】
一方、図５（ｃ）に示すように、開口５０１の形状が円形で、直径をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとし、化学修飾分子５０４が電極５０２の先端と円形の開口５０１の縁との間にあり、開口５０１には突き出ない構造の場合、図１Ｂ（ｄ）の構造と同様に、精度と信頼性・耐久性を両立させることができるが、比較的製造コストが高い。
【００６９】
本実施例では、同一平面上の電極５０２の数を２つ、電極５０２の層を４層としたが、電極５０２の数と層数は任意に選ぶことができる。同一平面上の電極５０２の数が３〜６の場合は、上面図は図２と同様となる。また、本実施例では、全ての電極５０２に化学修飾分子５０４を付与した場合を示したが、化学修飾分子の無い電極を有しても良い。更に、各電極先端の化学修飾分子５０４は、同じであっても、異なっても良く、任意に選ぶことができる。
【００７０】
＜実施例６＞
本発明によるｓｓＤＮＡ向け核酸分析デバイスの製造方法例を図６Ａから６Ｊを用いて説明する。ここでは、同一平面上に対向した２つの電極を有し、電極の先端と開口の縁が一致し、化学修飾分子が開口より突き出た構造の２電極付ナノポアの製造方法の一例を示す。図６Ａから６Ｊは製造プロセスフロー図で、デバイスの断面構造を示している。製造プロセスを以下で説明する。
【００７１】
結晶面方位が（１００）面のシリコン単結晶基板６０６上にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜６０７を２０ｎｍ堆積させ、その上にパッド電極となる窒化チタン膜６０８をスパッタリングにより５０ｎｍ堆積させてリソグラフィとドライエッチングにより窒化チタン膜６０８をパッドの形状（１００μｍ角）にパターニングする（図６Ａ）。
【００７２】
次に、トンネル電流計測用の電極となる窒化チタン膜６０９をＣＶＤ法により５ｎｍ堆積させて（図６Ｂ）、電極の形状にパターニングする（図６Ｃ）。電極はナノポアの形成される位置をギャップ６１０とし、分離された電極とする。ギャップ６１０の幅は形成する開口の大きさと合わせる。ここでは４ｎｍとする。この実施例では、ギャップ６１０を挟んで対向した電極としてパターニングしたが、ギャップ６１０の無い繋がった電極としても良い。但し、その場合、繋がっている電極をナノポア６１６（図６Ｉ参照）形成時に切断する必要がある。電極のパターニング後、ＣＶＤ法により２０ｎｍのシリコン窒化膜６１１、６０ｎｍのシリコン酸化膜６１２、２００ｎｍのシリコン窒化膜６１３を堆積する（図６Ｄ）。
【００７３】
次に、リソグラフィとドライエッチングにより、パッド上部のシリコン窒化膜６１１とシリコン酸化膜６１２とシリコン窒化膜６１３を除去し、窒化チタン６０９を露出させる。更に、電極ギャップ上部の２００ｎｍのシリコン窒化膜６１３を除去し、シリコン酸化膜６１２を露出させる（図６Ｅ、露出させる面積は５μｍ角とする）。その後、裏面にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜６１４を４００ｎｍ堆積し、リソグラフィとドライエッチにより１０３０μｍ角のシリコン基板６０６が露出した領域を形成する（図６Ｆ）。
【００７４】
次に裏面から露出したシリコン基板６０６を水酸化カリウム水溶液により異方性エッチングし、３０μｍ角前後のシリコン基板６０６の無い薄膜部分６１５を形成する（図６Ｇ）。薄膜部分６１５のシリコン酸化膜６１２をフッ酸によるウェットエッチで除去し（図６Ｈ）、透過型電子顕微鏡による電子ビームを照射することによりナノポア６１６を形成する（図６Ｉ）。開口の形状は、長径４ｎｍ、短径２ｎｍの楕円とし、長径方向に電極がある。ナノポア６１６の形成後、２つの電極表面に化学修飾分子６０４を付与する（図６Ｊ）。化学修飾分子６０４の厚さを約１ｎｍとし、２つの化学修飾部の間の距離が約２ｎｍにする。上面図は図１Ｂ（ｃ）と同様となる。ここでは化学修飾分子６０４には４−メルカプト安息香酸を用いた。
【００７５】
本実施例では、同一平面上に対向した２つの電極を有する２電極付ナノポアの製造方法を説明したが、電極の層が１層で２つよりも多くの電極を有する電極付ナノポアを製造する場合は、パッドのパターニング（図６Ａ）と電極のパターニング（図６Ｃ）を変更することで実現できる。また、図５（ｂ）のように電極の層を複数にする場合は、図６Ｂの後にシリコン窒化膜と窒化チタンを交互に堆積させて、図６Ｃと同様に最も下層の窒化チタンまで一括でパターニングする。更に、電極の数だけパッドを用意し、配線で各電極とパッドを接続すればよい。
本実施例では全ての電極に化学修飾分子６０４を付与したが、全ての化学修飾分子６０４が異なっても、同一でも良いし、化学修飾分子の無い電極が混在しても良い。
【００７６】
＜実施例７＞
実施例６では化学修飾分子が開口より突き出た構造の電極付ナノポアの製造方法を説明した。ここでは、同一平面上に対向した２つの電極を有し、化学修飾分子が電極先端と開口の縁との間にあり、開口には突き出ない構造の２電極付ナノポアの製造方法の一例を説明する。図７Ａ〜７Ｋは製造プロセスフロー図で、デバイスの断面構造を示している。製造プロセスを以下で説明する。
【００７７】
結晶面方位が（１００）面のシリコン単結晶基板７０６上にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜７０７を５０ｎｍ堆積させ、その上にＣＶＤ法によりアモルファスシリコン膜７１７を１０ｎｍ堆積させ、更にその上にパッド電極となる窒化チタン膜７０８をスパッタリングにより５０ｎｍ堆積させてリソグラフィとドライエッチングにより窒化チタン膜７０８をパッドの形状（１００μｍ角）にパターニングする（図７Ａ）。
【００７８】
次にスパッタリングにより金／チタン膜７１８を堆積させて（図７Ｂ）、電極の形状にパターニングする（図７Ｃ）。本実施例では、電極材料に５ｎｍの金、金と下地のアモルファスシリコン膜７１７との接着層に１ｎｍチタンを用いた。金は酸化しにくい導電材料として選んだ。電極はナノポアの形成される位置をギャップ７１０とし、分離された電極とする。ギャップ７１０の幅は図７Ｉにて形成するナノポアの大きさと合わせる。ここでは４ｎｍとする。本実施例では、ギャップ７１０を挟んで対向する電極としてパターニングしたが、ギャップの無い繋がった電極としても良い。その場合、繋がっている電極をナノポア７１６形成時に切断する必要がある。電極のパターニング後、ＣＶＤ法により１０ｎｍのアモルファスシリコン膜７１９、６０ｎｍのシリコン酸化膜７１２、２００ｎｍのシリコン窒化膜７１３を堆積する（図７Ｄ）。
【００７９】
次に、リソグラフィとドライエッチングにより、パッド上部のアモルファスシリコン膜７１９とシリコン酸化膜７１２とシリコン窒化膜７１３を除去し、金／チタン膜７１８を露出させる。更に、電極ギャップ上部の２００ｎｍのシリコン窒化膜７１３を除去し、シリコン酸化膜７１２を露出させる（図７Ｅ、露出させる面積は５μｍ角とする）。その後、裏面にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜７１４を４００ｎｍ堆積し、リソグラフィとドライエッチにより１０３０μｍ角のシリコン基板７０６が露出した領域を形成する（図７Ｆ）。
【００８０】
次に裏面から露出したシリコン基板７０６を水酸化カリウム水溶液により異方性エッチングし、３０μｍ角前後のシリコン基板７０６の無い薄膜部分７１５を形成する（図７Ｇ）。
【００８１】
薄膜部分７１５の表面側のシリコン酸化膜７１２をフッ酸によるウェットエッチで除去し、更に薄膜部分７１５の裏面側のシリコン窒化膜７０７を熱リン酸によるウェットエッチで除去する（図６Ｈ）。その後、透過型電子顕微鏡による電子ビームを照射することによりナノポア７１６を形成する（図７Ｉ）。開口の形状は、直径４ｎｍの円とする。対向する２つの電極間の距離も４ｎｍである。ナノポア７１６形成後、酸素プラズマに曝すことで、電極上下を挟むアモルファスシリコン膜７１７、７１９を酸化する。アモルファスシリコン膜がシリコン酸化膜となることで、体積が増加し、ナノポアが小さくなる。酸化後のナノポアの直径が２ｎｍとなるように酸素プラズマのパワーと時間を調整する。酸素プラズマ曝露の結果、電極上下のアモルファスシリコン膜が形成していた直径４ｎｍの円形の開口は、シリコン酸化膜による直径２ｎｍの円形の開口となる一方、電極材料の金は酸化しにくいため、酸化による体積増加は発生せず、２つの電極間距離は変わらない（図７Ｊ）。この後、２つの電極表面に化学修飾分子７０４を付与する（図７Ｋ）。化学修飾分子７０４の厚さを約１ｎｍとし、２つの化学修飾部の間の距離が約２ｎｍにする。上面図は図１Ｂ（ｄ）と同様となる。ここでは化学修飾分子７０４には４−メルカプト安息香酸を用いた。
【００８２】
本実施例では、同一平面上に対向した２つの電極を有する２電極付ナノポアの製造方法を説明したが、電極の層が１層で２つよりも多くの電極を有する電極付ナノポアを製造する場合は、パッドのパターニング（図７Ａ）と電極のパターニング（図７Ｃ）を変更することで実現できる。また、図５（ｃ）のように電極の層を複数にする場合は、図７Ｂの後にアモルファスシリコン膜と金／チタン膜を交互に堆積させて、図７Ｃと同様に最も下層の金／チタン膜まで一括でパターニングする。更に、電極の数だけパッドを用意し、配線で各電極とパッドを接続すればよい。
【００８３】
本実施例では全ての電極に化学修飾分子７０４を付与したが、全ての化学修飾分子７０４が異なってもよいし、同一でもよい。また、化学修飾分子の無い電極が混在してもよい。
【００８４】
＜実施例８＞
本発明による核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一構成を図８を用いて説明する。核酸分析装置は、第一溶液槽８２１、第二溶液槽８２２、両溶液槽を分割する化学修飾分子の付与された電極付ナノポアによる核酸分析デバイス８２３、ナノポア８１６を通じて核酸８３７を第一溶液槽８２１と第二溶液槽８２２との間で移動させる核酸駆動手段８２４、８２５、制御及びデータ処理手段８２６で構成される。本実施例では核酸駆動手段８２４、８２５を両溶液槽に配置したが、これに加えて、又はこれの替わりに核酸駆動手段８２４、８２５を核酸分析デバイス８２３に内蔵させても良い。両溶液槽には溶液を導入する導入口８２７、８２８と溶液を排出する排出口８２９、８３０がそれぞれ備えられている。更に、両溶液槽には電極８３１、８３２が備えられており、電極８３１、８３２は極性及び出力可変の電圧源８３３と電流計８３４に接続されている。これら電極８３１、８３２は、核酸駆動手段８２４、８２５にそれぞれ内蔵させても良い。
【００８５】
本実施例では、核酸分析デバイス８２３に全電極８０２に化学修飾分子８０４が付与された２電極付ナノポアを用いた例を示す。２つの電極８０２の間に極性及び出力可変の電圧源８３５と電流計８３６を接続する。電圧源８３３、８３５、電流計８３４、８３６、核酸駆動手段８２４、８２５は制御及びデータ処理手段８２６に接続されている。
【００８６】
核酸８３７を解析する際には、解析対象である核酸８３７をバッファ溶液に混合し、導入口８２７より第一溶液槽８２１に、バッファ溶液のみを導入口８２８より第二溶液槽８２２に導入する。核酸駆動手段８２４、８２５により、核酸８３７を第一溶液槽８２１から第二溶液槽８２２へ移動させる。核酸駆動と同時に電圧源８３３を用いて２つの電極８３１、８３２の間を流れる電流、即ち、ナノポア８１６を介して流れるイオン電流を電流計８３４を用いて計測する。核酸８３７がナノポア８１６に導入されるとイオン電流値が減少する。イオン電流値が減少したら、電極８０２の間を流れるトンネル電流により塩基種の識別が可能となるよう、核酸駆動手段８２４、８２５により、核酸８３７がナノポア８１６を通過するスピードを調節する。塩基種の識別は一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いや、各塩基の電流−電圧特性の違いにより識別する。
【００８７】
ここで、一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いでＤＮＡ鎖の塩基識別を行う方法を説明する。ＤＮＡ鎖の塩基にはＡＴＧＣの４種類があるが、これらの塩基の種類ごとに固有の電流値が観測され、制御及びデータ処理手段８２６に送られる。一例を図９に示す。予め、各塩基１種類のみが連なったポリマーがナノポア８１６を通過するときのトンネル電流を計測し、各塩基種に対応した電流値を求め、制御及びデータ処理手段のメモリに記憶しておく。そして、解析対象のＤＮＡ鎖のトンネル電流計測時に得られた電流値と予め計測した各塩基種に対応した電流値を比較することにより、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列を知ることができる。
【００８８】
核酸８３７を構成する全ての塩基が電極間を通過して、塩基識別が完了した後、同一の核酸８３７を逆方向に駆動して再び塩基識別を行い、ベリファイを行っても良い。また、核酸８３７がナノポア８１６を通過するスピードが速いために一回の測定で塩基種の識別ができない場合には、同一塩基を繰返し計測することにより統計的に識別しても良い。核酸８３７の分析が完了したら、排出口８３０から排出する。
【００８９】
本実施例では、１個のナノポアを有する核酸分析デバイスを使ったトンネル電流の計測を行っているが、多数のナノポアを同一基板上に配置して、多数の解析対象核酸のトンネル電流の同時計測により、スループットの向上も図れる。
【００９０】
＜実施例９＞
実施例８では化学修飾分子が付与された２電極付ナノポアを用いた核酸分析装置の一構成を説明した。１つのナノポアに対し、２つより多くの電極を用いて様々な電極間を流れるトンネル電流で塩基の種類を識別する方が、２電極の場合より識別能高く高精度に塩基配列を解析することができる。ここでは、化学修飾分子が付与された電極付ナノポアを用いた核酸分析装置の内、１つのナノポアに対して２つより多い電極を持つ電極付ナノポアを用いた核酸分析装置の一構成を図１０を用いて説明する。ここでは、図５（ｃ）のように、同一平面上の電極数を２つとし、電極の層を４層とした８電極付ナノポアを用いた例を説明する。８つの電極は４層の２電極対から構成されており、最も上層の電極対にはＴを修飾し、Ａに対する識別能を上げ、最も上層から２番目の電極対にはＣを修飾し、Ｇに対する識別能を上げ、最も上層から３番目の電極対にはＡを修飾し、Ｔに対する識別能を上げ、最も下層の電極対にはＧを修飾し、Ｃに対する識別能を上げている。
【００９１】
装置は、実施例８と同様に、第一溶液槽１０２１、第二溶液槽１０２２、両溶液槽を分割する化学修飾分子１００４が付与された電極付ナノポアによる核酸分析デバイス１０２３、ナノポア１０１６を通じて核酸１０３７を第一溶液槽１０２１と第二溶液槽１０２２との間で移動させる核酸駆動手段１０２４、１０２５、制御及びデータ処理手段１０２６で構成される。本実施例では核酸駆動手段１０２４、１０２５を両溶液槽に配置したが、これに加えて、又はこれの替わりに核酸駆動手段１０２４、１０２５を核酸分析デバイス１０２３に内蔵させても良い。両溶液槽には溶液を導入する導入口１０２７、１０２８と溶液を排出する排出口１０２９、１０３０がそれぞれ備えられている。更に、両溶液槽には電極１０３１、１０３２が備えられており、電極１０３１、１０３２は極性及び出力可変の電圧源１０３３と電流計１０３４に接続されている。これら電極１０３１、１０３２は、核酸駆動手段１０２４、１０２５にそれぞれ内蔵させても良い。４つの電極対それぞれに極性及び出力可変の電圧源１０３５、１０３８、１０４０、１０４２と電流計１０３６、１０３９、１０４１、１０４３を接続する。電圧源１０３３、１０３５、１０３８、１０４０、１０４２、電流計１０３４、１０３６、１０３９、１０４１、１０４３、核酸駆動手段１０２４、１０２５は制御及びデータ処理手段１０２６に接続されている。本実施例では、４つの電極対につき４組の電圧源と電流計を接続したが、スイッチを用いて、１組の電圧源と電流計を４組の電極対に切り替えて接続しても良い。その場合は、スイッチも制御及びデータ処理手段に接続する。
【００９２】
核酸１０３７を解析する際には、解析対象である核酸１０３７をバッファ溶液に混合し、導入口１０２７より第一溶液槽１０２１に、バッファ溶液のみを導入口１０２８より第二溶液槽１０２２に導入する。核酸駆動手段１０２４、１０２５により、核酸１０３７を第一溶液槽１０２１から第二溶液槽１０２２へ移動させる。核酸駆動と同時に電圧源１０３３を用いて２つの電極１０３１、１０３２の間を流れる電流、即ち、ナノポア１０１６を介して流れるイオン電流を電流計１０３４を用いて計測する。核酸１０３７がナノポア１０１６に導入されるとイオン電流値が減少する。電流値が減少したら、核酸分析デバイス１０２３が有する４つの電極対間を流れるトンネル電流により塩基種の識別が可能となるよう、核酸駆動手段１０２４、１０２５により、核酸１０３７がナノポア１０１６を通過するスピードを調節する。塩基種の識別は一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いや、各塩基の電流−電圧特性の違いにより識別する。
【００９３】
ここで、一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いでＤＮＡ鎖の塩基識別を行う方法を説明する。予め、各塩基１種類のみが連なったポリマーがナノポア１０１６を通過するときの核酸分析デバイス１０２３が有する４つの電極対間を流れるトンネル電流を計測し、４種の塩基に対応した電流値を求め、制御及びデータ処理手段１０２６のメモリに記憶しておく。４つの電極対の内、最も上層の電極対はＡに対する選択感度が高く、Ａが電極間にあるとき、Ａ以外の塩基に比べて十分大きな電流が流れるため、他の塩基と区別できる。
【００９４】
一方、Ａ以外の３種の塩基の識別能は低くても良い。同様に、最も上層から２番目の電極対はＧとＧ以外の塩基とを区別でき、最も上層から３番目の電極対はＴとＴ以外の塩基とを区別でき、最も下層の電極対はＣとＣ以外の塩基とを区別できる。解析対象のＤＮＡ鎖がある時間内に４つの電極対間を通過すると、４つの電極対間のトンネル電流がある時間内で変化する。各トンネル電流変化から、それぞれ別の塩基に対して高感度に識別したデータが得られるため、各データを互いに補完することにより解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列を知ることができる。
【００９５】
具体的には、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列が仮にＡＧＴＣＧＴＡＧＣの場合、ＤＮＡ鎖が４つの電極対間を通過する際に得られるトンネル電流の時間依存性を図１１を用いて説明する。最上層の電極対間を流れるトンネル電流の時間依存性からは、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列が、少なくとも“Ａ？？？？？Ａ？？”であることが分かる。ここで、“？”はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかの塩基。次に、最上層から２番目の電極対間のトンネル電流依存性からは少なくとも“？Ｇ？？Ｇ？？Ｇ？”であると分かる。以下同様に、各電極対間のトンネル電流の時間依存性からそれぞれ選択感度の高い塩基を識別したデータを得て、各データを互いに補完すると、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列を知ることができる。
【００９６】
実施例８と同様に、核酸１０３７を構成する全ての塩基が４つの電極対間を通過して、塩基識別が完了した後、同一の核酸１０３７を逆方向に駆動して再び塩基識別を行い、ベリファイを行っても良い。また、核酸１０３７がナノポア１０１６を通過するスピードが速いために一回の測定で塩基種の識別ができない場合には、同一塩基を繰返し計測することにより統計的に識別しても良い。核酸１０３７の分析が完了したら、排出口１０３０から排出する。
【００９７】
本実施例では、１個のナノポアを有する核酸分析デバイスを使ったトンネル電流の計測を行っているが、多数のナノポアを同一基板上に配置して、多数の解析対象核酸のトンネル電流の同時計測により、スループットの向上も図れる。
【００９８】
＜実施例１０＞
本発明による核酸分析デバイスの電極対構成の一例を説明する。
電極対間の解析対象核酸のトンネル電流を計測する際、電極対を構成する２つの電極は同じ化学修飾分子にせず、異なる化学修飾分子にしても良いし、片方の電極を化学修飾無しとしても良い。３つ以上の電極を有する核酸分析デバイスにおいて、電極の１つを共通電極としてグランドに接続し、ｎ個の電極で（ｎ−１）対の電極対を構成することができる（ｎ≧３）。ここでは、５つの電極１２０２を有する核酸分析デバイスにおいて、電極１２０２の１つを共通電極とし、４つの電極対を構成した実施例を図１２を用いて説明する。
【００９９】
図１２に同一平面上に５つの電極１２０２を有し、電極層は１層で構成されている。５つの電極１２０２のうち１つの電極を化学修飾無しとし、残り４つの電極には異なる化学修飾分子１２０４を付与する。５つの電極１２０２をここでは、電極ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅと区別して説明する。電極ａには化学修飾を付与せず、電極ｂにはＴを修飾し、Ａに対する識別能を上げ、電極ｃにはＣを修飾し、Ｇに対する識別能を上げ、電極ｄにはＡを修飾し、Ｔに対する識別能を上げ、電極ｅにはＧを修飾し、Ｃに対する識別能を上げている。電極ａを共通電極とし、電極ａとｂ、ａとｃ、ａとｄ、ａとｅの４つの電極対を構成する。電極対ａ−ｂでＡを識別し、電極対ａ−ｃでＧを識別し、電極対ａ−ｄでＴを識別し、電極対ａ−ｅでＣを識別する。
【０１００】
本実施例では、共通電極は化学修飾無しとしたが、化学修飾分子を付けても良い。また、本実施例では全ての電極が同一平面上に有ったが、電極層が２層以上で、異なる平面上に電極が存在しても良い。また、電極数をより多くし、高精度化しても良い。
【符号の説明】
【０１０１】
１０１，２０１，３０１，４０１，５０１，１２０１…開口、
１０２，２０２，３０２，４０２，５０２，８０２，８３１，８３２，１００２，１２０２…電極、
１０３，３０３，４０３，５０３，８０３，１００３…絶縁膜、
１０４，２０４，３０４，４０４，５０４，６０４，７０４，８０４，１００４，１２０４…化学修飾分子、
１０５，２０５，３０５，４０５，５０５…実効的なナノポア、
６０６，７０６…シリコン基板、
６０７，６１１，６１３，６１４，７１３，７１４…シリコン窒化膜、
６０８，６０９，７０８…窒化チタン膜、
６１０，７１０…ギャップ、
６１２，７１２，７２０…シリコン酸化膜、
６１５，７１５…薄膜部分、
６１６，７１６，８１６，１０１６…ナノポア、
７１７，７１９…アモルファスシリコン膜、
７１８…金／チタン膜、
８２１，１０２１…第一溶液槽、
８２２，１０２２…第二溶液槽、
８２３，１０２３…核酸分析デバイス、
８２４，８２５，１０２４，１０２５…核酸駆動手段、
８２６，１０２６…制御及びデータ処理手段、
８２７，８２８，１０２７，１０２８…導入口、
８２９，８３０，１０２９，１０３０…排出口、
８３３，８３５，１０３３，１０３５，１０３８，１０４０，１０４２…電圧源、
８３４，８３６，１０３４，１０３６，１０３９，１０４１，１０４３…電流計、
８３７，１０３７…核酸。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノサイズのポアが設けられた薄膜によりＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の配列解析等を行うデバイス及び分析装置に関する。特にポアに化学修飾分子付電極を有するナノポアを用いた核酸分析デバイス及びそれを用いた分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
次々世代ＤＮＡシーケンサを実現するアプローチとしてナノポアを用いる方式が注目を集めている。ＤＮＡを標識することなく、換言すると酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることがナノポア方式の大きな特長と考えられている。ナノポアはその形成法により大別して２種類に分類される。その一つはナノサイズの孔（以下「ナノポア」という）を形成するチャンネルタンパク質を２分子膜に埋設したいわゆるバイオナノポアであり、もう一つは半導体材料に微細加工を施してナノポアを形成するいわゆる固体ナノポアである。
【０００３】
また、このようなナノポアを用いるＤＮＡの解析法として、現在２種類の方法が提案されている。第１の手法は、封鎖電流方式である。すなわち、ナノポアが形成された薄膜の両側に液槽を設け、それぞれの液槽に電解質溶液と電極を設け、電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。イオン電流の大きさは一次近似としてナノポアの断面積に比例する。ＤＮＡがナノポアを通過すると、ＤＮＡがナノポアを封鎖し、有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この減少量を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、ＤＮＡの１本鎖と２本鎖との差異が識別できる。またバイオポアの一形態において、封鎖電流の大きさからＤＮＡの塩基の種類が判別可能と報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
ただし、バイオポアに用いる２分子膜は有機低分子が弱い力で集合して形成される繊細な薄膜であり、機械的な安定性に課題があると考えられる。またチャンネルタンパク質が２分子膜へ組み込まれる工程が自然現象に依存するため、チャンネルの数の制御や再現性に課題がある。一方、固体ナノポアは薄膜として半導体基板などを用いるため、バイオポアより構造の安定性の点で有利と考えられる。またナノポアを機械的に形成するため、工業的な生産が可能という利点もある。また薄膜材料として半導体基板以外にもグラフェン（Ｇｒａｐｈｅｎｅ）を利用してそれに設けた固体ナノポアを通過する生体分子を分析する装置及び方法も報告されている（特許文献１）。しかし固体ナノポアにおいては、封鎖電流によるＤＮＡ鎖の４種類の塩基識別は報告されていない。
【０００５】
第２の手法は、トンネル電流方式である。すなわち、ナノポアに面して電極対を対向して設け、電極間に電圧をかけることにより、ナノポアを通過するＤＮＡと電極間のトンネル電流を測定し、トンネル電流の大きさからＤＮＡを解析する方式が提案されている（特許文献２）。理論研究より、トンネル電流の大きさから統計的に塩基識別ができるという報告があるものの（非特許文献２）、実験的にＤＮＡ鎖の４種類の塩基を識別した報告はない。
【０００６】
以上のように、次々世代ＤＮＡシーケンサとして、ナノポア方式が期待されており、工業的生産性の観点では半導体材料に微細加工を施して形成できる固体ナノポアが有望であるものの、封鎖電流方式およびトンネル電流方式の何れの方式においても４種の塩基識別は実現されていない。
【０００７】
トンネル電流方式の関連技術として、走査プローブ顕微鏡を用い、プローブ先端と基板表面の両方に４−メルカプト安息香酸を修飾することによって複数種のＤＮＡヌクレオシドに対する識別能が向上するとの報告がある（非特許文献３）。また、走査プローブ顕微鏡のプローブ先端に核酸塩基分子を修飾することにより相補的な核酸塩基に対する識別能が向上すると報告されている（非特許文献４）。ＤＮＡの場合、アデニン（以下、Ａと表記）とチミン（以下、Ｔと表記）、シトシン（以下、Ｃと表記）とグアニン（以下、Ｇと表記）が相補的な核酸塩基となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／０３５６４７号
【特許文献２】米国特許ＵＳ６６２７０６７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Clarke，J．et al．，Nat． Nanotech．（2009年）第4巻第265−270頁
【非特許文献２】Lagerqvist，J．et al．， Nano Lett．（2006年）第6巻第779−782頁
【非特許文献３】Chang，S．et al．，Nano Lett．（2010年）第10巻第1070−1075頁
【非特許文献４】Ohshiro，T．et al．，PNAS （2006年）第103巻第10−14頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
固体ナノポアを用いて、トンネル電流方式により核酸塩基を解析する方法は、塩基識別を実現できる可能性は示唆されているものの（非特許文献２、非特許文献３）、従来の方法（特許文献２）では、塩基の識別能が低く、核酸の塩基配列を高精度に読み取ることが困難である。
【００１１】
そこで、本発明の課題は、固体ナノポアを用いたトンネル電流方式による核酸塩基の解析方法において、高い識別能で核酸の塩基配列を高精度に読み取ることが可能な核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を提供することである。
【００１２】
併せて、本解析方法により、酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることから、低コストに解析でき、更に、試薬に制限されていた読出し塩基長が長くなるため、従来よりも高スループットな解析技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本願発明の核酸分析デバイスの主な特徴は、以下の通りである。
【００１４】
（１）電流測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、固体基板と、固体基板を貫通して設けられ試料が通過するナノポアと、固体基板に配置され、それぞれの一端面がナノポアに面して設けられた少なくとも２つの電極とを備え、少なくとも１つの電極のナノポアに面する一端面には、核酸を構成する４種の塩基のうち少なくとも１種に対する識別能を向上させるための化学修飾分子が付与され、ナノポアに試料を進入させながら、少なくとも２つの電極間に電圧を印加して進入した試料中の核酸を構成する塩基に電流を流すことにより、核酸の分析を行うことを特徴とする。
【００１５】
また、本願発明の核酸分析装置の主な特徴は、以下の通りである。
【００１６】
（２）上記（１）に記載の核酸分析デバイスを有し、分析対象とする核酸を含有する試料溶液を導入する導入口と該試料溶液を排出する排出口を具備してなる第１の溶液槽と、溶液を導入する導入口と該溶液を排出する排出口を具備してなる第２の溶液槽と、第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に配置された核酸分析デバイスを有するナノポアを通じて、核酸を第１の溶液槽から第２の溶液槽へ移動させる核酸駆動手段と、第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に電圧を印加する第１電圧源と、ナノポアを介して第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に流れる電流を検出する第１電流計と、核酸分析デバイスに設けられた電極間に電圧を印加する第２電圧源と、核酸分析デバイスに設けられた電極間に流れる電流を検出する第２電流計と、少なくとも核酸駆動手段を制御する制御手段と、少なくとも第１および第２電流計で検出されたデータを取得して処理するデータ処理手段とを備え、 前記第２電圧源を用いて、ナノポアに進入した試料溶液中の核酸を構成する塩基に電流を流し、第２電流計を用いてその電流を計測することにより試料溶液中の核酸を分析することを特徴とする。
【００１７】
すなわち、本願発明の特徴は、トンネル電流方式固体ナノポアの電極表面に核酸塩基分子や有機化合物等を化学修飾することにより、特定または複数の核酸塩基に対する識別能を上げることにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、固体ナノポアを用いたトンネル電流方式による核酸塩基の解析方法において、塩基識別能が高く、塩基配列を高精度に読み取ることが可能な核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を提供できる。
【００１９】
また、酵素や蛍光色素などの試薬を用いずに解析できることから、低コストに解析でき、更に、試薬に制限されていた読出し塩基長が長くなるため、従来よりも高スループットな解析技術を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】第１の実施例に係わる、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアの構造の概略図である。
【図１Ｂ】第１の実施例に係わる、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアの構造（化学修飾分子付与の場合）の概略図である。
【図２】第２の実施例に係わる、同一平面上に３〜６つの化学修飾分子付電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアの構造の概略図である。
【図３】第３の実施例に係わる、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極のみに化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ａ】第４の実施例に係わる、同一平面上に３つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ｂ】第４の実施例に係わる、同一平面上に４つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ｃ】第４の実施例に係わる、同一平面上に５つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図４Ｄ】第４の実施例に係わる、同一平面上に６つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した構造の概略図である。
【図５】第５の実施例に係わる、８つの化学修飾分子付電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアであって、同一平面状の電極数が２つ、電極の層を４層である構造の概略図である。
【図６Ａ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｂ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｃ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｄ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｅ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｆ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｇ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｈ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｉ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図６Ｊ】第６の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出た構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ａ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｂ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｃ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｄ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｅ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｆ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｇ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｈ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｉ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｊ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図７Ｋ】第７の実施例に係わる、化学修飾分子が開口より突き出ない構造のトンネル電流方式固体ナノポアの製造方法の一例を説明する各工程断面図である。
【図８】第８の実施例に係わる、２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一構成の概略図である。
【図９】第８の実施例に係わる、ＤＮＡ鎖がナノポアを通過時に計測されるトンネル電流値の時間変化のグラフである。
【図１０】第９の実施例に係わる、４つの電極対を有するトンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一構成の概略図である。
【図１１】第９の実施例に係わる、ＤＮＡ鎖が４つの電極対を有するナノポアを通過時に計測される４つのトンネル電流値の時間変化のグラフである。
【図１２】第１０の実施例に係わる、５つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアによる核酸分析デバイスにおいて、電極の１つを共通電極とし、４つの電極対を構成した一例を説明する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
まず、以下に実施の形態を述べる。
本発明はトンネル電流方式固体ナノポアを用いて核酸塩基を解析するためのデバイス及びそのデバイスを用いた装置に関する。従って、本発明に係る核酸分析デバイスは、固体基板と、前記固体基板に設けられた少なくとも１つのポアと、前記個体基板に配置された少なくとも２つの電極を備える。
【００２２】
固体基板は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料含む）から形成することができる。電気的絶縁体材料の例としては、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレンが挙げられる。固体基板のサイズ及び厚さは、ナノポアを設けることができるものであれば特に限定されるものではない。固体基板は、当技術分野で公知の方法で作製することができ、あるいは市販品として入手することも可能である。例えば、固体基板は、リソグラフィ及びエッチング、レーザーアブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、蒸着、化学気相成長（ＣＶＤ）、電子ビーム若しくは収束イオンビームなどの技術を用いて作製することができる。固体基板は、表面への他の分子の吸着を避けるために、コーティングされていても良い。
【００２３】
固体基板は、ナノポアを設けるための薄膜部分を有することが好ましい。即ち、ナノポアを形成するのに適した材料及び厚さの薄膜部分を固体基板に設けることによって、ナノポアを簡便かつ効率的に固体基板上に形成することができる。そのような薄膜部分は、固体基板と同じ材料であっても良いし、或いは別の電気的絶縁体材料から形成されても良い。ナノポア形成の点から、薄膜部分の材料は、例えばシリコン、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸窒化シリコン（ＳｉＯＮ）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが好ましい。また薄膜部分は、単層であっても複層であっても良く、複層である場合には、後述する電極が薄膜部分の層に挟まれて配置されても良い。固体基板の薄膜部分の厚さは、５ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５０ｎｍである。薄膜部分は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（ＬＰＣＶＤ）により、固体基板上に形成することができる。
【００２４】
固体基板には、少なくとも１つのナノポアが設けられる。本発明において「ナノポア」とは、ナノメートル（ｎｍ）サイズの孔であり、固体基板、好ましくは固体基板の薄膜部分の表裏を貫通する孔である。
【００２５】
また、本発明において「開口」とは、ナノポア形成のために個体基板、または固体基板薄膜部分に開けられた貫通孔であって、当該孔の基板表面側および裏面側に表出している部分を指すものとする。上記開口の形状は、ナノポアが有する側壁と個体基板もしくは固体基板薄膜部分の表面、あるいは裏面とが交差して形成される輪郭形状をなすものとする。
核酸の特性解析時に、試料溶液中の核酸塩基やイオンなどは一方の開口からナノポアに進入し、同じ又は反対側の開口からナノポア外に出る。
【００２６】
ナノポアのサイズ（即ち、開口のサイズである。ただし、後述するように化学修飾分子を有する電極を用いた場合には、実効ナノポアのサイズとは異なる場合がある。）は、解析対象の種類によって適切なサイズを選択することができる。ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の直径は約１．５ｎｍであり、ｓｓＤＮＡを解析するためのナノポア径の適切な範囲は１．５ｎｍ〜１０ｎｍ程度、好ましくは１．５ｎｍ〜２．５ｎｍ程度である。ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の直径は２．６ｎｍであり、ｄｓＤＮＡを解析するためのナノポアの径の適切な範囲は３ｎｍ〜１０ｎｍ程度、好ましくは３ｎｍ〜５ｎｍ程度である。ナノポアの深さは、固体基板又は固体基板の薄膜部分の厚さを調整することにより変えることができる。
【００２７】
ナノポアの深さは、核酸塩基を構成するモノマー単位の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上の大きさとする。例えば、核酸塩基３個以上の大きさとした場合は、約１ｎｍ以上となる。これにより、核酸塩基の形状と移動速度を制御しながらナノポアに進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。
【００２８】
またナノポアの形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
【００２９】
ナノポアは、固体基板に少なくとも１つ設けることができ、複数のナノポアを設ける場合には、規則的に配列することが好ましい。ナノポアは、当技術分野での公知の方法により、例えば電子ビームやイオンビームを照射することにより、リソグラフィ技術などを使用することにより、固体基板に形成することができる。
【００３０】
固体基板には、少なくとも２つの電極が配置される。材料としては、例えば金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、銅、鉄、アルミ、チタン、ニッケル、タンタル、タングステン、コバルト、クロム、モリブデン、ニオブなどの金属や、窒化チタン、窒化タンタル、窒化タングステン、窒化ニオブ、窒化クロムなどの金属窒化物やタングステンシリサイド、チタンシリサイド、コバルトシリサイド、ニッケルシリサイドなどのシリサイドや、グラファイトやグラフェン、カーボンナノチューブなどのカーボン材料、シリコンやゲルマニウムなどの半導体、上記の混合物などが挙げられる。
【００３１】
電極はナノポアに面して設けられており、鋭角の端部を有して、端部をナノポアに面することが望ましい。その端部の角度は１０〜８０度、好ましくは１０〜４５度とする。なお、電極端部の頂点部分は厳密な意味での点でなくともよく、好ましくは１．５ｎｍ〜５ｎｍ以下、より好ましくは１．５ｎｍ〜２．５ｎｍ程度の曲率半径を有する丸みを帯びた形状であってもよい。鋭角の端部以外の電極の形状や大きさは、特に制限されるものでなく、使用する固体基板及びナノポアの大きさ、使用する電源などに応じて適宜選択することができる。
【００３２】
鋭角の端部の電極の厚さは、採用する材料に応じて、０．１ｎｍ〜１０ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ〜５ｎｍとする。より好ましくは０．１ｎｍ〜２ｎｍとする。鋭角の端部の電極の厚さが小さいほど、トンネル電流の伝導する空間を限定することができ、高分解能での解析が可能となる。鋭角の端部以外の電極の厚さは、特に制限されるものでなく、電極材料の抵抗率などに応じて適宜選択することができる。
【００３３】
電極は、その端部がナノポアに面して配置されていることが好ましい。より具体的には、電極をナノポア中心軸に対して直交する面内に、かつ薄膜の端部をナノポアに面して配置する。電極の端部はナノポアに面して設けられている限り、固体基板や薄膜部分の表面上に配置されてもよいし、あるいは固体基板や薄膜部分の内部に配置されてもよい。例えば、固体基板や薄膜部分を電気的絶縁体とし、その内部に電極を配置し、断面を絶縁体−電極−絶縁体の積層構造としてもよいし、更に絶縁体−電極−絶縁体−・・・−電極−絶縁体−と電極の層を複数積層した構造としてもよい。
【００３４】
電極は１つのナノポアに対して２つ以上が配置されており、電極数が多いほど核酸塩基に対する識別能が向上する。配置された２つ以上の電極のうち、少なくとも１つには化学修飾分子を付与する。化学修飾分子を付与する電極を複数とする場合は、全て同じ化学修飾分子としても良いし、全て異なる化学修飾分子としても良い。所望の感度が得られるよう、化学修飾分子付電極の数と化学修飾分子の種類の数を適宜決定する。
【００３５】
電極は、当技術分野で公知の方法により作製し、固体基板や薄膜部分の表面や内部に配置することができる。例えば、薄膜部分内部にチタン電極を配置する場合は、薄膜上に所望の厚さのチタンをスパッタリングにより堆積させた後、リソグラフィとドライエッチングによりチタン膜を所望の形状にパターニングし、その上から薄膜材料を堆積することにより実現できる。
【００３６】
電極端部には化学修飾分子を付与し、特定または複数の核酸塩基に対する識別能を上げる。化学修飾分子の厚さは２ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ以下、より好ましくは０．５ｎｍ以下とする。例えば、Ａに対する識別能を上げるためにはＴを修飾した電極を用い、Ｃに対してはＧを修飾した電極を用い、Ｔに対してはＡを修飾した電極を用い、Ｇに対してはＣを修飾した電極を用い、ウラシルに対してはＡを修飾した電極を用いる。核酸分子以外の化学修飾分子としては、例えば４−メルカプト安息香酸のような有機化合物を用いても良い。電極への核酸分子や有機化合物の化学修飾分子は、電極材料と核酸分子や有機化合物の電気的性質や化学的性質を利用して行う。例えば、核酸塩基のチオール誘導体を用いることで、金電極に核酸分子の化学修飾を行うことができる。有機化合物の化学修飾は自己組織化単分子膜の形成プロセスにより行うことが望ましい。複数の電極に対して、異なる化学修飾分子を付与する場合は、電極への電圧印加や表面状態の違い等によって化学修飾される電極の選択性を変えたり、不要な化学修飾分子の付与された電極に電流を流して不要な化学修飾分子を除去したりするなどして行う。
【００３７】
従来構造のトンネル電流方式固体ナノポアの電極端部に化学修飾分子を付与した場合、実効的な電極間距離と実効的なナノポアの径および実効的なナノポアの面積が減少し、ＤＮＡが通過できなくなる恐れがある。詳細は実施例１にも示すが、例えば、２つの対向した電極を有する、ナノポア径と電極間距離とが２ｎｍと等しい１本鎖解析向け円形ナノポアの１つの電極先端に１ｎｍ厚の化学修飾分子を付与した場合、化学修飾部先端と対向する化学修飾分子の無い電極先端との間の距離は１ｎｍとなるため、１本鎖ＤＮＡが通過できない可能性が高い。また、通過できたとしても、電極間からずれた位置を通過した場合は感度が低下するため好ましくない。
【００３８】
そこで、化学修飾後の実効的なナノポアの大きさが解析対象の種類に応じて適切なサイズとなるように化学修飾前のナノポアの大きさや形状、電極間距離、薄膜部分や電極の構造を調整する。具体的には、例えば、化学修飾分子の厚み分ナノポア径と電極間距離を大きくしておくことが挙げられる。従来構造のトンネル電流方式固体ナノポアの場合、電極先端と開口の縁はほぼ一致しているため、電極先端の化学修飾分子は、その厚さ分だけ開口の縁から突き出すことになる。化学修飾部の機械的、化学的強度が低い場合、ナノポアに入ってくる試料や試料溶液が化学修飾部に衝突することによって機能の劣化や化学修飾分子の剥離が起こる可能性がある。これを避ける手段としては、例えば、ナノポア径は解析対象の種類に応じた適切なサイズとしておき、電極先端と開口の縁との間に化学修飾分子を付与できるように電極のみを化学修飾分子の厚さ分後退させることが挙げられる。
【００３９】
本発明の分析装置は、核酸の移動速度を制御する機構、即ち試料移動機構を備えることが好ましい。試料移動機構は、例えば電極間の電流計測に同期して、核酸の中のモノマーを１単位ずつ、分析デバイスのナノポア中に進入させる。そのような機構としては、例えば電気泳動により核酸を駆動する試料駆動装置（任意関数発生器、電極等）を使用することができる。このような試料移動機構によって、核酸中のモノマーが順次ナノポアに進入し、離脱するように核酸の移動を制御することができ、ここのモノマーに対応するトンネル電流を経時的に取得することができる。
【００４０】
また、核酸の移動速度を制御する方法として、核酸を含む試料溶液の粘性を高める方法がある。例えば分析デバイス周囲の温度を制御して、試料溶液の温度を低下させ、試料溶液の粘性を高くすることによって、核酸のブラウン運動が抑えられる。あるいは、試料溶液に測定対象以外の生体ポリマーを添加することにより、試料溶液の粘性を高くできると同時に、核酸の立体構造を直鎖状にすることができるため、核酸の形状と移動速度を制御することが可能となる。その際、測定対象以外の生体ポリマーとしては、好ましくはナノポアの内径よりも大きいサイズのポリマー、より好ましくは３次元的にクロスリンクされたポリマーを用いることにより、測定対象以外の生体ポリマーはナノポアに進入することができず、測定対象でない生体ポリマーによるトンネル電流変化を排除することが可能となる。
【００４１】
核酸の移動速度を制御する別の方法は、本発明の分析デバイスの上部及び下部に存在するそれぞれの試料溶液に圧力差を印加する方法である。例えば、核酸が電気泳動によってナノポアを通過しようとする力と反対向きの力を核酸に印加することにより、核酸がナノポアを通過する速度を低下させることができる。
【００４２】
核酸の形状及び／又は移動速度を制御しながら分析デバイスのナノポアに進入させることにより、核酸の主軸とナノポアの中心軸とは概ね一致する。試料移動機構により核酸を駆動することにより、核酸はナノポアを通過し、核酸を構成するモノマーは順次、ナノポア側壁に形成された電極間を通過する。すなわち核酸の主軸方向に沿って配列するモノマーが順次電極間を通過し、その際電極間のトンネル電流が変化する。この変化量がモノマーの種類によって異なるため、トンネル電流を計測することにより、モノマーの識別を順次行うことができる。
【００４３】
本発明においては、上述した本発明の核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置を用いて、核酸の特性解析を行うことができる。本発明において、「核酸」とは、単位構造の低分子（単量体、モノマー）が複数連結した多量体（オリゴマー）や高分子（ポリマー）のうち、生体に存在するもの及び生体に存在するものから誘導されるものを意味する。具体的には、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡとからなるハイブリッド核酸などが含まれる。なお、核酸には、自然には存在しない配列や構成要素が含まれるポリマーが含まれ、例えば、ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｔ）、ｐｏｌｙ（Ｇ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）などの配列又は任意の配列を有する人為的に合成されたポリマー分子も含まれる。また、核酸には、当技術分野で公知の核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）によって調整された核酸や、ベクターにクローニングされている核酸も含まれる。これらの核酸を含む試料の調整方法は、当技術分野で周知であり、当業者であれば、核酸の種類に応じて適宜調整方法を選択することができる。
【００４４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。理解し易くするために、分析対象をｓｓＤＮＡとする。実施例１から５は、核酸分析デバイスの構成を説明し、実施例６から７は核酸分析デバイスの製造方法を説明し、実施例８から９では核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の構成を説明する。但し、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【００４５】
＜実施例１＞
本発明によるｓｓＤＮＡ向け核酸分析デバイスの構成の一例を図１Ａおよび１Ｂを用いて説明する。ここでは、対向する２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポア（以下、２電極付ナノポアとする）において、２つの電極に対して化学修飾分子を付与した場合の構造を上面図と断面図を用いて説明する。電極１０２は絶縁膜１０３により挟んだ構造とする。上面図では、電極１０２の形状を示すために絶縁膜１０３を非表示とするが、絶縁膜１０３の開口１０１は示す。また、電極１０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００４６】
まず、図１Ａに化学修飾分子の無い従来構造の２電極付ナノポアを比較のために示す。開口１０１の形状は円形で、ｓｓＤＮＡを分析するためにナノポア径と電極間距離を２ｎｍとした。図１Ｂは本発明により、化学修飾分子１０４を電極１０２の表面に付与した構造である。化学修飾分子１０４の厚さは１ｎｍ以下である。図１Ａの従来構造の２電極付ナノポアの２つの電極１０２に化学修飾分子１０４を付与したものが図１Ｂ（ａ）である。
ここで、図１Ｂにおいて、上面図には（ａ１）、断面図には（ａ２）の記号を付しているが、上面図あるいは断面図の区別を特に必要としない場合は、（ａ）と表記する。以下の図面の表記においても、同様な表記を採用するものとする。
【００４７】
図１Ｂ（ａ）の場合、電極１０２の先端の化学修飾分子１０４は、その厚さ分だけ開口１０１の縁から突き出すため、実効的なナノポア１０５の面積が減少し、分析対象であるｓｓＤＮＡが通過できない可能性がある。
【００４８】
そこで、図１Ｂ（ｂ）のように、化学修飾分子１０４の厚さ分だけナノポア径及び電極間距離を大きくし、化学修飾部の間の距離がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにする。しかし、図１Ｂ（ｂ）のように開口１０１の形状が円形の場合、上面図における縦方向の実効的なナノポア１０５のサイズは２ｎｍより大きく、ｓｓＤＮＡの分析に適したサイズよりも大きくなるため、精度良く塩基配列を読み出せない可能性がある。
【００４９】
そこで、図１Ｂ（ｃ）のように、化学修飾後の実効的なナノポア１０５の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにする。具体的には、開口１０１の形状を楕円とし、長径方向に対向する化学修飾分子付電極を配置し、化学修飾部の間の距離と短径を２ｎｍとする。この構造により、精度良く塩基配列を読み出すことができる。
しかし、図１Ｂ（ｃ）の構造の場合、化学修飾分子１０４が開口１０１の縁から突き出した構造をしているため、化学修飾部の機械的、化学的強度が低い場合、ナノポア１０５に入ってくる試料や試料溶液が化学修飾部に衝突することによって機能の劣化や化学修飾分子１０４の剥離が起こる可能性がある。その場合は、開口１０１をｓｓＤＮＡの分析に適した直径２ｎｍの円形とし、電極１０２の先端と開口１０１の縁との間に化学修飾分子１０４を付与できるように電極１０２のみを化学修飾分子１０４の厚さ分程度後退させる。図１Ｂ（ｄ）のように後退させると、化学修飾後も化学修飾分子１０４が開口１０１の縁から突き出さないため、長時間の使用による化学修飾分子１０４の機能の劣化や剥離を抑制できる。
【００５０】
図１Ｂ（ｄ）の構造は精度と信頼性・耐久性を両立させた構造であるが、構造がやや複雑なため、比較的製造コストが高い。求められるコストと精度と信頼性・耐久性に応じて構造を選ぶと良い。
【００５１】
本実施例における各電極先端の化学修飾分子１０４は、同じであっても、異なっても良い。また、開口１０１の形状は、円や楕円でなくとも、それに類する多角形としても良い。
【００５２】
＜実施例２＞
実施例１では同一平面上に２つの電極を有するトンネル電流方式固体ナノポアに化学修飾分子を付与した実施例を示したが、ここでは、同一平面上に２つよりも多くの電極を備えるトンネル電流方式固体ナノポアに化学修飾分子を付与した実施例を図２を用いて説明する。図２に同一平面上に３〜６つの電極２０２を有する固体ナノポアの上面図を示す。電極２０２は絶縁膜により挟んだ構造とする。電極２０２の形状を示すために絶縁膜を非表示とするが、開口２０１は示す。また、電極２０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００５３】
図２（ａ１）、（ａ２）が３電極を有する固体ナノポア、図２（ｂ１）、（ｂ２）が４電極を有する固体ナノポア、図２（ｃ１）、（ｃ２）が５電極を有する固体ナノポア、図２（ｄ１）、（ｄ２）が６電極を有する固体ナノポアのそれぞれ上面図および断面図である。
【００５４】
図２（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）は化学修飾分子２０４が開口２０１よりも突き出た構造をしており、図２（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）は図１Ｂ（ｄ）と同様に化学修飾分子２０４が電極２０２の先端と開口２０１の縁の間にあり、開口２０１より突き出ていない。前者は化学修飾後の実効的なナノポア２０５の径をｓｓＤＮＡに適した２ｎｍとし、後者はナノポア径を２ｎｍとする。前者は比較的製造コストが低い一方で信頼性・耐久性が低い可能性があり、後者は逆の特徴を持つ。
【００５５】
＜実施例３＞
実施例１〜２では、２つ以上の電極の内、全ての電極に化学修飾分子を付与したが、全ての電極に付与せずに一部の電極のみに付与しても良い。ここでは、２電極付ナノポアにおいて、２つの電極の内、１つの電極のみに化学修飾分子を付与した場合の実施例を図３を用いて説明する。図３に同一平面上に２つの電極を有する２電極付ナノポアの上面図と断面図を示す。電極３０２は絶縁膜３０３により挟んだ構造とする。電極３０２の形状を示すために絶縁膜３０３を非表示とするが、開口３０１は示す。また、電極３０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００５６】
図３（ａ）は開口３０１の形状が円形で、電極３０２の先端と開口３０１の縁が一致し、２つの電極３０２の片方に化学修飾分子３０４を付与することにより、化学修飾部先端と化学修飾分子の無い電極先端間の距離をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとした２電極付ナノポアである。この構造は、図１Ｂ（ｂ）の化学修飾部を１つ外して、円形の開口１０１の直径を小さくした構造に相当し、実施例１で説明したように、精度良く塩基配列を読み出せない可能性と信頼性・耐久性が低い可能性がある。
【００５７】
図３（ｂ）は電極３０２の先端と開口３０１の縁が一致し、片方の電極に化学修飾分子３０４を付与することにより、実効的なナノポア３０５の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにナノポアを形成した２電極付ナノポアである。具体的には、開口３０１の形状を楕円とし、長径方向に対向する電極３０２を配置し、２つの電極３０２の片方にのみ化学修飾分子３０４を付与し、化学修飾部先端と化学修飾分子の無い電極先端間の距離と短径を２ｎｍとする。この構造は、図１Ｂ（ｃ）の化学修飾部を１つ外して、楕円形の開口１０１の長径を小さくした構造に相当し、実施例１で説明したように、精度良く塩基配列を読み出せる一方、信頼性・耐久性が低い可能性がある。
【００５８】
図３（ｃ）は開口３０１の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍで、２つの電極３０２は共に開口３０１の縁よりも化学修飾分子３０４の厚さ分後退しており、２つの電極３０２の片方のみに化学修飾分子３０４が付与されている２電極付ナノポアである。電極３０２を開口３０１の縁よりも後退した構造を作製する場合、複数の電極３０２に対してそれぞれ異なる寸法だけ後退した構造を作製することは困難であるため、全ての電極３０２を開口３０１の縁よりも化学修飾分子３０４の厚さ分後退させた構造とする。この構造は、図１Ｂ（ｄ）の化学修飾部を１つ外した構造に相当し、実施例１で説明したように、精度と信頼性・耐久性を両立させた構造であるが、構造がやや複雑なため、比較的製造コストが高い。
【００５９】
＜実施例４＞
実施例３では、２電極付ナノポアにおいて、２つの電極の片方のみに化学修飾分子を付与した実施例を示したが、ここでは、同一平面上に２つよりも多くの電極を備えるトンネル電流方式固体ナノポアにおいて、１つ以上の電極に化学修飾分子を付与するが、全ての電極に化学修飾分子を付与しない場合の具体例として、１つの電極を除いて化学修飾分子を付与した実施例を図４Ａ〜４Ｄを用いて説明する。
【００６０】
図４Ａ〜図４Ｄに同一平面上に３〜６つの電極４０２を有する固体ナノポアの上面図を示す。電極４０２は絶縁膜により挟んだ構造とする。電極４０２の形状を示すために絶縁膜を非表示とするが、開口４０１は示す。また、電極４０１は配線に接続されるが、図では省略する。図４Ａが３電極を有する固体ナノポア、図４Ｂが４電極を有する固体ナノポア、図４Ｃが５電極を有する固体ナノポア、図４Ｄが６電極を有する固体ナノポアである。図４Ａ（ａ１）、４Ｂ（ｂ１）、４Ｃ（ｃ１）、４Ｄ（ｄ１）は、図３（ａ）と同様に開口４０１が円形で、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出た構造をしており、図４Ａ（ａ２）、４Ｂ（ｂ２）、４Ｃ（ｃ２）、４Ｄ（ｄ２）は、図３（ｂ）と同様に開口４０１が楕円形またはそれに類する形状で、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出た構造をしており、図４Ａ（ａ３）、４Ｂ（ｂ３）、４Ｃ（ｃ３）、４Ｄ（ｄ３）は、図３（ｃ）と同様に開口４０１が円形で、化学修飾分子４０４は電極４０２の先端と開口４０１の縁の間にあり、開口４０１には突き出ていない。
【００６１】
開口４０１が円形で、電極４０２の先端と開口４０１の縁が一致し、化学修飾分子４０４が開口４０１より突き出た構造の場合、図４Ａ（ａ１）、４Ｂ（ｂ１）、４Ｃ（ｃ１）、４Ｄ（ｄ１）に示すように、化学修飾分子の無い電極の先端が、他の化学修飾分子付電極の化学修飾部先端より離れてしまい、化学修飾部先端と化学修飾分子の無い電極の先端の位置で決まる実効的なナノポア４０５のサイズがｓｓＤＮＡの分析に適したサイズよりも大きくなり、精度良く塩基配列を読み出せない可能性がある。また、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性もある。
【００６２】
これに対して、図４Ａ（ａ２）、４Ｂ（ｂ２）、４Ｃ（ｃ２）、４Ｄ（ｄ２）に示すように、開口４０１の形状を楕円またはそれに類する形状とし、実効的なナノポア４０５の径がｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとなるようにナノポアを形成し、電極４０２を配置すると、精度を向上することができる。しかし、化学修飾分子４０４が開口４０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性がある。図４Ａ（ａ２）、４Ｂ（ｂ２）、４Ｃ（ｃ２）、４Ｄ（ｄ２）は、化学修飾分子の無い電極が１つの場合であるが、この構造の場合、化学修飾分子の無い電極の数に応じて開口４０１の形状や電極４０２の配置を調整し、実効的なナノポア４０５の大きさを分析対象に適した大きさにする必要がある。
【００６３】
一方、図４Ａ（ａ３）、４Ｂ（ｂ３）、４Ｃ（ｃ３）、４Ｄ（ｄ３）に示すように、開口４０１の形状が円形で、直径をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとし、化学修飾分子４０４が電極４０２の先端と円形の開口４０１の縁との間にあり、開口４０１には突き出ない構造の場合、図３（ｃ）の構造と同様に、精度と信頼性・耐久性を両立させることができるが、比較的製造コストが高い。また、この構造の場合、開口４０１の形状や、電極４０２の配置が化学修飾分子の無い電極の数に依らない。
【００６４】
＜実施例５＞
実施例１〜４では、同一平面上に２つ以上の電極を有し、電極の層が１層であるトンネル電流方式固体ナノポアの電極に対して化学修飾分子を付与した場合の構造を説明した。同一平面上の電極数が多いほど、製造の難易度が上がり、歩留まりが低下する恐れがあるため、同一平面上の電極数は４以下とし、金属の層と絶縁膜の積層数を増やすことにより電極数を増やした方が歩留まりが高い場合がある。ここでは、同一平面上の電極数を２つとし、電極の層を４層としたトンネル電流方式固体ナノポアの全ての電極に対して化学修飾分子を付与した場合の構造を図５を用いて説明する。
【００６５】
図５に同一平面上に２つの電極５０２を有し、電極５０２の層が４層である８電極付ナノポアの上面図と断面図を示す。各電極５０２は絶縁膜５０３により分離された構造とする。電極５０２の形状を示すために絶縁膜５０３を非表示とするが、開口５０１は示す。また、電極５０２は配線に接続されるが、図では省略する。
【００６６】
図５（ａ）は開口５０１の形状が円形で、電極５０２の先端と開口５０１の縁が一致し、電極５０２に化学修飾分子５０４を付与することにより、化学修飾部先端間の距離をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとした８電極付ナノポアである。上面図が図１Ｂ（ｂ）のそれと同様であるため、図１Ｂ（ｂ）の電極付ナノポアと同様に、化学修飾部先端間の距離が２ｎｍであっても、上面図における縦方向の実効的なナノポア５０５のサイズは２ｎｍより大きく、ｓｓＤＮＡの分析に適したサイズよりも大きくなるため、精度良く塩基配列を読み出せない可能性がある。また、化学修飾分子５０４が開口５０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性もある。
【００６７】
これに対して図５（ｂ）は図１Ｂ（ｃ）と同様に、開口５０１の形状を楕円とし、長径方向に対向する化学修飾付電極を配置し、化学修飾部の間の距離と短径を２ｎｍとした８電極付ナノポアである。実効的なナノポア５０５のサイズがｓｓＤＮＡの分析に適したサイズであるため、精度良く塩基配列を読み出すことができる。しかし、化学修飾分子５０４が開口５０１よりも突き出ているため、信頼性・耐久性が低い可能性がある。
【００６８】
一方、図５（ｃ）に示すように、開口５０１の形状が円形で、直径をｓｓＤＮＡの分析に適した２ｎｍとし、化学修飾分子５０４が電極５０２の先端と円形の開口５０１の縁との間にあり、開口５０１には突き出ない構造の場合、図１Ｂ（ｄ）の構造と同様に、精度と信頼性・耐久性を両立させることができるが、比較的製造コストが高い。
【００６９】
本実施例では、同一平面上の電極５０２の数を２つ、電極５０２の層を４層としたが、電極５０２の数と層数は任意に選ぶことができる。同一平面上の電極５０２の数が３〜６の場合は、上面図は図２と同様となる。また、本実施例では、全ての電極５０２に化学修飾分子５０４を付与した場合を示したが、化学修飾分子の無い電極を有しても良い。更に、各電極先端の化学修飾分子５０４は、同じであっても、異なっても良く、任意に選ぶことができる。
【００７０】
＜実施例６＞
本発明によるｓｓＤＮＡ向け核酸分析デバイスの製造方法例を図６Ａから６Ｊを用いて説明する。ここでは、同一平面上に対向した２つの電極を有し、電極の先端と開口の縁が一致し、化学修飾分子が開口より突き出た構造の２電極付ナノポアの製造方法の一例を示す。図６Ａから６Ｊは製造プロセスフロー図で、デバイスの断面構造を示している。製造プロセスを以下で説明する。
【００７１】
結晶面方位が（１００）面のシリコン単結晶基板６０６上にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜６０７を２０ｎｍ堆積させ、その上にパッド電極となる窒化チタン膜６０８をスパッタリングにより５０ｎｍ堆積させてリソグラフィとドライエッチングにより窒化チタン膜６０８をパッドの形状（１００μｍ角）にパターニングする（図６Ａ）。
【００７２】
次に、トンネル電流計測用の電極となる窒化チタン膜６０９をＣＶＤ法により５ｎｍ堆積させて（図６Ｂ）、電極の形状にパターニングする（図６Ｃ）。電極はナノポアの形成される位置をギャップ６１０とし、分離された電極とする。ギャップ６１０の幅は形成する開口の大きさと合わせる。ここでは４ｎｍとする。この実施例では、ギャップ６１０を挟んで対向した電極としてパターニングしたが、ギャップ６１０の無い繋がった電極としても良い。但し、その場合、繋がっている電極をナノポア６１６（図６Ｉ参照）形成時に切断する必要がある。電極のパターニング後、ＣＶＤ法により２０ｎｍのシリコン窒化膜６１１、６０ｎｍのシリコン酸化膜６１２、２００ｎｍのシリコン窒化膜６１３を堆積する（図６Ｄ）。
【００７３】
次に、リソグラフィとドライエッチングにより、パッド上部のシリコン窒化膜６１１とシリコン酸化膜６１２とシリコン窒化膜６１３を除去し、窒化チタン６０９を露出させる。更に、電極ギャップ上部の２００ｎｍのシリコン窒化膜６１３を除去し、シリコン酸化膜６１２を露出させる（図６Ｅ、露出させる面積は５μｍ角とする）。その後、裏面にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜６１４を４００ｎｍ堆積し、リソグラフィとドライエッチにより１０３０μｍ角のシリコン基板６０６が露出した領域を形成する（図６Ｆ）。
【００７４】
次に裏面から露出したシリコン基板６０６を水酸化カリウム水溶液により異方性エッチングし、３０μｍ角前後のシリコン基板６０６の無い薄膜部分６１５を形成する（図６Ｇ）。薄膜部分６１５のシリコン酸化膜６１２をフッ酸によるウェットエッチで除去し（図６Ｈ）、透過型電子顕微鏡による電子ビームを照射することによりナノポア６１６を形成する（図６Ｉ）。開口の形状は、長径４ｎｍ、短径２ｎｍの楕円とし、長径方向に電極がある。ナノポア６１６の形成後、２つの電極表面に化学修飾分子６０４を付与する（図６Ｊ）。化学修飾分子６０４の厚さを約１ｎｍとし、２つの化学修飾部の間の距離が約２ｎｍにする。上面図は図１Ｂ（ｃ）と同様となる。ここでは化学修飾分子６０４には４−メルカプト安息香酸を用いた。
【００７５】
本実施例では、同一平面上に対向した２つの電極を有する２電極付ナノポアの製造方法を説明したが、電極の層が１層で２つよりも多くの電極を有する電極付ナノポアを製造する場合は、パッドのパターニング（図６Ａ）と電極のパターニング（図６Ｃ）を変更することで実現できる。また、図５（ｂ）のように電極の層を複数にする場合は、図６Ｂの後にシリコン窒化膜と窒化チタンを交互に堆積させて、図６Ｃと同様に最も下層の窒化チタンまで一括でパターニングする。更に、電極の数だけパッドを用意し、配線で各電極とパッドを接続すればよい。
本実施例では全ての電極に化学修飾分子６０４を付与したが、全ての化学修飾分子６０４が異なっても、同一でも良いし、化学修飾分子の無い電極が混在しても良い。
【００７６】
＜実施例７＞
実施例６では化学修飾分子が開口より突き出た構造の電極付ナノポアの製造方法を説明した。ここでは、同一平面上に対向した２つの電極を有し、化学修飾分子が電極先端と開口の縁との間にあり、開口には突き出ない構造の２電極付ナノポアの製造方法の一例を説明する。図７Ａ〜７Ｋは製造プロセスフロー図で、デバイスの断面構造を示している。製造プロセスを以下で説明する。
【００７７】
結晶面方位が（１００）面のシリコン単結晶基板７０６上にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜７０７を５０ｎｍ堆積させ、その上にＣＶＤ法によりアモルファスシリコン膜７１７を１０ｎｍ堆積させ、更にその上にパッド電極となる窒化チタン膜７０８をスパッタリングにより５０ｎｍ堆積させてリソグラフィとドライエッチングにより窒化チタン膜７０８をパッドの形状（１００μｍ角）にパターニングする（図７Ａ）。
【００７８】
次にスパッタリングにより金／チタン膜７１８を堆積させて（図７Ｂ）、電極の形状にパターニングする（図７Ｃ）。本実施例では、電極材料に５ｎｍの金、金と下地のアモルファスシリコン膜７１７との接着層に１ｎｍチタンを用いた。金は酸化しにくい導電材料として選んだ。電極はナノポアの形成される位置をギャップ７１０とし、分離された電極とする。ギャップ７１０の幅は図７Ｉにて形成するナノポアの大きさと合わせる。ここでは４ｎｍとする。本実施例では、ギャップ７１０を挟んで対向する電極としてパターニングしたが、ギャップの無い繋がった電極としても良い。その場合、繋がっている電極をナノポア７１６形成時に切断する必要がある。電極のパターニング後、ＣＶＤ法により１０ｎｍのアモルファスシリコン膜７１９、６０ｎｍのシリコン酸化膜７１２、２００ｎｍのシリコン窒化膜７１３を堆積する（図７Ｄ）。
【００７９】
次に、リソグラフィとドライエッチングにより、パッド上部のアモルファスシリコン膜７１９とシリコン酸化膜７１２とシリコン窒化膜７１３を除去し、金／チタン膜７１８を露出させる。更に、電極ギャップ上部の２００ｎｍのシリコン窒化膜７１３を除去し、シリコン酸化膜７１２を露出させる（図７Ｅ、露出させる面積は５μｍ角とする）。その後、裏面にＣＶＤ法によりシリコン窒化膜７１４を４００ｎｍ堆積し、リソグラフィとドライエッチにより１０３０μｍ角のシリコン基板７０６が露出した領域を形成する（図７Ｆ）。
【００８０】
次に裏面から露出したシリコン基板７０６を水酸化カリウム水溶液により異方性エッチングし、３０μｍ角前後のシリコン基板７０６の無い薄膜部分７１５を形成する（図７Ｇ）。
【００８１】
薄膜部分７１５の表面側のシリコン酸化膜７１２をフッ酸によるウェットエッチで除去し、更に薄膜部分７１５の裏面側のシリコン窒化膜７０７を熱リン酸によるウェットエッチで除去する（図６Ｈ）。その後、透過型電子顕微鏡による電子ビームを照射することによりナノポア７１６を形成する（図７Ｉ）。開口の形状は、直径４ｎｍの円とする。対向する２つの電極間の距離も４ｎｍである。ナノポア７１６形成後、酸素プラズマに曝すことで、電極上下を挟むアモルファスシリコン膜７１７、７１９を酸化する。アモルファスシリコン膜がシリコン酸化膜となることで、体積が増加し、ナノポアが小さくなる。酸化後のナノポアの直径が２ｎｍとなるように酸素プラズマのパワーと時間を調整する。酸素プラズマ曝露の結果、電極上下のアモルファスシリコン膜が形成していた直径４ｎｍの円形の開口は、シリコン酸化膜による直径２ｎｍの円形の開口となる一方、電極材料の金は酸化しにくいため、酸化による体積増加は発生せず、２つの電極間距離は変わらない（図７Ｊ）。この後、２つの電極表面に化学修飾分子７０４を付与する（図７Ｋ）。化学修飾分子７０４の厚さを約１ｎｍとし、２つの化学修飾部の間の距離が約２ｎｍにする。上面図は図１Ｂ（ｄ）と同様となる。ここでは化学修飾分子７０４には４−メルカプト安息香酸を用いた。
【００８２】
本実施例では、同一平面上に対向した２つの電極を有する２電極付ナノポアの製造方法を説明したが、電極の層が１層で２つよりも多くの電極を有する電極付ナノポアを製造する場合は、パッドのパターニング（図７Ａ）と電極のパターニング（図７Ｃ）を変更することで実現できる。また、図５（ｃ）のように電極の層を複数にする場合は、図７Ｂの後にアモルファスシリコン膜と金／チタン膜を交互に堆積させて、図７Ｃと同様に最も下層の金／チタン膜まで一括でパターニングする。更に、電極の数だけパッドを用意し、配線で各電極とパッドを接続すればよい。
【００８３】
本実施例では全ての電極に化学修飾分子７０４を付与したが、全ての化学修飾分子７０４が異なってもよいし、同一でもよい。また、化学修飾分子の無い電極が混在してもよい。
【００８４】
＜実施例８＞
本発明による核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一構成を図８を用いて説明する。核酸分析装置は、第一溶液槽８２１、第二溶液槽８２２、両溶液槽を分割する化学修飾分子の付与された電極付ナノポアによる核酸分析デバイス８２３、ナノポア８１６を通じて核酸８３７を第一溶液槽８２１と第二溶液槽８２２との間で移動させる核酸駆動手段８２４、８２５、制御及びデータ処理手段８２６で構成される。本実施例では核酸駆動手段８２４、８２５を両溶液槽に配置したが、これに加えて、又はこれの替わりに核酸駆動手段８２４、８２５を核酸分析デバイス８２３に内蔵させても良い。両溶液槽には溶液を導入する導入口８２７、８２８と溶液を排出する排出口８２９、８３０がそれぞれ備えられている。更に、両溶液槽には電極８３１、８３２が備えられており、電極８３１、８３２は極性及び出力可変の電圧源８３３と電流計８３４に接続されている。これら電極８３１、８３２は、核酸駆動手段８２４、８２５にそれぞれ内蔵させても良い。
【００８５】
本実施例では、核酸分析デバイス８２３に全電極８０２に化学修飾分子８０４が付与された２電極付ナノポアを用いた例を示す。２つの電極８０２の間に極性及び出力可変の電圧源８３５と電流計８３６を接続する。電圧源８３３、８３５、電流計８３４、８３６、核酸駆動手段８２４、８２５は制御及びデータ処理手段８２６に接続されている。
【００８６】
核酸８３７を解析する際には、解析対象である核酸８３７をバッファ溶液に混合し、導入口８２７より第一溶液槽８２１に、バッファ溶液のみを導入口８２８より第二溶液槽８２２に導入する。核酸駆動手段８２４、８２５により、核酸８３７を第一溶液槽８２１から第二溶液槽８２２へ移動させる。核酸駆動と同時に電圧源８３３を用いて２つの電極８３１、８３２の間を流れる電流、即ち、ナノポア８１６を介して流れるイオン電流を電流計８３４を用いて計測する。核酸８３７がナノポア８１６に導入されるとイオン電流値が減少する。イオン電流値が減少したら、電極８０２の間を流れるトンネル電流により塩基種の識別が可能となるよう、核酸駆動手段８２４、８２５により、核酸８３７がナノポア８１６を通過するスピードを調節する。塩基種の識別は一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いや、各塩基の電流−電圧特性の違いにより識別する。
【００８７】
ここで、一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いでＤＮＡ鎖の塩基識別を行う方法を説明する。ＤＮＡ鎖の塩基にはＡＴＧＣの４種類があるが、これらの塩基の種類ごとに固有の電流値が観測され、制御及びデータ処理手段８２６に送られる。一例を図９に示す。予め、各塩基１種類のみが連なったポリマーがナノポア８１６を通過するときのトンネル電流を計測し、各塩基種に対応した電流値を求め、制御及びデータ処理手段のメモリに記憶しておく。そして、解析対象のＤＮＡ鎖のトンネル電流計測時に得られた電流値と予め計測した各塩基種に対応した電流値を比較することにより、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列を知ることができる。
【００８８】
核酸８３７を構成する全ての塩基が電極間を通過して、塩基識別が完了した後、同一の核酸８３７を逆方向に駆動して再び塩基識別を行い、ベリファイを行っても良い。また、核酸８３７がナノポア８１６を通過するスピードが速いために一回の測定で塩基種の識別ができない場合には、同一塩基を繰返し計測することにより統計的に識別しても良い。核酸８３７の分析が完了したら、排出口８３０から排出する。
【００８９】
本実施例では、１個のナノポアを有する核酸分析デバイスを使ったトンネル電流の計測を行っているが、多数のナノポアを同一基板上に配置して、多数の解析対象核酸のトンネル電流の同時計測により、スループットの向上も図れる。
【００９０】
＜実施例９＞
実施例８では化学修飾分子が付与された２電極付ナノポアを用いた核酸分析装置の一構成を説明した。１つのナノポアに対し、２つより多くの電極を用いて様々な電極間を流れるトンネル電流で塩基の種類を識別する方が、２電極の場合より識別能高く高精度に塩基配列を解析することができる。ここでは、化学修飾分子が付与された電極付ナノポアを用いた核酸分析装置の内、１つのナノポアに対して２つより多い電極を持つ電極付ナノポアを用いた核酸分析装置の一構成を図１０を用いて説明する。ここでは、図５（ｃ）のように、同一平面上の電極数を２つとし、電極の層を４層とした８電極付ナノポアを用いた例を説明する。８つの電極は４層の２電極対から構成されており、最も上層の電極対にはＴを修飾し、Ａに対する識別能を上げ、最も上層から２番目の電極対にはＣを修飾し、Ｇに対する識別能を上げ、最も上層から３番目の電極対にはＡを修飾し、Ｔに対する識別能を上げ、最も下層の電極対にはＧを修飾し、Ｃに対する識別能を上げている。
【００９１】
装置は、実施例８と同様に、第一溶液槽１０２１、第二溶液槽１０２２、両溶液槽を分割する化学修飾分子１００４が付与された電極付ナノポアによる核酸分析デバイス１０２３、ナノポア１０１６を通じて核酸１０３７を第一溶液槽１０２１と第二溶液槽１０２２との間で移動させる核酸駆動手段１０２４、１０２５、制御及びデータ処理手段１０２６で構成される。本実施例では核酸駆動手段１０２４、１０２５を両溶液槽に配置したが、これに加えて、又はこれの替わりに核酸駆動手段１０２４、１０２５を核酸分析デバイス１０２３に内蔵させても良い。両溶液槽には溶液を導入する導入口１０２７、１０２８と溶液を排出する排出口１０２９、１０３０がそれぞれ備えられている。更に、両溶液槽には電極１０３１、１０３２が備えられており、電極１０３１、１０３２は極性及び出力可変の電圧源１０３３と電流計１０３４に接続されている。これら電極１０３１、１０３２は、核酸駆動手段１０２４、１０２５にそれぞれ内蔵させても良い。４つの電極対それぞれに極性及び出力可変の電圧源１０３５、１０３８、１０４０、１０４２と電流計１０３６、１０３９、１０４１、１０４３を接続する。電圧源１０３３、１０３５、１０３８、１０４０、１０４２、電流計１０３４、１０３６、１０３９、１０４１、１０４３、核酸駆動手段１０２４、１０２５は制御及びデータ処理手段１０２６に接続されている。本実施例では、４つの電極対につき４組の電圧源と電流計を接続したが、スイッチを用いて、１組の電圧源と電流計を４組の電極対に切り替えて接続しても良い。その場合は、スイッチも制御及びデータ処理手段に接続する。
【００９２】
核酸１０３７を解析する際には、解析対象である核酸１０３７をバッファ溶液に混合し、導入口１０２７より第一溶液槽１０２１に、バッファ溶液のみを導入口１０２８より第二溶液槽１０２２に導入する。核酸駆動手段１０２４、１０２５により、核酸１０３７を第一溶液槽１０２１から第二溶液槽１０２２へ移動させる。核酸駆動と同時に電圧源１０３３を用いて２つの電極１０３１、１０３２の間を流れる電流、即ち、ナノポア１０１６を介して流れるイオン電流を電流計１０３４を用いて計測する。核酸１０３７がナノポア１０１６に導入されるとイオン電流値が減少する。電流値が減少したら、核酸分析デバイス１０２３が有する４つの電極対間を流れるトンネル電流により塩基種の識別が可能となるよう、核酸駆動手段１０２４、１０２５により、核酸１０３７がナノポア１０１６を通過するスピードを調節する。塩基種の識別は一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いや、各塩基の電流−電圧特性の違いにより識別する。
【００９３】
ここで、一定電圧の下で流れるトンネル電流値の違いでＤＮＡ鎖の塩基識別を行う方法を説明する。予め、各塩基１種類のみが連なったポリマーがナノポア１０１６を通過するときの核酸分析デバイス１０２３が有する４つの電極対間を流れるトンネル電流を計測し、４種の塩基に対応した電流値を求め、制御及びデータ処理手段１０２６のメモリに記憶しておく。４つの電極対の内、最も上層の電極対はＡに対する選択感度が高く、Ａが電極間にあるとき、Ａ以外の塩基に比べて十分大きな電流が流れるため、他の塩基と区別できる。
【００９４】
一方、Ａ以外の３種の塩基の識別能は低くても良い。同様に、最も上層から２番目の電極対はＧとＧ以外の塩基とを区別でき、最も上層から３番目の電極対はＴとＴ以外の塩基とを区別でき、最も下層の電極対はＣとＣ以外の塩基とを区別できる。解析対象のＤＮＡ鎖がある時間内に４つの電極対間を通過すると、４つの電極対間のトンネル電流がある時間内で変化する。各トンネル電流変化から、それぞれ別の塩基に対して高感度に識別したデータが得られるため、各データを互いに補完することにより解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列を知ることができる。
【００９５】
具体的には、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列が仮にＡＧＴＣＧＴＡＧＣの場合、ＤＮＡ鎖が４つの電極対間を通過する際に得られるトンネル電流の時間依存性を図１１を用いて説明する。最上層の電極対間を流れるトンネル電流の時間依存性からは、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列が、少なくとも“Ａ？？？？？Ａ？？”であることが分かる。ここで、“？”はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかの塩基。次に、最上層から２番目の電極対間のトンネル電流依存性からは少なくとも“？Ｇ？？Ｇ？？Ｇ？”であると分かる。以下同様に、各電極対間のトンネル電流の時間依存性からそれぞれ選択感度の高い塩基を識別したデータを得て、各データを互いに補完すると、解析対象のＤＮＡ鎖の塩基配列を知ることができる。
【００９６】
実施例８と同様に、核酸１０３７を構成する全ての塩基が４つの電極対間を通過して、塩基識別が完了した後、同一の核酸１０３７を逆方向に駆動して再び塩基識別を行い、ベリファイを行っても良い。また、核酸１０３７がナノポア１０１６を通過するスピードが速いために一回の測定で塩基種の識別ができない場合には、同一塩基を繰返し計測することにより統計的に識別しても良い。核酸１０３７の分析が完了したら、排出口１０３０から排出する。
【００９７】
本実施例では、１個のナノポアを有する核酸分析デバイスを使ったトンネル電流の計測を行っているが、多数のナノポアを同一基板上に配置して、多数の解析対象核酸のトンネル電流の同時計測により、スループットの向上も図れる。
【００９８】
＜実施例１０＞
本発明による核酸分析デバイスの電極対構成の一例を説明する。
電極対間の解析対象核酸のトンネル電流を計測する際、電極対を構成する２つの電極は同じ化学修飾分子にせず、異なる化学修飾分子にしても良いし、片方の電極を化学修飾無しとしても良い。３つ以上の電極を有する核酸分析デバイスにおいて、電極の１つを共通電極としてグランドに接続し、ｎ個の電極で（ｎ−１）対の電極対を構成することができる（ｎ≧３）。ここでは、５つの電極１２０２を有する核酸分析デバイスにおいて、電極１２０２の１つを共通電極とし、４つの電極対を構成した実施例を図１２を用いて説明する。
【００９９】
図１２に同一平面上に５つの電極１２０２を有し、電極層は１層で構成されている。５つの電極１２０２のうち１つの電極を化学修飾無しとし、残り４つの電極には異なる化学修飾分子１２０４を付与する。５つの電極１２０２をここでは、電極ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅと区別して説明する。電極ａには化学修飾を付与せず、電極ｂにはＴを修飾し、Ａに対する識別能を上げ、電極ｃにはＣを修飾し、Ｇに対する識別能を上げ、電極ｄにはＡを修飾し、Ｔに対する識別能を上げ、電極ｅにはＧを修飾し、Ｃに対する識別能を上げている。電極ａを共通電極とし、電極ａとｂ、ａとｃ、ａとｄ、ａとｅの４つの電極対を構成する。電極対ａ−ｂでＡを識別し、電極対ａ−ｃでＧを識別し、電極対ａ−ｄでＴを識別し、電極対ａ−ｅでＣを識別する。
【０１００】
本実施例では、共通電極は化学修飾無しとしたが、化学修飾分子を付けても良い。また、本実施例では全ての電極が同一平面上に有ったが、電極層が２層以上で、異なる平面上に電極が存在しても良い。また、電極数をより多くし、高精度化しても良い。
【符号の説明】
【０１０１】
１０１，２０１，３０１，４０１，５０１，１２０１…開口、
１０２，２０２，３０２，４０２，５０２，８０２，８３１，８３２，１００２，１２０２…電極、
１０３，３０３，４０３，５０３，８０３，１００３…絶縁膜、
１０４，２０４，３０４，４０４，５０４，６０４，７０４，８０４，１００４，１２０４…化学修飾分子、
１０５，２０５，３０５，４０５，５０５…実効的なナノポア、
６０６，７０６…シリコン基板、
６０７，６１１，６１３，６１４，７１３，７１４…シリコン窒化膜、
６０８，６０９，７０８…窒化チタン膜、
６１０，７１０…ギャップ、
６１２，７１２，７２０…シリコン酸化膜、
６１５，７１５…薄膜部分、
６１６，７１６，８１６，１０１６…ナノポア、
７１７，７１９…アモルファスシリコン膜、
７１８…金／チタン膜、
８２１，１０２１…第一溶液槽、
８２２，１０２２…第二溶液槽、
８２３，１０２３…核酸分析デバイス、
８２４，８２５，１０２４，１０２５…核酸駆動手段、
８２６，１０２６…制御及びデータ処理手段、
８２７，８２８，１０２７，１０２８…導入口、
８２９，８３０，１０２９，１０３０…排出口、
８３３，８３５，１０３３，１０３５，１０３８，１０４０，１０４２…電圧源、
８３４，８３６，１０３４，１０３６，１０３９，１０４１，１０４３…電流計、
８３７，１０３７…核酸。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電流測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
固体基板と、
前記固体基板を貫通して設けられ前記試料が通過するナノポアと、
前記固体基板に配置され、それぞれの一端面が前記ナノポアに面して設けられた少なくとも２つの電極と、
を備え、
少なくとも１つの前記電極の前記ナノポアに面する一端面には、核酸を構成する４種の塩基のうち少なくとも１種に対する識別能を向上させるための化学修飾分子が付与され、
前記ナノポアに前記試料を進入させながら、前記少なくとも２つの電極間に電圧を印加して前記進入した試料中の核酸を構成する塩基に電流を流すことにより、前記核酸の分析を行うことを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項２】
前記化学修飾分子が付与された電極の一端面が、前記ナノポアの側壁と前記個体基板表面または裏面とが交差して形成される輪郭形状を有する開口の該開口端よりも前記ナノポアの内部方向に突き出た配置構造を有し、
前記配置構造により決定される実効的なナノポアサイズを、分析対象とする前記核酸が通過できるサイズで、かつ前記塩基に電流が流れる程度のサイズとすることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項３】
前記化学修飾分子が付与された電極の一端面が、前記ナノポアの側壁と前記個体基板表面または裏面とが交差して形成される輪郭形状を有する開口の該開口端、あるいは該開口端より前記個体基板側に配置された配置構造を有し、
前記開口のサイズを、分析対象とする前記核酸が通過できるサイズでかつ該塩基に電流が流れる程度のサイズとすることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項４】
前記固体基板が、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレンのいずれか１つの材料で構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項５】
前記固体基板が、厚さ５〜２００ｎｍの薄膜部分を有し、
前記ナノポアは、前記薄膜部分に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項６】
前記薄膜部分が、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレン、酸化シリコン、窒化シリコン、酸窒化シリコン、金属酸化物、金属ケイ酸塩のいずれか１つの材料で構成されることを特徴とする請求項５に記載の核酸分析デバイス。
【請求項７】
前記電極が、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、銅、鉄、アルミ、チタン、ニッケル、タンタル、タングステン、コバルト、クロム、モリブデン、ニオブの何れかである金属材料、あるいは窒化チタン、窒化タンタル、窒化タングステン、窒化ニオブ、窒化クロムの何れかである金属窒化物材料、あるいはタングステンシリサイド、チタンシリサイド、コバルトシリサイド、ニッケルシリサイドの何れかであるシリサイド材料、あるいはグラファイト、グラフェン、カーボンナノチューブの何れかであるカーボン材料、あるいはシリコン、ゲルマニウムの何れかである半導体材料のいづれかで構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項８】
前記電極の厚さが、０．１〜１０ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項９】
前記化学修飾分子が、前記分析対象とする試料に含有される核酸分子、あるいは該核酸分子に対する分子認識能を有する有機化合物のいづれかで構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１０】
前記化学修飾分子の厚さが、２ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１１】
前記開口の形状が円形の場合はその直径が、楕円形の場合はその短径が、多角形の場合はその内接円の直径が、１０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項２または３に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１２】
前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡからなるハイブリッド核酸、人為的に合成されたポリマー分子の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１３】
前記ナノポアの深さが、前記核酸を構成するモノマー単位の２倍以上の大きさであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを有し、
分析対象とする核酸を含有する試料溶液を導入する導入口と該試料溶液を排出する排出口を具備してなる第１の溶液槽と、
溶液を導入する導入口と該溶液を排出する排出口を具備してなる第２の溶液槽と、
前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に配置された前記核酸分析デバイスを有するナノポアを通じて、前記核酸を前記第１の溶液槽から前記第２の溶液槽へ移動させる核酸駆動手段と、
前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に電圧を印加する第１電圧源と、
前記ナノポアを介して前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に流れる電流を検出する第１電流計と、
前記核酸分析デバイスに設けられた電極間に電圧を印加する第２電圧源と、
前記核酸分析デバイスに設けられた電極間に流れる電流を検出する第２電流計と、
少なくとも前記核酸駆動手段を制御する制御手段と、
少なくとも前記第１および第２電流計で検出されたデータを取得して処理するデータ処理手段と、を備え、
前記第２電圧源を用いて、前記ナノポアに進入した前記試料溶液中の核酸を構成する塩基に電流を流し、前記第２電流計を用いてその電流を計測することにより前記試料溶液中の核酸を分析することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１５】
前記核酸分析デバイスに前記核酸駆動手段を内蔵させたことを特徴とする請求項１４に記載の核酸分析装置。
【請求項１】
電流測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
固体基板と、
前記固体基板を貫通して設けられ前記試料が通過するナノポアと、
前記固体基板に配置され、それぞれの一端面が前記ナノポアに面して設けられた少なくとも２つの電極と、
を備え、
少なくとも１つの前記電極の前記ナノポアに面する一端面には、核酸を構成する４種の塩基のうち少なくとも１種に対する識別能を向上させるための化学修飾分子が付与され、
前記ナノポアに前記試料を進入させながら、前記少なくとも２つの電極間に電圧を印加して前記進入した試料中の核酸を構成する塩基に電流を流すことにより、前記核酸の分析を行うことを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項２】
前記化学修飾分子が付与された電極の一端面が、前記ナノポアの側壁と前記個体基板表面または裏面とが交差して形成される輪郭形状を有する開口の該開口端よりも前記ナノポアの内部方向に突き出た配置構造を有し、
前記配置構造により決定される実効的なナノポアサイズを、分析対象とする前記核酸が通過できるサイズで、かつ前記塩基に電流が流れる程度のサイズとすることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項３】
前記化学修飾分子が付与された電極の一端面が、前記ナノポアの側壁と前記個体基板表面または裏面とが交差して形成される輪郭形状を有する開口の該開口端、あるいは該開口端より前記個体基板側に配置された配置構造を有し、
前記開口のサイズを、分析対象とする前記核酸が通過できるサイズでかつ該塩基に電流が流れる程度のサイズとすることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項４】
前記固体基板が、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレンのいずれか１つの材料で構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項５】
前記固体基板が、厚さ５〜２００ｎｍの薄膜部分を有し、
前記ナノポアは、前記薄膜部分に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項６】
前記薄膜部分が、シリコン、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレン、酸化シリコン、窒化シリコン、酸窒化シリコン、金属酸化物、金属ケイ酸塩のいずれか１つの材料で構成されることを特徴とする請求項５に記載の核酸分析デバイス。
【請求項７】
前記電極が、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、銅、鉄、アルミ、チタン、ニッケル、タンタル、タングステン、コバルト、クロム、モリブデン、ニオブの何れかである金属材料、あるいは窒化チタン、窒化タンタル、窒化タングステン、窒化ニオブ、窒化クロムの何れかである金属窒化物材料、あるいはタングステンシリサイド、チタンシリサイド、コバルトシリサイド、ニッケルシリサイドの何れかであるシリサイド材料、あるいはグラファイト、グラフェン、カーボンナノチューブの何れかであるカーボン材料、あるいはシリコン、ゲルマニウムの何れかである半導体材料のいづれかで構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項８】
前記電極の厚さが、０．１〜１０ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項９】
前記化学修飾分子が、前記分析対象とする試料に含有される核酸分子、あるいは該核酸分子に対する分子認識能を有する有機化合物のいづれかで構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１０】
前記化学修飾分子の厚さが、２ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１１】
前記開口の形状が円形の場合はその直径が、楕円形の場合はその短径が、多角形の場合はその内接円の直径が、１０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項２または３に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１２】
前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡからなるハイブリッド核酸、人為的に合成されたポリマー分子の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１３】
前記ナノポアの深さが、前記核酸を構成するモノマー単位の２倍以上の大きさであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを有し、
分析対象とする核酸を含有する試料溶液を導入する導入口と該試料溶液を排出する排出口を具備してなる第１の溶液槽と、
溶液を導入する導入口と該溶液を排出する排出口を具備してなる第２の溶液槽と、
前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に配置された前記核酸分析デバイスを有するナノポアを通じて、前記核酸を前記第１の溶液槽から前記第２の溶液槽へ移動させる核酸駆動手段と、
前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に電圧を印加する第１電圧源と、
前記ナノポアを介して前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に流れる電流を検出する第１電流計と、
前記核酸分析デバイスに設けられた電極間に電圧を印加する第２電圧源と、
前記核酸分析デバイスに設けられた電極間に流れる電流を検出する第２電流計と、
少なくとも前記核酸駆動手段を制御する制御手段と、
少なくとも前記第１および第２電流計で検出されたデータを取得して処理するデータ処理手段と、を備え、
前記第２電圧源を用いて、前記ナノポアに進入した前記試料溶液中の核酸を構成する塩基に電流を流し、前記第２電流計を用いてその電流を計測することにより前記試料溶液中の核酸を分析することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１５】
前記核酸分析デバイスに前記核酸駆動手段を内蔵させたことを特徴とする請求項１４に記載の核酸分析装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図７Ｋ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図６Ｉ】
【図６Ｊ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図７Ｋ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１３−９０５７６（Ｐ２０１３−９０５７６Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３２６１２（Ｐ２０１１−２３２６１２）
【出願日】平成２３年１０月２４日（２０１１．１０．２４）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２４日（２０１１．１０．２４）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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