核酸増幅方法
【課題】そこで、本発明は、基材上にて核酸増幅反応を行うに際して、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高める。
【解決手段】解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のRCA反応を行い、アプタマー領域に対応する核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子を、当該核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により上記基材に固定する。
【解決手段】解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のRCA反応を行い、アプタマー領域に対応する核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子を、当該核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により上記基材に固定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば核酸の塩基配列決定方法等に用いられる核酸増幅方法、当該核酸増幅方法に使用する核酸増幅キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅方法は、増幅目的の核酸を鋳型としてDNAポリメラーゼの酵素活性により当該核酸を増幅することを基本的な原理としている。核酸増幅方法には、鋳型となる核酸又はプライマーをビーズや基板等の基材に固定化し、当該基材上にて核酸増幅反応を実行するタイプがある。
【０００３】
このような基材上にて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法は、一例として、ゲノムDNAやトランスクリプトームの配列決定に利用される塩基配列決定方法に利用される。特に、近年では、試料となるDNA断片を基板に数多く固定して、これら数多くのDNA断片の塩基配列をパラレルに決定する方法が開発されている。これにより、塩基解析速度は飛躍的に向上した。これらの技術では、解析対象となる核酸断片を核酸増幅反応により増幅することで、増幅された核酸断片が束（クラスタ）として基板上に配置される。したがって、基板に固定されたDNA断片の数に対応して、数多くの核酸断片の束が基板上に配置されることとなる。
【０００４】
例えば、非特許文献１では、基板上にプライマーを固定し、固定されたプライマーを用いて基板上でPCRを行うことで、基板上に増幅遺伝子断片のクラスタを形成している。また非特許文献２では、エマルジョンPCRを行い、所定の核酸断片を微粒子表面にて増幅・固定し、その後、微粒子を基板上に固定する。これにより、増幅した核酸断片の束（クラスタ）が平面上に複数配置されることとなる。
【０００５】
このように、基板上に配置された核酸断片の束（クラスタ）について、いわゆるシーケンス反応を行うことで、当該束（クラスタ）毎に塩基配列を決定する。そして、基板上に配置された数多くの束（クラスタ）を二次元画像センサにて測定し、画像解析により蛍光を読み取ることで束（クラスタ）毎に塩基配列を決定する。このように、基板に固定された多数の束（クラスタ）を平行して解析している。
【０００６】
このような塩基配列決定方法において、核酸断片の束（クラスタ）の形成は重要なステップである。すなわち、基板上に高密度で束（クラスタ）を配置することは、一度に画像センサから取得できる配列情報を増加させるため、ハイスループット化を達成できる。一方、１つの束（クラスタ）に含まれる核酸断片が多ければ多いほど、シーケンス反応における蛍光強度等の信号強度が向上することとなり、より信頼性の高い塩基配列分析及び検出系の簡素化を達成できる。
【０００７】
しかしながら、基板上の束（クラスタ）を高密度化することと、各束（クラスタ）に含まれる核酸断片を多数化することは、一般に相反する関係にある。すなわち、束（クラスタ）の密度を高めることは、クラスタ一つの占める面積を少なくすることであり、そこに含まれる核酸断片数が減少してしまう関係にある。よって、基板上の束（クラスタ）を高密度化し、且つ、各束（クラスタ）に含まれる核酸断片を多数化する技術が求められている。
【０００８】
換言すれば、基材上にて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法において、核酸増幅反応により得られた、単位面積あたりの核酸断片数を高める手法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 20, e87
【非特許文献２】Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、基材上にて核酸増幅反応を行うに際して、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高めることができる核酸増幅方法及び当該核酸増幅方法に用いる核酸増幅キットを提供することを目的とする。また、本発明は、この核酸増幅方法を適用することで、一回の処理で読み取れる核酸断片の数を増加させることでハイスループット化を達成でき、且つSN比を向上させることで優れた信頼性を達成できる塩基配列決定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した目的を達成するため、本発明者らは、鋭意研究の結果、解析対象の核酸領域とアプタマー領域と含む環状核酸を鋳型とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行うことで、アプタマーが特異的に相互作用する物質を有する基材上において、増幅された核酸分子を立体的に集積させることができ、単位面積あたりの増幅対象の核酸領域の数を増加できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明に係る核酸増幅方法は、解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う工程を含んでいる。本発明に係る核酸増幅方法によれば、上記アプタマー領域に対応する核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子を、当該核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により上記基材に固定することができる。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅方法において、上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものを使用することができる。この場合、上記第２の物質と上記結合分子とが結合した状態で、上記ローリングサークル増幅反応が進行する。ここで、上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であってもよいし、異なる物質であっても良い。
【００１４】
また、本発明に係る核酸増幅方法において、上記プライマーとして上記結合分子を導入したものを使用し、上記基材として上記第２の物質を固定したものを使用する場合、先ず、上記環状核酸と上記プライマーとの複合体を形成し、その後、上記第２の物質と上記結合分子とを結合させることで当該複合体を上記基材上に捕捉させる。その後、上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応を実行することが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明に係る核酸増幅方法においては、上記第２の物質を所定の距離で離間して配置した基材を使用することが好ましい。このとき、上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するよう、上記基材上にランダムに配置されても良いし、上記基材上に規則的なパターンで配置されてもよい。
【００１６】
さらにまた、本発明に係る核酸増幅方法において、上記アプタマー領域は上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計されていてもよい。この場合、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により合成された核酸分子を鋳型とする2回目の核酸増幅反応により、上記核酸アプタマーを含む上記一本鎖核酸分子が合成されることとなる。
【００１７】
なお、上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用しても良いし、鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを使用しても良い。また、上記基材は平面基板又はビーズのいずれであってもよい。
【００１８】
ところで、本発明に係る核酸増幅キットは、解析対象の核酸領域を導入する部位と、核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸と、上記環状核酸に含まれる所定の領域にアニールできるプライマーと、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とを備えている。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅キットにおいて、上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものであることを好ましい。ここで上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であってもよいし、異なる物質であっても良い。
【００２０】
また、本発明に係る核酸増幅キットにおいて、上記基材は、上記第２の物質を離間して配置したものであることが好ましい。上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように、上記基材上にランダムに配置されも良いし、上記基材上に規則的なパターンで配置されてもよい。
【００２１】
さらに、本発明に係る核酸増幅キットにおいて、環状核酸に含まれるアプタマー領域は、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計されてもよい。
【００２２】
さらにまた、本発明に係る核酸増幅キットは、鎖置換活性を有するポリメラーゼ又は鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを更に備えていても良い。なお、本発明に係る核酸増幅キットにおいて上記基材は平面基板又はビーズのいずれであっても良い。
【００２３】
また、本発明では、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高めた特徴的な核酸構築物を提供できる。すなわち、本発明に係る核酸構築物は、核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子と、上記核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とから構成される。本発明に係る核酸構築物では、上記核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により、上記一本鎖核酸分子が上記基材に固定される。
【００２４】
また、本発明に係る核酸構築物において、上記基材上には、複数の上記一本鎖核酸分子が固定され、各一本鎖核酸分子はそれぞれクラスタを形成することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、基材上にて核酸増幅反応を行うに際して、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高めることができる。また、本発明は、この核酸増幅方法を適用することで、一回の処理で読み取れる核酸断片の数を増加させることでハイスループット化を達成でき、且つSN比を向上させることで優れた信頼性を達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明を適用した核酸増幅方法の一実施形態を説明するための概略構成図である。
【図２】本発明を適用した核酸増幅方法の他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図３−１】本発明を適用した核酸増幅方法の更に他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図３−２】図３−１に示した核酸増幅方法に使用する基板を作製する方法の一例を説明する概略構成図である。
【図４】本発明を適用した核酸増幅方法の更に他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図５】本発明を適用した核酸増幅方法の更に他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図６】本発明を適用した核酸増幅方法を実施する増幅遺伝子クラスタ作成装置を説明するための概略構成図である。
【図７】本発明を適用した核酸増幅方法を適用して形成されたクラスタの分析を行う核酸分析装置を説明するための概略構成図である。
【図８】本発明を適用した核酸増幅方法を適用して形成されたクラスタの分析を行う核酸分析装置の他の例を説明するための概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る核酸増幅方法は、図１A〜Cに示すように、解析対象の核酸領域１とアプタマー領域２と含む環状核酸３を鋳型とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う方法である。核酸増幅方法では、アビジン様分子等といった特定の核酸アプタマーとの間で特異的に相互作用する第１の物質４を固定した基板５を使用する。
【００２８】
また、図１A〜Cに示した核酸増幅方法では、第１の物質４に対して相互作用する結合分子６を5'末端に有するプライマー７を使用している。なお、一例として、第１の物質４がアビジン様分子である場合、結合分子６はビオチン分子となる。この結合分子６を有するプライマー７を使用することによって、鎖置換型のローリングサークル増幅反応は基板５の表面で進行する。
【００２９】
また、鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、一例としては鎖置換活性を有するポリメラーゼ８により、プライマー７の3'末端から進行する。この増幅反応は、環状核酸３を鋳型とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応であるため、一本鎖の増幅核酸９を合成する。合成された一本鎖の増幅核酸９は、環状核酸３に対応して、解析対象の核酸領域１とアプタマー領域２と繰り返して含んでいる。合成された一本鎖核酸９は、複数のアプタマー領域２のうち少なくとも一部が基板５上に配置された第１の物質４と相互作用することで、立体的に集積されたクラスタ１０を形成する。
【００３０】
＜＜環状核酸３＞＞
ここで、環状核酸３について説明する。環状核酸３は、アプタマー領域２を含む母体となるベクターに、解析対象の核酸領域１を組み入れることで作製される。解析対象の核酸領域１としては、例えば、解析対象のゲノムDNAやトランスクリプトーム由来のcDNA等を断片化して得られる、例えば10〜1000bp、好ましくは50〜500bp、より好ましくは100〜250bpの長さにDNA断片とすることができる。DNA断片を母体となるベクターに挿入する手法は、特に限定されないが、例えば、DNA断片の両末端に所定の制限酵素の認識配列を有するアダプターを結合し、上記ベクターにおける同制限酵素認識部位に挿入する手法が挙げられる。
【００３１】
アプタマー領域２とは、二本鎖の環状核酸３における、核酸アプタマーと呼称されるポリヌクレオチドに相当する領域である。核酸アプタマーとは、所定の塩基配列を有することで特定の物質に対して特異的な親和性を有する一本鎖の核酸分子を意味する。なお、環状核酸３は二本鎖の核酸分子であるため、アプタマー領域２が上記の特定の物質と相互作用することはない。
【００３２】
核酸アプタマーとしては、例えば、下記の表１に示すものが知られている。なお、表１は、既知の核酸アプタマーの塩基配列と、当該核酸アプタマーが特異的に親和性を有する物質の種類とを対応付けて示している。
【００３３】
【表１】
【００３４】
また、核酸アプタマーとしては、例えば、Anal Chem. 2009 July 1; 81(13): 5490-5495やActa Biochim Biophys Sin (2009): 335-340に開示されたものを使用することもできる。
【００３５】
さらに、環状核酸３は、複数の核酸アプタマーに対応する複数の異なるアプタマー領域２を有する構成であってもよい。このとき、複数の核酸アプタマーは、上記表に示す核酸アプタマーから任意に選択することができる。なかでも、核酸アプタマーとしては、5'-TATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTAT-3'（配列番号４）、5'-CAAGAACTCCTAAGTATAATGTGAGGGATCCGAAATTCTGCTCTTATGTATGGCAAGATT-3'（配列番号３）、5'-GCGGGGTTGGGCGGGTGGGTTCGCTGGGCAGGGGGCGAGTG-3'（配列番号１１）、 5'-CCCAGCAGCACTGGTAGTGAGGCAGTTCACCGGTGGGGCGGTGAGTTTGGCTGCTATTTAT-3'（配列番号１９）、5'-GTACCAGCTTATTCAATTACAGATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTCCTGGACTTGGGACTAGATAGTATGTTCATCAG-3'（配列番号２１）を使用することが好ましい。核酸アプタマーとしてストレプトアビジンに対するアプタマー配列（5'-TATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTAT-3'（配列番号４）、5'-GTGATCGTCCAGCGACCGAGCAGGAAACTTATGTAACGACCCGAAATTCCTGCTTAGACT-3'（配列番号１））を使用した場合には、結合分子６としてビオチンを用いることで、基板５に固定する分子４をストレプトアビジン一種類で行うことができ、基板の製造が簡略化できるといった利点がある。また、核酸アプタマーとしてセルビオースに対するアプタマー配列（5'-GCGGGGTTGGGCGGGTGGGTTCGCTGGGCAGGGGGCGAGTG-3'（配列番号１１）など表１参照）やキチンに対するアプタマー配列（5'-CCCAGCAGCACTGGTAGTGAGGCAGTTCACCGGTGGGGCGGTGAGTTTGGCTGCTATTTAT-3'（配列番号１９））を使用した場合には、基板側に固定する分子が単純な糖類で良く、基板５の製造コストや保存性の点に優れるといった利点がある。また、セルビオースやコール酸などの低分子に対するアプタマー配列（それぞれ5'-GCGGGGTTGGGCGGGTGGGTTCGCTGGGCAGGGGGCGAGTG-3'（配列番号１１）、5'-GTACCAGCTTATTCAATTACAGATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTCCTGGACTTGGGACTAGATAGTATGTTCATCAG-3'（配列番号２１））を使用した場合、物質４の排除体積が小さいため基板５に物質４を高密度に固定することができ、結果アプタマー配列の結合を促進することが出来る。
【００３６】
さらにまた、環状核酸３は、プライマー７が特異的にアニールする領域を有している。すなわち、環状核酸３は、プラマー７全体の塩基配列又はプライマー７の3'末端側領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド領域を有している。ここで、プライマー７の3'末端側領域とは、プライマー７の3'末端の塩基を含む例えば5〜100bp、好ましくは10〜50bp、より好ましくは15〜30bpの領域である。この範囲であれば、プライマー７が環状核酸３に対して特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３７】
＜＜基板＞＞
次に、基板５について説明する。基板５は、例えば、ガラス基板，サファイア基板，シリコン基板などの無機物質からなる基板、ステンレスなどの金属からなる基板、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリカーボネート樹脂、シクロオレフィン樹脂、ポリスチレン樹脂などの有機物質からなる基板を用いることができる。また、基板５は、単一の材料からなるものに限定されず、異なる材質の板状部材を貼り合わせたものや、各種の表面処理が施されたものであっても良い。また、図示した基板５は平板状を呈しているが、基板５の形状は特に限定されない。例えば、詳細を後述するが、所定の塩基配列決定装置に使用されるフローセルの一主面を基板５としても良い。
【００３８】
基板５に配置されている第１の物質４は、上述した環状核酸３のアプタマー領域２が特異的に相互作用する物質である。すなわち、第１の物質４としては、上記表１に示した各種の物質を使用することができる。
【００３９】
また、基板５と第１の物質４との間の結合は、特に限定されず、共有結合、静電相互作用、疎水相互作用などの如何なる結合でもよい。結合は、用いる基板５の材質と固定する第１の物質４に応じて適切なものを選択することができる。特に、基板５と第１の物質４との間の結合は安定性の観点から、共有結合とすることが望ましい。一例として、第１の物質４としてストレプトアビジンを使用し、基板５としてポリスチレン樹脂を使用する場合には以下のような手順に従って、ストレプトアビジンをポリスチレン樹脂からなる基板５の表面に固定することができる。すなわち、先ず、ポリスチレン樹脂からなる基板５の表面をVUV処理によって酸化させカルボキシル基を導入する。次に、このカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）で活性化させる。次いで、この表面にストレプトアビジン溶液を接触させることで、ストレプトアビジン中のアミノ基とカルボキシル基との間でエステル結合を形成させる。これにより、ポリスチレン樹脂からなる基板５の表面にストレプトアビジンを共有結合により固定することができる。
【００４０】
一方、基板５は、その表面にて核酸増幅反応を進行させるため、当該反応に使用するプライマー７を固定する手段を有している。図１に示した例では、第１の物質４がアプタマー領域２と相互作用する役割と、プライマー７を固定する手段としての役割を兼ねている。詳細には、プライマー７の5'末端には、第１の物質４に対して相互作用する結合分子６が結合している。例えば、第１の物質４がアビジン様分子である場合、結合分子６としてビオチン分子を使用することによって、プライマー７を基板５の表面に結合できる。
【００４１】
なお、アビジン様分子としては、ビオチンに対する結合能を有するものであれば良く、その分子種まで限定されず、一般的に使用されている如何なる分子を使用しても良い。アビジン様分子としては、例えば、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、アビジンなどを用いることができる。
【００４２】
なお、プライマー７を固定する手段としては、第１の物質４に限定されず、プライマー７における5'末端側の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。すなわち、このオリゴヌクレオチドを基板５の表面に導入しておき、プライマー７の5'末端側をオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることで、プライマー７を基板５の表面に固定することもできる。
【００４３】
また、プライマー７を固定する手段としては、一定以上の親和性を有する分子種の組み合わせであれば如何なる手段を採用しても良い。例えば、プライマー７を固定する手段としては抗体を使用することができる。すなわち、基板５の表面に抗体を固定し、抗原性を有する物質を結合させたプライマー７又は抗体に対する核酸アプタマーを有するプライマー７を使用する。このようにすれば、プライマー７は、抗原抗体反応又は核酸アプタマーと抗体との相互作用により基板５の表面に固定することができる。ビオチンとアビジン様分子との組み合わせ以外の他の選択肢を利用することで、サンプル調整等の増幅反応以外の工程に、ビオチンやアビジン様分子の特異的結合を利用することができる。
【００４４】
＜＜核酸増幅反応＞＞
次に、上述した環状核酸３及び基板５を用いた核酸増幅反応工程について説明する。核酸増幅反応は、DNAポリメラーゼを用いた鎖置換型の反応である。鎖置換型の核酸合成反応は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いても良いし、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼとヘリカーゼ（例えば、T7ヘリカーゼ）とを組み合わせて用いてもよい。より具体的に、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼとしては、例えばphi29ポリメラーゼを用いることができる。鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼとしては、その他にBstポリメラーゼ、Csaポリメラーゼ、96-7ポリメラーゼ等が挙げられる。これらのポリメラーゼは、各々、反応至適温度・条件が異なっており、ハイブリダイゼーションさせるプライマー７のTm値・アプタマー領域２と第１の物質４との結合条件に応じて、適宜選択することができる。
【００４５】
また、核酸増幅反応は、上述したDNAポリメラーゼの他に、Tris・HCl（pH 8.8）、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine、dNTPs等といった核酸増幅反応に通常使用される各種物質を適切な濃度に調整した反応溶液にて実行する。本核酸増幅反応は、ローリングサークル増幅反応（RCA反応）で行うため、増幅のエラー（誤った塩基の取り込み）の蓄積がない。PCRのような増幅された遺伝子断片を更に鋳型とする増幅反応では、反応の初期にエラーが発生すると、以後その断片を鋳型とした増幅産物にもエラーが引き継がれ、エラーが蓄積する現象が知られている。これに対して、RCA反応では、増幅産物を鋳型としないため原理的にエラーの蓄積が生じ得ない。よって、合成された一本鎖の増幅核酸９は、正確な塩基配列を主とするクラスタ１０を構成することとなる。なお、RCA反応においても、一定の確率でエラーが起こってしまうが、その出現はランダムでありクラスタ１０全体としては、正しい配列情報を出力する。なお、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼのうち、特にphi29ポリメラーゼは増幅時にエラーを起こす確立が低いことが知られており、このポリメラーゼを用いることでより正確な情報を有したクラスタ１０を形成することができる。
【００４６】
さらに、核酸増幅反応に鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼとヘリカーゼとを組み合わせて用いた場合、DNAポリメラーゼとヘリカーゼとを任意の比率で反応させることができる。DNAやトランスポリメラーゼに対して過剰量のヘリカーゼを加えることで、解析対象の塩基配列のGC含量や高次構造に由来するクラスタ間の増幅倍率の差を平準化し、バイアスを軽減できる可能性がある。
【００４７】
さて、上述した環状核酸３及び基板５を用いた核酸増幅反応では、先ず、第１の物質４を有する基板５に対して、プライマー７をアニールさせた環状核酸３を結合させる。すなわち、環状核酸３とプライマー７とを所定の条件下で溶液中に共存させることにより、環状核酸３の所定の領域にプライマー７がハイブリダイズする。このように形成されたプライマー-環状核酸複合体１１を含む溶液を基板５に接触させると、プライマー７の結合分子６と第１の物質４とが結合し、プライマー-環状核酸複合体１１が基板５の表面に結合する。
【００４８】
次に、基板５の表面に、上述した鎖置換型のRCA反応に必要なDNAポリメラーゼ及び反応試薬を作用させ、適切な反応条件に晒す。これにより環状核酸３を鋳型としてRCA反応が起こり、一本鎖の増幅核酸９が合成される。この一本鎖の増幅核酸９は、解析対象となる核酸領域１１とアプタマー領域２を繰り返し持つコンカテマー構造を示す。このとき、一本鎖の増幅核酸９に繰り返して存在する複数のアプタマー領域２が基板５上の第１の物質４との間に相互作用を形成する。これにより、一本鎖の増幅核酸９は、基板５の平面方向及び/又は垂直方向に広がらず、基板５の表面の所定の範囲に集積されることとなる。すなわち、上述した核酸増幅反応によれば、解析対象の核酸領域１を含む一本鎖の増幅核酸９が立体的に集積されたクラスタ１０を形成することができる。
【００４９】
このように、核酸増幅反応により合成された一本鎖の増幅核酸９が基板５条に集積した形を取るため、単位面積当たりに存在する解析対象の核酸領域１の数を高めることができる。したがって、このクラスタ１０を対象としたシーケンス反応では、高い信号強度を得ることができるし、より数多くのクラスタ１０を形成することでスループットを向上させることができる。これによって、塩基配列の精度の向上及び効率化を達成することができる。
【００５０】
また、クラスタ１０を構成する増幅核酸９は一本鎖であり、これに続くシーケンス反応時にプライマーがハイブリダイゼーションしやすく、シーケンス反応の効率が良い。例えば、illumina社のbridge PCR（Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732）方式では、固体表面に相補鎖も存在することになりシーケンス反応時にプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる一因となる。また特に、ハイブリダイゼーションを繰り返し行いシーケンスを決定するsequence by ligation（Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 20, e87）方式において、高いハイブリダイゼーション効率は非常に優れたメリットになる。したがって、上述した核酸増幅反応により形成したクラスタ１０をこれら公知のシーケンス反応に応用することで、シーケンス反応の効率を改善することができ、配列情報の信号強度を高めることができる。
【００５１】
仮に、アプタマー領域２を有しない環状核酸を用いてRCA反応を行った場合、合成された一本鎖DNAは、非常に長い分子量で空間的にも広がった構造となる。これに対して本例では、RCAの鋳型となる環状DNAにアプタマー配列を組み込むことで、反応によって生じる一本鎖の増幅核酸９にアプタマー領域２を出現させ、このアプタマー領域２と基板上の第１の物質４との相互作用で、一本鎖の増幅核酸９の空間的な広がりを抑制し、解析対象の核酸領域１の高密度化を達成している。また、空間的な広がりを抑えることで、一般的なRCA産物で起こる液の粘性上昇や、一本鎖DNAへの物理的な力によるせん断を防いでいる。粘度の上昇は、物質供給を妨げ、シーケンス反応の効率を低下させる。せん断による一本鎖DNAの切断は、クラスタ中の遺伝子断片数を低下させシーケンス反応時の信号強度を低下させる。本方法より合成された一本鎖の増幅核酸９は、アプタマー領域２とそれに対応した第１の物質４とを用いることにより、この点を回避している。
【００５２】
なお、アプタマー領域２とそれに対応した第１の物質４との組み合わせは、上記表１に示すように数多く知られており、特に限定されることなく如何なる組み合わせを適用しても良い。特に、ポリメラーゼ反応を行う条件においては、アプタマー領域２と第１の物質４が相互作用せず、ポリメラーゼ反応を行う条件とは異なる条件（塩濃度条件や温度条件など）とすることで初めて相互作用するような組み合わせであっても良い。一方、アプタマー領域２と第１の物質４との組み合わせは、ポリメラーゼ反応を行う条件で相互作用するような組み合わせであっても良い。
【００５３】
なお、コンカテマー構造の形状を制御することで、RCA反応後の液の粘度上昇とDNA鎖の切断を防ぐ既知の手法としては、DNA nanoball（nature biotechnology volume 28, 43-44）が知られている。このDNA nanoball技術を本発明に更に適用することもできる。すなわち、合成された一本鎖の増幅核酸９がDNA nanoballを形成するように環状核酸３の塩基配列を設計しても良い。詳細には、環状核酸３の母体となるベクターにおいて、アプタマー領域２以外の領域に、互いに相補的な塩基配列を有する少なくとも一対の領域を設計しておく。これら一対の領域は、一本鎖の増幅核酸９として合成されたときにハイブリダズできる。これにより、一本鎖の増幅核酸は、DNA nanoball様の高次構造を形成することができる。
【００５４】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００５５】
本実施形態は、図２A〜Ｄに示すように、一本鎖の増幅核酸９に含まれるアプタマー領域２が結合する第１の物質４と、第１の物質４とは異なる物質であってプライマー７の結合分子６と結合する第２の物質２０とを有する基板２１を使用している。上述した実施形態では、第１の物質４が一本鎖の増幅核酸９に含まれるアプタマー領域２と結合するとともに、プライマー７の結合分子６と結合する役割を担っていた。本実施形態では、これら二種類の結合をそれぞれ異なる物質を用いることに特徴がある。
【００５６】
本実施形態において、第２の物質２０としては、第１の物質４とは異なる物質であって、結合分子６に特異的に結合する能力を有する物質を使用することができる。すなわち、第２の物質２０としては、結合分子６との組み合わせを考慮して適宜選択することができる。第２の物質２０としては、様々な分子を用いることが可能であり、例えば、上述した実施形態と同様にアビジン様分子も用いることができる。この場合、結合分子６はビオチン分子となる。ただし、この場合、第１の物質４としてはアビジン様分子以外の物質を使用し、アプタマー領域２としては当該アビジン様分子以外の物質に特異的に結合するオリゴヌクレオを選択する。このようなアビジン様分子以外の物質と当該物質に特異的に結合するオリゴヌクレオとの組み合わせは、上述した実施形態における表１のリストから適宜選択することができる。
【００５７】
本実施形態においては、上述した実施形態と同様の手順及び試薬類によって、鎖置換型のローリングサークル増幅反応による核酸増幅反応を実施できる。すなわち、第１の物質４及び第２の物質２０を有する基板２１に、プライマー７をアニールさせた環状核酸３を結合させる。すなわち、プライマー-環状核酸複合体１１を含む溶液を基板２１に所定の条件下で接触させる。これにより、プライマー７の結合分子６が基板２１条の第２の物質４と結合し、プライマー-環状核酸複合体１１が基板２１上に固定される。この状態で、上述した実施形態と同様に、鎖置換型のローリングサークル増幅反応による核酸増幅反応を進行させる。核酸増幅反応により、一本鎖の増幅核酸９が合成される。合成された一本鎖の増幅核酸９は、その内部に含まれるアプタマー領域２が基板２１上の第１の物質４と結合することによって、基板２１上に立体的に集積したクラスタ１０を形成する。
【００５８】
以上の説明から理解できるように、本実施形態では、プライマー-環状核酸複合体１１を補足する第２の物質２０とアプタマー領域２と結合する第１の物資４とを異なる物質としたため、クラスタ１０間の距離を調節することが可能になる。すなわち、隣り合うクラスタ１０間の距離は、基板２１上に配置された隣り合う第２の物質２０間の距離２２に依存する。よって、第１の物質４及び第２の物質２０を有する基板２１を作製する際に、隣り合う第２の物質２０を離間させれば隣り合うクラスタ１０間の距離を大とすることができ、逆に、隣り合う第２の物質２０を近接させれば隣り合うクラスタ１０間の距離を小とすることができる。
【００５９】
例えば、第１の物質４及び第２の物質２０を共にタンパク質とした場合、上述した実施形態と同様に、これら第１の物質４及び第２の物質２０を基板２１の表面に導入することができる。このとき、第１の物質４及び第２の物質２０を含有する溶液における両者の比率を調整することで、隣り合う第２の物質２０の距離２２を調整することができる。詳細には、溶液中の第２の物質２０の比率を上げれば、隣り合う第２の物質２０の距離２２を小とすることができ、逆に溶液中の第２の物質２０の比率を下げれば、隣り合う第２の物質２０の距離２２を大とすることができる。
【００６０】
なお、隣り合う第２の物質２０間の距離２２は、光学的な分離が可能な距離が望ましい。より具体的にはシーケンス反応の観測波長をλとし、開口数NAの対物レンズを用いた工学検出系を使用した場合において、距離２２はレイリーの定義〔（0.61xλ）/NA〕以上の距離であることが好ましく、数値としては200nm以上、より好ましくは400nm以上、更により好ましくは500nm以上とする。ただし、隣り合う第２の物質２０間の距離２２は、固定反応がランダムに起こるため確率的な分布を持っており、平均として光学的な分離が容易であれば良く、必ずしもすべての分子間距離がこの数字に従う必要はない。
【００６１】
以上のように、核酸増幅反応においてプライマー-環状核酸複合体１１を所望の距離で配置できるため、プライマー-環状核酸複合体１１の量が大過剰に与えられた場合であっても、核酸増幅反応で形成されるクラスタ１０間の距離を所望の距離とすることができる。一般に、基板上にて核酸増幅反応を進行させてクラスタを形成する場合、鋳型DNA分子を多量に加え過ぎてしまうと、クラスタ間の距離が密になりすぎて光学上クラスタの分離が不能になる「ホワイトアウト」という現象が知られている。ホワイトアウトを防ぐためには、従来、適当な濃度になるよう鋳型DNAを希釈し、基板上での核酸増幅反応を行っている。しかしながら、鋳型DNAの定量の精度などの問題から、必ずしも成功するわけではない。また、ホワイトアウトをより確実に防ぐため、クラスタ間の距離を十分に離そうとすると、必要以上にクラスタ密度が低下することとなり、スループット面での十分なパフォーマンスを発揮することができない。これに対して、本実施形態では、第２の物質２０の固定密度を制御することで、クラスタ１０の密度を所望に制御することができる。よって、本実施形態によれば、大過剰のプライマー-環状核酸複合体１１を加えても、ホワイトアウト現象は起こりにくい。本実施形態では、従来のようにホワイトアウトを警戒して低濃度のサンプルを用いる必要がないため、実用上のスループットを確保することができる。また、サンプルの濃度に対する高精度に調整する手間を省くことができユーザーへの実験上の利便性を高める。このように、本実施形態によれば、例えば、検出する光学系に併せて隣り合うクラスタ１０の距離を制御できるため、この「ホワイトアウト」を確実に防止できる。
【００６２】
また、一般に、基板上にて核酸増幅反応を進行させてクラスタを形成する場合、一般に増幅対象の塩基配列CG含量など依存してクラスタのサイズが大きく異なる。例えば、成長の遅いクラスタが成長の早いクラスタに隣り合うと、成長の遅いクラスタ由来の信号が検出しにくい傾向がある。しかしながら、本実施形態によれば、隣り合うクラスタ１０の距離を第２の物質２０間の距離２２で調整できるため、このような現象を起こりにくくできる。これによりシーケンスデータにおけるCGバイアスを低減できる。
【００６３】
なお、隣り合うクラスタ１０間の距離を離すためには、第２の物質２０の結合箇所は一価であることが望ましく、アビジン様分子であれば複合体を形成しない変異体を用いることが好ましい。
【００６４】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の更に他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００６５】
本実施形態は、図３A〜Ｂに示すように、第２の物質２０を規則的なパターンで配置した基板３０を使用している。第２の物質２０を規則的なパターンで配置するには、例えば、いわゆるマイクロコンタクトプリンティング工法を用いて実現することができる。一般に、マイクロコンタクトプリンティング工法で調製可能なスポットサイズは50nm程度であり、一箇所のスポットにおいて一分子の第２の物質２０を配置することは困難である。すなわち、マイクロコンタクトプリンティング工法で第２の物質２０を配置した場合、一箇所のスポットに複数の第２の物質２０が固定される可能性がある。この場合、過剰のプライマー-環状核酸複合体１１を加えると、一箇所のスポットに複数のプライマー-環状核酸複合体１１が固定され、その結果、核酸増幅反応により一箇所のスポットに複数のクラスタ１０が形成される虞がある。この場合、上述した「ホワイトアウト」の問題が生じる虞もある。
【００６６】
この場合、プライマー-環状核酸複合体１１の形状を大きくすることで、一箇所のスポットに対して１分子のプライマー-環状核酸複合体１１しか固定できないように調整することが好ましい。プライマー-環状核酸複合体１１の形状は、１分子のプライマー-環状核酸複合体１１が一箇所のスポットを占有しうる形状であれば特に限定されない。例えば、プライマー-環状核酸複合体１１の直径をスポットの直径の1/2以上、好ましくは3/5以上、より好ましくは2/3以上とすることで、１分子のプライマー-環状核酸複合体１１が一箇所のスポットを占有できる。ここで、プライマー-環状核酸複合体１１の直径とは、プライマー-環状核酸複合体１１が第２の物質２０に固定された状態で、基板２１の表面を垂直方向から観察したときの、プライマー-環状核酸複合体１１の直径を意味する。
【００６７】
プライマー-環状核酸複合体１１のサイズは、環状核酸３の大きさ（塩基長）の調整や、DNA nanoball（nature biotechnology volume 28, 43-44）構造により制御することができる。
【００６８】
マイクロコンタクトプリント工法を用いた基板３０の製造には、二通りの方法がある。すなわち、図３−２Ａに示すように、凸型のナノピラー構造３１を有するスタンパ３２を利用する方法と、図３−２Ｂに示すように、ナノホール構造３３を有するスタンパ３４を利用する方法である。
【００６９】
スタンパ３２を利用する方法では、先ず、第２の物質２０を凸型のナノピラー構造３１の表面に固定する。次にスタンパ３２を基板３０の一主面に押し付け、凸型のナノピラー構造３１の表面に固定された第２の物質２０を基板３０の一主面に転写する。次に、基板３０の一主面に、上述した実施形態と同様にして、第１の物質４を固定する。
【００７０】
スタンパ３４を利用する方法では、先ず、スタンパ３４の一主面におけるナノホール構造３３以外の面に第１の物質４を固定する。次にスタンパ３４を基板３０の一主面に押し付け、ナノホール構造３３以外の面に固定された第１の物質４を基板３０の一主面に転写する。次に、基板３０の一主面に、上述した実施形態と同様にして、第２の物質２０を固定する。
【００７１】
以上のように、規則的に配置された凸型のナノピラー構造３１或いはナノホール構造３３に応じて、第２の物質２０を基板３０上に規則的に配置することができる。特にナノピラー構造３３を有するスタンパ３４を利用した場合には、凸型のナノピラー構造３１を有するスタンパ３２を利用した場合と比較して、基板３０への押し付けの際の圧力を分散できる面積が広いため、適正な転写圧力の許容範囲が広く、基板作製の歩留まりに優れるため好ましい。
【００７２】
このように作製された基板３０を利用することによって、核酸増幅反応により形成されたクラスタ１０は、第２の物質２０の配置に従って出現することになる。この第２の物質２０の固定間隔３５を制御することで、クラスタ１０間の距離を調節できる。本実施形態によれば、クラスタ１０は特定の位置に一定間隔の距離をおいて存在することになるため、画像情報からの輝点検出が容易となる。またクラスタ１０間の距離を光学的に分離容易な距離にすることで、厳密な焦点調整を行わなくともシーケンス情報の取得が可能となる。これらは画像データの取得時間・処理時間を短縮と、それによるシーケンサーのスループットの向上をもたらす。
【００７３】
一般に、隣接してしまったクラスタからの輝点分離には、正確な焦点で境界判別を行う必要がある。境界が不鮮明な画像からではクラスタの分離が困難であり高い計算コスト必要とし、不鮮明な焦点画像では隣接クラスタ間で光のクロストークが生じデータの信頼性も低下しやすいからである。本実施形態のように、クラスタ１０間の距離が予め定まっている場合には、焦点調節に係る工数を削減することができ、画像取得・画像処理にかかる時間が短縮できるため、スループットの向上に貢献できる。
【００７４】
なお、第２の物質２０の固定間隔３５は、上述した実施形態における距離２２と同様に規定することができる。すなわち、第２の物質２０の固定間隔３５は光学的な分離が可能な距離以上とすることが好ましい。より具体的にはシーケンス反応の観測波長をλとし、開口数NAの対物レンズを用いた工学検出系を使用した場合において、固定間隔３５はレイリーの定義〔（0.61xλ）/NA〕以上の距離であることが好ましく、数値としては200nm以上、より好ましくは400nm以上、更により好ましくは500nm以上とする。
【００７５】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の更に他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００７６】
本実施形態は、図４A〜Ｂに示すように、所定の塩基配列からなる核酸アプタマーについて相補鎖が読み取られるアプタマー領域４０を有する環状核酸４１を使用している。環状核酸４１は、アプタマー領域４０が所定の核酸アプタマーの逆鎖を読み取るように構成した以外は、上述した実施形態における環状核酸３と同じ構成である。
【００７７】
本実施形態では、環状核酸４１を鋳型として鎖置換型のRCA反応により合成された一本鎖の増幅核酸４２が核酸アプタマーの相補鎖を有するようにする。ここで、核酸アプタマーは、所定の塩基配列からなる一本鎖核酸の状態で機能するが、相補鎖では機能しない。すなわち、RCA反応により合成された一本鎖の増幅核酸４２は、核酸アプタマーとして機能する領域が存在せず、第１の物質４に結合することはできない。
【００７８】
本実施形態では、鎖置換型のRCA反応により合成された一本鎖の増幅核酸４２を鋳型として、更に鎖置換型の核酸増幅反応を実施する（以下、2回目の核酸増幅反応）。この2回目の核酸増幅反応は、一本鎖の増幅核酸４２の一部の領域にハイブリダイズするプライマー４３を使用する。一本鎖の増幅核酸４２は、鎖置換型のRCA反応により合成されたものであるためプライマー４３がアニールする箇所を複数有している。なお、2回目の核酸増幅反応で使用するプライマー４３は、鎖置換型のRCA反応おいて使用したプライマー７の相補鎖とすることもできる。
【００７９】
上述した他の実施形態と同様に、鎖置換型のRCA反応を行った後、2回目の核酸増幅反応は、一本鎖の増幅核酸４２を鋳型とするため、RCA反応ではなく通常の鎖置換型の核酸増幅反応となる。このとき、一本鎖の増幅核酸４２には、プライマー４３がアニールする箇所を複数有しているため、増幅された核酸断片４４は級数的に増幅することとなる。そして、核酸断片４４は、核酸アプタマーとなる領域４５を含む一本鎖核酸となる。このように一本鎖核酸である核酸断片４４群は、基板５上に配置された第１の物質４と結合して、上述した実施形態と同様に立体的に集積された形状を呈することとなる。
【００８０】
以上のように、本実施形態によれば、反応を二段階に分け一回目のプライマーと逆方向のプライマーを用いた2回目の核酸増幅反応を実施することにより、増幅効率が増し、短時間の処理でシーケンス反応の検出に必要な数の解析対象の核酸領域１を得ることができる。この核酸断片４４はほとんどが一本鎖で構成されておりシーケンス反応の鋳型として適する。また核酸アプタマーとして機能する領域４５を繰り返し持つため、上述した実施形態と同様に立体的に集積された形状を呈することとなる。
【００８１】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の更に他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００８２】
本実施形態は、図５A〜Cに示すように、上述した実施形態における基板５や基板２１に代えてビーズ５０（曲面）を使用している。すなわち、本発明は、平板状の基板５、２１のみならず曲面状のビーズ５０といった如何なる基材を使用しても実施可能である。
【００８３】
図５Aに示すように、ビーズ５０上にプライマー-環状核酸複合体１１を固定し、環状核酸３を鋳型として鎖置換型のRCA反応を実行すると、上述した実施形態と同様に、一本鎖の増幅核酸９が合成される、合成された一本鎖の増幅核酸９は、アプタマー領域２が第１の物質４に結合することによって、ビーズ表面から放射状に散在するのではなく、ビーズ表面を覆うように存在する。すなわち、本実施形態では、一本鎖の増幅核酸９により覆われた核酸被覆ビーズ５１が形成される。この核酸被覆ビーズ５１は、表面に核酸を有しない裸ビーズ５２とは電気的性質が大きく異なっている。すなわち、核酸被覆ビーズ５１はマイナス電荷を帯びており、裸ビーズ５２はプラス電荷を帯びている。したがって、核酸増幅反応の終了後、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２が混在する溶液に電場を与えることで、図５Bに示すように、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２を容易に分離して回収することができる。
【００８４】
また核酸被覆ビーズ５１は、多量のリン酸基を有しているため、たとえばジルコニアなどで被覆した基板５３に結合することができる。よって、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２が混在する溶液をジルコニアなどで被覆した基板５３に接触させることで、図５Cに示すように、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２を容易に分離して回収することができる。なお、基板５３上に分離された核酸被覆ビーズ５１は、そのままシーケンス反応に供することができる。
【００８５】
一般的なビーズ上での遺伝子増幅反応は所謂エマルジョンPCRである。エマルジョンPCRでは、5’末端をビーズに固定したDNA断片をプライマーとして用いているため、遺伝子増幅反応の有無にかかわらず、一定量のDNA分子を最初からビーズ上に有している。このような状態では、図５Bや図５Cに示したような原理に基づいて、合成反応の起こったビーズと起こっていないビーズとを分離することは非常に困難である。これに対して、本実施形態によれば、図５Bや図５Cに示したような原理に基づいて核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２を容易に分離しでき、ユーザーがサンプル処理にかける時間を短縮することができる。
【００８６】
なお、本実施形態では、一般的なエマルジョンPCRと同じく、W/Oエマルジョンを微小反応場として用いて核酸増幅反応を実施しても良いが、エマルジョンを作製することなくビーズ上に遺伝子断片のクラスタ１０を形成することができる。
【００８７】
一般に、エマルジョンPCRにより、増幅断片を有するビーズを調製するには、ビーズに結合したプライマー、増幅対象となる遺伝子断片、ビーズに結合したプライマーとは逆向きのプライマーを用いて、W/Oエマルジョンを微小反応場としてPCRを行う。この時、PCRによって生じた核酸断片は二本鎖のうち一方のみが、ビーズと共有結合で結ばれている。一方、その相補鎖はビーズと直接結合しておらず、温度サイクルをかけることで引き剥がされ溶液中に遊離し、次のPCRの鋳型となる。この遊離した相補鎖が別のビーズ上で増幅しないよう、反応場を隔離する必要があり、エマルジョンによって空間的に閉じた反応容器内でPCRを行っている。この手法は、エマルジョンの作製や破壊を行わなくてはならず作業上煩雑である。また反応容器がエマルジョン中の水滴という非常に限られた空間であるため、核酸合成反応の基質・酵素の追加供給や合成によって生じた副反応物の除去を行うことができない。
【００８８】
このようなエマルジョンPCRの諸問題に対して、本実施形態によれば、ビーズ５０に対してプライマー-環状核酸複合体１１を固定しているため、合成された一本鎖の増幅核酸９はビーズ表面から解離していない。よって、基本的には、増幅核酸９の分散は起こりにくく、増幅核酸９が繰り返し持つアプタマー領域２によってビーズ５０に逐次絡めとられるため、空間的に広がりにくい。よって、一つのビーズ上で合成されたクラスタ１０は、他のビーズ５０に影響を及ぼさない。
【００８９】
＜＜増幅遺伝子クラスタ作成装置＞＞
次に、以上で説明した本発明に係る核酸増幅方法を実行する増幅遺伝子クラスタ作成装置を説明する。増幅遺伝子クラスタ作成装置は、例えば図６に示すように、増幅したクラスタ１０を形成する支持体６０に、予め流路６１を設けた反応チャンバー６２を張り合わせ、フローセル６３を備える。反応チャンバー６２は、少なくとも、クラスタ１０を形成する部分の部材が光透過性の材質から形成されていることが好ましい。反応チャンバー６２は、例えば、流路６１となる溝を予め掘ったPDMS（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体を用いる。
【００９０】
また、増幅遺伝子クラスタ作成装置は、具体的に、核酸試料、反応酵素、バッファー、ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット６４、反応液を送り出す分注ユニット６５、液の流れを制御するバルブ６６，廃液タンク６７から構成される。このように構成された増幅遺伝子クラスタ作成装置は、温調ユニット６４における温調機を通じたフローセル６３部分の温度制御と、反応基板（流路６１）への溶液交換によって、上述した各種実施形態に示した核酸増幅反応を制御し、その結果、所望のクラスタ１０を形成する。なお、反応終了時には、洗浄液が流路６１を通じて供給され、廃液タンク６７に収納される。
【００９１】
＜＜核酸分析装置＞＞
次に、本発明を適用した核酸分析装置について説明する。核酸分析装置は、図７に示すように、反応デバイス７０（反応部）に対して、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プライマー及び核酸試料からなる1種類以上の生体分子を供給する手段と、前記反応デバイス７０に光を照射する手段と、前記反応デバイス７０上の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。
【００９２】
具体的に、反応デバイス７０は、カバープレート７１と検出窓７２と溶液交換用口である注入口７３と排出口７４とから構成される反応チャンバーに設置される。なお、カバープレート７１と検出窓７２の材質としては、光透過性を有するPDMS（Polydimethylsiloxane）を使用する。核酸分析装置は、図示しないが、上述した核酸増幅方法の実施形態で説明した手順にて核酸増幅反応が進行するように、鎖置換型のRCA反応を行う酵素、環状核酸３、プライマー７、酵素の基質となるヌクレオチド並びに蛍光色素を有するヌクレオチドを順次、注入口７３を介して反応デバイス７０に供給する分注ユニットを有している。
【００９３】
また、核酸分析装置は、前記反応デバイス７０に光を照射する手段として、YAGレーザ光源（波長532ｎｍ，出力20ｍＷ）７６及びYAGレーザ光源（波長355ｎｍ，出力20ｍＷ）７７と、これらYAGレーザ光源７６及び７７から出射したレーザ光７８及び７９の光軸上に配置されたダイクロイックミラー８０（410ｎｍ以下を反射）と、同光軸上に配置された集光レンズ８１と、プリズム８２とを備えている。
【００９４】
さらに、核酸分析装置は、前記反応デバイス７０上の蛍光を測定する蛍光検出手段として、検出窓７２に対応する位置に配設される対物レンズ８３と、対物レンズ８３により平行光束とされた光軸上に配設された光学フィルタ８４と、同光軸上に配設された結像レンズ８５と、2次元CCDカメラ８６とを備えている。
【００９５】
以上のように構成された核酸分析装置は、上述したように核酸増幅反応が反応デバイス７０にて進行し、蛍光色素を取り込んだクラスタ１０が反応デバイス７０の基板表面に固定される。そして、YAGレーザ光源７６及びYAGレーザ光源７７から発振するレーザ光７８及び７９をダイクロイックミラー８０により同軸になるよう調整した後、レンズ８１によって集光し、その後、プリズム８２を介して反応デバイス７０へ臨界角以上で照射する。そして、検出窓７２より出射される蛍光は、対物レンズ８３により平行光束とされ、光学フィルタ８４により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ８５により2次元CCDカメラ８６上に結像される。
【００９６】
このように核酸分析装置によれば、本発明に係る核酸増幅方法を適用して基材上に形成された増幅核酸９のクラスタ１０を検出することができる。このとき、本発明に係る核酸増幅方法によれば、クラスタ１０を高密度化することができるとともに、各クラスタ１０に含まれる核酸量を多くすることができる。よって、2次元CCDカメラ８６を使用することで、より多くのクラスタ１０を高感度に撮像することができる。
【００９７】
なお、本発明に係る核酸増幅方法は、図７に示した核酸分析装置に限定されず、図８に示した核酸分析装置にも適用することができる。図８に示す核酸分析装置は、温調ユニット８７と光ファイバー８８を有する以外は、図７に示した核酸分析装置と同様に構成されている。
【００９８】
ところで、本発明に係る核酸増幅方法により、一般鎖の増幅核酸９からなるクラスタ１０を形成した後、このクラスタ１０を用いて解析対象の核酸領域１の塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定原理は、特に限定されないが、例えば、Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732に開示された手法を採用することができる。すなわち、
(1)アンカープライマーのハイブリダイゼーション
(2)蛍光プライマーのライゲーション、
(3)蛍光検出
(4)アンカープライマーと蛍光プライマーの除去
(5)上記(1)〜(4)の繰り返し
を行い、解析対象の核酸領域１の塩基配列を決定することができる。
【００９９】
また、塩基配列の決定方法としては、上記ライゲーションによる方法以外に逐次反応方式を用いることができる。蛍光色素付きヌクレオチドとして、Acta Biochim Biophys Sin (2009): 335-340に開示されているような、リボースの3′OHの位置に3′-O-アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの5位の位置にあるいはプリンの7位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応方式でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【０１００】
さらに、本実施形態では、P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。図７及び８に示すような核酸分析装置を使用することで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化、反応デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０２】
〔実施例１〕
＜材料＞
アプタマー配列として、ストレプトアビジンに対して親和性が報告されている配列（5'-TATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTAT-3'（配列番号４））を用いた。この配列を含む核酸試料（5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTATCAAAAGTGCACGCTACTTTG-3'（配列番号２２））を合成し、二種類のプライマー（5'-ATCATTGGATCCTAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3'（配列番号２３）、5'-ATCCATAAGCTTTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'（配列番号２４））を用いPCRで増幅した後、pSPT19のBamH I〜Hind IIIサイトに挿入し、プラスミド（pSPT19_AptB1）を得た。更にpSPT19_AptB1を鋳型として、二種類のプライマー（5'-GGCGTAGAGGATCTGGCTAGCGATGACCCTGCTGATTG-3'（配列番号２５）、5'-CGATCCGATGCTAGCGTAAAACGACGGCCAGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATG-3'（配列番号２６））を用いPCRを行った。得られた増幅断片を制限酵素処理し、電気泳動にて精製したものをライゲーションし、519bpからなる二本鎖環状DNA分子を得た。この二本鎖環状DNA分子をモデルとして用い本発明の検証を行った。基板にはストレプトアビジンを固定したガラス板を用いた。作製にはエステル活性化済みのガラス板（Hubbleスライドガラス、タカラバイオ）を用い、これを0.5mg/mlのストレプトアビジン（streptavidin TypeII、WAKO）溶液に室温・16時間浸漬し、ストレプトアビジンの固定反応を行った。
【０１０３】
＜基板上増幅反応とクラスタの評価＞
二本鎖環状DNA分子と5'ビオチン化プライマー(5'biotin-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3'（配列番号２７）)を終濃度20nMになるよう混合し、95℃で5分間加熱した後、緩やかに室温に戻し、両者をアニールさせた。この溶液を希釈した（終濃度1nM）ものを基板に与え、飽和蒸気下で室温・1時間静置し、基板に二本鎖環状DNA分子とビオチン化プライマーの複合体を固定した。未結合の物質は、150mM NaClを含むTEバッファー（以降TENバッファーと呼称）で洗浄し除去した。
【０１０４】
次いで、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（96-7ポリメラーゼ、ニッポンジーン）を含む溶液（8U/20μl）を与え、50℃にてRCA反応を行った。反応溶液には、メーカー添付のバッファーを用い、dNTP濃度は250μMで行った。4時間経過後に、EDTA（終濃度50mM）を添加した上で室温に戻し、反応停止とした。この基板をTENバッファーにて洗浄した後、5'末端をCy3標識したオリゴDNA（5'-Cy3 CTATAGTGTCACCTAAATCGTATG-3'（配列番号２８））1μMを基板にかけ、室温にて約16時間反応させ、TENバッファーにて洗浄し、基板上に形成された増幅遺伝子断片のクラスタを蛍光顕微鏡にて観察した。この蛍光標識プローブの相補鎖は、コンカテマー構造の繰り返し回数分だけ出現するため、輝点の蛍光強度は、その輝点に含まれる増幅遺伝子断片の数を反映することになる。Cy3標識デンドリマーを用い蛍光分子数と輝点強度との検量線を作り、クラスタあたりの蛍光分子数を算出し、クラスタあたりの増幅遺伝子断片数とした。結果基板上に、直径約800nm程度の輝点が形成されており、そこに含まれる遺伝子断片数は800〜1000分子程度であった。この値から基板上で合成された塩基長は、およそ400〜500kbpと見積もられた。
【０１０５】
このような非常に長いDNA分子は、通常今回観測された輝点よりも大きな体積を占めており、アプタマー配列を有していない二本鎖環状DNA分子を鋳型として用いる場合には、クラスタのサイズが大きくなり、面積あたりの遺伝子断片数が減少することになる。
【０１０６】
〔実施例2〕
本実施例では、基板上での合成反応時に、まずアプタマー配列の相補鎖側を合成し、次いでその逆鎖（アプタマー配列側）の合成反応を行い、二段階目の反応で生じたアプタマー配列で産物を基板に固定し、短時間で高い増幅倍率を得る効果について検討した。
【０１０７】
＜材料＞
材料には、実施例1と同様の基板と二本鎖環状DNA分子を用いた。
【０１０８】
＜増幅反応とクラスタの評価＞
二本鎖環状DNA分子と5'ビオチン化プライマー(5'biotin-TAATACGACTCACTATAGG-3'（配列番号２９）)を終濃度20nMになるよう混合し、95℃で5分間加熱した後、緩やかに室温に戻し、両者をアニールさせた。この溶液を希釈したもの（終濃度1nM）を基板に与え、飽和蒸気下で室温・1時間静置し、基板に二本鎖環状DNA分子とビオチン化プライマーの複合体を固定した。
【０１０９】
次いで、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（Csaポリメラーゼ、ニッポンジーン）を含む溶液（8U/20μl）を与え、60℃にて1時間RCA反応を行った。反応溶液には、メーカー添付のバッファーを用い、dNTP濃度は250μMで行った。反応後、基板をTENバッファーにて洗浄し、一回目の合成反応の終了とした。この基板にオリゴDNA（5'-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3'（配列番号２７））5μMを与え、熱処理（60℃15分）した後、ゆっくりと室温に戻し、コンカテマーにオリゴDNAをハイブリダイゼーションさせた。過剰量の（未結合の）オリゴDNAはTENバッファーにて洗浄し、除去した。
【０１１０】
次いで、基板に0.5U/μlのphi29ポリメラーゼ（Nxgen phi29、Lucigen社）を含む反応溶液（バッファー：メーカー添付、dNTP濃度：250μM）を与え、30℃にて2時間、反応を行った。終濃度50mMのEDTAを添加し、TENにて洗浄し、反応停止とした。以上の反応で形成されたクラスタに蛍光標識プローブ（5’-Cy3 CTATAGTGTCACCTAAATCGTATG-3’（配列番号２８））をハイブリダイゼーションさせた後、実施例1と同様に輝点強度を観察した。
【０１１１】
観察の結果、基板上に直径約900nmの輝点が認められ、そこに含まれる遺伝子断片数は平均22890分子と求められた。この3時間で20000倍以上の増幅率は、合成速度に換算すると約1kbp/secとなり、一箇所の複製起点からの反応では到底説明できず、逆鎖の合成反応が起こりその産物がアプタマー配列によって基板に固定されたものと推定される。アプタマー配列を有しない二本鎖環状DNA分子を鋳型として用いた場合には、二段階目の合成反応で生じた産物が基板への固定されないため、輝点における遺伝子増幅断片数は、本実施例に比べ大幅に低下する。例えば実施例１は一方向の合成反応のみのため、4時間反応で1000倍程度と、実施例２に比べ20分の１以下の増幅速度であった。
【符号の説明】
【０１１２】
１…解析対象の核酸領域、２…アプタマー領域、３…環状核酸、４…第１の物質、５…基板、６…結合分子、７…プライマー、８…ポリメラーゼ、９…増幅核酸、１０…クラスタ、１１…プライマー-環状核酸複合体、２０…第２の物質、２１…基板、２２…距離、３０…基板、３１…凸型のナノピラー構造、３２…スタンパ、３３…ナノホール構造、３４…スタンパ、３５…固定距離、４０…アプタマー領域、４１…環状核酸、４２…増幅核酸、４３…プライマー、４４…核酸残片、４５…領域、５０…ビーズ、５１…核酸被覆ビーズ、５２…裸ビーズ、５３…基板、６０…支持体、６１…流路、６２…反応チャンバー、６３…フローセル、６４…温調ユニット、６５…分注ユニット、６６…バルブ、６７…廃液タンク、７０…反応デバイス、７１…カバープレート、７２…検出窓、７３…注入口、７４…排出口、７６…YAGレーザ光源、７７…YAGレーザ光源、７８…レーザ光、７９…レーザ光、８０…ダイクロイックミラー、８１…レンズ、８２…プリズム、８３…対物レンズ、８４…光学フィルタ、８５…結像レンズ、８６…2次元CCDカメラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば核酸の塩基配列決定方法等に用いられる核酸増幅方法、当該核酸増幅方法に使用する核酸増幅キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅方法は、増幅目的の核酸を鋳型としてDNAポリメラーゼの酵素活性により当該核酸を増幅することを基本的な原理としている。核酸増幅方法には、鋳型となる核酸又はプライマーをビーズや基板等の基材に固定化し、当該基材上にて核酸増幅反応を実行するタイプがある。
【０００３】
このような基材上にて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法は、一例として、ゲノムDNAやトランスクリプトームの配列決定に利用される塩基配列決定方法に利用される。特に、近年では、試料となるDNA断片を基板に数多く固定して、これら数多くのDNA断片の塩基配列をパラレルに決定する方法が開発されている。これにより、塩基解析速度は飛躍的に向上した。これらの技術では、解析対象となる核酸断片を核酸増幅反応により増幅することで、増幅された核酸断片が束（クラスタ）として基板上に配置される。したがって、基板に固定されたDNA断片の数に対応して、数多くの核酸断片の束が基板上に配置されることとなる。
【０００４】
例えば、非特許文献１では、基板上にプライマーを固定し、固定されたプライマーを用いて基板上でPCRを行うことで、基板上に増幅遺伝子断片のクラスタを形成している。また非特許文献２では、エマルジョンPCRを行い、所定の核酸断片を微粒子表面にて増幅・固定し、その後、微粒子を基板上に固定する。これにより、増幅した核酸断片の束（クラスタ）が平面上に複数配置されることとなる。
【０００５】
このように、基板上に配置された核酸断片の束（クラスタ）について、いわゆるシーケンス反応を行うことで、当該束（クラスタ）毎に塩基配列を決定する。そして、基板上に配置された数多くの束（クラスタ）を二次元画像センサにて測定し、画像解析により蛍光を読み取ることで束（クラスタ）毎に塩基配列を決定する。このように、基板に固定された多数の束（クラスタ）を平行して解析している。
【０００６】
このような塩基配列決定方法において、核酸断片の束（クラスタ）の形成は重要なステップである。すなわち、基板上に高密度で束（クラスタ）を配置することは、一度に画像センサから取得できる配列情報を増加させるため、ハイスループット化を達成できる。一方、１つの束（クラスタ）に含まれる核酸断片が多ければ多いほど、シーケンス反応における蛍光強度等の信号強度が向上することとなり、より信頼性の高い塩基配列分析及び検出系の簡素化を達成できる。
【０００７】
しかしながら、基板上の束（クラスタ）を高密度化することと、各束（クラスタ）に含まれる核酸断片を多数化することは、一般に相反する関係にある。すなわち、束（クラスタ）の密度を高めることは、クラスタ一つの占める面積を少なくすることであり、そこに含まれる核酸断片数が減少してしまう関係にある。よって、基板上の束（クラスタ）を高密度化し、且つ、各束（クラスタ）に含まれる核酸断片を多数化する技術が求められている。
【０００８】
換言すれば、基材上にて核酸増幅反応を行う核酸増幅方法において、核酸増幅反応により得られた、単位面積あたりの核酸断片数を高める手法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 20, e87
【非特許文献２】Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、基材上にて核酸増幅反応を行うに際して、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高めることができる核酸増幅方法及び当該核酸増幅方法に用いる核酸増幅キットを提供することを目的とする。また、本発明は、この核酸増幅方法を適用することで、一回の処理で読み取れる核酸断片の数を増加させることでハイスループット化を達成でき、且つSN比を向上させることで優れた信頼性を達成できる塩基配列決定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した目的を達成するため、本発明者らは、鋭意研究の結果、解析対象の核酸領域とアプタマー領域と含む環状核酸を鋳型とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行うことで、アプタマーが特異的に相互作用する物質を有する基材上において、増幅された核酸分子を立体的に集積させることができ、単位面積あたりの増幅対象の核酸領域の数を増加できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明に係る核酸増幅方法は、解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う工程を含んでいる。本発明に係る核酸増幅方法によれば、上記アプタマー領域に対応する核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子を、当該核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により上記基材に固定することができる。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅方法において、上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものを使用することができる。この場合、上記第２の物質と上記結合分子とが結合した状態で、上記ローリングサークル増幅反応が進行する。ここで、上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であってもよいし、異なる物質であっても良い。
【００１４】
また、本発明に係る核酸増幅方法において、上記プライマーとして上記結合分子を導入したものを使用し、上記基材として上記第２の物質を固定したものを使用する場合、先ず、上記環状核酸と上記プライマーとの複合体を形成し、その後、上記第２の物質と上記結合分子とを結合させることで当該複合体を上記基材上に捕捉させる。その後、上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応を実行することが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明に係る核酸増幅方法においては、上記第２の物質を所定の距離で離間して配置した基材を使用することが好ましい。このとき、上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するよう、上記基材上にランダムに配置されても良いし、上記基材上に規則的なパターンで配置されてもよい。
【００１６】
さらにまた、本発明に係る核酸増幅方法において、上記アプタマー領域は上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計されていてもよい。この場合、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により合成された核酸分子を鋳型とする2回目の核酸増幅反応により、上記核酸アプタマーを含む上記一本鎖核酸分子が合成されることとなる。
【００１７】
なお、上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用しても良いし、鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを使用しても良い。また、上記基材は平面基板又はビーズのいずれであってもよい。
【００１８】
ところで、本発明に係る核酸増幅キットは、解析対象の核酸領域を導入する部位と、核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸と、上記環状核酸に含まれる所定の領域にアニールできるプライマーと、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とを備えている。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅キットにおいて、上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものであることを好ましい。ここで上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であってもよいし、異なる物質であっても良い。
【００２０】
また、本発明に係る核酸増幅キットにおいて、上記基材は、上記第２の物質を離間して配置したものであることが好ましい。上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように、上記基材上にランダムに配置されも良いし、上記基材上に規則的なパターンで配置されてもよい。
【００２１】
さらに、本発明に係る核酸増幅キットにおいて、環状核酸に含まれるアプタマー領域は、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計されてもよい。
【００２２】
さらにまた、本発明に係る核酸増幅キットは、鎖置換活性を有するポリメラーゼ又は鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを更に備えていても良い。なお、本発明に係る核酸増幅キットにおいて上記基材は平面基板又はビーズのいずれであっても良い。
【００２３】
また、本発明では、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高めた特徴的な核酸構築物を提供できる。すなわち、本発明に係る核酸構築物は、核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子と、上記核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とから構成される。本発明に係る核酸構築物では、上記核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により、上記一本鎖核酸分子が上記基材に固定される。
【００２４】
また、本発明に係る核酸構築物において、上記基材上には、複数の上記一本鎖核酸分子が固定され、各一本鎖核酸分子はそれぞれクラスタを形成することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、基材上にて核酸増幅反応を行うに際して、増幅された核酸断片を立体的に集積させ、単位面積あたりの核酸断片数を高めることができる。また、本発明は、この核酸増幅方法を適用することで、一回の処理で読み取れる核酸断片の数を増加させることでハイスループット化を達成でき、且つSN比を向上させることで優れた信頼性を達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明を適用した核酸増幅方法の一実施形態を説明するための概略構成図である。
【図２】本発明を適用した核酸増幅方法の他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図３−１】本発明を適用した核酸増幅方法の更に他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図３−２】図３−１に示した核酸増幅方法に使用する基板を作製する方法の一例を説明する概略構成図である。
【図４】本発明を適用した核酸増幅方法の更に他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図５】本発明を適用した核酸増幅方法の更に他の実施形態を説明するための概略構成図である。
【図６】本発明を適用した核酸増幅方法を実施する増幅遺伝子クラスタ作成装置を説明するための概略構成図である。
【図７】本発明を適用した核酸増幅方法を適用して形成されたクラスタの分析を行う核酸分析装置を説明するための概略構成図である。
【図８】本発明を適用した核酸増幅方法を適用して形成されたクラスタの分析を行う核酸分析装置の他の例を説明するための概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る核酸増幅方法は、図１A〜Cに示すように、解析対象の核酸領域１とアプタマー領域２と含む環状核酸３を鋳型とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う方法である。核酸増幅方法では、アビジン様分子等といった特定の核酸アプタマーとの間で特異的に相互作用する第１の物質４を固定した基板５を使用する。
【００２８】
また、図１A〜Cに示した核酸増幅方法では、第１の物質４に対して相互作用する結合分子６を5'末端に有するプライマー７を使用している。なお、一例として、第１の物質４がアビジン様分子である場合、結合分子６はビオチン分子となる。この結合分子６を有するプライマー７を使用することによって、鎖置換型のローリングサークル増幅反応は基板５の表面で進行する。
【００２９】
また、鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、一例としては鎖置換活性を有するポリメラーゼ８により、プライマー７の3'末端から進行する。この増幅反応は、環状核酸３を鋳型とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応であるため、一本鎖の増幅核酸９を合成する。合成された一本鎖の増幅核酸９は、環状核酸３に対応して、解析対象の核酸領域１とアプタマー領域２と繰り返して含んでいる。合成された一本鎖核酸９は、複数のアプタマー領域２のうち少なくとも一部が基板５上に配置された第１の物質４と相互作用することで、立体的に集積されたクラスタ１０を形成する。
【００３０】
＜＜環状核酸３＞＞
ここで、環状核酸３について説明する。環状核酸３は、アプタマー領域２を含む母体となるベクターに、解析対象の核酸領域１を組み入れることで作製される。解析対象の核酸領域１としては、例えば、解析対象のゲノムDNAやトランスクリプトーム由来のcDNA等を断片化して得られる、例えば10〜1000bp、好ましくは50〜500bp、より好ましくは100〜250bpの長さにDNA断片とすることができる。DNA断片を母体となるベクターに挿入する手法は、特に限定されないが、例えば、DNA断片の両末端に所定の制限酵素の認識配列を有するアダプターを結合し、上記ベクターにおける同制限酵素認識部位に挿入する手法が挙げられる。
【００３１】
アプタマー領域２とは、二本鎖の環状核酸３における、核酸アプタマーと呼称されるポリヌクレオチドに相当する領域である。核酸アプタマーとは、所定の塩基配列を有することで特定の物質に対して特異的な親和性を有する一本鎖の核酸分子を意味する。なお、環状核酸３は二本鎖の核酸分子であるため、アプタマー領域２が上記の特定の物質と相互作用することはない。
【００３２】
核酸アプタマーとしては、例えば、下記の表１に示すものが知られている。なお、表１は、既知の核酸アプタマーの塩基配列と、当該核酸アプタマーが特異的に親和性を有する物質の種類とを対応付けて示している。
【００３３】
【表１】
【００３４】
また、核酸アプタマーとしては、例えば、Anal Chem. 2009 July 1; 81(13): 5490-5495やActa Biochim Biophys Sin (2009): 335-340に開示されたものを使用することもできる。
【００３５】
さらに、環状核酸３は、複数の核酸アプタマーに対応する複数の異なるアプタマー領域２を有する構成であってもよい。このとき、複数の核酸アプタマーは、上記表に示す核酸アプタマーから任意に選択することができる。なかでも、核酸アプタマーとしては、5'-TATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTAT-3'（配列番号４）、5'-CAAGAACTCCTAAGTATAATGTGAGGGATCCGAAATTCTGCTCTTATGTATGGCAAGATT-3'（配列番号３）、5'-GCGGGGTTGGGCGGGTGGGTTCGCTGGGCAGGGGGCGAGTG-3'（配列番号１１）、 5'-CCCAGCAGCACTGGTAGTGAGGCAGTTCACCGGTGGGGCGGTGAGTTTGGCTGCTATTTAT-3'（配列番号１９）、5'-GTACCAGCTTATTCAATTACAGATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTCCTGGACTTGGGACTAGATAGTATGTTCATCAG-3'（配列番号２１）を使用することが好ましい。核酸アプタマーとしてストレプトアビジンに対するアプタマー配列（5'-TATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTAT-3'（配列番号４）、5'-GTGATCGTCCAGCGACCGAGCAGGAAACTTATGTAACGACCCGAAATTCCTGCTTAGACT-3'（配列番号１））を使用した場合には、結合分子６としてビオチンを用いることで、基板５に固定する分子４をストレプトアビジン一種類で行うことができ、基板の製造が簡略化できるといった利点がある。また、核酸アプタマーとしてセルビオースに対するアプタマー配列（5'-GCGGGGTTGGGCGGGTGGGTTCGCTGGGCAGGGGGCGAGTG-3'（配列番号１１）など表１参照）やキチンに対するアプタマー配列（5'-CCCAGCAGCACTGGTAGTGAGGCAGTTCACCGGTGGGGCGGTGAGTTTGGCTGCTATTTAT-3'（配列番号１９））を使用した場合には、基板側に固定する分子が単純な糖類で良く、基板５の製造コストや保存性の点に優れるといった利点がある。また、セルビオースやコール酸などの低分子に対するアプタマー配列（それぞれ5'-GCGGGGTTGGGCGGGTGGGTTCGCTGGGCAGGGGGCGAGTG-3'（配列番号１１）、5'-GTACCAGCTTATTCAATTACAGATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTCCTGGACTTGGGACTAGATAGTATGTTCATCAG-3'（配列番号２１））を使用した場合、物質４の排除体積が小さいため基板５に物質４を高密度に固定することができ、結果アプタマー配列の結合を促進することが出来る。
【００３６】
さらにまた、環状核酸３は、プライマー７が特異的にアニールする領域を有している。すなわち、環状核酸３は、プラマー７全体の塩基配列又はプライマー７の3'末端側領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド領域を有している。ここで、プライマー７の3'末端側領域とは、プライマー７の3'末端の塩基を含む例えば5〜100bp、好ましくは10〜50bp、より好ましくは15〜30bpの領域である。この範囲であれば、プライマー７が環状核酸３に対して特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３７】
＜＜基板＞＞
次に、基板５について説明する。基板５は、例えば、ガラス基板，サファイア基板，シリコン基板などの無機物質からなる基板、ステンレスなどの金属からなる基板、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリカーボネート樹脂、シクロオレフィン樹脂、ポリスチレン樹脂などの有機物質からなる基板を用いることができる。また、基板５は、単一の材料からなるものに限定されず、異なる材質の板状部材を貼り合わせたものや、各種の表面処理が施されたものであっても良い。また、図示した基板５は平板状を呈しているが、基板５の形状は特に限定されない。例えば、詳細を後述するが、所定の塩基配列決定装置に使用されるフローセルの一主面を基板５としても良い。
【００３８】
基板５に配置されている第１の物質４は、上述した環状核酸３のアプタマー領域２が特異的に相互作用する物質である。すなわち、第１の物質４としては、上記表１に示した各種の物質を使用することができる。
【００３９】
また、基板５と第１の物質４との間の結合は、特に限定されず、共有結合、静電相互作用、疎水相互作用などの如何なる結合でもよい。結合は、用いる基板５の材質と固定する第１の物質４に応じて適切なものを選択することができる。特に、基板５と第１の物質４との間の結合は安定性の観点から、共有結合とすることが望ましい。一例として、第１の物質４としてストレプトアビジンを使用し、基板５としてポリスチレン樹脂を使用する場合には以下のような手順に従って、ストレプトアビジンをポリスチレン樹脂からなる基板５の表面に固定することができる。すなわち、先ず、ポリスチレン樹脂からなる基板５の表面をVUV処理によって酸化させカルボキシル基を導入する。次に、このカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）で活性化させる。次いで、この表面にストレプトアビジン溶液を接触させることで、ストレプトアビジン中のアミノ基とカルボキシル基との間でエステル結合を形成させる。これにより、ポリスチレン樹脂からなる基板５の表面にストレプトアビジンを共有結合により固定することができる。
【００４０】
一方、基板５は、その表面にて核酸増幅反応を進行させるため、当該反応に使用するプライマー７を固定する手段を有している。図１に示した例では、第１の物質４がアプタマー領域２と相互作用する役割と、プライマー７を固定する手段としての役割を兼ねている。詳細には、プライマー７の5'末端には、第１の物質４に対して相互作用する結合分子６が結合している。例えば、第１の物質４がアビジン様分子である場合、結合分子６としてビオチン分子を使用することによって、プライマー７を基板５の表面に結合できる。
【００４１】
なお、アビジン様分子としては、ビオチンに対する結合能を有するものであれば良く、その分子種まで限定されず、一般的に使用されている如何なる分子を使用しても良い。アビジン様分子としては、例えば、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、アビジンなどを用いることができる。
【００４２】
なお、プライマー７を固定する手段としては、第１の物質４に限定されず、プライマー７における5'末端側の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。すなわち、このオリゴヌクレオチドを基板５の表面に導入しておき、プライマー７の5'末端側をオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることで、プライマー７を基板５の表面に固定することもできる。
【００４３】
また、プライマー７を固定する手段としては、一定以上の親和性を有する分子種の組み合わせであれば如何なる手段を採用しても良い。例えば、プライマー７を固定する手段としては抗体を使用することができる。すなわち、基板５の表面に抗体を固定し、抗原性を有する物質を結合させたプライマー７又は抗体に対する核酸アプタマーを有するプライマー７を使用する。このようにすれば、プライマー７は、抗原抗体反応又は核酸アプタマーと抗体との相互作用により基板５の表面に固定することができる。ビオチンとアビジン様分子との組み合わせ以外の他の選択肢を利用することで、サンプル調整等の増幅反応以外の工程に、ビオチンやアビジン様分子の特異的結合を利用することができる。
【００４４】
＜＜核酸増幅反応＞＞
次に、上述した環状核酸３及び基板５を用いた核酸増幅反応工程について説明する。核酸増幅反応は、DNAポリメラーゼを用いた鎖置換型の反応である。鎖置換型の核酸合成反応は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを用いても良いし、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼとヘリカーゼ（例えば、T7ヘリカーゼ）とを組み合わせて用いてもよい。より具体的に、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼとしては、例えばphi29ポリメラーゼを用いることができる。鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼとしては、その他にBstポリメラーゼ、Csaポリメラーゼ、96-7ポリメラーゼ等が挙げられる。これらのポリメラーゼは、各々、反応至適温度・条件が異なっており、ハイブリダイゼーションさせるプライマー７のTm値・アプタマー領域２と第１の物質４との結合条件に応じて、適宜選択することができる。
【００４５】
また、核酸増幅反応は、上述したDNAポリメラーゼの他に、Tris・HCl（pH 8.8）、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine、dNTPs等といった核酸増幅反応に通常使用される各種物質を適切な濃度に調整した反応溶液にて実行する。本核酸増幅反応は、ローリングサークル増幅反応（RCA反応）で行うため、増幅のエラー（誤った塩基の取り込み）の蓄積がない。PCRのような増幅された遺伝子断片を更に鋳型とする増幅反応では、反応の初期にエラーが発生すると、以後その断片を鋳型とした増幅産物にもエラーが引き継がれ、エラーが蓄積する現象が知られている。これに対して、RCA反応では、増幅産物を鋳型としないため原理的にエラーの蓄積が生じ得ない。よって、合成された一本鎖の増幅核酸９は、正確な塩基配列を主とするクラスタ１０を構成することとなる。なお、RCA反応においても、一定の確率でエラーが起こってしまうが、その出現はランダムでありクラスタ１０全体としては、正しい配列情報を出力する。なお、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼのうち、特にphi29ポリメラーゼは増幅時にエラーを起こす確立が低いことが知られており、このポリメラーゼを用いることでより正確な情報を有したクラスタ１０を形成することができる。
【００４６】
さらに、核酸増幅反応に鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼとヘリカーゼとを組み合わせて用いた場合、DNAポリメラーゼとヘリカーゼとを任意の比率で反応させることができる。DNAやトランスポリメラーゼに対して過剰量のヘリカーゼを加えることで、解析対象の塩基配列のGC含量や高次構造に由来するクラスタ間の増幅倍率の差を平準化し、バイアスを軽減できる可能性がある。
【００４７】
さて、上述した環状核酸３及び基板５を用いた核酸増幅反応では、先ず、第１の物質４を有する基板５に対して、プライマー７をアニールさせた環状核酸３を結合させる。すなわち、環状核酸３とプライマー７とを所定の条件下で溶液中に共存させることにより、環状核酸３の所定の領域にプライマー７がハイブリダイズする。このように形成されたプライマー-環状核酸複合体１１を含む溶液を基板５に接触させると、プライマー７の結合分子６と第１の物質４とが結合し、プライマー-環状核酸複合体１１が基板５の表面に結合する。
【００４８】
次に、基板５の表面に、上述した鎖置換型のRCA反応に必要なDNAポリメラーゼ及び反応試薬を作用させ、適切な反応条件に晒す。これにより環状核酸３を鋳型としてRCA反応が起こり、一本鎖の増幅核酸９が合成される。この一本鎖の増幅核酸９は、解析対象となる核酸領域１１とアプタマー領域２を繰り返し持つコンカテマー構造を示す。このとき、一本鎖の増幅核酸９に繰り返して存在する複数のアプタマー領域２が基板５上の第１の物質４との間に相互作用を形成する。これにより、一本鎖の増幅核酸９は、基板５の平面方向及び/又は垂直方向に広がらず、基板５の表面の所定の範囲に集積されることとなる。すなわち、上述した核酸増幅反応によれば、解析対象の核酸領域１を含む一本鎖の増幅核酸９が立体的に集積されたクラスタ１０を形成することができる。
【００４９】
このように、核酸増幅反応により合成された一本鎖の増幅核酸９が基板５条に集積した形を取るため、単位面積当たりに存在する解析対象の核酸領域１の数を高めることができる。したがって、このクラスタ１０を対象としたシーケンス反応では、高い信号強度を得ることができるし、より数多くのクラスタ１０を形成することでスループットを向上させることができる。これによって、塩基配列の精度の向上及び効率化を達成することができる。
【００５０】
また、クラスタ１０を構成する増幅核酸９は一本鎖であり、これに続くシーケンス反応時にプライマーがハイブリダイゼーションしやすく、シーケンス反応の効率が良い。例えば、illumina社のbridge PCR（Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732）方式では、固体表面に相補鎖も存在することになりシーケンス反応時にプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる一因となる。また特に、ハイブリダイゼーションを繰り返し行いシーケンスを決定するsequence by ligation（Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 20, e87）方式において、高いハイブリダイゼーション効率は非常に優れたメリットになる。したがって、上述した核酸増幅反応により形成したクラスタ１０をこれら公知のシーケンス反応に応用することで、シーケンス反応の効率を改善することができ、配列情報の信号強度を高めることができる。
【００５１】
仮に、アプタマー領域２を有しない環状核酸を用いてRCA反応を行った場合、合成された一本鎖DNAは、非常に長い分子量で空間的にも広がった構造となる。これに対して本例では、RCAの鋳型となる環状DNAにアプタマー配列を組み込むことで、反応によって生じる一本鎖の増幅核酸９にアプタマー領域２を出現させ、このアプタマー領域２と基板上の第１の物質４との相互作用で、一本鎖の増幅核酸９の空間的な広がりを抑制し、解析対象の核酸領域１の高密度化を達成している。また、空間的な広がりを抑えることで、一般的なRCA産物で起こる液の粘性上昇や、一本鎖DNAへの物理的な力によるせん断を防いでいる。粘度の上昇は、物質供給を妨げ、シーケンス反応の効率を低下させる。せん断による一本鎖DNAの切断は、クラスタ中の遺伝子断片数を低下させシーケンス反応時の信号強度を低下させる。本方法より合成された一本鎖の増幅核酸９は、アプタマー領域２とそれに対応した第１の物質４とを用いることにより、この点を回避している。
【００５２】
なお、アプタマー領域２とそれに対応した第１の物質４との組み合わせは、上記表１に示すように数多く知られており、特に限定されることなく如何なる組み合わせを適用しても良い。特に、ポリメラーゼ反応を行う条件においては、アプタマー領域２と第１の物質４が相互作用せず、ポリメラーゼ反応を行う条件とは異なる条件（塩濃度条件や温度条件など）とすることで初めて相互作用するような組み合わせであっても良い。一方、アプタマー領域２と第１の物質４との組み合わせは、ポリメラーゼ反応を行う条件で相互作用するような組み合わせであっても良い。
【００５３】
なお、コンカテマー構造の形状を制御することで、RCA反応後の液の粘度上昇とDNA鎖の切断を防ぐ既知の手法としては、DNA nanoball（nature biotechnology volume 28, 43-44）が知られている。このDNA nanoball技術を本発明に更に適用することもできる。すなわち、合成された一本鎖の増幅核酸９がDNA nanoballを形成するように環状核酸３の塩基配列を設計しても良い。詳細には、環状核酸３の母体となるベクターにおいて、アプタマー領域２以外の領域に、互いに相補的な塩基配列を有する少なくとも一対の領域を設計しておく。これら一対の領域は、一本鎖の増幅核酸９として合成されたときにハイブリダズできる。これにより、一本鎖の増幅核酸は、DNA nanoball様の高次構造を形成することができる。
【００５４】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００５５】
本実施形態は、図２A〜Ｄに示すように、一本鎖の増幅核酸９に含まれるアプタマー領域２が結合する第１の物質４と、第１の物質４とは異なる物質であってプライマー７の結合分子６と結合する第２の物質２０とを有する基板２１を使用している。上述した実施形態では、第１の物質４が一本鎖の増幅核酸９に含まれるアプタマー領域２と結合するとともに、プライマー７の結合分子６と結合する役割を担っていた。本実施形態では、これら二種類の結合をそれぞれ異なる物質を用いることに特徴がある。
【００５６】
本実施形態において、第２の物質２０としては、第１の物質４とは異なる物質であって、結合分子６に特異的に結合する能力を有する物質を使用することができる。すなわち、第２の物質２０としては、結合分子６との組み合わせを考慮して適宜選択することができる。第２の物質２０としては、様々な分子を用いることが可能であり、例えば、上述した実施形態と同様にアビジン様分子も用いることができる。この場合、結合分子６はビオチン分子となる。ただし、この場合、第１の物質４としてはアビジン様分子以外の物質を使用し、アプタマー領域２としては当該アビジン様分子以外の物質に特異的に結合するオリゴヌクレオを選択する。このようなアビジン様分子以外の物質と当該物質に特異的に結合するオリゴヌクレオとの組み合わせは、上述した実施形態における表１のリストから適宜選択することができる。
【００５７】
本実施形態においては、上述した実施形態と同様の手順及び試薬類によって、鎖置換型のローリングサークル増幅反応による核酸増幅反応を実施できる。すなわち、第１の物質４及び第２の物質２０を有する基板２１に、プライマー７をアニールさせた環状核酸３を結合させる。すなわち、プライマー-環状核酸複合体１１を含む溶液を基板２１に所定の条件下で接触させる。これにより、プライマー７の結合分子６が基板２１条の第２の物質４と結合し、プライマー-環状核酸複合体１１が基板２１上に固定される。この状態で、上述した実施形態と同様に、鎖置換型のローリングサークル増幅反応による核酸増幅反応を進行させる。核酸増幅反応により、一本鎖の増幅核酸９が合成される。合成された一本鎖の増幅核酸９は、その内部に含まれるアプタマー領域２が基板２１上の第１の物質４と結合することによって、基板２１上に立体的に集積したクラスタ１０を形成する。
【００５８】
以上の説明から理解できるように、本実施形態では、プライマー-環状核酸複合体１１を補足する第２の物質２０とアプタマー領域２と結合する第１の物資４とを異なる物質としたため、クラスタ１０間の距離を調節することが可能になる。すなわち、隣り合うクラスタ１０間の距離は、基板２１上に配置された隣り合う第２の物質２０間の距離２２に依存する。よって、第１の物質４及び第２の物質２０を有する基板２１を作製する際に、隣り合う第２の物質２０を離間させれば隣り合うクラスタ１０間の距離を大とすることができ、逆に、隣り合う第２の物質２０を近接させれば隣り合うクラスタ１０間の距離を小とすることができる。
【００５９】
例えば、第１の物質４及び第２の物質２０を共にタンパク質とした場合、上述した実施形態と同様に、これら第１の物質４及び第２の物質２０を基板２１の表面に導入することができる。このとき、第１の物質４及び第２の物質２０を含有する溶液における両者の比率を調整することで、隣り合う第２の物質２０の距離２２を調整することができる。詳細には、溶液中の第２の物質２０の比率を上げれば、隣り合う第２の物質２０の距離２２を小とすることができ、逆に溶液中の第２の物質２０の比率を下げれば、隣り合う第２の物質２０の距離２２を大とすることができる。
【００６０】
なお、隣り合う第２の物質２０間の距離２２は、光学的な分離が可能な距離が望ましい。より具体的にはシーケンス反応の観測波長をλとし、開口数NAの対物レンズを用いた工学検出系を使用した場合において、距離２２はレイリーの定義〔（0.61xλ）/NA〕以上の距離であることが好ましく、数値としては200nm以上、より好ましくは400nm以上、更により好ましくは500nm以上とする。ただし、隣り合う第２の物質２０間の距離２２は、固定反応がランダムに起こるため確率的な分布を持っており、平均として光学的な分離が容易であれば良く、必ずしもすべての分子間距離がこの数字に従う必要はない。
【００６１】
以上のように、核酸増幅反応においてプライマー-環状核酸複合体１１を所望の距離で配置できるため、プライマー-環状核酸複合体１１の量が大過剰に与えられた場合であっても、核酸増幅反応で形成されるクラスタ１０間の距離を所望の距離とすることができる。一般に、基板上にて核酸増幅反応を進行させてクラスタを形成する場合、鋳型DNA分子を多量に加え過ぎてしまうと、クラスタ間の距離が密になりすぎて光学上クラスタの分離が不能になる「ホワイトアウト」という現象が知られている。ホワイトアウトを防ぐためには、従来、適当な濃度になるよう鋳型DNAを希釈し、基板上での核酸増幅反応を行っている。しかしながら、鋳型DNAの定量の精度などの問題から、必ずしも成功するわけではない。また、ホワイトアウトをより確実に防ぐため、クラスタ間の距離を十分に離そうとすると、必要以上にクラスタ密度が低下することとなり、スループット面での十分なパフォーマンスを発揮することができない。これに対して、本実施形態では、第２の物質２０の固定密度を制御することで、クラスタ１０の密度を所望に制御することができる。よって、本実施形態によれば、大過剰のプライマー-環状核酸複合体１１を加えても、ホワイトアウト現象は起こりにくい。本実施形態では、従来のようにホワイトアウトを警戒して低濃度のサンプルを用いる必要がないため、実用上のスループットを確保することができる。また、サンプルの濃度に対する高精度に調整する手間を省くことができユーザーへの実験上の利便性を高める。このように、本実施形態によれば、例えば、検出する光学系に併せて隣り合うクラスタ１０の距離を制御できるため、この「ホワイトアウト」を確実に防止できる。
【００６２】
また、一般に、基板上にて核酸増幅反応を進行させてクラスタを形成する場合、一般に増幅対象の塩基配列CG含量など依存してクラスタのサイズが大きく異なる。例えば、成長の遅いクラスタが成長の早いクラスタに隣り合うと、成長の遅いクラスタ由来の信号が検出しにくい傾向がある。しかしながら、本実施形態によれば、隣り合うクラスタ１０の距離を第２の物質２０間の距離２２で調整できるため、このような現象を起こりにくくできる。これによりシーケンスデータにおけるCGバイアスを低減できる。
【００６３】
なお、隣り合うクラスタ１０間の距離を離すためには、第２の物質２０の結合箇所は一価であることが望ましく、アビジン様分子であれば複合体を形成しない変異体を用いることが好ましい。
【００６４】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の更に他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００６５】
本実施形態は、図３A〜Ｂに示すように、第２の物質２０を規則的なパターンで配置した基板３０を使用している。第２の物質２０を規則的なパターンで配置するには、例えば、いわゆるマイクロコンタクトプリンティング工法を用いて実現することができる。一般に、マイクロコンタクトプリンティング工法で調製可能なスポットサイズは50nm程度であり、一箇所のスポットにおいて一分子の第２の物質２０を配置することは困難である。すなわち、マイクロコンタクトプリンティング工法で第２の物質２０を配置した場合、一箇所のスポットに複数の第２の物質２０が固定される可能性がある。この場合、過剰のプライマー-環状核酸複合体１１を加えると、一箇所のスポットに複数のプライマー-環状核酸複合体１１が固定され、その結果、核酸増幅反応により一箇所のスポットに複数のクラスタ１０が形成される虞がある。この場合、上述した「ホワイトアウト」の問題が生じる虞もある。
【００６６】
この場合、プライマー-環状核酸複合体１１の形状を大きくすることで、一箇所のスポットに対して１分子のプライマー-環状核酸複合体１１しか固定できないように調整することが好ましい。プライマー-環状核酸複合体１１の形状は、１分子のプライマー-環状核酸複合体１１が一箇所のスポットを占有しうる形状であれば特に限定されない。例えば、プライマー-環状核酸複合体１１の直径をスポットの直径の1/2以上、好ましくは3/5以上、より好ましくは2/3以上とすることで、１分子のプライマー-環状核酸複合体１１が一箇所のスポットを占有できる。ここで、プライマー-環状核酸複合体１１の直径とは、プライマー-環状核酸複合体１１が第２の物質２０に固定された状態で、基板２１の表面を垂直方向から観察したときの、プライマー-環状核酸複合体１１の直径を意味する。
【００６７】
プライマー-環状核酸複合体１１のサイズは、環状核酸３の大きさ（塩基長）の調整や、DNA nanoball（nature biotechnology volume 28, 43-44）構造により制御することができる。
【００６８】
マイクロコンタクトプリント工法を用いた基板３０の製造には、二通りの方法がある。すなわち、図３−２Ａに示すように、凸型のナノピラー構造３１を有するスタンパ３２を利用する方法と、図３−２Ｂに示すように、ナノホール構造３３を有するスタンパ３４を利用する方法である。
【００６９】
スタンパ３２を利用する方法では、先ず、第２の物質２０を凸型のナノピラー構造３１の表面に固定する。次にスタンパ３２を基板３０の一主面に押し付け、凸型のナノピラー構造３１の表面に固定された第２の物質２０を基板３０の一主面に転写する。次に、基板３０の一主面に、上述した実施形態と同様にして、第１の物質４を固定する。
【００７０】
スタンパ３４を利用する方法では、先ず、スタンパ３４の一主面におけるナノホール構造３３以外の面に第１の物質４を固定する。次にスタンパ３４を基板３０の一主面に押し付け、ナノホール構造３３以外の面に固定された第１の物質４を基板３０の一主面に転写する。次に、基板３０の一主面に、上述した実施形態と同様にして、第２の物質２０を固定する。
【００７１】
以上のように、規則的に配置された凸型のナノピラー構造３１或いはナノホール構造３３に応じて、第２の物質２０を基板３０上に規則的に配置することができる。特にナノピラー構造３３を有するスタンパ３４を利用した場合には、凸型のナノピラー構造３１を有するスタンパ３２を利用した場合と比較して、基板３０への押し付けの際の圧力を分散できる面積が広いため、適正な転写圧力の許容範囲が広く、基板作製の歩留まりに優れるため好ましい。
【００７２】
このように作製された基板３０を利用することによって、核酸増幅反応により形成されたクラスタ１０は、第２の物質２０の配置に従って出現することになる。この第２の物質２０の固定間隔３５を制御することで、クラスタ１０間の距離を調節できる。本実施形態によれば、クラスタ１０は特定の位置に一定間隔の距離をおいて存在することになるため、画像情報からの輝点検出が容易となる。またクラスタ１０間の距離を光学的に分離容易な距離にすることで、厳密な焦点調整を行わなくともシーケンス情報の取得が可能となる。これらは画像データの取得時間・処理時間を短縮と、それによるシーケンサーのスループットの向上をもたらす。
【００７３】
一般に、隣接してしまったクラスタからの輝点分離には、正確な焦点で境界判別を行う必要がある。境界が不鮮明な画像からではクラスタの分離が困難であり高い計算コスト必要とし、不鮮明な焦点画像では隣接クラスタ間で光のクロストークが生じデータの信頼性も低下しやすいからである。本実施形態のように、クラスタ１０間の距離が予め定まっている場合には、焦点調節に係る工数を削減することができ、画像取得・画像処理にかかる時間が短縮できるため、スループットの向上に貢献できる。
【００７４】
なお、第２の物質２０の固定間隔３５は、上述した実施形態における距離２２と同様に規定することができる。すなわち、第２の物質２０の固定間隔３５は光学的な分離が可能な距離以上とすることが好ましい。より具体的にはシーケンス反応の観測波長をλとし、開口数NAの対物レンズを用いた工学検出系を使用した場合において、固定間隔３５はレイリーの定義〔（0.61xλ）/NA〕以上の距離であることが好ましく、数値としては200nm以上、より好ましくは400nm以上、更により好ましくは500nm以上とする。
【００７５】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の更に他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００７６】
本実施形態は、図４A〜Ｂに示すように、所定の塩基配列からなる核酸アプタマーについて相補鎖が読み取られるアプタマー領域４０を有する環状核酸４１を使用している。環状核酸４１は、アプタマー領域４０が所定の核酸アプタマーの逆鎖を読み取るように構成した以外は、上述した実施形態における環状核酸３と同じ構成である。
【００７７】
本実施形態では、環状核酸４１を鋳型として鎖置換型のRCA反応により合成された一本鎖の増幅核酸４２が核酸アプタマーの相補鎖を有するようにする。ここで、核酸アプタマーは、所定の塩基配列からなる一本鎖核酸の状態で機能するが、相補鎖では機能しない。すなわち、RCA反応により合成された一本鎖の増幅核酸４２は、核酸アプタマーとして機能する領域が存在せず、第１の物質４に結合することはできない。
【００７８】
本実施形態では、鎖置換型のRCA反応により合成された一本鎖の増幅核酸４２を鋳型として、更に鎖置換型の核酸増幅反応を実施する（以下、2回目の核酸増幅反応）。この2回目の核酸増幅反応は、一本鎖の増幅核酸４２の一部の領域にハイブリダイズするプライマー４３を使用する。一本鎖の増幅核酸４２は、鎖置換型のRCA反応により合成されたものであるためプライマー４３がアニールする箇所を複数有している。なお、2回目の核酸増幅反応で使用するプライマー４３は、鎖置換型のRCA反応おいて使用したプライマー７の相補鎖とすることもできる。
【００７９】
上述した他の実施形態と同様に、鎖置換型のRCA反応を行った後、2回目の核酸増幅反応は、一本鎖の増幅核酸４２を鋳型とするため、RCA反応ではなく通常の鎖置換型の核酸増幅反応となる。このとき、一本鎖の増幅核酸４２には、プライマー４３がアニールする箇所を複数有しているため、増幅された核酸断片４４は級数的に増幅することとなる。そして、核酸断片４４は、核酸アプタマーとなる領域４５を含む一本鎖核酸となる。このように一本鎖核酸である核酸断片４４群は、基板５上に配置された第１の物質４と結合して、上述した実施形態と同様に立体的に集積された形状を呈することとなる。
【００８０】
以上のように、本実施形態によれば、反応を二段階に分け一回目のプライマーと逆方向のプライマーを用いた2回目の核酸増幅反応を実施することにより、増幅効率が増し、短時間の処理でシーケンス反応の検出に必要な数の解析対象の核酸領域１を得ることができる。この核酸断片４４はほとんどが一本鎖で構成されておりシーケンス反応の鋳型として適する。また核酸アプタマーとして機能する領域４５を繰り返し持つため、上述した実施形態と同様に立体的に集積された形状を呈することとなる。
【００８１】
＜＜他の実施形態＞＞
次に、本発明の更に他の実施形態について説明する。以下の説明において、上述した実施形態と同一の構成・部材については同一の名称及び符号を付すことによって、その詳細な説明は省略する。
【００８２】
本実施形態は、図５A〜Cに示すように、上述した実施形態における基板５や基板２１に代えてビーズ５０（曲面）を使用している。すなわち、本発明は、平板状の基板５、２１のみならず曲面状のビーズ５０といった如何なる基材を使用しても実施可能である。
【００８３】
図５Aに示すように、ビーズ５０上にプライマー-環状核酸複合体１１を固定し、環状核酸３を鋳型として鎖置換型のRCA反応を実行すると、上述した実施形態と同様に、一本鎖の増幅核酸９が合成される、合成された一本鎖の増幅核酸９は、アプタマー領域２が第１の物質４に結合することによって、ビーズ表面から放射状に散在するのではなく、ビーズ表面を覆うように存在する。すなわち、本実施形態では、一本鎖の増幅核酸９により覆われた核酸被覆ビーズ５１が形成される。この核酸被覆ビーズ５１は、表面に核酸を有しない裸ビーズ５２とは電気的性質が大きく異なっている。すなわち、核酸被覆ビーズ５１はマイナス電荷を帯びており、裸ビーズ５２はプラス電荷を帯びている。したがって、核酸増幅反応の終了後、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２が混在する溶液に電場を与えることで、図５Bに示すように、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２を容易に分離して回収することができる。
【００８４】
また核酸被覆ビーズ５１は、多量のリン酸基を有しているため、たとえばジルコニアなどで被覆した基板５３に結合することができる。よって、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２が混在する溶液をジルコニアなどで被覆した基板５３に接触させることで、図５Cに示すように、核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２を容易に分離して回収することができる。なお、基板５３上に分離された核酸被覆ビーズ５１は、そのままシーケンス反応に供することができる。
【００８５】
一般的なビーズ上での遺伝子増幅反応は所謂エマルジョンPCRである。エマルジョンPCRでは、5’末端をビーズに固定したDNA断片をプライマーとして用いているため、遺伝子増幅反応の有無にかかわらず、一定量のDNA分子を最初からビーズ上に有している。このような状態では、図５Bや図５Cに示したような原理に基づいて、合成反応の起こったビーズと起こっていないビーズとを分離することは非常に困難である。これに対して、本実施形態によれば、図５Bや図５Cに示したような原理に基づいて核酸被覆ビーズ５１及び裸ビーズ５２を容易に分離しでき、ユーザーがサンプル処理にかける時間を短縮することができる。
【００８６】
なお、本実施形態では、一般的なエマルジョンPCRと同じく、W/Oエマルジョンを微小反応場として用いて核酸増幅反応を実施しても良いが、エマルジョンを作製することなくビーズ上に遺伝子断片のクラスタ１０を形成することができる。
【００８７】
一般に、エマルジョンPCRにより、増幅断片を有するビーズを調製するには、ビーズに結合したプライマー、増幅対象となる遺伝子断片、ビーズに結合したプライマーとは逆向きのプライマーを用いて、W/Oエマルジョンを微小反応場としてPCRを行う。この時、PCRによって生じた核酸断片は二本鎖のうち一方のみが、ビーズと共有結合で結ばれている。一方、その相補鎖はビーズと直接結合しておらず、温度サイクルをかけることで引き剥がされ溶液中に遊離し、次のPCRの鋳型となる。この遊離した相補鎖が別のビーズ上で増幅しないよう、反応場を隔離する必要があり、エマルジョンによって空間的に閉じた反応容器内でPCRを行っている。この手法は、エマルジョンの作製や破壊を行わなくてはならず作業上煩雑である。また反応容器がエマルジョン中の水滴という非常に限られた空間であるため、核酸合成反応の基質・酵素の追加供給や合成によって生じた副反応物の除去を行うことができない。
【００８８】
このようなエマルジョンPCRの諸問題に対して、本実施形態によれば、ビーズ５０に対してプライマー-環状核酸複合体１１を固定しているため、合成された一本鎖の増幅核酸９はビーズ表面から解離していない。よって、基本的には、増幅核酸９の分散は起こりにくく、増幅核酸９が繰り返し持つアプタマー領域２によってビーズ５０に逐次絡めとられるため、空間的に広がりにくい。よって、一つのビーズ上で合成されたクラスタ１０は、他のビーズ５０に影響を及ぼさない。
【００８９】
＜＜増幅遺伝子クラスタ作成装置＞＞
次に、以上で説明した本発明に係る核酸増幅方法を実行する増幅遺伝子クラスタ作成装置を説明する。増幅遺伝子クラスタ作成装置は、例えば図６に示すように、増幅したクラスタ１０を形成する支持体６０に、予め流路６１を設けた反応チャンバー６２を張り合わせ、フローセル６３を備える。反応チャンバー６２は、少なくとも、クラスタ１０を形成する部分の部材が光透過性の材質から形成されていることが好ましい。反応チャンバー６２は、例えば、流路６１となる溝を予め掘ったPDMS（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体を用いる。
【００９０】
また、増幅遺伝子クラスタ作成装置は、具体的に、核酸試料、反応酵素、バッファー、ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット６４、反応液を送り出す分注ユニット６５、液の流れを制御するバルブ６６，廃液タンク６７から構成される。このように構成された増幅遺伝子クラスタ作成装置は、温調ユニット６４における温調機を通じたフローセル６３部分の温度制御と、反応基板（流路６１）への溶液交換によって、上述した各種実施形態に示した核酸増幅反応を制御し、その結果、所望のクラスタ１０を形成する。なお、反応終了時には、洗浄液が流路６１を通じて供給され、廃液タンク６７に収納される。
【００９１】
＜＜核酸分析装置＞＞
次に、本発明を適用した核酸分析装置について説明する。核酸分析装置は、図７に示すように、反応デバイス７０（反応部）に対して、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プライマー及び核酸試料からなる1種類以上の生体分子を供給する手段と、前記反応デバイス７０に光を照射する手段と、前記反応デバイス７０上の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。
【００９２】
具体的に、反応デバイス７０は、カバープレート７１と検出窓７２と溶液交換用口である注入口７３と排出口７４とから構成される反応チャンバーに設置される。なお、カバープレート７１と検出窓７２の材質としては、光透過性を有するPDMS（Polydimethylsiloxane）を使用する。核酸分析装置は、図示しないが、上述した核酸増幅方法の実施形態で説明した手順にて核酸増幅反応が進行するように、鎖置換型のRCA反応を行う酵素、環状核酸３、プライマー７、酵素の基質となるヌクレオチド並びに蛍光色素を有するヌクレオチドを順次、注入口７３を介して反応デバイス７０に供給する分注ユニットを有している。
【００９３】
また、核酸分析装置は、前記反応デバイス７０に光を照射する手段として、YAGレーザ光源（波長532ｎｍ，出力20ｍＷ）７６及びYAGレーザ光源（波長355ｎｍ，出力20ｍＷ）７７と、これらYAGレーザ光源７６及び７７から出射したレーザ光７８及び７９の光軸上に配置されたダイクロイックミラー８０（410ｎｍ以下を反射）と、同光軸上に配置された集光レンズ８１と、プリズム８２とを備えている。
【００９４】
さらに、核酸分析装置は、前記反応デバイス７０上の蛍光を測定する蛍光検出手段として、検出窓７２に対応する位置に配設される対物レンズ８３と、対物レンズ８３により平行光束とされた光軸上に配設された光学フィルタ８４と、同光軸上に配設された結像レンズ８５と、2次元CCDカメラ８６とを備えている。
【００９５】
以上のように構成された核酸分析装置は、上述したように核酸増幅反応が反応デバイス７０にて進行し、蛍光色素を取り込んだクラスタ１０が反応デバイス７０の基板表面に固定される。そして、YAGレーザ光源７６及びYAGレーザ光源７７から発振するレーザ光７８及び７９をダイクロイックミラー８０により同軸になるよう調整した後、レンズ８１によって集光し、その後、プリズム８２を介して反応デバイス７０へ臨界角以上で照射する。そして、検出窓７２より出射される蛍光は、対物レンズ８３により平行光束とされ、光学フィルタ８４により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ８５により2次元CCDカメラ８６上に結像される。
【００９６】
このように核酸分析装置によれば、本発明に係る核酸増幅方法を適用して基材上に形成された増幅核酸９のクラスタ１０を検出することができる。このとき、本発明に係る核酸増幅方法によれば、クラスタ１０を高密度化することができるとともに、各クラスタ１０に含まれる核酸量を多くすることができる。よって、2次元CCDカメラ８６を使用することで、より多くのクラスタ１０を高感度に撮像することができる。
【００９７】
なお、本発明に係る核酸増幅方法は、図７に示した核酸分析装置に限定されず、図８に示した核酸分析装置にも適用することができる。図８に示す核酸分析装置は、温調ユニット８７と光ファイバー８８を有する以外は、図７に示した核酸分析装置と同様に構成されている。
【００９８】
ところで、本発明に係る核酸増幅方法により、一般鎖の増幅核酸９からなるクラスタ１０を形成した後、このクラスタ１０を用いて解析対象の核酸領域１の塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定原理は、特に限定されないが、例えば、Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732に開示された手法を採用することができる。すなわち、
(1)アンカープライマーのハイブリダイゼーション
(2)蛍光プライマーのライゲーション、
(3)蛍光検出
(4)アンカープライマーと蛍光プライマーの除去
(5)上記(1)〜(4)の繰り返し
を行い、解析対象の核酸領域１の塩基配列を決定することができる。
【００９９】
また、塩基配列の決定方法としては、上記ライゲーションによる方法以外に逐次反応方式を用いることができる。蛍光色素付きヌクレオチドとして、Acta Biochim Biophys Sin (2009): 335-340に開示されているような、リボースの3′OHの位置に3′-O-アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの5位の位置にあるいはプリンの7位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応方式でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【０１００】
さらに、本実施形態では、P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。図７及び８に示すような核酸分析装置を使用することで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化、反応デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０２】
〔実施例１〕
＜材料＞
アプタマー配列として、ストレプトアビジンに対して親和性が報告されている配列（5'-TATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTAT-3'（配列番号４））を用いた。この配列を含む核酸試料（5'-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTATAACGCCCGTGTTGCTCGGTTATCAAAAGTGCACGCTACTTTG-3'（配列番号２２））を合成し、二種類のプライマー（5'-ATCATTGGATCCTAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3'（配列番号２３）、5'-ATCCATAAGCTTTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'（配列番号２４））を用いPCRで増幅した後、pSPT19のBamH I〜Hind IIIサイトに挿入し、プラスミド（pSPT19_AptB1）を得た。更にpSPT19_AptB1を鋳型として、二種類のプライマー（5'-GGCGTAGAGGATCTGGCTAGCGATGACCCTGCTGATTG-3'（配列番号２５）、5'-CGATCCGATGCTAGCGTAAAACGACGGCCAGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATG-3'（配列番号２６））を用いPCRを行った。得られた増幅断片を制限酵素処理し、電気泳動にて精製したものをライゲーションし、519bpからなる二本鎖環状DNA分子を得た。この二本鎖環状DNA分子をモデルとして用い本発明の検証を行った。基板にはストレプトアビジンを固定したガラス板を用いた。作製にはエステル活性化済みのガラス板（Hubbleスライドガラス、タカラバイオ）を用い、これを0.5mg/mlのストレプトアビジン（streptavidin TypeII、WAKO）溶液に室温・16時間浸漬し、ストレプトアビジンの固定反応を行った。
【０１０３】
＜基板上増幅反応とクラスタの評価＞
二本鎖環状DNA分子と5'ビオチン化プライマー(5'biotin-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3'（配列番号２７）)を終濃度20nMになるよう混合し、95℃で5分間加熱した後、緩やかに室温に戻し、両者をアニールさせた。この溶液を希釈した（終濃度1nM）ものを基板に与え、飽和蒸気下で室温・1時間静置し、基板に二本鎖環状DNA分子とビオチン化プライマーの複合体を固定した。未結合の物質は、150mM NaClを含むTEバッファー（以降TENバッファーと呼称）で洗浄し除去した。
【０１０４】
次いで、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（96-7ポリメラーゼ、ニッポンジーン）を含む溶液（8U/20μl）を与え、50℃にてRCA反応を行った。反応溶液には、メーカー添付のバッファーを用い、dNTP濃度は250μMで行った。4時間経過後に、EDTA（終濃度50mM）を添加した上で室温に戻し、反応停止とした。この基板をTENバッファーにて洗浄した後、5'末端をCy3標識したオリゴDNA（5'-Cy3 CTATAGTGTCACCTAAATCGTATG-3'（配列番号２８））1μMを基板にかけ、室温にて約16時間反応させ、TENバッファーにて洗浄し、基板上に形成された増幅遺伝子断片のクラスタを蛍光顕微鏡にて観察した。この蛍光標識プローブの相補鎖は、コンカテマー構造の繰り返し回数分だけ出現するため、輝点の蛍光強度は、その輝点に含まれる増幅遺伝子断片の数を反映することになる。Cy3標識デンドリマーを用い蛍光分子数と輝点強度との検量線を作り、クラスタあたりの蛍光分子数を算出し、クラスタあたりの増幅遺伝子断片数とした。結果基板上に、直径約800nm程度の輝点が形成されており、そこに含まれる遺伝子断片数は800〜1000分子程度であった。この値から基板上で合成された塩基長は、およそ400〜500kbpと見積もられた。
【０１０５】
このような非常に長いDNA分子は、通常今回観測された輝点よりも大きな体積を占めており、アプタマー配列を有していない二本鎖環状DNA分子を鋳型として用いる場合には、クラスタのサイズが大きくなり、面積あたりの遺伝子断片数が減少することになる。
【０１０６】
〔実施例2〕
本実施例では、基板上での合成反応時に、まずアプタマー配列の相補鎖側を合成し、次いでその逆鎖（アプタマー配列側）の合成反応を行い、二段階目の反応で生じたアプタマー配列で産物を基板に固定し、短時間で高い増幅倍率を得る効果について検討した。
【０１０７】
＜材料＞
材料には、実施例1と同様の基板と二本鎖環状DNA分子を用いた。
【０１０８】
＜増幅反応とクラスタの評価＞
二本鎖環状DNA分子と5'ビオチン化プライマー(5'biotin-TAATACGACTCACTATAGG-3'（配列番号２９）)を終濃度20nMになるよう混合し、95℃で5分間加熱した後、緩やかに室温に戻し、両者をアニールさせた。この溶液を希釈したもの（終濃度1nM）を基板に与え、飽和蒸気下で室温・1時間静置し、基板に二本鎖環状DNA分子とビオチン化プライマーの複合体を固定した。
【０１０９】
次いで、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（Csaポリメラーゼ、ニッポンジーン）を含む溶液（8U/20μl）を与え、60℃にて1時間RCA反応を行った。反応溶液には、メーカー添付のバッファーを用い、dNTP濃度は250μMで行った。反応後、基板をTENバッファーにて洗浄し、一回目の合成反応の終了とした。この基板にオリゴDNA（5'-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3'（配列番号２７））5μMを与え、熱処理（60℃15分）した後、ゆっくりと室温に戻し、コンカテマーにオリゴDNAをハイブリダイゼーションさせた。過剰量の（未結合の）オリゴDNAはTENバッファーにて洗浄し、除去した。
【０１１０】
次いで、基板に0.5U/μlのphi29ポリメラーゼ（Nxgen phi29、Lucigen社）を含む反応溶液（バッファー：メーカー添付、dNTP濃度：250μM）を与え、30℃にて2時間、反応を行った。終濃度50mMのEDTAを添加し、TENにて洗浄し、反応停止とした。以上の反応で形成されたクラスタに蛍光標識プローブ（5’-Cy3 CTATAGTGTCACCTAAATCGTATG-3’（配列番号２８））をハイブリダイゼーションさせた後、実施例1と同様に輝点強度を観察した。
【０１１１】
観察の結果、基板上に直径約900nmの輝点が認められ、そこに含まれる遺伝子断片数は平均22890分子と求められた。この3時間で20000倍以上の増幅率は、合成速度に換算すると約1kbp/secとなり、一箇所の複製起点からの反応では到底説明できず、逆鎖の合成反応が起こりその産物がアプタマー配列によって基板に固定されたものと推定される。アプタマー配列を有しない二本鎖環状DNA分子を鋳型として用いた場合には、二段階目の合成反応で生じた産物が基板への固定されないため、輝点における遺伝子増幅断片数は、本実施例に比べ大幅に低下する。例えば実施例１は一方向の合成反応のみのため、4時間反応で1000倍程度と、実施例２に比べ20分の１以下の増幅速度であった。
【符号の説明】
【０１１２】
１…解析対象の核酸領域、２…アプタマー領域、３…環状核酸、４…第１の物質、５…基板、６…結合分子、７…プライマー、８…ポリメラーゼ、９…増幅核酸、１０…クラスタ、１１…プライマー-環状核酸複合体、２０…第２の物質、２１…基板、２２…距離、３０…基板、３１…凸型のナノピラー構造、３２…スタンパ、３３…ナノホール構造、３４…スタンパ、３５…固定距離、４０…アプタマー領域、４１…環状核酸、４２…増幅核酸、４３…プライマー、４４…核酸残片、４５…領域、５０…ビーズ、５１…核酸被覆ビーズ、５２…裸ビーズ、５３…基板、６０…支持体、６１…流路、６２…反応チャンバー、６３…フローセル、６４…温調ユニット、６５…分注ユニット、６６…バルブ、６７…廃液タンク、７０…反応デバイス、７１…カバープレート、７２…検出窓、７３…注入口、７４…排出口、７６…YAGレーザ光源、７７…YAGレーザ光源、７８…レーザ光、７９…レーザ光、８０…ダイクロイックミラー、８１…レンズ、８２…プリズム、８３…対物レンズ、８４…光学フィルタ、８５…結像レンズ、８６…2次元CCDカメラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う工程を含み、
上記アプタマー領域に対応する核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子を、当該核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により上記基材に固定することを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものであり、上記第２の物質と上記結合分子とが結合した状態で、上記ローリングサークル増幅反応が進行することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であることを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
上記第１の物質と上記第２の物質とは異なる物質であることを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
上記環状核酸と上記プライマーとの複合体を形成し、上記第２の物質と上記結合分子とが結合することで当該複合体を上記基材上に捕捉させた後、上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応を実行することを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
上記第２の物質を基材上に離間して配置することで、上記増幅反応により合成された上記一本鎖核酸分子を離間させて上記基材上に配置することを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上にランダムに配置されたことを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上に規則的なパターンで配置されたことを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
上記アプタマー領域は上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計され、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により合成された核酸分子を鋳型とする2回目の核酸増幅反応により、上記核酸アプタマーを含む上記一本鎖核酸分子を合成することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを使用することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
上記基材は平面基板又はビーズであることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１３】
解析対象の核酸領域を導入する部位と、核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸と、
上記環状核酸に含まれる所定の領域にアニールできるプライマーと、
当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とを備える核酸増幅キット。
【請求項１４】
上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものであることを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項１５】
上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１６】
上記第１の物質と上記第２の物質とは異なる物質であることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１７】
上記基材は、上記第２の物質を離間して配置したものであることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１８】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上にランダムに配置されたことを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１９】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上に規則的なパターンで配置されたことを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項２０】
上記アプタマー領域は、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計されたことを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項２１】
鎖置換活性を有するポリメラーゼを更に含むことを特徴とする請求項１３載の核酸増幅キット。
【請求項２２】
鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを更に含むことを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項２３】
上記基材は平面基板又はビーズであることを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項２４】
核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子と、
上記核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とから構成され、
上記核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により、上記一本鎖核酸分子が上記基材に固定されたことを特徴とする核酸構築物。
【請求項２５】
上記基材上には、複数の上記一本鎖核酸分子が固定され、各一本鎖核酸分子はそれぞれクラスタを形成していることを特徴とする請求項２４記載の上記基材上にてクラスタを形成していることを特徴とする増幅構築物。
【請求項２６】
解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う反応部と、
上記反応部に対して励起光を照射する光照射手段と、
上記反応部上の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備え、
上記反応部において上記基板上に合成された増幅核酸からなるクラスタを用いて上記解析対象の核酸領域の塩基配列を決定する塩基配列決定装置。
【請求項１】
解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う工程を含み、
上記アプタマー領域に対応する核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子を、当該核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により上記基材に固定することを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものであり、上記第２の物質と上記結合分子とが結合した状態で、上記ローリングサークル増幅反応が進行することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であることを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
上記第１の物質と上記第２の物質とは異なる物質であることを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
上記環状核酸と上記プライマーとの複合体を形成し、上記第２の物質と上記結合分子とが結合することで当該複合体を上記基材上に捕捉させた後、上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応を実行することを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
上記第２の物質を基材上に離間して配置することで、上記増幅反応により合成された上記一本鎖核酸分子を離間させて上記基材上に配置することを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上にランダムに配置されたことを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上に規則的なパターンで配置されたことを特徴とする請求項２記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
上記アプタマー領域は上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計され、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により合成された核酸分子を鋳型とする2回目の核酸増幅反応により、上記核酸アプタマーを含む上記一本鎖核酸分子を合成することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
上記鎖置換型のローリングサークル増幅反応は、鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを使用することを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
上記基材は平面基板又はビーズであることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項１３】
解析対象の核酸領域を導入する部位と、核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸と、
上記環状核酸に含まれる所定の領域にアニールできるプライマーと、
当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とを備える核酸増幅キット。
【請求項１４】
上記プライマーは、上記基材上に固定された第２の物質に対して結合する能力を有する結合分子を導入したものであることを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項１５】
上記第１の物質と上記第２の物質とは同じ物質であることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１６】
上記第１の物質と上記第２の物質とは異なる物質であることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１７】
上記基材は、上記第２の物質を離間して配置したものであることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１８】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上にランダムに配置されたことを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項１９】
上記第２の物質は、隣り合う第２の物質同士が所定の距離を有するように上記基材上に規則的なパターンで配置されたことを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅キット。
【請求項２０】
上記アプタマー領域は、鎖置換型のローリングサークル増幅反応により上記核酸アプタマーの相補鎖が合成されるように設計されたことを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項２１】
鎖置換活性を有するポリメラーゼを更に含むことを特徴とする請求項１３載の核酸増幅キット。
【請求項２２】
鎖置換活性を有しないポリメラーゼとヘリカーゼを更に含むことを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項２３】
上記基材は平面基板又はビーズであることを特徴とする請求項１３記載の核酸増幅キット。
【請求項２４】
核酸アプタマー及び解析対象の核酸領域を含む一本鎖核酸分子と、
上記核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材とから構成され、
上記核酸アプタマーと上記第１の物質との間の親和性により、上記一本鎖核酸分子が上記基材に固定されたことを特徴とする核酸構築物。
【請求項２５】
上記基材上には、複数の上記一本鎖核酸分子が固定され、各一本鎖核酸分子はそれぞれクラスタを形成していることを特徴とする請求項２４記載の上記基材上にてクラスタを形成していることを特徴とする増幅構築物。
【請求項２６】
解析対象の核酸領域と核酸アプタマーに対応するアプタマー領域とを含む環状核酸を鋳型とし、当該核酸アプタマーと親和性を有する第１の物質が固定された基材上にてプライマーを起点とした鎖置換型のローリングサークル増幅反応を行う反応部と、
上記反応部に対して励起光を照射する光照射手段と、
上記反応部上の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備え、
上記反応部において上記基板上に合成された増幅核酸からなるクラスタを用いて上記解析対象の核酸領域の塩基配列を決定する塩基配列決定装置。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−９４０６７（Ｐ２０１３−９４０６７Ａ）
【公開日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３６８２２（Ｐ２０１１−２３６８２２）
【出願日】平成２３年１０月２８日（２０１１．１０．２８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２８日（２０１１．１０．２８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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