自己免疫疾患を抑制するためのコポリマー、及びその使用方法
【課題】１４、３５、及び５０アミノ酸残基の長さを有する３成分及び４成分ランダムアミノ酸コポリマーを提供する。
【解決手段】ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒは、ＭＢＰ８５−９９又はプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）４０−６０特異的ＨＬＡ−ＤＲ−２制限Ｔ細胞クローンに対す効果的な阻害剤である。これらのコポリマーは、全脊髄ホモジェネート（ＷＳＣＨ）又は脳炎誘発性エピトープＰＬＰ１３９−１５１によってマウスの感受性ＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）菌株において発症したＥＡＥを効果的に抑制する。おおよそＹ０．８：Ｆ０．２のモル比を有するＹＦＡＫの５０−ｍｅｒは、未標識化ＭＢＰ８５−９９又はＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）よりも効果的に、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子へのビオチン化ＭＢＰ８５−９９エピトープの結合を阻害する。
【解決手段】ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒは、ＭＢＰ８５−９９又はプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）４０−６０特異的ＨＬＡ−ＤＲ−２制限Ｔ細胞クローンに対す効果的な阻害剤である。これらのコポリマーは、全脊髄ホモジェネート（ＷＳＣＨ）又は脳炎誘発性エピトープＰＬＰ１３９−１５１によってマウスの感受性ＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）菌株において発症したＥＡＥを効果的に抑制する。おおよそＹ０．８：Ｆ０．２のモル比を有するＹＦＡＫの５０−ｍｅｒは、未標識化ＭＢＰ８５−９９又はＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）よりも効果的に、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子へのビオチン化ＭＢＰ８５−９９エピトープの結合を阻害する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のモル比のアミノ酸を有し、所定の長さのポリペプチドに合成され、自己免疫疾患の症状及び再発の頻度を抑制することができるポリペプチドの設計に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、人工の０．１％に影響を及ぼす中枢神経系の炎症性疾患であり、北欧人種コーカソイドのＭＳ患者においてはＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）ハプロタイプに関係する。ＭＳの動物タイプである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、Ｔ細胞性自己免疫疾患である。ＥＡＥは、例えば、ミエリン塩基タンパク質（ＭＢＰ；Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２３巻、３４３−３４７頁、１９９９年）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ；Ｊ．Ｍ．Ｇｒｅｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻、７８３−７８８頁、１９９２年）、又はミエリン希突起膠糖タンパク質（ＭＯＧ；Ｉ．Ｍｅｎｄｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５巻、１９５１−１９５９頁、１９９５年）等のミエリン成分由来のペプチドを皮下注射によって誘発することができる。
【０００３】
ＥＡＥの過程では、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、マウスのクラスIIＭＨＣ分子（例えば、Ｈ−２Ａｓ）によって表わされる自己抗原を認識し、最終的に、これは疾病の臨床的徴候として観測され得る病理学的変化をもたらす。ＥＡＥは、当該疾病を抑制するために有力な治療用化合物の有効性を検証するための広く研究されたシステムを提供する。これらの化合物には、サイトカイン（Ｊ．Ｐ．Ｌｅｏｎａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７９５巻、２１６−２２６頁、１９９６年）、アネルギーを誘発するペプチド抗原（Ａ．Ｇａｕｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、１４９１−１４９４頁、１９９２年）、経口免疫寛容を誘発するペプチド抗原（Ｋ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９巻、１０３６−１０４４頁、１９９７年；Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８巻、３３５−３４３頁、１９９７年）、又は改変ペプチド配位子（Ｃ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８１巻、１５６９−１５７４頁、１９９５年；Ｌ．Ｂ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、９２７９−９２８４頁、１９９７年）が含まれる。
【０００４】
コポリマー１（Ｃｏｐ１；Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）；ＹＥＡＫ）は、約５：３：１．５：１のモル比のアラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びチロシン（Ｙ）からなるランダムアミノ酸コポリマーである。Ｃｏｐ１は、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物を用いて、溶液中で合成される（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年）。当初は、当該コポリマー及びその他の関連するコポリマーを用いて免疫応答性の遺伝的根拠が定められていた。現在、これらはクラスIIＭＨＣ遺伝子として知られている（Ｈ．Ｏ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ及びＭ．Ｓｅｌａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２２巻、５１７−５３２頁、１９６５年；Ｈ．Ｏ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ及びＭ．Ｓｅｌａ、１２６巻、９６９−９７８頁、１９６７年）。ポリ（Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｋ）又はＹＥＡＫとしても知らているＣｏｐ１は、実験的アレルギー性脳脊髄炎の抑制（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年；Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻、２７３−２７９頁、１９７３年；Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、３巻、２５６−２６２頁、１９７４年；Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、１７−２５頁、１９９３年）、及び多発性硬化症の再発の治療（ＭＳ；Ｍ．Ｂ．Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１７巻、４０８−４１４頁、１９８７年；Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４５巻、１２６８−１２７６頁、１９９５年；Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５０巻、７０１−７０８頁、１９９８年）のいずれにおいても有効であることが判明した。
【０００５】
Ｃｏｐ１は、ＭＳに対する療法として認可され、現在では広く用いられている。しかしながら、Ｃｏｐ１はＭＳの再発率を減少させるが、再発を除去することまではできず、当該疾病に対する治療薬ではない。ＭＳ及びその他の自己免疫疾患の治療に対する改善された組成物及びその使用方法を開発することが重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の特徴の１つは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を（Ｙ＋Ｆ）：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＹＦＡＫである。ここで、“（Ｙ＋Ｆ）”という表現は、Ａ及びＫの各モル比に対する、ＹとＦのモル比の合計を意味する。
【０００７】
当該アミノ酸は、固相反応によって重合される。別の実施態様では、当該アミノ酸は、溶液化学によって重合される。関連する実施態様では、Ｆ対Ｙのモル比は約１であり、例えば、Ｆ対Ｙのモル比は少なくとも約２であり、又は、Ｙは約４である。
【０００８】
別の実施態様では、Ｙのモル比はＦよりも大きく、例えば、Ｆ対Ｙのモル比は少なくとも約２であり、又は、Ｆ対Ｙのモル比は少なくとも約４である。一般に、当該コポリマーの長さは、少なくとも約２５アミノ酸残基であり、例えば、当該コポリマーの長さは、少なくとも約３５アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、又は少なくとも７０アミノ酸残基である。
【０００９】
１の実施態様では、本発明は、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋを約０．２：０．８：５：３のモル比で含む線状ランダムアミノ酸コポリマーを提供するものである。関連する実施態様では、本発明は、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋを約０．５：０．５：５：３のモル比で含む線状ランダムアミノ酸コポリマーを提供する。別の関連する実施態様では、本発明は、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋを約０．８：０．２：５：３のモル比で含む線状ランダムアミノ酸コポリマーを提供する。一般に、当該コポリマーアミノ酸は固相反応を用いて重合され、又は、当該コポリマーアミノ酸は溶液化学を用いて重合される。
【００１０】
別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＦＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＷＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＹＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＦ：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＦＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＷ：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＷＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を（Ｖ＋Ｗ）：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＷＡＫを提供する。ここで、“（Ｖ＋Ｗ）”という表現は、Ａ及びＫの各モル比に対する、ＶとＷのモル比の合計を意味するものである。
【００１１】
別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ｗ：Ａ：Ｋが約０．５：０．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＷＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ｅ：Ａ：Ｋが約１：１．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＥＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、フェニルアラニン（Ｆ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＦ：Ｅ：Ａ：Ｋが約１：１．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＦＥＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を（Ｖ＋Ｙ）：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＹＡＫを提供する。ここで、“（Ｖ＋Ｙ）”という表現は、Ａ及びＫの各モル比に対する、ＶとＹのモル比の合計を意味するものである。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ｙ：Ａ：Ｋが約０．５：０．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＹＡＫを提供する。さらに、ここに挙げた組成物は、いずれも、薬学的に許容可能な緩衝液において、及び／又は単位用量（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ）において提供され得る。
【００１２】
本明細書におけるコポリマーは、上述のアミノ酸からなるが、更に、上述のアミノ酸組成物を共有し、かつ結果として得られるコポリマーがほぼ同一の機能を有するように１以上の更なる置換基（例えば、１以上の更なるアミノ酸）を含むコポリマーと等価であるとみなされる。例えば、ＦＥＡＫ、ＦＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＹＡＫ、ＹＦＡＫコポリマー、又は、本明細書に記載される任意のコポリマー組成物のほとんどを含み（すなわち、当該組成物の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％を含み）、かつそれらとほぼ同一の機能特性を有するコポリマーは、本明細書に記載の組成物と等価であるとみなされる。自己免疫疾患の治療に有効な本明細書における組成物の投薬量が、当該組成物とほぼ同じ置換基を含む自己免疫疾患の治療用コポリマーの投薬量とほぼ同一の場合には、機能がほぼ同一であるとみなす。
【００１３】
本発明のコポリマー組成物は、少なくとも１の更なる治療薬と組合せることができる。関連する実施態様では、当該更なる治療薬は、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、又は可溶性サイトカインレセプター等である。例えば、サイトカインは、β−インターフェロン、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０よりなる群から選択される。
【００１４】
本発明の１の実施態様は、上述のコポリマーの少なくとも１単位用量を含むキットである。
【００１５】
本発明の特徴の１つは、自己免疫疾患を有する対象の治療に用いる組成物の製造方法であり、ここで、当該組成物は、ランダム線状アミノ酸コポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ、ＶＹＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＥＡＫ、及びＦＥＡＫのいずれかを含む。一般に、当該コポリマーは、少なくとも約５０残基、例えば、少なくとも約７０残基の長さを有する。さらに、そのように場合、当該組成物は、薬学的に許容可能なキャリヤーを更に含む。さらに、当該使用には、効果的な用量で組成物を投与することを含み得る。“効果的な用量”とは、自己免疫疾患の臨床症状及び再発の頻度のいずれか又は両方を改善する組成物の量である。投与の前において、コポリマーは、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質への自己抗原性ペプチドの結合を阻害するために選択される。例えば、ＭＨＣクラスIIタンパク質−ペプチド複合体に対するクラスII特異的Ｔ細胞の応答を阻害するコポリマーが選択される。自己免疫疾患は、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、重症甲状腺機能低下症、多発性硬化症、脱髄疾患、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫血小板減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、グレーブス病、乾癬、尋常性天疱瘡、関節リウマチ、及びその他よりなる群から選択される。好ましい実施態様では、当該自己免疫疾患は多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病である。一緒に投与され得る更なる治療薬は、例えば、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、又は可溶性サイトカインレセプターである。サイトカインは、インターフェロン−β、インターロイキン−４、又はインターロイキン−１０である。酵素阻害剤は、プロテアーゼ阻害剤又はシクロオキシゲナーゼ阻害剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
文脈によって必要とされない限り、本明細書及び特許請求の範囲では、次の語は、以下に説明する意味を有する。
【００１７】
“自己免疫疾病（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）”又は“自己免疫疾患”という語は、自己抗原として知られる自己コード化物に対する不適切な免疫応答によってもたらされる病状を意味する。本発明のコポリマー組成物は、自己免疫疾患の症状を治療するために用いることができる。それらの疾病の種類には、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、重症甲状腺機能低下症、多発性硬化症、脱髄疾患（脳又は脊髄における斑点又は硬化組織によって特徴付けられる）、重症筋無力症（神経筋接合部のアセチルコリン受容体に対する自己免疫攻撃（ａｔｔａｃｋ）に起因する）、ギラン−バレー症候群、多発性神経炎、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫血小板減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、グレーブス病（甲状腺機能低下症の一形態）、乾癬、尋常性天疱瘡、関節リウマチ（ＲＡ）が含まれる。
【００１８】
“脱髄疾病”という語には、神経細胞の伸長部分を覆っている細胞膜で構成されるミエリン鞘の一部が分解により除去される病状が含まれる。脱髄疾病は、予防接種後、抗ＴＮＦ処置後、ウイルス感染後、及びＭＳにおいて生じ得る。
【００１９】
アミノ酸の“誘導体”という語は、当該アミノ酸の原子に結合した更なる置換基、例えば、Ｎ−無水カルボキシ基、γ−ベンジル基、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル基、又はハライド基を有する、アミノ酸の化学的関連物質を意味する。
【００２０】
“アナログ”という語は、異なる配置（例えば、異性体、又は、Ｌ−構造ではなくＤ−構造）を有するアミノ酸の化学的関連物質、又は、アミノ酸に近似するサイズ、電荷、形状を有する有機分子、又は、ペプチド結合に含まれる原子を修飾したアミノ酸を意味する。これにより、当該アナログ残基を有するコポリマーは、アナログがコポリマーの内部にあるか末端に位置するかにかかわらず、そのようなアナログを有しないその他の類似のコポリマーよりも優れたプロテアーゼ耐性を有する。
【００２１】
“アミノ酸”及び“アミノ酸コポリマー”という語には、アミノ酸誘導体及び／又は本明細書で定義されるアミノ酸アナログである１以上の成分を含まれることができ、当該誘導体又はアナログは、組成物によって示される２０の天然アミノ酸のうちの任意の１以上における残基の部分又は全体を含む。例えば、１以上のチロシン残基を有するアミノ酸コポリマー組成物では、これら残基の１以上の部分をホモチロシンで置換することができる。さらに、２つの隣接する残基の間に１以上の非ペプチド又は擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）結合を有するアミノ酸コポリマーも、当該定義の範囲内に含まれる。
【００２２】
“疎水性”アミノ酸という語は、脂肪族アミノ酸であるアラニン（Ａ、又はａｌａ）、ギリシン（Ｇ、又はｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉ、又はｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、又はｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、又はｍｅｔ）、プロリン（Ｐ、又はｐｒｏ）、及びバリン（Ｖ、又はｖａｌ）、及び芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ、又はｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｆ、又はｐｈｅ）、及びチロシン（Ｙ、又はｔｙｒ）を意味する。ここで、かっこ内の１文字記号及び３文字記号は、各アミノ酸の標準コード略語である。これらのアミノ酸は、コポリマー又はその他のポリペプチドに残基として存在する場合、脂肪族側鎖の長さ及び芳香族側鎖の大きさの関数として、疎水性を与える。
【００２３】
“荷電”アミノ酸という語は、アミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ、又はａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ、又はｇｌｕ），アルギニン（Ｒ、又はａｒｇ）、及びリシン（Ｋ、又はｌｙｓ）を意味する。これらは、当該アミノ酸の１以上の残基を有するコポリマー又はその他のアミノ酸組成物に水溶液におけるｐＨの生理学的値に正電荷（ｌｙｓ及びａｒｇ）又は負電荷（ａｓｐ、ｇｌｕ）を与える。ヒスチジン（Ｈ、又はｈｉｓ）は、ｐＨ７で疎水性であり、ｐＨ６で電荷を持つ。
【００２４】
“アネルギー”という語は、抗原に対する被験対象の免疫不応答を意味する。
【００２５】
本明細書において、“被検体（ｓｕｂｊｅｃｔ）”という語は、哺乳類（ヒトを含む）を意味する。
【００２６】
“異種細胞”という語は、被検体の細胞と無関係のＭＨＣタンパク質生産細胞を意味し、例えば、当該異種細胞は哺乳類の細胞ではない。当該異種細胞は、例えば、冷血動物からのものであり、無脊椎動物からのものであることができる。当該異種細胞は、昆虫の細胞であり、又は、酵母細胞などの微生物の細胞である。
【００２７】
“クラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ−２タンパク質の表面”という語は、外部環境と接触し（水性溶媒と相互作用するようなタンパク質の特性を含む）、及びその他の細胞成分（例えば、核酸、他のタンパク質、及びペプチド）と結合することができる、３次元配置におけるタンパク質分子の一部を含む。
【００２８】
“Ｐ１ポケット”及び“Ｐ４ポケット”という語は、結合した自然発生抗原又はエピトープ、及び結合した合成ペプチド又はコポリマーを含む含まれるクラスIIＭＨＣタンパク質と結合するペプチドからのアミノ酸残基側鎖に適合するクラスIIＭＨＣタンパク質分子のペプチド結合表面における３次元多形領域を含む（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７頁、１９９８年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６１巻、６４０頁、２００１年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３頁、２００１年）。
【００２９】
“Ｐ−１位置”及び“Ｐ５位置”という語は、Ｔ細胞受容体に直接接触したクラスIIＭＨＣタンパク質分子ペプチド錯体におけるアミノ酸残基を意味する（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６１巻、６４０頁、２００１年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３頁、２００１年）。Ｐ−１位置という語は、Ｐ１ポケットを占有するペプチドのアミノ酸残基の前に存在するアミノ酸について用いられる。Ｐ５位置という語は、Ｐ４ポケットを占有するアミノ酸残基の後に存在するアミノ酸残基について用いられる。
【００３０】
“抗原結合溝”という語は、クラスIIＭＨＣタンパク質分子におけるα及びβサブユニットの両方の表面によって形成される、クラスIIＭＨＣタンパク質分子の表面における３次元抗原相互作用部位について用いられる（（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、２１５頁、１９９４年）。
【００３１】
“薬学的に許容可能なキャリヤー”という語には、生理学的に相溶性である、任意の溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤（例えば、抗菌剤及び抗真菌剤）、等浸透圧及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、当該キャリヤーは、静脈内、筋肉内、経口、腹膜内、経皮、又は皮下投与に適しており、さらに、活性化合物は、酸の働き又はその他の不都合な自然条件による不活性化から保護するための物質によって被膜することができる。
【００３２】
宿主の免疫応答が自己の分子（自己抗原）と外部の抗原を区別することができず、それにより、異常な免疫応答が発生する場合に、自己免疫疾患がもたらされる。自己免疫疾患における自己の分子に対する免疫応答によって、自己寛容（ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の正常状態からの逸脱がもたらされる。これは、自己抗原と反応することができるＴ細胞及びＢ細胞の崩壊を伴うものであり、若年期における免疫系の発達で生じた事象によって回避されてきたものである。処理ペプチドをＴ細胞に結合させて提供（ｐｒｅｓｅｎｔ）する能力によって免疫応答の制御における中心的な役割を担っている細胞表面タンパク質は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子である（Ｊ．Ｂ．Ｒｏｔｈｂａｒｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、５２７頁、１９９１年）。
【００３３】
ＭＳに加えて、その他の脱髄疾病は、例えば、ウイルス感染後、予防接種後、脳脊髄炎後において（Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１２巻、２７７−２８２頁、１９９１年）、及び、その後における特定の抗ＴＮＦ剤の投与において発症することが判明している（ＦＤＡ Ｔａｌｋ Ｐａｐｅｒ、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ｈｔｔｐ：／／．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｂｂｓ／ｔｏｐｉｃｓ／ＡＮＳＷＥＲＳ／ＡＮＳＤＯ９５４．ｈｔｍｌ）。
【００３４】
自己免疫疾患に対する治療薬としてのアミノ酸コポリマー
本発明の方法には、特定の対立遺伝子によってコード化されたクラスIIＭＨＣタンパク質に結合し得るような薬剤の使用が含まれる。そのような薬剤は特定のクラスIIＭＨＣタンパク質に結合して、自己免疫疾患に関連する自己抗原の結合を阻害し及び／又は阻止することができ、又は結合の間にアネルギーを導入することができる。その結果、自己抗原に対する免疫応答がなくなる。
【００３５】
自己免疫疾患を治療するために、多くの治療薬が開発されてきた。例えば、シクロオキシゲナーゼを阻害することによって低分子量の炎症性化合物の生成を阻止し得る薬剤が開発されている。また、抗ＴＮＦ特異的モノクローナル抗体断片を用いて、又は当該ＴＮＦレセプターの可溶性形態を用いて炎症性タンパク質の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を抑制することによって、炎症のタンパク質メディエーターを阻害することで機能し得る薬剤が、市販されている。さらに、Ｔ細胞の表面におけるタンパク質（ＣＤ４レセプター、又は細胞粘着レセプターＩＣＡＭ−１）の機能を標的として阻害し、それにより、抗原提示細胞（ＡＰＣ）との生産的相互作用を阻止する薬剤が、市販されている。しかしながら、天然に折り畳まれたタンパク質である治療薬は、生産、製剤、貯蔵、及び運搬における問題を招く。さらに、天然タンパク質は、ウイルス及びプリオン等の病原体が混入する可能性がある。
【００３６】
自己免疫応答の阻害における更なる標的は、ＭＨＣ分子に代表されるリンパ球表面タンパク質である。詳細には、これらのタンパク質は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）−ＤＲ、−ＤＱ、及び−ＤＰとして表わされるクラスIIＭＨＣ遺伝子によりコード化される。各ＭＨＣ遺伝子は、哺乳類群の中における多数の代替形質又は対立形質に見出されている。特定の自己免疫疾患（例えば、ＭＳ及び関節リウマチ（ＲＡ））にかかっている被検体のゲノムは、当該疾患に連関する１以上の特徴的なクラスIIＭＨＣ対立遺伝子を有している傾向が強い。
【００３７】
ＭＳ及びその他の脱髄疾病の治療薬を得る方法の１つとしては、精製されたクラスIIＭＨＣ対立遺伝子タンパク質分子（特に、脱髄疾病に関連するクラスIIＭＨＣ対立遺伝子の生産物であるタンパク質）と生体外で選択的に結合するペプチドを特定することである。さらに、当該薬剤は、生体内の抗原提示細胞の表面における場合と同じように当該タンパク質と結合し、それによって、ＭＳ等の脱髄疾病の原因であるＴ細胞類を遮断し、アネルギー化し、又は不活性化するべきである。
【００３８】
クラスIIＭＨＣタンパク質は、２つのほぼ等しい大きさのサブユニットα及びβ（これらは、膜貫通タンパク質である）から構成される。α及びβサブユニットの両方のタンパク質特性により形成されるペプチド結合クレフト（ｃｌｅｆｔ）は、Ｔ細胞に対する抗原の提示部位である。少なくとも３つのタイプのクラスIIＭＨＣ分子、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱ、及び−ＤＰが存在し、さらに、これらの各タイプには多数の対立形質が存在する。クラスIIＭＨＣ分子は、主として、Ｂリンパ球及び抗原提示細胞（マクロファージ及び樹状細胞など）の表面において発現する（Ｌ．Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｗ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＴｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）、Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、６０２−６０６頁、１９９４年）。
【００３９】
本発明の実施態様には、３以上の異なるアミノ酸を含むコポリマーである組成物を用いてクラスIIＭＨＣ分子を標的とすることによって、自己免疫疾患を治療する新規な方法が含まれる。
【００４０】
本発明のコポリマーは、Ｆｍｏｃ又はｔ−ｂｏｃ開始アミノ酸アナログ等を用いて合成することができ、それらは、更なる重合（固相合成）のための自動ペプチド合成装置における樹脂上に固定化される。当該アミノ酸は、最適な結合特性を有するコポリマーを提供するためにモル比を調整して重合される。
【００４１】
合成手順には、活性化形態の選択されたアミノ酸（例えば、Ｎ−カルボキシ無水物として活性化されたアミノ酸）の混合物を、適切に誘導化されたアミノ酸前駆体のそれぞれを適切なモル比で含む溶液を提供する工程が含まれ得る。当該前駆体は、特定の官能基（例えば、Ｌ−リシンのεアミノ基）を保護するために誘導化されており、例えば、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンである。或いは、当該合成手順には、好ましいモル比の選択されたアミノ酸誘導化前駆体の合成手順におけるオンライン混合工程を含まれ得る。ヘテロポリマー合成設備は、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｌａｙｔｏｎ、オーストラリア）、ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）、及びＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州）から購入することができる。
【００４２】
ペプチド合成のための樹脂支持体の例には、メリーフィールド樹脂（１％のＤＶＢ架橋を有するクロロメチル化ポリスチレン）、Ｆｍｏｃアミノ酸Ｗａｎｇ樹脂（４−ベンジルオキシベンジルアルコール）が含まれ、当該樹脂はアミノ酸が予め挿入される（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ｔｒｐ（ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂）。異なるメッシュサイズ（例えば、１００−２００メッシュ）、及び初期アミノ酸における官能基化における高い又は低い挿入密度（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）の樹脂が入手可能である。
【００４３】
本発明の組成物に重合される異なる誘導化アミノ酸溶液（好ましくは、ペプチド合成において通常行われているように保護されている）が、ビーズ試料（例えば、Ｆｍｏｃ）に添加される。樹脂から除去される完全なコポリマー樹脂の合成、非ブロック化、及び開裂のための試薬は、装置の製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）、又はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州））から入手可能である。例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９１年を参照されたい（当該内容は、引用により本明細書中に取り込まれる）。更なるアミノ酸又はアミノ酸アナログ又は誘導体を、コポリマーを構成するために選択された少なくとも３のアミノ酸に添加して、当該アミノ酸のごく一部を置換し、例えば、向上したプロテアーゼ耐性を有し、それゆえ改善された薬理学的特性（例えば、生体内におけるより長い寿命）を有するコポリマーを提供することができる。アナログの例は、ホモチロシン又はその他の置換チロシン誘導体、及びアミノ酪酸であり、これらはいずれもＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍｔｅｃｈからＦｍｏｃ誘導体として市販されている。
【００４４】
本発明の方法における治療用組成物
薬学的に許容可能なキャリヤーには、生理学的に相溶性である、任意の溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤（例えば、抗菌剤及び抗真菌剤）、等浸透圧及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、当該キャリヤーは、静脈内、筋肉内、経口、腹膜内、経皮、又は皮下投与に適しており、さらに、活性化合物は、酸の働き又はその他の不都合な自然条件による不活性化から保護するための物質によって被膜することができる。
【００４５】
本発明の方法には、被検体に投与するのに適切な薬剤組成物中にコポリマーを取り込むことが含まれる。本発明の組成物は、当該技術分野において公知である種々の方法によって投与することができる。活性化合物は、迅速な放出から保護するキャリヤー、例えば、インプラント、経皮貼付、及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む放出制御剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を用いて調製することができる。そのような剤形を調製するための多くの方法が特許されており、当該技術分野における当業者に周知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９７８年参照。薬学的に許容可能なキャリヤーにおける輸送用の薬剤組成物は無菌性であり、好ましくは、製造及び貯蔵条件下において安定である。当該組成物は、溶液、微小エマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に適するその他の規則構造として製剤され得る。
【００４６】
最適な所望の応答（例えば、治療効果）が得られるように、用量を調節することができる。例えば、単一のボーラスで投与することができ、時間をかけていくつかに分割して投与することもでき、又は、投与量を疾患状況の要求に応じて比例的に増減することもできる。
【００４７】
一般に、本発明の１の実施態様は、治療効果（例えば、症状の緩和）をもたらす最少の有効量である、適切な１日量で治療用コポリマー組成物を投与することである。好ましくは、本発明の治療用ヘテロポリマー化合物は、治療開始時における適切な最少投与量として、１の被検体について１日当り、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、又は少なくとも約２０ｍｇの量で投与される。一般に、有効量の本発明における組成物を含む配合物は、被検体１キログラムにつき、１日当り約５０乃至約４００マイクログラムの範囲で投与することができる。
【００４８】
当該技術分野における技術常識を有する医師又は獣医は、所望される薬剤組成物の有効量を容易に決定し及び指示することができるであろう。例えば、医師又は獣医は、薬剤組成物に用いられる本発明の組成物の投与量について、所望の治療効果を達成するために必要な量よりも低いレベルで開始し、その後、所望の効果が得られるまで時間と共に投与量を増加させることができる。
【００４９】
別の実施態様では、薬剤組成物は、更なる治療約も含む。従って、本発明の方法において、薬剤コポリマー組成物は、併用療法の一部として、すなわち更なる薬剤と組合せて投与することができる。更なる治療薬として、自己免疫疾患及び関節炎の治療のためのコポリマーと共に併用治療に用いることができる物質の例には、炎症性分子又は不用のサイトカイン（インターロイキン−６、インターロイキン−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子−α等）へ選択的に結合し得る抗体又は抗体断片；タンパク質であることができる酵素阻害剤（例えば、α１−抗トリプシン又はアプロチニン）；シクロオキシゲナーゼ阻害剤であることができる酵素阻害剤；人工結合タンパク質（例えば、カリクレインの人工阻害剤等のプロテアーゼ阻害剤である人工タンパク質）；抗菌剤（例えば、アモキシシリン、リファンピシン、エリスロマイシン等の抗生物質）；抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル等の低分子量化合物；ステロイド（例えば、コルチコステロイド）又は性ステロイド（例えば、プロゲステロン）；非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アスピリン、イブプロフェン、又はアセトアミノフェン）；メトトレキサート又はアドリアマイシン等の抗がん剤；サイトカイン遮断剤；接着分子遮断剤；又は、サイトカインが含まれる。
【００５０】
更なる治療薬は、サイトカイン（本明細書では、自然発生タンパク質又は変異体であって、成長因子として機能する制限剤は含まない）、リンフォカイン、インターフェロン（特に、インターフェロン−β）、腫瘍壊死因子、血管形成誘導因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）又は抗血管形成誘導因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン、成熟因子、走化性タンパク質などであることができる。本発明の実施態様であるアミノ酸コポリマーに添加される更なる薬剤は、別のポリマー、例えば、ＹＥＡＫ又はＣｏｐ１であるＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）、又は、これらの或いはその他のアミノ酸の一部を含むコポリマー（Ａｈａｒｏｎｉら、ＷＯ ００／０５２５０、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６７４７）、又はオリゴペプチド又はペプチド誘導体を含むコポリマー（Ｓｔｏｍｉｎｇｅｒら、ＷＯ ００／０５２４９、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６６１７；ＷＯ ０２／５９１４３、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２０７１）であることができる。本発明の組成物と組み合わせて用いられる好ましい治療薬は、サイトカインであって、インターフェロン−β、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０が含まれる。
【００５１】
本発明の組成物と共に用いられ得る治療薬は、遺伝子融合の効力によってビリオンコートタンパク質に共有結合しているタンパク質を改造する技術分野における当業者に公知である、人工結合タンパク質であることができ（Ｒ．Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２３３，４０９号；Ｒ．Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，４０３，４８４号）、これは、当該技術分野において公知の方法によって製造することができる。種々のその他の標的を結合するタンパク質を作り出すことができ、本発明のヘテロポリマーと共に組み合わせた治療薬として用いることができる。
【００５２】
当該投与の結果としての症状の改善は、投与開始後の一定期間における、ＭＳの発作における再発頻度の減少、症状の重傷度の減少、及び再発発作の除去を意味する。好ましくは、治療的に有効な投薬量によって、治療されていない被検体と比較して、症状及び再発頻度が少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、及び少なくとも約８０％減少し、或いは、１以上の症状又は自己免疫疾患の再発が約１００％除去される。当該期間は、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約６ヶ月、又は少なくとも約１年間であることができる。
【００５３】
ランダム合成コポリマーの使用方法は、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子生産物に関連するその他の自己免疫疾患の治療における基礎とすることもできる。これは、当該タンパク質レセプター分子と結合する候補性自己抗原と競合することにより、Ｔ細胞アネルギー又はＴ細胞アポトーシスを導入することによって、又は、自己抗原に対するその後のＴ細胞応答を生体内において阻害するようにＴ細胞を抑制することによってなされる。さらに、１以上の更なる成分、例えば、種々の量で重合反応に添加されるアミノ酸アナログ又は誘導体を有する合成コポリマーは、種々の自己免疫性Ｔ細胞応答に対する効果的な阻害剤になり得る。
【００５４】
Ｃｏｐ１の活性は、最初のステップとして、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、クラスIIＭＨＣタンパク質（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻、４８７２−４８７６頁、１９９４年）の表面に結合し、その後、その有効性は、これらのタンパク質から生じる特異的エフェクターＴ細胞認識ペプチドエピトープの活性に対するミエリン抗原との競合（Ａ．Ｂｅｎ−Ｎｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２４３巻、Ｓ１４−２２頁、１９９６年；Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４巻、２０９−２１７頁、１９９６年）、及び／又は抗原特異的調節Ｔ細胞の導入（Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、１７−２５頁、１９９３年）のいずれかに依存する。
【００５５】
これらの活性に関する更なるコポリマーの評価及びメカニズムの調査によって、治療薬の改善に結びつく情報が得られる可能性がある。最近の研究によって、多岐にわたるコポリマーのほぼ全てが、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、及び−ＤＲ４のそれぞれの精製分子に結合するＹＥＡＫのランダム混合物に見出されること、及び、ＹＥＡＫは、一般に、精製クラスIIＭＨＣタンパク質に結合することが明らかとなっている（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７、１９９８年）。Ｃｏｐ１は、さらに、ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）に対するＭＢＰ８５−９９の結合と競合し、ＭＢＰ８５−９９に対するＤＲ−２制限Ｔ細胞の応答を阻害する。Ｃｏｐ１における４つのアミノ酸のうちの３つのみを含有するランダムコポリマー（例えば、ＹＡＫ）の、クラスIIＭＨＣ分子に対する結合についての研究によって、ＹＡＫが最も効果的であることが判明した（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、６３５−６４１頁、１９９９年）。
【００５６】
ＭＳ関連分子であるＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）に対するＣｏｐ１の結合モチーフは、Ｐ−２におけるＥ、Ｐ−１におけるＫ、及びＰ−１におけるＹを示し、その他の位置における選好（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は観測されていない（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）。さらに、ＡはＰ１において過剰発現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）である。Ｐ１はアンカー位置なので、当該位置におけるＹの結合は予想しなかった。ＤＲ−２対立遺伝子でコード化されたタンパク質におけるＰ１ポケットは小さいものであり（これは、β８６Ｇｌｙではなくβ８６Ｖａｌの存在による）、当該位置におけるＡの過剰発現は、この事実に起因するものであろう。Ｐ−１におけるＫの効果は、α１へリックスの上部における残基とＫの相互作用による結合の安定性に依存すると考えられ、これは、Ｓα５３又はＥα５５におけるα１へリックス残基の側鎖と相互作用し得るＨＬＡ−ＤＲ１と錯形成するＨＡ３０６−３１８のＰ−１におけるＫ残基と同様である（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、２１５−２２１頁、１９９４年）。
【００５７】
ＭＢＰ８５−９９の結合モチーフによって設計されたコポリマー（Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９巻、２７９−２９０頁、１９９４年）は、Ｃｏｐ１よりも優れた治療薬であろう。本明細書では、それぞれが１４−、３５−、及び５０−ｍｅｒの長さで合成された３種又は４種のアミノ酸を含むいくつかのランダムコポリマーが、固相法により生産される。これらのコポリマーの設計は、第一に、コポリマーの有効性を改善するため、ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）に結合するＭＢＰ８５−９９のアンカー残基（特に、Ｐ１アンカー）に関するアミノ酸の選択によってなされる（Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９巻、２７９−２９０頁、１９９４年；Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）。ＭＳにおける自己抗原特異的Ｔ細胞応答、及びＭＳの動物型であるＥＡＥの疾患進行に対する当該コポリマーの効果を、以下の実施例に示す。
【００５８】
自己免疫疾患の治療における主な目標は、抗原提示細胞の表面における自己ＭＨＣレセプターによって提示される自己抗原性ペプチドと自己反応性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）との三分子相互作用を阻害する抗原特異性免疫調節療法の開発である。これらのＴ細胞性自己免疫疾患の療法は、公知の標的抗原を有する動物モデルについて成功している（例えば、Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８巻、３３５−３４３頁、１９９７年；Ｌ．Ｂ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、９２７９−９２８４頁、１９９７年を参照）。改変ペプチド配位子（ＡＰＬ）は、矛盾する発見ではあるが、ＥＡＥの治療（Ｌ．Ｂ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、９２７９−９２８４頁、１９９７年；Ｓ．Ｂｒｏｃｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３７９巻、３４３−３４６頁、１９９６年）、及びＭＳの治療（Ｂ．Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻、１１６７−１１７５頁、２０００年；Ｌ．Ｋａｐｐｏｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻、１１７６−１１８２、２０００年）のいずれにも用いられる。
【００５９】
再発軽減ＭＳに対する認可治療薬であるＣｏｐ１（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標））は、クラスIIＭＨＣ分子に対する乱交雑結合剤として機能し（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７、１９９８年）、ＴＣＲのアンタゴニストとして機能し（Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、６３４−６３９頁、１９９９年）、及び／又はサプレッサー細胞の誘発物質として機能する（Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、１７−２５頁、１９９３年）と提案されていた。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）は、現在では広く用いられており、毒性はほとんど又は全く無く、６年間にわたってＭＳ患者への効力が持続する（Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．、６巻、２５５−２６６頁、２０００年）。しかしながら、当該試薬は、再発頻度を３０％減少させるが、再発を除去することまではできない。新規な化合物の開発によって、ＭＳに対する、或いはその他の自己免疫疾患に対する治療薬の改善が提供され得る。
【００６０】
実施例１−６では、１４−、３５−、又は５０ｍｅｒの長さのコポリマーを用いて、本明細書に記載のコポリマーの最適なサイズを決定した。５０−ｍｅｒが、ＨＬＡ−ＤＲ−２との結合およびＭＢＰ特異的Ｔ細胞応答の阻害において最も有効であったので、実施例７−１１において用いたコポリマーは、５０−ｍｅｒとして合成したものである。抗原の提示の阻害及びＥＡＥの抑制に有効であることが判明した５０以上というアミノ酸のサイズは、本発明のランダムコポリマーが、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、９２５−３４頁、１９９７年）又はオリゴマーＴ細胞エピトープ（Ｏ．Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１４６４２−１４６４７頁、１９９７年）と同様に、細胞膜の一部のおいてクラスIIＭＨＣ分子と結合してクラスターを形成することによって機能するということを示唆するものである。
【００６１】
本明細書の実施例７−１１におけるランダムコポリマーの残基は、主として、免疫優性Ｔ細胞エピトープであるＭＢＰ８５−９９ペプチド（配列番号２）のアンカー残基に基づいて設計されたものである。コポリマー１におけるＹは、ＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）の推定されるＰ１ポケットにおいて見出されたが、Ｆとぴったりであり、ＭＢＰ８５−９９におけるＶ８９に適合する当該ポケットに対して、Ｙは大きすぎる。さらに、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）のＦ９２はＰ４ポケットに存在するが（Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）、Ｙ又はＷは当該ポケットには窮屈であろう。本発明のＹとＦ含有コポリマーにおけるこれら２つの残基の相互関係を、異なるＹ：Ｆの比で合成されたコポリマーを用いて検証した。さらに、実施例１１では、異なるサイズのＰ１及びＰ４に適合するための異なるサイズの芳香族基の必要性に基づいて合成のために選択された、Ｖ−とＷ−含有コポリマー及びＶ−とＹ−含有コポリマーが、ＥＳＥ症状の治療に特に有効であることを示している。各Ｐ１及びＰ４のサイズ、形状、及び電荷分布についての知見、及びＥＡＥ治療薬としてのＶ−とＷ−含有ポリマーのデータを考慮すると、コポリマーの合成においてＶとＷをそれぞれ置換し得る新規な有機側鎖を有するアミノ酸を設計することができ、それにより、これらの部位に対してＶとＷと同等又はさらにタイトにフィットする側鎖を有する薬剤を提供することができる。そのような化合物を含むコポリマーは、ＥＡＥやＭＳ等の自己免疫疾患に対する治療薬として更に有用であろう。
【００６２】
本発明について十分説明してきたが、実施例及び特許請求の範囲において本発明の更なる実施態様を述べる。ただし、当該実施態様は、限定的なものと解釈されるべきではない。引用した文献及び特許の内容は、本明細書中にそっくりそのまま取り込まれる。
【実施例】
【００６３】
原料及び方法
コポリマー、ペプチド、及び抗体
Ｃｏｐ１とほぼ等しいモル比のポリ（Ｙ，Ｅ，Ａ，Ｋ）（これをＹＥＡＫと表わす）、ポリ（Ｖ，Ｅ，Ａ，Ｋ）又はＶＥＡＫ、ポリ（Ｆ，Ｅ，Ａ，Ｋ）又はＦＥＡＫを（ここで、Ｖ又はＦは、Ｃｏｐ１におけるＹと同じモル比で存在する）、各サイクルで所望の比で混合されるＦｍｏｃアミノ酸を用い、１４−、３５−、及び５０−ｍｅｒとして固相法（Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、オーストラリア）によって合成した。１Ｙ：１．５Ｅ：４．３Ａ：３．３Ｋのモル比（これは、１：１．５：４．４：３．３のモル比を有するＹ：Ｅ：Ａ：Ｋを表わす）であって、８１５０の平均分子量（ＭＷ）を有するＣｏｐ１のバッチ５２５９６（Ｂ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年）を、Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、イスラエル）から入手した。酢酸グラチラス（Ｃｏｐ１、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標））は、Ｔｅｖａ Ｍａｒｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ミズリー州）から入手した。Ｃｏｐ１のビオチン化は、ＤＭＳＯ中で過剰のＮ−ヒドロキシサクシンイミドビオチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻、４８７２−４８７６頁、１９９４年）。未反応のビオチンは、透析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）メンブレンＭＷＣＯ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）。
【００６４】
ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおいて固相技術（Ｇ．Ｂａｒａｎｙ及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９７９年）を用いて合成し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。ペプチド配列は、ＭＢＰ（ヒトに基づくミエリンタンパク質）８６−１００、ＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴ（配列番号１）；ＭＢＰ０８５−９９、ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ（配列番号２）、ＭＷ１７９５；ＰＬＰ（ヒトプロテオリピドタンパク質）４０−６０、ＴＧＴＥＫＬＩＥＴＹＦＳＫＮＹＱＤＹＥＹＬ（配列番号３）、ＭＷ２６０３；及びＰＬＰ１３９−１５１、ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号４）、ＭＷ１５２０である。これらは、標識化されていない、又はＳＧＳＧスペーサー及びＣ末端の遊離酸によってＮ末端に連結したビオチンで標識化されている。
【００６５】
ＦＡＫ（モル比１：５：３）、ＹＦＡＫ（モル比０．２：０．８：５：３）、ＹＦＡＫ（モル比０．８：０．２：５：３）、及びＹＦＡＫ（モル比０．５：０．５：５：３）を、５０−ｍｅｒとして固相化学により合成した（Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、オーストラリア）。インプットモル比と得られたポリマーのアミノ酸組成物についての約１０％の不一致は、当該手順の使用について過去に報告されているデータと一致していた。
【００６６】
タンパク質の発現及び精製
可溶性ＨＬＡ−ＤＲ−２分子を、ショウジョウバエＳ２細胞中で発現させ、上述のように精製した（Ａ．Ｋａｌａｎｄａｄｚｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、２０１５６−２０１６２頁、１９９６年）。細胞は、０−５％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズリー州）を補足したＥｘＣｅｌｌ４０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州）を用いて、回転びん中で２６℃において成長させた。細胞は、１ｍＭ ＣｕＳＯ４の導入の４−５日後に回収した。回収した細胞の上澄みを、順次、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、及びタンパク質Ａ−ＬＢ３．１カラムに通し、その後、５０ｍＭの３−（シクロへキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（ｐＨ１１．５）を用いて結合しているＨＬＡ−ＤＲを流出させ、２００ｍＭのリン酸（ｐＨ６．０）で中和した。タンパク質は、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０メンブレン（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）で捕集した。
【００６７】
ＨＰＬＣ分離及びマイクロシークエンシング
異なるコポリマーを分離し、上述のようにプールを配列決定した（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）。詳細には、１０４０ダイオードアレイ検出器を有するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０９０ＨＰＬＣにおけるＺｏｒｂａｘ Ｃ１８ １．０ｍｍの逆相カラムを用いて、ｍｉｃｒｏｂｏｒｅＨＰＬＣにより分画を行った。アセトニトリル中で０．０５５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の勾配（０乃至１０分では０％、７３分では３３％、及び１０５分では６０％）により、５４μｌ／分の流速でコポリマーを流出させた。ピーク選択、逆相分離、及びエドマンマイクロシークエンシングにおける戦略は、既に説明されている（Ｒ．Ｍ．Ｃｈｉｃｚら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、１７８巻、２７−４７頁、１９９３年）。プールしたフラクションについて、生産者のルーチン３．５を用いるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇ１００５Ａ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）のタンパク質シークエンサーにおいて、自動化エドマン分解を行った。
【００６８】
クラスIIＭＨＣタンパク質に対するペプチドの結合のアッセイ
（Ａ）溶液
当該分析に用いた溶液は以下のとおりである。結合緩衝液は、特に示さない限り、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮａＮ３、ｐＨ５．０である。ＰＢＳは、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７．５ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、２．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ７．２である。ＴＢＳは、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２．７ｍＭの塩化カリウムである。ＴＴＢＳは、ＴＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたものである。
【００６９】
（Ｂ）マイクロタイターアッセイ用プレートの調製
イムノアッセイ用プレート（９６ウェルのマイクロタイター、ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、ニュージャージー州）を、ＰＢＳ中で１μｇ／ウェルの親和性精製ＬＢ３．１モノクローナル抗体（総量１００μｌ）を用いて、４℃で１８時間コーティングした。その後、３７℃で１時間、ＴＢＳ／３％ＢＳＡでウェルをブロックし、ＴＴＢＳで３回洗浄した。試料の添加の前に、５０μｌのＴＢＳ／１％ＢＳＡを各ウェルの添加した。
【００７０】
（Ｃ）阻害反応
５０μｌの結合緩衝液中で最終濃度０．１３μＭのビオチン化ペプチドＭＢＰ８６−１００（配列番号１）を、非標識化阻害剤（ランダムコポリマー又はＭＢＰ８５−９９、配列番号２）及びＨＬＡ−ＤＲ−２分子と共に、３７℃で４０時間培養した。
【００７１】
（Ｄ）クラスIIＭＨＣタンパク質／ペプチド錯体の検出
ストレプタビジン複合アルカリ性ホスファターゼを用いて、結合したペプチド−ビオチンを以下のように検出した。プレートをＴＴＢＳで３回洗浄し、１００μｌのストレプタビジン複合アルカリ性ホスファターゼ（１：３０００、ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）と共に３７℃で１時間培養した。その後、トリエタノールアミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中のｐ−ニトロフェニルリン酸を添加した。４１０ｎｍにおける吸収を、マイクロプレート読み取り機（モデルＭＲ４０００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、バージニア州）によりモニターした。
【００７２】
抗原提示アッセイ
ＨＬＡ−ＤＲ−２制限Ｔ細胞は、ＤＲ−２（８０７３、患者Ｏｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）及びＨｙ１Ｂ、患者Ｈｙ（ＤＲＢ１＊１６０２））を有する再発軽減ＭＳの患者から得たＴＣＲに対する遺伝子をＢＷ５８ＴＣＲα−／β−細胞に輸送するＭＢＰ８４−１０２−特異的形質移入体（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｉら、Ｈｕｍａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３頁、２００１年）；及び、ＨＬＡ−ＤＲ−２トランジェニックマウスからのＭＢＰ８４−１０２特異的（２Ｅ１２）及びＰＬＰ４０−６０特異的（１０６Ａ）ハイブリドーマ（Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２３巻、３４３−３４７頁、１９９９年）である。マウスＴ細胞ハイブリドーマは、ＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｈ−２ｓ−制限されている（ｈＰＬＰ／１及びｈＰＬＰ／ｃ４、Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６頁、１９９３年）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｌ４６６（ＨＬＡ−ＤＲ−２ｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）で形質移入されたＬ細胞）、Ｌ４１６（ＨＬＡ−ＤＲ−２ａ（ＤＲＢ５＊０１０１）で形質移入されたＬ細胞）、ＭＧＡＲ（ＤＲＢ１＊１５０１でホモ接合されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）、及びＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）マウスからの脾細胞である。Ｔ細胞刺激実験は、９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、２００μｌの総量で実施した。照射（３０００ｒａｄ）ＡＰＣ（２．５ｘ１０４／ウェル）を、所定の濃度のコポリマー、及びＭＢＰ８５−９９（配列番号１）、ＰＬＰ４０−６０（配列番号３）、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）と共に、３７℃で２時間培養した。その後、Ｔ細胞（５ｘ１０４／ウェル）を添加し、プレートを３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を取り、ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬ（５ｘ１０４／ウェル）と共に１２時間培養し、その後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。プレートを回収し、１４５０ｍｉｃｒｏｂｅｔａＰｌｕｓ液体シンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を用いて放射能をモニターした。
【００７３】
マウス菌株
ＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）マウス（８−１２週間の年齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）から購入し、ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｅｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ８５−２３、１９８７年改訂）のガイドラインに従ってＨａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設の保存した。ヒト化マウス（Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３（３）巻、３４３−３４７頁、１９９９年；及び、Ｄ．Ａｌｔｍａｎ、Ｄ．Ｈａｆｌｅｒ、及びＶ．Ｋｕｃｈｒｏｏ、未公表文献）は、導入遺伝子ＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊１５０１）及びＭＳ患者ＯｂからのＴＣＲ（クローンＯｂ．１Ａ１２から増幅したＴＣＲα及びＴＣＲβのＶ（Ｄ）Ｊ再構成）を保因する（ｃａｒｒｙ）。
【００７４】
ＥＡＥの導入及び抑制
マウスの尾の付け根及び首の項部に、上述のように調製した全脊髄ホモジェネート（ＷＳＣＨ、５００μｇ／マウス）（Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６−１１２７頁、１９９３年）皮下注射し、又は、同量のＰＢＳ及び完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含有するエマルション中の結核菌Ｈ３７Ｒａ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、メリーランド州）とＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（５０μｇ／マウス）を皮下注射した。免疫付与の１日後、百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、カリフォルニア州、２００ｎｇ）を尾に静脈注射した。上述の病状の重症度に従って（Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６頁、１９９３年）、１−５の目盛の範囲でマウスについてのＥＡＥ臨床的徴候を毎日記録した。ＥＡＥの抑制の評価において、各コポリマー（５００μｇ／マウス）を混合し、上述の脳炎誘発性エマルションを注入した。
【００７５】
神経病理学
炎症及び脱髄の評価のために、マウスにおいて、４０ｍｌのトランプ固定液（０．１Ｍリン酸バッファー中（ｐＨ７．４）における４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒド）を麻酔下において上行大動脈を経てかん流させた。脳及び脊髄の薄片を、冷１％四酸化オスミウムで１時間後置し、増大エタノール（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ）を有する溶媒で脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。１μｍの断片を得て、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観測した。
【００７６】
実施例１．新規コポリマーの合成及び微量分析
それぞれ１４−、３５−、及び５０−ｍｅｒの長さである、ランダム４成分アミノ酸コポリマーＹＥＡＫ、ＶＥＡＫ、及びＦＥＡＫを固相法で合成した。以下の構造情報に基づいて、Ｙを置換するものとしてＶ又はＦを選択した。すなわち、ＤＲＢ１＊１５０１のＰ１ポケットが、Ｙには大き過ぎるが、ＶやＦには適切である小ポケットをもたらすβ８６Ｖを含むこと（ただし、高ペプチド濃度の場合は除く、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｉｅｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻、２３３１−２３４０、１９９１年）。ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）の結合においてＰ１に生じる残基はＶであり、及び、Ｆはよりタイトなフィットを提供すると考えられること。ＭＢＰ８５−９９においてＰ４に生じる残基がＦであること。
【００７７】
固相合成手順によって、アミノ酸組成、分布、疎水性、及び大きさの点において、溶液化学のみを用いてこれまでに生産されてきたコポリマーと類似したコポリマーが生産されるか否かを検証するために、当該新規化合物について、アミン酸分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離、及びマイクロシークエンシングを行った。
【００７８】
アミノ酸分析により、各コポリマーのＹ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、及びＫのモル比は、Ａ以外は予測された範囲内の比であるが、当該Ａのモル比は、全てのコポリマー（特に、３５−及び５０−ｍｅｒ）において増大していることがわかった。例えば、ＶＥＡＫの５０−ｍｅｒでは、観測されたモル比が、１．０Ｖ：２．１Ｅ：１０．７Ａ：２．９Ｋであったのに対し、その予想値は１．０Ｖ：１．５Ｅ：５．０Ａ：３．０Ｋであった。アセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣによるコポリマー分離は、いくつかの小さなピークを有する広いピークを示し、これは、約４０乃至約１２０分の溶出範囲に広がっており、未処理Ｃｏｐ１（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３、２００１年）と類似するものであった。最初の１０アミノ酸のエドマン配列決定では、各サイクルともアミノ酸分析の結果と類似する一定の比を示した。これは、コポリマーにおけるアミノ酸配列がランダムであることを示唆するものである。
【００７９】
実施例２．ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対する新規ランダムコポリマーの結合性
Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物を用いて溶液中で合成されたＣｏｐ１及び３つのアミノ酸のランダムコポリマー（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年）、すなわち、Ｙ、Ｅ、Ａ、及びＫのうちの３つのアミノ酸を含むコポリマーは、精製ＨＬＡ−ＤＲ−２と結合し、ＭＢＰ−８５−９９の結合と競合することがわかっている（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７、１９９８年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、６３５−６４１頁、１９９９年）。
【００８０】
固相法によって合成されたコポリマーが、ＨＬＡ−ＤＲ−２との結合において、当該自己抗原エピトープとも競合するか否かを検証するため、ビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）及び非標識化ペプチド及びランダムコポリマーを用いて、競合結合アッセイを行った。ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対するビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）の結合は、ＹＥＡＫの５０−ｍｅｒ、非標識化ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）ペプチド、又はＣｏｐ１の場合に最も効果的に阻害された。ここで実験したその他のランダムコポリマー（すなわち、１４及び３５の長さのアミノ酸残基を有するもの）は、いずれも、当該アッセイにおいてほとんど効果がなかった。
【００８１】
実施例３．ランダムコポリマーの存在下におけるＭＢＰ特異的Ｔ細胞の増殖反応
いくつかのＭＢＰ８４−１０２特異的Ｔ細胞クローン（上記「原料及び方法」を参照）を有する各ランダムコポリマーの生物活性を評価するために、一連の増殖アッセイを行った。
【００８２】
それぞれＨＬＡ−ＤＲ−２分子を発現させる３つのタイプのＡＰＣを試験して、どれが最も効果的にＭＢＰ８５−９９（配列番号２）ペプチドを提示するかについて評価した。当該ペプチドがヒトＢ細胞株ＭＧＡＲ（ＤＲ−２ｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）発現）によって提示される場合には、Ｌ４６６（ＤＲ−２ｂ−発現Ｌ細胞形質移入体）細胞の場合よりも高い増殖レベルが観測された。Ｌ４１６（ＤＲ−２ａ（ＤＲＢ５＊０１０１）−発現Ｌ細胞）を用いた場合には、全く応答が観測されず、全てのＴ細胞クローンがＤＲ−２ｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）対立遺伝子に限定されることを確認した。それゆえ、ＭＧＡＲ細胞（又は、時にはＬ４６６細胞）は、その後、以下に述べる抗原提示アッセイにおいて用いた。
【００８３】
３つの異なるＴ細胞クローンの各コポリマーの存在下におけるＭＢＰ８５−９９ペプチドによる増殖阻害を検証した。概ね、試験したＴ細胞クローンにかかわらず１４−ｍｅｒは阻害しなかったが、一方、３５−及び５０−ｍｅｒは、高い阻害レベルを示した。全てのクローンについて、ＹＥＡＫの５０−ｍｅｒは、（平均７０−ｍｅｒである）Ｃｏｐ１とほぼ同等であった。ＹＥＡＫの３５−ｍｅｒでは大幅に阻害が減少し、ＹＥＡＫの１４−ｍｅｒでは非常に低いものであった。
【００８４】
２Ｅ１２Ｔ細胞クローンの増殖の阻害は、ＦＥＡＫの３５−及び５０−ｍｅｒの存在下、及びＣｏｐ１の存在下において効果的であった（図１Ａ、左下パネル）。ＶＥＡＫは、２Ｅ１２クローンを阻害しなかった（図１Ａ、右下パネル）。ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒは、幾分Ｃｏｐ１の阻害よりも低かった。Ｈｙ１Ｂの場合では、Ｃｏｐ１が最も優れた阻害剤であり、ＦＥＡＫ及びＶＥＡＫの５０−ｍｅｒの阻害は、それより低いレベルであった（図１Ｃ）。
【００８５】
Ｖ、Ｅ、Ａ、及びＫの組合せでは、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対する結合親和性が低くなり、及びＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８５−９９特異的Ｔ細胞の阻害が低レベルとなった。これは、ＭＢＰ８５−９９／ＨＬＡ−ＤＲ−２錯体において、Ｖが、当該ペプチド（配列番号２）の位置８９における残基であり、ＨＬＡ−ＤＲ−２タンパク質のＰ１ポケットにおいてβ８６Ｖａｌと相互作用するという観測に反する（Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）。Ｆ側鎖もＰ４ポケットにフィットするので、ＦＥＡＫはより優れた結合剤である。残基ＡはＰ１ポケットと相互作用し、ＹはＰ４ポケットと相互作用する（Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）。ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）は、Ｖ８９のために、比較的親和性の低いペプチドである。
【００８６】
ＦＥＡＫにおける残基Ｋは、おそらく、ＭＢＰ８５−９９の位置９３におけるＫ（配列番号２；Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９巻、２７９−２９０頁、１９９４年；Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）と同様に、ＴＣＲとの相互作用において重要なものであろう。一方、結合部位におけるコポリマーのＮ末端付近に存在するＫは、Ｓα５３又はＥα５５におけるα１ヘリックスの側鎖と相互作用することができるＨＬＡ−ＤＲ１に結合したＨＡ３０６−３１８（配列番号５）のＰ１における残基Ｋ（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、２１５−２２１頁、１９９４年）と同様に、ＨＬＡ−ＤＲ分子及びＴＣＲとの安定な相互作用に寄与し得る。
【００８７】
実施例４．ＰＬＰ特異的Ｔ細胞クローンの増殖
ランダムコポリマーが、ＭＳにおける別の潜在的な自己抗原（すなわち、ＰＬＰ）の提示を阻害することができるかを検証するため、２つの異なるＰＬＰエピトープを用いた。ＤＲＢ１＊１５０１に結合するヒトＰＬＰ４０−６０（配列番号３）（Ｍ．Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１３９５−１４１２頁、２０００年）、及び、Ｈ−２ｓと結合し、ＳＪＬ／Ｊマウスにおいて脳炎誘発性のマウスＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチド（Ｖ．Ｋ．Ｔｕｏｈｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２巻、１５２３−１５２７頁、１９８９年）。当該アッセイに用いたＴ細胞は、１０６Ａ（ＨＬＡ−ＤＲ−２トランスジェニックマウスからのＰＬＰ４０−６０特異的ハイブリドーマ；Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２３巻、３４３−３４７頁、１９９９年）、及びｈＰＬＰ／１及びｈＰＬＰ／ｃ４（ＳＪＬ／ＪマウスからのＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｈ−２ｓ制限ハイブリドーマ；Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６−１１２７頁、１９９３年）である。Ｔ細胞ハイブリドーマの増殖は、投与量に依存して対応ペプチドによってもたらされる。その後、各コポリマーを抗原提示アッセイに添加した。
【００８８】
Ｌ４６６ＡＰＣによる１０６Ａ Ｔ細胞へのＰＬＰ４０−６０（配列番号３）エピトープの提示は、ＦＥＡＫの３５−ｍｅｒ及び５０−ｍｅｒによって最も効果的に阻害された（図２Ａ、下段パネル）。阻害のレベルは、Ｃｏｐ１の存在下よりも幾分高かった。ＭＢＰ特異的Ｔ細胞の場合と同様に、ＹＥＡＫ５０−ｍｅｒはＣｏｐ１とほぼ同様の結果だったが（図２Ａ、上段パネル）、一方、ＶＥＡＫは、最も高濃度の場合においてのみ、ＰＬＰ４０−６０特異的Ｔ細胞を阻害した（図２Ａ、中段）。
【００８９】
マウスＨ−２ｓ制限ＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｔ細胞ハイブリドーマであるｈＰＬＰ／１の増殖は、Ｃｏｐ１によって最も阻害された。ＦＥＡＫ及びＶＥＡＫは、それよりも幾分効果が少なかった（図２Ｂ）。ｈＰＬＰ／ｃ４ハイブリドーマは、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒ及びＣｏｐ１によって最も阻害された（図２Ｃ）。
【００９０】
特定の理論に制限されるわけではないが、コポリマーが自己反応性Ｔ細胞応答を制限する際のいくつかのメカニズムが仮定されている。すなわち、それらは、ＭＨＣ／ＴＣＲ閉塞（ｂｌｏｃｋａｇｅ）、競合、アネルギー誘導、アポトーシス、及びバイスタンダー抑制である。最初の２つのメカニズムは、自己反応性Ｔ細胞の数が増大し始めた場合の、誘導期の初期段階におけるコポリマーの効果を意味するものである。バイスタンダー抑制は、誘導期及びエフェクター期の両方において機能し、調節Ｔ細胞の発達又は交差反応性Ｔ細胞の増大を促進し、それによって、自己反応性脳炎誘発性Ｔ細胞を抑制することができる。生体外における増殖では、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）で免疫付与されたマウスのＴ細胞は、試験コポリマーに対する交差反応性を用いることなく、免疫付与ペプチドのみに応答を生じた。しかしながら、自己ペプチド及びコポリマーの存在下の生体外におけるＰＬＰ１３９−１５１Ｔ細胞の場合には、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に対するＴ細胞の応答は、著しく抑えられた。また、いくつかの同時免疫付与（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスでは、Ｔ細胞は、コポリマーと共にＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に応答して増殖した。
【００９１】
以下の実施例における、生体内に投与されてＥＡＥに対する最も優れた抑制を示すコポリマーは、また、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に対するＴ細胞の増殖応答に対する最も優れた抑制を示す。すなわち、コポリマーの機能における可能性のあるメカニズムは、ＭＨＣの閉塞、及び抗原提示における競合であると考えられる。
【００９２】
実施例５．ＷＳＣＨを導入したＥＡＥに対するＶＥＡＫ及びＦＥＡＫランダムコポリマーの生体内における効果
ＶＥＡＫ及びＦＥＡＫランダムコポリマーが、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＥＡＥの臨床経過に与える影響を調べるために、いくつかの生体内実験を行った。疾患導入の手順は、皮下注射して、ＷＳＣＨ（５００μｇ）及び各ポリマー（５００μｇ）を両方とも免疫付与することである。これは、Ｃｏｐ１によるＥＡＥの抑制についての過去の研究における手順と同様のものである（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４巻、２０９−２１７頁、１９９６年）。疾患の導入の後、マウスについて、典型的なＥＡＥの臨床的徴候の様子を４０日間毎日観測した（表１）。
【００９３】
当該データは、ＷＳＣＨを注射されたマウスは、１４−１５日目あたりにＥＡＥを発症し、約２．２の最大臨床スコアを記録した（発生率：１８／３２、死亡率：３％）。３５−及び５０−ｍｅｒのＶＥＡＫを同時免疫付与したもの（それぞれ、表１の６行目及び４行目）は、ＥＡＥの経過にほとんど影響を与えず、ＷＳＣＨのみを注入した群と同様の発生率と最大スコアとなった。しかしながら、これらの同時免疫付与マウスでは、疾患の発生が、若干遅くなった。
【００９４】
一方、それぞれＦＥＡＫの３５−ｍｅｒ又は５０−ｍｅｒで治療したマウスは（それぞれ表１の７行目及び５行目）は、ＥＡＥの症状すら発生しなかった。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）の治療（表１の２行目）によってＥＡＥが抑制された。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）で治療した１４のマウスのうちの１つは、２０日目に発症そ、最大スコアは３．０であった。同様に、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒを注射した１６のマウスのうちの２つ（表１の３行目）は、１４日目で軽度に発症し、最大スコアは１．０であった。
【００９５】
各コポリマーを注射したマウスにおける炎症及び脱髄の程度を評価するため、脊髄試料について中枢神経系の免疫組織化学を行った。ＷＳＣＨのみ、又はＷＳＣＨとＶＥＡＫ５０−ｍｅｒを注射した疾患マウスの腰髄から得た試料は、脱髄と共に、広範囲な中髄膜（ｓｕｂｍｅｎｉｎｇｅａｌ）、血管周囲、及び実質性の浸潤を示した。一方、他のコポリマーによる治療後のおいて全く疾患の徴候を示さなかったマウスから得た試料では、浸潤及び脱髄の症状は検出されなかった。
【００９６】
本明細書の実施例において合成し特性評価された各ランダムコポリマーの中では、ＷＳＣＨを導入されたＥＡＥの抑制において、ＦＥＡＫが最も有効であった。
【００９７】
実施例６．ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列番号４）を導入したＥＡＥおけるＶＥＡＫ又はＦＥＡＫランダムコポリマーの治療
本発明のランダムコポリマーが慢性再発性ＥＡＥの発症に与える影響を検証するため、５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４；ＳＪＬ／Ｊ菌株における脳炎誘発性エピトープ）のみ、又は５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）と５００μｇのコポリマーをマウスに皮下注射した。マウスについて、疾患の導入の後９０日間毎日測定した。
【００９８】
ＣＦＡにおいてＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）エピトープのみで免疫付与した場合のＥＡＥは、ＷＳＣＨを導入したＥＡＥ（表１）と比較して、より重い臨床的徴候（表３）を有していた。例えば、８のマウスのうちの５は、死亡率３３％という重症のＥＡＥを発症した。当該初発（ｆｉｒｓｔ ａｔｔａｃｋ）は、免疫付与の約１４日後に発症し（最大臨床スコアが４．０）、その後、概ね３０日、５０日、７０日、８５日のピークがある疾患発症の事後的な変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）を示した。
【００９９】
種々のコポリマーを同時に注射した試料は、それぞれ違った形でＥＡＥの臨床的徴候が減少した。ＶＥＡＫの５０−ｍｅｒで治療した群では（図３Ｂ）、８のマウスのうちの４が、ＥＡＥの臨床的徴候を示した。初発は、１３日目に発生し、約２０日目にピークになった（平均最大スコア：１．６）。
【０１００】
ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒ（図３Ｃ）を同時に注射した場合、８のうちの３のマウスは疾患した。ペプチドのみを注射した対照試料やＶＥＡＫで治療した群と比較すると、当該初発は遅くなり、症状も重症ではなかった（２３−２５日目、平均最大スコアは１．１）。臨床的症状は、約４０日までにほぼ完全に治った。
【０１０１】
Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）で治療した場合（図３Ｄ）では、ＦＥＡＫにおける結果と同様に、初発が遅れた（２６日目に開始し、３４日目にピーク、最大平均スコアは１．２５）。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）の群では、８のうちの２つのマウスが、ＥＡＥを発症した（死亡率１２％）。
【０１０２】
表１及び図３のデータは、ＷＳＣＨ又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドのいずれかによって誘発されるＥＡＥが、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒによって効果的に抑制されたことを示唆するものである。さらに、当該データは、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒが、Ｃｏｐ１よりも効果的に、ＷＳＣＨ又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドのいずれかによって誘発されるＥＡＥを抑制することを示すものである。この観測は、脳炎誘発性物質とコポリマーを同時にＳＪＬ／Ｊマウスに注射した場合に歴然としていた。Ｃｏｐ１は、ＷＳＣＨ又は合成ＰＬＰペプチドによって誘発されたＥＡＥを阻害し、両方の抗原を同時にマウスに免疫付与した場合にのみＰＬＰ特異的Ｔ細胞応答を阻害した（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４巻、２０９−２１７頁、１９９６年）。これは、それらが、クラスIIＭＨＣ分子との結合において競合することを示唆している。
【０１０３】
特定の理論に制限されるわけではないが、本発明の５０−ｍｅｒランダムコポリマーの活性メカニズムは、Ｃｏｐ１の場合と同様であって、それにより、クラスIIＭＨＣタンパク質に対する潜在的自己抗原ペプチドの結合が阻害され、その後、Ｔ細胞が抑制されると考えられる。
【０１０４】
実施例７．Ｙ及びＦ含有コポリマーの合成及び微量分析
アミノ酸Ｙ、Ｅ、Ａ、及びＫで構成されるランダムコポリマーの５０−ｍｅｒは、１４−又は３５−ｍｅｒよりも、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）へのヒト免疫優性エピトープＭＢＰ８５−９９（配列番号２）の結合に対する強力な阻害剤である。これらのコポリマーのいくつかは、ＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８４−１０２特異的Ｔ細胞の応答を阻害し、さらに、脳炎誘発エピトープＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）によって誘発された感受性ＳＪＬ／Ｊ菌株におけるＥＡＥを抑制した。
【０１０５】
ここでは、コポリマーにおけるアミノ酸組成及びアミノ酸比率についての分析を、ランダム３成分コポリマーＦＡＫの５０−ｍｅｒにおいて、及び、異なる比率のＹ：Ｋを有する４成分アミノ酸コポリマーＹＦＡＫ（“Ｙ及びＦ含有”コポリマー）において行った。各５０−ｍｅｒコポリマーは、固相法によって合成した。ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子に結合するＭＢＰ８５−９９（配列番号２）エピトープのアンカー残基に応じて、これらのコポリマーを構成するアミノ酸を選択した。
【０１０６】
以下の構造的基準に基づいて、異なる比率のＹとＦを有するコポリマーを設計した。すなわち、ＤＲＢ１＊１５０１のＰ１ポケットが、Ｙには大き過ぎるが、ＶやＦには適切である小ポケットをもたらすβ８６Ｖを含むこと。従って、ＭＢＰ８５−９９の結合においてＰ１に生じる残基はＶであるが、ＦはＰ１に対してタイトなフィットを提供すること。及び、ＭＢＰ８５−９９におけるＰ４に生じる残基がＦであるが、当該ポケットはＹにとって十分大きく、ＹはＦよりも適切にフィットし得ること。合成手順によって、アミノ酸組成、分布、疎水性、及び大きさの点において、従来技術によって生産されたコポリマーと類似したコポリマーが生産されるか否かを検証するために、当該新規化合物について、アミン酸分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離、及びマイクロシークエンシングを行った。
【０１０７】
アミノ酸分析により、各コポリマーのＹ、Ｆ、及びＫのモル比は、Ａ以外は期待したインプットモル比の範囲内であるが、当該Ａのモル比は、全てのコポリマーにおいて増大していることがわかった。Ｃｏｐ１において上述したアセトニトリル勾配を用いた（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）コポリマーのＨＰＬＣ分離は、いくつかの小さなピークを有する広いピークを示した。これは、約４０乃至８０分の溶出したものであり、未処理Ｃｏｐ１の溶出と類似するものであった。
【０１０８】
合成した各コポリマーにおけるいくつかの最初のアミノ酸のプール配列決定は、Ｙ、Ｆ、又はＫの各レベルよりも著しく高いＡのレベルを有するランダムパターンを示した。これは、これらのランダムコポリマー組成の分析において判明した初期におけるＡの高いモル比と対応するものである。コポリマーにおけるアミノ酸にはいずれも配列特異性及び優先的位置決め（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）は観測されなかったが、これは、当該ポリマーがランダム配列であることを示唆するものである。
【０１０９】
実施例８．ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対するＹ及びＦ含有ランダムコポリマーの結合性
固相法によって合成されたＹ及びＦ含有ランダムコポリマーが、ＨＬＡ−ＤＲ−２との結合において、自己抗原ＭＳ関連エピトープＭＢＰ８５−９９（配列番号２）と競合するか否かを検証するため、ビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）及び非標識化ランダムコポリマーを用いて、競合結合アッセイを行った。
【０１１０】
ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対するビオチン化ＭＢＰ８６−１００の結合は、ＦＡＫの５０−ｍｅｒ及びＹＥＡＫの５０−ｍｅｒコポリマー（Ｙ０．８：Ｆ０．２のモル比を有する；図４）によって効果的に阻害された。従って、当該Ｙ及びＦ含有５０−ｍｅｒランダムコポリマーは、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ−２分子とに結合において、ＭＳ関連エピトープ（配列番号２）と競合する。
【０１１１】
実施例９．ランダム５０−ｍｅｒコポリマーの存在下におけるＭＢＰ特異的Ｔ細胞の増殖反応
ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）ペプチドに応答する３つの異なるＴ細胞クローンの増殖における、各５０−ｍｅｒコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＹＦＡＫ（０．８：０．２）の存在による効果を検証した。２つの独立した実験の結果を図５に示す。
【０１１２】
当該データは、３つのＭＢＰ特異的ＨＬＡ−ＤＲ−２制限クローンのそれぞれにおいて、Ｙ及びＦ含有ＹＦＡＫコポリマー及びＦＡＫコポリマーが効果的な阻害剤であることを示している。これらのコポリマーの中でも、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＦＡＫは、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）よりも良い阻害剤であり、Ｃｏｐ１よりも優れていた。
【０１１３】
異なるＹ：Ｆ比率を有する３つのＹＦＡＫコポリマー及びＦＡＫコポリマーの優れた窓外活性が、クローン２Ｅ１２に対しては、当該３つのコポリマーの低濃度条件（例えば、約２０μＭ））において観測され、他のＴ細胞クローンに対しては、いくつかのポリマーの低濃度条件において観測された。より高い濃度（例えば、約１００μＭを超える濃度）では、観測された阻害レベルは、当該実施例におけるコポリマー全てで同様なものであった（図５）。
【０１１４】
実施例１０．ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列番号４）を導入したＥＡＥおけるＹ及びＦ含有ランダムコポリマーによる治療
Ｙ及びＦ含有５０−ｍｅｒランダムコポリマーがＳＪＬ／ＪマウスにおけるＥＡＥの臨床経過に与える影響を調べるために、生体内実験を行った。上記の実施例と同様に、同時免疫付与の手順は、脳炎誘発性エピトープＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４；５０μｇ）とコポリマー製剤（５００μｇ）をＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射することである。疾患の導入の後、マウスについて、典型的なＥＡＥの徴候の様子を７０日間毎日観測した。
【０１１５】
ＣＦＡにおいてＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）エピトープのみで免疫付与した場合、慢性再発性ＥＡＥが生じた（図６、表２）。この処理を受けた１３のマウスは、全て、死亡率７７％という重症のＥＡＥを発症した。初発は１１日目付近に発症し（最大臨床スコアが４．６）、その後、概疾患発症の事後的な変動を示した（図６）。
【０１１６】
本発明のランダムコポリマーを同時に注射した試料は、それぞれ違った形でＥＡＥの臨床的徴候が減少した。ＹＦＡＫ０．２：０．８で処理した群は、１６のマウスのうちのわずか２のみが、ＥＡＥの臨床的徴候を示した（死亡率６％）。当該臨床的徴候は、未処理群における１１日目から遅れて約３７日目に初発が生じた（平均最大スコア０．６；図６、表２）。
【０１１７】
同様に、ＹＦＡＫ０．５：０．５で処理した群は、１６のうち１が疾病したマウスであり（死亡率０％）、初発は３３日目に生じた。さらに、ＹＦＡＫ０．８：０．２で処理したマウスは、１７のうちの８がＥＡＥを発症し、死亡しなかった。この群では、観測された平均最大臨床スコア（１．５）及び発症時期（２７日目）は、それぞれ、上記のＹ対Ｆの比が低いＹＦＡＫ製剤で処理したマウスから得られたデータよりも治療上の効果が小さいことを示唆するものである。
【０１１８】
ＦＡＫを同時に注射した場合には、１７のうち３つが疾病したマウスであり、死亡率が１２％、平均最大臨床スコアが０．９、平均発症時期が２５日目であった（表２の５行目）。ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）とＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）を同時に注射した場合は、１６のうち１２のマウスがＥＡＥを発症し、平均発症時期は２２日目であり、平均臨床スコアは２．６であった（表２の６行目）。
【０１１９】
別の実験において、個々のマウスについての臨床的症状の観測結果は、ＹＦＡＫ０．５：０．５の治療によって、全ての群のマウスにおける症状を全て除去できることを示している。個々のマウスについての当該データからは、Ｆ含有コポリマーはＰＬＰ誘発ＥＡＥの治療においてＣｏｐ１よりも効果的であり、Ｆ対Ｙのモル比の大きさがＥＡＥの優れた治療と関連することが明らかである。
【０１２０】
すなわち、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に誘発されたＥＡＥは、３つの異なるＹＦＡＫコポリマー及びＦＡＫによって効果的に抑制された。その効果の順列は、ＹＦＡＫ０．５：０．５＞ＹＦＡＫ０．２：０．８＞ＦＡＫ＞ＹＦＡＫ０．８：０．２である。Ｆ含有コポリマーは、Ｃｏｐ１よりも効果的にＰＬＰ誘発ＥＡＥを治療した。
【０１２１】
ここで合成し分析したＹ及びＦ含有ランダムアミノ酸コポリマーは、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子、自己抗原特異的Ｔ細胞の阻害、及びＥＡＥの抑制において、Ｃｏｐ１（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標））よりも効果的である。これらのコポリマーは、主として、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子と相互作用する免疫優性Ｔ細胞エピトープＭＢＰ８５−９９（配列番号２）の残基に基づいて、設計及び合成した。コポリマー製剤の長さは、活性に重要なものであり、５０−ｍｅｒが最も効果的である。長いポリペプチドは、隣接するクラスII分子と連結することができる。
【０１２２】
５０−ｍｅｒランダムコポリマーＦＡＫ、及びＹ対Ｆのモル比が異なるＹＥＡＫ５０−ｍｅｒコポリマーは、以下の機能活性において対照例Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）よりも優れている：すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子への結合、ＭＢＰ特異的ＤＲ−２制限Ｔ細胞の阻害、及びＥＡＥの抑制。ランダムコポリマーＶＥＡＫは、ＭＢＰ−９９自己抗原（配列番号２）のＰ１に相当する位置にアミノ酸残基Ｖを有するにもかかわらず、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対する低い結合親和性、ＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８５−９９特異的Ｔ細胞の低い阻害レベル、及びＥＡＥの進行に対する無効果を示した。ここにおけるデータは、ＶをＦで置換することによって、より優れた阻害化合物が得られることを示している。おそらく、これは、ＦがＰ１ポケットに対し、及びＹがＰ４ポケットに対しよりタイトにフィットするためと考えられる。
【０１２３】
脳炎誘発性エピトープＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に誘発されたＥＡＥの進行に対する本発明のコポリマーの効果は、著しいものである。脳炎誘発性物質とコポリマーを同時にＳＪＬ／Ｊマウスに注射した場合、ＥＡＥの臨床的徴候が、当該ＹＦＡＫコポリマー又はＦＡＫで治療することによって著しく減少した。
【０１２４】
特定の理論に制限されるわけではないが、これらのデータは、クラスIIＭＨＣ分子による抗原提示の効果的な遮断剤としてのコポリマーを含み、潜在的自己抗原ペプチドの結合を阻害し、それによって自己免疫Ｔ細胞の抑制をもたらすランダムコポリマーの活性メカニズムを裏付けるものである。
【０１２５】
ＹＦＡＫの５０−ｍｅｒ及びＦＡＫの５０−ｍｅｒコポリマーは、患者の６０％がＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）ハプロタイプであるＭＳの治療において用いられ得る。ランダムコポリマーの乱交雑な結合性を鑑みると（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７頁、１９９８年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、６３５−６４１頁、１９９９年）、本発明のコポリマーは、その他のＨＬＡ−ＤＲ特異性を有するＭＳ患者にも有効であり、さらには、その他の自己免疫疾病において使用される新規な治療薬を提供し得る。
【０１２６】
実施例１１．バリン（Ｖ）及びチロシン（Ｙ）含有、又はバリン（Ｖ）及びトリプトファン（Ｗ）含有コポリマーの同時免疫付与／予備免疫付与による、ヒト化マウスにおけるＭＢＰ８５−９９（配列番号２）誘発ＥＡＥの抑制
ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）のペプチド結合ポケットは、Ｐ１にβ８６Ｖａｌ残基を有しており、そのサイズは、Ｖ又はＦ残基には適切であるが、Ｙ又はＷには十分なサイズではない。一方、大きな疎水性ポケットＰ４はβ７１Ａｌａを有しており、それは、Ｙ又はＷ等の大きなサイズの残基に適切である。Ｐ９ポケットは、乱交雑である。当該構造的考察に基づいて、ＡとＫと共に、バリン（Ｖ）及びチロシン（Ｙ）を含有する、又はバリン（Ｖ）及びトリプトファン（Ｗ）を含有するコポリマーを合成し、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）によって誘発されたＥＡＥの進行及び症状における効果を試験した。
【０１２７】
実験に用いた動物は、トランス遺伝子ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊１５０１）及びＭＳ患者ＯｂからのＴＣＲ（クローンＯｂ．１Ａ１２から増幅したＴＣＲα及びＴＣＲβのＶ（Ｄ）Ｊ再構成）を保因するヒト化マウスである。各群のマウスは、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）を皮下注射してＥＡＥを誘発させた。図７に示すように、マウス群は、ＥＡＥの誘発の２日前にＣｏｐ１、ＹＦＡＫ０．５：０．５、或いは対照ＭＢＰ８５−９９のいずれかを注射して予め免疫付与したもの、又は、Ｃｏｐ１、ＹＦＡＫ０．５：０．５、ＹＦＡＫ０．２：０．８、ＶＹＡＫ０．５：０．５、或いはＶＷＡＫ０．５：０．５、及びＥＡＥ誘発ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）を同時に免疫付与したものである。５０日間に渡って、所定の日に臨床症状をモニターした。
【０１２８】
ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）のみを導入した対照マウス群は、約２５日目に臨床スコアが４を超える重症度を示した。この群の臨床症状は、８つの測定点（１１日目から３２日目）で３−４の高い値に上昇し、その後、２乃至３の重症度で安定した。合計で１４の測定点（すなわち、７日目から終点の５０日目まで）に渡って症状の継続が観測され、当該症状は２乃至３の重症度で安定した。
【０１２９】
一方、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）と共にＶＷＡＫを同時に免疫付与したマウスは、最少のＥＡＥ臨床症状を示した（図７）。５０日間に渡る実験経過において、当該マウスは、３７日目までに通常の臨床状況に戻った。約９日目に発生したＶＷＡＫ処理マウスの症状は、最大で約１以下の臨床スコアを示した。図７におけるその他のコポリマーは、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）に比較するとわずかに症状の回復が見られたが、症状の重症度を大幅に減少させるものではなかった。ＹＦＡＫ０．２：０．８を同時免疫付与した群は１乃至約２、ＹＦＡＫ０．５：０．５を予め免疫付与した群は１乃至２、及びＹＦＡＫ０．５：０．５を同時免疫付与した群はわずかに１より大きいものであった。
【０１３０】
ＶＷＡＫを同時免疫付与した群において症状の回復が最も大きく、ＹＦＡＫ０．５：０．５を予備免疫付与した群において症状の継続期間が最も短かった。後者のグループでは、合計で５つの測定点でしか症状は観測されず、その後、臨床症状はなくなった。ＹＦＡＫ０．５：０．５で予備処理した群のデータを図８にプロットする（四角マーク）。これは、ＹＦＡＫ０．５：０．５で処理した群における症状の重症度及び継続期間と、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）のみを導入した対照群（菱形マーク）及びＣｏｐ１で処理した群（三角マーク）との比較を示すものである。ここにおける予備免疫付与の手順は、自己免疫疾患ＥＡＥに対する予防接種に相当するものである。
【０１３１】
ＹＦＡＫ０．５：０．５の予備免疫付与の場合と対照的に、Ｃｏｐ１を予備免疫付与した群又は同時免疫付与した群は、症状を回復させたものの、臨床スコアを約２乃至３（Ｃｏｐ１予備免疫付与）又は３よりわずかに大きい（Ｃｏｐ１同時免疫付与）レベルまで軽減しただけであった。さらに、症状は、マウスが無症状になるまでの７日目から３７日目の９つの測定点（Ｃｏｐ１同時免疫付与）の間、又は７日目から５０日目の１４の測定点（Ｃｏｐ１予備免疫付与）に渡って観測された。ＹＦＡＫ処理群にように症状が除去されることはなく、マウスの症状は、約１より大きい重症度のレベルで安定した。これらのデータは、ＥＡＥの疾患状態の発症に対する動物の予備免疫付与において、ＹＦＡＫ０．５：０．５が最も効果的であることを示すものである。
【０１３２】
これらのデータは、アミノ酸Ｖ、Ａ、及びＫを有するランダムコポリマーにおけるＷ又はＦの存在が、クラスIIＭＨＣのメジャーグルーブ（例えば、Ｐ１及びＰ４位置）への当該コポリマーのフィットをよりタイトにし得ることを示唆するものである。当該データは、ＹＦＡＫ及びＶＷＡＫが、ＭＳ、脱髄疾病、及びその他の自己免疫疾患に対する有望な潜在的治療薬であることを示すものである。
【０１３３】
【表１】
【０１３４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、ランダムコポリマーの存在下におけるＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ特異的Ｔ細胞系２Ｅ１２（パネルＡ）、８０７３（パネルＢ）、及びＨｙ１Ｂ（パネルＣ）の阻害を示すグラフである。照射されたＬ４６６（Ａ）又はＭＧＡＲ（Ｂ、Ｃ）細胞は、最終濃度が４μＭ（Ａ）又は１２．５μＭ（Ｂ、Ｃ）のＭＢＰ８５−９９（配列番号２）及び異なる濃度の各ランダムポリマーと共に、３７℃で２時間培養した（２つ培養した）。その後、Ｔ細胞を添加し、３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を、ＩＬ−２−依存の細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬＬ）と共に培養し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。
【図２】図２は、ランダムコポリマーの存在下における、ＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＰＬＰ４０−６０特異的ヒトＴ細胞１０６Ａの阻害を示す線グラフ（Ａ）、Ｈ−２ｓ−制限ＰＬＰ１３９−１５１特異的マウスＴ細胞ハイブリドーマ（それぞれ、ｈＰＬＰ／１及びｈＰＬＰ／ｃ４）の阻害を示す棒グラフ（Ｂ及びＣ）である。照射されたＬ４６６（Ａ）又はＳＪＬ／Ｊマウスからの脾細胞（Ｂ及びＣ）は、最終濃度が６０μＭ（Ａ）のプロテオリピドタンパク質ペプチドＰＬＰ４０−６０（配列番号３）及び横軸に示した濃度の異なるランダムポリマーと共に、又は、最終濃度が２４μＭのＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列番号４；Ｂ及びＣ）及び異なるコポリマー（２８μＭ）と共に、３７℃で２時間培養した。その後、Ｔ細胞を添加し、３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を、ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬと共に培養し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。「＊印」は、０％の阻害を示すものである。
【図３】図３は、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＶＥＡＫ、ＦＥＡＫ、及びＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）による抑制を示すグラフである。５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドと５００μｇのランダムコポリマーを、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）のみをＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射した。疾患の進行は、横軸の日数に対する縦軸に示した臨床症状の状況によってモニターした。縦軸に示した結果は、臨床症状の１日平均スコアを表わしている。
【図４】図４は、ランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐ１による、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子へのビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）の結合の阻害率を示すものである。組換え水溶性ＨＬＡ−ＤＲ−２分子は、ビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１；０．１３μＭ）と共に、及び横軸に示した濃度の非標識化ランダムコポリマー又は合成非標識化ペプチド対照であるＭＢＰ８５−９９（配列番号２）と共に培養した。培養は、３７℃で４０時間、ｐＨ７．０で２つ行った。縦軸に示した結合阻害率の結果は、２つの独立した実験のうちの１つを表わすものである。特異的結合は、次の式を用いて阻害の割合として表わす。阻害率＝１００％−［（競合剤存在下における４１０ｎｍの吸収−バックグラウンド）／（競合剤非存在下の吸収−バックグラウンド）Ｘ１００]。競合剤非存在下における４１０ｎｍのシグナルは０．８−０．９であり、バックグラウンドは０．１であった。
【図５】図５は、ランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐ１の存在下での、２Ｅ１２、８０７３、及びＨｙ１Ｂの各細胞系におけるＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８４−１０２特異的Ｔ細胞の阻害を示すグラフである。照射されたＭＧＡＲ細胞は、最終濃度が１２．５μＭのＭＢＰ８５−９９（配列番号２）及び異なる濃度の各ランダムポリマーと共に、３７℃で２時間培養した（２つ培養した）。その後、Ｔ細胞を添加し、３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を、ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬ細胞系のそれぞれと共に培養し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。
【図６Ａ】図６は、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）による抑制を示すグラフである。５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドと５００μｇのランダムコポリマーをＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射し、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）のみで免疫性を与えた。疾患の進行は、横軸に示した疾患導入後の日数に対する、縦軸に示した臨床症状の状況によってモニターした。図６Ａは、２つの実験にそれぞれについて、５乃至９のマウスから構成される各グループにおける臨床症状の１日平均スコア（縦軸）の結果を示すものである。
【図６Ｂ】図６は、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）による抑制を示すグラフである。５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドと５００μｇのランダムコポリマーをＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射し、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）のみで免疫性を与えた。疾患の進行は、横軸に示した疾患導入後の日数に対する、縦軸に示した臨床症状の状況によってモニターした。図６Ｂは、各マウス単体のデータであって、各カラムの最上段は治療に用いたコポリマーであり、代表的な実験において、各グラフの右上隅に表示したマウスについて観測された最大臨床スコアを示すものである。
【図７】図７は、ＭＢＰ８５−８９（配列番号２）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＹＦＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＷＡＫ、及びＣｏｐ１による抑制、及びコポリマーで処置していない対照マウスのデータを示すグラフである。ヒト化マウス（Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３（３）巻、３４３−３４７頁、１９９９年；及び、Ｄ．Ａｌｔｍａｎ、Ｄ．Ｈａｆｌｅｒ、及びＶ．Ｋｕｃｈｒｏｏ、未公表文献）は、導入遺伝子ＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊１５０１）及びＭＳ患者ＯｂからのＴＣＲ（クローンＯｂ．１Ａ１２から増幅したＴＣＲα及びＴＣＲβのＶ（Ｄ）Ｊ再構成）を保因する（ｃａｒｒｙ）。同時に免疫付与された（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスは、０日目において、５００μｇのランダムコポリマー又は表示している対照物質、及び５０μｇのＥＡＥ誘発ＭＢＰ８５−８９（配列番号２）を同時に導入したものである。事前に免疫付与された（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスは、ＥＡＥ誘発の２日前にコポリマーを予め導入したものである。コポリマーＶＹＡＫ及びＶＷＡＫは、それぞれ、Ｖ：Ｙ：Ａ：Ｋ及びＶ：Ｗ：Ａ：Ｋが０．５：０．５：５：３のモル比を有する。当該データは、３、５、７、９、１１、１４、１６、１８、２２、２５、２８、３２、３７、４０、４３、及び５０日目のそれぞれにおける（横軸）、臨床症状のスコア（縦軸）によって疾患の進行を示すものである。
【図８】図８は、図７における動物群のうちの３つから得たデータを一緒に再プロットした線図である。ひし形は、コポリマーの処置を受けていない対照ＥＡＥ誘発マウスである。四角形は、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）で処置したＥＡＥ誘発マウスである。三角形は、Ｃｏｐ１で処置したＥＡＥ誘発マウスである。図における処置は、それぞれ、ＥＡＥ導入の２日前に行った（すなわち、疾患に対する予防接種である）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のモル比のアミノ酸を有し、所定の長さのポリペプチドに合成され、自己免疫疾患の症状及び再発の頻度を抑制することができるポリペプチドの設計に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、人工の０．１％に影響を及ぼす中枢神経系の炎症性疾患であり、北欧人種コーカソイドのＭＳ患者においてはＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）ハプロタイプに関係する。ＭＳの動物タイプである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、Ｔ細胞性自己免疫疾患である。ＥＡＥは、例えば、ミエリン塩基タンパク質（ＭＢＰ；Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２３巻、３４３−３４７頁、１９９９年）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ；Ｊ．Ｍ．Ｇｒｅｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻、７８３−７８８頁、１９９２年）、又はミエリン希突起膠糖タンパク質（ＭＯＧ；Ｉ．Ｍｅｎｄｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５巻、１９５１−１９５９頁、１９９５年）等のミエリン成分由来のペプチドを皮下注射によって誘発することができる。
【０００３】
ＥＡＥの過程では、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、マウスのクラスIIＭＨＣ分子（例えば、Ｈ−２Ａｓ）によって表わされる自己抗原を認識し、最終的に、これは疾病の臨床的徴候として観測され得る病理学的変化をもたらす。ＥＡＥは、当該疾病を抑制するために有力な治療用化合物の有効性を検証するための広く研究されたシステムを提供する。これらの化合物には、サイトカイン（Ｊ．Ｐ．Ｌｅｏｎａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７９５巻、２１６−２２６頁、１９９６年）、アネルギーを誘発するペプチド抗原（Ａ．Ｇａｕｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻、１４９１−１４９４頁、１９９２年）、経口免疫寛容を誘発するペプチド抗原（Ｋ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９巻、１０３６−１０４４頁、１９９７年；Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８巻、３３５−３４３頁、１９９７年）、又は改変ペプチド配位子（Ｃ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８１巻、１５６９−１５７４頁、１９９５年；Ｌ．Ｂ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、９２７９−９２８４頁、１９９７年）が含まれる。
【０００４】
コポリマー１（Ｃｏｐ１；Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）；ＹＥＡＫ）は、約５：３：１．５：１のモル比のアラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びチロシン（Ｙ）からなるランダムアミノ酸コポリマーである。Ｃｏｐ１は、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物を用いて、溶液中で合成される（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年）。当初は、当該コポリマー及びその他の関連するコポリマーを用いて免疫応答性の遺伝的根拠が定められていた。現在、これらはクラスIIＭＨＣ遺伝子として知られている（Ｈ．Ｏ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ及びＭ．Ｓｅｌａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２２巻、５１７−５３２頁、１９６５年；Ｈ．Ｏ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ及びＭ．Ｓｅｌａ、１２６巻、９６９−９７８頁、１９６７年）。ポリ（Ｙ、Ｅ、Ａ、Ｋ）又はＹＥＡＫとしても知らているＣｏｐ１は、実験的アレルギー性脳脊髄炎の抑制（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年；Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻、２７３−２７９頁、１９７３年；Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、３巻、２５６−２６２頁、１９７４年；Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、１７−２５頁、１９９３年）、及び多発性硬化症の再発の治療（ＭＳ；Ｍ．Ｂ．Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１７巻、４０８−４１４頁、１９８７年；Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４５巻、１２６８−１２７６頁、１９９５年；Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５０巻、７０１−７０８頁、１９９８年）のいずれにおいても有効であることが判明した。
【０００５】
Ｃｏｐ１は、ＭＳに対する療法として認可され、現在では広く用いられている。しかしながら、Ｃｏｐ１はＭＳの再発率を減少させるが、再発を除去することまではできず、当該疾病に対する治療薬ではない。ＭＳ及びその他の自己免疫疾患の治療に対する改善された組成物及びその使用方法を開発することが重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の特徴の１つは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を（Ｙ＋Ｆ）：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＹＦＡＫである。ここで、“（Ｙ＋Ｆ）”という表現は、Ａ及びＫの各モル比に対する、ＹとＦのモル比の合計を意味する。
【０００７】
当該アミノ酸は、固相反応によって重合される。別の実施態様では、当該アミノ酸は、溶液化学によって重合される。関連する実施態様では、Ｆ対Ｙのモル比は約１であり、例えば、Ｆ対Ｙのモル比は少なくとも約２であり、又は、Ｙは約４である。
【０００８】
別の実施態様では、Ｙのモル比はＦよりも大きく、例えば、Ｆ対Ｙのモル比は少なくとも約２であり、又は、Ｆ対Ｙのモル比は少なくとも約４である。一般に、当該コポリマーの長さは、少なくとも約２５アミノ酸残基であり、例えば、当該コポリマーの長さは、少なくとも約３５アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、又は少なくとも７０アミノ酸残基である。
【０００９】
１の実施態様では、本発明は、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋを約０．２：０．８：５：３のモル比で含む線状ランダムアミノ酸コポリマーを提供するものである。関連する実施態様では、本発明は、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋを約０．５：０．５：５：３のモル比で含む線状ランダムアミノ酸コポリマーを提供する。別の関連する実施態様では、本発明は、Ｙ：Ｆ：Ａ：Ｋを約０．８：０．２：５：３のモル比で含む線状ランダムアミノ酸コポリマーを提供する。一般に、当該コポリマーアミノ酸は固相反応を用いて重合され、又は、当該コポリマーアミノ酸は溶液化学を用いて重合される。
【００１０】
別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＦＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＷＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＹＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＦ：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＦＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＷ：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＷＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を（Ｖ＋Ｗ）：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＷＡＫを提供する。ここで、“（Ｖ＋Ｗ）”という表現は、Ａ及びＫの各モル比に対する、ＶとＷのモル比の合計を意味するものである。
【００１１】
別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ｗ：Ａ：Ｋが約０．５：０．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＷＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ｅ：Ａ：Ｋが約１：１．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＥＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、フェニルアラニン（Ｆ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＦ：Ｅ：Ａ：Ｋが約１：１．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＦＥＡＫを提供する。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を（Ｖ＋Ｙ）：Ａ：Ｋが約１：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＹＡＫを提供する。ここで、“（Ｖ＋Ｙ）”という表現は、Ａ及びＫの各モル比に対する、ＶとＹのモル比の合計を意味するものである。別の側面において、本発明は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）をＶ：Ｙ：Ａ：Ｋが約０．５：０．５：５：３のモル比で含む、線状ランダムアミノ酸コポリマーＶＹＡＫを提供する。さらに、ここに挙げた組成物は、いずれも、薬学的に許容可能な緩衝液において、及び／又は単位用量（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ）において提供され得る。
【００１２】
本明細書におけるコポリマーは、上述のアミノ酸からなるが、更に、上述のアミノ酸組成物を共有し、かつ結果として得られるコポリマーがほぼ同一の機能を有するように１以上の更なる置換基（例えば、１以上の更なるアミノ酸）を含むコポリマーと等価であるとみなされる。例えば、ＦＥＡＫ、ＦＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＹＡＫ、ＹＦＡＫコポリマー、又は、本明細書に記載される任意のコポリマー組成物のほとんどを含み（すなわち、当該組成物の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％を含み）、かつそれらとほぼ同一の機能特性を有するコポリマーは、本明細書に記載の組成物と等価であるとみなされる。自己免疫疾患の治療に有効な本明細書における組成物の投薬量が、当該組成物とほぼ同じ置換基を含む自己免疫疾患の治療用コポリマーの投薬量とほぼ同一の場合には、機能がほぼ同一であるとみなす。
【００１３】
本発明のコポリマー組成物は、少なくとも１の更なる治療薬と組合せることができる。関連する実施態様では、当該更なる治療薬は、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、又は可溶性サイトカインレセプター等である。例えば、サイトカインは、β−インターフェロン、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０よりなる群から選択される。
【００１４】
本発明の１の実施態様は、上述のコポリマーの少なくとも１単位用量を含むキットである。
【００１５】
本発明の特徴の１つは、自己免疫疾患を有する対象の治療に用いる組成物の製造方法であり、ここで、当該組成物は、ランダム線状アミノ酸コポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ、ＶＹＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＥＡＫ、及びＦＥＡＫのいずれかを含む。一般に、当該コポリマーは、少なくとも約５０残基、例えば、少なくとも約７０残基の長さを有する。さらに、そのように場合、当該組成物は、薬学的に許容可能なキャリヤーを更に含む。さらに、当該使用には、効果的な用量で組成物を投与することを含み得る。“効果的な用量”とは、自己免疫疾患の臨床症状及び再発の頻度のいずれか又は両方を改善する組成物の量である。投与の前において、コポリマーは、自己免疫疾患に関連するＭＨＣクラスIIタンパク質への自己抗原性ペプチドの結合を阻害するために選択される。例えば、ＭＨＣクラスIIタンパク質−ペプチド複合体に対するクラスII特異的Ｔ細胞の応答を阻害するコポリマーが選択される。自己免疫疾患は、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、重症甲状腺機能低下症、多発性硬化症、脱髄疾患、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫血小板減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、グレーブス病、乾癬、尋常性天疱瘡、関節リウマチ、及びその他よりなる群から選択される。好ましい実施態様では、当該自己免疫疾患は多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病である。一緒に投与され得る更なる治療薬は、例えば、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、又は可溶性サイトカインレセプターである。サイトカインは、インターフェロン−β、インターロイキン−４、又はインターロイキン−１０である。酵素阻害剤は、プロテアーゼ阻害剤又はシクロオキシゲナーゼ阻害剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
文脈によって必要とされない限り、本明細書及び特許請求の範囲では、次の語は、以下に説明する意味を有する。
【００１７】
“自己免疫疾病（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）”又は“自己免疫疾患”という語は、自己抗原として知られる自己コード化物に対する不適切な免疫応答によってもたらされる病状を意味する。本発明のコポリマー組成物は、自己免疫疾患の症状を治療するために用いることができる。それらの疾病の種類には、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、重症甲状腺機能低下症、多発性硬化症、脱髄疾患（脳又は脊髄における斑点又は硬化組織によって特徴付けられる）、重症筋無力症（神経筋接合部のアセチルコリン受容体に対する自己免疫攻撃（ａｔｔａｃｋ）に起因する）、ギラン−バレー症候群、多発性神経炎、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫血小板減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、グレーブス病（甲状腺機能低下症の一形態）、乾癬、尋常性天疱瘡、関節リウマチ（ＲＡ）が含まれる。
【００１８】
“脱髄疾病”という語には、神経細胞の伸長部分を覆っている細胞膜で構成されるミエリン鞘の一部が分解により除去される病状が含まれる。脱髄疾病は、予防接種後、抗ＴＮＦ処置後、ウイルス感染後、及びＭＳにおいて生じ得る。
【００１９】
アミノ酸の“誘導体”という語は、当該アミノ酸の原子に結合した更なる置換基、例えば、Ｎ−無水カルボキシ基、γ−ベンジル基、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル基、又はハライド基を有する、アミノ酸の化学的関連物質を意味する。
【００２０】
“アナログ”という語は、異なる配置（例えば、異性体、又は、Ｌ−構造ではなくＤ−構造）を有するアミノ酸の化学的関連物質、又は、アミノ酸に近似するサイズ、電荷、形状を有する有機分子、又は、ペプチド結合に含まれる原子を修飾したアミノ酸を意味する。これにより、当該アナログ残基を有するコポリマーは、アナログがコポリマーの内部にあるか末端に位置するかにかかわらず、そのようなアナログを有しないその他の類似のコポリマーよりも優れたプロテアーゼ耐性を有する。
【００２１】
“アミノ酸”及び“アミノ酸コポリマー”という語には、アミノ酸誘導体及び／又は本明細書で定義されるアミノ酸アナログである１以上の成分を含まれることができ、当該誘導体又はアナログは、組成物によって示される２０の天然アミノ酸のうちの任意の１以上における残基の部分又は全体を含む。例えば、１以上のチロシン残基を有するアミノ酸コポリマー組成物では、これら残基の１以上の部分をホモチロシンで置換することができる。さらに、２つの隣接する残基の間に１以上の非ペプチド又は擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）結合を有するアミノ酸コポリマーも、当該定義の範囲内に含まれる。
【００２２】
“疎水性”アミノ酸という語は、脂肪族アミノ酸であるアラニン（Ａ、又はａｌａ）、ギリシン（Ｇ、又はｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉ、又はｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、又はｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、又はｍｅｔ）、プロリン（Ｐ、又はｐｒｏ）、及びバリン（Ｖ、又はｖａｌ）、及び芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ、又はｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｆ、又はｐｈｅ）、及びチロシン（Ｙ、又はｔｙｒ）を意味する。ここで、かっこ内の１文字記号及び３文字記号は、各アミノ酸の標準コード略語である。これらのアミノ酸は、コポリマー又はその他のポリペプチドに残基として存在する場合、脂肪族側鎖の長さ及び芳香族側鎖の大きさの関数として、疎水性を与える。
【００２３】
“荷電”アミノ酸という語は、アミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ、又はａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ、又はｇｌｕ），アルギニン（Ｒ、又はａｒｇ）、及びリシン（Ｋ、又はｌｙｓ）を意味する。これらは、当該アミノ酸の１以上の残基を有するコポリマー又はその他のアミノ酸組成物に水溶液におけるｐＨの生理学的値に正電荷（ｌｙｓ及びａｒｇ）又は負電荷（ａｓｐ、ｇｌｕ）を与える。ヒスチジン（Ｈ、又はｈｉｓ）は、ｐＨ７で疎水性であり、ｐＨ６で電荷を持つ。
【００２４】
“アネルギー”という語は、抗原に対する被験対象の免疫不応答を意味する。
【００２５】
本明細書において、“被検体（ｓｕｂｊｅｃｔ）”という語は、哺乳類（ヒトを含む）を意味する。
【００２６】
“異種細胞”という語は、被検体の細胞と無関係のＭＨＣタンパク質生産細胞を意味し、例えば、当該異種細胞は哺乳類の細胞ではない。当該異種細胞は、例えば、冷血動物からのものであり、無脊椎動物からのものであることができる。当該異種細胞は、昆虫の細胞であり、又は、酵母細胞などの微生物の細胞である。
【００２７】
“クラスII ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ−２タンパク質の表面”という語は、外部環境と接触し（水性溶媒と相互作用するようなタンパク質の特性を含む）、及びその他の細胞成分（例えば、核酸、他のタンパク質、及びペプチド）と結合することができる、３次元配置におけるタンパク質分子の一部を含む。
【００２８】
“Ｐ１ポケット”及び“Ｐ４ポケット”という語は、結合した自然発生抗原又はエピトープ、及び結合した合成ペプチド又はコポリマーを含む含まれるクラスIIＭＨＣタンパク質と結合するペプチドからのアミノ酸残基側鎖に適合するクラスIIＭＨＣタンパク質分子のペプチド結合表面における３次元多形領域を含む（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７頁、１９９８年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６１巻、６４０頁、２００１年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３頁、２００１年）。
【００２９】
“Ｐ−１位置”及び“Ｐ５位置”という語は、Ｔ細胞受容体に直接接触したクラスIIＭＨＣタンパク質分子ペプチド錯体におけるアミノ酸残基を意味する（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６１巻、６４０頁、２００１年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３頁、２００１年）。Ｐ−１位置という語は、Ｐ１ポケットを占有するペプチドのアミノ酸残基の前に存在するアミノ酸について用いられる。Ｐ５位置という語は、Ｐ４ポケットを占有するアミノ酸残基の後に存在するアミノ酸残基について用いられる。
【００３０】
“抗原結合溝”という語は、クラスIIＭＨＣタンパク質分子におけるα及びβサブユニットの両方の表面によって形成される、クラスIIＭＨＣタンパク質分子の表面における３次元抗原相互作用部位について用いられる（（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、２１５頁、１９９４年）。
【００３１】
“薬学的に許容可能なキャリヤー”という語には、生理学的に相溶性である、任意の溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤（例えば、抗菌剤及び抗真菌剤）、等浸透圧及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、当該キャリヤーは、静脈内、筋肉内、経口、腹膜内、経皮、又は皮下投与に適しており、さらに、活性化合物は、酸の働き又はその他の不都合な自然条件による不活性化から保護するための物質によって被膜することができる。
【００３２】
宿主の免疫応答が自己の分子（自己抗原）と外部の抗原を区別することができず、それにより、異常な免疫応答が発生する場合に、自己免疫疾患がもたらされる。自己免疫疾患における自己の分子に対する免疫応答によって、自己寛容（ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の正常状態からの逸脱がもたらされる。これは、自己抗原と反応することができるＴ細胞及びＢ細胞の崩壊を伴うものであり、若年期における免疫系の発達で生じた事象によって回避されてきたものである。処理ペプチドをＴ細胞に結合させて提供（ｐｒｅｓｅｎｔ）する能力によって免疫応答の制御における中心的な役割を担っている細胞表面タンパク質は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子である（Ｊ．Ｂ．Ｒｏｔｈｂａｒｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、５２７頁、１９９１年）。
【００３３】
ＭＳに加えて、その他の脱髄疾病は、例えば、ウイルス感染後、予防接種後、脳脊髄炎後において（Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１２巻、２７７−２８２頁、１９９１年）、及び、その後における特定の抗ＴＮＦ剤の投与において発症することが判明している（ＦＤＡ Ｔａｌｋ Ｐａｐｅｒ、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ｈｔｔｐ：／／．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｂｂｓ／ｔｏｐｉｃｓ／ＡＮＳＷＥＲＳ／ＡＮＳＤＯ９５４．ｈｔｍｌ）。
【００３４】
自己免疫疾患に対する治療薬としてのアミノ酸コポリマー
本発明の方法には、特定の対立遺伝子によってコード化されたクラスIIＭＨＣタンパク質に結合し得るような薬剤の使用が含まれる。そのような薬剤は特定のクラスIIＭＨＣタンパク質に結合して、自己免疫疾患に関連する自己抗原の結合を阻害し及び／又は阻止することができ、又は結合の間にアネルギーを導入することができる。その結果、自己抗原に対する免疫応答がなくなる。
【００３５】
自己免疫疾患を治療するために、多くの治療薬が開発されてきた。例えば、シクロオキシゲナーゼを阻害することによって低分子量の炎症性化合物の生成を阻止し得る薬剤が開発されている。また、抗ＴＮＦ特異的モノクローナル抗体断片を用いて、又は当該ＴＮＦレセプターの可溶性形態を用いて炎症性タンパク質の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を抑制することによって、炎症のタンパク質メディエーターを阻害することで機能し得る薬剤が、市販されている。さらに、Ｔ細胞の表面におけるタンパク質（ＣＤ４レセプター、又は細胞粘着レセプターＩＣＡＭ−１）の機能を標的として阻害し、それにより、抗原提示細胞（ＡＰＣ）との生産的相互作用を阻止する薬剤が、市販されている。しかしながら、天然に折り畳まれたタンパク質である治療薬は、生産、製剤、貯蔵、及び運搬における問題を招く。さらに、天然タンパク質は、ウイルス及びプリオン等の病原体が混入する可能性がある。
【００３６】
自己免疫応答の阻害における更なる標的は、ＭＨＣ分子に代表されるリンパ球表面タンパク質である。詳細には、これらのタンパク質は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）−ＤＲ、−ＤＱ、及び−ＤＰとして表わされるクラスIIＭＨＣ遺伝子によりコード化される。各ＭＨＣ遺伝子は、哺乳類群の中における多数の代替形質又は対立形質に見出されている。特定の自己免疫疾患（例えば、ＭＳ及び関節リウマチ（ＲＡ））にかかっている被検体のゲノムは、当該疾患に連関する１以上の特徴的なクラスIIＭＨＣ対立遺伝子を有している傾向が強い。
【００３７】
ＭＳ及びその他の脱髄疾病の治療薬を得る方法の１つとしては、精製されたクラスIIＭＨＣ対立遺伝子タンパク質分子（特に、脱髄疾病に関連するクラスIIＭＨＣ対立遺伝子の生産物であるタンパク質）と生体外で選択的に結合するペプチドを特定することである。さらに、当該薬剤は、生体内の抗原提示細胞の表面における場合と同じように当該タンパク質と結合し、それによって、ＭＳ等の脱髄疾病の原因であるＴ細胞類を遮断し、アネルギー化し、又は不活性化するべきである。
【００３８】
クラスIIＭＨＣタンパク質は、２つのほぼ等しい大きさのサブユニットα及びβ（これらは、膜貫通タンパク質である）から構成される。α及びβサブユニットの両方のタンパク質特性により形成されるペプチド結合クレフト（ｃｌｅｆｔ）は、Ｔ細胞に対する抗原の提示部位である。少なくとも３つのタイプのクラスIIＭＨＣ分子、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱ、及び−ＤＰが存在し、さらに、これらの各タイプには多数の対立形質が存在する。クラスIIＭＨＣ分子は、主として、Ｂリンパ球及び抗原提示細胞（マクロファージ及び樹状細胞など）の表面において発現する（Ｌ．Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｗ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＴｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）、Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、６０２−６０６頁、１９９４年）。
【００３９】
本発明の実施態様には、３以上の異なるアミノ酸を含むコポリマーである組成物を用いてクラスIIＭＨＣ分子を標的とすることによって、自己免疫疾患を治療する新規な方法が含まれる。
【００４０】
本発明のコポリマーは、Ｆｍｏｃ又はｔ−ｂｏｃ開始アミノ酸アナログ等を用いて合成することができ、それらは、更なる重合（固相合成）のための自動ペプチド合成装置における樹脂上に固定化される。当該アミノ酸は、最適な結合特性を有するコポリマーを提供するためにモル比を調整して重合される。
【００４１】
合成手順には、活性化形態の選択されたアミノ酸（例えば、Ｎ−カルボキシ無水物として活性化されたアミノ酸）の混合物を、適切に誘導化されたアミノ酸前駆体のそれぞれを適切なモル比で含む溶液を提供する工程が含まれ得る。当該前駆体は、特定の官能基（例えば、Ｌ−リシンのεアミノ基）を保護するために誘導化されており、例えば、ε，Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンである。或いは、当該合成手順には、好ましいモル比の選択されたアミノ酸誘導化前駆体の合成手順におけるオンライン混合工程を含まれ得る。ヘテロポリマー合成設備は、例えば、Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｌａｙｔｏｎ、オーストラリア）、ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）、及びＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州）から購入することができる。
【００４２】
ペプチド合成のための樹脂支持体の例には、メリーフィールド樹脂（１％のＤＶＢ架橋を有するクロロメチル化ポリスチレン）、Ｆｍｏｃアミノ酸Ｗａｎｇ樹脂（４−ベンジルオキシベンジルアルコール）が含まれ、当該樹脂はアミノ酸が予め挿入される（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｄ−ｔｒｐ（ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂）。異なるメッシュサイズ（例えば、１００−２００メッシュ）、及び初期アミノ酸における官能基化における高い又は低い挿入密度（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）の樹脂が入手可能である。
【００４３】
本発明の組成物に重合される異なる誘導化アミノ酸溶液（好ましくは、ペプチド合成において通常行われているように保護されている）が、ビーズ試料（例えば、Ｆｍｏｃ）に添加される。樹脂から除去される完全なコポリマー樹脂の合成、非ブロック化、及び開裂のための試薬は、装置の製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）、又はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州））から入手可能である。例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９１年を参照されたい（当該内容は、引用により本明細書中に取り込まれる）。更なるアミノ酸又はアミノ酸アナログ又は誘導体を、コポリマーを構成するために選択された少なくとも３のアミノ酸に添加して、当該アミノ酸のごく一部を置換し、例えば、向上したプロテアーゼ耐性を有し、それゆえ改善された薬理学的特性（例えば、生体内におけるより長い寿命）を有するコポリマーを提供することができる。アナログの例は、ホモチロシン又はその他の置換チロシン誘導体、及びアミノ酪酸であり、これらはいずれもＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍｔｅｃｈからＦｍｏｃ誘導体として市販されている。
【００４４】
本発明の方法における治療用組成物
薬学的に許容可能なキャリヤーには、生理学的に相溶性である、任意の溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤（例えば、抗菌剤及び抗真菌剤）、等浸透圧及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、当該キャリヤーは、静脈内、筋肉内、経口、腹膜内、経皮、又は皮下投与に適しており、さらに、活性化合物は、酸の働き又はその他の不都合な自然条件による不活性化から保護するための物質によって被膜することができる。
【００４５】
本発明の方法には、被検体に投与するのに適切な薬剤組成物中にコポリマーを取り込むことが含まれる。本発明の組成物は、当該技術分野において公知である種々の方法によって投与することができる。活性化合物は、迅速な放出から保護するキャリヤー、例えば、インプラント、経皮貼付、及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む放出制御剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を用いて調製することができる。そのような剤形を調製するための多くの方法が特許されており、当該技術分野における当業者に周知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９７８年参照。薬学的に許容可能なキャリヤーにおける輸送用の薬剤組成物は無菌性であり、好ましくは、製造及び貯蔵条件下において安定である。当該組成物は、溶液、微小エマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に適するその他の規則構造として製剤され得る。
【００４６】
最適な所望の応答（例えば、治療効果）が得られるように、用量を調節することができる。例えば、単一のボーラスで投与することができ、時間をかけていくつかに分割して投与することもでき、又は、投与量を疾患状況の要求に応じて比例的に増減することもできる。
【００４７】
一般に、本発明の１の実施態様は、治療効果（例えば、症状の緩和）をもたらす最少の有効量である、適切な１日量で治療用コポリマー組成物を投与することである。好ましくは、本発明の治療用ヘテロポリマー化合物は、治療開始時における適切な最少投与量として、１の被検体について１日当り、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、又は少なくとも約２０ｍｇの量で投与される。一般に、有効量の本発明における組成物を含む配合物は、被検体１キログラムにつき、１日当り約５０乃至約４００マイクログラムの範囲で投与することができる。
【００４８】
当該技術分野における技術常識を有する医師又は獣医は、所望される薬剤組成物の有効量を容易に決定し及び指示することができるであろう。例えば、医師又は獣医は、薬剤組成物に用いられる本発明の組成物の投与量について、所望の治療効果を達成するために必要な量よりも低いレベルで開始し、その後、所望の効果が得られるまで時間と共に投与量を増加させることができる。
【００４９】
別の実施態様では、薬剤組成物は、更なる治療約も含む。従って、本発明の方法において、薬剤コポリマー組成物は、併用療法の一部として、すなわち更なる薬剤と組合せて投与することができる。更なる治療薬として、自己免疫疾患及び関節炎の治療のためのコポリマーと共に併用治療に用いることができる物質の例には、炎症性分子又は不用のサイトカイン（インターロイキン−６、インターロイキン−８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及び腫瘍壊死因子−α等）へ選択的に結合し得る抗体又は抗体断片；タンパク質であることができる酵素阻害剤（例えば、α１−抗トリプシン又はアプロチニン）；シクロオキシゲナーゼ阻害剤であることができる酵素阻害剤；人工結合タンパク質（例えば、カリクレインの人工阻害剤等のプロテアーゼ阻害剤である人工タンパク質）；抗菌剤（例えば、アモキシシリン、リファンピシン、エリスロマイシン等の抗生物質）；抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル等の低分子量化合物；ステロイド（例えば、コルチコステロイド）又は性ステロイド（例えば、プロゲステロン）；非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アスピリン、イブプロフェン、又はアセトアミノフェン）；メトトレキサート又はアドリアマイシン等の抗がん剤；サイトカイン遮断剤；接着分子遮断剤；又は、サイトカインが含まれる。
【００５０】
更なる治療薬は、サイトカイン（本明細書では、自然発生タンパク質又は変異体であって、成長因子として機能する制限剤は含まない）、リンフォカイン、インターフェロン（特に、インターフェロン−β）、腫瘍壊死因子、血管形成誘導因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）又は抗血管形成誘導因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン、成熟因子、走化性タンパク質などであることができる。本発明の実施態様であるアミノ酸コポリマーに添加される更なる薬剤は、別のポリマー、例えば、ＹＥＡＫ又はＣｏｐ１であるＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）、又は、これらの或いはその他のアミノ酸の一部を含むコポリマー（Ａｈａｒｏｎｉら、ＷＯ ００／０５２５０、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６７４７）、又はオリゴペプチド又はペプチド誘導体を含むコポリマー（Ｓｔｏｍｉｎｇｅｒら、ＷＯ ００／０５２４９、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１６６１７；ＷＯ ０２／５９１４３、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２０７１）であることができる。本発明の組成物と組み合わせて用いられる好ましい治療薬は、サイトカインであって、インターフェロン−β、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０が含まれる。
【００５１】
本発明の組成物と共に用いられ得る治療薬は、遺伝子融合の効力によってビリオンコートタンパク質に共有結合しているタンパク質を改造する技術分野における当業者に公知である、人工結合タンパク質であることができ（Ｒ．Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２３３，４０９号；Ｒ．Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，４０３，４８４号）、これは、当該技術分野において公知の方法によって製造することができる。種々のその他の標的を結合するタンパク質を作り出すことができ、本発明のヘテロポリマーと共に組み合わせた治療薬として用いることができる。
【００５２】
当該投与の結果としての症状の改善は、投与開始後の一定期間における、ＭＳの発作における再発頻度の減少、症状の重傷度の減少、及び再発発作の除去を意味する。好ましくは、治療的に有効な投薬量によって、治療されていない被検体と比較して、症状及び再発頻度が少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、及び少なくとも約８０％減少し、或いは、１以上の症状又は自己免疫疾患の再発が約１００％除去される。当該期間は、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約６ヶ月、又は少なくとも約１年間であることができる。
【００５３】
ランダム合成コポリマーの使用方法は、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子生産物に関連するその他の自己免疫疾患の治療における基礎とすることもできる。これは、当該タンパク質レセプター分子と結合する候補性自己抗原と競合することにより、Ｔ細胞アネルギー又はＴ細胞アポトーシスを導入することによって、又は、自己抗原に対するその後のＴ細胞応答を生体内において阻害するようにＴ細胞を抑制することによってなされる。さらに、１以上の更なる成分、例えば、種々の量で重合反応に添加されるアミノ酸アナログ又は誘導体を有する合成コポリマーは、種々の自己免疫性Ｔ細胞応答に対する効果的な阻害剤になり得る。
【００５４】
Ｃｏｐ１の活性は、最初のステップとして、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、クラスIIＭＨＣタンパク質（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻、４８７２−４８７６頁、１９９４年）の表面に結合し、その後、その有効性は、これらのタンパク質から生じる特異的エフェクターＴ細胞認識ペプチドエピトープの活性に対するミエリン抗原との競合（Ａ．Ｂｅｎ−Ｎｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２４３巻、Ｓ１４−２２頁、１９９６年；Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４巻、２０９−２１７頁、１９９６年）、及び／又は抗原特異的調節Ｔ細胞の導入（Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、１７−２５頁、１９９３年）のいずれかに依存する。
【００５５】
これらの活性に関する更なるコポリマーの評価及びメカニズムの調査によって、治療薬の改善に結びつく情報が得られる可能性がある。最近の研究によって、多岐にわたるコポリマーのほぼ全てが、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、及び−ＤＲ４のそれぞれの精製分子に結合するＹＥＡＫのランダム混合物に見出されること、及び、ＹＥＡＫは、一般に、精製クラスIIＭＨＣタンパク質に結合することが明らかとなっている（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７、１９９８年）。Ｃｏｐ１は、さらに、ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）に対するＭＢＰ８５−９９の結合と競合し、ＭＢＰ８５−９９に対するＤＲ−２制限Ｔ細胞の応答を阻害する。Ｃｏｐ１における４つのアミノ酸のうちの３つのみを含有するランダムコポリマー（例えば、ＹＡＫ）の、クラスIIＭＨＣ分子に対する結合についての研究によって、ＹＡＫが最も効果的であることが判明した（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、６３５−６４１頁、１９９９年）。
【００５６】
ＭＳ関連分子であるＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）に対するＣｏｐ１の結合モチーフは、Ｐ−２におけるＥ、Ｐ−１におけるＫ、及びＰ−１におけるＹを示し、その他の位置における選好（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は観測されていない（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）。さらに、ＡはＰ１において過剰発現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）である。Ｐ１はアンカー位置なので、当該位置におけるＹの結合は予想しなかった。ＤＲ−２対立遺伝子でコード化されたタンパク質におけるＰ１ポケットは小さいものであり（これは、β８６Ｇｌｙではなくβ８６Ｖａｌの存在による）、当該位置におけるＡの過剰発現は、この事実に起因するものであろう。Ｐ−１におけるＫの効果は、α１へリックスの上部における残基とＫの相互作用による結合の安定性に依存すると考えられ、これは、Ｓα５３又はＥα５５におけるα１へリックス残基の側鎖と相互作用し得るＨＬＡ−ＤＲ１と錯形成するＨＡ３０６−３１８のＰ−１におけるＫ残基と同様である（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、２１５−２２１頁、１９９４年）。
【００５７】
ＭＢＰ８５−９９の結合モチーフによって設計されたコポリマー（Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９巻、２７９−２９０頁、１９９４年）は、Ｃｏｐ１よりも優れた治療薬であろう。本明細書では、それぞれが１４−、３５−、及び５０−ｍｅｒの長さで合成された３種又は４種のアミノ酸を含むいくつかのランダムコポリマーが、固相法により生産される。これらのコポリマーの設計は、第一に、コポリマーの有効性を改善するため、ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）に結合するＭＢＰ８５−９９のアンカー残基（特に、Ｐ１アンカー）に関するアミノ酸の選択によってなされる（Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９巻、２７９−２９０頁、１９９４年；Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）。ＭＳにおける自己抗原特異的Ｔ細胞応答、及びＭＳの動物型であるＥＡＥの疾患進行に対する当該コポリマーの効果を、以下の実施例に示す。
【００５８】
自己免疫疾患の治療における主な目標は、抗原提示細胞の表面における自己ＭＨＣレセプターによって提示される自己抗原性ペプチドと自己反応性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）との三分子相互作用を阻害する抗原特異性免疫調節療法の開発である。これらのＴ細胞性自己免疫疾患の療法は、公知の標的抗原を有する動物モデルについて成功している（例えば、Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８巻、３３５−３４３頁、１９９７年；Ｌ．Ｂ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、９２７９−９２８４頁、１９９７年を参照）。改変ペプチド配位子（ＡＰＬ）は、矛盾する発見ではあるが、ＥＡＥの治療（Ｌ．Ｂ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、９２７９−９２８４頁、１９９７年；Ｓ．Ｂｒｏｃｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３７９巻、３４３−３４６頁、１９９６年）、及びＭＳの治療（Ｂ．Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻、１１６７−１１７５頁、２０００年；Ｌ．Ｋａｐｐｏｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻、１１７６−１１８２、２０００年）のいずれにも用いられる。
【００５９】
再発軽減ＭＳに対する認可治療薬であるＣｏｐ１（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標））は、クラスIIＭＨＣ分子に対する乱交雑結合剤として機能し（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７、１９９８年）、ＴＣＲのアンタゴニストとして機能し（Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、６３４−６３９頁、１９９９年）、及び／又はサプレッサー細胞の誘発物質として機能する（Ｒ．Ａｈａｒｏｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、１７−２５頁、１９９３年）と提案されていた。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）は、現在では広く用いられており、毒性はほとんど又は全く無く、６年間にわたってＭＳ患者への効力が持続する（Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．、６巻、２５５−２６６頁、２０００年）。しかしながら、当該試薬は、再発頻度を３０％減少させるが、再発を除去することまではできない。新規な化合物の開発によって、ＭＳに対する、或いはその他の自己免疫疾患に対する治療薬の改善が提供され得る。
【００６０】
実施例１−６では、１４−、３５−、又は５０ｍｅｒの長さのコポリマーを用いて、本明細書に記載のコポリマーの最適なサイズを決定した。５０−ｍｅｒが、ＨＬＡ−ＤＲ−２との結合およびＭＢＰ特異的Ｔ細胞応答の阻害において最も有効であったので、実施例７−１１において用いたコポリマーは、５０−ｍｅｒとして合成したものである。抗原の提示の阻害及びＥＡＥの抑制に有効であることが判明した５０以上というアミノ酸のサイズは、本発明のランダムコポリマーが、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、９２５−３４頁、１９９７年）又はオリゴマーＴ細胞エピトープ（Ｏ．Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１４６４２−１４６４７頁、１９９７年）と同様に、細胞膜の一部のおいてクラスIIＭＨＣ分子と結合してクラスターを形成することによって機能するということを示唆するものである。
【００６１】
本明細書の実施例７−１１におけるランダムコポリマーの残基は、主として、免疫優性Ｔ細胞エピトープであるＭＢＰ８５−９９ペプチド（配列番号２）のアンカー残基に基づいて設計されたものである。コポリマー１におけるＹは、ＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）の推定されるＰ１ポケットにおいて見出されたが、Ｆとぴったりであり、ＭＢＰ８５−９９におけるＶ８９に適合する当該ポケットに対して、Ｙは大きすぎる。さらに、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）のＦ９２はＰ４ポケットに存在するが（Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）、Ｙ又はＷは当該ポケットには窮屈であろう。本発明のＹとＦ含有コポリマーにおけるこれら２つの残基の相互関係を、異なるＹ：Ｆの比で合成されたコポリマーを用いて検証した。さらに、実施例１１では、異なるサイズのＰ１及びＰ４に適合するための異なるサイズの芳香族基の必要性に基づいて合成のために選択された、Ｖ−とＷ−含有コポリマー及びＶ−とＹ−含有コポリマーが、ＥＳＥ症状の治療に特に有効であることを示している。各Ｐ１及びＰ４のサイズ、形状、及び電荷分布についての知見、及びＥＡＥ治療薬としてのＶ−とＷ−含有ポリマーのデータを考慮すると、コポリマーの合成においてＶとＷをそれぞれ置換し得る新規な有機側鎖を有するアミノ酸を設計することができ、それにより、これらの部位に対してＶとＷと同等又はさらにタイトにフィットする側鎖を有する薬剤を提供することができる。そのような化合物を含むコポリマーは、ＥＡＥやＭＳ等の自己免疫疾患に対する治療薬として更に有用であろう。
【００６２】
本発明について十分説明してきたが、実施例及び特許請求の範囲において本発明の更なる実施態様を述べる。ただし、当該実施態様は、限定的なものと解釈されるべきではない。引用した文献及び特許の内容は、本明細書中にそっくりそのまま取り込まれる。
【実施例】
【００６３】
原料及び方法
コポリマー、ペプチド、及び抗体
Ｃｏｐ１とほぼ等しいモル比のポリ（Ｙ，Ｅ，Ａ，Ｋ）（これをＹＥＡＫと表わす）、ポリ（Ｖ，Ｅ，Ａ，Ｋ）又はＶＥＡＫ、ポリ（Ｆ，Ｅ，Ａ，Ｋ）又はＦＥＡＫを（ここで、Ｖ又はＦは、Ｃｏｐ１におけるＹと同じモル比で存在する）、各サイクルで所望の比で混合されるＦｍｏｃアミノ酸を用い、１４−、３５−、及び５０−ｍｅｒとして固相法（Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、オーストラリア）によって合成した。１Ｙ：１．５Ｅ：４．３Ａ：３．３Ｋのモル比（これは、１：１．５：４．４：３．３のモル比を有するＹ：Ｅ：Ａ：Ｋを表わす）であって、８１５０の平均分子量（ＭＷ）を有するＣｏｐ１のバッチ５２５９６（Ｂ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年）を、Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、イスラエル）から入手した。酢酸グラチラス（Ｃｏｐ１、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標））は、Ｔｅｖａ Ｍａｒｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓ（Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ミズリー州）から入手した。Ｃｏｐ１のビオチン化は、ＤＭＳＯ中で過剰のＮ−ヒドロキシサクシンイミドビオチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻、４８７２−４８７６頁、１９９４年）。未反応のビオチンは、透析により除去した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）メンブレンＭＷＣＯ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）。
【００６４】
ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおいて固相技術（Ｇ．Ｂａｒａｎｙ及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９７９年）を用いて合成し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。ペプチド配列は、ＭＢＰ（ヒトに基づくミエリンタンパク質）８６−１００、ＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴ（配列番号１）；ＭＢＰ０８５−９９、ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ（配列番号２）、ＭＷ１７９５；ＰＬＰ（ヒトプロテオリピドタンパク質）４０−６０、ＴＧＴＥＫＬＩＥＴＹＦＳＫＮＹＱＤＹＥＹＬ（配列番号３）、ＭＷ２６０３；及びＰＬＰ１３９−１５１、ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号４）、ＭＷ１５２０である。これらは、標識化されていない、又はＳＧＳＧスペーサー及びＣ末端の遊離酸によってＮ末端に連結したビオチンで標識化されている。
【００６５】
ＦＡＫ（モル比１：５：３）、ＹＦＡＫ（モル比０．２：０．８：５：３）、ＹＦＡＫ（モル比０．８：０．２：５：３）、及びＹＦＡＫ（モル比０．５：０．５：５：３）を、５０−ｍｅｒとして固相化学により合成した（Ｃｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、オーストラリア）。インプットモル比と得られたポリマーのアミノ酸組成物についての約１０％の不一致は、当該手順の使用について過去に報告されているデータと一致していた。
【００６６】
タンパク質の発現及び精製
可溶性ＨＬＡ−ＤＲ−２分子を、ショウジョウバエＳ２細胞中で発現させ、上述のように精製した（Ａ．Ｋａｌａｎｄａｄｚｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、２０１５６−２０１６２頁、１９９６年）。細胞は、０−５％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズリー州）を補足したＥｘＣｅｌｌ４０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州）を用いて、回転びん中で２６℃において成長させた。細胞は、１ｍＭ ＣｕＳＯ４の導入の４−５日後に回収した。回収した細胞の上澄みを、順次、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、及びタンパク質Ａ−ＬＢ３．１カラムに通し、その後、５０ｍＭの３−（シクロへキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（ｐＨ１１．５）を用いて結合しているＨＬＡ−ＤＲを流出させ、２００ｍＭのリン酸（ｐＨ６．０）で中和した。タンパク質は、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０メンブレン（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）で捕集した。
【００６７】
ＨＰＬＣ分離及びマイクロシークエンシング
異なるコポリマーを分離し、上述のようにプールを配列決定した（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）。詳細には、１０４０ダイオードアレイ検出器を有するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０９０ＨＰＬＣにおけるＺｏｒｂａｘ Ｃ１８ １．０ｍｍの逆相カラムを用いて、ｍｉｃｒｏｂｏｒｅＨＰＬＣにより分画を行った。アセトニトリル中で０．０５５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の勾配（０乃至１０分では０％、７３分では３３％、及び１０５分では６０％）により、５４μｌ／分の流速でコポリマーを流出させた。ピーク選択、逆相分離、及びエドマンマイクロシークエンシングにおける戦略は、既に説明されている（Ｒ．Ｍ．Ｃｈｉｃｚら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、１７８巻、２７−４７頁、１９９３年）。プールしたフラクションについて、生産者のルーチン３．５を用いるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇ１００５Ａ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）のタンパク質シークエンサーにおいて、自動化エドマン分解を行った。
【００６８】
クラスIIＭＨＣタンパク質に対するペプチドの結合のアッセイ
（Ａ）溶液
当該分析に用いた溶液は以下のとおりである。結合緩衝液は、特に示さない限り、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮａＮ３、ｐＨ５．０である。ＰＢＳは、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７．５ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、２．５ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ７．２である。ＴＢＳは、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２．７ｍＭの塩化カリウムである。ＴＴＢＳは、ＴＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたものである。
【００６９】
（Ｂ）マイクロタイターアッセイ用プレートの調製
イムノアッセイ用プレート（９６ウェルのマイクロタイター、ＰＲＯ−ＢＩＮＤ（商標）、Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、ニュージャージー州）を、ＰＢＳ中で１μｇ／ウェルの親和性精製ＬＢ３．１モノクローナル抗体（総量１００μｌ）を用いて、４℃で１８時間コーティングした。その後、３７℃で１時間、ＴＢＳ／３％ＢＳＡでウェルをブロックし、ＴＴＢＳで３回洗浄した。試料の添加の前に、５０μｌのＴＢＳ／１％ＢＳＡを各ウェルの添加した。
【００７０】
（Ｃ）阻害反応
５０μｌの結合緩衝液中で最終濃度０．１３μＭのビオチン化ペプチドＭＢＰ８６−１００（配列番号１）を、非標識化阻害剤（ランダムコポリマー又はＭＢＰ８５−９９、配列番号２）及びＨＬＡ−ＤＲ−２分子と共に、３７℃で４０時間培養した。
【００７１】
（Ｄ）クラスIIＭＨＣタンパク質／ペプチド錯体の検出
ストレプタビジン複合アルカリ性ホスファターゼを用いて、結合したペプチド−ビオチンを以下のように検出した。プレートをＴＴＢＳで３回洗浄し、１００μｌのストレプタビジン複合アルカリ性ホスファターゼ（１：３０００、ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）と共に３７℃で１時間培養した。その後、トリエタノールアミン緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中のｐ−ニトロフェニルリン酸を添加した。４１０ｎｍにおける吸収を、マイクロプレート読み取り機（モデルＭＲ４０００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、バージニア州）によりモニターした。
【００７２】
抗原提示アッセイ
ＨＬＡ−ＤＲ−２制限Ｔ細胞は、ＤＲ−２（８０７３、患者Ｏｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）及びＨｙ１Ｂ、患者Ｈｙ（ＤＲＢ１＊１６０２））を有する再発軽減ＭＳの患者から得たＴＣＲに対する遺伝子をＢＷ５８ＴＣＲα−／β−細胞に輸送するＭＢＰ８４−１０２−特異的形質移入体（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｉら、Ｈｕｍａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３頁、２００１年）；及び、ＨＬＡ−ＤＲ−２トランジェニックマウスからのＭＢＰ８４−１０２特異的（２Ｅ１２）及びＰＬＰ４０−６０特異的（１０６Ａ）ハイブリドーマ（Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２３巻、３４３−３４７頁、１９９９年）である。マウスＴ細胞ハイブリドーマは、ＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｈ−２ｓ−制限されている（ｈＰＬＰ／１及びｈＰＬＰ／ｃ４、Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６頁、１９９３年）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｌ４６６（ＨＬＡ−ＤＲ−２ｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）で形質移入されたＬ細胞）、Ｌ４１６（ＨＬＡ−ＤＲ−２ａ（ＤＲＢ５＊０１０１）で形質移入されたＬ細胞）、ＭＧＡＲ（ＤＲＢ１＊１５０１でホモ接合されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）、及びＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）マウスからの脾細胞である。Ｔ細胞刺激実験は、９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、２００μｌの総量で実施した。照射（３０００ｒａｄ）ＡＰＣ（２．５ｘ１０４／ウェル）を、所定の濃度のコポリマー、及びＭＢＰ８５−９９（配列番号１）、ＰＬＰ４０−６０（配列番号３）、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）と共に、３７℃で２時間培養した。その後、Ｔ細胞（５ｘ１０４／ウェル）を添加し、プレートを３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を取り、ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬ（５ｘ１０４／ウェル）と共に１２時間培養し、その後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。プレートを回収し、１４５０ｍｉｃｒｏｂｅｔａＰｌｕｓ液体シンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を用いて放射能をモニターした。
【００７３】
マウス菌株
ＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）マウス（８−１２週間の年齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）から購入し、ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｅｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ８５−２３、１９８７年改訂）のガイドラインに従ってＨａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設の保存した。ヒト化マウス（Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３（３）巻、３４３−３４７頁、１９９９年；及び、Ｄ．Ａｌｔｍａｎ、Ｄ．Ｈａｆｌｅｒ、及びＶ．Ｋｕｃｈｒｏｏ、未公表文献）は、導入遺伝子ＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊１５０１）及びＭＳ患者ＯｂからのＴＣＲ（クローンＯｂ．１Ａ１２から増幅したＴＣＲα及びＴＣＲβのＶ（Ｄ）Ｊ再構成）を保因する（ｃａｒｒｙ）。
【００７４】
ＥＡＥの導入及び抑制
マウスの尾の付け根及び首の項部に、上述のように調製した全脊髄ホモジェネート（ＷＳＣＨ、５００μｇ／マウス）（Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６−１１２７頁、１９９３年）皮下注射し、又は、同量のＰＢＳ及び完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含有するエマルション中の結核菌Ｈ３７Ｒａ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、メリーランド州）とＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（５０μｇ／マウス）を皮下注射した。免疫付与の１日後、百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、カリフォルニア州、２００ｎｇ）を尾に静脈注射した。上述の病状の重症度に従って（Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６頁、１９９３年）、１−５の目盛の範囲でマウスについてのＥＡＥ臨床的徴候を毎日記録した。ＥＡＥの抑制の評価において、各コポリマー（５００μｇ／マウス）を混合し、上述の脳炎誘発性エマルションを注入した。
【００７５】
神経病理学
炎症及び脱髄の評価のために、マウスにおいて、４０ｍｌのトランプ固定液（０．１Ｍリン酸バッファー中（ｐＨ７．４）における４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒド）を麻酔下において上行大動脈を経てかん流させた。脳及び脊髄の薄片を、冷１％四酸化オスミウムで１時間後置し、増大エタノール（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ）を有する溶媒で脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。１μｍの断片を得て、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観測した。
【００７６】
実施例１．新規コポリマーの合成及び微量分析
それぞれ１４−、３５−、及び５０−ｍｅｒの長さである、ランダム４成分アミノ酸コポリマーＹＥＡＫ、ＶＥＡＫ、及びＦＥＡＫを固相法で合成した。以下の構造情報に基づいて、Ｙを置換するものとしてＶ又はＦを選択した。すなわち、ＤＲＢ１＊１５０１のＰ１ポケットが、Ｙには大き過ぎるが、ＶやＦには適切である小ポケットをもたらすβ８６Ｖを含むこと（ただし、高ペプチド濃度の場合は除く、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｉｅｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻、２３３１−２３４０、１９９１年）。ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）の結合においてＰ１に生じる残基はＶであり、及び、Ｆはよりタイトなフィットを提供すると考えられること。ＭＢＰ８５−９９においてＰ４に生じる残基がＦであること。
【００７７】
固相合成手順によって、アミノ酸組成、分布、疎水性、及び大きさの点において、溶液化学のみを用いてこれまでに生産されてきたコポリマーと類似したコポリマーが生産されるか否かを検証するために、当該新規化合物について、アミン酸分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離、及びマイクロシークエンシングを行った。
【００７８】
アミノ酸分析により、各コポリマーのＹ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、及びＫのモル比は、Ａ以外は予測された範囲内の比であるが、当該Ａのモル比は、全てのコポリマー（特に、３５−及び５０−ｍｅｒ）において増大していることがわかった。例えば、ＶＥＡＫの５０−ｍｅｒでは、観測されたモル比が、１．０Ｖ：２．１Ｅ：１０．７Ａ：２．９Ｋであったのに対し、その予想値は１．０Ｖ：１．５Ｅ：５．０Ａ：３．０Ｋであった。アセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣによるコポリマー分離は、いくつかの小さなピークを有する広いピークを示し、これは、約４０乃至約１２０分の溶出範囲に広がっており、未処理Ｃｏｐ１（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２巻、７５３−７６３、２００１年）と類似するものであった。最初の１０アミノ酸のエドマン配列決定では、各サイクルともアミノ酸分析の結果と類似する一定の比を示した。これは、コポリマーにおけるアミノ酸配列がランダムであることを示唆するものである。
【００７９】
実施例２．ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対する新規ランダムコポリマーの結合性
Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物を用いて溶液中で合成されたＣｏｐ１及び３つのアミノ酸のランダムコポリマー（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２４２−２４８頁、１９７１年）、すなわち、Ｙ、Ｅ、Ａ、及びＫのうちの３つのアミノ酸を含むコポリマーは、精製ＨＬＡ−ＤＲ−２と結合し、ＭＢＰ−８５−９９の結合と競合することがわかっている（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ及びＪ．Ｌ．Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７、１９９８年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、６３５−６４１頁、１９９９年）。
【００８０】
固相法によって合成されたコポリマーが、ＨＬＡ−ＤＲ−２との結合において、当該自己抗原エピトープとも競合するか否かを検証するため、ビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）及び非標識化ペプチド及びランダムコポリマーを用いて、競合結合アッセイを行った。ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対するビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）の結合は、ＹＥＡＫの５０−ｍｅｒ、非標識化ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）ペプチド、又はＣｏｐ１の場合に最も効果的に阻害された。ここで実験したその他のランダムコポリマー（すなわち、１４及び３５の長さのアミノ酸残基を有するもの）は、いずれも、当該アッセイにおいてほとんど効果がなかった。
【００８１】
実施例３．ランダムコポリマーの存在下におけるＭＢＰ特異的Ｔ細胞の増殖反応
いくつかのＭＢＰ８４−１０２特異的Ｔ細胞クローン（上記「原料及び方法」を参照）を有する各ランダムコポリマーの生物活性を評価するために、一連の増殖アッセイを行った。
【００８２】
それぞれＨＬＡ−ＤＲ−２分子を発現させる３つのタイプのＡＰＣを試験して、どれが最も効果的にＭＢＰ８５−９９（配列番号２）ペプチドを提示するかについて評価した。当該ペプチドがヒトＢ細胞株ＭＧＡＲ（ＤＲ−２ｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）発現）によって提示される場合には、Ｌ４６６（ＤＲ−２ｂ−発現Ｌ細胞形質移入体）細胞の場合よりも高い増殖レベルが観測された。Ｌ４１６（ＤＲ−２ａ（ＤＲＢ５＊０１０１）−発現Ｌ細胞）を用いた場合には、全く応答が観測されず、全てのＴ細胞クローンがＤＲ−２ｂ（ＤＲＢ１＊１５０１）対立遺伝子に限定されることを確認した。それゆえ、ＭＧＡＲ細胞（又は、時にはＬ４６６細胞）は、その後、以下に述べる抗原提示アッセイにおいて用いた。
【００８３】
３つの異なるＴ細胞クローンの各コポリマーの存在下におけるＭＢＰ８５−９９ペプチドによる増殖阻害を検証した。概ね、試験したＴ細胞クローンにかかわらず１４−ｍｅｒは阻害しなかったが、一方、３５−及び５０−ｍｅｒは、高い阻害レベルを示した。全てのクローンについて、ＹＥＡＫの５０−ｍｅｒは、（平均７０−ｍｅｒである）Ｃｏｐ１とほぼ同等であった。ＹＥＡＫの３５−ｍｅｒでは大幅に阻害が減少し、ＹＥＡＫの１４−ｍｅｒでは非常に低いものであった。
【００８４】
２Ｅ１２Ｔ細胞クローンの増殖の阻害は、ＦＥＡＫの３５−及び５０−ｍｅｒの存在下、及びＣｏｐ１の存在下において効果的であった（図１Ａ、左下パネル）。ＶＥＡＫは、２Ｅ１２クローンを阻害しなかった（図１Ａ、右下パネル）。ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒは、幾分Ｃｏｐ１の阻害よりも低かった。Ｈｙ１Ｂの場合では、Ｃｏｐ１が最も優れた阻害剤であり、ＦＥＡＫ及びＶＥＡＫの５０−ｍｅｒの阻害は、それより低いレベルであった（図１Ｃ）。
【００８５】
Ｖ、Ｅ、Ａ、及びＫの組合せでは、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対する結合親和性が低くなり、及びＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８５−９９特異的Ｔ細胞の阻害が低レベルとなった。これは、ＭＢＰ８５−９９／ＨＬＡ−ＤＲ−２錯体において、Ｖが、当該ペプチド（配列番号２）の位置８９における残基であり、ＨＬＡ−ＤＲ−２タンパク質のＰ１ポケットにおいてβ８６Ｖａｌと相互作用するという観測に反する（Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）。Ｆ側鎖もＰ４ポケットにフィットするので、ＦＥＡＫはより優れた結合剤である。残基ＡはＰ１ポケットと相互作用し、ＹはＰ４ポケットと相互作用する（Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）。ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）は、Ｖ８９のために、比較的親和性の低いペプチドである。
【００８６】
ＦＥＡＫにおける残基Ｋは、おそらく、ＭＢＰ８５−９９の位置９３におけるＫ（配列番号２；Ｋ．Ｗ．Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９巻、２７９−２９０頁、１９９４年；Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９巻、１５１１−１５２０頁、１９９８年）と同様に、ＴＣＲとの相互作用において重要なものであろう。一方、結合部位におけるコポリマーのＮ末端付近に存在するＫは、Ｓα５３又はＥα５５におけるα１ヘリックスの側鎖と相互作用することができるＨＬＡ−ＤＲ１に結合したＨＡ３０６−３１８（配列番号５）のＰ１における残基Ｋ（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、２１５−２２１頁、１９９４年）と同様に、ＨＬＡ−ＤＲ分子及びＴＣＲとの安定な相互作用に寄与し得る。
【００８７】
実施例４．ＰＬＰ特異的Ｔ細胞クローンの増殖
ランダムコポリマーが、ＭＳにおける別の潜在的な自己抗原（すなわち、ＰＬＰ）の提示を阻害することができるかを検証するため、２つの異なるＰＬＰエピトープを用いた。ＤＲＢ１＊１５０１に結合するヒトＰＬＰ４０−６０（配列番号３）（Ｍ．Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１３９５−１４１２頁、２０００年）、及び、Ｈ−２ｓと結合し、ＳＪＬ／Ｊマウスにおいて脳炎誘発性のマウスＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチド（Ｖ．Ｋ．Ｔｕｏｈｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２巻、１５２３−１５２７頁、１９８９年）。当該アッセイに用いたＴ細胞は、１０６Ａ（ＨＬＡ−ＤＲ−２トランスジェニックマウスからのＰＬＰ４０−６０特異的ハイブリドーマ；Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２３巻、３４３−３４７頁、１９９９年）、及びｈＰＬＰ／１及びｈＰＬＰ／ｃ４（ＳＪＬ／ＪマウスからのＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｈ−２ｓ制限ハイブリドーマ；Ｌ．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、１１１６−１１２７頁、１９９３年）である。Ｔ細胞ハイブリドーマの増殖は、投与量に依存して対応ペプチドによってもたらされる。その後、各コポリマーを抗原提示アッセイに添加した。
【００８８】
Ｌ４６６ＡＰＣによる１０６Ａ Ｔ細胞へのＰＬＰ４０−６０（配列番号３）エピトープの提示は、ＦＥＡＫの３５−ｍｅｒ及び５０−ｍｅｒによって最も効果的に阻害された（図２Ａ、下段パネル）。阻害のレベルは、Ｃｏｐ１の存在下よりも幾分高かった。ＭＢＰ特異的Ｔ細胞の場合と同様に、ＹＥＡＫ５０−ｍｅｒはＣｏｐ１とほぼ同様の結果だったが（図２Ａ、上段パネル）、一方、ＶＥＡＫは、最も高濃度の場合においてのみ、ＰＬＰ４０−６０特異的Ｔ細胞を阻害した（図２Ａ、中段）。
【００８９】
マウスＨ−２ｓ制限ＰＬＰ１３９−１５１特異的Ｔ細胞ハイブリドーマであるｈＰＬＰ／１の増殖は、Ｃｏｐ１によって最も阻害された。ＦＥＡＫ及びＶＥＡＫは、それよりも幾分効果が少なかった（図２Ｂ）。ｈＰＬＰ／ｃ４ハイブリドーマは、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒ及びＣｏｐ１によって最も阻害された（図２Ｃ）。
【００９０】
特定の理論に制限されるわけではないが、コポリマーが自己反応性Ｔ細胞応答を制限する際のいくつかのメカニズムが仮定されている。すなわち、それらは、ＭＨＣ／ＴＣＲ閉塞（ｂｌｏｃｋａｇｅ）、競合、アネルギー誘導、アポトーシス、及びバイスタンダー抑制である。最初の２つのメカニズムは、自己反応性Ｔ細胞の数が増大し始めた場合の、誘導期の初期段階におけるコポリマーの効果を意味するものである。バイスタンダー抑制は、誘導期及びエフェクター期の両方において機能し、調節Ｔ細胞の発達又は交差反応性Ｔ細胞の増大を促進し、それによって、自己反応性脳炎誘発性Ｔ細胞を抑制することができる。生体外における増殖では、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）で免疫付与されたマウスのＴ細胞は、試験コポリマーに対する交差反応性を用いることなく、免疫付与ペプチドのみに応答を生じた。しかしながら、自己ペプチド及びコポリマーの存在下の生体外におけるＰＬＰ１３９−１５１Ｔ細胞の場合には、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に対するＴ細胞の応答は、著しく抑えられた。また、いくつかの同時免疫付与（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスでは、Ｔ細胞は、コポリマーと共にＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に応答して増殖した。
【００９１】
以下の実施例における、生体内に投与されてＥＡＥに対する最も優れた抑制を示すコポリマーは、また、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に対するＴ細胞の増殖応答に対する最も優れた抑制を示す。すなわち、コポリマーの機能における可能性のあるメカニズムは、ＭＨＣの閉塞、及び抗原提示における競合であると考えられる。
【００９２】
実施例５．ＷＳＣＨを導入したＥＡＥに対するＶＥＡＫ及びＦＥＡＫランダムコポリマーの生体内における効果
ＶＥＡＫ及びＦＥＡＫランダムコポリマーが、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＥＡＥの臨床経過に与える影響を調べるために、いくつかの生体内実験を行った。疾患導入の手順は、皮下注射して、ＷＳＣＨ（５００μｇ）及び各ポリマー（５００μｇ）を両方とも免疫付与することである。これは、Ｃｏｐ１によるＥＡＥの抑制についての過去の研究における手順と同様のものである（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４巻、２０９−２１７頁、１９９６年）。疾患の導入の後、マウスについて、典型的なＥＡＥの臨床的徴候の様子を４０日間毎日観測した（表１）。
【００９３】
当該データは、ＷＳＣＨを注射されたマウスは、１４−１５日目あたりにＥＡＥを発症し、約２．２の最大臨床スコアを記録した（発生率：１８／３２、死亡率：３％）。３５−及び５０−ｍｅｒのＶＥＡＫを同時免疫付与したもの（それぞれ、表１の６行目及び４行目）は、ＥＡＥの経過にほとんど影響を与えず、ＷＳＣＨのみを注入した群と同様の発生率と最大スコアとなった。しかしながら、これらの同時免疫付与マウスでは、疾患の発生が、若干遅くなった。
【００９４】
一方、それぞれＦＥＡＫの３５−ｍｅｒ又は５０−ｍｅｒで治療したマウスは（それぞれ表１の７行目及び５行目）は、ＥＡＥの症状すら発生しなかった。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）の治療（表１の２行目）によってＥＡＥが抑制された。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）で治療した１４のマウスのうちの１つは、２０日目に発症そ、最大スコアは３．０であった。同様に、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒを注射した１６のマウスのうちの２つ（表１の３行目）は、１４日目で軽度に発症し、最大スコアは１．０であった。
【００９５】
各コポリマーを注射したマウスにおける炎症及び脱髄の程度を評価するため、脊髄試料について中枢神経系の免疫組織化学を行った。ＷＳＣＨのみ、又はＷＳＣＨとＶＥＡＫ５０−ｍｅｒを注射した疾患マウスの腰髄から得た試料は、脱髄と共に、広範囲な中髄膜（ｓｕｂｍｅｎｉｎｇｅａｌ）、血管周囲、及び実質性の浸潤を示した。一方、他のコポリマーによる治療後のおいて全く疾患の徴候を示さなかったマウスから得た試料では、浸潤及び脱髄の症状は検出されなかった。
【００９６】
本明細書の実施例において合成し特性評価された各ランダムコポリマーの中では、ＷＳＣＨを導入されたＥＡＥの抑制において、ＦＥＡＫが最も有効であった。
【００９７】
実施例６．ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列番号４）を導入したＥＡＥおけるＶＥＡＫ又はＦＥＡＫランダムコポリマーの治療
本発明のランダムコポリマーが慢性再発性ＥＡＥの発症に与える影響を検証するため、５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４；ＳＪＬ／Ｊ菌株における脳炎誘発性エピトープ）のみ、又は５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）と５００μｇのコポリマーをマウスに皮下注射した。マウスについて、疾患の導入の後９０日間毎日測定した。
【００９８】
ＣＦＡにおいてＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）エピトープのみで免疫付与した場合のＥＡＥは、ＷＳＣＨを導入したＥＡＥ（表１）と比較して、より重い臨床的徴候（表３）を有していた。例えば、８のマウスのうちの５は、死亡率３３％という重症のＥＡＥを発症した。当該初発（ｆｉｒｓｔ ａｔｔａｃｋ）は、免疫付与の約１４日後に発症し（最大臨床スコアが４．０）、その後、概ね３０日、５０日、７０日、８５日のピークがある疾患発症の事後的な変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）を示した。
【００９９】
種々のコポリマーを同時に注射した試料は、それぞれ違った形でＥＡＥの臨床的徴候が減少した。ＶＥＡＫの５０−ｍｅｒで治療した群では（図３Ｂ）、８のマウスのうちの４が、ＥＡＥの臨床的徴候を示した。初発は、１３日目に発生し、約２０日目にピークになった（平均最大スコア：１．６）。
【０１００】
ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒ（図３Ｃ）を同時に注射した場合、８のうちの３のマウスは疾患した。ペプチドのみを注射した対照試料やＶＥＡＫで治療した群と比較すると、当該初発は遅くなり、症状も重症ではなかった（２３−２５日目、平均最大スコアは１．１）。臨床的症状は、約４０日までにほぼ完全に治った。
【０１０１】
Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）で治療した場合（図３Ｄ）では、ＦＥＡＫにおける結果と同様に、初発が遅れた（２６日目に開始し、３４日目にピーク、最大平均スコアは１．２５）。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）の群では、８のうちの２つのマウスが、ＥＡＥを発症した（死亡率１２％）。
【０１０２】
表１及び図３のデータは、ＷＳＣＨ又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドのいずれかによって誘発されるＥＡＥが、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒによって効果的に抑制されたことを示唆するものである。さらに、当該データは、ＦＥＡＫの５０−ｍｅｒが、Ｃｏｐ１よりも効果的に、ＷＳＣＨ又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドのいずれかによって誘発されるＥＡＥを抑制することを示すものである。この観測は、脳炎誘発性物質とコポリマーを同時にＳＪＬ／Ｊマウスに注射した場合に歴然としていた。Ｃｏｐ１は、ＷＳＣＨ又は合成ＰＬＰペプチドによって誘発されたＥＡＥを阻害し、両方の抗原を同時にマウスに免疫付与した場合にのみＰＬＰ特異的Ｔ細胞応答を阻害した（Ｄ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４巻、２０９−２１７頁、１９９６年）。これは、それらが、クラスIIＭＨＣ分子との結合において競合することを示唆している。
【０１０３】
特定の理論に制限されるわけではないが、本発明の５０−ｍｅｒランダムコポリマーの活性メカニズムは、Ｃｏｐ１の場合と同様であって、それにより、クラスIIＭＨＣタンパク質に対する潜在的自己抗原ペプチドの結合が阻害され、その後、Ｔ細胞が抑制されると考えられる。
【０１０４】
実施例７．Ｙ及びＦ含有コポリマーの合成及び微量分析
アミノ酸Ｙ、Ｅ、Ａ、及びＫで構成されるランダムコポリマーの５０−ｍｅｒは、１４−又は３５−ｍｅｒよりも、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）へのヒト免疫優性エピトープＭＢＰ８５−９９（配列番号２）の結合に対する強力な阻害剤である。これらのコポリマーのいくつかは、ＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８４−１０２特異的Ｔ細胞の応答を阻害し、さらに、脳炎誘発エピトープＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）によって誘発された感受性ＳＪＬ／Ｊ菌株におけるＥＡＥを抑制した。
【０１０５】
ここでは、コポリマーにおけるアミノ酸組成及びアミノ酸比率についての分析を、ランダム３成分コポリマーＦＡＫの５０−ｍｅｒにおいて、及び、異なる比率のＹ：Ｋを有する４成分アミノ酸コポリマーＹＦＡＫ（“Ｙ及びＦ含有”コポリマー）において行った。各５０−ｍｅｒコポリマーは、固相法によって合成した。ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子に結合するＭＢＰ８５−９９（配列番号２）エピトープのアンカー残基に応じて、これらのコポリマーを構成するアミノ酸を選択した。
【０１０６】
以下の構造的基準に基づいて、異なる比率のＹとＦを有するコポリマーを設計した。すなわち、ＤＲＢ１＊１５０１のＰ１ポケットが、Ｙには大き過ぎるが、ＶやＦには適切である小ポケットをもたらすβ８６Ｖを含むこと。従って、ＭＢＰ８５−９９の結合においてＰ１に生じる残基はＶであるが、ＦはＰ１に対してタイトなフィットを提供すること。及び、ＭＢＰ８５−９９におけるＰ４に生じる残基がＦであるが、当該ポケットはＹにとって十分大きく、ＹはＦよりも適切にフィットし得ること。合成手順によって、アミノ酸組成、分布、疎水性、及び大きさの点において、従来技術によって生産されたコポリマーと類似したコポリマーが生産されるか否かを検証するために、当該新規化合物について、アミン酸分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離、及びマイクロシークエンシングを行った。
【０１０７】
アミノ酸分析により、各コポリマーのＹ、Ｆ、及びＫのモル比は、Ａ以外は期待したインプットモル比の範囲内であるが、当該Ａのモル比は、全てのコポリマーにおいて増大していることがわかった。Ｃｏｐ１において上述したアセトニトリル勾配を用いた（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻、４６９７−４７０４頁、１９９９年）コポリマーのＨＰＬＣ分離は、いくつかの小さなピークを有する広いピークを示した。これは、約４０乃至８０分の溶出したものであり、未処理Ｃｏｐ１の溶出と類似するものであった。
【０１０８】
合成した各コポリマーにおけるいくつかの最初のアミノ酸のプール配列決定は、Ｙ、Ｆ、又はＫの各レベルよりも著しく高いＡのレベルを有するランダムパターンを示した。これは、これらのランダムコポリマー組成の分析において判明した初期におけるＡの高いモル比と対応するものである。コポリマーにおけるアミノ酸にはいずれも配列特異性及び優先的位置決め（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）は観測されなかったが、これは、当該ポリマーがランダム配列であることを示唆するものである。
【０１０９】
実施例８．ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対するＹ及びＦ含有ランダムコポリマーの結合性
固相法によって合成されたＹ及びＦ含有ランダムコポリマーが、ＨＬＡ−ＤＲ−２との結合において、自己抗原ＭＳ関連エピトープＭＢＰ８５−９９（配列番号２）と競合するか否かを検証するため、ビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）及び非標識化ランダムコポリマーを用いて、競合結合アッセイを行った。
【０１１０】
ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対するビオチン化ＭＢＰ８６−１００の結合は、ＦＡＫの５０−ｍｅｒ及びＹＥＡＫの５０−ｍｅｒコポリマー（Ｙ０．８：Ｆ０．２のモル比を有する；図４）によって効果的に阻害された。従って、当該Ｙ及びＦ含有５０−ｍｅｒランダムコポリマーは、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ−２分子とに結合において、ＭＳ関連エピトープ（配列番号２）と競合する。
【０１１１】
実施例９．ランダム５０−ｍｅｒコポリマーの存在下におけるＭＢＰ特異的Ｔ細胞の増殖反応
ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）ペプチドに応答する３つの異なるＴ細胞クローンの増殖における、各５０−ｍｅｒコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＹＦＡＫ（０．８：０．２）の存在による効果を検証した。２つの独立した実験の結果を図５に示す。
【０１１２】
当該データは、３つのＭＢＰ特異的ＨＬＡ−ＤＲ−２制限クローンのそれぞれにおいて、Ｙ及びＦ含有ＹＦＡＫコポリマー及びＦＡＫコポリマーが効果的な阻害剤であることを示している。これらのコポリマーの中でも、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＦＡＫは、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）よりも良い阻害剤であり、Ｃｏｐ１よりも優れていた。
【０１１３】
異なるＹ：Ｆ比率を有する３つのＹＦＡＫコポリマー及びＦＡＫコポリマーの優れた窓外活性が、クローン２Ｅ１２に対しては、当該３つのコポリマーの低濃度条件（例えば、約２０μＭ））において観測され、他のＴ細胞クローンに対しては、いくつかのポリマーの低濃度条件において観測された。より高い濃度（例えば、約１００μＭを超える濃度）では、観測された阻害レベルは、当該実施例におけるコポリマー全てで同様なものであった（図５）。
【０１１４】
実施例１０．ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列番号４）を導入したＥＡＥおけるＹ及びＦ含有ランダムコポリマーによる治療
Ｙ及びＦ含有５０−ｍｅｒランダムコポリマーがＳＪＬ／ＪマウスにおけるＥＡＥの臨床経過に与える影響を調べるために、生体内実験を行った。上記の実施例と同様に、同時免疫付与の手順は、脳炎誘発性エピトープＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４；５０μｇ）とコポリマー製剤（５００μｇ）をＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射することである。疾患の導入の後、マウスについて、典型的なＥＡＥの徴候の様子を７０日間毎日観測した。
【０１１５】
ＣＦＡにおいてＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）エピトープのみで免疫付与した場合、慢性再発性ＥＡＥが生じた（図６、表２）。この処理を受けた１３のマウスは、全て、死亡率７７％という重症のＥＡＥを発症した。初発は１１日目付近に発症し（最大臨床スコアが４．６）、その後、概疾患発症の事後的な変動を示した（図６）。
【０１１６】
本発明のランダムコポリマーを同時に注射した試料は、それぞれ違った形でＥＡＥの臨床的徴候が減少した。ＹＦＡＫ０．２：０．８で処理した群は、１６のマウスのうちのわずか２のみが、ＥＡＥの臨床的徴候を示した（死亡率６％）。当該臨床的徴候は、未処理群における１１日目から遅れて約３７日目に初発が生じた（平均最大スコア０．６；図６、表２）。
【０１１７】
同様に、ＹＦＡＫ０．５：０．５で処理した群は、１６のうち１が疾病したマウスであり（死亡率０％）、初発は３３日目に生じた。さらに、ＹＦＡＫ０．８：０．２で処理したマウスは、１７のうちの８がＥＡＥを発症し、死亡しなかった。この群では、観測された平均最大臨床スコア（１．５）及び発症時期（２７日目）は、それぞれ、上記のＹ対Ｆの比が低いＹＦＡＫ製剤で処理したマウスから得られたデータよりも治療上の効果が小さいことを示唆するものである。
【０１１８】
ＦＡＫを同時に注射した場合には、１７のうち３つが疾病したマウスであり、死亡率が１２％、平均最大臨床スコアが０．９、平均発症時期が２５日目であった（表２の５行目）。ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）とＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）を同時に注射した場合は、１６のうち１２のマウスがＥＡＥを発症し、平均発症時期は２２日目であり、平均臨床スコアは２．６であった（表２の６行目）。
【０１１９】
別の実験において、個々のマウスについての臨床的症状の観測結果は、ＹＦＡＫ０．５：０．５の治療によって、全ての群のマウスにおける症状を全て除去できることを示している。個々のマウスについての当該データからは、Ｆ含有コポリマーはＰＬＰ誘発ＥＡＥの治療においてＣｏｐ１よりも効果的であり、Ｆ対Ｙのモル比の大きさがＥＡＥの優れた治療と関連することが明らかである。
【０１２０】
すなわち、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に誘発されたＥＡＥは、３つの異なるＹＦＡＫコポリマー及びＦＡＫによって効果的に抑制された。その効果の順列は、ＹＦＡＫ０．５：０．５＞ＹＦＡＫ０．２：０．８＞ＦＡＫ＞ＹＦＡＫ０．８：０．２である。Ｆ含有コポリマーは、Ｃｏｐ１よりも効果的にＰＬＰ誘発ＥＡＥを治療した。
【０１２１】
ここで合成し分析したＹ及びＦ含有ランダムアミノ酸コポリマーは、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子、自己抗原特異的Ｔ細胞の阻害、及びＥＡＥの抑制において、Ｃｏｐ１（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標））よりも効果的である。これらのコポリマーは、主として、ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子と相互作用する免疫優性Ｔ細胞エピトープＭＢＰ８５−９９（配列番号２）の残基に基づいて、設計及び合成した。コポリマー製剤の長さは、活性に重要なものであり、５０−ｍｅｒが最も効果的である。長いポリペプチドは、隣接するクラスII分子と連結することができる。
【０１２２】
５０−ｍｅｒランダムコポリマーＦＡＫ、及びＹ対Ｆのモル比が異なるＹＥＡＫ５０−ｍｅｒコポリマーは、以下の機能活性において対照例Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）よりも優れている：すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子への結合、ＭＢＰ特異的ＤＲ−２制限Ｔ細胞の阻害、及びＥＡＥの抑制。ランダムコポリマーＶＥＡＫは、ＭＢＰ−９９自己抗原（配列番号２）のＰ１に相当する位置にアミノ酸残基Ｖを有するにもかかわらず、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子に対する低い結合親和性、ＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８５−９９特異的Ｔ細胞の低い阻害レベル、及びＥＡＥの進行に対する無効果を示した。ここにおけるデータは、ＶをＦで置換することによって、より優れた阻害化合物が得られることを示している。おそらく、これは、ＦがＰ１ポケットに対し、及びＹがＰ４ポケットに対しよりタイトにフィットするためと考えられる。
【０１２３】
脳炎誘発性エピトープＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）に誘発されたＥＡＥの進行に対する本発明のコポリマーの効果は、著しいものである。脳炎誘発性物質とコポリマーを同時にＳＪＬ／Ｊマウスに注射した場合、ＥＡＥの臨床的徴候が、当該ＹＦＡＫコポリマー又はＦＡＫで治療することによって著しく減少した。
【０１２４】
特定の理論に制限されるわけではないが、これらのデータは、クラスIIＭＨＣ分子による抗原提示の効果的な遮断剤としてのコポリマーを含み、潜在的自己抗原ペプチドの結合を阻害し、それによって自己免疫Ｔ細胞の抑制をもたらすランダムコポリマーの活性メカニズムを裏付けるものである。
【０１２５】
ＹＦＡＫの５０−ｍｅｒ及びＦＡＫの５０−ｍｅｒコポリマーは、患者の６０％がＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）ハプロタイプであるＭＳの治療において用いられ得る。ランダムコポリマーの乱交雑な結合性を鑑みると（Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、４３８６−４３９７頁、１９９８年；Ｍ．Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、６３５−６４１頁、１９９９年）、本発明のコポリマーは、その他のＨＬＡ−ＤＲ特異性を有するＭＳ患者にも有効であり、さらには、その他の自己免疫疾病において使用される新規な治療薬を提供し得る。
【０１２６】
実施例１１．バリン（Ｖ）及びチロシン（Ｙ）含有、又はバリン（Ｖ）及びトリプトファン（Ｗ）含有コポリマーの同時免疫付与／予備免疫付与による、ヒト化マウスにおけるＭＢＰ８５−９９（配列番号２）誘発ＥＡＥの抑制
ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＢ１＊１５０１）のペプチド結合ポケットは、Ｐ１にβ８６Ｖａｌ残基を有しており、そのサイズは、Ｖ又はＦ残基には適切であるが、Ｙ又はＷには十分なサイズではない。一方、大きな疎水性ポケットＰ４はβ７１Ａｌａを有しており、それは、Ｙ又はＷ等の大きなサイズの残基に適切である。Ｐ９ポケットは、乱交雑である。当該構造的考察に基づいて、ＡとＫと共に、バリン（Ｖ）及びチロシン（Ｙ）を含有する、又はバリン（Ｖ）及びトリプトファン（Ｗ）を含有するコポリマーを合成し、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）によって誘発されたＥＡＥの進行及び症状における効果を試験した。
【０１２７】
実験に用いた動物は、トランス遺伝子ＨＬＡ−ＤＲ−２（ＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊１５０１）及びＭＳ患者ＯｂからのＴＣＲ（クローンＯｂ．１Ａ１２から増幅したＴＣＲα及びＴＣＲβのＶ（Ｄ）Ｊ再構成）を保因するヒト化マウスである。各群のマウスは、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）を皮下注射してＥＡＥを誘発させた。図７に示すように、マウス群は、ＥＡＥの誘発の２日前にＣｏｐ１、ＹＦＡＫ０．５：０．５、或いは対照ＭＢＰ８５−９９のいずれかを注射して予め免疫付与したもの、又は、Ｃｏｐ１、ＹＦＡＫ０．５：０．５、ＹＦＡＫ０．２：０．８、ＶＹＡＫ０．５：０．５、或いはＶＷＡＫ０．５：０．５、及びＥＡＥ誘発ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）を同時に免疫付与したものである。５０日間に渡って、所定の日に臨床症状をモニターした。
【０１２８】
ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）のみを導入した対照マウス群は、約２５日目に臨床スコアが４を超える重症度を示した。この群の臨床症状は、８つの測定点（１１日目から３２日目）で３−４の高い値に上昇し、その後、２乃至３の重症度で安定した。合計で１４の測定点（すなわち、７日目から終点の５０日目まで）に渡って症状の継続が観測され、当該症状は２乃至３の重症度で安定した。
【０１２９】
一方、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）と共にＶＷＡＫを同時に免疫付与したマウスは、最少のＥＡＥ臨床症状を示した（図７）。５０日間に渡る実験経過において、当該マウスは、３７日目までに通常の臨床状況に戻った。約９日目に発生したＶＷＡＫ処理マウスの症状は、最大で約１以下の臨床スコアを示した。図７におけるその他のコポリマーは、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）に比較するとわずかに症状の回復が見られたが、症状の重症度を大幅に減少させるものではなかった。ＹＦＡＫ０．２：０．８を同時免疫付与した群は１乃至約２、ＹＦＡＫ０．５：０．５を予め免疫付与した群は１乃至２、及びＹＦＡＫ０．５：０．５を同時免疫付与した群はわずかに１より大きいものであった。
【０１３０】
ＶＷＡＫを同時免疫付与した群において症状の回復が最も大きく、ＹＦＡＫ０．５：０．５を予備免疫付与した群において症状の継続期間が最も短かった。後者のグループでは、合計で５つの測定点でしか症状は観測されず、その後、臨床症状はなくなった。ＹＦＡＫ０．５：０．５で予備処理した群のデータを図８にプロットする（四角マーク）。これは、ＹＦＡＫ０．５：０．５で処理した群における症状の重症度及び継続期間と、ＭＢＰ８５−９９（配列番号２）のみを導入した対照群（菱形マーク）及びＣｏｐ１で処理した群（三角マーク）との比較を示すものである。ここにおける予備免疫付与の手順は、自己免疫疾患ＥＡＥに対する予防接種に相当するものである。
【０１３１】
ＹＦＡＫ０．５：０．５の予備免疫付与の場合と対照的に、Ｃｏｐ１を予備免疫付与した群又は同時免疫付与した群は、症状を回復させたものの、臨床スコアを約２乃至３（Ｃｏｐ１予備免疫付与）又は３よりわずかに大きい（Ｃｏｐ１同時免疫付与）レベルまで軽減しただけであった。さらに、症状は、マウスが無症状になるまでの７日目から３７日目の９つの測定点（Ｃｏｐ１同時免疫付与）の間、又は７日目から５０日目の１４の測定点（Ｃｏｐ１予備免疫付与）に渡って観測された。ＹＦＡＫ処理群にように症状が除去されることはなく、マウスの症状は、約１より大きい重症度のレベルで安定した。これらのデータは、ＥＡＥの疾患状態の発症に対する動物の予備免疫付与において、ＹＦＡＫ０．５：０．５が最も効果的であることを示すものである。
【０１３２】
これらのデータは、アミノ酸Ｖ、Ａ、及びＫを有するランダムコポリマーにおけるＷ又はＦの存在が、クラスIIＭＨＣのメジャーグルーブ（例えば、Ｐ１及びＰ４位置）への当該コポリマーのフィットをよりタイトにし得ることを示唆するものである。当該データは、ＹＦＡＫ及びＶＷＡＫが、ＭＳ、脱髄疾病、及びその他の自己免疫疾患に対する有望な潜在的治療薬であることを示すものである。
【０１３３】
【表１】
【０１３４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、ランダムコポリマーの存在下におけるＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ特異的Ｔ細胞系２Ｅ１２（パネルＡ）、８０７３（パネルＢ）、及びＨｙ１Ｂ（パネルＣ）の阻害を示すグラフである。照射されたＬ４６６（Ａ）又はＭＧＡＲ（Ｂ、Ｃ）細胞は、最終濃度が４μＭ（Ａ）又は１２．５μＭ（Ｂ、Ｃ）のＭＢＰ８５−９９（配列番号２）及び異なる濃度の各ランダムポリマーと共に、３７℃で２時間培養した（２つ培養した）。その後、Ｔ細胞を添加し、３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を、ＩＬ−２−依存の細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬＬ）と共に培養し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。
【図２】図２は、ランダムコポリマーの存在下における、ＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＰＬＰ４０−６０特異的ヒトＴ細胞１０６Ａの阻害を示す線グラフ（Ａ）、Ｈ−２ｓ−制限ＰＬＰ１３９−１５１特異的マウスＴ細胞ハイブリドーマ（それぞれ、ｈＰＬＰ／１及びｈＰＬＰ／ｃ４）の阻害を示す棒グラフ（Ｂ及びＣ）である。照射されたＬ４６６（Ａ）又はＳＪＬ／Ｊマウスからの脾細胞（Ｂ及びＣ）は、最終濃度が６０μＭ（Ａ）のプロテオリピドタンパク質ペプチドＰＬＰ４０−６０（配列番号３）及び横軸に示した濃度の異なるランダムポリマーと共に、又は、最終濃度が２４μＭのＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（配列番号４；Ｂ及びＣ）及び異なるコポリマー（２８μＭ）と共に、３７℃で２時間培養した。その後、Ｔ細胞を添加し、３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を、ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬと共に培養し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。「＊印」は、０％の阻害を示すものである。
【図３】図３は、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＶＥＡＫ、ＦＥＡＫ、及びＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）による抑制を示すグラフである。５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドと５００μｇのランダムコポリマーを、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）のみをＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射した。疾患の進行は、横軸の日数に対する縦軸に示した臨床症状の状況によってモニターした。縦軸に示した結果は、臨床症状の１日平均スコアを表わしている。
【図４】図４は、ランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐ１による、ＨＬＡ−ＤＲ−２分子へのビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１）の結合の阻害率を示すものである。組換え水溶性ＨＬＡ−ＤＲ−２分子は、ビオチン化ＭＢＰ８６−１００（配列番号１；０．１３μＭ）と共に、及び横軸に示した濃度の非標識化ランダムコポリマー又は合成非標識化ペプチド対照であるＭＢＰ８５−９９（配列番号２）と共に培養した。培養は、３７℃で４０時間、ｐＨ７．０で２つ行った。縦軸に示した結合阻害率の結果は、２つの独立した実験のうちの１つを表わすものである。特異的結合は、次の式を用いて阻害の割合として表わす。阻害率＝１００％−［（競合剤存在下における４１０ｎｍの吸収−バックグラウンド）／（競合剤非存在下の吸収−バックグラウンド）Ｘ１００]。競合剤非存在下における４１０ｎｍのシグナルは０．８−０．９であり、バックグラウンドは０．１であった。
【図５】図５は、ランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐ１の存在下での、２Ｅ１２、８０７３、及びＨｙ１Ｂの各細胞系におけるＨＬＡ−ＤＲ−２制限ＭＢＰ８４−１０２特異的Ｔ細胞の阻害を示すグラフである。照射されたＭＧＡＲ細胞は、最終濃度が１２．５μＭのＭＢＰ８５−９９（配列番号２）及び異なる濃度の各ランダムポリマーと共に、３７℃で２時間培養した（２つ培養した）。その後、Ｔ細胞を添加し、３７℃で２４時間培養した。上澄み（３０μｌ）を、ＩＬ−２−依存ＣＴＬＬ細胞系のそれぞれと共に培養し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）を用いて１２時間標識化した。
【図６Ａ】図６は、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）による抑制を示すグラフである。５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドと５００μｇのランダムコポリマーをＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射し、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）のみで免疫性を与えた。疾患の進行は、横軸に示した疾患導入後の日数に対する、縦軸に示した臨床症状の状況によってモニターした。図６Ａは、２つの実験にそれぞれについて、５乃至９のマウスから構成される各グループにおける臨床症状の１日平均スコア（縦軸）の結果を示すものである。
【図６Ｂ】図６は、ＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＦＡＫ、ＹＦＡＫ（０．２：０．８）、ＹＦＡＫ（０．８：０．２）、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）、及びＣｏｐａｘｏｎｅ（商標）による抑制を示すグラフである。５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）ペプチドと５００μｇのランダムコポリマーをＳＪＬ／Ｊマウスに皮下注射し、又はＰＬＰ１３９−１５１（配列番号４）のみで免疫性を与えた。疾患の進行は、横軸に示した疾患導入後の日数に対する、縦軸に示した臨床症状の状況によってモニターした。図６Ｂは、各マウス単体のデータであって、各カラムの最上段は治療に用いたコポリマーであり、代表的な実験において、各グラフの右上隅に表示したマウスについて観測された最大臨床スコアを示すものである。
【図７】図７は、ＭＢＰ８５−８９（配列番号２）ペプチドにより誘発されるＥＡＥについての、異なるランダムコポリマーＹＦＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＷＡＫ、及びＣｏｐ１による抑制、及びコポリマーで処置していない対照マウスのデータを示すグラフである。ヒト化マウス（Ｌ．Ｓ．Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３（３）巻、３４３−３４７頁、１９９９年；及び、Ｄ．Ａｌｔｍａｎ、Ｄ．Ｈａｆｌｅｒ、及びＶ．Ｋｕｃｈｒｏｏ、未公表文献）は、導入遺伝子ＨＬＡ ＤＲ−２（ＤＲＡ＊０１０１及びＤＲＢ１＊１５０１）及びＭＳ患者ＯｂからのＴＣＲ（クローンＯｂ．１Ａ１２から増幅したＴＣＲα及びＴＣＲβのＶ（Ｄ）Ｊ再構成）を保因する（ｃａｒｒｙ）。同時に免疫付与された（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスは、０日目において、５００μｇのランダムコポリマー又は表示している対照物質、及び５０μｇのＥＡＥ誘発ＭＢＰ８５−８９（配列番号２）を同時に導入したものである。事前に免疫付与された（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）マウスは、ＥＡＥ誘発の２日前にコポリマーを予め導入したものである。コポリマーＶＹＡＫ及びＶＷＡＫは、それぞれ、Ｖ：Ｙ：Ａ：Ｋ及びＶ：Ｗ：Ａ：Ｋが０．５：０．５：５：３のモル比を有する。当該データは、３、５、７、９、１１、１４、１６、１８、２２、２５、２８、３２、３７、４０、４３、及び５０日目のそれぞれにおける（横軸）、臨床症状のスコア（縦軸）によって疾患の進行を示すものである。
【図８】図８は、図７における動物群のうちの３つから得たデータを一緒に再プロットした線図である。ひし形は、コポリマーの処置を受けていない対照ＥＡＥ誘発マウスである。四角形は、ＹＦＡＫ（０．５：０．５）で処置したＥＡＥ誘発マウスである。三角形は、Ｃｏｐ１で処置したＥＡＥ誘発マウスである。図における処置は、それぞれ、ＥＡＥ導入の２日前に行った（すなわち、疾患に対する予防接種である）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＹＦＡＫ。
【請求項２】
前記アミノ酸が固相反応又は溶液化学によって重合される、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項３】
Ｆ対Ｙのモル比が約１である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項４】
Ｆ対Ｙのモル比が少なくとも約２である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項５】
Ｆ対Ｙのモル比が約４である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項６】
Ｙ対Ｆのモル比が少なくとも約２である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項７】
Ｙ対Ｆのモル比が少なくとも約４である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項８】
少なくとも約２５のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項９】
少なくとも約３５のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１０】
少なくとも約５０のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１１】
少なくとも約７０のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１２】
少なくとも１の更なる治療薬と組み合わされる、請求項１乃至１１のいずれか１請求項に記載のコポリマー。
【請求項１３】
前記更なる治療薬が、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、又は可溶性サイトカインレセプターよりなる群から選択される、請求項１２に記載のコポリマー。
【請求項１４】
前記サイトカインが、β−インターフェロン、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０よりなる群から選択される、請求項１３に記載のコポリマー。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１に記載のコポリマーを少なくとも１単位用量で含む、キット。
【請求項１６】
自己免疫疾患を有する被検体の治療に用いられる組成物の製造方法であって、当該組成物が線状ランダムアミノ酸コポリマーＹＦＡＫを含む、当該製造方法。
【請求項１７】
前記コポリマーが少なくとも約５０残基の長さを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コポリマーが少なくとも約７０残基の長さを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が薬学的に許容可能なキャリヤーを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＨＣクラスIIタンパク質−ペプチド複合体に対するクラスII特異的Ｔ細胞応答を阻害するコポリマーを選択することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、重症甲状腺機能低下症、多発性硬化症、脱髄疾患、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫血小板減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、グレーブス病、乾癬、尋常性天疱瘡、及び関節リウマチから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患が糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記更なる治療薬が、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、可溶性サイトカインレセプター、及び更なる線状ランダムアミノ酸コポリマー組成物よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記サイトカインが、β−インターフェロン、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素阻害剤が、プロテアーゼ阻害剤及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、及びリシン（Ｋ）を含む線状ランダムアミノ酸コポリマーＹＦＡＫ。
【請求項２】
前記アミノ酸が固相反応又は溶液化学によって重合される、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項３】
Ｆ対Ｙのモル比が約１である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項４】
Ｆ対Ｙのモル比が少なくとも約２である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項５】
Ｆ対Ｙのモル比が約４である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項６】
Ｙ対Ｆのモル比が少なくとも約２である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項７】
Ｙ対Ｆのモル比が少なくとも約４である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項８】
少なくとも約２５のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項９】
少なくとも約３５のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１０】
少なくとも約５０のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１１】
少なくとも約７０のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１２】
少なくとも１の更なる治療薬と組み合わされる、請求項１乃至１１のいずれか１請求項に記載のコポリマー。
【請求項１３】
前記更なる治療薬が、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、又は可溶性サイトカインレセプターよりなる群から選択される、請求項１２に記載のコポリマー。
【請求項１４】
前記サイトカインが、β−インターフェロン、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０よりなる群から選択される、請求項１３に記載のコポリマー。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１に記載のコポリマーを少なくとも１単位用量で含む、キット。
【請求項１６】
自己免疫疾患を有する被検体の治療に用いられる組成物の製造方法であって、当該組成物が線状ランダムアミノ酸コポリマーＹＦＡＫを含む、当該製造方法。
【請求項１７】
前記コポリマーが少なくとも約５０残基の長さを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コポリマーが少なくとも約７０残基の長さを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が薬学的に許容可能なキャリヤーを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＨＣクラスIIタンパク質−ペプチド複合体に対するクラスII特異的Ｔ細胞応答を阻害するコポリマーを選択することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、重症甲状腺機能低下症、多発性硬化症、脱髄疾患、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、自己免疫性卵巣炎、慢性免疫血小板減少性紫斑病、大腸炎、糖尿病、グレーブス病、乾癬、尋常性天疱瘡、及び関節リウマチから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患が糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記更なる治療薬が、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗代謝剤、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤、可溶性サイトカインレセプター、及び更なる線状ランダムアミノ酸コポリマー組成物よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記サイトカインが、β−インターフェロン、インターロイキン−４、及びインターロイキン−１０よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素阻害剤が、プロテアーゼ阻害剤及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１６２５４５（Ｐ２０１２−１６２５４５Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−８５５３８（Ｐ２０１２−８５５３８）
【出願日】平成２４年４月４日（２０１２．４．４）
【分割の表示】特願２００３−５３２５２２（Ｐ２００３−５３２５２２）の分割
【原出願日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）
【出願人】（５００４９１７８６）プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年４月４日（２０１２．４．４）
【分割の表示】特願２００３−５３２５２２（Ｐ２００３−５３２５２２）の分割
【原出願日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．３）
【出願人】（５００４９１７８６）プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ (8)
【Ｆターム（参考）】
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