生体液のプロテオーム分析
【課題】ＩＡＩ及び他の病的な母体／胎児の状態の初期及び正確な診断を可能にする新規なアプローチを提供する。
【解決手段】本発明は、生体液のプロテオームの同定、胎児起源の母体状態、染色体異数性、及び胎児の成長及び成熟に関連する胎児の疾患を含む、母体／胎児の状態の状況の決定におけるそれらの使用に関する。特定的には、本発明は、羊膜液のプロテオーム同定（複数のタンパク質は羊膜液の組成を表す）及び正常なプロテオームにおける特性変化と種々の病的な母体／胎児の状態、例えば羊膜内感染、又は染色体不全との相関に関する。本発明は、生体液のプロテオミクス分析による、病的な胎児／母体の状態を初期診断、予後のための、及び監視するための、非侵襲及び感受性の方法を提供する。
【解決手段】本発明は、生体液のプロテオームの同定、胎児起源の母体状態、染色体異数性、及び胎児の成長及び成熟に関連する胎児の疾患を含む、母体／胎児の状態の状況の決定におけるそれらの使用に関する。特定的には、本発明は、羊膜液のプロテオーム同定（複数のタンパク質は羊膜液の組成を表す）及び正常なプロテオームにおける特性変化と種々の病的な母体／胎児の状態、例えば羊膜内感染、又は染色体不全との相関に関する。本発明は、生体液のプロテオミクス分析による、病的な胎児／母体の状態を初期診断、予後のための、及び監視するための、非侵襲及び感受性の方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、生体液のプロテオームの同定、胎児起源の母体状態、染色体異数性、及び胎児の成長及び成熟に関連する胎児の疾患を含む、母体／胎児の状態の状況の決定におけるそれらの使用に関する。特定的には、本発明は、羊水のプロテオーム同定（複数のタンパク質は羊水の組成を表す）及び正常なプロテオームにおける特性変化と種々の病的な母体／胎児の状態、例えば羊膜内感染、又は染色体不全との相関に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
プロテオミクス
タンパク質発現パターンの大スケール分析は、現在のＤＮＡ クローニング及び遺伝子プロファイリングアプローチに対する重要かつ必要な相補体として現れた（Ｐａｎｄｅｙ ａｎｄ Ｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４０５：８３７−４６（２０００））。ＤＮＡ配列情報は、ホモロジー方法に基づくいくつかの構造的及び潜在的なタンパク質改質を推定するのに役立つが、翻訳後改質、タンパク分解又は区画化を介するタンパク質機能の制御についての情報を与えない。
伝統的なゲルベースの方法、例えば、一次元及び二次元ゲル電気泳動は、小スケールのタンパク質（＜１，０００タンパク質）検出に有用であるが、これらは大量のサンプルを必要とする（Ｌｉｌｌｅｙ ＫＳ，Ｒａｚｚａｑ Ａ，Ｄｕｐｒｅｅ Ｐ：Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．６（１）：４６−５０，２００２）。この制限を克服するためのアプローチとしては、サンプル中のタンパク質の質量を示すプロフィールを正確に作成するマトリックス支援又は表面増強レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）飛行時間質量分析計が挙げられる。これらのパターン又はプロフィールは、種々の疾患を同定及び監視するために使用することができる。同定の第２のレベルは、ペプチドフラグメントからアミノ酸配列情報を作成するためにカップリングペプチドマッピングからタンデム質量分析に由来する。これは、四極飛行時間ＭＳ（Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ）にＭＡＬＤＩ／ＳＥＬＤＩ又はＥＳＩをカップリングすることによって達成可能である。後者の方法はさらに、特定のペプチドの定量に使用することができる（ＩＣＡＴ技術）。
【０００３】
（病的な母体／胎児の状態の診断）
母体及び／又は胎児又は新生児の健康を含むか、又はいくつかの場合には、母体及び／又は胎児又は新生児の生命を脅かす、妊娠中に進行し得る多くの病的な母体及び胎児の状態、例えば、羊膜内感染（ＩＡＩ）、子かん前症、早期出産及び早期分娩、及び染色体異数性が存在する。このような状態の初期診断は、適切な時期の処置及び介入を可能にするのに必須である。残念なことに、心象的な徴候及び症状は遅く表れ、しばしば非特異的で一致しないため、これらの状態のほとんどの初期診断は困難である。例えば、ＩＡＩの臨床的症状としては、典型的には、母体の発熱及び白血球増加症が挙げられるが、これらの症状はしばしば後で起こり、鋭敏でもなく特異的でもない。このように、Ｇｒａｖｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７１：１６６０−７（１９９４）は非ヒト霊長類モデルを利用し、グループＢの連鎖球菌を用いた実験的羊膜内感染の後、熱及び白血球増加症が、実験的感染の２８時間〜４０時間後に生じる感染により誘発される早期分娩が発症時には５０％しか存在しないことを示した。それ故に、診断の遅れを避けるために、疑惑の高い指標及び補助的な実験室的試験の適切な使用が保証される。ＩＡＩを診断するために通常使用される臨床的基準としては、以下の症状の２つ以上を伴う母体の発熱（≧３７．８℃）が挙げられる：母体白血球増加症（3１５，０００／ｍｍ３）、母体又は胎児の心急搏症、子宮圧痛、又は羊水の悪臭。
【０００４】
臨床的特長が整合しないため、ＩＡＩの診断を補助するために他の補助的な実験室的試験が利用されてきた。これらの試験としては以下のものが挙げられる：母体のＣ−反応性タンパク質の測定、グラム染色に対して白血球又は微生物、羊水培養物について羊膜の直接試験、羊水のグルコース濃度の測定、羊水白血球エステラーゼの検出、気−液クロマトグラフィーによる微生物の有機酸の検出、種々の羊水又は膣のサイトカインの測定（例えば、インターロイキン２、４、６、顆粒球コロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子−α）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９、ラクトフェリン、及び超音波検査法による胎児活性の評価（生物物理学的プロフィール）。サイトカイン又は他の生化学因子の測定は高価であり、一般的に臨床的に入手可能ではなく、主に研究ツールである。さらに、これらの試験の試験効率は、羊水グラム染色及び培養物、羊水グルコース濃度、及び羊水白血球エステラーゼの検出のようなより容易に利用可能な従来の試験よりも整合性があるわけではない。これらの試験の効率は、以前に広くまとめられている（Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ａ． ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｅ．：Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｐｒｅｔｅｒｍ ｒｕｐｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １６２：８０９，１９９０）。全て合理的な感受性及び特異性を有するが、予想される値は、ＩＡＩの診断における臨床的特長を独立して利用するために十分感受性又は特異的ではない。
【０００５】
それ故に、ＩＡＩ及び他の病的な母体／胎児の状態の初期及び正確な診断を可能にする新規なアプローチの必要性が非常に存在する。
【０００６】
染色体異数性を診断するための新規な、有効かつ信頼性のある非侵襲方法を開発することが特に望ましい。現在、母体の血清スクリーニング及び超音波による染色体異数性の絶対的診断は、ミッド−トリメスターの遺伝子羊膜穿刺を必要とする。これは、妊娠の損失のリスクの０．５％に関連する侵襲手順である。さらに、羊水細胞の染色体分析は、労働集約的であり、２週間までかかる時間のかかる手順である。それ故に、信頼できる試験は、母体血清又は他の生体液から染色体異数性の検出を高め、母体スクリーニングの陽性率の受容できない高い誤り率を減らし、羊膜穿刺後の羊水からの診断の速度及び効率を高めるために必要である。他の病的な（ｐａｔａｈｏｌｏｇｉｃ）異数性状態、例えば、クラインフェルター症候群及びターナー症候群は、超音波検査法又は従来の母体血清スクリーニングを用いたスクリーニングによっては完全に見落とされる場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、生体液のプロテオミクス分析による、病的な胎児／母体の状態を初期診断、予後のための、及び監視するための、非侵襲及び感受性の方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、限定されないが、羊膜内感染（ＩＡＩ）、染色体異数性、及び胎児の在胎齢及び成熟度に関連する胎児の疾患を含む病的な胎児／母体の状態を初期診断、予後のための、及び監視することが可能な生体液、例えば、羊水及び母体血清のプロテオミクスプロフィールを提供する。特定的には、本発明は、ＩＡＩ及び染色体異数性のための正常及び病的なプロテオミクスプロフィールを提供する。問題となる胎児／母体状態を排除する（陰性の診断）ことを可能にし、患者が不必要で潜在的に危険な処置又は介入を受ける必要性を排除するため、正常なプロテオミクスプロフィールの決定は非常に重要である。
【０００９】
本発明はさらに、生体的、例えば、羊水又は母体血清中で異なって発現する種々の胎児又は母体の状態、例えば、ＩＡＩ及び染色体異数性のような病的な状態が存在する場合、これらの存在及び状況のための特定のバイオマーカーを提供する。このようなバイオマーカー及びこのようなバイオマーカーに結合する抗体は、例えば、タンパク質又は抗体アレイ上に存在してもよく、単純な非侵襲診断アッセイにおける利用が見出されている。
【００１０】
１つの局面では、本発明は、哺乳動物被検体から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は上記状態に特徴的な少なくとも１つの固有の発現サインを含む参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程を含む、母体又は胎児の状態を決定するための方法に関する。
【００１１】
本方法の一実施形態では、哺乳動物被検体は妊娠したメスであり、好ましくは霊長類又はヒトである。
【００１２】
別の実施形態では、母体の状態は、子宮内感染、子かん前症、及び早期分娩からなる群から選択される。
【００１３】
さらなる実施形態では、胎児の状態は、染色体異数性、先天性奇形、在胎齢及び胎児成熟度からなる群から選択され、ここで、染色体異数性は、例えば、ダウン症候群、トリソミー−１３、トリソミー−１８、ターナー症候群、又はクラインフェルター症候群であることができる。
【００１４】
任意の生体液は、限定されないが、羊水、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、及び唾液、好ましくは、羊水又は母体血清を含む、本発明の実行において使用することができる。
【００１５】
さらなる実施形態では、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールは、少なくとも２つのタンパク質の情報、又は少なくとも５つのタンパク質の情報、又は少なくとも１０つのタンパク質の情報、又は少なくとも２０つのタンパク質の情報、又は少なくとも５０つのタンパク質の情報を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、プロテオミクスプロフィールはマススペクトルである。
【００１７】
別の実施形態では、マススペクトルは、マススペクトルの３〜５ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む。
【００１８】
なお別の実施形態では、マススペクトルの１０〜１２ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、上記母体状態が羊膜内感染であり、上記固有の発現サインが前記試験サンプル中の１０〜１１ｋＤａ分子量範囲における余剰ピークであり、これが羊膜内感染の指標である。
【００２０】
異なる実施形態では、プロテオミクスプロフィールはＷｅｓｔｅｒｎブロット分析によって作成される。
【００２１】
別の実施形態では、生体液は、ヒトの生体液であり、プロテオミクスプロフィールが以下：マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン（ｃｒｏｎｉｎ）様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む。
【００２２】
さらなる実施形態では、プロテオミクスプロフィールは、マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の情報を含む。
【００２３】
上述の方法は、限定されないが、羊膜内感染、臓器系、筋骨格奇形の不全を含む発育不全、及び染色体異数性から生じる状態、例えば、ダウン症候群、トリソミー−１３、トリソミー−１８、ターナー症候群、又はクラインフェルター症候群を含む、種々の胎児及び母体の状態の診断のために好適である。
【００２４】
試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが本質的に正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと同じである場合、被検体は上記の母体又は胎児の状態を有していないと決定される。
【００２５】
上記プロテオミクスプロフィールが疾患サンプルと本質的に同じ固有の発現サインを含有する場合、患者は対応する母体又は胎児の状態と診断される。
【００２６】
別の局面では、本発明は、羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが３〜５ｋＤａ及び／又は１０〜１２ｋＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程を含む方法に関する。
【００２７】
さらなる局面では、本発明は、羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）ＩＧＦＢ−１、プロフィリン、セルロプラスミン、及びＬ−プラスチン、カルグラヌリン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現される場合に上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程を含む、方法に関する。
【００２８】
特定の実施形態では、ＩＧＦＢＰ−１、プロフィリン、セルロプラスミン、及びカルグラヌリン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体のうち少なくとも１つが、正常サンプルと比較して試験サンプルにおいて過剰発現する。
【００２９】
別の実施形態では、Ｌ−プラスチンが、正常サンプルと比較して試験サンプルにおいて過剰発現する。
【００３０】
なお別の実施形態では、ＩＧＦＢＰ−１の存在が図１２に示されるタンパク分解性のフラグメント又はそれらのフラグメントを同定することによって検出される。
【００３１】
別の局面では、本発明は、染色体異数性を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが４〜１５ｋＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を染色体異数性であると診断する工程を含む方法に関する。
【００３２】
異なる局面では、本発明は、胎児の発育不全を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）少なくとも１つのアクチン調整タンパク質、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体が前記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記発育不全の存在を確認する工程を含む方法に関する。
【００３３】
本方法の特定の実施形態では、アクチン調整タンパク質は、モエシン、ｐ５７、ゲルゾリン、及び１４−３−３タンパク質からなる群から選択される。
【００３４】
さらなる局面では、本発明は、母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）、白血球エラスターゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカルシン（ｌｉｐｃａｌｃｉｎ）（ＮＧＡＬ）、ミエロペルオキシダーゼ、Ｌ−プラスチン、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）、ＦＡＬＬ−３９、アジロシジン（ａｚｙｒｏｃｉｄｉｎ）（ＣＡＰＳ７）、プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害を確認する工程を含む方法に関する。
【００３５】
なおさらなる局面では、本発明は、妊娠したメス哺乳動物から得られる生体液のプロテオミクスプロフィール中でＧｐ−３４０の存在を検出する工程を含む、新生児セプシスを診断するための方法に関する。
【００３６】
なお別の局面では、本発明は、マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変体タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン（ｃｒｏｎｉｎ）様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質情報を含む生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００３７】
さなる局面では、本発明は、マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ；プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質情報を含む生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００３８】
本発明はさらに、ＩＧＦＢ−１，プロフィリン、セルロプラスミン、Ｌ−プラスチン、及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）からなる群から選択されるタンパク質の存在を確認する情報を含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００３９】
別の局面では、本発明は、上記生体液中に存在するタンパク質又はそれらのフラグメントの分子量情報を提供する形態で表され、３〜５ＫＤａ及び／又は１０〜１２ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００４０】
さらなる局面では、本発明は、図１Ａ〜１Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図２Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図３Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図４Ａ又は４Ｂのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図６〜１０のいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィールに関する。
【００４１】
特定の実施形態では、上記プロテオミクスプロフィールはマイクロアレイフォーマットにおいて分析される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
母体又は胎児の状態を決定するための方法であって、
哺乳動物被検体から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は上記状態に特徴的な少なくとも１つの固有の発現サインを含む参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程と、
上記母体又は胎児の状態を決定する工程とを含む、
方法。
（項目２）
上記哺乳動物被検体が妊娠したメスである、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記妊娠したメスがヒトである、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記母体の状態が、羊膜内感染、子かん前症、及び早期陣痛からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記胎児の状態が、染色体異数性、先天性奇形、在胎齢及び成熟度からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記生体液が、羊膜液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、及び唾液からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目３に記載の方法。
（項目８）
上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが、少なくとも２つのタンパク質の情報を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記プロテオミクスプロフィールがマススペクトルである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記プロテオミクスプロフィールが、マススペクトルの３〜５ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記プロテオミクスプロフィールが、マススペクトルの１０〜１２ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記母体状態が羊膜内感染であり、上記固有の発現サインが上記試験サンプル中の１０〜１２ｋＤａ分子量範囲における余剰ピークであり、これが羊膜内感染の指標である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記プロテオミクスプロフィールがＷｅｓｔｅｒｎブロット分析によって生成される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記生体液がヒトの生体液であり、プロテオミクスプロフィールが以下：マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の２つ以上の発現情報を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の全ての発現情報を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
上記生体液が羊膜液である、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
上記プロテオミクスプロフィールが正常サンプルのプロテオミクスプロフィールである、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
上記プロテオミクスプロフィールが上記試験サンプル又は参照サンプルのプロテオミクスプロフィールである、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
上記タンパク質の１つ以上が、上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現される、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
上記プロテオミクスプロフィールが以下：マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；プロフィリンＩ，グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の２つ以上の発現情報を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の全ての発現情報を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
上記被検体が羊膜感染と診断される、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
上記患者が発育不全であると診断される、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
上記発育不全が臓器系の発育における不全である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記臓器系が中枢神経系又は心臓血管系である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記発育不全が筋骨格の奇形である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記発育不全が染色体の異数性から生じる、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが上記正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと本質的に同じであり、上記被検体が上記母体又は胎児の状態を有さないと決定される、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
上記プロテオミクスプロフィールが、表３及び４に列挙されるタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
上記プロテオミクスプロフィールが、上記参照サンプルと同じ固有の発現サインを含む、項目２２に記載の方法。
（項目３４）
上記固有の発現サインが羊膜内感染に特徴的である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
上記被検体が羊膜内感染であると診断される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが３〜５ＫＤａ及び／又は１０〜１２ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程
を含む方法。
（項目３７）
上記プロテオミクスプロフィールがマススペクトルの形態で表される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記哺乳動物が霊長類である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記霊長類がヒトである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記羊膜内感染の推移を監視する工程をさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）ＩＧＦＢ−１、カルグラヌリン、アズロシジン、プロフィリン、セルロプラスミン、及びＬ−プラスチン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現される場合に上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程
を含む、方法。
（項目４３）
上記哺乳動物が霊長類である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記霊長類がヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ＩＧＦＢＰ−１、カルグラヌリン、アズロシジン、プロフィリン、及びセルロプラスミン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体の少なくとも１つが上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて過剰発現する、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
Ｌ−プラスチンが上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて過剰発現する、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
ＩＧＦＢＰ−１の存在が図１２に示されるタンパク分解性のフラグメント又はそれらのフラグメントを同定することによって検出される、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
上記羊膜内感染の状況を監視する工程をさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
染色体異数性を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが４〜１５ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を染色体異数性であると診断する工程
を含む方法。
（項目５１）
上記染色体異数性がダウン症候群である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
胎児の発育不全を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）少なくとも１つのアクチン調整タンパク質、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記発育不全の存在を確認する工程
を含む方法。
（項目５３）
上記アクチン調整タンパク質がモエシン、ｐ５７、ゲルソリン、及び１４−３−３タンパク質からなる群から選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）、白血球エラスターゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカルシン（ｌｉｐｃａｌｃｉｎ）（ＮＧＡＬ）、ミエロペルオキシダーゼ、Ｌ−プラスチン、カルグラヌリン、ＦＡＬＬ−３９、アジロシジン（ａｚｙｒｏｃｉｄｉｎ）（ＣＡＰ３７）、プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害の存在を確認する工程
を含む方法。
（項目５５）
新生児セプシスを診断するための方法であって、妊娠したメス哺乳動物から得られる生体液のプロテオミクスプロフィールにおいてＧｐ−３４０の存在を検出する工程を含む方法。
（項目５６）
マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変体タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目５７）
マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目５８）
表３及び４に列挙されるタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の情報を含む、生体サンプルのプロテオミクスプロフィール。
（項目５９）
上記１つ以上のタンパク質、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体の存在を確認する、項目５６〜５８のいずれか１項に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目６０）
ＩＧＦＢ−１，プロフィリン、セルロプラスミン、Ｌ−プラスチン、及びカルグラヌリンからなる群から選択されるタンパク質の存在を確認する情報を含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目６１）
上記生体液中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク質分解性フラグメントの分子量の情報を提供する形態で表され、３〜５ＫＤａ及び／又は１０〜１２ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目６２）
マススペクトルとして表される、項目６０に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目６３）
上記生体液が羊膜液又は母体血清である、項目６１に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目６４）
図１Ａ〜１Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６５）
図２Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６６）
図３Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６７）
図４Ａ又は４Ｂに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６８）
図６〜１０のいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６９）
マイクロアレイフォーマットにおいて分析される、項目６３〜６７のいずれか１項に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目７０）
固体支持体上に固定された表２〜４に列挙されるタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質を含む、タンパク質アレイ。
（項目７１）
固体支持体上に固定された表２〜４に列挙される１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、抗体アレイ。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】図１Ａ。霊長類の羊水中の感染を誘発する示差タンパク質の発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ａ）ピーク強度において差異を示す２３５レーザー強度で集められた全スペクトル。
【図１Ｂ】図１Ｂ。霊長類の羊水中の感染を誘発する示差タンパク質の発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｂ）コントロールと感染したものとの間で約１０〜１２ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。
【図１Ｃ】図１Ｃ。霊長類の羊水中の感染を誘発する示差タンパク質の発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｃ）コントロールと感染したものとの間で約３〜５ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。実線は、診断試験を開発するために使用される、発現（固有の発現サイン）において有意な差を示すために使用された。
【図２】図２Ａ〜Ｃ。感染に応答する霊長類羊水の時間推移分析（ＧＢＳ）。以下に記載されるように、バクテリアの接種前で感染後に羊水を集め、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。図２Ａ：感染前；２Ｂ：感染１２時間後；２Ｃ：感染３６時間後。
【図３Ａ】図３Ａ。ヒト羊水において感染を誘発する示差タンパク質発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ａ）ピーク強度において差異を示す２３５レーザー強度で集められた全スペクトル。
【図３Ｂ】図３Ｂ。ヒト羊水において感染を誘発する示差タンパク質発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｂ）コントロールと感染したものとの間で約１０〜１２ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。
【図３Ｃ】図３Ｃ。ヒト羊水において感染を誘発する示差タンパク質発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｃ）コントロールと感染したものとの間で約３〜５ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。
【図４Ａ】図４Ａ。ヒト由来の羊水を用いた遺伝子ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で達成されるマススペクトル。（Ａ）コントロール、子宮内感染なし。
【図４Ｂ】図４Ｂ。ヒト由来の羊水を用いた遺伝子ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で達成されるマススペクトル。（Ｂ）サンプル、子宮内感染あり。
【図５】図５。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色されたゲル。（Ａ）プールされた４つのヒトコントロールＡＦサンプル；（Ｂ）個々のコントロールＡＦサンプル；（Ｃ）プールされた４つのヒトの感染ＡＦサンプル；（Ｄ）個々の感染したＡＦサンプル。
【図６】図６。ヒト羊水中の示差タンパク質発現の検出。（Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールされた）；（Ｂ）感染したＡＦサンプル（プールされた）。
【図７】図７。ヒト羊水中の示差タンパク質発現の検出。（Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールされた；（Ｂ）感染したＡＦサンプル（プールされた）。
【図８】図８は、ヒト羊水及び母体血清中の示差タンパク質発現の検出を示す。（Ａ）コントロールサンプル（プールされた）；（Ｂ）感染したサンプル（プールされた）。
【図９】図９は、タンパク質アレイを用いた、母体血清中で示差発現されたタンパク質の検出を示す。（１）対応するタンパク質とそれらの抗体との結合を示すタンパク質アレイの擬似色画像；（２）アレイの拡大された領域；（３）カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）ＩＰのＷｅｓｔｅｒｎブロット。
【図１０】図１０は、トリソミーを識別するための固有のプロフィールを用いた、母体血清中の示差タンパク質発現パターンを示す。
【図１１】図ｌｌ。羊水タンパク質ＰＲＯ１＿ヒト（Ｐ０７７３７）プロフィリンＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜１１）のタンパク質のデノボ配列同定の概要図。
【図１２】図１２。ＩＧＦＢＰ−１ デノボタンパク質同定及びタンパク分解性のフラグメント配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。Ｍｓ／ＭＳを用いたサンプル０４２６ｓｅ＿Ｈｌ＿１２及び０４２５ｓｅ＿Ｈｌ＿１３中に見いだされるペプチド配列が下側の枠内に示される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及び３）。これらは、トリプシン染色した１−Ｄゲルバンドで試験し、ＭＳ／ＭＳ分析にかけた場合、感染した羊水から得られた。１−Ｄゲル中で検出したＩＧＦ−ＢＰ−１のタンパク分解性のフラグメント（低分子量範囲、図５）、感染した羊水由来のトリプシン消化した約１０．５〜１２ＫＤａバンドのＷｅｓｔｅｒｎブロット（図６）及びＭＳ／ＭＳ分析（図１３）を下線を引いた配列の領域中に表す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【図１３】図１３。感染した羊水由来の１０．５〜１１ｋＤ １Ｄゲルバンドのトリプシン消化物のＬＣＱ−ＭＳプロフィール。親イオンを示すＬＣＱ−ＭＳはサンプル中に存在する潜在的なタンパク質を表す。
【図１４】図１４。図１３に示される保持時間１７．５５〜１８．２１分のピークについてのマススペクトル。
【図１５】図１５。図１４に示される４３４．９ピークの親イオンについてのＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１６】図１６。ＩＡＩに対するバイオマーカーの免疫検出。（１６ａ）霊長類コントロール（−）及び感染した（＋）ＡＦ。（１６ｂ）ヒトコントロール（−）及び感染した（＋）ＡＦ。（１６ｃ）ヒトコントロール（−）及び感染した（＋）ＡＦ。ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）制御されていないコントロールマーカー。ＩＧＦＢＰ−１バンドはインタクトなタンパク質（約３０ｋＤａ）及びタンパク分解性のフラグメント（約１１ｋＤａ）を表す。（１６ｄ）免疫沈降物由来のプールされた母体血清中のＩＧＦＢＰ１の検出。コントロール（−）及び感染した（＋）血清。（１６ｅ）免疫沈降物由来のプールされた母体血清中のカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂの検出。コントロール（−）及び感染した（＋）血清。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（好ましい実施形態の詳細な記載）
Ａ．定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）は、本出願中で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００４４】
用語「プロテオーム」は、所与の時間で生物学的サンプル中のタンパク質の有意な部分を記載するために本明細書中で使用される。プロテオームの概念は、ゲノムとは基本的に異なる。ゲノムは事実上静的であるが、プロテオームは内部事象及び外部事象に応答して連続的に変化する。
【００４５】
用語「プロテオミクスプロフィール」は、生物学的サンプル中、例えば、所与の時間での生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの代表例を示すために本明細書中で使用される。プロテオミクスプロフィールは、例えば、マススペクトルとして表すことができるが、タンパク質の物理化学的性質又は生化学的性質のいずれかに基づく他の代表例も含まれる。従って、プロテオミクスプロフィールは、例えば、二次元ゲル電気泳動、例えば、２−Ｄ ＰＡＧＥによって決定されるようなタンパク質の電気泳動性における差に基づいてもよく、例えば、二次元電気泳動ゲル中の複数のスポットとして表すことができる。示差発現プロフィールは、特定の同定されたタンパク質の非存在下でさえ、重要な診断値を有してもよい。次いで、例えば、イムノブロッティングによって単一のタンパク質スポットを検出することができ、タンパク質マイクロアレイを用いた複数のスポット又はタンパク質を検出することができる。プロテオミクスプロフィールは、典型的には、いくつかのピークから５０以上のピークを表す複雑なプロフィールまでの範囲にある情報を表すか又は含有する。従って、例えば、プロテオミクスプロフィールは、少なくとも２、又は少なくとも５、又は少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０、又は少なくとも３５、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５、又は少なくとも５０タンパク質を含有するか又は表してもよい。
【００４６】
用語「病的な状態」は、最も広い意味において使用され、被検体の健康を危うくする全ての変化及び現象をカバーする。病的な母体の状態とは、限定されないが、羊膜内感染、胎児又は母体起源の状態、例えば、子かん前症、及び早期分娩及び早期分娩が挙げられる。病的な胎児の状態とは、限定されないが、染色体不全（異数性）、例えば、ダウン症候群、及び在胎齢及び胎児の成熟度における全ての異常が挙げられる。
【００４７】
用語「病的な［母体又は胎児］状態の状況」は、最も広い意味において使用され、病的な状態の非存在、存在、程度、段階、性質、成長又は抑制を指す。
【００４８】
用語「固有の発現サイン」は、統計学的に有意な様式で、対応する正常な生物学的サンプル（同じ種類の起源、例えば生体液から得られる）とは異なる生物学的サンプル（例えば、参照サンプル）のプロテオミクスプロフィール内の固有の特徴又はモチーフを記載するために使用される。
【００４９】
用語「羊膜内感染（ＩＡＩ）」、「羊水感染」、「羊膜炎」及び「臨床的絨毛羊膜炎は、相互に交換可能に使用され、妊娠中の羊水及び子宮内成分の細菌に限定されないものを含む、急性感染を指す。
【００５０】
「患者応答」は、限定されないが、（１）病的な状態の、少なくともある程度までの阻害、（２）病的な状態の予防、（３）病的な状態に関連する１つ以上の症状の、少なくともある程度までの軽減；（４）処置後の生存時間の増加；及び／又は（５）処置後の所与の時間点での死亡率の減少を含む、患者に対する利益を示す任意の終点を用いて評価することができる。
【００５１】
用語「処置」は、治療的処置及び予防又は防止測定を指し、この目的は、標的とされる病的な状態又は障害を防ぐか又は遅らせる（減らす）ことである。処置を必要とするものとしては、障害を既に有しているもの、及び障害を有すると考えられるもの又は障害を防ぐと思われるものが挙げられる。
【００５２】
「先天性奇形」は、遺伝性ではないが出世時に存在する異常である。
【００５３】
Ｂ．詳細な記載
本発明は、母体又は胎児の生体液のプロテオミクスプロフィールに基づく、母体及び胎児の状態の初期の、信頼性のある非侵襲試験のための方法及び手段に関する。本発明は、例えば、以下の文献に記載されるような当該技術において公知のプロテオミクス技術を利用する（これらの内容は参考としてここに組み込まれる）：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）．Ｍ．Ｒ．Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１００７；２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｎｄｒｅｗ Ｌ Ｌｉｎｋ，ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ｔ．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ ｅｄｉｔｏｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２０００；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）．Ｐ．Ｊａｍｅｓ ｅｄｉｔｏｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２００１；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｌｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｄ．Ｃ．Ｌｉｅｂｌｅｒ ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｐｌｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐｌｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒ．Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００２。
【００５４】
当業者は、本発明の実施において使用することが可能な、本明細書中に記載されるものと類似又は等価の多くの方法及び物質を認識する。実際に、本発明は、いかなる様式でも記載される方法及び物質に限定されない。
【００５５】
１．生体液中で発現するタンパク質及びポリペプチドの同定
本発明によれば、生体液のプロテオミクス分析は、当該技術分野で公知の種々の方法を用いて行うことができる。
【００５６】
典型的には、異なる起源、例えば、正常な生体液（正常サンプル）及び試験生体液（試験サンプル）由来のサンプルのタンパク質パターン（プロテオームマップ）は、疾患において上方調整又は下方調整されるタンパク質を検出するために比較される。次いで、これらのタンパク質を、例えば、ペプチド−マスフィンガープリンティング及び／又は質量分析法及び配列決定方法を用いて、同定及び完全な特徴決定のために切除することができるか、又は正常及び／又は疾患特異的なプロテオームマップを目的の疾患の診断のために直接的に使用することができるか、又は疾患の存在又は非存在下を確認するために直接的に使用することができる。
【００５７】
比較分析において、タンパク質の相対量を正確に表すために、及び正確な結果を得るために、正常サンプル及び試験サンプルを同じ様式で実際に処置することが重要である。全タンパク質の要求される量は、使用される分析技術に依存し、当業者によって容易に決定することができる。生物学的サンプル中に存在するタンパク質は、典型的には、それらのｐＩ及び分子量に従って二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）によって分離される。タンパク質は、等電集束法（一次元電気泳動）を用いて最初にそれらの電荷によって分離される。この工程は、例えば、市販の固定化ｐＨ−勾配（ＩＰＧ）片を用いて行うことができる。二次元は通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析であり、集束されたＩＰＧ片をサンプルとして使用する。２−ＤＥ分離後、タンパク質は従来の染料、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ又は銀染色を用いて視覚化することができ、公知の技術及び装置、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーター及びＰＤＱＵＥＳＴソフトウェア（両方市販されている）を用いて画像化する。次いで、個々のスポットをゲルから切断し、脱色し、トリプシン消化を行う。ペプチド混合物を質量分析計（ＭＳ）によって分析することができる。又は、例えばキャピラリー高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ペプチドを分離することができ、個々にＭＳによって、又はプールにおいて分析することができる。
【００５８】
質量分析計は、イオン源、質量分析器、イオン検出器及びデータ取得ユニットからなる。最初に、ペプチドをイオン源中でイオン化する。次いで、イオン化されたペプチドをそれらの質量 対 電荷比に従って質量分析器中で分離し、分離したイオンを検出する。質量分析法は、特に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及び電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）方法の発明で、タンパク質分析に広く使用されている。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び三極又は四極−ＴＯＦを含む質量分析器、又はＥＳＩに結合したイオン捕捉質量分析器のいくつかのバージョンが存在する。従って、例えば、Ｑ−Ｔｏｆ−２質量分析器は、全マススペクトル範囲にわたってイオンの同時検出を可能にする直交飛行時間分析器を利用する。さらなる詳細については、例えば、ｅ．ｇ．Ｃｈｅｍｕｓｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３６：８４９−８６５（２００１）。
【００５９】
所望な場合、ペプチドフラグメント及びそれらから結果として誘導されるタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知の技術、例えば、質量分析法又はＥｄｍａｎ分解の特定の改変によって決定することができる。
【００６０】
２．初期及び非侵襲の診断から利益を受ける胎児−母体の状態
ａ．羊膜内感染
羊膜内感染（ＩＡＩ）は、妊娠中の羊水及び子宮内成分の急性バクテリア感染である。予想試験は、ＩＡＩが全ての分娩の４〜１０％生じることを示す（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｐｒｉｈｏｄａ，Ｔ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．：Ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．７３：５７１，１９８９；Ｓｏｐｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｙｈａｌｌ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ Ｄａｌｔｏｎ，Ｈ．Ｐ．：Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １６１：５６２，１９８９；ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ−Ｚｅｎｏ，Ｊ．Ａ．，Ｐｅａｃｅｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ａｄａｓｈｅｋ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｃｏｌ，Ｍ．Ｌ．：Ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｂｏｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：４５０，１９９２）。ＩＡＩを記載するために使用される他の用語としては、羊水感染、羊膜炎、及び臨床的絨毛羊膜炎が挙げられる。羊膜内感染は、母体の発熱、子宮圧痛、白血球増加症、及び胎児心急搏症によって臨床的に診断され、組織学的な絨毛羊膜炎とは区別されるべきである。羊膜内感染は、母体及び新生児の罹患率の重要な原因である。羊膜内感染は、産褥期における発熱性罹患率の原因の１０〜４０％を占め、初期新生児セプシス及び肺炎の原因の２０〜４０％に関連する（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．：Ｑｉｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．３６：７９５，１９９３）。母体菌血症は、ＩＡＩを患う患者の２〜６％に生じ、産褥感染の罹患率は増加する。ＩＡＩを患う患者の間で、不完全な分娩及び帝王切開による分娩のリスクが増加する。Ｄｕｆｆらは、分娩中に進行した羊膜内感染をもつ患者の中で、不完全な分娩の発生率が７５％であり、帝王切開による分娩の発生率が３４％であることを報告した（Ｄｕｆｆ，Ｐ．，Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｒ． ａｎｄ Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．：Ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｔｅｒｍ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １４７：３９１， １９８３）。羊膜内感染はさらに、特に早期新生児の間で、早期進行した新生児罹患率及び死亡率と関連する。概して、母体のＩＡＩに対して生まれる低体重新生児の中では、周産期死亡率が３〜４倍増加する（Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．：Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １３６：７０９，１９８０；Ｇｉｌｓｔｒａｐ，Ｌ．Ｃ．，ＩＩＩ，Ｌｅｖｅｎｏ，Ｋ．Ｊ．，Ｃｏｘ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｕｍｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｍａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｃ．Ｒ．：Ｉｎｔｒａｐａｒｔｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ：ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｅｐｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５９：５７９，１９８８）。呼吸困難症候群、心室内出血、及び新生児セプシスの増加も存在する。Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｗ．Ｊ．：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ ａｔ ｏｎｅ ｙｅａｒ。Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ７０：１８３，１９８７）。近年、ＩＡＩは、新生児脳室周囲白質軟化症及び脳性小児麻痺に関係があるとされており；大脳白室損傷及び脳性小児麻痺のリスクは、羊膜内感染の背景において９倍高まる。Ｂｅｊａｒ，Ｒ．，Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｐ．，Ａｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｂｅｎｉｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，Ｖａｕｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｃｏｅｎ，Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｃ．，Ｓｃｈｒａｇｇ，Ｐ．，Ｖｉｌｌｅｇａｓ，Ｉ．， ａｎｄ Ｒｅｓｎｉｋ，Ｒ．：Ａｎｔｅｎａｔａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｉ．Ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５９：３５７，１９８８；Ｇｒｅｔｈｅｒ，Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ｂ．：Ｍａｔｅｒｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐａｌｓｙ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ． ＪＡＭＡ ２７８：２０７，１９９７）。最後に、潜伏性ＩＡＩは、インタクトな胚膜をもつ早期分娩の女性の少なくとも１０％に見出され、このことは、ＩＡＩが未熟児の、重要な潜在的に予防可能な原因であることを示唆する（Ｒｏｍｅｒｏ，Ｒ．，Ａｖｉｌａ，Ｃ．，Ｂｒｅｋｕｓ，Ｃ．Ａ．， ａｎｄ Ｍｏｒｏｔｔｉ，Ｒ．：Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｐａｒｔｕｒｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６２２：３５５，１９９１）。Ｎｅｗｔｏｎによってまとめられた文献は、２７週よりも低い在胎齢で臨床的なＡＩＡの発生率が４１％であり、２７〜３７週の在胎齢で１５％の発生率であり、妊娠３８週以上では２％であることを示した（Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，前出）。下部生殖路（ｌｏｗｅｒ ｇｅｎｉｔａｌ
ｔｒａｃｔ）に対する既存のバクテリアはさらに、臨床的な羊膜内感染の徴候なくインタクトな胚膜をもつ早期分娩において全ての女性の１０〜２０％の羊水から回収され（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，前出）、２３〜２４週で妊娠を終了する早期分娩の女性の６７％までの羊水から回収された（Ｗａｔｔｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｋｒｏｈｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．， ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ａ．：Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｃｕｌｔ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ａｇｅ ａｎｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｗｏｍｅｎ ｉｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ。Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ７９：３５１，１９９２）。これらの患者のほとんどは迅速に分娩し、臨床的に明らかなＩＡＩが多くにおいて進んでいる。これらの観察結果は、仮新構成の初期の潜伏性の子宮内感染が早期分娩に先行し、極端な早期分娩の重要な原因となる場合があるという説を支持する。
【００６１】
ｂ．子かん前症
子かん前症（タンパク尿、水腫、又はその両方を伴う母体の高血圧として定義される）は、最初のトリメスターにおいて妊娠が中断しない妊娠の７％に生じる。原因は知られていないが、妊娠可能年齢の極値の母体の糖尿病、多胎妊娠を有する妊娠、及び既に存在していた母体の腎臓疾患又は高血圧において、さらによく見られる。子かん前症は、周産期死亡率の増加と関連し、子かんを生じる場合があり、母体の発作によって特徴付けられ、母体の死亡率を高める。現在、子かん前症のための治療の主要な方法は、分娩及び硫酸マグネシウムを用いた抗痙攣薬による予防である。硫酸マグネシウム治療が出現する前には、観察された母体死亡率は２０〜３０％であった。しかし、迅速な診断と共に、硫酸マグネシウムを用いた抗痙攣薬、抗高血圧在による治療及び分娩により、母体の死亡率はほぼ０％にまで減った。
【００６２】
不幸なことに、通常認識される症状及び徴候に基づく子かん前症の診断はしばしば困難であり、疾患の経緯において後期に生じる。しばしば、胎児の成長又は健康がおびやかされることは、子かん前症の最初の認識される症状発現である。子かん前症の実験的なマーカーとしては、タンパク尿の量、及び尿酸又はクレアチニンの血清濃度の上昇が挙げられる。初期子かん前症のための血清マーカー又は子かん前症が進行する女性を同定するマーカーは現時点で利用不可能である。近年、レプチン及び尿酸を含む予想血清マーカーが、１つの研究において、後に続く子かん前症と関連していた（Ｇｕｒｓｏｙ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉｃｉａ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ：Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．ｌ９（６）：３０３−１０，２００２）が、これらの発見を確認するためには多くの作業が必要である。子かん前症のための初期及び信頼できるマーカーの開発は、新生児及び母体のための結果を最適化するための治療及び介入を無条件で可能にする。
【００６３】
ｃ．早期分娩及び早産
早期出産は、妊娠が完結する３７週の前に出生することと定義される。アメリカ合衆国での早期出生の発生率は、全ての生きた状態での出生の１０〜１１％であり、早期分娩の積極的な処置にもかかわらず増加している。全体として、未成熟及びその結果は、先天性奇形をもたらさない周産期の脂肪の８０％の原因となり、国のヘルスケア予算に年間約５０億ドルが追加される。早期出生のためのリスク因子としては、白人でないこと、年齢が若いこと、社会的なステイタスが低いこと、母体の体重が５５ｋｇ未満であること、未経産であること、最初のトリメスター出血であること、多胎妊娠であることが挙げられる（Ｍｅｉｓ ＰＪ，Ｍｉｃｈｉｅｌｕｔｔｅ Ｒ，Ｐｅｔｅｒｓ ＴＪ ｅｔ ａｌ．， Ｆａｃｔｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ ｉｎ Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｗａｌｅｓ：Ｈ Ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａｎｄ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７３：５９７−６０２，１９９５）
不幸なことに、自然発生的な早期出生のリスクを持つ患者の予測は一般的に期待はずれである（Ｃｒｅａｓｙ ＲＫ，ｌａｍｓ ＪＤ．Ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ−Ｆｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｒｅａｓｙ ＲＫ，Ｒｅｓｎｉｋ Ｒ（ｅｄｓ．）．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９．Ｐａｇｅ ４９８−５３１）。早期出生の最も大きなリスクをもつ集団を定義し、それによって初期介入からの潜在的な利益を得ようとする以前の試みは、リスクスコアリング指標（ｒｉｓｋ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｉｎｄｉｃｅｓ）、胎児フィブロネクチンの生化学的検出、頚部の長さの超音波測定、及ぶ生息地となる子宮の活性の監視を含んでいた。これらのプログラムは、高価であり、患者が初期の介入又は予防から利益を受ける程度の正確性を持って予測することができなかったということによって阻まれていた。全ては、約３０％のわずかに陽性の予想値を持ち、患者の大多数が満期での分娩の「リスク保持者（ａｔ ｒｉｓｋ）」であると定義された。子宮収縮を阻害するための薬理学的処置を含む介入は有効であるが、早期分娩の初期の信頼できる診断に依存する。それ故に、早期出生の最も大きなリスクを持つ患者を同定するための初期の信頼できるマーカーは、早期出生に関連する莫大なコスト及び新生児死亡率及び罹患率を減らすために必要である。
【００６４】
ｄ．染色体異数性
染色体異常は、周産期罹患率及び死亡率の頻度の高い原因である。染色体異常は、２００人の生児出生あたり１の発生率で生じる。これらの異常の主な原因は染色体異数性であり、染色体の異常の多くは親からの遺伝である。最も頻繁な染色体異数性の１つはトリソミー−２１（ダウン症候群）であり、８００人の生児出生あたり１の発生率を有する（Ｈｏｏｋ ＥＢ，Ｈａｍｅｒｔｏｎ ＪＬ：Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ｓｅｘ ａｎｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ．Ｉｎ Ｈｏｏｋ ＥＢ，Ｐｏｒｔｅｒ ＩＨ（ｅｄｓ．）：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｐｐ ６３−７９．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７８）。トリソミー−２１の一次リスク因子は、母体の年齢が３５歳を超えていることであるが、トリソミー−２１をもつ子供の８０％は、３５歳より若い女性から生まれている。他の一般的な異数体状態としてはトリソミー１３及び１８、ターナー症候群及びクラインフェルター症候群が挙げられる。
【００６５】
トリソミー−２１をもつ子供の８０％が３５歳より若い女性から生まれているため、母体年齢のみに基づいて設計されている出生前診断スクリーニングプログラムでは不十分である。それ故に、出生前スクリーニングプログラムは、胎児染色体異数性と関連する母体血清スクリーニング、超音波又はそれら両方の組み合わせと組み合わせられている。広く利用されている候補血清マーカーとしては、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、未接合エストリオール、ヒトコリオゴナドトロフィック（ｃｈｏｒｉｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）ホルモン（ｈＨＣＧ）、及びインヒビン−Ａが挙げられる。しかし、スクリーニングの陽性率２〜５％で、トリソミー−２１及び他の異数性の検出率は期待はずれであり、検出率は７０〜８６％である（Ｃｕｃｋｌｅ Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ．９２（１）：９７−１０１，２０００）。さらに、試験の真の陽性率、すなわち、スクリーニング陽性試験の中でのこれらの中のトリソミー−２１の率はわずか１〜２％であり、９８％を超えて最終的な陽性率は誤りを生じている。
【００６６】
染色体異数性の確定的な診断の後、母体血清スクリーニング及び超音波は、ミッド−トリメスター遺伝子羊膜穿刺を必要とする。これは、妊娠を中断させるリスクの０．５％に関連する侵襲手順である。さらに、羊水細胞の染色体分析は、労働集約的であり、２週間までかかる時間のかかる手順である。それ故に、母体の血清から染色体異数性の検出を向上させ、母体スクリーニングの受け入れられないほど誤って高い陽性率を減らし、羊膜穿刺後の羊水からの診断の速度及び効率を高めるために、信頼性の高い試験が必要とされている。
【００６７】
３．生体液のプロテオミクスプロフィールを用いた母体／胎児の状態の診断
本発明は、生体液、例えば、羊水、血清、血漿、尿、能脊髄液、母乳、粘液、又は唾液のプロテオミクスプロフィールによって上述及び他の類似の母体／胎児の状態を診断するための、初期及び信頼できる、非侵襲方法を提供する。
【００６８】
上に注記されたように、本発明の本文において、用語「プロテオミクスプロフィール」は、生物学的サンプル中、例えば、所与の時間での生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの代表例を示すために使用される。プロテオミクスプロフィールは、例えば、マススペクトルとして表すことができるが、タンパク質の物理化学的性質又は生化学的性質のいずれかに基づく他の代表例も含まれる。生体液のプロテオーム中に存在するタンパク質の全て又はいくつかを同定し、配列決定することが可能であるが、このことは本発明に従って作成されるプロテオミクスプロフィールの診断使用には必要ではない。特定の疾患の診断は、診断される疾患又は病的な状態が存在する場合に、正常なプロテオミクスプロフィールと同じ状況下で得られた生体液のプロテオミクスプロフィールとの特徴的な差異（固有の発現サイン）に基づくことができる。固有の発現サインは、統計学的に有意な様式で、同じ種類の供給源から得られる対応する正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィールとは異なる、試験又は参照生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィール内の任意の固有の特徴又はモチーフであることができる。例えば、プロテオミクスプロフィールがマススペクトルの形態で存在する場合、固有の発現サインは、典型的には、対応する正常サンプルのマススペクトルとは定性的又は定量的に異なるピーク又はピークの組み合わせである。従って、マススペクトルにおいて新たなピーク又は新たなピークの組み合わせの出現、又はマススペクトルにおいて既存のピーク又は既存のピークの組み合わせの振幅又は形状における任意の統計学的に有意な変化を、固有の発現サインであるとみなすことができる。哺乳動物被検体から得られた試験サンプルのプロテオミクスプロフィールは、病的な母体又は胎児の状態に特徴的な固有の発現サインを含む参照サンプルのプロテオミクスプロフィールと比較され、参照サンプルと共通の固有の発現サインを有している場合、哺乳動物被検体はこのような病的な状態であると診断される。
【００６９】
特定の病的な母体／胎児の状態は、診断される被検体から得られる生体液のプロテオミクスプロフィールと、同じ様式で得て、診断された同じ種類の正常な生体液のプロテオミクスプロフィールとを比較することによって診断することができる。試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと本質的に同じである場合、被検体は、被検体の病的な母体／胎児の状態を有していないとみなされる。試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと比較して固有の発現サインを示す場合、被検体は、問題となる母体／胎児の状態と診断される。
【００７０】
それに代えて又はそれに加えて、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールは、問題となる病的な母体／胎児の状態と独立して診断された被検体の生体液から得られた参照サンプルのプロテオミクスプロフィールと比較されてもよい。この場合には、被検体は、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと参照サンプルのプロテオミクスプロフィールとが、固有の発現サインを表す少なくとも１つの特徴又は特徴の組み合わせを共通して持っている場合、病的な状態と診断される。
【００７１】
本発明の方法では、正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィールは診断において重要な役割を果たす。上に議論されたように、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィールと本質的に同じである場合、患者は、同定される病的な母体／胎児の状態を有していないと診断される。患者が、潜在的に副作用があり得るか、又はそうでなくても患者、胎児又は新生児を危険な状態に置き得る、不必要な処置又は介入を受ける必要性を排除するため、この「陰性」診断は、非常に重要性が高い。このデータは、その差異が統計学的に有意であるか否かを決定するために分析される。
【００７２】
本発明の診断方法の感度は、従来のタンパク質分離方法を用いて、本質的に同じ発現レベルで正常プロテオーム及び疾患プロテオームの両方に見出されるタンパク質（一般的なタンパク質、例えば、アルブミン及び免疫グロブリン）を分析の前に除去することによって高めることができる。固有の発現サインの一部分ではないこのような一般的なタンパク質の除去により、改良された感度及び診断の精度が得られる。それに代えて又はそれに加えて、一般的なタンパク質の発現サインは、診断を呼び出すために、典型的には、機械が配置されているスペクトル選択アルゴリズムを用いた結果のコンピューター分析の間に排除できる（か又はシグナルを除去することができる）。以下の実施例に詳細に記載される結果は、統計学的に有意な様式で、羊水の正常プロテオミクスプロフィールとは異なる、羊膜内感染（ＩＡＩ）に特徴的なプロテオミクスプロフィールを表す。それに加えて、実施例はそれぞれ、ＩＡＩ及びダウン症候群に特徴的な発現マーカー及び固有の発現サインを表す。
【００７３】
プロテオミクスプロフィールを比較するための統計学的方法は当該技術分野で周知である。例えば、マススペクトルの場合には、プロテオミクスプロフィールは、スペクトルの平行軸に沿った、キーとなる質量／電荷（Ｍ／Ｚ）位置でのピーク振幅値によって定義される。それ故に、特徴的なプロテオミクスプロフィールは、例えば、与えられたＭ／Ｚ値のスペクトル振幅の組み合わせによって形成されるパターンによって特徴付けることができる。特徴的な発現サインの存在又は非存在、又は２つのプロフィールの実質的な同定は、試験サンプルのプロテオミクスプロフィール（パターン）と参照サンプル又は正常サンプルのプロテオミクスプロフィール（パターン）とを適切なアルゴリズムで照合することによって決定することができる。プロテオミクスパターンを分析するための統計学的方法は、例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５９：５７２−７７（２００２）．；Ｉｓｓａｑ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９２：５８７−９２（２００２）；Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８：３９５−４０４（２００２）；ａｎｄ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，４８：１２９６−１３０４（２００２）に開示される。
【００７４】
特定の実施形態では、患者から得られたサンプルは、タンパク質チップに適用され、プロテオミクスパターンは質量分析法によって作成される。スペクトル内のピークのパターンは、上述のように、好適なバイオインフォマテクスソフトウェアによって分析することができる。
【００７５】
４．スクリーニングアッセイ
本発明のプロテオミクスプロフィールはさらに、特定の母体／胎児の状態の処置のために、候補薬物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいてさらなる有用性を見出す。このようなスクリーニングアッセイは、試験分子が、処置される母体／胎児の状態に特徴的な発現サインを含有するプロテオミクスプロフィールを発現サインを欠いたプロテオミクスプロフィールに変換する能力に基づく。１つの特定の実施形態では、試験化合物が病的な発現プロフィールを正常な発現プロフィールに変換する能力が試験され、別の実施形態では、スクリーニングアッセイは、試験化合物が、病的な状態に特徴的な固有の発現サインを対応する正常な発現サインに変換する能力を試験する。このようなスクリーニングアッセイは、疾患の生物学的サンプルを処置し、処置前と処置後のプロテオミクス発現プロフィールを比較することによって、インビトロで行うことができる。それに代えて又はそれに加えて、標的の病的な母体／胎児の状態を示す実験動物を試験化合物で処置し、処置前及び処置後の動物の生体液を採取し、２つのサンプルのプロテオミクスプロフィールを比較することによって、薬物スクリーニングを行うことができる。このアッセイでは、生体液のサンプルを処置後の種々の時間点で、及び処置後の時間推移に沿って採取することも可能である。これらの方法論は、薬学的薬剤の毒性を特徴決定するため、及び特定の治療のための最適候補物を同定するために適用してもよい。
【００７６】
試験化合物は、例えば、ペプチド、非ペプチド有機低分子、タンパク質、ポリペプチド、抗体（抗体フラグメントを含む）、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチドデコイ、及び薬物又は候補薬物として以前に使用された任意の他の種類の分子であることができる。
【００７７】
生体液は、例えば、羊水、血清（例えば、母体血清）、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、又は唾液であることができる。
【００７８】
同定された治療的に活性な化合物は、従来の薬学的配合物中に配合することができる。当該技術分野で公知の配合物の要約は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出される。このマニュアルの参照は当該技術分野で通常のことである。
【００７９】
５．タンパク質及び抗体アレイ
上に議論される診断アッセイ及びスクリーニングアッセイの両方は、タンパク質アレイを用いて行うことができる。近年、タンパク質アレイは、タンパク質を検出し、それらの発現レベルを監視し、タンパク質相互作用及び機能を観察するための強力な手段として広く認識されている。それらは、自動化手段を用いて多くの数の決定を同時に行うことができる場合、高スループットタンパク質分析を可能にする。ＤＮＡアレイのために元々開発されたマイクロアレイ又はチップフォーマットでは、大量のデータを作成しつつ最小限の物質の使用でこのような決定を行うことができる。
【００８０】
上述のような２Ｄゲル電気泳動及び質量分析法によるプロテオーム分析は非常に効果的ではあるが、常に高い感度を提供するわけではなく、低い発生量で発現する多くのタンパク質を分析できない場合がある。タンパク質マイクロアレイは、それらの高い効率に加えて、改良された感度を提供する。タンパク質アレイは、当該技術分野で周知の種々の共有結合又は非共有結合の化学を用いて、固体表面上、例えば、ガラス、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜、及びマイクロビーズ上にタンパク質を固定することによって形成される。固体支持体は、カップリング手順の前及び後に化学的に安定であり、良好なスポット形態を可能にし、非特異的結合を最少にするべきであり、検出システムにおけるバックグラウンドに影響をあたえないべきであり、異なる検出システムと適合性であるべきである。
【００８１】
概して、タンパク質マイクロアレイは、ＤＮＡアレイの読みのために一般的に使用されるものと同じ検出方法を使用する。同様に、ＤＮＡマイクロアレイの読みのために使用されるものと同じ装置はたんぱく質アレイに適用可能である。
【００８２】
従って、捕捉アレイ（例えば、抗体アレイ）は、２つの異なる供給源、例えば正常性体液及び疾患性体液由来の蛍光標識されたタンパク質を用いてプローブ化することができる。この場合では、読み出しは、標的タンパク質の発現レベルにおける変化を反映するものとして蛍光シグナルにおける変化に基づく。代替的な読み出しとしては、限定されないが、蛍光共鳴エネルギー転移、表面プラズモン共鳴、ローリングサークルＤＮＡ増幅、質量分析法、共鳴光分散、及び原子力顕微鏡が挙げられる。
【００８３】
さらなる詳細のために、例えば、Ｚｈｏｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：Ｓ３４−９（２００１）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４０−４５−（２００１）；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎｏｃｋ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４２：４９４−５００（２００３）；ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：１４−９（２００２）を参照。生体分子アレイはさらに、米国特許第６，４０６，９２１号（２００２年６月１８日に登録）にも開示され、その開示全体は、ここで参考として明らかに組み込まれる。
【００８４】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかである。
【実施例】
【００８５】
実施例１
一般的なプロトコル
羊膜内感染の霊長類モデル
このプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒｅｇｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒによって承認され、ヒトのケアのためのガイドラインに従った。時間通りの妊娠状態の１９匹の妊娠したアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を、慢性的にカテーテル挿入し、以前に記載されているとおりに手術後に維持した（Ｈａｌｕｓｋａ ＧＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＲＵ ４８６ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎ ｌａｔｅ ｇｅｓｔａｔｉｏｎ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １５７：１４８７−９５（１９８７）；ａｎｄ Ｇｒａｖｅｔｔ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｔｒａ−ａｎｍｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１：１６６０−７（１９９４））。
【００８６】
簡潔に述べると、妊娠約１１０日（期間は１６７日である）に、妊娠した動物をジャケット内及び綱システムで慣らした（Ｄｕｃｓｓａｙ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖｅｓｔ ａｎｄ ｔｅｔｈｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ３８：３４３−４（１９８８））。慣らした後、一般的な麻酔下で妊娠１１９日〜１２６日に子宮内手術を行った。母体の大腿動脈及び静脈カテーテル、胎児の動脈及び静脈カテーテル、２つの開口末端を有する羊膜内圧力カテーテル、子宮筋層の筋電法の電極、及び胎児の筋電法の電力を外科的に移植した。手術後１〜５日間、子宮の非刺激性を制御するために全ての動物に硫酸テルブタリン（１日に２回、３〜５時間にわたって１ｍｇを静脈投与）を与えた。動物にさらにセファゾリン（１２時間ごとに２５０ｍｇを静脈投与）を与え、バクテリアの接種前少なくとも４８時間に投与をやめた。
【００８７】
８〜１３日間（妊娠１２６〜１３８日）操作後に安定させた後、（ａ）生理食塩水中に懸濁させたグループＢ連鎖球菌（タイプＩＩＩ）の１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）（ｎ＝７）、（ｂ）１０Ｂ培地に懸濁させたＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ １０７ｃｆｕ（正式にはＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、血液型亜型１）（ｎ＝６）、又は（ｃ）１０％のショ糖及び２％の内毒素の存在しない胎児子ウシ血清を含むリン酸緩衝化食塩水に懸濁させたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ１０６〜１０７ｃｆｕ（ｎ＝６）を羊膜内接種することによって実験的な羊膜内感染（ＩＡＩ）を確立させた。グループＢ連鎖球菌単離物は、髄膜炎をもつ新生児からもともと回収した。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍは、絨毛羊膜炎及び新生児セプシスをもつ患者の胎盤及び膜から低継代させた臨床単離物由来であった。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓは、ｐｏｓｔｍａｒｔｕｍ子宮内筋層炎をもつ患者由来の子宮内膜単離物であった。
【００８８】
試験期間中（接種前は毎日、接種後は４時間〜１２時間ごと）、定量的なバクテリア培養物、血球計算板による白血球細胞分析、及びサイトカイン濃度及びプロスタグランジン濃度のために（以前に報告されたＧｒａｖｅｔｔ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１：１６６０−７（１９９４））、及びプロテオミクス分析のために、全ての動物から羊水サンプルを順次集めた。
【００８９】
胎児の心電図及び子宮活性（心電図及び羊膜内の圧力）を、手術から分娩まで連続して記録した。時間あたりの収縮曲線の下の面積として子宮の収縮を記録し、ある時間の収縮面積（ＨＣＡ）（ｍｍＨｇ／時間（秒））として表した。
【００９０】
母体の頚を感染前に膣から触診し、その後も順次触診した。一致性、消失、及び膨張を各触診ごとに記録した。１匹の動物を除いて帝王切開によって分娩させ、１匹の動物においては膣から分娩させた後、感染を確認するために胎児、子宮脱落膜、胎盤、及び内膜のバクテリア培養物を得て、絨毛羊膜炎の証拠を出すために組織病理学的な研究を行った。
【００９１】
感染は上述のように行われた羊膜内接種の後、迅速に確立されていた。子宮絨毛羊膜炎が基本レベル１００から１０，０００ｍｍＨｇ×ｓｅｃ／ｈｒよりも大きなレベルまでの増加が、平均でグループＢ連鎖球菌を用いて接種した３３＋９時間後、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍを用いて接種した４３±１４時間後；及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓを用いて接種した６２±１４時間後に生じた。子宮収縮は進行性の頚部の膨張をもたらし、全ての場合において消失した。子宮収縮の増加は、以前に報告されているように、炎症前サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ−８、プロスタグランジンＥ２及びＦ２αにおける顕著な増加に先行した（Ｇｒａｖｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１：１６６０−７（１９９４））。陣痛の発生前にＩＡＩの臨床的な徴候を示した動物はいなかった。絨毛羊膜炎を全ての場合において確認した。
【００９２】
ヒトの研究（女性における潜伏的なＩＡＩ）
以前に記載されるように、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ又はシアトルの関連病院で１９９１年６月２５日〜１９９７年６月３０日まで、インタクトな胚膜を持つ妊娠２２〜３４週での早期分娩で入院した３０９人の女性から研究集団を抜き出した（Ｈｉｔｔｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７７：５０−６（１９９７））。全ての女性は、書面によるインフォームドコンセントを受けておリ、試験プロトコルは、全ての参加病院についてＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓによって承認された。全ての参加者は、研究登録時にインタクトな胚膜を有していた。早期分娩は、＞１ｃｍの頚部の変化又は頚部の膨張又は＞５０％の頚部成熟度のいずれかを伴って、≦１０分の頻度での規則的な子宮収縮として定義された。
【００９３】
潜伏的なＩＡＩは、陽性のＡＦ微生物培養物及び／又はＡＦインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度＞２ｎｇ／ｍｌ、絨毛羊膜炎の組織学的証拠（１０の隣接しない部分において４００倍の部分あたり、≧１０の多形核の白血球の存在によって定義される）及び子宮圧痛又は発熱の非存在によって定義された。本発明者らは以前に、報告した。ＡＦ ＩＬ−６濃度＞２ｎｇ／ｍｌは試験集団全体について７５パーセンタイル以上であり、ポリメラーゼ連鎖反応によるバクテリアの検出と相関関係にあることを報告した（Ｈｉｔｔｉｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２４：１２２８−３２（１９９７））。入院時に＞４ｃｍの頚部膨張又は破壊された膜を持つ女性は排除した。多胎妊娠、頚部セルクラージュ、前置胎盤、常位胎盤早期剥離、糖尿病、高血圧、及び子かん前症の女性は、他の基準を満たせば適格とみなした。
【００９４】
経腹壁的な羊膜穿刺を全ての試験参加者について超音波による誘導の下で行い、登録時に静脈穿刺によって母体の静脈血を集めた。この研究集団から、部分集合（表１Ａ及び１Ｂ）は、ここで報告されるようなプロテオミクス分析について遡及的に同定した。この部分集合は、それぞれ１１人の患者の３つのグループを含んでいた：グループＩ−上に定義されるような潜伏性のＩＡＩの証拠を有する患者；グループＩ−記録された子宮内感染を有さないが、３４週以下の妊娠期間での早期出産をした患者のランダムに選択された部分集合、及びグループＩＩＩ−感染しておらず、早期分娩を有したが早産防止薬に反応して、後でほぼ所定期間に近い期間（妊娠＞３５週）で後に分娩した患者。これら３つのグループ間で母体の年齢、人種、又は経産に差異はなかった（表１Ａ及び１Ｂ）。しかし、子宮内感染を有する患者は、登録時にはいくらか在胎齢が早くにみられ（ｐ＝０．１０）、感染なしに早期出産した患者又は所定の期間で分娩した患者よりも顕著に早い在胎齢で分娩した（それぞれ、２７．３±０．９週 対 ２９．８±１．０及び３７．０±０．９週、ｐ＜０．０００ｌ）。それに加えて、子宮内感染を有する患者は、登録から分娩まで顕著に短い時間を有していた（他の２つのグループの８．４±６．３日及び４６．９±５．６日と比較して、２．１±５．６日、ｐ＜０．０００１）。子宮内感染を有する患者の９１％が、登録の７日以内に分娩した。分析までサンプルを−２０℃で保存し、２回を超えては解凍しないようにした。
【００９５】
感染を有する１１人の患者の中で、４人から（大腸菌を有する２人、カンジダアルビカンスを有する１人、及び混合嫌気菌を有する１人）微生物を回収し；これらの患者の全ては７日以内に分娩した。他の７人の患者は、２，０００ｐｇ／ｍｌより大きな羊水ＩＬ−６濃度に基づいて同定した。インターロイキン−６の平均羊水濃度は、感染なく早期出産をした患者の中の０．６８±０．２０ｎｇ／ｍｌ及び早期分娩があり、所定期間に分娩した患者の中の０．２５±０．１３ｎｇ／ｍｌと比較して、これらの患者の中で２７．７±７．８ｎｇ／ｍｌであった（ｐ＜０．０１）。
（表１Ａ）
試験集合の特性
【００９６】
【表１Ａ】
データは、平均、標準偏差で示した。連続データについてのＡＮＯＶＡによる分析及びカテゴリーデータについてのカイ二乗分析として表された。省略語：ＰＭＤ，早期分娩＜３５週；ＩＵＩ、子宮内感染；ＰＭＬ、分娩なしの早産。
（表１Ｂ）
スクリーニング結果
【００９７】
【表１Ｂ】
＊このプール中の２つの陽性サンプルは、ＰＣＲ手順によって陽性の、２つの被検体のＡＦが低レベルのバクテリアを示したことから、潜伏性感染を表す。このことは、タンパク質プロファイリングが潜伏性羊膜内感染を同定するのに使用可能であることを示す。
【００９８】
上述の表では、データは、平均、標準偏差で示した。連続データについてのＡＮＯＶＡによる分析及びカテゴリーデータについてのカイ二乗分析として表された。省略語：ＰＭＤ，早期分娩＜３５週；ＩＵＩ、子宮内感染；ＰＭＬ、分娩なしの早産。
（表１Ｃ）
試験結果をスクリーニングするためのＦｉｓｈｅｒ試験の有意性値
【００９９】
【表１Ｃ】
不顕性のＩＡＩをもつ１１人の患者のうち４人は、回収された微生物を有していた（大腸菌を有する２人、カンジダアルビカンスを有する１人、及び混合嫌気菌を有する１人）。感染している他の７人の患者は、＞２ｎｇ／ｍｌの顕著に高いＡＦ ＩＬ−６濃度をもとに同定した。ＩＬ−６の平均ＡＦ濃度は、感染なく早期出産をした患者の中の０．６８±０．２０ｎｇ／ｍｌ及び早産があるが、所定期間に分娩したグループＩＩＩの患者の中の０．２５±０．１３ｎｇ／ｍｌと比較して、これらの患者の中で２７．７±７．８ｎｇ／ｍｌであった（ｐ＜０．０１）。
【０１００】
羊水のプロテオミクス分析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるタンパク質同定
コントロールサンプル及び感染サンプル由来の羊水１００μｇを、ヨードアセトアミドで還元し、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。８０Ｖで電気泳動を行ない、サンプル中のタンパク質を分離した。電気泳動の後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色し、画像をＢｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーター及びＰＤＱＵＥＳＴソフトウェアで集めた。各レーンからの個々のバンドをゲルから切断し、脱色し、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１２：４８７−５１１（１９９９））の方法を用いて、ゲル中でトリプシンで３７℃で２４〜４８時間消化した。ペプチドを０．１％ＴＦＡで抽出し、スピードバキューム（ｓｐｅｅｄｖａｃ）中で乾燥した。抽出物を０．１％ＴＦＡに溶解し、Ｚｉｐ Ｔｉｐｃ１８ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を用いて、ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）に接続したＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，ＵＫ）を用いて、及び／又は１１０ キャピラリーＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に接続したイオン捕捉（ＬＣＱ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、精製した（Ｍａｒｖｉｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４（１４）：１２８７−９２，２０００）。
【０１０１】
２−次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動
羊水（４００〜２０００μｇ）（アルブミンを含むものと含まないもの）をＩＥＦバッファーに溶解し、ＩＰＧ片（ｐＨ３〜１０）２４ｃｍに室温で１２時間再水和させた。再水和後、ＩＰＧ片を７０〜９０ｋＶｈｒｓで１次元電気泳動にかけた。次いで、ＩＰＧ片をＤＴＴ平衡バッファーＩ及びＩＡＡ平衡バッファーＩＩを用いて順次１５分間平衡化させ、その後２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。次いで、ＩＰＧ片を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに入れ、１２０Ｖで１２時間ゲル電気泳動し、２次元でタンパク質を分離した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーター及びＰＤＱＵＥＳＴソフトウェアを用いて画像化した。個々のスポットをゲルから切断し、脱色し、ゲル中でトリプシンで３７℃で２４〜４８時間消化した。ペプチドを０．１％ＴＦＡで抽出し、Ｚｉｐ Ｔｉｐｃ１８ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を用いて精製した（２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：１１２，１９９９）。
【０１０２】
ＨＰＬＣ分画
アルブミン及びＩｇＧを除去した後のヒト羊水サンプル（１〜１５ｍｇタンパク質）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。オートサンプラー及びＵＶ吸収検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ １５２５ ＨＰＬＣ上でＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを用いてアニオン交換クロマトグラフィーを行った。直線的な塩溶離勾配を用いてタンパク質を分画した。フラクションを１分ごとに集めた。フラクションをプールし、トリプシンで消化し、ペプチド混合物を質量分析計（Ｑ−Ｔｏｆ−２）を用いて分析した。
【０１０３】
質量分析計による分析
（１）Ｑ−Ｔｏｆ−２
ゲル中で消化した後のサンプルをＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＣａｐＬＣに接続したＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ−２質量分析計で分析した。Ｑ−Ｔｏｆ−２に規則的なＺ−スプレー又はナノスプレー源を取り付け、Ｉｎｔｅｇｒａｆｒｉｔ Ｃ１８ ７５ｕｍ ＩＤ×１５ｃｍ石英ガラスキャピラリーカラムに接続した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴ及びＭａｓｓＬｙｎｘ３．５ソフトウェアを入れたＣｏｍｐａｑワークステーションで、装置を制御し、データを得た。ＣａｐＬＣ内に直接注入又は注射することによってＱ−Ｔｏｆ−２をＧｌｕ１Ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｂを用いて較正した。ＭＳ／ＭＳＭＳ調査方法を使用して、ＭＳ／ＭＳＭＳスペクトルを得た。ＭＳ調査について質量４００〜１５００をスキャンし、ＭＳＭＳについて質量５０〜１９００をスキャンした。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００及びＳＥＱＵＥＳＴ（バージョン１．３）及び／又はＬＵＴＥＦＩＳＫを入れたＰＣで一次データ分析を行った。ピークピッキングのためのビルトイン自動化機能を用い、各ピークについて質量中心−フィッティングを適用して、ピークリストを作成した。
【０１０４】
（２）ＬＣＱ−ＭＳ
乾燥したＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ染色したゲルからのタンパク質スポットを切除し、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５０％アセトニトリル溶液０．５ｍｌ中で３０分間再水和／洗浄した。次いで、ゲル領域を真空遠心分離によって乾燥し、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：４８７−５１１（１９９９）の方法を用いて、２０ｎＭシーケンスグレード改変トリプシン（ＰｒｏＭｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で再水和させることによって系中で消化した。次いで、トリプシン消化物を真空遠心分離によって濃縮し、逆相クロマトグラフィーによって分離し、ペプチドをモデルＬＣＱイオン捕捉質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分析した。サンプルを、１０μＬｍｉｎ−１流速及び勾配０〜４０％Ｂ（水中の７５％アセトニトリル）を１時間かけて、Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−１８ ０．５ｍｍ×１５０ｍｍミクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）カラムを用いて、１１００キャピラリーＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて分離した。標準的なＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ電気スプレー源にペプチドを直接導入した。標準的なＬＣＱソフトウェアを用いて自動化様式でＭＳ／ＭＳスペクトルを得て、次いで、ＳＥＱＵＥＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いてさらに分析した。さらなる詳細のために、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．（前出）を参照。
【０１０５】
データ分析
（１）Ｓｅｑｕｅｓｔ及びＤＴＡＳｅｌｅｃｔ ＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて、Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３−６９（１９９９）に記載されるように、タンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の自動化分析を行った。ＳＥＱＵＥＳＴは、データベースペプチド配列に対して連続的なタンデムマススペクトルを一致させる。索引付きの重複のないＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（公開日）及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（公開日）から得られたタンパク質配列のデータベースを組み合わせて使用して、デフォルトパラメーターを用いてサーチを行った。Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｍａｎａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いてデータベースを構築した。Ｓ−カルボキシアミド化システインは、単なる改変であるとみなされた。
【０１０６】
Ｓｅｑｕｅｓｔの結果をＤＴＡＳｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔａｂｂ，２００２）を用いてさらに分析した。ＤＴＡＳｅｌｅｃｔはＳＥＱＵＥＳＴ同定物を系統立て、ふるい分ける。以下のものを除いてデフォルトパラメーターを使用した：（１）タンパク質の記載中に列「ケラチン」を含む任意のデータベースマッチは排除され、（２）ＬＣＱ質量分析計からのスペクトルを二重に荷電したイオンについて２．４の交さ相関スコアカットオフでふるい分けられた。ＤＴＡＳｅｌｅｃｔによって選択された各スペクトル及び提案された配列対を視覚的に観察し、管理のために最終的な結果をスプレッドシート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）又はデータベース（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａｃｃｅｓｓ）にインプットした。
【０１０７】
さらなる詳細については、Ｔａｂｂ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．，ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ：Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１：２１−２６（２００２）も参照。
【０１０８】
（２）Ｌｕｔｅｆｉｓｋ コンピュータープログラムＬｕｔｅｆｉｓｋ １９００ ｖ１．２．５（Ｔａｙｌｏｒ ＪＡ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＳ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７３（１１）：２５９４−６０４（２００１）を用いて、全てのスペクトルの自動化デノボ配列決定を行った。Ｌｕｔｅｆｉｓｋは、ホモロジー−ベースの配列サーチのために十分詳細であるスペクトルについてペプチド配列を作成する。改質、アクリルアミド、カルバミドメチル化、及びリン酸化を考慮した。
【０１０９】
ＭＡＬＤＩ検出プロトコル及びパラメーター
二段階遅延抽出源を備えた特注の飛行時間反射質量分析計（Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ７（６）：４９６−５０１（１９９３））を用いて、ＭＡＬＤＩ質量分析法を行った。約１μＬのサンプル溶液を１μｌのＳＡ（６０：４０水／アセトニトリル ０．１％ＴＦＡ最終濃度中のシナピン酸）と混合した。この検体／マトリックス溶液の１．０μＬの液滴をマトリックス前結晶化サンプルプローブ上に付着させ、空気中で乾燥させた。（３５５ｎｍ）Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）を用いてサンプルを照射し、２３ｋＶで７００ｎｓ／１．０ｋＶの遅延を有したイオン源を操作することによって、マススペクトルを作成した。２０の連続したスペクトルの合計として各マススペクトルを記録し、それぞれ光子の単独のパルスによって作成された。追加した標準からのイオンを質量較正に使用した。
【０１１０】
羊水のＳＥＬＤＩ分析
羊水サンプルからの全０．５〜３．０ｕｇタンパク質でＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅ ＮＰ２０（ＳｉＯ２表面）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｈ４（疎水性表面：Ｃ−１６（長鎖脂肪族）、又は固定化ニッケル（ＩＭＡＣ）ＳＥＬＤＩタンパク質Ｃｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上に点を付けた。室温で１時間インキュベーションした後、ＮＰ１及びＨ４チップを５ｕｌの水洗浄液にさらし、結合していないタンパク質及び干渉物質（すなわち、バッファー、塩、洗剤）を除去した。２〜３分空気乾燥した後、５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中のシナピン酸の飽和溶液０．５ｕｌを２回適用し、０．５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）を添加し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（ＰＢＳＩＩ），Ｉｓｓａｑ，Ｊ．Ｈ，ｅｔ ａｌ．：Ｔｈｅ ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ。Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．５；２９２（３）：５８７−９２，２０００中の飛行時間質量分析計によって質量分析を行った。
【０１１１】
ポリクローナル抗体及びＷｅｓｔｅｒｎイムノブロッティング
対応するタンパク質由来の免疫抗原性のペプチドを使用してウサギポリクローナル抗体（ＤＳＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）を作成し、次いで、アフィニティー精製した抗体をＷｅｓｔｅｒｎブロットのために使用した。１００μｇのＡＦタンパク質を４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。母体血清から、３００μｇのタンパク質をＩＧＦＢＰ１モノクローナル抗体（ＤＳＬＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた免疫沈降のために使用し、生成物をＷｅｓｔｅｒｎブロットした。母体血清中のカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂの検出のために、１５０μｇのアルブミンを除去した母体血清をＷｅｓｔｅｒｎブロットのために使用した。ＰＢＳＴ中の５％脂肪除去牛乳を用いて室温で４５分間、膜をブロックし、１μｇ／ｍｌの一次抗体（ＩＧＦＢＰ−１、アズロシジン、ビタミン−Ｄ結合タンパク質及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）−Ｂ、ＤＳＬ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡから）を用いて４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（シグマ）を用いて膜をインキュベートし、高められた化学ルミネセンスを用いて視覚化した。
【０１１２】
実施例２
羊水中で発現したタンパク質及びポリペプチドの同定
実施例１に記載された物質及び方法を用いて、正常羊水及び感染羊水中で発現したタンパク質及びポリペプチドを同定した。ヒト及び霊長類の羊水サンプル（プールしたもの及び個々のもの）を、実施例１に記載されるようなタンパク質分離技術で分離した（１−Ｄ、２−Ｄ及びＨＰＬＣ分画）。分離したタンパク質（ゲルバンド、スポット及びフラクション）をトリプシンで消化して、ペプチドプールを作成した。ペプチドプールをタンデムＭＳを用いて分析して、それらのアミノ酸配列及び組成を解読した。
【０１１３】
スペクトル検証プログラムを用いて５０００のＭＳスペクトルを選択した。デノボ配列決定プログラム（Ｌｕｔｅｆｉｓｋ，Ｐｅａｋｓ）を用いてこれらのスペクトルファイルを分析し、各ペプチドに対応するアミノ酸配列を作成した。ペプチドプールから作成されたデノボ配列を使用して、実施例１に記載されるようにタンパク質及びＤＮＡデータベースをサーチした。
【０１１４】
ホモロジーマップ及び配列検証を用いて、種々のタンパク質の発現を羊水中で発見した。検出したタンパク質を、既知の構造類似性（配列ホモロジーマップ）に基づいて潜在的な機能について分析した。広範囲の疾患にかかわる重要な機能分類に属するタンパク質が発見された。ヒト羊水中で最初に発見されたタンパク質及びポリペプチドをこれらの潜在的な機能カテゴリーのもとで以下の表２に列挙する。
【０１１５】
免疫アッセイにおいて示差的に発現することが示されたタンパク質、及び感染した羊水中でより豊富に又は固有に現れるタンパク質は別個に表示する。この内容において、相対的な量は、参照サンプルと比較して、試験サンプル中の特定のポリペプチド又はタンパク質を表すペプチドの量として定義される。それ故に、同じタンパク質から誘導されるより多くのペプチドが、羊水の感染していない参照サンプルよりも感染した羊水中に存在する場合、タンパク質は、感染した羊水中でより豊富に現れる。
【０１１６】
表３は、羊水中に存在する以前に知られたタンパク質及びポリペプチドを列挙し、これらの存在は、本アッセイによって再確認された。感染に関連する事象のための既知のマーカーであるタンパク質は、別個に示される。
（表２）
ヒト羊水中で最初に発見されたタンパク質及びポリペプチド
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表２Ａ】
・タンパク質は免疫アッセイでも示差的に発現することが示される
＃これらのタンパク質を表すペプチドは、感染した羊水中でより豊富であるか、又は固有に検出される。
（表３）
人羊水中に存在することが以前に知られており、デノボ配列決定を用いて同定されたタンパク質及びポリペプチド
【０１１９】
【表３】
＊感染に関連する事象についての既知のマーカー
羊水中で初めて発見されたさらなるタンパク質が以下の表４に表される。
（表４）
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
【表４Ａ】
【０１２２】
【表４Ｂ】
【０１２３】
【表４Ｃ】
【０１２４】
【表４Ｄ】
【０１２５】
【表４Ｅ】
ＩＰＩ＝国際タンパク質指数
子宮内の状態のための診断マーカー：
上の表に列挙されたたんぱく質は、子宮内状態を検出し監視するための有望な候補である。このような状態及び対応するタンパク質マーカーのいくつかの例を以下でさらに詳細に議論する。
【０１２６】
発育不全のマーカーとしてのアクチン調整及び関連タンパク質：
表２の構造タンパク質の中に列挙されるモエシン（膜を組織化する伸長スパイクタンパク質）は、膜貫通タンパク質のアクチン細胞骨格に対する結合に関与し、種々の細胞シグナル伝達経路に関係していることが知られている（Ｓｐｅｃｋ Ｏ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｅｓｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｈｏ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ２；４２１（６９１８）：８３−７，２００３）。Ｒｈｏ−ファミリーＧＴＰａｓｅ及びそれらのエフェクターが、アクチン改変分子、例えばコフィリン及びプロフィリン（これらも表２の構造タンパク質として列挙されている）の活性を調整し、その結果、増殖の円錐伸長又は収縮に関連する細胞骨格に変化を生じることが知られていた（Ｔａｎｇ ＢＬ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ，４２（３）：１８９−２０３，２００３）。コロニン様タンパク質ｐ５７（表２において列挙される別の構造タンパク質）はさらに、アクチン架橋及びキャッピングに関与し（Ｗｅｉｔｚｄｏｅｒｆｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｒｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ２／３ ｉｎ ｆｅｔａｌ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２９３：８３６，２００２）、既知の発育不全において調節異常を示す。別のアクチン調整タンパク質であるゲルゾリン（表２中のトランスポーター／結合タンパク質の列挙されるゲルゾリン前駆体を参照）はさらに、発育において制御され、臓器系において重要であることが知られている（Ａｒａｉ Ｍ，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＤＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌｓｏｌｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２１５，２９７，１９９９）。１４−３−３タンパク質はさらに、シグナル伝達及び分化経路にかかわる既知の上皮マーカーであり、脳及び他の生体臓器の正常な発育に必須である（Ｗｕ Ｃ，Ｍｕｓｌｉｎ ＡＪ．Ｒｏｌｅ ｏｆ １４−３−３ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，１１９，４５，２００２）。
【０１２７】
それ故に、発育中に重要な役割を有する列挙されたアクチン調整タンパク質及び他の関連分子は、ヒト羊水中で最初に同定され、種々の臓器系の発育不全、例えば、染色体異数性から生じ得る、例えば、中枢神経系、心臓血管系及び他の筋骨格の奇形を検出するために使用可能であった。このことは、感染した羊水中で示差的に発現することが示され、その示差発現が免疫アッセイによって確認される、プロファイリングＩにとって特に正しい。
【０１２８】
感染及び免疫応答関連障害のマーカー：
マクロファージキャッピングタンパク質、白血球エラスターゼ、好中球ゲラテナーゼ関連リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｃｎ）、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｌｅｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、Ｌ−プラスチン（リンパ球サイトゾルタンパク質）及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）（表２中の免疫応答関連遺伝子の列挙を参照）の感染した羊水での本発明の検出は、最初にこれらのタンパク質の羊膜内感染における存在および調整を示す。これらのタンパク質のいくつかは、感染、炎症及びストレスに対する応答において免疫細胞の既知のレスポンダーである。マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）は、アクチンフィラメントを調整し、炎症プロセスに関与するＣａ（２＋）−感受性タンパク質である（Ｄａｂｉｒｉ ＧＡ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃＤＮＡ．Ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｌｓｏｌｉｎ／ｖｉｌｌｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １５；２６７（２３）：１６５４５−５２，１９９２）。同様に、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）は、外傷及び創傷治癒において役割を果たすことが知られているカルシウム結合タンパク質である（Ｔｈｏｒｅｙ ＩＳ．ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃａ２＋−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１００Ａ８ ａｎｄ Ｓ１００Ａ９ ａｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｉｎｊｕｒｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１；２７６（３８）：３５８１８−２５，２００１）。白血球エラスターゼ及び好中球ゼラチナーゼに関連するリポカルシン（ＮＧＡＬ）は、静菌機構及び溶菌機構に関与する（Ｇｏｅｔｚ ＤＨ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ＮＧＡＬ ｉｓ ａ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｒｏｎ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ．：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０（５）：１０３３−４３，２００２）。
【０１２９】
上述の免疫調整剤に加えて、本発明者らはさらに、感染した羊水中に２つの抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９及びアズロシジンを最初に発見した。抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９（ＬＬ−３７）はバクテリアリポ多糖類（１ｐｓ）に結合し、骨髄、精巣及び好中球中で発現する。Ｆａｌｌ−３９は肥満細胞の脱顆粒を刺激し、肥満細胞の強力な化学走性因子である。その抗菌活性のほかに、Ｆａｌｌ−３９は、肥満細胞を炎症病巣に動員する能力を有している場合がある。基本培地Ｅの存在下で、合成ＦＡＬＬ−３９は、大腸菌Ｄ２１及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｂｍ１１に対して非常に活性であった。皮膚のバリアの保全性が破壊された場合、Ｆａｌｌ３９が最初の防御線に参加し、局所的な感染及び微生物の全身侵襲を防ぐという防御的な役割が提案された（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ Ｂ，ｅｔ ａｌ．：ＦＡＬＬ−３９， ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ， ｉｓ ｃｙｓｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，３；９２（１）：１９５−９，１９９５）。
【０１３０】
アズロシジン（ＣＡＰ３７）は、ヒト好中球から単離されたカチオン性抗菌タンパク質であり、宿主防御及び炎症において重要な関係を有する。アズロシジンは、炎症中に放出され、単核球／マクロファージ機能、例えば、化学走性、生存の増加、及び分化を調整する（Ｐｅｒｅｉｒａ ＨＡ． ＣＡＰ３ ７， ａ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ；５７（６）：８０５−１２，１９９５）。
【０１３１】
プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターは、タンパク質制御において鍵となる役割を果たし、いくつかの鍵となる生理学的機構を制御する。本発明者らは、羊膜内感染を含むヒト羊水中で初めてプロテアーゼのセルピンファミリー（セルピン、扁平上皮細胞癌腫抗原１及び２、グリア誘導ネキシン）の発現を同定した。セリンプロテアーゼインヒビターのセルピンスーパーファミリーは、多くの生物学的経路において、プロテアーゼの制御において中心的な役割を有し、例えば、アミロイドーシス、プリオン脳障害及びハンチントン病及びアルツハイマー病のような構造的な疾患にかかわる。（Ｌｏｍａｓ ＤＡ，Ｃａｒｒｅｌｌ ＲＷ，Ｓｅｒｐｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ；３：７５９，２００２）。
【０１３２】
さらに、羊膜内感染において、本願発明者らは、免疫制御に関与する周知のプロテアーゼインヒビターであるシスタチンの発現を同定した（Ｖｒａｙ Ｂ，Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｓ，Ｈｏｅｂｅｋｅ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｉｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ；５９（９）：１５０３−１２，２００２）。
【０１３３】
列挙されたタンパク質は、感染及び／又は免疫応答関連障害の有望なマーカーである。
【０１３４】
マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ前駆体、Ｌ−プラスチン、アズロシジン、抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ、プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン、セルピンＩ２、及びシスタチンＡを表すペプチドが、正常な羊水と比較して感染した羊水中でさらに豊富に又は固有に検出され、免疫アッセイにおいて示差発現を示したことは注記すべきことである。
【０１３５】
それ故に、これらのタンパク質は、羊膜内感染及び／又は免疫応答関連障害のマーカーとして特に重要である。
【０１３６】
ヒト羊水中で検出された他の疾患（感染）に特異的なタンパク質
表２に列挙されたＧｐ−３４０改変体タンパク質は、ヒトの感染羊水中で検出され、肺において以前に同定されたスカベンジャーレセプターである。このタンパク質は、バクテリア（連鎖球菌及び改変体）に結合することが知られている。感染した羊水におけるこのタンパク質の検出は、ＩＡＩのためのバイオマーカーを同定するための本発明の感受性のプロテオミクスアプローチを補完する。従って、感染した羊水中で同定されたＧｐ−３４０改変体タンパク質は、それ自身で新生児セプシスを検出するのに有用である）。
【０１３７】
ＩＧＦＢＰ−１（タンパク分解性のフラグメント）
表２に示されるように、ＩＧＦＢＰ−１は、感染した羊水中で示差的に発現することが示された。インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）系は、胎児及び胎盤の成長に決定的に関与し、自己分泌／パラ分泌機構を介する子宮内膜中のステロイドホルモン作用を調整する。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、増殖及び分化を刺激し、インビトロでいくつかの細胞種において分化した細胞機能を維持した。子宮内膜間質細胞はＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩを産生し、さらに高アフィニティーのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を産生する。ＩＧＦ作用を調整可能な６つの高アフィニティーＩＧＦＢＰのｍＲＮＡは、ヒト子宮内膜中で発現される。ヒト子宮内膜中で最も豊富なＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ−１であり、これは、後期分泌段階及び妊娠中において、前脱落膜化／脱落膜化子宮内膜間質細胞によって分泌される。このことは、臨床的な産科学及び婦人科学について示唆を有し、ここに子かん前症、子宮内成長阻害、多嚢胞性卵巣症候群及び栄養芽細胞及び子宮内膜の新生物におけるＩＧＦＢＰ−１の病態生理学的な役割の証拠が存在する。
【０１３８】
ヒト羊水中及び母体血清中のＩＧＦＢＰ−１タンパク分解性のフラグメントの存在及び調整は、妊娠に関連する子宮内及び母体状態を監視するための新しい道筋を開く。
【０１３９】
さらなる詳細については、以下の実施例１２も参照されたい。
【０１４０】
実施例３
子宮内感染後の霊長類及びヒト羊水のタンパク質発現プロフィール
化学的に定義された正常相のチップアレイに結合したＡＦ抽出物の２３５レーザー強度で集めた全スペクトルＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析において、３〜５ｋＤａ及び１１〜１２ｋＤａ領域において、感染及び非感染の霊長類及びヒトのＡＦ間でいくつかのピーク強度が異なることがわかった
対応する正常な発現プロフィールと比較した場合の子宮内感染後の霊長類羊水のタンパク質発現プロフィールを図１Ａ〜Ｃに示す。図１Ａ〜Ｃに示されるように、コントロール及び感染羊水の全体的なタンパク質発現プロフィールは異なる。小さな質量範囲における羊水プロフィールの詳細なスペクトル（図１Ｂ及び１Ｃ）は、約３〜５ｋＤａ及び１０〜１２ｋＤａ範囲において、コントロールと感染サンプルとのタンパク質発現プロフィールが別個のものであり、特徴的に異なることを示す。このことは、子宮内感染に応答するタンパク質発現の全体的な調整を示し、子宮内感染を診断する固有の発現サインを検出する能力を示す。
【０１４１】
図２は、感染（ＧＢＳ）に応答する霊長類羊水の時間推移分析を示す。バクテリア接種の前及び感染後に順次羊水を集め、実施例１に示されるようなＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。図２Ａは感染前のタンパク質発現プロフィールを示し、図２Ｂは感染１２時間後のタンパク質発現プロフィールを示し、図２Ｃは感染３６時間後のタンパク質発現プロフィールを示す。
【０１４２】
図２Ｃに示されるように、子宮内感染の診断ピーク（１０〜１１ｋＤａ）のうちの１つは、急性感染の３６時間以内に、明らかに高いレベルの発現レベルに到達する。このことは、診断タンパク質プロフィールを、疾患の状況及び処置に対する応答を監視するために使用できることを示す。
【０１４３】
図３は、化学的に定義された正常相チップアレイに結合したヒト羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。図３Ａは、２３５レーザー強度での全スペクトルを示す。図３Ｂは、１０〜１２ｋＤａ領域における感染サンプル及びコントロールサンプルの間の差異を示す詳細なスペクトルである。図３は、３〜５ｋＤａ領域において感染サンプル及びコントロールサンプルの間の特徴的な差異を示す詳細なスペクトルである。
【０１４４】
図３Ａ〜Ｃに示されるように、コントロール羊水及び感染羊水の全体的なタンパク質発現 プロフィールは異なっている。さらに小さな質量範囲における羊水プロフィールの詳細なスペクトル（図３Ｂ及びＣ）は、コントロールサンプルと感染サンプルとの間でタンパク質が異なって過剰発現している（３〜５ＫＤａ及び１０〜１２ｋＤａ範囲）ことを示す。タンパク質ピークの相対強度分析は、２つの異なる診断クラスター（１０〜１２ｋＤａ及び３〜５ｋＤａ範囲）の存在を示唆する。このことは、子宮内感染に応答したタンパク質発現の全体的な調整を示し、ヒト及び霊長類モデルの両方における子宮内感染の診断に固有の発現サインを検出する能力を示す。
【０１４５】
ヒト羊水の診断パターンは、霊長類の羊水の診断パターンと良好に一致することは注記すべきことである（実施例３及び４）。
【０１４６】
実施例４
示差質量分析計を用いた診断プロフィールの作成
診断タンパク質発現プロフィールは、異なる種類の質量分析計を用いて検出することができる。異なる質量分析計が類似の診断プロフィールを作成するか否かを試験した。診断プロフィールが実質的に質量分析計の種類に依存しない場合、羊水中で検出された示差的なタンパク質発現は、子宮内感染の診断サインを与えることができる。
【０１４７】
図４は、ヒトコントロール由来の羊水（子宮内感染なし）（Ａ）、及び子宮内感染ありのサンプル（Ｂ）を用いて、一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で得たマススペクトルを示す（Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ７（６）：４９６−５０１（１９９３））。
【０１４８】
図４Ａ及びＢに示されるように、１０〜１２ｋＤａ範囲における子宮内感染の診断プロフィールは、代替の質量分析計を用いて検出され、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ機を用いて検出したプロフィールと類似である。このことは、示差的なタンパク質発現プロフィールが確固たるものであり、広範囲の現在の質量分析計を用いて検出できることを示す。
【０１４９】
まとめると、羊水タンパク質及びポリペプチドが、疾患の状況を診断する示差的な発現パターンを示すことがわかった。ここに示された結果は、疾患に特異的な診断パターンが複数の質量分析計アプローチを用いて検出可能であることを示す。パターン又はタンパク質発現プロフィールは、ヒト及び霊長類の間で比較可能である。プロフィールを使用して、時間が推移した場合の効果（感染又は処置）を監視することができる。
【０１５０】
実施例５
診断的及び予防的に監視するための羊水におけるタンパク質及びポリペプチド発現の定量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
多量の塩を含有するヒト羊水（ＡＦ）由来のタンパク質をアセトンで沈殿させた。１００μｇの羊水タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色した。ゲル画像をＢｉｏ−ＲａｄゲルＳｃａｎｎｅｒでスキャンした。
【０１５１】
図５は、ＳＤＳ−Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色したゲルを示す。（Ａ）プールした４つのヒトコントロールＡＦサンプル；（Ｂ）個々のコントロールＡＦサンプル；（Ｃ）プールした４つのヒト感染ＡＦサンプル；及び（Ｄ）個々の感染ＡＦサンプル。
【０１５２】
図５は、１０〜１５ｋＤａ範囲におけるコントロールタンパク質及び感染タンパク質の間の発現レベルの顕著な違いを示す。質量分析計を用いて質量検出されたこの質量におけるタンパク質及びタンパク分解性のフラグメントのいくつかが、タンパク質発現レベルを反映した診断プロフィールに関係することと、診断的有用性及び予後的有用性を有することが結論付けられた。
【０１５３】
実施例６
子宮内感染由来の羊水のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析
１００μｇのＡＦタンパク質を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに２００Ｖで６０分かけ、ＰＶＤＦ膜に９０ｍＭで７５分移した。膜を５％ミルクＰＢＳＴで室温で４５分間ブロックし、１μｇ／ｍｌの一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｄａｋｏ）で４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜を二次抗体ＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ）で室温で９０分間インキュベートし、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）で視覚化した。
【０１５４】
この結果を図６に示す：（Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールした）；（Ｂ）感染したＡＦサンプル（プールした）。図６は、ＩＧＦＢＰ１（１１ｋＤａ）、プロフィリン及びセルロプラスミン（１３０ｋＤａ）が、感染していないＡＦと比較して感染したＡＦでさらに高いレベルで発現していることを示す。Ｌ−プラスチンレベルは、感染していないＡＦと比較して感染したサンプルにおいて、さらに低かった。これらのタンパク質をさらに、ＭＳアプローチを用いてヒトの感染サンプルから同定し（デノボ配列決定）、上の実施例２に列挙した。
【０１５５】
実施例７
子宮内感染由来の羊水の免疫沈降分析
２μｇの一次抗体を６００μｇのＡＦタンパク質と混合し、４℃で一晩インキュベートした。１５μｌのタンパク質Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを追加し、シェーカー上で室温で６０分インキュベートした。ビーズをＩＰバッファーで６回洗浄した。
【０１５６】
結果を図７に示す。ここで、（Ａ）はコントロール羊水サンプル（プールされた）を示し、及び（Ｂ）は感染した羊水サンプルを示す。図７は、セルロプラスミン（約１３０ｋＤａ）及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）（約１６ＫＤａ）がコントロール羊水よりも感染した羊水においてさらに高いレベルで発現していることを示す。
【０１５７】
実施例８
ヒト羊水及び母体血清における示差的なタンパク質発現の検出
羊水中で示差的に発現するタンパク質を、母体血清における同様のタンパク質を測定するための手がかりとして使用することができるか否かを試験した。これにより、診断及び監視のための迅速な非侵襲試験を開発することが可能になる。結果を図８に示す。ここで、（Ａ）はコントロールサンプル（プールされた）であり、（Ｂ）は感染サンプルである（プールされた）。
【０１５８】
図８は、ＩＧＦＢＰ−１のより小さなタンパク分解性のフラグメントが、子宮内感染に応答して、ＡＦ及び母体血清の両方で一致して示差的に発現することを示す。
【０１５９】
実施例９
子宮内感染由来の羊水のタンパク質マイクロアレイ分析
抗体：ＩＧＦＢＰ−１（ＤＳＬ）；補体Ｃ３、Ｄｅｓｍｉｎ、好中球エラスターゼ、ＮＳＥ抗体（ＤＡＫＯ）；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）、セルロプラスミン、ＴＩＭＰ−１、プラスチン及びプロファイリング（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。
【０１６０】
抗体スポッティング：抗体を４０％グリセロール、６０％ＰＢＳ、ｐＨ７．５に１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、Ａｒｒａｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）を用いてアルデヒドスライドの上にスポッティングした。
【０１６１】
湿潤チャンバー中室温で３時間インキュベートした後、スライドを１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳ溶液（ｐＨ７．５）中で室温で穏やかに攪拌しながら１時間インキュベートした。
【０１６２】
タンパク質のビオチン化：Ｂｉｏｔｉｎ−ＮＨＳをＤＤ水に５０ｍｇ／ｌで溶解した。この溶液１０ｕｌを母体血清タンパク質溶液（１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ８．５）中５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、シェーカー上で３時間インキュベートした。５ｕｌのエタノールアミンを添加し反応を停止させた。ビオチン化タンパク質を２００ｕｌのＴＮＢバッファーで希釈し、抗体アレイを添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＴＮＴバッファーで３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、室温で３０分インキュベートした。Ｃｙ５−チラミド蛍光を用いて抗原−抗体相互作用を検出した。定量のためにスライドをＰＥ蛍光スキャナーでスキャンした。コントロール及び感染したスライドの画像を画像分析プログラムで重ね、相対量について擬似色で表した。結果を図９に示す。ここで、タンパク質アレイの擬似色画像は、対応するタンパク質とそれらの抗体との結合を示す。緑色は感染したサンプルを表し、赤色はコントロールサンプルを表す。部分ＩＩは、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）発現（緑色）が感染血清サンプルよりも高いことを示すアレイの拡大領域である。部分ＩＩＩは、感染羊水サンプル中で同様に多く発現していることを示すカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）ＩＰのＷｅｓｔｅｒｎブロットである。
【０１６３】
実施例１０
感染した羊水の固有の診断サイン中に表されるタンパク質のさらなる分析
コントロール及び感染した羊水のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロフィールが、陽性に感染したサンプルの代表例で、１０〜１２ＫＤａの質量範囲で固有のサインを示すことが示された（図１、２及び３）。コントロール及び感染した羊水を１−Ｄゲルで分離し（図５）、プールされたか又は独立した感染羊水サンプル中でさらに豊富な、１０〜１２ＫＤａの質量範囲におけるバンドを示す。これらの１−Ｄゲルバンドの単離及び図１３に示すようなＬＣＱ−ＭＳを用いたさらなる分析により、ＩＧＦ−ＢＲ−１及びＳ−１００カルシウム結合タンパク質の代表例であるペプチドを同定した。
【０１６４】
図８に示されるような抗−ＩＧＦ−ＢＰ１抗体を用いたコントロール及び感染した羊水のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析はさらに、感染においてタンパク分解性のフラグメント（約１１ＫＤａ）の示差的な発現を示す。
【０１６５】
羊水ポリペプチドの配列決定はさらに、感染した羊水中のＩＧＦ−ＢＰ１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）の存在を同定した（表３）。
【０１６６】
ＩＧＦＢＰ−１の同定した新規なタンパク分解性のフラグメント配列を図１２に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。図において、感染した羊水の１−Ｄゲル電気泳動、トリプシン消化及びＭＳ／ＭＳ分析後にサンプル中に見出されるペプチド配列「０４２６ｓｅｑ＿ＨＩ＿１２」及び「０４２５ｓｅｑ＿ＨＩ−１１３」を下の枠中に示す（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２及び３）。感染羊水由来のトリプシン消化した約１０．５〜１２ｋＤａバンドの１−Ｄゲル中で検出されたＩＧＦ−ＢＰ−１のタンパク分解性のフラグメント（低分子量範囲、図５）、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット（図６）、及びＭＳ／ＭＳ分析（図１３）は、下線を引いた配列の領域で現される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【０１６７】
実際に、ＭＳ／ＭＳ分析及び配列サーチの結果は、図１３に示されるマススペクトル中の親イオン４３４．８９がＩＧＦ−ＢＰ−１配列（ＲＳＰＧＳＰＥＩＲ）を表すことを示し、ＩＧＦ−ＢＰ−１タンパク分解性のフラグメントの配列マップが図１２に示される。親イオン１０８２．９７は、Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質（すなわち、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ及びＢ）を表し、ＡＦのデノボ配列決定によっても独立して同定される（表２及び３）。
【０１６８】
図１４は、図１３に示される保持時間１７．５５〜１８．２１分のピークのマススペクトルを示す。強く出てくるピークは質量４３４．９であることが明らかである。図１５は、図１４に示される４３４．９ピークの親イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。データベースサーチに基づいて、親イオンはＩＧＦＢＰ−１の部分配列に対応する。
【０１６９】
実施例１１
ＩＡＩバイオマーカーの免疫検出
ＩＡＩにおいて同定されるタンパク質の示差発現を確認するために、全体的なタンパク質発現分析において同定された１１−ｋＤａ ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳプロフィール（カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ及びＩＧＦＢＰ−１）、１つの免疫制御分子（アズロシジン）、及び制御されていないタンパク質（ビタミンＤ結合タンパク質）から２つのマーカーを選択した。図１６に示されるように、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析は、全ての３つのバイオマーカーが、ＩＡＩ羊水で行われたタンパク質同定実験と一致する示差的な発現を示すことを確認した。
【０１７０】
ＩＧＦＢＰ−１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂに対して開発した特異的抗体を利用することによって、羊水中で示差的に発現したタンパク質が、血清が入手可能な限定された数の患者（ｎ＝５）由来のプールされた母体血清中で同定できるか否かを観察した。この限定された分析において、感染羊水とコントロール羊水との間で示差的に存在する１１ｋＤａピークに対応する１１ｋＤａのタンパク分解性のＩＧＦＢＰ−１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂのフラグメントはさらに、ＩＡＩに応答して母体血清中で検出された（図１６ｄ及びｅ）。アズロシジンは母体血清中で検出されなかった。
【０１７１】
実施例１２
染色体異数性に特徴的な診断プロフィール
母体血清スクリーニングを用いてトリソミー−２１をより正確に同定するためにプロテオームプロファイリングの有用性を試験した。この研究は、パネル（コントロール（ｎ＝６）、トリソミー−２１（ｎ＝６）及びトリソミー−１８（ｎ＝４）、十分に特徴決定された母体血清サンプル（同じ症例についての羊水サンプルのマッチングは、標準的な染色体マッピング方法及び陽性確認されたトリソミーの存在により試験した）で行ない、子宮内感染モデルについて上に記載されるようなＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ方法論を用いて分析した。
【０１７２】
図１０は、トリソミーを区別するための固有のプロフィールを有する母体血清における示差的なタンパク質発現パターンを示す。１μｇの母体血清（タンパク質分離カラム（ＢｉｏＲａｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でアルブミン及び免疫アルブミンを除去した後）を使用して、上に記載されるように、化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合した母体血清抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。２３５レーザー強度で集めた全スペクトルは、ピーク強度における差異を示す。（Ａ）コントロール血清；（Ｂ）トリソミー−２１（ダウンの）血清；（Ｃ）トリソミー−１８血清。詳細なスペクトルは、４〜１５ＫＤａ範囲において差異を示し、それぞれの症例について固有である。矢印は、診断スクリーニング試験を開発するためのアルゴリズムを処方するための組み合わせにおいて使用可能な診断ピークを示す。このことはさらに、種々の生体液（例えば母体血清）のタンパク質発現パターンの検出が、胎児−母体の状態を非侵襲アプローチでさらに正確に同定可能であることを示す。
【０１７３】
臨床的に関連する微生物を利用した実験的な霊長類モデルにおける、および異なる微生物に感染したメスにおける、ＩＡＩの設定でのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける有意に過剰発現した１１ｋＤａピークの検出は、広範囲の病原体によって生じるＩＡＩのこのサインに特定的であることを確認した。この過剰発現したクラスターは、急性炎症をおこした組織中のマクロファージ及び上皮細胞によって発現する、この固有のクラスター中で同定された１セットのタンパク質、すなわち、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）は、Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質ファミリーのメンバーであるため、感染に対する基本的な子宮内免疫応答を表し得る。このクラスターからの第２の候補は、ＩＧＦＢＰ−１の特異的なタンパク分解性のフラグメントであり、感染に応答する潜在的なプロテアーゼ関連機構を示す。インタクトなＩＧＦＢＰ−１は、ＡＦにおいて見出される主要なＩＧＦＢＰであり、胚膜及び母体の脱落膜の両方によって合成される。ＩＧＦＢＰのタンパク分解性の開裂は、十分に特徴決定された現象であるが（Ｍａｉｌｅ ｅｔ ａｌ．ＩＧＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｔｅｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ ＩＧＦ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉ：Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ＣＲ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｃ，Ｊｒ．，ｅｄｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、本試験において記載される特定のフラグメントは以前に記載されていない。
【０１７４】
第２のアプローチでは、コントロール及びＩＡＩにおいてＡＦ中で発現するタンパク質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた特徴決定により、ＩＡＩにおいて感染及び免疫応答に関連する顕著な量の分子を初めて同定した。マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）は、アクチンフィラメントを調整し、炎症プロセスに関与するＣａ＋２−感受性タンパク質である（Ｄａｂｒｉ ｅｔ ａｌ．．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１６５４５−５２（１９９２））。白血球エラスターゼ及び好中球ゼラチナーゼに関連するリポカルシン（ＮＧＡＬ）は、静菌機構及び溶菌機構に関与する（Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ｌ）：１０３３−４３（２００２））。
【０１７５】
上述の免疫調整剤に加えて、感染に応答するＡＦ中の抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９及びアズロシジンの検出は、子宮内免疫応答における新しい洞察を与える。抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９（ＬＬ−３７）はバクテリアリポ多糖類に結合し、肥満細胞に対する強力な化学走性因子であり、微生物の局所感染及び全身侵襲を防ぐための最初の防御線として働く（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳＣＩ ｕｓａ ９２：１９５−９（１９９５））。アズロシジン（ＣＡＰ３７）は、宿主保護及び炎症において重要な関与を有するヒト好中球から単離されたカチオン性抗菌タンパク質である（ｐＥＲＥＩＲＡ，ｊ．１ＥＵＫＱＣ ｂｌＯＬ ５７：８０５−１２（１９９５））。Ｇｐ−３４０改変体タンパク質は、肺において以前に同定されたバクテリアに結合するスカベンジャーレセプターである（Ｐｒａｋｏｂｈｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：３９８６０−６（２０００））。これらのタンパク質の同定は、ＩＡＩのためのバイオマーカーを同定するために使用される感受性のプロテオミクスアプローチを補完する。
【０１７６】
現在利用可能な実験的な試験を利用して、母体のＣ−反応性タンパク質の測定、白血球又はグラム染色についてのＡＦの直接の検査、ＡＦ微生物培養又はＰＣＲ、ＡＦグルコース及びＩＬ−６濃度の測定、及びＡＦ白血球エステラーゼの検出を含む、ＩＡＩの診断を確認した。羊水の微生物培養物及び広い範囲のスペクトルバクテリアｒＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応のみが、ＩＡＩに感受性で特異的であるように思われる。しかし、生殖器マイコプラスマについての微生物培養又はＰＣＲに基づく試験は、広範囲に利用することができず、羊膜穿刺は羊水を得ることが必要である。プロテオミクスに基づくアプローチの１つの利点は、候補ペプチドバイオマーカーによってそれ自身で迅速な作用時点での発育を知ることができ、コスト的にも有効な診断免疫アッセイであることである。他のＡＦ及び血清スクリーニング試験（例えば、神経管不全についてα−フェトタンパク質）と類似して、感染した羊水内で同定されるペプチドは、母体血清中で検出可能であり、非侵襲診断試験における有用性が見出される。上述の実施例において表されるデータ、特にプールされた母体血清を利用するデータは、ＩＧＦＢＰ−１制限フラグメント及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂが、ＩＡＩ中にＡＦ及び母体の血液中に現れる２つのバイオマーカーであるが、感染の非存在下ではそうではないこのアプローチの容易性を示す。
【０１７７】
まとめると、プロテオミクスに基づくＡＦの分析は、実験的な非ヒト霊長類モデル及び早産及び潜伏性のＩＡＩをもつ女性のコホートの両方において、ＩＡＩについてのバイオマーカーを同定するために使用された。診断タンパク質発現プロフィールを、ＩＡＩの検出において感受性で特異的なＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳプロファイリングによって同定した。ＡＦ中で発現したタンパク質の高スループット分析によって、いくつかの免疫制御分子の発現を初めて同定した。診断１１ｋＤａピークにおいて検出されるタンパク質（ＩＧＦＢＰ−１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ）の免疫検出は、ＩＡＩ中の羊水中及び母体血液中のこれらのバイオマーカーの存在及び示差的な発現を確認した。本明細書中で示されるデータは、妊娠中の潜伏性のＩＡＩを検出する迅速で非侵襲アッセイの基礎として役立つ。このことは、特異的な介入及び治療トライアルにおいて、臨床医及び観察者が早期分娩について高いリスクを有する女性の特定のサブグループを標的にすることができるため、重要なブレークスルーである。最後に、これらの試験は、感染及び炎症プロセス及び概して妊娠の病態生理学についての特定のバイオメーカー及び診断プロフィールを同定するためのプロテオミクスに基づくアプローチの有用性を示す。それ故に、本明細書中で示されるデータは、羊水及び他の生体液（例えば血清）中のタンパク質の示差的な発現を示し、迅速な、非侵襲及び正確な種々の母体／胎児の状態及び染色体異数性の診断、予後及び監視のための有効なアプローチを示す。
【０１７８】
上述の記載を通して、本発明は、特定の実施形態を参照して議論されるが、それらに限定されない。実際に、本明細書中に示され記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、上述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものである。
【０１７９】
記載全体で引用される全ての参考文献、及び本明細書中で引用される参考文献は、本明細書中にその全体が参考として組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、生体液のプロテオームの同定、胎児起源の母体状態、染色体異数性、及び胎児の成長及び成熟に関連する胎児の疾患を含む、母体／胎児の状態の状況の決定におけるそれらの使用に関する。特定的には、本発明は、羊水のプロテオーム同定（複数のタンパク質は羊水の組成を表す）及び正常なプロテオームにおける特性変化と種々の病的な母体／胎児の状態、例えば羊膜内感染、又は染色体不全との相関に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
プロテオミクス
タンパク質発現パターンの大スケール分析は、現在のＤＮＡ クローニング及び遺伝子プロファイリングアプローチに対する重要かつ必要な相補体として現れた（Ｐａｎｄｅｙ ａｎｄ Ｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４０５：８３７−４６（２０００））。ＤＮＡ配列情報は、ホモロジー方法に基づくいくつかの構造的及び潜在的なタンパク質改質を推定するのに役立つが、翻訳後改質、タンパク分解又は区画化を介するタンパク質機能の制御についての情報を与えない。
伝統的なゲルベースの方法、例えば、一次元及び二次元ゲル電気泳動は、小スケールのタンパク質（＜１，０００タンパク質）検出に有用であるが、これらは大量のサンプルを必要とする（Ｌｉｌｌｅｙ ＫＳ，Ｒａｚｚａｑ Ａ，Ｄｕｐｒｅｅ Ｐ：Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．６（１）：４６−５０，２００２）。この制限を克服するためのアプローチとしては、サンプル中のタンパク質の質量を示すプロフィールを正確に作成するマトリックス支援又は表面増強レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）飛行時間質量分析計が挙げられる。これらのパターン又はプロフィールは、種々の疾患を同定及び監視するために使用することができる。同定の第２のレベルは、ペプチドフラグメントからアミノ酸配列情報を作成するためにカップリングペプチドマッピングからタンデム質量分析に由来する。これは、四極飛行時間ＭＳ（Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ）にＭＡＬＤＩ／ＳＥＬＤＩ又はＥＳＩをカップリングすることによって達成可能である。後者の方法はさらに、特定のペプチドの定量に使用することができる（ＩＣＡＴ技術）。
【０００３】
（病的な母体／胎児の状態の診断）
母体及び／又は胎児又は新生児の健康を含むか、又はいくつかの場合には、母体及び／又は胎児又は新生児の生命を脅かす、妊娠中に進行し得る多くの病的な母体及び胎児の状態、例えば、羊膜内感染（ＩＡＩ）、子かん前症、早期出産及び早期分娩、及び染色体異数性が存在する。このような状態の初期診断は、適切な時期の処置及び介入を可能にするのに必須である。残念なことに、心象的な徴候及び症状は遅く表れ、しばしば非特異的で一致しないため、これらの状態のほとんどの初期診断は困難である。例えば、ＩＡＩの臨床的症状としては、典型的には、母体の発熱及び白血球増加症が挙げられるが、これらの症状はしばしば後で起こり、鋭敏でもなく特異的でもない。このように、Ｇｒａｖｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７１：１６６０−７（１９９４）は非ヒト霊長類モデルを利用し、グループＢの連鎖球菌を用いた実験的羊膜内感染の後、熱及び白血球増加症が、実験的感染の２８時間〜４０時間後に生じる感染により誘発される早期分娩が発症時には５０％しか存在しないことを示した。それ故に、診断の遅れを避けるために、疑惑の高い指標及び補助的な実験室的試験の適切な使用が保証される。ＩＡＩを診断するために通常使用される臨床的基準としては、以下の症状の２つ以上を伴う母体の発熱（≧３７．８℃）が挙げられる：母体白血球増加症（3１５，０００／ｍｍ３）、母体又は胎児の心急搏症、子宮圧痛、又は羊水の悪臭。
【０００４】
臨床的特長が整合しないため、ＩＡＩの診断を補助するために他の補助的な実験室的試験が利用されてきた。これらの試験としては以下のものが挙げられる：母体のＣ−反応性タンパク質の測定、グラム染色に対して白血球又は微生物、羊水培養物について羊膜の直接試験、羊水のグルコース濃度の測定、羊水白血球エステラーゼの検出、気−液クロマトグラフィーによる微生物の有機酸の検出、種々の羊水又は膣のサイトカインの測定（例えば、インターロイキン２、４、６、顆粒球コロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子−α）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９、ラクトフェリン、及び超音波検査法による胎児活性の評価（生物物理学的プロフィール）。サイトカイン又は他の生化学因子の測定は高価であり、一般的に臨床的に入手可能ではなく、主に研究ツールである。さらに、これらの試験の試験効率は、羊水グラム染色及び培養物、羊水グルコース濃度、及び羊水白血球エステラーゼの検出のようなより容易に利用可能な従来の試験よりも整合性があるわけではない。これらの試験の効率は、以前に広くまとめられている（Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ａ． ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｅ．：Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｐｒｅｔｅｒｍ ｒｕｐｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １６２：８０９，１９９０）。全て合理的な感受性及び特異性を有するが、予想される値は、ＩＡＩの診断における臨床的特長を独立して利用するために十分感受性又は特異的ではない。
【０００５】
それ故に、ＩＡＩ及び他の病的な母体／胎児の状態の初期及び正確な診断を可能にする新規なアプローチの必要性が非常に存在する。
【０００６】
染色体異数性を診断するための新規な、有効かつ信頼性のある非侵襲方法を開発することが特に望ましい。現在、母体の血清スクリーニング及び超音波による染色体異数性の絶対的診断は、ミッド−トリメスターの遺伝子羊膜穿刺を必要とする。これは、妊娠の損失のリスクの０．５％に関連する侵襲手順である。さらに、羊水細胞の染色体分析は、労働集約的であり、２週間までかかる時間のかかる手順である。それ故に、信頼できる試験は、母体血清又は他の生体液から染色体異数性の検出を高め、母体スクリーニングの陽性率の受容できない高い誤り率を減らし、羊膜穿刺後の羊水からの診断の速度及び効率を高めるために必要である。他の病的な（ｐａｔａｈｏｌｏｇｉｃ）異数性状態、例えば、クラインフェルター症候群及びターナー症候群は、超音波検査法又は従来の母体血清スクリーニングを用いたスクリーニングによっては完全に見落とされる場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、生体液のプロテオミクス分析による、病的な胎児／母体の状態を初期診断、予後のための、及び監視するための、非侵襲及び感受性の方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、限定されないが、羊膜内感染（ＩＡＩ）、染色体異数性、及び胎児の在胎齢及び成熟度に関連する胎児の疾患を含む病的な胎児／母体の状態を初期診断、予後のための、及び監視することが可能な生体液、例えば、羊水及び母体血清のプロテオミクスプロフィールを提供する。特定的には、本発明は、ＩＡＩ及び染色体異数性のための正常及び病的なプロテオミクスプロフィールを提供する。問題となる胎児／母体状態を排除する（陰性の診断）ことを可能にし、患者が不必要で潜在的に危険な処置又は介入を受ける必要性を排除するため、正常なプロテオミクスプロフィールの決定は非常に重要である。
【０００９】
本発明はさらに、生体的、例えば、羊水又は母体血清中で異なって発現する種々の胎児又は母体の状態、例えば、ＩＡＩ及び染色体異数性のような病的な状態が存在する場合、これらの存在及び状況のための特定のバイオマーカーを提供する。このようなバイオマーカー及びこのようなバイオマーカーに結合する抗体は、例えば、タンパク質又は抗体アレイ上に存在してもよく、単純な非侵襲診断アッセイにおける利用が見出されている。
【００１０】
１つの局面では、本発明は、哺乳動物被検体から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は上記状態に特徴的な少なくとも１つの固有の発現サインを含む参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程を含む、母体又は胎児の状態を決定するための方法に関する。
【００１１】
本方法の一実施形態では、哺乳動物被検体は妊娠したメスであり、好ましくは霊長類又はヒトである。
【００１２】
別の実施形態では、母体の状態は、子宮内感染、子かん前症、及び早期分娩からなる群から選択される。
【００１３】
さらなる実施形態では、胎児の状態は、染色体異数性、先天性奇形、在胎齢及び胎児成熟度からなる群から選択され、ここで、染色体異数性は、例えば、ダウン症候群、トリソミー−１３、トリソミー−１８、ターナー症候群、又はクラインフェルター症候群であることができる。
【００１４】
任意の生体液は、限定されないが、羊水、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、及び唾液、好ましくは、羊水又は母体血清を含む、本発明の実行において使用することができる。
【００１５】
さらなる実施形態では、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールは、少なくとも２つのタンパク質の情報、又は少なくとも５つのタンパク質の情報、又は少なくとも１０つのタンパク質の情報、又は少なくとも２０つのタンパク質の情報、又は少なくとも５０つのタンパク質の情報を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、プロテオミクスプロフィールはマススペクトルである。
【００１７】
別の実施形態では、マススペクトルは、マススペクトルの３〜５ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む。
【００１８】
なお別の実施形態では、マススペクトルの１０〜１２ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、上記母体状態が羊膜内感染であり、上記固有の発現サインが前記試験サンプル中の１０〜１１ｋＤａ分子量範囲における余剰ピークであり、これが羊膜内感染の指標である。
【００２０】
異なる実施形態では、プロテオミクスプロフィールはＷｅｓｔｅｒｎブロット分析によって作成される。
【００２１】
別の実施形態では、生体液は、ヒトの生体液であり、プロテオミクスプロフィールが以下：マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン（ｃｒｏｎｉｎ）様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む。
【００２２】
さらなる実施形態では、プロテオミクスプロフィールは、マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の情報を含む。
【００２３】
上述の方法は、限定されないが、羊膜内感染、臓器系、筋骨格奇形の不全を含む発育不全、及び染色体異数性から生じる状態、例えば、ダウン症候群、トリソミー−１３、トリソミー−１８、ターナー症候群、又はクラインフェルター症候群を含む、種々の胎児及び母体の状態の診断のために好適である。
【００２４】
試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが本質的に正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと同じである場合、被検体は上記の母体又は胎児の状態を有していないと決定される。
【００２５】
上記プロテオミクスプロフィールが疾患サンプルと本質的に同じ固有の発現サインを含有する場合、患者は対応する母体又は胎児の状態と診断される。
【００２６】
別の局面では、本発明は、羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが３〜５ｋＤａ及び／又は１０〜１２ｋＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程を含む方法に関する。
【００２７】
さらなる局面では、本発明は、羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）ＩＧＦＢ−１、プロフィリン、セルロプラスミン、及びＬ−プラスチン、カルグラヌリン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現される場合に上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程を含む、方法に関する。
【００２８】
特定の実施形態では、ＩＧＦＢＰ−１、プロフィリン、セルロプラスミン、及びカルグラヌリン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体のうち少なくとも１つが、正常サンプルと比較して試験サンプルにおいて過剰発現する。
【００２９】
別の実施形態では、Ｌ−プラスチンが、正常サンプルと比較して試験サンプルにおいて過剰発現する。
【００３０】
なお別の実施形態では、ＩＧＦＢＰ−１の存在が図１２に示されるタンパク分解性のフラグメント又はそれらのフラグメントを同定することによって検出される。
【００３１】
別の局面では、本発明は、染色体異数性を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが４〜１５ｋＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を染色体異数性であると診断する工程を含む方法に関する。
【００３２】
異なる局面では、本発明は、胎児の発育不全を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）少なくとも１つのアクチン調整タンパク質、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体が前記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記発育不全の存在を確認する工程を含む方法に関する。
【００３３】
本方法の特定の実施形態では、アクチン調整タンパク質は、モエシン、ｐ５７、ゲルゾリン、及び１４−３−３タンパク質からなる群から選択される。
【００３４】
さらなる局面では、本発明は、母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）、白血球エラスターゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカルシン（ｌｉｐｃａｌｃｉｎ）（ＮＧＡＬ）、ミエロペルオキシダーゼ、Ｌ−プラスチン、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）、ＦＡＬＬ−３９、アジロシジン（ａｚｙｒｏｃｉｄｉｎ）（ＣＡＰＳ７）、プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害を確認する工程を含む方法に関する。
【００３５】
なおさらなる局面では、本発明は、妊娠したメス哺乳動物から得られる生体液のプロテオミクスプロフィール中でＧｐ−３４０の存在を検出する工程を含む、新生児セプシスを診断するための方法に関する。
【００３６】
なお別の局面では、本発明は、マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変体タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン（ｃｒｏｎｉｎ）様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質情報を含む生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００３７】
さなる局面では、本発明は、マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ；プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質情報を含む生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００３８】
本発明はさらに、ＩＧＦＢ−１，プロフィリン、セルロプラスミン、Ｌ−プラスチン、及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）からなる群から選択されるタンパク質の存在を確認する情報を含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００３９】
別の局面では、本発明は、上記生体液中に存在するタンパク質又はそれらのフラグメントの分子量情報を提供する形態で表され、３〜５ＫＤａ及び／又は１０〜１２ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィールに関する。
【００４０】
さらなる局面では、本発明は、図１Ａ〜１Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図２Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図３Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図４Ａ又は４Ｂのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール、又は図６〜１０のいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィールに関する。
【００４１】
特定の実施形態では、上記プロテオミクスプロフィールはマイクロアレイフォーマットにおいて分析される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
母体又は胎児の状態を決定するための方法であって、
哺乳動物被検体から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は上記状態に特徴的な少なくとも１つの固有の発現サインを含む参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程と、
上記母体又は胎児の状態を決定する工程とを含む、
方法。
（項目２）
上記哺乳動物被検体が妊娠したメスである、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記妊娠したメスがヒトである、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記母体の状態が、羊膜内感染、子かん前症、及び早期陣痛からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記胎児の状態が、染色体異数性、先天性奇形、在胎齢及び成熟度からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記生体液が、羊膜液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、及び唾液からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目３に記載の方法。
（項目８）
上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが、少なくとも２つのタンパク質の情報を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記プロテオミクスプロフィールがマススペクトルである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記プロテオミクスプロフィールが、マススペクトルの３〜５ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記プロテオミクスプロフィールが、マススペクトルの１０〜１２ｋＤａ範囲で少なくとも１つの固有の発現サインを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記母体状態が羊膜内感染であり、上記固有の発現サインが上記試験サンプル中の１０〜１２ｋＤａ分子量範囲における余剰ピークであり、これが羊膜内感染の指標である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記プロテオミクスプロフィールがＷｅｓｔｅｒｎブロット分析によって生成される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記生体液がヒトの生体液であり、プロテオミクスプロフィールが以下：マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の２つ以上の発現情報を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の全ての発現情報を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
上記生体液が羊膜液である、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
上記プロテオミクスプロフィールが正常サンプルのプロテオミクスプロフィールである、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
上記プロテオミクスプロフィールが上記試験サンプル又は参照サンプルのプロテオミクスプロフィールである、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
上記タンパク質の１つ以上が、上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現される、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
上記プロテオミクスプロフィールが以下：マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；プロフィリンＩ，グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の２つ以上の発現情報を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記プロテオミクスプロフィールが上記タンパク質の全ての発現情報を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
上記被検体が羊膜感染と診断される、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
上記患者が発育不全であると診断される、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
上記発育不全が臓器系の発育における不全である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記臓器系が中枢神経系又は心臓血管系である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記発育不全が筋骨格の奇形である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記発育不全が染色体の異数性から生じる、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが上記正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと本質的に同じであり、上記被検体が上記母体又は胎児の状態を有さないと決定される、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
上記プロテオミクスプロフィールが、表３及び４に列挙されるタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
上記プロテオミクスプロフィールが、上記参照サンプルと同じ固有の発現サインを含む、項目２２に記載の方法。
（項目３４）
上記固有の発現サインが羊膜内感染に特徴的である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
上記被検体が羊膜内感染であると診断される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが３〜５ＫＤａ及び／又は１０〜１２ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程
を含む方法。
（項目３７）
上記プロテオミクスプロフィールがマススペクトルの形態で表される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記哺乳動物が霊長類である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記霊長類がヒトである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記羊膜内感染の推移を監視する工程をさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
羊膜内感染を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）ＩＧＦＢ−１、カルグラヌリン、アズロシジン、プロフィリン、セルロプラスミン、及びＬ−プラスチン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現される場合に上記哺乳動物を羊膜内感染であると診断する工程
を含む、方法。
（項目４３）
上記哺乳動物が霊長類である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記霊長類がヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記生体液が羊膜液又は母体の血清である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ＩＧＦＢＰ−１、カルグラヌリン、アズロシジン、プロフィリン、及びセルロプラスミン、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体の少なくとも１つが上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて過剰発現する、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
Ｌ−プラスチンが上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて過剰発現する、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
ＩＧＦＢＰ−１の存在が図１２に示されるタンパク分解性のフラグメント又はそれらのフラグメントを同定することによって検出される、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
上記羊膜内感染の状況を監視する工程をさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
染色体異数性を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程であって、上記プロテオミクスプロフィールが上記サンプル中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク分解性のフラグメントの量の情報を与える、工程；及び
（ｂ）上記試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが４〜１５ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを示す場合、上記哺乳動物を染色体異数性であると診断する工程
を含む方法。
（項目５１）
上記染色体異数性がダウン症候群である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
胎児の発育不全を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）少なくとも１つのアクチン調整タンパク質、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記発育不全の存在を確認する工程
を含む方法。
（項目５３）
上記アクチン調整タンパク質がモエシン、ｐ５７、ゲルソリン、及び１４−３−３タンパク質からなる群から選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害を診断するための方法であって、
（ａ）妊娠したメスの哺乳動物から得られる生体液の試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと、正常サンプルのプロテオミクスプロフィール又は参照プロテオミクスプロフィールとを比較する工程；及び
（ｂ）マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）、白血球エラスターゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカルシン（ｌｉｐｃａｌｃｉｎ）（ＮＧＡＬ）、ミエロペルオキシダーゼ、Ｌ−プラスチン、カルグラヌリン、ＦＡＬＬ−３９、アジロシジン（ａｚｙｒｏｃｉｄｉｎ）（ＣＡＰ３７）、プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質が上記正常サンプルと比較して上記試験サンプルにおいて異なって発現する場合、上記母体又は胎児の感染又は免疫応答に関連する障害の存在を確認する工程
を含む方法。
（項目５５）
新生児セプシスを診断するための方法であって、妊娠したメス哺乳動物から得られる生体液のプロテオミクスプロフィールにおいてＧｐ−３４０の存在を検出する工程を含む方法。
（項目５６）
マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；Ｇｐ３４０改変体タンパク質；Ｅｂｎｅｒ唾液腺タンパク質ホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３５５３９２）；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；コフィリン；モエシン；プロフィリンＩ、クロニン様タンパク質ｐ５７；アネキシンＩＩ、フィブロネクチン；グリアから誘導されるネキシン；アンチトロンビン−ＩＩＩ；扁平上皮細胞癌腫抗原１、扁平上皮細胞癌腫抗原２；セルピン１２；シスタチンＡ；シスタチンＢ；シスタチンＣ；ＩＧＦＢＰ−１；ビタミンＤ−結合タンパク質；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；１４−３−３タンパク質シグマ；１４−３−３タンパク質ゼータ／デルタ；ゲルゾリン；ラクトトランスフェリン；ホスホグリセレートキナーゼ１；ホスホグリセレートムターゼ１；及びトランスケトラーゼ；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目５７）
マクロファージキャッピングタンパク質；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン；ミエロペルオキシダーゼ；Ｌ−プラスチン；アズロシジン；抗菌性タンパク質ＦＡＬＬ−３９；白血球エラスターゼインヒビター；カルグラヌリンＡ；カルグラヌリンＢ；プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン；セルピン１２；シスタチンＡ；及びＩＧＦＢＰ−１；又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現情報を含む、生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目５８）
表３及び４に列挙されるタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の情報を含む、生体サンプルのプロテオミクスプロフィール。
（項目５９）
上記１つ以上のタンパク質、又はそれらのフラグメント、前駆体、又は天然に生じる改変体の存在を確認する、項目５６〜５８のいずれか１項に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目６０）
ＩＧＦＢ−１，プロフィリン、セルロプラスミン、Ｌ−プラスチン、及びカルグラヌリンからなる群から選択されるタンパク質の存在を確認する情報を含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目６１）
上記生体液中に存在するタンパク質又はそれらのタンパク質分解性フラグメントの分子量の情報を提供する形態で表され、３〜５ＫＤａ及び／又は１０〜１２ＫＤａ分子量範囲で固有の発現サインを含む、羊膜内感染に特徴的な生体液のプロテオミクスプロフィール。
（項目６２）
マススペクトルとして表される、項目６０に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目６３）
上記生体液が羊膜液又は母体血清である、項目６１に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目６４）
図１Ａ〜１Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６５）
図２Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６６）
図３Ａ〜Ｃのいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６７）
図４Ａ又は４Ｂに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６８）
図６〜１０のいずれか１つに本質的に示されるようなプロテオミクスプロフィール。
（項目６９）
マイクロアレイフォーマットにおいて分析される、項目６３〜６７のいずれか１項に記載のプロテオミクスプロフィール。
（項目７０）
固体支持体上に固定された表２〜４に列挙されるタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質を含む、タンパク質アレイ。
（項目７１）
固体支持体上に固定された表２〜４に列挙される１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、抗体アレイ。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】図１Ａ。霊長類の羊水中の感染を誘発する示差タンパク質の発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ａ）ピーク強度において差異を示す２３５レーザー強度で集められた全スペクトル。
【図１Ｂ】図１Ｂ。霊長類の羊水中の感染を誘発する示差タンパク質の発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｂ）コントロールと感染したものとの間で約１０〜１２ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。
【図１Ｃ】図１Ｃ。霊長類の羊水中の感染を誘発する示差タンパク質の発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｃ）コントロールと感染したものとの間で約３〜５ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。実線は、診断試験を開発するために使用される、発現（固有の発現サイン）において有意な差を示すために使用された。
【図２】図２Ａ〜Ｃ。感染に応答する霊長類羊水の時間推移分析（ＧＢＳ）。以下に記載されるように、バクテリアの接種前で感染後に羊水を集め、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。図２Ａ：感染前；２Ｂ：感染１２時間後；２Ｃ：感染３６時間後。
【図３Ａ】図３Ａ。ヒト羊水において感染を誘発する示差タンパク質発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ａ）ピーク強度において差異を示す２３５レーザー強度で集められた全スペクトル。
【図３Ｂ】図３Ｂ。ヒト羊水において感染を誘発する示差タンパク質発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｂ）コントロールと感染したものとの間で約１０〜１２ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。
【図３Ｃ】図３Ｃ。ヒト羊水において感染を誘発する示差タンパク質発現。化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合する羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析。（Ｃ）コントロールと感染したものとの間で約３〜５ＫＤａにおける差異を示す詳細なスペクトル。
【図４Ａ】図４Ａ。ヒト由来の羊水を用いた遺伝子ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で達成されるマススペクトル。（Ａ）コントロール、子宮内感染なし。
【図４Ｂ】図４Ｂ。ヒト由来の羊水を用いた遺伝子ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で達成されるマススペクトル。（Ｂ）サンプル、子宮内感染あり。
【図５】図５。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色されたゲル。（Ａ）プールされた４つのヒトコントロールＡＦサンプル；（Ｂ）個々のコントロールＡＦサンプル；（Ｃ）プールされた４つのヒトの感染ＡＦサンプル；（Ｄ）個々の感染したＡＦサンプル。
【図６】図６。ヒト羊水中の示差タンパク質発現の検出。（Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールされた）；（Ｂ）感染したＡＦサンプル（プールされた）。
【図７】図７。ヒト羊水中の示差タンパク質発現の検出。（Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールされた；（Ｂ）感染したＡＦサンプル（プールされた）。
【図８】図８は、ヒト羊水及び母体血清中の示差タンパク質発現の検出を示す。（Ａ）コントロールサンプル（プールされた）；（Ｂ）感染したサンプル（プールされた）。
【図９】図９は、タンパク質アレイを用いた、母体血清中で示差発現されたタンパク質の検出を示す。（１）対応するタンパク質とそれらの抗体との結合を示すタンパク質アレイの擬似色画像；（２）アレイの拡大された領域；（３）カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）ＩＰのＷｅｓｔｅｒｎブロット。
【図１０】図１０は、トリソミーを識別するための固有のプロフィールを用いた、母体血清中の示差タンパク質発現パターンを示す。
【図１１】図ｌｌ。羊水タンパク質ＰＲＯ１＿ヒト（Ｐ０７７３７）プロフィリンＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜１１）のタンパク質のデノボ配列同定の概要図。
【図１２】図１２。ＩＧＦＢＰ−１ デノボタンパク質同定及びタンパク分解性のフラグメント配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。Ｍｓ／ＭＳを用いたサンプル０４２６ｓｅ＿Ｈｌ＿１２及び０４２５ｓｅ＿Ｈｌ＿１３中に見いだされるペプチド配列が下側の枠内に示される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及び３）。これらは、トリプシン染色した１−Ｄゲルバンドで試験し、ＭＳ／ＭＳ分析にかけた場合、感染した羊水から得られた。１−Ｄゲル中で検出したＩＧＦ−ＢＰ−１のタンパク分解性のフラグメント（低分子量範囲、図５）、感染した羊水由来のトリプシン消化した約１０．５〜１２ＫＤａバンドのＷｅｓｔｅｒｎブロット（図６）及びＭＳ／ＭＳ分析（図１３）を下線を引いた配列の領域中に表す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【図１３】図１３。感染した羊水由来の１０．５〜１１ｋＤ １Ｄゲルバンドのトリプシン消化物のＬＣＱ−ＭＳプロフィール。親イオンを示すＬＣＱ−ＭＳはサンプル中に存在する潜在的なタンパク質を表す。
【図１４】図１４。図１３に示される保持時間１７．５５〜１８．２１分のピークについてのマススペクトル。
【図１５】図１５。図１４に示される４３４．９ピークの親イオンについてのＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１６】図１６。ＩＡＩに対するバイオマーカーの免疫検出。（１６ａ）霊長類コントロール（−）及び感染した（＋）ＡＦ。（１６ｂ）ヒトコントロール（−）及び感染した（＋）ＡＦ。（１６ｃ）ヒトコントロール（−）及び感染した（＋）ＡＦ。ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）制御されていないコントロールマーカー。ＩＧＦＢＰ−１バンドはインタクトなタンパク質（約３０ｋＤａ）及びタンパク分解性のフラグメント（約１１ｋＤａ）を表す。（１６ｄ）免疫沈降物由来のプールされた母体血清中のＩＧＦＢＰ１の検出。コントロール（−）及び感染した（＋）血清。（１６ｅ）免疫沈降物由来のプールされた母体血清中のカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂの検出。コントロール（−）及び感染した（＋）血清。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（好ましい実施形態の詳細な記載）
Ａ．定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）は、本出願中で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００４４】
用語「プロテオーム」は、所与の時間で生物学的サンプル中のタンパク質の有意な部分を記載するために本明細書中で使用される。プロテオームの概念は、ゲノムとは基本的に異なる。ゲノムは事実上静的であるが、プロテオームは内部事象及び外部事象に応答して連続的に変化する。
【００４５】
用語「プロテオミクスプロフィール」は、生物学的サンプル中、例えば、所与の時間での生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの代表例を示すために本明細書中で使用される。プロテオミクスプロフィールは、例えば、マススペクトルとして表すことができるが、タンパク質の物理化学的性質又は生化学的性質のいずれかに基づく他の代表例も含まれる。従って、プロテオミクスプロフィールは、例えば、二次元ゲル電気泳動、例えば、２−Ｄ ＰＡＧＥによって決定されるようなタンパク質の電気泳動性における差に基づいてもよく、例えば、二次元電気泳動ゲル中の複数のスポットとして表すことができる。示差発現プロフィールは、特定の同定されたタンパク質の非存在下でさえ、重要な診断値を有してもよい。次いで、例えば、イムノブロッティングによって単一のタンパク質スポットを検出することができ、タンパク質マイクロアレイを用いた複数のスポット又はタンパク質を検出することができる。プロテオミクスプロフィールは、典型的には、いくつかのピークから５０以上のピークを表す複雑なプロフィールまでの範囲にある情報を表すか又は含有する。従って、例えば、プロテオミクスプロフィールは、少なくとも２、又は少なくとも５、又は少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０、又は少なくとも３５、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５、又は少なくとも５０タンパク質を含有するか又は表してもよい。
【００４６】
用語「病的な状態」は、最も広い意味において使用され、被検体の健康を危うくする全ての変化及び現象をカバーする。病的な母体の状態とは、限定されないが、羊膜内感染、胎児又は母体起源の状態、例えば、子かん前症、及び早期分娩及び早期分娩が挙げられる。病的な胎児の状態とは、限定されないが、染色体不全（異数性）、例えば、ダウン症候群、及び在胎齢及び胎児の成熟度における全ての異常が挙げられる。
【００４７】
用語「病的な［母体又は胎児］状態の状況」は、最も広い意味において使用され、病的な状態の非存在、存在、程度、段階、性質、成長又は抑制を指す。
【００４８】
用語「固有の発現サイン」は、統計学的に有意な様式で、対応する正常な生物学的サンプル（同じ種類の起源、例えば生体液から得られる）とは異なる生物学的サンプル（例えば、参照サンプル）のプロテオミクスプロフィール内の固有の特徴又はモチーフを記載するために使用される。
【００４９】
用語「羊膜内感染（ＩＡＩ）」、「羊水感染」、「羊膜炎」及び「臨床的絨毛羊膜炎は、相互に交換可能に使用され、妊娠中の羊水及び子宮内成分の細菌に限定されないものを含む、急性感染を指す。
【００５０】
「患者応答」は、限定されないが、（１）病的な状態の、少なくともある程度までの阻害、（２）病的な状態の予防、（３）病的な状態に関連する１つ以上の症状の、少なくともある程度までの軽減；（４）処置後の生存時間の増加；及び／又は（５）処置後の所与の時間点での死亡率の減少を含む、患者に対する利益を示す任意の終点を用いて評価することができる。
【００５１】
用語「処置」は、治療的処置及び予防又は防止測定を指し、この目的は、標的とされる病的な状態又は障害を防ぐか又は遅らせる（減らす）ことである。処置を必要とするものとしては、障害を既に有しているもの、及び障害を有すると考えられるもの又は障害を防ぐと思われるものが挙げられる。
【００５２】
「先天性奇形」は、遺伝性ではないが出世時に存在する異常である。
【００５３】
Ｂ．詳細な記載
本発明は、母体又は胎児の生体液のプロテオミクスプロフィールに基づく、母体及び胎児の状態の初期の、信頼性のある非侵襲試験のための方法及び手段に関する。本発明は、例えば、以下の文献に記載されるような当該技術において公知のプロテオミクス技術を利用する（これらの内容は参考としてここに組み込まれる）：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）．Ｍ．Ｒ．Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１００７；２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｎｄｒｅｗ Ｌ Ｌｉｎｋ，ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ｔ．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ ｅｄｉｔｏｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２０００；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）．Ｐ．Ｊａｍｅｓ ｅｄｉｔｏｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２００１；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｌｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｄ．Ｃ．Ｌｉｅｂｌｅｒ ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｐｌｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐｌｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒ．Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００２。
【００５４】
当業者は、本発明の実施において使用することが可能な、本明細書中に記載されるものと類似又は等価の多くの方法及び物質を認識する。実際に、本発明は、いかなる様式でも記載される方法及び物質に限定されない。
【００５５】
１．生体液中で発現するタンパク質及びポリペプチドの同定
本発明によれば、生体液のプロテオミクス分析は、当該技術分野で公知の種々の方法を用いて行うことができる。
【００５６】
典型的には、異なる起源、例えば、正常な生体液（正常サンプル）及び試験生体液（試験サンプル）由来のサンプルのタンパク質パターン（プロテオームマップ）は、疾患において上方調整又は下方調整されるタンパク質を検出するために比較される。次いで、これらのタンパク質を、例えば、ペプチド−マスフィンガープリンティング及び／又は質量分析法及び配列決定方法を用いて、同定及び完全な特徴決定のために切除することができるか、又は正常及び／又は疾患特異的なプロテオームマップを目的の疾患の診断のために直接的に使用することができるか、又は疾患の存在又は非存在下を確認するために直接的に使用することができる。
【００５７】
比較分析において、タンパク質の相対量を正確に表すために、及び正確な結果を得るために、正常サンプル及び試験サンプルを同じ様式で実際に処置することが重要である。全タンパク質の要求される量は、使用される分析技術に依存し、当業者によって容易に決定することができる。生物学的サンプル中に存在するタンパク質は、典型的には、それらのｐＩ及び分子量に従って二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）によって分離される。タンパク質は、等電集束法（一次元電気泳動）を用いて最初にそれらの電荷によって分離される。この工程は、例えば、市販の固定化ｐＨ−勾配（ＩＰＧ）片を用いて行うことができる。二次元は通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析であり、集束されたＩＰＧ片をサンプルとして使用する。２−ＤＥ分離後、タンパク質は従来の染料、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ又は銀染色を用いて視覚化することができ、公知の技術及び装置、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーター及びＰＤＱＵＥＳＴソフトウェア（両方市販されている）を用いて画像化する。次いで、個々のスポットをゲルから切断し、脱色し、トリプシン消化を行う。ペプチド混合物を質量分析計（ＭＳ）によって分析することができる。又は、例えばキャピラリー高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ペプチドを分離することができ、個々にＭＳによって、又はプールにおいて分析することができる。
【００５８】
質量分析計は、イオン源、質量分析器、イオン検出器及びデータ取得ユニットからなる。最初に、ペプチドをイオン源中でイオン化する。次いで、イオン化されたペプチドをそれらの質量 対 電荷比に従って質量分析器中で分離し、分離したイオンを検出する。質量分析法は、特に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及び電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）方法の発明で、タンパク質分析に広く使用されている。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び三極又は四極−ＴＯＦを含む質量分析器、又はＥＳＩに結合したイオン捕捉質量分析器のいくつかのバージョンが存在する。従って、例えば、Ｑ−Ｔｏｆ−２質量分析器は、全マススペクトル範囲にわたってイオンの同時検出を可能にする直交飛行時間分析器を利用する。さらなる詳細については、例えば、ｅ．ｇ．Ｃｈｅｍｕｓｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３６：８４９−８６５（２００１）。
【００５９】
所望な場合、ペプチドフラグメント及びそれらから結果として誘導されるタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知の技術、例えば、質量分析法又はＥｄｍａｎ分解の特定の改変によって決定することができる。
【００６０】
２．初期及び非侵襲の診断から利益を受ける胎児−母体の状態
ａ．羊膜内感染
羊膜内感染（ＩＡＩ）は、妊娠中の羊水及び子宮内成分の急性バクテリア感染である。予想試験は、ＩＡＩが全ての分娩の４〜１０％生じることを示す（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｐｒｉｈｏｄａ，Ｔ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．：Ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．７３：５７１，１９８９；Ｓｏｐｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｙｈａｌｌ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ Ｄａｌｔｏｎ，Ｈ．Ｐ．：Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １６１：５６２，１９８９；ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ−Ｚｅｎｏ，Ｊ．Ａ．，Ｐｅａｃｅｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ａｄａｓｈｅｋ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｃｏｌ，Ｍ．Ｌ．：Ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｂｏｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：４５０，１９９２）。ＩＡＩを記載するために使用される他の用語としては、羊水感染、羊膜炎、及び臨床的絨毛羊膜炎が挙げられる。羊膜内感染は、母体の発熱、子宮圧痛、白血球増加症、及び胎児心急搏症によって臨床的に診断され、組織学的な絨毛羊膜炎とは区別されるべきである。羊膜内感染は、母体及び新生児の罹患率の重要な原因である。羊膜内感染は、産褥期における発熱性罹患率の原因の１０〜４０％を占め、初期新生児セプシス及び肺炎の原因の２０〜４０％に関連する（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．：Ｑｉｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．３６：７９５，１９９３）。母体菌血症は、ＩＡＩを患う患者の２〜６％に生じ、産褥感染の罹患率は増加する。ＩＡＩを患う患者の間で、不完全な分娩及び帝王切開による分娩のリスクが増加する。Ｄｕｆｆらは、分娩中に進行した羊膜内感染をもつ患者の中で、不完全な分娩の発生率が７５％であり、帝王切開による分娩の発生率が３４％であることを報告した（Ｄｕｆｆ，Ｐ．，Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｒ． ａｎｄ Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．：Ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｔｅｒｍ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １４７：３９１， １９８３）。羊膜内感染はさらに、特に早期新生児の間で、早期進行した新生児罹患率及び死亡率と関連する。概して、母体のＩＡＩに対して生まれる低体重新生児の中では、周産期死亡率が３〜４倍増加する（Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．：Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １３６：７０９，１９８０；Ｇｉｌｓｔｒａｐ，Ｌ．Ｃ．，ＩＩＩ，Ｌｅｖｅｎｏ，Ｋ．Ｊ．，Ｃｏｘ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｕｍｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｍａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｃ．Ｒ．：Ｉｎｔｒａｐａｒｔｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ：ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｅｐｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５９：５７９，１９８８）。呼吸困難症候群、心室内出血、及び新生児セプシスの増加も存在する。Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｗ．Ｊ．：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｏｒｉｏａｒｎｎｉｏｎｉｔｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ ａｔ ｏｎｅ ｙｅａｒ。Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ７０：１８３，１９８７）。近年、ＩＡＩは、新生児脳室周囲白質軟化症及び脳性小児麻痺に関係があるとされており；大脳白室損傷及び脳性小児麻痺のリスクは、羊膜内感染の背景において９倍高まる。Ｂｅｊａｒ，Ｒ．，Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｐ．，Ａｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｂｅｎｉｒｓｃｈｋｅ，Ｋ．，Ｖａｕｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｃｏｅｎ，Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｃ．，Ｓｃｈｒａｇｇ，Ｐ．，Ｖｉｌｌｅｇａｓ，Ｉ．， ａｎｄ Ｒｅｓｎｉｋ，Ｒ．：Ａｎｔｅｎａｔａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｉ．Ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５９：３５７，１９８８；Ｇｒｅｔｈｅｒ，Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ｂ．：Ｍａｔｅｒｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐａｌｓｙ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ． ＪＡＭＡ ２７８：２０７，１９９７）。最後に、潜伏性ＩＡＩは、インタクトな胚膜をもつ早期分娩の女性の少なくとも１０％に見出され、このことは、ＩＡＩが未熟児の、重要な潜在的に予防可能な原因であることを示唆する（Ｒｏｍｅｒｏ，Ｒ．，Ａｖｉｌａ，Ｃ．，Ｂｒｅｋｕｓ，Ｃ．Ａ．， ａｎｄ Ｍｏｒｏｔｔｉ，Ｒ．：Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｐａｒｔｕｒｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６２２：３５５，１９９１）。Ｎｅｗｔｏｎによってまとめられた文献は、２７週よりも低い在胎齢で臨床的なＡＩＡの発生率が４１％であり、２７〜３７週の在胎齢で１５％の発生率であり、妊娠３８週以上では２％であることを示した（Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，前出）。下部生殖路（ｌｏｗｅｒ ｇｅｎｉｔａｌ
ｔｒａｃｔ）に対する既存のバクテリアはさらに、臨床的な羊膜内感染の徴候なくインタクトな胚膜をもつ早期分娩において全ての女性の１０〜２０％の羊水から回収され（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，前出）、２３〜２４週で妊娠を終了する早期分娩の女性の６７％までの羊水から回収された（Ｗａｔｔｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｋｒｏｈｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｓ．Ｌ．， ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ａ．：Ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｃｕｌｔ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ａｇｅ ａｎｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｗｏｍｅｎ ｉｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ。Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ７９：３５１，１９９２）。これらの患者のほとんどは迅速に分娩し、臨床的に明らかなＩＡＩが多くにおいて進んでいる。これらの観察結果は、仮新構成の初期の潜伏性の子宮内感染が早期分娩に先行し、極端な早期分娩の重要な原因となる場合があるという説を支持する。
【００６１】
ｂ．子かん前症
子かん前症（タンパク尿、水腫、又はその両方を伴う母体の高血圧として定義される）は、最初のトリメスターにおいて妊娠が中断しない妊娠の７％に生じる。原因は知られていないが、妊娠可能年齢の極値の母体の糖尿病、多胎妊娠を有する妊娠、及び既に存在していた母体の腎臓疾患又は高血圧において、さらによく見られる。子かん前症は、周産期死亡率の増加と関連し、子かんを生じる場合があり、母体の発作によって特徴付けられ、母体の死亡率を高める。現在、子かん前症のための治療の主要な方法は、分娩及び硫酸マグネシウムを用いた抗痙攣薬による予防である。硫酸マグネシウム治療が出現する前には、観察された母体死亡率は２０〜３０％であった。しかし、迅速な診断と共に、硫酸マグネシウムを用いた抗痙攣薬、抗高血圧在による治療及び分娩により、母体の死亡率はほぼ０％にまで減った。
【００６２】
不幸なことに、通常認識される症状及び徴候に基づく子かん前症の診断はしばしば困難であり、疾患の経緯において後期に生じる。しばしば、胎児の成長又は健康がおびやかされることは、子かん前症の最初の認識される症状発現である。子かん前症の実験的なマーカーとしては、タンパク尿の量、及び尿酸又はクレアチニンの血清濃度の上昇が挙げられる。初期子かん前症のための血清マーカー又は子かん前症が進行する女性を同定するマーカーは現時点で利用不可能である。近年、レプチン及び尿酸を含む予想血清マーカーが、１つの研究において、後に続く子かん前症と関連していた（Ｇｕｒｓｏｙ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉｃｉａ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ：Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．ｌ９（６）：３０３−１０，２００２）が、これらの発見を確認するためには多くの作業が必要である。子かん前症のための初期及び信頼できるマーカーの開発は、新生児及び母体のための結果を最適化するための治療及び介入を無条件で可能にする。
【００６３】
ｃ．早期分娩及び早産
早期出産は、妊娠が完結する３７週の前に出生することと定義される。アメリカ合衆国での早期出生の発生率は、全ての生きた状態での出生の１０〜１１％であり、早期分娩の積極的な処置にもかかわらず増加している。全体として、未成熟及びその結果は、先天性奇形をもたらさない周産期の脂肪の８０％の原因となり、国のヘルスケア予算に年間約５０億ドルが追加される。早期出生のためのリスク因子としては、白人でないこと、年齢が若いこと、社会的なステイタスが低いこと、母体の体重が５５ｋｇ未満であること、未経産であること、最初のトリメスター出血であること、多胎妊娠であることが挙げられる（Ｍｅｉｓ ＰＪ，Ｍｉｃｈｉｅｌｕｔｔｅ Ｒ，Ｐｅｔｅｒｓ ＴＪ ｅｔ ａｌ．， Ｆａｃｔｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ ｉｎ Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｗａｌｅｓ：Ｈ Ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａｎｄ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７３：５９７−６０２，１９９５）
不幸なことに、自然発生的な早期出生のリスクを持つ患者の予測は一般的に期待はずれである（Ｃｒｅａｓｙ ＲＫ，ｌａｍｓ ＪＤ．Ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ−Ｆｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｒｅａｓｙ ＲＫ，Ｒｅｓｎｉｋ Ｒ（ｅｄｓ．）．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９．Ｐａｇｅ ４９８−５３１）。早期出生の最も大きなリスクをもつ集団を定義し、それによって初期介入からの潜在的な利益を得ようとする以前の試みは、リスクスコアリング指標（ｒｉｓｋ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｉｎｄｉｃｅｓ）、胎児フィブロネクチンの生化学的検出、頚部の長さの超音波測定、及ぶ生息地となる子宮の活性の監視を含んでいた。これらのプログラムは、高価であり、患者が初期の介入又は予防から利益を受ける程度の正確性を持って予測することができなかったということによって阻まれていた。全ては、約３０％のわずかに陽性の予想値を持ち、患者の大多数が満期での分娩の「リスク保持者（ａｔ ｒｉｓｋ）」であると定義された。子宮収縮を阻害するための薬理学的処置を含む介入は有効であるが、早期分娩の初期の信頼できる診断に依存する。それ故に、早期出生の最も大きなリスクを持つ患者を同定するための初期の信頼できるマーカーは、早期出生に関連する莫大なコスト及び新生児死亡率及び罹患率を減らすために必要である。
【００６４】
ｄ．染色体異数性
染色体異常は、周産期罹患率及び死亡率の頻度の高い原因である。染色体異常は、２００人の生児出生あたり１の発生率で生じる。これらの異常の主な原因は染色体異数性であり、染色体の異常の多くは親からの遺伝である。最も頻繁な染色体異数性の１つはトリソミー−２１（ダウン症候群）であり、８００人の生児出生あたり１の発生率を有する（Ｈｏｏｋ ＥＢ，Ｈａｍｅｒｔｏｎ ＪＬ：Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ｓｅｘ ａｎｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ．Ｉｎ Ｈｏｏｋ ＥＢ，Ｐｏｒｔｅｒ ＩＨ（ｅｄｓ．）：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｐｐ ６３−７９．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７８）。トリソミー−２１の一次リスク因子は、母体の年齢が３５歳を超えていることであるが、トリソミー−２１をもつ子供の８０％は、３５歳より若い女性から生まれている。他の一般的な異数体状態としてはトリソミー１３及び１８、ターナー症候群及びクラインフェルター症候群が挙げられる。
【００６５】
トリソミー−２１をもつ子供の８０％が３５歳より若い女性から生まれているため、母体年齢のみに基づいて設計されている出生前診断スクリーニングプログラムでは不十分である。それ故に、出生前スクリーニングプログラムは、胎児染色体異数性と関連する母体血清スクリーニング、超音波又はそれら両方の組み合わせと組み合わせられている。広く利用されている候補血清マーカーとしては、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、未接合エストリオール、ヒトコリオゴナドトロフィック（ｃｈｏｒｉｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）ホルモン（ｈＨＣＧ）、及びインヒビン−Ａが挙げられる。しかし、スクリーニングの陽性率２〜５％で、トリソミー−２１及び他の異数性の検出率は期待はずれであり、検出率は７０〜８６％である（Ｃｕｃｋｌｅ Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ．９２（１）：９７−１０１，２０００）。さらに、試験の真の陽性率、すなわち、スクリーニング陽性試験の中でのこれらの中のトリソミー−２１の率はわずか１〜２％であり、９８％を超えて最終的な陽性率は誤りを生じている。
【００６６】
染色体異数性の確定的な診断の後、母体血清スクリーニング及び超音波は、ミッド−トリメスター遺伝子羊膜穿刺を必要とする。これは、妊娠を中断させるリスクの０．５％に関連する侵襲手順である。さらに、羊水細胞の染色体分析は、労働集約的であり、２週間までかかる時間のかかる手順である。それ故に、母体の血清から染色体異数性の検出を向上させ、母体スクリーニングの受け入れられないほど誤って高い陽性率を減らし、羊膜穿刺後の羊水からの診断の速度及び効率を高めるために、信頼性の高い試験が必要とされている。
【００６７】
３．生体液のプロテオミクスプロフィールを用いた母体／胎児の状態の診断
本発明は、生体液、例えば、羊水、血清、血漿、尿、能脊髄液、母乳、粘液、又は唾液のプロテオミクスプロフィールによって上述及び他の類似の母体／胎児の状態を診断するための、初期及び信頼できる、非侵襲方法を提供する。
【００６８】
上に注記されたように、本発明の本文において、用語「プロテオミクスプロフィール」は、生物学的サンプル中、例えば、所与の時間での生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの代表例を示すために使用される。プロテオミクスプロフィールは、例えば、マススペクトルとして表すことができるが、タンパク質の物理化学的性質又は生化学的性質のいずれかに基づく他の代表例も含まれる。生体液のプロテオーム中に存在するタンパク質の全て又はいくつかを同定し、配列決定することが可能であるが、このことは本発明に従って作成されるプロテオミクスプロフィールの診断使用には必要ではない。特定の疾患の診断は、診断される疾患又は病的な状態が存在する場合に、正常なプロテオミクスプロフィールと同じ状況下で得られた生体液のプロテオミクスプロフィールとの特徴的な差異（固有の発現サイン）に基づくことができる。固有の発現サインは、統計学的に有意な様式で、同じ種類の供給源から得られる対応する正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィールとは異なる、試験又は参照生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィール内の任意の固有の特徴又はモチーフであることができる。例えば、プロテオミクスプロフィールがマススペクトルの形態で存在する場合、固有の発現サインは、典型的には、対応する正常サンプルのマススペクトルとは定性的又は定量的に異なるピーク又はピークの組み合わせである。従って、マススペクトルにおいて新たなピーク又は新たなピークの組み合わせの出現、又はマススペクトルにおいて既存のピーク又は既存のピークの組み合わせの振幅又は形状における任意の統計学的に有意な変化を、固有の発現サインであるとみなすことができる。哺乳動物被検体から得られた試験サンプルのプロテオミクスプロフィールは、病的な母体又は胎児の状態に特徴的な固有の発現サインを含む参照サンプルのプロテオミクスプロフィールと比較され、参照サンプルと共通の固有の発現サインを有している場合、哺乳動物被検体はこのような病的な状態であると診断される。
【００６９】
特定の病的な母体／胎児の状態は、診断される被検体から得られる生体液のプロテオミクスプロフィールと、同じ様式で得て、診断された同じ種類の正常な生体液のプロテオミクスプロフィールとを比較することによって診断することができる。試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと本質的に同じである場合、被検体は、被検体の病的な母体／胎児の状態を有していないとみなされる。試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが正常サンプルのプロテオミクスプロフィールと比較して固有の発現サインを示す場合、被検体は、問題となる母体／胎児の状態と診断される。
【００７０】
それに代えて又はそれに加えて、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールは、問題となる病的な母体／胎児の状態と独立して診断された被検体の生体液から得られた参照サンプルのプロテオミクスプロフィールと比較されてもよい。この場合には、被検体は、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールと参照サンプルのプロテオミクスプロフィールとが、固有の発現サインを表す少なくとも１つの特徴又は特徴の組み合わせを共通して持っている場合、病的な状態と診断される。
【００７１】
本発明の方法では、正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィールは診断において重要な役割を果たす。上に議論されたように、試験サンプルのプロテオミクスプロフィールが正常な生物学的サンプルのプロテオミクスプロフィールと本質的に同じである場合、患者は、同定される病的な母体／胎児の状態を有していないと診断される。患者が、潜在的に副作用があり得るか、又はそうでなくても患者、胎児又は新生児を危険な状態に置き得る、不必要な処置又は介入を受ける必要性を排除するため、この「陰性」診断は、非常に重要性が高い。このデータは、その差異が統計学的に有意であるか否かを決定するために分析される。
【００７２】
本発明の診断方法の感度は、従来のタンパク質分離方法を用いて、本質的に同じ発現レベルで正常プロテオーム及び疾患プロテオームの両方に見出されるタンパク質（一般的なタンパク質、例えば、アルブミン及び免疫グロブリン）を分析の前に除去することによって高めることができる。固有の発現サインの一部分ではないこのような一般的なタンパク質の除去により、改良された感度及び診断の精度が得られる。それに代えて又はそれに加えて、一般的なタンパク質の発現サインは、診断を呼び出すために、典型的には、機械が配置されているスペクトル選択アルゴリズムを用いた結果のコンピューター分析の間に排除できる（か又はシグナルを除去することができる）。以下の実施例に詳細に記載される結果は、統計学的に有意な様式で、羊水の正常プロテオミクスプロフィールとは異なる、羊膜内感染（ＩＡＩ）に特徴的なプロテオミクスプロフィールを表す。それに加えて、実施例はそれぞれ、ＩＡＩ及びダウン症候群に特徴的な発現マーカー及び固有の発現サインを表す。
【００７３】
プロテオミクスプロフィールを比較するための統計学的方法は当該技術分野で周知である。例えば、マススペクトルの場合には、プロテオミクスプロフィールは、スペクトルの平行軸に沿った、キーとなる質量／電荷（Ｍ／Ｚ）位置でのピーク振幅値によって定義される。それ故に、特徴的なプロテオミクスプロフィールは、例えば、与えられたＭ／Ｚ値のスペクトル振幅の組み合わせによって形成されるパターンによって特徴付けることができる。特徴的な発現サインの存在又は非存在、又は２つのプロフィールの実質的な同定は、試験サンプルのプロテオミクスプロフィール（パターン）と参照サンプル又は正常サンプルのプロテオミクスプロフィール（パターン）とを適切なアルゴリズムで照合することによって決定することができる。プロテオミクスパターンを分析するための統計学的方法は、例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５９：５７２−７７（２００２）．；Ｉｓｓａｑ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９２：５８７−９２（２００２）；Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８：３９５−４０４（２００２）；ａｎｄ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，４８：１２９６−１３０４（２００２）に開示される。
【００７４】
特定の実施形態では、患者から得られたサンプルは、タンパク質チップに適用され、プロテオミクスパターンは質量分析法によって作成される。スペクトル内のピークのパターンは、上述のように、好適なバイオインフォマテクスソフトウェアによって分析することができる。
【００７５】
４．スクリーニングアッセイ
本発明のプロテオミクスプロフィールはさらに、特定の母体／胎児の状態の処置のために、候補薬物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいてさらなる有用性を見出す。このようなスクリーニングアッセイは、試験分子が、処置される母体／胎児の状態に特徴的な発現サインを含有するプロテオミクスプロフィールを発現サインを欠いたプロテオミクスプロフィールに変換する能力に基づく。１つの特定の実施形態では、試験化合物が病的な発現プロフィールを正常な発現プロフィールに変換する能力が試験され、別の実施形態では、スクリーニングアッセイは、試験化合物が、病的な状態に特徴的な固有の発現サインを対応する正常な発現サインに変換する能力を試験する。このようなスクリーニングアッセイは、疾患の生物学的サンプルを処置し、処置前と処置後のプロテオミクス発現プロフィールを比較することによって、インビトロで行うことができる。それに代えて又はそれに加えて、標的の病的な母体／胎児の状態を示す実験動物を試験化合物で処置し、処置前及び処置後の動物の生体液を採取し、２つのサンプルのプロテオミクスプロフィールを比較することによって、薬物スクリーニングを行うことができる。このアッセイでは、生体液のサンプルを処置後の種々の時間点で、及び処置後の時間推移に沿って採取することも可能である。これらの方法論は、薬学的薬剤の毒性を特徴決定するため、及び特定の治療のための最適候補物を同定するために適用してもよい。
【００７６】
試験化合物は、例えば、ペプチド、非ペプチド有機低分子、タンパク質、ポリペプチド、抗体（抗体フラグメントを含む）、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチドデコイ、及び薬物又は候補薬物として以前に使用された任意の他の種類の分子であることができる。
【００７７】
生体液は、例えば、羊水、血清（例えば、母体血清）、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、又は唾液であることができる。
【００７８】
同定された治療的に活性な化合物は、従来の薬学的配合物中に配合することができる。当該技術分野で公知の配合物の要約は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出される。このマニュアルの参照は当該技術分野で通常のことである。
【００７９】
５．タンパク質及び抗体アレイ
上に議論される診断アッセイ及びスクリーニングアッセイの両方は、タンパク質アレイを用いて行うことができる。近年、タンパク質アレイは、タンパク質を検出し、それらの発現レベルを監視し、タンパク質相互作用及び機能を観察するための強力な手段として広く認識されている。それらは、自動化手段を用いて多くの数の決定を同時に行うことができる場合、高スループットタンパク質分析を可能にする。ＤＮＡアレイのために元々開発されたマイクロアレイ又はチップフォーマットでは、大量のデータを作成しつつ最小限の物質の使用でこのような決定を行うことができる。
【００８０】
上述のような２Ｄゲル電気泳動及び質量分析法によるプロテオーム分析は非常に効果的ではあるが、常に高い感度を提供するわけではなく、低い発生量で発現する多くのタンパク質を分析できない場合がある。タンパク質マイクロアレイは、それらの高い効率に加えて、改良された感度を提供する。タンパク質アレイは、当該技術分野で周知の種々の共有結合又は非共有結合の化学を用いて、固体表面上、例えば、ガラス、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜、及びマイクロビーズ上にタンパク質を固定することによって形成される。固体支持体は、カップリング手順の前及び後に化学的に安定であり、良好なスポット形態を可能にし、非特異的結合を最少にするべきであり、検出システムにおけるバックグラウンドに影響をあたえないべきであり、異なる検出システムと適合性であるべきである。
【００８１】
概して、タンパク質マイクロアレイは、ＤＮＡアレイの読みのために一般的に使用されるものと同じ検出方法を使用する。同様に、ＤＮＡマイクロアレイの読みのために使用されるものと同じ装置はたんぱく質アレイに適用可能である。
【００８２】
従って、捕捉アレイ（例えば、抗体アレイ）は、２つの異なる供給源、例えば正常性体液及び疾患性体液由来の蛍光標識されたタンパク質を用いてプローブ化することができる。この場合では、読み出しは、標的タンパク質の発現レベルにおける変化を反映するものとして蛍光シグナルにおける変化に基づく。代替的な読み出しとしては、限定されないが、蛍光共鳴エネルギー転移、表面プラズモン共鳴、ローリングサークルＤＮＡ増幅、質量分析法、共鳴光分散、及び原子力顕微鏡が挙げられる。
【００８３】
さらなる詳細のために、例えば、Ｚｈｏｕ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：Ｓ３４−９（２００１）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４０−４５−（２００１）；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎｏｃｋ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４２：４９４−５００（２００３）；ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：１４−９（２００２）を参照。生体分子アレイはさらに、米国特許第６，４０６，９２１号（２００２年６月１８日に登録）にも開示され、その開示全体は、ここで参考として明らかに組み込まれる。
【００８４】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかである。
【実施例】
【００８５】
実施例１
一般的なプロトコル
羊膜内感染の霊長類モデル
このプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒｅｇｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒによって承認され、ヒトのケアのためのガイドラインに従った。時間通りの妊娠状態の１９匹の妊娠したアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を、慢性的にカテーテル挿入し、以前に記載されているとおりに手術後に維持した（Ｈａｌｕｓｋａ ＧＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＲＵ ４８６ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎ ｌａｔｅ ｇｅｓｔａｔｉｏｎ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １５７：１４８７−９５（１９８７）；ａｎｄ Ｇｒａｖｅｔｔ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｔｒａ−ａｎｍｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１：１６６０−７（１９９４））。
【００８６】
簡潔に述べると、妊娠約１１０日（期間は１６７日である）に、妊娠した動物をジャケット内及び綱システムで慣らした（Ｄｕｃｓｓａｙ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖｅｓｔ ａｎｄ ｔｅｔｈｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ３８：３４３−４（１９８８））。慣らした後、一般的な麻酔下で妊娠１１９日〜１２６日に子宮内手術を行った。母体の大腿動脈及び静脈カテーテル、胎児の動脈及び静脈カテーテル、２つの開口末端を有する羊膜内圧力カテーテル、子宮筋層の筋電法の電極、及び胎児の筋電法の電力を外科的に移植した。手術後１〜５日間、子宮の非刺激性を制御するために全ての動物に硫酸テルブタリン（１日に２回、３〜５時間にわたって１ｍｇを静脈投与）を与えた。動物にさらにセファゾリン（１２時間ごとに２５０ｍｇを静脈投与）を与え、バクテリアの接種前少なくとも４８時間に投与をやめた。
【００８７】
８〜１３日間（妊娠１２６〜１３８日）操作後に安定させた後、（ａ）生理食塩水中に懸濁させたグループＢ連鎖球菌（タイプＩＩＩ）の１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）（ｎ＝７）、（ｂ）１０Ｂ培地に懸濁させたＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ １０７ｃｆｕ（正式にはＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、血液型亜型１）（ｎ＝６）、又は（ｃ）１０％のショ糖及び２％の内毒素の存在しない胎児子ウシ血清を含むリン酸緩衝化食塩水に懸濁させたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ１０６〜１０７ｃｆｕ（ｎ＝６）を羊膜内接種することによって実験的な羊膜内感染（ＩＡＩ）を確立させた。グループＢ連鎖球菌単離物は、髄膜炎をもつ新生児からもともと回収した。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍは、絨毛羊膜炎及び新生児セプシスをもつ患者の胎盤及び膜から低継代させた臨床単離物由来であった。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓは、ｐｏｓｔｍａｒｔｕｍ子宮内筋層炎をもつ患者由来の子宮内膜単離物であった。
【００８８】
試験期間中（接種前は毎日、接種後は４時間〜１２時間ごと）、定量的なバクテリア培養物、血球計算板による白血球細胞分析、及びサイトカイン濃度及びプロスタグランジン濃度のために（以前に報告されたＧｒａｖｅｔｔ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｔｒａ−ａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１：１６６０−７（１９９４））、及びプロテオミクス分析のために、全ての動物から羊水サンプルを順次集めた。
【００８９】
胎児の心電図及び子宮活性（心電図及び羊膜内の圧力）を、手術から分娩まで連続して記録した。時間あたりの収縮曲線の下の面積として子宮の収縮を記録し、ある時間の収縮面積（ＨＣＡ）（ｍｍＨｇ／時間（秒））として表した。
【００９０】
母体の頚を感染前に膣から触診し、その後も順次触診した。一致性、消失、及び膨張を各触診ごとに記録した。１匹の動物を除いて帝王切開によって分娩させ、１匹の動物においては膣から分娩させた後、感染を確認するために胎児、子宮脱落膜、胎盤、及び内膜のバクテリア培養物を得て、絨毛羊膜炎の証拠を出すために組織病理学的な研究を行った。
【００９１】
感染は上述のように行われた羊膜内接種の後、迅速に確立されていた。子宮絨毛羊膜炎が基本レベル１００から１０，０００ｍｍＨｇ×ｓｅｃ／ｈｒよりも大きなレベルまでの増加が、平均でグループＢ連鎖球菌を用いて接種した３３＋９時間後、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍを用いて接種した４３±１４時間後；及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓを用いて接種した６２±１４時間後に生じた。子宮収縮は進行性の頚部の膨張をもたらし、全ての場合において消失した。子宮収縮の増加は、以前に報告されているように、炎症前サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ−８、プロスタグランジンＥ２及びＦ２αにおける顕著な増加に先行した（Ｇｒａｖｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１：１６６０−７（１９９４））。陣痛の発生前にＩＡＩの臨床的な徴候を示した動物はいなかった。絨毛羊膜炎を全ての場合において確認した。
【００９２】
ヒトの研究（女性における潜伏的なＩＡＩ）
以前に記載されるように、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ又はシアトルの関連病院で１９９１年６月２５日〜１９９７年６月３０日まで、インタクトな胚膜を持つ妊娠２２〜３４週での早期分娩で入院した３０９人の女性から研究集団を抜き出した（Ｈｉｔｔｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １７７：５０−６（１９９７））。全ての女性は、書面によるインフォームドコンセントを受けておリ、試験プロトコルは、全ての参加病院についてＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓによって承認された。全ての参加者は、研究登録時にインタクトな胚膜を有していた。早期分娩は、＞１ｃｍの頚部の変化又は頚部の膨張又は＞５０％の頚部成熟度のいずれかを伴って、≦１０分の頻度での規則的な子宮収縮として定義された。
【００９３】
潜伏的なＩＡＩは、陽性のＡＦ微生物培養物及び／又はＡＦインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度＞２ｎｇ／ｍｌ、絨毛羊膜炎の組織学的証拠（１０の隣接しない部分において４００倍の部分あたり、≧１０の多形核の白血球の存在によって定義される）及び子宮圧痛又は発熱の非存在によって定義された。本発明者らは以前に、報告した。ＡＦ ＩＬ−６濃度＞２ｎｇ／ｍｌは試験集団全体について７５パーセンタイル以上であり、ポリメラーゼ連鎖反応によるバクテリアの検出と相関関係にあることを報告した（Ｈｉｔｔｉｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２４：１２２８−３２（１９９７））。入院時に＞４ｃｍの頚部膨張又は破壊された膜を持つ女性は排除した。多胎妊娠、頚部セルクラージュ、前置胎盤、常位胎盤早期剥離、糖尿病、高血圧、及び子かん前症の女性は、他の基準を満たせば適格とみなした。
【００９４】
経腹壁的な羊膜穿刺を全ての試験参加者について超音波による誘導の下で行い、登録時に静脈穿刺によって母体の静脈血を集めた。この研究集団から、部分集合（表１Ａ及び１Ｂ）は、ここで報告されるようなプロテオミクス分析について遡及的に同定した。この部分集合は、それぞれ１１人の患者の３つのグループを含んでいた：グループＩ−上に定義されるような潜伏性のＩＡＩの証拠を有する患者；グループＩ−記録された子宮内感染を有さないが、３４週以下の妊娠期間での早期出産をした患者のランダムに選択された部分集合、及びグループＩＩＩ−感染しておらず、早期分娩を有したが早産防止薬に反応して、後でほぼ所定期間に近い期間（妊娠＞３５週）で後に分娩した患者。これら３つのグループ間で母体の年齢、人種、又は経産に差異はなかった（表１Ａ及び１Ｂ）。しかし、子宮内感染を有する患者は、登録時にはいくらか在胎齢が早くにみられ（ｐ＝０．１０）、感染なしに早期出産した患者又は所定の期間で分娩した患者よりも顕著に早い在胎齢で分娩した（それぞれ、２７．３±０．９週 対 ２９．８±１．０及び３７．０±０．９週、ｐ＜０．０００ｌ）。それに加えて、子宮内感染を有する患者は、登録から分娩まで顕著に短い時間を有していた（他の２つのグループの８．４±６．３日及び４６．９±５．６日と比較して、２．１±５．６日、ｐ＜０．０００１）。子宮内感染を有する患者の９１％が、登録の７日以内に分娩した。分析までサンプルを−２０℃で保存し、２回を超えては解凍しないようにした。
【００９５】
感染を有する１１人の患者の中で、４人から（大腸菌を有する２人、カンジダアルビカンスを有する１人、及び混合嫌気菌を有する１人）微生物を回収し；これらの患者の全ては７日以内に分娩した。他の７人の患者は、２，０００ｐｇ／ｍｌより大きな羊水ＩＬ−６濃度に基づいて同定した。インターロイキン−６の平均羊水濃度は、感染なく早期出産をした患者の中の０．６８±０．２０ｎｇ／ｍｌ及び早期分娩があり、所定期間に分娩した患者の中の０．２５±０．１３ｎｇ／ｍｌと比較して、これらの患者の中で２７．７±７．８ｎｇ／ｍｌであった（ｐ＜０．０１）。
（表１Ａ）
試験集合の特性
【００９６】
【表１Ａ】
データは、平均、標準偏差で示した。連続データについてのＡＮＯＶＡによる分析及びカテゴリーデータについてのカイ二乗分析として表された。省略語：ＰＭＤ，早期分娩＜３５週；ＩＵＩ、子宮内感染；ＰＭＬ、分娩なしの早産。
（表１Ｂ）
スクリーニング結果
【００９７】
【表１Ｂ】
＊このプール中の２つの陽性サンプルは、ＰＣＲ手順によって陽性の、２つの被検体のＡＦが低レベルのバクテリアを示したことから、潜伏性感染を表す。このことは、タンパク質プロファイリングが潜伏性羊膜内感染を同定するのに使用可能であることを示す。
【００９８】
上述の表では、データは、平均、標準偏差で示した。連続データについてのＡＮＯＶＡによる分析及びカテゴリーデータについてのカイ二乗分析として表された。省略語：ＰＭＤ，早期分娩＜３５週；ＩＵＩ、子宮内感染；ＰＭＬ、分娩なしの早産。
（表１Ｃ）
試験結果をスクリーニングするためのＦｉｓｈｅｒ試験の有意性値
【００９９】
【表１Ｃ】
不顕性のＩＡＩをもつ１１人の患者のうち４人は、回収された微生物を有していた（大腸菌を有する２人、カンジダアルビカンスを有する１人、及び混合嫌気菌を有する１人）。感染している他の７人の患者は、＞２ｎｇ／ｍｌの顕著に高いＡＦ ＩＬ−６濃度をもとに同定した。ＩＬ−６の平均ＡＦ濃度は、感染なく早期出産をした患者の中の０．６８±０．２０ｎｇ／ｍｌ及び早産があるが、所定期間に分娩したグループＩＩＩの患者の中の０．２５±０．１３ｎｇ／ｍｌと比較して、これらの患者の中で２７．７±７．８ｎｇ／ｍｌであった（ｐ＜０．０１）。
【０１００】
羊水のプロテオミクス分析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるタンパク質同定
コントロールサンプル及び感染サンプル由来の羊水１００μｇを、ヨードアセトアミドで還元し、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。８０Ｖで電気泳動を行ない、サンプル中のタンパク質を分離した。電気泳動の後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色し、画像をＢｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーター及びＰＤＱＵＥＳＴソフトウェアで集めた。各レーンからの個々のバンドをゲルから切断し、脱色し、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１２：４８７−５１１（１９９９））の方法を用いて、ゲル中でトリプシンで３７℃で２４〜４８時間消化した。ペプチドを０．１％ＴＦＡで抽出し、スピードバキューム（ｓｐｅｅｄｖａｃ）中で乾燥した。抽出物を０．１％ＴＦＡに溶解し、Ｚｉｐ Ｔｉｐｃ１８ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を用いて、ＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）に接続したＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，ＵＫ）を用いて、及び／又は１１０ キャピラリーＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に接続したイオン捕捉（ＬＣＱ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、精製した（Ｍａｒｖｉｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４（１４）：１２８７−９２，２０００）。
【０１０１】
２−次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動
羊水（４００〜２０００μｇ）（アルブミンを含むものと含まないもの）をＩＥＦバッファーに溶解し、ＩＰＧ片（ｐＨ３〜１０）２４ｃｍに室温で１２時間再水和させた。再水和後、ＩＰＧ片を７０〜９０ｋＶｈｒｓで１次元電気泳動にかけた。次いで、ＩＰＧ片をＤＴＴ平衡バッファーＩ及びＩＡＡ平衡バッファーＩＩを用いて順次１５分間平衡化させ、その後２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。次いで、ＩＰＧ片を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに入れ、１２０Ｖで１２時間ゲル電気泳動し、２次元でタンパク質を分離した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーター及びＰＤＱＵＥＳＴソフトウェアを用いて画像化した。個々のスポットをゲルから切断し、脱色し、ゲル中でトリプシンで３７℃で２４〜４８時間消化した。ペプチドを０．１％ＴＦＡで抽出し、Ｚｉｐ Ｔｉｐｃ１８ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を用いて精製した（２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：１１２，１９９９）。
【０１０２】
ＨＰＬＣ分画
アルブミン及びＩｇＧを除去した後のヒト羊水サンプル（１〜１５ｍｇタンパク質）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。オートサンプラー及びＵＶ吸収検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ １５２５ ＨＰＬＣ上でＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを用いてアニオン交換クロマトグラフィーを行った。直線的な塩溶離勾配を用いてタンパク質を分画した。フラクションを１分ごとに集めた。フラクションをプールし、トリプシンで消化し、ペプチド混合物を質量分析計（Ｑ−Ｔｏｆ−２）を用いて分析した。
【０１０３】
質量分析計による分析
（１）Ｑ−Ｔｏｆ−２
ゲル中で消化した後のサンプルをＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＣａｐＬＣに接続したＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ−２質量分析計で分析した。Ｑ−Ｔｏｆ−２に規則的なＺ−スプレー又はナノスプレー源を取り付け、Ｉｎｔｅｇｒａｆｒｉｔ Ｃ１８ ７５ｕｍ ＩＤ×１５ｃｍ石英ガラスキャピラリーカラムに接続した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴ及びＭａｓｓＬｙｎｘ３．５ソフトウェアを入れたＣｏｍｐａｑワークステーションで、装置を制御し、データを得た。ＣａｐＬＣ内に直接注入又は注射することによってＱ−Ｔｏｆ−２をＧｌｕ１Ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｂを用いて較正した。ＭＳ／ＭＳＭＳ調査方法を使用して、ＭＳ／ＭＳＭＳスペクトルを得た。ＭＳ調査について質量４００〜１５００をスキャンし、ＭＳＭＳについて質量５０〜１９００をスキャンした。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００及びＳＥＱＵＥＳＴ（バージョン１．３）及び／又はＬＵＴＥＦＩＳＫを入れたＰＣで一次データ分析を行った。ピークピッキングのためのビルトイン自動化機能を用い、各ピークについて質量中心−フィッティングを適用して、ピークリストを作成した。
【０１０４】
（２）ＬＣＱ−ＭＳ
乾燥したＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ染色したゲルからのタンパク質スポットを切除し、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５０％アセトニトリル溶液０．５ｍｌ中で３０分間再水和／洗浄した。次いで、ゲル領域を真空遠心分離によって乾燥し、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：４８７−５１１（１９９９）の方法を用いて、２０ｎＭシーケンスグレード改変トリプシン（ＰｒｏＭｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で再水和させることによって系中で消化した。次いで、トリプシン消化物を真空遠心分離によって濃縮し、逆相クロマトグラフィーによって分離し、ペプチドをモデルＬＣＱイオン捕捉質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分析した。サンプルを、１０μＬｍｉｎ−１流速及び勾配０〜４０％Ｂ（水中の７５％アセトニトリル）を１時間かけて、Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−１８ ０．５ｍｍ×１５０ｍｍミクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）カラムを用いて、１１００キャピラリーＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて分離した。標準的なＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ電気スプレー源にペプチドを直接導入した。標準的なＬＣＱソフトウェアを用いて自動化様式でＭＳ／ＭＳスペクトルを得て、次いで、ＳＥＱＵＥＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いてさらに分析した。さらなる詳細のために、Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．（前出）を参照。
【０１０５】
データ分析
（１）Ｓｅｑｕｅｓｔ及びＤＴＡＳｅｌｅｃｔ ＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて、Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３−６９（１９９９）に記載されるように、タンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の自動化分析を行った。ＳＥＱＵＥＳＴは、データベースペプチド配列に対して連続的なタンデムマススペクトルを一致させる。索引付きの重複のないＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（公開日）及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（公開日）から得られたタンパク質配列のデータベースを組み合わせて使用して、デフォルトパラメーターを用いてサーチを行った。Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｍａｎａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いてデータベースを構築した。Ｓ−カルボキシアミド化システインは、単なる改変であるとみなされた。
【０１０６】
Ｓｅｑｕｅｓｔの結果をＤＴＡＳｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔａｂｂ，２００２）を用いてさらに分析した。ＤＴＡＳｅｌｅｃｔはＳＥＱＵＥＳＴ同定物を系統立て、ふるい分ける。以下のものを除いてデフォルトパラメーターを使用した：（１）タンパク質の記載中に列「ケラチン」を含む任意のデータベースマッチは排除され、（２）ＬＣＱ質量分析計からのスペクトルを二重に荷電したイオンについて２．４の交さ相関スコアカットオフでふるい分けられた。ＤＴＡＳｅｌｅｃｔによって選択された各スペクトル及び提案された配列対を視覚的に観察し、管理のために最終的な結果をスプレッドシート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）又はデータベース（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａｃｃｅｓｓ）にインプットした。
【０１０７】
さらなる詳細については、Ｔａｂｂ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．，ＤＴＡＳｅｌｅｃｔ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ：Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１：２１−２６（２００２）も参照。
【０１０８】
（２）Ｌｕｔｅｆｉｓｋ コンピュータープログラムＬｕｔｅｆｉｓｋ １９００ ｖ１．２．５（Ｔａｙｌｏｒ ＪＡ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＳ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７３（１１）：２５９４−６０４（２００１）を用いて、全てのスペクトルの自動化デノボ配列決定を行った。Ｌｕｔｅｆｉｓｋは、ホモロジー−ベースの配列サーチのために十分詳細であるスペクトルについてペプチド配列を作成する。改質、アクリルアミド、カルバミドメチル化、及びリン酸化を考慮した。
【０１０９】
ＭＡＬＤＩ検出プロトコル及びパラメーター
二段階遅延抽出源を備えた特注の飛行時間反射質量分析計（Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ７（６）：４９６−５０１（１９９３））を用いて、ＭＡＬＤＩ質量分析法を行った。約１μＬのサンプル溶液を１μｌのＳＡ（６０：４０水／アセトニトリル ０．１％ＴＦＡ最終濃度中のシナピン酸）と混合した。この検体／マトリックス溶液の１．０μＬの液滴をマトリックス前結晶化サンプルプローブ上に付着させ、空気中で乾燥させた。（３５５ｎｍ）Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）を用いてサンプルを照射し、２３ｋＶで７００ｎｓ／１．０ｋＶの遅延を有したイオン源を操作することによって、マススペクトルを作成した。２０の連続したスペクトルの合計として各マススペクトルを記録し、それぞれ光子の単独のパルスによって作成された。追加した標準からのイオンを質量較正に使用した。
【０１１０】
羊水のＳＥＬＤＩ分析
羊水サンプルからの全０．５〜３．０ｕｇタンパク質でＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅ ＮＰ２０（ＳｉＯ２表面）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｈ４（疎水性表面：Ｃ−１６（長鎖脂肪族）、又は固定化ニッケル（ＩＭＡＣ）ＳＥＬＤＩタンパク質Ｃｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上に点を付けた。室温で１時間インキュベーションした後、ＮＰ１及びＨ４チップを５ｕｌの水洗浄液にさらし、結合していないタンパク質及び干渉物質（すなわち、バッファー、塩、洗剤）を除去した。２〜３分空気乾燥した後、５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中のシナピン酸の飽和溶液０．５ｕｌを２回適用し、０．５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）を添加し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（ＰＢＳＩＩ），Ｉｓｓａｑ，Ｊ．Ｈ，ｅｔ ａｌ．：Ｔｈｅ ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ。Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．５；２９２（３）：５８７−９２，２０００中の飛行時間質量分析計によって質量分析を行った。
【０１１１】
ポリクローナル抗体及びＷｅｓｔｅｒｎイムノブロッティング
対応するタンパク質由来の免疫抗原性のペプチドを使用してウサギポリクローナル抗体（ＤＳＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）を作成し、次いで、アフィニティー精製した抗体をＷｅｓｔｅｒｎブロットのために使用した。１００μｇのＡＦタンパク質を４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。母体血清から、３００μｇのタンパク質をＩＧＦＢＰ１モノクローナル抗体（ＤＳＬＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた免疫沈降のために使用し、生成物をＷｅｓｔｅｒｎブロットした。母体血清中のカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂの検出のために、１５０μｇのアルブミンを除去した母体血清をＷｅｓｔｅｒｎブロットのために使用した。ＰＢＳＴ中の５％脂肪除去牛乳を用いて室温で４５分間、膜をブロックし、１μｇ／ｍｌの一次抗体（ＩＧＦＢＰ−１、アズロシジン、ビタミン−Ｄ結合タンパク質及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）−Ｂ、ＤＳＬ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡから）を用いて４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（シグマ）を用いて膜をインキュベートし、高められた化学ルミネセンスを用いて視覚化した。
【０１１２】
実施例２
羊水中で発現したタンパク質及びポリペプチドの同定
実施例１に記載された物質及び方法を用いて、正常羊水及び感染羊水中で発現したタンパク質及びポリペプチドを同定した。ヒト及び霊長類の羊水サンプル（プールしたもの及び個々のもの）を、実施例１に記載されるようなタンパク質分離技術で分離した（１−Ｄ、２−Ｄ及びＨＰＬＣ分画）。分離したタンパク質（ゲルバンド、スポット及びフラクション）をトリプシンで消化して、ペプチドプールを作成した。ペプチドプールをタンデムＭＳを用いて分析して、それらのアミノ酸配列及び組成を解読した。
【０１１３】
スペクトル検証プログラムを用いて５０００のＭＳスペクトルを選択した。デノボ配列決定プログラム（Ｌｕｔｅｆｉｓｋ，Ｐｅａｋｓ）を用いてこれらのスペクトルファイルを分析し、各ペプチドに対応するアミノ酸配列を作成した。ペプチドプールから作成されたデノボ配列を使用して、実施例１に記載されるようにタンパク質及びＤＮＡデータベースをサーチした。
【０１１４】
ホモロジーマップ及び配列検証を用いて、種々のタンパク質の発現を羊水中で発見した。検出したタンパク質を、既知の構造類似性（配列ホモロジーマップ）に基づいて潜在的な機能について分析した。広範囲の疾患にかかわる重要な機能分類に属するタンパク質が発見された。ヒト羊水中で最初に発見されたタンパク質及びポリペプチドをこれらの潜在的な機能カテゴリーのもとで以下の表２に列挙する。
【０１１５】
免疫アッセイにおいて示差的に発現することが示されたタンパク質、及び感染した羊水中でより豊富に又は固有に現れるタンパク質は別個に表示する。この内容において、相対的な量は、参照サンプルと比較して、試験サンプル中の特定のポリペプチド又はタンパク質を表すペプチドの量として定義される。それ故に、同じタンパク質から誘導されるより多くのペプチドが、羊水の感染していない参照サンプルよりも感染した羊水中に存在する場合、タンパク質は、感染した羊水中でより豊富に現れる。
【０１１６】
表３は、羊水中に存在する以前に知られたタンパク質及びポリペプチドを列挙し、これらの存在は、本アッセイによって再確認された。感染に関連する事象のための既知のマーカーであるタンパク質は、別個に示される。
（表２）
ヒト羊水中で最初に発見されたタンパク質及びポリペプチド
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表２Ａ】
・タンパク質は免疫アッセイでも示差的に発現することが示される
＃これらのタンパク質を表すペプチドは、感染した羊水中でより豊富であるか、又は固有に検出される。
（表３）
人羊水中に存在することが以前に知られており、デノボ配列決定を用いて同定されたタンパク質及びポリペプチド
【０１１９】
【表３】
＊感染に関連する事象についての既知のマーカー
羊水中で初めて発見されたさらなるタンパク質が以下の表４に表される。
（表４）
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
【表４Ａ】
【０１２２】
【表４Ｂ】
【０１２３】
【表４Ｃ】
【０１２４】
【表４Ｄ】
【０１２５】
【表４Ｅ】
ＩＰＩ＝国際タンパク質指数
子宮内の状態のための診断マーカー：
上の表に列挙されたたんぱく質は、子宮内状態を検出し監視するための有望な候補である。このような状態及び対応するタンパク質マーカーのいくつかの例を以下でさらに詳細に議論する。
【０１２６】
発育不全のマーカーとしてのアクチン調整及び関連タンパク質：
表２の構造タンパク質の中に列挙されるモエシン（膜を組織化する伸長スパイクタンパク質）は、膜貫通タンパク質のアクチン細胞骨格に対する結合に関与し、種々の細胞シグナル伝達経路に関係していることが知られている（Ｓｐｅｃｋ Ｏ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｅｓｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｈｏ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ２；４２１（６９１８）：８３−７，２００３）。Ｒｈｏ−ファミリーＧＴＰａｓｅ及びそれらのエフェクターが、アクチン改変分子、例えばコフィリン及びプロフィリン（これらも表２の構造タンパク質として列挙されている）の活性を調整し、その結果、増殖の円錐伸長又は収縮に関連する細胞骨格に変化を生じることが知られていた（Ｔａｎｇ ＢＬ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ，４２（３）：１８９−２０３，２００３）。コロニン様タンパク質ｐ５７（表２において列挙される別の構造タンパク質）はさらに、アクチン架橋及びキャッピングに関与し（Ｗｅｉｔｚｄｏｅｒｆｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｒｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ２／３ ｉｎ ｆｅｔａｌ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２９３：８３６，２００２）、既知の発育不全において調節異常を示す。別のアクチン調整タンパク質であるゲルゾリン（表２中のトランスポーター／結合タンパク質の列挙されるゲルゾリン前駆体を参照）はさらに、発育において制御され、臓器系において重要であることが知られている（Ａｒａｉ Ｍ，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＤＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌｓｏｌｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２１５，２９７，１９９９）。１４−３−３タンパク質はさらに、シグナル伝達及び分化経路にかかわる既知の上皮マーカーであり、脳及び他の生体臓器の正常な発育に必須である（Ｗｕ Ｃ，Ｍｕｓｌｉｎ ＡＪ．Ｒｏｌｅ ｏｆ １４−３−３ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，１１９，４５，２００２）。
【０１２７】
それ故に、発育中に重要な役割を有する列挙されたアクチン調整タンパク質及び他の関連分子は、ヒト羊水中で最初に同定され、種々の臓器系の発育不全、例えば、染色体異数性から生じ得る、例えば、中枢神経系、心臓血管系及び他の筋骨格の奇形を検出するために使用可能であった。このことは、感染した羊水中で示差的に発現することが示され、その示差発現が免疫アッセイによって確認される、プロファイリングＩにとって特に正しい。
【０１２８】
感染及び免疫応答関連障害のマーカー：
マクロファージキャッピングタンパク質、白血球エラスターゼ、好中球ゲラテナーゼ関連リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｃｎ）、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｌｅｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、Ｌ−プラスチン（リンパ球サイトゾルタンパク質）及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）（表２中の免疫応答関連遺伝子の列挙を参照）の感染した羊水での本発明の検出は、最初にこれらのタンパク質の羊膜内感染における存在および調整を示す。これらのタンパク質のいくつかは、感染、炎症及びストレスに対する応答において免疫細胞の既知のレスポンダーである。マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）は、アクチンフィラメントを調整し、炎症プロセスに関与するＣａ（２＋）−感受性タンパク質である（Ｄａｂｉｒｉ ＧＡ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃＤＮＡ．Ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｌｓｏｌｉｎ／ｖｉｌｌｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １５；２６７（２３）：１６５４５−５２，１９９２）。同様に、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）は、外傷及び創傷治癒において役割を果たすことが知られているカルシウム結合タンパク質である（Ｔｈｏｒｅｙ ＩＳ．ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｃａ２＋−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１００Ａ８ ａｎｄ Ｓ１００Ａ９ ａｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｉｎｊｕｒｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１；２７６（３８）：３５８１８−２５，２００１）。白血球エラスターゼ及び好中球ゼラチナーゼに関連するリポカルシン（ＮＧＡＬ）は、静菌機構及び溶菌機構に関与する（Ｇｏｅｔｚ ＤＨ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ＮＧＡＬ ｉｓ ａ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｒｏｎ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ．：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０（５）：１０３３−４３，２００２）。
【０１２９】
上述の免疫調整剤に加えて、本発明者らはさらに、感染した羊水中に２つの抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９及びアズロシジンを最初に発見した。抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９（ＬＬ−３７）はバクテリアリポ多糖類（１ｐｓ）に結合し、骨髄、精巣及び好中球中で発現する。Ｆａｌｌ−３９は肥満細胞の脱顆粒を刺激し、肥満細胞の強力な化学走性因子である。その抗菌活性のほかに、Ｆａｌｌ−３９は、肥満細胞を炎症病巣に動員する能力を有している場合がある。基本培地Ｅの存在下で、合成ＦＡＬＬ−３９は、大腸菌Ｄ２１及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｂｍ１１に対して非常に活性であった。皮膚のバリアの保全性が破壊された場合、Ｆａｌｌ３９が最初の防御線に参加し、局所的な感染及び微生物の全身侵襲を防ぐという防御的な役割が提案された（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ Ｂ，ｅｔ ａｌ．：ＦＡＬＬ−３９， ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ， ｉｓ ｃｙｓｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，３；９２（１）：１９５−９，１９９５）。
【０１３０】
アズロシジン（ＣＡＰ３７）は、ヒト好中球から単離されたカチオン性抗菌タンパク質であり、宿主防御及び炎症において重要な関係を有する。アズロシジンは、炎症中に放出され、単核球／マクロファージ機能、例えば、化学走性、生存の増加、及び分化を調整する（Ｐｅｒｅｉｒａ ＨＡ． ＣＡＰ３ ７， ａ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ；５７（６）：８０５−１２，１９９５）。
【０１３１】
プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターは、タンパク質制御において鍵となる役割を果たし、いくつかの鍵となる生理学的機構を制御する。本発明者らは、羊膜内感染を含むヒト羊水中で初めてプロテアーゼのセルピンファミリー（セルピン、扁平上皮細胞癌腫抗原１及び２、グリア誘導ネキシン）の発現を同定した。セリンプロテアーゼインヒビターのセルピンスーパーファミリーは、多くの生物学的経路において、プロテアーゼの制御において中心的な役割を有し、例えば、アミロイドーシス、プリオン脳障害及びハンチントン病及びアルツハイマー病のような構造的な疾患にかかわる。（Ｌｏｍａｓ ＤＡ，Ｃａｒｒｅｌｌ ＲＷ，Ｓｅｒｐｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ；３：７５９，２００２）。
【０１３２】
さらに、羊膜内感染において、本願発明者らは、免疫制御に関与する周知のプロテアーゼインヒビターであるシスタチンの発現を同定した（Ｖｒａｙ Ｂ，Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｓ，Ｈｏｅｂｅｋｅ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｉｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ；５９（９）：１５０３−１２，２００２）。
【０１３３】
列挙されたタンパク質は、感染及び／又は免疫応答関連障害の有望なマーカーである。
【０１３４】
マクロファージキャッピングタンパク質、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ミエロペルオキシダーゼ前駆体、Ｌ−プラスチン、アズロシジン、抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ、プロフィリンＩ、グリアから誘導されるネキシン、セルピンＩ２、及びシスタチンＡを表すペプチドが、正常な羊水と比較して感染した羊水中でさらに豊富に又は固有に検出され、免疫アッセイにおいて示差発現を示したことは注記すべきことである。
【０１３５】
それ故に、これらのタンパク質は、羊膜内感染及び／又は免疫応答関連障害のマーカーとして特に重要である。
【０１３６】
ヒト羊水中で検出された他の疾患（感染）に特異的なタンパク質
表２に列挙されたＧｐ−３４０改変体タンパク質は、ヒトの感染羊水中で検出され、肺において以前に同定されたスカベンジャーレセプターである。このタンパク質は、バクテリア（連鎖球菌及び改変体）に結合することが知られている。感染した羊水におけるこのタンパク質の検出は、ＩＡＩのためのバイオマーカーを同定するための本発明の感受性のプロテオミクスアプローチを補完する。従って、感染した羊水中で同定されたＧｐ−３４０改変体タンパク質は、それ自身で新生児セプシスを検出するのに有用である）。
【０１３７】
ＩＧＦＢＰ−１（タンパク分解性のフラグメント）
表２に示されるように、ＩＧＦＢＰ−１は、感染した羊水中で示差的に発現することが示された。インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）系は、胎児及び胎盤の成長に決定的に関与し、自己分泌／パラ分泌機構を介する子宮内膜中のステロイドホルモン作用を調整する。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、増殖及び分化を刺激し、インビトロでいくつかの細胞種において分化した細胞機能を維持した。子宮内膜間質細胞はＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩを産生し、さらに高アフィニティーのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を産生する。ＩＧＦ作用を調整可能な６つの高アフィニティーＩＧＦＢＰのｍＲＮＡは、ヒト子宮内膜中で発現される。ヒト子宮内膜中で最も豊富なＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ−１であり、これは、後期分泌段階及び妊娠中において、前脱落膜化／脱落膜化子宮内膜間質細胞によって分泌される。このことは、臨床的な産科学及び婦人科学について示唆を有し、ここに子かん前症、子宮内成長阻害、多嚢胞性卵巣症候群及び栄養芽細胞及び子宮内膜の新生物におけるＩＧＦＢＰ−１の病態生理学的な役割の証拠が存在する。
【０１３８】
ヒト羊水中及び母体血清中のＩＧＦＢＰ−１タンパク分解性のフラグメントの存在及び調整は、妊娠に関連する子宮内及び母体状態を監視するための新しい道筋を開く。
【０１３９】
さらなる詳細については、以下の実施例１２も参照されたい。
【０１４０】
実施例３
子宮内感染後の霊長類及びヒト羊水のタンパク質発現プロフィール
化学的に定義された正常相のチップアレイに結合したＡＦ抽出物の２３５レーザー強度で集めた全スペクトルＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析において、３〜５ｋＤａ及び１１〜１２ｋＤａ領域において、感染及び非感染の霊長類及びヒトのＡＦ間でいくつかのピーク強度が異なることがわかった
対応する正常な発現プロフィールと比較した場合の子宮内感染後の霊長類羊水のタンパク質発現プロフィールを図１Ａ〜Ｃに示す。図１Ａ〜Ｃに示されるように、コントロール及び感染羊水の全体的なタンパク質発現プロフィールは異なる。小さな質量範囲における羊水プロフィールの詳細なスペクトル（図１Ｂ及び１Ｃ）は、約３〜５ｋＤａ及び１０〜１２ｋＤａ範囲において、コントロールと感染サンプルとのタンパク質発現プロフィールが別個のものであり、特徴的に異なることを示す。このことは、子宮内感染に応答するタンパク質発現の全体的な調整を示し、子宮内感染を診断する固有の発現サインを検出する能力を示す。
【０１４１】
図２は、感染（ＧＢＳ）に応答する霊長類羊水の時間推移分析を示す。バクテリア接種の前及び感染後に順次羊水を集め、実施例１に示されるようなＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。図２Ａは感染前のタンパク質発現プロフィールを示し、図２Ｂは感染１２時間後のタンパク質発現プロフィールを示し、図２Ｃは感染３６時間後のタンパク質発現プロフィールを示す。
【０１４２】
図２Ｃに示されるように、子宮内感染の診断ピーク（１０〜１１ｋＤａ）のうちの１つは、急性感染の３６時間以内に、明らかに高いレベルの発現レベルに到達する。このことは、診断タンパク質プロフィールを、疾患の状況及び処置に対する応答を監視するために使用できることを示す。
【０１４３】
図３は、化学的に定義された正常相チップアレイに結合したヒト羊水抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。図３Ａは、２３５レーザー強度での全スペクトルを示す。図３Ｂは、１０〜１２ｋＤａ領域における感染サンプル及びコントロールサンプルの間の差異を示す詳細なスペクトルである。図３は、３〜５ｋＤａ領域において感染サンプル及びコントロールサンプルの間の特徴的な差異を示す詳細なスペクトルである。
【０１４４】
図３Ａ〜Ｃに示されるように、コントロール羊水及び感染羊水の全体的なタンパク質発現 プロフィールは異なっている。さらに小さな質量範囲における羊水プロフィールの詳細なスペクトル（図３Ｂ及びＣ）は、コントロールサンプルと感染サンプルとの間でタンパク質が異なって過剰発現している（３〜５ＫＤａ及び１０〜１２ｋＤａ範囲）ことを示す。タンパク質ピークの相対強度分析は、２つの異なる診断クラスター（１０〜１２ｋＤａ及び３〜５ｋＤａ範囲）の存在を示唆する。このことは、子宮内感染に応答したタンパク質発現の全体的な調整を示し、ヒト及び霊長類モデルの両方における子宮内感染の診断に固有の発現サインを検出する能力を示す。
【０１４５】
ヒト羊水の診断パターンは、霊長類の羊水の診断パターンと良好に一致することは注記すべきことである（実施例３及び４）。
【０１４６】
実施例４
示差質量分析計を用いた診断プロフィールの作成
診断タンパク質発現プロフィールは、異なる種類の質量分析計を用いて検出することができる。異なる質量分析計が類似の診断プロフィールを作成するか否かを試験した。診断プロフィールが実質的に質量分析計の種類に依存しない場合、羊水中で検出された示差的なタンパク質発現は、子宮内感染の診断サインを与えることができる。
【０１４７】
図４は、ヒトコントロール由来の羊水（子宮内感染なし）（Ａ）、及び子宮内感染ありのサンプル（Ｂ）を用いて、一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で得たマススペクトルを示す（Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ７（６）：４９６−５０１（１９９３））。
【０１４８】
図４Ａ及びＢに示されるように、１０〜１２ｋＤａ範囲における子宮内感染の診断プロフィールは、代替の質量分析計を用いて検出され、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ機を用いて検出したプロフィールと類似である。このことは、示差的なタンパク質発現プロフィールが確固たるものであり、広範囲の現在の質量分析計を用いて検出できることを示す。
【０１４９】
まとめると、羊水タンパク質及びポリペプチドが、疾患の状況を診断する示差的な発現パターンを示すことがわかった。ここに示された結果は、疾患に特異的な診断パターンが複数の質量分析計アプローチを用いて検出可能であることを示す。パターン又はタンパク質発現プロフィールは、ヒト及び霊長類の間で比較可能である。プロフィールを使用して、時間が推移した場合の効果（感染又は処置）を監視することができる。
【０１５０】
実施例５
診断的及び予防的に監視するための羊水におけるタンパク質及びポリペプチド発現の定量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
多量の塩を含有するヒト羊水（ＡＦ）由来のタンパク質をアセトンで沈殿させた。１００μｇの羊水タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色した。ゲル画像をＢｉｏ−ＲａｄゲルＳｃａｎｎｅｒでスキャンした。
【０１５１】
図５は、ＳＤＳ−Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色したゲルを示す。（Ａ）プールした４つのヒトコントロールＡＦサンプル；（Ｂ）個々のコントロールＡＦサンプル；（Ｃ）プールした４つのヒト感染ＡＦサンプル；及び（Ｄ）個々の感染ＡＦサンプル。
【０１５２】
図５は、１０〜１５ｋＤａ範囲におけるコントロールタンパク質及び感染タンパク質の間の発現レベルの顕著な違いを示す。質量分析計を用いて質量検出されたこの質量におけるタンパク質及びタンパク分解性のフラグメントのいくつかが、タンパク質発現レベルを反映した診断プロフィールに関係することと、診断的有用性及び予後的有用性を有することが結論付けられた。
【０１５３】
実施例６
子宮内感染由来の羊水のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析
１００μｇのＡＦタンパク質を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに２００Ｖで６０分かけ、ＰＶＤＦ膜に９０ｍＭで７５分移した。膜を５％ミルクＰＢＳＴで室温で４５分間ブロックし、１μｇ／ｍｌの一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｄａｋｏ）で４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜を二次抗体ＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ）で室温で９０分間インキュベートし、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）で視覚化した。
【０１５４】
この結果を図６に示す：（Ａ）コントロールＡＦサンプル（プールした）；（Ｂ）感染したＡＦサンプル（プールした）。図６は、ＩＧＦＢＰ１（１１ｋＤａ）、プロフィリン及びセルロプラスミン（１３０ｋＤａ）が、感染していないＡＦと比較して感染したＡＦでさらに高いレベルで発現していることを示す。Ｌ−プラスチンレベルは、感染していないＡＦと比較して感染したサンプルにおいて、さらに低かった。これらのタンパク質をさらに、ＭＳアプローチを用いてヒトの感染サンプルから同定し（デノボ配列決定）、上の実施例２に列挙した。
【０１５５】
実施例７
子宮内感染由来の羊水の免疫沈降分析
２μｇの一次抗体を６００μｇのＡＦタンパク質と混合し、４℃で一晩インキュベートした。１５μｌのタンパク質Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを追加し、シェーカー上で室温で６０分インキュベートした。ビーズをＩＰバッファーで６回洗浄した。
【０１５６】
結果を図７に示す。ここで、（Ａ）はコントロール羊水サンプル（プールされた）を示し、及び（Ｂ）は感染した羊水サンプルを示す。図７は、セルロプラスミン（約１３０ｋＤａ）及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）（約１６ＫＤａ）がコントロール羊水よりも感染した羊水においてさらに高いレベルで発現していることを示す。
【０１５７】
実施例８
ヒト羊水及び母体血清における示差的なタンパク質発現の検出
羊水中で示差的に発現するタンパク質を、母体血清における同様のタンパク質を測定するための手がかりとして使用することができるか否かを試験した。これにより、診断及び監視のための迅速な非侵襲試験を開発することが可能になる。結果を図８に示す。ここで、（Ａ）はコントロールサンプル（プールされた）であり、（Ｂ）は感染サンプルである（プールされた）。
【０１５８】
図８は、ＩＧＦＢＰ−１のより小さなタンパク分解性のフラグメントが、子宮内感染に応答して、ＡＦ及び母体血清の両方で一致して示差的に発現することを示す。
【０１５９】
実施例９
子宮内感染由来の羊水のタンパク質マイクロアレイ分析
抗体：ＩＧＦＢＰ−１（ＤＳＬ）；補体Ｃ３、Ｄｅｓｍｉｎ、好中球エラスターゼ、ＮＳＥ抗体（ＤＡＫＯ）；カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）、セルロプラスミン、ＴＩＭＰ−１、プラスチン及びプロファイリング（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。
【０１６０】
抗体スポッティング：抗体を４０％グリセロール、６０％ＰＢＳ、ｐＨ７．５に１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、Ａｒｒａｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）を用いてアルデヒドスライドの上にスポッティングした。
【０１６１】
湿潤チャンバー中室温で３時間インキュベートした後、スライドを１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳ溶液（ｐＨ７．５）中で室温で穏やかに攪拌しながら１時間インキュベートした。
【０１６２】
タンパク質のビオチン化：Ｂｉｏｔｉｎ−ＮＨＳをＤＤ水に５０ｍｇ／ｌで溶解した。この溶液１０ｕｌを母体血清タンパク質溶液（１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ８．５）中５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、シェーカー上で３時間インキュベートした。５ｕｌのエタノールアミンを添加し反応を停止させた。ビオチン化タンパク質を２００ｕｌのＴＮＢバッファーで希釈し、抗体アレイを添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＴＮＴバッファーで３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、室温で３０分インキュベートした。Ｃｙ５−チラミド蛍光を用いて抗原−抗体相互作用を検出した。定量のためにスライドをＰＥ蛍光スキャナーでスキャンした。コントロール及び感染したスライドの画像を画像分析プログラムで重ね、相対量について擬似色で表した。結果を図９に示す。ここで、タンパク質アレイの擬似色画像は、対応するタンパク質とそれらの抗体との結合を示す。緑色は感染したサンプルを表し、赤色はコントロールサンプルを表す。部分ＩＩは、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）発現（緑色）が感染血清サンプルよりも高いことを示すアレイの拡大領域である。部分ＩＩＩは、感染羊水サンプル中で同様に多く発現していることを示すカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）ＩＰのＷｅｓｔｅｒｎブロットである。
【０１６３】
実施例１０
感染した羊水の固有の診断サイン中に表されるタンパク質のさらなる分析
コントロール及び感染した羊水のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロフィールが、陽性に感染したサンプルの代表例で、１０〜１２ＫＤａの質量範囲で固有のサインを示すことが示された（図１、２及び３）。コントロール及び感染した羊水を１−Ｄゲルで分離し（図５）、プールされたか又は独立した感染羊水サンプル中でさらに豊富な、１０〜１２ＫＤａの質量範囲におけるバンドを示す。これらの１−Ｄゲルバンドの単離及び図１３に示すようなＬＣＱ−ＭＳを用いたさらなる分析により、ＩＧＦ−ＢＲ−１及びＳ−１００カルシウム結合タンパク質の代表例であるペプチドを同定した。
【０１６４】
図８に示されるような抗−ＩＧＦ−ＢＰ１抗体を用いたコントロール及び感染した羊水のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析はさらに、感染においてタンパク分解性のフラグメント（約１１ＫＤａ）の示差的な発現を示す。
【０１６５】
羊水ポリペプチドの配列決定はさらに、感染した羊水中のＩＧＦ−ＢＰ１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）の存在を同定した（表３）。
【０１６６】
ＩＧＦＢＰ−１の同定した新規なタンパク分解性のフラグメント配列を図１２に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。図において、感染した羊水の１−Ｄゲル電気泳動、トリプシン消化及びＭＳ／ＭＳ分析後にサンプル中に見出されるペプチド配列「０４２６ｓｅｑ＿ＨＩ＿１２」及び「０４２５ｓｅｑ＿ＨＩ−１１３」を下の枠中に示す（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２及び３）。感染羊水由来のトリプシン消化した約１０．５〜１２ｋＤａバンドの１−Ｄゲル中で検出されたＩＧＦ−ＢＰ−１のタンパク分解性のフラグメント（低分子量範囲、図５）、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット（図６）、及びＭＳ／ＭＳ分析（図１３）は、下線を引いた配列の領域で現される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
【０１６７】
実際に、ＭＳ／ＭＳ分析及び配列サーチの結果は、図１３に示されるマススペクトル中の親イオン４３４．８９がＩＧＦ−ＢＰ−１配列（ＲＳＰＧＳＰＥＩＲ）を表すことを示し、ＩＧＦ−ＢＰ−１タンパク分解性のフラグメントの配列マップが図１２に示される。親イオン１０８２．９７は、Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質（すなわち、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ａ及びＢ）を表し、ＡＦのデノボ配列決定によっても独立して同定される（表２及び３）。
【０１６８】
図１４は、図１３に示される保持時間１７．５５〜１８．２１分のピークのマススペクトルを示す。強く出てくるピークは質量４３４．９であることが明らかである。図１５は、図１４に示される４３４．９ピークの親イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。データベースサーチに基づいて、親イオンはＩＧＦＢＰ−１の部分配列に対応する。
【０１６９】
実施例１１
ＩＡＩバイオマーカーの免疫検出
ＩＡＩにおいて同定されるタンパク質の示差発現を確認するために、全体的なタンパク質発現分析において同定された１１−ｋＤａ ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳプロフィール（カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ及びＩＧＦＢＰ−１）、１つの免疫制御分子（アズロシジン）、及び制御されていないタンパク質（ビタミンＤ結合タンパク質）から２つのマーカーを選択した。図１６に示されるように、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット分析は、全ての３つのバイオマーカーが、ＩＡＩ羊水で行われたタンパク質同定実験と一致する示差的な発現を示すことを確認した。
【０１７０】
ＩＧＦＢＰ−１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂに対して開発した特異的抗体を利用することによって、羊水中で示差的に発現したタンパク質が、血清が入手可能な限定された数の患者（ｎ＝５）由来のプールされた母体血清中で同定できるか否かを観察した。この限定された分析において、感染羊水とコントロール羊水との間で示差的に存在する１１ｋＤａピークに対応する１１ｋＤａのタンパク分解性のＩＧＦＢＰ−１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂのフラグメントはさらに、ＩＡＩに応答して母体血清中で検出された（図１６ｄ及びｅ）。アズロシジンは母体血清中で検出されなかった。
【０１７１】
実施例１２
染色体異数性に特徴的な診断プロフィール
母体血清スクリーニングを用いてトリソミー−２１をより正確に同定するためにプロテオームプロファイリングの有用性を試験した。この研究は、パネル（コントロール（ｎ＝６）、トリソミー−２１（ｎ＝６）及びトリソミー−１８（ｎ＝４）、十分に特徴決定された母体血清サンプル（同じ症例についての羊水サンプルのマッチングは、標準的な染色体マッピング方法及び陽性確認されたトリソミーの存在により試験した）で行ない、子宮内感染モデルについて上に記載されるようなＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ方法論を用いて分析した。
【０１７２】
図１０は、トリソミーを区別するための固有のプロフィールを有する母体血清における示差的なタンパク質発現パターンを示す。１μｇの母体血清（タンパク質分離カラム（ＢｉｏＲａｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でアルブミン及び免疫アルブミンを除去した後）を使用して、上に記載されるように、化学的に定義されたＮｏｒｍａｌ Ｐｈａｓｅチップアレイに結合した母体血清抽出物のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。２３５レーザー強度で集めた全スペクトルは、ピーク強度における差異を示す。（Ａ）コントロール血清；（Ｂ）トリソミー−２１（ダウンの）血清；（Ｃ）トリソミー−１８血清。詳細なスペクトルは、４〜１５ＫＤａ範囲において差異を示し、それぞれの症例について固有である。矢印は、診断スクリーニング試験を開発するためのアルゴリズムを処方するための組み合わせにおいて使用可能な診断ピークを示す。このことはさらに、種々の生体液（例えば母体血清）のタンパク質発現パターンの検出が、胎児−母体の状態を非侵襲アプローチでさらに正確に同定可能であることを示す。
【０１７３】
臨床的に関連する微生物を利用した実験的な霊長類モデルにおける、および異なる微生物に感染したメスにおける、ＩＡＩの設定でのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける有意に過剰発現した１１ｋＤａピークの検出は、広範囲の病原体によって生じるＩＡＩのこのサインに特定的であることを確認した。この過剰発現したクラスターは、急性炎症をおこした組織中のマクロファージ及び上皮細胞によって発現する、この固有のクラスター中で同定された１セットのタンパク質、すなわち、カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）は、Ｓ−１００カルシウム結合タンパク質ファミリーのメンバーであるため、感染に対する基本的な子宮内免疫応答を表し得る。このクラスターからの第２の候補は、ＩＧＦＢＰ−１の特異的なタンパク分解性のフラグメントであり、感染に応答する潜在的なプロテアーゼ関連機構を示す。インタクトなＩＧＦＢＰ−１は、ＡＦにおいて見出される主要なＩＧＦＢＰであり、胚膜及び母体の脱落膜の両方によって合成される。ＩＧＦＢＰのタンパク分解性の開裂は、十分に特徴決定された現象であるが（Ｍａｉｌｅ ｅｔ ａｌ．ＩＧＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｔｅｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ ＩＧＦ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉ：Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ＣＲ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｃ，Ｊｒ．，ｅｄｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、本試験において記載される特定のフラグメントは以前に記載されていない。
【０１７４】
第２のアプローチでは、コントロール及びＩＡＩにおいてＡＦ中で発現するタンパク質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた特徴決定により、ＩＡＩにおいて感染及び免疫応答に関連する顕著な量の分子を初めて同定した。マクロファージキャッピングタンパク質（ＭＣＰ）は、アクチンフィラメントを調整し、炎症プロセスに関与するＣａ＋２−感受性タンパク質である（Ｄａｂｒｉ ｅｔ ａｌ．．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１６５４５−５２（１９９２））。白血球エラスターゼ及び好中球ゼラチナーゼに関連するリポカルシン（ＮＧＡＬ）は、静菌機構及び溶菌機構に関与する（Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ｌ）：１０３３−４３（２００２））。
【０１７５】
上述の免疫調整剤に加えて、感染に応答するＡＦ中の抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９及びアズロシジンの検出は、子宮内免疫応答における新しい洞察を与える。抗菌性タンパク質Ｆａｌｌ−３９（ＬＬ−３７）はバクテリアリポ多糖類に結合し、肥満細胞に対する強力な化学走性因子であり、微生物の局所感染及び全身侵襲を防ぐための最初の防御線として働く（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳＣＩ ｕｓａ ９２：１９５−９（１９９５））。アズロシジン（ＣＡＰ３７）は、宿主保護及び炎症において重要な関与を有するヒト好中球から単離されたカチオン性抗菌タンパク質である（ｐＥＲＥＩＲＡ，ｊ．１ＥＵＫＱＣ ｂｌＯＬ ５７：８０５−１２（１９９５））。Ｇｐ−３４０改変体タンパク質は、肺において以前に同定されたバクテリアに結合するスカベンジャーレセプターである（Ｐｒａｋｏｂｈｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：３９８６０−６（２０００））。これらのタンパク質の同定は、ＩＡＩのためのバイオマーカーを同定するために使用される感受性のプロテオミクスアプローチを補完する。
【０１７６】
現在利用可能な実験的な試験を利用して、母体のＣ−反応性タンパク質の測定、白血球又はグラム染色についてのＡＦの直接の検査、ＡＦ微生物培養又はＰＣＲ、ＡＦグルコース及びＩＬ−６濃度の測定、及びＡＦ白血球エステラーゼの検出を含む、ＩＡＩの診断を確認した。羊水の微生物培養物及び広い範囲のスペクトルバクテリアｒＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応のみが、ＩＡＩに感受性で特異的であるように思われる。しかし、生殖器マイコプラスマについての微生物培養又はＰＣＲに基づく試験は、広範囲に利用することができず、羊膜穿刺は羊水を得ることが必要である。プロテオミクスに基づくアプローチの１つの利点は、候補ペプチドバイオマーカーによってそれ自身で迅速な作用時点での発育を知ることができ、コスト的にも有効な診断免疫アッセイであることである。他のＡＦ及び血清スクリーニング試験（例えば、神経管不全についてα−フェトタンパク質）と類似して、感染した羊水内で同定されるペプチドは、母体血清中で検出可能であり、非侵襲診断試験における有用性が見出される。上述の実施例において表されるデータ、特にプールされた母体血清を利用するデータは、ＩＧＦＢＰ−１制限フラグメント及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂが、ＩＡＩ中にＡＦ及び母体の血液中に現れる２つのバイオマーカーであるが、感染の非存在下ではそうではないこのアプローチの容易性を示す。
【０１７７】
まとめると、プロテオミクスに基づくＡＦの分析は、実験的な非ヒト霊長類モデル及び早産及び潜伏性のＩＡＩをもつ女性のコホートの両方において、ＩＡＩについてのバイオマーカーを同定するために使用された。診断タンパク質発現プロフィールを、ＩＡＩの検出において感受性で特異的なＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳプロファイリングによって同定した。ＡＦ中で発現したタンパク質の高スループット分析によって、いくつかの免疫制御分子の発現を初めて同定した。診断１１ｋＤａピークにおいて検出されるタンパク質（ＩＧＦＢＰ−１及びカルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）Ｂ）の免疫検出は、ＩＡＩ中の羊水中及び母体血液中のこれらのバイオマーカーの存在及び示差的な発現を確認した。本明細書中で示されるデータは、妊娠中の潜伏性のＩＡＩを検出する迅速で非侵襲アッセイの基礎として役立つ。このことは、特異的な介入及び治療トライアルにおいて、臨床医及び観察者が早期分娩について高いリスクを有する女性の特定のサブグループを標的にすることができるため、重要なブレークスルーである。最後に、これらの試験は、感染及び炎症プロセス及び概して妊娠の病態生理学についての特定のバイオメーカー及び診断プロフィールを同定するためのプロテオミクスに基づくアプローチの有用性を示す。それ故に、本明細書中で示されるデータは、羊水及び他の生体液（例えば血清）中のタンパク質の示差的な発現を示し、迅速な、非侵襲及び正確な種々の母体／胎児の状態及び染色体異数性の診断、予後及び監視のための有効なアプローチを示す。
【０１７８】
上述の記載を通して、本発明は、特定の実施形態を参照して議論されるが、それらに限定されない。実際に、本明細書中に示され記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、上述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものである。
【０１７９】
記載全体で引用される全ての参考文献、及び本明細書中で引用される参考文献は、本明細書中にその全体が参考として組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−１２２２３８（Ｐ２０１０−１２２２３８Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４４７７２（Ｐ２０１０−４４７７２）
【出願日】平成２２年３月１日（２０１０．３．１）
【分割の表示】特願２００６−５０７５１８（Ｐ２００６−５０７５１８）の分割
【原出願日】平成１６年３月２３日（２００４．３．２３）
【出願人】（５０５３５９２２９）プロテオジェニックス， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１日（２０１０．３．１）
【分割の表示】特願２００６−５０７５１８（Ｐ２００６−５０７５１８）の分割
【原出願日】平成１６年３月２３日（２００４．３．２３）
【出願人】（５０５３５９２２９）プロテオジェニックス， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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