薬剤耐性菌検出方法
本発明は、試料において、バンコマイシン耐性腸球菌種などの薬剤耐性菌を検出するための方法及びオリゴヌクレオチドを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年８月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／９６４，４９９号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
腸球菌属のメンバーは、自然、動物、及び人間に存在するグラム陽性球菌である。腸球菌は、人間の正常な胃腸管及び生殖器官の生理的寄生菌の一部である。既知の種のうち、大腸レンサ球菌（８０〜９０％）及びエンテロコッカス・フェシウム（５％〜１０％）が人間において最も優勢である。腸球菌は、典型的には、人間において病原性ではない。しかしながら、これらは、増大する多剤耐性レベルを示しており（カウフホルト（Kaufhold）及びクライン（Klein）、１９９５年、細菌学中央報（Zentralblatt. Fuer. Bakterilogie.）、２８２巻（４号）、５０７〜５１８頁；スヴェック（Svec）ら、１９９６年、疫学・細菌学・免疫学（Epidemiologie Mikrobiologie Imunologie）、４５巻、１５３〜１５７頁）、院内感染の重要な原因として認識が高まってきている。大腸レンサ球菌感染は、尿路感染症（ＵＴＩ）、菌血症、心内膜炎、並びに創傷感染及び腹部−骨盤感染を含み、全てのＵＴＩの１６％、及び全ての菌血症の８％に達する。
【０００３】
バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は、二番目に一般的な院内感染の原因として認識されており、それを上回るのは大腸菌のみである。耐性は、染色体を介していてもよく（固有）、又はプラスミド媒介性若しくはトランスポゾン媒介性（獲得）であってもよい。ＶＲＥは、グラム陽性細菌に対して有効な「最後の手段」の抗生物質とみなされているバンコマイシンを含む、ほぼ全ての入手可能な抗生物質に対する耐性を特徴とする。医師にとって処置選択肢は限られており、ストラテジーには、抗菌剤の組み合わせ又は新しい、実証されていない化合物の使用が含まれる。患者は症状を示すことなくＶＲＥに定着され保菌している可能性があり、主要な定着場所は、肛門、腋窩、便、会陰、臍、創傷、フォーリーカテーテル、及び結腸瘻造設部である。
【０００４】
高いレベルのバンコマイシン耐性を与える遺伝子である大腸レンサ球菌プラスミド産（plasmid-born）ｖａｎＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで黄色ブドウ球菌などのグラム陽性の微生物に伝わる可能性がある（レクレルク（Leclercq）ら、１９８９年、抗菌薬及び化学療法（Antimicrob. Agents Chemother.）３３巻、１０〜１５頁；ノーブル（Noble）ら、１９９２年、ＦＥＭＳ微生物学レター（FEMS Microbiology Letters）、７２巻、１９５〜１９８頁）黄色ブドウ球菌、連鎖球菌種、エッゲルセラ・レンタ（Eggerrthella lenta）、及びクロストリジウム・イノキュウムの臨床分離株におけるバンコマイシン耐性が報告されており、バンコマイシン耐性は、バンコマイシン耐性腸球菌から獲得された可能性が最も高かった（疾病対策予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）、２００２年、罹患率及び死亡率週報（Morb. Mortal. Wkly. Rep.）、５１巻、５６５〜５６７頁；疾病対策予防センター、２００２年、罹患率及び死亡率週報、５１巻、９０２頁；ヴァイゲル（Weigel）ら、２００３年、サイエンス（Science）、３０２巻、１５６９〜１５７１頁；ヴァイゲルら、２００７年、抗菌薬及び化学療法（Antimicrob. Agents Chemother.）、５１巻、２３１〜２３８頁；メヴィウス（Mevius）ら、１９９８年、抗菌薬及び化学療法ジャーナル（J. Antimicrob. Chemother.）、４２巻、２７５〜２７６頁；ポヤルト（Poyart）ら、１９９７年、抗菌薬及び化学療法（Antimicrob. Agents Chemother.）、４１巻、２４〜２９頁；スティニア（Stinear）ら、２００１年、ランセット（Lancet）、３５７巻、８５５〜８５６頁）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
薬剤耐性菌の初期の同定及び治療的介入を目的とする診断ツールへの継続的な需要がある。
【０００６】
本発明は、生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法を含む。例えば、本方法は、増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅することを含むことができ、ここで、標的ポリヌクレオチドは、細菌におけるバンコマイシン耐性と関連する。増幅することは少なくとも１つの循環工程を含んでもよく、ここで、循環工程は増幅産物を結果として得るために好適な条件下で生体試料を第１のプライマー及び第２のプライマーと接触させること、及び、増幅された産物とプローブをハイブリダイズさせるために好適な条件下で増幅産物をプローブと接触させることを含む。プローブのＴＭは、第１のプライマーのＴＭ及び第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。増幅された産物が検出され、ここで、増幅された産物の存在は生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す。
【０００７】
標的ポリヌクレオチドは、ｖａｎＡポリヌクレオチド、例えば配列番号７、又はその一部を含むポリヌクレオチドであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを増幅するために用いることができるプライマーの例は、例えば、配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のプライマー、及び配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含み、ここで、プライマー対は配列番号７の一部、好ましくは配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。本方法において有用なプローブは、配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有する、及び／又は配列番号７と実質的に相補的なプローブを含む。
【０００８】
標的ポリヌクレオチドは、ｖａｎＢポリヌクレオチド、例えば配列番号８、又はその一部を含むポリヌクレオチドであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを増幅するために用いることができるプライマーの例は、例えば、配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のプライマー、及び配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含み、ここで、プライマー対は配列番号８の一部、好ましくは配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。本方法において有用なプローブは、配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有する、及び／又は配列番号８と実質的に相補的なプローブを含む。
【０００９】
本方法は、混合物を形成するために生体試料をプローブ、第１のプライマー、及び第２のプライマーと接触させることを含んでもよく、ここで、プライマーは細菌におけるバンコマイシンに対する薬剤耐性と関連する標的ポリヌクレオチドを増幅することができ、ここで、プローブは標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。プローブのＴＭは、第１のプライマー及び第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い薬剤耐性に関連するポリヌクレオチドが生体試料内に存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に混合物を曝露する。増幅された産物が検出され、ここで、増幅された産物の存在は生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す。
【００１０】
本方法は、結果として増幅産物を得るために生体試料内に存在する標的ヌクレオチドを増幅させることを含み、ここで、生体試料は第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマー、第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマー、又はそれらの組み合わせと、結果として増幅産物を得るための好適な条件下で、接触させられる。第１のｖａｎＡプライマーは配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＡプライマーは配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。第１のｖａｎＢプライマーは配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＢプライマーは配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。増幅された産物は検出され、ここで、増幅された産物の存在は、生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す。
【００１１】
本方法は、生体試料を、混合物を形成するために第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマーと、混合物を形成するために第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマーと、又はそれらの組み合わせと、接触させることを含んでもよい。第１のｖａｎＡプライマーは配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＡプライマーは配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。第１のｖａｎＢプライマーは配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＢプライマーは配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。混合物は、ｖａｎＡポリヌクレオチド又はｖａｎＢポリヌクレオチドが生体試料内に存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に曝露され、増幅された産物の不在が検出され、ここで、増幅された産物の不在は、生体試料内の薬剤耐性菌の不在を示す。
【００１２】
いくつかの態様では、本方法は、生体試料をプローブと接触させることを更に含み、ここで、プローブのＴＭは、第１のプライマーのＴＭ及び第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。プローブは、フルオロフォア及びクエンチャーを含んでもよい。本方法は、第２のプローブの使用を更に含むこともでき、ここで、第２のプローブは、本方法で用いられるプライマーのＴＭより少なくとも８℃高いＴＭを有する。２つのプローブが用いられる場合、１つのプローブはドナーフルオロフォアを含んでもよく、第２のプローブはアクセプタフルオロフォアを含んでもよい。
【００１３】
薬剤耐性菌は、グラム陽性細菌、例えば、ブドウ球菌属（黄色ブドウ球菌など）又は腸球菌属（大腸レンサ球菌、Ｅ．フェシウム、Ｅ．アビウム、Ｅ．ガリナルム、又はＥ．デュランスなど）のメンバーであってもよい。本発明の方法は、生体試料を獲得することを更に含むことができる。生体試料は薬剤耐性菌による感染が疑われる個体由来であってもよく、生体試料は糞便物質を含んでもよい。増幅された産物の存否を判断することは、それぞれの循環工程後に実行することができる。
【００１４】
本発明は、ポリヌクレオチドを分離するための方法も提供する。本発明は、一本鎖ポリヌクレオチドの混合物を提供すること、及び、ハイブリッドを結果として得るために一本鎖ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、混合物をオリゴヌクレオチドに曝露することを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、配列番号１との少なくとも約８０％同一性、配列番号２との少なくとも約８０％同一性、配列番号３との少なくとも約８０％同一性、配列番号４との少なくとも約８０％同一性、配列番号５との少なくとも約８０％同一性、又は配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。ハイブリッドはその後洗浄されて、汚染を除去してもよい。オリゴヌクレオチドは親和性ラベルを含むことができ、オリゴヌクレオチドは曝露前又は後に固相物質に付着することができる。混合物は生体試料から獲得することができ、本方法は、結果として一本鎖ヌクレオチドを得るために、生体試料内に存在するポリヌクレオチドを変性することを更に含むことができる。
【００１５】
本発明には、キットも含まれる。キットは、梱包物質、第１のｖａｎＡプライマー、第２のｖａｎＡプライマー、及びプローブを備えることができ、ここで、プローブのＴＭは、第１及び第２のｖａｎＡプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。プローブは、配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、配列番号７にハイブリダイズすることができる。第１のプライマーは配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、第２のプライマーは配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、プライマー対は配列番号７の４６８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。
【００１６】
キットは、梱包物質、第１のｖａｎＢプライマー、第２のｖａｎＢプライマー、及びプローブを備えることができ、ここで、プローブのＴＭは、第１及び第２のｖａｎＢプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。プローブは、配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、配列番号８にハイブリダイズすることができる。第１のプライマーは配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、第２のプライマーは配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、プライマー対は配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。
【００１７】
プローブは、フルオロフォア及びクエンチャーを含むことができる。
【００１８】
本発明はまた、分離されたポリヌクレオチドを含み、これらには例えば、配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、当該ポリヌクレオチドは配列番号２と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）、配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、当該ポリヌクレオチドは配列番号１と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）、配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、約１３９ヌクレオチドの増幅産物を結果として得るために当該ポリヌクレオチドが配列番号５と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）、配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、当該ポリヌクレオチドは配列番号４と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）が挙げられる。
【００１９】
定義
本明細書において使われる際、用語「ポリヌクレオチド」は、リボンヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかである、任意の長さの高分子型のヌクレオチドを指し、二本鎖及び一本鎖の両方のＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、例えばコード領域、制御領域などの非コード領域を含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から直接取得するか、又は組換え技法、酵素の技法、又は化学的技法の助けを用いて調製してもよい。ポリヌクレオチドは、トポロジーにおいて直鎖又は環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター若しくはクローニングベクターなどのベクターの一部、又は断片であることができる。「オリゴヌクレオチド」は、本発明のポリヌクレオチド、典型的にはプライマー及び／又はプローブを指す。
【００２０】
「標的ポリヌクレオチド」は、本明細書において使われる際、増幅が所望される目的のポリヌクレオチド配列を含有する。標的配列は、実際の配列に関して既知であっても既知でなくてもよい。
【００２１】
「コード領域」は、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であり、適切な制御配列の管理下におかれた場合、コード化されたポリペプチドを発現する。コード領域の境界は、通常、５’末端にある翻訳開始コドン及び３’末端にある翻訳終止コドンによって決定される。「制御配列」は、そのヌクレオチド配列が操作可能に連結されているコード配列の発現を制御するヌクレオチド配列である。制御配列の非限定的な例は、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳終止部位、及び転写ターミネーターを含む。用語「操作可能に連結される」は、構成要素が意図されたように機能することを可能にする関係にあるような、構成要素の並置を指す。制御配列は、コード領域の発現が制御配列と両立する条件下で達成されるように、接合される際に、コード領域に「操作可能に連結される」。
【００２２】
「プライマー」は、本明細書において使われる際、標的ポリヌクレオチドの一部に相補的なオリゴヌクレオチドであり、標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、増幅反応及び増幅産物の合成の開始点として用いることができる。「プライマー対」は、１つの増幅反応に共に用いることができる２つのプライマーを指す。「ｖａｎＡプライマー」及び「ｖａｎＢプライマー」は、ｖａｎＡ又はｖａｎＢポリヌクレオチドをそれぞれハイブリダイズし、適切な条件下で増幅を開始することができるプライマー対を指す。「プローブ」は、本明細書において使われる際、２つのプライマーを用いて形成される増幅産物の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドである。「ｖａｎＡプローブ」及び「ｖａｎＢプローブ」は、ｖａｎＡプライマー又はｖａｎＢプライマーを用いることから生じた増幅産物をハイブリダイズするプローブをそれぞれ指す。
【００２３】
用語「相補体」及び「相補的」は、本明細書において使われる際、ポリヌクレオチドの１つのストランド上のアデニンが第２のポリヌクレオチドのストランド上のチミン又はウラシルに塩基対合し、ポリヌクレオチドの１つのストランド上のシトシンが第２のポリヌクレオチドのストランド上のグアニンに塩基対合する場合に、２つの一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、プライマー及び標的ポリヌクレオチド）が互いに塩基対合できる能力を指す。２つのポリヌクレオチドは、１つのポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列と塩基対合できる場合に、互いに相補的である。例えば、５’−ＡＴＧＣ及び５’−ＧＣＡＴは相補的である。用語「実質的な相補体（substantial complement）」、「実質的に相補的（substantially complementary）」、及び「実質的な相補性（substantial complementarity）」は、本明細書において使われる際、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で特定のポリヌクレオチドを選択的にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、数多くの、ｐＨ、塩及び温度の条件下で起こり得る。ｐＨは、６〜９で、好ましくは６．８〜８．５で変動し得る。塩濃度は０．１５Ｍナトリウム〜０．９Ｍナトリウムで変動する場合があり、他のカチオンは、ナトリウムについて指定されているイオン強度に等しいイオン強度である限り、用いることができる。ハイブリダイゼーション反応温度は、３０℃〜８０℃、好ましくは４５℃〜７０℃で変動する場合がある。更に、室温で、又は室温付近などの、低温で特定のハイブリダイゼーションを促進するために、他の化合物をハイブリダイゼーション反応に加えることができる。温度要件を下げるために想到される化合物には、ホルムアミドがある。したがって、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが当該ポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間で発生する場合、典型的には第２のポリヌクレオチドに「実質的に相補的」である。本明細書において使われる際、「特定のハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における２つのポリヌクレオチド間でのハイブリダイゼーションを指す。
【００２４】
「同一性（identity）」は、プライマー又はプローブなどのオリゴヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド又は増幅産物の少なくとも一部との間の配列類似性を指す。類似性は、２つのポリヌクレオチド（すなわち、プライマー又はプローブのヌクレオチド配列及び参照ヌクレオチド配列）の残渣をそれらの配列の長さに沿った同一のヌクレオチドの数を最適化するために整列することによって決定される。配列の一方又は両方のギャップは、共有されるヌクレオチドの数を最適化するための整列を行う際に許容されるが、それぞれの配列内のヌクレオチドはそれでもなお、それらの適切な順序のままでいなければならない。配列類似性は、典型的には少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、少なくとも約９０％同一性、又は少なくとも約９５％同一性である。配列類似性は、例えば、ＧＣＧＦａｓｔＡ（ジェネティクス・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group）、ウィスコンシン州マディソン（Madison））、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ４．５（コダック／ＩＢＩソフトウェア・パッケージ（Kodak/IBI software package））などのシークエンス技法又は当該技術分野において既知の、他の好適なシークエンシングプログラム若しくは方法を用いて、決定することができる。好ましくは、プライマーと標的ポリヌクレオチドとの間、又はプローブと増幅産物との間の配列類似性は、タツソヴァ（Tatusova）ら（１９９９年、ＦＥＭＳ微生物学レター（FEMS Microbiol Lett.）、１７４巻、２４７〜２５０頁）に記述されるように、及びワールド・ワイド・ウェブ（World Wide Web）、例えば米国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって維持されるインターネットサイトを通じて入手可能な、ＢＬＡＳＴ２探索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを用いて決定される。好ましくは、ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ＝１、ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ＝−２、ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝２、ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝１１、を含む、全てのＢＬＡＳＴ２探索パラメーターの初期値が用いられ、任意でｆｉｌｔｅｒをオンにする。ＢＬＡＳＴ探索アルゴリズムを用いる２つのヌクレオチド配列の比較において、配列類似性は「同一性」として示される。
【００２５】
「ラベル（label）」は、オリゴヌクレオチドに添付されるか（共有結合又は非共有結合）又は添付されることが可能な部分を指し、これらは、オリゴヌクレオチドについての情報（例えば、オリゴヌクレオチドについての記述的又は同定情報）又はラベル付けされたオリゴヌクレオチドが相互作用する（例えば、ハイブリダイズする）別のポリヌクレオチドについての情報を提供するか又は提供可能である。ラベルを用いて、検出可能な（及び任意で定量化可能な）信号を提供することができる。ラベルを用いて、オリゴヌクレオチドを表面に添付することもできる。
【００２６】
「フルオロフォア」は、より短い波長の光を吸収した後に特定の波長の光を放射することができる部分である。特定のフルオロフォアによって放射される光の波長は、そのフルオロフォアに特徴的である。したがって、特定のフルオロフォアは、より短い波長の光によってフルオロフォアが励起した後の適切な光によって検出することができる。
【００２７】
用語「クエンチャー（quencher）」は、本明細書において使われる際、フルオロフォアから放射されるエネルギーを吸収する、あるいはそうでなければ、蛍光染料が光を放射する能力に干渉する部分を指す。クエンチャーは、フルオロフォアから吸収したエネルギーを、そのクエンチャーに特徴的な信号で再放射することができ、したがってクエンチャーはフルオロフォア（蛍光クエンチャー）として振る舞うこともできる。この現象は、通常、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）として既知である。あるいは、クエンチャーはフルオロフォアから吸収したエネルギーを熱として拡散することもできる（非蛍光クエンチャー）。
【００２８】
「生体試料」は、真核生物源又は原核生物源から獲得された試料を指す。真核生物源の例は、ヒト又はネズミ科のメンバー（ラット又はマウスなどのネズミ科の動物）を含む。原核生物源の例は、腸球菌を含む。生体試料は、例えば、単一の細胞の形態、組織の形態、又は液体の形態を取ることができる。細胞又は組織は、インビトロ培養由来とすることができる。
【００２９】
ハイブリダイゼーション、ストランド伸長などのような、あるイベントが発生することを「可能にする」条件、又は「好適な」条件は、そのようなイベントが発生するのを妨げない条件である。したがって、これらの条件は、そのイベントを可能にし、増強し、容易にし、かつ／又は促す。当該技術分野において既知であり本明細書に記載されるそのような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、及び緩衝条件によって決まり得る。これらの条件は、ハイブリダイゼーション、分裂、又はストランド伸長などの、いずれのイベントが所望されるかによっても決まり得る。
【００３０】
「分離された」ポリヌクレオチドは、その自然環境から取り出されたポリヌクレオチドを指す。「精製された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドと天然で関連している他の成分から、少なくとも約６０％フリー、好ましくは少なくとも約７５％フリー、最も好ましくは少なくとも約９０％フリーであるポリヌクレオチドである。
【００３１】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況において、他の実施形態も好まれる可能性がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００３２】
用語「含む」及びこの変形は、これらの用語が現れる説明及び請求項において制限する意味を持たない。
【００３３】
特に指定されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」は、同じ意味で使用され、「１つ以上」を意味する。
【００３４】
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数（例えば１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、など）が包含される。
【００３５】
用語「及び／又は」は、列挙した要素の１つ又は全て、あるいは列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００３６】
本発明の上述の「課題を解決するための手段」は、本発明の開示される各実施形態又は全ての実施を記載することを目的としていない。以下の説明により、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願のいくつかの箇所で、実施例の一覧として説明を提供するが、実施例は各種組み合わせにて使用することが可能である。いずれの場合にも、記載した一覧は、代表的な群としてのみ役立つものであり、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ｖａｎＡコード領域のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１Ｂ】ｖａｎＢコード領域のヌクレオチド配列（配列番号８）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、薬剤耐性原核細菌に特有のポリヌクレオチドを検出するための方法を含む。これらの細菌は、ｖａｎＡ又はｖａｎＢコード領域を有することによって薬剤耐性である。好ましくは、原核細菌は腸球菌属（本明細書では腸球菌種又は腸球菌と呼ばれる）のメンバー、例えば、大腸レンサ球菌、Ｅ．フェシウム、Ｅ．アビウム、Ｅ．ガリナルム、又はＥ．デュランス、より好ましくは、大腸レンサ球菌又はＥ．フェシウムであり、最も好ましくは、大腸レンサ球菌である。薬剤耐性菌の他の例として、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌種、及び連鎖球菌種が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明は、増幅技法並びにプライマー及びプローブなどのオリゴヌクレオチドを用いて、バンコマイシン耐性腸球菌に存在するｖａｎＡ及び／又はｖａｎＢコード領域の一部を検出することを目的とする方法を含む。本発明の方法を用いて、生体試料内の薬剤耐性菌の存否を同定することが可能である。いくつかの態様では、増幅技法はリアルタイムアッセイの使用を含む。本発明は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドも含む。
【００３９】
オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために用いることができるプライマーを含む。ｖａｎＡコード領域の一例は、配列番号７（ジェンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＢ２４７３２７、図１Ａを参照）において開示されている。ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために有用なプライマーは、配列番号７の領域、好ましくは、配列番号７の約６４８〜約７５１のヌクレオチドを含む領域を増幅することができる。結果的に、プライマーのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド約６４８〜約６７０、好ましくはヌクレオチド６４８〜６７０（配列番号１として本明細書で言及される）に対応することができる。同様に、プライマーのヌクレオチド配列は、約７２６〜７５１、好ましくは７２６〜７５１のヌクレオチドの相補体（配列番号２として本明細書で言及される）に対応する場合がある。ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために有用なプライマー対の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号１及び配列番号２、配列番号１との配列類似性を有するプライマー及び配列番号２、配列番号１及び配列番号２との配列類似性を有するプライマー、並びに配列番号１との配列類似性を有するプライマー及び配列番号２との配列類似性を有するプライマー。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＢコード領域の一部を増幅するために用いることができるプライマーを含む。ｖａｎＢコード領域の一例は、配列番号８（ジェンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＹ６６５５５１、図１Ｂを参照）において開示されている。ｖａｎＢコード領域の一部を増幅するために有用なプライマーは、配列番号８の領域、好ましくは、配列番号８の約４９２〜約６３０のヌクレオチドを含む領域を増幅することができる。結果的に、プライマーのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド約４９２〜約５１６、好ましくは４９２〜５１６（配列番号４として本明細書で言及される）に対応することができる。同様に、プライマーのヌクレオチド配列は、約６０８〜６３０、好ましくは６０８〜６３０のヌクレオチドの相補体（配列番号５として本明細書で言及される）に対応する場合がある。ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために有用なプライマー対の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号４及び配列番号５、配列番号４との配列類似性を有するプライマー及び配列番号５、配列番号４及び配列番号５との配列類似性を有するプライマー、並びに配列番号４との配列類似性を有するプライマー及び配列番号５との配列類似性を有するプライマー。
【００４１】
ｖａｎＡ又はｖａｎＢのコード領域を増幅するプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）、カリフォルニア州フォスターシティ（Foser City））、及びＩＤＴ（登録商標）ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０（インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）、アイオワ州コーラルヴィル（Coralville））などのすぐに入手可能なコンピュータプログラムを用いて設計することができる。プライマーを設計する際に考慮できる因子として、融解温度、プライマー長さ、増幅産物の大きさ、及び特異性が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される増幅方法において有用なプライマーは、典型的には、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃又は少なくとも５９℃より高い融解温度（ＴＭ）を有する。プライマーのＴＭは、ウォレス・ルール（Wallace Rule）（ウォレスら、１９７９年、核酸研究（Nucleic Acids Res.）、６巻、３５４３〜３５５７頁）によって、又はＩＤＴ Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ３．０などのすぐに入手可能なコンピュータプログラムによって決定することができる。典型的には、プライマー対のプライマーは、４℃以下、３℃以下、２℃以下、又は１℃以下の幅で変動するＴＭを有する。典型的には、２つのプライマーは十分に長く、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつ細菌、好ましくは腸球菌内に存在する他の非標的ポリヌクレオチド及び増幅反応に存在する可能性がある他のポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。プライマー長さは、通常、約１５〜約３０ヌクレオチド（例えば、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０ヌクレオチド）である。
【００４２】
本発明において有用なプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５に対する配列類似性を有することができる。配列類似性を有するそのようなプライマーにおける非相補的ヌクレオチドは、本質的にはプライマー中の任意の場所に位置することができる。いくつかの態様では、シトシン残基又はグアニン残基を保存することが好ましい。例えば、配列番号１に対する配列類似性を有するプライマーにおいて、配列番号１において１つ以上のアデニン残基又はチミン残基を変更し、シトシン残基及びグアニン残基を保存することがより好ましい。好ましくは、配列類似性を有するプライマーの３’末端にある第１のヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５にある対応する第１のヌクレオチドと同一である。
【００４３】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５との配列類似性を有するプライマーは、適切な条件下で標的ポリヌクレオチドを増幅する活性を有する。配列類似性を有するそのような候補プライマー（すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５と比較されるプライマー）が標的ポリヌクレオチドを増幅する活性を有するか否かは、以下のプロファイルでＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis））によって検査することができる：９５℃で３０秒、その後、９５℃で０秒（２０℃／秒勾配）、６０℃で３０秒（２０℃／秒勾配）を４５サイクル。増幅は、５マイクロリットル（μＬ）の試料及び５μＬの以下の混合物を含有する全体積１０μＬで実行することができる：２つのプライマー（それぞれ１０マイクロモル（μＭ）で０．５μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭで２μＬ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（１０ｘで１μＬ、ロシュ（Roche））。配列番号１又は配列番号２のいずれかとの配列類似性を有する候補プライマーを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド６４８〜７５１を有するポリヌクレオチドである。そのようなヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ ７００２２１（商標）として指示されるエンテロコッカス・フェシウムから獲得された全細胞ＤＮＡに存在する。配列番号４又は配列番号５のいずれかとの配列類似性を有する候補プライマーを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド４９２〜６３０を含むポリヌクレオチドである。そのようなヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ ７００８０２（商標）として指示されるエンテロコッカス・フェシウムから獲得された全細胞ＤＮＡに存在する。配列番号１との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号２である。配列番号２との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号１である。配列番号４との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号５である。配列番号５との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号４である。
【００４４】
本発明のプライマーは、追加的なヌクレオチドを更に含むことができる。典型的には、このような追加的なヌクレオチドはプライマーの５’末端に存在し、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むヌクレオチド、ヘアピンループを形成するヌクレオチド、及び、プライマーが、例えばスコーピオンプライマー（scorpions primer）（例えば、ウィトコンベ（Whitcombe）ら、米国特許第６，３２６，１４５号、及びウィトコンベ（Whitcombe）ら、１９９９年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１７巻、８０４〜８１７頁を参照）又はアンプリフルーア（amplifluor）プライマー（例えば、ナザレンコ（Nazarenko）ら、１９９７年、核酸研究（Nucl. Acids Res.）、２５巻、２５１６〜２５２１頁を参照）として用いられることを可能にする他のヌクレオチドを含む。プライマーがそのような追加的なヌクレオチドを含む際、プライマーが配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５との配列類似性を有するか否かを判断するのに、その追加的なヌクレオチドは含まれない。同様に、一般的に約１０〜約５０ヌクレオチドであるプライマーの長さを判断するのに、追加的なヌクレオチドは含まれない。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＡプライマー又はｖａｎＢプライマーの使用から生じる増幅された産物の少なくとも一部にハイブリダイズするために用いることができるプローブを含む。そのような本明細書で有用なｖａｎＡプローブは、配列番号７の約６７１〜約７２５のヌクレオチド、好ましくは、配列番号７の６８４〜７１２ヌクレオチド、を含む領域にハイブリダイズする。そのような本明細書で有用なｖａｎＢプローブは、配列番号８の約５１７〜約６０７のヌクレオチド、好ましくはヌクレオチド５４９〜５７３を含む領域にハイブリダイズする。
【００４６】
典型的には、ｖａｎＡプローブは、ｖａｎＡプライマーの特定のセットを用いる本発明の方法において用いるように設計され、ｖａｎＢプローブは、ｖａｎＢプライマーの特定のセットを用いる本発明の方法において用いるように設計される。ｖａｎＡプローブ及びｖａｎＢプローブを設計することは、本明細書に記載されるプライマーを設計することと同様な方法で行われる。本明細書に記載される方法に有用なプローブを設計する際に考慮できる因子として、融解温度、長さ、プライマーに関するプローブの位置が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、プローブは、プローブと共に用いられるプライマーの最も高いＴＭよりも高いＴＭを有する。好ましくは、プローブは、プローブと共に用いられるプライマーの最も高いＴＭよりも、少なくとも約８℃高い、少なくとも約８．５℃高い、少なくとも約９℃高い、少なくとも約９．５℃高い、又は少なくとも約１０℃高いＴＭを有する。典型的には、より高いＴｍは、プライマー以前にプローブがハイブリダイズするのを可能にし、それによって、プローブでのそれぞれの増幅産物のラべリングの最大化を助ける。
【００４７】
典型的には、プローブは十分に長く、標的ポリヌクレオチド（及び増幅産物）にハイブリダイズし、かつ細菌、好ましくは、腸球菌に存在する他の非標的ポリヌクレオチド、及び増幅反応に存在する可能性がある他のポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。プローブ長さは一般的には、約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドである。好ましくはプローブ及びプローブと共に用いられるプライマーは増幅産物の同じヌクレオチドにハイブリダイズしない。プローブは、増幅された産物の１つのストランドにハイブリダイズし、典型的にはそのストランドにハイブリダイズするプライマーの前に、増幅された産物にハイブリダイズするように設計される。本発明のいくつかの態様では、プローブは、同じストランドにハイブリダイズするプライマーの１、２、３、４、又は５ヌクレオチド以内で、増幅された産物の１つのストランドにハイブリダイズする。２つのプローブの使用を伴う本発明のいくつかの態様では、２つのプローブは好ましくは増幅された産物の同じストランドにハイブリダイズし、２つのプローブは任意で、互いの１、２、３、４、又は５ヌクレオチド以内で、同じ増幅産物にハイブリダイズすることができる。
【００４８】
本発明において有用なプローブは、配列番号３、又は配列番号６に対する配列類似性を有することができる。配列類似性を有するそのようなプローブにおける非相補的ヌクレオチドは、本質的にはプローブ中の任意の場所に位置することができる。いくつかの態様では、シトシン残基又はグアニン残基を保存することが好ましい。配列番号３又は配列番号６との配列類似性を有するプローブは、プライマー対のプライマーがハイブリダイズするのと同じ条件下で増幅された産物にハイブリダイズする活性を有する。配列類似性を有するそのような候補プローブ（すなわち、配列番号３又は配列番号６と比較されるプローブ）がこの活性を有するか否かは、候補プローブをプライマー対との増幅反応に含めること、及びアニーリング工程中に候補プローブが増幅産物とのハイブリッドを形成するか否かを判断することによって試験することができる。配列番号３との配列類似性を有する候補プローブを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド６４８〜７５１を含むポリヌクレオチドであり、配列番号６との配列類似性を有する候補プローブを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド４９２〜６３０を含むポリヌクレオチドである。配列番号３との配列類似性を有する候補プローブを試験する際、配列番号１及び配列番号２がプライマー対として用いられる。配列番号６との配列類似性を有する候補プローブを試験する際、配列番号４及び配列番号５がプライマー対として用いられる。
【００４９】
本発明のプローブは、追加的なヌクレオチドを更に含むことができる。そのような追加的なヌクレオチドは、５’末端、３’末端のいずれか、又は両方に存在することができ、例えばヘアピンループを形成するヌクレオチド、及び、プローブを例えば分子指標として用いることを可能にする他のヌクレオチドを含むことができる。プローブがそのような追加的なヌクレオチドを含む際、プローブが配列番号７又は配列番号８との配列類似性を有するか否かを判断するのに、その追加的なヌクレオチドは含まれない。同様に、一般的に約１５〜約３０ヌクレオチドであるプローブの長さを判断するのに、追加的なヌクレオチドは含まれない。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは修飾することができる。そのような修飾は、特定の環境におけるポリヌクレオチドの安定性を向上させるのに有用であり得る。修飾は、核酸主鎖、塩基、糖、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。修飾は、合成、自然発生、又は非自然発生である場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに存在する１つ以上の核酸における修飾を含むことができる。主鎖の修飾の例として、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸が挙げられるが、これらに限定されない（ニールソン（Nielson）ら、米国特許第５，５３９，０８２号、エゴーム（Egholm）ら、ネイチャー（Nature）、１９９３年、３６５巻、５６６〜５６８頁）。核酸塩基の修飾の例として、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、擬似ウラシル（pseudouracil）、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）若しくは６−アザピリミジン若しくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、又はプロピン修飾が挙げられるが、これらに限定されない。核酸糖修飾の例として、２’−糖修飾、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、又は２’−デオキシヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
オリゴヌクレオチドはラベルを含んでもよい。代表的なラベルとして、フルオロフォアラベル（例えば、クエンチャー又は吸収体など）、非蛍光ラベル、比色分析ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、放射性ラベル、質量修飾基（mass-modifying groups）、親和力ラベル、磁性粒子、抗原、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼなど）、基質などが挙げられるが、これらに限定されない。ラベルは、蛍光、放射能、比色、重量測定、Ｘ線回折又はＸ線吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能な信号を提供することができる。親和力ラベルは、別の分子との特異的相互作用を提供する。親和力ラベルの例は、例えば、抗体のように、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ（polyethyleneoxy）、ハプテン、及びペプチドを含む。
【００５２】
特定の態様では、ラベルはフルオロフォアである。フルオロフォアラベルとして、フルオレセイン・ファミリー、カルボキシローダミン・ファミリー、シアニン・ファミリー、及びローダミン・ファミリーの染料が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いることができる染料の他のファミリーとして、例えば、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの染料、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの染料、クマリン・ファミリーの染料、オキサジン・ファミリーの色素、チアジン・ファミリーの色素、スクアライン・ファミリーの色素、キレート化ランタニド・ファミリーの色素、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＪの商品名でモレキュラー・プローブス（Molecular Probes）から入手可能な染料のファミリー、及びＢｏｄｉｐｙＪの商品名でインヴィトロジェン（Invitrogen）（カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad））から入手可能な染料のファミリーが挙げられる。フルオレセイン・ファミリーの染料として、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル（fused phenyl）−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、及び２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−フルオレセイン（ＺＯＥ）が挙げられる。カルボキシローダミン・ファミリーの染料として、テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、テキサスレッド、Ｒ１１０、及びＲ６Ｇが挙げられる。シアニン・ファミリーの染料として、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７が挙げられる。フルオロフォアは、例えば、パーキンエルマー（Perkin-Elmer）（カリフォルニア州フォスターシティ（Foster City））、モレキュラー・プローブス株式会社（Molecular Probes, Inc.）（オレゴン州ユージーン（Eugene））、及びアマシャムＧＥヘルスケア（Amersham GE Healthcare）（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway））から市販されている。
【００５３】
ラベルは、クエンチャーであってもよい。クエンチャーは、蛍光クエンチャー又は非蛍光クエンチャーであってもよい。蛍光クエンチャーとして、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、シアニン染料（ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ）、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、及びニトロイミダゾール化合物など）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアから吸収したエネルギーを拡散する代表的な非蛍光クエンチャーとして、ビオサーチ・テクノロジーズ株式会社（Biosearch Technologies, Inc.）（カリフォルニア州ナヴァト（Novato））から商品名ブラックホールＪ（Black HoleJ）で入手可能なもの、エポック・バイオサイエンス（Epoch Biosciences）（ワシントン州ボセル（Bothell））から商品名エクリプス・ダークＪ（Eclipse DarkJ）で入手可能なもの、アナスペック株式会社（Anaspec, Inc.）（カリフォルニア州サンノゼ（San Jose））から商品名ＱｘｌＪで入手可能なもの、及びインテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）（アイオワ州コーラルヴィル（Coralville））から商品名アイオワブラックＪ（Iowa BlackJ）で入手可能なものが挙げられる。
【００５４】
典型的には、フルオロフォア及びクエンチャーは共に用いられ、同じ又は異なるヌクレオチド上に存在する可能性がある。共に対になっている場合、フルオロフォア及び蛍光クエンチャーは、それぞれドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアとして言及することができる。多数の好都合なフルオロフォア／クエンチャー対は、当該技術分野において既知であり（例えば、グレイザー（Glazer）ら、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Current Opinion in Biotechnology）、１９９７年、８巻、９４〜１０２頁、チャギ（Tyagi）ら、１９９８年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１６巻、４９〜５３頁を参照）、例えば、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）（オレゴン州ジャンクションシティ（Junction City））、及びアプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティ（Foster City））から商業的に容易に入手可能である。種々のアクセプタフルオロフォアと共に用いることができるドナーフルオロフォアの例として、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィリコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２−，２’−ジスルホン酸誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。アクセプタフルオロフォアは、典型的には用いられるドナーフルオロフォアによって決まる。アクセプタフルオロフォアの例として、ＬＣＪ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣＪ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン・ローダミンＢスルホニルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリトロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又は他のランタニドイオンのキレート（例えば、ユウロピウム及びテルビウム）が挙げられるが、これらに限定されない。ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアは、例えば、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）又はシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（ミズーリ州セントルイス（St.Louis））から商業的に容易に入手可能である。
【００５５】
ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアを用いるリアルタイムアッセイに有用なプローブの例として、隣接プローブ（カルドゥーロ（Cardullo）ら、１９８８年、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８５巻、８７９０〜８７９４頁、ヴィットヴェア（Wittwer）、１９９７年、バイオテクニックス（BioTechniques）、２２巻、１３０〜１３１頁）、及びＴａｑｍａｎプローブ（ホランド（Holland）ら、１９９１年、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８８巻、７２７６〜７２８０頁、リヴァク（Livak）ら、１９９５年、ＰＣＲ応用方法（PCR Methods Appl.）、４巻、３５７〜６２頁）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォア及び非蛍光クエンチャーを用いるリアルタイムアッセイに有用なプローブ及びプライマーの例として、分子指標（チャギ（Tyagi）ら、１９９６年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１４巻、３０３〜３０８頁、ヨハンソン（Johansson）ら、２００２年、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１２４巻、６９５０〜６９５６頁）、スコーピオンプライマー（二重鎖スコーピオンプライマーを含む）（ウィトコンベ（Whitcombe）ら、米国特許第６，３２６，１４５号、ウィトコンベ（Whitcombe）ら、１９９９年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１７巻、８０４〜８１７頁）、アンプリフルーアプライマー（ナザレンコ（Nazarenko）ら、１９９７年、核酸研究（Nucl.Acids res.）、２５巻、２５１６〜２５２１頁）、及び点灯（light-up）プローブ（スヴァンヴィク（Svanvik）ら、２０００年、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）、２８７巻、１７９〜１８２頁）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、ベクターに存在し得る。ベクターは、別のポリヌクレオチドが、付着したポリヌクレオチドの複製をもたらすように付着することができるプラスミド、ファージ、又はコスミドなどの複製ポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターの構成体は、当該技術分野において既知の標準のライゲーション技法を用いる。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９８９年）を参照のこと。ベクターは、更なるクローニング（ポリヌクレオチドの増幅）、すなわちクローニングベクター、又は、ポリヌクレオチドの発現、すなわち発現ベクターを提供することができる。用語「ベクター」として、プラスミドベクター及びウィルス性ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウィルス性ベクターの例として、例えば、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクター、及びヘルペスウィルスベクターが挙げられる。典型的には、ベクターは、細菌の宿主、例えば大腸菌において複製可能である。好ましくは、ベクターはプラスミドである。ベクターはまた、配列番号７、又はその一部、好ましくは配列番号７の約６４８〜約７５１のヌクレオチドなどのｖａｎＡコード領域、又は配列番号８、又はその一部、好ましくは配列番号８の約４９２〜約６３０のヌクレオチドなどのｖａｎＢコード領域も含むことができる。そのようなベクターは、例えば、制御標的ポリヌクレオチドとして用いることができる。
【００５７】
ベクターの選択は、選択マーカー、ベクター複製率などのような、結果として得られる作成物における種々の所望の特性によって決まる。本明細書のベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、原核細胞である。好適な原核細胞として、グラム陰性細菌、例えば、大腸菌などの真正細菌が挙げられる。ベクターは、当業者に既知で、日常的に用いられる方法を用いて宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、熱ショック、リポフェクション、顕微注入、及びウィルス媒介核酸転移は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。更に、裸のＤＮＡは、細胞に直接送ることができる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、インビトロ又はインビボで産生することができる。例えば、インビトロ合成のための方法として、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を用いた化学合成が挙げられるが、これに限定されない。合成ポリヌクレオチド及びそのような合成のための試薬の商業的供給者は周知である。インビトロ合成のための方法は、例えば、無細胞系で環状又は線形発現ベクターを用いるインビトロ転写も含む発現ベクターを用いて、細胞内で本発明のポリヌクレオチドを産生することができ、その後、そのポリヌクレオチドは細胞から分離される。
【００５９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のうちの１つ、又はそれらの断片に含有されるヌクレオチド配列と同一又は十分に同一なポリヌクレオチドは、核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして用いて、腸球菌属（及び標的ポリヌクレオチド配列との高い配列類似性を有する、腸球菌以外の属に属する細菌からのホモログ及びオルソログをコード化する遺伝子）の薬剤耐性原核細菌に特徴的な標的ポリヌクレオチドを検出することができる。典型的には、これらのプライマーポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列のうちの１つと、少なくとも約８０％同一〜少なくとも約９５％同一である（例えば、少なくとも約８０％配列同一性、少なくとも約８５％配列同一性、少なくとも約９０％配列同一性、又は少なくとも約９５％配列同一性を有する）。
【００６０】
配列番号３、若しくは配列番号６のうちの１つ、又はそれらの断片に含有されるヌクレオチド配列と同一又は十分に同一なポリヌクレオチドは、核酸検出反応（例えば、ハイブリダイゼーション）のためのプローブとして用いて、腸球菌属（及び標的ポリヌクレオチド配列との高い配列類似性を有する、腸球菌以外の属に属する細菌からのホモログ及びオルソログをコード化する遺伝子）の薬剤耐性原核細菌に特徴的な標的ポリヌクレオチドを検出することができる。典型的には、これらのプローブポリヌクレオチドは、配列番号３、又は配列番号６に示されるヌクレオチド配列のうちの１つと、少なくとも約８０％同一〜少なくとも約９５％同一である（例えば、少なくとも約８０％配列同一性、少なくとも約８５％配列同一性、少なくとも約９０％配列同一性、又は少なくとも約９５％配列同一性を有する）。
【００６１】
使用方法
本発明は、薬剤耐性原核細菌、好ましくは、腸球菌属のメンバー、例えば、大腸レンサ球菌、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・ガリナルム、又はエンテロコッカス・デュランス、より好ましくは、大腸レンサ球菌又はエンテロコッカス・フェシウム、最も好ましくは、大腸レンサ球菌、に特徴的なポリヌクレオチドを検出するための方法を含む。薬剤耐性菌の他の例として、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌種、及び連鎖球菌種が挙げられるが、これらに限定されない。試料が被験者から獲得されると、本方法を用いて被験者が薬剤耐性菌に感染しているか否かを判断することができる。本発明のこの態様の方法は、典型的には、標的ポリヌクレオチドを本発明のプライマー対と接触させること、ポリヌクレオチドを増幅すること、及び結果として得られる増幅された産物を検出することを含む。
【００６２】
本方法で用いられる標的ポリヌクレオチドは、試料内に存在してもよい。試料は、食品試料、飲料試料、発酵ブロス、法医学試料、環境試料（例えば、土壌、汚れ、廃棄物、汚水、又は水）、又は生体試料であってもよい。好ましくは、試料は生体試料である。「生体試料」は、真核生物源又は原核生物源から獲得された試料を指す。真核生物源の例は、ヒト又はネズミ科のメンバー（ラット又はマウスなどのネズミ科の動物）を含む。原核生物源の例として、腸球菌、及び内因性又は組換えのｖａｎＡ又はｖａｎＢコード領域を含有する他の細菌を含む。
【００６３】
生体試料は、例えば、単一の細胞の形態、組織の形態、又は液体の形態を取ることができる。細胞又は組織は、インビトロ培養由来とすることができる。動物から獲得される場合、生体試料は、例えば肛門スワブ、直腸スワブ、便の試料、血液、及び／又は体液から獲得することができる。いくつかの態様では、生体試料は、腸球菌感染を有すると疑われる被験者から獲得される。試料は、分離されたポリヌクレオチド、例えば、本明細書で記載されるようなベクター内に存在するポリヌクレオチド、又は本明細書で以下に記載される方法を用いて分離されるポリヌクレオチドであってもよい。
【００６４】
試料は、水若しくは有機媒体の中に溶解若しくは分散しているか、又はそこからポリヌクレオチドが水若しくは有機媒体に抽出されている固体試料（例えば、固体組織）であってもよい。例えば、試料は臓器ホモジェネートであってもよい。したがって、試料は先行して抽出されたポリヌクレオチドであってもよい。
【００６５】
いくつかの態様では、試料は、存在している細菌、好ましくは腸球菌、を濃縮するために、濃縮ブロスを用いてインキュベートされてもよい。そのような細菌についての試料の感度は、増幅及び検出のためにポリヌクレオチドを抽出する試料調製に先行する集積培養プロセスを含むことによって増強される。試料原料（例えば、生体試料）は、試料中の他の細菌を殺すが抗生物質耐性菌の増殖を可能にする特定の濃度で抗生物質（複数可）を補われた好適な媒体／ブロスを接種するために用いられ、その後、カルチャーは好適な温度（例えば、３７℃）である期間（例えば、１８〜２４時間）インキュベートされる。好ましくは、抗生物質は、例えば４ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）〜８ｍｇ／ｍＬの濃度で用いることのできるバンコマイシンである。集積培養プロセスの最後に、目的の細菌を有する試料は、遠心分離、濾過、又は他の好適な方法によってカルチャーの一部から収集され、増幅及び検出を含む本発明の方法に用いられる。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、不純、部分的に純粋、又は純粋な試料からであってもよい。ポリヌクレオチドは著しく不純な試料からも獲得することができるため、元の試料の純度は重要ではない。例えば、ポリヌクレオチドは、血液、唾液、糞便、又は組織などの生体液の不純な試料から獲得することができる。より高い純度の試料が所望される場合、試料は、本発明の方法を行うのに先立って、当業者に既知の任意の従来の手段によって処理することができる。ポリヌクレオチドは、本明細書で以下に記載される方法を用いて分離することができる。
【００６７】
複合生体試料（糞便、血液、食品、組織、痰など）は、固体のくず及び／又は増幅阻害因子を含有する場合がある。固体のくずは、一般的に沈殿又は遠心分離（固体からの分離上清）、濾過などによって除去される。増幅阻害因子は、多くの場合、タンパク質変性剤又はプロテアーゼを用いる処置、希釈などによって除去される。所望されないポリヌクレオチド含有細胞は、選択的な溶菌、分画遠心分離、濾過などによって減らすことができる。
【００６８】
特定の細菌、好ましくは腸球菌種は、腸球菌種内に存在する標的ポリヌクレオチドの増幅に先立って、試料から取り出すことができる。例えば、生体試料は、腸球菌と相互作用するが、生体試料内に存在する他の要素とは相互作用しない作用薬によって官能化される基質に曝露することができる。相互作用は、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、親和力バインディング、又は物理的なトラッピングなどの弱い力などの、幅広い多様な機構を介した可逆的な保持である。有用な作用薬の例として、抗腸球菌抗体によって媒介されるものなどの特異的相互作用、及び非特異的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。細菌との非特異的相互作用を媒介するために用いることができる作用薬の例として、例えば、シリカ、ジルコニア、アルミナビーズ、金などの金属コロイド、及び、メルカプト化学を通じて官能化されている金でコーティングされたシートが挙げられる（パータサラティ（Parthasarathy）、米国特許仮出願第６０／９１３，８１３号、２００７年４月２５日出願、代理人整理番号第６２４７０ＵＳ００２号）。
【００６９】
腸球菌と相互作用する作用薬は、任意の固相物質上に存在することができる。例として、ポリオレフィン、ポリスチレン、ナイロン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、多糖、及びフッ素化ポリマー、並びに、アガロース、ラテックス、セルロース、及びデキストランなどの樹脂が挙げられる。固体物質は、マイクロ流体装置に導入することができる任意の形態、好ましくは粒子状物質（例えば、粒子、ビーズ、マイクロビーズ、マイクロスフェア）又は任意の他の形態（例えば、微小繊維）の形態、を取り得る（パータサラティ（Parthasarathy）、米国特許仮出願第６０／９１３，８１３号、２００７年４月２５日出願、代理人整理番号第６２４７０ＵＳ００２号）。
【００７０】
増幅反応において用いるのに先立ち、生体試料などの試料に存在するポリヌクレオチドは増幅のために調製することができる。増幅のためのポリヌクレオチド調製処置は、当該技術分野において周知であり、日常的に用いられている。ポリヌクレオチドは、生体試料から抽出することができる。抽出は、典型的にはポリヌクレオチドを放出させるために細菌を溶菌することを含む。本明細書では、溶菌は細胞膜の物理的な破壊である。抽出は、標準的な技法及び試薬の使用によって達成することができる。例として、例えば、煮沸、プロテイナーゼを用いた加水分解、超音波への曝露、洗浄剤、強塩基、又はフェノールクロロホルムなどの有機溶媒（リン（Lin）ら、米国特許第５，６２０，８５２号、ケロッグ（Kellogg）ら、米国特許第５，０１０，１８３号）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをバインディングするための条件下で磁性ガラス粒子などの粒子を用い、続けて不純物を除去するために洗浄し、その後バインディングされたポリヌクレオチドを取り出すために設計された洗浄を用いて清浄化されたポリヌクレオチドを得ることによって調製することができる（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ、国際公開第ＷＯ０１／３７２９１Ａ１号）。
【００７１】
標的として本発明の方法で用いられるポリヌクレオチドは、任意の分子量、及び、一本鎖形状、二本鎖形状、環状、プラスミドなどであってもよい。ポリヌクレオチドの種々のタイプは、互いに分離することができる（例えば、ＤＮＡからＲＮＡ、又は一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ）。例えば、少なくとも長さ約１００塩基のポリヌクレオチド、長さ１，０００塩基〜１０，０００塩基のより長い分子、及び、更に最大約３．２メガ塩基の高分子量の核酸を本発明の方法で用いることができる。
【００７２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのポリヌクレオチド増幅は、ポリヌクレオチドの特定のセグメントの酵素増幅のための方法である。増幅は、以下の基本的な工程のサイクルの繰り返しに基づく。二本鎖ポリヌクレオチドの変性、その後、標的ポリヌクレオチドへのプライマーアニーリング、及びポリメラーゼによるプライマー伸長（ミュリス（Mullis）ら、米国特許第４，６８３，１９５号、ミュリス（Mullis）、米国特許第４，６８３，２０２号、及びミュリス（Mullis）ら、米国特許第４，８００，１５９号）。プライマーは、ＤＮＡの対向するストランドをアニールするように設計され、１つのプライマーのポリメラーゼ触媒された伸長産物が他のプライマーにとって鋳型ストランドとして役立つことができるように配置される。増幅プロセスによって、長さがプライマーの５’末端によって定義される別個のポリヌクレオチド断片が、結果として指数関数的に増加することができる。
【００７３】
一般的に、これらの工程は循環工程において達成される。ＤＮＡ増幅において用いられる典型的な循環工程は、２つの標的温度を伴い、それによって、変性、アニーリング、及び伸長がもたらされる。第１の温度は、二本鎖標的ポリヌクレオチドを分離させて一本鎖に分離するのに十分に高い所定の標的変性温度への上昇である。一般的に、循環工程の標的変性温度は、９４℃〜９６℃のように、ほぼ９２℃〜９８℃であり、反応は０秒〜５分間の範囲の時間にわたってこの温度で保たれる。反応混合物の温度は、その後、第２の標的温度まで下げられる。この第２の標的温度によって、プライマー（及び存在する場合にはプローブ（単数又は複数））がＤＮＡの１つのストランドにアニーリング又はハイブリダイズすること、及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長産物の合成を促進することが可能になる。一般的に、循環工程の第２の温度は、５９℃〜６１℃のように、ほぼ５７℃〜６３℃であり、反応は０秒〜１分間の範囲の時間にわたってこの温度で保たれる。この第２の温度は、使用されるプライマー（及び存在する場合にはプローブ（単数又は複数））及び標的ポリヌクレオチドによって大きく異なり得る。これによって１つの循環工程が完了する。次のサイクルは、その後、反応混合物の温度を変性温度まで上げることによって開始する。典型的には、サイクルは、所望の結果を提供するために繰り返され、これは一定量のＤＮＡを産生するため及び／又は増幅された産物を検出するためであり得る。検出における使用に関して、循環工程の数は、試料の性質によって決まる。例えば、試料がポリヌクレオチドの複雑な混合物である場合、検出に十分な標的ポリヌクレオチドを増幅するためにより多くの循環工程が必要とされる場合がある。一般的に、循環工程は、少なくとも約２０回繰り返されるが、４０回、６０回、又は１００回までも繰り返すことができる。当事者によって理解されるように、熱サイクル反応の上記の説明は例示のみのために提供されており、したがって温度、時間及びサイクル数は、熱サイクル反応及び用途の性質によって異なり得る。
【００７４】
任意で、第３の温度も循環工程で用いられる。３つの標的温度を使用することによっても、結果的に変性、アニーリング、及び伸長が得られるが、別個の標的温度が変性、アニーリング、及び伸長のために用いられる。３つの標的温度が用いられる場合、アニーリング温度は一般的に、用途によって４５℃〜６０℃の範囲である。第３の標的温度は、伸長のためであり、典型的には３０秒〜１０分にの範囲の時間にわたって保持され、アニーリング温度〜変性温度の範囲の温度で生じる。
【００７５】
本方法の方法で用いるためのＤＮＡポリメラーゼ及び本発明の組成物は、本発明の方法によるプライマーの効果的な伸長を可能にする。したがって、好ましいポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに沿ってプライマーの伸長を可能にするポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは耐熱性である。耐熱性ポリメラーゼは、熱安定性であるポリメラーゼであり、すなわちこのポリメラーゼは鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖の鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたって上昇した温度に曝露された際にも不可逆的に変性しない。有用な耐熱性ポリメラーゼは周知であり、日常的に用いられている。耐熱性ポリメラーゼはサームス・フラブス（Thermus flavus）、Ｔ．ルバー（T. ruber）、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）、Ｔ．エクアティカス（T. aquaticus）、Ｔ．ラクテウス（T. lacteus）、Ｔ．ルーベンス（T. rubens）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）及びメタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）から分離されている。
【００７６】
ポリメラーゼは、典型的には標的ポリヌクレオチドにアニールされるプライマーの３’末端において合成を開始し、標的ポリヌクレオチドに沿って５’−方向に進む。ポリメラーゼは、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、存在する場合、干渉するアニールされたプローブ（単数又は複数）を加水分解して、合成が完了するまでプローブ（単数又は複数）の部分を剥離させることができる。５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有する好適なポリメラーゼの例として、例えば、Ｔｆｉ、Ｔａｑ、及びＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ（ロシュ（Roche））が挙げられる。他の態様では、プライマー、終止又はプライマー伸長ポリヌクレオチドの劣化を最小化するために、ポリメラーゼは５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないか全く有しない。このエキソヌクレアーゼ活性は、ｐＨ、塩濃度、標的が二本鎖であるか又は一本鎖であるかなどの要素によって決まり得る。これら全ては、当業者に周知である。５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないか全く有しない好適なポリメラーゼの例として、Ｋｌｅｎｔａｑ（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス（St. Louis））が挙げられる。
【００７７】
典型的には、増幅は、異なる配列を有することができる１つ以上の標的ポリヌクレオチドを、増幅反応を実行するための反応成分を含有する「マスターミックス」と混合すること、及びこの反応混合物を標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする温度条件にさらすことを伴う。マスターミックス内の反応成分は、反応混合物のｐＨを調節するバッファ、マグネシウムイオン、増幅産物の合成に必要なエネルギー及びヌクレオシドを提供する１つ以上の天然ヌクレオチド（しばしば等しい濃度で存在する、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン又はウラシル）、ポリヌクレオチド合成の開始を容易にするためにターゲットにバインディングするプライマー対、合成されている相補的なストランドにヌクレオチドを加えるポリメラーゼ、及び任意で、１つ以上のプローブを含むことができる。当業者は、本発明の方法を実行するために標的ポリヌクレオチドの存在が要求されないが、首尾よい増幅反応が標的ポリヌクレオチドが不在の場合に発生しないことを理解するであろう。
【００７８】
増幅された産物の存否は判定されるか、又は産物の量が測定される。増幅された産物を検出することは、当該技術分野において周知であり、かつ日常的に用いられている標準的な方法によって遂行することができる。検出することは、例えば、複数の増幅サイクルが実行された後、又はそれぞれの増幅サイクルの間（典型的にはリアルタイムとして言及される）に起こる可能性がある。複数の増幅サイクルが実行された後の増幅産物の検出は、例えば、増幅産物をゲル上に分散すること及び予期された増幅産物が存在しているか否かを判定することによって容易に達成される。リアルタイム検出又は増幅産物の定量化を容易にするために、増幅反応において用いられる１つ以上のプライマー及び／又はプローブはラべリングすることができ、増幅産物が存在していることを示す検出可能な信号を発生させるための種々のフォーマットが利用可能である。最も便利なラベルは典型的には、ドナーフルオロフォアラベル、アクセプタフルオロフォアラベル、フルオロフォア、クエンチャー、及びそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない種々のフォーマットで用いられる蛍光剤である。種々のフォーマットを用いるアッセイの種類は、ラべリングされている１つ以上のプライマー（例えば、スコーピオンプライマー、アンプリフルーアプライマー）、ラべリングされている１つ以上のプローブ（例えば、隣接プローブ、Ｔａｑｍａｎプローブ、点灯プローブ、分子指標）又はそれらの組み合わせを含むことができる。当業者は、これらの既知のフォーマットに加えて、新しい種類のフォーマットが日常的に開示されることを理解するであろう。本発明は、方法の種類又は増幅された産物を検出するために用いられるプローブ及び／若しくはプライマーの種類によって限定されない。適切なラベル（例えば、異なるフルオロフォア）を用いて、いくつかの異なるプライマー対（及び、任意で、存在する場合はプローブ）の結果を、単一の反応で結合（多重化）することができる。
【００７９】
ラべリングされたプライマー及び／又はプローブを用いる検出の代替として、増幅産物は蛍光ＤＮＡバインディング染料などのポリヌクレオチドバインディング染料を用いて検出することができる。例として、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ又はＳＹＢＲＧｏｌｄ（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））が挙げられる。二本鎖の増幅産物との相互作用の際、そのようなポリヌクレオチドバインディング染料は、好適な波長の光で励起した後、蛍光信号を放出する。ポリヌクレオチド介在染料などのポリヌクレオチドバインディング染料も用いることができる。
【００８０】
対照は、増幅反応が実行されるときに含むことができる。対照標的ポリヌクレオチドは、例えば、対照プライマー及び対照プローブを用いて、陽性対照試料（例えば、ｖａｎＡ又はｖａｎＢ以外の標的ポリヌクレオチド）から増幅することができる。陽性対照試料は、標的ｖａｎＡ又はｖａｎＢポリヌクレオチドを増幅するために用いることもできる。そのような対照は、内部で（例えば、それぞれの増幅反応内で）又は別個の試料内で対象の試料と並行して増幅することができる。それぞれの実行は、例えば、標的ｖａｎＡ又はｖａｎＢポリヌクレオチドを欠く陰性対照も含むことができる。
【００８１】
本発明は増幅された産物の増幅及び検出を遂行するために用いられる装置に限定されないことを理解されたい。例えば、好適な装置は従来の増幅装置、例えばＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）リアルタイムＰＣＤシステム（ロシュ（Roche））（ユタ大学研究財団（University of Utah Research Foundation）、国際公開第ＷＯ９７／４６７０７号、ＷＯ９７／４６７１４号、ＷＯ９７／４６７１２号）、ＭＸ３００５ｐ（ストラタジーン（Stratagene）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla））、及びバイオ・ラッド（Bio-Rad）から入手可能な増幅装置を含むことができる。本発明は、マイクロ流体装置と接続して実施されることが好ましい。「マイクロ流体」は、５００μｍ未満、典型的には０．１μｍ〜５００μｍの少なくとも１つの内部の断面の寸法、例えば、奥行、横幅、長さ、直径などを有する１つ以上の液体通路、チャンバ、又は導管を有する装置を指す。典型的には、マイクロ流体装置は、複数のチャンバ（例えば、増幅反応チャンバ、充填チャンバなど）を備え、それぞれのチャンバは試料を含有するための体積を画定する。潜在的に好適なマイクロ流体装置のいくつかの例は、米国特許出願公開第２００２／００６４８８５号（ベディンガム（Bedingham）ら）、ＵＳ２００２／００４８５３３号（ベディンガムら）、ＵＳ２００２／００４７００３号（ベディンガムら）、及びＵＳ２００３／１３８７７９号（パータサラティ（Parthasarathy）ら）、並びに米国特許第６，６２７，１５９号（ベディンガムら）、同第６，７２０，１８７号（ベディンガムら）、同第６，７３４，４０１号（ベディンガムら）、同第６，８１４，９３５号（ハームズ（Harms）ら）、同第６，９８７，２５３号（ベディンガムら）、同第７，０２６，１６８号（ベディンガムら）及び同第７，１６４，１０７号（ベディンガムら）に記載されている。
【００８２】
本発明は、ポリヌクレオチドを分離、好ましくは、清浄化するための方法も含む。本発明のこの態様の方法は、典型的には、一本鎖ポリヌクレオチドを含有する混合物を提供すること、結果としてハイブリッドを得るために、一本鎖ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションのための好適な条件下で本発明のオリゴヌクレオチドに混合物を曝露すること、及びそのハイブリッドをハイブリダイズされていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離することを含む。そのような方法は、薬剤耐性腸球菌内に存在する標的ポリヌクレオチドの増幅に先立ち試料を調製するために用いることができる。
【００８３】
混合物は、試料、好ましくは生体試料から獲得することができる。典型的には、薬剤耐性菌、好ましくは、腸球菌を含有することができる。本明細書で上記に記載したように、試料は抽出によって分離のために調製することができる。混合物内のポリヌクレオチドは、不純（例えば、他の細胞物質及び／又は固形のくずが存在する）、部分的に清浄、又は清浄化されている場合がある。混合物内のポリヌクレオチドは、周知かつ日常的な方法を用いて変性することができる。そのような方法の例として、例えば、加熱、又はアルカリ性条件への曝露が挙げられる。
【００８４】
一本鎖ポリヌクレオチドの混合物は、オリゴヌクレオチド及び相補的な一本鎖ポリヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションのための好適な条件下で本発明のオリゴヌクレオチドに曝露される。オリゴヌクレオチドは、典型的にはラベル、好ましくは親和力ラベルを含む。特に有用な従来のハイブリダイゼーションフォーマットは、オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定されるフォーマット（固相ハイブリダイゼーション）及びポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの両方）が全て溶解しているフォーマット（溶液ハイブリダイゼーション）を含む。
【００８５】
固相ハイブリダイゼーションフォーマットにおいて、オリゴヌクレオチドは典型的には、ハイブリダイゼーションに先立ち固相物質に付着させられる。溶液ハイブリダイゼーションフォーマットにおいて、オリゴヌクレオチドは典型的には、ハイブリダイゼーションの後、固相物質に付着させられる。両方のフォーマットにおいて、付着は、オリゴヌクレオチドに付着させられる、ラベル、好ましくは親和力ラベルによって媒介される。有用な固相物質の例として、例えば、ポリオレフィン、ポリスチレン、ナイロン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、多糖、及びフッ素化ポリマー、並びに、アガロース、ラテックス、セルロース、及びデキストランなどの樹脂が挙げられる。固形物は、マイクロ流体装置に導入することができる任意の形態、好ましくは粒子状物質（例えば、粒子、ビーズ、マイクロビーズ、マイクロスフェア）又は任意の他の形態（例えば、微小繊維）を取り得る（パータサラティ（Parthasarathy）、米国特許仮出願第６０／９１３，８１３号、２００７年４月２５日出願、代理人整理番号第６２４７０ＵＳ００２号）。
【００８６】
ハイブリダイゼーションは、ラべリングされたオリゴヌクレオチドを実質的に相補的な、好ましくは相補的な、混合物に存在する一本鎖ポリヌクレオチドに選択的にバインディングするのに好適な条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実行される。ハイブリダイゼーション反応及びプローブ合成のための一般的な方法は、分子クローニング（Molecular Cloning）（Ｔ．マニアティス（T. Maniatis）、Ｅ．フリッチュ（E. Fritsch）及びＪ．サンブルック（J. Sambrook）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８２年）に開示されている。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔの試薬などのハイブリダイゼーションバッファの使用、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、及びブロック試薬１００μｇ／ｍＬサケ精子を含む。ハイブリダイゼーションは、６８℃で少なくとも２時間発生することが可能である場合がある。ハイブリダイゼーション（及び、適切である場合、ラべリングされたオリゴヌクレオチドの付着）後、ハイブリダイズされていないポリヌクレオチド、及び存在し得る任意の他の物質は、室温で数回、２ｘＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳを含有する溶液で洗浄することによって除去することができる。任意で、分離されたポリヌクレオチドは、分離されたポリペプチドを放出させるためにハイブリッドを変性すること、及びバインディングされたオリゴヌクレオチド及び固体支持体を除去することによって清浄化することができる。
【００８７】
キット
本発明は、キットを提供し、当該キットは、例えば、プライマー対などの本発明のオリゴヌクレオチド、及び任意でプローブを含むことができる。本発明のキット内に含まれ得る他の構成要素は、マスターミックスなどの従来の試薬、固相支持体、ハイブリダイゼーション溶液、外部の陽性対照及び陰性対照などを含むことができる。
【００８８】
キットは典型的には、キットの内容物を収容するのに用いる１つ以上の物理的構造体を意味する梱包物質を含む。梱包物質は、周知の方法で組み立てられ、好ましくは、無菌の、汚染物質を含まない環境を提供することができる。梱包物質は、キットの内容を示すマーキングを有することができる。更に、キットは、キット内の物質をいかに用いるかを示す指示を備えることができる。本明細書で使用するとき、「梱包」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、金属箔などの固体マトリックス又は固体物質を意味する。
【００８９】
「指示」は、典型的には、試料調製の条件、増幅条件などを含む、本発明の種々の方法を記載する明確な表現を含む。
【００９０】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量、及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００９１】
（実施例１）
遺伝子特異プライマー及びプローブを用いる、核酸試料におけるｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の検出
グリコペプチド耐性遺伝子を同定するための、核酸ベースの検出ストラテジーは、試料がグリコペプチド抗生物質による処置を生き延びることができる細菌を含有する試料であるか否かを見分けるためのアッセイにおいて有用であり得る。この実施例において、プライマー及びプローブは、エンテロコッカス・ヘシュウム（ＡＴＣＣ ７００２２１、ヴァージニア州マナッサス（Manassas））、及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）としても既知のエンテロコッカス・フィカリス（ＡＴＣＣ ７００８０２、ヴァージニア州マナッサス（Manassas））のｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を検出するために用いられた。
【００９２】
ＶＲＥは、血液寒天培地に縞目上に塗布され、３７℃で２０時間インキュベートされた。細胞懸濁液は、ＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に、１×１０８コロニー形成単位毎ミリリットル（ＣＦＵ／ｍＬ）にほぼ相当する０．５のマクファーランド（McFarland）標準になるように希釈することによって、生長培地（fresh growth）から準備された。１００ミリリットルのこの細胞懸濁液は、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＤＮＡ分離キットＩＩＩ（細菌、菌類）キットを用いてＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣシステム（ロシュ（Roche）（インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis））から入手した器具及び試薬）で製造業者の指示に基づき抽出及び分離された。
【００９３】
プライマー及びプローブは、インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）（アイオワ州コーラルヴィル（Coralville））によって合成された。ｖａｎＡプローブ配列、５’ＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＡ（配列番号３）は、６−カルボキシ−４’，５−ジクロロ−２’，７’−ジメソキシフルオレセイン（ＪＯＥ）及びＢＨＱ（ブラック・ホール・クエンチャー（BLACK HOLE QUENCHER）、インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）、アイオワ州コーラルヴィル）によって、それぞれ５’−及び３’−位置において二重標識された。ｖａｎＢプローブ配列、５’ＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡ（配列番号６）は、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びＢＨＱによって、それぞれ５’−及び３’−位置において二重標識された。プライマー配列及びプローブ配列は表１に列挙されている。
【００９４】
【表１】
【００９５】
それぞれの試料は、プライマー、プローブ及び酵素の最適化された以下の濃度、並びに熱サイクルプロトコルを用いて、ｖａｎＡ及びｖａｎＢ遺伝子のためのリアルタイムＰＣＲ増幅に曝露された。ＰＣＲ増幅は、５マイクロリットル（μＬ）の試料及び５μＬの以下の混合物を含有する全体積１０μＬで実行することができる：２つのプライマー（それぞれ１０マイクロモル（μＭ）で０．５μＬ）、プローブ（２μＭで１μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５μＭで２μＬ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（１０ｘで１ｍＬ、ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス）。増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Roche））において、以下のプロトコルを用いて実行された。９５℃で３０秒（変性）；９５℃で０秒（２０℃／秒勾配）、６０℃で２０秒（２０℃／秒勾配、単一の獲得）の４５ＰＣＲサイクル。
【００９６】
結果は、ロシュ（Roche）のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０リアルタイムＰＣＲシステムによって提供されるソフトウェアを用いて分析された。プライマーは、ｖａｎＡ及びｖａｎＢ遺伝子を表２及び表３に示されるこの実施例に提示される条件下で首尾よく増幅した。
【００９７】
【表２】
【００９８】
これらの結果は、ｖａｎＡ遺伝子が、配列番号１、２、及び３のプライマー及びプローブを用いて首尾よく増幅及び検出されたことを示す。
【００９９】
【表３】
【０１００】
これらの結果は、ｖａｎＢ遺伝子が、配列番号４〜６によって首尾よく増幅及び検出されたことを示す。
【０１０１】
いくつかの腸球菌の参照ストレインは、これらの既知のバンコマイシン耐性プロファイルが細菌の染色体におけるｖａｎＡ又はｖａｎＢ遺伝子の存在に関連しているか否かを判定するために試験された。特に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（ヴァージニア州マナッサス（Manassas））から購入した腸球菌分離株は、血液寒天培地に縞目上に塗布され、３７℃で２０時間インキュベートされた。細胞懸濁液は、ＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に、ほぼ１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当する０．５のマクファーランド（McFarland）標準になるように希釈することによって、生長培地（fresh growth）から調製された。１００マイクロリットルのこの細胞懸濁液は、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＤＮＡ分離キットＩＩＩ（細菌、菌類）キットを用いてＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣシステム（ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis）から入手した器具及び試薬）で製造業者の指示に基づき抽出及び分離された。
【０１０２】
それぞれの試料は、プライマー、プローブ及び酵素の最適化された以下の濃度、並びに熱サイクルプロトコルを用いて、ｖａｎ遺伝子Ａ及びｖａｎＢ遺伝子のためのリアルタイムＰＣＲ増幅に曝露された。ＰＣＲ増幅は、５μＬの試料及び５μＬの以下の混合物を含有する全体積１０μＬで実行することができる：２つのプライマー（それぞれ１０μＭで０．５μＬ）、プローブ（２μＭで１μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭで２μＬ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（１０×で１μＬ、ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス）。増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Roche））において、以下のプロトコルを用いて実行された。９５℃で３０秒（変性）；９５℃で０秒（２０℃／秒勾配）、６０℃で２０秒（２０℃／秒勾配、単一の獲得）の４５ＰＣＲサイクル。結果は表４において見ることができる。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
これらの結果は、配列番号１〜６は、腸球菌の染色体内のｖａｎ遺伝子Ａ及びｖａｎＢ遺伝子に特異的であり、非ｖａｎＡ配列又は非ｖａｎＢ配列にハイブリダイズしないことを示す。
【０１０５】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び出版物、並びに電子的に存在するもの（例えば、及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）などに登録されているヌクレオチド配列、並びにスイスプロット（SwissProt）、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどに登録されているアミノ酸配列、並びにジェンバンク（GenBank）及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）の注釈つきコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参考として組み込まれる。本出願の開示と本明細書に参照として援用される任意の文書の開示（複数可）との間にいずれの不一致が認められる場合にも、本出願の開示が優先される。前述の詳細な説明及び実施例は理解を明確化するためにのみ提示されている。それらから無用の限定を解するべきでない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきではない。当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に包含されるからである。
【０１０６】
全ての見出しは読者の利便性のためであって、特記しない場合は、見出しの後に続く文面の意味を制限するために用いているのではない。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年８月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／９６４，４９９号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
腸球菌属のメンバーは、自然、動物、及び人間に存在するグラム陽性球菌である。腸球菌は、人間の正常な胃腸管及び生殖器官の生理的寄生菌の一部である。既知の種のうち、大腸レンサ球菌（８０〜９０％）及びエンテロコッカス・フェシウム（５％〜１０％）が人間において最も優勢である。腸球菌は、典型的には、人間において病原性ではない。しかしながら、これらは、増大する多剤耐性レベルを示しており（カウフホルト（Kaufhold）及びクライン（Klein）、１９９５年、細菌学中央報（Zentralblatt. Fuer. Bakterilogie.）、２８２巻（４号）、５０７〜５１８頁；スヴェック（Svec）ら、１９９６年、疫学・細菌学・免疫学（Epidemiologie Mikrobiologie Imunologie）、４５巻、１５３〜１５７頁）、院内感染の重要な原因として認識が高まってきている。大腸レンサ球菌感染は、尿路感染症（ＵＴＩ）、菌血症、心内膜炎、並びに創傷感染及び腹部−骨盤感染を含み、全てのＵＴＩの１６％、及び全ての菌血症の８％に達する。
【０００３】
バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は、二番目に一般的な院内感染の原因として認識されており、それを上回るのは大腸菌のみである。耐性は、染色体を介していてもよく（固有）、又はプラスミド媒介性若しくはトランスポゾン媒介性（獲得）であってもよい。ＶＲＥは、グラム陽性細菌に対して有効な「最後の手段」の抗生物質とみなされているバンコマイシンを含む、ほぼ全ての入手可能な抗生物質に対する耐性を特徴とする。医師にとって処置選択肢は限られており、ストラテジーには、抗菌剤の組み合わせ又は新しい、実証されていない化合物の使用が含まれる。患者は症状を示すことなくＶＲＥに定着され保菌している可能性があり、主要な定着場所は、肛門、腋窩、便、会陰、臍、創傷、フォーリーカテーテル、及び結腸瘻造設部である。
【０００４】
高いレベルのバンコマイシン耐性を与える遺伝子である大腸レンサ球菌プラスミド産（plasmid-born）ｖａｎＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで黄色ブドウ球菌などのグラム陽性の微生物に伝わる可能性がある（レクレルク（Leclercq）ら、１９８９年、抗菌薬及び化学療法（Antimicrob. Agents Chemother.）３３巻、１０〜１５頁；ノーブル（Noble）ら、１９９２年、ＦＥＭＳ微生物学レター（FEMS Microbiology Letters）、７２巻、１９５〜１９８頁）黄色ブドウ球菌、連鎖球菌種、エッゲルセラ・レンタ（Eggerrthella lenta）、及びクロストリジウム・イノキュウムの臨床分離株におけるバンコマイシン耐性が報告されており、バンコマイシン耐性は、バンコマイシン耐性腸球菌から獲得された可能性が最も高かった（疾病対策予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）、２００２年、罹患率及び死亡率週報（Morb. Mortal. Wkly. Rep.）、５１巻、５６５〜５６７頁；疾病対策予防センター、２００２年、罹患率及び死亡率週報、５１巻、９０２頁；ヴァイゲル（Weigel）ら、２００３年、サイエンス（Science）、３０２巻、１５６９〜１５７１頁；ヴァイゲルら、２００７年、抗菌薬及び化学療法（Antimicrob. Agents Chemother.）、５１巻、２３１〜２３８頁；メヴィウス（Mevius）ら、１９９８年、抗菌薬及び化学療法ジャーナル（J. Antimicrob. Chemother.）、４２巻、２７５〜２７６頁；ポヤルト（Poyart）ら、１９９７年、抗菌薬及び化学療法（Antimicrob. Agents Chemother.）、４１巻、２４〜２９頁；スティニア（Stinear）ら、２００１年、ランセット（Lancet）、３５７巻、８５５〜８５６頁）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
薬剤耐性菌の初期の同定及び治療的介入を目的とする診断ツールへの継続的な需要がある。
【０００６】
本発明は、生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法を含む。例えば、本方法は、増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅することを含むことができ、ここで、標的ポリヌクレオチドは、細菌におけるバンコマイシン耐性と関連する。増幅することは少なくとも１つの循環工程を含んでもよく、ここで、循環工程は増幅産物を結果として得るために好適な条件下で生体試料を第１のプライマー及び第２のプライマーと接触させること、及び、増幅された産物とプローブをハイブリダイズさせるために好適な条件下で増幅産物をプローブと接触させることを含む。プローブのＴＭは、第１のプライマーのＴＭ及び第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。増幅された産物が検出され、ここで、増幅された産物の存在は生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す。
【０００７】
標的ポリヌクレオチドは、ｖａｎＡポリヌクレオチド、例えば配列番号７、又はその一部を含むポリヌクレオチドであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを増幅するために用いることができるプライマーの例は、例えば、配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のプライマー、及び配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含み、ここで、プライマー対は配列番号７の一部、好ましくは配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。本方法において有用なプローブは、配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有する、及び／又は配列番号７と実質的に相補的なプローブを含む。
【０００８】
標的ポリヌクレオチドは、ｖａｎＢポリヌクレオチド、例えば配列番号８、又はその一部を含むポリヌクレオチドであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを増幅するために用いることができるプライマーの例は、例えば、配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のプライマー、及び配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含み、ここで、プライマー対は配列番号８の一部、好ましくは配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。本方法において有用なプローブは、配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有する、及び／又は配列番号８と実質的に相補的なプローブを含む。
【０００９】
本方法は、混合物を形成するために生体試料をプローブ、第１のプライマー、及び第２のプライマーと接触させることを含んでもよく、ここで、プライマーは細菌におけるバンコマイシンに対する薬剤耐性と関連する標的ポリヌクレオチドを増幅することができ、ここで、プローブは標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。プローブのＴＭは、第１のプライマー及び第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い薬剤耐性に関連するポリヌクレオチドが生体試料内に存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に混合物を曝露する。増幅された産物が検出され、ここで、増幅された産物の存在は生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す。
【００１０】
本方法は、結果として増幅産物を得るために生体試料内に存在する標的ヌクレオチドを増幅させることを含み、ここで、生体試料は第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマー、第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマー、又はそれらの組み合わせと、結果として増幅産物を得るための好適な条件下で、接触させられる。第１のｖａｎＡプライマーは配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＡプライマーは配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。第１のｖａｎＢプライマーは配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＢプライマーは配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。増幅された産物は検出され、ここで、増幅された産物の存在は、生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す。
【００１１】
本方法は、生体試料を、混合物を形成するために第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマーと、混合物を形成するために第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマーと、又はそれらの組み合わせと、接触させることを含んでもよい。第１のｖａｎＡプライマーは配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＡプライマーは配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。第１のｖａｎＢプライマーは配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、第２のｖａｎＢプライマーは配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、プライマー対は配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。混合物は、ｖａｎＡポリヌクレオチド又はｖａｎＢポリヌクレオチドが生体試料内に存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に曝露され、増幅された産物の不在が検出され、ここで、増幅された産物の不在は、生体試料内の薬剤耐性菌の不在を示す。
【００１２】
いくつかの態様では、本方法は、生体試料をプローブと接触させることを更に含み、ここで、プローブのＴＭは、第１のプライマーのＴＭ及び第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。プローブは、フルオロフォア及びクエンチャーを含んでもよい。本方法は、第２のプローブの使用を更に含むこともでき、ここで、第２のプローブは、本方法で用いられるプライマーのＴＭより少なくとも８℃高いＴＭを有する。２つのプローブが用いられる場合、１つのプローブはドナーフルオロフォアを含んでもよく、第２のプローブはアクセプタフルオロフォアを含んでもよい。
【００１３】
薬剤耐性菌は、グラム陽性細菌、例えば、ブドウ球菌属（黄色ブドウ球菌など）又は腸球菌属（大腸レンサ球菌、Ｅ．フェシウム、Ｅ．アビウム、Ｅ．ガリナルム、又はＥ．デュランスなど）のメンバーであってもよい。本発明の方法は、生体試料を獲得することを更に含むことができる。生体試料は薬剤耐性菌による感染が疑われる個体由来であってもよく、生体試料は糞便物質を含んでもよい。増幅された産物の存否を判断することは、それぞれの循環工程後に実行することができる。
【００１４】
本発明は、ポリヌクレオチドを分離するための方法も提供する。本発明は、一本鎖ポリヌクレオチドの混合物を提供すること、及び、ハイブリッドを結果として得るために一本鎖ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、混合物をオリゴヌクレオチドに曝露することを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、配列番号１との少なくとも約８０％同一性、配列番号２との少なくとも約８０％同一性、配列番号３との少なくとも約８０％同一性、配列番号４との少なくとも約８０％同一性、配列番号５との少なくとも約８０％同一性、又は配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有する配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。ハイブリッドはその後洗浄されて、汚染を除去してもよい。オリゴヌクレオチドは親和性ラベルを含むことができ、オリゴヌクレオチドは曝露前又は後に固相物質に付着することができる。混合物は生体試料から獲得することができ、本方法は、結果として一本鎖ヌクレオチドを得るために、生体試料内に存在するポリヌクレオチドを変性することを更に含むことができる。
【００１５】
本発明には、キットも含まれる。キットは、梱包物質、第１のｖａｎＡプライマー、第２のｖａｎＡプライマー、及びプローブを備えることができ、ここで、プローブのＴＭは、第１及び第２のｖａｎＡプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。プローブは、配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、配列番号７にハイブリダイズすることができる。第１のプライマーは配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、第２のプライマーは配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、プライマー対は配列番号７の４６８〜７５１ヌクレオチドを増幅する。
【００１６】
キットは、梱包物質、第１のｖａｎＢプライマー、第２のｖａｎＢプライマー、及びプローブを備えることができ、ここで、プローブのＴＭは、第１及び第２のｖａｎＢプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い。プローブは、配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、配列番号８にハイブリダイズすることができる。第１のプライマーは配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、第２のプライマーは配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、プライマー対は配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する。
【００１７】
プローブは、フルオロフォア及びクエンチャーを含むことができる。
【００１８】
本発明はまた、分離されたポリヌクレオチドを含み、これらには例えば、配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、当該ポリヌクレオチドは配列番号２と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）、配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、当該ポリヌクレオチドは配列番号１と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）、配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、約１３９ヌクレオチドの増幅産物を結果として得るために当該ポリヌクレオチドが配列番号５と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）、配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列（ここで、当該ポリヌクレオチドは配列番号４と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する）が挙げられる。
【００１９】
定義
本明細書において使われる際、用語「ポリヌクレオチド」は、リボンヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかである、任意の長さの高分子型のヌクレオチドを指し、二本鎖及び一本鎖の両方のＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、例えばコード領域、制御領域などの非コード領域を含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から直接取得するか、又は組換え技法、酵素の技法、又は化学的技法の助けを用いて調製してもよい。ポリヌクレオチドは、トポロジーにおいて直鎖又は環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター若しくはクローニングベクターなどのベクターの一部、又は断片であることができる。「オリゴヌクレオチド」は、本発明のポリヌクレオチド、典型的にはプライマー及び／又はプローブを指す。
【００２０】
「標的ポリヌクレオチド」は、本明細書において使われる際、増幅が所望される目的のポリヌクレオチド配列を含有する。標的配列は、実際の配列に関して既知であっても既知でなくてもよい。
【００２１】
「コード領域」は、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列であり、適切な制御配列の管理下におかれた場合、コード化されたポリペプチドを発現する。コード領域の境界は、通常、５’末端にある翻訳開始コドン及び３’末端にある翻訳終止コドンによって決定される。「制御配列」は、そのヌクレオチド配列が操作可能に連結されているコード配列の発現を制御するヌクレオチド配列である。制御配列の非限定的な例は、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳終止部位、及び転写ターミネーターを含む。用語「操作可能に連結される」は、構成要素が意図されたように機能することを可能にする関係にあるような、構成要素の並置を指す。制御配列は、コード領域の発現が制御配列と両立する条件下で達成されるように、接合される際に、コード領域に「操作可能に連結される」。
【００２２】
「プライマー」は、本明細書において使われる際、標的ポリヌクレオチドの一部に相補的なオリゴヌクレオチドであり、標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、増幅反応及び増幅産物の合成の開始点として用いることができる。「プライマー対」は、１つの増幅反応に共に用いることができる２つのプライマーを指す。「ｖａｎＡプライマー」及び「ｖａｎＢプライマー」は、ｖａｎＡ又はｖａｎＢポリヌクレオチドをそれぞれハイブリダイズし、適切な条件下で増幅を開始することができるプライマー対を指す。「プローブ」は、本明細書において使われる際、２つのプライマーを用いて形成される増幅産物の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドである。「ｖａｎＡプローブ」及び「ｖａｎＢプローブ」は、ｖａｎＡプライマー又はｖａｎＢプライマーを用いることから生じた増幅産物をハイブリダイズするプローブをそれぞれ指す。
【００２３】
用語「相補体」及び「相補的」は、本明細書において使われる際、ポリヌクレオチドの１つのストランド上のアデニンが第２のポリヌクレオチドのストランド上のチミン又はウラシルに塩基対合し、ポリヌクレオチドの１つのストランド上のシトシンが第２のポリヌクレオチドのストランド上のグアニンに塩基対合する場合に、２つの一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、プライマー及び標的ポリヌクレオチド）が互いに塩基対合できる能力を指す。２つのポリヌクレオチドは、１つのポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列と塩基対合できる場合に、互いに相補的である。例えば、５’−ＡＴＧＣ及び５’−ＧＣＡＴは相補的である。用語「実質的な相補体（substantial complement）」、「実質的に相補的（substantially complementary）」、及び「実質的な相補性（substantial complementarity）」は、本明細書において使われる際、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で特定のポリヌクレオチドを選択的にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、数多くの、ｐＨ、塩及び温度の条件下で起こり得る。ｐＨは、６〜９で、好ましくは６．８〜８．５で変動し得る。塩濃度は０．１５Ｍナトリウム〜０．９Ｍナトリウムで変動する場合があり、他のカチオンは、ナトリウムについて指定されているイオン強度に等しいイオン強度である限り、用いることができる。ハイブリダイゼーション反応温度は、３０℃〜８０℃、好ましくは４５℃〜７０℃で変動する場合がある。更に、室温で、又は室温付近などの、低温で特定のハイブリダイゼーションを促進するために、他の化合物をハイブリダイゼーション反応に加えることができる。温度要件を下げるために想到される化合物には、ホルムアミドがある。したがって、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが当該ポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間で発生する場合、典型的には第２のポリヌクレオチドに「実質的に相補的」である。本明細書において使われる際、「特定のハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における２つのポリヌクレオチド間でのハイブリダイゼーションを指す。
【００２４】
「同一性（identity）」は、プライマー又はプローブなどのオリゴヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド又は増幅産物の少なくとも一部との間の配列類似性を指す。類似性は、２つのポリヌクレオチド（すなわち、プライマー又はプローブのヌクレオチド配列及び参照ヌクレオチド配列）の残渣をそれらの配列の長さに沿った同一のヌクレオチドの数を最適化するために整列することによって決定される。配列の一方又は両方のギャップは、共有されるヌクレオチドの数を最適化するための整列を行う際に許容されるが、それぞれの配列内のヌクレオチドはそれでもなお、それらの適切な順序のままでいなければならない。配列類似性は、典型的には少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、少なくとも約９０％同一性、又は少なくとも約９５％同一性である。配列類似性は、例えば、ＧＣＧＦａｓｔＡ（ジェネティクス・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group）、ウィスコンシン州マディソン（Madison））、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ４．５（コダック／ＩＢＩソフトウェア・パッケージ（Kodak/IBI software package））などのシークエンス技法又は当該技術分野において既知の、他の好適なシークエンシングプログラム若しくは方法を用いて、決定することができる。好ましくは、プライマーと標的ポリヌクレオチドとの間、又はプローブと増幅産物との間の配列類似性は、タツソヴァ（Tatusova）ら（１９９９年、ＦＥＭＳ微生物学レター（FEMS Microbiol Lett.）、１７４巻、２４７〜２５０頁）に記述されるように、及びワールド・ワイド・ウェブ（World Wide Web）、例えば米国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって維持されるインターネットサイトを通じて入手可能な、ＢＬＡＳＴ２探索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを用いて決定される。好ましくは、ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ＝１、ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ＝−２、ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝２、ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝１１、を含む、全てのＢＬＡＳＴ２探索パラメーターの初期値が用いられ、任意でｆｉｌｔｅｒをオンにする。ＢＬＡＳＴ探索アルゴリズムを用いる２つのヌクレオチド配列の比較において、配列類似性は「同一性」として示される。
【００２５】
「ラベル（label）」は、オリゴヌクレオチドに添付されるか（共有結合又は非共有結合）又は添付されることが可能な部分を指し、これらは、オリゴヌクレオチドについての情報（例えば、オリゴヌクレオチドについての記述的又は同定情報）又はラベル付けされたオリゴヌクレオチドが相互作用する（例えば、ハイブリダイズする）別のポリヌクレオチドについての情報を提供するか又は提供可能である。ラベルを用いて、検出可能な（及び任意で定量化可能な）信号を提供することができる。ラベルを用いて、オリゴヌクレオチドを表面に添付することもできる。
【００２６】
「フルオロフォア」は、より短い波長の光を吸収した後に特定の波長の光を放射することができる部分である。特定のフルオロフォアによって放射される光の波長は、そのフルオロフォアに特徴的である。したがって、特定のフルオロフォアは、より短い波長の光によってフルオロフォアが励起した後の適切な光によって検出することができる。
【００２７】
用語「クエンチャー（quencher）」は、本明細書において使われる際、フルオロフォアから放射されるエネルギーを吸収する、あるいはそうでなければ、蛍光染料が光を放射する能力に干渉する部分を指す。クエンチャーは、フルオロフォアから吸収したエネルギーを、そのクエンチャーに特徴的な信号で再放射することができ、したがってクエンチャーはフルオロフォア（蛍光クエンチャー）として振る舞うこともできる。この現象は、通常、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）として既知である。あるいは、クエンチャーはフルオロフォアから吸収したエネルギーを熱として拡散することもできる（非蛍光クエンチャー）。
【００２８】
「生体試料」は、真核生物源又は原核生物源から獲得された試料を指す。真核生物源の例は、ヒト又はネズミ科のメンバー（ラット又はマウスなどのネズミ科の動物）を含む。原核生物源の例は、腸球菌を含む。生体試料は、例えば、単一の細胞の形態、組織の形態、又は液体の形態を取ることができる。細胞又は組織は、インビトロ培養由来とすることができる。
【００２９】
ハイブリダイゼーション、ストランド伸長などのような、あるイベントが発生することを「可能にする」条件、又は「好適な」条件は、そのようなイベントが発生するのを妨げない条件である。したがって、これらの条件は、そのイベントを可能にし、増強し、容易にし、かつ／又は促す。当該技術分野において既知であり本明細書に記載されるそのような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、及び緩衝条件によって決まり得る。これらの条件は、ハイブリダイゼーション、分裂、又はストランド伸長などの、いずれのイベントが所望されるかによっても決まり得る。
【００３０】
「分離された」ポリヌクレオチドは、その自然環境から取り出されたポリヌクレオチドを指す。「精製された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドと天然で関連している他の成分から、少なくとも約６０％フリー、好ましくは少なくとも約７５％フリー、最も好ましくは少なくとも約９０％フリーであるポリヌクレオチドである。
【００３１】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況において、他の実施形態も好まれる可能性がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００３２】
用語「含む」及びこの変形は、これらの用語が現れる説明及び請求項において制限する意味を持たない。
【００３３】
特に指定されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」は、同じ意味で使用され、「１つ以上」を意味する。
【００３４】
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数（例えば１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、など）が包含される。
【００３５】
用語「及び／又は」は、列挙した要素の１つ又は全て、あるいは列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００３６】
本発明の上述の「課題を解決するための手段」は、本発明の開示される各実施形態又は全ての実施を記載することを目的としていない。以下の説明により、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願のいくつかの箇所で、実施例の一覧として説明を提供するが、実施例は各種組み合わせにて使用することが可能である。いずれの場合にも、記載した一覧は、代表的な群としてのみ役立つものであり、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ｖａｎＡコード領域のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図１Ｂ】ｖａｎＢコード領域のヌクレオチド配列（配列番号８）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、薬剤耐性原核細菌に特有のポリヌクレオチドを検出するための方法を含む。これらの細菌は、ｖａｎＡ又はｖａｎＢコード領域を有することによって薬剤耐性である。好ましくは、原核細菌は腸球菌属（本明細書では腸球菌種又は腸球菌と呼ばれる）のメンバー、例えば、大腸レンサ球菌、Ｅ．フェシウム、Ｅ．アビウム、Ｅ．ガリナルム、又はＥ．デュランス、より好ましくは、大腸レンサ球菌又はＥ．フェシウムであり、最も好ましくは、大腸レンサ球菌である。薬剤耐性菌の他の例として、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌種、及び連鎖球菌種が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明は、増幅技法並びにプライマー及びプローブなどのオリゴヌクレオチドを用いて、バンコマイシン耐性腸球菌に存在するｖａｎＡ及び／又はｖａｎＢコード領域の一部を検出することを目的とする方法を含む。本発明の方法を用いて、生体試料内の薬剤耐性菌の存否を同定することが可能である。いくつかの態様では、増幅技法はリアルタイムアッセイの使用を含む。本発明は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドも含む。
【００３９】
オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために用いることができるプライマーを含む。ｖａｎＡコード領域の一例は、配列番号７（ジェンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＢ２４７３２７、図１Ａを参照）において開示されている。ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために有用なプライマーは、配列番号７の領域、好ましくは、配列番号７の約６４８〜約７５１のヌクレオチドを含む領域を増幅することができる。結果的に、プライマーのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド約６４８〜約６７０、好ましくはヌクレオチド６４８〜６７０（配列番号１として本明細書で言及される）に対応することができる。同様に、プライマーのヌクレオチド配列は、約７２６〜７５１、好ましくは７２６〜７５１のヌクレオチドの相補体（配列番号２として本明細書で言及される）に対応する場合がある。ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために有用なプライマー対の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号１及び配列番号２、配列番号１との配列類似性を有するプライマー及び配列番号２、配列番号１及び配列番号２との配列類似性を有するプライマー、並びに配列番号１との配列類似性を有するプライマー及び配列番号２との配列類似性を有するプライマー。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＢコード領域の一部を増幅するために用いることができるプライマーを含む。ｖａｎＢコード領域の一例は、配列番号８（ジェンバンク（GenBank）受け入れ番号ＡＹ６６５５５１、図１Ｂを参照）において開示されている。ｖａｎＢコード領域の一部を増幅するために有用なプライマーは、配列番号８の領域、好ましくは、配列番号８の約４９２〜約６３０のヌクレオチドを含む領域を増幅することができる。結果的に、プライマーのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド約４９２〜約５１６、好ましくは４９２〜５１６（配列番号４として本明細書で言及される）に対応することができる。同様に、プライマーのヌクレオチド配列は、約６０８〜６３０、好ましくは６０８〜６３０のヌクレオチドの相補体（配列番号５として本明細書で言及される）に対応する場合がある。ｖａｎＡコード領域の一部を増幅するために有用なプライマー対の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号４及び配列番号５、配列番号４との配列類似性を有するプライマー及び配列番号５、配列番号４及び配列番号５との配列類似性を有するプライマー、並びに配列番号４との配列類似性を有するプライマー及び配列番号５との配列類似性を有するプライマー。
【００４１】
ｖａｎＡ又はｖａｎＢのコード領域を増幅するプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）、カリフォルニア州フォスターシティ（Foser City））、及びＩＤＴ（登録商標）ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０（インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）、アイオワ州コーラルヴィル（Coralville））などのすぐに入手可能なコンピュータプログラムを用いて設計することができる。プライマーを設計する際に考慮できる因子として、融解温度、プライマー長さ、増幅産物の大きさ、及び特異性が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される増幅方法において有用なプライマーは、典型的には、少なくとも５６℃、少なくとも５７℃、少なくとも５８℃又は少なくとも５９℃より高い融解温度（ＴＭ）を有する。プライマーのＴＭは、ウォレス・ルール（Wallace Rule）（ウォレスら、１９７９年、核酸研究（Nucleic Acids Res.）、６巻、３５４３〜３５５７頁）によって、又はＩＤＴ Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ３．０などのすぐに入手可能なコンピュータプログラムによって決定することができる。典型的には、プライマー対のプライマーは、４℃以下、３℃以下、２℃以下、又は１℃以下の幅で変動するＴＭを有する。典型的には、２つのプライマーは十分に長く、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつ細菌、好ましくは腸球菌内に存在する他の非標的ポリヌクレオチド及び増幅反応に存在する可能性がある他のポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。プライマー長さは、通常、約１５〜約３０ヌクレオチド（例えば、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０ヌクレオチド）である。
【００４２】
本発明において有用なプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５に対する配列類似性を有することができる。配列類似性を有するそのようなプライマーにおける非相補的ヌクレオチドは、本質的にはプライマー中の任意の場所に位置することができる。いくつかの態様では、シトシン残基又はグアニン残基を保存することが好ましい。例えば、配列番号１に対する配列類似性を有するプライマーにおいて、配列番号１において１つ以上のアデニン残基又はチミン残基を変更し、シトシン残基及びグアニン残基を保存することがより好ましい。好ましくは、配列類似性を有するプライマーの３’末端にある第１のヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５にある対応する第１のヌクレオチドと同一である。
【００４３】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５との配列類似性を有するプライマーは、適切な条件下で標的ポリヌクレオチドを増幅する活性を有する。配列類似性を有するそのような候補プライマー（すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５と比較されるプライマー）が標的ポリヌクレオチドを増幅する活性を有するか否かは、以下のプロファイルでＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis））によって検査することができる：９５℃で３０秒、その後、９５℃で０秒（２０℃／秒勾配）、６０℃で３０秒（２０℃／秒勾配）を４５サイクル。増幅は、５マイクロリットル（μＬ）の試料及び５μＬの以下の混合物を含有する全体積１０μＬで実行することができる：２つのプライマー（それぞれ１０マイクロモル（μＭ）で０．５μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭで２μＬ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（１０ｘで１μＬ、ロシュ（Roche））。配列番号１又は配列番号２のいずれかとの配列類似性を有する候補プライマーを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド６４８〜７５１を有するポリヌクレオチドである。そのようなヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ ７００２２１（商標）として指示されるエンテロコッカス・フェシウムから獲得された全細胞ＤＮＡに存在する。配列番号４又は配列番号５のいずれかとの配列類似性を有する候補プライマーを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド４９２〜６３０を含むポリヌクレオチドである。そのようなヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ ７００８０２（商標）として指示されるエンテロコッカス・フェシウムから獲得された全細胞ＤＮＡに存在する。配列番号１との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号２である。配列番号２との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号１である。配列番号４との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号５である。配列番号５との配列類似性を有する候補プライマーをテストする際、用いられる第２のプライマーは配列番号４である。
【００４４】
本発明のプライマーは、追加的なヌクレオチドを更に含むことができる。典型的には、このような追加的なヌクレオチドはプライマーの５’末端に存在し、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むヌクレオチド、ヘアピンループを形成するヌクレオチド、及び、プライマーが、例えばスコーピオンプライマー（scorpions primer）（例えば、ウィトコンベ（Whitcombe）ら、米国特許第６，３２６，１４５号、及びウィトコンベ（Whitcombe）ら、１９９９年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１７巻、８０４〜８１７頁を参照）又はアンプリフルーア（amplifluor）プライマー（例えば、ナザレンコ（Nazarenko）ら、１９９７年、核酸研究（Nucl. Acids Res.）、２５巻、２５１６〜２５２１頁を参照）として用いられることを可能にする他のヌクレオチドを含む。プライマーがそのような追加的なヌクレオチドを含む際、プライマーが配列番号１、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５との配列類似性を有するか否かを判断するのに、その追加的なヌクレオチドは含まれない。同様に、一般的に約１０〜約５０ヌクレオチドであるプライマーの長さを判断するのに、追加的なヌクレオチドは含まれない。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＡプライマー又はｖａｎＢプライマーの使用から生じる増幅された産物の少なくとも一部にハイブリダイズするために用いることができるプローブを含む。そのような本明細書で有用なｖａｎＡプローブは、配列番号７の約６７１〜約７２５のヌクレオチド、好ましくは、配列番号７の６８４〜７１２ヌクレオチド、を含む領域にハイブリダイズする。そのような本明細書で有用なｖａｎＢプローブは、配列番号８の約５１７〜約６０７のヌクレオチド、好ましくはヌクレオチド５４９〜５７３を含む領域にハイブリダイズする。
【００４６】
典型的には、ｖａｎＡプローブは、ｖａｎＡプライマーの特定のセットを用いる本発明の方法において用いるように設計され、ｖａｎＢプローブは、ｖａｎＢプライマーの特定のセットを用いる本発明の方法において用いるように設計される。ｖａｎＡプローブ及びｖａｎＢプローブを設計することは、本明細書に記載されるプライマーを設計することと同様な方法で行われる。本明細書に記載される方法に有用なプローブを設計する際に考慮できる因子として、融解温度、長さ、プライマーに関するプローブの位置が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、プローブは、プローブと共に用いられるプライマーの最も高いＴＭよりも高いＴＭを有する。好ましくは、プローブは、プローブと共に用いられるプライマーの最も高いＴＭよりも、少なくとも約８℃高い、少なくとも約８．５℃高い、少なくとも約９℃高い、少なくとも約９．５℃高い、又は少なくとも約１０℃高いＴＭを有する。典型的には、より高いＴｍは、プライマー以前にプローブがハイブリダイズするのを可能にし、それによって、プローブでのそれぞれの増幅産物のラべリングの最大化を助ける。
【００４７】
典型的には、プローブは十分に長く、標的ポリヌクレオチド（及び増幅産物）にハイブリダイズし、かつ細菌、好ましくは、腸球菌に存在する他の非標的ポリヌクレオチド、及び増幅反応に存在する可能性がある他のポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。プローブ長さは一般的には、約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドである。好ましくはプローブ及びプローブと共に用いられるプライマーは増幅産物の同じヌクレオチドにハイブリダイズしない。プローブは、増幅された産物の１つのストランドにハイブリダイズし、典型的にはそのストランドにハイブリダイズするプライマーの前に、増幅された産物にハイブリダイズするように設計される。本発明のいくつかの態様では、プローブは、同じストランドにハイブリダイズするプライマーの１、２、３、４、又は５ヌクレオチド以内で、増幅された産物の１つのストランドにハイブリダイズする。２つのプローブの使用を伴う本発明のいくつかの態様では、２つのプローブは好ましくは増幅された産物の同じストランドにハイブリダイズし、２つのプローブは任意で、互いの１、２、３、４、又は５ヌクレオチド以内で、同じ増幅産物にハイブリダイズすることができる。
【００４８】
本発明において有用なプローブは、配列番号３、又は配列番号６に対する配列類似性を有することができる。配列類似性を有するそのようなプローブにおける非相補的ヌクレオチドは、本質的にはプローブ中の任意の場所に位置することができる。いくつかの態様では、シトシン残基又はグアニン残基を保存することが好ましい。配列番号３又は配列番号６との配列類似性を有するプローブは、プライマー対のプライマーがハイブリダイズするのと同じ条件下で増幅された産物にハイブリダイズする活性を有する。配列類似性を有するそのような候補プローブ（すなわち、配列番号３又は配列番号６と比較されるプローブ）がこの活性を有するか否かは、候補プローブをプライマー対との増幅反応に含めること、及びアニーリング工程中に候補プローブが増幅産物とのハイブリッドを形成するか否かを判断することによって試験することができる。配列番号３との配列類似性を有する候補プローブを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド６４８〜７５１を含むポリヌクレオチドであり、配列番号６との配列類似性を有する候補プローブを評価するための標的ポリヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド４９２〜６３０を含むポリヌクレオチドである。配列番号３との配列類似性を有する候補プローブを試験する際、配列番号１及び配列番号２がプライマー対として用いられる。配列番号６との配列類似性を有する候補プローブを試験する際、配列番号４及び配列番号５がプライマー対として用いられる。
【００４９】
本発明のプローブは、追加的なヌクレオチドを更に含むことができる。そのような追加的なヌクレオチドは、５’末端、３’末端のいずれか、又は両方に存在することができ、例えばヘアピンループを形成するヌクレオチド、及び、プローブを例えば分子指標として用いることを可能にする他のヌクレオチドを含むことができる。プローブがそのような追加的なヌクレオチドを含む際、プローブが配列番号７又は配列番号８との配列類似性を有するか否かを判断するのに、その追加的なヌクレオチドは含まれない。同様に、一般的に約１５〜約３０ヌクレオチドであるプローブの長さを判断するのに、追加的なヌクレオチドは含まれない。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは修飾することができる。そのような修飾は、特定の環境におけるポリヌクレオチドの安定性を向上させるのに有用であり得る。修飾は、核酸主鎖、塩基、糖、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。修飾は、合成、自然発生、又は非自然発生である場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに存在する１つ以上の核酸における修飾を含むことができる。主鎖の修飾の例として、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸が挙げられるが、これらに限定されない（ニールソン（Nielson）ら、米国特許第５，５３９，０８２号、エゴーム（Egholm）ら、ネイチャー（Nature）、１９９３年、３６５巻、５６６〜５６８頁）。核酸塩基の修飾の例として、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、擬似ウラシル（pseudouracil）、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）若しくは６−アザピリミジン若しくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、又はプロピン修飾が挙げられるが、これらに限定されない。核酸糖修飾の例として、２’−糖修飾、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、又は２’−デオキシヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
オリゴヌクレオチドはラベルを含んでもよい。代表的なラベルとして、フルオロフォアラベル（例えば、クエンチャー又は吸収体など）、非蛍光ラベル、比色分析ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、放射性ラベル、質量修飾基（mass-modifying groups）、親和力ラベル、磁性粒子、抗原、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼなど）、基質などが挙げられるが、これらに限定されない。ラベルは、蛍光、放射能、比色、重量測定、Ｘ線回折又はＸ線吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能な信号を提供することができる。親和力ラベルは、別の分子との特異的相互作用を提供する。親和力ラベルの例は、例えば、抗体のように、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ（polyethyleneoxy）、ハプテン、及びペプチドを含む。
【００５２】
特定の態様では、ラベルはフルオロフォアである。フルオロフォアラベルとして、フルオレセイン・ファミリー、カルボキシローダミン・ファミリー、シアニン・ファミリー、及びローダミン・ファミリーの染料が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いることができる染料の他のファミリーとして、例えば、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの染料、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの染料、クマリン・ファミリーの染料、オキサジン・ファミリーの色素、チアジン・ファミリーの色素、スクアライン・ファミリーの色素、キレート化ランタニド・ファミリーの色素、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＪの商品名でモレキュラー・プローブス（Molecular Probes）から入手可能な染料のファミリー、及びＢｏｄｉｐｙＪの商品名でインヴィトロジェン（Invitrogen）（カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad））から入手可能な染料のファミリーが挙げられる。フルオレセイン・ファミリーの染料として、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル（fused phenyl）−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、及び２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−フルオレセイン（ＺＯＥ）が挙げられる。カルボキシローダミン・ファミリーの染料として、テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、テキサスレッド、Ｒ１１０、及びＲ６Ｇが挙げられる。シアニン・ファミリーの染料として、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７が挙げられる。フルオロフォアは、例えば、パーキンエルマー（Perkin-Elmer）（カリフォルニア州フォスターシティ（Foster City））、モレキュラー・プローブス株式会社（Molecular Probes, Inc.）（オレゴン州ユージーン（Eugene））、及びアマシャムＧＥヘルスケア（Amersham GE Healthcare）（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway））から市販されている。
【００５３】
ラベルは、クエンチャーであってもよい。クエンチャーは、蛍光クエンチャー又は非蛍光クエンチャーであってもよい。蛍光クエンチャーとして、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、シアニン染料（ニトロチアゾールブルー（ＮＴＢ）、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、及びニトロイミダゾール化合物など）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアから吸収したエネルギーを拡散する代表的な非蛍光クエンチャーとして、ビオサーチ・テクノロジーズ株式会社（Biosearch Technologies, Inc.）（カリフォルニア州ナヴァト（Novato））から商品名ブラックホールＪ（Black HoleJ）で入手可能なもの、エポック・バイオサイエンス（Epoch Biosciences）（ワシントン州ボセル（Bothell））から商品名エクリプス・ダークＪ（Eclipse DarkJ）で入手可能なもの、アナスペック株式会社（Anaspec, Inc.）（カリフォルニア州サンノゼ（San Jose））から商品名ＱｘｌＪで入手可能なもの、及びインテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）（アイオワ州コーラルヴィル（Coralville））から商品名アイオワブラックＪ（Iowa BlackJ）で入手可能なものが挙げられる。
【００５４】
典型的には、フルオロフォア及びクエンチャーは共に用いられ、同じ又は異なるヌクレオチド上に存在する可能性がある。共に対になっている場合、フルオロフォア及び蛍光クエンチャーは、それぞれドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアとして言及することができる。多数の好都合なフルオロフォア／クエンチャー対は、当該技術分野において既知であり（例えば、グレイザー（Glazer）ら、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Current Opinion in Biotechnology）、１９９７年、８巻、９４〜１０２頁、チャギ（Tyagi）ら、１９９８年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１６巻、４９〜５３頁を参照）、例えば、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）（オレゴン州ジャンクションシティ（Junction City））、及びアプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティ（Foster City））から商業的に容易に入手可能である。種々のアクセプタフルオロフォアと共に用いることができるドナーフルオロフォアの例として、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィリコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２−，２’−ジスルホン酸誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。アクセプタフルオロフォアは、典型的には用いられるドナーフルオロフォアによって決まる。アクセプタフルオロフォアの例として、ＬＣＪ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣＪ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン・ローダミンＢスルホニルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリトロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又は他のランタニドイオンのキレート（例えば、ユウロピウム及びテルビウム）が挙げられるが、これらに限定されない。ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアは、例えば、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）又はシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（ミズーリ州セントルイス（St.Louis））から商業的に容易に入手可能である。
【００５５】
ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアを用いるリアルタイムアッセイに有用なプローブの例として、隣接プローブ（カルドゥーロ（Cardullo）ら、１９８８年、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８５巻、８７９０〜８７９４頁、ヴィットヴェア（Wittwer）、１９９７年、バイオテクニックス（BioTechniques）、２２巻、１３０〜１３１頁）、及びＴａｑｍａｎプローブ（ホランド（Holland）ら、１９９１年、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８８巻、７２７６〜７２８０頁、リヴァク（Livak）ら、１９９５年、ＰＣＲ応用方法（PCR Methods Appl.）、４巻、３５７〜６２頁）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォア及び非蛍光クエンチャーを用いるリアルタイムアッセイに有用なプローブ及びプライマーの例として、分子指標（チャギ（Tyagi）ら、１９９６年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１４巻、３０３〜３０８頁、ヨハンソン（Johansson）ら、２００２年、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）、１２４巻、６９５０〜６９５６頁）、スコーピオンプライマー（二重鎖スコーピオンプライマーを含む）（ウィトコンベ（Whitcombe）ら、米国特許第６，３２６，１４５号、ウィトコンベ（Whitcombe）ら、１９９９年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nat. Biotechnol.）、１７巻、８０４〜８１７頁）、アンプリフルーアプライマー（ナザレンコ（Nazarenko）ら、１９９７年、核酸研究（Nucl.Acids res.）、２５巻、２５１６〜２５２１頁）、及び点灯（light-up）プローブ（スヴァンヴィク（Svanvik）ら、２０００年、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）、２８７巻、１７９〜１８２頁）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、ベクターに存在し得る。ベクターは、別のポリヌクレオチドが、付着したポリヌクレオチドの複製をもたらすように付着することができるプラスミド、ファージ、又はコスミドなどの複製ポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターの構成体は、当該技術分野において既知の標準のライゲーション技法を用いる。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９８９年）を参照のこと。ベクターは、更なるクローニング（ポリヌクレオチドの増幅）、すなわちクローニングベクター、又は、ポリヌクレオチドの発現、すなわち発現ベクターを提供することができる。用語「ベクター」として、プラスミドベクター及びウィルス性ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウィルス性ベクターの例として、例えば、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクター、及びヘルペスウィルスベクターが挙げられる。典型的には、ベクターは、細菌の宿主、例えば大腸菌において複製可能である。好ましくは、ベクターはプラスミドである。ベクターはまた、配列番号７、又はその一部、好ましくは配列番号７の約６４８〜約７５１のヌクレオチドなどのｖａｎＡコード領域、又は配列番号８、又はその一部、好ましくは配列番号８の約４９２〜約６３０のヌクレオチドなどのｖａｎＢコード領域も含むことができる。そのようなベクターは、例えば、制御標的ポリヌクレオチドとして用いることができる。
【００５７】
ベクターの選択は、選択マーカー、ベクター複製率などのような、結果として得られる作成物における種々の所望の特性によって決まる。本明細書のベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、原核細胞である。好適な原核細胞として、グラム陰性細菌、例えば、大腸菌などの真正細菌が挙げられる。ベクターは、当業者に既知で、日常的に用いられる方法を用いて宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、熱ショック、リポフェクション、顕微注入、及びウィルス媒介核酸転移は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。更に、裸のＤＮＡは、細胞に直接送ることができる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、インビトロ又はインビボで産生することができる。例えば、インビトロ合成のための方法として、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を用いた化学合成が挙げられるが、これに限定されない。合成ポリヌクレオチド及びそのような合成のための試薬の商業的供給者は周知である。インビトロ合成のための方法は、例えば、無細胞系で環状又は線形発現ベクターを用いるインビトロ転写も含む発現ベクターを用いて、細胞内で本発明のポリヌクレオチドを産生することができ、その後、そのポリヌクレオチドは細胞から分離される。
【００５９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のうちの１つ、又はそれらの断片に含有されるヌクレオチド配列と同一又は十分に同一なポリヌクレオチドは、核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして用いて、腸球菌属（及び標的ポリヌクレオチド配列との高い配列類似性を有する、腸球菌以外の属に属する細菌からのホモログ及びオルソログをコード化する遺伝子）の薬剤耐性原核細菌に特徴的な標的ポリヌクレオチドを検出することができる。典型的には、これらのプライマーポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されるヌクレオチド配列のうちの１つと、少なくとも約８０％同一〜少なくとも約９５％同一である（例えば、少なくとも約８０％配列同一性、少なくとも約８５％配列同一性、少なくとも約９０％配列同一性、又は少なくとも約９５％配列同一性を有する）。
【００６０】
配列番号３、若しくは配列番号６のうちの１つ、又はそれらの断片に含有されるヌクレオチド配列と同一又は十分に同一なポリヌクレオチドは、核酸検出反応（例えば、ハイブリダイゼーション）のためのプローブとして用いて、腸球菌属（及び標的ポリヌクレオチド配列との高い配列類似性を有する、腸球菌以外の属に属する細菌からのホモログ及びオルソログをコード化する遺伝子）の薬剤耐性原核細菌に特徴的な標的ポリヌクレオチドを検出することができる。典型的には、これらのプローブポリヌクレオチドは、配列番号３、又は配列番号６に示されるヌクレオチド配列のうちの１つと、少なくとも約８０％同一〜少なくとも約９５％同一である（例えば、少なくとも約８０％配列同一性、少なくとも約８５％配列同一性、少なくとも約９０％配列同一性、又は少なくとも約９５％配列同一性を有する）。
【００６１】
使用方法
本発明は、薬剤耐性原核細菌、好ましくは、腸球菌属のメンバー、例えば、大腸レンサ球菌、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・ガリナルム、又はエンテロコッカス・デュランス、より好ましくは、大腸レンサ球菌又はエンテロコッカス・フェシウム、最も好ましくは、大腸レンサ球菌、に特徴的なポリヌクレオチドを検出するための方法を含む。薬剤耐性菌の他の例として、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌種、及び連鎖球菌種が挙げられるが、これらに限定されない。試料が被験者から獲得されると、本方法を用いて被験者が薬剤耐性菌に感染しているか否かを判断することができる。本発明のこの態様の方法は、典型的には、標的ポリヌクレオチドを本発明のプライマー対と接触させること、ポリヌクレオチドを増幅すること、及び結果として得られる増幅された産物を検出することを含む。
【００６２】
本方法で用いられる標的ポリヌクレオチドは、試料内に存在してもよい。試料は、食品試料、飲料試料、発酵ブロス、法医学試料、環境試料（例えば、土壌、汚れ、廃棄物、汚水、又は水）、又は生体試料であってもよい。好ましくは、試料は生体試料である。「生体試料」は、真核生物源又は原核生物源から獲得された試料を指す。真核生物源の例は、ヒト又はネズミ科のメンバー（ラット又はマウスなどのネズミ科の動物）を含む。原核生物源の例として、腸球菌、及び内因性又は組換えのｖａｎＡ又はｖａｎＢコード領域を含有する他の細菌を含む。
【００６３】
生体試料は、例えば、単一の細胞の形態、組織の形態、又は液体の形態を取ることができる。細胞又は組織は、インビトロ培養由来とすることができる。動物から獲得される場合、生体試料は、例えば肛門スワブ、直腸スワブ、便の試料、血液、及び／又は体液から獲得することができる。いくつかの態様では、生体試料は、腸球菌感染を有すると疑われる被験者から獲得される。試料は、分離されたポリヌクレオチド、例えば、本明細書で記載されるようなベクター内に存在するポリヌクレオチド、又は本明細書で以下に記載される方法を用いて分離されるポリヌクレオチドであってもよい。
【００６４】
試料は、水若しくは有機媒体の中に溶解若しくは分散しているか、又はそこからポリヌクレオチドが水若しくは有機媒体に抽出されている固体試料（例えば、固体組織）であってもよい。例えば、試料は臓器ホモジェネートであってもよい。したがって、試料は先行して抽出されたポリヌクレオチドであってもよい。
【００６５】
いくつかの態様では、試料は、存在している細菌、好ましくは腸球菌、を濃縮するために、濃縮ブロスを用いてインキュベートされてもよい。そのような細菌についての試料の感度は、増幅及び検出のためにポリヌクレオチドを抽出する試料調製に先行する集積培養プロセスを含むことによって増強される。試料原料（例えば、生体試料）は、試料中の他の細菌を殺すが抗生物質耐性菌の増殖を可能にする特定の濃度で抗生物質（複数可）を補われた好適な媒体／ブロスを接種するために用いられ、その後、カルチャーは好適な温度（例えば、３７℃）である期間（例えば、１８〜２４時間）インキュベートされる。好ましくは、抗生物質は、例えば４ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）〜８ｍｇ／ｍＬの濃度で用いることのできるバンコマイシンである。集積培養プロセスの最後に、目的の細菌を有する試料は、遠心分離、濾過、又は他の好適な方法によってカルチャーの一部から収集され、増幅及び検出を含む本発明の方法に用いられる。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、不純、部分的に純粋、又は純粋な試料からであってもよい。ポリヌクレオチドは著しく不純な試料からも獲得することができるため、元の試料の純度は重要ではない。例えば、ポリヌクレオチドは、血液、唾液、糞便、又は組織などの生体液の不純な試料から獲得することができる。より高い純度の試料が所望される場合、試料は、本発明の方法を行うのに先立って、当業者に既知の任意の従来の手段によって処理することができる。ポリヌクレオチドは、本明細書で以下に記載される方法を用いて分離することができる。
【００６７】
複合生体試料（糞便、血液、食品、組織、痰など）は、固体のくず及び／又は増幅阻害因子を含有する場合がある。固体のくずは、一般的に沈殿又は遠心分離（固体からの分離上清）、濾過などによって除去される。増幅阻害因子は、多くの場合、タンパク質変性剤又はプロテアーゼを用いる処置、希釈などによって除去される。所望されないポリヌクレオチド含有細胞は、選択的な溶菌、分画遠心分離、濾過などによって減らすことができる。
【００６８】
特定の細菌、好ましくは腸球菌種は、腸球菌種内に存在する標的ポリヌクレオチドの増幅に先立って、試料から取り出すことができる。例えば、生体試料は、腸球菌と相互作用するが、生体試料内に存在する他の要素とは相互作用しない作用薬によって官能化される基質に曝露することができる。相互作用は、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、親和力バインディング、又は物理的なトラッピングなどの弱い力などの、幅広い多様な機構を介した可逆的な保持である。有用な作用薬の例として、抗腸球菌抗体によって媒介されるものなどの特異的相互作用、及び非特異的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。細菌との非特異的相互作用を媒介するために用いることができる作用薬の例として、例えば、シリカ、ジルコニア、アルミナビーズ、金などの金属コロイド、及び、メルカプト化学を通じて官能化されている金でコーティングされたシートが挙げられる（パータサラティ（Parthasarathy）、米国特許仮出願第６０／９１３，８１３号、２００７年４月２５日出願、代理人整理番号第６２４７０ＵＳ００２号）。
【００６９】
腸球菌と相互作用する作用薬は、任意の固相物質上に存在することができる。例として、ポリオレフィン、ポリスチレン、ナイロン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、多糖、及びフッ素化ポリマー、並びに、アガロース、ラテックス、セルロース、及びデキストランなどの樹脂が挙げられる。固体物質は、マイクロ流体装置に導入することができる任意の形態、好ましくは粒子状物質（例えば、粒子、ビーズ、マイクロビーズ、マイクロスフェア）又は任意の他の形態（例えば、微小繊維）の形態、を取り得る（パータサラティ（Parthasarathy）、米国特許仮出願第６０／９１３，８１３号、２００７年４月２５日出願、代理人整理番号第６２４７０ＵＳ００２号）。
【００７０】
増幅反応において用いるのに先立ち、生体試料などの試料に存在するポリヌクレオチドは増幅のために調製することができる。増幅のためのポリヌクレオチド調製処置は、当該技術分野において周知であり、日常的に用いられている。ポリヌクレオチドは、生体試料から抽出することができる。抽出は、典型的にはポリヌクレオチドを放出させるために細菌を溶菌することを含む。本明細書では、溶菌は細胞膜の物理的な破壊である。抽出は、標準的な技法及び試薬の使用によって達成することができる。例として、例えば、煮沸、プロテイナーゼを用いた加水分解、超音波への曝露、洗浄剤、強塩基、又はフェノールクロロホルムなどの有機溶媒（リン（Lin）ら、米国特許第５，６２０，８５２号、ケロッグ（Kellogg）ら、米国特許第５，０１０，１８３号）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをバインディングするための条件下で磁性ガラス粒子などの粒子を用い、続けて不純物を除去するために洗浄し、その後バインディングされたポリヌクレオチドを取り出すために設計された洗浄を用いて清浄化されたポリヌクレオチドを得ることによって調製することができる（ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ、国際公開第ＷＯ０１／３７２９１Ａ１号）。
【００７１】
標的として本発明の方法で用いられるポリヌクレオチドは、任意の分子量、及び、一本鎖形状、二本鎖形状、環状、プラスミドなどであってもよい。ポリヌクレオチドの種々のタイプは、互いに分離することができる（例えば、ＤＮＡからＲＮＡ、又は一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ）。例えば、少なくとも長さ約１００塩基のポリヌクレオチド、長さ１，０００塩基〜１０，０００塩基のより長い分子、及び、更に最大約３．２メガ塩基の高分子量の核酸を本発明の方法で用いることができる。
【００７２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのポリヌクレオチド増幅は、ポリヌクレオチドの特定のセグメントの酵素増幅のための方法である。増幅は、以下の基本的な工程のサイクルの繰り返しに基づく。二本鎖ポリヌクレオチドの変性、その後、標的ポリヌクレオチドへのプライマーアニーリング、及びポリメラーゼによるプライマー伸長（ミュリス（Mullis）ら、米国特許第４，６８３，１９５号、ミュリス（Mullis）、米国特許第４，６８３，２０２号、及びミュリス（Mullis）ら、米国特許第４，８００，１５９号）。プライマーは、ＤＮＡの対向するストランドをアニールするように設計され、１つのプライマーのポリメラーゼ触媒された伸長産物が他のプライマーにとって鋳型ストランドとして役立つことができるように配置される。増幅プロセスによって、長さがプライマーの５’末端によって定義される別個のポリヌクレオチド断片が、結果として指数関数的に増加することができる。
【００７３】
一般的に、これらの工程は循環工程において達成される。ＤＮＡ増幅において用いられる典型的な循環工程は、２つの標的温度を伴い、それによって、変性、アニーリング、及び伸長がもたらされる。第１の温度は、二本鎖標的ポリヌクレオチドを分離させて一本鎖に分離するのに十分に高い所定の標的変性温度への上昇である。一般的に、循環工程の標的変性温度は、９４℃〜９６℃のように、ほぼ９２℃〜９８℃であり、反応は０秒〜５分間の範囲の時間にわたってこの温度で保たれる。反応混合物の温度は、その後、第２の標的温度まで下げられる。この第２の標的温度によって、プライマー（及び存在する場合にはプローブ（単数又は複数））がＤＮＡの１つのストランドにアニーリング又はハイブリダイズすること、及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長産物の合成を促進することが可能になる。一般的に、循環工程の第２の温度は、５９℃〜６１℃のように、ほぼ５７℃〜６３℃であり、反応は０秒〜１分間の範囲の時間にわたってこの温度で保たれる。この第２の温度は、使用されるプライマー（及び存在する場合にはプローブ（単数又は複数））及び標的ポリヌクレオチドによって大きく異なり得る。これによって１つの循環工程が完了する。次のサイクルは、その後、反応混合物の温度を変性温度まで上げることによって開始する。典型的には、サイクルは、所望の結果を提供するために繰り返され、これは一定量のＤＮＡを産生するため及び／又は増幅された産物を検出するためであり得る。検出における使用に関して、循環工程の数は、試料の性質によって決まる。例えば、試料がポリヌクレオチドの複雑な混合物である場合、検出に十分な標的ポリヌクレオチドを増幅するためにより多くの循環工程が必要とされる場合がある。一般的に、循環工程は、少なくとも約２０回繰り返されるが、４０回、６０回、又は１００回までも繰り返すことができる。当事者によって理解されるように、熱サイクル反応の上記の説明は例示のみのために提供されており、したがって温度、時間及びサイクル数は、熱サイクル反応及び用途の性質によって異なり得る。
【００７４】
任意で、第３の温度も循環工程で用いられる。３つの標的温度を使用することによっても、結果的に変性、アニーリング、及び伸長が得られるが、別個の標的温度が変性、アニーリング、及び伸長のために用いられる。３つの標的温度が用いられる場合、アニーリング温度は一般的に、用途によって４５℃〜６０℃の範囲である。第３の標的温度は、伸長のためであり、典型的には３０秒〜１０分にの範囲の時間にわたって保持され、アニーリング温度〜変性温度の範囲の温度で生じる。
【００７５】
本方法の方法で用いるためのＤＮＡポリメラーゼ及び本発明の組成物は、本発明の方法によるプライマーの効果的な伸長を可能にする。したがって、好ましいポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに沿ってプライマーの伸長を可能にするポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは耐熱性である。耐熱性ポリメラーゼは、熱安定性であるポリメラーゼであり、すなわちこのポリメラーゼは鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖の鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたって上昇した温度に曝露された際にも不可逆的に変性しない。有用な耐熱性ポリメラーゼは周知であり、日常的に用いられている。耐熱性ポリメラーゼはサームス・フラブス（Thermus flavus）、Ｔ．ルバー（T. ruber）、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）、Ｔ．エクアティカス（T. aquaticus）、Ｔ．ラクテウス（T. lacteus）、Ｔ．ルーベンス（T. rubens）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）及びメタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）から分離されている。
【００７６】
ポリメラーゼは、典型的には標的ポリヌクレオチドにアニールされるプライマーの３’末端において合成を開始し、標的ポリヌクレオチドに沿って５’−方向に進む。ポリメラーゼは、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、存在する場合、干渉するアニールされたプローブ（単数又は複数）を加水分解して、合成が完了するまでプローブ（単数又は複数）の部分を剥離させることができる。５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有する好適なポリメラーゼの例として、例えば、Ｔｆｉ、Ｔａｑ、及びＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ（ロシュ（Roche））が挙げられる。他の態様では、プライマー、終止又はプライマー伸長ポリヌクレオチドの劣化を最小化するために、ポリメラーゼは５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないか全く有しない。このエキソヌクレアーゼ活性は、ｐＨ、塩濃度、標的が二本鎖であるか又は一本鎖であるかなどの要素によって決まり得る。これら全ては、当業者に周知である。５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないか全く有しない好適なポリメラーゼの例として、Ｋｌｅｎｔａｑ（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス（St. Louis））が挙げられる。
【００７７】
典型的には、増幅は、異なる配列を有することができる１つ以上の標的ポリヌクレオチドを、増幅反応を実行するための反応成分を含有する「マスターミックス」と混合すること、及びこの反応混合物を標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする温度条件にさらすことを伴う。マスターミックス内の反応成分は、反応混合物のｐＨを調節するバッファ、マグネシウムイオン、増幅産物の合成に必要なエネルギー及びヌクレオシドを提供する１つ以上の天然ヌクレオチド（しばしば等しい濃度で存在する、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン又はウラシル）、ポリヌクレオチド合成の開始を容易にするためにターゲットにバインディングするプライマー対、合成されている相補的なストランドにヌクレオチドを加えるポリメラーゼ、及び任意で、１つ以上のプローブを含むことができる。当業者は、本発明の方法を実行するために標的ポリヌクレオチドの存在が要求されないが、首尾よい増幅反応が標的ポリヌクレオチドが不在の場合に発生しないことを理解するであろう。
【００７８】
増幅された産物の存否は判定されるか、又は産物の量が測定される。増幅された産物を検出することは、当該技術分野において周知であり、かつ日常的に用いられている標準的な方法によって遂行することができる。検出することは、例えば、複数の増幅サイクルが実行された後、又はそれぞれの増幅サイクルの間（典型的にはリアルタイムとして言及される）に起こる可能性がある。複数の増幅サイクルが実行された後の増幅産物の検出は、例えば、増幅産物をゲル上に分散すること及び予期された増幅産物が存在しているか否かを判定することによって容易に達成される。リアルタイム検出又は増幅産物の定量化を容易にするために、増幅反応において用いられる１つ以上のプライマー及び／又はプローブはラべリングすることができ、増幅産物が存在していることを示す検出可能な信号を発生させるための種々のフォーマットが利用可能である。最も便利なラベルは典型的には、ドナーフルオロフォアラベル、アクセプタフルオロフォアラベル、フルオロフォア、クエンチャー、及びそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない種々のフォーマットで用いられる蛍光剤である。種々のフォーマットを用いるアッセイの種類は、ラべリングされている１つ以上のプライマー（例えば、スコーピオンプライマー、アンプリフルーアプライマー）、ラべリングされている１つ以上のプローブ（例えば、隣接プローブ、Ｔａｑｍａｎプローブ、点灯プローブ、分子指標）又はそれらの組み合わせを含むことができる。当業者は、これらの既知のフォーマットに加えて、新しい種類のフォーマットが日常的に開示されることを理解するであろう。本発明は、方法の種類又は増幅された産物を検出するために用いられるプローブ及び／若しくはプライマーの種類によって限定されない。適切なラベル（例えば、異なるフルオロフォア）を用いて、いくつかの異なるプライマー対（及び、任意で、存在する場合はプローブ）の結果を、単一の反応で結合（多重化）することができる。
【００７９】
ラべリングされたプライマー及び／又はプローブを用いる検出の代替として、増幅産物は蛍光ＤＮＡバインディング染料などのポリヌクレオチドバインディング染料を用いて検出することができる。例として、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ又はＳＹＢＲＧｏｌｄ（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））が挙げられる。二本鎖の増幅産物との相互作用の際、そのようなポリヌクレオチドバインディング染料は、好適な波長の光で励起した後、蛍光信号を放出する。ポリヌクレオチド介在染料などのポリヌクレオチドバインディング染料も用いることができる。
【００８０】
対照は、増幅反応が実行されるときに含むことができる。対照標的ポリヌクレオチドは、例えば、対照プライマー及び対照プローブを用いて、陽性対照試料（例えば、ｖａｎＡ又はｖａｎＢ以外の標的ポリヌクレオチド）から増幅することができる。陽性対照試料は、標的ｖａｎＡ又はｖａｎＢポリヌクレオチドを増幅するために用いることもできる。そのような対照は、内部で（例えば、それぞれの増幅反応内で）又は別個の試料内で対象の試料と並行して増幅することができる。それぞれの実行は、例えば、標的ｖａｎＡ又はｖａｎＢポリヌクレオチドを欠く陰性対照も含むことができる。
【００８１】
本発明は増幅された産物の増幅及び検出を遂行するために用いられる装置に限定されないことを理解されたい。例えば、好適な装置は従来の増幅装置、例えばＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）リアルタイムＰＣＤシステム（ロシュ（Roche））（ユタ大学研究財団（University of Utah Research Foundation）、国際公開第ＷＯ９７／４６７０７号、ＷＯ９７／４６７１４号、ＷＯ９７／４６７１２号）、ＭＸ３００５ｐ（ストラタジーン（Stratagene）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（La Jolla））、及びバイオ・ラッド（Bio-Rad）から入手可能な増幅装置を含むことができる。本発明は、マイクロ流体装置と接続して実施されることが好ましい。「マイクロ流体」は、５００μｍ未満、典型的には０．１μｍ〜５００μｍの少なくとも１つの内部の断面の寸法、例えば、奥行、横幅、長さ、直径などを有する１つ以上の液体通路、チャンバ、又は導管を有する装置を指す。典型的には、マイクロ流体装置は、複数のチャンバ（例えば、増幅反応チャンバ、充填チャンバなど）を備え、それぞれのチャンバは試料を含有するための体積を画定する。潜在的に好適なマイクロ流体装置のいくつかの例は、米国特許出願公開第２００２／００６４８８５号（ベディンガム（Bedingham）ら）、ＵＳ２００２／００４８５３３号（ベディンガムら）、ＵＳ２００２／００４７００３号（ベディンガムら）、及びＵＳ２００３／１３８７７９号（パータサラティ（Parthasarathy）ら）、並びに米国特許第６，６２７，１５９号（ベディンガムら）、同第６，７２０，１８７号（ベディンガムら）、同第６，７３４，４０１号（ベディンガムら）、同第６，８１４，９３５号（ハームズ（Harms）ら）、同第６，９８７，２５３号（ベディンガムら）、同第７，０２６，１６８号（ベディンガムら）及び同第７，１６４，１０７号（ベディンガムら）に記載されている。
【００８２】
本発明は、ポリヌクレオチドを分離、好ましくは、清浄化するための方法も含む。本発明のこの態様の方法は、典型的には、一本鎖ポリヌクレオチドを含有する混合物を提供すること、結果としてハイブリッドを得るために、一本鎖ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションのための好適な条件下で本発明のオリゴヌクレオチドに混合物を曝露すること、及びそのハイブリッドをハイブリダイズされていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離することを含む。そのような方法は、薬剤耐性腸球菌内に存在する標的ポリヌクレオチドの増幅に先立ち試料を調製するために用いることができる。
【００８３】
混合物は、試料、好ましくは生体試料から獲得することができる。典型的には、薬剤耐性菌、好ましくは、腸球菌を含有することができる。本明細書で上記に記載したように、試料は抽出によって分離のために調製することができる。混合物内のポリヌクレオチドは、不純（例えば、他の細胞物質及び／又は固形のくずが存在する）、部分的に清浄、又は清浄化されている場合がある。混合物内のポリヌクレオチドは、周知かつ日常的な方法を用いて変性することができる。そのような方法の例として、例えば、加熱、又はアルカリ性条件への曝露が挙げられる。
【００８４】
一本鎖ポリヌクレオチドの混合物は、オリゴヌクレオチド及び相補的な一本鎖ポリヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションのための好適な条件下で本発明のオリゴヌクレオチドに曝露される。オリゴヌクレオチドは、典型的にはラベル、好ましくは親和力ラベルを含む。特に有用な従来のハイブリダイゼーションフォーマットは、オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定されるフォーマット（固相ハイブリダイゼーション）及びポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの両方）が全て溶解しているフォーマット（溶液ハイブリダイゼーション）を含む。
【００８５】
固相ハイブリダイゼーションフォーマットにおいて、オリゴヌクレオチドは典型的には、ハイブリダイゼーションに先立ち固相物質に付着させられる。溶液ハイブリダイゼーションフォーマットにおいて、オリゴヌクレオチドは典型的には、ハイブリダイゼーションの後、固相物質に付着させられる。両方のフォーマットにおいて、付着は、オリゴヌクレオチドに付着させられる、ラベル、好ましくは親和力ラベルによって媒介される。有用な固相物質の例として、例えば、ポリオレフィン、ポリスチレン、ナイロン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、多糖、及びフッ素化ポリマー、並びに、アガロース、ラテックス、セルロース、及びデキストランなどの樹脂が挙げられる。固形物は、マイクロ流体装置に導入することができる任意の形態、好ましくは粒子状物質（例えば、粒子、ビーズ、マイクロビーズ、マイクロスフェア）又は任意の他の形態（例えば、微小繊維）を取り得る（パータサラティ（Parthasarathy）、米国特許仮出願第６０／９１３，８１３号、２００７年４月２５日出願、代理人整理番号第６２４７０ＵＳ００２号）。
【００８６】
ハイブリダイゼーションは、ラべリングされたオリゴヌクレオチドを実質的に相補的な、好ましくは相補的な、混合物に存在する一本鎖ポリヌクレオチドに選択的にバインディングするのに好適な条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実行される。ハイブリダイゼーション反応及びプローブ合成のための一般的な方法は、分子クローニング（Molecular Cloning）（Ｔ．マニアティス（T. Maniatis）、Ｅ．フリッチュ（E. Fritsch）及びＪ．サンブルック（J. Sambrook）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８２年）に開示されている。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔの試薬などのハイブリダイゼーションバッファの使用、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、及びブロック試薬１００μｇ／ｍＬサケ精子を含む。ハイブリダイゼーションは、６８℃で少なくとも２時間発生することが可能である場合がある。ハイブリダイゼーション（及び、適切である場合、ラべリングされたオリゴヌクレオチドの付着）後、ハイブリダイズされていないポリヌクレオチド、及び存在し得る任意の他の物質は、室温で数回、２ｘＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳを含有する溶液で洗浄することによって除去することができる。任意で、分離されたポリヌクレオチドは、分離されたポリペプチドを放出させるためにハイブリッドを変性すること、及びバインディングされたオリゴヌクレオチド及び固体支持体を除去することによって清浄化することができる。
【００８７】
キット
本発明は、キットを提供し、当該キットは、例えば、プライマー対などの本発明のオリゴヌクレオチド、及び任意でプローブを含むことができる。本発明のキット内に含まれ得る他の構成要素は、マスターミックスなどの従来の試薬、固相支持体、ハイブリダイゼーション溶液、外部の陽性対照及び陰性対照などを含むことができる。
【００８８】
キットは典型的には、キットの内容物を収容するのに用いる１つ以上の物理的構造体を意味する梱包物質を含む。梱包物質は、周知の方法で組み立てられ、好ましくは、無菌の、汚染物質を含まない環境を提供することができる。梱包物質は、キットの内容を示すマーキングを有することができる。更に、キットは、キット内の物質をいかに用いるかを示す指示を備えることができる。本明細書で使用するとき、「梱包」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、金属箔などの固体マトリックス又は固体物質を意味する。
【００８９】
「指示」は、典型的には、試料調製の条件、増幅条件などを含む、本発明の種々の方法を記載する明確な表現を含む。
【００９０】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量、及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００９１】
（実施例１）
遺伝子特異プライマー及びプローブを用いる、核酸試料におけるｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の検出
グリコペプチド耐性遺伝子を同定するための、核酸ベースの検出ストラテジーは、試料がグリコペプチド抗生物質による処置を生き延びることができる細菌を含有する試料であるか否かを見分けるためのアッセイにおいて有用であり得る。この実施例において、プライマー及びプローブは、エンテロコッカス・ヘシュウム（ＡＴＣＣ ７００２２１、ヴァージニア州マナッサス（Manassas））、及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）としても既知のエンテロコッカス・フィカリス（ＡＴＣＣ ７００８０２、ヴァージニア州マナッサス（Manassas））のｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を検出するために用いられた。
【００９２】
ＶＲＥは、血液寒天培地に縞目上に塗布され、３７℃で２０時間インキュベートされた。細胞懸濁液は、ＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に、１×１０８コロニー形成単位毎ミリリットル（ＣＦＵ／ｍＬ）にほぼ相当する０．５のマクファーランド（McFarland）標準になるように希釈することによって、生長培地（fresh growth）から準備された。１００ミリリットルのこの細胞懸濁液は、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＤＮＡ分離キットＩＩＩ（細菌、菌類）キットを用いてＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣシステム（ロシュ（Roche）（インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis））から入手した器具及び試薬）で製造業者の指示に基づき抽出及び分離された。
【００９３】
プライマー及びプローブは、インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）（アイオワ州コーラルヴィル（Coralville））によって合成された。ｖａｎＡプローブ配列、５’ＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＡ（配列番号３）は、６−カルボキシ−４’，５−ジクロロ−２’，７’−ジメソキシフルオレセイン（ＪＯＥ）及びＢＨＱ（ブラック・ホール・クエンチャー（BLACK HOLE QUENCHER）、インテグレーテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）、アイオワ州コーラルヴィル）によって、それぞれ５’−及び３’−位置において二重標識された。ｖａｎＢプローブ配列、５’ＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡ（配列番号６）は、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びＢＨＱによって、それぞれ５’−及び３’−位置において二重標識された。プライマー配列及びプローブ配列は表１に列挙されている。
【００９４】
【表１】
【００９５】
それぞれの試料は、プライマー、プローブ及び酵素の最適化された以下の濃度、並びに熱サイクルプロトコルを用いて、ｖａｎＡ及びｖａｎＢ遺伝子のためのリアルタイムＰＣＲ増幅に曝露された。ＰＣＲ増幅は、５マイクロリットル（μＬ）の試料及び５μＬの以下の混合物を含有する全体積１０μＬで実行することができる：２つのプライマー（それぞれ１０マイクロモル（μＭ）で０．５μＬ）、プローブ（２μＭで１μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５μＭで２μＬ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（１０ｘで１ｍＬ、ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス）。増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Roche））において、以下のプロトコルを用いて実行された。９５℃で３０秒（変性）；９５℃で０秒（２０℃／秒勾配）、６０℃で２０秒（２０℃／秒勾配、単一の獲得）の４５ＰＣＲサイクル。
【００９６】
結果は、ロシュ（Roche）のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０リアルタイムＰＣＲシステムによって提供されるソフトウェアを用いて分析された。プライマーは、ｖａｎＡ及びｖａｎＢ遺伝子を表２及び表３に示されるこの実施例に提示される条件下で首尾よく増幅した。
【００９７】
【表２】
【００９８】
これらの結果は、ｖａｎＡ遺伝子が、配列番号１、２、及び３のプライマー及びプローブを用いて首尾よく増幅及び検出されたことを示す。
【００９９】
【表３】
【０１００】
これらの結果は、ｖａｎＢ遺伝子が、配列番号４〜６によって首尾よく増幅及び検出されたことを示す。
【０１０１】
いくつかの腸球菌の参照ストレインは、これらの既知のバンコマイシン耐性プロファイルが細菌の染色体におけるｖａｎＡ又はｖａｎＢ遺伝子の存在に関連しているか否かを判定するために試験された。特に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（ヴァージニア州マナッサス（Manassas））から購入した腸球菌分離株は、血液寒天培地に縞目上に塗布され、３７℃で２０時間インキュベートされた。細胞懸濁液は、ＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に、ほぼ１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当する０．５のマクファーランド（McFarland）標準になるように希釈することによって、生長培地（fresh growth）から調製された。１００マイクロリットルのこの細胞懸濁液は、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＤＮＡ分離キットＩＩＩ（細菌、菌類）キットを用いてＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣシステム（ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis）から入手した器具及び試薬）で製造業者の指示に基づき抽出及び分離された。
【０１０２】
それぞれの試料は、プライマー、プローブ及び酵素の最適化された以下の濃度、並びに熱サイクルプロトコルを用いて、ｖａｎ遺伝子Ａ及びｖａｎＢ遺伝子のためのリアルタイムＰＣＲ増幅に曝露された。ＰＣＲ増幅は、５μＬの試料及び５μＬの以下の混合物を含有する全体積１０μＬで実行することができる：２つのプライマー（それぞれ１０μＭで０．５μＬ）、プローブ（２μＭで１μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭで２μＬ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（１０×で１μＬ、ロシュ（Roche）、インディアナ州インディアナポリス）。増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０リアルタイムＰＣＲシステム（ロシュ（Roche））において、以下のプロトコルを用いて実行された。９５℃で３０秒（変性）；９５℃で０秒（２０℃／秒勾配）、６０℃で２０秒（２０℃／秒勾配、単一の獲得）の４５ＰＣＲサイクル。結果は表４において見ることができる。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
これらの結果は、配列番号１〜６は、腸球菌の染色体内のｖａｎ遺伝子Ａ及びｖａｎＢ遺伝子に特異的であり、非ｖａｎＡ配列又は非ｖａｎＢ配列にハイブリダイズしないことを示す。
【０１０５】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び出版物、並びに電子的に存在するもの（例えば、及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）などに登録されているヌクレオチド配列、並びにスイスプロット（SwissProt）、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどに登録されているアミノ酸配列、並びにジェンバンク（GenBank）及びリファレンス・シーケンス（RefSeq）の注釈つきコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参考として組み込まれる。本出願の開示と本明細書に参照として援用される任意の文書の開示（複数可）との間にいずれの不一致が認められる場合にも、本出願の開示が優先される。前述の詳細な説明及び実施例は理解を明確化するためにのみ提示されている。それらから無用の限定を解するべきでない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきではない。当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に包含されるからである。
【０１０６】
全ての見出しは読者の利便性のためであって、特記しない場合は、見出しの後に続く文面の意味を制限するために用いているのではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法であって、
増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ここで、前記標的ポリヌクレオチドが、薬剤耐性菌におけるバンコマイシン耐性と関連し、増幅することが少なくとも１つの循環工程を含み、循環工程が、前記増幅された産物を結果として得るために好適な条件下で前記生体試料を第１のプライマー及び第２のプライマーと接触させることと、前記増幅された産物とプローブをハイブリダイズさせるために好適な条件下で前記増幅産物を前記プローブと接触させることとを含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマーのＴＭ及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い；及び
前記増幅された産物を検出すること、ここで、前記増幅された産物の存在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す
を含む、方法。
【請求項２】
生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法であって、
増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ここで、前記生体試料が、増幅された産物を結果として得るために好適な条件下で第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマーに接触させられ、前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する；及び
前記増幅された産物を検出すること、ここで、前記増幅された産物の存在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す
を含む、方法。
【請求項３】
生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法であって、
増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ここで、前記生体試料が、増幅された産物を結果として得るために好適な条件下で第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマーに接触させられ、前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する；及び
前記増幅された産物を検出する、ここで、前記増幅された産物の存在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す
を含む、方法。
【請求項４】
生体試料内の薬剤耐性菌の不在を検出するための方法であって、
混合物を形成するために生体試料をプローブ、第１のプライマー及び第２のプライマーと接触させること、ここで、前記プライマーがバンコマイシンに対する薬剤耐性と関連する標的ポリヌクレオチドを増幅することができ、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い；
前記生体試料内に薬剤耐性に関連する前記標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に前記混合物を曝露すること；及び
前記増幅された産物の不在を検出すること、ここで、前記増幅された産物の不在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の不在を示す
を含む、方法。
【請求項５】
生体試料内の薬剤耐性菌の不在を検出するための方法であって、
混合物を形成するために生体試料を第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマーと接触させること、ここで、前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する；
前記生体試料内にｖａｎＡポリヌクレオチドが存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に前記混合物を曝露すること；及び
前記増幅された産物の不在を検出すること、ここで、前記増幅された産物の不在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の不在を示す
を含む、方法。
【請求項６】
生体試料内の薬剤耐性菌の不在を検出するための方法であって、
混合物を形成するために生体試料を第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマーと接触させること、ここで、前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する；
前記生体試料内にｖａｎＡポリヌクレオチドが存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に前記混合物を曝露すること；及び
前記増幅された産物の不在を検出すること、ここで、前記増幅された産物の不在が前記試料内の薬剤耐性菌の不在を示す
を含む、方法。
【請求項７】
前記細菌が腸球菌のメンバーである、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記腸球菌の前記メンバーが大腸レンサ球菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的ポリヌクレオチドがｖａｎＡポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のプライマーが配列番号１を含み、前記第２のプライマーが配列番号２を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号７にハイブリダイズする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ポリヌクレオチドがｖａｎＢポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のプライマーが配列番号４を含み、前記第２のプライマーが配列番号５を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号８にハイブリダイズする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
第２のプローブを更に含み、該第２のプローブが前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭより少なくとも８℃高いＴＭを有する、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項１８】
１つのプローブがドナーフルオロフォアを含み、第２のプローブがアクセプタフルオロフォアを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が薬剤耐性菌による感染が疑われる個体由来である、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が糞便物質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料を獲得することを更に含む、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出することが、それぞれの循環工程後に実行される、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のｖａｎＡプライマーが配列番号１を含み、前記第２のｖａｎＡプライマーが配列番号２を含む、請求項２、４、又は１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のｖａｎＢプライマーが配列番号４を含み、前記第２のｖａｎＢプライマーが配列番号５を含む、請求項３、６、又は１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記増幅することが、前記生体試料をプローブと接触させることを更に含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅することが、前記第１のｖａｎＡプライマー、前記第２のｖａｎＡプライマー、及びプローブを含む混合物を形成するために前記生体試料を前記プローブと接触させることを更に含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅することが、前記第１のｖａｎＢプライマー、前記第２のｖａｎＢプライマー、及びプローブを含む混合物を形成するために生体試料を前記プローブと接触させることを更に含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブがフルオロフォア及びクエンチャーを含む、請求項１、４、２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出することが、フルオロフォアを検出することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅することが、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１、４、２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドを分離するための方法であって、
一本鎖ポリヌクレオチドを含む混合物を提供すること；
ハイブリッドを結果として得るために一本鎖ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、前記混合物を前記オリゴヌクレオチドに曝露すること、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１との少なくとも約８０％同一性、配列番号２との少なくとも約８０％同一性、配列番号３との少なくとも約８０％同一性、配列番号４との少なくとも約８０％同一性、配列番号５との少なくとも約８０％同一性、又は配列番号６との少なくとも約８０％同一性から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが親和性ラベルを含む；及び
前記ハイブリッドを洗浄すること
を含む、方法。
【請求項３２】
前記曝露後に前記オリゴヌクレオチドを固相物質に付着させることを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、曝露前に固相物質に付着させられることを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記混合物が生体試料から獲得される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体試料が糞便物質を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
梱包物質、第１のｖａｎＡプライマー、第２のｖａｎＡプライマー、及びプローブを備えるキットであって、前記プローブのＴＭが、前記第１及び前記第２のｖａｎＡプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、キット。
【請求項３７】
前記プローブが、配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号７にハイブリダイズする、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
梱包物質、第１のｖａｎＢプライマー、第２のｖａｎＢプライマー、及びプローブを備えるキットであって、前記プローブのＴＭが、前記第１及び前記第２のｖａｎＢプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、キット。
【請求項３９】
前記プローブが、配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号８にハイブリダイズする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記プローブが、フルオロフォア及びクエンチャーを含む、請求項３６又は３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のプライマーが配列番号１を含み、前記第２のプライマーが配列番号２を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４２】
前記第１のプライマーが配列番号４を含み、前記第２のプライマーが配列番号５を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４３】
梱包物質、第１のｖａｎＡプライマー、及び第２のｖａｎＡプライマーを備えるキットであって、前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する、キット。
【請求項４４】
前記第１のプライマーが配列番号１を含み、前記第２のプライマーが配列番号２を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
梱包物質、第１のｖａｎＢプライマー、及び第２のｖａｎＢプライマーを備えるキットであって、前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する、キット。
【請求項４６】
前記第１のプライマーが配列番号４を含み、前記第２のプライマーが配列番号５を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号２と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号１と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、約１３９ヌクレオチドの増幅産物を結果として得るために前記ポリヌクレオチドが配列番号５と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号４と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項１】
生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法であって、
増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ここで、前記標的ポリヌクレオチドが、薬剤耐性菌におけるバンコマイシン耐性と関連し、増幅することが少なくとも１つの循環工程を含み、循環工程が、前記増幅された産物を結果として得るために好適な条件下で前記生体試料を第１のプライマー及び第２のプライマーと接触させることと、前記増幅された産物とプローブをハイブリダイズさせるために好適な条件下で前記増幅産物を前記プローブと接触させることとを含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマーのＴＭ及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い；及び
前記増幅された産物を検出すること、ここで、前記増幅された産物の存在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す
を含む、方法。
【請求項２】
生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法であって、
増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ここで、前記生体試料が、増幅された産物を結果として得るために好適な条件下で第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマーに接触させられ、前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する；及び
前記増幅された産物を検出すること、ここで、前記増幅された産物の存在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す
を含む、方法。
【請求項３】
生体試料内の薬剤耐性菌を検出するための方法であって、
増幅された産物を結果として得るために生体試料内に存在する標的ポリヌクレオチドを増幅すること、ここで、前記生体試料が、増幅された産物を結果として得るために好適な条件下で第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマーに接触させられ、前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する；及び
前記増幅された産物を検出する、ここで、前記増幅された産物の存在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の存在を示す
を含む、方法。
【請求項４】
生体試料内の薬剤耐性菌の不在を検出するための方法であって、
混合物を形成するために生体試料をプローブ、第１のプライマー及び第２のプライマーと接触させること、ここで、前記プライマーがバンコマイシンに対する薬剤耐性と関連する標的ポリヌクレオチドを増幅することができ、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い；
前記生体試料内に薬剤耐性に関連する前記標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に前記混合物を曝露すること；及び
前記増幅された産物の不在を検出すること、ここで、前記増幅された産物の不在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の不在を示す
を含む、方法。
【請求項５】
生体試料内の薬剤耐性菌の不在を検出するための方法であって、
混合物を形成するために生体試料を第１のｖａｎＡプライマー及び第２のｖａｎＡプライマーと接触させること、ここで、前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する；
前記生体試料内にｖａｎＡポリヌクレオチドが存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に前記混合物を曝露すること；及び
前記増幅された産物の不在を検出すること、ここで、前記増幅された産物の不在が前記生体試料内の薬剤耐性菌の不在を示す
を含む、方法。
【請求項６】
生体試料内の薬剤耐性菌の不在を検出するための方法であって、
混合物を形成するために生体試料を第１のｖａｎＢプライマー及び第２のｖａｎＢプライマーと接触させること、ここで、前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する；
前記生体試料内にｖａｎＡポリヌクレオチドが存在する場合に、増幅された産物を形成するのに好適な条件に前記混合物を曝露すること；及び
前記増幅された産物の不在を検出すること、ここで、前記増幅された産物の不在が前記試料内の薬剤耐性菌の不在を示す
を含む、方法。
【請求項７】
前記細菌が腸球菌のメンバーである、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記腸球菌の前記メンバーが大腸レンサ球菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的ポリヌクレオチドがｖａｎＡポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のプライマーが配列番号１を含み、前記第２のプライマーが配列番号２を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号７にハイブリダイズする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ポリヌクレオチドがｖａｎＢポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のプライマーが配列番号４を含み、前記第２のプライマーが配列番号５を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号８にハイブリダイズする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
第２のプローブを更に含み、該第２のプローブが前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭより少なくとも８℃高いＴＭを有する、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項１８】
１つのプローブがドナーフルオロフォアを含み、第２のプローブがアクセプタフルオロフォアを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が薬剤耐性菌による感染が疑われる個体由来である、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が糞便物質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料を獲得することを更に含む、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出することが、それぞれの循環工程後に実行される、請求項１、２、３、４、５、又は６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のｖａｎＡプライマーが配列番号１を含み、前記第２のｖａｎＡプライマーが配列番号２を含む、請求項２、４、又は１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のｖａｎＢプライマーが配列番号４を含み、前記第２のｖａｎＢプライマーが配列番号５を含む、請求項３、６、又は１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記増幅することが、前記生体試料をプローブと接触させることを更に含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅することが、前記第１のｖａｎＡプライマー、前記第２のｖａｎＡプライマー、及びプローブを含む混合物を形成するために前記生体試料を前記プローブと接触させることを更に含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅することが、前記第１のｖａｎＢプライマー、前記第２のｖａｎＢプライマー、及びプローブを含む混合物を形成するために生体試料を前記プローブと接触させることを更に含み、前記プローブのＴＭが、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブがフルオロフォア及びクエンチャーを含む、請求項１、４、２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出することが、フルオロフォアを検出することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅することが、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１、４、２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドを分離するための方法であって、
一本鎖ポリヌクレオチドを含む混合物を提供すること；
ハイブリッドを結果として得るために一本鎖ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの特定のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、前記混合物を前記オリゴヌクレオチドに曝露すること、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１との少なくとも約８０％同一性、配列番号２との少なくとも約８０％同一性、配列番号３との少なくとも約８０％同一性、配列番号４との少なくとも約８０％同一性、配列番号５との少なくとも約８０％同一性、又は配列番号６との少なくとも約８０％同一性から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが親和性ラベルを含む；及び
前記ハイブリッドを洗浄すること
を含む、方法。
【請求項３２】
前記曝露後に前記オリゴヌクレオチドを固相物質に付着させることを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、曝露前に固相物質に付着させられることを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記混合物が生体試料から獲得される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体試料が糞便物質を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
梱包物質、第１のｖａｎＡプライマー、第２のｖａｎＡプライマー、及びプローブを備えるキットであって、前記プローブのＴＭが、前記第１及び前記第２のｖａｎＡプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、キット。
【請求項３７】
前記プローブが、配列番号３との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号７にハイブリダイズする、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
梱包物質、第１のｖａｎＢプライマー、第２のｖａｎＢプライマー、及びプローブを備えるキットであって、前記プローブのＴＭが、前記第１及び前記第２のｖａｎＢプライマーのＴＭよりも少なくとも８℃高い、キット。
【請求項３９】
前記プローブが、配列番号６との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号８にハイブリダイズする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記プローブが、フルオロフォア及びクエンチャーを含む、請求項３６又は３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のプライマーが配列番号１を含み、前記第２のプライマーが配列番号２を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４２】
前記第１のプライマーが配列番号４を含み、前記第２のプライマーが配列番号５を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４３】
梱包物質、第１のｖａｎＡプライマー、及び第２のｖａｎＡプライマーを備えるキットであって、前記第１のプライマーが配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを増幅する、キット。
【請求項４４】
前記第１のプライマーが配列番号１を含み、前記第２のプライマーが配列番号２を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
梱包物質、第１のｖａｎＢプライマー、及び第２のｖａｎＢプライマーを備えるキットであって、前記第１のプライマーが配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記第２のプライマーが配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含み、プライマー対が配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを増幅する、キット。
【請求項４６】
前記第１のプライマーが配列番号４を含み、前記第２のプライマーが配列番号５を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
配列番号１との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号２と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号２との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号１と共に用いられる際、配列番号７の６４８〜７５１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号４との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、約１３９ヌクレオチドの増幅産物を結果として得るために前記ポリヌクレオチドが配列番号５と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号５との少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが配列番号４と共に用いられる際、配列番号８の４９２〜６３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチド。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３６３４３（Ｐ２０１０−５３６３４３Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１１１３（Ｐ２０１０−５２１１１３）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７２８４０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３２４８６
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７２８４０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３２４８６
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
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