核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法
【課題】簡便で精度の高い核酸増幅反応用マイクロチップの提供。
【解決手段】核酸増幅反応の反応場となるウェルの内面に、増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が、ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で予め固着されている、核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。前記核酸増幅用マイクロチップにおいては、増幅対象の核酸鎖を含むサンプル溶液と、増幅反応に必要な残りの物質の導入のみで、核酸増幅反応の開始が可能となる。
【解決手段】核酸増幅反応の反応場となるウェルの内面に、増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が、ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で予め固着されている、核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。前記核酸増幅用マイクロチップにおいては、増幅対象の核酸鎖を含むサンプル溶液と、増幅反応に必要な残りの物質の導入のみで、核酸増幅反応の開始が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法に関する。より詳しくは、核酸増幅反応の反応場となるウェル内に、反応に必要な１以上の成分を含む試薬が、所定の形状で固着化された核酸増幅反応用マイクロチップ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。これらのマイクロチップは、例えば、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサなどに利用され始めている。
【０００３】
このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ−Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化あるいは、分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。
【０００４】
μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を化学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、例えば、マイクロチップ上のウェル内で核酸増幅反応等の複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えばリアルタイムＰＣＲ装置）などがある。
【０００５】
従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、核酸増幅反応に必要な試薬及び鋳型ＤＮＡを予め全て混合し、この混合液をマイクロチップに配設された複数のウェル内に導入して反応を行う方法が取られてきた。しかし、この方法では、ウェル内に混合液が導入されるまでに一定の時間が必要であるため、その間に混合液内で反応が進行し、非特異的な増幅を容易にし、定量性を低下させてしまう問題が生じていた。
【０００６】
前述の問題に対し、例えば特許文献１には、核酸増幅反応に必要な試薬の一部を予め固体状態で流路内に保持したマイクロチップが開示されている。しかし、特許文献１に開示のマイクロチップについて、固体状態の試薬の形状や、マイクロチップ内での詳細な配置について、記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−４３９９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本技術は、簡便でかつ精度の高い核酸増幅反応用マイクロチップ及び核酸増幅反応用マイクロチップの製造を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、マイクロチップに内在させる核酸増幅反応に必要な試薬の、固着化における形状に着目し、検討を行った。その結果、試薬を固着させるマイクロチップのウェル内面に親水化処理を施し、核酸増幅反応に必要な物質を含む溶液をウェルに滴下した後乾燥することにより、試薬がウェル中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着化されることを見出した。固着化した試薬が、表面積の大きい、所定の形状に揃うことによって、核酸増幅反応の開始時にウェル内に固着した試薬が溶解し易く、ウェル間でのばらつきが抑えられる。
【００１０】
すなわち本技術は、
核酸増幅反応の反応場であるウェルに、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が前記ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着された、核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。
前記ウェルを構成する面が親水性である核酸増幅反応用マイクロチップが好適である。
また、前記物質が前記ウェルの辺縁部から中心部に向けて高さを減じたすり鉢形状で存在する、核酸増幅反応用マイクロチップが好適である。
前記物質が前記ウェルの中心部を除く領域に環状に存在する、核酸増幅反応用マイクロチップがより好適である。
本技術はまた、
核酸増幅反応の反応場となるウェルを形成した基板層の該ウェルを構成する面を親水化する工程と、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を前記ウェル内に滴下する工程と、前記物質を乾燥させ前記ウェル内に固着化する工程と、を含む核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を提供する。
前記親水化する工程に、前記ウェルを構成する面をプラズマに曝露する工程を含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法が好適である。
また、前記固着化する工程に、前記ウェルに滴下された前記物質を凍結乾燥する工程を含む核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法が好適である。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、簡便で精度の高い核酸増幅反応用マイクロチップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの上面模式図である。
【図２】ウェル内に固着化された試薬の形状を説明するための模式図である。
【図３】本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの部分断面模式図（図１、Ｐ−Ｐ’断面）である。
【図４】本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図５】実施例における核酸増幅反応用マイクロチップのウェル内に固着された試薬の形状を示す図面代用写真である。
【図６】実施例における核酸増幅反応用マイクロチップのウェル内に固着された試薬の溶解時の状態を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップについて
（１−１）核酸増幅反応用マイクロチップの構成
（１−２）核酸増幅反応用試薬
（１−３）分岐流路とウェルの連通部
２．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
（２−１）基板層の成形
（２−２）ウェル内の親水化処理
（２−３）ウェル内への試薬の滴下
（２−４）ウェルへの試薬の固着化
（２−５）基板層の貼り合わせ
【００１４】
１．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップについて
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」とも称する）について説明する。また、本技術に係るマイクロチップを用いて行う「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えばＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ法などの増幅核酸の定量を伴う反応も包含される。
【００１５】
（１−１）核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図１は、本技術に係るマイクロチップの上面模式図である。符号Ａで示すマイクロチップは、外部からサンプル溶液が導入される導入口１と、核酸増幅反応の反応場となるウェル４と、一端において導入口１に、他の一端において排出口５に連通する主流路２と、主流路２から分岐しウェル４に連通する分岐流路３から構成されている。ここで述べるサンプル溶液とは、核酸増幅反応において増幅の対象となる鋳型核酸であるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を含む溶液を指す。
【００１６】
マイクロチップＡは、複数の基板層から構成される。基板層の材質は、ガラスや各種プラスチップ（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン等）とすることができる。ウェル４内で増幅された核酸鎖の検出又は定量を光学的に行う場合においては、基板層の材質は、光透過性を有し、自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが望ましい。マイクロチップＡを構成する基板層は複数であって、数は限定されない。また、ガラスからなる基板層にプラスチックの基板層を貼り合わせるといった複数の材質を貼り合わせて成るマイクロチップＡとすることもできる。何れの材質を基板層として用いた場合であっても、基板層に設けられるウェル４の内面は、親水性であることが好ましい。ウェル４内面の親水化処理については、（２−２）に記載する。
【００１７】
図１においては、マイクロチップＡにウェル４を９つ配設する場合を例示しているが、１個のマイクロチップに配設されるウェル４の数は何れであっても良く、ウェル４の形状も円柱形状に限定されない。マイクロチップに形成される主流路２、分岐流路３についても、図１に示した様態に限定されない。１個のマイクロチップに複数の導入口１と複数の主流路２を形成した構成であっても良い。また、導入口１からマイクロチップＡに導入されたサンプル溶液を外部に排出する排水口５は必須の構成ではなく、サンプル溶液が外部に排出されない構造とすることもできる。
【００１８】
（１−２）核酸増幅反応用試薬
図２は、本技術に係るマイクロチップＡのウェル４内における核酸増幅反応用試薬（以下「試薬」とも称する）の形状を模式的に示した図である。符号Ｒで示す試薬は、ウェル４の内面に、ウェル４の中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着されている。例えば偏在の形状は、図２（Ａ）に示すように、ウェル４の辺縁部から中心部に向かって高さを減じた、すり鉢形状とできる。また、本技術に係る実施形態の変形例として図２（Ｂ）を示す。すり鉢形状である試薬Ｒが、ウェル４の辺縁部から中心部へ向かって嵩を減じ、ウェル４の中心部に到達するまでに、その嵩を失うと、（Ｂ）に図示するように、試薬Ｒはウェル４の中心部を除く領域に環状に配置される。
【００１９】
ウェル４に固着化される試薬Ｒには、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている。具体的には、増幅の対象であるＤＮＡ、ＲＮＡ等の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」とも称する」）、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、核酸増幅反応に直接必要ではないが、増幅した核酸を検出するための蛍光標識等の標識を備えたプローブや、二本鎖の核酸にインターカレートする検出用試薬なども、増幅核酸鎖の検出に必要な物質として、試薬Ｒに含まれる成分とできる。ウェル４に固着した試薬Ｒに含まれる成分は、これらの核酸増幅反応及び検出に必要な物質のうち１又は複数とすることができる。また、試薬Ｒに複数の成分が含まれる場合、複数の成分が均一に混合された一層からなる試薬Ｒとすることもできるが、複数の成分がウェル４内に順に積層された、層構造を有した試薬Ｒとすることもできる。
【００２０】
ウェル４内に積層される試薬Ｒの、１つの層に含まれる物質の種類は、１又は複数として特に限定されず、１つのウェル４における試薬Ｒの層の数も限定されない。物質がウェル４内に積層されている順序も、任意の順序とできる。例えば「プライマー、ｄＮＴＰｓ、酵素、反応緩衝液に含まれる成分」の順で４層からなる構成や、「反応緩衝液に含まれる成分、酵素、ｄＮＴＰｓ及びプライマー」の順序で３層からなり、かつ１つの層には予め複数の核酸増幅反応に必要な物質が混合されている構成であっても良い。例えば、プライマーが含まれる層を下層に、他の試薬が含まれる層を上層に、ウェル４内に積層すると、核酸増幅反応の開始時に、プライマーを含む下層まで溶解されて初めて核酸増幅反応が開始されるため、核酸の非特異的増幅が防止され、好適である。また、１個のマイクロチップＡに複数のウェル４を有する場合、ウェル４間で積層される試薬Ｒの種類や積層数が同一でなくても良く、例えば図１のマイクロチップＡにおいて９つ設けられたウェル４に、核酸増幅反応に必要な１種類の物質のみを含む試薬Ｒ、反応に必要な物質が複数混合された一層からなる試薬Ｒ、反応に必要な複数の物質が順に積層されている試薬Ｒ等、各々異なる物質の構成や積層数から成る試薬Ｒが固着されていても良い。
【００２１】
試薬Ｒを、核酸増幅反応に必要な複数の物質を含んだ層状構造とすることによって、単層に比べ、より多くの種類の反応に必要な物質をマイクロチップＡ内に分離した状態で保持でき、核酸増幅反応開始時に増幅対象の核酸を含むサンプル溶液に加える物質の種類を減らすことができる。この結果、本技術に係るマイクロチップＡにおいて、より簡便な分析が可能となる。また、核酸増幅反応開始時まで、増幅反応に必要な物質の混合が避けられることによって、プライマーダイマー等の非特異的増幅が抑えられ、マイクロチップＡを用いて、精度の高い分析が可能となる。
【００２２】
（１−３）分岐流路とウェルの連通部
マイクロチップＡにおいて、導入口１から導入されるサンプル溶液は、主流路２を経て分岐流路３で分岐し、ウェル４に至る。分岐流路３がウェル４に連通する部分は、ウェル４内に固着された試薬Ｒの容量にかかわらず、ウェル４の側面の何れの位置に設けることもできるが、本技術に係るマイクロチップＡでは、分岐流路３とウェル４の連通部が、前記ウェル４内に固着された核酸増幅反応に必要な物質の最厚部における高さより高い位置に配設にされていることが好ましい。図３（Ａ）及び（Ｂ）は、図１中Ｐ−Ｐ’断面に対応する部分断面模式図、及びその変形例であり、前記連通部の形状を例示する。
【００２３】
図３（Ａ）に示すＰ−Ｐ’の部分断面において、マイクロチップＡは、分岐流路３及びウェル４が形成された基板層ａ１と、基板層ａ２とが貼り合わされた、２層の基板層で構成される。分岐流路３とウェル４の連通部は、ウェル４内に固着された試薬Ｒの最厚部の高さｈよりも上方に、試薬Ｒが連通部を塞がない配置で、ウェル４の側面に設けられている。そのため、分岐流路３を通流したサンプル溶液が連通部からウェル４内に導入された際、サンプル溶液は、固着されている試薬Ｒの表面と接触する。試薬Ｒは、ウェル４内に中心部に比して辺縁部に偏在し、例えばすり鉢形状や環状であることにより、サンプル溶液との接触面積が大きくなるため、サンプル溶液導入時に素早く溶解される。図３においては、試薬Ｒの形状を、図２（Ａ）に示す形状と同様にして示したが、試薬Ｒの形状は、図２（Ｂ）に示す形状の他、ウェル４の内面に中心部に比して辺縁部に偏在する形状であれば、何れであっても良い。
【００２４】
図３（Ｂ）に示すＰ−Ｐ’の部分断面において、マイクロチップＡは、ウェル４を構成する部分のみが刳り抜いて形成された基板層ａ２の一の面に、分岐流路３の底面が形成された基板層ａ１が貼り合わされ、更にもう一の面に基板層ａ３が貼り合わされた、３層の基板層で構成される。分岐流路３とウェル４の連通部は、ウェル４内に固着された試薬Ｒの最厚部の高さｈよりも下方に、試薬Ｒが連通部を塞ぐ配置で、ウェル４の側面に設けられている。そのため、分岐流路３を通流したサンプル溶液は連通部において試薬Ｒを溶解しつつウェル４内に導入することとなる。サンプル溶液は連通部に到達し、試薬Ｒを貫通しウェル４中央部に到達した後は、（Ａ）における混合と同様に試薬Ｒの表面と接触する。また、（Ｂ）の構成においては、連通部が試薬Ｒの最厚部の高さｈよりも下方に設けられていることによる、サンプル溶液導入後のウェル４内からの反応液の分岐流路３への逆流を防止するために、分岐流路３とウェル４との連通部に逆止弁を設けることが好ましい。
【００２５】
上述したマイクロチップの構成により、本技術に係るマイクロチップＡにおいては、ウェル４内に固着されていない核酸増幅反応に必要な残りの物質と、増幅の対象である鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡを含むサンプル溶液のみの導入によって、核酸増幅反応を開始することができる。また本技術に係るマイクロチップにおいては、ウェル４に固着された試薬Ｒの形状がすり鉢状、環状等、中心部に比して辺縁部に偏在する形状に統一されていることによって、反応開始時のウェル４間での試薬Ｒ等の混合状態のむらを解消できる。更にウェル４の中央部において試薬Ｒの厚みが薄い、又は中央部に試薬Ｒが存在しないというウェル４内に固着した試薬Ｒの形状は、表面積が大きく、サンプル溶液との混合時の溶解を容易にし、ウェル４中央部に溶け残りが生じることを抑える。そのため、例えば核酸の光学的検出を行う場合、試薬Ｒの溶け残りによってウェル４中央部に極端に高いシグナル強度が測定されることを回避できる。
【００２６】
２．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法について
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下「マイクロチップ」とも称する）の製造方法について、図４に示すフローチャートに則して説明する。
【００２７】
（２−１）基板層の成形
図４中、符号Ｓ１は基板層の成形工程である。本工程では、基板層に、図１に示す導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４及び排出口５を成形する。成形には、例えばガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチング、プラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工等の方法を用いることができる。ウェル４等の基板層への形成は、図３（Ａ）に示すように基板層ａ１のみに成形する場合や、図３（Ｂ）に示すように複数の基板層に成形する場合の何れも可能であり、主流路２、分岐流路３やウェル４等の各構成要素のマイクロチップにおける配設位置に応じて選択すれば良い。
【００２８】
（２−２）ウェル内の親水化処理
図４中、符号Ｓ２は、ウェル４を構成する、内面の親水化工程である。本工程では、前述の成形工程Ｓ１によって基板層に成形されたウェル４の内面に親水化処理を行う。親水化処理には、例えば親水性樹脂の塗布、光触媒作用を利用した表面処理、アルカリケイ酸塩等の無機系コート処理、エッチング処理、プラズマ処理等の方法を用いることができる。また、基板層の成形時にウェル４内面にエンボス（凹凸）形状をスタンパーで造りこみ、親水化処理としても良い。本技術に係るマイクロチップＡにおいては、特にウェル４内面をプラズマに曝露する親水化処理方法が好適である。
【００２９】
（２−３）ウェル内への試薬の滴下
図４中、符号Ｓ３は核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を含んだ試薬Ｒを、マイクロチップＡのウェル４内へ滴下する工程である。本工程では、増幅反応に用いる物質を含んだ液状又はゲル状の試薬Ｒを、前述の親水化工程Ｓ２により親水化処理を施したウェル４に滴下する。ウェル４に滴下された試薬Ｒの液滴は、ウェル４を構成する面の親水化処理によってウェル４内で中心部に比して辺縁部に偏在した形状に留まる。ウェル４内面の親水性の程度や、試薬Ｒの量及び性質等に応じて、ウェル４内に偏在する試薬Ｒの形状は、例えば図２（Ａ）に示す、すり鉢形状や、（Ｂ）に示す、環状となる。
【００３０】
ウェル４へ試薬Ｒを滴下する工程には、必要に応じて試薬Ｒの滴下前に、試薬Ｒに含まれる成分に対して所定の処理を行う工程を含んでいても良い。例えばプライマーを含む試薬Ｒを滴下する場合、予め試薬Ｒを９５℃程度の温度で処理し、プライマーを変性させ１本鎖にすることで、プライマーダイマーの発生を抑え、核酸増幅反応時に非特異的な核酸の増幅を低減することが可能となる。
【００３１】
図４においては、ウェル４内へ試薬Ｒを滴下する工程Ｓ３を、基板層の成形工程Ｓ１とウェル４の内面の親水化工程Ｓ２に続く工程として示しているが、本技術に係るマイクロチップＡの製造方法では、別途、ウェル４等が成形されて親水化処理を施された基板層を用意し、ウェル４内へ滴下する工程Ｓ３から行うことも可能である。
【００３２】
（２−４）ウェルへの試薬の固着化
図４中、符号Ｓ４はウェル４内の試薬Ｒを乾燥させ、試薬Ｒをウェル４内面に固着化する工程である。前述の試薬Ｒを滴下する工程Ｓ３によってウェル４内に滴下された試薬Ｒは、ウェル４内面の親水化処理により、ウェル４内で中心部に比して辺縁部に偏在した形状に留まる。本工程では、試薬Ｒの該形状を保持したまま乾燥し、試薬Ｒをウェル４に固着化させる。乾燥方法としては、凍結乾燥が好適である。また、この凍結乾燥の工程の前に、予め試薬Ｒを十分に凍結するための冷却工程を設けても良い。ウェル４に滴下した試薬Ｒが、前記形状であることによって、滴下された試薬Ｒの表面積が大きくなり、冷却工程において試薬Ｒが均一に冷却される。また試薬Ｒの均一な冷却は、固着化の過程において試薬Ｒの形状を安定させる。この冷却工程と凍結乾燥工程とを組み合わせることにより、凍結乾燥時のウェル４における試薬Ｒの突沸等が予防され、滴下時のウェル４内における試薬Ｒの形状を、滴下以降の工程においても保持することが容易となる。
【００３３】
マイクロチップＡのウェル４内に固着化される試薬Ｒは、ウェル４内への試薬Ｒの滴下の工程Ｓ３と、ウェル４への試薬Ｒの固着化の工程Ｓ４とを繰り返して、核酸増幅反応に必要な物質の一部をウェル４内に積層させても良い。ウェル４において試薬Ｒの積層を行う際、滴下工程Ｓ３及び固着化工程Ｓ４の二巡目以降については、既にウェル４内に固着化された試薬Ｒの溶解を防ぐために、試薬Ｒの滴下時にマイクロチップＡを低温に保持しておくことが好ましく、滴下後は、試薬Ｒを直ちに凍結させることが好ましい。
【００３４】
（２−５）基板層の貼り合わせ
図４中、符号Ｓ５は基板層の貼り合わせ工程である。本工程では、前述の固着化工程Ｓ４によってウェル４内に試薬Ｒを保持した基板層と、他の基板層を貼り合わせる。基板層の貼り合わせには、例えば接着剤や粘着性を有したシートを用いる方法や、熱融着、陽極接合、超音波接合等の方法を用いることができる。また、基板層の表面を酸素プラズマ処理や真空紫外光処理により活性化して貼り合わせることも可能である。ポリジメチルシロキサン等のプラスチックの場合、ガラスとの親和性が高く、表面を前記処理によって活性化し接触させると、ダングリングボンドが反応して強固な共有結合であるＳｉ−Ｏ−Ｓｉシラノール結合を形成し、十分な強度の接合が得られる。酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理は、基板層の材質に応じて条件を設定すれば良い。
【００３５】
上述の、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法によって作製されたマイクロチップＡでは、ウェル４内に固着化された試薬Ｒが、ウェル４内面の親水化処理により一定の形状に揃う。そのため、マイクロチップＡ内に導入されるサンプル液との混合時に、固着された試薬Ｒの溶解の程度について、ウェル４間でのばらつきが抑えられる。また、試薬Ｒが、ウェル４辺縁部から中央部に向って嵩を減じて偏在した形状で固着されていることにより、試薬Ｒの表面積が大きくなる。このため、サンプル溶液との混合時に、試薬Ｒは溶解され易くなる。かつ固着化された試薬Ｒが前記の形状であるより、ウェル４中央部に試薬Ｒの溶け残りが生ずることが抑えられ、増幅核酸の光学的検出を行う場合、核酸増幅反応開始時におけるウェル４中央部での極端に強度が高いシグナルの検出を抑えることができる。従って、本技術に係る製造方法により作製されたマイクロチップを用いて、簡便で精度の高い核酸増幅反応を行うことが可能となる。
【００３６】
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。
（１）核酸増幅反応の反応場であるウェルに、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が前記ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着された、核酸増幅反応用マイクロチップ。
（２）前記ウェルを構成する面が親水性である、上記（１）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（３）前記物質が前記ウェルの辺縁部から中心部に向けて高さを減じたすり鉢形状で存在する、上記（１）又は（２）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（４）前記物質が前記ウェルの中心部を除く領域に環状に存在する、上記（１）から（３）の何れかに記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（５）核酸増幅反応の反応場となるウェルを形成した基板層の該ウェルを構成する面を親水化する工程と、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を前記ウェル内に滴下する工程と、前記物質を乾燥させ前記ウェル内に固着化する工程とを含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（６）前記親水化する工程に、前記ウェルを構成する面をプラズマに曝露する工程を含む、上記（５）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（７）前記固着化する工程に、前記ウェルに滴下された前記物質を凍結乾燥する工程を含む、上記（５）又は（６）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【実施例】
【００３７】
本技術に係るマイクロチップの作製方法に則してマイクロチップを作製し、ウェル内に固着化された試薬の形状及び試薬の溶解時の状態を観察した。
【００３８】
＜マイクロチップの材料及び作製方法＞
マイクロチップの材料として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の基板層に、主流路、分岐流路、ウェルを成形した後、流路及びウェルを形成していない面のみを活性化し、ガラス板と貼り合わせた。次にメタルマスクによって流路等を保護し、ウェル内面のみ反応性イオンエッチング（１０ｃｃ、５０Ｗ、１５秒）により、親水化処理を行った。上記工程により作製されたマイクロチップを、実施例とした。比較例としてウェル内面の親水化処理を除いた点以外は、全て実施例と同様に作製されたマイクロチップを用意した。実施例及び比較例のマイクロチップの各ウェルにプライマーを含む試薬液を滴下し、実施例については−２８℃に置き、試薬を凍結させた。一方、比較例のマイクロチップは、２つの群に分け、１つの群は実施例と同様に−２８℃に置き、滴下した試薬を凍結させた。もう１つの群については、室温での減圧乾燥（１０００Ｐａ）によって試薬をウェルに固着させた。−２８℃における凍結処理を行った比較例の群を、比較例１とし、減圧乾燥を行った群を比較例２とする。実施例及び比較例１は、試薬の凍結後、凍結乾燥機（２５Ｐａ）において、試薬をウェル内に固着させた。プライマーを含む試薬液を固着させた実施例及び比較例１、２のマイクロチップの各ウェルには、次に酵素を含む試薬液を滴下し、固着化させた。滴下後の固着化の工程は、プライマーを含む試薬液の場合と同様に、実施例及び比較例１については凍結処理後、凍結乾燥を行い、比較例２については減圧乾燥を行った。
【００３９】
＜観察結果＞
実施例及び比較例１、２のウェル内に固着化された試薬の形状について、マイクロチップ上面から観察した結果を図５に示す。（Ａ）に示す実施例の各ウェルでは、試薬は中心部を除いて環状に固着化されている。また固着化された試薬の形状はウェル間で均一であった。（Ｂ）に示す比較例１では、ウェル内に固着化された試薬の形状は、ウェル内面の一方に集中し、ウェル間で不均一であった。（Ｃ）に示す比較例２においては、比較例１と同様にウェル内面の一方に試薬が偏って固着化される形状が観察されたが、いくつかのウェルにおいてはウェル中央部に試薬が集中している形状も観察された（図５（Ｃ）矢印）。
【００４０】
実施例及び比較例１、２のウェル内に核酸増幅反応用緩衝液を加え、３０秒後のウェル内の試薬の状態を観察した。マイクロチップ上面からウェル内を観察した結果を、図６に示す。（Ａ）は実施例のウェルであり、（Ｂ）及び（Ｃ）は各々比較例１及び比較例２のウェルである。実施例、比較例１、２の何れにおいても固着化された試薬の溶け残りは観察されたが、比較例２において、特に大きい試薬の溶け残りがウェル中央部に観察された（図６（Ｃ）矢印）。
【００４１】
本実施例の結果において、ウェル内面の親水化処理工程と乾燥処理前の試薬の十分な凍結は、マイクロチップのウェル内に固着された試薬の形状に影響することが示された。また、固着化した試薬の形状の違いによって、溶解時の溶け残りの発生に差が生じることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップによれば、簡便な方法で高精度な分析を行うことができる。そのため、臨床における遺伝子型判定や感染病原体判定などのための核酸増幅装置として、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップは用いられ得る。
【符号の説明】
【００４３】
Ａ：核酸増幅反応用マイクロチップ、ａ１、ａ２、ａ３：基板層、ｈ：試薬の最厚部における高さ、Ｒ：試薬、１：導入口、２：主流路、３：分岐流路、４：ウェル、５：排出口
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法に関する。より詳しくは、核酸増幅反応の反応場となるウェル内に、反応に必要な１以上の成分を含む試薬が、所定の形状で固着化された核酸増幅反応用マイクロチップ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。これらのマイクロチップは、例えば、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサなどに利用され始めている。
【０００３】
このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ−Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化あるいは、分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。
【０００４】
μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を化学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、例えば、マイクロチップ上のウェル内で核酸増幅反応等の複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えばリアルタイムＰＣＲ装置）などがある。
【０００５】
従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、核酸増幅反応に必要な試薬及び鋳型ＤＮＡを予め全て混合し、この混合液をマイクロチップに配設された複数のウェル内に導入して反応を行う方法が取られてきた。しかし、この方法では、ウェル内に混合液が導入されるまでに一定の時間が必要であるため、その間に混合液内で反応が進行し、非特異的な増幅を容易にし、定量性を低下させてしまう問題が生じていた。
【０００６】
前述の問題に対し、例えば特許文献１には、核酸増幅反応に必要な試薬の一部を予め固体状態で流路内に保持したマイクロチップが開示されている。しかし、特許文献１に開示のマイクロチップについて、固体状態の試薬の形状や、マイクロチップ内での詳細な配置について、記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−４３９９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本技術は、簡便でかつ精度の高い核酸増幅反応用マイクロチップ及び核酸増幅反応用マイクロチップの製造を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、マイクロチップに内在させる核酸増幅反応に必要な試薬の、固着化における形状に着目し、検討を行った。その結果、試薬を固着させるマイクロチップのウェル内面に親水化処理を施し、核酸増幅反応に必要な物質を含む溶液をウェルに滴下した後乾燥することにより、試薬がウェル中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着化されることを見出した。固着化した試薬が、表面積の大きい、所定の形状に揃うことによって、核酸増幅反応の開始時にウェル内に固着した試薬が溶解し易く、ウェル間でのばらつきが抑えられる。
【００１０】
すなわち本技術は、
核酸増幅反応の反応場であるウェルに、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が前記ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着された、核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。
前記ウェルを構成する面が親水性である核酸増幅反応用マイクロチップが好適である。
また、前記物質が前記ウェルの辺縁部から中心部に向けて高さを減じたすり鉢形状で存在する、核酸増幅反応用マイクロチップが好適である。
前記物質が前記ウェルの中心部を除く領域に環状に存在する、核酸増幅反応用マイクロチップがより好適である。
本技術はまた、
核酸増幅反応の反応場となるウェルを形成した基板層の該ウェルを構成する面を親水化する工程と、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を前記ウェル内に滴下する工程と、前記物質を乾燥させ前記ウェル内に固着化する工程と、を含む核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を提供する。
前記親水化する工程に、前記ウェルを構成する面をプラズマに曝露する工程を含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法が好適である。
また、前記固着化する工程に、前記ウェルに滴下された前記物質を凍結乾燥する工程を含む核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法が好適である。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、簡便で精度の高い核酸増幅反応用マイクロチップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの上面模式図である。
【図２】ウェル内に固着化された試薬の形状を説明するための模式図である。
【図３】本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの部分断面模式図（図１、Ｐ−Ｐ’断面）である。
【図４】本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図５】実施例における核酸増幅反応用マイクロチップのウェル内に固着された試薬の形状を示す図面代用写真である。
【図６】実施例における核酸増幅反応用マイクロチップのウェル内に固着された試薬の溶解時の状態を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップについて
（１−１）核酸増幅反応用マイクロチップの構成
（１−２）核酸増幅反応用試薬
（１−３）分岐流路とウェルの連通部
２．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
（２−１）基板層の成形
（２−２）ウェル内の親水化処理
（２−３）ウェル内への試薬の滴下
（２−４）ウェルへの試薬の固着化
（２−５）基板層の貼り合わせ
【００１４】
１．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップについて
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」とも称する）について説明する。また、本技術に係るマイクロチップを用いて行う「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えばＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ法などの増幅核酸の定量を伴う反応も包含される。
【００１５】
（１−１）核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図１は、本技術に係るマイクロチップの上面模式図である。符号Ａで示すマイクロチップは、外部からサンプル溶液が導入される導入口１と、核酸増幅反応の反応場となるウェル４と、一端において導入口１に、他の一端において排出口５に連通する主流路２と、主流路２から分岐しウェル４に連通する分岐流路３から構成されている。ここで述べるサンプル溶液とは、核酸増幅反応において増幅の対象となる鋳型核酸であるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を含む溶液を指す。
【００１６】
マイクロチップＡは、複数の基板層から構成される。基板層の材質は、ガラスや各種プラスチップ（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン等）とすることができる。ウェル４内で増幅された核酸鎖の検出又は定量を光学的に行う場合においては、基板層の材質は、光透過性を有し、自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが望ましい。マイクロチップＡを構成する基板層は複数であって、数は限定されない。また、ガラスからなる基板層にプラスチックの基板層を貼り合わせるといった複数の材質を貼り合わせて成るマイクロチップＡとすることもできる。何れの材質を基板層として用いた場合であっても、基板層に設けられるウェル４の内面は、親水性であることが好ましい。ウェル４内面の親水化処理については、（２−２）に記載する。
【００１７】
図１においては、マイクロチップＡにウェル４を９つ配設する場合を例示しているが、１個のマイクロチップに配設されるウェル４の数は何れであっても良く、ウェル４の形状も円柱形状に限定されない。マイクロチップに形成される主流路２、分岐流路３についても、図１に示した様態に限定されない。１個のマイクロチップに複数の導入口１と複数の主流路２を形成した構成であっても良い。また、導入口１からマイクロチップＡに導入されたサンプル溶液を外部に排出する排水口５は必須の構成ではなく、サンプル溶液が外部に排出されない構造とすることもできる。
【００１８】
（１−２）核酸増幅反応用試薬
図２は、本技術に係るマイクロチップＡのウェル４内における核酸増幅反応用試薬（以下「試薬」とも称する）の形状を模式的に示した図である。符号Ｒで示す試薬は、ウェル４の内面に、ウェル４の中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着されている。例えば偏在の形状は、図２（Ａ）に示すように、ウェル４の辺縁部から中心部に向かって高さを減じた、すり鉢形状とできる。また、本技術に係る実施形態の変形例として図２（Ｂ）を示す。すり鉢形状である試薬Ｒが、ウェル４の辺縁部から中心部へ向かって嵩を減じ、ウェル４の中心部に到達するまでに、その嵩を失うと、（Ｂ）に図示するように、試薬Ｒはウェル４の中心部を除く領域に環状に配置される。
【００１９】
ウェル４に固着化される試薬Ｒには、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている。具体的には、増幅の対象であるＤＮＡ、ＲＮＡ等の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」とも称する」）、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、核酸増幅反応に直接必要ではないが、増幅した核酸を検出するための蛍光標識等の標識を備えたプローブや、二本鎖の核酸にインターカレートする検出用試薬なども、増幅核酸鎖の検出に必要な物質として、試薬Ｒに含まれる成分とできる。ウェル４に固着した試薬Ｒに含まれる成分は、これらの核酸増幅反応及び検出に必要な物質のうち１又は複数とすることができる。また、試薬Ｒに複数の成分が含まれる場合、複数の成分が均一に混合された一層からなる試薬Ｒとすることもできるが、複数の成分がウェル４内に順に積層された、層構造を有した試薬Ｒとすることもできる。
【００２０】
ウェル４内に積層される試薬Ｒの、１つの層に含まれる物質の種類は、１又は複数として特に限定されず、１つのウェル４における試薬Ｒの層の数も限定されない。物質がウェル４内に積層されている順序も、任意の順序とできる。例えば「プライマー、ｄＮＴＰｓ、酵素、反応緩衝液に含まれる成分」の順で４層からなる構成や、「反応緩衝液に含まれる成分、酵素、ｄＮＴＰｓ及びプライマー」の順序で３層からなり、かつ１つの層には予め複数の核酸増幅反応に必要な物質が混合されている構成であっても良い。例えば、プライマーが含まれる層を下層に、他の試薬が含まれる層を上層に、ウェル４内に積層すると、核酸増幅反応の開始時に、プライマーを含む下層まで溶解されて初めて核酸増幅反応が開始されるため、核酸の非特異的増幅が防止され、好適である。また、１個のマイクロチップＡに複数のウェル４を有する場合、ウェル４間で積層される試薬Ｒの種類や積層数が同一でなくても良く、例えば図１のマイクロチップＡにおいて９つ設けられたウェル４に、核酸増幅反応に必要な１種類の物質のみを含む試薬Ｒ、反応に必要な物質が複数混合された一層からなる試薬Ｒ、反応に必要な複数の物質が順に積層されている試薬Ｒ等、各々異なる物質の構成や積層数から成る試薬Ｒが固着されていても良い。
【００２１】
試薬Ｒを、核酸増幅反応に必要な複数の物質を含んだ層状構造とすることによって、単層に比べ、より多くの種類の反応に必要な物質をマイクロチップＡ内に分離した状態で保持でき、核酸増幅反応開始時に増幅対象の核酸を含むサンプル溶液に加える物質の種類を減らすことができる。この結果、本技術に係るマイクロチップＡにおいて、より簡便な分析が可能となる。また、核酸増幅反応開始時まで、増幅反応に必要な物質の混合が避けられることによって、プライマーダイマー等の非特異的増幅が抑えられ、マイクロチップＡを用いて、精度の高い分析が可能となる。
【００２２】
（１−３）分岐流路とウェルの連通部
マイクロチップＡにおいて、導入口１から導入されるサンプル溶液は、主流路２を経て分岐流路３で分岐し、ウェル４に至る。分岐流路３がウェル４に連通する部分は、ウェル４内に固着された試薬Ｒの容量にかかわらず、ウェル４の側面の何れの位置に設けることもできるが、本技術に係るマイクロチップＡでは、分岐流路３とウェル４の連通部が、前記ウェル４内に固着された核酸増幅反応に必要な物質の最厚部における高さより高い位置に配設にされていることが好ましい。図３（Ａ）及び（Ｂ）は、図１中Ｐ−Ｐ’断面に対応する部分断面模式図、及びその変形例であり、前記連通部の形状を例示する。
【００２３】
図３（Ａ）に示すＰ−Ｐ’の部分断面において、マイクロチップＡは、分岐流路３及びウェル４が形成された基板層ａ１と、基板層ａ２とが貼り合わされた、２層の基板層で構成される。分岐流路３とウェル４の連通部は、ウェル４内に固着された試薬Ｒの最厚部の高さｈよりも上方に、試薬Ｒが連通部を塞がない配置で、ウェル４の側面に設けられている。そのため、分岐流路３を通流したサンプル溶液が連通部からウェル４内に導入された際、サンプル溶液は、固着されている試薬Ｒの表面と接触する。試薬Ｒは、ウェル４内に中心部に比して辺縁部に偏在し、例えばすり鉢形状や環状であることにより、サンプル溶液との接触面積が大きくなるため、サンプル溶液導入時に素早く溶解される。図３においては、試薬Ｒの形状を、図２（Ａ）に示す形状と同様にして示したが、試薬Ｒの形状は、図２（Ｂ）に示す形状の他、ウェル４の内面に中心部に比して辺縁部に偏在する形状であれば、何れであっても良い。
【００２４】
図３（Ｂ）に示すＰ−Ｐ’の部分断面において、マイクロチップＡは、ウェル４を構成する部分のみが刳り抜いて形成された基板層ａ２の一の面に、分岐流路３の底面が形成された基板層ａ１が貼り合わされ、更にもう一の面に基板層ａ３が貼り合わされた、３層の基板層で構成される。分岐流路３とウェル４の連通部は、ウェル４内に固着された試薬Ｒの最厚部の高さｈよりも下方に、試薬Ｒが連通部を塞ぐ配置で、ウェル４の側面に設けられている。そのため、分岐流路３を通流したサンプル溶液は連通部において試薬Ｒを溶解しつつウェル４内に導入することとなる。サンプル溶液は連通部に到達し、試薬Ｒを貫通しウェル４中央部に到達した後は、（Ａ）における混合と同様に試薬Ｒの表面と接触する。また、（Ｂ）の構成においては、連通部が試薬Ｒの最厚部の高さｈよりも下方に設けられていることによる、サンプル溶液導入後のウェル４内からの反応液の分岐流路３への逆流を防止するために、分岐流路３とウェル４との連通部に逆止弁を設けることが好ましい。
【００２５】
上述したマイクロチップの構成により、本技術に係るマイクロチップＡにおいては、ウェル４内に固着されていない核酸増幅反応に必要な残りの物質と、増幅の対象である鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡを含むサンプル溶液のみの導入によって、核酸増幅反応を開始することができる。また本技術に係るマイクロチップにおいては、ウェル４に固着された試薬Ｒの形状がすり鉢状、環状等、中心部に比して辺縁部に偏在する形状に統一されていることによって、反応開始時のウェル４間での試薬Ｒ等の混合状態のむらを解消できる。更にウェル４の中央部において試薬Ｒの厚みが薄い、又は中央部に試薬Ｒが存在しないというウェル４内に固着した試薬Ｒの形状は、表面積が大きく、サンプル溶液との混合時の溶解を容易にし、ウェル４中央部に溶け残りが生じることを抑える。そのため、例えば核酸の光学的検出を行う場合、試薬Ｒの溶け残りによってウェル４中央部に極端に高いシグナル強度が測定されることを回避できる。
【００２６】
２．本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法について
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下「マイクロチップ」とも称する）の製造方法について、図４に示すフローチャートに則して説明する。
【００２７】
（２−１）基板層の成形
図４中、符号Ｓ１は基板層の成形工程である。本工程では、基板層に、図１に示す導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４及び排出口５を成形する。成形には、例えばガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチング、プラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工等の方法を用いることができる。ウェル４等の基板層への形成は、図３（Ａ）に示すように基板層ａ１のみに成形する場合や、図３（Ｂ）に示すように複数の基板層に成形する場合の何れも可能であり、主流路２、分岐流路３やウェル４等の各構成要素のマイクロチップにおける配設位置に応じて選択すれば良い。
【００２８】
（２−２）ウェル内の親水化処理
図４中、符号Ｓ２は、ウェル４を構成する、内面の親水化工程である。本工程では、前述の成形工程Ｓ１によって基板層に成形されたウェル４の内面に親水化処理を行う。親水化処理には、例えば親水性樹脂の塗布、光触媒作用を利用した表面処理、アルカリケイ酸塩等の無機系コート処理、エッチング処理、プラズマ処理等の方法を用いることができる。また、基板層の成形時にウェル４内面にエンボス（凹凸）形状をスタンパーで造りこみ、親水化処理としても良い。本技術に係るマイクロチップＡにおいては、特にウェル４内面をプラズマに曝露する親水化処理方法が好適である。
【００２９】
（２−３）ウェル内への試薬の滴下
図４中、符号Ｓ３は核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を含んだ試薬Ｒを、マイクロチップＡのウェル４内へ滴下する工程である。本工程では、増幅反応に用いる物質を含んだ液状又はゲル状の試薬Ｒを、前述の親水化工程Ｓ２により親水化処理を施したウェル４に滴下する。ウェル４に滴下された試薬Ｒの液滴は、ウェル４を構成する面の親水化処理によってウェル４内で中心部に比して辺縁部に偏在した形状に留まる。ウェル４内面の親水性の程度や、試薬Ｒの量及び性質等に応じて、ウェル４内に偏在する試薬Ｒの形状は、例えば図２（Ａ）に示す、すり鉢形状や、（Ｂ）に示す、環状となる。
【００３０】
ウェル４へ試薬Ｒを滴下する工程には、必要に応じて試薬Ｒの滴下前に、試薬Ｒに含まれる成分に対して所定の処理を行う工程を含んでいても良い。例えばプライマーを含む試薬Ｒを滴下する場合、予め試薬Ｒを９５℃程度の温度で処理し、プライマーを変性させ１本鎖にすることで、プライマーダイマーの発生を抑え、核酸増幅反応時に非特異的な核酸の増幅を低減することが可能となる。
【００３１】
図４においては、ウェル４内へ試薬Ｒを滴下する工程Ｓ３を、基板層の成形工程Ｓ１とウェル４の内面の親水化工程Ｓ２に続く工程として示しているが、本技術に係るマイクロチップＡの製造方法では、別途、ウェル４等が成形されて親水化処理を施された基板層を用意し、ウェル４内へ滴下する工程Ｓ３から行うことも可能である。
【００３２】
（２−４）ウェルへの試薬の固着化
図４中、符号Ｓ４はウェル４内の試薬Ｒを乾燥させ、試薬Ｒをウェル４内面に固着化する工程である。前述の試薬Ｒを滴下する工程Ｓ３によってウェル４内に滴下された試薬Ｒは、ウェル４内面の親水化処理により、ウェル４内で中心部に比して辺縁部に偏在した形状に留まる。本工程では、試薬Ｒの該形状を保持したまま乾燥し、試薬Ｒをウェル４に固着化させる。乾燥方法としては、凍結乾燥が好適である。また、この凍結乾燥の工程の前に、予め試薬Ｒを十分に凍結するための冷却工程を設けても良い。ウェル４に滴下した試薬Ｒが、前記形状であることによって、滴下された試薬Ｒの表面積が大きくなり、冷却工程において試薬Ｒが均一に冷却される。また試薬Ｒの均一な冷却は、固着化の過程において試薬Ｒの形状を安定させる。この冷却工程と凍結乾燥工程とを組み合わせることにより、凍結乾燥時のウェル４における試薬Ｒの突沸等が予防され、滴下時のウェル４内における試薬Ｒの形状を、滴下以降の工程においても保持することが容易となる。
【００３３】
マイクロチップＡのウェル４内に固着化される試薬Ｒは、ウェル４内への試薬Ｒの滴下の工程Ｓ３と、ウェル４への試薬Ｒの固着化の工程Ｓ４とを繰り返して、核酸増幅反応に必要な物質の一部をウェル４内に積層させても良い。ウェル４において試薬Ｒの積層を行う際、滴下工程Ｓ３及び固着化工程Ｓ４の二巡目以降については、既にウェル４内に固着化された試薬Ｒの溶解を防ぐために、試薬Ｒの滴下時にマイクロチップＡを低温に保持しておくことが好ましく、滴下後は、試薬Ｒを直ちに凍結させることが好ましい。
【００３４】
（２−５）基板層の貼り合わせ
図４中、符号Ｓ５は基板層の貼り合わせ工程である。本工程では、前述の固着化工程Ｓ４によってウェル４内に試薬Ｒを保持した基板層と、他の基板層を貼り合わせる。基板層の貼り合わせには、例えば接着剤や粘着性を有したシートを用いる方法や、熱融着、陽極接合、超音波接合等の方法を用いることができる。また、基板層の表面を酸素プラズマ処理や真空紫外光処理により活性化して貼り合わせることも可能である。ポリジメチルシロキサン等のプラスチックの場合、ガラスとの親和性が高く、表面を前記処理によって活性化し接触させると、ダングリングボンドが反応して強固な共有結合であるＳｉ−Ｏ−Ｓｉシラノール結合を形成し、十分な強度の接合が得られる。酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理は、基板層の材質に応じて条件を設定すれば良い。
【００３５】
上述の、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法によって作製されたマイクロチップＡでは、ウェル４内に固着化された試薬Ｒが、ウェル４内面の親水化処理により一定の形状に揃う。そのため、マイクロチップＡ内に導入されるサンプル液との混合時に、固着された試薬Ｒの溶解の程度について、ウェル４間でのばらつきが抑えられる。また、試薬Ｒが、ウェル４辺縁部から中央部に向って嵩を減じて偏在した形状で固着されていることにより、試薬Ｒの表面積が大きくなる。このため、サンプル溶液との混合時に、試薬Ｒは溶解され易くなる。かつ固着化された試薬Ｒが前記の形状であるより、ウェル４中央部に試薬Ｒの溶け残りが生ずることが抑えられ、増幅核酸の光学的検出を行う場合、核酸増幅反応開始時におけるウェル４中央部での極端に強度が高いシグナルの検出を抑えることができる。従って、本技術に係る製造方法により作製されたマイクロチップを用いて、簡便で精度の高い核酸増幅反応を行うことが可能となる。
【００３６】
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。
（１）核酸増幅反応の反応場であるウェルに、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が前記ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着された、核酸増幅反応用マイクロチップ。
（２）前記ウェルを構成する面が親水性である、上記（１）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（３）前記物質が前記ウェルの辺縁部から中心部に向けて高さを減じたすり鉢形状で存在する、上記（１）又は（２）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（４）前記物質が前記ウェルの中心部を除く領域に環状に存在する、上記（１）から（３）の何れかに記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
（５）核酸増幅反応の反応場となるウェルを形成した基板層の該ウェルを構成する面を親水化する工程と、前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を前記ウェル内に滴下する工程と、前記物質を乾燥させ前記ウェル内に固着化する工程とを含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（６）前記親水化する工程に、前記ウェルを構成する面をプラズマに曝露する工程を含む、上記（５）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（７）前記固着化する工程に、前記ウェルに滴下された前記物質を凍結乾燥する工程を含む、上記（５）又は（６）に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【実施例】
【００３７】
本技術に係るマイクロチップの作製方法に則してマイクロチップを作製し、ウェル内に固着化された試薬の形状及び試薬の溶解時の状態を観察した。
【００３８】
＜マイクロチップの材料及び作製方法＞
マイクロチップの材料として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の基板層に、主流路、分岐流路、ウェルを成形した後、流路及びウェルを形成していない面のみを活性化し、ガラス板と貼り合わせた。次にメタルマスクによって流路等を保護し、ウェル内面のみ反応性イオンエッチング（１０ｃｃ、５０Ｗ、１５秒）により、親水化処理を行った。上記工程により作製されたマイクロチップを、実施例とした。比較例としてウェル内面の親水化処理を除いた点以外は、全て実施例と同様に作製されたマイクロチップを用意した。実施例及び比較例のマイクロチップの各ウェルにプライマーを含む試薬液を滴下し、実施例については−２８℃に置き、試薬を凍結させた。一方、比較例のマイクロチップは、２つの群に分け、１つの群は実施例と同様に−２８℃に置き、滴下した試薬を凍結させた。もう１つの群については、室温での減圧乾燥（１０００Ｐａ）によって試薬をウェルに固着させた。−２８℃における凍結処理を行った比較例の群を、比較例１とし、減圧乾燥を行った群を比較例２とする。実施例及び比較例１は、試薬の凍結後、凍結乾燥機（２５Ｐａ）において、試薬をウェル内に固着させた。プライマーを含む試薬液を固着させた実施例及び比較例１、２のマイクロチップの各ウェルには、次に酵素を含む試薬液を滴下し、固着化させた。滴下後の固着化の工程は、プライマーを含む試薬液の場合と同様に、実施例及び比較例１については凍結処理後、凍結乾燥を行い、比較例２については減圧乾燥を行った。
【００３９】
＜観察結果＞
実施例及び比較例１、２のウェル内に固着化された試薬の形状について、マイクロチップ上面から観察した結果を図５に示す。（Ａ）に示す実施例の各ウェルでは、試薬は中心部を除いて環状に固着化されている。また固着化された試薬の形状はウェル間で均一であった。（Ｂ）に示す比較例１では、ウェル内に固着化された試薬の形状は、ウェル内面の一方に集中し、ウェル間で不均一であった。（Ｃ）に示す比較例２においては、比較例１と同様にウェル内面の一方に試薬が偏って固着化される形状が観察されたが、いくつかのウェルにおいてはウェル中央部に試薬が集中している形状も観察された（図５（Ｃ）矢印）。
【００４０】
実施例及び比較例１、２のウェル内に核酸増幅反応用緩衝液を加え、３０秒後のウェル内の試薬の状態を観察した。マイクロチップ上面からウェル内を観察した結果を、図６に示す。（Ａ）は実施例のウェルであり、（Ｂ）及び（Ｃ）は各々比較例１及び比較例２のウェルである。実施例、比較例１、２の何れにおいても固着化された試薬の溶け残りは観察されたが、比較例２において、特に大きい試薬の溶け残りがウェル中央部に観察された（図６（Ｃ）矢印）。
【００４１】
本実施例の結果において、ウェル内面の親水化処理工程と乾燥処理前の試薬の十分な凍結は、マイクロチップのウェル内に固着された試薬の形状に影響することが示された。また、固着化した試薬の形状の違いによって、溶解時の溶け残りの発生に差が生じることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップによれば、簡便な方法で高精度な分析を行うことができる。そのため、臨床における遺伝子型判定や感染病原体判定などのための核酸増幅装置として、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップは用いられ得る。
【符号の説明】
【００４３】
Ａ：核酸増幅反応用マイクロチップ、ａ１、ａ２、ａ３：基板層、ｈ：試薬の最厚部における高さ、Ｒ：試薬、１：導入口、２：主流路、３：分岐流路、４：ウェル、５：排出口
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応の反応場であるウェルに、
前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が前記ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着された、
核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項２】
前記ウェルを構成する面が親水性である、請求項１に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項３】
前記物質が前記ウェルの辺縁部から中心部に向けて高さを減じたすり鉢形状で存在する、
請求項２に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項４】
前記物質が前記ウェルの中心部を除く領域に環状に存在する、
請求項３に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項５】
核酸増幅反応の反応場となるウェルを形成した基板層の該ウェルを構成する面を親水化する工程と、
前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を前記ウェル内に滴下する工程と、
前記物質を乾燥させ前記ウェル内に固着化する工程とを含む、
核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項６】
前記親水化する工程に、前記ウェルを構成する面をプラズマに曝露する工程を含む、
請求項５に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項７】
前記固着化する工程に、前記ウェルに滴下された前記物質を凍結乾燥する工程を含む、
請求項６に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項１】
核酸増幅反応の反応場であるウェルに、
前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部が前記ウェルの中心部に比して辺縁部に偏在した形状で固着された、
核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項２】
前記ウェルを構成する面が親水性である、請求項１に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項３】
前記物質が前記ウェルの辺縁部から中心部に向けて高さを減じたすり鉢形状で存在する、
請求項２に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項４】
前記物質が前記ウェルの中心部を除く領域に環状に存在する、
請求項３に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項５】
核酸増幅反応の反応場となるウェルを形成した基板層の該ウェルを構成する面を親水化する工程と、
前記核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を前記ウェル内に滴下する工程と、
前記物質を乾燥させ前記ウェル内に固着化する工程とを含む、
核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項６】
前記親水化する工程に、前記ウェルを構成する面をプラズマに曝露する工程を含む、
請求項５に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項７】
前記固着化する工程に、前記ウェルに滴下された前記物質を凍結乾燥する工程を含む、
請求項６に記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−９０５８６（Ｐ２０１３−９０５８６Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３３６８１（Ｐ２０１１−２３３６８１）
【出願日】平成２３年１０月２５日（２０１１．１０．２５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２５日（２０１１．１０．２５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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