皮膚外用剤
【課題】メラニン色素の産生を抑制し、美白効果に優れる皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】皮膚外用剤は、式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する。
（式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。）皮膚外用剤は乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料等の化粧品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品として利用され、肌に塗布或いは散布することにより、メラニン色素の産生を抑制し、美白効果を発揮する。
【解決手段】皮膚外用剤は、式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する。
（式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。）皮膚外用剤は乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料等の化粧品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品として利用され、肌に塗布或いは散布することにより、メラニン色素の産生を抑制し、美白効果を発揮する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生を抑制し美白効果を有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニン色素は、本来、紫外線による皮膚障害を緩和するために大切な役割を果たしている。しかし、過剰にメラニン産生が亢進した状態のしみ等の局所的な色素沈着は、美容上の問題として大きな関心が寄せられている。
【０００３】
このような背景から、近年では、エイジングケアや美肌・美白効果など、アンチエイジングに焦点を当てた機能性化粧品等への感心が高くなっている。化粧品等に美白成分として用いられている一般的な化合物として、ハイドロキノン、アルブチン、ビタミンＣ誘導体などがある。
【０００４】
また、化粧品等をはじめ医薬品素材の先導化合物は、天然物から抽出・分離されたものが多い。例えば、特許文献１では、シノブノキ由来の化合物が抗酸化活性を有することが報じられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０９０６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
美白有効成分として使用されているハイドロキノンやアルブチンはメラニン産生抑制効果が良好とはいえない。また、ハイドロキノンは毒性を有することも報じられている。
【０００７】
また、特許文献１に開示の化合物は腫瘍や炎症等の治療、予防等に用いられることが記載されているが、美白効果について何ら記載されていない。
【０００８】
本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、メラニン色素の産生を抑制し、美白効果に優れる皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の観点に係る皮膚外用剤は、
式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする。
【化１】
（式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。）
【００１０】
本発明の第２の観点に係る皮膚外用剤は、
式１１乃至１４のいずれかで表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする。
【化２】
【００１１】
また、前記化合物がシノブノキから抽出された化合物であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る皮膚外用剤は、メラニンの産生を抑制するので、美白効果を有する。また、皮膚外用剤は、天然化合物であり毒性を有さず、副作用のおそれが低いという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例におけるシノブノキから各化合物抽出、分離スキームを示す図である。
【図２】実施例におけるシノブノキから各化合物抽出、分離スキームを示す図である。
【図３】実施例における（Ａ）メラノーマ細胞株Ｂ１６の写真、（Ｂ）メラノーマ細胞株Ｂ１６Ｙ２４の写真である。
【図４】実施例における（Ａ）メラニン産生抑制活性試験のプロトコルを示す図、（Ｂ）細胞毒性評価試験のプロトコルを示す図である。
【図５】実施例におけるチロシナーゼ活性阻害試験のプロトコルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施の形態に係る皮膚外用剤について詳細に説明する。皮膚外用剤は、式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有する。
【化３】
【００１５】
式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルである。また、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基である。グルコピラノシルは好ましくはβ−Ｄ−グルコピラノシルであり、Ｒ１がグルコピラノシルである場合には、式１及び式２で表される化合物はＯ−グリコシド結合により配糖体を形成している。
【００１６】
また、皮膚外用剤は、好ましくは、式１１乃至式１４のいずれかで表される化合物を含有する。
【化４】
【００１７】
上記の化合物は、皮膚外用剤中に、一種単独で、或いは複数種配合されていてもよい。
【００１８】
メラニン（メラニン色素）は、ヒトを含む動物、植物、原生動物において形成される色素である。皮膚の表皮最下層の基底層や毛髪の毛母などにあるメラノサイト（色素細胞）で生成される。メラニンの産生には、アミノ酸の一つであるチロシンが重要である。このチロシンにチロシナーゼという酸化酵素が働き、ドーパという化合物に変わる。更にチロシナーゼはドーパにも働きかけ、ドーパキノンという化合物に変化させる。ドーパキノンは化学的反応性が高いので、酵素の力を借りる事なく次々と反応していく。そして、ドーパクロム、インドールキノンへと変化し、最終的には酸化、重合し、メラニンになると考えられている。
【００１９】
本実施の形態に係る皮膚外用剤のメラニン産生抑制メカニズムは明らかではないが、上記の発生メカニズムのいずれかの進行を阻害しているものと考えられる。そして、皮膚外用剤は、後述の実施例に示すように、美白成分として一般的に用いられているハイドロキノン、アルブチン等よりもメラニン生成抑制活性に優れる。したがって、上記化合物を含有する皮膚外用剤は、メラニン色素の産生を抑制し、日焼けやシミ等を抑え、美白効果を発揮する。
【００２０】
上記の化合物は、後述の実施例にて示すように、シノブノキから抽出して得ることができる。また、各種公知の合成方法を組み合わせて得られたものであってもよい。
【００２１】
更に、上記化合物は、シノブノキから抽出され得る天然化合物であることから、皮膚外用剤を肌に塗布或いは散布しても人体に悪影響を及ぼすおそれが低い。
【００２２】
皮膚外用剤は、皮膚に種々の方法にて塗布或いは散布し、皮膚に付着させて用いる。皮膚外用剤の形態は、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、ローション、化粧水、美容液、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料、軟膏剤、クリーム剤、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等、いずれの形態の化粧料であっても外用医薬品等であってもよい。
【００２３】
上記成分以外に、必要に応じ皮膚外用剤の効果を損なわない範囲で、通常、化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、保湿剤、各種皮膚栄養成分、紫外線吸収剤、酸化防止剤、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、色剤、水、防腐剤、香料等を必要に応じて適宜配合されていてもよい。
【実施例】
【００２４】
シノブノキから新規アルブチン誘導体及びその関連化合物を単離し、メラニン産生抑制活性試験を行った。
【００２５】
本実施例に用いた原料や装置等を以下に示す。
（材料植物）
沖縄県で採取したシノブノキ（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ ｒｏｂｕｓｔａ Ａ． Ｃｕｎｎ．）を用いた。
（旋光度）
旋光度はＰ−１０３０（日本分光工業）デジタル旋光度計を用いて測定した。測定溶媒及び温度は各測定値に付記した。
（核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル）
ＪＥＯＬ α−４００（日本電子）核磁気共鳴装置を使用して測定した（共鳴周波数：１Ｈ ＮＭＲ：４００ＭＨｚ、１３Ｃ ＮＭＲ：１００ＭＨｚ）。いずれも溶媒中のＤシグナルをｉｎｔｅｒｎａｌ ｌｏｃｋ ｓｉｇｎａｌとした。ケミカルシフト値の表示は内部標準物質テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からのδ値（ｐｐｍ）で示し、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける結合定数は括弧内にＨｚ単位で記した。
（質量分析（ＭＳ））
ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳはＱＳＴＡＲ ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）質量分析装置を使用した。
（赤外吸収（ＩＲ）スペクトル）
赤外吸収スペクトルはＨＯＲＩＢＡ ＦＴ−７１０（堀場製作所）分光光度計を使用し、フィルム法にて試料を調製し測定した。
（紫外吸収（ＵＶ）スペクトル）
ＪＡＳＣＯ Ｖ−５２０（日本分光工業）分光光度計を使用し、層長１ｃｍの石英製セルを用いて測定した。測定溶媒はメタノールを用いた。
（カラムクロマトグラフィー）
順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、７０−２３０ｍｅｓｈのｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（Ｍｅｒｃｋ）を使用した。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５ Ｃ１８ＯＰＮ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を使用した。
（高速液体クロマトグラフィー）
分取用カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ（６．０×２５０ｍｍ）を使用し、検出にＵＶ９７５（日本分光工業）、ＲＩ−９３０（日本分光工業）、溶媒にメタノール−水系を用いて、流速１．６ｍｌ／ｍｉｎで、紫外部吸収の検出波長は２５４ｎｍで行った。
（液滴向流クロマトグラフィー）
液滴向流クロマトグラフィーには、本体に液滴向流クロマトグラフ ＥＹＥＬＡ ＤＣＣ−３０００（東京理科機械）を使用した。分離部は内径２ｍｍ×長さ４０ｃｍのカラム管３００本からなり、溶媒は固定相にクロロホルム：メタノール：水：１−プロパノール＝９：１２：８：２の下層を、移動相にその上層を用いて液滴上昇法にて溶出した。溶出液は５ｇを１フラクションとして分取した。
（簿層クロマトグラフィー（ＴＬＣ））
ＴＬＣプレートとして厚さ０．２５ｍｍのｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、クロロホルム：メタノール：水＝１５：６：１の混合溶媒を展開溶媒とした。プレート上のスポットはＵＶ（２５４ｎｍ）照射及び１０％硫酸を噴霧後、加熱し呈色させ検出した。
【００２６】
（シノブノキからの化合物の抽出、単離、精製）
図１及び図２に示すスキームにしたがって、シノブノキから化合物を抽出、単離、精製した。まず、シノブノキの乾燥葉（６．３７ｋｇ）をメタノールで３回（４．５Ｌ）抽出し、３．０Ｌに濃縮した後、ヘキサン３．０Ｌで抽出した。メタノール層を濃縮後、水３．０Ｌで懸濁し、酢酸エチル、ブタノールをそれぞれ３．０Ｌで連続的に抽出、濃縮し、ヘキサン層（３２．６ｇ）、酢酸エチル層（１６０ｇ）、ブタノール層（４０５ｇ）、水層（４７５ｇ）を得た。
【００２７】
このうち、ブタノール可溶画分（２３７ｇ）を水とメタノールの混合溶媒［水−メタノール（４：１，６Ｌ）、（３：２，６Ｌ）、（２：３，６Ｌ）、（１：４，６Ｌ）、メタノール６Ｌ］を用いた逆相系多孔性樹脂Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィー（内径７．５ｃｍ×高さ５０ｃｍ、１フラクション＝１Ｌ）に付した。
【００２８】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィーで得られた２０％メタノール溶出画分（フラクション ４〜６，１９．９ｇ）を、クロロホルムとメタノールの混合溶媒［クロロホルム３Ｌ、クロロホルム−メタノール（９８：２，３Ｌ）、（９６：４，３Ｌ）、（９２：８，３Ｌ）、（９０：１０，３Ｌ）、（８７．５：１２．５，３Ｌ）、（８５：１５，３Ｌ）、（８０：２０，３Ｌ）、（７５：２５，３Ｌ）、（７０：３０，３Ｌ）、（６０：４０，３Ｌ）、クロロホルム−メタノール−水（６０：４０：３，３．１２Ｌ）］を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径５ｃｍ×高さ４８．５ｃｍ、１フラクション＝５００ｍＬ）に付した。
【００２９】
１５〜２０％メタノール可溶画分のフラクション４２〜４５（２．５０ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、得られたフラクション３４〜４８（４６１ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２０〜２７（１９８ｍｇ）を得た。得られたフラクション２０〜２７（１９８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：２０）で精製し、その保持時間１２分のピークからＣｐｄ２１（６．８ｍｇ）を得た。
２０〜２５％メタノール溶出画分のフラクション４６〜５２（３．８４ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション４２〜５１（１９８ｍｇ）、フラクション７０〜９８（４７７ｍｇ）、フラクション６２〜６９よりＣｐｄ６（１８７ｍｇ）を得た。
得られたフラクション４２〜５１（１９８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション８〜１１（１９．９ｍｇ）を得た。得られたフラクション８〜１１（１９．９ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）で精製し、その保持時間３．５分のピークからＣｐｄ７（４．０ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション７０〜９８（４７７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション５１〜５７よりＣｐｄ９（１７．０ｍｇ）を得た。
２５〜４０％メタノール溶出画分のフラクション５３〜６６（２．１９ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１０〜１５（３１．０ｍｇ）を得た。得られたフラクション１０〜１５（３１．０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：９）で精製し、その保持時間１１．５分のピークからＣｐｄ１６（１１．８ｍｇ）を得た。
【００３０】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィーで得られた２０〜４０％メタノール溶出画分の母液（フラクション７〜１２、４５．１ｇ）を、クロロホルムとメタノールの混合溶媒［クロロホルム４．５Ｌ、クロロホルム−メタノール（９８：２，４．５Ｌ）、（９６：４，４．５Ｌ）、（９５：５，４．５Ｌ）、（９２：８，４．５Ｌ）、（９０：１０，４．５Ｌ）、（８７．５：１２．５，４．５Ｌ）、（８２．５：１７．５，４．５Ｌ）、（８０：２０，４．５Ｌ）、（７５：２５，４．５Ｌ）、（７０：３０，４．５Ｌ）、クロロホルム−メタノール−水（７０：３０：４，４．６８Ｌ）］を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径５．５ｃｍ×高さ４５．８ｃｍ、１フラクション＝５００ｍＬ）に付した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた８〜１０％メタノール溶出画分のフラクション４８〜５２（１３．１ｇ）のうち１．８７ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション８３〜９６（６８２ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション４１〜５１よりＣｐｄ２７（６２０ｍｇ）を、フラクション５２〜５８よりＣｐｄ１１（７５．４ｍｇ）を得た。
【００３１】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１０〜１２．５％メタノール溶出画分のフラクション５３〜６０（８．７９ｇ）のうち１．８０ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション６０〜８０（１６４ｍｇ）、フラクション８９〜９９（５４４ｍｇ）、フラクション１２５〜１３９よりＣｐｄ２３（３２７ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション６６〜８０（１６４ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１７〜２５よりＣｐｄ１１（４３．８）を得た。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション８９〜９９（５４４ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション３５〜４３よりＣｐｄ２７（４３３ｍｇ）を得た。
【００３２】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１２．５〜１５％メタノール溶出画分のフラクション６１〜６６（２．６１ｇ）のうち１．７６ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション６９〜８７（１７６ｍｇ）とフラクション８８〜９９（２０４ｍｇ）とフラクション１００〜１１９（５４８ｍｇ）とフラクション１３３〜１５９（４３５ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション６９〜８７（１７６ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１７〜２２よりＣｐｄ１０（７０．０ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション８８〜９９（２０４ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２０〜２４（２７．２ｍｇ）とフラクション２５〜２８（３８．５ｍｇ）とフラクション３９〜４６よりＣｐｄ２８（３５．６ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション２０〜２４（２７．２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間１５分のピークからＣｐｄ１（７．９ｍｇ）を得た。液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション２５〜２８（３８．５ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ１８（８．８ｍｇ）を、その保持時間１６分のピークからＣｐｄ１（３．７ｍｇ）を得た。
【００３３】
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１００〜１１９（５４８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２５〜３５（１７０ｍｇ）とフラクション３６〜４２よりＣｐｄ２７（２４７ｍｇ）とフラクション４３〜４７（４３．８ｍｇ）を得た。そのうちフラクション２５〜３５（１７０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間１３分のピークからフラクション３（８０．４ｍｇ）を得、フラクション３（８０．４ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間３５分のピークからＣｐｄ２９（２７ｍｇ）を、その保持時間４３分のピークからＣｐｄ２（２１．３ｍｇ）を得た。液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション４３〜４７（４３．８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間２０分のピークからＣｐｄ３０（５．４ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１３３〜１５９（４３５ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２４〜２９よりＣｐｄ２３（２２７ｍｇ）とフラクション３０〜３３（５２．９ｍｇ）を得た。そのうち、フラクション３０〜３３（５２．９ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝７：１３）で精製し、その保持時間１９分のピークからＣｐｄ８（６．２ｍｇ）を得た。
【００３４】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１２．５〜１５％メタノール溶出画分のフラクション６７〜７３（２．０１ｇ）のうち１．８５ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション７０〜８８（２７３ｍｇ）とフラクション１００〜１１５（４５８ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション７０〜８８（２７３ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１２〜１８（１３０ｍｇ）とフラクション１９〜２３（６４．７ｍｇ）をえた。
そのうち、フラクション１２〜１８（１３０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間１０分のピークからフラクション１（３３．８ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからフラクション２（２７．７ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション１（３３．８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間１０分のピークからＣｐｄ２０（３．８ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ２０（５．４ｍｇ）を得た。
高速液体クロマトグラフィーで得られたフラクション２（２７．７ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間１０分のピークからＣｐｄ２０（８．７ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ２（７．０ｍｇ）を、残渣から１１．２ｍｇを得た。
高速クロマトグラフィーで得られたフラクション２（７．０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間８分のピークからＣｐｄ４（１．０ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ２０（４．５ｍｇ）を得た。
高速クロマトグラフィーで得られた残渣（１１．２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間８分のピークからＣｐｄ４（０．９ｍｇ）を得た。
液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション１９〜２３（６４．７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１４〜１６からＣｐｄ５（１２．２ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１００〜１１５（４５８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２３〜２７よりＣｐｄ３（１７５ｍｇ）とフラクション１５〜２２（１３０ｍｇ）とフラクション２８〜３５（６６．１ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション１５〜２２（１３０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間４５分のピークからＣｐｄ１２（１８．８ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション２８〜３５（６６．１ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：１７）で精製し、その保持時間３５分のピークからＣｐｄ２９（２０．９ｍｇ）を得た。
【００３５】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１７．５〜２５％メタノール溶出画分のフラクション７４〜８７（３．８５ｇ）のうち１．７４ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション７０〜８８（２７３ｍｇ）よりＣｐｄ５（４１．７ｍｇ）を、フラクション１００〜１１５（４５８ｍｇ）よりＣｐｄ２４（２５．３ｍｇ）を、フラクション１３０〜１４４（１９８ｍｇ）を得た。
得られたフラクション１３０〜１４４（１９８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１１〜１５（７０．９ｍｇ）を得、さらにそれを高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：７）で精製し、その保持時間１８分のピークからＣｐｄ１９（２０．１ｍｇ）を得た。
【００３６】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィーで得られた４０〜６０％メタノール溶出画分（フラクション１３〜１８、３９．０ｇ）を、クロロホルムとメタノールの混合溶媒［クロロホルム４．５Ｌ、クロロホルム−メタノール（９８：２，４．５Ｌ）、（９６：４，４．５Ｌ）、（９５：５，４．５Ｌ）、（９２：８，４．５Ｌ）、（９０：１０，４．５Ｌ）、（８７．５：１２．５，４．５Ｌ）、（８５：１５，４．５Ｌ）、（８２．５：１７．５，４．５Ｌ）、（８０：２０，４．５Ｌ）、（７５：２５，４．５Ｌ）、（７０：３０，４．５Ｌ）、クロロホルム−メタノール−水（７０：３０：４，４．６８Ｌ）］を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径５．５ｃｍ×高さ４０．３ｃｍ、１フラクション＝５００ｍＬ）に付した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた８〜１０％メタノール溶出画分のフラクション４０〜４７（１０．２ｇ）のうち１．８０ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１４７〜１６４（１．０４ｍｇ）を得た。
フラクション１４７〜１６４（１．０４ｍｇ）のうち６５６ｍｇを液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション８３〜９３（２０．３ｍｇ）とフラクション９９〜１０８よりＣｐｄ１３（２２４ｍｇ）を得た。
フラクション８３〜９３（２０．３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）で精製し、その保持時間９分のピークからＣｐｄ１７（９．３ｍｇ）を得た。
【００３７】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１０％メタノール溶出画分のフラクション４８〜５４（４．９７ｇ）のうち１．９０ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ，５０％メタノール５００ｍＬ→７０％メタノール５００ｍＬ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１５８〜１７０（５２５ｍｇ）とフラクション１７１〜１８０（２９７ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション１５８〜１７０（５２５ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション９２〜１１４（２６４ｍｇ）を得た。フラクション９２〜１１４（２６４ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：７）で精製し、その保持時間１０分のピークからＣｐｄ２７（５．０ｍｇ）を、その保持時間１２分のピークからＣｐｄ２２（２．０ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１７１〜１８０（２９７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション３７〜４０よりＣｐｄ２６（１９．５ｍｇ）とフラクション４１〜５１（１５３ｍｇ）を得た。
得られたフラクション４１〜５１（１５３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：１１）で精製し、その保持時間８分のピークからＣｐｄ１５（１１．８ｍｇ）を得た。
【００３８】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１２．５％メタノール溶出画分のフラクション５５〜６２（２．８０ｇ）のうち１．８７ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ，５０％メタノール５００ｍＬ→７０％メタノール５００ｍＬ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１２９〜１３８（１６７ｍｇ）とフラクション１７５〜１８２（１７０ｍｇ）を得た。
フラクション１２９〜１３８（１６７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２１〜２７よりＣｐｄ２３（２３．９ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１７５〜１８２（１７０ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２８〜３５（３１．６ｍｇ）を得た。
得られたフラクション２８〜３５（３１．６ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝２：３）で精製し、その保持時間２４分のピークからＣｐｄ１４（１１．８ｍｇ）を得た。
【００３９】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１５％メタノール溶出画分のフラクション６３〜７２（３．５８ｇ）のうち１．８２ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ，５０％メタノール５００ｍＬ→７０％メタノール５００ｍＬ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション２９〜３７よりＣｐｄ２５（１０．６ｍｇ）を得た。
【００４０】
以上のようにして、シノブノキから、２２種の新規化合物フェノール性配糖体Ｇｒｅｖｉｌｌｏｓｉｄｅ Ａ−Ｈ（Ｃｐｄ１〜Ｃｐｄ８）、Ｇｒｅｖｉｌｌｏｓｉｄｅ Ｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｃｐｄ９）ならびにＣｐｄ１０〜Ｃｐｄ２２を単離、構造決定した。また、ＲｏｂｕｓｔａｓｉｄｅＢ，Ｃ（Ｃｐｄ２３，Ｃｐｄ２４）についてはこれまで報告されている構造を訂正した。また、５種のフェノール性配糖体Ａｒｂｕｔｉｎ（Ｃｐｄ２５）、Ｒｏｂｕｓｔａｓｉｄｅ Ａ（Ｃｐｄ２６）、Ｒｏｂｕｓｔａｓｉｄｅ Ｄ（Ｃｐｄ２７）、ｔｒａｎｓ−２，５−Ｄｉｈｙｄｏｘｙ ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（Ｃｐｄ２８）、Ｉｃａｒｉｓｉｄｅ Ｆ２（Ｃｐｄ２９）、及び、１種のメガスティグマン配糖体Ｓｔａｐｈｙｌｉｏｎｏｓｉｄｅ Ｄ（Ｃｐｄ３０）の６種の化合物を単離し、同定した。
【００４１】
単離したＣｐｄ１〜Ｃｐｄ３０の構造式を以下に示す。
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００４２】
なお、単離した上記化合物中、Ｃｐｄ１１，Ｃｐｄ１８，Ｃｐｄ２２，Ｃｐｄ２７が、それぞれ上記式１１、式１２、式１３、式１４に示す化合物に該当する。このうち、新規化合物であるＣｐｄ１１，Ｃｐｄ１８，Ｃｐｄ２２の性状及び分析データを以下に示す。
【００４３】
Ｃｐｄ１１の性状及び分析データを表１及び表２に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
Ｃｐｄ１８の性状及び分析データを表３及び表４に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
Ｃｐｄ２２の性状及び分析データを表５及び表６に示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】
（メラニン産生抑制活性試験及びチロシナーゼ活性阻害試験）
上記のようにして単離したＣｐｄ１０〜Ｃｐｄ２８を用い、メラニン産生抑制活性試験及びチロシナーゼ活性阻害試験を行った。
【００５３】
動物細胞を用いたメラニン産生抑制モデルとして、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６が一般的に使用されており、Ｂ１６メラノーマ細胞を用いた評価系は、メラニン合成酵素群に対する阻害活性と、酵素発現そのものの抑制活性を総合的に判断できるとされており、メラニン生成抑制活性の有無を判断する上で、非常に優れた評価系である。
【００５４】
メラニン産生抑制活性試験は、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を用い、吸光度測定によるメラニン含有量の評価と、ＭＴＴ法を用いた細胞毒性評価を併せて行った。
【００５５】
活性試験を行うにあたり、限界希釈法を用いてマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６由来の高メラニン色素産生株Ｂ１６Ｙ２４を選抜・クローニングし、１０％牛胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。図３に示すが、限界希釈法実施前のマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６と高メラニン色素産生株Ｂ１６Ｙ２４の写真を比較すると、Ｂ１６Ｙ２４の方が、より効率的にメラニンを産生していることが確認できる。
【００５６】
本実施例では、効率的にメラニンを産生するＢ１６Ｙ２４を用い、図４（Ａ）、（Ｂ）に示すプロトコルに従って、Ｃｐｄ１０〜Ｃｐｄ２８のメラニン産生抑制活性試験並びに細胞毒性評価試験を行った。
【００５７】
メラニン産生抑制率は以下の計算式により算出した。また、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）は簡易法（５０％をまたぐ２点を選び、５０％との交点から求める方法）にて算出した。サンプルの溶解にはＤＭＳＯを使用し、終濃度０．１％に統一した。
抑制率（％）＝
［１−（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］×１００
Ａｂｌａｎｋ：ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｗｅｌｌの吸光度
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：ＤＭＳＯのみ
【００５８】
チロシナーゼ活性阻害試験は、メラニン合成経路の律速段階と考えられるＬ−チロシンからドーパキノンへの変換反応のうち、反応速度の速いＬ−ＤＯＰＡからｄｏｐａｑｕｉｎｏｎｅへの酸化反応に着目し、図５に示すプロトコルに従って、Ｌ−ＤＯＰＡを基質とし、チロシナーゼとサンプルを同時に添加し、生成したメラニン含有量を測定することで、メラニン生成過程におけるチロシナーゼ活性評価を行った。
【００５９】
メラニン産生抑制活性試験と同様に、抑制率は以下の計算式から算出した。ＩＣ５０は簡易法（５０％をまたぐ２点を選び、５０％との交点から求める方法）にて算出した。サンプルの溶解にはＤＭＳＯを使用し、終濃度０．１％に統一した。
抑制率（％）＝
［１−（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］×１００
Ａｂｌａｎｋ：チロシナーゼ添加前の吸光度
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：ＤＭＳＯのみ
【００６０】
（結果）
メラニン産生抑制活性試験の結果を表７に示す。
【００６１】
【表７】
【００６２】
Ｃｐｄ１１、Ｃｐｄ１８、Ｃｐｄ２２、Ｃｐｄ２７では、これまで美白組成物として化粧品等にも利用されているＡｒｂｕｔｉｎ（Ｃｐｄ２５）に比べて、顕著な活性が見られた。また、チロシナーゼ阻害活性試験において、Ｃｐｄ１１に微弱ながら活性が認められた。
【００６３】
もっとも顕著な活性を示したＣｐｄ１１及びＣｐｄ２２の優位性について検討すべく、ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅならびにＫｏｊｉｃ ａｃｉｄを対象に、Ｃｐｄ１１及びＣｐｄ２２と同様の濃度域においてメラニン産生抑制活性試験並びに細胞毒性評価試験を行った。その結果を表８に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
その結果、Ｂ１６Ｙ２４ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓにおいて、Ｋｏｊｉｃ ａｃｉｄには、メラニン産生抑制活性は認められなかった。また、ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅにおいては、高い細胞毒性が認められた。
【００６６】
一方、Ｃｐｄ１１、Ｃｐｄ２２においては、いずれもメラニン産生抑制活性を認める濃度域において、細胞毒性は認められなかった。
【００６７】
以上のように、Ｃｐｄ１１、Ｃｐｄ２２では、顕著なメラニン産生抑制活性を示すとともに、細胞毒性も認められず、好適に皮膚外用剤として利用できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
皮膚外用剤は肌に塗布或いは散布することにより、メラニン色素の産生を抑制し、美白効果を発揮する。したがって、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料等の化粧品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品として利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生を抑制し美白効果を有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニン色素は、本来、紫外線による皮膚障害を緩和するために大切な役割を果たしている。しかし、過剰にメラニン産生が亢進した状態のしみ等の局所的な色素沈着は、美容上の問題として大きな関心が寄せられている。
【０００３】
このような背景から、近年では、エイジングケアや美肌・美白効果など、アンチエイジングに焦点を当てた機能性化粧品等への感心が高くなっている。化粧品等に美白成分として用いられている一般的な化合物として、ハイドロキノン、アルブチン、ビタミンＣ誘導体などがある。
【０００４】
また、化粧品等をはじめ医薬品素材の先導化合物は、天然物から抽出・分離されたものが多い。例えば、特許文献１では、シノブノキ由来の化合物が抗酸化活性を有することが報じられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０９０６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
美白有効成分として使用されているハイドロキノンやアルブチンはメラニン産生抑制効果が良好とはいえない。また、ハイドロキノンは毒性を有することも報じられている。
【０００７】
また、特許文献１に開示の化合物は腫瘍や炎症等の治療、予防等に用いられることが記載されているが、美白効果について何ら記載されていない。
【０００８】
本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、メラニン色素の産生を抑制し、美白効果に優れる皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の観点に係る皮膚外用剤は、
式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする。
【化１】
（式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。）
【００１０】
本発明の第２の観点に係る皮膚外用剤は、
式１１乃至１４のいずれかで表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする。
【化２】
【００１１】
また、前記化合物がシノブノキから抽出された化合物であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る皮膚外用剤は、メラニンの産生を抑制するので、美白効果を有する。また、皮膚外用剤は、天然化合物であり毒性を有さず、副作用のおそれが低いという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例におけるシノブノキから各化合物抽出、分離スキームを示す図である。
【図２】実施例におけるシノブノキから各化合物抽出、分離スキームを示す図である。
【図３】実施例における（Ａ）メラノーマ細胞株Ｂ１６の写真、（Ｂ）メラノーマ細胞株Ｂ１６Ｙ２４の写真である。
【図４】実施例における（Ａ）メラニン産生抑制活性試験のプロトコルを示す図、（Ｂ）細胞毒性評価試験のプロトコルを示す図である。
【図５】実施例におけるチロシナーゼ活性阻害試験のプロトコルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施の形態に係る皮膚外用剤について詳細に説明する。皮膚外用剤は、式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有する。
【化３】
【００１５】
式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルである。また、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基である。グルコピラノシルは好ましくはβ−Ｄ−グルコピラノシルであり、Ｒ１がグルコピラノシルである場合には、式１及び式２で表される化合物はＯ−グリコシド結合により配糖体を形成している。
【００１６】
また、皮膚外用剤は、好ましくは、式１１乃至式１４のいずれかで表される化合物を含有する。
【化４】
【００１７】
上記の化合物は、皮膚外用剤中に、一種単独で、或いは複数種配合されていてもよい。
【００１８】
メラニン（メラニン色素）は、ヒトを含む動物、植物、原生動物において形成される色素である。皮膚の表皮最下層の基底層や毛髪の毛母などにあるメラノサイト（色素細胞）で生成される。メラニンの産生には、アミノ酸の一つであるチロシンが重要である。このチロシンにチロシナーゼという酸化酵素が働き、ドーパという化合物に変わる。更にチロシナーゼはドーパにも働きかけ、ドーパキノンという化合物に変化させる。ドーパキノンは化学的反応性が高いので、酵素の力を借りる事なく次々と反応していく。そして、ドーパクロム、インドールキノンへと変化し、最終的には酸化、重合し、メラニンになると考えられている。
【００１９】
本実施の形態に係る皮膚外用剤のメラニン産生抑制メカニズムは明らかではないが、上記の発生メカニズムのいずれかの進行を阻害しているものと考えられる。そして、皮膚外用剤は、後述の実施例に示すように、美白成分として一般的に用いられているハイドロキノン、アルブチン等よりもメラニン生成抑制活性に優れる。したがって、上記化合物を含有する皮膚外用剤は、メラニン色素の産生を抑制し、日焼けやシミ等を抑え、美白効果を発揮する。
【００２０】
上記の化合物は、後述の実施例にて示すように、シノブノキから抽出して得ることができる。また、各種公知の合成方法を組み合わせて得られたものであってもよい。
【００２１】
更に、上記化合物は、シノブノキから抽出され得る天然化合物であることから、皮膚外用剤を肌に塗布或いは散布しても人体に悪影響を及ぼすおそれが低い。
【００２２】
皮膚外用剤は、皮膚に種々の方法にて塗布或いは散布し、皮膚に付着させて用いる。皮膚外用剤の形態は、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、ローション、化粧水、美容液、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料、軟膏剤、クリーム剤、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等、いずれの形態の化粧料であっても外用医薬品等であってもよい。
【００２３】
上記成分以外に、必要に応じ皮膚外用剤の効果を損なわない範囲で、通常、化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、保湿剤、各種皮膚栄養成分、紫外線吸収剤、酸化防止剤、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、色剤、水、防腐剤、香料等を必要に応じて適宜配合されていてもよい。
【実施例】
【００２４】
シノブノキから新規アルブチン誘導体及びその関連化合物を単離し、メラニン産生抑制活性試験を行った。
【００２５】
本実施例に用いた原料や装置等を以下に示す。
（材料植物）
沖縄県で採取したシノブノキ（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ ｒｏｂｕｓｔａ Ａ． Ｃｕｎｎ．）を用いた。
（旋光度）
旋光度はＰ−１０３０（日本分光工業）デジタル旋光度計を用いて測定した。測定溶媒及び温度は各測定値に付記した。
（核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル）
ＪＥＯＬ α−４００（日本電子）核磁気共鳴装置を使用して測定した（共鳴周波数：１Ｈ ＮＭＲ：４００ＭＨｚ、１３Ｃ ＮＭＲ：１００ＭＨｚ）。いずれも溶媒中のＤシグナルをｉｎｔｅｒｎａｌ ｌｏｃｋ ｓｉｇｎａｌとした。ケミカルシフト値の表示は内部標準物質テトラメチルシラン（ＴＭＳ）からのδ値（ｐｐｍ）で示し、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける結合定数は括弧内にＨｚ単位で記した。
（質量分析（ＭＳ））
ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳはＱＳＴＡＲ ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）質量分析装置を使用した。
（赤外吸収（ＩＲ）スペクトル）
赤外吸収スペクトルはＨＯＲＩＢＡ ＦＴ−７１０（堀場製作所）分光光度計を使用し、フィルム法にて試料を調製し測定した。
（紫外吸収（ＵＶ）スペクトル）
ＪＡＳＣＯ Ｖ−５２０（日本分光工業）分光光度計を使用し、層長１ｃｍの石英製セルを用いて測定した。測定溶媒はメタノールを用いた。
（カラムクロマトグラフィー）
順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、７０−２３０ｍｅｓｈのｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（Ｍｅｒｃｋ）を使用した。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５ Ｃ１８ＯＰＮ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を使用した。
（高速液体クロマトグラフィー）
分取用カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ（６．０×２５０ｍｍ）を使用し、検出にＵＶ９７５（日本分光工業）、ＲＩ−９３０（日本分光工業）、溶媒にメタノール−水系を用いて、流速１．６ｍｌ／ｍｉｎで、紫外部吸収の検出波長は２５４ｎｍで行った。
（液滴向流クロマトグラフィー）
液滴向流クロマトグラフィーには、本体に液滴向流クロマトグラフ ＥＹＥＬＡ ＤＣＣ−３０００（東京理科機械）を使用した。分離部は内径２ｍｍ×長さ４０ｃｍのカラム管３００本からなり、溶媒は固定相にクロロホルム：メタノール：水：１−プロパノール＝９：１２：８：２の下層を、移動相にその上層を用いて液滴上昇法にて溶出した。溶出液は５ｇを１フラクションとして分取した。
（簿層クロマトグラフィー（ＴＬＣ））
ＴＬＣプレートとして厚さ０．２５ｍｍのｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、クロロホルム：メタノール：水＝１５：６：１の混合溶媒を展開溶媒とした。プレート上のスポットはＵＶ（２５４ｎｍ）照射及び１０％硫酸を噴霧後、加熱し呈色させ検出した。
【００２６】
（シノブノキからの化合物の抽出、単離、精製）
図１及び図２に示すスキームにしたがって、シノブノキから化合物を抽出、単離、精製した。まず、シノブノキの乾燥葉（６．３７ｋｇ）をメタノールで３回（４．５Ｌ）抽出し、３．０Ｌに濃縮した後、ヘキサン３．０Ｌで抽出した。メタノール層を濃縮後、水３．０Ｌで懸濁し、酢酸エチル、ブタノールをそれぞれ３．０Ｌで連続的に抽出、濃縮し、ヘキサン層（３２．６ｇ）、酢酸エチル層（１６０ｇ）、ブタノール層（４０５ｇ）、水層（４７５ｇ）を得た。
【００２７】
このうち、ブタノール可溶画分（２３７ｇ）を水とメタノールの混合溶媒［水−メタノール（４：１，６Ｌ）、（３：２，６Ｌ）、（２：３，６Ｌ）、（１：４，６Ｌ）、メタノール６Ｌ］を用いた逆相系多孔性樹脂Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィー（内径７．５ｃｍ×高さ５０ｃｍ、１フラクション＝１Ｌ）に付した。
【００２８】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィーで得られた２０％メタノール溶出画分（フラクション ４〜６，１９．９ｇ）を、クロロホルムとメタノールの混合溶媒［クロロホルム３Ｌ、クロロホルム−メタノール（９８：２，３Ｌ）、（９６：４，３Ｌ）、（９２：８，３Ｌ）、（９０：１０，３Ｌ）、（８７．５：１２．５，３Ｌ）、（８５：１５，３Ｌ）、（８０：２０，３Ｌ）、（７５：２５，３Ｌ）、（７０：３０，３Ｌ）、（６０：４０，３Ｌ）、クロロホルム−メタノール−水（６０：４０：３，３．１２Ｌ）］を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径５ｃｍ×高さ４８．５ｃｍ、１フラクション＝５００ｍＬ）に付した。
【００２９】
１５〜２０％メタノール可溶画分のフラクション４２〜４５（２．５０ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、得られたフラクション３４〜４８（４６１ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２０〜２７（１９８ｍｇ）を得た。得られたフラクション２０〜２７（１９８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：２０）で精製し、その保持時間１２分のピークからＣｐｄ２１（６．８ｍｇ）を得た。
２０〜２５％メタノール溶出画分のフラクション４６〜５２（３．８４ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション４２〜５１（１９８ｍｇ）、フラクション７０〜９８（４７７ｍｇ）、フラクション６２〜６９よりＣｐｄ６（１８７ｍｇ）を得た。
得られたフラクション４２〜５１（１９８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション８〜１１（１９．９ｍｇ）を得た。得られたフラクション８〜１１（１９．９ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）で精製し、その保持時間３．５分のピークからＣｐｄ７（４．０ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション７０〜９８（４７７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション５１〜５７よりＣｐｄ９（１７．０ｍｇ）を得た。
２５〜４０％メタノール溶出画分のフラクション５３〜６６（２．１９ｇ）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１０〜１５（３１．０ｍｇ）を得た。得られたフラクション１０〜１５（３１．０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：９）で精製し、その保持時間１１．５分のピークからＣｐｄ１６（１１．８ｍｇ）を得た。
【００３０】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィーで得られた２０〜４０％メタノール溶出画分の母液（フラクション７〜１２、４５．１ｇ）を、クロロホルムとメタノールの混合溶媒［クロロホルム４．５Ｌ、クロロホルム−メタノール（９８：２，４．５Ｌ）、（９６：４，４．５Ｌ）、（９５：５，４．５Ｌ）、（９２：８，４．５Ｌ）、（９０：１０，４．５Ｌ）、（８７．５：１２．５，４．５Ｌ）、（８２．５：１７．５，４．５Ｌ）、（８０：２０，４．５Ｌ）、（７５：２５，４．５Ｌ）、（７０：３０，４．５Ｌ）、クロロホルム−メタノール−水（７０：３０：４，４．６８Ｌ）］を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径５．５ｃｍ×高さ４５．８ｃｍ、１フラクション＝５００ｍＬ）に付した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた８〜１０％メタノール溶出画分のフラクション４８〜５２（１３．１ｇ）のうち１．８７ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション８３〜９６（６８２ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション４１〜５１よりＣｐｄ２７（６２０ｍｇ）を、フラクション５２〜５８よりＣｐｄ１１（７５．４ｍｇ）を得た。
【００３１】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１０〜１２．５％メタノール溶出画分のフラクション５３〜６０（８．７９ｇ）のうち１．８０ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション６０〜８０（１６４ｍｇ）、フラクション８９〜９９（５４４ｍｇ）、フラクション１２５〜１３９よりＣｐｄ２３（３２７ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション６６〜８０（１６４ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１７〜２５よりＣｐｄ１１（４３．８）を得た。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション８９〜９９（５４４ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション３５〜４３よりＣｐｄ２７（４３３ｍｇ）を得た。
【００３２】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１２．５〜１５％メタノール溶出画分のフラクション６１〜６６（２．６１ｇ）のうち１．７６ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション６９〜８７（１７６ｍｇ）とフラクション８８〜９９（２０４ｍｇ）とフラクション１００〜１１９（５４８ｍｇ）とフラクション１３３〜１５９（４３５ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション６９〜８７（１７６ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１７〜２２よりＣｐｄ１０（７０．０ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション８８〜９９（２０４ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２０〜２４（２７．２ｍｇ）とフラクション２５〜２８（３８．５ｍｇ）とフラクション３９〜４６よりＣｐｄ２８（３５．６ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション２０〜２４（２７．２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間１５分のピークからＣｐｄ１（７．９ｍｇ）を得た。液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション２５〜２８（３８．５ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ１８（８．８ｍｇ）を、その保持時間１６分のピークからＣｐｄ１（３．７ｍｇ）を得た。
【００３３】
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１００〜１１９（５４８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２５〜３５（１７０ｍｇ）とフラクション３６〜４２よりＣｐｄ２７（２４７ｍｇ）とフラクション４３〜４７（４３．８ｍｇ）を得た。そのうちフラクション２５〜３５（１７０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間１３分のピークからフラクション３（８０．４ｍｇ）を得、フラクション３（８０．４ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間３５分のピークからＣｐｄ２９（２７ｍｇ）を、その保持時間４３分のピークからＣｐｄ２（２１．３ｍｇ）を得た。液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション４３〜４７（４３．８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：３）で精製し、その保持時間２０分のピークからＣｐｄ３０（５．４ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１３３〜１５９（４３５ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２４〜２９よりＣｐｄ２３（２２７ｍｇ）とフラクション３０〜３３（５２．９ｍｇ）を得た。そのうち、フラクション３０〜３３（５２．９ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝７：１３）で精製し、その保持時間１９分のピークからＣｐｄ８（６．２ｍｇ）を得た。
【００３４】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１２．５〜１５％メタノール溶出画分のフラクション６７〜７３（２．０１ｇ）のうち１．８５ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション７０〜８８（２７３ｍｇ）とフラクション１００〜１１５（４５８ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション７０〜８８（２７３ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１２〜１８（１３０ｍｇ）とフラクション１９〜２３（６４．７ｍｇ）をえた。
そのうち、フラクション１２〜１８（１３０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間１０分のピークからフラクション１（３３．８ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからフラクション２（２７．７ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション１（３３．８ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間１０分のピークからＣｐｄ２０（３．８ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ２０（５．４ｍｇ）を得た。
高速液体クロマトグラフィーで得られたフラクション２（２７．７ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間１０分のピークからＣｐｄ２０（８．７ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ２（７．０ｍｇ）を、残渣から１１．２ｍｇを得た。
高速クロマトグラフィーで得られたフラクション２（７．０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間８分のピークからＣｐｄ４（１．０ｍｇ）を、その保持時間１３分のピークからＣｐｄ２０（４．５ｍｇ）を得た。
高速クロマトグラフィーで得られた残渣（１１．２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間８分のピークからＣｐｄ４（０．９ｍｇ）を得た。
液滴向流クロマトグラフィーで得られたフラクション１９〜２３（６４．７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１４〜１６からＣｐｄ５（１２．２ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１００〜１１５（４５８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２３〜２７よりＣｐｄ３（１７５ｍｇ）とフラクション１５〜２２（１３０ｍｇ）とフラクション２８〜３５（６６．１ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション１５〜２２（１３０ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：４）で精製し、その保持時間４５分のピークからＣｐｄ１２（１８．８ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション２８〜３５（６６．１ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：１７）で精製し、その保持時間３５分のピークからＣｐｄ２９（２０．９ｍｇ）を得た。
【００３５】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１７．５〜２５％メタノール溶出画分のフラクション７４〜８７（３．８５ｇ）のうち１．７４ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション７０〜８８（２７３ｍｇ）よりＣｐｄ５（４１．７ｍｇ）を、フラクション１００〜１１５（４５８ｍｇ）よりＣｐｄ２４（２５．３ｍｇ）を、フラクション１３０〜１４４（１９８ｍｇ）を得た。
得られたフラクション１３０〜１４４（１９８ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション１１〜１５（７０．９ｍｇ）を得、さらにそれを高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：７）で精製し、その保持時間１８分のピークからＣｐｄ１９（２０．１ｍｇ）を得た。
【００３６】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムクロマトグラフィーで得られた４０〜６０％メタノール溶出画分（フラクション１３〜１８、３９．０ｇ）を、クロロホルムとメタノールの混合溶媒［クロロホルム４．５Ｌ、クロロホルム−メタノール（９８：２，４．５Ｌ）、（９６：４，４．５Ｌ）、（９５：５，４．５Ｌ）、（９２：８，４．５Ｌ）、（９０：１０，４．５Ｌ）、（８７．５：１２．５，４．５Ｌ）、（８５：１５，４．５Ｌ）、（８２．５：１７．５，４．５Ｌ）、（８０：２０，４．５Ｌ）、（７５：２５，４．５Ｌ）、（７０：３０，４．５Ｌ）、クロロホルム−メタノール−水（７０：３０：４，４．６８Ｌ）］を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（内径５．５ｃｍ×高さ４０．３ｃｍ、１フラクション＝５００ｍＬ）に付した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた８〜１０％メタノール溶出画分のフラクション４０〜４７（１０．２ｇ）のうち１．８０ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１４７〜１６４（１．０４ｍｇ）を得た。
フラクション１４７〜１６４（１．０４ｍｇ）のうち６５６ｍｇを液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション８３〜９３（２０．３ｍｇ）とフラクション９９〜１０８よりＣｐｄ１３（２２４ｍｇ）を得た。
フラクション８３〜９３（２０．３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）で精製し、その保持時間９分のピークからＣｐｄ１７（９．３ｍｇ）を得た。
【００３７】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１０％メタノール溶出画分のフラクション４８〜５４（４．９７ｇ）のうち１．９０ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ，５０％メタノール５００ｍＬ→７０％メタノール５００ｍＬ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１５８〜１７０（５２５ｍｇ）とフラクション１７１〜１８０（２９７ｍｇ）を得た。
そのうち、フラクション１５８〜１７０（５２５ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション９２〜１１４（２６４ｍｇ）を得た。フラクション９２〜１１４（２６４ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：７）で精製し、その保持時間１０分のピークからＣｐｄ２７（５．０ｍｇ）を、その保持時間１２分のピークからＣｐｄ２２（２．０ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１７１〜１８０（２９７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション３７〜４０よりＣｐｄ２６（１９．５ｍｇ）とフラクション４１〜５１（１５３ｍｇ）を得た。
得られたフラクション４１〜５１（１５３ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝３：１１）で精製し、その保持時間８分のピークからＣｐｄ１５（１１．８ｍｇ）を得た。
【００３８】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１２．５％メタノール溶出画分のフラクション５５〜６２（２．８０ｇ）のうち１．８７ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ，５０％メタノール５００ｍＬ→７０％メタノール５００ｍＬ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション１２９〜１３８（１６７ｍｇ）とフラクション１７５〜１８２（１７０ｍｇ）を得た。
フラクション１２９〜１３８（１６７ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２１〜２７よりＣｐｄ２３（２３．９ｍｇ）を得た。
逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られたフラクション１７５〜１８２（１７０ｍｇ）を液滴向流クロマトグラフィーにかけ、フラクション２８〜３５（３１．６ｍｇ）を得た。
得られたフラクション２８〜３５（３１．６ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（メタノール：水＝２：３）で精製し、その保持時間２４分のピークからＣｐｄ１４（１１．８ｍｇ）を得た。
【００３９】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた１５％メタノール溶出画分のフラクション６３〜７２（３．５８ｇ）のうち１．８２ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール１Ｌ→５０％メタノール１Ｌ，５０％メタノール５００ｍＬ→７０％メタノール５００ｍＬ；ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）にかけ、フラクション２９〜３７よりＣｐｄ２５（１０．６ｍｇ）を得た。
【００４０】
以上のようにして、シノブノキから、２２種の新規化合物フェノール性配糖体Ｇｒｅｖｉｌｌｏｓｉｄｅ Ａ−Ｈ（Ｃｐｄ１〜Ｃｐｄ８）、Ｇｒｅｖｉｌｌｏｓｉｄｅ Ｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｃｐｄ９）ならびにＣｐｄ１０〜Ｃｐｄ２２を単離、構造決定した。また、ＲｏｂｕｓｔａｓｉｄｅＢ，Ｃ（Ｃｐｄ２３，Ｃｐｄ２４）についてはこれまで報告されている構造を訂正した。また、５種のフェノール性配糖体Ａｒｂｕｔｉｎ（Ｃｐｄ２５）、Ｒｏｂｕｓｔａｓｉｄｅ Ａ（Ｃｐｄ２６）、Ｒｏｂｕｓｔａｓｉｄｅ Ｄ（Ｃｐｄ２７）、ｔｒａｎｓ−２，５−Ｄｉｈｙｄｏｘｙ ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（Ｃｐｄ２８）、Ｉｃａｒｉｓｉｄｅ Ｆ２（Ｃｐｄ２９）、及び、１種のメガスティグマン配糖体Ｓｔａｐｈｙｌｉｏｎｏｓｉｄｅ Ｄ（Ｃｐｄ３０）の６種の化合物を単離し、同定した。
【００４１】
単離したＣｐｄ１〜Ｃｐｄ３０の構造式を以下に示す。
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００４２】
なお、単離した上記化合物中、Ｃｐｄ１１，Ｃｐｄ１８，Ｃｐｄ２２，Ｃｐｄ２７が、それぞれ上記式１１、式１２、式１３、式１４に示す化合物に該当する。このうち、新規化合物であるＣｐｄ１１，Ｃｐｄ１８，Ｃｐｄ２２の性状及び分析データを以下に示す。
【００４３】
Ｃｐｄ１１の性状及び分析データを表１及び表２に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
Ｃｐｄ１８の性状及び分析データを表３及び表４に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
Ｃｐｄ２２の性状及び分析データを表５及び表６に示す。
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】
（メラニン産生抑制活性試験及びチロシナーゼ活性阻害試験）
上記のようにして単離したＣｐｄ１０〜Ｃｐｄ２８を用い、メラニン産生抑制活性試験及びチロシナーゼ活性阻害試験を行った。
【００５３】
動物細胞を用いたメラニン産生抑制モデルとして、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６が一般的に使用されており、Ｂ１６メラノーマ細胞を用いた評価系は、メラニン合成酵素群に対する阻害活性と、酵素発現そのものの抑制活性を総合的に判断できるとされており、メラニン生成抑制活性の有無を判断する上で、非常に優れた評価系である。
【００５４】
メラニン産生抑制活性試験は、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を用い、吸光度測定によるメラニン含有量の評価と、ＭＴＴ法を用いた細胞毒性評価を併せて行った。
【００５５】
活性試験を行うにあたり、限界希釈法を用いてマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６由来の高メラニン色素産生株Ｂ１６Ｙ２４を選抜・クローニングし、１０％牛胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。図３に示すが、限界希釈法実施前のマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６と高メラニン色素産生株Ｂ１６Ｙ２４の写真を比較すると、Ｂ１６Ｙ２４の方が、より効率的にメラニンを産生していることが確認できる。
【００５６】
本実施例では、効率的にメラニンを産生するＢ１６Ｙ２４を用い、図４（Ａ）、（Ｂ）に示すプロトコルに従って、Ｃｐｄ１０〜Ｃｐｄ２８のメラニン産生抑制活性試験並びに細胞毒性評価試験を行った。
【００５７】
メラニン産生抑制率は以下の計算式により算出した。また、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）は簡易法（５０％をまたぐ２点を選び、５０％との交点から求める方法）にて算出した。サンプルの溶解にはＤＭＳＯを使用し、終濃度０．１％に統一した。
抑制率（％）＝
［１−（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］×１００
Ａｂｌａｎｋ：ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｗｅｌｌの吸光度
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：ＤＭＳＯのみ
【００５８】
チロシナーゼ活性阻害試験は、メラニン合成経路の律速段階と考えられるＬ−チロシンからドーパキノンへの変換反応のうち、反応速度の速いＬ−ＤＯＰＡからｄｏｐａｑｕｉｎｏｎｅへの酸化反応に着目し、図５に示すプロトコルに従って、Ｌ−ＤＯＰＡを基質とし、チロシナーゼとサンプルを同時に添加し、生成したメラニン含有量を測定することで、メラニン生成過程におけるチロシナーゼ活性評価を行った。
【００５９】
メラニン産生抑制活性試験と同様に、抑制率は以下の計算式から算出した。ＩＣ５０は簡易法（５０％をまたぐ２点を選び、５０％との交点から求める方法）にて算出した。サンプルの溶解にはＤＭＳＯを使用し、終濃度０．１％に統一した。
抑制率（％）＝
［１−（Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）］×１００
Ａｂｌａｎｋ：チロシナーゼ添加前の吸光度
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：ＤＭＳＯのみ
【００６０】
（結果）
メラニン産生抑制活性試験の結果を表７に示す。
【００６１】
【表７】
【００６２】
Ｃｐｄ１１、Ｃｐｄ１８、Ｃｐｄ２２、Ｃｐｄ２７では、これまで美白組成物として化粧品等にも利用されているＡｒｂｕｔｉｎ（Ｃｐｄ２５）に比べて、顕著な活性が見られた。また、チロシナーゼ阻害活性試験において、Ｃｐｄ１１に微弱ながら活性が認められた。
【００６３】
もっとも顕著な活性を示したＣｐｄ１１及びＣｐｄ２２の優位性について検討すべく、ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅならびにＫｏｊｉｃ ａｃｉｄを対象に、Ｃｐｄ１１及びＣｐｄ２２と同様の濃度域においてメラニン産生抑制活性試験並びに細胞毒性評価試験を行った。その結果を表８に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
その結果、Ｂ１６Ｙ２４ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓにおいて、Ｋｏｊｉｃ ａｃｉｄには、メラニン産生抑制活性は認められなかった。また、ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅにおいては、高い細胞毒性が認められた。
【００６６】
一方、Ｃｐｄ１１、Ｃｐｄ２２においては、いずれもメラニン産生抑制活性を認める濃度域において、細胞毒性は認められなかった。
【００６７】
以上のように、Ｃｐｄ１１、Ｃｐｄ２２では、顕著なメラニン産生抑制活性を示すとともに、細胞毒性も認められず、好適に皮膚外用剤として利用できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
皮膚外用剤は肌に塗布或いは散布することにより、メラニン色素の産生を抑制し、美白効果を発揮する。したがって、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料等の化粧品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品として利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする皮膚外用剤。
【化１】
（式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。）
【請求項２】
式１１乃至１４のいずれかで表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする皮膚外用剤。
【化２】
【請求項３】
前記化合物がシノブノキから抽出された化合物である、
ことを特徴とする請求項２に記載の皮膚外用剤。
【請求項１】
式１又は式２で表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする皮膚外用剤。
【化１】
（式１及び式２中、Ｒ１は、水素、アルキル基又はグルコピラノシルであり、式１中、Ｒ２は水素、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を表す。）
【請求項２】
式１１乃至１４のいずれかで表される化合物を有効成分として含有し、メラニン色素の産生を抑制する、
ことを特徴とする皮膚外用剤。
【化２】
【請求項３】
前記化合物がシノブノキから抽出された化合物である、
ことを特徴とする請求項２に記載の皮膚外用剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２１９０５６（Ｐ２０１２−２１９０５６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８５８３０（Ｐ２０１１−８５８３０）
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第１９回 医歯薬学総合研究科発表会（薬学系）、国立大学法人広島大学 平成２２年１２月１５日
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第１９回 医歯薬学総合研究科発表会（薬学系）、国立大学法人広島大学 平成２２年１２月１５日
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]