血小板凝集反応評価方法、及び血小板凝集反応評価装置
【課題】繰り返し計算をすることなく、光散乱法の測定結果を利用して、血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。
【解決手段】試料中の血小板凝集塊のサイズ（大中小のサイズ）及び数密度を光散乱法によって測定し、該測定結果と反応速度論とに基づいて図３で示すような反応速度定数行列を求める。この反応速度定数行列の各要素を解析することにより、血小板の凝集反応を定量的に評価する。例えば、破線１で囲まれる要素は凝集反応を示し、破線２で囲まれる要素は脱凝集反応を示しているので、数値を比較することにより、全体として凝集に向かっているか脱凝集に向かっているかを判断することができる。解析の際に解の収束性を考慮する必要が無いので、繰り返し計算をする必要が無く、解析の時間を短くすることができる。
【解決手段】試料中の血小板凝集塊のサイズ（大中小のサイズ）及び数密度を光散乱法によって測定し、該測定結果と反応速度論とに基づいて図３で示すような反応速度定数行列を求める。この反応速度定数行列の各要素を解析することにより、血小板の凝集反応を定量的に評価する。例えば、破線１で囲まれる要素は凝集反応を示し、破線２で囲まれる要素は脱凝集反応を示しているので、数値を比較することにより、全体として凝集に向かっているか脱凝集に向かっているかを判断することができる。解析の際に解の収束性を考慮する必要が無いので、繰り返し計算をする必要が無く、解析の時間を短くすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価方法及び血小板凝集反応評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血小板の凝集反応を評価する方法としては濁度法や光散乱法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
このうちの濁度法は、
・ 血液を遠心分離して多血小板血漿（ＰＲＰ；Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）を得る工程
・ 該多血小板血漿を所定の温度に加温する工程
・ 攪拌している状態の該多血小板血漿に凝集惹起剤を添加する工程
・ 該凝集惹起剤を添加した後の光透過率の変化を測定する工程
からなる。凝集惹起剤の添加に伴って凝集反応が始まるまでは、光を遮る血小板が多く含まれるので光透過率は小さいが、凝集反応が進んで血小板が互いに結合されて凝集塊を形成するにつれ、該血漿を透過する光の割合が増加する。濁度法は、この原理を利用したものであり、光の透過率を血小板凝集の指標にしている。他方の光散乱法は、
・ 血液を遠心分離して多血小板血漿を得る工程
・ 該多血小板血漿を所定の温度に加温する工程
・ 攪拌している状態の該多血小板血漿に凝集惹起剤を添加する工程
・ 該多血小板血漿にレーザー光を照射する工程
・ レーザー光の照射により生じた散乱光の強度から凝集塊のサイズと数密度を測定する工程
からなる。
【０００４】
上述の濁度法においては、活性化に伴って血小板の形状が変化したり、内部顆粒が血小板外に放出されたりすると、光の透過率が大きな影響を受けてしまって凝集反応の測定が不可能になるという問題があり、また、凝集反応が微弱な場合には該凝集を検出できないという問題があった。他方の光散乱法においてはそのような問題は無いものの、測定者の熟練度に応じて測定結果が異なってしまうという問題があった。
【０００５】
そこで、このような問題を解決するものとして、血小板の凝集反応を定量的に評価する方法が提案されている。その一つは、粒子数収支モデルに衝突効率や凝集塊の空隙率という変数を導入して血小板凝集反応の定量化を行おうとしたものであり、
・ ずり応力下における血小板凝集反応を定量化する方法や、
・ モンテカルロ法による確率論モデルを組み合わせて、ずり応力下における血小板と白血球（好中球）のヘテロ型凝集反応のシミュレーションを行う方法
などが挙げられる。また、移流拡散方程式を用いた２体衝突理論に基づく数理モデルの適用例も提案されており、
・ アデノシン２リン酸（ＡＤＰ；Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）によって惹起される凝集の定量化、
・ 低濃度ＡＤＰ惹起による自然凝集の定量化、
・ ポアズイユ流れ中におけるコラーゲン凝集の定量化
などが報告されている。
【特許文献１】特開平０６−５０８７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述の評価方法（つまり、血小板の凝集反応を定量的に評価する方法）では、幾つかの問題があった。例えば、上述の評価方法では粒子サイズ分布を計算で求めるようになっているが、その計算精度を高めるためには繰り返し計算をする必要があり、その計算に時間が掛かってしまうという問題があった。また、上述の光散乱法による測定結果を上述の評価方法に利用しようとした場合、光散乱法では大中小の３つのサイズに分けて各凝集塊の数密度を測定するのに対し、上述の評価方法では、より細かくサイズ分けしたデータが必要であるため、該光散乱法の測定結果の利用が困難であるという問題があった。
【０００７】
本発明は、上述の問題を解消できる血小板凝集反応評価方法及び血小板凝集反応評価装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る発明は、試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価方法において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める工程と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める工程と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程と、からなることを特徴とする。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明において、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化は、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出することを特徴とする。
【００１０】
請求項３に係る発明は、請求項１又は２に係る発明において、前記血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化の測定は時間分解式レーザー散乱法により行うことを特徴とする。
【００１１】
請求項４に係る発明は、請求項３に係る発明において、前記時間分解式レーザー散乱法の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出することを特徴とする。
【数１９】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【００１２】
請求項５に係る発明は、請求項３又は４に係る発明において、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求めることを特徴とする。
【数２０】
【００１３】
請求項６に係る発明は、請求項５に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求めることを特徴とする。
【００１４】
請求項７に係る発明は、請求項５又は６に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数２１】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数２２】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求めることを特徴とする。
【数２３】
【００１５】
請求項８に係る発明は、請求項７に係る発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数２４】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数２５】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整することを特徴とする。
【００１６】
請求項９に係る発明は、請求項７又は８に記載の発明において、凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数２６】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数２７】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【００１７】
請求項１０に係る発明は、請求項７又は８に記載の発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【００１８】
請求項１１に係る発明は、試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価装置において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する凝集塊測定手段と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める未凝集血小板解析手段と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める差分データ算出手段と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める反応速度定数行列算出手段と、からなることを特徴とする。
【００１９】
請求項１２に係る発明は、請求項１１に係る発明において、前記未凝集血小板解析手段は、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出することを特徴とする。
【００２０】
請求項１３に係る発明は、請求項１１又は１２に係る発明において、前記凝集塊測定手段による測定は時間分解式レーザー散乱法により行うことを特徴とする。
【００２１】
請求項１４に係る発明は、請求項１３に係る発明において、前記凝集塊測定手段の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出することを特徴とする。
【数２８】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
ことを特徴とする。
【００２２】
請求項１５に係る発明は、請求項１３又は１４に係る発明において、前記反応速度定数行列算出手段は、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求めることを特徴とする。
【数２９】
【００２３】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求めることを特徴とする。
【００２４】
請求項１７に係る発明は、請求項１５又は１６に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数３０】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数３１】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求めることを特徴とする。
【数３２】
【００２５】
請求項１８に係る発明は、請求項１７に係る発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数３３】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数３４】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整することを特徴とする。
【００２６】
請求項１９に係る発明は、請求項１７又は１８に係る発明において、凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数３５】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数３６】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【００２７】
請求項２０に係る発明は、請求項１７又は１８に係る発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
請求項１乃至２０に係る発明によれば、血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。また、解の収束性を考慮する必要が無いため、従来の方法のような繰り返し計算は不要であり、解析の時間を短くすることができる。さらに、反応速度定数行列を求めるために必要な数値は、測定（時間分解式レーザー散乱法による測定）及び計算（未凝集血小板の数密度の算出）によって得ることができるため、解析を簡単に行うことができる。また、従来方法のように、血小板の衝突効率等の変数を導入する必要が無いので、該変数による影響を排除でき、精度の良い評価を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、図１乃至図９に沿って、本発明を実施するための最良の形態について説明する。ここで、図１(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(b) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に１００μＭ濃度のエピネフリンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(d) は、凝集惹起剤に１μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図である。また、図２は、未凝集血小板、小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊相互間の状態遷移の経路の一例を示す模式図であり、図３は、反応速度定数行列を説明するための図であり、図４(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c)
は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。さらに、図５(a) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b)
は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。また、図６(a)
は、平均凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図であり、同図(b) は、平均脱凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図である。さらに、図７(a) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。また、図８(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの実測データ（ＴＲＬＳ法による測定結果）及び濁度を示す図であり、同図(b) は、小凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(c)
は、中凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(d) は、大凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図である。さらに、図９(a) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。
【００３０】
本発明に係る血小板凝集反応評価方法は、試料中（具体的には、多血小板血漿試料中）における血小板の凝集反応を定量的に評価する方法であって、
(1) 前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程
(2) 前記試料中における未凝集血小板（つまり、活性化されていない血小板や、活性化されてはいるがまだ凝集していない血小板）の数密度の経時的変化を求める工程
(3) 前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める工程
(4) 前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データ等から、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程
からなることを特徴とする。これにより、求めた該反応速度定数行列から血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。以下、各工程について具体的に説明する。
【００３１】
(1) 試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程
【００３２】
まず、試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する。該測定には、血小板凝集測定法のうちの光散乱法を用いると良く、特に、時間分解式レーザー散乱法（ＴＲＬＳ法：Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いると良い。該ＴＲＬＳ法では、凝集塊を大・中・小の３種類のサイズに分類し、サイズ毎の計数結果（数密度）を一定時間毎（例えば、１０秒毎）に移動加算し、時系列データを求めると良い。例えば、図１(a) はそのようにして求めた時系列データをグラフにしたものであり、Ｓは小凝集塊の数密度の経時的変化を示し、Ｍは中凝集塊の数密度の経時的変化を示し、Ｌは大凝集塊の数密度の経時的変化を示す。なお、それらの詳細については実施例１及び３にて説明する。
【００３３】
(2) 未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める工程
【００３４】
上述のＴＲＬＳ法では、小凝集塊や中凝集塊や大凝集塊の数密度を測定することは可能であるが、未凝集血小板の数密度を測定することはできない。そこで、本発明においては、未凝集血小板の数密度は、小凝集塊や中凝集塊や大凝集塊の測定結果から算出するようにした。
【００３５】
いま、小凝集塊の数密度を［Ｓ］とし、中凝集塊の数密度を［Ｍ］とし、大凝集塊の数密度を［Ｌ］とし、未凝集血小板の数密度を［Ｎ］とすると、次の（１）式が成立する。この式において、［Ｓ］［Ｍ］［Ｌ］は上述の工程で各時刻毎に求められ、ｎＳ，ｎＭ，ｎＬ，ｎＴは後述の方法で求めることができる定数であるので、これらより、各時刻毎の［Ｎ］を算出することができる。
【数３７】
【００３６】
ここで、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数であり、ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数であり、ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数であり、ｎＴは、試料中の血小板数密度である。ｎＳ，ｎＭ，ｎＬは、次のようにして見積もると良い。本発明者らが、未凝集血小板、小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊のそれぞれの平均粒径を散乱光強度から見積もったところ、２．０μｍ，６．７μｍ，１５．０μｍ，２３．０μｍであった。それらを球形と仮定したときの体積は、各々 ４．２μｍ3，１５８μｍ3，１７６７μｍ3，６３７０μｍ3となる。したがって、ｎＳ，ｎＭ，ｎＬは、次の（２）式で求められることとなる。
【数３８】
【００３７】
一方、ｎＴの値は、事前に測定した血液中の総血小板数密度のデータと血液から採取されたＰＲＰの容量から算出した。
【００３８】
なお、未凝集血小板の数密度を上述のような計算で求めるのではなく、公知の方法（ＴＲＬＳ法以外の方法）で測定するようにしても良い。例えば、測定したい試料を２つに分け、一方の試料では上記(1) のように血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定し、他方の試料では未凝集血小板の数密度を測定すると良い。
【００３９】
(3) 前記血小板凝集塊の測定結果及び前記未凝集血小板の算出結果のそれぞれの差分データを求める工程
【００４０】
本工程では、前記(1) の工程の測定結果（小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊の数密度の時系列データ）、及び前記(2) の工程の算出結果（未凝集血小板数密度の時系列データ）について、それぞれ差分データを求める。
【００４１】
(4) 反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程
【００４２】
上述の未凝集血小板Ｎ、小凝集塊Ｓ、中凝集塊Ｍ及び大凝集塊Ｌの４つのコンパートメント間の状態遷移が、図２に示す反応経路に沿って行われると想定し、反応経路毎に反応速度定数ｋij（但し，ｉ＝Ｎ，Ｓ，Ｍ，Ｌ，ｊ＝Ｎ，Ｓ，Ｍ，Ｌ，ｉ≠ｊ）を設定した。図示のモデルでは、
・ ＮとＮ，ＮとＳ，あるいは，ＳとＳが結合しＳに、
・ ＮとＳ，ＮとＭ，ＳとＭ，あるいは，ＭとＭが結合しＭに、
・ ＳとＭ，ＭとＭ，ＳとＬ，ＭとＬ，あるいは，ＬとＬが結合しＬに
それぞれ凝集する場合を想定している。また、同様に、脱凝集反応については、
・ Ｓが解離して，ＮとＮ，ＮとＳ，あるいは，ＳとＳに、
・ Ｍが解離して，ＮとＳ，ＮとＭ，ＳとＭ，あるいは，ＭとＭに、
・ Ｌが解離して，ＳとＭ，ＭとＭ，ＳとＬ，ＭとＬ，あるいは，ＬとＬに
それぞれ解離する場合を考慮に入れている。
【００４３】
これらの反応経路によって構成される血小板凝集反応（ある時刻における血小板凝集反応）を反応速度論を用いて数式化すると、次の（３）式のようになる。
【数３９】
【００４４】
ここで、上式の左辺の∂［Ｎ］（ｔ）／∂ｔは、ある時刻ｔにおける未凝集血小板数密度の時間変化を示すもの（つまり、上述の差分データ）であり、∂［Ｓ］（ｔ）／∂ｔは小凝集塊数密度の差分データ、∂［Ｍ］（ｔ）／∂ｔは中凝集塊数密度の差分データ、∂［Ｌ］（ｔ）／∂ｔは大凝集塊の差分データである。また、［Ｎ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける未凝集血小板の凝集塊数密度であり、［Ｓ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける小凝集塊の凝集塊数密度であり、［Ｍ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける中凝集塊の凝集塊数密度であり、［Ｌ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける大凝集塊の凝集塊数密度である。（３）式は、各時刻におけるデータを重畳して表現されている。
【００４５】
この（３）式において、２つ目の行列（反応速度定数行列）は、血小板凝集反応の程度と様式を示すものであり（詳細は後述する）、血小板凝集反応の程度と様式を定量的に評価するには、該反応速度定数行列を求める必要がある。以下、該反応速度定数行列を求める方法について説明する。
【００４６】
上記（３）式中の各行列を、Ｙ，Ｌ，Ｘで置き換えると、（３）式は次の（４）式のようになる。
【数４０】
【００４７】
この（４）式を次のように変形すると、反応速度定数行列Ｌを求めることができる。
【数４１】
【００４８】
しかしながら、上述の（３）式の場合、未知数の数は反応速度定数行列の要素の数、つまり１６個であるのに対して、方程式の数は多く（仮に、４２０秒間に１０秒毎の測定を行った場合は、方程式の数は、４×４２０÷１０＝１６８個となる。）、解は一意的には決まらない。そこで、上記（３）式を解くにはＭｏｏｒｅ−Ｐｅｎｒｏｓｅの一般逆行列を用いる。そのために、まず、（６）式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解する。
【数４２】
【００４９】
このとき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋は次の（７）式のように表されるため、（６）式で得られた行列Ｕ、対角化行列Ｓ、及び行列ＶＴを用い、一般逆行列Ｘ＋を計算する。
【数４３】
【００５０】
そして、この（７）式を上記（５）式に代入すると、（８）式のようになる。
【数４４】
【００５１】
ここで、Ｌ∧はＬの推定値であることを意味する。このようにして、Ｘの一般逆行列Ｘ＋と実験データの差分行列Ｙから反応速度定数行列Ｌ∧を計算する。
【００５２】
なお、系全体をスカラ倍した解もまた同じ方程式を満たすことから、得られた解はスカラ倍の自由度を持つ。そこで、一旦得られたＬ∧から、差分行列Ｙ∧＝Ｌ∧Ｘを再計算し、その要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcを用いて次の（９）式より、元の時系列データを再計算する。
【数４５】
【００５３】
但し、[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcには、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値として実測値を用いた。こうして得られた[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）の最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整した。
【００５４】
なお、実際の血小板凝集反応では反応速度定数は時間と共に漸次変化するが、血小板凝集反応は複雑な反応であり、種々の素反応がカスケード式に起こり、これら素反応の組み合わせによって一つ一つの反応が構成されているという事実から、本発明では、各反応における反応速度定数が時間によって漸次変化するものではなく、幾つかのタイミングで段階的に変化するものと考えて解析を行った。具体的には、測定時間４２０秒を４段階に分け、
(i) 凝集惹起剤添加前（測定開始後０〜３０秒）
(ii) 惹起剤添加後１１０秒間（測定開始後３０〜１４０秒）
(iii) その後の１４０秒間（測定開始後１４０〜２８０秒）
(iv) その後１４０秒間（測定開始後２８０〜４２０秒）
とし（図４及び図５等参照）、段階(i) では、反応に変化がないと仮定して∂［Ｓ］／∂ｔを強制的に０に固定する。残りの３段階については、(ii)〜(iv)の各段階でのデータから、３種類の反応速度定数行列を計算した。ここで、反応が弱い場合など、上記の４段階に分けると行列が求められない場合は、全４２０秒間のデータのうち、凝集惹起剤添加を添加した後の３９０秒間の全データを用いて、１種類の反応速度定数行列を求めた。
【００５５】
反応速度定数行列を図３に示すが、符号１の破線で囲まれる下三角要素（ｋＮＳ，ｋＮＭ，ｋＮＬ，ｋＳＭ，ｋＳＬ，ｋＭＬ）は凝集に向かう各反応の反応速度定数を表しているとみることができ、符号２の破線で囲まれる上三角要素（ｋＳＮ，ｋＭＮ，ｋＭＳ，ｋＬＮ，ｋＬＳ，ｋＬＭ）は脱凝集に向かう各反応の反応速度定数を表しているとみることができる。反応速度定数はその反応が起こる確率を表わすので、該反応速度定数を利用することによって、その反応の起こり易さの指標を作ることができる。具体的には、反応速度定数と凝集塊数密度とを掛けて求めた反応速度を利用することによって、その反応の起り易さの指標を作ることができる。そのような指標としては、
Ａ． 反応経路毎に求めた反応速度や、
Ｂ． 反応経路毎に求めた反応速度を、上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせた値
を挙げることができる。さらに具体的には、上記Ａの反応速度（反応経路別の反応速度）としては、
Ａ−１． ある反応経路の反応速度定数ｋｉｊと、その反応経路での凝集塊数密度（ある時刻の凝集塊数密度）Ｃｉｊとの積により求めた、ある時刻での反応速度ｖｉｊ（下記の（１０）式参照）や、
Ａ−２． 上記反応速度ｖｉｊを、ある時刻からある時刻までの間 複数回（複数個）求めて、それら複数の反応速度ｖｉｊの総和を取ったものｓｉｊ（下記の（１１）式参照。以下、“反応経路別の反応速度和”と称する）や、
Ａ−３． 上記反応速度ｖｉｊを、ある時刻からある時刻までの間 複数回（複数個：ｎ）求めて、それら複数の反応速度ｖｉｊの平均を算出したもの（下記の（１２）式参照。）
などを挙げることができる。これらの値のいずれかを各反応経路毎に比較すれば、その反応を起り易さを推定することができる（詳細は実施例３にて説明する）。
【数４６】
【数４７】
【数４８】
【００５６】
一方、上記Ｂの値としては、上記Ａ−１の値を上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせたものや、上記Ａ−２の値を上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせたものや、上記Ａ−３の値を上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせたものなどを挙げることができる。下記の（１３）式は、上記Ａ−２の値を上記下三角要素に関して足し合わせたもの（以下、“平均凝集速度”と称する）を示し、（１４）式は、上記Ａ−２の値を上記上三角要素に関して足し合わせたもの（以下、“平均脱凝集速度”と称する）を示す。これらの平均凝集速度と平均脱凝集速度は、起きている反応が全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを判別することができる指標となる。また、下記の（１５）式は、上記Ａ−３の値を上記下三角要素に関して足し合わせたものを示し、下記の（１６式は、上記Ａ−３の値を上記上三角要素に関して足し合わせたものを示す。
【数４９】
【数５０】
【数５１】
【数５２】
【００５７】
このように、本方法によれば、並列に起こっている凝集および脱凝集反応によって決定されている各時点でのＮ，Ｓ，Ｍ，Ｌの数密度を凝集反応による成分と脱凝集反応による成分に分解し、各々の平均反応速度を計算することができるため、従来のＴＲＬＳ法の問題点を解決することができる。また、どの経路の凝集や解離が発生したかという反応様式は、要素の配列位置によって識別することができる。この場合は、上述の反応速度（各経路別の反応速度等）を指標として用いることができる。なお、未凝集血小板(Ｎ)，小(Ｓ)，中(Ｍ)，大(Ｌ)凝集塊の数が同じでない場合には、「反応速度定数×関与した凝集塊数の和」なども指標となり得る。したがって、本方法によれば、凝集反応を反応経路ごとに分類した上で、各々の反応速度定数を定量化することができる。
【００５８】
本発明によれば、血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。また、本発明によれば、解の収束性を考慮する必要が無いため、従来の方法のような繰り返し計算は不要であり、解析の時間を短くすることができる。さらに、本発明によれば、反応速度定数行列を求めるために必要な数値は、測定（時間分解式レーザー散乱法による測定）及び計算（未凝集血小板の数密度の算出）によって得ることができるため、解析を簡単に行うことができる。また、従来方法のように、血小板の衝突効率等の変数を導入する必要が無いので、該変数による影響を排除でき、精度の良い評価を行うことができる。さらに、血栓性疾患の診断はもちろん、アスピリンや抗血小板薬、あるいは、新しく開発されている抗凝集薬剤などの抑制・亢進機能の定量的評価に応用できるものと期待される。
【００５９】
一方、本発明に係る血小板凝集反応評価装置は、試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価するものであって、
・ 前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する凝集塊測定手段と、
・ 前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める未凝集血小板解析手段と、
・ 前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める差分データ算出手段と、
・ 前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データ等から、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める反応速度定数行列算出手段と、
からなる。この場合、前記凝集塊測定手段による測定は時間分解式レーザー散乱法により行うと良い。また、上述の未凝集血小板解析手段は、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出するようにすると良い。具体的には、前記凝集塊測定手段の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出するようにすると良い。
【数５３】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【００６０】
なお、未凝集血小板の数密度を上述のような計算で求めるのではなく、公知の方法（ＴＲＬＳ法以外の方法）で測定するようにしても良い。例えば、測定したい試料を２つに分け、一方の試料では上記のように血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定し、他方の試料では未凝集血小板の数密度を測定すると良い。
【００６１】
さらに、前記反応速度定数行列算出手段は、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求めると良い。
【数５４】
【００６２】
前記反応速度行列は、前記（３）式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより求めても良い。例えば、上式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数５５】
上式の行列Ｕ，Ｓ，ＶＴに基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数５６】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求めるようにすると良い。
【数５７】
【実施例１】
【００６３】
本実施例においては、本評価方法の妥当性を評価するために、多血小板血漿試料を濃度の異なるアデノシン２リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＡＤＰ）で惹起したときの凝集反応程度の変化を解析した。
【００６４】
〈２μＭ濃度のＡＤＰを使用した場合の解析〉
まず、２２ゲージの翼状針（テルモ株式会社製、ＳＶ−２１ＣＬ）を使って、一人の被検者（健常者）Ａから２０ｍｌの血液を採取し、該血液に抗凝固剤（採血した血液量の１／１０の量の３．８％クエン酸ナトリウム溶液）を加え、１５０Ｇで１０分間だけ穏やかに遠心分離をし、その上清よりＰＲＰを採取した。ＰＲＰ採取後の血液を、さらに９００Ｇで１０分間だけ遠心分離をし、その上層からＰＰＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ、乏血小板血漿）を採取した。そして、合計の量が１０ｍｌとなるように、このＰＰＰを上述のＰＲＰに加え、調整した。なお、その被検者Ａからは、５ｍｌの血液をさらに採取し、市販されている血球計数装置にて、総血小板数を測定した。
【００６５】
上述のように調整したＰＲＰ試料をレーザー散乱粒子計測型血小板凝集能測定装置（興和株式会社製、ＰＡ−２００Ｂ）にかけ、血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定した。具体的には、ＰＲＰ試料３００μｌをスターラ入り専用キュベット（直径が５．６ｍｍの円筒状キュベット）に入れ、攪拌し、測定を開始した。この間、ＰＲＰ試料はスターラによって攪拌されており、０．８２ｄｙｎ／ｃｍ２程度のずり応力が作用している状態（末梢血管中で作用するずり応力のおよそ１／３０）となる。そして、このキュベットに赤色レーザー（波長：λ＝６５０ｎｍ)を照射すると、血小板凝集塊にて散乱光が発生するが、その９０°散乱光をフォトダイオードで検出し、得られた光散乱信号のピークから散乱光強度を取得し、凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定した。
【００６６】
なお、本実施例においては、測定開始後３０秒で、ＰＲＰ試料に凝集惹起剤を添加した。この凝集惹起剤としては、６０μＭ濃度のＡＤＰ（シグマアルドリッチ社製、Ａ２７５４）を精製水にて希釈し、最終濃度が２μＭとなるものを用いた。そして、凝集惹起剤を添加して６分３０秒が経過した時点で測定を終了した。そのように測定して得た時系列データを図１(a) に示す。この場合、ＡＤＰを添加すると直ちに血小板が凝集して、小凝集塊の数が急激に増加することが分った。最初は、放出反応を伴わない、可逆性の（一度凝集した凝集塊が再び解離する）一次凝集が起こり、その後、放出反応が誘発され不可逆性の二次凝集へと進み、中凝集塊の数や大凝集塊の数が増加していくことが分った。中凝集塊が増えるときは小凝集塊の数が減っていくように見え、大凝集塊が増えるときは小・中凝集塊の数が減っていくように見えるが、これは小・中凝集塊が大きくなり、中・大凝集塊へ移行するからである。反応の最後には大凝集塊も減っているように見えるが、これは、大凝集塊に分類される凝集塊がさらにその大きさを大きくしても、その凝集塊の分類が大凝集塊のまま変わらないため、数だけが減っていくように見えるためである。
【００６７】
図１(a) に示した時系列データを解析した結果を図４に示す。同図(a)
は小凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(b) は中凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(c) は大凝集塊数密度の経時的変化を示す。各図中の実線はＴＲＬＳ法での測定結果を示し、破線は本方法による計算結果を示す。いずれの場合も、測定結果と計算結果とはほぼ近似していることが分った。
【００６８】
次に、上述の方法により反応速度定数行列を求めた。解析の結果得られた行列は以下の通りであった。
【数５８】
【００６９】
〈０．６μＭ濃度のＡＤＰを使用した場合の解析〉
次に、６０μＭ濃度のＡＤＰ（シグマアルドリッチ社製、Ａ２７５４）を精製水にて希釈し、最終濃度が０．６μＭとなる凝集惹起剤を調整した。この凝集惹起剤を用いて、上述と同様の測定及び解析を行った。上述のレーザー散乱粒子計測型血小板凝集能測定装置にて測定して得た時系列データを図１(b) に示す。この惹起剤を用いた場合には、小凝集塊はできるけれども、中・大凝集塊へ発達せずに小凝集塊が解離し、再び血小板へと戻るという、可逆性の一次凝集のみの反応となっていることが分った。
【００７０】
この時系列データを解析した結果を図５に示す。同図(a) は小凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(b) は中凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(c) は大凝集塊数密度の経時的変化を示す。各図中の実線はＴＲＬＳ法での測定結果を示し、破線は本方法による計算結果を示す。小凝集塊及び大凝集塊の計算結果は、数密度の値及び変化の様子が測定結果にほぼ近似しており、中凝集塊の計算結果は、数密度の値こそ差異があるものの変化の様子が測定結果にほぼ近似していることが分った。
【００７１】
次に、上述と同様に反応速度定数行列を求めた。解析の結果得られた行列は以下の通りであった。
【数５９】
【００７２】
〈２つの解析結果の比較〉
上述のようにして得られた２つの反応速度定数行列を比較すると、２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した凝集（（１７）式参照）では、凝集を表す下三角要素のうちｋＳＬを除く要素（図３のｋＮＳ，ｋＮＭ，ｋＮＬ，ｋＳＭ，ｋＭＬに相当する要素）が、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合（（１８）式参照）よりも大きくなっていることが分った。また、脱凝集を表す上三角要素のうちｋＭＮ，ｋＬＳ，ｋＬＭを除く要素（図３のｋＳＮ，ｋＭＳ，ｋＬＮに相当する要素）は０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の方が大きくなっていることが分った。但し、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の大凝集塊の数密度は、図５(c)
に示されるように０であるため、その反応速度定数行列の要素（第４行と第４列の要素）は意味を持たないことに留意する必要がある。したがって、それ以外の要素（つまり、１〜３行、１〜３列の要素）で比較する必要があり、ｋＭＮ以外の要素では、高濃度のＡＤＰで惹起した場合の方が強い凝集反応が起こっていることを示しているとみることができる。
【００７３】
上述の反応速度定数行列から上述の平均凝集速度（（１３）式参照）と平均脱凝集速度（（１４）式参照）とを計算し、ＡＤＰ濃度との関係を図６(a) (b) に示した。この図より、
・ 平均凝集速度は、ＡＤＰ濃度が増えると線形に増加し、
・ 平均脱凝集速度は、ＡＤＰ濃度が増えると線形に減少する
ことが分った。この結果は、平均凝集速度や平均脱凝集速度が、血小板の凝集反応の程度を表わす指標となり得る可能性を示唆するものである。
【００７４】
さらに、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合について、上述した（１１）式の値（つまり、反応経路別の反応速度和）を反応経路毎に求めた。図７(a) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。なお、縦軸のスケールは、反応速度和の最大値を１としている。ここで、説明の便宜上、０．６μＭ濃度のＡＤＰを“低濃度ＡＤＰ”と称し、２μＭ濃度のＡＤＰを“高濃度ＡＤＰ”と称することとすると、凝集反応を示す反応経路では、図７(a) に示すように、小凝集塊Ｓ→大凝集塊Ｌの反応経路を除き、高濃度ＡＤＰを使用した方が反応速度和は大きくなっていることが分る。また、低濃度ＡＤＰを使用した場合は、未凝集血小板Ｎ→小凝集塊Ｓの反応経路では、反応速度和はある程度の値を示しているものの、未凝集血小板Ｎ→中凝集塊Ｍの反応経路では、反応速度和は非常に小さくなっている。これにより、低濃度ＡＤＰを使用した場合には、未凝集血小板から小凝集塊は形成されるものの、中凝集塊に発達することはほとんど無いことが推察できる。これは上述したとおり、ADP濃度の高いほど凝集反応が強く惹起されていることを表している。他方の脱凝集反応を示す反応経路では、図７(b) に示すように、低濃度ADPを使用したときの反応速度和は、
・ 小凝集塊Ｓ→未凝集血小板Ｎの反応経路
・ 中凝集塊Ｍ→未凝集血小板Ｎの反応経路
・ 中凝集塊Ｍ→小凝集塊Ｓの反応経路
である程度の値を示していた。これらの結果から、低濃度ADPを用いた場合には、小凝集塊Ｓや中凝集塊Ｍが形成されたとしても直ちに解離して未凝集凝集塊Ｎや小凝集塊Ｓに戻るといった反応になっていることがわかり、反応が一次凝集に留まっていることを意味していると考えられる。これに対し、高濃度ADPを用いた場合には、中凝集塊Ｍや大凝集塊Ｌが形成されるのに対し、小凝集塊Ｓから未凝集血小板Ｎの解離は低濃度ADPの場合と同程度、中凝集塊Ｍから未凝集血小板Ｎの解離はむしろ小さくなっており、反応全体として強い凝集反応が進んでいることがわかる。また、大凝集塊Ｌから小凝集塊Ｓや中凝集塊Ｍへの解離、小凝集塊Ｓや中凝集塊Ｍから未凝集血小板Ｎへの解離はみられるが、中凝集塊Ｍから小凝集塊Ｓへの反応が確認できないことは興味深い。これはこの経路の逆方向の反応が遮断されていることを示し、反応が二次凝集に進んでいることと関係があるのかもしれない。一次凝集で形成されるのは中凝集塊Ｍまでで、反応が二次凝集まで進むとはじめて中凝集塊Ｍや大凝集塊Ｌの大きな凝集塊が形成されるものと解釈できる。このように、本方法によって得られる経路ごとの反応速度和を比較することによって、ADP濃度により惹起される凝集反応が一次凝集と二次凝集に分類されることを定量的に判別することができることがわかった。
【００７５】
本実施例によれば、本評価方法によって、血小板凝集反応を凝集塊の形成機構によって分類した上で、凝集程度を定量的に評価することができる可能性が示された。
【実施例２】
【００７６】
上述と同様の方法で、別の被検者（健常者）Ｂからも血液を採取し、同様の測定及び解析を行った。図８(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの実測データ（ＴＲＬＳ法による測定結果）及び濁度を示し、同図(b)
は、小凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示し、同図(c) は、中凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示し、同図(d) は、大凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す。また、解析の結果得られた反応速度定数行列は以下の通りであった。
【数６０】
【００７７】
被検者Ｂは被検者Ａに比べて血小板凝集能が低く、被検者ＢのＰＲＰに２μＭ濃度のＡＤＰを添加した場合が被検者Ａで０．６μＭ濃度のＡＤＰを添加した場合と同程度になっていた。また、図１(b)
と図８(a) を比較すると、両者に大きな差がないことから、被検者Ｂは被検者Ａに比べて血小板凝集能が低く、２μＭのＡＤＰによる被検者Ｂの凝集と、０．６μＭのＡＤＰによる被検者Ａの凝集とは一見して同じ程度であるかのように思える。しかし、（１７）式の反応速度定数行列及び（１８）式の反応速度定数行列の各要素を比較すると、両者の値には違いが見られる。上述の平均凝集速度を計算したところ、被検者Aの7.8´10-2に対して被検者Bでの値は6.5´10-2になっており、両者の凝集反応程度の違いを数値的に示すことができた。すなわち、本方法による定量化は、パターン同士を比較するよりも詳細にデータ評価を行うことのできる可能性を示している。
【実施例３】
【００７８】
本実施例においては、
・ ６０μＭ濃度のＡＤＰ（シグマアルドリッチ社製、Ａ２７５４）を精製水で希釈して、最終濃度を２μＭとしたもの
・ ３ｍＭ濃度のエピネフリン（第一三共株式会社製、ボスミン注射液）を精製水で希釈して、最終濃度を１００μＭとしたもの
・ ３０μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを添付の緩衝液で希釈して、最終濃度を１μｇ／ｍｌとしたもの
の３種類の凝集惹起剤を使用した場合の凝集反応をそれぞれ解析し、惹起剤の種類による凝集様式の違いについて検討した。なお、凝集塊の測定方法や反応速度定数行列の解析方法は、実施例１と同じとした。
【００７９】
ＴＲＬＳ法の測定結果を図１(a) (c) (d) に示す。同図の(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときのデータを示し、同図の(c) は、凝集惹起剤に１００μＭ濃度のエピネフリンを用いたときのデータを示し、同図の(d)
は、凝集惹起剤に１μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを用いたときのデータを示す。いずれの場合も、各々の惹起剤添加後に凝集反応が始まり、小・中・大凝集塊が作られている。
【００８０】
さらに、各凝集惹起剤（つまり、２μＭ濃度のＡＤＰやエピネフリンやコラーゲン）で惹起した場合について、上述した（１１）式の値（つまり、反応経路別の反応速度和）を反応経路毎に求めた。図９(a) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。なお、縦軸のスケールは、反応速度和の最大値を１としている。
【００８１】
ＡＤＰを用いた場合は、図９(a) に示すようにｓＳＭの値が最大であった。これは、小凝集塊から中凝集塊になる反応が多いことを示している。次いでｓＭＬ，ｓＮＳの順に大きい値となっており、各々、ＭからＬ、あるいはＮからＳが形成される反応が比較的強く起こっていることがわかる。さらに、図１０(b)より、ＡＤＰは他の試薬に比べてＮからＳ・Ｍ・Ｌになる凝集が多いことがわかる。これは、ＡＤＰ添加によって表出したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）やフィブリノゲンを仲介として活性化された血小板（Ｎ）が接触することで発達していくことを示すものであり、既に文献で発表されている研究結果と一致するものである。
【００８２】
エピネフリンを用いた場合は、ｓＮＳ，ｓＳＭ，ｓＭＬがある程度の値を持ち（図９(a) 参照）、ｓＮＭ，ｓＮＬはほとんど０であるが（図９(b) 参照）、このことは、未凝集血小板Ｎから中凝集塊Ｍや大凝集塊Ｌが形成される反応はほとんどなく、未凝集血小板Ｎからは小凝集塊Ｓだけができ、小凝集塊Ｓから中・大凝集塊Ｍ，Ｌが形成される傾向が強いことを示している。このように段階的に凝集が進んでいくという結果は、未凝集血小板Ｎ同士の結合によって小凝集塊Ｓが形成され、形成された小凝集塊Ｓ同士が結合することによって中・大凝集塊Ｍ，Ｌが形成されるというエピネフリン凝集特有の凝集様式を数値的に支持する結果となっている．
【００８３】
コラーゲンを用いた場合は、エピネフリン凝集によく似た反応速度定数行列の要素構成になっていることから、コラーゲン凝集もエピネフリン凝集に似た様式で段階的に凝集が発達していくと推測することができる。凝集反応では、未凝集血小板Ｎから小・中凝集塊Ｓ，Ｍが形成される反応(ｓＮＳ，ｓＮＭ，ｓＮＬ)よりも小・中凝集塊Ｓ，Ｍから中・大凝集塊Ｍ，Ｌが形成される反応(ｓＳＭ，ｓＳＬ，ｓＭＬ)が強くなっていることが特徴的であり、反応が急速に進む傾向が強いことを示している。また、脱凝集反応では、中・大凝集塊Ｍ，Ｌから未凝集血小板Ｎになる反応(ｓＭＮ，ｓＬＮ)が強く出ており、解離反応が大きいことがわかる。これは、血小板表面に結合したプロテオグリカンとコラーゲンが結合した後、プロテオグリカンが除去されるまでの間に解離を伴う反応が起こることを示しているかもしれない。
【００８４】
これらの解析結果は、本方法による定量化によって、血小板の凝集機構を分類し、評価することができる可能性を示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(b) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に１００μＭ濃度のエピネフリンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(d) は、凝集惹起剤に１μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図である。
【図２】図２は、未凝集血小板、小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊相互間の状態遷移の経路の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、反応速度定数行列を説明するための図である。
【図４】図４(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b)は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。
【図５】図５(a) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b)は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。
【図６】図６(a) は、平均凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図であり、同図(b)は、平均脱凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図である。
【図７】図７(a) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。
【図８】図８(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの実測データ（ＴＲＬＳ法による測定結果）及び濁度を示す図であり、同図(b)は、小凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(c) は、中凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(d)は、大凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図である。
【図９】図９(a) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。
【符号の説明】
【００８６】
１ 凝集に向かう各反応の反応速度定数を示す要素
２ 脱凝集に向かう各反応の反応速度定数を示す要素
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価方法及び血小板凝集反応評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血小板の凝集反応を評価する方法としては濁度法や光散乱法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
このうちの濁度法は、
・ 血液を遠心分離して多血小板血漿（ＰＲＰ；Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）を得る工程
・ 該多血小板血漿を所定の温度に加温する工程
・ 攪拌している状態の該多血小板血漿に凝集惹起剤を添加する工程
・ 該凝集惹起剤を添加した後の光透過率の変化を測定する工程
からなる。凝集惹起剤の添加に伴って凝集反応が始まるまでは、光を遮る血小板が多く含まれるので光透過率は小さいが、凝集反応が進んで血小板が互いに結合されて凝集塊を形成するにつれ、該血漿を透過する光の割合が増加する。濁度法は、この原理を利用したものであり、光の透過率を血小板凝集の指標にしている。他方の光散乱法は、
・ 血液を遠心分離して多血小板血漿を得る工程
・ 該多血小板血漿を所定の温度に加温する工程
・ 攪拌している状態の該多血小板血漿に凝集惹起剤を添加する工程
・ 該多血小板血漿にレーザー光を照射する工程
・ レーザー光の照射により生じた散乱光の強度から凝集塊のサイズと数密度を測定する工程
からなる。
【０００４】
上述の濁度法においては、活性化に伴って血小板の形状が変化したり、内部顆粒が血小板外に放出されたりすると、光の透過率が大きな影響を受けてしまって凝集反応の測定が不可能になるという問題があり、また、凝集反応が微弱な場合には該凝集を検出できないという問題があった。他方の光散乱法においてはそのような問題は無いものの、測定者の熟練度に応じて測定結果が異なってしまうという問題があった。
【０００５】
そこで、このような問題を解決するものとして、血小板の凝集反応を定量的に評価する方法が提案されている。その一つは、粒子数収支モデルに衝突効率や凝集塊の空隙率という変数を導入して血小板凝集反応の定量化を行おうとしたものであり、
・ ずり応力下における血小板凝集反応を定量化する方法や、
・ モンテカルロ法による確率論モデルを組み合わせて、ずり応力下における血小板と白血球（好中球）のヘテロ型凝集反応のシミュレーションを行う方法
などが挙げられる。また、移流拡散方程式を用いた２体衝突理論に基づく数理モデルの適用例も提案されており、
・ アデノシン２リン酸（ＡＤＰ；Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）によって惹起される凝集の定量化、
・ 低濃度ＡＤＰ惹起による自然凝集の定量化、
・ ポアズイユ流れ中におけるコラーゲン凝集の定量化
などが報告されている。
【特許文献１】特開平０６−５０８７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述の評価方法（つまり、血小板の凝集反応を定量的に評価する方法）では、幾つかの問題があった。例えば、上述の評価方法では粒子サイズ分布を計算で求めるようになっているが、その計算精度を高めるためには繰り返し計算をする必要があり、その計算に時間が掛かってしまうという問題があった。また、上述の光散乱法による測定結果を上述の評価方法に利用しようとした場合、光散乱法では大中小の３つのサイズに分けて各凝集塊の数密度を測定するのに対し、上述の評価方法では、より細かくサイズ分けしたデータが必要であるため、該光散乱法の測定結果の利用が困難であるという問題があった。
【０００７】
本発明は、上述の問題を解消できる血小板凝集反応評価方法及び血小板凝集反応評価装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る発明は、試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価方法において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める工程と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める工程と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程と、からなることを特徴とする。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明において、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化は、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出することを特徴とする。
【００１０】
請求項３に係る発明は、請求項１又は２に係る発明において、前記血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化の測定は時間分解式レーザー散乱法により行うことを特徴とする。
【００１１】
請求項４に係る発明は、請求項３に係る発明において、前記時間分解式レーザー散乱法の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出することを特徴とする。
【数１９】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【００１２】
請求項５に係る発明は、請求項３又は４に係る発明において、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求めることを特徴とする。
【数２０】
【００１３】
請求項６に係る発明は、請求項５に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求めることを特徴とする。
【００１４】
請求項７に係る発明は、請求項５又は６に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数２１】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数２２】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求めることを特徴とする。
【数２３】
【００１５】
請求項８に係る発明は、請求項７に係る発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数２４】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数２５】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整することを特徴とする。
【００１６】
請求項９に係る発明は、請求項７又は８に記載の発明において、凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数２６】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数２７】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【００１７】
請求項１０に係る発明は、請求項７又は８に記載の発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【００１８】
請求項１１に係る発明は、試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価装置において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する凝集塊測定手段と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める未凝集血小板解析手段と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める差分データ算出手段と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める反応速度定数行列算出手段と、からなることを特徴とする。
【００１９】
請求項１２に係る発明は、請求項１１に係る発明において、前記未凝集血小板解析手段は、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出することを特徴とする。
【００２０】
請求項１３に係る発明は、請求項１１又は１２に係る発明において、前記凝集塊測定手段による測定は時間分解式レーザー散乱法により行うことを特徴とする。
【００２１】
請求項１４に係る発明は、請求項１３に係る発明において、前記凝集塊測定手段の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出することを特徴とする。
【数２８】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
ことを特徴とする。
【００２２】
請求項１５に係る発明は、請求項１３又は１４に係る発明において、前記反応速度定数行列算出手段は、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求めることを特徴とする。
【数２９】
【００２３】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求めることを特徴とする。
【００２４】
請求項１７に係る発明は、請求項１５又は１６に係る発明において、前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数３０】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数３１】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求めることを特徴とする。
【数３２】
【００２５】
請求項１８に係る発明は、請求項１７に係る発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数３３】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数３４】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整することを特徴とする。
【００２６】
請求項１９に係る発明は、請求項１７又は１８に係る発明において、凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数３５】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数３６】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【００２７】
請求項２０に係る発明は、請求項１７又は１８に係る発明において、求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
請求項１乃至２０に係る発明によれば、血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。また、解の収束性を考慮する必要が無いため、従来の方法のような繰り返し計算は不要であり、解析の時間を短くすることができる。さらに、反応速度定数行列を求めるために必要な数値は、測定（時間分解式レーザー散乱法による測定）及び計算（未凝集血小板の数密度の算出）によって得ることができるため、解析を簡単に行うことができる。また、従来方法のように、血小板の衝突効率等の変数を導入する必要が無いので、該変数による影響を排除でき、精度の良い評価を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、図１乃至図９に沿って、本発明を実施するための最良の形態について説明する。ここで、図１(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(b) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に１００μＭ濃度のエピネフリンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(d) は、凝集惹起剤に１μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図である。また、図２は、未凝集血小板、小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊相互間の状態遷移の経路の一例を示す模式図であり、図３は、反応速度定数行列を説明するための図であり、図４(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c)
は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。さらに、図５(a) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b)
は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。また、図６(a)
は、平均凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図であり、同図(b) は、平均脱凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図である。さらに、図７(a) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。また、図８(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの実測データ（ＴＲＬＳ法による測定結果）及び濁度を示す図であり、同図(b) は、小凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(c)
は、中凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(d) は、大凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図である。さらに、図９(a) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。
【００３０】
本発明に係る血小板凝集反応評価方法は、試料中（具体的には、多血小板血漿試料中）における血小板の凝集反応を定量的に評価する方法であって、
(1) 前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程
(2) 前記試料中における未凝集血小板（つまり、活性化されていない血小板や、活性化されてはいるがまだ凝集していない血小板）の数密度の経時的変化を求める工程
(3) 前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める工程
(4) 前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データ等から、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程
からなることを特徴とする。これにより、求めた該反応速度定数行列から血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。以下、各工程について具体的に説明する。
【００３１】
(1) 試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程
【００３２】
まず、試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する。該測定には、血小板凝集測定法のうちの光散乱法を用いると良く、特に、時間分解式レーザー散乱法（ＴＲＬＳ法：Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いると良い。該ＴＲＬＳ法では、凝集塊を大・中・小の３種類のサイズに分類し、サイズ毎の計数結果（数密度）を一定時間毎（例えば、１０秒毎）に移動加算し、時系列データを求めると良い。例えば、図１(a) はそのようにして求めた時系列データをグラフにしたものであり、Ｓは小凝集塊の数密度の経時的変化を示し、Ｍは中凝集塊の数密度の経時的変化を示し、Ｌは大凝集塊の数密度の経時的変化を示す。なお、それらの詳細については実施例１及び３にて説明する。
【００３３】
(2) 未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める工程
【００３４】
上述のＴＲＬＳ法では、小凝集塊や中凝集塊や大凝集塊の数密度を測定することは可能であるが、未凝集血小板の数密度を測定することはできない。そこで、本発明においては、未凝集血小板の数密度は、小凝集塊や中凝集塊や大凝集塊の測定結果から算出するようにした。
【００３５】
いま、小凝集塊の数密度を［Ｓ］とし、中凝集塊の数密度を［Ｍ］とし、大凝集塊の数密度を［Ｌ］とし、未凝集血小板の数密度を［Ｎ］とすると、次の（１）式が成立する。この式において、［Ｓ］［Ｍ］［Ｌ］は上述の工程で各時刻毎に求められ、ｎＳ，ｎＭ，ｎＬ，ｎＴは後述の方法で求めることができる定数であるので、これらより、各時刻毎の［Ｎ］を算出することができる。
【数３７】
【００３６】
ここで、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数であり、ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数であり、ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数であり、ｎＴは、試料中の血小板数密度である。ｎＳ，ｎＭ，ｎＬは、次のようにして見積もると良い。本発明者らが、未凝集血小板、小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊のそれぞれの平均粒径を散乱光強度から見積もったところ、２．０μｍ，６．７μｍ，１５．０μｍ，２３．０μｍであった。それらを球形と仮定したときの体積は、各々 ４．２μｍ3，１５８μｍ3，１７６７μｍ3，６３７０μｍ3となる。したがって、ｎＳ，ｎＭ，ｎＬは、次の（２）式で求められることとなる。
【数３８】
【００３７】
一方、ｎＴの値は、事前に測定した血液中の総血小板数密度のデータと血液から採取されたＰＲＰの容量から算出した。
【００３８】
なお、未凝集血小板の数密度を上述のような計算で求めるのではなく、公知の方法（ＴＲＬＳ法以外の方法）で測定するようにしても良い。例えば、測定したい試料を２つに分け、一方の試料では上記(1) のように血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定し、他方の試料では未凝集血小板の数密度を測定すると良い。
【００３９】
(3) 前記血小板凝集塊の測定結果及び前記未凝集血小板の算出結果のそれぞれの差分データを求める工程
【００４０】
本工程では、前記(1) の工程の測定結果（小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊の数密度の時系列データ）、及び前記(2) の工程の算出結果（未凝集血小板数密度の時系列データ）について、それぞれ差分データを求める。
【００４１】
(4) 反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程
【００４２】
上述の未凝集血小板Ｎ、小凝集塊Ｓ、中凝集塊Ｍ及び大凝集塊Ｌの４つのコンパートメント間の状態遷移が、図２に示す反応経路に沿って行われると想定し、反応経路毎に反応速度定数ｋij（但し，ｉ＝Ｎ，Ｓ，Ｍ，Ｌ，ｊ＝Ｎ，Ｓ，Ｍ，Ｌ，ｉ≠ｊ）を設定した。図示のモデルでは、
・ ＮとＮ，ＮとＳ，あるいは，ＳとＳが結合しＳに、
・ ＮとＳ，ＮとＭ，ＳとＭ，あるいは，ＭとＭが結合しＭに、
・ ＳとＭ，ＭとＭ，ＳとＬ，ＭとＬ，あるいは，ＬとＬが結合しＬに
それぞれ凝集する場合を想定している。また、同様に、脱凝集反応については、
・ Ｓが解離して，ＮとＮ，ＮとＳ，あるいは，ＳとＳに、
・ Ｍが解離して，ＮとＳ，ＮとＭ，ＳとＭ，あるいは，ＭとＭに、
・ Ｌが解離して，ＳとＭ，ＭとＭ，ＳとＬ，ＭとＬ，あるいは，ＬとＬに
それぞれ解離する場合を考慮に入れている。
【００４３】
これらの反応経路によって構成される血小板凝集反応（ある時刻における血小板凝集反応）を反応速度論を用いて数式化すると、次の（３）式のようになる。
【数３９】
【００４４】
ここで、上式の左辺の∂［Ｎ］（ｔ）／∂ｔは、ある時刻ｔにおける未凝集血小板数密度の時間変化を示すもの（つまり、上述の差分データ）であり、∂［Ｓ］（ｔ）／∂ｔは小凝集塊数密度の差分データ、∂［Ｍ］（ｔ）／∂ｔは中凝集塊数密度の差分データ、∂［Ｌ］（ｔ）／∂ｔは大凝集塊の差分データである。また、［Ｎ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける未凝集血小板の凝集塊数密度であり、［Ｓ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける小凝集塊の凝集塊数密度であり、［Ｍ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける中凝集塊の凝集塊数密度であり、［Ｌ］（ｔ）は、ある時刻ｔにおける大凝集塊の凝集塊数密度である。（３）式は、各時刻におけるデータを重畳して表現されている。
【００４５】
この（３）式において、２つ目の行列（反応速度定数行列）は、血小板凝集反応の程度と様式を示すものであり（詳細は後述する）、血小板凝集反応の程度と様式を定量的に評価するには、該反応速度定数行列を求める必要がある。以下、該反応速度定数行列を求める方法について説明する。
【００４６】
上記（３）式中の各行列を、Ｙ，Ｌ，Ｘで置き換えると、（３）式は次の（４）式のようになる。
【数４０】
【００４７】
この（４）式を次のように変形すると、反応速度定数行列Ｌを求めることができる。
【数４１】
【００４８】
しかしながら、上述の（３）式の場合、未知数の数は反応速度定数行列の要素の数、つまり１６個であるのに対して、方程式の数は多く（仮に、４２０秒間に１０秒毎の測定を行った場合は、方程式の数は、４×４２０÷１０＝１６８個となる。）、解は一意的には決まらない。そこで、上記（３）式を解くにはＭｏｏｒｅ−Ｐｅｎｒｏｓｅの一般逆行列を用いる。そのために、まず、（６）式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解する。
【数４２】
【００４９】
このとき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋は次の（７）式のように表されるため、（６）式で得られた行列Ｕ、対角化行列Ｓ、及び行列ＶＴを用い、一般逆行列Ｘ＋を計算する。
【数４３】
【００５０】
そして、この（７）式を上記（５）式に代入すると、（８）式のようになる。
【数４４】
【００５１】
ここで、Ｌ∧はＬの推定値であることを意味する。このようにして、Ｘの一般逆行列Ｘ＋と実験データの差分行列Ｙから反応速度定数行列Ｌ∧を計算する。
【００５２】
なお、系全体をスカラ倍した解もまた同じ方程式を満たすことから、得られた解はスカラ倍の自由度を持つ。そこで、一旦得られたＬ∧から、差分行列Ｙ∧＝Ｌ∧Ｘを再計算し、その要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcを用いて次の（９）式より、元の時系列データを再計算する。
【数４５】
【００５３】
但し、[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcには、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値として実測値を用いた。こうして得られた[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）の最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整した。
【００５４】
なお、実際の血小板凝集反応では反応速度定数は時間と共に漸次変化するが、血小板凝集反応は複雑な反応であり、種々の素反応がカスケード式に起こり、これら素反応の組み合わせによって一つ一つの反応が構成されているという事実から、本発明では、各反応における反応速度定数が時間によって漸次変化するものではなく、幾つかのタイミングで段階的に変化するものと考えて解析を行った。具体的には、測定時間４２０秒を４段階に分け、
(i) 凝集惹起剤添加前（測定開始後０〜３０秒）
(ii) 惹起剤添加後１１０秒間（測定開始後３０〜１４０秒）
(iii) その後の１４０秒間（測定開始後１４０〜２８０秒）
(iv) その後１４０秒間（測定開始後２８０〜４２０秒）
とし（図４及び図５等参照）、段階(i) では、反応に変化がないと仮定して∂［Ｓ］／∂ｔを強制的に０に固定する。残りの３段階については、(ii)〜(iv)の各段階でのデータから、３種類の反応速度定数行列を計算した。ここで、反応が弱い場合など、上記の４段階に分けると行列が求められない場合は、全４２０秒間のデータのうち、凝集惹起剤添加を添加した後の３９０秒間の全データを用いて、１種類の反応速度定数行列を求めた。
【００５５】
反応速度定数行列を図３に示すが、符号１の破線で囲まれる下三角要素（ｋＮＳ，ｋＮＭ，ｋＮＬ，ｋＳＭ，ｋＳＬ，ｋＭＬ）は凝集に向かう各反応の反応速度定数を表しているとみることができ、符号２の破線で囲まれる上三角要素（ｋＳＮ，ｋＭＮ，ｋＭＳ，ｋＬＮ，ｋＬＳ，ｋＬＭ）は脱凝集に向かう各反応の反応速度定数を表しているとみることができる。反応速度定数はその反応が起こる確率を表わすので、該反応速度定数を利用することによって、その反応の起こり易さの指標を作ることができる。具体的には、反応速度定数と凝集塊数密度とを掛けて求めた反応速度を利用することによって、その反応の起り易さの指標を作ることができる。そのような指標としては、
Ａ． 反応経路毎に求めた反応速度や、
Ｂ． 反応経路毎に求めた反応速度を、上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせた値
を挙げることができる。さらに具体的には、上記Ａの反応速度（反応経路別の反応速度）としては、
Ａ−１． ある反応経路の反応速度定数ｋｉｊと、その反応経路での凝集塊数密度（ある時刻の凝集塊数密度）Ｃｉｊとの積により求めた、ある時刻での反応速度ｖｉｊ（下記の（１０）式参照）や、
Ａ−２． 上記反応速度ｖｉｊを、ある時刻からある時刻までの間 複数回（複数個）求めて、それら複数の反応速度ｖｉｊの総和を取ったものｓｉｊ（下記の（１１）式参照。以下、“反応経路別の反応速度和”と称する）や、
Ａ−３． 上記反応速度ｖｉｊを、ある時刻からある時刻までの間 複数回（複数個：ｎ）求めて、それら複数の反応速度ｖｉｊの平均を算出したもの（下記の（１２）式参照。）
などを挙げることができる。これらの値のいずれかを各反応経路毎に比較すれば、その反応を起り易さを推定することができる（詳細は実施例３にて説明する）。
【数４６】
【数４７】
【数４８】
【００５６】
一方、上記Ｂの値としては、上記Ａ−１の値を上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせたものや、上記Ａ−２の値を上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせたものや、上記Ａ−３の値を上記下三角要素或いは上三角要素に関して足し合わせたものなどを挙げることができる。下記の（１３）式は、上記Ａ−２の値を上記下三角要素に関して足し合わせたもの（以下、“平均凝集速度”と称する）を示し、（１４）式は、上記Ａ−２の値を上記上三角要素に関して足し合わせたもの（以下、“平均脱凝集速度”と称する）を示す。これらの平均凝集速度と平均脱凝集速度は、起きている反応が全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを判別することができる指標となる。また、下記の（１５）式は、上記Ａ−３の値を上記下三角要素に関して足し合わせたものを示し、下記の（１６式は、上記Ａ−３の値を上記上三角要素に関して足し合わせたものを示す。
【数４９】
【数５０】
【数５１】
【数５２】
【００５７】
このように、本方法によれば、並列に起こっている凝集および脱凝集反応によって決定されている各時点でのＮ，Ｓ，Ｍ，Ｌの数密度を凝集反応による成分と脱凝集反応による成分に分解し、各々の平均反応速度を計算することができるため、従来のＴＲＬＳ法の問題点を解決することができる。また、どの経路の凝集や解離が発生したかという反応様式は、要素の配列位置によって識別することができる。この場合は、上述の反応速度（各経路別の反応速度等）を指標として用いることができる。なお、未凝集血小板(Ｎ)，小(Ｓ)，中(Ｍ)，大(Ｌ)凝集塊の数が同じでない場合には、「反応速度定数×関与した凝集塊数の和」なども指標となり得る。したがって、本方法によれば、凝集反応を反応経路ごとに分類した上で、各々の反応速度定数を定量化することができる。
【００５８】
本発明によれば、血小板の凝集反応を定量的に評価することができる。また、本発明によれば、解の収束性を考慮する必要が無いため、従来の方法のような繰り返し計算は不要であり、解析の時間を短くすることができる。さらに、本発明によれば、反応速度定数行列を求めるために必要な数値は、測定（時間分解式レーザー散乱法による測定）及び計算（未凝集血小板の数密度の算出）によって得ることができるため、解析を簡単に行うことができる。また、従来方法のように、血小板の衝突効率等の変数を導入する必要が無いので、該変数による影響を排除でき、精度の良い評価を行うことができる。さらに、血栓性疾患の診断はもちろん、アスピリンや抗血小板薬、あるいは、新しく開発されている抗凝集薬剤などの抑制・亢進機能の定量的評価に応用できるものと期待される。
【００５９】
一方、本発明に係る血小板凝集反応評価装置は、試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価するものであって、
・ 前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する凝集塊測定手段と、
・ 前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める未凝集血小板解析手段と、
・ 前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める差分データ算出手段と、
・ 前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データ等から、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める反応速度定数行列算出手段と、
からなる。この場合、前記凝集塊測定手段による測定は時間分解式レーザー散乱法により行うと良い。また、上述の未凝集血小板解析手段は、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出するようにすると良い。具体的には、前記凝集塊測定手段の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出するようにすると良い。
【数５３】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【００６０】
なお、未凝集血小板の数密度を上述のような計算で求めるのではなく、公知の方法（ＴＲＬＳ法以外の方法）で測定するようにしても良い。例えば、測定したい試料を２つに分け、一方の試料では上記のように血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定し、他方の試料では未凝集血小板の数密度を測定すると良い。
【００６１】
さらに、前記反応速度定数行列算出手段は、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求めると良い。
【数５４】
【００６２】
前記反応速度行列は、前記（３）式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより求めても良い。例えば、上式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数５５】
上式の行列Ｕ，Ｓ，ＶＴに基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数５６】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求めるようにすると良い。
【数５７】
【実施例１】
【００６３】
本実施例においては、本評価方法の妥当性を評価するために、多血小板血漿試料を濃度の異なるアデノシン２リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＡＤＰ）で惹起したときの凝集反応程度の変化を解析した。
【００６４】
〈２μＭ濃度のＡＤＰを使用した場合の解析〉
まず、２２ゲージの翼状針（テルモ株式会社製、ＳＶ−２１ＣＬ）を使って、一人の被検者（健常者）Ａから２０ｍｌの血液を採取し、該血液に抗凝固剤（採血した血液量の１／１０の量の３．８％クエン酸ナトリウム溶液）を加え、１５０Ｇで１０分間だけ穏やかに遠心分離をし、その上清よりＰＲＰを採取した。ＰＲＰ採取後の血液を、さらに９００Ｇで１０分間だけ遠心分離をし、その上層からＰＰＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ、乏血小板血漿）を採取した。そして、合計の量が１０ｍｌとなるように、このＰＰＰを上述のＰＲＰに加え、調整した。なお、その被検者Ａからは、５ｍｌの血液をさらに採取し、市販されている血球計数装置にて、総血小板数を測定した。
【００６５】
上述のように調整したＰＲＰ試料をレーザー散乱粒子計測型血小板凝集能測定装置（興和株式会社製、ＰＡ−２００Ｂ）にかけ、血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定した。具体的には、ＰＲＰ試料３００μｌをスターラ入り専用キュベット（直径が５．６ｍｍの円筒状キュベット）に入れ、攪拌し、測定を開始した。この間、ＰＲＰ試料はスターラによって攪拌されており、０．８２ｄｙｎ／ｃｍ２程度のずり応力が作用している状態（末梢血管中で作用するずり応力のおよそ１／３０）となる。そして、このキュベットに赤色レーザー（波長：λ＝６５０ｎｍ)を照射すると、血小板凝集塊にて散乱光が発生するが、その９０°散乱光をフォトダイオードで検出し、得られた光散乱信号のピークから散乱光強度を取得し、凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定した。
【００６６】
なお、本実施例においては、測定開始後３０秒で、ＰＲＰ試料に凝集惹起剤を添加した。この凝集惹起剤としては、６０μＭ濃度のＡＤＰ（シグマアルドリッチ社製、Ａ２７５４）を精製水にて希釈し、最終濃度が２μＭとなるものを用いた。そして、凝集惹起剤を添加して６分３０秒が経過した時点で測定を終了した。そのように測定して得た時系列データを図１(a) に示す。この場合、ＡＤＰを添加すると直ちに血小板が凝集して、小凝集塊の数が急激に増加することが分った。最初は、放出反応を伴わない、可逆性の（一度凝集した凝集塊が再び解離する）一次凝集が起こり、その後、放出反応が誘発され不可逆性の二次凝集へと進み、中凝集塊の数や大凝集塊の数が増加していくことが分った。中凝集塊が増えるときは小凝集塊の数が減っていくように見え、大凝集塊が増えるときは小・中凝集塊の数が減っていくように見えるが、これは小・中凝集塊が大きくなり、中・大凝集塊へ移行するからである。反応の最後には大凝集塊も減っているように見えるが、これは、大凝集塊に分類される凝集塊がさらにその大きさを大きくしても、その凝集塊の分類が大凝集塊のまま変わらないため、数だけが減っていくように見えるためである。
【００６７】
図１(a) に示した時系列データを解析した結果を図４に示す。同図(a)
は小凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(b) は中凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(c) は大凝集塊数密度の経時的変化を示す。各図中の実線はＴＲＬＳ法での測定結果を示し、破線は本方法による計算結果を示す。いずれの場合も、測定結果と計算結果とはほぼ近似していることが分った。
【００６８】
次に、上述の方法により反応速度定数行列を求めた。解析の結果得られた行列は以下の通りであった。
【数５８】
【００６９】
〈０．６μＭ濃度のＡＤＰを使用した場合の解析〉
次に、６０μＭ濃度のＡＤＰ（シグマアルドリッチ社製、Ａ２７５４）を精製水にて希釈し、最終濃度が０．６μＭとなる凝集惹起剤を調整した。この凝集惹起剤を用いて、上述と同様の測定及び解析を行った。上述のレーザー散乱粒子計測型血小板凝集能測定装置にて測定して得た時系列データを図１(b) に示す。この惹起剤を用いた場合には、小凝集塊はできるけれども、中・大凝集塊へ発達せずに小凝集塊が解離し、再び血小板へと戻るという、可逆性の一次凝集のみの反応となっていることが分った。
【００７０】
この時系列データを解析した結果を図５に示す。同図(a) は小凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(b) は中凝集塊数密度の経時的変化を示し、同図(c) は大凝集塊数密度の経時的変化を示す。各図中の実線はＴＲＬＳ法での測定結果を示し、破線は本方法による計算結果を示す。小凝集塊及び大凝集塊の計算結果は、数密度の値及び変化の様子が測定結果にほぼ近似しており、中凝集塊の計算結果は、数密度の値こそ差異があるものの変化の様子が測定結果にほぼ近似していることが分った。
【００７１】
次に、上述と同様に反応速度定数行列を求めた。解析の結果得られた行列は以下の通りであった。
【数５９】
【００７２】
〈２つの解析結果の比較〉
上述のようにして得られた２つの反応速度定数行列を比較すると、２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した凝集（（１７）式参照）では、凝集を表す下三角要素のうちｋＳＬを除く要素（図３のｋＮＳ，ｋＮＭ，ｋＮＬ，ｋＳＭ，ｋＭＬに相当する要素）が、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合（（１８）式参照）よりも大きくなっていることが分った。また、脱凝集を表す上三角要素のうちｋＭＮ，ｋＬＳ，ｋＬＭを除く要素（図３のｋＳＮ，ｋＭＳ，ｋＬＮに相当する要素）は０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の方が大きくなっていることが分った。但し、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の大凝集塊の数密度は、図５(c)
に示されるように０であるため、その反応速度定数行列の要素（第４行と第４列の要素）は意味を持たないことに留意する必要がある。したがって、それ以外の要素（つまり、１〜３行、１〜３列の要素）で比較する必要があり、ｋＭＮ以外の要素では、高濃度のＡＤＰで惹起した場合の方が強い凝集反応が起こっていることを示しているとみることができる。
【００７３】
上述の反応速度定数行列から上述の平均凝集速度（（１３）式参照）と平均脱凝集速度（（１４）式参照）とを計算し、ＡＤＰ濃度との関係を図６(a) (b) に示した。この図より、
・ 平均凝集速度は、ＡＤＰ濃度が増えると線形に増加し、
・ 平均脱凝集速度は、ＡＤＰ濃度が増えると線形に減少する
ことが分った。この結果は、平均凝集速度や平均脱凝集速度が、血小板の凝集反応の程度を表わす指標となり得る可能性を示唆するものである。
【００７４】
さらに、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合について、上述した（１１）式の値（つまり、反応経路別の反応速度和）を反応経路毎に求めた。図７(a) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。なお、縦軸のスケールは、反応速度和の最大値を１としている。ここで、説明の便宜上、０．６μＭ濃度のＡＤＰを“低濃度ＡＤＰ”と称し、２μＭ濃度のＡＤＰを“高濃度ＡＤＰ”と称することとすると、凝集反応を示す反応経路では、図７(a) に示すように、小凝集塊Ｓ→大凝集塊Ｌの反応経路を除き、高濃度ＡＤＰを使用した方が反応速度和は大きくなっていることが分る。また、低濃度ＡＤＰを使用した場合は、未凝集血小板Ｎ→小凝集塊Ｓの反応経路では、反応速度和はある程度の値を示しているものの、未凝集血小板Ｎ→中凝集塊Ｍの反応経路では、反応速度和は非常に小さくなっている。これにより、低濃度ＡＤＰを使用した場合には、未凝集血小板から小凝集塊は形成されるものの、中凝集塊に発達することはほとんど無いことが推察できる。これは上述したとおり、ADP濃度の高いほど凝集反応が強く惹起されていることを表している。他方の脱凝集反応を示す反応経路では、図７(b) に示すように、低濃度ADPを使用したときの反応速度和は、
・ 小凝集塊Ｓ→未凝集血小板Ｎの反応経路
・ 中凝集塊Ｍ→未凝集血小板Ｎの反応経路
・ 中凝集塊Ｍ→小凝集塊Ｓの反応経路
である程度の値を示していた。これらの結果から、低濃度ADPを用いた場合には、小凝集塊Ｓや中凝集塊Ｍが形成されたとしても直ちに解離して未凝集凝集塊Ｎや小凝集塊Ｓに戻るといった反応になっていることがわかり、反応が一次凝集に留まっていることを意味していると考えられる。これに対し、高濃度ADPを用いた場合には、中凝集塊Ｍや大凝集塊Ｌが形成されるのに対し、小凝集塊Ｓから未凝集血小板Ｎの解離は低濃度ADPの場合と同程度、中凝集塊Ｍから未凝集血小板Ｎの解離はむしろ小さくなっており、反応全体として強い凝集反応が進んでいることがわかる。また、大凝集塊Ｌから小凝集塊Ｓや中凝集塊Ｍへの解離、小凝集塊Ｓや中凝集塊Ｍから未凝集血小板Ｎへの解離はみられるが、中凝集塊Ｍから小凝集塊Ｓへの反応が確認できないことは興味深い。これはこの経路の逆方向の反応が遮断されていることを示し、反応が二次凝集に進んでいることと関係があるのかもしれない。一次凝集で形成されるのは中凝集塊Ｍまでで、反応が二次凝集まで進むとはじめて中凝集塊Ｍや大凝集塊Ｌの大きな凝集塊が形成されるものと解釈できる。このように、本方法によって得られる経路ごとの反応速度和を比較することによって、ADP濃度により惹起される凝集反応が一次凝集と二次凝集に分類されることを定量的に判別することができることがわかった。
【００７５】
本実施例によれば、本評価方法によって、血小板凝集反応を凝集塊の形成機構によって分類した上で、凝集程度を定量的に評価することができる可能性が示された。
【実施例２】
【００７６】
上述と同様の方法で、別の被検者（健常者）Ｂからも血液を採取し、同様の測定及び解析を行った。図８(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの実測データ（ＴＲＬＳ法による測定結果）及び濁度を示し、同図(b)
は、小凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示し、同図(c) は、中凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示し、同図(d) は、大凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す。また、解析の結果得られた反応速度定数行列は以下の通りであった。
【数６０】
【００７７】
被検者Ｂは被検者Ａに比べて血小板凝集能が低く、被検者ＢのＰＲＰに２μＭ濃度のＡＤＰを添加した場合が被検者Ａで０．６μＭ濃度のＡＤＰを添加した場合と同程度になっていた。また、図１(b)
と図８(a) を比較すると、両者に大きな差がないことから、被検者Ｂは被検者Ａに比べて血小板凝集能が低く、２μＭのＡＤＰによる被検者Ｂの凝集と、０．６μＭのＡＤＰによる被検者Ａの凝集とは一見して同じ程度であるかのように思える。しかし、（１７）式の反応速度定数行列及び（１８）式の反応速度定数行列の各要素を比較すると、両者の値には違いが見られる。上述の平均凝集速度を計算したところ、被検者Aの7.8´10-2に対して被検者Bでの値は6.5´10-2になっており、両者の凝集反応程度の違いを数値的に示すことができた。すなわち、本方法による定量化は、パターン同士を比較するよりも詳細にデータ評価を行うことのできる可能性を示している。
【実施例３】
【００７８】
本実施例においては、
・ ６０μＭ濃度のＡＤＰ（シグマアルドリッチ社製、Ａ２７５４）を精製水で希釈して、最終濃度を２μＭとしたもの
・ ３ｍＭ濃度のエピネフリン（第一三共株式会社製、ボスミン注射液）を精製水で希釈して、最終濃度を１００μＭとしたもの
・ ３０μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを添付の緩衝液で希釈して、最終濃度を１μｇ／ｍｌとしたもの
の３種類の凝集惹起剤を使用した場合の凝集反応をそれぞれ解析し、惹起剤の種類による凝集様式の違いについて検討した。なお、凝集塊の測定方法や反応速度定数行列の解析方法は、実施例１と同じとした。
【００７９】
ＴＲＬＳ法の測定結果を図１(a) (c) (d) に示す。同図の(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときのデータを示し、同図の(c) は、凝集惹起剤に１００μＭ濃度のエピネフリンを用いたときのデータを示し、同図の(d)
は、凝集惹起剤に１μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを用いたときのデータを示す。いずれの場合も、各々の惹起剤添加後に凝集反応が始まり、小・中・大凝集塊が作られている。
【００８０】
さらに、各凝集惹起剤（つまり、２μＭ濃度のＡＤＰやエピネフリンやコラーゲン）で惹起した場合について、上述した（１１）式の値（つまり、反応経路別の反応速度和）を反応経路毎に求めた。図９(a) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。なお、縦軸のスケールは、反応速度和の最大値を１としている。
【００８１】
ＡＤＰを用いた場合は、図９(a) に示すようにｓＳＭの値が最大であった。これは、小凝集塊から中凝集塊になる反応が多いことを示している。次いでｓＭＬ，ｓＮＳの順に大きい値となっており、各々、ＭからＬ、あるいはＮからＳが形成される反応が比較的強く起こっていることがわかる。さらに、図１０(b)より、ＡＤＰは他の試薬に比べてＮからＳ・Ｍ・Ｌになる凝集が多いことがわかる。これは、ＡＤＰ添加によって表出したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）やフィブリノゲンを仲介として活性化された血小板（Ｎ）が接触することで発達していくことを示すものであり、既に文献で発表されている研究結果と一致するものである。
【００８２】
エピネフリンを用いた場合は、ｓＮＳ，ｓＳＭ，ｓＭＬがある程度の値を持ち（図９(a) 参照）、ｓＮＭ，ｓＮＬはほとんど０であるが（図９(b) 参照）、このことは、未凝集血小板Ｎから中凝集塊Ｍや大凝集塊Ｌが形成される反応はほとんどなく、未凝集血小板Ｎからは小凝集塊Ｓだけができ、小凝集塊Ｓから中・大凝集塊Ｍ，Ｌが形成される傾向が強いことを示している。このように段階的に凝集が進んでいくという結果は、未凝集血小板Ｎ同士の結合によって小凝集塊Ｓが形成され、形成された小凝集塊Ｓ同士が結合することによって中・大凝集塊Ｍ，Ｌが形成されるというエピネフリン凝集特有の凝集様式を数値的に支持する結果となっている．
【００８３】
コラーゲンを用いた場合は、エピネフリン凝集によく似た反応速度定数行列の要素構成になっていることから、コラーゲン凝集もエピネフリン凝集に似た様式で段階的に凝集が発達していくと推測することができる。凝集反応では、未凝集血小板Ｎから小・中凝集塊Ｓ，Ｍが形成される反応(ｓＮＳ，ｓＮＭ，ｓＮＬ)よりも小・中凝集塊Ｓ，Ｍから中・大凝集塊Ｍ，Ｌが形成される反応(ｓＳＭ，ｓＳＬ，ｓＭＬ)が強くなっていることが特徴的であり、反応が急速に進む傾向が強いことを示している。また、脱凝集反応では、中・大凝集塊Ｍ，Ｌから未凝集血小板Ｎになる反応(ｓＭＮ，ｓＬＮ)が強く出ており、解離反応が大きいことがわかる。これは、血小板表面に結合したプロテオグリカンとコラーゲンが結合した後、プロテオグリカンが除去されるまでの間に解離を伴う反応が起こることを示しているかもしれない。
【００８４】
これらの解析結果は、本方法による定量化によって、血小板の凝集機構を分類し、評価することができる可能性を示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(b) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に１００μＭ濃度のエピネフリンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図であり、同図(d) は、凝集惹起剤に１μｇ／ｍｌ濃度のコラーゲンを用いたときの凝集塊数密度の時間的変化（測定データ）及び濁度法により求めた光透過率の時間的変化を示す図である。
【図２】図２は、未凝集血小板、小凝集塊、中凝集塊及び大凝集塊相互間の状態遷移の経路の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、反応速度定数行列を説明するための図である。
【図４】図４(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b)は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。
【図５】図５(a) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の小凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(b)は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の中凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図であり、同図(c) は、凝集惹起剤に０．６μＭ濃度のＡＤＰを用いた場合の大凝集塊の数密度変化（計算結果及び測定結果）の一例を示す図である。
【図６】図６(a) は、平均凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図であり、同図(b)は、平均脱凝集速度とＡＤＰの濃度との関係を示す図である。
【図７】図７(a) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、０．６μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和と２μＭ濃度のＡＤＰで惹起した場合の反応速度和とを図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。
【図８】図８(a) は、凝集惹起剤に２μＭ濃度のＡＤＰを用いたときの実測データ（ＴＲＬＳ法による測定結果）及び濁度を示す図であり、同図(b)は、小凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(c) は、中凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図であり、同図(d)は、大凝集塊数密度の経時変化（計算結果及び測定結果）を示す図である。
【図９】図９(a) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した下三角要素１の反応経路別に示した図であり、同図(b) は、各凝集惹起剤で惹起した反応速度和を図３に示した上三角要素２の反応経路別に示した図である。
【符号の説明】
【００８６】
１ 凝集に向かう各反応の反応速度定数を示す要素
２ 脱凝集に向かう各反応の反応速度定数を示す要素
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価方法において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める工程と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める工程と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程と、
からなることを特徴とする血小板凝集反応評価方法。
【請求項２】
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化は、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出する、
ことを特徴とする請求項１に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項３】
前記血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化の測定は時間分解式レーザー散乱法により行う、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項４】
前記時間分解式レーザー散乱法の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出する、
ことを特徴とする請求項３に記載の血小板凝集反応評価方法。
【数１】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【請求項５】
反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求める、
ことを特徴とする請求項３又は４に記載の血小板凝集反応評価方法。
【数２】
【請求項６】
前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求める、
ことを特徴とする請求項５に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項７】
前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数３】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数４】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求める、
【数５】
ことを特徴とする、請求項５又は６に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項８】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数６】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数７】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整する、
ことを特徴とする、請求項７に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項９】
凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数８】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数９】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項１０】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項１１】
試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価装置において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する凝集塊測定手段と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める未凝集血小板解析手段と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める差分データ算出手段と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める反応速度定数行列算出手段と、
からなることを特徴とする血小板凝集反応評価装置。
【請求項１２】
前記未凝集血小板解析手段は、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出する、
ことを特徴とする請求項１１に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１３】
前記凝集塊測定手段による測定は時間分解式レーザー散乱法により行う、
ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１４】
前記凝集塊測定手段の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出する、
ことを特徴とする請求項１３に記載の血小板凝集反応評価装置。
【数１０】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【請求項１５】
前記反応速度定数行列算出手段は、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求める、
ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の血小板凝集反応評価装置。
【数１１】
【請求項１６】
前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求める、
ことを特徴とする請求項１５に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１７】
前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数１２】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数１３】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求める、
【数１４】
ことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１８】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数１５】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数１６】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整する、
ことを特徴とする、請求項１７に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１９】
凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数１７】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数１８】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項２０】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１】
試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価方法において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する工程と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める工程と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める工程と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める工程と、
からなることを特徴とする血小板凝集反応評価方法。
【請求項２】
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化は、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出する、
ことを特徴とする請求項１に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項３】
前記血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化の測定は時間分解式レーザー散乱法により行う、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項４】
前記時間分解式レーザー散乱法の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出する、
ことを特徴とする請求項３に記載の血小板凝集反応評価方法。
【数１】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【請求項５】
反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求める、
ことを特徴とする請求項３又は４に記載の血小板凝集反応評価方法。
【数２】
【請求項６】
前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求める、
ことを特徴とする請求項５に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項７】
前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数３】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数４】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求める、
【数５】
ことを特徴とする、請求項５又は６に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項８】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数６】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数７】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整する、
ことを特徴とする、請求項７に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項９】
凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数８】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数９】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項１０】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の血小板凝集反応評価方法。
【請求項１１】
試料中における血小板の凝集反応を定量的に評価する血小板凝集反応評価装置において、
前記試料中の血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化を測定する凝集塊測定手段と、
前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を求める未凝集血小板解析手段と、
前記血小板凝集塊の経時的変化及び前記未凝集血小板の経時的変化のそれぞれの差分データを求める差分データ算出手段と、
前記血小板凝集塊の測定結果及び前記差分データから、反応速度論に基づいて反応速度定数行列を求める反応速度定数行列算出手段と、
からなることを特徴とする血小板凝集反応評価装置。
【請求項１２】
前記未凝集血小板解析手段は、前記試料中における未凝集血小板の数密度の経時的変化を、前記測定した血小板凝集塊のサイズ及び数密度の経時的変化に基づき算出する、
ことを特徴とする請求項１１に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１３】
前記凝集塊測定手段による測定は時間分解式レーザー散乱法により行う、
ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１４】
前記凝集塊測定手段の測定結果から、大サイズの凝集塊の数密度［Ｌ］、中サイズの凝集塊の数密度［Ｍ］、及び小サイズの凝集塊の数密度［Ｓ］のそれぞれの経時的変化を求め、それらを下式に代入することにより、前記未凝集血小板の数密度［Ｎ］の時系列データを算出する、
ことを特徴とする請求項１３に記載の血小板凝集反応評価装置。
【数１０】
但し、ｎＳは、小凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＭは、中凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＬは、大凝集塊を構成するのに必要な未凝集血小板の平均数
ｎＴは、試料中の血小板数密度
【請求項１５】
前記反応速度定数行列算出手段は、反応速度論に基づく下式から反応速度定数行列を求める、
ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の血小板凝集反応評価装置。
【数１１】
【請求項１６】
前記反応速度論に基づく式中の３つ目の行列の逆行列を求めることにより、前記反応速度行列を求める、
ことを特徴とする請求項１５に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１７】
前記反応速度論に基づく式中の１つ目の行列をＹとし、２つ目の行列をＬとし、３つ目の行列をＸとした場合に、次式のように、Ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｅｒ変換とＱＲ変換によって行列Ｘを特異値分解し、
【数１２】
上式に基づき、Ｘの一般逆行列Ｘ＋を次式で計算し、
【数１３】
該一般逆行列Ｘ＋を次式に代入して反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧を求める、
【数１４】
ことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１８】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧と次式とから、凝集塊数密度の差分の時系列を表わす行列（推定値）Ｙ∧を求め、
【数１５】
該行列Ｙ∧の要素∂［Ｎ］／∂ｔcalc，∂［Ｓ］／∂ｔcalc，∂［Ｍ］／∂ｔcalc，∂［Ｌ］／∂ｔcalcと、血小板数密度及び凝集塊数密度の初期値としての実測値[N](0)calc，[S](0)calc，[M](0)calc，[L](0)calcと、次式とから、[N](i)calc，[S](i)calc，[M](i)calc，[L](i)calc（ただし、ｉ＝０，１，２・・・）を求め、
【数１６】
その最大値[N](i)calc,max，[S](i)calc,max，[M](i)calc,max，[L](i)calc,maxがそれぞれの実測値の最大値[N](i)max，[S](i)max，[M](i)max，[L](i)maxに等しくなるように、各々のスケーリング因子αN，αS，αM，αLを決定することによってスケーリングを取り、解の絶対値を調整する、
ことを特徴とする、請求項１７に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項１９】
凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均凝集速度と、
【数１７】
脱凝集に向かう各反応経路の反応速度和ｓｉｊを下式のように足し合わせた平均脱凝集速度と、
【数１８】
を比較することによって、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の血小板凝集反応評価装置。
【請求項２０】
求めた反応速度定数行列（推定値）Ｌ∧の各反応の反応速度定数と、その反応に関与した凝集塊数の和との積により、全体として凝集に向かおうとしているのか脱凝集に向かおうとしているのかを定量的に評価する、
ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の血小板凝集反応評価装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２４４０５３（Ｐ２００９−２４４０５３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９０２１１（Ｐ２００８−９０２１１）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１月２４日 社団法人日本機械学会発行の「第２０回バイオエンジニアリング講演会講演論文集」に発表
【出願人】（５０４１３３１１０）国立大学法人 電気通信大学 (383)
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１月２４日 社団法人日本機械学会発行の「第２０回バイオエンジニアリング講演会講演論文集」に発表
【出願人】（５０４１３３１１０）国立大学法人 電気通信大学 (383)
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]