腱及び／又は靭帯細胞の分化誘導剤
【課題】腱及び／又は靭帯細胞の分化誘導剤、並びに分化誘導剤を含む腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【解決手段】腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤は、（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクターの少なくとも一種を有効成分として含む。
【解決手段】腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤は、（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクターの少なくとも一種を有効成分として含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腱及び／又は靭帯細胞の分化誘導剤、分化誘導剤を用いた医薬、分化誘導剤を用いたスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腱は筋肉と骨とを結合する組織であり、靱帯は骨と骨とを結合する組織である。これらの組織は、力や運動を伝達するという重要な機能を持っている。腱や靱帯は、酷使や加齢によって損傷し、また減少するが、栄養血管が少ないため、腱の治癒力は非常に弱く、完治が極めて難しい。腱細胞の分化機構等の生物学的理解も不十分であるため、現在、再生医療等の治療法は確立していない。
【０００３】
腱や靱帯は、コラーゲン原線維がクロスリンクしてできる線維でできている。腱の線維間には腱細胞が僅かに存在し、コラーゲン、プロテオグリカン等の細胞外基質の産生を行っている。腱の大部分を構成するコラーゲンは、腱に弾性力を与えるが、そのほとんどはＩ型コラーゲンである。プロテオグリカンは、腱においてはｄｅｃｏｒｉｎ、ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ、ｂｉｇｌｙｃａｎ、ｌｕｍｉｃａｎ等が存在し、コラーゲン線維同士の結合や集合に関与している。プロテオグリカンの遺伝子欠損マウスでは、腱のコラーゲン原線維の異常が観察される。エーラスダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ）症候群に代表されるコラーゲン産生に異常を有する疾患患者に腱の障害が報告されている。腱細胞における細胞外基質の産生は、腱の形成にとって重要であることが示唆される。
【０００４】
近年、腱及び靭帯細胞並びに腱及び靭帯前駆細胞で発現するｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ（ｂＨＬＨ）型の転写因子であるＳｃｌｅｒａｘｉｓ（Ｓｃｘ）が腱発生に重要な因子であることが報告され、Ｓｃｘノックアウトマウスでは、腱の著しい形成不全が観察された（非特許文献１）。また、腱の主成分であるＩ型コラーゲンを直接誘導することが示唆された（非特許文献２）。しかし、Ｓｃｘノックアウトマウスは、後述の実施例に示すように、腱においてすべてのＩ型コラーゲンが消失するわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｓｅｒｊｅｓｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ： ａ ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｐｒｅｆｉｇｕｒｅｓ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１（４） ｐ１０９９−１１１０
【非特許文献２】Ｌｅｊａｒｄ Ｖ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ ａｎｄ ＮＦＡＴｃ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ１（Ｉ） ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｅｎｄｏｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（２４） ｐ１７６６５−１７６７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腱及び靭帯細胞は、Ｉ型コラーゲン等の基質を産生する細胞であって、それぞれ、腱及び靭帯組織の形成及び維持に関与する。腱及び靭帯は、上記したように再生能の低い組織であり、腱及び靭帯疾患治療に向けての再生医療が望まれる。Ｓｃｘは、腱及び靭帯細胞で発現し、腱及び靭帯の主成分であるＩ型コラーゲンの発現を誘導することが示唆されるものの、他のＩ型コラーゲンの発現調節因子の存在が示唆される等、腱発生のメカニズムには未解明な部分が多いのが現状である。腱及び靭帯細胞への分化誘導方法も、確立されていない。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、腱及び／又は靭帯細胞の分化誘導剤、並びに該分化誘導剤を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明の目的は、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞へ分化誘導させるために使用する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、腱及び靭帯細胞への分化方法の確立には、分化に重要な遺伝子を特定し、その遺伝子を導入又は誘導することが重要であると考えた。本発明者らは、後述の実施例に示すように、Ｍｋｘ遺伝子を破壊すると、腱組織と腱細胞のＩ型コラーゲン生産量が減少し、逆に細胞内に過剰発現させると、Ｉ型コラーゲン量が増大することを発見した。Ｍｋｘは、従来、胎生期において腱に発現するホメオボックス型の転写因子として知られていたが、Ｍｋｘが腱細胞においてその分化を制御しＩ型コラーゲンの発現を調節する重要な因子であることが初めて明らかとなった。これらの知見をもとに、本発明者らは、以下の発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、
（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクター
の少なくとも一種を有効成分として含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤を提供する。
【００１１】
上記分化誘導剤は、
（Ａ１）Ｓｃｘタンパク質、
（Ｂ１）前記Ｓｃｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、Ｉ型コラーゲンを誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ１）前記（Ａ１）又は（Ｂ１）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ１）前記（Ｃ１）の核酸を含む発現ベクター、
の少なくとも一種をさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明は、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞の生育に適した条件下で、上記分化誘導剤を用いて前記細胞を培養する工程、及び前記培養された細胞の中から、腱及び／又は靭帯細胞を選択する工程を含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する方法を提供する。
【００１３】
前記細胞は、例えば繊維芽細胞、腱前駆細胞、靱帯前駆細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、体性幹細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である。
【００１４】
本発明は、また、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤を含む腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【００１５】
上記腱又は靭帯関連疾患は、例えばエーラスダンロス症候群である。
【００１６】
本発明は、また、上記分化誘導方法により得られる、腱及び／又は靭帯細胞を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【００１７】
上記腱又は靭帯関連疾患は、例えばエーラスダンロス症候群である。
【００１８】
本発明は、また、Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む、腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【００１９】
前記機能的に欠損したＭｋｘ遺伝子は、Ｍｋｘ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたことにより腱細胞特異的にレポーター遺伝子を発現することが好ましい。
【００２０】
前記レポーター遺伝子は、例えばＶｅｎｕｓ遺伝子である。
【００２１】
本発明は、また、上記分化誘導剤を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法を提供する。
【００２２】
本発明は、また、上記分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法を提供する。
【００２３】
本発明は、また、上記遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法を提供する
【００２４】
本発明は、また、被験物質の存在下又は非存在下で、上記分化誘導方法を行い、該被験物質存在下又は非存在下での腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を比較することを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。
【００２５】
上記スクリーニング又は評価する方法は、例えば被験物質の存在下で培養した細胞における、Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量を測定すること、並びに前記被験物質を非存在下で培養した細胞内の量と比べて、前記測定した量が多い又は少ない場合に、前記被験物質を腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質として選択することを含む。
【００２６】
本発明は、また、上記遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞を用いることを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。
【００２７】
上記スクリーニング又は評価する方法は、例えば遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞に被験物質を接触させること、及びノックインされたレポーター遺伝子の発現を上昇又は低下させる被験物質を選択することを含む。
【発明の効果】
【００２８】
関節の再生等の医学において、腱や靱帯は筋・骨格をつなぐ重要な組織である。そして、Ｍｋｘ遺伝子を過剰発現させると、腱の主要コンポーネントであるＩ型コラーゲンの発現が上昇することから、Ｍｋｘは腱の成熟過程において重要であることが示唆される。損傷した腱や靱帯の部位にＭｋｘ及びその上流・下流遺伝子等からなる医薬を外来的に導入することで、腱の治癒、運動器の再生や再建を促進することが期待される。
【００２９】
エーラスダンロス症候群等の腱及び／又は靭帯関連疾患に罹患している患者から採取した細胞を用いて、本発明の分化誘導剤で自家腱及び／又は靭帯細胞を製造することもでき、結果として該疾患に対する再生医療が可能となる。
【００３０】
Ｍｋｘ遺伝子が腱細胞や靱帯細胞特異的に蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子で置き換えられている本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、蛍光タンパクの発光を指標にＭｋｘを調節する被験物質のスクリーニングや評価、腱損傷モデル実験等における治癒過程でのＭｋｘの局所的な発現をモニターするためのモデル動物として有用である。
【００３１】
分化誘導剤や分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を用いて、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法は、腱分化の分子メカニズム理解の基礎となり、腱の障害やエーラスダンロス症候群等の腱関連疾患の治療標的発見を導くきっかけとなるかもしれない。
【００３２】
Ｍｋｘは、腱の発生・成熟に重要であることから、腱・靱帯等の疾患等で、Ｍｋｘそのものの遺伝子配列又はＭｋｘの遺伝子ネットワークに関与する上流及び下流遺伝子等の遺伝子に異常を起こしている可能性が大きい。それらの探索、診断、治療に、本発発明のスクリーニング方法が応用される。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法によって選択された物質や本発明の医薬によれば、腱又は靭帯関連疾患、特にＭｋｘに異常を抱える疾患を、予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】Ｍｋｘ変異マウスを作製するために設計するＭｋｘターゲッティングコンストラクトの一例を示す。ここで、矢印ａ〜ｅはジェノタイピング用ＰＣＲプライマー、□はＵＴＲ、■は翻訳領域、ＤＴ−ＡはジフテリアトキシンＡ、ＷＴは野生型アリル、ＴＡはターゲッティングされたアリルを意味する。
【図１Ｂ】野生型マウスとＭｋｘ変異マウスでの図１Ａのプライマーａ、ｂ及びｃを用いたゲノミックＰＣＲ（図面代用写真）を示す。
【図１Ｃ】上段は、野生型マウスの胚のＥ１３．５前肢（Ｆｏｒｅｌｉｍｂ）及び尾（Ｔａｉｌ）におけるＭｋｘのＷＩＳＨ（ホールマウント ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）（図面代用写真）を示し、そして下段は、野生型マウス及びＭｋｘ変異マウスのＶｅｎｕｓ蛍光シグナルの観察（図面代用写真）を示す。
【図１Ｄ】Ｅ１６．５のＶｅｎｕｓノックインへテロマウスの胚の尾におけるミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０；ｒｅｄ）を用いた免疫組織染色とＶｅｎｕｓ蛍光シグナルを観察した顕微鏡写真を示す。図中、○で囲んだ部分が筋肉のマーカー遺伝子であるミオシン重鎖発現細胞を示し、それ以外はＶｅｎｕｓ発現細胞の蛍光シグナルを示す。また、Ｂａｒは１００ μｍである。
【図１Ｅ】野生型マウスとＭｋｘ変異マウスのアキレス腱におけるＭｋｘのＲＴ−ＰＣＲ解析（図面代用写真）を示す。Ｇａｐｄｈは内在性コントールを示す。
【図２Ａ】３ヶ月齢の野生型マウスにおいて、膝蓋腱（Ａの矢印）、アキレス腱（Ｃの矢印、後肢（Ｅの矢印）、前肢の腱（Ｇの矢印）、尾腱（Ｉの矢印）、背中の腱（Ｋの矢印）及び広頸筋腱（Ｍの矢印）を観察した図面代用写真、並びに３ヶ月齢のＭｋｘノックアウトマウスにおいて、膝蓋腱（Ｂの矢印）、アキレス腱（Ｄの矢印、後肢（Ｆの矢印）、前肢の腱（Ｈの矢印）、尾腱（Ｊの矢印）、背中の腱（Ｌの矢印）及び広頸筋腱（Ｎの矢印）を観察した図面代用写真を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスでは、腱の異常が観察される。
【図２Ｂ】野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱の引張強度を測定したグラフである。
【図２Ｃ】野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のヤング率を測定したグラフである。
【図３Ａ】３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱のＨ＆Ｅ染色像（図面代用写真）を示す。ａ及びｃのバーは１ｍｍを意味し、ｂ及びｄのバーは５０μｍを意味する。Ｍｋｘ欠損マウスでは、腱の低形成が起きていることがわかる。
【図３Ｂ】７日齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱の厚さを測定したグラフである。Ｍｋｘノックアウトマウスは、膝蓋腱の厚さが有意に減少している。
【図３Ｃ】３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱のＨ＆Ｅ染色像（図面代用写真）を示す。ａ及びｃのバーは２００μｍを意味し、ｂ及びｄのバーは５０μｍを意味する。△矢頭は、尾腱の線維束を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスの尾腱の線維束は有意に細っている。
【図３Ｄ】３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度を測定したグラフである。
【図３Ｅ】Ｅ１８．５の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの胚の尾腱のアザン染色像（図面代用写真）を示す。△矢頭は尾腱の線維束を示す。また、左図のバーは５００μｍ、右図のバーは２００μｍを意味する。
【図３Ｆ】野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン原線維の電子顕微鏡観察像（図面代用写真）を示す。ここで、バーは２００ｎｍを意味する。
【図４Ａ】８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン量の測定結果を示す。Ｍｋｘ欠損腱細胞では、Ｉ型コラーゲン産生能が低下することがわかる。
【図４Ｂ】８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）とβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロット解析の結果（図面代用写真）を示す。
【図４Ｃ】８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２及びＳｃｘのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析結果を示す。
【図４Ｄ】ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクター（Ｍｋｘ）又は空ベクター（Ｅｍｐｔｙ）をトランスフェクションしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、ＦＬＡＧ及びβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロットの結果（図面代用写真）を示す。
【図４Ｅ】腱分化ネットワークの模式図を示す。
【図５Ａ】Ｍｋｘ変異ＥＳ又はマウスのサザンブロット解析のために、野生型（ＷＴ）及びターゲッティングされたアリル（ＴＡ）と各プローブの位置を示す。ここで、ＮはＮｃｏＩを意味し、ＳはＳａｃＩを意味する。
【図５Ｂ】組換え胚性幹細胞のサザンブロット解析結果（図面代用写真）を示す。ここで、ＴＡはターゲッティングされたアリルを意味し、ＷＴは野生型アリルを意味する。
【図５Ｃ】野生型マウス及びＭｋｘ変異マウスのサザンブロット解析結果（図面代用写真）を示す。
【図６Ａ】野生型マウス（成体）の筋肉、アキレス腱及び尾腱におけるＭｋｘのＲＴ−ＰＣＲ解析（図面代用写真）を示す。Ｍｋｘヘテロマウス（成体）のＶｅｎｕｓの発現は、Ｍｋｘ発現とリンクすることがわかる。Ｇａｐｄｈは内在性コントロールを示す。
【図６Ｂ】Ｍｋｘヘテロマウス及び野生型マウスのアキレス腱（Ｂ−Ｅ）、尾腱（Ｆ−Ｉ）及び体幹の腱（Ｊ−Ｍ）におけるＶｅｎｕｓの発現と外観写真を示す。
【図７】出生後の各ステージにおけるＭｋｘ＋／＋，Ｍｋｘ＋／−及びＭｋｘ−／−マウスの体重を比較したグラフを示す。野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスとで体重の差は見られない。
【図８】３ヶ月齢の野生型マウス（ＷＴ）のアキレス腱（Ａ）、尾腱（Ｃ）、膝蓋腱（Ｅ）及び体幹の腱（Ｇ）の外観写真と、３ヶ月齢のネオマイシン耐性遺伝子を除去したＭｋｘノックアウトマウス（ＫＯ）のアキレス腱（Ｂ）、尾腱（Ｄ）、膝蓋腱（Ｆ）及び体幹の腱（Ｈ）の外観写真を示す。腱の異常は、ネオマイシン耐性遺伝子を除去させたノックアウトマウスにおいても起きている。
【図９】野生型マウス及びＭｋｘノックアウトマウスの膝十字靭帯のＨ＆Ｅ染色像（図面代用写真）を示す。左図のバーは５００μｍ、右図のバーは２００μｍを意味する。膝十字靭帯は、Ｍｋｘノックアウトマウスにおいても影響はない。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤は、以下の（Ａ）から（Ｄ）の少なくとも一種を有効成分として含む。
（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、
（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクター
【００３６】
Ｍｋｘ（Ｍｏｈａｗｋ、別名 Ｉｒｘｌ１）とは、胎生期において、腱に発現するホメオボックス型の転写因子である。Ｍｋｘは、不定型ホメオボックス遺伝子のＴＡＬＥスーパークラスの中の新しく分類されたクラスに属する唯一の遺伝子である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３５（３） ｐ７９２−８０１）。Ｍｋｘは、腱、筋肉、軟骨の前駆細胞、オスの生殖腺、及び腎臓の尿管芽先端で発現することが報告されている（Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３５（３） ｐ７９２−８０１等）。本発明者らも、Ｅ９．５、Ｅ１０．５及びＥ１１．５のマウス胚を用いた１５２０個の転写因子及び転写コファクターのホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションデータベース（ＥＭＢＲＹＳ）の構築過程で、腱で発現する転写因子として同定していた（Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７（６） ｐ８３６−８４８）。
【００３７】
本発明では、細胞から腱細胞及び／又は靱帯細胞を作製、再生、増強等する分化誘導剤としてＭｋｘタンパク質を用いる。
【００３８】
本発明の分化誘導剤を実験及び研究用に供する場合は、Ｍｋｘタンパク質の由来は問わない。例えば、ヒト、マウス、サル、チンパンジー、ブタ、イヌ等の哺乳動物が挙げられる。本発明の分化誘導剤をヒトの腱細胞及び／又は靱帯細胞を再生等の医療行為に使用する場合は、ヒトのＭｋｘタンパク質を用いることが好ましい。
【００３９】
ヒトＭｋｘタンパク質に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＰ＿７７５８４７として入手することができ、Ｍｋｘタンパク質は、３５２個のアミノ酸で構成されるタンパク質である。また、ヒトＭｋｘ遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＭ＿１７３５７６として入手可能である。ヒトＭｋｘ遺伝子は、ヒト第１０染色体上に存在し、全長で約３６５８の塩基対よりなり、７個のエキソンで構成される。マウスＭｋｘ遺伝子は、ＮＣＢＩから、アクセッション番号ＮＭ＿１７７５９５として入手することができる。
【００４０】
本発明の分化誘導剤に用いる（Ａ）Ｍｋｘタンパク質は、天然由来のタンパク質の他に、組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質は、常法により、Ｍｋｘタンパク質をコードする核酸を組み込んだ形質転換体を培養等することにより得ることができる。
【００４１】
本発明の分化誘導剤に用いる（Ｂ）Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体は、当業者に公知の方法により容易に取得することができる。変異体が分化誘導活性を有するか否かは、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ等で測定することができる。
【００４２】
Ｍｋｘタンパク質の変異体は、また、Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有するものでもよい。
【００４３】
本発明の分化誘導剤は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする（Ｃ）核酸でもよい。核酸には、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡが挙げられる。染色体ＤＮＡは、例えばＰＣＲによる増幅や細胞等からＤＮＡライブラリ−を調製し、Ｍｋｘタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブでスクリーニングすることにより取得する。ｃＤＮＡは、例えば腱細胞等からＲＮＡを抽出し、Ｍｋｘタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＰＣＲ法により取得する。
【００４４】
本発明の分化誘導剤は、（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクターでもよい。発現ベクターは、公知のベクターにＭｋｘ遺伝子を発現可能に連結することで得る。前記ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター等が挙げられる。
【００４５】
前記プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃＨｉｓ，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０，ｐＹＥ５２等）が挙げられる。ファージベクターとしては、λファージ等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ジャガイモエックスウイルス等が挙げられる。
【００４６】
Ｍｋｘ遺伝子をベクターへ挿入するには、ＤＮＡを制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位に挿入する方法又はリコンビナーゼやＧａｔｗａｙシステム等を用いたクローニング法等が採用される。その際、Ｍｋｘ遺伝子の機能を発揮できるようにベクターに組み込む必要がある。そのために、ベクターには、Ｍｋｘ遺伝子の他に、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有させるとよい。選択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等を挙げることができる。
【００４７】
発現ベクターは、Ｍｋｘ遺伝子を直接発現させるものでも、例えばＦＬＡＧタグやＭｙｃタグ等の他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として発現させるものでもよい。
【００４８】
本発明の分化誘導剤は、さらに、以下の（Ａ１）〜（Ｄ１）の少なくとも一種を含んでいてもよい。
（Ａ１）Ｓｃｘタンパク質、
（Ｂ１）前記Ｓｃｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、Ｉ型コラーゲンを誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ１）前記（Ａ１）又は（Ｂ１）のタンパク質をコードする核酸、並びに
（Ｄ１）前記（Ｃ１）の核酸を含む発現ベクター。
【００４９】
Ｓｃｘタンパク質は、前述のとおり、腱の主成分であるＩ型コラーゲンを直接誘導することが示唆されている（非特許文献１）。Ｓｃｘノックアウトマウスは、腱を部分的に消失する。一方、Ｍｋｘノックアウトマウスは、実施例に示すように、腱の低形成は認められるが、腱細胞数は変わらない。このことから、Ｓｃｘ腱細胞分化の初期段階から必須の因子であり、Ｍｋｘは、後期分化・成熟に重要であることが予想される。また、腱細胞の分化とそこでのＩ型コラーゲンの産生には、Ｓｃｘ遺伝子による初期分化と、Ｍｋｘによる成熟の両者の協同作業が重要といえる。したがって、本発明の分化誘導剤に（Ａ１）〜（Ｄ１）のＳｃｘ関連物質を含めることは、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化をより効率的に行う点で好ましい。
【００５０】
Ｓｃｘタンパク質に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＰ＿００１００８２７２として入手することができる。また、Ｓｃｘ遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＭ＿００１００８２７１として入手可能である。
【００５１】
（Ａ１）〜（Ｄ１）の作製方法は、タンパク質及び遺伝子がＭｋｘと異なる以外は（Ａ）〜（Ｄ）で述べた内容と同じである。
【００５２】
本発明は、また、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞の生育に適した条件下で、上記分化誘導剤を用いて前記細胞を培養する工程、及び前記培養された細胞の中から、腱及び／又は靭帯細胞を選択する工程を含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する方法を提供する。
【００５３】
前記腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞は、例えば、繊維芽細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２等）、腱前駆細胞、靱帯前駆細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。
【００５４】
以下に、分化誘導方法の一態様を説明する。まず、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞に分化誘導剤を導入して、それを培養する。具体的には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＤＭＥＭ培地等で培養して得られる５０％コンフルエントのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、Ｍｋｘ発現ベクターをトランスフェクションする。トランスフェクションは、公知の方法で行え、またトランスフェクション以外の導入法として例えばウィルスベクターによる導入法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム法等が挙げられる。
【００５５】
培養方法は、分化誘導方法に適したものであれば、特に制限されない。例えば、平面培養法、浮遊凝集培養法、懸濁培養法、フィーダー細胞との共培養法、旋回培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法等が挙げられる。
【００５６】
培養後、回収した細胞を細胞溶解バッファーで溶解して全可溶型タンパク質を取得する。全可溶型タンパク質をウエスタンブロット等にかけ、Ｉ型コラーゲンの存在を確認することが好ましい。
【００５７】
上記分化誘導剤を用いてＭｋｘ遺伝子を過剰発現させると、腱の主要コンポーネントであるＩ型コラーゲンの発現が上昇する。損傷した腱部位に分化誘導剤や分化誘導剤を用いて製造した腱細胞及び／又は靱帯細胞を導入すれば、腱の治癒、運動器の再生や再建を促進することが期待できる。そこで、本発明は、上記分化誘導剤、又は上記分化誘導剤を用いて製造した腱及び／又は靭帯細胞を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【００５８】
本発明の分化誘導剤は、遺伝子治療用にも好適である。遺伝子治療の腱又は靭帯関連疾患の候補は、エーラスダンロス症候群がある。エーラスダンロス症候群は、ヒトの皮膚や組織を形成するコラーゲン等の結合組織成分が先天性代謝異常を示し、その結果、靱帯や関節の異常な可動性亢進等を引き起こす疾患である。現在、根本的治療法は見つかっていない。エーラスダンロス症候群で腱及び／又は靭帯が罹患している患者から採取した細胞を用いて、分化誘導剤で自家腱及び／又は靭帯細胞を製造することにより、該疾患に対する再生医療が期待される。
【００５９】
上記医薬の投与形態は、特に限定されないが、好ましくは損傷した腱及び／又は靱帯部位への直接投与である。具体的には、皮下注射剤、筋肉注射剤等の注射剤、点滴剤、経皮投与剤、軟膏剤等の外用薬剤、細胞の単層又は複層のシート等が挙げられる。
【００６０】
これらの剤形に適用される助剤や製剤技術には当業分野に公知のものを使用可能である。例えば、注射剤であれば、適当な緩衝剤、安定剤、保存剤、無痛化剤、等張化剤、溶解補助剤等が挙げられる。
【００６１】
本発明の医薬は、ヒトを含む動物に対して、薬理上必要量が投与される。薬理上必要量は、剤形、投与方法、患者や実験動物の症状、治療部位、患者や実験動物の年齢、性別、体重等を考慮して、医師等の判断により適宜決められる。
【００６２】
本発明は、また、Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む、腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物を提供する。「Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損」とは、本明細書において、Ｍｋｘ遺伝子が本来有する正常な機能を十分に発揮しないか、全く発揮しない状態を意味する。
【００６３】
遺伝子改変非ヒト動物には、Ｍｋｘ欠損遺伝子のヘテロ接合体（Ｍｋｘ＋／−と表示することがある）とホモ接合体（Ｍｋｘ−／−と表示することがある）の二種類がある。本明細書中、「Ｍｋｘ変異」（例えばＭｋｘ変異マウス）の記載は、両者を含む意味で使用する。
【００６４】
ノックアウトマウスのようなホモ接合体は、遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／又は靭帯が野生型動物と比べて有意に低形成を示す。具体的には、Ｍｋｘノックアウトマウスは、全身の腱が低形成になり、尾腱の線維束が細くなるにもかかわらず、腱細胞の数は野生型と同程度である。さらに、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱は、コラーゲン原線維の径が小さく、Ｉ型コラーゲンの量が低下する。以上の結果から、Ｍｋｘは、腱細胞において、Ｉ型コラーゲンの産生能に寄与し、腱細胞の分化に重要な役割を担っていることが示唆される。この知見に基づく本発明のＭｋｘノックアウトマウスは、Ｍｋｘの腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導への研究や腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬の探索に有用である。
【００６５】
一方、ヘテロマウスのようなヘテロ接合体は、腱形成に異常が見られない。ヘテロマウスは、腱に異常がなく、腱や靭帯などＭｋｘが発現する細胞で蛍光タンパク質のＶｅｎｕｓが発現するので、Ｍｋｘがどこで発現しているか、Ｍｋｘがどのような物質や遺伝子で発現が誘導されるか等の解析や、腱組織がどのようにできるかの観察、腱細胞を分離して細胞の性状を調査する等に有用である。
【００６６】
非ヒト動物の例は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、チンパンジー、サル、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヒツジ等の家畜類、イヌ、ネコ等の愛玩動物であり、好ましくはマウスである。
【００６７】
Ｍｋｘ遺伝子を機能的に欠損させる方法は、当業分野で公知の方法のいずれも採用することができる。具体的には、Ｍｋｘ遺伝子を含むゲノムＤＮＡのエキソンを含む領域をターゲッティングベクターで相同組み換えする方法が例示される。
【００６８】
Ｍｋｘ遺伝子を機能的に欠損させる際に、Ｍｋｘ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたことにより腱細胞特異的にレポーター遺伝子を発現させることが好ましい。ヘテロ接合体のＭｋｘヘテロマウスのＭｋｘ欠損部位を蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子で置き換えると、レポーター遺伝子が腱細胞特異的に発現するとともに、正常な腱細胞もまた視認できる（図１Ｄ）。このようなＭｋｘヘテロマウスは、Ｍｋｘの腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導への研究や、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬の探索に極めて有用である。
【００６９】
前記レポーター遺伝子には、Ｖｅｎｕｓ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＦｌＡｓＨ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲＦＰ１、ｍＰｌｕｍ、ＰｈｉＹＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子等を使用することができる。
【００７０】
さらに、Ｍｋｘ遺伝子の下流に、ネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを挿入することが好ましい。
【００７１】
上記選択マーカーの両端をｌｏｘＰ配列で挟んでおくことがより好ましい。こうすると、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いて、選択マーカーの除去が可能である。
【００７２】
遺伝子改変非ヒト動物は、それ自体公知の方法により製造することができる。具体的には、
１．Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞クローンを作製する工程、
２．上記胚性幹細胞クローンを胚にインジェクションする工程、
３．キメラ胚を動物の子宮に移して、キメラ動物を作る工程、
４．キメラ動物を交配させ、ヘテロ接合体を得る工程、及び
５．ヘテロ接合体同士を交配させ、ホモ接合体を得る工程、
を含む。
【００７３】
Ｍｋｘヘテロマウス及びＭｋｘノックアウトマウスを例に、遺伝子改変非ヒト動物をより具体的に説明する。ゲノムＤＮＡのＭｋｘ遺伝子を欠損させるために、胚性幹細胞での相同組み換えにおいてＭｋｘ遺伝子の部分領域（エキソンの一部を含む）を、例えば蛍光タンパク質遺伝子とポジティブ選択マーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）とのカセットに置き換わるようなターゲッティングベクターを設計する（図１Ａ）。また、ポジティブ選択マーカー遺伝子の両側にＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列のようなリコンビナーゼ標的配列を加えると、Ｃｒｅ酵素を介したマーカー遺伝子の切除が可能である。ネガティブ選択用にジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子等を組み込む。
【００７４】
上記のターゲッティングベクターを、胚性幹細胞クローンや、初代培養細胞株等の体細胞へ導入する。胚性幹細胞クローンは、マウス、ヒト、ハムスター、ブタ等の動物の胚盤胞から分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することにより樹立することができる。市販の胚性幹細胞クローンを使用することができ、例えばＴＴ２、ＥＳ−Ｄ３、ＳＣＣ−ＰＳＡ１等が挙げられる。
【００７５】
ターゲッティングベクターの組み込まれた胚性幹細胞等を、ネオマイシン耐性選択ならＧ４１８抗生物質を含む培地といった適宜の選択培地で培養後、組換え胚性幹細胞クローンを分離する。
【００７６】
適切に組み込まれた組換え胚性幹細胞クローンのスクリーニングを、サザンブロットやＰＣＴ法により行う。図５Ａに、サザンブロット解析のための野生型（ＷＴ）及びターゲッティングされたアリル（ＴＡ）と各プローブの位置を示す。
【００７７】
相同組み換えの確認された胚性幹細胞クローンを、マイクロインジェクション法、凝集法等で８細胞期等のマウス胚に導入してキメラ胚を作る。
【００７８】
得られたキメラ胚を動物の子宮に移してキメラ動物を作る。得られたキメラ動物を野生型動物（例えばＣ５７ＢＬ／６マウス）と掛け合わせる。生殖細胞への伝達をゲノミックＰＣＲやサザンブロット解析により確認する。ＬｏｘＰ配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子カセットを、Ｍｅｏｘ−Ｃｒｅトランスジェニック動物との掛け合わせにより除去する。Ｃｒｅを介したネオマイシン耐性遺伝子除去をゲノミックＰＣＲで確認する。キメラ動物を野生型動物と交配させ、Ｍｋｘヘテロ接合体を得る。
【００７９】
Ｍｋｘヘテロ接合体同士を交配させて、ホモ接合体（Ｍｋｘノックアウトマウス）を得る。
【００８０】
本発明は、また、上記分化誘導剤、上記分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞、若しくは遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患を解析又は分析する方法を提供する。分析や解析の対象は、細胞に分化誘導剤を作用させ分化させて得られるＭｋｘヘテロマウスの胚とその組織、トランスジェニック非ヒト動物からを得られた腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞等である。分析や解析の手法を以下に例示する。
【００８１】
ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）は、マウス胚での遺伝子発現パターンの解析に有効である。ＷＩＳＨは、常法を用いることができ、例えばＹｏｋｏｙａｍａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｄｙｎａｍｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｎ−２８ ｄｕｒｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ８（３）：１５５−１６０に記載の方法に従う。これに用いるプローブの合成方法の詳細は、ＥＭＢＲＹＳウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｒｙｓ．ｊｐ／ｈｔｍｌ／ＭａｉｎＭｅｎｕ．ｈｔｍｌ？）にて閲覧可能である。
【００８２】
Ｖｅｎｕｓ等の蛍光タンパク質は、Ｍｋｘ遺伝子の各組織での発現パターンを観察するのに有効である。
【００８３】
免疫組織染色は、マウス胚や成体マウスの各組織の観察に有効である。各組織に特異的なマーカーとして、筋肉ではミオシン重鎖、血管ではＰＥＣＡＭ１等がある。これらのマーカー遺伝子の発現を、マーカー特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色する。まず、マウス胚をパラホルムアルデヒドに固定した組織を凍結組織切片作製用包埋剤に包埋して凍結する。検体を薄切りして風乾後、ブロッキング剤にて１時間ブロッキングする。その切片を抗ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０，ＤＳＨＢ）でインキュベートし、さらに、二次抗体と共にインキュベートする。ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘへテロマウスでは、ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０）の赤い染色とＶｅｎｕｓの緑色シグナルの両方が観察される。
【００８４】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱の異常を調査するために、腱及び靱帯の組織学的観察を行うことが有効である。その手法として、以下に電子顕微鏡観察、Ｈ＆Ｅ染色及びアザン染色を例示する。
【００８５】
電子顕微鏡を用いると、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱におけるコラーゲン原線維を観察できる。まず、アキレス腱断片を採取し、緩衝液にて固定する。緩衝液及び生理食塩水で洗浄し、エタノールにて脱水後、樹脂に包埋して極薄切りにする。得られた切片を銅の格子上に置き、透過型電子顕微鏡にて観察する。
【００８６】
Ｈ＆Ｅ染色から、野生型マウスやＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度を求めることができる。まず、成体の膝、尾等の組織を採取し、パラホルムアルデヒド等に固定する。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。
【００８７】
アザン染色は、コラーゲンを検出する。まず、マウスの尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに固定する。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、アゾカルミン−アニリンブルー（アザン）で染色する。
【００８８】
Ｍｋｘ欠損した腱の力学的特性を調べるには、例えば筋腱ジャンクションから踵結節までの全腱を用いて引張試験を行う。張力の決定は、Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｅ， ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４（２１）：３８０５−３８１３で報告された方法に従って、単軸の材料テストシステム（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ＡＧＳ−Ｇ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ． Ｌｔｄ．）を使用するとよい。それぞれの検体の最初の長さと断面積を、デジタルカリパスを使用して、Ｈ＆Ｅ染色した切片の顕微鏡検査によって測定する。データ収集には、例えばＴｒａｐｅｚｉｕｍソフトウェア（登録商標、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）を用いる。各検体の応力−歪み曲線は、ｌｏａｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔカーブから作られ、ヤング率はそれぞれの応力−歪み曲線と腱断面積から算出される。
【００８９】
本発明は、また、被験物質の存在下又は非存在下で、上記分化誘導方法を行い、該被験物質存在下又は非存在下での腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を比較することを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。
【００９０】
好ましくは、被験物質の存在下で培養した細胞における、Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量を測定すること、並びに前記被験物質を非存在下で培養した細胞内の量と比べることを含む。測定量が多いか又は少ない場合に、前記被験物質を腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質として選択する。
【００９１】
上記培養培地は、用いる細胞に応じて適宜決められる。例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭ１６４０培地、１９９培地等である。培養条件も、細胞に応じて適宜、決められる。
【００９２】
本発明は、また、上記遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞を用いることを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。好ましくは、遺伝子改変非ヒト動物から採取した腱、その組織又はその細胞に被験物質を接触させること、及びノックインされた蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子の発現を上昇又は低下させる被験物質を選択することを含む。
【００９３】
上記スクリーニング又は評価する方法に供する被験物質は、特に制限されない。例えば、天然又は人工の有機化合物や無機化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖質、脂質、細胞、植物、動物等の抽出物等である。
【００９４】
被験物質と分化誘導させる細胞や遺伝子改変非ヒト動物の組織等との接触は、特に制限されないが、添加、トランスフェクション、ウィルスベクターによる導入等である。
【００９５】
Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量、レポーター遺伝子の発現の上昇又は低下の測定は、常法に基づく、例えばノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫学的手法、 等である。
【実施例】
【００９６】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕（分化誘導剤の作製と評価）
Ｍｋｘタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターからなる分化誘導剤を、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス線維芽細胞に導入してＭｋｘを過剰発現させることにより、分化誘導剤の効果を調べた。
【００９７】
まず、マウスＭｋｘ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７７５９５）の全タンパク質コード領域をｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶＴＭ−７．１ベクター（ＳＩＧＭＡ社）に組み込むことにより、ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクターを作製した。また、ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ遺伝子を組み込まない空ベクターを陰性対照として用いた。
【００９８】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＡＴＤＣから入手）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。６ウエルプレートにて培養した５０％コンフルエントのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、トランスフェクション試薬（製品名、ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｒｏｃｈｅ社）１０μｌ、及び上記ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクター又は空ベクター１μｇをトランスフェクションした。
【００９９】
４８時間培養後、細胞を回収した。ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ＤＯＣ，０．１％ＳＤＳ，１％ＮＰ４０；ｐＨ ８．０）で細胞を溶解して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中の全可溶型タンパク質を取得し、以下のウエスタンブロット解析に供した。
【０１００】
取得した全可溶型タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にセミドライ法でブロットした。メンブレンをブロッキング剤（製品名Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）にて３０分間ブロッキングし、抗Ｉ型コラーゲン抗体又は抗β−アクチン抗体と共に４℃、一晩インキュベートした。
【０１０１】
洗浄後、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Ａ６１５４，ＳＩＧＭＡ社）、又はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａ２３０４，ＳＩＧＭＡ社）と共に１時間インキュベートした。抗原−抗体の発色には、化学発光試薬（製品名Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ、ナカライテスク社）を用いた。
【０１０２】
図４Ｄに、ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクター又は空ベクターをトランスフェクションしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、ＦＬＡＧ及びβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロットの結果を示す。図４Ｄに示すとおり、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞内にＭｋｘを過剰発現させると、Ｉ型コラーゲン量が増大した。
【０１０３】
〔実施例２〕（Ｍｋｘ変異マウスの作製と評価）
マウスの染色体上のＭｋｘ遺伝子を機能的に欠損させるために、図１Ａに、胚性細胞での相同組み換えにおいてＭｋｘの翻訳スタートからエキソン２の終わりまでをＭｋｘ遺伝子がＶｅｎｕｓ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子とのカセットで置き換わるようなターゲッティングベクターを設計した。
【０１０４】
図１Ａのターゲッティングコンストラクトをもとに、Ｃ５７ＢＬ／６ゲノムＢＡＣクローン（ＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ社）を鋳型にしたＰＣＲを行うことによって、Ｍｋｘ遺伝子の５‘及び３’側の隣接領域を増幅した。これらの相同組み換え領域を、Ｖｅｎｕｓ遺伝子とポジティブ選択用のネオマイシン耐性遺伝子とネガティブ選択用のジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のベクターに組み込むことにより、ターゲッティングベクターを作製した。
【０１０５】
上記のターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで直鎖化し、ＴＴ２Ｆ胚性幹細胞へエレクトロポレーション法により導入した。ターゲッティングベクターの組み込まれたＴＴ２Ｆ胚性幹細胞を、Ｇ４１８を含む培地で培養して、組換え胚性幹細胞クローンを分離した。
【０１０６】
適切に組み込まれた組換え胚性幹細胞クローンのスクリーニングを、５‘プローブ、３’プローブ及びｎｅｏプローブを用いたサザンブロット法により行った。
【０１０７】
図５Ａに、サザンブロット解析のための、野生型（ＷＴ）及びターゲッティングされたアリル（ＴＡ）と各プローブの位置を示す。図５Ｂに、組換え胚性幹細胞のサザンブロットの結果を示す。図５Ｃに、野生型マウス及びＭｋｘ変異マウスのサザンブロットの結果を示す。
【０１０８】
相同組み換えの確認された２つの胚性幹細胞クローンを８細胞期のマウス胚にインジェクションした。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと掛け合わせ、生殖細胞への伝達をゲノミックＰＣＲにより確認した。ＬｏｘＰ配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子カセットを、Ｍｅｏｘ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスとの掛け合わせにより除去し、Ｃｒｅを介したネオマイシン耐性遺伝子除去の確認をゲノミックＰＣＲにより行った。ジェノタイピングに使用したＰＣＲプライマーの配列を表１に記載する。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
図１Ｂに、野生型マウスとＭｋｘ変異マウスのプライマーａ、ｂ及びｃを用いたゲノミックＰＣＲ結果を示す。
【０１１１】
ターゲッティングベクターを用いて作製されたＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウスは、Ｍｋｘの発現が陽性であり、かつ、ノックインしたＶｅｎｕｓ遺伝子の発現もまた予想される。そこで、マウス胚の蛍光シグナルの観察を行った。Ｍｋｘプローブを用いたホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【０１１２】
図１Ｃに、Ｅ１３．５前肢（Ｆｏｒｅｌｉｍｂ）及び尾（Ｔａｉｌ）における野生型マウスとＭｋｘヘテロマウスの胚のＭｋｘのホールマウントｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを示す。ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウスの前肢と尾では、Ｍｋｘの発現と同様の場所で、Ｖｅｎｕｓの発現が観察された。
【０１１３】
Ｍｋｘヘテロマウス胚の免疫組織染色のために、Ｅ１６．５マウス胚の尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で２時間固定した。組織を、凍結組織切片作製用包埋剤（製品名Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社）に包埋し、液体窒素で直ちに凍結した。検体を１０μｍに薄切りし、その凍結切片を風乾後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）にて１時間ブロッキングした。その切片を抗ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０，ＤＳＨＢ）と共に４℃、一晩インキュベートした。洗浄後、二次抗体蛍光試薬（製品名Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｌｅｘａ ５９４）と共に１時間インキュベートした。
【０１１４】
図１Ｄに、Ｅ１６．５のＶｅｎｕｓノックインＭｋｘへテロマウスの胚の尾における抗ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０；ｒｅｄ）を用いた免疫組織染色とＶｅｎｕｓ蛍光シグナルを観察した顕微鏡写真を示す。図中、○で囲んだ部分はＭＦ２０免疫組織染色（実際は赤色に呈色）を示し、それ以外はＶｅｎｕｓ蛍光シグナル（実際は緑色に呈色）を示す。ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウスの胚は、Ｅ１６．５の尾において腱特異的なＶｅｎｕｓの発現を示した。
【０１１５】
Ｍｋｘヘテロマウス胚の解析に加え、その成体マウスにおけるＶｅｎｕｓの発現についても調査した。成体の腱でのＭｋｘの発現は明らかではなかったので、成体の腱でのＭｋｘの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調査した。図６Ａに、野生型マウス（成体）の筋肉、アキレス腱及び尾腱におけるＭｋｘ及びＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。図６Ａから、Ｍｋｘがアキレス腱及び尾腱で強く発現していることを確認した。
【０１１６】
図６Ｂに、Ｍｋｘヘテロマウス及び野生型マウスのアキレス腱（Ｂ−Ｅ）、尾腱（Ｆ−Ｉ）及び体幹の腱（Ｊ−Ｍ）におけるＶｅｎｕｓの発現と外観写真を示す。図６Ｂから、ＭｋｘヘテロマウスにおけるＶｅｎｕｓは、アキレス腱、尾腱及び体幹の腱において特異的発現を示した。
【０１１７】
Ｍｋｘ遺伝子の欠損を確認するために、Ｍｋｘ変異マウスを用いたＲＴ−ＰＣＲによる発現解析を行った。核酸抽出薬（製品名ＩＳＯＧＥＮ、Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて全ＲＮＡを分離した。分離した全ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（製品名Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて逆転写し、そのｃＤＮＡを鋳型にＤＮＡポリメラーゼ（製品名Ｇｏ−Ｔａｑ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＰＣＲした。プライマー配列を表２に示す。Ｇａｐｄｈは、ｍＲＮＡのコントロールとして用いた。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
図１Ｅに、野生型マウスとＭｋｘ変異マウスのアキレス腱におけるＭｋｘ及びＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲの解析結果を示す。図１Ｅから、Ｍｋｘノックアウトマウス（成体）のアキレス腱において、Ｍｋｘの発現が完全に消失していることがわかった。
【０１２０】
以上の結果から、Ｍｋｘ変異マウス（ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウス及びＭｋｘノックアウトマウス）は、Ｍｋｘの機能解析だけでなく、腱の生物学的解析やＭｋｘの発現解析に有用であることが示された。
【０１２１】
〔実施例３〕（Ｍｋｘノックアウトマウスの作製と評価）
実施例２で作製したＭｋｘヘテロマウス同士を掛け合わせることにより、Ｍｋｘノックアウトマウスを作製した。産まれた各遺伝子型の新生仔マウスの数と比を表３に示す。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
ヘテロマウス同士の掛け合わせによって産まれた２０６匹の新生仔マウスのジェノタイピングの結果は、メンデルの法則に従った。
【０１２４】
Ｍｋｘヘテロマウス及びＭｋｘホモマウス（ノックアウトマウス）は、問題なく生存、生殖し、重量測定の結果も野生型マウスと変わらなかった（図７）。
【０１２５】
Ｍｋｘヘテロマウスでは、腱の異常は見られなかった（図６Ｂ）。腱形成におけるＭｋｘの役割を調査するために、Ｍｋｘノックアウトマウスで腱の異常が観察されるか否かを調べた。
【０１２６】
図２Ａに、野生型マウスにおいて、膝蓋腱（Ａの矢印）、アキレス腱（Ｃの矢印、後肢（Ｅの矢印）、前肢の腱（Ｇの矢印）、尾腱（Ｉの矢印）、背中の腱（Ｋの矢印）及び広頸筋腱（Ｍの矢印）を観察した写真、並びにＭｋｘノックアウトマウスにおいて、膝蓋腱（Ｂの矢印）、アキレス腱（Ｄの矢印、後肢（Ｆの矢印）、前肢の腱（Ｈの矢印）、尾腱（Ｊの矢印）、背中の腱（Ｌの矢印）及び広頸筋腱（Ｎの矢印）を観察した写真を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスでは、膝蓋腱、アキレス腱、尾腱、四肢の腱、体幹の腱及び広頸筋腱が、野生型マウスに比べて低形成であり、白色が薄くなっていた。この腱の異常は、７日齢から８ヶ月齢までのＭｋｘノックアウトマウスとネオマイシン耐性遺伝子を除去したマウス（図８）においても観察された。
【０１２７】
Ｍｋｘが欠損した腱の力学的特性を調べるために、筋腱ジャンクションから踵結節までの全腱を用いて引張試験を行った。張力の決定は、Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｅ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４（２１）：３８０５−３８１３で報告された方法に従って、単軸の材料テストシステム（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ＡＧＳ−Ｇ、島津社）を使用して行った。検体を、０．５ ｍｍ／ｓｅｃの重圧率で引張した。
【０１２８】
それぞれの検体の最初の長さと断面積を、デジタルカリパスを使用して、Ｈ＆Ｅ染色した切片の顕微鏡検査によって測定した。データ収集はＴｒａｐｅｚｉｕｍ（登録商標、島津社）ソフトウェアを用いて行った。各検体の応力−歪み曲線は、ｌｏａｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔカーブから作られ、ヤング率はそれぞれの応力−歪み曲線と腱断面積から算出した。
【０１２９】
図２Ｂに、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱の引張強度を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスのアキレス腱は、引張強度が低く、機能低下が見受けられた。図２Ｃに、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のヤング率を示す。単位面積あたりの引張強度及び単位面積あたりの弾力性を示すヤング率の値は、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスでほぼ同程度であった。以上の結果から、Ｍｋｘノックアウトマウスのアキレス腱における引張強度の低下は、腱が細くなることに起因していることが示唆された。
【０１３０】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱の異常をさらに詳細に調査するために、組織学的解析を行った。成体マウスの膝又は尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１３１】
図３Ａに、３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱のＨ＆Ｅ染色像を示す。Ｈ＆Ｅ染色の結果、３ヶ月齢のＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱は、野生型マウスに比べて薄いことが分かった。
【０１３２】
図３Ｂに、７日齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱の厚さを示す。７日齢のノックアウトマウスにおいても、膝蓋腱が薄く、野生型マウスの腱の約半分の厚さになっていた（図３Ｂ）。
【０１３３】
図９に、野生型マウス及びＭｋｘノックアウトマウスの膝十字靭帯のＨ＆Ｅ染色像を示す。腱と同様の組成を持つ組織である靭帯の１つである膝十字靭帯においては、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスとの間に差は見られなかった。
【０１３４】
図３Ｃに、３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱のＨ＆Ｅ染色像を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスの尾腱でも、腱線維束の径の縮小（図３Ｃの△矢頭）が見られた。
【０１３５】
図３Ｄに、３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスの尾腱では、細胞密度が高く、１つの尾腱線維束における細胞数は野生型マウスと同程度であった。このことから、Ｍｋｘノックアウト腱細胞は、機能的に不完全であることが示唆される。
【０１３６】
Ｍｋｘノックアウトマウスにおける腱の形成不全が胎生期においても観察されるか否かを調査するため、Ｅ１８．５のＭｋｘ欠損胚の尾腱のアザン染色を行った。具体的には、尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、アゾカルミン−アニリンブルー（アザン）で染色した。
【０１３７】
図３Ｅに、Ｅ１８．５の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの胚の尾腱のアザン染色像を示す。図３Ｅからは、尾腱の大きさは、野生型マウスと違いが見られない。Ｍｋｘノックアウト胚では、コラーゲンを検出するアニリンブルーの染色の密度が低い（△矢頭部）ことが分かった。
【０１３８】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱におけるコラーゲン原線維について解析するため、アキレス腱を電子顕微鏡で観察した。約１ｍｍ３のアキレス腱断片を採取し、４％パラホルムアルデヒドと２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸バッファーにて一晩固定した。０．１Ｍカコジル酸バッファー及び生理食塩水で洗浄し、エタノールにて脱水後、エポキシ樹脂に包埋して極薄切りにした。得られた切片を銅の格子上に置き、水性ウラニルアセテートとクエン酸鉛と対比させて、透過型電子顕微鏡（Ｈ−７１００，日立社）にて観察した。
【０１３９】
図３Ｆに、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン原線維の電子顕微鏡観察像を示す。ノックアウトマウスの腱におけるコラーゲン原線維の径は、野生型マウスと比べて均一に小さいことが分かった。これらの結果から、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱では、コラーゲンが減少していること、さらにはＭｋｘが腱の分化に重要であることが示唆された。
【０１４０】
３ヶ月齢のＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度（図３Ｄ）に示されるように、Ｍｋｘノックアウトマウスでは、腱の量が減少しているにもかかわらず、腱細胞の数は野生型マウスと変わらなかった。これは、Ｍｋｘノックアウト腱細胞において、細胞外基質の産生能が低下していることを示唆する。また、図３Ｅに示すＥ１８．５のＭｋｘノックアウトマウスの胚の尾腱のアザン染色像、並びに図３Ｆに示すＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン原線維の微細構造解析から、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱ではコラーゲン産生能が減少していると考えられる。
【０１４１】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱細胞のコラーゲン産生能を調査するため、８週齢の野生型マウス及びＭｋｘノックアウトマウスの腱のコラーゲン量を測定した。コラーゲンの定量は、市販のコラーゲン定量キット（製品名Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）の説明書に従った。結果を図４Ａに示す。ノックアウトマウスの腱のコラーゲン量は野生型マウスと比べて少ないことが分かった。
【０１４２】
図４Ｂに８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）とβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロット解析を示す。腱の細胞外基質の主要成分であるＩ型コラーゲンの発現量が示すように、Ｍｋｘノックアウトマウスでのタンパク質及びｍＲＮＡの両方とも減少していた。
【０１４３】
８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２及びＳｃｘのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。プライマー配列を表４に示す。Ｇａｐｄｈは、ｍＲＮＡのコントロールとして用いた。
【０１４４】
【表４】
【０１４５】
ｄｅｌｔａ−ｄｅｌｔａ ＣＴ法により測定した相対発現量のグラフを図４Ｃに示す。図４Ｃでは、Ｉ型コラーゲンの発現を誘導することが示唆されている転写因子であるＳｃｘの発現は減少していなかった。これから、ＭｋｘノックアウトマウスにおけるＩ型コラーゲンの減少は、Ｓｃｘの減少ではないことが示唆された。
【０１４６】
以上の結果から、Ｍｋｘは、腱細胞においてＩ型コラーゲンの発現を調節する重要な因子であることが実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腱及び／又は靭帯細胞の分化誘導剤、分化誘導剤を用いた医薬、分化誘導剤を用いたスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腱は筋肉と骨とを結合する組織であり、靱帯は骨と骨とを結合する組織である。これらの組織は、力や運動を伝達するという重要な機能を持っている。腱や靱帯は、酷使や加齢によって損傷し、また減少するが、栄養血管が少ないため、腱の治癒力は非常に弱く、完治が極めて難しい。腱細胞の分化機構等の生物学的理解も不十分であるため、現在、再生医療等の治療法は確立していない。
【０００３】
腱や靱帯は、コラーゲン原線維がクロスリンクしてできる線維でできている。腱の線維間には腱細胞が僅かに存在し、コラーゲン、プロテオグリカン等の細胞外基質の産生を行っている。腱の大部分を構成するコラーゲンは、腱に弾性力を与えるが、そのほとんどはＩ型コラーゲンである。プロテオグリカンは、腱においてはｄｅｃｏｒｉｎ、ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ、ｂｉｇｌｙｃａｎ、ｌｕｍｉｃａｎ等が存在し、コラーゲン線維同士の結合や集合に関与している。プロテオグリカンの遺伝子欠損マウスでは、腱のコラーゲン原線維の異常が観察される。エーラスダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ）症候群に代表されるコラーゲン産生に異常を有する疾患患者に腱の障害が報告されている。腱細胞における細胞外基質の産生は、腱の形成にとって重要であることが示唆される。
【０００４】
近年、腱及び靭帯細胞並びに腱及び靭帯前駆細胞で発現するｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ（ｂＨＬＨ）型の転写因子であるＳｃｌｅｒａｘｉｓ（Ｓｃｘ）が腱発生に重要な因子であることが報告され、Ｓｃｘノックアウトマウスでは、腱の著しい形成不全が観察された（非特許文献１）。また、腱の主成分であるＩ型コラーゲンを直接誘導することが示唆された（非特許文献２）。しかし、Ｓｃｘノックアウトマウスは、後述の実施例に示すように、腱においてすべてのＩ型コラーゲンが消失するわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｓｅｒｊｅｓｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ： ａ ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｐｒｅｆｉｇｕｒｅｓ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１（４） ｐ１０９９−１１１０
【非特許文献２】Ｌｅｊａｒｄ Ｖ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ ａｎｄ ＮＦＡＴｃ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ１（Ｉ） ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｅｎｄｏｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（２４） ｐ１７６６５−１７６７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腱及び靭帯細胞は、Ｉ型コラーゲン等の基質を産生する細胞であって、それぞれ、腱及び靭帯組織の形成及び維持に関与する。腱及び靭帯は、上記したように再生能の低い組織であり、腱及び靭帯疾患治療に向けての再生医療が望まれる。Ｓｃｘは、腱及び靭帯細胞で発現し、腱及び靭帯の主成分であるＩ型コラーゲンの発現を誘導することが示唆されるものの、他のＩ型コラーゲンの発現調節因子の存在が示唆される等、腱発生のメカニズムには未解明な部分が多いのが現状である。腱及び靭帯細胞への分化誘導方法も、確立されていない。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、腱及び／又は靭帯細胞の分化誘導剤、並びに該分化誘導剤を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明の目的は、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞へ分化誘導させるために使用する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、腱及び靭帯細胞への分化方法の確立には、分化に重要な遺伝子を特定し、その遺伝子を導入又は誘導することが重要であると考えた。本発明者らは、後述の実施例に示すように、Ｍｋｘ遺伝子を破壊すると、腱組織と腱細胞のＩ型コラーゲン生産量が減少し、逆に細胞内に過剰発現させると、Ｉ型コラーゲン量が増大することを発見した。Ｍｋｘは、従来、胎生期において腱に発現するホメオボックス型の転写因子として知られていたが、Ｍｋｘが腱細胞においてその分化を制御しＩ型コラーゲンの発現を調節する重要な因子であることが初めて明らかとなった。これらの知見をもとに、本発明者らは、以下の発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、
（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクター
の少なくとも一種を有効成分として含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤を提供する。
【００１１】
上記分化誘導剤は、
（Ａ１）Ｓｃｘタンパク質、
（Ｂ１）前記Ｓｃｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、Ｉ型コラーゲンを誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ１）前記（Ａ１）又は（Ｂ１）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ１）前記（Ｃ１）の核酸を含む発現ベクター、
の少なくとも一種をさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明は、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞の生育に適した条件下で、上記分化誘導剤を用いて前記細胞を培養する工程、及び前記培養された細胞の中から、腱及び／又は靭帯細胞を選択する工程を含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する方法を提供する。
【００１３】
前記細胞は、例えば繊維芽細胞、腱前駆細胞、靱帯前駆細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、体性幹細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である。
【００１４】
本発明は、また、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤を含む腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【００１５】
上記腱又は靭帯関連疾患は、例えばエーラスダンロス症候群である。
【００１６】
本発明は、また、上記分化誘導方法により得られる、腱及び／又は靭帯細胞を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【００１７】
上記腱又は靭帯関連疾患は、例えばエーラスダンロス症候群である。
【００１８】
本発明は、また、Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む、腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【００１９】
前記機能的に欠損したＭｋｘ遺伝子は、Ｍｋｘ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたことにより腱細胞特異的にレポーター遺伝子を発現することが好ましい。
【００２０】
前記レポーター遺伝子は、例えばＶｅｎｕｓ遺伝子である。
【００２１】
本発明は、また、上記分化誘導剤を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法を提供する。
【００２２】
本発明は、また、上記分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法を提供する。
【００２３】
本発明は、また、上記遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法を提供する
【００２４】
本発明は、また、被験物質の存在下又は非存在下で、上記分化誘導方法を行い、該被験物質存在下又は非存在下での腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を比較することを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。
【００２５】
上記スクリーニング又は評価する方法は、例えば被験物質の存在下で培養した細胞における、Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量を測定すること、並びに前記被験物質を非存在下で培養した細胞内の量と比べて、前記測定した量が多い又は少ない場合に、前記被験物質を腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質として選択することを含む。
【００２６】
本発明は、また、上記遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞を用いることを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。
【００２７】
上記スクリーニング又は評価する方法は、例えば遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞に被験物質を接触させること、及びノックインされたレポーター遺伝子の発現を上昇又は低下させる被験物質を選択することを含む。
【発明の効果】
【００２８】
関節の再生等の医学において、腱や靱帯は筋・骨格をつなぐ重要な組織である。そして、Ｍｋｘ遺伝子を過剰発現させると、腱の主要コンポーネントであるＩ型コラーゲンの発現が上昇することから、Ｍｋｘは腱の成熟過程において重要であることが示唆される。損傷した腱や靱帯の部位にＭｋｘ及びその上流・下流遺伝子等からなる医薬を外来的に導入することで、腱の治癒、運動器の再生や再建を促進することが期待される。
【００２９】
エーラスダンロス症候群等の腱及び／又は靭帯関連疾患に罹患している患者から採取した細胞を用いて、本発明の分化誘導剤で自家腱及び／又は靭帯細胞を製造することもでき、結果として該疾患に対する再生医療が可能となる。
【００３０】
Ｍｋｘ遺伝子が腱細胞や靱帯細胞特異的に蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子で置き換えられている本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、蛍光タンパクの発光を指標にＭｋｘを調節する被験物質のスクリーニングや評価、腱損傷モデル実験等における治癒過程でのＭｋｘの局所的な発現をモニターするためのモデル動物として有用である。
【００３１】
分化誘導剤や分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を用いて、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法は、腱分化の分子メカニズム理解の基礎となり、腱の障害やエーラスダンロス症候群等の腱関連疾患の治療標的発見を導くきっかけとなるかもしれない。
【００３２】
Ｍｋｘは、腱の発生・成熟に重要であることから、腱・靱帯等の疾患等で、Ｍｋｘそのものの遺伝子配列又はＭｋｘの遺伝子ネットワークに関与する上流及び下流遺伝子等の遺伝子に異常を起こしている可能性が大きい。それらの探索、診断、治療に、本発発明のスクリーニング方法が応用される。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法によって選択された物質や本発明の医薬によれば、腱又は靭帯関連疾患、特にＭｋｘに異常を抱える疾患を、予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】Ｍｋｘ変異マウスを作製するために設計するＭｋｘターゲッティングコンストラクトの一例を示す。ここで、矢印ａ〜ｅはジェノタイピング用ＰＣＲプライマー、□はＵＴＲ、■は翻訳領域、ＤＴ−ＡはジフテリアトキシンＡ、ＷＴは野生型アリル、ＴＡはターゲッティングされたアリルを意味する。
【図１Ｂ】野生型マウスとＭｋｘ変異マウスでの図１Ａのプライマーａ、ｂ及びｃを用いたゲノミックＰＣＲ（図面代用写真）を示す。
【図１Ｃ】上段は、野生型マウスの胚のＥ１３．５前肢（Ｆｏｒｅｌｉｍｂ）及び尾（Ｔａｉｌ）におけるＭｋｘのＷＩＳＨ（ホールマウント ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）（図面代用写真）を示し、そして下段は、野生型マウス及びＭｋｘ変異マウスのＶｅｎｕｓ蛍光シグナルの観察（図面代用写真）を示す。
【図１Ｄ】Ｅ１６．５のＶｅｎｕｓノックインへテロマウスの胚の尾におけるミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０；ｒｅｄ）を用いた免疫組織染色とＶｅｎｕｓ蛍光シグナルを観察した顕微鏡写真を示す。図中、○で囲んだ部分が筋肉のマーカー遺伝子であるミオシン重鎖発現細胞を示し、それ以外はＶｅｎｕｓ発現細胞の蛍光シグナルを示す。また、Ｂａｒは１００ μｍである。
【図１Ｅ】野生型マウスとＭｋｘ変異マウスのアキレス腱におけるＭｋｘのＲＴ−ＰＣＲ解析（図面代用写真）を示す。Ｇａｐｄｈは内在性コントールを示す。
【図２Ａ】３ヶ月齢の野生型マウスにおいて、膝蓋腱（Ａの矢印）、アキレス腱（Ｃの矢印、後肢（Ｅの矢印）、前肢の腱（Ｇの矢印）、尾腱（Ｉの矢印）、背中の腱（Ｋの矢印）及び広頸筋腱（Ｍの矢印）を観察した図面代用写真、並びに３ヶ月齢のＭｋｘノックアウトマウスにおいて、膝蓋腱（Ｂの矢印）、アキレス腱（Ｄの矢印、後肢（Ｆの矢印）、前肢の腱（Ｈの矢印）、尾腱（Ｊの矢印）、背中の腱（Ｌの矢印）及び広頸筋腱（Ｎの矢印）を観察した図面代用写真を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスでは、腱の異常が観察される。
【図２Ｂ】野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱の引張強度を測定したグラフである。
【図２Ｃ】野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のヤング率を測定したグラフである。
【図３Ａ】３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱のＨ＆Ｅ染色像（図面代用写真）を示す。ａ及びｃのバーは１ｍｍを意味し、ｂ及びｄのバーは５０μｍを意味する。Ｍｋｘ欠損マウスでは、腱の低形成が起きていることがわかる。
【図３Ｂ】７日齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱の厚さを測定したグラフである。Ｍｋｘノックアウトマウスは、膝蓋腱の厚さが有意に減少している。
【図３Ｃ】３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱のＨ＆Ｅ染色像（図面代用写真）を示す。ａ及びｃのバーは２００μｍを意味し、ｂ及びｄのバーは５０μｍを意味する。△矢頭は、尾腱の線維束を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスの尾腱の線維束は有意に細っている。
【図３Ｄ】３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度を測定したグラフである。
【図３Ｅ】Ｅ１８．５の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの胚の尾腱のアザン染色像（図面代用写真）を示す。△矢頭は尾腱の線維束を示す。また、左図のバーは５００μｍ、右図のバーは２００μｍを意味する。
【図３Ｆ】野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン原線維の電子顕微鏡観察像（図面代用写真）を示す。ここで、バーは２００ｎｍを意味する。
【図４Ａ】８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン量の測定結果を示す。Ｍｋｘ欠損腱細胞では、Ｉ型コラーゲン産生能が低下することがわかる。
【図４Ｂ】８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）とβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロット解析の結果（図面代用写真）を示す。
【図４Ｃ】８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２及びＳｃｘのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析結果を示す。
【図４Ｄ】ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクター（Ｍｋｘ）又は空ベクター（Ｅｍｐｔｙ）をトランスフェクションしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、ＦＬＡＧ及びβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロットの結果（図面代用写真）を示す。
【図４Ｅ】腱分化ネットワークの模式図を示す。
【図５Ａ】Ｍｋｘ変異ＥＳ又はマウスのサザンブロット解析のために、野生型（ＷＴ）及びターゲッティングされたアリル（ＴＡ）と各プローブの位置を示す。ここで、ＮはＮｃｏＩを意味し、ＳはＳａｃＩを意味する。
【図５Ｂ】組換え胚性幹細胞のサザンブロット解析結果（図面代用写真）を示す。ここで、ＴＡはターゲッティングされたアリルを意味し、ＷＴは野生型アリルを意味する。
【図５Ｃ】野生型マウス及びＭｋｘ変異マウスのサザンブロット解析結果（図面代用写真）を示す。
【図６Ａ】野生型マウス（成体）の筋肉、アキレス腱及び尾腱におけるＭｋｘのＲＴ−ＰＣＲ解析（図面代用写真）を示す。Ｍｋｘヘテロマウス（成体）のＶｅｎｕｓの発現は、Ｍｋｘ発現とリンクすることがわかる。Ｇａｐｄｈは内在性コントロールを示す。
【図６Ｂ】Ｍｋｘヘテロマウス及び野生型マウスのアキレス腱（Ｂ−Ｅ）、尾腱（Ｆ−Ｉ）及び体幹の腱（Ｊ−Ｍ）におけるＶｅｎｕｓの発現と外観写真を示す。
【図７】出生後の各ステージにおけるＭｋｘ＋／＋，Ｍｋｘ＋／−及びＭｋｘ−／−マウスの体重を比較したグラフを示す。野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスとで体重の差は見られない。
【図８】３ヶ月齢の野生型マウス（ＷＴ）のアキレス腱（Ａ）、尾腱（Ｃ）、膝蓋腱（Ｅ）及び体幹の腱（Ｇ）の外観写真と、３ヶ月齢のネオマイシン耐性遺伝子を除去したＭｋｘノックアウトマウス（ＫＯ）のアキレス腱（Ｂ）、尾腱（Ｄ）、膝蓋腱（Ｆ）及び体幹の腱（Ｈ）の外観写真を示す。腱の異常は、ネオマイシン耐性遺伝子を除去させたノックアウトマウスにおいても起きている。
【図９】野生型マウス及びＭｋｘノックアウトマウスの膝十字靭帯のＨ＆Ｅ染色像（図面代用写真）を示す。左図のバーは５００μｍ、右図のバーは２００μｍを意味する。膝十字靭帯は、Ｍｋｘノックアウトマウスにおいても影響はない。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤は、以下の（Ａ）から（Ｄ）の少なくとも一種を有効成分として含む。
（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、
（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクター
【００３６】
Ｍｋｘ（Ｍｏｈａｗｋ、別名 Ｉｒｘｌ１）とは、胎生期において、腱に発現するホメオボックス型の転写因子である。Ｍｋｘは、不定型ホメオボックス遺伝子のＴＡＬＥスーパークラスの中の新しく分類されたクラスに属する唯一の遺伝子である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３５（３） ｐ７９２−８０１）。Ｍｋｘは、腱、筋肉、軟骨の前駆細胞、オスの生殖腺、及び腎臓の尿管芽先端で発現することが報告されている（Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３５（３） ｐ７９２−８０１等）。本発明者らも、Ｅ９．５、Ｅ１０．５及びＥ１１．５のマウス胚を用いた１５２０個の転写因子及び転写コファクターのホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションデータベース（ＥＭＢＲＹＳ）の構築過程で、腱で発現する転写因子として同定していた（Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７（６） ｐ８３６−８４８）。
【００３７】
本発明では、細胞から腱細胞及び／又は靱帯細胞を作製、再生、増強等する分化誘導剤としてＭｋｘタンパク質を用いる。
【００３８】
本発明の分化誘導剤を実験及び研究用に供する場合は、Ｍｋｘタンパク質の由来は問わない。例えば、ヒト、マウス、サル、チンパンジー、ブタ、イヌ等の哺乳動物が挙げられる。本発明の分化誘導剤をヒトの腱細胞及び／又は靱帯細胞を再生等の医療行為に使用する場合は、ヒトのＭｋｘタンパク質を用いることが好ましい。
【００３９】
ヒトＭｋｘタンパク質に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＰ＿７７５８４７として入手することができ、Ｍｋｘタンパク質は、３５２個のアミノ酸で構成されるタンパク質である。また、ヒトＭｋｘ遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＭ＿１７３５７６として入手可能である。ヒトＭｋｘ遺伝子は、ヒト第１０染色体上に存在し、全長で約３６５８の塩基対よりなり、７個のエキソンで構成される。マウスＭｋｘ遺伝子は、ＮＣＢＩから、アクセッション番号ＮＭ＿１７７５９５として入手することができる。
【００４０】
本発明の分化誘導剤に用いる（Ａ）Ｍｋｘタンパク質は、天然由来のタンパク質の他に、組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質は、常法により、Ｍｋｘタンパク質をコードする核酸を組み込んだ形質転換体を培養等することにより得ることができる。
【００４１】
本発明の分化誘導剤に用いる（Ｂ）Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体は、当業者に公知の方法により容易に取得することができる。変異体が分化誘導活性を有するか否かは、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ等で測定することができる。
【００４２】
Ｍｋｘタンパク質の変異体は、また、Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有するものでもよい。
【００４３】
本発明の分化誘導剤は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする（Ｃ）核酸でもよい。核酸には、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡが挙げられる。染色体ＤＮＡは、例えばＰＣＲによる増幅や細胞等からＤＮＡライブラリ−を調製し、Ｍｋｘタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブでスクリーニングすることにより取得する。ｃＤＮＡは、例えば腱細胞等からＲＮＡを抽出し、Ｍｋｘタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＰＣＲ法により取得する。
【００４４】
本発明の分化誘導剤は、（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクターでもよい。発現ベクターは、公知のベクターにＭｋｘ遺伝子を発現可能に連結することで得る。前記ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター等が挙げられる。
【００４５】
前記プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃＨｉｓ，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０，ｐＹＥ５２等）が挙げられる。ファージベクターとしては、λファージ等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ジャガイモエックスウイルス等が挙げられる。
【００４６】
Ｍｋｘ遺伝子をベクターへ挿入するには、ＤＮＡを制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位に挿入する方法又はリコンビナーゼやＧａｔｗａｙシステム等を用いたクローニング法等が採用される。その際、Ｍｋｘ遺伝子の機能を発揮できるようにベクターに組み込む必要がある。そのために、ベクターには、Ｍｋｘ遺伝子の他に、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有させるとよい。選択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等を挙げることができる。
【００４７】
発現ベクターは、Ｍｋｘ遺伝子を直接発現させるものでも、例えばＦＬＡＧタグやＭｙｃタグ等の他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として発現させるものでもよい。
【００４８】
本発明の分化誘導剤は、さらに、以下の（Ａ１）〜（Ｄ１）の少なくとも一種を含んでいてもよい。
（Ａ１）Ｓｃｘタンパク質、
（Ｂ１）前記Ｓｃｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、Ｉ型コラーゲンを誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ１）前記（Ａ１）又は（Ｂ１）のタンパク質をコードする核酸、並びに
（Ｄ１）前記（Ｃ１）の核酸を含む発現ベクター。
【００４９】
Ｓｃｘタンパク質は、前述のとおり、腱の主成分であるＩ型コラーゲンを直接誘導することが示唆されている（非特許文献１）。Ｓｃｘノックアウトマウスは、腱を部分的に消失する。一方、Ｍｋｘノックアウトマウスは、実施例に示すように、腱の低形成は認められるが、腱細胞数は変わらない。このことから、Ｓｃｘ腱細胞分化の初期段階から必須の因子であり、Ｍｋｘは、後期分化・成熟に重要であることが予想される。また、腱細胞の分化とそこでのＩ型コラーゲンの産生には、Ｓｃｘ遺伝子による初期分化と、Ｍｋｘによる成熟の両者の協同作業が重要といえる。したがって、本発明の分化誘導剤に（Ａ１）〜（Ｄ１）のＳｃｘ関連物質を含めることは、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化をより効率的に行う点で好ましい。
【００５０】
Ｓｃｘタンパク質に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＰ＿００１００８２７２として入手することができる。また、Ｓｃｘ遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＭ＿００１００８２７１として入手可能である。
【００５１】
（Ａ１）〜（Ｄ１）の作製方法は、タンパク質及び遺伝子がＭｋｘと異なる以外は（Ａ）〜（Ｄ）で述べた内容と同じである。
【００５２】
本発明は、また、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞の生育に適した条件下で、上記分化誘導剤を用いて前記細胞を培養する工程、及び前記培養された細胞の中から、腱及び／又は靭帯細胞を選択する工程を含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する方法を提供する。
【００５３】
前記腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞は、例えば、繊維芽細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２等）、腱前駆細胞、靱帯前駆細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。
【００５４】
以下に、分化誘導方法の一態様を説明する。まず、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞に分化誘導剤を導入して、それを培養する。具体的には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＤＭＥＭ培地等で培養して得られる５０％コンフルエントのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、Ｍｋｘ発現ベクターをトランスフェクションする。トランスフェクションは、公知の方法で行え、またトランスフェクション以外の導入法として例えばウィルスベクターによる導入法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム法等が挙げられる。
【００５５】
培養方法は、分化誘導方法に適したものであれば、特に制限されない。例えば、平面培養法、浮遊凝集培養法、懸濁培養法、フィーダー細胞との共培養法、旋回培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法等が挙げられる。
【００５６】
培養後、回収した細胞を細胞溶解バッファーで溶解して全可溶型タンパク質を取得する。全可溶型タンパク質をウエスタンブロット等にかけ、Ｉ型コラーゲンの存在を確認することが好ましい。
【００５７】
上記分化誘導剤を用いてＭｋｘ遺伝子を過剰発現させると、腱の主要コンポーネントであるＩ型コラーゲンの発現が上昇する。損傷した腱部位に分化誘導剤や分化誘導剤を用いて製造した腱細胞及び／又は靱帯細胞を導入すれば、腱の治癒、運動器の再生や再建を促進することが期待できる。そこで、本発明は、上記分化誘導剤、又は上記分化誘導剤を用いて製造した腱及び／又は靭帯細胞を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【００５８】
本発明の分化誘導剤は、遺伝子治療用にも好適である。遺伝子治療の腱又は靭帯関連疾患の候補は、エーラスダンロス症候群がある。エーラスダンロス症候群は、ヒトの皮膚や組織を形成するコラーゲン等の結合組織成分が先天性代謝異常を示し、その結果、靱帯や関節の異常な可動性亢進等を引き起こす疾患である。現在、根本的治療法は見つかっていない。エーラスダンロス症候群で腱及び／又は靭帯が罹患している患者から採取した細胞を用いて、分化誘導剤で自家腱及び／又は靭帯細胞を製造することにより、該疾患に対する再生医療が期待される。
【００５９】
上記医薬の投与形態は、特に限定されないが、好ましくは損傷した腱及び／又は靱帯部位への直接投与である。具体的には、皮下注射剤、筋肉注射剤等の注射剤、点滴剤、経皮投与剤、軟膏剤等の外用薬剤、細胞の単層又は複層のシート等が挙げられる。
【００６０】
これらの剤形に適用される助剤や製剤技術には当業分野に公知のものを使用可能である。例えば、注射剤であれば、適当な緩衝剤、安定剤、保存剤、無痛化剤、等張化剤、溶解補助剤等が挙げられる。
【００６１】
本発明の医薬は、ヒトを含む動物に対して、薬理上必要量が投与される。薬理上必要量は、剤形、投与方法、患者や実験動物の症状、治療部位、患者や実験動物の年齢、性別、体重等を考慮して、医師等の判断により適宜決められる。
【００６２】
本発明は、また、Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む、腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物を提供する。「Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損」とは、本明細書において、Ｍｋｘ遺伝子が本来有する正常な機能を十分に発揮しないか、全く発揮しない状態を意味する。
【００６３】
遺伝子改変非ヒト動物には、Ｍｋｘ欠損遺伝子のヘテロ接合体（Ｍｋｘ＋／−と表示することがある）とホモ接合体（Ｍｋｘ−／−と表示することがある）の二種類がある。本明細書中、「Ｍｋｘ変異」（例えばＭｋｘ変異マウス）の記載は、両者を含む意味で使用する。
【００６４】
ノックアウトマウスのようなホモ接合体は、遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／又は靭帯が野生型動物と比べて有意に低形成を示す。具体的には、Ｍｋｘノックアウトマウスは、全身の腱が低形成になり、尾腱の線維束が細くなるにもかかわらず、腱細胞の数は野生型と同程度である。さらに、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱は、コラーゲン原線維の径が小さく、Ｉ型コラーゲンの量が低下する。以上の結果から、Ｍｋｘは、腱細胞において、Ｉ型コラーゲンの産生能に寄与し、腱細胞の分化に重要な役割を担っていることが示唆される。この知見に基づく本発明のＭｋｘノックアウトマウスは、Ｍｋｘの腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導への研究や腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬の探索に有用である。
【００６５】
一方、ヘテロマウスのようなヘテロ接合体は、腱形成に異常が見られない。ヘテロマウスは、腱に異常がなく、腱や靭帯などＭｋｘが発現する細胞で蛍光タンパク質のＶｅｎｕｓが発現するので、Ｍｋｘがどこで発現しているか、Ｍｋｘがどのような物質や遺伝子で発現が誘導されるか等の解析や、腱組織がどのようにできるかの観察、腱細胞を分離して細胞の性状を調査する等に有用である。
【００６６】
非ヒト動物の例は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、チンパンジー、サル、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヒツジ等の家畜類、イヌ、ネコ等の愛玩動物であり、好ましくはマウスである。
【００６７】
Ｍｋｘ遺伝子を機能的に欠損させる方法は、当業分野で公知の方法のいずれも採用することができる。具体的には、Ｍｋｘ遺伝子を含むゲノムＤＮＡのエキソンを含む領域をターゲッティングベクターで相同組み換えする方法が例示される。
【００６８】
Ｍｋｘ遺伝子を機能的に欠損させる際に、Ｍｋｘ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたことにより腱細胞特異的にレポーター遺伝子を発現させることが好ましい。ヘテロ接合体のＭｋｘヘテロマウスのＭｋｘ欠損部位を蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子で置き換えると、レポーター遺伝子が腱細胞特異的に発現するとともに、正常な腱細胞もまた視認できる（図１Ｄ）。このようなＭｋｘヘテロマウスは、Ｍｋｘの腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導への研究や、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬の探索に極めて有用である。
【００６９】
前記レポーター遺伝子には、Ｖｅｎｕｓ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＦｌＡｓＨ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲＦＰ１、ｍＰｌｕｍ、ＰｈｉＹＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子等を使用することができる。
【００７０】
さらに、Ｍｋｘ遺伝子の下流に、ネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを挿入することが好ましい。
【００７１】
上記選択マーカーの両端をｌｏｘＰ配列で挟んでおくことがより好ましい。こうすると、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いて、選択マーカーの除去が可能である。
【００７２】
遺伝子改変非ヒト動物は、それ自体公知の方法により製造することができる。具体的には、
１．Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞クローンを作製する工程、
２．上記胚性幹細胞クローンを胚にインジェクションする工程、
３．キメラ胚を動物の子宮に移して、キメラ動物を作る工程、
４．キメラ動物を交配させ、ヘテロ接合体を得る工程、及び
５．ヘテロ接合体同士を交配させ、ホモ接合体を得る工程、
を含む。
【００７３】
Ｍｋｘヘテロマウス及びＭｋｘノックアウトマウスを例に、遺伝子改変非ヒト動物をより具体的に説明する。ゲノムＤＮＡのＭｋｘ遺伝子を欠損させるために、胚性幹細胞での相同組み換えにおいてＭｋｘ遺伝子の部分領域（エキソンの一部を含む）を、例えば蛍光タンパク質遺伝子とポジティブ選択マーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）とのカセットに置き換わるようなターゲッティングベクターを設計する（図１Ａ）。また、ポジティブ選択マーカー遺伝子の両側にＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列のようなリコンビナーゼ標的配列を加えると、Ｃｒｅ酵素を介したマーカー遺伝子の切除が可能である。ネガティブ選択用にジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子等を組み込む。
【００７４】
上記のターゲッティングベクターを、胚性幹細胞クローンや、初代培養細胞株等の体細胞へ導入する。胚性幹細胞クローンは、マウス、ヒト、ハムスター、ブタ等の動物の胚盤胞から分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することにより樹立することができる。市販の胚性幹細胞クローンを使用することができ、例えばＴＴ２、ＥＳ−Ｄ３、ＳＣＣ−ＰＳＡ１等が挙げられる。
【００７５】
ターゲッティングベクターの組み込まれた胚性幹細胞等を、ネオマイシン耐性選択ならＧ４１８抗生物質を含む培地といった適宜の選択培地で培養後、組換え胚性幹細胞クローンを分離する。
【００７６】
適切に組み込まれた組換え胚性幹細胞クローンのスクリーニングを、サザンブロットやＰＣＴ法により行う。図５Ａに、サザンブロット解析のための野生型（ＷＴ）及びターゲッティングされたアリル（ＴＡ）と各プローブの位置を示す。
【００７７】
相同組み換えの確認された胚性幹細胞クローンを、マイクロインジェクション法、凝集法等で８細胞期等のマウス胚に導入してキメラ胚を作る。
【００７８】
得られたキメラ胚を動物の子宮に移してキメラ動物を作る。得られたキメラ動物を野生型動物（例えばＣ５７ＢＬ／６マウス）と掛け合わせる。生殖細胞への伝達をゲノミックＰＣＲやサザンブロット解析により確認する。ＬｏｘＰ配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子カセットを、Ｍｅｏｘ−Ｃｒｅトランスジェニック動物との掛け合わせにより除去する。Ｃｒｅを介したネオマイシン耐性遺伝子除去をゲノミックＰＣＲで確認する。キメラ動物を野生型動物と交配させ、Ｍｋｘヘテロ接合体を得る。
【００７９】
Ｍｋｘヘテロ接合体同士を交配させて、ホモ接合体（Ｍｋｘノックアウトマウス）を得る。
【００８０】
本発明は、また、上記分化誘導剤、上記分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞、若しくは遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患を解析又は分析する方法を提供する。分析や解析の対象は、細胞に分化誘導剤を作用させ分化させて得られるＭｋｘヘテロマウスの胚とその組織、トランスジェニック非ヒト動物からを得られた腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞等である。分析や解析の手法を以下に例示する。
【００８１】
ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）は、マウス胚での遺伝子発現パターンの解析に有効である。ＷＩＳＨは、常法を用いることができ、例えばＹｏｋｏｙａｍａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｄｙｎａｍｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｎ−２８ ｄｕｒｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ８（３）：１５５−１６０に記載の方法に従う。これに用いるプローブの合成方法の詳細は、ＥＭＢＲＹＳウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｒｙｓ．ｊｐ／ｈｔｍｌ／ＭａｉｎＭｅｎｕ．ｈｔｍｌ？）にて閲覧可能である。
【００８２】
Ｖｅｎｕｓ等の蛍光タンパク質は、Ｍｋｘ遺伝子の各組織での発現パターンを観察するのに有効である。
【００８３】
免疫組織染色は、マウス胚や成体マウスの各組織の観察に有効である。各組織に特異的なマーカーとして、筋肉ではミオシン重鎖、血管ではＰＥＣＡＭ１等がある。これらのマーカー遺伝子の発現を、マーカー特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色する。まず、マウス胚をパラホルムアルデヒドに固定した組織を凍結組織切片作製用包埋剤に包埋して凍結する。検体を薄切りして風乾後、ブロッキング剤にて１時間ブロッキングする。その切片を抗ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０，ＤＳＨＢ）でインキュベートし、さらに、二次抗体と共にインキュベートする。ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘへテロマウスでは、ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０）の赤い染色とＶｅｎｕｓの緑色シグナルの両方が観察される。
【００８４】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱の異常を調査するために、腱及び靱帯の組織学的観察を行うことが有効である。その手法として、以下に電子顕微鏡観察、Ｈ＆Ｅ染色及びアザン染色を例示する。
【００８５】
電子顕微鏡を用いると、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱におけるコラーゲン原線維を観察できる。まず、アキレス腱断片を採取し、緩衝液にて固定する。緩衝液及び生理食塩水で洗浄し、エタノールにて脱水後、樹脂に包埋して極薄切りにする。得られた切片を銅の格子上に置き、透過型電子顕微鏡にて観察する。
【００８６】
Ｈ＆Ｅ染色から、野生型マウスやＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度を求めることができる。まず、成体の膝、尾等の組織を採取し、パラホルムアルデヒド等に固定する。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。
【００８７】
アザン染色は、コラーゲンを検出する。まず、マウスの尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに固定する。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、アゾカルミン−アニリンブルー（アザン）で染色する。
【００８８】
Ｍｋｘ欠損した腱の力学的特性を調べるには、例えば筋腱ジャンクションから踵結節までの全腱を用いて引張試験を行う。張力の決定は、Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｅ， ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４（２１）：３８０５−３８１３で報告された方法に従って、単軸の材料テストシステム（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ＡＧＳ−Ｇ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ． Ｌｔｄ．）を使用するとよい。それぞれの検体の最初の長さと断面積を、デジタルカリパスを使用して、Ｈ＆Ｅ染色した切片の顕微鏡検査によって測定する。データ収集には、例えばＴｒａｐｅｚｉｕｍソフトウェア（登録商標、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）を用いる。各検体の応力−歪み曲線は、ｌｏａｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔカーブから作られ、ヤング率はそれぞれの応力−歪み曲線と腱断面積から算出される。
【００８９】
本発明は、また、被験物質の存在下又は非存在下で、上記分化誘導方法を行い、該被験物質存在下又は非存在下での腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を比較することを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。
【００９０】
好ましくは、被験物質の存在下で培養した細胞における、Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量を測定すること、並びに前記被験物質を非存在下で培養した細胞内の量と比べることを含む。測定量が多いか又は少ない場合に、前記被験物質を腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質として選択する。
【００９１】
上記培養培地は、用いる細胞に応じて適宜決められる。例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭ１６４０培地、１９９培地等である。培養条件も、細胞に応じて適宜、決められる。
【００９２】
本発明は、また、上記遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞を用いることを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法を提供する。好ましくは、遺伝子改変非ヒト動物から採取した腱、その組織又はその細胞に被験物質を接触させること、及びノックインされた蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子の発現を上昇又は低下させる被験物質を選択することを含む。
【００９３】
上記スクリーニング又は評価する方法に供する被験物質は、特に制限されない。例えば、天然又は人工の有機化合物や無機化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖質、脂質、細胞、植物、動物等の抽出物等である。
【００９４】
被験物質と分化誘導させる細胞や遺伝子改変非ヒト動物の組織等との接触は、特に制限されないが、添加、トランスフェクション、ウィルスベクターによる導入等である。
【００９５】
Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量、レポーター遺伝子の発現の上昇又は低下の測定は、常法に基づく、例えばノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット法、免疫学的手法、 等である。
【実施例】
【００９６】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕（分化誘導剤の作製と評価）
Ｍｋｘタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターからなる分化誘導剤を、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス線維芽細胞に導入してＭｋｘを過剰発現させることにより、分化誘導剤の効果を調べた。
【００９７】
まず、マウスＭｋｘ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７７５９５）の全タンパク質コード領域をｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶＴＭ−７．１ベクター（ＳＩＧＭＡ社）に組み込むことにより、ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクターを作製した。また、ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ遺伝子を組み込まない空ベクターを陰性対照として用いた。
【００９８】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＡＴＤＣから入手）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。６ウエルプレートにて培養した５０％コンフルエントのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、トランスフェクション試薬（製品名、ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｒｏｃｈｅ社）１０μｌ、及び上記ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクター又は空ベクター１μｇをトランスフェクションした。
【００９９】
４８時間培養後、細胞を回収した。ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ＤＯＣ，０．１％ＳＤＳ，１％ＮＰ４０；ｐＨ ８．０）で細胞を溶解して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中の全可溶型タンパク質を取得し、以下のウエスタンブロット解析に供した。
【０１００】
取得した全可溶型タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にセミドライ法でブロットした。メンブレンをブロッキング剤（製品名Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）にて３０分間ブロッキングし、抗Ｉ型コラーゲン抗体又は抗β−アクチン抗体と共に４℃、一晩インキュベートした。
【０１０１】
洗浄後、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Ａ６１５４，ＳＩＧＭＡ社）、又はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａ２３０４，ＳＩＧＭＡ社）と共に１時間インキュベートした。抗原−抗体の発色には、化学発光試薬（製品名Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ、ナカライテスク社）を用いた。
【０１０２】
図４Ｄに、ＦＬＡＧ−Ｍｋｘ発現ベクター又は空ベクターをトランスフェクションしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、ＦＬＡＧ及びβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロットの結果を示す。図４Ｄに示すとおり、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞内にＭｋｘを過剰発現させると、Ｉ型コラーゲン量が増大した。
【０１０３】
〔実施例２〕（Ｍｋｘ変異マウスの作製と評価）
マウスの染色体上のＭｋｘ遺伝子を機能的に欠損させるために、図１Ａに、胚性細胞での相同組み換えにおいてＭｋｘの翻訳スタートからエキソン２の終わりまでをＭｋｘ遺伝子がＶｅｎｕｓ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子とのカセットで置き換わるようなターゲッティングベクターを設計した。
【０１０４】
図１Ａのターゲッティングコンストラクトをもとに、Ｃ５７ＢＬ／６ゲノムＢＡＣクローン（ＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ社）を鋳型にしたＰＣＲを行うことによって、Ｍｋｘ遺伝子の５‘及び３’側の隣接領域を増幅した。これらの相同組み換え領域を、Ｖｅｎｕｓ遺伝子とポジティブ選択用のネオマイシン耐性遺伝子とネガティブ選択用のジフテリアトキシンＡ（ＤＴ−Ａ）遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のベクターに組み込むことにより、ターゲッティングベクターを作製した。
【０１０５】
上記のターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで直鎖化し、ＴＴ２Ｆ胚性幹細胞へエレクトロポレーション法により導入した。ターゲッティングベクターの組み込まれたＴＴ２Ｆ胚性幹細胞を、Ｇ４１８を含む培地で培養して、組換え胚性幹細胞クローンを分離した。
【０１０６】
適切に組み込まれた組換え胚性幹細胞クローンのスクリーニングを、５‘プローブ、３’プローブ及びｎｅｏプローブを用いたサザンブロット法により行った。
【０１０７】
図５Ａに、サザンブロット解析のための、野生型（ＷＴ）及びターゲッティングされたアリル（ＴＡ）と各プローブの位置を示す。図５Ｂに、組換え胚性幹細胞のサザンブロットの結果を示す。図５Ｃに、野生型マウス及びＭｋｘ変異マウスのサザンブロットの結果を示す。
【０１０８】
相同組み換えの確認された２つの胚性幹細胞クローンを８細胞期のマウス胚にインジェクションした。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと掛け合わせ、生殖細胞への伝達をゲノミックＰＣＲにより確認した。ＬｏｘＰ配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子カセットを、Ｍｅｏｘ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスとの掛け合わせにより除去し、Ｃｒｅを介したネオマイシン耐性遺伝子除去の確認をゲノミックＰＣＲにより行った。ジェノタイピングに使用したＰＣＲプライマーの配列を表１に記載する。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
図１Ｂに、野生型マウスとＭｋｘ変異マウスのプライマーａ、ｂ及びｃを用いたゲノミックＰＣＲ結果を示す。
【０１１１】
ターゲッティングベクターを用いて作製されたＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウスは、Ｍｋｘの発現が陽性であり、かつ、ノックインしたＶｅｎｕｓ遺伝子の発現もまた予想される。そこで、マウス胚の蛍光シグナルの観察を行った。Ｍｋｘプローブを用いたホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【０１１２】
図１Ｃに、Ｅ１３．５前肢（Ｆｏｒｅｌｉｍｂ）及び尾（Ｔａｉｌ）における野生型マウスとＭｋｘヘテロマウスの胚のＭｋｘのホールマウントｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを示す。ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウスの前肢と尾では、Ｍｋｘの発現と同様の場所で、Ｖｅｎｕｓの発現が観察された。
【０１１３】
Ｍｋｘヘテロマウス胚の免疫組織染色のために、Ｅ１６．５マウス胚の尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で２時間固定した。組織を、凍結組織切片作製用包埋剤（製品名Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社）に包埋し、液体窒素で直ちに凍結した。検体を１０μｍに薄切りし、その凍結切片を風乾後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）にて１時間ブロッキングした。その切片を抗ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０，ＤＳＨＢ）と共に４℃、一晩インキュベートした。洗浄後、二次抗体蛍光試薬（製品名Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｌｅｘａ ５９４）と共に１時間インキュベートした。
【０１１４】
図１Ｄに、Ｅ１６．５のＶｅｎｕｓノックインＭｋｘへテロマウスの胚の尾における抗ミオシン重鎖抗体（ＭＦ２０；ｒｅｄ）を用いた免疫組織染色とＶｅｎｕｓ蛍光シグナルを観察した顕微鏡写真を示す。図中、○で囲んだ部分はＭＦ２０免疫組織染色（実際は赤色に呈色）を示し、それ以外はＶｅｎｕｓ蛍光シグナル（実際は緑色に呈色）を示す。ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウスの胚は、Ｅ１６．５の尾において腱特異的なＶｅｎｕｓの発現を示した。
【０１１５】
Ｍｋｘヘテロマウス胚の解析に加え、その成体マウスにおけるＶｅｎｕｓの発現についても調査した。成体の腱でのＭｋｘの発現は明らかではなかったので、成体の腱でのＭｋｘの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調査した。図６Ａに、野生型マウス（成体）の筋肉、アキレス腱及び尾腱におけるＭｋｘ及びＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。図６Ａから、Ｍｋｘがアキレス腱及び尾腱で強く発現していることを確認した。
【０１１６】
図６Ｂに、Ｍｋｘヘテロマウス及び野生型マウスのアキレス腱（Ｂ−Ｅ）、尾腱（Ｆ−Ｉ）及び体幹の腱（Ｊ−Ｍ）におけるＶｅｎｕｓの発現と外観写真を示す。図６Ｂから、ＭｋｘヘテロマウスにおけるＶｅｎｕｓは、アキレス腱、尾腱及び体幹の腱において特異的発現を示した。
【０１１７】
Ｍｋｘ遺伝子の欠損を確認するために、Ｍｋｘ変異マウスを用いたＲＴ−ＰＣＲによる発現解析を行った。核酸抽出薬（製品名ＩＳＯＧＥＮ、Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて全ＲＮＡを分離した。分離した全ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（製品名Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて逆転写し、そのｃＤＮＡを鋳型にＤＮＡポリメラーゼ（製品名Ｇｏ−Ｔａｑ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＰＣＲした。プライマー配列を表２に示す。Ｇａｐｄｈは、ｍＲＮＡのコントロールとして用いた。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
図１Ｅに、野生型マウスとＭｋｘ変異マウスのアキレス腱におけるＭｋｘ及びＧａｐｄｈのＲＴ−ＰＣＲの解析結果を示す。図１Ｅから、Ｍｋｘノックアウトマウス（成体）のアキレス腱において、Ｍｋｘの発現が完全に消失していることがわかった。
【０１２０】
以上の結果から、Ｍｋｘ変異マウス（ＶｅｎｕｓノックインＭｋｘヘテロマウス及びＭｋｘノックアウトマウス）は、Ｍｋｘの機能解析だけでなく、腱の生物学的解析やＭｋｘの発現解析に有用であることが示された。
【０１２１】
〔実施例３〕（Ｍｋｘノックアウトマウスの作製と評価）
実施例２で作製したＭｋｘヘテロマウス同士を掛け合わせることにより、Ｍｋｘノックアウトマウスを作製した。産まれた各遺伝子型の新生仔マウスの数と比を表３に示す。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
ヘテロマウス同士の掛け合わせによって産まれた２０６匹の新生仔マウスのジェノタイピングの結果は、メンデルの法則に従った。
【０１２４】
Ｍｋｘヘテロマウス及びＭｋｘホモマウス（ノックアウトマウス）は、問題なく生存、生殖し、重量測定の結果も野生型マウスと変わらなかった（図７）。
【０１２５】
Ｍｋｘヘテロマウスでは、腱の異常は見られなかった（図６Ｂ）。腱形成におけるＭｋｘの役割を調査するために、Ｍｋｘノックアウトマウスで腱の異常が観察されるか否かを調べた。
【０１２６】
図２Ａに、野生型マウスにおいて、膝蓋腱（Ａの矢印）、アキレス腱（Ｃの矢印、後肢（Ｅの矢印）、前肢の腱（Ｇの矢印）、尾腱（Ｉの矢印）、背中の腱（Ｋの矢印）及び広頸筋腱（Ｍの矢印）を観察した写真、並びにＭｋｘノックアウトマウスにおいて、膝蓋腱（Ｂの矢印）、アキレス腱（Ｄの矢印、後肢（Ｆの矢印）、前肢の腱（Ｈの矢印）、尾腱（Ｊの矢印）、背中の腱（Ｌの矢印）及び広頸筋腱（Ｎの矢印）を観察した写真を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスでは、膝蓋腱、アキレス腱、尾腱、四肢の腱、体幹の腱及び広頸筋腱が、野生型マウスに比べて低形成であり、白色が薄くなっていた。この腱の異常は、７日齢から８ヶ月齢までのＭｋｘノックアウトマウスとネオマイシン耐性遺伝子を除去したマウス（図８）においても観察された。
【０１２７】
Ｍｋｘが欠損した腱の力学的特性を調べるために、筋腱ジャンクションから踵結節までの全腱を用いて引張試験を行った。張力の決定は、Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｅ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４（２１）：３８０５−３８１３で報告された方法に従って、単軸の材料テストシステム（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ ＡＧＳ−Ｇ、島津社）を使用して行った。検体を、０．５ ｍｍ／ｓｅｃの重圧率で引張した。
【０１２８】
それぞれの検体の最初の長さと断面積を、デジタルカリパスを使用して、Ｈ＆Ｅ染色した切片の顕微鏡検査によって測定した。データ収集はＴｒａｐｅｚｉｕｍ（登録商標、島津社）ソフトウェアを用いて行った。各検体の応力−歪み曲線は、ｌｏａｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔカーブから作られ、ヤング率はそれぞれの応力−歪み曲線と腱断面積から算出した。
【０１２９】
図２Ｂに、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱の引張強度を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスのアキレス腱は、引張強度が低く、機能低下が見受けられた。図２Ｃに、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のヤング率を示す。単位面積あたりの引張強度及び単位面積あたりの弾力性を示すヤング率の値は、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスでほぼ同程度であった。以上の結果から、Ｍｋｘノックアウトマウスのアキレス腱における引張強度の低下は、腱が細くなることに起因していることが示唆された。
【０１３０】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱の異常をさらに詳細に調査するために、組織学的解析を行った。成体マウスの膝又は尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１３１】
図３Ａに、３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱のＨ＆Ｅ染色像を示す。Ｈ＆Ｅ染色の結果、３ヶ月齢のＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱は、野生型マウスに比べて薄いことが分かった。
【０１３２】
図３Ｂに、７日齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの膝蓋腱の厚さを示す。７日齢のノックアウトマウスにおいても、膝蓋腱が薄く、野生型マウスの腱の約半分の厚さになっていた（図３Ｂ）。
【０１３３】
図９に、野生型マウス及びＭｋｘノックアウトマウスの膝十字靭帯のＨ＆Ｅ染色像を示す。腱と同様の組成を持つ組織である靭帯の１つである膝十字靭帯においては、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスとの間に差は見られなかった。
【０１３４】
図３Ｃに、３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱のＨ＆Ｅ染色像を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスの尾腱でも、腱線維束の径の縮小（図３Ｃの△矢頭）が見られた。
【０１３５】
図３Ｄに、３ヶ月齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度を示す。Ｍｋｘノックアウトマウスの尾腱では、細胞密度が高く、１つの尾腱線維束における細胞数は野生型マウスと同程度であった。このことから、Ｍｋｘノックアウト腱細胞は、機能的に不完全であることが示唆される。
【０１３６】
Ｍｋｘノックアウトマウスにおける腱の形成不全が胎生期においても観察されるか否かを調査するため、Ｅ１８．５のＭｋｘ欠損胚の尾腱のアザン染色を行った。具体的には、尾を採取し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定した。組織を、脱水後、パラフィン包埋し、薄切りし、アゾカルミン−アニリンブルー（アザン）で染色した。
【０１３７】
図３Ｅに、Ｅ１８．５の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスの胚の尾腱のアザン染色像を示す。図３Ｅからは、尾腱の大きさは、野生型マウスと違いが見られない。Ｍｋｘノックアウト胚では、コラーゲンを検出するアニリンブルーの染色の密度が低い（△矢頭部）ことが分かった。
【０１３８】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱におけるコラーゲン原線維について解析するため、アキレス腱を電子顕微鏡で観察した。約１ｍｍ３のアキレス腱断片を採取し、４％パラホルムアルデヒドと２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸バッファーにて一晩固定した。０．１Ｍカコジル酸バッファー及び生理食塩水で洗浄し、エタノールにて脱水後、エポキシ樹脂に包埋して極薄切りにした。得られた切片を銅の格子上に置き、水性ウラニルアセテートとクエン酸鉛と対比させて、透過型電子顕微鏡（Ｈ−７１００，日立社）にて観察した。
【０１３９】
図３Ｆに、野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン原線維の電子顕微鏡観察像を示す。ノックアウトマウスの腱におけるコラーゲン原線維の径は、野生型マウスと比べて均一に小さいことが分かった。これらの結果から、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱では、コラーゲンが減少していること、さらにはＭｋｘが腱の分化に重要であることが示唆された。
【０１４０】
３ヶ月齢のＭｋｘノックアウトマウスの尾腱の細胞密度（図３Ｄ）に示されるように、Ｍｋｘノックアウトマウスでは、腱の量が減少しているにもかかわらず、腱細胞の数は野生型マウスと変わらなかった。これは、Ｍｋｘノックアウト腱細胞において、細胞外基質の産生能が低下していることを示唆する。また、図３Ｅに示すＥ１８．５のＭｋｘノックアウトマウスの胚の尾腱のアザン染色像、並びに図３Ｆに示すＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のコラーゲン原線維の微細構造解析から、Ｍｋｘノックアウトマウスの腱ではコラーゲン産生能が減少していると考えられる。
【０１４１】
Ｍｋｘノックアウトマウスの腱細胞のコラーゲン産生能を調査するため、８週齢の野生型マウス及びＭｋｘノックアウトマウスの腱のコラーゲン量を測定した。コラーゲンの定量は、市販のコラーゲン定量キット（製品名Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）の説明書に従った。結果を図４Ａに示す。ノックアウトマウスの腱のコラーゲン量は野生型マウスと比べて少ないことが分かった。
【０１４２】
図４Ｂに８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）とβ−ａｃｔｉｎのウエスタンブロット解析を示す。腱の細胞外基質の主要成分であるＩ型コラーゲンの発現量が示すように、Ｍｋｘノックアウトマウスでのタンパク質及びｍＲＮＡの両方とも減少していた。
【０１４３】
８週齢の野生型マウスとＭｋｘノックアウトマウスのアキレス腱のＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２及びＳｃｘのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。プライマー配列を表４に示す。Ｇａｐｄｈは、ｍＲＮＡのコントロールとして用いた。
【０１４４】
【表４】
【０１４５】
ｄｅｌｔａ−ｄｅｌｔａ ＣＴ法により測定した相対発現量のグラフを図４Ｃに示す。図４Ｃでは、Ｉ型コラーゲンの発現を誘導することが示唆されている転写因子であるＳｃｘの発現は減少していなかった。これから、ＭｋｘノックアウトマウスにおけるＩ型コラーゲンの減少は、Ｓｃｘの減少ではないことが示唆された。
【０１４６】
以上の結果から、Ｍｋｘは、腱細胞においてＩ型コラーゲンの発現を調節する重要な因子であることが実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、
（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクター
の少なくとも一種を有効成分として含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤。
【請求項２】
（Ａ１）Ｓｃｘタンパク質、
（Ｂ１）前記Ｓｃｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、Ｉ型コラーゲンを誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ１）前記（Ａ１）又は（Ｂ１）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ１）前記（Ｃ１）の核酸を含む発現ベクター、
の少なくとも一種を含む、請求項１に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤。
【請求項３】
腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞の生育に適した条件下で、請求項１又は２に記載の分化誘導剤を用いて前記細胞を培養する工程、及び前記培養された細胞の中から、腱及び／又は靭帯細胞を選択する工程を含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する方法。
【請求項４】
前記腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞が、繊維芽細胞、腱前駆細胞、靱帯前駆細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、体性幹細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項３に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞を腱及び／又は靭帯細胞に分化誘導する方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬。
【請求項６】
腱又は靭帯関連疾患が、エーラスダンロス症候群である、請求項５に記載の腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬。
【請求項８】
Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む、腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項９】
前記機能的に欠損したＭｋｘ遺伝子は、Ｍｋｘ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたことにより腱細胞特異的にレポーター遺伝子を発現する、請求項８に記載の腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子が、Ｖｅｎｕｓ遺伝子である、請求項９に記載の腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の分化誘導剤を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法。
【請求項１２】
請求項３又は４に記載の分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法。
【請求項１３】
請求項８、９又は１０に記載の遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法。
【請求項１４】
被験物質の存在下又は非存在下で、請求項３又は４に記載の分化誘導方法を行い、該被験物質存在下又は非存在下での腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を比較することを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１５】
被験物質の存在下で培養した細胞における、Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量を測定すること、並びに前記被験物質を非存在下で培養した細胞内の量と比べて、前記測定した量が多い又は少ない場合に、前記被験物質を腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質として選択することを含む、請求項１４に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１６】
請求項８、９又は１０記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞を用いることを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１７】
遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞に被験物質を接触させること、及びノックインされたレポーター遺伝子の発現を上昇又は低下させる被験物質を選択することを含む、請求項１６に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１】
（Ａ）Ｍｋｘタンパク質、
（Ｂ）前記Ｍｋｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ）前記（Ｃ）の核酸を含む発現ベクター
の少なくとも一種を有効成分として含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤。
【請求項２】
（Ａ１）Ｓｃｘタンパク質、
（Ｂ１）前記Ｓｃｘタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも一種の変異を有し、かつ、Ｉ型コラーゲンを誘導する活性を有する変異体、
（Ｃ１）前記（Ａ１）又は（Ｂ１）のタンパク質をコードする核酸、並びに、
（Ｄ１）前記（Ｃ１）の核酸を含む発現ベクター、
の少なくとも一種を含む、請求項１に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤。
【請求項３】
腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞の生育に適した条件下で、請求項１又は２に記載の分化誘導剤を用いて前記細胞を培養する工程、及び前記培養された細胞の中から、腱及び／又は靭帯細胞を選択する工程を含む、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を誘導する方法。
【請求項４】
前記腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞が、繊維芽細胞、腱前駆細胞、靱帯前駆細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、体性幹細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項３に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞を腱及び／又は靭帯細胞に分化誘導する方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化誘導剤を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬。
【請求項６】
腱又は靭帯関連疾患が、エーラスダンロス症候群である、請求項５に記載の腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を含む、腱又は靭帯関連疾患を予防又は治療するための医薬。
【請求項８】
Ｍｋｘ遺伝子の機能的欠損を含む、腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項９】
前記機能的に欠損したＭｋｘ遺伝子は、Ｍｋｘ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたことにより腱細胞特異的にレポーター遺伝子を発現する、請求項８に記載の腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子が、Ｖｅｎｕｓ遺伝子である、請求項９に記載の腱又は靱帯関連疾患の研究用の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の分化誘導剤を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法。
【請求項１２】
請求項３又は４に記載の分化誘導方法により得られる腱及び／又は靭帯細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法。
【請求項１３】
請求項８、９又は１０に記載の遺伝子改変非ヒト動物の腱及び／靱帯、それらの組織又は細胞を用いることを特徴とする、腱又は靭帯関連疾患の解析又は分析方法。
【請求項１４】
被験物質の存在下又は非存在下で、請求項３又は４に記載の分化誘導方法を行い、該被験物質存在下又は非存在下での腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化を比較することを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１５】
被験物質の存在下で培養した細胞における、Ｍｋｘの発現量及び／又はＭｋｘをコードする塩基配列に対するｍＲＮＡの転写量を測定すること、並びに前記被験物質を非存在下で培養した細胞内の量と比べて、前記測定した量が多い又は少ない場合に、前記被験物質を腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質として選択することを含む、請求項１４に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１６】
請求項８、９又は１０記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞を用いることを特徴とする、腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１７】
遺伝子改変非ヒト動物から得られる腱、その組織又はその細胞に被験物質を接触させること、及びノックインされたレポーター遺伝子の発現を上昇又は低下させる被験物質を選択することを含む、請求項１６に記載の腱及び／又は靭帯細胞への分化能を有する細胞から腱及び／又は靭帯細胞への分化調節に関連する物質をスクリーニング又は評価する方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−２０５９６４（Ｐ２０１１−２０５９６４Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７６６２５（Ｐ２０１０−７６６２５）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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