細胞ベースの治療に関連する材料および方法
本発明は、組織再生および加齢性組織変化についての細胞変性と関連した疾患状態の処置のために使用され得る新規な細胞集団の提供に関する。上記細胞集団は、Ｔｈｙ１．１細胞マーカーに対して陽性もしくは陰性であることによって特徴付けられる成体幹細胞／前駆細胞に由来する。一実施形態において、本発明は、成体組織に由来する単離された細胞集団を提供し、ここで該細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき；該細胞は、Ｐｄｘ−１陽性であることで特徴付けられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００８年５月９日に出願された、米国仮特許出願第６１／０５２，０９８号と同時係属中であり、かつ少なくとも１人の発明者と共有され、かつそれへの優先権を主張する。先行する出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、組織再生、および細胞変性もしくは加齢性組織変化（ａｇｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｈａｎｇｅ）と関連する疾患状態の処置のために使用され得る新規な細胞集団の提供に関する。特に（しかし網羅的ではない）、本発明は、膵臓細胞タイプおよび肝細胞タイプの両方に分化するための両能性を示す新規な細胞集団の決定から生じる材料および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
幹細胞は、培養において長期間増殖する能力を有し、特定の細胞タイプになるために誘導され得る分化していない細胞である。幹細胞は、主に胚もしくは生体から単離され得るが、これらは、異なる特徴および機能を有するようである。
【０００４】
幹細胞は、多くの哺乳動物種の胚（胚性／胚幹細胞−ＥＳＣ）から単離されてきた。マウス由来のものは、２０年間にわたって集中した研究の対象であり、単離されかつ１９９８年以来研究されてきたヒトＥＳＣの単離のための方法を可能にした。
【０００５】
ＥＳＣは、代表的には、胚盤胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に由来し、ここで胚盤胞は、インビボで全てのその後の発生細胞タイプを生じるように続く。成体幹細胞（ＡＳＣ）は、他方で、多くの組織に存在し、そこでは、それらは、傷害および、または消耗（ｗｅａｒ ａｎｄ ｔｅａｒ）を介して失われた細胞の置換を可能にする。これら細胞は、疾患（例えば、糖尿病およびパーキンソン病）の処置のための細胞ベースの治療を提供する能力を有する。上記疾患では、特定の病理をもたらす細胞損失および損傷が存在する。これら細胞はまた、薬物のスクリーニング、毒物学的調査、発生プログラミングの調査、加齢性組織損失および変性の処置のための優れた能力を有する。これら細胞はまた、外科手術的除去後の、傷害後の、もしくは美容外科手順の一部としての組織再生の能力を有する。
【０００６】
ＡＳＣは、成体組織もしくは器官中の分化した細胞の中で見いだされる未分化の細胞であり、ＡＳＣは、分化しておらず、そしてそれ自体を自分で補充する（ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗ）し得、組織もしくは器官の主要な細胞タイプを得るように分化する能力を維持する。ＡＳＣは、組織修復を維持しかつもたらすと考えられる。成熟組織における成体幹細胞の起源は未知であり、それらの可塑性の程度は、未だ決定されていない。移植におけるそれらの用途は、広く知られている。骨髄由来のＡＳＣは、３０年間にわたって移植で使用されてきた。成体非ＨＳＣの使用、それらの効力、可塑性および長期追跡での安全性は、未だ証明されていない。非間質性ＡＳＣの報告は、現場で討議されたままであるが、神経幹細胞は、今では確立されており、真正な（ｂｏｎｅ ｆｉｄｅ）ＡＳＣタイプとして受け入れられている。
【０００７】
ＥＳＣの証明された多能性特徴およびＥＳＣを多数増殖させる能力は、ＥＳＣを細胞ベースの治療の魅力的な候補にしている。この状況においてＡＳＣの使用には厳しい制限が存在する。ここでこのような細胞は、非常に稀であると考えられておりかつそれらの増殖条件は、可能性のある治療に十分な数で適切な細胞を生成するほど十分に明確でない。
【０００８】
しかし、ＡＳＣは、「自己」に由来し得るという点で、決定的な利点を確かに有しているので、いかなる患者でも、彼ら自身の細胞を受容し、顕著に高まった癌のリスクを含め、拒絶を防止するために免疫抑制の有害な副作用に苦しむ必要はない。制限された有効性／可塑性はまた、以上型の細胞分化が制限され、新生物のリスクが低減されるという点で、高められた安全性因子であると考えられる。
【０００９】
肝臓および膵臓の共通する発生起源は、これら器官が、共通する幹細胞／前駆細胞集団を共有し得ることを示唆する。この過程の裏付けにおいてかなりの間接的証拠が存在する。外植片実験から、Ｐｄｘ−１を発現する腹側内胚葉は、心臓中胚葉への近接によって、肝臓系統に流用されることが実証されている（非特許文献１）。肝細胞特性を有する細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）はまた、マウス膵臓内の管領域において観察された。銅欠乏性食餌を与えられたマウスは、膵臓損傷、腺房細胞の損失を受け、４〜６週間後には、肝円形様細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｏｖａｌ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）が観察される（非特許文献２；非特許文献３）。さらに、脾臓に移植された、銅欠乏性食餌に供されたラットから単離した膵臓細胞は、実質構造へと組み込まれかつ成熟肝臓特異的タンパク質を発現することによって、形態的にも機能的にも肝細胞への分化を示した（Ｄａｂｅｖａら，１９９７）。フマリルアセトアセテートヒドロラーゼが欠損し、後にチロシン血症を伴う共通遺伝子のレシピエントに移植した野生型マウス膵臓細胞の懸濁物はまた、肝機能の正常化とともに、ドナー由来細胞によって生合成レスキューを生じることが報告された（Ｗａｎｇら，２００１）。さらに、成体マウス膵臓におけるＫＧＦのトランスジェニック過剰発現は、膵島内で肝細胞の出現および付随して膵管増殖を生じる（Ｋｒａｋｏｗｓｋｉら，１９９９ｂ；Ｋｒａｋｏｗｓｋｉら，１９９９ａ）。
【００１０】
いくつかの推定される膵臓前駆細胞が、膵管細胞および島細胞の両方から特徴付けられた（Ａｂｒａｈａｍら，２００４；Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓら，１９９７；Ｌｅｃｈｎｅｒら，２００２；Ｒａｍｉｙａら，２０００）。これら細胞集団のうちの一方は、インビトロでの分化後に、αフェトプロテインおよびｃ−Ｍｅｔ（代表的には、肝細胞によって発現されるタンパク質）を発現することが観察された（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら，２００１）。（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら， ２００１）より近年になってからは、ヒト膵管上皮から単離された間葉系幹細胞集団は、膵臓分化、肝臓分化および中胚葉分化の能力を有することが報告された（Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら，２００６）。これら細胞は、Ｇａｔａ ４、アルブミンおよびＴＡＴ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）を発現するように誘導され得るが、機能的評価は未だ報告されていない。
【００１１】
本発明者は、以前に、さらなる細胞タイプである、ＳＴＺ糖尿病モデルにおいて多能性および機能的効力を示す、成体ラット膵管から単離された膵臓由来開通細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ Ｃｅｌｌ）（ＰＤＰＣ）を決定した（Ｓｈｉｅｌｓ ２００４；および特許文献１（本明細書に参考として援用される））。成体ラット肝臓において、推定される幹細胞の集団は、化学的傷害、もしくは部分的肝切除術による誘導後に誘導され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，２００３）（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら， １９９８； Ｐｅｔｅｒｓｅｎら， ２００３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２０４７６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｇ．， Ｊ．Ｊｕｎｇ， Ｍ．Ｚｈｅｎｇ， Ｊ．Ｌｏｒａ ａｎｄ Ｋ．Ｓ．Ｚａｒｅｔ： Ａ ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｅｖ．（２００１）１２８、８７１−８８１
【非特許文献２】Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ．， Ｖ．Ｓｕｂｂａｒａｏ ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｒｅｄｄｙ： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｐｐｅｒ ｒｅｐｌｅｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． Ｄｅｖ．（１９８６）１８、１０９−１１７
【非特許文献３】Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｒｅｄｄｙ： Ｈｅｐａｔｉｃ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｄｅｖ．（１９９５）６、１５１−１５６
【非特許文献４】Ｄａｂｅｖａ，Ｍ．Ｄ．， Ｓ．Ｇ．Ｈｗａｎｇ， Ｓ．Ｒ．Ｖａｓａ， Ｅ．Ｈｕｒｓｔｏｎ， Ｐ．Ｍ．Ｎｏｖｉｋｏｆｆ， Ｄ．Ｃ．Ｈｉｘｓｏｎ， Ｓ．Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｓｈａｆｒｉｔｚ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ Ｄｅｖ．（１９９７）９４、７３５６−７３６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
細胞変性と特に関連する疾患を処置するために、細胞ベースの治療において使用され得る細胞集団を提供することが継続して必要である。糖尿病は、このような疾患の一例である。膵臓におけるインスリンは、インスリン分泌β細胞によって作られる。インビボでは、β細胞ターンオーバーは、生涯全体を通じて起こると考えられているが、置換細胞の起源に関しては、論争がある。従って、糖尿病は、完全に機能するネイティブ細胞に類似した細胞の提供（特に、自己に由来する細胞）が処置の重要な選択肢を提供する疾患の一例である。糖尿病の場合には、インスリンを生成し得るという点で、β細胞に類似の細胞の提供は、上記疾患にとって重大な細胞ベースの治療を提供する。
【００１５】
この疾患および他の疾患を考慮に入れて、本発明者は、成体膵管から肝細胞／前駆細胞集団に由来する細胞の亜集団を単離した。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞の亜集団は、Ｐｄｘ−１（ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿０００２００．１ ＧＩ：４５５７６７３； ＲＡＴ： ＮＰ＿０７４０４３．３ ＧＩ：５０８３８８０２）陽性である。Ｐｄｘ−１発現の存在は、細胞が非β細胞由来インスリンの供給源としての能力を有することを示す。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される成体幹細胞／前駆細胞の亜集団は、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０）（ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿００６２７９）の存在もしくは非存在によって特徴付けられる。Ｔｈｙ１．１陽性亜集団およびＴｈｙ１．１陰性亜集団の特性は、以下で議論される。
【００１８】
（１．Ｔｈｙ１．１陽性細胞）
維持（非分化）培地中で、Ｔｈｙ１．１陽性細胞亜集団は、Ｐｄｘ−１陽性、インスリン陰性およびグルカゴン陰性である。Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、膵臓分化培地中に置かれた場合、最初に、線維芽細胞様形態を示し、次いで、親細胞層から最後には分離する絡み合った細胞クラスタを形成する。得られた分化した細胞クラスタは、Ｐｄｘ−１、インスリンおよびグルカゴンについて陽性である（図４、パネルＢ）。
【００１９】
本明細書に記載されるＴｈｙ１．１陽性細胞亜集団に関する驚くべき決定は、それらが、少なくとも両能性のある（ｂｉｐｏｔｅｎｔ）ことである。具体的には、適切な分化培地とともに提供される場合、Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、膵臓細胞タイプもしくは肝細胞タイプのいずれかに分化し得る。
【００２０】
（２．Ｔｈｙ１．１陰性細胞）
非分化状態において、Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団は、Ｐｄｘ−１について陽性であるが、インスリンおよびグルカゴンについては陰性である。分化培地中で増殖される場合、Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、形態学的変化を示さなかったが、インスリン転写が検出された。よって、Ｔｈｙ１．１陰性集団は、非β細胞由来インスリンの新規な供給源を提供する。
【００２１】
よって、その最も一般には、本発明は、多能性成体幹細胞集団に由来する細胞の新規な亜集団を使用して、細胞ベースの治療に基づく加齢の疾患および状態を処置するための材料および方法を提供する。上記亜集団は、Ｐｄｘ−１陽性である。
【００２２】
このような細胞集団は、糖尿病のような疾患およびパーキンソン病のような神経変性障害の細胞ベースの治療に対する能力を提供する。
【００２３】
成体幹細胞集団（前駆細胞としても公知）は、成体膵臓組織（例えば、ヒト、ラット、マウス、霊長類、ブタなど）に由来し得る。上記成体組織は、好ましくは、膵臓組織であるが、乳房、骨髄、心臓、肝臓もしくは腎臓のような他の器官に由来する組織であってもよい。
【００２４】
本発明の一実施形態において、成体幹細胞は成体ラット膵臓に由来し、これは、１９７７年のブダペスト条約に従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＧｌａｓｇｏｗのＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔによって、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＳＰ４ ０ＪＧのＴｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにおいて、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣ番号Ｑ６２０３の下で寄託された。これら細胞は、本明細書中以降、ＰＤＰＣ（膵臓由来前駆細胞）として知られる。
【００２５】
上記のように、本発明者はまた、マーカーＴｈｙ１．１（ＣＤ９０）（ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿００６２７９）を参照して、２つのさらなる亜集団を決定した。これら２つの亜集団は異なるが、等しく重要な特性を有する。特に、Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、膵臓細胞タイプおよび肝細胞タイプの両方への分化能力を示す。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される細胞亜集団は、インスリンの非β細胞供給源を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される細胞亜集団は、試験物質の毒性を評価するための細胞タイプを提供する（例えば、毒物学試験のために）。
【００２６】
よって、第１の局面において、成体組織から発生する幹細胞／前駆細胞の集団を提供する。ここで上記細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき、上記細胞は、Ｔｈｙ１．１陽性である。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞はまた、Ｐｄｘ−１陽性である。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、ネスチン（ＲＡＴ：ＮＰ＿０３７１１９．１ ＧＩ：６９８１２６２； ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿００６６０８．１ ＧＩ：３８１７６３００）陽性である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記集団中のネスチン陽性細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリー分析によって決定される場合、５０％未満（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％もしくは１％未満）である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、ＰＣＲによって、ネスチン核酸の発現によって、ネスチン陽性細胞として区別可能である。
【００２８】
細胞集団は、Ｔｈｙ１．１陽性（ＣＤ９０陽性）（ＲＡＴ：ＬＯＣＵＳ：Ｐ０１８３０ ＧＩ１３５８３２； ＮＰ＿００６２７９ ＧＩ：１９９２３３６２）として見なされ得る。ここでＴｈｙ１．１陽性細胞のパーセンテージは、５０％より大きく、好ましくは、６０％より大きく、より好ましくは、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％より大きい。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、純度が９８％より高い。Ｔｈｙ１．１陽性細胞のパーセンテージは、例えば、フローサイトメトリーによって、もしくはＰＣＲによって決定され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団は、Ｐｄｘ−１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔ、およびネスチンのうちの１種以上の発現について陽性である。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＫ１９のうちの１種以上の発現について陰性である。いくつかの実施形態において、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団は、以下の細胞表面マーカープロフィールを有する：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陽性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 陰性
ＣＤ１４７ 約９０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約８５％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
Ｃ−ＫＩＴ 陰性
ＣＫ１９ 陰性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
ネスチン 陽性
（低い＝細胞のうちの約５％以下が上記マーカーを発現する）。
【００３０】
本発明はまた、本発明のこの局面に従う細胞集団とともに、薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００３１】
本発明の第２の局面において、成体哺乳動物組織から単離された両能性のある幹細胞集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、上記成体哺乳動物組織を培養する工程；発生する細胞集団単層を得る工程；およびＴｈｙ１．１について陽性である細胞を含む亜集団を単離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記亜集団のうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％が、Ｔｈｙ１．１陽性である。
【００３２】
上記方法はまた、上記で提供されるプロフィール（例えば、Ｐｄｘ−１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔ、およびネスチンのうちの１種以上について陽性ならびに／またはＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＫ１９のうちの１種以上について陰性）中に提供される１種以上の他の細胞表面マーカーと組み合わせて、Ｔｈｙ１．１について陽性樽細胞を単離する工程を包含し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記成体哺乳動物組織は、膵臓であり、例えば、膵管由来である。いくつかの実施形態において、上記成体哺乳動物組織は、乳房、肝臓もしくは腎臓である。いくつかの実施形態において、上記成体哺乳動物組織は、ヒト組織である。
【００３４】
発生する細胞集団単層を得るために成体哺乳動物組織を得る代わりに、方法は、既に単離された成体幹細胞（例えば、２００５年５月１２日に、アクセッション番号Ｑ６２０３の下でＥＣＡＣＣに寄託されたもの）を得ることを包含し得る。
【００３５】
第３の局面において、培養において幹細胞の集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団を、肝臓系統分化に適した培地中で培養する工程を包含する。一例として（他は、当業者に公知である）、上記培養培地は、無血清ＦＧＦ−４含有分化培地であり得る。
【００３６】
第４の局面において、培養において膵臓細胞の集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団を、膵臓系統分化に適した培地中で培養する工程を包含する。
【００３７】
本発明は、本明細書で記載される方法から得られるもしくは得ることができる細胞および細胞集団に及ぶ。
【００３８】
本発明の第５の局面において、細胞変性もしくは加齢性組織変化と関連する疾患状態を処置するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性成体幹細胞集団もしくは上記Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団を含む薬学的組成物を、上記疾患もしくは加齢性状態を有する患者に投与する工程を包含する。
【００３９】
Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、静脈内に投与され得るか、または疾患部位に移植され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記疾患は、膵臓細胞、神経細胞、心血管細胞（例えば、心筋細胞）、上皮細胞、肝細胞、もしくは腎細胞の変性と関連する。
【００４１】
上記処置されるべき疾患状態としては、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、肝臓疾患、腎臓疾患、眼の疾患、パーキンソン病および心血管疾患ならびに身体の器官および組織の加齢性変性状態が挙げられ得る。本発明のこの局面はまた、美容外科手術の形態として（例えば、組織の細胞再生および加齢の形態を妨げるため）使用され得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記細胞のドナーおよび上記レシピエントは、同じ種である（例えば、両方ともヒト）。いくつかの実施形態において、上記細胞のドナーおよび上記レシピエントは、異なる種である。よって、本発明の一実施形態は、ヒト患者の処置における、ラットに由来する成体幹細胞集団の使用を包含する。
【００４３】
本発明の第６の局面において、指定された分化した細胞集団（例えば、膵臓細胞もしくは肝細胞）を生成するための方法が提供され、上記方法は、成体幹細胞集団を提供する工程；Ｐｄｘ−１および／もしくはＴｈｙ１．１マーカー、ならびに必要に応じて、Ｔｈｙ１．１亜集団細胞表面マーカープロフィールに関連して本明細書で同定される１種以上の他のマーカーを使用して、細胞亜集団を選択する工程；ならびに細胞分化の助けとなる条件下で上記細胞亜集団を培養する工程を包含する。
【００４４】
本発明は、美容外科手術を含め、医療処置の方法において使用するための本発明の第１の局面に従う細胞集団をさらに提供する。上記方法は、細胞損失もしくは変性（例えば、糖尿病もしくはパーキンソン病）と関連する疾患状態もしくは加齢の状態を処置し得る。
【００４５】
本発明の第６の局面において、成体組織から発生する細胞集団が提供され、ここで上記細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき、上記細胞は、Ｔｈｙ１．１陰性である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、上記細胞集団は、Ｐｄｘ−１陽性である。上記細胞集団はまた、ネスチン陽性であり得る。
【００４７】
本発明はまた、成体幹Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明の第７の局面において、成体哺乳動物組織から単離された幹細胞集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、上記成体哺乳動物組織を培養する工程；発生する細胞集団単層を得る工程；およびＴｈｙ１．１について陰性の細胞の亜集団を単離する工程を包含する。一実施形態において、上記方法は、Ｐｄｘ−１陽性および／もしくはネスチン陽性でもある細胞の亜集団を単離する工程をさらに包含する。
【００４９】
一実施形態において、Ｔｈｙ１．１陰性細胞の亜集団は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔのうちの１種以上の発現について陽性であり、そして／またはＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびｃｋ７のうちの１種以上の発現について陰性である。一実施形態において、以下の細胞表面マーカープロフィールであるＴｈｙ１．１陰性細胞の亜集団が単離される：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陰性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 約８０％＋
ＣＤ１４７ 約８０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約６０％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
ｃ−ＫＩＴ 陰性
ｃｋ７ 陰性
ＣＫ１９ 弱陽性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
（低い＝細胞のうちの５％以下がそのマーカーを発現する）。
【００５０】
発生する細胞集団単層を得るために成体哺乳動物組織を得る代わりに、上記方法は、既に単離された成体幹細胞／前駆細胞（例えば、２００５年５月１２日にアクセッション番号Ｑ６２０３の下でＥＣＡＣＣに寄託されたもの）を得る工程を包含し得る。
【００５１】
本発明の第８の局面において、糖尿病もしくはインスリン生成の低下と関連する疾患状態を処置するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陰性細胞集団、もしくは上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団を含む薬学的組成物を、上記疾患もしくは加齢性状態を有する患者に投与する工程を包含する。
【００５２】
Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団は、静脈内投与され得るか、または上記疾患部位に移植され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、上記細胞のドナーおよび上記レシピエントは、同じ種（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、上記細胞および上記レシピエントは、異なる種である。よって、本発明の一実施形態は、ヒト患者の処置における成体ラット幹細胞／前駆細胞の使用を包含する。
【００５４】
本発明の第９の局面において、インスリンを生成することができる指定された分化した細胞集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、成体幹細胞集団を提供する工程；Ｐｄｘ−１について陽性でありかつＴｈｙ１．１マーカーについて陰性である成体幹細胞亜集団を選択する工程；ならびに細胞分化の助けとなる条件下で、上記細胞亜集団を培養する工程を包含する。上記方法は、Ｔｈｙ１．１細胞表面マーカープロフィールの一部として上記で同定された１種以上のさらなるマーカーに基づいて、上記成体幹細胞集団を選択する工程をさらに包含し得る。
【００５５】
本発明は、医療処置の方法において使用するための、本発明に従う成体幹細胞Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団をさらに提供する。特に、上記方法は、糖尿病を処置することであり得る。
【００５６】
インスリンを生成するための方法もまた、本明細書で提供される。インスリンを生成するための方法は、本明細書に記載されるＴｈｙ１．１陰性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団（例えば、成体組織（例えば、成体膵臓組織）に由来するＴｈｙ１．１陰性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団）を、インスリンが生成される条件下で培養する工程を包含し得る。上記方法は、上記培養物からインスリンを単離する工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔのうちの１種以上の発現について陽性であり、そして／またはＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびｃｋ７のうちの１種以上の発現について陰性である。
【００５７】
別の実施形態において、インスリンを生成するための方法は、本明細書に記載されるＴｈｙ１．１陽性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団（例えば、成体組織（例えば、成体膵臓組織）に由来する分化したＴｈｙ１．１陽性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団）を、インスリンが生成される条件下で培養する工程を包含する。上記方法は、インスリンを上記培養物から単離する工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、Ｐｄｘ−１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔ、およびネスチンのうちの１種以上の発現について陽性であり、そして／またはＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＫ１９のうちの１種以上の発現について陰性である。
【００５８】
本発明の局面および実施形態は、ここで添付の図面を参照しながら、例示によって示される。さらなる局面および実施形態は、当業者に明らかである。本文において言及される全ての文書は、本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、未分化のＴｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団のインビトロでの形態である。Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ集団およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ集団のインビトロでの肝臓分化および膵臓分化（図１Ａ〜Ｃ）：形態学的変化は、分化の間にＴｈｙ１．１陰性集団においてほとんど認められない。（図１Ａ）未分化のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ。（図１Ｂ）膵臓分化誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ。（図１Ｃ）肝臓分化誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ。（図１Ｄ-Ｉ）：Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣの肝臓分化の誘導に際して、顕著な形態学的変化が認められた。（図１Ｄ）未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ（線維芽細胞様形態）。（図１Ｅ）肝臓分化誘導後１４日目のＴｈｙ１陽性ＰＤＰＣ。（図１Ｆ）肝臓分化誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ−管腔構造が優勢な上皮形態が存在する。（図１Ｇ）肝臓誘導後２８日目のｔｈｙ１陽性ＰＤＰＣの立方形の形態。（図１Ｈ）膵臓誘導後１４日目のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ。（図１Ｉ）膵臓誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ−島様クラスタが形成され、その後、培地へと分離する。
【図２】図２は、フローサイトメトリーによってＭＡＣＳソートしたＰＤＰＣの細胞表面特徴付けである。（図２Ａ）Ｔｈｙ１（ＣＤ９０）陽性集団は、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔの発現について陰性であり、ＣＤ７１については低いが、ＣＤ１４７、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｆの発現については陽性である。（図２Ｂ）Ｔｈｙ１（ＣＤ９０）陰性集団は、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔの発現については陰性であり、ＣＤ７１については低いが、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｆの発現については陽性である。
【図３】図３は、Ｔｈｙ１．１ソートしたＰＤＰＣ集団の免疫細胞化学である。陽性コントロールは、アルブミン（図３Ａ）、サイトケラチン７（図３Ｅ）、ビメンチン（図３Ｉ）およびサイトケラチン１９（図３Ｍ）について示される。上記未分化のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ集団は、アルブミン（図３Ｂ）、サイトケラチン７（図３Ｆ）、ビメンチン（図３Ｊ）について陰性染色を示すが、サイトケラチン１９（図３Ｎ）については弱い染色を示す。上記未分化のＴｈｙ１．１陽性集団は、アルブミン（図３Ｃ）、サイトケラチン７（図３Ｇ）、ビメンチン（図３Ｋ）およびサイトケラチン１９（図３Ｏ）について陰性であった。しかし、肝臓分化培地中での１４日目までに、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、アルブミンについて陽性であり（図３Ｄ）、管腔様領域においては、ビメンチン（図３Ｌ）およびサイトケラチン１９（図３Ｐ）について陽性であったが、サイトケラチン７は、全体を通じて陰性のままであった（図３Ｈ）。
【図４】図４は、膵臓分化培地中のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ（図４Ａ）およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ（図４Ｂ）のＲＴ−ＰＣＲ。Ｔｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣおよびＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣを、膵臓分化培地中で２８日間にわたって培養した。列：（１）陽性コントロール、（２）未分化のＰＤＰＣ、（３）２８日目の分化したＰＤＰＣ、（４〜６） サンプル１〜３のＲＴなし（ｎｏ ＲＴ）コントロール。
【図５】図５は、肝臓分化培地中のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣおよびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣのＲＴ−ＰＣＲである。Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ（図５Ａ）およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ（図５Ｂ）を、肝臓分化培地中で２８日間培養した。列：（１）陽性コントロール、（２）未分化のＰＤＰＣ、（３）７日目、（４）１４日目、（５）２１日目、（６）２８日目、（７〜１３）サンプル１〜６のＲＴなしコントロール。アルブミン、ＣＫ１９およびＨＮＦ１αの発現は、上記Ｔｈｙ１．１陽性集団において誘導されたが、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団においては認められなかった。
【図６】図６は、未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ集団（図６Ｂ）もしくはＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ集団（図６Ｃ）がグリコーゲンを貯蔵しないことを示す。ＦＧＦ−４含有培地中で培養した後のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、グリコーゲンを生成および貯蔵する（図６ＤおよびＥ）。グリコーゲン貯蔵は、過ヨウ素酸−シッフによって染色される場合に、赤紫色の染色の蓄積として認められる。ＦＧＦ−４含有肝臓分化培地中で培養した後のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣは、染色を示さない（図６Ｆ）。陽性コントロール（図６Ａ）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
（詳細な説明）
（材料および方法）
（ラットＰＤＰＣの単離および維持培養）
膵管を、切開することによって１２ヶ月齢のＡｌｂｉｎｏ Ｓｗｉｓｓ（Ｇｌａｓｇｏｗ）ラットから単離し、ＣＭＲＬ培地中に播種する前に切り刻んだ。上記ＰＤＰ細胞は、培養において約５週間後にコンフルエントな単層として発生した。次いで、これらを採取し、ＰＢＳ中で洗浄した。ＰＤＰＣを、０．２μｍ フィルターキャップ付きのＴ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＫ）において、３７℃で５％ ＣＯ２雰囲気中、２０ｍｌのＣＭＲＬ １０６６培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ．）（１０％ ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ、および１００ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を補充）中の培養において維持した。コンフルエント未満の培養物を、ピペットでの培養培地の完全な除去、ならびに１０ｍｌのカルシウムおよびマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を上記フラスコに室温で５分間添加することによる、接着性細胞の洗浄することによって継代した。上記ＨＢＳＳをピペットで上記フラスコから除去した後、２ｍｌのトリプシン−Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（２００ｍｇ／Ｌ Ｖｅｒｓｅｎｅ、５００ｍｇ／Ｌ トリプシン）を、上記フラスコに添加した。上記フラスコを、上記細胞単層の分離が確認されうるまで、顕微鏡で定期的に観察した。次いで、細胞を、ピペットで取り出し、望ましい場合、１／５〜１／１０の密度で２０ｍｌの新鮮な培養培地を添加して上記のように再培養した。
【００６１】
ＰＤＰＣを、０．２μｍ フィルターキャップ付きのＴ７５において、３７℃で５％ ＣＯ２雰囲気中、ＣＭＲＬ １０６６培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）（５％ ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ、および１００ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ）を補充）中で長期間維持した。ＰＤＰＣを、３７℃で加湿５％ ＣＯ２雰囲気中、単層として増殖させ、９０％ コンフルエントになったときに、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて継代した。細胞を計数し、３３００細胞／ｃｍ２の密度で再度プレートした。
【００６２】
（磁性活性化細胞ソーティング）
磁性活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を、製造業者のプロトコル（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に従って、１０６標的細胞あたり１μｇの一次抗体（マウス抗ラットＴｈｙ１．１（ＣＤ９０）（Ｓｅｒｏｔｅｃ））を使用して、４℃において２０分間にわたって、単離および除去のために行った。ソートした細胞集団を、維持培養培地中で再懸濁し、組織培養フラスコに再度プレートした。ＭＡＣＳを、実験において使用する前に、各陽性ソートした集団および陰性ソートした集団に対して２回行った。全てのソートした集団を、後の分化実験の前に、蛍光活性化フローサイトメトリーでチェックした。
【００６３】
（細胞表面抗原のフローサイトメトリー評価）
細胞を、ＨＢＳＳ中の０．５％ ＢＳＡにおいて再懸濁した。次いで、それらを１０００×ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し、得られた細胞ペレットを、ＨＢＢＳ中に再懸濁する。トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で生存性係数した後、１×１０６細胞／ｍｌを、１００μｌ 一次抗体で標識した。使用した一次抗体は、ＣＤ９０に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ４７Ｒ，１：７５）、ＣＤ４４に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ６４３，１：１０）、ＣＤ４９ｆに対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ２０３４，１：５０）、ＣＤ１４７に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ７２９，１：１０）、ｃ−ＫＩＴに対するもの（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−１９９８３，１：２０）、ＣＤ７１に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ １５５ＦＴ，１：１０）、ＣＤ２４に対するもの（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５１１３３，１：５０）、ＣＤ４５に対するもの（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５４８７５，１：５０）、ＣＤ３１に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ１３３４ＧＡ，１：５０）およびＣＤ３４に対するもの（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７３２４，１：５０）であった。２次抗体を、０．２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中、遮光して、４℃において４５分間にわたって添加した。次いで、上記細胞を洗浄し、０．２％ ＢＳＡ中のウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｅｌｙ，ＵＫ １：２０）の１００μｌ ＦＩＴＣ結合体化Ｆａｂ２フラグメントを遮光して４℃で４５分間にわたって添加することによって標識する前に、１０００×ｒｐｍで、０．２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中、３回遠心分離した。アイソタイプＦＩＴＣコントロールもまた行った。前述のように、３回洗浄し、遠心分離した後、得られた細胞ペレットを、１ｍｌのＨＢＳＳ中で再懸濁し、上記細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）を使用して分析した。
【００６４】
（分化実験）
膵臓分化のために、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団およびＴｈｙ１．１陰性細胞集団（継代３０）を、６６００細胞／ｃｍ２の細胞密度においてプレートした。２４時間後、維持培地を除去し、単層をＨＢＳＳで３回洗浄した。引き続き、細胞をＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｌｏｎｚａ）（１×ＩＴＳ、１．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ、および１００μ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）、ニコチンアミド １０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＫＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）および０．２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充）中で培養した。
【００６５】
肝性分化のために、細胞を、Ｔ７５および６ウェルプレート中、６６００細胞／ｃｍ２においてプレートし、２４時間維持で、チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中２５００細胞／ｃｍ２において、ＨＢＳＳ、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｌｏｎｚａ）（線維芽細胞増殖因子−４ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、１×ＩＴＳ、１００μ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．２％ ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を補充）で３回洗浄した後に、置換した。培地好感を１週間に３回行い、細胞を、膵臓分化については０日目および２８日目に、および肝臓分化については０日目、７日目、１４日目、２１日目および２８日目に、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞およびＴｈｙ１．１陰性細胞からのＲＮＡ抽出のために採取した。チャンバースライドにおいて肝臓分化を受けている細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、１０〜１４日の間で４％ パラホルムアルデヒドで室温において１５分間固定した。未分化のＴｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団を、同時にチャンバースライド中でも増殖させ、上記のように、９０％コンフルエントにおいて固定した。
【００６６】
（免疫蛍光）
細胞内タンパク質の染色のために、細胞を上記のように固定した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間にわたって透過性にした。スライドを、ロバ血清とともに２０分間にわたってインキュベートし、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈した以前に最適化した、ラットアルブミンに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ１４２５５，１：１００）、ＣＫ１９に対する一次抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔ． Ｍ０８０２９Ｍ，１：１００）、ＣＫ７に対する一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３２２６，１：１００）、ＣＫ１８に対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｆ−４７７２）およびビメンチンに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ８９７９，１：５０）と１時間にわたってインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて、適切なＦＩＴＣ標識２次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ６７４９もしくはＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｆ０３１３，Ｅｌｙ，ＵＫ）で洗浄した。上記一次抗体の省略を、陰性コントロールとして行った。ラット肝臓の凍結切片を、陽性コントロールとして使用した。スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ中にマウントする前に３回洗浄し、そして蛍光顕微鏡によって可視化し、撮影した。
【００６７】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を使用することによって抽出し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ分析器によって定量した。サンプルを、ＤＮＡｓｅ処理（Ａｍｂｉｏｎ）し、ｃＤＮＡへの逆転写を、製造業者の説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ＲＴなし陰性コントロールを、全てのサンプルについて行った。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ハウスキーピング遺伝子であるＢａｃｔｉｎを使用して、テンプレートの品質を評価した。全てのＰＣＲ反応を、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ −２００を使用して行った。ネスト化ＰＣＲを、膵臓分化実験について行った。
【００６８】
以下の特異的オリゴヌクレオチドプライマーに、ＰＤＸ １、インスリンＩＩおよびグルカゴンを使用した（ＰＤＸ−１，順方向 ５−ｃｇｇｃｃａｃａｃａｇｃｔｃｔａｃａａｇｇ−３（配列番号１）、逆方向 ５−ｃｔｃｃｇｇｔｔｃｔｇｃｔｇｃｇｔａｔｇｃ−３（配列番号２）、ネスト化逆方向 ５−ｔｔｃｃａｇｇｃｃｃｃｃａｇｔｃｔｃｇｇ−３（配列番号３）（３０５ｂｐ）、インスリン，順方向 ５−ａｔｇｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｃｃｇｃｔｔ−３（配列番号４）；逆方向 ５−ｔｇｃｃａａｇｇｔｃｔｇａａｇｇｔｃａｃ−３（配列番号５）；ネスト化順方向 ５−ｃｃｔｇｃｔｃａｔｃｃｔｃｔｇｇｇａｇｃｃ−３（配列番号６）（２０９ｂｐ）；グルカゴン，順方向 ５−ｇａｃｃｇｔｔｔａｃｇｔｇｇｃｔｇｇ−３（配列番号７）；逆方向 ５−ｃｇｇｔｔｃｃｔｃｔｔｇｇｔｇｔｔｃａｔｃａａｇ−３（配列番号８）；ネスト化順方向 ５−ａｃａａｇｇｃａｇｃｔｇｇｃａｇｃａｔｇｃ−３（配列番号９）（２１０ｂｐ）。ラット膵臓総ＲＮＡを逆転写し、陽性コントロールとして使用した。以下の特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、肝臓分化実験のために使用した：アルブミン（１４１ｂｐ） 順方向 ５-ｃｔｇｇｇａｇｔｇｔｇｃａｇａｔａｔｃａｇａｇｔ−３（配列番号１０），逆方向 ５−ｇａｇａａｇｇｔｃａｃｃａａｇｔｇｃｔｇｔａｇｔ−３（配列番号１１）、ＨＮＦ３β（６３ｂｐ） 順方向 ５−ｃｃｔａｃｔｃｇｔａｃａｔｃｔｃｇｃｔｃａｔｃａ−３（配列番号１２），逆方向 −ｃｇｃｔｃａｇｃｇｔｃａｇｃａｔｃｔｔ（配列番号１３）、ＨＮＦ１（１３８ｂｐ）α 順方向 ５−ａｇｃｔｇｃｔｃｃｔｃｃａｔｃａｔｃａｇａ−３（配列番号１４），逆方向 ５−ｔｇｔｔｃｃａａｇｃａｔｔａａｇｔｔｔｔｃｔａｔｔｃｔａａ−３（配列番号１５）、Ｇａｔａ４（１７３ｂｐ） 順方向 ５−ｃａｔｇｃｔｔｇｃａｇｔｔｇｔｇｃｔａｇ−３（配列番号１６），逆方向 ５−ａｔｔｃｔｃｔｇｃｔａｃｇｇｃｃａｇｔａ−３（配列番号１７）、α−フェトプロテイン（１２４ｂｐ） 順方向 ５−ｇｔｃｃｔｔｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｇｇａｇａｔ−３（配列番号１８），逆方向 ５−ｃｔｇｔｃａｃｔｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｃｔｇｇ−３（配列番号１９）、ＣＹＰ２Ｂ１（５４９ｂｐ） 順方向 ５−ｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃｔｇ−３（配列番号２０），逆方向 ５−ａｃｔｇｔｇｇｇｔｃａｔｇｇａｇａｇｃｔ−３（配列番号２１）、ＣＫ１９（１９３ｂｐ） 順方向 ５−ａｇｔａａｃｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇａｃａｃ−３（配列番号２２），逆方向 ５−ａｇｔｃｇｃａｃｔｇｇｔａｇｃａａｇｇｔ−３（配列番号２３）、ＣＫ１８（７０ｂｐ） 順方向 ５ｇｇａｃｃｔｃａｇｃａａｇａｔｃａｔｇｇｃ−３（配列番号２４），逆方向 ５ ｃｃａｃｇａｔｃｔｔａｃｇｇｇｔａｇｔｔｇ−３（配列番号２５）。次いで、上記ＰＣＲ産物に、アガロースゲル電気泳動をかけて、エチジウムブロミド染色で可視化した。ラット肝臓組織を、陽性コントロールとして使用した。
【００６９】
（過ヨウ素酸シッフ染色）
グリコーゲン貯蔵についての過ヨウ素酸シッフ染色を、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞およびＴｈｙ１．１陰性細胞、ならびに肝臓分化２１日目のＴｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団に対して行った。ヒト肝臓切片を、陽性コントロールとして使用した。細胞を、４％ パラホルムアルデヒド中、室温で１０分間にわたって固定した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間にわたって透過性にし、ＰＢＳで２回およびｄｄＨ２Ｏで１回洗浄した。細胞を、過ヨウ素酸溶液（１ｇ／ｄＬ）に室温で５分間浸漬した。ウェルを、蒸留水で３回すすいだ。細胞を、シッフ試薬中に室温で１５分間浸漬した。細胞を、水道の流水で５分間洗浄した。細胞をヘマトキシリン溶液で９０秒間、対比染色した。水道の流水で１５〜３０秒間、細胞をすすぐ。
【００７０】
（結果）
（Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団の特徴付け）
ＰＤＰＣのＭＡＣソーティングを使用して、それぞれ、Ｔｈｙ１．１陽性細胞を発現する集団を９８．５％超で、およびＴｈｙ１．１陰性細胞を発現する集団を９８．７％純度で単離した。次いで、これら集団を培養し、いかなる分化実験もしくは特徴付け実験の前にも、１０〜１２日ごとに定期的にフローサイトメトリーによって再評価した。
【００７１】
表現型的には、Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団は、形態学において別個の差異を示した：上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、線維芽細胞様形態を示した（図１，パネルＡ）一方で、Ｔｈｙ１．１陰性集団は、より上皮様の形態を示した（図１，パネルＤ）。
【００７２】
いくつかの差異がまた、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団と、Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団との間で、細胞表面マーカーの発現において認められた。両方の細胞系統は、ＣＤ１４７、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｆを発現した。両方とも、ＣＤ７１は低く、造血（ｈａｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびｃ−ｋｉｔを発現しなかった。上記Ｔｈｙ１．１陽性ソートした細胞集団とは対照的に、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団は、ＣＤ２４について陽性であった（図２ａおよび２ｂ）。上記亜集団はまた、肝性マーカー、胆嚢マーカーおよび間葉性マーカーであるアルブミン、ビメンチン、ＣＫ７およびＣＫ１９での免疫細胞化学によって評価した（図３）。
【００７３】
両方のＴｈｙ１．１ソートした集団は、アルブミン、ＣＫ７およびビメンチンについて陰性であった（図３−パネルＢ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、ＪおよびＫ）。上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、ＣＫ１９についても陰性であった（図３，パネルＯ）のに対して、上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、弱陽性であった（図３，パネルＮ）。両方の集団は、ＲＴ ＰＣＲによって、ｃ−Ｍｅｔおよびネスチンについて陽性であった（データは示さず）。
【００７４】
まとめると、上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団は、以下の細胞表面マーカープロフィールを発現する：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陰性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 約８０％＋
ＣＤ１４７ 約８０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約６０％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
ｃ−Ｋｉｔ 陰性
ｃｋ７ 陰性
ＣＫ１９ 弱陽性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
上記Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、以下の細胞表面マーカープロフィールを発現する：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陽性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 陰性
ＣＤ１４７ 約９０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約８５％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
Ｃ−ＫＩＴ 陰性
ＣＫ１９ 陰性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
ネスチン 陽性。
【００７５】
（Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団の分化能）
（膵臓分化）
Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団は、膵臓分化培地において顕著に異なる形態学的変化を示した。上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、形態において最初に線維芽細胞様を示し、１４〜２１日目までに絡み合った細胞クラスタを形成し、２８日目までに島様の球形クラスタへと形成された。これは、最終的に、親細胞層から分離した（図１，パネルＤ、Ｈ、Ｉ）。対照的に、上記Ｔｈｙ−１．１陰性細胞は、小さな上皮様形態を有する単層のままであり、三次元構造へと発展しなかった（図１，パネルＡおよびＢ）。
【００７６】
未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析は、陽性Ｐｄｘ−１発現を示したが、インスリンの発現もグルカゴンの発現も示さなかった（図４−Ｂ）。分化した細胞クラスタは、３種のマーカー全ての転写発現について全て陽性であった（図４ パネルＢ）。
【００７７】
しかし、Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、維持培地もしくは分化培地のいずれかで増殖させた場合に、Ｐｄｘ−１を発現した。著しいことには、分化培地中で増殖させた場合、形態学的な変化を示さないにも拘わらず、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団においてインスリン転写が検出された。グルカゴンは、上記未分化のＴｈｙ−１．１陰性細胞において発現せず、分化後にインビトロで誘導もされなかった（図４ パネルＡ）。
【００７８】
（肝臓分化）
Ｔｈｙ−１．１陽性ＰＤＰＣおよびＴｈｙ−１．１陰性ＰＤＰＣを、血清非含有ＦＧＦ４含有培地中で培養して、肝性の能力を評価した。Ｔｈｙ−１．１陽性細胞は、線維芽細胞様から上皮／立方形形態へと形態学的変化を示した。さらに、２８日目までには、平らになった上皮との培養全体を通じて、管腔構造が明らかになった。上記膵臓分化プレートにおいて認められるものに類似したときおりの三次元島様構造が、肝臓分化プレートにおいても認められた。上記Ｔｈｙ−１．１陰性集団は、単層のままであり、三次元構造も管腔様構造も明らかでなく、顕著な形態学的変化もなかった（図１Ａ，Ｃ）。
【００７９】
本発明者は、ＲＴ−ＰＣＲによって２８日間にわたって、上記２つの集団の分化をさらに試験した。ＲＴ−ＰＣＲを、内胚葉特異的遺伝子であるＨＮＦ３βおよびＧＡＴＡ ４、初期肝臓マーカーであるαフェトプロテインおよびＣＫ１８、成熟肝臓マーカーであるＨＮＦ１α、アルブミンおよびシトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｂ１について行った。未分化のＴｈｙ１．１陰性細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＨＮＦ３−βおよびＣＫ１９を発現したが、アルブミン、ＣＫ１８、ＨＮＦ１α、ＣＹ２Ｂ１、Ｇａｔａ４およびαフェトプロテインを発現しなかった（図５，パネルＢ）。他の初期肝臓マーカーもしくは成熟肝臓マーカー、またはＣＹ２Ｂ１のいずれも、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団において誘導されなかった。興味深いことには、未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、初期内胚葉マーカーであるＨＮＦ３−β、ＧＡＴＡ ４およびαフェトプロテインを発現したが、肝臓分化の１４日目までに、肝細胞分化の後期マーカーであるＨＮＦ１−αおよびアルブミンを発現しなかった（図５ パネルＡ）。ＣＫ １９（胆嚢細胞によって正常に発現される）はまた、培養における上記管腔構造の出現と一致して、１４〜２８日目の間に誘導された。アルブミン発現の誘導は、免疫細胞化学によって確認された。未分化の細胞は、アルブミン内容物について陰性に染色される（図３，パネルＡ）一方で、１４日目の分化した細胞は、アルブミン染色について強く陽性であった（図３，パネルＤ）。興味深いことには、１０日目および１４日目の時点で分化した細胞は、胆嚢マーカーであるＣＫ１９およびＣＫ７について陰性に染色された（図３，パネルＮおよびＧ）が、上記管腔様構造のみにおいてビメンチンについては陽性に染色された（図３，パネルＬ）。ＣＫ １８はまた、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞において、および上記２８日間の分化期間全体を通じて発現した。ＣＹＰ２Ｂ１は、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞において、および上記分化期間全体を通じて存在した。
【００８０】
未分化のＴｈｙ１．１陰性細胞は、免疫細胞化学によれば、ＣＫ７、ビメンチンおよびアルブミンの発現について陰性であり、ＣＫ１９について弱陽性であった。上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、ＣＫ１９について陰性であった。
【００８１】
（グリコーゲン貯蔵についての過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色）
貯蔵グリコーゲンの存在は、ＰＡＳ染色によって決定される場合、Ｔｈｙ−１．１陽性ＰＤＰＣでもＴｈｙ−１．１陰性ＰＤＰＣでも認められず、２１日目の分化したＴｈｙ−１．１陰性細胞においても認められなかった。しかし、グリコーゲン貯蔵を示す、ＰＡＳでの陽性染色は、２１日目までに上記Ｔｈｙ１．１陽性の分化した細胞において認められた（図６）。
【００８２】
（糖尿病の動物モデルにおける細胞亜集団の試験）
本明細書に記載の細胞亜集団（例えば、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団もしくはＴｈｙ１．１陰性細胞集団）は、糖尿病のような疾患の動物モデルにおいて使用されうる。一実施形態において、細胞の亜集団は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性の糖尿病の齧歯類和合（ｒｏｄｅｎｔ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）異種移植片モデルにおいて使用される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目にＳＴＺを注射することによって糖尿病にする一方で、７５０，０００個の細胞（例えば、Ｔｈｙ１．１陽性細胞）を、３日目に、処置した動物の尾静脈に注射する。コントロール動物に、生理食塩水の注射を与えるか、または等数のＣ５７ＢＬ／６骨髄細胞を与える。３日ごとに血糖をモニターする。血糖の安定化および／もしくはコントロールに対して増大した生存は、上記投与した細胞が、上記動物においてインスリン生成をもたらすことを示す。
【００８３】
（考察）
本明細書で提供されるのは、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ亜集団およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ亜集団のインビトロ培養、選択および特徴付けに関する詳細である。さらに、膵臓系統および肝臓系統への分化、ならびにマーカーＴｈｙ１．１（これは、インビトロで系統への両能性を示す）を使用してソートした細胞集団の提供に関するそれらの効力について詳細が開示される。
【００８４】
Ｔｈｙ１．１は、機能が明らかには理解されていない細胞表面タンパク質である。しかし、細胞認識（Ｇｕｎｔｅｒら，１９８４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９８５）、細胞接着（Ｇｕｎｔｅｒら， １９８４； Ｗｉｌｌｉａｍｓ， １９８５）（Ｈｅら，１９９１；Ｈｕｅｂｅｒら，１９９２）およびシグナル伝達（Ｋｒｏｃｚｅｋら，１９８６）に関与していることが示唆された。Ｔｈｙ１．１発現は種々の幹細胞集団において認められ、顕著には、成体ラット肝臓における円形細胞集団は、Ｔｈｙ１．１が、潜在的に損傷後の修復細胞として、細胞が間質組織を認識しかつこれに接着することを可能にし得るという仮説をもたらした（Ｍａｓｓｏｎら，２００６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９９８；Ｔｅｒｒａｃｅら，２００７）。Ｔｈｙ１．１はまた、ヒト、マウスおよびラットにおける胎児肝臓の幹細胞、臍帯血および間葉性幹細胞上で発現される。Ｔｈｙ１．１陽性集団内のより大きなインビトロ効力における本知見は、これら観察と一致している。これら観察はまた、このような細胞のさらなる使用を可能にするために、単離および精製のための方法もまた、示す。
【００８５】
以前の研究から、多くの異なる細胞タイプ（骨髄由来ＭＳＣ、ＭＡＰＣ、子宮内膜および膵臓由来のＭＳＣを含む）の肝臓分化が示された（Ｊｉａｎｇら，２００２；Ｍｅｎｇら，２００７；Ｓｃｈｗａｒｔｚら，２００２；Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら，２００６）。ＰＤＰＣの（Ｊｉａｎｇら， ２００２； Ｍｅｎｇら， ２００７； Ｓｃｈｗａｒｔｚら， ２００２； Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら， ２００６）Ｔｈｙ１．１陽性亜集団は、形態学的表現型を共有し、これら集団とともに多くの細胞表面マーカーを発現する（ＣＤ４４＋、ＣＤ２４−、ＣＤ４５−、ＣＤ３１−およびＣＤ３４を含む）。しかし、このこととは対照的に、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３−βおよびαフェトプロテインを発現する別個の細胞タイプであるようであり、これは、これら他の細胞タイプのうちのいずれかについて発現される場合に記載されていない。
【００８６】
ＨＮＦ３−βは、内胚葉能力において重要な役割を果たすと考えられている完全な兄はいようのマーカーである（Ｇｕａｌｄｉら １９９６）一方で、ＧＡＴＡ４は、腹側前腸内胚葉発生および初期肝臓遺伝子発現について必要とされる転写因子である（Ｇｕａｌｄｉら，１９９６；Ｒｏｓｓｉら，２００１）。ＨＮＦ３−βは、上記アルブミンエンハンサーへのＧＡＴＡ４の結合のその後の促進とともに、アルブミンエンハンサーの前後に位置しているヌクレオソームに指向されることが示された（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９６；Ｃｉｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｚａｒｅｔ，１９９９）。ＧＡＴＡ４−／−胚およびＨＮＦ３−β−／−胚の両方は、前腸形態発生の欠損を示す（Ｄｕｎｃａｎら，１９９７）。従って、未分化のＰＤＰＣにおけるＨＮＦ３−βおよびＧＡＴＡ４の発現、ならびにその後の肝臓特異的遺伝子（例えば、アルブミンおよびＨＮＦ１−α）の発現のＦＧＦ刺激誘導は、ＨＮＦ ３−βおよびＧＡＴＡ ４が、これら細胞が肝臓へと発達する結果（ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｔｅ）になる可能性を制御するように協同して作用するという提唱と一致する。さらに、分化の２１日後の上記Ｔｈｙ１．１陽性集団におけるＰＡＳ染色の存在は、より成熟した肝細胞の機能的特徴を示した。このことは、ＨＮＦ１−αの発現と一致する。ＨＮＦ１−αは、遺伝子産物が成熟肝機能（炭水化物貯蔵および合成、ならびに脂質代謝を含む）と関連する遺伝子に結合することが公知である（Ｏｄｏｍら，２００４）。
【００８７】
未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、ＡＦＰを発現する。この観察は、初期腹側前腸内胚葉における肝形成の前に、ネスチン陽性島由来の前駆細胞におけるＡＦＰ発現、ならびに低レベルのＡＦＰおよびＴＴＲ発現を記載する報告と一致する。この発現は、その後、心臓の中胚葉シグナル伝達から分離された内胚葉において失われる（Ｇｕａｌｄｉら，１９９６；Ｊｕｎｇら，１９９９；Ｚｕｌｅｗｓｋｉら，２００１）。このことは、腹側前腸内胚葉の標準的な（ｄｅｆａｕｌｔ）膵臓となる運命の特徴であることもまた、示唆された（Ｄｅｕｓｃｈら）。前記Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ集団におけるＡＦＰの発現（これは、膵臓系統および肝臓系統の両方への能力を示す）は、この知見と矛盾しない（Ｄｅｕｔｓｃｈら，２００１）。
【００８８】
重大なことには、上記未分化のＴｈｙ１．１陰性集団は、ＨＮＦ３βを発現するが、ＧＡＴＡ ４も、αフェトプロテインも発現せず、上記分化実験の間に誘導されなかった。肝臓の能力の証拠は、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団において認められなかった。このことは、この未分化の集団内でのＰｄｘ−１発現、およびＧａｔａ４発現の非存在と一致する。ビメンチンは、未分化のＴｈｙ１．１陽性集団においても、Ｔｈｙ１．１陰性集団においても発現されなかったが、肝臓分化の間に管様構造を形成する細胞において発現された。ビメンチンは、間葉マーカーを表すと考えられる。しかし、Ｍａｓｓｏｎらは、肝門構造（ｐｏｒｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）におけるＴｈｙ１．１およびビメンチンの発現を観察し、組織切片内の上皮細胞における、および胎児肝臓上皮細胞の培養物におけるビメンチン発現も示した（Ｍａｓｓｏｎら，２００６）。（Ｍａｓｓｏｎら， ２００６）
上記膵臓分化に関するデータは、興味をそそるものである。島様クラスタの形態学的な証拠は、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団において認められなかった。対照的に、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、三次元島様構造およびＰＤＸ−１、インスリンおよびグルカゴンの転写発現を生じる特徴的な形態学的変化とともに、容易に膵臓系統へと誘導できた。
【００８９】
両方の集団におけるＰｄｘ−１転写発現の検出は、それらがインスリン生成細胞になる可能性を示す。しかし、顕著なことには、Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、分化培地中で増殖される場合、形態学的屁かを示さないにも拘わらず、インスリンを発現した。グルカゴンは、上記未分化のＴｈｙ−１．１陰性細胞において発現されず、分化後にインビトロで誘導もされなかった（図４ パネル）。
【００９０】
膵臓前駆細胞／幹細胞の種々の異なる候補集団が、以前から記載されてきた（ネスチンもしくは他の神経幹細胞マーカーを発現する島前駆細胞を含む）（Ａｂｒａｈａｍら，２００４；Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓら，１９９７；Ｌｅｃｈｎｅｒら，２００２；Ｒａｍｉｙａら，２０００）。別の集団は、ＰＤＸ−１（インスリン生成細胞についての公知のマーカー）を発現することが示された。そしてこれら細胞は、適切な条件下で、インビトロで導管および内分泌腺分化の両方を刺激し得る（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら，２０００；Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉら，１９９３）。さらに、膵管の上皮細胞が、新たな島および腺房の増殖および形成の能力がある前駆細胞へ分化する能力を有するという証拠が存在し（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら，２００４）、もっとも近年では、（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら， ２００４）ＣＫ１９＋ 非ナイン分泌性膵臓上皮細胞（ＮＥＰＣ）が、胎児膵臓組織の存在下にある場合、インビボでインスリン生成細胞へと分化するように部分的に誘導されることが報告された（Ｈａｏら，２００６）。
【００９１】
これら細胞が果たす正確な生理学的役割が探究されてきた。Ｄｏｒらは、新たな島細胞生成よりむしろβ細胞複製が、優勢な機構である（これによって、膵臓内分泌組織が、ほぼ完全な膵切除術後に再生する）という議論の代わりに、導管細胞もしくは前駆細胞からの再生が生じるという見方を吟味してきた（Ｄｏｒら，２００４）が、この解釈は、未だ論議の的である（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｗｅｉｒ，２００５）。本知見は、このようなプロセスを潜在的に促進する場合に、インスリンを生成し得る非β細胞の役割と一致する。これら細胞が移植治療の代替のインスリン生成細胞供給源を提供することは明らかである。
【００９２】
本発明者は、無血清ＦＧＦ−４含有分化プロトコルの使用によって、肝臓系統分化を示す、形態学的発現変化および遺伝子発現変化の両方の過程を観察した。膵臓分化および肝臓分化についての胚性腹側内胚葉の潜在的な両能性は、腹側内胚葉が心臓中胚葉への近接によって肝臓系統へ分化した外植片実験において調査された。心臓中胚葉によって分泌される誘導因子（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−４）の非存在は、腹側内胚葉の標準的な膵臓経路が継続することを可能にし（Ｄｅｕｔｓｃｈら，２００１）、そして一般的なＦＧＦシグナル伝達アンタゴニストは、インビトロでの肝発生（Ｊｕｎｇら，１９９９）およびＦＧＦ−４（Ｚｈｕら，１９９９）を阻害する。本データは、この概念と完全に一致する。
【００９３】
本発明者は、両能性のある内胚葉前駆体の集団と一致して、インビトロで、効力およびシグナル伝達に対する転写応答を示すＰＤＰＣの単離および特徴付けを示した。前述で、マウスストレプトゾトシン誘導性糖尿病モデルにおける、ソートしていないＰＤＰＣ集団の投与は、分化およびラットインスリンの生成と同時に、マウス膵臓再生の刺激を実証した（Ｓｈｉｅｌｓ ２００５およびＷＯ ２００６／１２０４７６（ともに、本明細書に参考として援用される））。
【００９４】
参考文献のリスト
【００９５】
【化１】
【００９６】
【化２】
【００９７】
【化３】
【００９８】
【化４】
【００９９】
【化５】
【０１００】
【化６】
【０１０１】
【化７】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図３Ｎ】
【図３Ｏ】
【図３Ｐ】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００８年５月９日に出願された、米国仮特許出願第６１／０５２，０９８号と同時係属中であり、かつ少なくとも１人の発明者と共有され、かつそれへの優先権を主張する。先行する出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、組織再生、および細胞変性もしくは加齢性組織変化（ａｇｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｈａｎｇｅ）と関連する疾患状態の処置のために使用され得る新規な細胞集団の提供に関する。特に（しかし網羅的ではない）、本発明は、膵臓細胞タイプおよび肝細胞タイプの両方に分化するための両能性を示す新規な細胞集団の決定から生じる材料および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
幹細胞は、培養において長期間増殖する能力を有し、特定の細胞タイプになるために誘導され得る分化していない細胞である。幹細胞は、主に胚もしくは生体から単離され得るが、これらは、異なる特徴および機能を有するようである。
【０００４】
幹細胞は、多くの哺乳動物種の胚（胚性／胚幹細胞−ＥＳＣ）から単離されてきた。マウス由来のものは、２０年間にわたって集中した研究の対象であり、単離されかつ１９９８年以来研究されてきたヒトＥＳＣの単離のための方法を可能にした。
【０００５】
ＥＳＣは、代表的には、胚盤胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に由来し、ここで胚盤胞は、インビボで全てのその後の発生細胞タイプを生じるように続く。成体幹細胞（ＡＳＣ）は、他方で、多くの組織に存在し、そこでは、それらは、傷害および、または消耗（ｗｅａｒ ａｎｄ ｔｅａｒ）を介して失われた細胞の置換を可能にする。これら細胞は、疾患（例えば、糖尿病およびパーキンソン病）の処置のための細胞ベースの治療を提供する能力を有する。上記疾患では、特定の病理をもたらす細胞損失および損傷が存在する。これら細胞はまた、薬物のスクリーニング、毒物学的調査、発生プログラミングの調査、加齢性組織損失および変性の処置のための優れた能力を有する。これら細胞はまた、外科手術的除去後の、傷害後の、もしくは美容外科手順の一部としての組織再生の能力を有する。
【０００６】
ＡＳＣは、成体組織もしくは器官中の分化した細胞の中で見いだされる未分化の細胞であり、ＡＳＣは、分化しておらず、そしてそれ自体を自分で補充する（ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗ）し得、組織もしくは器官の主要な細胞タイプを得るように分化する能力を維持する。ＡＳＣは、組織修復を維持しかつもたらすと考えられる。成熟組織における成体幹細胞の起源は未知であり、それらの可塑性の程度は、未だ決定されていない。移植におけるそれらの用途は、広く知られている。骨髄由来のＡＳＣは、３０年間にわたって移植で使用されてきた。成体非ＨＳＣの使用、それらの効力、可塑性および長期追跡での安全性は、未だ証明されていない。非間質性ＡＳＣの報告は、現場で討議されたままであるが、神経幹細胞は、今では確立されており、真正な（ｂｏｎｅ ｆｉｄｅ）ＡＳＣタイプとして受け入れられている。
【０００７】
ＥＳＣの証明された多能性特徴およびＥＳＣを多数増殖させる能力は、ＥＳＣを細胞ベースの治療の魅力的な候補にしている。この状況においてＡＳＣの使用には厳しい制限が存在する。ここでこのような細胞は、非常に稀であると考えられておりかつそれらの増殖条件は、可能性のある治療に十分な数で適切な細胞を生成するほど十分に明確でない。
【０００８】
しかし、ＡＳＣは、「自己」に由来し得るという点で、決定的な利点を確かに有しているので、いかなる患者でも、彼ら自身の細胞を受容し、顕著に高まった癌のリスクを含め、拒絶を防止するために免疫抑制の有害な副作用に苦しむ必要はない。制限された有効性／可塑性はまた、以上型の細胞分化が制限され、新生物のリスクが低減されるという点で、高められた安全性因子であると考えられる。
【０００９】
肝臓および膵臓の共通する発生起源は、これら器官が、共通する幹細胞／前駆細胞集団を共有し得ることを示唆する。この過程の裏付けにおいてかなりの間接的証拠が存在する。外植片実験から、Ｐｄｘ−１を発現する腹側内胚葉は、心臓中胚葉への近接によって、肝臓系統に流用されることが実証されている（非特許文献１）。肝細胞特性を有する細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１）はまた、マウス膵臓内の管領域において観察された。銅欠乏性食餌を与えられたマウスは、膵臓損傷、腺房細胞の損失を受け、４〜６週間後には、肝円形様細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｏｖａｌ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）が観察される（非特許文献２；非特許文献３）。さらに、脾臓に移植された、銅欠乏性食餌に供されたラットから単離した膵臓細胞は、実質構造へと組み込まれかつ成熟肝臓特異的タンパク質を発現することによって、形態的にも機能的にも肝細胞への分化を示した（Ｄａｂｅｖａら，１９９７）。フマリルアセトアセテートヒドロラーゼが欠損し、後にチロシン血症を伴う共通遺伝子のレシピエントに移植した野生型マウス膵臓細胞の懸濁物はまた、肝機能の正常化とともに、ドナー由来細胞によって生合成レスキューを生じることが報告された（Ｗａｎｇら，２００１）。さらに、成体マウス膵臓におけるＫＧＦのトランスジェニック過剰発現は、膵島内で肝細胞の出現および付随して膵管増殖を生じる（Ｋｒａｋｏｗｓｋｉら，１９９９ｂ；Ｋｒａｋｏｗｓｋｉら，１９９９ａ）。
【００１０】
いくつかの推定される膵臓前駆細胞が、膵管細胞および島細胞の両方から特徴付けられた（Ａｂｒａｈａｍら，２００４；Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓら，１９９７；Ｌｅｃｈｎｅｒら，２００２；Ｒａｍｉｙａら，２０００）。これら細胞集団のうちの一方は、インビトロでの分化後に、αフェトプロテインおよびｃ−Ｍｅｔ（代表的には、肝細胞によって発現されるタンパク質）を発現することが観察された（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら，２００１）。（Ｚｕｌｅｗｓｋｉら， ２００１）より近年になってからは、ヒト膵管上皮から単離された間葉系幹細胞集団は、膵臓分化、肝臓分化および中胚葉分化の能力を有することが報告された（Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら，２００６）。これら細胞は、Ｇａｔａ ４、アルブミンおよびＴＡＴ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）を発現するように誘導され得るが、機能的評価は未だ報告されていない。
【００１１】
本発明者は、以前に、さらなる細胞タイプである、ＳＴＺ糖尿病モデルにおいて多能性および機能的効力を示す、成体ラット膵管から単離された膵臓由来開通細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ Ｃｅｌｌ）（ＰＤＰＣ）を決定した（Ｓｈｉｅｌｓ ２００４；および特許文献１（本明細書に参考として援用される））。成体ラット肝臓において、推定される幹細胞の集団は、化学的傷害、もしくは部分的肝切除術による誘導後に誘導され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，２００３）（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら， １９９８； Ｐｅｔｅｒｓｅｎら， ２００３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２０４７６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｇ．， Ｊ．Ｊｕｎｇ， Ｍ．Ｚｈｅｎｇ， Ｊ．Ｌｏｒａ ａｎｄ Ｋ．Ｓ．Ｚａｒｅｔ： Ａ ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｅｖ．（２００１）１２８、８７１−８８１
【非特許文献２】Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ．， Ｖ．Ｓｕｂｂａｒａｏ ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｒｅｄｄｙ： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｐｐｅｒ ｒｅｐｌｅｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． Ｄｅｖ．（１９８６）１８、１０９−１１７
【非特許文献３】Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｒｅｄｄｙ： Ｈｅｐａｔｉｃ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｄｅｖ．（１９９５）６、１５１−１５６
【非特許文献４】Ｄａｂｅｖａ，Ｍ．Ｄ．， Ｓ．Ｇ．Ｈｗａｎｇ， Ｓ．Ｒ．Ｖａｓａ， Ｅ．Ｈｕｒｓｔｏｎ， Ｐ．Ｍ．Ｎｏｖｉｋｏｆｆ， Ｄ．Ｃ．Ｈｉｘｓｏｎ， Ｓ．Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｓｈａｆｒｉｔｚ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ Ｄｅｖ．（１９９７）９４、７３５６−７３６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
細胞変性と特に関連する疾患を処置するために、細胞ベースの治療において使用され得る細胞集団を提供することが継続して必要である。糖尿病は、このような疾患の一例である。膵臓におけるインスリンは、インスリン分泌β細胞によって作られる。インビボでは、β細胞ターンオーバーは、生涯全体を通じて起こると考えられているが、置換細胞の起源に関しては、論争がある。従って、糖尿病は、完全に機能するネイティブ細胞に類似した細胞の提供（特に、自己に由来する細胞）が処置の重要な選択肢を提供する疾患の一例である。糖尿病の場合には、インスリンを生成し得るという点で、β細胞に類似の細胞の提供は、上記疾患にとって重大な細胞ベースの治療を提供する。
【００１５】
この疾患および他の疾患を考慮に入れて、本発明者は、成体膵管から肝細胞／前駆細胞集団に由来する細胞の亜集団を単離した。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞の亜集団は、Ｐｄｘ−１（ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿０００２００．１ ＧＩ：４５５７６７３； ＲＡＴ： ＮＰ＿０７４０４３．３ ＧＩ：５０８３８８０２）陽性である。Ｐｄｘ−１発現の存在は、細胞が非β細胞由来インスリンの供給源としての能力を有することを示す。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される成体幹細胞／前駆細胞の亜集団は、Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０）（ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿００６２７９）の存在もしくは非存在によって特徴付けられる。Ｔｈｙ１．１陽性亜集団およびＴｈｙ１．１陰性亜集団の特性は、以下で議論される。
【００１８】
（１．Ｔｈｙ１．１陽性細胞）
維持（非分化）培地中で、Ｔｈｙ１．１陽性細胞亜集団は、Ｐｄｘ−１陽性、インスリン陰性およびグルカゴン陰性である。Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、膵臓分化培地中に置かれた場合、最初に、線維芽細胞様形態を示し、次いで、親細胞層から最後には分離する絡み合った細胞クラスタを形成する。得られた分化した細胞クラスタは、Ｐｄｘ−１、インスリンおよびグルカゴンについて陽性である（図４、パネルＢ）。
【００１９】
本明細書に記載されるＴｈｙ１．１陽性細胞亜集団に関する驚くべき決定は、それらが、少なくとも両能性のある（ｂｉｐｏｔｅｎｔ）ことである。具体的には、適切な分化培地とともに提供される場合、Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、膵臓細胞タイプもしくは肝細胞タイプのいずれかに分化し得る。
【００２０】
（２．Ｔｈｙ１．１陰性細胞）
非分化状態において、Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団は、Ｐｄｘ−１について陽性であるが、インスリンおよびグルカゴンについては陰性である。分化培地中で増殖される場合、Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、形態学的変化を示さなかったが、インスリン転写が検出された。よって、Ｔｈｙ１．１陰性集団は、非β細胞由来インスリンの新規な供給源を提供する。
【００２１】
よって、その最も一般には、本発明は、多能性成体幹細胞集団に由来する細胞の新規な亜集団を使用して、細胞ベースの治療に基づく加齢の疾患および状態を処置するための材料および方法を提供する。上記亜集団は、Ｐｄｘ−１陽性である。
【００２２】
このような細胞集団は、糖尿病のような疾患およびパーキンソン病のような神経変性障害の細胞ベースの治療に対する能力を提供する。
【００２３】
成体幹細胞集団（前駆細胞としても公知）は、成体膵臓組織（例えば、ヒト、ラット、マウス、霊長類、ブタなど）に由来し得る。上記成体組織は、好ましくは、膵臓組織であるが、乳房、骨髄、心臓、肝臓もしくは腎臓のような他の器官に由来する組織であってもよい。
【００２４】
本発明の一実施形態において、成体幹細胞は成体ラット膵臓に由来し、これは、１９７７年のブダペスト条約に従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＧｌａｓｇｏｗのＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔによって、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＳＰ４ ０ＪＧのＴｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにおいて、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣ番号Ｑ６２０３の下で寄託された。これら細胞は、本明細書中以降、ＰＤＰＣ（膵臓由来前駆細胞）として知られる。
【００２５】
上記のように、本発明者はまた、マーカーＴｈｙ１．１（ＣＤ９０）（ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿００６２７９）を参照して、２つのさらなる亜集団を決定した。これら２つの亜集団は異なるが、等しく重要な特性を有する。特に、Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、膵臓細胞タイプおよび肝細胞タイプの両方への分化能力を示す。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される細胞亜集団は、インスリンの非β細胞供給源を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される細胞亜集団は、試験物質の毒性を評価するための細胞タイプを提供する（例えば、毒物学試験のために）。
【００２６】
よって、第１の局面において、成体組織から発生する幹細胞／前駆細胞の集団を提供する。ここで上記細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき、上記細胞は、Ｔｈｙ１．１陽性である。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞はまた、Ｐｄｘ−１陽性である。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、ネスチン（ＲＡＴ：ＮＰ＿０３７１１９．１ ＧＩ：６９８１２６２； ＨＵＭＡＮ： ＮＰ＿００６６０８．１ ＧＩ：３８１７６３００）陽性である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記集団中のネスチン陽性細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリー分析によって決定される場合、５０％未満（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％もしくは１％未満）である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、ＰＣＲによって、ネスチン核酸の発現によって、ネスチン陽性細胞として区別可能である。
【００２８】
細胞集団は、Ｔｈｙ１．１陽性（ＣＤ９０陽性）（ＲＡＴ：ＬＯＣＵＳ：Ｐ０１８３０ ＧＩ１３５８３２； ＮＰ＿００６２７９ ＧＩ：１９９２３３６２）として見なされ得る。ここでＴｈｙ１．１陽性細胞のパーセンテージは、５０％より大きく、好ましくは、６０％より大きく、より好ましくは、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％より大きい。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、純度が９８％より高い。Ｔｈｙ１．１陽性細胞のパーセンテージは、例えば、フローサイトメトリーによって、もしくはＰＣＲによって決定され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団は、Ｐｄｘ−１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔ、およびネスチンのうちの１種以上の発現について陽性である。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、ＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＫ１９のうちの１種以上の発現について陰性である。いくつかの実施形態において、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団は、以下の細胞表面マーカープロフィールを有する：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陽性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 陰性
ＣＤ１４７ 約９０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約８５％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
Ｃ−ＫＩＴ 陰性
ＣＫ１９ 陰性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
ネスチン 陽性
（低い＝細胞のうちの約５％以下が上記マーカーを発現する）。
【００３０】
本発明はまた、本発明のこの局面に従う細胞集団とともに、薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００３１】
本発明の第２の局面において、成体哺乳動物組織から単離された両能性のある幹細胞集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、上記成体哺乳動物組織を培養する工程；発生する細胞集団単層を得る工程；およびＴｈｙ１．１について陽性である細胞を含む亜集団を単離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記亜集団のうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％が、Ｔｈｙ１．１陽性である。
【００３２】
上記方法はまた、上記で提供されるプロフィール（例えば、Ｐｄｘ−１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔ、およびネスチンのうちの１種以上について陽性ならびに／またはＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＫ１９のうちの１種以上について陰性）中に提供される１種以上の他の細胞表面マーカーと組み合わせて、Ｔｈｙ１．１について陽性樽細胞を単離する工程を包含し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記成体哺乳動物組織は、膵臓であり、例えば、膵管由来である。いくつかの実施形態において、上記成体哺乳動物組織は、乳房、肝臓もしくは腎臓である。いくつかの実施形態において、上記成体哺乳動物組織は、ヒト組織である。
【００３４】
発生する細胞集団単層を得るために成体哺乳動物組織を得る代わりに、方法は、既に単離された成体幹細胞（例えば、２００５年５月１２日に、アクセッション番号Ｑ６２０３の下でＥＣＡＣＣに寄託されたもの）を得ることを包含し得る。
【００３５】
第３の局面において、培養において幹細胞の集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団を、肝臓系統分化に適した培地中で培養する工程を包含する。一例として（他は、当業者に公知である）、上記培養培地は、無血清ＦＧＦ−４含有分化培地であり得る。
【００３６】
第４の局面において、培養において膵臓細胞の集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性細胞集団を、膵臓系統分化に適した培地中で培養する工程を包含する。
【００３７】
本発明は、本明細書で記載される方法から得られるもしくは得ることができる細胞および細胞集団に及ぶ。
【００３８】
本発明の第５の局面において、細胞変性もしくは加齢性組織変化と関連する疾患状態を処置するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陽性成体幹細胞集団もしくは上記Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団を含む薬学的組成物を、上記疾患もしくは加齢性状態を有する患者に投与する工程を包含する。
【００３９】
Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、静脈内に投与され得るか、または疾患部位に移植され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記疾患は、膵臓細胞、神経細胞、心血管細胞（例えば、心筋細胞）、上皮細胞、肝細胞、もしくは腎細胞の変性と関連する。
【００４１】
上記処置されるべき疾患状態としては、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、肝臓疾患、腎臓疾患、眼の疾患、パーキンソン病および心血管疾患ならびに身体の器官および組織の加齢性変性状態が挙げられ得る。本発明のこの局面はまた、美容外科手術の形態として（例えば、組織の細胞再生および加齢の形態を妨げるため）使用され得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記細胞のドナーおよび上記レシピエントは、同じ種である（例えば、両方ともヒト）。いくつかの実施形態において、上記細胞のドナーおよび上記レシピエントは、異なる種である。よって、本発明の一実施形態は、ヒト患者の処置における、ラットに由来する成体幹細胞集団の使用を包含する。
【００４３】
本発明の第６の局面において、指定された分化した細胞集団（例えば、膵臓細胞もしくは肝細胞）を生成するための方法が提供され、上記方法は、成体幹細胞集団を提供する工程；Ｐｄｘ−１および／もしくはＴｈｙ１．１マーカー、ならびに必要に応じて、Ｔｈｙ１．１亜集団細胞表面マーカープロフィールに関連して本明細書で同定される１種以上の他のマーカーを使用して、細胞亜集団を選択する工程；ならびに細胞分化の助けとなる条件下で上記細胞亜集団を培養する工程を包含する。
【００４４】
本発明は、美容外科手術を含め、医療処置の方法において使用するための本発明の第１の局面に従う細胞集団をさらに提供する。上記方法は、細胞損失もしくは変性（例えば、糖尿病もしくはパーキンソン病）と関連する疾患状態もしくは加齢の状態を処置し得る。
【００４５】
本発明の第６の局面において、成体組織から発生する細胞集団が提供され、ここで上記細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき、上記細胞は、Ｔｈｙ１．１陰性である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、上記細胞集団は、Ｐｄｘ−１陽性である。上記細胞集団はまた、ネスチン陽性であり得る。
【００４７】
本発明はまた、成体幹Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団を、薬学的に受容可能なキャリアとともに含む薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明の第７の局面において、成体哺乳動物組織から単離された幹細胞集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、上記成体哺乳動物組織を培養する工程；発生する細胞集団単層を得る工程；およびＴｈｙ１．１について陰性の細胞の亜集団を単離する工程を包含する。一実施形態において、上記方法は、Ｐｄｘ−１陽性および／もしくはネスチン陽性でもある細胞の亜集団を単離する工程をさらに包含する。
【００４９】
一実施形態において、Ｔｈｙ１．１陰性細胞の亜集団は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔのうちの１種以上の発現について陽性であり、そして／またはＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびｃｋ７のうちの１種以上の発現について陰性である。一実施形態において、以下の細胞表面マーカープロフィールであるＴｈｙ１．１陰性細胞の亜集団が単離される：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陰性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 約８０％＋
ＣＤ１４７ 約８０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約６０％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
ｃ−ＫＩＴ 陰性
ｃｋ７ 陰性
ＣＫ１９ 弱陽性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
（低い＝細胞のうちの５％以下がそのマーカーを発現する）。
【００５０】
発生する細胞集団単層を得るために成体哺乳動物組織を得る代わりに、上記方法は、既に単離された成体幹細胞／前駆細胞（例えば、２００５年５月１２日にアクセッション番号Ｑ６２０３の下でＥＣＡＣＣに寄託されたもの）を得る工程を包含し得る。
【００５１】
本発明の第８の局面において、糖尿病もしくはインスリン生成の低下と関連する疾患状態を処置するための方法が提供され、上記方法は、本発明に従うＴｈｙ１．１陰性細胞集団、もしくは上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団を含む薬学的組成物を、上記疾患もしくは加齢性状態を有する患者に投与する工程を包含する。
【００５２】
Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団は、静脈内投与され得るか、または上記疾患部位に移植され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、上記細胞のドナーおよび上記レシピエントは、同じ種（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、上記細胞および上記レシピエントは、異なる種である。よって、本発明の一実施形態は、ヒト患者の処置における成体ラット幹細胞／前駆細胞の使用を包含する。
【００５４】
本発明の第９の局面において、インスリンを生成することができる指定された分化した細胞集団を生成するための方法が提供され、上記方法は、成体幹細胞集団を提供する工程；Ｐｄｘ−１について陽性でありかつＴｈｙ１．１マーカーについて陰性である成体幹細胞亜集団を選択する工程；ならびに細胞分化の助けとなる条件下で、上記細胞亜集団を培養する工程を包含する。上記方法は、Ｔｈｙ１．１細胞表面マーカープロフィールの一部として上記で同定された１種以上のさらなるマーカーに基づいて、上記成体幹細胞集団を選択する工程をさらに包含し得る。
【００５５】
本発明は、医療処置の方法において使用するための、本発明に従う成体幹細胞Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団をさらに提供する。特に、上記方法は、糖尿病を処置することであり得る。
【００５６】
インスリンを生成するための方法もまた、本明細書で提供される。インスリンを生成するための方法は、本明細書に記載されるＴｈｙ１．１陰性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団（例えば、成体組織（例えば、成体膵臓組織）に由来するＴｈｙ１．１陰性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団）を、インスリンが生成される条件下で培養する工程を包含し得る。上記方法は、上記培養物からインスリンを単離する工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔのうちの１種以上の発現について陽性であり、そして／またはＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびｃｋ７のうちの１種以上の発現について陰性である。
【００５７】
別の実施形態において、インスリンを生成するための方法は、本明細書に記載されるＴｈｙ１．１陽性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団（例えば、成体組織（例えば、成体膵臓組織）に由来する分化したＴｈｙ１．１陽性のＰｄｘ−１陽性細胞の集団）を、インスリンが生成される条件下で培養する工程を包含する。上記方法は、インスリンを上記培養物から単離する工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団は、Ｐｄｘ−１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ｃ−Ｍｅｔ、およびネスチンのうちの１種以上の発現について陽性であり、そして／またはＣＤ２４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＫ１９のうちの１種以上の発現について陰性である。
【００５８】
本発明の局面および実施形態は、ここで添付の図面を参照しながら、例示によって示される。さらなる局面および実施形態は、当業者に明らかである。本文において言及される全ての文書は、本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、未分化のＴｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団のインビトロでの形態である。Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ集団およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ集団のインビトロでの肝臓分化および膵臓分化（図１Ａ〜Ｃ）：形態学的変化は、分化の間にＴｈｙ１．１陰性集団においてほとんど認められない。（図１Ａ）未分化のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ。（図１Ｂ）膵臓分化誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ。（図１Ｃ）肝臓分化誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ。（図１Ｄ-Ｉ）：Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣの肝臓分化の誘導に際して、顕著な形態学的変化が認められた。（図１Ｄ）未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ（線維芽細胞様形態）。（図１Ｅ）肝臓分化誘導後１４日目のＴｈｙ１陽性ＰＤＰＣ。（図１Ｆ）肝臓分化誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ−管腔構造が優勢な上皮形態が存在する。（図１Ｇ）肝臓誘導後２８日目のｔｈｙ１陽性ＰＤＰＣの立方形の形態。（図１Ｈ）膵臓誘導後１４日目のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ。（図１Ｉ）膵臓誘導後２８日目のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ−島様クラスタが形成され、その後、培地へと分離する。
【図２】図２は、フローサイトメトリーによってＭＡＣＳソートしたＰＤＰＣの細胞表面特徴付けである。（図２Ａ）Ｔｈｙ１（ＣＤ９０）陽性集団は、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔの発現について陰性であり、ＣＤ７１については低いが、ＣＤ１４７、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｆの発現については陽性である。（図２Ｂ）Ｔｈｙ１（ＣＤ９０）陰性集団は、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔの発現については陰性であり、ＣＤ７１については低いが、ＣＤ２４、ＣＤ１４７、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｆの発現については陽性である。
【図３】図３は、Ｔｈｙ１．１ソートしたＰＤＰＣ集団の免疫細胞化学である。陽性コントロールは、アルブミン（図３Ａ）、サイトケラチン７（図３Ｅ）、ビメンチン（図３Ｉ）およびサイトケラチン１９（図３Ｍ）について示される。上記未分化のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ集団は、アルブミン（図３Ｂ）、サイトケラチン７（図３Ｆ）、ビメンチン（図３Ｊ）について陰性染色を示すが、サイトケラチン１９（図３Ｎ）については弱い染色を示す。上記未分化のＴｈｙ１．１陽性集団は、アルブミン（図３Ｃ）、サイトケラチン７（図３Ｇ）、ビメンチン（図３Ｋ）およびサイトケラチン１９（図３Ｏ）について陰性であった。しかし、肝臓分化培地中での１４日目までに、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、アルブミンについて陽性であり（図３Ｄ）、管腔様領域においては、ビメンチン（図３Ｌ）およびサイトケラチン１９（図３Ｐ）について陽性であったが、サイトケラチン７は、全体を通じて陰性のままであった（図３Ｈ）。
【図４】図４は、膵臓分化培地中のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ（図４Ａ）およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ（図４Ｂ）のＲＴ−ＰＣＲ。Ｔｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣおよびＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣを、膵臓分化培地中で２８日間にわたって培養した。列：（１）陽性コントロール、（２）未分化のＰＤＰＣ、（３）２８日目の分化したＰＤＰＣ、（４〜６） サンプル１〜３のＲＴなし（ｎｏ ＲＴ）コントロール。
【図５】図５は、肝臓分化培地中のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣおよびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣのＲＴ−ＰＣＲである。Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ（図５Ａ）およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ（図５Ｂ）を、肝臓分化培地中で２８日間培養した。列：（１）陽性コントロール、（２）未分化のＰＤＰＣ、（３）７日目、（４）１４日目、（５）２１日目、（６）２８日目、（７〜１３）サンプル１〜６のＲＴなしコントロール。アルブミン、ＣＫ１９およびＨＮＦ１αの発現は、上記Ｔｈｙ１．１陽性集団において誘導されたが、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団においては認められなかった。
【図６】図６は、未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ集団（図６Ｂ）もしくはＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ集団（図６Ｃ）がグリコーゲンを貯蔵しないことを示す。ＦＧＦ−４含有培地中で培養した後のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、グリコーゲンを生成および貯蔵する（図６ＤおよびＥ）。グリコーゲン貯蔵は、過ヨウ素酸−シッフによって染色される場合に、赤紫色の染色の蓄積として認められる。ＦＧＦ−４含有肝臓分化培地中で培養した後のＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣは、染色を示さない（図６Ｆ）。陽性コントロール（図６Ａ）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
（詳細な説明）
（材料および方法）
（ラットＰＤＰＣの単離および維持培養）
膵管を、切開することによって１２ヶ月齢のＡｌｂｉｎｏ Ｓｗｉｓｓ（Ｇｌａｓｇｏｗ）ラットから単離し、ＣＭＲＬ培地中に播種する前に切り刻んだ。上記ＰＤＰ細胞は、培養において約５週間後にコンフルエントな単層として発生した。次いで、これらを採取し、ＰＢＳ中で洗浄した。ＰＤＰＣを、０．２μｍ フィルターキャップ付きのＴ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＫ）において、３７℃で５％ ＣＯ２雰囲気中、２０ｍｌのＣＭＲＬ １０６６培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ．）（１０％ ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ、および１００ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を補充）中の培養において維持した。コンフルエント未満の培養物を、ピペットでの培養培地の完全な除去、ならびに１０ｍｌのカルシウムおよびマグネシウム非含有ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を上記フラスコに室温で５分間添加することによる、接着性細胞の洗浄することによって継代した。上記ＨＢＳＳをピペットで上記フラスコから除去した後、２ｍｌのトリプシン−Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（２００ｍｇ／Ｌ Ｖｅｒｓｅｎｅ、５００ｍｇ／Ｌ トリプシン）を、上記フラスコに添加した。上記フラスコを、上記細胞単層の分離が確認されうるまで、顕微鏡で定期的に観察した。次いで、細胞を、ピペットで取り出し、望ましい場合、１／５〜１／１０の密度で２０ｍｌの新鮮な培養培地を添加して上記のように再培養した。
【００６１】
ＰＤＰＣを、０．２μｍ フィルターキャップ付きのＴ７５において、３７℃で５％ ＣＯ２雰囲気中、ＣＭＲＬ １０６６培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）（５％ ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ、および１００ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ）を補充）中で長期間維持した。ＰＤＰＣを、３７℃で加湿５％ ＣＯ２雰囲気中、単層として増殖させ、９０％ コンフルエントになったときに、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて継代した。細胞を計数し、３３００細胞／ｃｍ２の密度で再度プレートした。
【００６２】
（磁性活性化細胞ソーティング）
磁性活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を、製造業者のプロトコル（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に従って、１０６標的細胞あたり１μｇの一次抗体（マウス抗ラットＴｈｙ１．１（ＣＤ９０）（Ｓｅｒｏｔｅｃ））を使用して、４℃において２０分間にわたって、単離および除去のために行った。ソートした細胞集団を、維持培養培地中で再懸濁し、組織培養フラスコに再度プレートした。ＭＡＣＳを、実験において使用する前に、各陽性ソートした集団および陰性ソートした集団に対して２回行った。全てのソートした集団を、後の分化実験の前に、蛍光活性化フローサイトメトリーでチェックした。
【００６３】
（細胞表面抗原のフローサイトメトリー評価）
細胞を、ＨＢＳＳ中の０．５％ ＢＳＡにおいて再懸濁した。次いで、それらを１０００×ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し、得られた細胞ペレットを、ＨＢＢＳ中に再懸濁する。トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で生存性係数した後、１×１０６細胞／ｍｌを、１００μｌ 一次抗体で標識した。使用した一次抗体は、ＣＤ９０に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ４７Ｒ，１：７５）、ＣＤ４４に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ６４３，１：１０）、ＣＤ４９ｆに対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ２０３４，１：５０）、ＣＤ１４７に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ７２９，１：１０）、ｃ−ＫＩＴに対するもの（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−１９９８３，１：２０）、ＣＤ７１に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ １５５ＦＴ，１：１０）、ＣＤ２４に対するもの（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５１１３３，１：５０）、ＣＤ４５に対するもの（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５４８７５，１：５０）、ＣＤ３１に対するもの（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ１３３４ＧＡ，１：５０）およびＣＤ３４に対するもの（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７３２４，１：５０）であった。２次抗体を、０．２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中、遮光して、４℃において４５分間にわたって添加した。次いで、上記細胞を洗浄し、０．２％ ＢＳＡ中のウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｅｌｙ，ＵＫ １：２０）の１００μｌ ＦＩＴＣ結合体化Ｆａｂ２フラグメントを遮光して４℃で４５分間にわたって添加することによって標識する前に、１０００×ｒｐｍで、０．２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中、３回遠心分離した。アイソタイプＦＩＴＣコントロールもまた行った。前述のように、３回洗浄し、遠心分離した後、得られた細胞ペレットを、１ｍｌのＨＢＳＳ中で再懸濁し、上記細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）を使用して分析した。
【００６４】
（分化実験）
膵臓分化のために、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団およびＴｈｙ１．１陰性細胞集団（継代３０）を、６６００細胞／ｃｍ２の細胞密度においてプレートした。２４時間後、維持培地を除去し、単層をＨＢＳＳで３回洗浄した。引き続き、細胞をＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｌｏｎｚａ）（１×ＩＴＳ、１．２５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢ、および１００μ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）、ニコチンアミド １０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＫＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）および０．２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充）中で培養した。
【００６５】
肝性分化のために、細胞を、Ｔ７５および６ウェルプレート中、６６００細胞／ｃｍ２においてプレートし、２４時間維持で、チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中２５００細胞／ｃｍ２において、ＨＢＳＳ、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｌｏｎｚａ）（線維芽細胞増殖因子−４ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、１×ＩＴＳ、１００μ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．２％ ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を補充）で３回洗浄した後に、置換した。培地好感を１週間に３回行い、細胞を、膵臓分化については０日目および２８日目に、および肝臓分化については０日目、７日目、１４日目、２１日目および２８日目に、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞およびＴｈｙ１．１陰性細胞からのＲＮＡ抽出のために採取した。チャンバースライドにおいて肝臓分化を受けている細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、１０〜１４日の間で４％ パラホルムアルデヒドで室温において１５分間固定した。未分化のＴｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団を、同時にチャンバースライド中でも増殖させ、上記のように、９０％コンフルエントにおいて固定した。
【００６６】
（免疫蛍光）
細胞内タンパク質の染色のために、細胞を上記のように固定した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間にわたって透過性にした。スライドを、ロバ血清とともに２０分間にわたってインキュベートし、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈した以前に最適化した、ラットアルブミンに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ１４２５５，１：１００）、ＣＫ１９に対する一次抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔ． Ｍ０８０２９Ｍ，１：１００）、ＣＫ７に対する一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３２２６，１：１００）、ＣＫ１８に対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｆ−４７７２）およびビメンチンに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ８９７９，１：５０）と１時間にわたってインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて、適切なＦＩＴＣ標識２次抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ６７４９もしくはＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｆ０３１３，Ｅｌｙ，ＵＫ）で洗浄した。上記一次抗体の省略を、陰性コントロールとして行った。ラット肝臓の凍結切片を、陽性コントロールとして使用した。スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ中にマウントする前に３回洗浄し、そして蛍光顕微鏡によって可視化し、撮影した。
【００６７】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を使用することによって抽出し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ分析器によって定量した。サンプルを、ＤＮＡｓｅ処理（Ａｍｂｉｏｎ）し、ｃＤＮＡへの逆転写を、製造業者の説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ＲＴなし陰性コントロールを、全てのサンプルについて行った。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ハウスキーピング遺伝子であるＢａｃｔｉｎを使用して、テンプレートの品質を評価した。全てのＰＣＲ反応を、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ −２００を使用して行った。ネスト化ＰＣＲを、膵臓分化実験について行った。
【００６８】
以下の特異的オリゴヌクレオチドプライマーに、ＰＤＸ １、インスリンＩＩおよびグルカゴンを使用した（ＰＤＸ−１，順方向 ５−ｃｇｇｃｃａｃａｃａｇｃｔｃｔａｃａａｇｇ−３（配列番号１）、逆方向 ５−ｃｔｃｃｇｇｔｔｃｔｇｃｔｇｃｇｔａｔｇｃ−３（配列番号２）、ネスト化逆方向 ５−ｔｔｃｃａｇｇｃｃｃｃｃａｇｔｃｔｃｇｇ−３（配列番号３）（３０５ｂｐ）、インスリン，順方向 ５−ａｔｇｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｃｃｇｃｔｔ−３（配列番号４）；逆方向 ５−ｔｇｃｃａａｇｇｔｃｔｇａａｇｇｔｃａｃ−３（配列番号５）；ネスト化順方向 ５−ｃｃｔｇｃｔｃａｔｃｃｔｃｔｇｇｇａｇｃｃ−３（配列番号６）（２０９ｂｐ）；グルカゴン，順方向 ５−ｇａｃｃｇｔｔｔａｃｇｔｇｇｃｔｇｇ−３（配列番号７）；逆方向 ５−ｃｇｇｔｔｃｃｔｃｔｔｇｇｔｇｔｔｃａｔｃａａｇ−３（配列番号８）；ネスト化順方向 ５−ａｃａａｇｇｃａｇｃｔｇｇｃａｇｃａｔｇｃ−３（配列番号９）（２１０ｂｐ）。ラット膵臓総ＲＮＡを逆転写し、陽性コントロールとして使用した。以下の特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、肝臓分化実験のために使用した：アルブミン（１４１ｂｐ） 順方向 ５-ｃｔｇｇｇａｇｔｇｔｇｃａｇａｔａｔｃａｇａｇｔ−３（配列番号１０），逆方向 ５−ｇａｇａａｇｇｔｃａｃｃａａｇｔｇｃｔｇｔａｇｔ−３（配列番号１１）、ＨＮＦ３β（６３ｂｐ） 順方向 ５−ｃｃｔａｃｔｃｇｔａｃａｔｃｔｃｇｃｔｃａｔｃａ−３（配列番号１２），逆方向 −ｃｇｃｔｃａｇｃｇｔｃａｇｃａｔｃｔｔ（配列番号１３）、ＨＮＦ１（１３８ｂｐ）α 順方向 ５−ａｇｃｔｇｃｔｃｃｔｃｃａｔｃａｔｃａｇａ−３（配列番号１４），逆方向 ５−ｔｇｔｔｃｃａａｇｃａｔｔａａｇｔｔｔｔｃｔａｔｔｃｔａａ−３（配列番号１５）、Ｇａｔａ４（１７３ｂｐ） 順方向 ５−ｃａｔｇｃｔｔｇｃａｇｔｔｇｔｇｃｔａｇ−３（配列番号１６），逆方向 ５−ａｔｔｃｔｃｔｇｃｔａｃｇｇｃｃａｇｔａ−３（配列番号１７）、α−フェトプロテイン（１２４ｂｐ） 順方向 ５−ｇｔｃｃｔｔｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｇｇａｇａｔ−３（配列番号１８），逆方向 ５−ｃｔｇｔｃａｃｔｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｃｔｇｇ−３（配列番号１９）、ＣＹＰ２Ｂ１（５４９ｂｐ） 順方向 ５−ｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃｔｇ−３（配列番号２０），逆方向 ５−ａｃｔｇｔｇｇｇｔｃａｔｇｇａｇａｇｃｔ−３（配列番号２１）、ＣＫ１９（１９３ｂｐ） 順方向 ５−ａｇｔａａｃｇｔｇｃｇｔｇｃｔｇａｃａｃ−３（配列番号２２），逆方向 ５−ａｇｔｃｇｃａｃｔｇｇｔａｇｃａａｇｇｔ−３（配列番号２３）、ＣＫ１８（７０ｂｐ） 順方向 ５ｇｇａｃｃｔｃａｇｃａａｇａｔｃａｔｇｇｃ−３（配列番号２４），逆方向 ５ ｃｃａｃｇａｔｃｔｔａｃｇｇｇｔａｇｔｔｇ−３（配列番号２５）。次いで、上記ＰＣＲ産物に、アガロースゲル電気泳動をかけて、エチジウムブロミド染色で可視化した。ラット肝臓組織を、陽性コントロールとして使用した。
【００６９】
（過ヨウ素酸シッフ染色）
グリコーゲン貯蔵についての過ヨウ素酸シッフ染色を、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞およびＴｈｙ１．１陰性細胞、ならびに肝臓分化２１日目のＴｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団に対して行った。ヒト肝臓切片を、陽性コントロールとして使用した。細胞を、４％ パラホルムアルデヒド中、室温で１０分間にわたって固定した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間にわたって透過性にし、ＰＢＳで２回およびｄｄＨ２Ｏで１回洗浄した。細胞を、過ヨウ素酸溶液（１ｇ／ｄＬ）に室温で５分間浸漬した。ウェルを、蒸留水で３回すすいだ。細胞を、シッフ試薬中に室温で１５分間浸漬した。細胞を、水道の流水で５分間洗浄した。細胞をヘマトキシリン溶液で９０秒間、対比染色した。水道の流水で１５〜３０秒間、細胞をすすぐ。
【００７０】
（結果）
（Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団の特徴付け）
ＰＤＰＣのＭＡＣソーティングを使用して、それぞれ、Ｔｈｙ１．１陽性細胞を発現する集団を９８．５％超で、およびＴｈｙ１．１陰性細胞を発現する集団を９８．７％純度で単離した。次いで、これら集団を培養し、いかなる分化実験もしくは特徴付け実験の前にも、１０〜１２日ごとに定期的にフローサイトメトリーによって再評価した。
【００７１】
表現型的には、Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団は、形態学において別個の差異を示した：上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、線維芽細胞様形態を示した（図１，パネルＡ）一方で、Ｔｈｙ１．１陰性集団は、より上皮様の形態を示した（図１，パネルＤ）。
【００７２】
いくつかの差異がまた、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団と、Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団との間で、細胞表面マーカーの発現において認められた。両方の細胞系統は、ＣＤ１４７、ＣＤ４４およびＣＤ４９ｆを発現した。両方とも、ＣＤ７１は低く、造血（ｈａｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ）マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびｃ−ｋｉｔを発現しなかった。上記Ｔｈｙ１．１陽性ソートした細胞集団とは対照的に、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団は、ＣＤ２４について陽性であった（図２ａおよび２ｂ）。上記亜集団はまた、肝性マーカー、胆嚢マーカーおよび間葉性マーカーであるアルブミン、ビメンチン、ＣＫ７およびＣＫ１９での免疫細胞化学によって評価した（図３）。
【００７３】
両方のＴｈｙ１．１ソートした集団は、アルブミン、ＣＫ７およびビメンチンについて陰性であった（図３−パネルＢ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、ＪおよびＫ）。上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、ＣＫ１９についても陰性であった（図３，パネルＯ）のに対して、上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、弱陽性であった（図３，パネルＮ）。両方の集団は、ＲＴ ＰＣＲによって、ｃ−Ｍｅｔおよびネスチンについて陽性であった（データは示さず）。
【００７４】
まとめると、上記Ｔｈｙ１．１陰性細胞集団は、以下の細胞表面マーカープロフィールを発現する：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陰性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 約８０％＋
ＣＤ１４７ 約８０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約６０％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
ｃ−Ｋｉｔ 陰性
ｃｋ７ 陰性
ＣＫ１９ 弱陽性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
上記Ｔｈｙ１．１陽性細胞は、以下の細胞表面マーカープロフィールを発現する：
Ｔｈｙ１．１（ＣＤ９０） 陽性
Ｐｄｘ−１ 陽性
ＣＤ４９ｆ 約９５％＋
ＣＤ２４ 陰性
ＣＤ１４７ 約９０％＋
ＣＤ４５ 陰性
ＣＤ４４ 約８５％＋
ＣＤ７１ 低い
ＣＤ３１ 陰性
Ｃ−ＫＩＴ 陰性
ＣＫ１９ 陰性
ｃ−Ｍｅｔ 陽性
ネスチン 陽性。
【００７５】
（Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団の分化能）
（膵臓分化）
Ｔｈｙ１．１陽性集団およびＴｈｙ１．１陰性集団は、膵臓分化培地において顕著に異なる形態学的変化を示した。上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、形態において最初に線維芽細胞様を示し、１４〜２１日目までに絡み合った細胞クラスタを形成し、２８日目までに島様の球形クラスタへと形成された。これは、最終的に、親細胞層から分離した（図１，パネルＤ、Ｈ、Ｉ）。対照的に、上記Ｔｈｙ−１．１陰性細胞は、小さな上皮様形態を有する単層のままであり、三次元構造へと発展しなかった（図１，パネルＡおよびＢ）。
【００７６】
未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析は、陽性Ｐｄｘ−１発現を示したが、インスリンの発現もグルカゴンの発現も示さなかった（図４−Ｂ）。分化した細胞クラスタは、３種のマーカー全ての転写発現について全て陽性であった（図４ パネルＢ）。
【００７７】
しかし、Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、維持培地もしくは分化培地のいずれかで増殖させた場合に、Ｐｄｘ−１を発現した。著しいことには、分化培地中で増殖させた場合、形態学的な変化を示さないにも拘わらず、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団においてインスリン転写が検出された。グルカゴンは、上記未分化のＴｈｙ−１．１陰性細胞において発現せず、分化後にインビトロで誘導もされなかった（図４ パネルＡ）。
【００７８】
（肝臓分化）
Ｔｈｙ−１．１陽性ＰＤＰＣおよびＴｈｙ−１．１陰性ＰＤＰＣを、血清非含有ＦＧＦ４含有培地中で培養して、肝性の能力を評価した。Ｔｈｙ−１．１陽性細胞は、線維芽細胞様から上皮／立方形形態へと形態学的変化を示した。さらに、２８日目までには、平らになった上皮との培養全体を通じて、管腔構造が明らかになった。上記膵臓分化プレートにおいて認められるものに類似したときおりの三次元島様構造が、肝臓分化プレートにおいても認められた。上記Ｔｈｙ−１．１陰性集団は、単層のままであり、三次元構造も管腔様構造も明らかでなく、顕著な形態学的変化もなかった（図１Ａ，Ｃ）。
【００７９】
本発明者は、ＲＴ−ＰＣＲによって２８日間にわたって、上記２つの集団の分化をさらに試験した。ＲＴ−ＰＣＲを、内胚葉特異的遺伝子であるＨＮＦ３βおよびＧＡＴＡ ４、初期肝臓マーカーであるαフェトプロテインおよびＣＫ１８、成熟肝臓マーカーであるＨＮＦ１α、アルブミンおよびシトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｂ１について行った。未分化のＴｈｙ１．１陰性細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＨＮＦ３−βおよびＣＫ１９を発現したが、アルブミン、ＣＫ１８、ＨＮＦ１α、ＣＹ２Ｂ１、Ｇａｔａ４およびαフェトプロテインを発現しなかった（図５，パネルＢ）。他の初期肝臓マーカーもしくは成熟肝臓マーカー、またはＣＹ２Ｂ１のいずれも、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団において誘導されなかった。興味深いことには、未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、初期内胚葉マーカーであるＨＮＦ３−β、ＧＡＴＡ ４およびαフェトプロテインを発現したが、肝臓分化の１４日目までに、肝細胞分化の後期マーカーであるＨＮＦ１−αおよびアルブミンを発現しなかった（図５ パネルＡ）。ＣＫ １９（胆嚢細胞によって正常に発現される）はまた、培養における上記管腔構造の出現と一致して、１４〜２８日目の間に誘導された。アルブミン発現の誘導は、免疫細胞化学によって確認された。未分化の細胞は、アルブミン内容物について陰性に染色される（図３，パネルＡ）一方で、１４日目の分化した細胞は、アルブミン染色について強く陽性であった（図３，パネルＤ）。興味深いことには、１０日目および１４日目の時点で分化した細胞は、胆嚢マーカーであるＣＫ１９およびＣＫ７について陰性に染色された（図３，パネルＮおよびＧ）が、上記管腔様構造のみにおいてビメンチンについては陽性に染色された（図３，パネルＬ）。ＣＫ １８はまた、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞において、および上記２８日間の分化期間全体を通じて発現した。ＣＹＰ２Ｂ１は、未分化のＴｈｙ１．１陽性細胞において、および上記分化期間全体を通じて存在した。
【００８０】
未分化のＴｈｙ１．１陰性細胞は、免疫細胞化学によれば、ＣＫ７、ビメンチンおよびアルブミンの発現について陰性であり、ＣＫ１９について弱陽性であった。上記Ｔｈｙ１．１陽性集団は、ＣＫ１９について陰性であった。
【００８１】
（グリコーゲン貯蔵についての過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色）
貯蔵グリコーゲンの存在は、ＰＡＳ染色によって決定される場合、Ｔｈｙ−１．１陽性ＰＤＰＣでもＴｈｙ−１．１陰性ＰＤＰＣでも認められず、２１日目の分化したＴｈｙ−１．１陰性細胞においても認められなかった。しかし、グリコーゲン貯蔵を示す、ＰＡＳでの陽性染色は、２１日目までに上記Ｔｈｙ１．１陽性の分化した細胞において認められた（図６）。
【００８２】
（糖尿病の動物モデルにおける細胞亜集団の試験）
本明細書に記載の細胞亜集団（例えば、Ｔｈｙ１．１陽性細胞集団もしくはＴｈｙ１．１陰性細胞集団）は、糖尿病のような疾患の動物モデルにおいて使用されうる。一実施形態において、細胞の亜集団は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性の糖尿病の齧歯類和合（ｒｏｄｅｎｔ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）異種移植片モデルにおいて使用される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目にＳＴＺを注射することによって糖尿病にする一方で、７５０，０００個の細胞（例えば、Ｔｈｙ１．１陽性細胞）を、３日目に、処置した動物の尾静脈に注射する。コントロール動物に、生理食塩水の注射を与えるか、または等数のＣ５７ＢＬ／６骨髄細胞を与える。３日ごとに血糖をモニターする。血糖の安定化および／もしくはコントロールに対して増大した生存は、上記投与した細胞が、上記動物においてインスリン生成をもたらすことを示す。
【００８３】
（考察）
本明細書で提供されるのは、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ亜集団およびＴｈｙ１．１陰性ＰＤＰＣ亜集団のインビトロ培養、選択および特徴付けに関する詳細である。さらに、膵臓系統および肝臓系統への分化、ならびにマーカーＴｈｙ１．１（これは、インビトロで系統への両能性を示す）を使用してソートした細胞集団の提供に関するそれらの効力について詳細が開示される。
【００８４】
Ｔｈｙ１．１は、機能が明らかには理解されていない細胞表面タンパク質である。しかし、細胞認識（Ｇｕｎｔｅｒら，１９８４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９８５）、細胞接着（Ｇｕｎｔｅｒら， １９８４； Ｗｉｌｌｉａｍｓ， １９８５）（Ｈｅら，１９９１；Ｈｕｅｂｅｒら，１９９２）およびシグナル伝達（Ｋｒｏｃｚｅｋら，１９８６）に関与していることが示唆された。Ｔｈｙ１．１発現は種々の幹細胞集団において認められ、顕著には、成体ラット肝臓における円形細胞集団は、Ｔｈｙ１．１が、潜在的に損傷後の修復細胞として、細胞が間質組織を認識しかつこれに接着することを可能にし得るという仮説をもたらした（Ｍａｓｓｏｎら，２００６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９９８；Ｔｅｒｒａｃｅら，２００７）。Ｔｈｙ１．１はまた、ヒト、マウスおよびラットにおける胎児肝臓の幹細胞、臍帯血および間葉性幹細胞上で発現される。Ｔｈｙ１．１陽性集団内のより大きなインビトロ効力における本知見は、これら観察と一致している。これら観察はまた、このような細胞のさらなる使用を可能にするために、単離および精製のための方法もまた、示す。
【００８５】
以前の研究から、多くの異なる細胞タイプ（骨髄由来ＭＳＣ、ＭＡＰＣ、子宮内膜および膵臓由来のＭＳＣを含む）の肝臓分化が示された（Ｊｉａｎｇら，２００２；Ｍｅｎｇら，２００７；Ｓｃｈｗａｒｔｚら，２００２；Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら，２００６）。ＰＤＰＣの（Ｊｉａｎｇら， ２００２； Ｍｅｎｇら， ２００７； Ｓｃｈｗａｒｔｚら， ２００２； Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒら， ２００６）Ｔｈｙ１．１陽性亜集団は、形態学的表現型を共有し、これら集団とともに多くの細胞表面マーカーを発現する（ＣＤ４４＋、ＣＤ２４−、ＣＤ４５−、ＣＤ３１−およびＣＤ３４を含む）。しかし、このこととは対照的に、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３−βおよびαフェトプロテインを発現する別個の細胞タイプであるようであり、これは、これら他の細胞タイプのうちのいずれかについて発現される場合に記載されていない。
【００８６】
ＨＮＦ３−βは、内胚葉能力において重要な役割を果たすと考えられている完全な兄はいようのマーカーである（Ｇｕａｌｄｉら １９９６）一方で、ＧＡＴＡ４は、腹側前腸内胚葉発生および初期肝臓遺伝子発現について必要とされる転写因子である（Ｇｕａｌｄｉら，１９９６；Ｒｏｓｓｉら，２００１）。ＨＮＦ３−βは、上記アルブミンエンハンサーへのＧＡＴＡ４の結合のその後の促進とともに、アルブミンエンハンサーの前後に位置しているヌクレオソームに指向されることが示された（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９６；Ｃｉｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｚａｒｅｔ，１９９９）。ＧＡＴＡ４−／−胚およびＨＮＦ３−β−／−胚の両方は、前腸形態発生の欠損を示す（Ｄｕｎｃａｎら，１９９７）。従って、未分化のＰＤＰＣにおけるＨＮＦ３−βおよびＧＡＴＡ４の発現、ならびにその後の肝臓特異的遺伝子（例えば、アルブミンおよびＨＮＦ１−α）の発現のＦＧＦ刺激誘導は、ＨＮＦ ３−βおよびＧＡＴＡ ４が、これら細胞が肝臓へと発達する結果（ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｔｅ）になる可能性を制御するように協同して作用するという提唱と一致する。さらに、分化の２１日後の上記Ｔｈｙ１．１陽性集団におけるＰＡＳ染色の存在は、より成熟した肝細胞の機能的特徴を示した。このことは、ＨＮＦ１−αの発現と一致する。ＨＮＦ１−αは、遺伝子産物が成熟肝機能（炭水化物貯蔵および合成、ならびに脂質代謝を含む）と関連する遺伝子に結合することが公知である（Ｏｄｏｍら，２００４）。
【００８７】
未分化のＴｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、ＡＦＰを発現する。この観察は、初期腹側前腸内胚葉における肝形成の前に、ネスチン陽性島由来の前駆細胞におけるＡＦＰ発現、ならびに低レベルのＡＦＰおよびＴＴＲ発現を記載する報告と一致する。この発現は、その後、心臓の中胚葉シグナル伝達から分離された内胚葉において失われる（Ｇｕａｌｄｉら，１９９６；Ｊｕｎｇら，１９９９；Ｚｕｌｅｗｓｋｉら，２００１）。このことは、腹側前腸内胚葉の標準的な（ｄｅｆａｕｌｔ）膵臓となる運命の特徴であることもまた、示唆された（Ｄｅｕｓｃｈら）。前記Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣ集団におけるＡＦＰの発現（これは、膵臓系統および肝臓系統の両方への能力を示す）は、この知見と矛盾しない（Ｄｅｕｔｓｃｈら，２００１）。
【００８８】
重大なことには、上記未分化のＴｈｙ１．１陰性集団は、ＨＮＦ３βを発現するが、ＧＡＴＡ ４も、αフェトプロテインも発現せず、上記分化実験の間に誘導されなかった。肝臓の能力の証拠は、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団において認められなかった。このことは、この未分化の集団内でのＰｄｘ−１発現、およびＧａｔａ４発現の非存在と一致する。ビメンチンは、未分化のＴｈｙ１．１陽性集団においても、Ｔｈｙ１．１陰性集団においても発現されなかったが、肝臓分化の間に管様構造を形成する細胞において発現された。ビメンチンは、間葉マーカーを表すと考えられる。しかし、Ｍａｓｓｏｎらは、肝門構造（ｐｏｒｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）におけるＴｈｙ１．１およびビメンチンの発現を観察し、組織切片内の上皮細胞における、および胎児肝臓上皮細胞の培養物におけるビメンチン発現も示した（Ｍａｓｓｏｎら，２００６）。（Ｍａｓｓｏｎら， ２００６）
上記膵臓分化に関するデータは、興味をそそるものである。島様クラスタの形態学的な証拠は、上記Ｔｈｙ１．１陰性集団において認められなかった。対照的に、Ｔｈｙ１．１陽性ＰＤＰＣは、三次元島様構造およびＰＤＸ−１、インスリンおよびグルカゴンの転写発現を生じる特徴的な形態学的変化とともに、容易に膵臓系統へと誘導できた。
【００８９】
両方の集団におけるＰｄｘ−１転写発現の検出は、それらがインスリン生成細胞になる可能性を示す。しかし、顕著なことには、Ｔｈｙ１．１陰性細胞は、分化培地中で増殖される場合、形態学的屁かを示さないにも拘わらず、インスリンを発現した。グルカゴンは、上記未分化のＴｈｙ−１．１陰性細胞において発現されず、分化後にインビトロで誘導もされなかった（図４ パネル）。
【００９０】
膵臓前駆細胞／幹細胞の種々の異なる候補集団が、以前から記載されてきた（ネスチンもしくは他の神経幹細胞マーカーを発現する島前駆細胞を含む）（Ａｂｒａｈａｍら，２００４；Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓら，１９９７；Ｌｅｃｈｎｅｒら，２００２；Ｒａｍｉｙａら，２０００）。別の集団は、ＰＤＸ−１（インスリン生成細胞についての公知のマーカー）を発現することが示された。そしてこれら細胞は、適切な条件下で、インビトロで導管および内分泌腺分化の両方を刺激し得る（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら，２０００；Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉら，１９９３）。さらに、膵管の上皮細胞が、新たな島および腺房の増殖および形成の能力がある前駆細胞へ分化する能力を有するという証拠が存在し（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら，２００４）、もっとも近年では、（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら， ２００４）ＣＫ１９＋ 非ナイン分泌性膵臓上皮細胞（ＮＥＰＣ）が、胎児膵臓組織の存在下にある場合、インビボでインスリン生成細胞へと分化するように部分的に誘導されることが報告された（Ｈａｏら，２００６）。
【００９１】
これら細胞が果たす正確な生理学的役割が探究されてきた。Ｄｏｒらは、新たな島細胞生成よりむしろβ細胞複製が、優勢な機構である（これによって、膵臓内分泌組織が、ほぼ完全な膵切除術後に再生する）という議論の代わりに、導管細胞もしくは前駆細胞からの再生が生じるという見方を吟味してきた（Ｄｏｒら，２００４）が、この解釈は、未だ論議の的である（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｗｅｉｒ，２００５）。本知見は、このようなプロセスを潜在的に促進する場合に、インスリンを生成し得る非β細胞の役割と一致する。これら細胞が移植治療の代替のインスリン生成細胞供給源を提供することは明らかである。
【００９２】
本発明者は、無血清ＦＧＦ−４含有分化プロトコルの使用によって、肝臓系統分化を示す、形態学的発現変化および遺伝子発現変化の両方の過程を観察した。膵臓分化および肝臓分化についての胚性腹側内胚葉の潜在的な両能性は、腹側内胚葉が心臓中胚葉への近接によって肝臓系統へ分化した外植片実験において調査された。心臓中胚葉によって分泌される誘導因子（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−４）の非存在は、腹側内胚葉の標準的な膵臓経路が継続することを可能にし（Ｄｅｕｔｓｃｈら，２００１）、そして一般的なＦＧＦシグナル伝達アンタゴニストは、インビトロでの肝発生（Ｊｕｎｇら，１９９９）およびＦＧＦ−４（Ｚｈｕら，１９９９）を阻害する。本データは、この概念と完全に一致する。
【００９３】
本発明者は、両能性のある内胚葉前駆体の集団と一致して、インビトロで、効力およびシグナル伝達に対する転写応答を示すＰＤＰＣの単離および特徴付けを示した。前述で、マウスストレプトゾトシン誘導性糖尿病モデルにおける、ソートしていないＰＤＰＣ集団の投与は、分化およびラットインスリンの生成と同時に、マウス膵臓再生の刺激を実証した（Ｓｈｉｅｌｓ ２００５およびＷＯ ２００６／１２０４７６（ともに、本明細書に参考として援用される））。
【００９４】
参考文献のリスト
【００９５】
【化１】
【００９６】
【化２】
【００９７】
【化３】
【００９８】
【化４】
【００９９】
【化５】
【０１００】
【化６】
【０１０１】
【化７】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図３Ｎ】
【図３Ｏ】
【図３Ｐ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体組織に由来する単離された細胞集団であって、ここで該細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき；該細胞は、Ｐｄｘ−１陽性であることで特徴付けられる、単離された細胞集団。
【請求項２】
前記細胞は、ネスチン陰性である、請求項１に記載の単離された細胞集団。
【請求項３】
前記細胞は、ネスチン陽性である、請求項１に記載の単離された細胞集団。
【請求項４】
前記成体組織は、膵臓組織、骨髄組織、心臓組織、乳房組織、肝臓組織もしくは腎臓組織である、上記請求項のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項５】
前記成体組織は、ヒトのものである、請求項３に記載の単離された細胞集団。
【請求項６】
前記成体組織は、膵臓組織である、請求項４に記載の単離された細胞集団。
【請求項７】
前記細胞は、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣにおいてアクセッション番号Ｑ６２０３の下で寄託された細胞に由来する、請求項６に記載の単離された細胞集団。
【請求項８】
前記細胞は、細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陽性である、上記請求項のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項９】
前記細胞は、細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陰性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項１０】
上記請求項のいずれか１項に記載の単離された細胞集団および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
成体哺乳動物組織から両能性のある幹細胞集団を単離する方法であって、該方法は、
該成体哺乳動物組織を培養する工程；
発生する細胞集団単層を単離する工程；および
細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陽性である細胞をさらに単離し、それによって、両能性のある幹細胞集団を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記単離された細胞は、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９Ｆ、Ｃ−Ｍｅｔおよびネスチンからなる群より選択される１種以上の細胞表面マーカーについても陽性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記成体哺乳動物組織は、ヒトのものである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記成体哺乳動物組織は、膵臓、乳房、肝臓もしくは腎臓からなる群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織は、ＣＭＲＬ−１０６６培地（ｓｉｇｍａ−Ｃ−０４２２）中で培養される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織は、管全体（ｗｈｏｌｅ ｄｕｃｔ）を含む成体膵管に由来する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記管組織は、前記培養工程を補助するために切り刻まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
両能性のある幹細胞集団を単離する方法であって、該方法は、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣにおいてアクセッション番号Ｑ６２０３の下で寄託されたような細胞集団を得る工程；および細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陽性である細胞の亜集団を単離する工程、を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、成体細胞集団。
【請求項２０】
細胞変性もしくは加齢性組織変化と関連する疾患状態を処置する方法であって、該方法は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞集団もしくは請求項１０に記載の薬学的組成物を、該疾患を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記細胞は、前記患者に静脈内投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、前記疾患部位もしくは加齢性変性の部位に移植される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患は、膵臓細胞、ニューロン細胞、心血管細胞、上皮細胞、肝細胞、筋細胞、網膜細胞、毛包細胞もしくは腎細胞の変性と関連する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患は、糖尿病（Ｉ型もしくはＩＩ型）、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎疾患、眼の疾患、肝疾患もしくは心血管疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞のドナーおよび前記患者は、同じ種である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者はヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項９に記載の成体幹細胞集団を、成体哺乳動物組織から単離する方法であって、該方法は、
該成体哺乳動物組織を培養する工程；
発生する細胞集団単層を単離する工程；および
細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陰性である細胞をさらに単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記単離された細胞は、ＣＤ１４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４４、ＣＫ１９、Ｃ−Ｍｅｔおよびネスチンからなる群より選択される１種以上の細胞表面マーカーについて陽性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記成体哺乳動物組織は、ヒトのものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記成体哺乳動物組織は、膵臓、乳房、肝臓もしくは腎臓からなる群より選択される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項９に記載の成体幹細胞集団を単離する方法であって、該方法は、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣにおいてアクセッション番号Ｑ６２０３の下で寄託されたような細胞集団を得る工程；および細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陰性である細胞の亜集団を単離する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
処置方法において使用するための、請求項８に記載の単離された成体幹細胞集団。
【請求項３３】
前記処置方法は、膵臓細胞もしくは肝細胞の変性と関連する疾患のためである、請求項３２に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３４】
処置方法において使用するための、請求項９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３５】
前記処置方法は、糖尿病のためである、請求項３４に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３６】
前記処置方法は、前記細胞を疾患部位に移植する工程を包含する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項１】
成体組織に由来する単離された細胞集団であって、ここで該細胞は、血清の存在下でマトリゲルなしの培養システムにおいて増殖でき；該細胞は、Ｐｄｘ−１陽性であることで特徴付けられる、単離された細胞集団。
【請求項２】
前記細胞は、ネスチン陰性である、請求項１に記載の単離された細胞集団。
【請求項３】
前記細胞は、ネスチン陽性である、請求項１に記載の単離された細胞集団。
【請求項４】
前記成体組織は、膵臓組織、骨髄組織、心臓組織、乳房組織、肝臓組織もしくは腎臓組織である、上記請求項のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項５】
前記成体組織は、ヒトのものである、請求項３に記載の単離された細胞集団。
【請求項６】
前記成体組織は、膵臓組織である、請求項４に記載の単離された細胞集団。
【請求項７】
前記細胞は、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣにおいてアクセッション番号Ｑ６２０３の下で寄託された細胞に由来する、請求項６に記載の単離された細胞集団。
【請求項８】
前記細胞は、細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陽性である、上記請求項のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項９】
前記細胞は、細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陰性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項１０】
上記請求項のいずれか１項に記載の単離された細胞集団および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
成体哺乳動物組織から両能性のある幹細胞集団を単離する方法であって、該方法は、
該成体哺乳動物組織を培養する工程；
発生する細胞集団単層を単離する工程；および
細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陽性である細胞をさらに単離し、それによって、両能性のある幹細胞集団を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記単離された細胞は、ＣＤ１４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９Ｆ、Ｃ−Ｍｅｔおよびネスチンからなる群より選択される１種以上の細胞表面マーカーについても陽性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記成体哺乳動物組織は、ヒトのものである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記成体哺乳動物組織は、膵臓、乳房、肝臓もしくは腎臓からなる群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織は、ＣＭＲＬ−１０６６培地（ｓｉｇｍａ−Ｃ−０４２２）中で培養される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織は、管全体（ｗｈｏｌｅ ｄｕｃｔ）を含む成体膵管に由来する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記管組織は、前記培養工程を補助するために切り刻まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
両能性のある幹細胞集団を単離する方法であって、該方法は、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣにおいてアクセッション番号Ｑ６２０３の下で寄託されたような細胞集団を得る工程；および細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陽性である細胞の亜集団を単離する工程、を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、成体細胞集団。
【請求項２０】
細胞変性もしくは加齢性組織変化と関連する疾患状態を処置する方法であって、該方法は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞集団もしくは請求項１０に記載の薬学的組成物を、該疾患を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記細胞は、前記患者に静脈内投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、前記疾患部位もしくは加齢性変性の部位に移植される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患は、膵臓細胞、ニューロン細胞、心血管細胞、上皮細胞、肝細胞、筋細胞、網膜細胞、毛包細胞もしくは腎細胞の変性と関連する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患は、糖尿病（Ｉ型もしくはＩＩ型）、パーキンソン病、アルツハイマー病、腎疾患、眼の疾患、肝疾患もしくは心血管疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞のドナーおよび前記患者は、同じ種である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者はヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項９に記載の成体幹細胞集団を、成体哺乳動物組織から単離する方法であって、該方法は、
該成体哺乳動物組織を培養する工程；
発生する細胞集団単層を単離する工程；および
細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陰性である細胞をさらに単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記単離された細胞は、ＣＤ１４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４４、ＣＫ１９、Ｃ−Ｍｅｔおよびネスチンからなる群より選択される１種以上の細胞表面マーカーについて陽性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記成体哺乳動物組織は、ヒトのものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記成体哺乳動物組織は、膵臓、乳房、肝臓もしくは腎臓からなる群より選択される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項９に記載の成体幹細胞集団を単離する方法であって、該方法は、２００５年５月１２日にＥＣＡＣＣにおいてアクセッション番号Ｑ６２０３の下で寄託されたような細胞集団を得る工程；および細胞表面マーカーＴｈｙ１．１について陰性である細胞の亜集団を単離する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
処置方法において使用するための、請求項８に記載の単離された成体幹細胞集団。
【請求項３３】
前記処置方法は、膵臓細胞もしくは肝細胞の変性と関連する疾患のためである、請求項３２に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３４】
処置方法において使用するための、請求項９に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３５】
前記処置方法は、糖尿病のためである、請求項３４に記載の単離された幹細胞集団。
【請求項３６】
前記処置方法は、前記細胞を疾患部位に移植する工程を包含する、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の単離された幹細胞集団。
【図４】
【図５】
【図６】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５１９５７４（Ｐ２０１１−５１９５７４Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０７９８７（Ｐ２０１１−５０７９８７）
【出願日】平成２１年５月８日（２００９．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１１４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６１６８
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５０６２７７５９１）ザ ユニバーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ グラスゴー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月８日（２００９．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１１４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６１６８
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５０６２７７５９１）ザ ユニバーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ グラスゴー (1)
【Ｆターム（参考）】
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