残留農薬検出方法および表面プラズモン共鳴センサ
【課題】非イオン性および陰イオン性の界面活性剤を助剤とする広範な残留農薬の検知を可能にする。
【解決手段】表面プラズモン共鳴センサの表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物を用いて自己組織化単分子の膜１５を形成し、界面活性剤を助剤とする残留農薬を含む被検査溶液を膜１５に触れるように流して共鳴角を変化させ、その共鳴角の変化量に基づいて被検査溶液中の農薬濃度を検出する残留農薬検出方法であって、チオール化合物として、炭素鎖が１１以上の化合物を用いている。
【解決手段】表面プラズモン共鳴センサの表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物を用いて自己組織化単分子の膜１５を形成し、界面活性剤を助剤とする残留農薬を含む被検査溶液を膜１５に触れるように流して共鳴角を変化させ、その共鳴角の変化量に基づいて被検査溶液中の農薬濃度を検出する残留農薬検出方法であって、チオール化合物として、炭素鎖が１１以上の化合物を用いている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農産物製品の残留農薬を、広範な農薬種類に対して高感度に検出するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
平成１５年の食品衛生法の改正により、一定量以上の農薬等が残留する食品の販売等を禁止するポジティブリスト制度が導入され、残留農薬の基準値がない農薬には、一律０．０１ppmの基準値が設定された。
【０００３】
その結果、年間２００万件を超える検査が行われているが、検査に指定されている公定法では、ガスクロマトグラフィー質量分析計などの分析装置が用いられるため、分析時間（コスト）の削減が課題となっている。
【０００４】
その一つの解決策として、本願出願人らは、脂質高分子膜を用いて、市販農薬に助剤として使用されている界面活性剤を検出することで、間接的に残留農薬のスクリーニングを行うための測定手法を提案している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−００７７２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記脂質高分子膜を用いた検出方法では、農薬に助剤として用いられる界面活性剤のうち、非イオン性の界面活性剤の検出が難しく、検査できる農薬の種類の範囲が全体の７０％程度に限られるという問題があった。
【０００７】
本発明は、この問題を解決し、非イオン性および陰イオン性の界面活性剤を助剤とする広範な残留農薬の検知が可能な残留農薬検出方法および表面プラズモン共鳴センサを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の請求項１記載の残留農薬検出方法は、
表面プラズモン共鳴センサの表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物を用いて自己組織化単分子膜を形成し、界面活性剤を助剤とする残留農薬を含む被検査溶液を前記自己組織化単分子膜に触れるように流して共鳴角を変化させ、該共鳴角の変化量に基づいて前記被検査溶液中の農薬濃度を検出する残留農薬検出方法であって、
前記チオール化合物として、炭素鎖が１１以上の化合物を用いたことを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項２の残留農薬検出方法は、請求項１記載の残留農薬検出方法において、
助剤として陰イオン性の界面活性剤が含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物を用いたことを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項３の残留農薬検出方法は、請求項２記載の残留農薬検出方法において、
陰イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride 分子量281.93
を用いたことを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項４の残留農薬検出方法は、請求項１記載の残留農薬検出方法において、
非イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかを用いていることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の請求項５の表面プラズモン共鳴センサは、
センサ表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物による自己組織化単分子膜が形成された表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物は、炭素鎖が１１以上の化合物であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の請求項６の表面プラズモン共鳴センサは、請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物は、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の請求項７の表面プラズモン共鳴センサは、請求項６記載の表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物が、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride
分子量281.93
であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の請求項８の表面プラズモン共鳴センサは、請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物が、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明では、残留農薬に助剤として含まれる界面活性剤を、表面プラズモン共鳴センサで検出できるように、そのセンサ表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物によって形成する自己組織化単分子膜として、炭素鎖の長さと界面活性剤の吸着性の関係を調べた結果から、炭素鎖長１１以上のチオール化合物は、非イオン性界面活性剤に対して高感度な応答を示すことを確認しており、この化合物を用いることで、従来検出できなかった非イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤を助剤とする広範な農薬の高感度検知が可能となる。
【００１７】
また、特に、陰イオン性界面活性剤に対しては、末端に四級アンモニウムカチオンを有するＴＭＡに代表される化合物を用いることで、極めて高感度な検出が可能となる。
【００１８】
また、非イオン性界面活性剤に対しては、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
の化合物を用いることで高感度な検出が可能となり、さらに、その炭素鎖が最長のＣ２０が特に高感度検出可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】表面プラズモン共鳴センサの構造の模式図
【図２】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳに対するＴＭＡセンサ膜の応答特性
【図３】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳの各センサ膜への吸着特性
【図４】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳのＣ２０〜Ｃ１１センサ膜への吸着特性
【図５】非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ５８に対するＣ２０センサ膜の応答特性
【図６】非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ５８のＣ２０およびＣ１８センサ膜への吸着特性
【図７】非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ５８のＣ２０〜Ｃ１１センサ膜への吸着特性
【図８】農薬原体およびＳＤＳ混合物に対するＴＭＡセンサ膜の応答特性
【図９】農薬原体およびＳＤＳ混合物に対するＣ２０センサ膜の応答特性
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。
本願発明者らは、一種の高感度な屈折率計である表面プラズモン共鳴測定装置を用いた残留農薬検知の可能性を確かめるべく、種々の実験を行った。以下、その実験方法および測定結果について説明する。
【００２１】
（実験方法）
（Ａ）測定系
測定には、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと記す）センサを用いている。
このＳＰＲセンサは、表面プラズモン共鳴現象を利用して高感度に化学物質などを検出することが可能なセンサであり、具体的には図１の構成を有している。
【００２２】
即ち、プリズム１１の表面側の金薄膜１２に対してプリズム１１側から発光器（ＬＥＤ等）１３から光を照射し、その反射光を受光器１４で受けて強度を測定する。この時、金薄膜１２の表面では、エバネッセント波がしみ出す。金薄膜１２表面のプラズモンとエバネッセント波の波数が一致したとき共鳴が起こり、光のエネルギーが共鳴に使われるため、反射光強度は減少する。この反射光強度が最小となる入射角度を共鳴角と呼ぶ。共鳴角は金薄膜１２表面の屈折率に依存して変化し、その屈折率は金薄膜１２表面の質量変化に応じて変化する。
【００２３】
そして、金薄膜１２の表面には、測定対象物質に選択的に結合するような化合物（自己組織化単分子膜ＳＡＭ）の膜１５が形成されており、被測定液をこの膜１５に触れるように流動させることで、被測定液中の検出対象物質を膜１５の表面に結合させて質量増加させ、共鳴角を変位させる。
【００２４】
本発明の実験では、前記ＳＰＲセンサを用いた装置として、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のBiacore
J（登録商標）を使用した。またセンサに装着する金薄膜としてＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＳＩＡ Ｋｉｔのものを用いた。ランニングバッファーとして、Phosphate-buffered saline(ＰＢＳ; １０mM phosphate, １４０mM ＮａＣｌ, pH 7.4)を用いた。ランニングバッファーは使用前にフィルターでろ過し、十分脱気を行い用いた。流速は約３０μl/minに設定して、測定を行った。
【００２５】
（Ｂ）試薬
測定対象として、以下の陰イオン性界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、非イオン性界面活性剤のポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Ｂｒｉｊ５８)を用いた。
（ａ１）ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ) （和光純薬工業株式会社） 分子量288.38cmc 8.1mM
（ａ２）ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Ｂｒｉｊ５８) （和光純薬工業株式会社） 分子量1124cmc 0.08mM
【００２６】
また、農薬として、以下のイマザリルおよびグリホサートを選んだ。
（ｂ１）イマザリル Ｃ１４Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２０（和光純薬工業株式会社） 分子量297.18
（ｂ２）グリホサート ＨＯ２ＣＣＨ２ＮＨＣＨ２Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２ （和光純薬工業株式会社） 分子量169.07
【００２７】
表面の修飾試薬（ＳＡＭ）としては、以下の４種類のチオール化合物、1-Undecanethiol、1-Octadecanethiol、Eicosane thiolおよびN,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride(ＴＭＡ)を用いた。
【００２８】
（ｃ１）Ｃ１１ 1-Undecanethiol （化学式HS-(CH2)10-CH3）(東京化成工業株式会社) 分子量188.37
（ｃ２）Ｃ１８ 1-Octadecanethiol （化学式HS-(CH2)17-CH3）(東京化成工業株式会社) 分子量286.56
（ｃ３）Ｃ２０ Eicosane thiol （化学式HS-(CH2)19-CH3）(Endeavour Speciality Chemicals社) 分子量314.62
（ｃ４）ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride （化学式HS-(CH2)11NMe3）(Prochimia Surfaces社) 分子量281.93
【００２９】
また、比較のために、ＯＨ末端の試薬として、
（ｃ５）ＯＨ 11-mercapto-1-undecanol （化学式HS-(CH2)11-OH）(ALDRICH) 分子量204.37
を用いている。
【００３０】
（Ｃ）センサ表面の作製
金薄膜として、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＳＩＡ Ｋｉｔ Ａｕに含まれるＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ａｕを用いた。
【００３１】
また、金薄膜チップをアセトン、エタノール、2-プロパノールに浸漬し、それぞれ１０、２、２分間超音波洗浄を行った。その後、ＳＣ１洗浄液（アンモニア水、過酸化水素水、純水を１：１：５で混合した溶液）に浸漬し、ホットプレートで２０分間９０度に加熱した。その後、金薄膜チップを超純水でリンスした。
【００３２】
続いて、洗浄後の金チップを、１mMのSAM溶液（溶媒 エタノール）に２４時間浸漬し、ＳＡＭｓ（自己組織化単分子膜）を形成した。ＳＡＭｓ形成後は、修飾試薬エタノール溶液から取り出し、金薄膜の表面に非特異的吸着している修飾試薬を除去するため、エタノールに浸漬し、超音波洗浄機で３分間洗浄した。その後、エタノールから取り出した金薄膜チップを超純水でリンスし、窒素ブローで乾燥させた。
【００３３】
（Ｄ）試薬の調整
（ｄ１）ストック溶液の調整
１００ppmのイマザリル、グリホサート、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ５８ in ＰＢＳ溶液を用意した。イマザリルはアセトンに溶かした後、ＰＢＳ溶液を加え、１００ppmイマザリル ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３４】
（ｄ２）界面活性剤溶液
１００ppmの界面活性剤 ＰＢＳ溶液をＰＢＳで希釈し、各濃度の界面活性剤 ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３５】
（ｄ３）農薬溶液
１００ppmの農薬 ＰＢＳ溶液をＰＢＳで希釈し、各濃度の農薬 ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３６】
（ｄ４）農薬＋界面活性剤溶液
１００ppmの界面活性剤 ＰＢＳ溶液と１００ppmの農薬 ＰＢＳ溶液を１：１の割合で混合し、さらにＰＢＳにより希釈し、界面活性剤と農薬がそれぞれ３０、１００、３００、１０００ppbの各濃度となる農薬＋界面活性剤 ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３７】
（Ｅ）測定結果
（Ｅ−１）ＳＡＭｓへのＳＤＳ吸着の測定
センサの金薄膜表面に前記４種類のチオール化合物（ｃ１）〜（ｃ４）と（ｃ５）のＯＨとを修飾したセンサを用いて、ＳＤＳ吸着の測定を行った。ＳＰＲ装置に緩衝液を流し、各濃度のＳＤＳ溶液を２分間添加した。測定は３回行った。
【００３８】
図２は、チオール化合物として（ｃ４）のＴＭＡセンサ表面を用いたＳＰＲ測定のセンサグラムである。この図２の測定結果において、１０００ppbのＳＤＳ溶液の応答を見ると、溶液流通開始後からＴＭＡセンサ表面にＳＤＳが吸着することによりセンサ応答が立ち上がり、流通終了と同時にベースライン付近まで戻っていることがわかる。０〜３０ppbの応答に違いは見られないが、１００ppb以上では３０ppb以下との差がはっきりわかる。なお、単位ＲＵ（Resonace Unit）は、共鳴角度０．１°＝１０００ＲＵに相当する値である。
【００３９】
図３は、ＳＡＭｓへのＳＤＳ吸着特性を測定した結果である。この図３の結果から、Ｃ１１、Ｃ１８、Ｃ２０、ＴＭＡで表面修飾された各センサいずれについてもＳＤＳ濃度に相関する応答が得られており、これらの炭素鎖１１以上の４つのチオール化合物に関してＳＤＳの検知が可能である。
【００４０】
その中で、特に、末端に四級アンモニウムカチオンが導入されているＴＭＡセンサ表面への吸着が一番高く、極めて高感度な検出が可能であることを示している。
【００４１】
なお、サンプル溶液とランニングバッファーの比重の違いから生じるバルク効果（溶媒による屈折率変化）はヘキサエチレングリコール(ＥＧ６０Ｈ) ＳＡＭをリファレンスとして用いて差し引いている。低濃度域（１０ppm以下）では、バルク効果の影響はほとんどない。ヘキサエチレングリコールＳＡＭに使った試薬は以下の通りである。
ＥＧ６０Ｈ 11-mercaptoundecanol hexaethylenglycol ether
化学式 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)-OH (Prochimia Surfaces社) 分子量 468.69
【００４２】
ここで、ＴＭＡセンサとＣ１１センサの炭素鎖長は同じであるから、Ｃ１１センサに対して、末端に四級アンモニウムカチオンが導入されている点が異なるＴＭＡセンサが、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳの吸着がより促進されていることが明らかである。また、末端にヒドロキシル基を有するＯＨセンサには、ほとんど吸着が見られない。
【００４３】
図４は、図３からＣ２０、Ｃ１８、Ｃ１１の各センサの特性を比較するために抜き出したものであり、Ｃ１８センサ表面とＣ２０センサ表面の特性に大きな違いはないが、低濃度域ではＣ２０センサ表面の方が応答性がよい。また、Ｃ１１センサ表面とは、１０ppm以上の濃度領域で吸着量が明確に異なることがわかる。
【００４４】
（Ｅ−２）ＳＡＭｓへのＢｒｉｊ５８吸着の測定
センサ表面に、上記（ｃ１）〜（ｃ４）の４種類のチオール化合物を修飾し、ＳＤＳ吸着の測定を行った。ＳＰＲ装置に緩衝液を流し、各濃度のＢｒｉｊ５８溶液を２分間添加した。測定は３回行った。
【００４５】
図５は、例としてＣ２０センサ表面におけるＳＰＲ測定のセンサグラムを示す。この図５から、ＴＭＡセンサ表面へのＳＤＳ吸着特性と同様に、３０ppb以下では応答が見られないが、１００ppb以上で、センサグラムの上昇が見られる。
【００４６】
図６は、Ｃ２０センサ表面およびＣ１８センサ表面へのＢｒｉｊ５８吸着特性を示すものであり、Ｃ１８センサとＣ２０センサの特性に大きな違いはないが、図７に示す低濃度域の拡大図ではＣ２０センサの方が応答性がよいことがわかる。
【００４７】
なお、ここでは、アルキル鎖を持つチオール化合物のうち、炭素鎖１１、１８、２０の化合物について実験しているが、実験結果から非イオン性の界面活性剤Ｂｒｉｊ５８に対しては、炭素鎖が長い程感度が高くなっているので、炭素鎖が２０を超えるものがより高い感度をもつことが十分予測されるが、炭素鎖が２０を超えるチオール化合物は製造上困難性があり、現状では、非イオン性界面活性剤に対して、Ｃ２０のセンサが最も適していると認められる。なお、図６の結果は、ヘキサエチレングリコール(ＥＧ６０Ｈ)
ＳＡＭをリファレンスとして用いてバルク効果を差し引いている。低濃度域（３ppm以下）では、バルク効果の影響はほとんどない。
【００４８】
（Ｅ−３）疑似農薬の測定
図８にＴＭＡセンサ表面における農薬原体および陰イオン性のＳＤＳ混合疑似農薬の測定結果、図９にＣ２０センサ表面における農薬原体および非イオン性のＢｒｉｊ５８混合疑似農薬の測定結果を示す。
【００４９】
これらの測定結果から、グリホサートおよびイマザリルに対しては、１０００ppbまでの濃度範囲ではほとんど応答しておらず、ＳＤＳあるいはＢｒｉｊ５８との混合溶液では、どちらも応答していることがわかる。つまり、どちらのセンサ表面でも原体のグリホサートおよびイマザリル単体ではセンサ応答がほとんどないが、助剤である界面活性剤のＳＤＳあるいはＢｒｉｊ５８が存在するとセンサ応答が得られている。
【００５０】
なお、実際には、農薬の原体と助剤の混合比が製品によって決まっているから、助剤である界面活性剤の濃度検知が行えれば、既知の混合比から農薬原体の濃度も推定でき、その推定値が、ある基準値を超える被検査溶液に対してのみ、ガスクロマトグラフィー質量分析計などの分析装置を用いた公定法による分析を行えばよいから、効率的な検査が行える。
【００５１】
（Ｅ−４）検出限界
サンプルとして、ＰＢＳのみを流した場合（測定回数１１回）の平均値と標準偏差σから、検出限界を、
検出限界(ＲＵ)＝平均値＋３．２９σ
として求めた。この結果より、ＳＤＳの検出限界は15.99RU、Ｂｒｉｊ５８の検出限界は16.31RUとなる。
【００５２】
そして、この検出限界における界面活性剤濃度を検量線より求めると、
ＳＤＳ……５０ppb
ＳＤＳ＋グリホサート……９０ppb
ＳＤＳ＋イマザリル……６０ppb
Ｂｒｉｊ５８……３０ppb
Ｂｒｉｊ５８＋グリホサート……９０ppb
Ｂｒｉｊ５８＋イマザリル……９０ppb
となり、総じて９０ppbの濃度で検出できることがわかる。
【００５３】
以上の測定結果から、ＴＭＡで代表されるように、末端に四級アンモニウムカチオンを有するチオール化合物によるＳＡＭが好適であり、また、Ｃ２０〜Ｃ１１のようなアルカンチオール化合物によるＳＡＭの場合、炭素鎖長が長い程、応答が高いと認められる。
【００５４】
したがって、アニオン性（陰イオン性）界面活性剤の検出には、鎖長が長く（Ｃ１１以上）、末端に四級アンモニウムカチオンを有するＳＡＭを用いることで、より高感度に界面活性剤および農薬助剤を検出することが可能であり、非イオン性界面活性剤の検出には、炭素鎖が長い（Ｃ１１以上）ほど高感度な検出が可能であり、これらを使い分けることで８０％の農薬の検知が可能となった。
【符号の説明】
【００５５】
１１……プリズム、１２……金薄膜、１３……発光器、１４……受光器、１５……膜
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農産物製品の残留農薬を、広範な農薬種類に対して高感度に検出するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
平成１５年の食品衛生法の改正により、一定量以上の農薬等が残留する食品の販売等を禁止するポジティブリスト制度が導入され、残留農薬の基準値がない農薬には、一律０．０１ppmの基準値が設定された。
【０００３】
その結果、年間２００万件を超える検査が行われているが、検査に指定されている公定法では、ガスクロマトグラフィー質量分析計などの分析装置が用いられるため、分析時間（コスト）の削減が課題となっている。
【０００４】
その一つの解決策として、本願出願人らは、脂質高分子膜を用いて、市販農薬に助剤として使用されている界面活性剤を検出することで、間接的に残留農薬のスクリーニングを行うための測定手法を提案している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−００７７２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記脂質高分子膜を用いた検出方法では、農薬に助剤として用いられる界面活性剤のうち、非イオン性の界面活性剤の検出が難しく、検査できる農薬の種類の範囲が全体の７０％程度に限られるという問題があった。
【０００７】
本発明は、この問題を解決し、非イオン性および陰イオン性の界面活性剤を助剤とする広範な残留農薬の検知が可能な残留農薬検出方法および表面プラズモン共鳴センサを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の請求項１記載の残留農薬検出方法は、
表面プラズモン共鳴センサの表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物を用いて自己組織化単分子膜を形成し、界面活性剤を助剤とする残留農薬を含む被検査溶液を前記自己組織化単分子膜に触れるように流して共鳴角を変化させ、該共鳴角の変化量に基づいて前記被検査溶液中の農薬濃度を検出する残留農薬検出方法であって、
前記チオール化合物として、炭素鎖が１１以上の化合物を用いたことを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項２の残留農薬検出方法は、請求項１記載の残留農薬検出方法において、
助剤として陰イオン性の界面活性剤が含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物を用いたことを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項３の残留農薬検出方法は、請求項２記載の残留農薬検出方法において、
陰イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride 分子量281.93
を用いたことを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項４の残留農薬検出方法は、請求項１記載の残留農薬検出方法において、
非イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかを用いていることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の請求項５の表面プラズモン共鳴センサは、
センサ表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物による自己組織化単分子膜が形成された表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物は、炭素鎖が１１以上の化合物であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の請求項６の表面プラズモン共鳴センサは、請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物は、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の請求項７の表面プラズモン共鳴センサは、請求項６記載の表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物が、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride
分子量281.93
であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の請求項８の表面プラズモン共鳴センサは、請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物が、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明では、残留農薬に助剤として含まれる界面活性剤を、表面プラズモン共鳴センサで検出できるように、そのセンサ表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物によって形成する自己組織化単分子膜として、炭素鎖の長さと界面活性剤の吸着性の関係を調べた結果から、炭素鎖長１１以上のチオール化合物は、非イオン性界面活性剤に対して高感度な応答を示すことを確認しており、この化合物を用いることで、従来検出できなかった非イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤を助剤とする広範な農薬の高感度検知が可能となる。
【００１７】
また、特に、陰イオン性界面活性剤に対しては、末端に四級アンモニウムカチオンを有するＴＭＡに代表される化合物を用いることで、極めて高感度な検出が可能となる。
【００１８】
また、非イオン性界面活性剤に対しては、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
の化合物を用いることで高感度な検出が可能となり、さらに、その炭素鎖が最長のＣ２０が特に高感度検出可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】表面プラズモン共鳴センサの構造の模式図
【図２】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳに対するＴＭＡセンサ膜の応答特性
【図３】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳの各センサ膜への吸着特性
【図４】陰イオン性界面活性剤ＳＤＳのＣ２０〜Ｃ１１センサ膜への吸着特性
【図５】非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ５８に対するＣ２０センサ膜の応答特性
【図６】非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ５８のＣ２０およびＣ１８センサ膜への吸着特性
【図７】非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ５８のＣ２０〜Ｃ１１センサ膜への吸着特性
【図８】農薬原体およびＳＤＳ混合物に対するＴＭＡセンサ膜の応答特性
【図９】農薬原体およびＳＤＳ混合物に対するＣ２０センサ膜の応答特性
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。
本願発明者らは、一種の高感度な屈折率計である表面プラズモン共鳴測定装置を用いた残留農薬検知の可能性を確かめるべく、種々の実験を行った。以下、その実験方法および測定結果について説明する。
【００２１】
（実験方法）
（Ａ）測定系
測定には、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと記す）センサを用いている。
このＳＰＲセンサは、表面プラズモン共鳴現象を利用して高感度に化学物質などを検出することが可能なセンサであり、具体的には図１の構成を有している。
【００２２】
即ち、プリズム１１の表面側の金薄膜１２に対してプリズム１１側から発光器（ＬＥＤ等）１３から光を照射し、その反射光を受光器１４で受けて強度を測定する。この時、金薄膜１２の表面では、エバネッセント波がしみ出す。金薄膜１２表面のプラズモンとエバネッセント波の波数が一致したとき共鳴が起こり、光のエネルギーが共鳴に使われるため、反射光強度は減少する。この反射光強度が最小となる入射角度を共鳴角と呼ぶ。共鳴角は金薄膜１２表面の屈折率に依存して変化し、その屈折率は金薄膜１２表面の質量変化に応じて変化する。
【００２３】
そして、金薄膜１２の表面には、測定対象物質に選択的に結合するような化合物（自己組織化単分子膜ＳＡＭ）の膜１５が形成されており、被測定液をこの膜１５に触れるように流動させることで、被測定液中の検出対象物質を膜１５の表面に結合させて質量増加させ、共鳴角を変位させる。
【００２４】
本発明の実験では、前記ＳＰＲセンサを用いた装置として、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のBiacore
J（登録商標）を使用した。またセンサに装着する金薄膜としてＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＳＩＡ Ｋｉｔのものを用いた。ランニングバッファーとして、Phosphate-buffered saline(ＰＢＳ; １０mM phosphate, １４０mM ＮａＣｌ, pH 7.4)を用いた。ランニングバッファーは使用前にフィルターでろ過し、十分脱気を行い用いた。流速は約３０μl/minに設定して、測定を行った。
【００２５】
（Ｂ）試薬
測定対象として、以下の陰イオン性界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、非イオン性界面活性剤のポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Ｂｒｉｊ５８)を用いた。
（ａ１）ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ) （和光純薬工業株式会社） 分子量288.38cmc 8.1mM
（ａ２）ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Ｂｒｉｊ５８) （和光純薬工業株式会社） 分子量1124cmc 0.08mM
【００２６】
また、農薬として、以下のイマザリルおよびグリホサートを選んだ。
（ｂ１）イマザリル Ｃ１４Ｈ１４Ｃｌ２Ｎ２０（和光純薬工業株式会社） 分子量297.18
（ｂ２）グリホサート ＨＯ２ＣＣＨ２ＮＨＣＨ２Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２ （和光純薬工業株式会社） 分子量169.07
【００２７】
表面の修飾試薬（ＳＡＭ）としては、以下の４種類のチオール化合物、1-Undecanethiol、1-Octadecanethiol、Eicosane thiolおよびN,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride(ＴＭＡ)を用いた。
【００２８】
（ｃ１）Ｃ１１ 1-Undecanethiol （化学式HS-(CH2)10-CH3）(東京化成工業株式会社) 分子量188.37
（ｃ２）Ｃ１８ 1-Octadecanethiol （化学式HS-(CH2)17-CH3）(東京化成工業株式会社) 分子量286.56
（ｃ３）Ｃ２０ Eicosane thiol （化学式HS-(CH2)19-CH3）(Endeavour Speciality Chemicals社) 分子量314.62
（ｃ４）ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride （化学式HS-(CH2)11NMe3）(Prochimia Surfaces社) 分子量281.93
【００２９】
また、比較のために、ＯＨ末端の試薬として、
（ｃ５）ＯＨ 11-mercapto-1-undecanol （化学式HS-(CH2)11-OH）(ALDRICH) 分子量204.37
を用いている。
【００３０】
（Ｃ）センサ表面の作製
金薄膜として、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のＳＩＡ Ｋｉｔ Ａｕに含まれるＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ａｕを用いた。
【００３１】
また、金薄膜チップをアセトン、エタノール、2-プロパノールに浸漬し、それぞれ１０、２、２分間超音波洗浄を行った。その後、ＳＣ１洗浄液（アンモニア水、過酸化水素水、純水を１：１：５で混合した溶液）に浸漬し、ホットプレートで２０分間９０度に加熱した。その後、金薄膜チップを超純水でリンスした。
【００３２】
続いて、洗浄後の金チップを、１mMのSAM溶液（溶媒 エタノール）に２４時間浸漬し、ＳＡＭｓ（自己組織化単分子膜）を形成した。ＳＡＭｓ形成後は、修飾試薬エタノール溶液から取り出し、金薄膜の表面に非特異的吸着している修飾試薬を除去するため、エタノールに浸漬し、超音波洗浄機で３分間洗浄した。その後、エタノールから取り出した金薄膜チップを超純水でリンスし、窒素ブローで乾燥させた。
【００３３】
（Ｄ）試薬の調整
（ｄ１）ストック溶液の調整
１００ppmのイマザリル、グリホサート、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ５８ in ＰＢＳ溶液を用意した。イマザリルはアセトンに溶かした後、ＰＢＳ溶液を加え、１００ppmイマザリル ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３４】
（ｄ２）界面活性剤溶液
１００ppmの界面活性剤 ＰＢＳ溶液をＰＢＳで希釈し、各濃度の界面活性剤 ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３５】
（ｄ３）農薬溶液
１００ppmの農薬 ＰＢＳ溶液をＰＢＳで希釈し、各濃度の農薬 ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３６】
（ｄ４）農薬＋界面活性剤溶液
１００ppmの界面活性剤 ＰＢＳ溶液と１００ppmの農薬 ＰＢＳ溶液を１：１の割合で混合し、さらにＰＢＳにより希釈し、界面活性剤と農薬がそれぞれ３０、１００、３００、１０００ppbの各濃度となる農薬＋界面活性剤 ＰＢＳ溶液を作成した。
【００３７】
（Ｅ）測定結果
（Ｅ−１）ＳＡＭｓへのＳＤＳ吸着の測定
センサの金薄膜表面に前記４種類のチオール化合物（ｃ１）〜（ｃ４）と（ｃ５）のＯＨとを修飾したセンサを用いて、ＳＤＳ吸着の測定を行った。ＳＰＲ装置に緩衝液を流し、各濃度のＳＤＳ溶液を２分間添加した。測定は３回行った。
【００３８】
図２は、チオール化合物として（ｃ４）のＴＭＡセンサ表面を用いたＳＰＲ測定のセンサグラムである。この図２の測定結果において、１０００ppbのＳＤＳ溶液の応答を見ると、溶液流通開始後からＴＭＡセンサ表面にＳＤＳが吸着することによりセンサ応答が立ち上がり、流通終了と同時にベースライン付近まで戻っていることがわかる。０〜３０ppbの応答に違いは見られないが、１００ppb以上では３０ppb以下との差がはっきりわかる。なお、単位ＲＵ（Resonace Unit）は、共鳴角度０．１°＝１０００ＲＵに相当する値である。
【００３９】
図３は、ＳＡＭｓへのＳＤＳ吸着特性を測定した結果である。この図３の結果から、Ｃ１１、Ｃ１８、Ｃ２０、ＴＭＡで表面修飾された各センサいずれについてもＳＤＳ濃度に相関する応答が得られており、これらの炭素鎖１１以上の４つのチオール化合物に関してＳＤＳの検知が可能である。
【００４０】
その中で、特に、末端に四級アンモニウムカチオンが導入されているＴＭＡセンサ表面への吸着が一番高く、極めて高感度な検出が可能であることを示している。
【００４１】
なお、サンプル溶液とランニングバッファーの比重の違いから生じるバルク効果（溶媒による屈折率変化）はヘキサエチレングリコール(ＥＧ６０Ｈ) ＳＡＭをリファレンスとして用いて差し引いている。低濃度域（１０ppm以下）では、バルク効果の影響はほとんどない。ヘキサエチレングリコールＳＡＭに使った試薬は以下の通りである。
ＥＧ６０Ｈ 11-mercaptoundecanol hexaethylenglycol ether
化学式 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)-OH (Prochimia Surfaces社) 分子量 468.69
【００４２】
ここで、ＴＭＡセンサとＣ１１センサの炭素鎖長は同じであるから、Ｃ１１センサに対して、末端に四級アンモニウムカチオンが導入されている点が異なるＴＭＡセンサが、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳの吸着がより促進されていることが明らかである。また、末端にヒドロキシル基を有するＯＨセンサには、ほとんど吸着が見られない。
【００４３】
図４は、図３からＣ２０、Ｃ１８、Ｃ１１の各センサの特性を比較するために抜き出したものであり、Ｃ１８センサ表面とＣ２０センサ表面の特性に大きな違いはないが、低濃度域ではＣ２０センサ表面の方が応答性がよい。また、Ｃ１１センサ表面とは、１０ppm以上の濃度領域で吸着量が明確に異なることがわかる。
【００４４】
（Ｅ−２）ＳＡＭｓへのＢｒｉｊ５８吸着の測定
センサ表面に、上記（ｃ１）〜（ｃ４）の４種類のチオール化合物を修飾し、ＳＤＳ吸着の測定を行った。ＳＰＲ装置に緩衝液を流し、各濃度のＢｒｉｊ５８溶液を２分間添加した。測定は３回行った。
【００４５】
図５は、例としてＣ２０センサ表面におけるＳＰＲ測定のセンサグラムを示す。この図５から、ＴＭＡセンサ表面へのＳＤＳ吸着特性と同様に、３０ppb以下では応答が見られないが、１００ppb以上で、センサグラムの上昇が見られる。
【００４６】
図６は、Ｃ２０センサ表面およびＣ１８センサ表面へのＢｒｉｊ５８吸着特性を示すものであり、Ｃ１８センサとＣ２０センサの特性に大きな違いはないが、図７に示す低濃度域の拡大図ではＣ２０センサの方が応答性がよいことがわかる。
【００４７】
なお、ここでは、アルキル鎖を持つチオール化合物のうち、炭素鎖１１、１８、２０の化合物について実験しているが、実験結果から非イオン性の界面活性剤Ｂｒｉｊ５８に対しては、炭素鎖が長い程感度が高くなっているので、炭素鎖が２０を超えるものがより高い感度をもつことが十分予測されるが、炭素鎖が２０を超えるチオール化合物は製造上困難性があり、現状では、非イオン性界面活性剤に対して、Ｃ２０のセンサが最も適していると認められる。なお、図６の結果は、ヘキサエチレングリコール(ＥＧ６０Ｈ)
ＳＡＭをリファレンスとして用いてバルク効果を差し引いている。低濃度域（３ppm以下）では、バルク効果の影響はほとんどない。
【００４８】
（Ｅ−３）疑似農薬の測定
図８にＴＭＡセンサ表面における農薬原体および陰イオン性のＳＤＳ混合疑似農薬の測定結果、図９にＣ２０センサ表面における農薬原体および非イオン性のＢｒｉｊ５８混合疑似農薬の測定結果を示す。
【００４９】
これらの測定結果から、グリホサートおよびイマザリルに対しては、１０００ppbまでの濃度範囲ではほとんど応答しておらず、ＳＤＳあるいはＢｒｉｊ５８との混合溶液では、どちらも応答していることがわかる。つまり、どちらのセンサ表面でも原体のグリホサートおよびイマザリル単体ではセンサ応答がほとんどないが、助剤である界面活性剤のＳＤＳあるいはＢｒｉｊ５８が存在するとセンサ応答が得られている。
【００５０】
なお、実際には、農薬の原体と助剤の混合比が製品によって決まっているから、助剤である界面活性剤の濃度検知が行えれば、既知の混合比から農薬原体の濃度も推定でき、その推定値が、ある基準値を超える被検査溶液に対してのみ、ガスクロマトグラフィー質量分析計などの分析装置を用いた公定法による分析を行えばよいから、効率的な検査が行える。
【００５１】
（Ｅ−４）検出限界
サンプルとして、ＰＢＳのみを流した場合（測定回数１１回）の平均値と標準偏差σから、検出限界を、
検出限界(ＲＵ)＝平均値＋３．２９σ
として求めた。この結果より、ＳＤＳの検出限界は15.99RU、Ｂｒｉｊ５８の検出限界は16.31RUとなる。
【００５２】
そして、この検出限界における界面活性剤濃度を検量線より求めると、
ＳＤＳ……５０ppb
ＳＤＳ＋グリホサート……９０ppb
ＳＤＳ＋イマザリル……６０ppb
Ｂｒｉｊ５８……３０ppb
Ｂｒｉｊ５８＋グリホサート……９０ppb
Ｂｒｉｊ５８＋イマザリル……９０ppb
となり、総じて９０ppbの濃度で検出できることがわかる。
【００５３】
以上の測定結果から、ＴＭＡで代表されるように、末端に四級アンモニウムカチオンを有するチオール化合物によるＳＡＭが好適であり、また、Ｃ２０〜Ｃ１１のようなアルカンチオール化合物によるＳＡＭの場合、炭素鎖長が長い程、応答が高いと認められる。
【００５４】
したがって、アニオン性（陰イオン性）界面活性剤の検出には、鎖長が長く（Ｃ１１以上）、末端に四級アンモニウムカチオンを有するＳＡＭを用いることで、より高感度に界面活性剤および農薬助剤を検出することが可能であり、非イオン性界面活性剤の検出には、炭素鎖が長い（Ｃ１１以上）ほど高感度な検出が可能であり、これらを使い分けることで８０％の農薬の検知が可能となった。
【符号の説明】
【００５５】
１１……プリズム、１２……金薄膜、１３……発光器、１４……受光器、１５……膜
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴センサの表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物を用いて自己組織化単分子膜を形成し、界面活性剤を助剤とする残留農薬を含む被検査溶液を前記自己組織化単分子膜に触れるように流して共鳴角を変化させ、該共鳴角の変化量に基づいて被検査溶液中の農薬濃度を検出する残留農薬検出方法であって、
前記チオール化合物として、炭素鎖が１１以上の化合物を用いたことを特徴とする残留農薬検出方法。
【請求項２】
助剤として陰イオン性の界面活性剤が含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物を用いたことを特徴とする請求項１記載の残留農薬検出方法。
【請求項３】
陰イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride
分子量281.93
を用いたことを特徴とする請求項２記載の残留農薬検出方法。
【請求項４】
非イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかを用いていることを特徴とする請求項１記載の残留農薬検出方法。
【請求項５】
センサ表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物による自己組織化単分子膜が形成された表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物は、炭素鎖が１１以上の化合物であることを特徴とする表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項６】
前記チオール化合物は、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物であることを特徴とする請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項７】
前記チオール化合物が、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride
分子量281.93
であることを特徴とする請求項６記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項８】
前記チオール化合物が、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかであることを特徴とする請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項１】
表面プラズモン共鳴センサの表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物を用いて自己組織化単分子膜を形成し、界面活性剤を助剤とする残留農薬を含む被検査溶液を前記自己組織化単分子膜に触れるように流して共鳴角を変化させ、該共鳴角の変化量に基づいて被検査溶液中の農薬濃度を検出する残留農薬検出方法であって、
前記チオール化合物として、炭素鎖が１１以上の化合物を用いたことを特徴とする残留農薬検出方法。
【請求項２】
助剤として陰イオン性の界面活性剤が含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物を用いたことを特徴とする請求項１記載の残留農薬検出方法。
【請求項３】
陰イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride
分子量281.93
を用いたことを特徴とする請求項２記載の残留農薬検出方法。
【請求項４】
非イオン性の界面活性剤が助剤として含まれている被検査溶液に対して、
前記チオール化合物として、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかを用いていることを特徴とする請求項１記載の残留農薬検出方法。
【請求項５】
センサ表面に、アルキル鎖を持つチオール化合物による自己組織化単分子膜が形成された表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記チオール化合物は、炭素鎖が１１以上の化合物であることを特徴とする表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項６】
前記チオール化合物は、末端に四級アンモニウムカチオンを有する化合物であることを特徴とする請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項７】
前記チオール化合物が、
ＴＭＡ N,N,N-trimethyl-(mercaptoundecyl) ammonium chloride
分子量281.93
であることを特徴とする請求項６記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項８】
前記チオール化合物が、
Ｃ１１ 1-Undecanethiol 分子量188.37
Ｃ１８ 1-Octadecanethiol 分子量286.56
Ｃ２０ Eicosane thiol 分子量314.62
のいずれかであることを特徴とする請求項５記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１３−２８１７（Ｐ２０１３−２８１７Ａ）
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３０６５６（Ｐ２０１１−１３０６５６）
【出願日】平成２３年６月１０日（２０１１．６．１０）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０２２４０６０７）株式会社インテリジェントセンサーテクノロジー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１０日（２０１１．６．１０）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０２２４０６０７）株式会社インテリジェントセンサーテクノロジー (10)
【Ｆターム（参考）】
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