熱ショックタンパク質の発現誘導剤
【課題】効果的な熱ショックタンパク質の発現誘導剤を提供する。
【解決手段】
アルニカというキク科の植物、サルビアというシソ科の植物、及びマジョラムというシソ科の植物が、熱ショックタンパク質の発現を誘導するという、本発明者らが初めて見出した知見に基づき、アルニカを含有する熱ショックタンパク質発現誘導剤、サルビアを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤、及びマジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤を提供する。
【解決手段】
アルニカというキク科の植物、サルビアというシソ科の植物、及びマジョラムというシソ科の植物が、熱ショックタンパク質の発現を誘導するという、本発明者らが初めて見出した知見に基づき、アルニカを含有する熱ショックタンパク質発現誘導剤、サルビアを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤、及びマジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生命工学に係り、熱ショックタンパク質の発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の細胞、組織、あるいは器官が、一般的な生理的温度より３℃以上高い温度に晒されると、生体の防御システムの一つとして、一群の特異的タンパク質が発現することが知られている。これら一群の特異的タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって測定した場合、１０〜１１０ＫＤａの分子量を有し、熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、以下、「ＨＳＰ」と称する場合もある。）と呼ばれる。
【０００３】
ＨＳＰは、分子量の相違により、ＨＳＰ９０ファミリー（分子量：９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下）、ＨＳＰ７０ファミリー（分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）、ＨＳＰ６０ファミリー（分子量：６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満）、及び低分子量ＨＳＰファミリー（分子量：６０ｋＤａ未満）に分類されている。
【０００４】
ＨＳＰの機能は多岐にわたる。例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０ファミリーは、変性タンパク質に結合して、変性タンパク質を天然のフォールディング（高次構造・折り畳み構造）に巻き戻す作用や、第三のタンパク質や核酸との会合、細胞内での局在化や膜透過への関与など、いわゆる分子シャペロンと呼ばれる機能を担っている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照。）。そこで、ＨＳＰの発現を誘導する生薬抽出物を含有する熱ショックタンパク質誘導剤が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。さらに、水生プランクトンであるアルテミアの孵化直前の耐久卵から水抽出した活性エキス（アルテミアエキス）成分が、ヒト皮膚細胞においてＨＳＰ７０の発現を誘発することが見出されている。そこで、アルテミアエキス成分を含有する抗皮膚ストレス（ストレス防御）用化粧料も提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
また、人の皮膚が紫外線を吸収すると、身体を紫外線から守るために、皮膚基底層にあるメラノサイトにおいてメラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼが活性化し、メラニンが産生される。すなわち、メラニンは、皮膚に日光が当たることで産生される色素であり、紫外線を吸収したり散乱したりすることにより、強い紫外線から細胞や皮膚を守る働きを有している。その一方、皮膚のシミの発生は、メラニンの部分的な異常増加が原因であると考えられている。
【０００６】
ここで、ＨＳＰは、紫外線、放射線、及び外的傷害等の外界からのストレスに晒された場合にも、発現が誘導される。これらのストレスは、細胞のタンパク質を変性させ、不溶性沈殿を形成して細胞にダメージを与える。しかし、ＨＳＰの発現により、ストレスによる細胞へのダメージを抑制することが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｒｉｃｋ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｈａｒｔｌ， Ｆ． −Ｕ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２， ３４９−３８４ （１９９３）
【非特許文献２】Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ． ＆ Ｗｅｌｃｈ． Ｗ． Ｊ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ９， ６０１−６３４ （１９９３）
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１２７２９６号公報
【特許文献２】特開２００４−２３８２９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明は、生体内におけるＨＳＰの発現に伴う有利な効果に鑑み、効果的なＨＳＰの発現誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アルニカというキク科の植物、サルビアというシソ科の植物、及びマジョラムというシソ科の植物が、ＨＳＰの発現を誘導することを初めて見出した。そこで、本発明の態様は、アルニカを含有するＨＳＰの発現誘導剤であることを要旨とする。本発明の他の態様は、サルビアを含有するＨＳＰの発現誘導剤であることを要旨とする。また、本発明の他の態様は、マジョラムを含有するＨＳＰの発現誘導剤であることを要旨とする。本発明の態様に係るＨＳＰの発現誘導剤は、例えば、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、及び貼付剤等の皮膚外用剤として提供されてもよい。
【００１１】
本発明の態様に係るＨＳＰの発現誘導剤を人体に内用又は外用することにより、ＨＳＰの発現を誘導し、抗細胞死作用、抗炎症作用、細胞保護作用、及び胃粘膜保護作用等を得ることが可能となる。
【００１２】
さらに、本発明者らは、ＨＳＰの生体防御機能に着目し、その作用を種々検討した結果、ＨＳＰのなかでも、ＨＳＰ７０ファミリー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）が、シミの発生原因とされるメラニンの発現を効果的に抑制し、皮膚美白作用があることを見出した。さらに、アルニカ、サルビア、及びマジョラムは、ＨＳＰ７０の発現を誘導することも見出した。したがって、本発明の態様に係るＨＳＰの発現誘導剤は、メラニンの発現を抑制し、皮膚美白作用をも奏する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、効果的なＨＳＰの発現誘導剤を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の結果を示す図であり、Ｂ１６細胞における熱ショックによるＨＳＰ７０の誘導の結果を示す。
【図２】実施例１の結果を示す図であり、３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ：Ｓｉｇｍａ社）によるメラニン誘導に対する熱ショックの影響を示す。
【図３】実施例１における、熱ショックによる種々のＨＳＰの発現誘導の結果を示す。
【図４】実施例１の結果を示す図であり、ＨＳＰ７０過剰発現株におけるＨＳＰ７０の誘導の結果を示す。
【図５】実施例１の結果を示す図であり、ＩＢＭＸによるメラニン誘導に対するＨＳＰ７０の過剰発現の影響を示す。
【図６】実施例１の結果を示す図であり、ＩＢＭＸによるチロシナーゼの発現誘導に対するＨＳＰ７０の影響を示す。
【図７】実施例１の結果を示す図であり、ＩＢＭＸによるチロシナーゼの発現誘導に対するＨＳＰ７０の影響を示す。
【図８】実施例３に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図９】実施例４に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１０】実施例５に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１１】実施例６に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１２】実施例７に係るチロシナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】実施例８に係るメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１４】実施例９に係るメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１５】実施例１０に係るメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１６】実施例１１に係るチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量の測定結果を示すグラフである。
【図１７】実施例１２に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１８】実施例１３に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１９】実施例１４に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。ここで、本発明の実施の形態に係るＨＳＰの発現誘導剤、メラニン産生抑制剤、皮膚外用剤、及び美白化粧料は、それぞれアルニカ、サルビア、及びマジョラムの少なくとも一つを含有する。アルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有するＨＳＰの発現誘導剤を内用又は外用することにより、アルニカ、サルビア、又はマジョラムによりＨＳＰの発現を誘導される。そのため、抗細胞死作用、抗炎症作用、細胞保護作用、及び胃粘膜保護作用等を得ることが可能となる。また、アルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有するメラニン産生抑制剤を内用又は外用することにより、ＨＳＰの発現が誘導され、発現したＨＳＰによってチロシナーゼの発現が抑制される。チロシナーゼの活性は、メラニンの発現に関与しているため、チロシナーゼの発現を抑制することにより、メラニンの発現をも抑制することが可能となる。さらにアルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有する美白化粧料を内用又は外用することにより、メラニンの発現が抑制され、結果として美白作用がもたらされる。
【００１６】
本発明者らは、ＨＳＰ７０が、メラニンの発現に関与するチロシナーゼの働きを抑制し、その結果、メラニンの発現が抑制されることを見出した。その結果、美白作用を効果的に得ることが可能となる。
【００１７】
実施の形態に係るＨＳＰの発現誘導剤、メラニン産生抑制剤、皮膚外用剤、及び美白化粧料に含有されるアルニカ、サルビア、又はマジョラムは、抽出物であることが好ましい。アルニカ、サルビア、又はマジョラムの抽出物の調製は、植物の抽出分画を得る一般的な方法を採用することができ、その抽出方法は特に限定されない。また、抽出に際してアルニカ、サルビア、又はマジョラムはそのまま粉砕して用いてもよく、また、乾燥品を粉砕して用いることができる。抽出に使用する抽出溶媒は、これらに限定されないが、水、あるいは適当な有機溶媒を用いて抽出することができる。抽出したアルニカ、サルビア、又はマジョラムの抽出液は、そのまま使用してもよく、また効果を高めるために濃縮して用いることもでき、さらに得られた濃縮液を凍結乾燥し、粉末状のものを使用することもできる。
【００１８】
実施の形態に係るアルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有する皮膚外用剤は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、粉末剤、顆粒剤、及び貼付剤等の剤型をとることができる。また、皮膚外用剤は、必要に応じて薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物を含有し得る。添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤、並びに湿潤剤など、一般的に皮膚外用剤の調製に使用されるものが使用可能である。
【００１９】
実施の形態に係る化粧料は、具体的には、化粧水、乳液、クリーム、美容液、及びパック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、及びメイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液剤、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、及びチークカラー等のメイクアップ化粧料、並びにハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、及びボディローション等の形態をとり得る。実施の形態に係る皮膚外用剤及び美白化粧料のそれぞれは、アルニカ、サルビア、又はマジョラムを有機又は無機の担体と共に含有していてもよい。担体としては、乳糖、でんぷん等の賦形剤、並びに植物性又は動物性の脂肪や油脂等が使用可能である。担体に対するアルニカの重量比率は、例えば０．０１〜１００重量％であるが、これに限定されない。
【００２０】
また、実施の形態に係る美白化粧料におけるアルニカ、サルビア、又はマジョラムの配合量は、シミの予防・改善の目的、用いる人の性別、体重、年齢、剤型、シミの種類や程度、使用部位、使用回数などの種々の条件により決定される。例えば、皮膚に塗布する場合には、０．１μｇ〜１０ｍｇ（アルニカ活性成分乾燥重量）／ｋｇ／日で、一日１回から数回に分けて適用することができるが、使用量はこの範囲に限定されるものではない。
【００２１】
実施の形態に係る美白化粧料を内用又は外用することにより、メラニンの発現を抑制することが可能となり、その結果、シミの予防・改善作用をもたらすことが可能となる。実施の形態に係る美白化粧料は、紫外線による直接的な肌への刺激、或いは心身ストレス、ホルモンバランス等の異常に起因するシミなどの発生を抑制することも可能である。
【実施例】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を、ＨＳＰ７０の発現の誘導、それによるメラニン産生抑制等の作用を説明しながら、より詳細に説明していく。
【００２３】
なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の実施の形態の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１：細胞培養法におけるＨＳＰ７０の効果の確認）
＜細胞培養法及びＨＳＰ過剰発現株の作成＞
マウスメラノーマ由来のＢ１６細胞（理研バイオリソースセンター）を、ＤＭＥＭ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、５％炭酸ガス雰囲気下３７℃で培養した。次に、リポフェクタミン（ＴＭ２０００：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｕｍａｎ ＨＳＰ７０、又はｐｃＤＮＡ３．１をＢ１６細胞に導入した後、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、Ｇ４１８耐性クローンであるＨＳＰ７０過剰発現株を選択した。また、ＨＳＰ７０の発現は、イムノブロット法により調べた。
【００２５】
＜薬剤添加法、及び熱ショック処理法＞
メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸをＤＭＳＯに溶解した。次に、ＩＢＭＸをＤＭＥＭ培地に１００μｍｏｌ／Ｌで希釈した後、培地交換を行い、５％炭酸ガス雰囲気下３７℃で各時間、Ｂ１６細胞を培養した。熱ショック処理は、５％炭酸ガス雰囲気下４２℃にて１時間、Ｂ１６細胞を培養することにより行った。さらに５％炭酸ガス雰囲気下３７℃で６時間、Ｂ１６細胞を培養した後、Ｂ１６細胞を実験に用いた。
【００２６】
＜イムノブロット法＞
熱ショックを１時間行い、更に６時間培養した後、又はＩＢＭＸ １００μｍｏｌ／Ｌ存在下、４８時間培養した後、細胞を遠心して回収した。次に、回収物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， ２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4， ４．３ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＰＯ4）で洗った後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ ［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．２）， １５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， １％ ＮＰ−４０， １％ Ｓｏｄｉｕｍ， ｄｅｏｘｙｃｏｌａｔｅ， ０．０５％ ＳＤＳ］に溶解し、遠心後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。
【００２７】
各サンプルのタンパク質量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （ｂｒａｄｆｏｒｄ法:Ｂｉｏ Ｒａｄ社）により求め、同量のタンパク質量に揃えた後、実験に使用した。サンプルはポリアクリルアミドを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。その後、１次抗体 （ａｇａｉｎｓｔ ＨＳＰ７０、ＨＳＰ２５、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ９０ （Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社）、 １：１０００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ、 ａｇａｉｎｓｔ ａｃｔｉｎ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、 １：１０００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）、及び２次抗体で免疫ブロットし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＤｕｒａ（化学発光法：Ｐｉｅｒｃｅ社）により目的のバンドをＬＡＳ−３０００ ｍｉｎｉを用いて検出した。
【００２８】
＜メラニン定量法＞
ＩＢＭＸ １００μｍｏｌ／Ｌ存在下、７２時間培養した後、細胞を遠心して回収しＰＢＳで洗った後、１Ｎ ＮａＯＨに溶解し、１００℃／３０分加熱した。遠心後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。各サンプルのタンパク質量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔにより求め、同量のタンパク質量に揃えた後、４９０ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ社）により測定した。
【００２９】
＜Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法＞
ＩＢＭＸ １００μｍｏｌ／Ｌ存在下、４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡ ２．５μｇを、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ社）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは、ｉＱ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲに利用し、Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分、９０℃で１０分の後に、９５℃で３０秒、６３℃で６０秒のサイクルを、４５サイクルという条件で行った。特異性は、反応生成物をテンプレート（−）及び逆転写（−）のコントロールと一緒にアガロースゲル電気泳動を行って確認した。それぞれの反応において、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準として用いた。
【００３０】
プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ ｗｗｗ．ｃｇｉ）により設計した。プライマーの配列を以下に記載する。
【００３１】
Tyrosinase 5'-ctcctggcagatcatttgt-3' 5'-ggttttggctttgtcatggt-3'
GAPDH 5'-aactttggcattgtggaagg-3' 5'-acacattgggggtaggaaca-'
【００３２】
＜統計学的的解析＞
以下の実施例を含め、すべての値は、平均値±標準偏差［ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ （ＳＤ）］で示している。有意差検定は、Ｔｕｋｅｙ'ｓ ｔｅｓｔを用い
た。ｐの値が０．０５未満になったとき有意な差があると判定した。
【００３３】
＜結果＞
その結果を、図１乃至図７に示す。
図１は、Ｂ１６細胞の熱ショックによるＨＳＰ７０の発現誘導を示す結果であり、図２は、ＩＢＭＸによるメラニン産生誘導に対する熱ショックの影響を示す結果である。
図１及び図２に示す結果から判明するように、熱ショックによりＨＳＰ７０が発現誘導されており、ＩＢＭＸによるメラニンの産生誘導の抑制にＨＳＰ７０が関与していることが示された。
【００３４】
図３は、熱ショックによる種々のＨＳＰの発現誘導を示す結果である。熱ショックにより、ＨＳＰ７０だけでなく、ＨＳＰ２５等も発現誘導されていることが判明した。
【００３５】
図４は、ＨＳＰ７０過剰発現株におけるＨＳＰ７０の誘導を示す結果である。図５は、ＨＳＰ７０過剰発現株におけるＩＢＭＸによるメラニン誘導に対するＨＳＰ７０の影響を示す結果である。
以上の図１〜図５に示す結果から、ＨＳＰ７０過剰発現株においても同様にＩＢＭＸによるメラニンの発現誘導が抑制されることが見られ、特に図４及び図５の結果からは、ＨＳＰ７０が単独でも、ＩＢＭＸによるメラニンの発現誘導を抑制することに関与していることが示された。
【００３６】
図６乃至図７は、ＨＳＰ７０過剰発現株において、ＩＢＭＸによるチロシナーゼのタンパク質の発現誘導、及びチロシナーゼｍＲＮＡの発現誘導が抑制されたことを示す。
図６は、チロシナーゼのタンパク質の発現結果を、図７は、チロシナーゼのｍＲＮＡの発現結果を示すものである。
図中に示す結果より、ＩＢＭＸによるチロシナーゼの発現誘導をＨＳＰ７０が抑制することが示された。すなわち、ＨＳＰ７０は、チロシナーゼの発現を抑制することで、メラニンの産生を抑制していることが示された。
【００３７】
以上の実施例１の結果から、ＨＳＰ７０の発現誘導が、メラニンの産生を抑制することが確認された。そこで、アルニカ、サルビア、及びマジョラムがＨＳＰ７０の合成を誘導するか否か、以下の実施例２以降で検討した。
【００３８】
（実施例２：アルニカ抽出物、サルビア抽出物、及びマジョラム抽出物の調製）
ＨＳＰ７０発現誘導剤を構成するアルニカ抽出物は、以下のように調整した。まず、生のアルニカ（丸善製薬）を粉砕した後、凍結乾燥し、ミキサーでさらに粉砕した。なお、乾燥したアルニカを用意した場合は、アルニカを水に戻した後、アルニカをミキサーにより粉砕した。その後、粉砕したアルニカを凍結乾燥し、ミキサーでさらに粉砕した。次に、凍結乾燥した粉砕物にエタノールを加え、３時間抽出し、濾過して濾液を得た。その後、濾液を乾燥状態になるまで濃縮し、アルニカ抽出物を得た。サルビア抽出物及びマジョラム抽出物も、同様の方法により得た。
【００３９】
（実施例３：アルニカ抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６（理研バイオリソースセンター）を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、濃度２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに１２時間又は２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、１２時間又は２４時間培養した。
【００４０】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、図８に示すように、１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。１２時間培養した場合と、２４時間培養した場合とで、有意な差は認められなかった。
【００４１】
これに対し、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。なお、アルニカ抽出物の濃度が７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ以下の場合も、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のアルニカ抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００４２】
（実施例４：アルニカ抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個又は２４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、濃度５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は２０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００４３】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種した場合は、図９に示すように、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。また、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ及び１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液からも、ＨＳＰ７０のバンドが確認された。
【００４４】
２４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種した場合は、２０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。また、１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液からも、ＨＳＰ７０のバンドが確認された。
【００４５】
これに対し、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。なお、２４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種した場合、アルニカ抽出物の濃度が７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ以下であると、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のアルニカ抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００４６】
（実施例５：サルビア抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たサルビア抽出物を、濃度５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、８０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１００×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００４７】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、図１０に示すように、８０×１０-2ｍｇ／ｍＬ以上のサルビア抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。
【００４８】
これに対し、サルビア抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のサルビア抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００４９】
（実施例６：マジョラム抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たマジョラム抽出物を、濃度４０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、６０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は７０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５０】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、図１１に示すように、６０×１０-2ｍｇ／ｍＬ以上のマジョラム抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。
【００５１】
これに対し、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のマジョラム抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００５２】
（実施例７：アルニカ抽出物によるチロシナーゼ活性の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５３】
さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。細胞を回収し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ社）含有ＰＢＳ１００μＬでサスペンドした後、３０分間超音波処理した。基質となるＬ−ＤＯＰＡ２００μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに添加し、あらかじめ３７度に保温しておいた。サンプルのタンパク質量をBｒａｄｆｏｒｄ法により求め、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００含有ＰＢＳでタンパク濃度１００μｇ／５０μＬに調整した後、保温しておいたＬ−ＤＯＰＡに５０μＬ添加し、３７度で１時間定温放置しながら４９０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。ここで、図１２に示すように、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のチロシナーゼ活性を１００％とすると、アルニカ抽出物を添加せず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のチロシナーゼ活性は約３８０％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてアルニカ抽出物を添加した場合のチロシナーゼ活性は、アルニカ抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、アルニカ抽出物にチロシナーゼ活性の抑制能があることが示された。
【００５４】
（実施例８：アルニカ抽出物によるメラニン発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５５】
また、アルニカ抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、７２時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、７２時間培養した。
【００５６】
その後、実施例１と同様の方法により、メラニンの発現量を測定した。ここで、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のメラニン量を１００％とすると、図１３に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、アルニカ抽出物を添加した場合のメラニン量は、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸの両方を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００５７】
また、アルニカ抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のメラニンの発現量は約１７０％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてアルニカ抽出物を添加した場合のメラニン量は、アルニカ抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、アルニカ抽出物に、メラニン発現の抑制能があることが示された。
【００５８】
（実施例９：サルビア抽出物によるメラニン発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たサルビア抽出物を、２５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１００×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５９】
また、サルビア抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、７２時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、７２時間培養した。
【００６０】
その後、実施例１と同様の方法によりに、メラニンの発現量を測定した。ここで、サルビア抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のメラニン量を１００％とすると、図１４に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、サルビア抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、サルビア抽出物及びＩＢＭＸの両方を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００６１】
また、サルビア抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のメラニンの発現量は約１７０％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてサルビア抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、サルビア抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、サルビア抽出物に、メラニン発現の抑制能があることが示された。
【００６２】
（実施例１０：マジョラム抽出物によるメラニン発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たマジョラム抽出物を、１０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、２０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、３０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は５０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００６３】
また、マジョラム抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、７２時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、７２時間培養した。
【００６４】
その後、実施例１と同様の方法によりに、メラニンの発現量を測定した。ここで、マジョラム抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のメラニンの発現量を１００％とすると、図１５に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、マジョラム抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、マジョラム抽出物及びＩＢＭＸの両方を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００６５】
また、マジョラム抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のメラニンの発現量は約１７５％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてマジョラム抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、マジョラム抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、マジョラム抽出物に、メラニン発現の抑制能があることが示された。
【００６６】
（実施例１１：アルニカ抽出物によるチロシナーゼｍＲＮＡ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００６７】
アルニカ抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、２４時間培養した。その後、ｍＲＮＡを抽出し、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量を１とすると、図１６に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ及び１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量は、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合と比較して、わずかに低下した。
【００６８】
また、アルニカ抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量は約２．０近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてアルニカ抽出物を添加した場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量は、アルニカ抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００６９】
（実施例１２：アルニカ抽出物によるチロシナーゼ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、濃度１．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００７０】
次に、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。その後、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗チロシナーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロット法により成熟型チロシナーゼ及び未成熟型チロシナーゼの発現量を測定した。その結果、図１７に示すように、アルニカ抽出物の未成熟型チロシナーゼの発現量への影響は確認されなかったものの、添加したアルニカ抽出物の濃度が上昇するにつれて、成熟型チロシナーゼの発現量が低下したことが示された。よって、アルニカ抽出物は、成熟型チロシナーゼの発現を抑制することが示された。
【００７１】
（実施例１３：サルビア抽出物によるチロシナーゼ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たサルビア抽出物を、濃度２５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１００×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００７２】
次に、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。その後、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗チロシナーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロット法により成熟型チロシナーゼ及び未成熟型チロシナーゼの発現量を測定した。その結果、図１８に示すように、サルビア抽出物の未成熟型チロシナーゼの発現量への影響は確認されなかったものの、添加したサルビア抽出物の濃度が上昇するにつれて、成熟型チロシナーゼの発現量が低下したことが示された。よって、サルビア抽出物は、成熟型チロシナーゼの発現を抑制することが示された。
【００７３】
（実施例１４：マジョラム抽出物によるチロシナーゼ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たマジョラム抽出物を、濃度１０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、２０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、３０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は５０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００７４】
次に、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。その後、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗チロシナーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロット法により成熟型チロシナーゼ及び未成熟型チロシナーゼの発現量を測定した。その結果、図１９に示すように、マジョラム抽出物の未成熟型チロシナーゼの発現量への影響は確認されなかったものの、添加したマジョラム抽出物の濃度が上昇するにつれて、成熟型チロシナーゼの発現量が低下したことが示された。よって、マジョラム抽出物は、成熟型チロシナーゼの発現を抑制することが示された。
【００７５】
（実施例１５：皮膚外用剤）
以下の処方により、皮膚外用剤（クリーム剤）を得た。
スクワラン ２０重量％
ミツロウ ５
精製ホホバ油 ５
グリセリンモノステアレート ２
ソルビタンモノステアレート ２
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２
グリセリン ５
アルニカ抽出物 １
精製水 １００とする残部
【００７６】
（実施例１６：美白化粧料）
（１）ローション
以下の処方により、ローションを得た。
ソルビット ２重量％
１，３−ブチレングリコール ２
ポリエチレングリコール１０００ １
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２５ＥＯ） ２
エタノール １０
テプレノン １
防腐剤 適量
精製水 １００とする残部
【００７７】
（２）乳液
以下の処方により、乳液を得た。
スクワラン １重量％
グリセリン １
ステアリルアルコール ０．３
ソルビタンモノステアレート １．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２
１，３−ブチレングリコール ５
アルニカ抽出物 １
精製水 １００とする残部
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の実施の形態に係る熱ショックタンパク質の発現誘導剤は、ＨＳＰ７０ファミリーの発現を誘導し、抗細胞死作用、抗炎症作用、細胞保護作用、及び胃粘膜保護作用等をもたらす。また、本発明の実施の形態に係る熱ショックタンパク質の発現誘導剤は、ＨＳＰ７０ファミリーの発現を誘導し、紫外線による直接的な肌への刺激、或いは心身ストレス、ホルモンバランス等の異常に起因するシミなどの発生に対処可能である。そのため、本発明の実施の形態に係る熱ショックタンパク質の発現誘導剤は、医薬品産業及び化粧品産業に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生命工学に係り、熱ショックタンパク質の発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の細胞、組織、あるいは器官が、一般的な生理的温度より３℃以上高い温度に晒されると、生体の防御システムの一つとして、一群の特異的タンパク質が発現することが知られている。これら一群の特異的タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって測定した場合、１０〜１１０ＫＤａの分子量を有し、熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、以下、「ＨＳＰ」と称する場合もある。）と呼ばれる。
【０００３】
ＨＳＰは、分子量の相違により、ＨＳＰ９０ファミリー（分子量：９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下）、ＨＳＰ７０ファミリー（分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）、ＨＳＰ６０ファミリー（分子量：６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満）、及び低分子量ＨＳＰファミリー（分子量：６０ｋＤａ未満）に分類されている。
【０００４】
ＨＳＰの機能は多岐にわたる。例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０ファミリーは、変性タンパク質に結合して、変性タンパク質を天然のフォールディング（高次構造・折り畳み構造）に巻き戻す作用や、第三のタンパク質や核酸との会合、細胞内での局在化や膜透過への関与など、いわゆる分子シャペロンと呼ばれる機能を担っている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照。）。そこで、ＨＳＰの発現を誘導する生薬抽出物を含有する熱ショックタンパク質誘導剤が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。さらに、水生プランクトンであるアルテミアの孵化直前の耐久卵から水抽出した活性エキス（アルテミアエキス）成分が、ヒト皮膚細胞においてＨＳＰ７０の発現を誘発することが見出されている。そこで、アルテミアエキス成分を含有する抗皮膚ストレス（ストレス防御）用化粧料も提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
また、人の皮膚が紫外線を吸収すると、身体を紫外線から守るために、皮膚基底層にあるメラノサイトにおいてメラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼが活性化し、メラニンが産生される。すなわち、メラニンは、皮膚に日光が当たることで産生される色素であり、紫外線を吸収したり散乱したりすることにより、強い紫外線から細胞や皮膚を守る働きを有している。その一方、皮膚のシミの発生は、メラニンの部分的な異常増加が原因であると考えられている。
【０００６】
ここで、ＨＳＰは、紫外線、放射線、及び外的傷害等の外界からのストレスに晒された場合にも、発現が誘導される。これらのストレスは、細胞のタンパク質を変性させ、不溶性沈殿を形成して細胞にダメージを与える。しかし、ＨＳＰの発現により、ストレスによる細胞へのダメージを抑制することが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｒｉｃｋ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｈａｒｔｌ， Ｆ． −Ｕ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２， ３４９−３８４ （１９９３）
【非特許文献２】Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ． ＆ Ｗｅｌｃｈ． Ｗ． Ｊ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ９， ６０１−６３４ （１９９３）
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１２７２９６号公報
【特許文献２】特開２００４−２３８２９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明は、生体内におけるＨＳＰの発現に伴う有利な効果に鑑み、効果的なＨＳＰの発現誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アルニカというキク科の植物、サルビアというシソ科の植物、及びマジョラムというシソ科の植物が、ＨＳＰの発現を誘導することを初めて見出した。そこで、本発明の態様は、アルニカを含有するＨＳＰの発現誘導剤であることを要旨とする。本発明の他の態様は、サルビアを含有するＨＳＰの発現誘導剤であることを要旨とする。また、本発明の他の態様は、マジョラムを含有するＨＳＰの発現誘導剤であることを要旨とする。本発明の態様に係るＨＳＰの発現誘導剤は、例えば、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、及び貼付剤等の皮膚外用剤として提供されてもよい。
【００１１】
本発明の態様に係るＨＳＰの発現誘導剤を人体に内用又は外用することにより、ＨＳＰの発現を誘導し、抗細胞死作用、抗炎症作用、細胞保護作用、及び胃粘膜保護作用等を得ることが可能となる。
【００１２】
さらに、本発明者らは、ＨＳＰの生体防御機能に着目し、その作用を種々検討した結果、ＨＳＰのなかでも、ＨＳＰ７０ファミリー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）が、シミの発生原因とされるメラニンの発現を効果的に抑制し、皮膚美白作用があることを見出した。さらに、アルニカ、サルビア、及びマジョラムは、ＨＳＰ７０の発現を誘導することも見出した。したがって、本発明の態様に係るＨＳＰの発現誘導剤は、メラニンの発現を抑制し、皮膚美白作用をも奏する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、効果的なＨＳＰの発現誘導剤を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の結果を示す図であり、Ｂ１６細胞における熱ショックによるＨＳＰ７０の誘導の結果を示す。
【図２】実施例１の結果を示す図であり、３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ：Ｓｉｇｍａ社）によるメラニン誘導に対する熱ショックの影響を示す。
【図３】実施例１における、熱ショックによる種々のＨＳＰの発現誘導の結果を示す。
【図４】実施例１の結果を示す図であり、ＨＳＰ７０過剰発現株におけるＨＳＰ７０の誘導の結果を示す。
【図５】実施例１の結果を示す図であり、ＩＢＭＸによるメラニン誘導に対するＨＳＰ７０の過剰発現の影響を示す。
【図６】実施例１の結果を示す図であり、ＩＢＭＸによるチロシナーゼの発現誘導に対するＨＳＰ７０の影響を示す。
【図７】実施例１の結果を示す図であり、ＩＢＭＸによるチロシナーゼの発現誘導に対するＨＳＰ７０の影響を示す。
【図８】実施例３に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図９】実施例４に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１０】実施例５に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１１】実施例６に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１２】実施例７に係るチロシナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】実施例８に係るメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１４】実施例９に係るメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１５】実施例１０に係るメラニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１６】実施例１１に係るチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量の測定結果を示すグラフである。
【図１７】実施例１２に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１８】実施例１３に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図１９】実施例１４に係るウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。ここで、本発明の実施の形態に係るＨＳＰの発現誘導剤、メラニン産生抑制剤、皮膚外用剤、及び美白化粧料は、それぞれアルニカ、サルビア、及びマジョラムの少なくとも一つを含有する。アルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有するＨＳＰの発現誘導剤を内用又は外用することにより、アルニカ、サルビア、又はマジョラムによりＨＳＰの発現を誘導される。そのため、抗細胞死作用、抗炎症作用、細胞保護作用、及び胃粘膜保護作用等を得ることが可能となる。また、アルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有するメラニン産生抑制剤を内用又は外用することにより、ＨＳＰの発現が誘導され、発現したＨＳＰによってチロシナーゼの発現が抑制される。チロシナーゼの活性は、メラニンの発現に関与しているため、チロシナーゼの発現を抑制することにより、メラニンの発現をも抑制することが可能となる。さらにアルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有する美白化粧料を内用又は外用することにより、メラニンの発現が抑制され、結果として美白作用がもたらされる。
【００１６】
本発明者らは、ＨＳＰ７０が、メラニンの発現に関与するチロシナーゼの働きを抑制し、その結果、メラニンの発現が抑制されることを見出した。その結果、美白作用を効果的に得ることが可能となる。
【００１７】
実施の形態に係るＨＳＰの発現誘導剤、メラニン産生抑制剤、皮膚外用剤、及び美白化粧料に含有されるアルニカ、サルビア、又はマジョラムは、抽出物であることが好ましい。アルニカ、サルビア、又はマジョラムの抽出物の調製は、植物の抽出分画を得る一般的な方法を採用することができ、その抽出方法は特に限定されない。また、抽出に際してアルニカ、サルビア、又はマジョラムはそのまま粉砕して用いてもよく、また、乾燥品を粉砕して用いることができる。抽出に使用する抽出溶媒は、これらに限定されないが、水、あるいは適当な有機溶媒を用いて抽出することができる。抽出したアルニカ、サルビア、又はマジョラムの抽出液は、そのまま使用してもよく、また効果を高めるために濃縮して用いることもでき、さらに得られた濃縮液を凍結乾燥し、粉末状のものを使用することもできる。
【００１８】
実施の形態に係るアルニカ、サルビア、又はマジョラムを含有する皮膚外用剤は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、粉末剤、顆粒剤、及び貼付剤等の剤型をとることができる。また、皮膚外用剤は、必要に応じて薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物を含有し得る。添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤、並びに湿潤剤など、一般的に皮膚外用剤の調製に使用されるものが使用可能である。
【００１９】
実施の形態に係る化粧料は、具体的には、化粧水、乳液、クリーム、美容液、及びパック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、及びメイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液剤、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、及びチークカラー等のメイクアップ化粧料、並びにハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、及びボディローション等の形態をとり得る。実施の形態に係る皮膚外用剤及び美白化粧料のそれぞれは、アルニカ、サルビア、又はマジョラムを有機又は無機の担体と共に含有していてもよい。担体としては、乳糖、でんぷん等の賦形剤、並びに植物性又は動物性の脂肪や油脂等が使用可能である。担体に対するアルニカの重量比率は、例えば０．０１〜１００重量％であるが、これに限定されない。
【００２０】
また、実施の形態に係る美白化粧料におけるアルニカ、サルビア、又はマジョラムの配合量は、シミの予防・改善の目的、用いる人の性別、体重、年齢、剤型、シミの種類や程度、使用部位、使用回数などの種々の条件により決定される。例えば、皮膚に塗布する場合には、０．１μｇ〜１０ｍｇ（アルニカ活性成分乾燥重量）／ｋｇ／日で、一日１回から数回に分けて適用することができるが、使用量はこの範囲に限定されるものではない。
【００２１】
実施の形態に係る美白化粧料を内用又は外用することにより、メラニンの発現を抑制することが可能となり、その結果、シミの予防・改善作用をもたらすことが可能となる。実施の形態に係る美白化粧料は、紫外線による直接的な肌への刺激、或いは心身ストレス、ホルモンバランス等の異常に起因するシミなどの発生を抑制することも可能である。
【実施例】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を、ＨＳＰ７０の発現の誘導、それによるメラニン産生抑制等の作用を説明しながら、より詳細に説明していく。
【００２３】
なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の実施の形態の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１：細胞培養法におけるＨＳＰ７０の効果の確認）
＜細胞培養法及びＨＳＰ過剰発現株の作成＞
マウスメラノーマ由来のＢ１６細胞（理研バイオリソースセンター）を、ＤＭＥＭ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、５％炭酸ガス雰囲気下３７℃で培養した。次に、リポフェクタミン（ＴＭ２０００：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｕｍａｎ ＨＳＰ７０、又はｐｃＤＮＡ３．１をＢ１６細胞に導入した後、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、Ｇ４１８耐性クローンであるＨＳＰ７０過剰発現株を選択した。また、ＨＳＰ７０の発現は、イムノブロット法により調べた。
【００２５】
＜薬剤添加法、及び熱ショック処理法＞
メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸをＤＭＳＯに溶解した。次に、ＩＢＭＸをＤＭＥＭ培地に１００μｍｏｌ／Ｌで希釈した後、培地交換を行い、５％炭酸ガス雰囲気下３７℃で各時間、Ｂ１６細胞を培養した。熱ショック処理は、５％炭酸ガス雰囲気下４２℃にて１時間、Ｂ１６細胞を培養することにより行った。さらに５％炭酸ガス雰囲気下３７℃で６時間、Ｂ１６細胞を培養した後、Ｂ１６細胞を実験に用いた。
【００２６】
＜イムノブロット法＞
熱ショックを１時間行い、更に６時間培養した後、又はＩＢＭＸ １００μｍｏｌ／Ｌ存在下、４８時間培養した後、細胞を遠心して回収した。次に、回収物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， ２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4， ４．３ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＰＯ4）で洗った後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ ［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．２）， １５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， １％ ＮＰ−４０， １％ Ｓｏｄｉｕｍ， ｄｅｏｘｙｃｏｌａｔｅ， ０．０５％ ＳＤＳ］に溶解し、遠心後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。
【００２７】
各サンプルのタンパク質量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （ｂｒａｄｆｏｒｄ法:Ｂｉｏ Ｒａｄ社）により求め、同量のタンパク質量に揃えた後、実験に使用した。サンプルはポリアクリルアミドを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。その後、１次抗体 （ａｇａｉｎｓｔ ＨＳＰ７０、ＨＳＰ２５、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ９０ （Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社）、 １：１０００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ、 ａｇａｉｎｓｔ ａｃｔｉｎ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、 １：１０００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）、及び２次抗体で免疫ブロットし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＤｕｒａ（化学発光法：Ｐｉｅｒｃｅ社）により目的のバンドをＬＡＳ−３０００ ｍｉｎｉを用いて検出した。
【００２８】
＜メラニン定量法＞
ＩＢＭＸ １００μｍｏｌ／Ｌ存在下、７２時間培養した後、細胞を遠心して回収しＰＢＳで洗った後、１Ｎ ＮａＯＨに溶解し、１００℃／３０分加熱した。遠心後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。各サンプルのタンパク質量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔにより求め、同量のタンパク質量に揃えた後、４９０ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ社）により測定した。
【００２９】
＜Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法＞
ＩＢＭＸ １００μｍｏｌ／Ｌ存在下、４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡ ２．５μｇを、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ社）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは、ｉＱ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲに利用し、Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分、９０℃で１０分の後に、９５℃で３０秒、６３℃で６０秒のサイクルを、４５サイクルという条件で行った。特異性は、反応生成物をテンプレート（−）及び逆転写（−）のコントロールと一緒にアガロースゲル電気泳動を行って確認した。それぞれの反応において、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準として用いた。
【００３０】
プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ ｗｗｗ．ｃｇｉ）により設計した。プライマーの配列を以下に記載する。
【００３１】
Tyrosinase 5'-ctcctggcagatcatttgt-3' 5'-ggttttggctttgtcatggt-3'
GAPDH 5'-aactttggcattgtggaagg-3' 5'-acacattgggggtaggaaca-'
【００３２】
＜統計学的的解析＞
以下の実施例を含め、すべての値は、平均値±標準偏差［ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ （ＳＤ）］で示している。有意差検定は、Ｔｕｋｅｙ'ｓ ｔｅｓｔを用い
た。ｐの値が０．０５未満になったとき有意な差があると判定した。
【００３３】
＜結果＞
その結果を、図１乃至図７に示す。
図１は、Ｂ１６細胞の熱ショックによるＨＳＰ７０の発現誘導を示す結果であり、図２は、ＩＢＭＸによるメラニン産生誘導に対する熱ショックの影響を示す結果である。
図１及び図２に示す結果から判明するように、熱ショックによりＨＳＰ７０が発現誘導されており、ＩＢＭＸによるメラニンの産生誘導の抑制にＨＳＰ７０が関与していることが示された。
【００３４】
図３は、熱ショックによる種々のＨＳＰの発現誘導を示す結果である。熱ショックにより、ＨＳＰ７０だけでなく、ＨＳＰ２５等も発現誘導されていることが判明した。
【００３５】
図４は、ＨＳＰ７０過剰発現株におけるＨＳＰ７０の誘導を示す結果である。図５は、ＨＳＰ７０過剰発現株におけるＩＢＭＸによるメラニン誘導に対するＨＳＰ７０の影響を示す結果である。
以上の図１〜図５に示す結果から、ＨＳＰ７０過剰発現株においても同様にＩＢＭＸによるメラニンの発現誘導が抑制されることが見られ、特に図４及び図５の結果からは、ＨＳＰ７０が単独でも、ＩＢＭＸによるメラニンの発現誘導を抑制することに関与していることが示された。
【００３６】
図６乃至図７は、ＨＳＰ７０過剰発現株において、ＩＢＭＸによるチロシナーゼのタンパク質の発現誘導、及びチロシナーゼｍＲＮＡの発現誘導が抑制されたことを示す。
図６は、チロシナーゼのタンパク質の発現結果を、図７は、チロシナーゼのｍＲＮＡの発現結果を示すものである。
図中に示す結果より、ＩＢＭＸによるチロシナーゼの発現誘導をＨＳＰ７０が抑制することが示された。すなわち、ＨＳＰ７０は、チロシナーゼの発現を抑制することで、メラニンの産生を抑制していることが示された。
【００３７】
以上の実施例１の結果から、ＨＳＰ７０の発現誘導が、メラニンの産生を抑制することが確認された。そこで、アルニカ、サルビア、及びマジョラムがＨＳＰ７０の合成を誘導するか否か、以下の実施例２以降で検討した。
【００３８】
（実施例２：アルニカ抽出物、サルビア抽出物、及びマジョラム抽出物の調製）
ＨＳＰ７０発現誘導剤を構成するアルニカ抽出物は、以下のように調整した。まず、生のアルニカ（丸善製薬）を粉砕した後、凍結乾燥し、ミキサーでさらに粉砕した。なお、乾燥したアルニカを用意した場合は、アルニカを水に戻した後、アルニカをミキサーにより粉砕した。その後、粉砕したアルニカを凍結乾燥し、ミキサーでさらに粉砕した。次に、凍結乾燥した粉砕物にエタノールを加え、３時間抽出し、濾過して濾液を得た。その後、濾液を乾燥状態になるまで濃縮し、アルニカ抽出物を得た。サルビア抽出物及びマジョラム抽出物も、同様の方法により得た。
【００３９】
（実施例３：アルニカ抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６（理研バイオリソースセンター）を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、濃度２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに１２時間又は２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、１２時間又は２４時間培養した。
【００４０】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、図８に示すように、１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。１２時間培養した場合と、２４時間培養した場合とで、有意な差は認められなかった。
【００４１】
これに対し、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。なお、アルニカ抽出物の濃度が７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ以下の場合も、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のアルニカ抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００４２】
（実施例４：アルニカ抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個又は２４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、濃度５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は２０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００４３】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種した場合は、図９に示すように、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。また、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ及び１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液からも、ＨＳＰ７０のバンドが確認された。
【００４４】
２４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種した場合は、２０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。また、１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した細胞培養液からも、ＨＳＰ７０のバンドが確認された。
【００４５】
これに対し、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。なお、２４×１０5個の表皮細胞ＰＡＭ２１２を播種した場合、アルニカ抽出物の濃度が７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ以下であると、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のアルニカ抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００４６】
（実施例５：サルビア抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たサルビア抽出物を、濃度５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、８０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１００×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００４７】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、図１０に示すように、８０×１０-2ｍｇ／ｍＬ以上のサルビア抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。
【００４８】
これに対し、サルビア抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のサルビア抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００４９】
（実施例６：マジョラム抽出物によるＨＳＰ７０発現誘導の確認）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たマジョラム抽出物を、濃度４０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、６０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は７０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５０】
次に、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタン・ブロット法によりＨＳＰ７０の発現量を測定した。その結果、図１１に示すように、６０×１０-2ｍｇ／ｍＬ以上のマジョラム抽出物を添加した細胞培養液から、ＨＳＰ７０のバンドが明確に確認された。
【００５１】
これに対し、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞培養液からは、ＨＳＰ７０のバンドは確認されなかった。したがって、適切な濃度のマジョラム抽出物は、ＨＳＰ７０の誘導発現作用を有することが示された。
【００５２】
（実施例７：アルニカ抽出物によるチロシナーゼ活性の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５３】
さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。細胞を回収し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ社）含有ＰＢＳ１００μＬでサスペンドした後、３０分間超音波処理した。基質となるＬ−ＤＯＰＡ２００μＬを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに添加し、あらかじめ３７度に保温しておいた。サンプルのタンパク質量をBｒａｄｆｏｒｄ法により求め、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００含有ＰＢＳでタンパク濃度１００μｇ／５０μＬに調整した後、保温しておいたＬ−ＤＯＰＡに５０μＬ添加し、３７度で１時間定温放置しながら４９０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。ここで、図１２に示すように、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のチロシナーゼ活性を１００％とすると、アルニカ抽出物を添加せず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のチロシナーゼ活性は約３８０％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてアルニカ抽出物を添加した場合のチロシナーゼ活性は、アルニカ抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、アルニカ抽出物にチロシナーゼ活性の抑制能があることが示された。
【００５４】
（実施例８：アルニカ抽出物によるメラニン発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５５】
また、アルニカ抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、７２時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、７２時間培養した。
【００５６】
その後、実施例１と同様の方法により、メラニンの発現量を測定した。ここで、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のメラニン量を１００％とすると、図１３に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、アルニカ抽出物を添加した場合のメラニン量は、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸの両方を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００５７】
また、アルニカ抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のメラニンの発現量は約１７０％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてアルニカ抽出物を添加した場合のメラニン量は、アルニカ抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、アルニカ抽出物に、メラニン発現の抑制能があることが示された。
【００５８】
（実施例９：サルビア抽出物によるメラニン発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たサルビア抽出物を、２５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１００×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００５９】
また、サルビア抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、７２時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、７２時間培養した。
【００６０】
その後、実施例１と同様の方法によりに、メラニンの発現量を測定した。ここで、サルビア抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のメラニン量を１００％とすると、図１４に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、サルビア抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、サルビア抽出物及びＩＢＭＸの両方を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００６１】
また、サルビア抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のメラニンの発現量は約１７０％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてサルビア抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、サルビア抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、サルビア抽出物に、メラニン発現の抑制能があることが示された。
【００６２】
（実施例１０：マジョラム抽出物によるメラニン発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たマジョラム抽出物を、１０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、２０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、３０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は５０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００６３】
また、マジョラム抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、７２時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、７２時間培養した。
【００６４】
その後、実施例１と同様の方法によりに、メラニンの発現量を測定した。ここで、マジョラム抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のメラニンの発現量を１００％とすると、図１５に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、マジョラム抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、マジョラム抽出物及びＩＢＭＸの両方を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００６５】
また、マジョラム抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のメラニンの発現量は約１７５％近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてマジョラム抽出物を添加した場合のメラニンの発現量は、マジョラム抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。よって、マジョラム抽出物に、メラニン発現の抑制能があることが示された。
【００６６】
（実施例１１：アルニカ抽出物によるチロシナーゼｍＲＮＡ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。次に、培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００６７】
アルニカ抽出物を添加して２４時間培養した後、さらに、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、２４時間培養した。その後、ｍＲＮＡを抽出し、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量を１とすると、図１６に示すように、ＩＢＭＸを添加せず、７．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ及び１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬのアルニカ抽出物を添加した場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量は、アルニカ抽出物及びＩＢＭＸを添加しなかった場合と比較して、わずかに低下した。
【００６８】
また、アルニカ抽出物を加えず、ＩＢＭＸを１００μｍｏｌ／Ｌ添加した場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量は約２．０近くまで上昇した。しかし、ＩＢＭＸに加えてアルニカ抽出物を添加した場合のチロシナーゼｍＲＮＡの相対発現量は、アルニカ抽出物を添加しなかった場合と比較して、顕著に減少した。
【００６９】
（実施例１２：アルニカ抽出物によるチロシナーゼ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たアルニカ抽出物を、濃度１．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、２．５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５．０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００７０】
次に、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。その後、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗チロシナーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロット法により成熟型チロシナーゼ及び未成熟型チロシナーゼの発現量を測定した。その結果、図１７に示すように、アルニカ抽出物の未成熟型チロシナーゼの発現量への影響は確認されなかったものの、添加したアルニカ抽出物の濃度が上昇するにつれて、成熟型チロシナーゼの発現量が低下したことが示された。よって、アルニカ抽出物は、成熟型チロシナーゼの発現を抑制することが示された。
【００７１】
（実施例１３：サルビア抽出物によるチロシナーゼ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たサルビア抽出物を、濃度２５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、５０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、７５×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は１００×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００７２】
次に、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。その後、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗チロシナーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロット法により成熟型チロシナーゼ及び未成熟型チロシナーゼの発現量を測定した。その結果、図１８に示すように、サルビア抽出物の未成熟型チロシナーゼの発現量への影響は確認されなかったものの、添加したサルビア抽出物の濃度が上昇するにつれて、成熟型チロシナーゼの発現量が低下したことが示された。よって、サルビア抽出物は、成熟型チロシナーゼの発現を抑制することが示された。
【００７３】
（実施例１４：マジョラム抽出物によるチロシナーゼ発現の抑制）
培養液を満たした直径１００ｍｍの培養皿に、４×１０5個のメラノーマ細胞Ｂ１６を播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養した。この培養液に、実施例２で得たマジョラム抽出物を、濃度１０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、２０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、３０×１０-2ｍｇ／ｍＬ、又は５０×１０-2ｍｇ／ｍＬで添加し、さらに２４時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、２４時間培養した。
【００７４】
次に、メラニン発現を誘導する作用のあるＩＢＭＸを、濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるよう培養液に添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、ＩＢＭＸを添加しなかった細胞も、４８時間培養した。その後、細胞培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、抗チロシナーゼ抗体を用いたウエスタン・ブロット法により成熟型チロシナーゼ及び未成熟型チロシナーゼの発現量を測定した。その結果、図１９に示すように、マジョラム抽出物の未成熟型チロシナーゼの発現量への影響は確認されなかったものの、添加したマジョラム抽出物の濃度が上昇するにつれて、成熟型チロシナーゼの発現量が低下したことが示された。よって、マジョラム抽出物は、成熟型チロシナーゼの発現を抑制することが示された。
【００７５】
（実施例１５：皮膚外用剤）
以下の処方により、皮膚外用剤（クリーム剤）を得た。
スクワラン ２０重量％
ミツロウ ５
精製ホホバ油 ５
グリセリンモノステアレート ２
ソルビタンモノステアレート ２
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２
グリセリン ５
アルニカ抽出物 １
精製水 １００とする残部
【００７６】
（実施例１６：美白化粧料）
（１）ローション
以下の処方により、ローションを得た。
ソルビット ２重量％
１，３−ブチレングリコール ２
ポリエチレングリコール１０００ １
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２５ＥＯ） ２
エタノール １０
テプレノン １
防腐剤 適量
精製水 １００とする残部
【００７７】
（２）乳液
以下の処方により、乳液を得た。
スクワラン １重量％
グリセリン １
ステアリルアルコール ０．３
ソルビタンモノステアレート １．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ２
１，３−ブチレングリコール ５
アルニカ抽出物 １
精製水 １００とする残部
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の実施の形態に係る熱ショックタンパク質の発現誘導剤は、ＨＳＰ７０ファミリーの発現を誘導し、抗細胞死作用、抗炎症作用、細胞保護作用、及び胃粘膜保護作用等をもたらす。また、本発明の実施の形態に係る熱ショックタンパク質の発現誘導剤は、ＨＳＰ７０ファミリーの発現を誘導し、紫外線による直接的な肌への刺激、或いは心身ストレス、ホルモンバランス等の異常に起因するシミなどの発生に対処可能である。そのため、本発明の実施の形態に係る熱ショックタンパク質の発現誘導剤は、医薬品産業及び化粧品産業に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。
【請求項２】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０ファミリーに属する、請求項１に記載の発現誘導剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の熱ショックタンパク質の発現誘導剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項４】
ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、又は貼付剤である、請求項３に記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
サルビアを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。
【請求項６】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０ファミリーに属する、請求項５に記載の発現誘導剤。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の熱ショックタンパク質の発現誘導剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項８】
ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、又は貼付剤である、請求項７に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
マジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。
【請求項１０】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０ファミリーに属する、請求項９に記載の発現誘導剤。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の熱ショックタンパク質の発現誘導剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項１２】
ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、又は貼付剤である、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１】
アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。
【請求項２】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０ファミリーに属する、請求項１に記載の発現誘導剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の熱ショックタンパク質の発現誘導剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項４】
ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、又は貼付剤である、請求項３に記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
サルビアを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。
【請求項６】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０ファミリーに属する、請求項５に記載の発現誘導剤。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の熱ショックタンパク質の発現誘導剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項８】
ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、又は貼付剤である、請求項７に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
マジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。
【請求項１０】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０ファミリーに属する、請求項９に記載の発現誘導剤。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の熱ショックタンパク質の発現誘導剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項１２】
ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、又は貼付剤である、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１１−１９０２００（Ｐ２０１１−１９０２００Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５６５２３（Ｐ２０１０−５６５２３）
【出願日】平成２２年３月１２日（２０１０．３．１２）
【出願人】（３９９０８８２８９）株式会社再春館製薬所 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１２日（２０１０．３．１２）
【出願人】（３９９０８８２８９）株式会社再春館製薬所 (6)
【Ｆターム（参考）】
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