被検物質の電気化学的検出方法
【課題】高い検出感度で被検物質を検出することができる被検物質の電気化学的検出方法を提供する。
【解決手段】作用電極上に捕捉された被検物質Ｓを標識し検出する際に、被検物質Ｓと、被検物質Ｓに結合する結合物質９１に、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質９２を介して標識物質９３が保持された標識結合物質９０とを含む複合体を形成させる。そして、作用電極６０上に存在する標識物質９３を電気化学的に検出する。
【解決手段】作用電極上に捕捉された被検物質Ｓを標識し検出する際に、被検物質Ｓと、被検物質Ｓに結合する結合物質９１に、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質９２を介して標識物質９３が保持された標識結合物質９０とを含む複合体を形成させる。そして、作用電極６０上に存在する標識物質９３を電気化学的に検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の電気化学的検出方法に関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出及び定量等、並びに、これらを利用する疾病の臨床検査及び診断等に有用な、被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査及び診断は、生体試料中に含まれる疾病に関連する遺伝子又はタンパク質等を、遺伝子検出法及び免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査及び診断を行なうための方法として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる光電流を、核酸、タンパク質等の被検物質の検出に利用する光化学的検出方法が提案されている。ここで、臨床検査及び診断では、検体に含まれる微量な被検物質を検出する必要があるため、被検物質の検出感度の向上が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１の段落番号［００６９］〜［００７８］には、被検物質であるタンパク質を特異的に認識する捕捉物質である抗体が固定化された電極と、電気化学的に活性な標識物質により結合物質である抗体が標識された標識抗体とを用いる光電流による被検物質の特異的検出法が開示されている。特許文献１に記載の方法では、まず、被検物質と電極上の抗体とを接触させ、抗体によって被検物質を電極上に捕捉する。その後、電極上に捕捉された被検物質と、標識抗体とを接触させて、捕捉物質と被検物質と標識抗体とを含む複合体を形成させる。そして、複合体中の標識物質に基づく光電流を測定することにより、被検物質が検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０２４４４６号、段落番号［００６９］〜［００７８］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、電極上で形成された複合体が嵩高いため、複合体中に含まれる標識物質と電極との間の物理的距離が長くなり、標識物質と電極との間において、電子輸送が行なわれにくくなる。例えば、ＩｇＧ抗体は、１０ｎｍ程度の大きさを有している。したがって、特許文献１に記載の方法において、捕捉物質及び標識抗体を構成する抗体としてＩｇＧ抗体を用いる場合、被検物質の検出に際して、電極上に形成される複合体中の標識物質は、電子輸送が効率よく起こりうる電極表面から非常に離れた位置に存在することになる。このように、特許文献１に記載の方法では、被検物質の検出の際に形成される複合体の嵩高さが、高感度化を図る上で大きな制約となっている。
【０００６】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、高い検出感度で被検物質を検出することができる被検物質の電気化学的検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、被検物質の検出に際して、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質を介して、標識物質が抗体に固定された標識結合物質を用いることにより、検出感度が著しく向上するという知見を得て、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕 被検物質を電解液中で電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が作用電極本体上に固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、当該被検物質に結合する結合物質に修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程
を含み、
前記修飾物質は、電解液と、補足物質が結合している部位以外の作用電極部位と、に対して相互作用を生じる物質である、
被検物質の電気化学的検出方法、
〔２〕 前記電解液が、非プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が親水性を示す前記〔１〕に記載の方法、
〔３〕 前記修飾物質が、ＤＮＡである前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法、
〔４〕 前記電解液が、プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が疎水性を示す前記〔１〕に記載の方法、
〔５〕 前記工程（２）において、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、前記標識結合物質とを接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕 前記工程（２）において、前記被検物質に結合する第１結合物質を含む結合体と、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質とを接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体と、前記結合体に結合する第２結合物質に前記修飾物質を介して前記標識物質が結合した標識体とを接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる前記〔１〕に記載の方法、
〔７〕 前記工程（２）の後、作用電極を洗浄し、被検物質に結合していない標識結合物質を除去する前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
〔８〕 前記標識物質が、電気化学的又は光化学的に活性な物質である前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕 前記標識結合物質が、前記結合物質に、修飾物質を介して複数の標識物質が保持された多価標識結合物質である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕 前記工程（３）で得られた検出結果に基づいて、前記被検物質を定量する、〔９〕に記載の方法、並びに
〔１１〕 前記被検物質は複数種類である、請求項〔９〕又は〔１０〕のいずれかに記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。
【図２】図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図である。（Ｂ）は図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図である。（Ｃ）は図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図７】従来の被検物質の電気化学的検出方法における検出工程を示す概略説明図である。
【図８】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図９】本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１０】（Ａ）は試験例１において、実施例１で得られた標識結合物質を用いて被検物質を検出する場合（実験番号１）の検出工程を示す概略説明図である。（Ｂ）は、試験例１において、比較例１で得られた標識抗体を用いて被検物質を検出する場合（実験番号３）の検出工程を示す概略説明図である。
【図１１】試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】実施例２における実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法の処理手順の一部を示す工程説明図である。
【図１３】実施例２における実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法の処理手順の一部を示す工程説明図である。
【図１４】（Ａ）は実施例２における実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図である。（Ｂ）は実施例２における実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図である。
【図１５】実施例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１６】製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体の概略説明図である。
【図１７】実施例３における実験番号９の被検物質の電気化学的検出方法の処理手順の一部を示す工程説明図である。
【図１８】実施例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１９】実施例４において、被検物質（マウスＩｇＧ）の濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２０】実施例５において、被検物質（ヒトＩＬ−６）の濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２１】実施例６において、検出対象物の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［検出装置の構成］
本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用いる検出方法に用いる検出装置である。
【００１２】
検出装置１は、検出チップ２０が挿入されるチップ受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
【００１３】
図２は、図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源１３と、電流計１４と、電源１５と、Ａ／Ｄ変換部１６と、制御部１７と、ディスプレイ１２とを備えている。
光源１３は、検出チップ２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。これらの光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザー又は太陽光が好ましく、レーザーが特に好ましい。光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるように構成されたものであってもよい。
電流計１４は、励起された標識物質から放出される電子に起因して検出チップ２０内を流れる電流を測定する。
電源１５は、検出チップ２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１６は、電流計１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１７は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等から構成されている。この制御部１７は、ディスプレイ１２、光源１３、電流計１４及び電源１５の動作を制御する。また、制御部１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１２は、制御部１７で概算された被検物質の量等の情報を表示する。
【００１４】
なお、標識物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１３を備えていなくてもよい（図示せず）。
標識物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光等を検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００１５】
［検出チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ２０の構成を説明する。
【００１６】
図３は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。図４（Ａ）は、図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図であり、図４（Ｂ）は、図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図であり、図４（Ｃ）は、図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【００１７】
検出チップ２０は、上基板３０と、上基板３０の下方に設けられた下基板４０と、上基板３０と下基板４０とに挟まれた間隔保持部材５０とを備えている。検出チップ２０では、上基板３０と下基板４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板３０と下基板４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１８】
上基板３０は、図４（Ｂ）に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６０とを備えている。この基板本体３０ａには、被検物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口３０ｂが設けられている。基板本体３０ａの表面には、作用電極６０と、作用電極６０に接続されている電極リード７１とが形成されている。上基板３０においては、作用電極６０は、基板本体３０ａの一側部〔図４（Ｂ）の左側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６０から基板本体３０ａの他側部〔図４（Ｂ）の右側〕に向けて延びている。試料注入口３０ｂは、基板本体３０ａにおいて、間隔保持部材５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００１９】
本実施の形態において、基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板本体３０ａの形状は、基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。
【００２０】
基板本体３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。基板本体３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００２１】
下基板４０は、図４（Ｃ）に示されるように、基板本体４０ａと、対極６６と、参照電極６９とを備えている。基板本体４０ａは、上基板３０の基板本体３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。基板本体４０ａ及び基板本体３０ａは、必ずしも、同寸法である必要はない。
【００２２】
基板本体４０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体４０ａの厚さ及び大きさは、上基板３０の基板本体３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２３】
基板本体４０ａの表面には、対極６６と、対極６６に接続された電極リード７２と、参照電極６９と、参照電極６９に接続された電極リード７３とが形成されている。下基板４０においては、対極６６は、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕に配置されている。参照電極６９は、基板本体４０ａ上において、対極６６と対向する位置に配置されている。対極６６の電極リード７２と参照電極６９の電極リード７３とは、それぞれ、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕から他側部〔図４（Ｃ）の左側〕へ向けて延びている。対極６６及び参照電極６９の各電極リード７２，７３は、基板本体４０ａの他側部〔図４（Ｃ）の左側〕において互いに並列するように配置されている。電極リード７２，７３は、上基板３０と下基板４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している〔図３及び図４（Ａ）参照〕。なお、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａは、当該基板本体を透過させるようにして光を照射する場合には、透過性を有する材料から構成された基板本体であることが望ましい。この場合、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａのうち、光を照射する側の基板本体が、透過性を有する材料から構成されていればよい。
【００２４】
つぎに、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９について、詳細に説明する。
図５は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。作用電極６０は、ほぼ四角形状に形成されている。作用電極６０は、図５に示されるように、基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体６１と、作用電極本体６１上に固定化された捕捉物質８１とから構成されている。作用電極本体６１には、電極リード７１が接続されている。
【００２５】
後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおいては、作用電極本体６１は、励起光が照射されることにより被検物質から生じた電子を受容する半導体からなる。この半導体は、導電体及び電子受容体として機能する。半導体は、光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、半導体は、後述の標識物質の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。かかる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。上記した半導体のなかでは、酸化物半導体が好ましい。酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）が好ましい。作用電極の厚さは、通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜２００ｎｍ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
【００２６】
本発明においては、後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極本体６１は、半導体層と導電層とから構成されていてもよい。この場合、作用電極本体６１の電極リード７１は、導電層に接続される。
半導体層を構成する半導体は、上記した半導体と同様である。この場合の半導体層の厚さは、好ましくは０．１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
導電層は、導電性材料からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等の炭素系材料等が挙げられる。導電層の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１００ｎｍである。導電層の厚さは、導電性が確保でき、かつ電極から生じる光電流（バックグランド電流）が最小となる膜厚が望ましい。なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等が挙げられる。導電層は、例えば、当該導電層を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。
【００２７】
一方、後述の酸化還元電流・電気化学発光検出方法に用いる検出チップにおいては、作用電極本体６１は、導電性材料からなる。
導電性材料は、光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極本体６１の導電層に用いられる導電性材料と同様である。
導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。
この場合、作用電極本体６１の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００２８】
作用電極本体６１の表面には、捕捉物質８１が固定化されている〔図５参照〕。捕捉物質８１は、被検物質を捕捉する物質である。これにより、被検物質を作用電極本体６１の近傍に存在させることができる。捕捉物質８１は、被検物質の種類に応じて、適宜選択することができる。捕捉物質８１としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
【００２９】
対極６６は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。対極６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。導電性材料からなる薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００３０】
参照電極６９は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。参照電極６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。導電性材料からなる薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。本実施の形態では、参照電極６９を設けているが、本発明においては、参照電極６９を設けなくてもよい。対極６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６６が参照電極６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６０に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６９を設けることが好ましい。
【００３１】
つぎに、間隔保持部材５０について、説明する。間隔保持部材５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。間隔保持部材５０は、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９を取り囲むように配置されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。上基板３０と下基板４０との間には間隔保持部材５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極（作用電極６０、対極６６及び参照電極６９）の間には試料や電解液を収容するための空間２０ａが形成されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。間隔保持部材５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム等のプラスチック製両面テープ等を用いることもできる。
【００３２】
本発明においては、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９は、同一の基板本体上に形成されていてもよい。本発明においては、対極６６及び参照電極６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。この場合、対極６６及び参照電極６９のうちの少なくともいずれかが間隔保持部材５０の部材本体に設けられていてもよい。そして、上基板３０及び下基板４０のいずれかに、間隔保持部材５０の部材本体に設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００３３】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、被検物質を電解液中で電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が作用電極本体上に固定された作用電極に接触させ、捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、当該被検物質に結合する結合物質に、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる工程、及び
（３） 工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程
を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質と、結合物質に修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる点に１つの大きな特徴がある。
【００３５】
本発明の方法では、標識物質として、光化学的又は電気化学的に活性な物質が用いられる。光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。一方、電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。したがって、本発明の方法は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出方法（図６及び図８参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出方法（図９参照）に大別することができる。
【００３６】
１．光電気化学検出方法
まず、光電気化学検出方法について説明する。光電気化学検出方法には、上述した図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いることができるが、これらに限定されるものではない。以下、図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いる場合を例としてあげて説明する。図６は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００３７】
光電気化学検出方法では、ユーザーは、被検物質Ｓを含む試料を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する〔図６（Ａ）試料供給工程を参照〕。これにより、試料中の被検物質が検出チップ２０を構成する上基板３０の作用電極本体６１上の捕捉物質８１によって捕捉される〔図６（Ｂ）被検物質捕捉工程を参照〕。このとき、試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ）は、捕捉物質８１に捕捉されない。
捕捉物質８１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質８１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質８１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００３８】
捕捉物質８１による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質８１が核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質８１が核酸に対する抗体、タンパク質に対する抗体又はペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうのに適した溶液中で行なうことができる。被検物質がリガンドであり、捕捉物質８１がリガンドに対するレセプターである場合、及び、被検物質がレセプターであり、捕捉物質８１がレセプターに対するリガンドである場合には、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプターとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
【００３９】
つぎに、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質９０を注入して、標識結合物質９０を、作用電極本体６１上の捕捉物質８１により捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図６（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識結合物質９０とを含む複合体が形成される。
【００４０】
標識結合物質９０は、被検物質Ｓに結合する結合物質９１と、修飾物質９２と、標識物質９３とから構成されている。標識結合物質９０では、標識物質９３が修飾物質９２を介して結合物質９１に固定化されている。
【００４１】
結合物質９１は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質８１とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。結合物質９１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、結合物質９１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、結合物質９１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００４２】
修飾物質９２は、結合物質９１と標識物質９３との間に介在している。修飾物質９２は、電解液と作用電極本体６１とに対する相互作用を生じる物質である。
【００４３】
修飾物質９２は、後述の検出工程に用いられる電解液及び作用電極の表面の極性に応じて、親水性を示す修飾物質及び疎水性を示す修飾物質のなかから選択することが好ましい。
本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、電解液が、非プロトン性溶媒を含有し、かつ作用電極の表面及び修飾物質が親水性を示すか、あるいは電解液が、プロトン性溶媒を含有し、かつ作用電極の表面及び修飾物質が疎水性を示すことが好ましい。
【００４４】
親水性を示す修飾物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；親水性高分子化合物であるポリエチレングリコール；親水性アミノ酸であるアスパラギン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、チロシン、システイン等から主に構成される親水性ポリペプチド等が挙げられる。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。親水性を示す作用電極としては、例えば、表面に親水性官能基を有する電極等が挙げられる。親水性官能基としては、例えば、水酸基を含む官能基（例えば、シラノール基等）、アミノ基、チオール基等が挙げられる。かかる親水性を示す作用電極は、例えば、作用電極本体を、アミノ基を付与するアミノプロピルトリエトキシシラン、チオール基を付与するメルカプトプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤で処理を施すこと等により得ることができる。また、本発明においては、表面に親水性官能基を有する電極に、ポリエチレングリコール、核酸等をさらに結合させて親水性処理を施してもよい。
【００４５】
一方、疎水性を示す修飾物質としては、例えば、疎水性アミノ酸であるグリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等から主に構成される疎水性ペプチド；疎水性を示す炭化水素から主に構成される高分子化合物（例えば、スチレンオリゴマー、アクリルオリゴマー等）が挙げられる。プロトン性溶媒としては、例えば、水；水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等が挙げられる。疎水性を示す作用電極としては、例えば、表面に疎水性官能基を有する電極等が挙げられる。かかる疎水性を示す作用電極は、例えば、シラノール基が導入された金属酸化物からなる作用電極本体に対して、当該作用電極本体の表面にメチル基やフェニル基を導入しうる化合物、例えば、メチルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン等で処理すること等により得ることができる。
【００４６】
修飾物質９２の長さは、作用電極上での複合体の形成反応、例えば、捕捉した被検物質への結合物質の結合反応を阻害しない範囲で適宜選択することができる。修飾物質９２の長さは、通常、１００ｎｍ以下が好ましい。なお、修飾物質９２の長さの下限値は、修飾物質９２の種類などにより異なるので、修飾物質９２の種類などに応じて適宜設定することが望ましい。
【００４７】
標識物質９３は、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質９３として、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ−８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報等を参照することができる。
【００４８】
修飾物質９２と結合物質９１との結合様式としては、共有結合、非共有結合等が挙げられる。
【００４９】
修飾物質９２を結合物質９１に共有結合により結合させる方法は、特に限定されるものではない。
【００５０】
結合物質９１において、修飾物質９２を共有結合させる部位は、特に限定されないが、結合物質９１と修飾物質９２との結合等の操作が簡便であることから、アミノ基及びスルフヒドリル基が好ましい。
【００５１】
アミノ基へ結合できる反応基としては、例えば、サクシンイミド基（ＮＨＳ）、イソチオシアノ基（ＩＴＣ）、クロロスルホニル基、クロロアシル基、オキシエチレン基、クロロアルキル基、アルデヒド基、カルボキシル基等が挙げられる。これらのなかでは、アミノ基を介して目的とする修飾物質９２を共有結合により結合させる場合には、水系での反応が必須であり、反応溶液のｐＨが中性〜弱アルカリ性領域にあること、氷冷下から３７℃程度の反応温度で短時間に反応が進むこと等のように反応化合物を使用できる条件が限られていることから、好ましくはＮＨＳ及びＩＴＣである。したがって、修飾物質９２として、ＮＨＳ及び／又はＩＴＣを有する修飾物質を用いることができる。
【００５２】
スルフヒドリル基に結合させることができる反応基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基等があげられる。スルホヒドリル基は、通常、ポリペプチド中ではジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成している。そのため、スルフヒドリル基を、修飾物質９２を結合させる部位として用いる場合、ポリペプチド中のジスルフィド構造を還元し、スルフヒドリル基として用いることになる。ジスルフィド結合の還元には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）等を用いることができる。したがって、修飾物質９２が、アミノ基及びスルフヒドリル基に対する反応性の高い官能基（例えば、サクシンイミド基、マレイミド基等）を有している場合には、結合物質９１と修飾物質９２とを混合するだけで、結合物質９１のアミノ基及びスルフヒドリル基に修飾物質９２を直接結合させることができる。かかる修飾物質９２としては、例えば、サクシンイミドエステル修飾したＤＮＡ等が挙げられる。
【００５３】
修飾物質９２が、アミノ基、スルフヒドリル基、アルデヒド基、カルボキシル基等を有している場合は、例えば、化学クロスリンカーを介して結合物質９１と修飾物質９２とを結合させること；結合物質９１がスルフヒドリル基を有する場合、結合物質９１と修飾物質９２との間にジチオール結合を形成させること；一般的な化学反応を行なうこと等により、結合物質９１と修飾物質９２とを容易に結合させることができる。
【００５４】
クロスリンカーは、一般的に直鎖状の構造を有しており、両末端にアミノ基やチオール基と反応するサクシンイミド基、マレイミド基等を有するスペーサーからなる。かかるクロスリンカーを用いることにより、結合物質９１と修飾物質９２とを連結させることが可能である。
【００５５】
例えば、修飾物質９２がチオール基を有する場合、この修飾物質９２を結合物質９１のアミノ基に結合させる際に、一方の末端にサクシンイミド基を有し、かつ他方の末端にマレイミド基を有するクロスリンカーを用いることができる。この場合、まず、結合物質９１中のアミノ基とクロスリンカー中のサクシンイミド基とを反応させ、クロスリンカーのマレイミド基を結合物質９１に導入する。そして、マレイミド基と修飾物質９２中のチオール基とを反応させることにより結合させることができる。ここで、クロスリンカーのスペーサーの長さは、特に限定されるものではない。クロスリンカーの具体例としては、Ｎ−［α−マレイミドアセトアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、（マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ＮＨＳ−ＰＥＧｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄ等が挙げられる。クロスリンカーは、両末端の官能基がアミノ基との反応性を有するグルタルアルデヒド、アミン反応性のＮＨＳエステル基と光反応性のジアジリン基の２つの官能基を末端に有するクロスリンカー等であってもよい。
【００５６】
結合物質９１及び修飾物質９２の両方がチオール基を有している場合、結合物質９１のチオール基と修飾物質９２のチオール基とを反応させることにより、ジチオール結合を形成することによっても結合可能である。修飾物質９２がカルボキシル基を有し、かつ結合物質９１がアミノ基を有する場合、カルボキシル基をＮＨＳで活性化して、結合物質９１のアミノ基と結合させることができる。修飾物質９２がアルデヒド基を有し、かつ結合物質９１がアミノ基を有する場合、修飾物質９２のアルデヒド基と結合物質９１のアミノ基との間でシッフ塩基を形成させた後、還元して安定な結合をつくることができる。
【００５７】
修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により結合させる方法は、特に限定されるものではない。
【００５８】
修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により結合させる方法としては、修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により直接結合させる方法、結合物質９１に共有結合により結合させた物質を介して修飾物質９２を非共有結合により結合させる方法等が考えられる。
【００５９】
修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により結合させる方法としては、例えば、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を利用する方法等が挙げられる。結合物質９１に共有結合により結合させた物質を介して修飾物質９２を非共有結合により結合させる方法としては、例えば、まず、末端にアミノ基等を有するＤＮＡを結合物質９１に共有結合させ、つぎに、上記したＤＮＡに、修飾物質９２を結合させた相補的なＤＮＡをハイブリダイゼーションにより非共有結合的に結合させる方法等が挙げられる。
【００６０】
修飾物質９２への標識物質９３の結合方法についても、修飾物質９２を結合物質９１に結合させるのと同様の方法により行なうことができる。
【００６１】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図６（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００６２】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２，７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、参照電極６９を基準として任意の電位が作用電極本体６１に印加される。電極に印加される電位は、被検物質に対する励起光が照射されていない場合の電流値（定常電流、暗電流）が小さく、被検物質から生じる光電流が最大となる電位が好ましい。電位は、対極６６に印加してもよく、作用電極本体６１に印加してもよい。
【００６３】
その後、検出装置１の光源１３により、作用電極６０上の標識物質９３に励起光が照射される。これにより、標識物質９３が励起し、電子を発生する。そして、発生した電子は、作用電極６０に移動する。その結果、作用電極６０と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６０と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質９３の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質Ｓを定量することができる。なお、励起光は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて得られる特定波長領域の光のみであってもよい。
【００６４】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された電流値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００６５】
電解液として、酸化された状態の標識物質９３に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒又はプロトン性極性溶媒と、を含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。電解液は、ゲル状であってもよく、固体であってもよい。
【００６６】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。
【００６７】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００６８】
標識物質９３への光の照射には、標識物質９３を光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質９３の種類等に応じて、適宜選択することができる。光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて得られる特定波長領域の光のみを標識物質９３に照射してもよい。
【００６９】
標識物質９３に由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコーダ、計算機等を備える測定装置を用いることができる。
かかる検出工程では、光電流を定量することにより、被検物質の量を調べることができる。
【００７０】
以上のように、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓの検出時には、結合物質９１と標識物質９３との間に修飾物質９２が介在した状態となっている〔図６（Ｄ）を参照〕。これに対して、従来の被検物質の電気化学的検出方法では、例えば、図７（Ａ）に示されるように、被検物質Ｓの標識には、結合物質としての抗体１０２が標識物質１０３により直接標識された標識抗体１０１が用いられている。そして、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識抗体１０１とを含む複合体を形成させ、電極上に形成された複合体中の標識物質１０３から生じる電流（光電流）に基づいて被検物質Ｓが検出される。そのため、図７に示される従来の方法では、被検物質Ｓの検出の際に形成される複合体の嵩高さが、高感度化を図る上で大きな制約となり、検出される光電流が小さくなる傾向にある。
【００７１】
ところが、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、作用電極６０上に形成される複合体は、図７に示される従来の方法での被検物質Ｓの標識の際に形成される複合体と比べ、より嵩高くなっているにもかかわらず、予想外にも、図７に示される従来の方法よりも、高い検出感度で被検物質を検出することができる。
【００７２】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００７３】
本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質１９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００７４】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質が予め結合されている標識結合物質を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、図８に示されるように、標識工程中において、標識結合物質が形成されるように操作を行なってもよい。図８は、本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程は、前述した図６に示される方法の（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程と同様である。一方、図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ｃ）標識工程において、まず、被検物質Ｓに結合体〔第１結合体９０ａ及び第２結合体９０ｂ〕を付加する〔図８（Ｃ−１）結合体付加工程を参照〕。この（Ｃ−１）結合体付加工程では、まず、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９１ａと、第２結合物質９１ｂとからなる第１結合体９０ａを、作用電極本体６１上の捕捉物質により捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図８（Ｃ−１−１）第１結合体付加工程を参照〕。つぎに、第１結合体９０ａに含まれる第２結合物質９１ｂに結合する第２結合体９０ｂを、第１結合体９０ａに結合させる〔図８（Ｃ−１−２）第２結合体付加工程を参照〕。その後、第２結合物質９１ｂに修飾物質９２を介して標識物質９３が固定された標識体９０ｃを、第２結合体９０ｂに結合させる〔図８（Ｃ−２）標識体付加工程を参照〕。なお、図８に示される方法では、第１結合体９０ａ及び標識体９０ｃは、同じ結合物質（第２結合物質９１ｂ）により、第２結合体９０ｂに結合するが、第１結合体９０ａ中において、第２結合体９０ｂと結合する結合物質と、標識体９０ｃ中において、第２結合体９０ｂと結合する結合物質とは、互いに異なる物質であってもよい。
【００７５】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出方法
つぎに、酸化還元電流・電気化学発光検出方法について説明する。図９は、本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００７６】
かかる酸化還元電流・電気化学発光検出方法は、標識工程〔図９（Ｃ）参照〕において、標識物質１９３として、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質を用いる点及び検出工程〔図９（Ｄ）参照〕において、電圧を作用電極６０に印加して標識物質１９３から生じた光を検出する点が光電気化学検出方法と大きく異なっている。したがって、試料供給工程〔図９（Ａ）参照〕及び被検物質捕捉工程〔図９（Ｂ）参照〕は、光電気化学検出方法と同様である。なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置１は、光源１３を備えず、標識物質から生じる光を検出するためのセンサをさらに備えている装置である。本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出チップ２０は、作用電極本体６１が導電性材料からなるものである。
【００７７】
標識工程においては、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質１９０を注入して、標識結合物質１９０を作用電極本体６１上の捕捉物質８１により捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図９（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識結合物質１９０とを含む複合体が形成される。
【００７８】
標識結合物質１９０は、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９１と、修飾物質９２と、標識物質１９３とから構成されている。標識結合物質１９０では、第１結合物質９１と、標識物質１９３とが修飾物質９２を介して連結されている。
【００７９】
標識物質１９３は、電圧を印加することにより発光する標識物質である。
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノール、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノール、クロロフェノールのようなフェノール類若しくはナフトール類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質１９３として、電圧を印加することにより発光する標識物質の代わりに、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質を用いてもよい。
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
【００８０】
なお、第１結合物質９１及び修飾物質９２は、光電気化学検出方法における第１結合物質９１及び修飾物質９２と同様である。
【００８１】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図９（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００８２】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２，７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、作用電極６０に電圧が印加される。これにより、標識物質１９３が励起され、光が生じる。標識物質１９３に基づく光の測定には、フォトンカウンタ等が用いられる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバーの先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバー電極を用いて光を間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【００８３】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された光量の値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された光量の値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００８４】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法においても、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００８５】
本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質１９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質１９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００８６】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質１９３が予め結合されている標識結合物質１９０を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、標識工程中において、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識結合物質１９０とを含む複合体が形成されるように操作を行なってもよい。
【００８７】
図９（Ｄ）では、光を測定する場合を例として挙げて示しているが、標識物質１９３が電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質である場合には、標識物質１９３が励起され、電子が発生する。そして、発生した電子は、作用電極６０に移動する。その結果、作用電極６０と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６０と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質を定量することができる。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８９】
（製造例１）
シランカップリング剤である３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ａを得た。
【００９０】
（製造例２）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。この薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【００９１】
つぎに、作用電極本体の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の本体表面にチオール基を付与した。
【００９２】
また、捕捉物質である抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〔ダコ社製〕を、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）固定ゲル〔ピアース製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＣＥＰ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｌ〕と接触させて還元し、抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体を作製した。得られた抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにトリス緩衝溶液〔ｐＨ７．２、以下、「ＴＢＳ」という〕に添加し、抗体溶液を得た。
【００９３】
つぎに、得られた抗体溶液を作用電極本体上に滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションし、抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体と作用電極本体上のチオール基とを反応させジチオール結合を形成した。これにより、抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体を作用電極本体上に固定した。つぎに、作用電極本体上に、１ｍＭトリエチレングリコール モノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル〔シグマ社製〕を滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションして作用電極本体のブロッキングを行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【００９４】
（製造例３）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性溶媒を得た。この非プロトン性溶媒に、電解質塩としてテトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、電解液を得た。
【００９５】
（製造例４）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜（導電層）からなる対極を形成し、対極基板を得た。この対極には電流計と接続するための対極リードを接続した。これにより、対極基板を得た。
【００９６】
（実施例１）
抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を、その濃度が７．３μＭとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に添加した。つぎに、得られた混合物に、クロスリンカー〔（株）同仁化学研究所製、Ｎ−(４−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド（ＧＭＢＳ）〕のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液〔クロスリンカーの濃度：２５ｍＭ〕を、クロスリンカーの濃度が２．５ｍＭになるように添加した。得られた混合物を室温で３０分間インキュベーションし、抗マウスＩｇＧ抗体とＧＭＢＳとを反応させた。得られた産物を脱塩カラム〔ピアース社製、商品名：Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ〕に供して未反応のＧＭＢＳを除去し、クロスリンカー結合抗体を得た。
【００９７】
つぎに、得られたクロスリンカー結合抗体と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡとを、スクシンイミド基導入抗体／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡ（モル比）が１／１４となるように混合した。得られた混合物を室温で４時間インキュベーションして、クロスリンカー結合抗体と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡとを反応させた。なお、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡは、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製5'-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3'（配列番号：１）〕の５’末端がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０で標識され、かつ３’末端がチオール基修飾されたＤＮＡである。
【００９８】
得られた産物を、限外ろ過カラム〔アミコン社製、商品名：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ １００Ｋ〕に４回通して未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡを完全に除去し、標識結合物質を得た。得られた標識結合物質を、その濃度が１ｍｇ/ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、標識結合物質含有溶液を得た。
【００９９】
得られた標識結合物質について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の吸収波長７４９ｎｍにおける吸収を測定することにより、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数を調べた。その結果、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数は、９個であることが確認された。
【０１００】
（比較例１）
抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を、その濃度が１４．６μＭとなるように、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に添加した。つぎに、得られた混合物に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体〔商品名：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（インビトロジェン社製）〕のＤＭＳＯ溶液〔ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体の濃度：１５ｍＭ〕を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体の濃度が１．５ｍＭになるように添加した。得られた混合物を室温で１時間インキュベーションし、抗マウスＩｇＧ抗体とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体とを反応させた。得られた産物を脱塩カラム〔ピアース社製、商品名：Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ〕に供して未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０を除去し、標識抗体を得た。得られた標識抗体を、その濃度が２ｍｇ/ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、標識抗体含有溶液を得た。
【０１０１】
得られた標識抗体について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の吸収波長７４９ｎｍにおける吸収を測定することにより、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数を調べた。その結果、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数は、１０個であることが確認された。
【０１０２】
（試験例１）
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、１質量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．０５質量％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ−Ｔ）を入れた。つぎに、上記した空間内の液体の排出後、１００ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ（被験物質）含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた〔図６（Ｂ）被検物質捕捉工程を参照〕。
【０１０３】
（１−２）標識
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、実施例１で得られた１ｍｇ／ｍＬ標識結合物質含有溶液を、標識結合物質の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションして、作用電極上の被検物質を標識した〔図６（Ｃ）参照〕（実験番号１）。
【０１０４】
一方、被検物質が存在しない場合の対照実験を以下のように行なった。まず、被検物質を捕捉させていない作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、実施例１で得られた１ｍｇ／ｍＬ標識結合物質含有溶液を、標識結合物質の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした（実験番号２）。
【０１０５】
（２）対照実験
（１−１）と同様の操作を行ない、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた。
【０１０６】
その後、（１−２）において、実施例１で得られた標識結合物質含有溶液の代わりに、比較例１で得られた標識抗体含有溶液を用いたことを除き、（１−２）と同様の操作を行ない、作用電極上の被検物質を標識した（実験番号３）。
【０１０７】
一方、被検物質が存在しない場合の対照実験を以下のように行なった。被検物質を捕捉させていない作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、比較例１で得られた２ｍｇ／ｍＬ標識抗体含有溶液を、標識結合物質の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした（実験番号４）。
【０１０８】
（３）光電流の測定
実験番号１〜４の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。つぎに、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。その後、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１０９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した〔図６（Ｄ）検出工程参照〕。
【０１１０】
試験例１において、実施例１で得られた標識結合物質を用いて被検物質を検出する場合（実験番号１）の検出工程を示す概略説明図を図１０（Ａ）に、試験例１において、比較例１で得られた標識抗体を用いて被検物質を検出する場合（実験番号３）の検出工程を示す概略説明図を図１０（Ｂ）に示す。また、試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１１に示す。
【０１１１】
実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法においては、実施例１で得られた標識結合物質〔図１０（Ａ）において、１１０を参照〕が用いられている。そのため、図１０（Ａ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体１分子あたり９個の標識物質から光電流が生じる。これに対して、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法においては、比較例１で得られた標識抗体〔図１０（Ｂ）中、１２１参照〕が用いられている。そのため、図１０（Ｂ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体１分子あたり１０個の標識物質から光電流が生じる。したがって、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と略同じであるか、若干小さいことが予想されうる。
【０１１２】
しかしながら、図１１に示された結果から、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は２０ｎＡであるのに対して、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は４．５ｎＡであることがわかる。これらの結果から、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、予想外にも、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と比べ、はるかに大きいことがわかる。
【０１１３】
実施例１で得られた標識結合物質及び比較例１で得られた標識抗体では、結合物質として同一の抗体が用いられている。そのため、被検物質への実施例１で得られた標識結合物質及び比較例１で得られた標識抗体それぞれの結合効率は、略同じであると考えられる。また、被検物質がない場合では、いずれも、光電流は約０ｎＡである（図１１中、実験番号２及び実験番号４を参照）。そのため、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流との違いは、ノイズの影響ではないと考えられる。したがって、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流との違いは、標識物質と結合物質との間にＤＮＡが介在しているかどうかによると考えられる。
【０１１４】
（実施例２）
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔを入れた。上記した空間内の液体の排出後、１００ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ（被検物質）含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ３０μＬを、上記した空間内に添加した〔図１２（Ａ）を参照〕。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた〔図１２（Ｂ）を参照〕。
【０１１５】
（１−２）標識
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、２．１ｍｇ／ｍＬビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔シグマ社製〕を含む溶液を、濃度が４μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔図１２（Ｂ）において、１３０ａを参照〕を、捕捉物質〔図１２（Ｂ）において、８１を参照〕に捕捉された被検物質〔図１２（Ｂ）において、Ｓを参照〕に結合させた。なお、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体〔図１２（Ｂ）において、１３１ａを参照〕をビオチン〔図１２（Ｂ）において、１３１ｂを参照〕で標識したものである。
【０１１６】
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕を含む溶液〔第２結合体の濃度：２ｍｇ／ｍＬ〕を、第２結合体の濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジン〔図１２（Ｃ）において、１３０ｂを参照〕を、作用電極上のビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体に結合させた。
【０１１７】
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、標識体であるビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを含有する溶液〔標識体の濃度：１００μＭ〕を、標識体の濃度が１μＭとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた（実験番号５）。第１結合体と第２結合体とからなる複合体〔図１２（Ｄ）において、１３１を参照〕は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質〔図１２（Ｄ）において、１３１を参照〕に、修飾物質であるＤＮＡ〔図１２（Ｄ）において、１３２を参照〕を介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０〔図１２（Ｄ）において、１３３参照〕が結合している。
【０１１８】
なお、ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡは、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製、5'-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3'（配列番号：１）〕の５’末端がビオチン修飾され、かつ３’末端がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０で標識されたＤＮＡである。
【０１１９】
一方、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった（実験番号６）。
【０１２０】
（２）対照実験
第１結合体、第２結合体及び標識体を用いる代わりに、標識物質が抗体に直接結合した標識抗体〔比較例１で得られた標識抗体〕を用い、以下のように、対照実験を行なった。まず、（１−１）と同様の操作を行ない、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた〔図１３（Ｂ）を参照〕。
【０１２１】
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、比較例１で得られた１ｍｇ／ｍＬ標識抗体含有溶液を、標識抗体の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションして、作用電極上の被検物質を標識した〔図１３（Ｂ）参照〕（実験番号７）。
【０１２２】
一方、被検物質が存在しない場合の対照実験を以下のように行なった。まず、被検物質を捕捉させていない作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、比較例１で得られた２ｍｇ／ｍＬ標識抗体含有溶液を、標識抗体の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした（実験番号８）。
【０１２３】
（３）光電流の測定
実験番号５〜８の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。つぎに、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。その後、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１２４】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０〔図１２（Ｄ）において、１３３参照〕が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１２５】
実施例２における実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図を図１４（Ａ）に、実施例２における実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図を図１４（Ｂ）に示す。また、実施例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１５に示す。
【０１２６】
実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法においては、図１４（Ａ）に示されるように、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔図中、１３１ａを参照〕と、第２結合体であるストレプトアビジン〔図中、１３０ｂを参照〕と、標識体であるビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ〔図中、１３０ｃを参照〕とが用いられている。ここで、ストレプトアビジンの分子量は、５３ｋＤａ程度であり、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体のビオチンとストレプトアビジンが結合したときの立体障害を考慮すると、１分子のビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（分子量１５０ｋＤａ程度）に結合させることができるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数は、最大４分子程度であると考えられる。また、ストレプトアビジン中の４つのビオチン結合サイトのうちの３つに、ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを結合させることができる。そのため、図１４（Ａ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体１分子あたり９〜１２個の標識物質から光電流が生じる。これに対して、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法においては、標識抗体〔図１４（Ｂ）において、１４１を参照〕が用いられている。そのため、図１４（Ｂ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体〔図１４（Ｂ）において、１４２を参照〕１分子あたり１０個の標識物質〔ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、図１４（Ｂ）において、１４３を参照〕から光電流が生じる。したがって、ＤＮＡを考慮しなければ、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と同程度であることが予想されうる。
【０１２７】
しかしながら、図１５に示された結果から、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は１２ｎＡであるのに対して、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は４．５ｎＡであることがわかる。これらの結果から、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、予想外にも、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と比べ、はるかに大きいことがわかる。したがって、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流との違いは、標識物質と結合物質との間にＤＮＡが介在しているかどうかによると考えられる。
【０１２８】
ＤＮＡは、親水性を示す。したがって、ＤＮＡは、非プロトン性溶媒を含有する電解液及び親水性のトリエチレングリコール（ＴＥＧ）鎖が導入された作用電極本体に対し、相互作用（親水性相互作用）を生じると考えられる。一方、電解液がプロトン性溶媒を含有し、かつ作用電極本体に疎水性の官能基が導入されている場合には、ＤＮＡの代わりに疎水性を有する物質を用いることにより、相互作用（疎水性相互作用）が生じると考えられる。
【０１２９】
以上の結果から、被検物質を標識するために、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質を介して標識物質が結合物質に少なくとも固定された標識結合物質を用いることにより、高感度で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１３０】
（製造例５）
ビオチン化ＤＮＡ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを、それぞれの濃度が１μＭ及び１０μＭとなるように１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液中に添加した。得られた混合物を８０℃で１分間加熱した後、当該混合物の温度を毎分１℃下降させながら４℃まで冷却した。これにより、ビオチン化ＤＮＡとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、ビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体（図１６中、１７０参照）を作製した。なお、ビオチン化ＤＮＡは、８４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製、5'-biotin-AAACCACGGCCCTAGGGACAACGACCACGGCCCTAGGGACAACGACCACGGCCCTAGGGACAACGACCACGGCCCTAGGGACAACGA-3'（配列番号：２）、図１６中、１７２ａ参照〕の５’末端がビオチン（図１６中、１７２ｂ参照）で修飾されたＤＮＡ（リン酸骨格の５’末端に(ＣＨ2)3リンカーを介してビオチンが結合しているＤＮＡ）である（図１６中、１７２参照）。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡは、２０ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製、5'-CGTTGTCCCTAGGGCCGTGGGTATGCGCGCTGCTATGCCG-3'（配列番号：３）、図１６中、１７１ｂ参照〕の５’末端及び３’末端がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（図１６中、１７１ａ参照）で標識されたＤＮＡである（図１６中、１７１参照）。
【０１３１】
（実施例３）
多価標識ＤＮＡによるマウスＩｇＧの検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。つぎに、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、被検物質である１０ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ ３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、作用電極基板の作用電極本体（図１７中、６１参照）上に固定された捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体、図１７中、８１参照〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ、図１７中、Ｓ参照〕を捕捉させた〔図１７（Ａ）参照〕。
【０１３２】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〔ダコ社製〕を、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５１参照）を、捕捉物質（図１７中、８１参照）に捕捉された被検物質（図１７中、Ｓ参照）に結合させた〔図１７（Ｂ）参照〕。なお、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体は、抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５２参照）をビオチン（図１７中、１５３参照）で標識したものである。
【０１３３】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕を、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジン（図１７中、１６０参照）を、作用電極本体（図１７中、６１参照）上のビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５１参照）中のビオチン（図１７中、１５３）に結合させた〔図１７（Ｃ）参照〕。
【０１３４】
（１−３）色素標識
（１−２）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）３０μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極本体（図１７中、６１参照）上に、被検物質（図１７中、Ｓ参照）と第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５１参照）と第２結合体であるストレプトアビジン（図１７中、１６０参照）と標識体であるビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体（図１７中、１７０参照）とを含む複合体を形成させた〔図１７（Ｄ）参照〕。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１３５】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１３６】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した（実験番号９）。
【０１３７】
なお、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体の代わりに、実験番号５（ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ：配列番号１）で使用した複合体を用いて、上記と同様の操作を行なったものを対照実験とした（実験番号１０）。
【０１３８】
実施例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１８に示す。
【０１３９】
図１８に示された結果から、実験番号９の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は３．６ｎＡであるのに対して、実験番号１０の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は０．６８ｎＡであることがわかる。これらの結果から、実験番号９の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、実験番号１０の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と比べて大きいことがわかる。
【０１４０】
以上の結果から、被検物質を標識するために、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、より高感度で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１４１】
（実施例４）
多価標識ＤＮＡによるマウスＩｇＧの定量検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、被検物質である１０ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ ３０μＬを上記した空間内に添加した。その後、前記作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた。
【０１４２】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〔ダコ社製〕を、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体を、捕捉物質に捕捉された被検物質に結合させた。なお、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体は、抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）2抗体をビオチンで標識したものである。
【０１４３】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕２ｍｇ／ｍＬを、濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジンを、作用電極上のビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体に結合させた。
【０１４４】
（１−３）色素標識
（１−２）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）３０μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１４５】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１４６】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１４７】
なお、（１−１）において、被検物質として、１０ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧを用いる代わりに、１００ｐｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、１ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧを用いたことを除き、上記と同様の操作を行なって電流を測定した。また、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった。
【０１４８】
実施例４において、被検物質（マウスＩｇＧ）の濃度と光電流との関係を調べた結果を図１９に示す。
【０１４９】
図１９に示された結果から、被検物質の濃度が１００ｐｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬである場合に検出される光電流は、それぞれ、０．９５ｎＡ、２．８５ｎＡ及び１４．９ｎＡであることがわかる。また、被検物質が存在しない場合に検出される光電流は、０．４７ｎＡであることがわかる。したがって、これらの結果から、被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は被検物質の濃度に応じて増加していることがわかる。また、これらの結果から、被検物質の濃度が１００ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合、被検物質を定量的に検出することができることがわかる。
【０１５０】
以上の結果から、被検物質を標識するために、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、高感度で定量的に被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１５１】
（製造例６）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。上記した薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【０１５２】
つぎに、作用電極本体の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の本体表面にチオール基を付与した。
【０１５３】
また、捕捉物質である抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕を、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）固定ゲル〔ピアース社製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＣＥＰ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｌ〕と接触させて還元し、重鎖還元型抗ヒトインターロイキン−６抗体を作製した。得られた抗ヒトインターロイキン−６抗体を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳに添加し、抗体溶液を得た。
【０１５４】
つぎに、得られた抗体溶液を作用電極本体上に滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションし、抗ヒトインターロイキン−６抗体と作用電極本体上のチオール基とを反応させジチオール結合を形成した。これにより、抗ヒトインターロイキン−６抗体を作用電極本体上に固定した。つぎに、作用電極本体上に、１ｍＭトリエチレングリコール モノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル〔シグマ社製〕を滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションして作用電極本体のブロッキングを行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【０１５５】
（実施例５）
多価標識ＤＮＡによるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の定量検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例６で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。上記した空間内の液体の排出後、被検物質であるヒトインターロイキン−６を２５質量％ウシ血清〔サーモサイエンティフィック社製〕と０．７５質量％ＢＳＡとを含むＴＢＳ−Ｔで希釈して得られた被検物質溶液（被検物質の濃度：５００ｐｇ／ｍＬ）３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗ヒトインターロイキン−６抗体〕に、被検物質〔インターロイキン−６〕を捕捉させた。
【０１５６】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕をその濃度が１μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体を、捕捉物質に捕捉された被検物質に結合させた。なお、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体は、抗ヒトインターロイキン−６抗体をビオチンで標識したものである。
【０１５７】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕２ｍｇ／ｍＬを、濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジンを、作用電極上のビオチン標識ヒトインターロイキン−６抗体に結合させた。
【０１５８】
（１−３）色素標識
（１−２）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）１００μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１５９】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１６０】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１６１】
なお、（１−１）において、被検物質の濃度が５００ｐｇ／ｍＬである被検物質溶液を用いる代わりに、被検物質の濃度が７．８ｐｇ／ｍＬ、１５．６ｐｇ／ｍＬ、３１．２ｐｇ／ｍＬ、６２．５ｐｇ／ｍＬ、１２５ｐｇ／ｍＬ又は２５０ｐｇ／ｍＬである被検物質溶液を用いたことを除き、上記と同様の操作を行なって電流を測定した。また、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった。
【０１６２】
実施例５において、被検物質（ヒトＩＬ−６）の濃度と光電流との関係を調べた結果を図２０に示す。
【０１６３】
図２０に示された結果から被検物質の濃度が７．８ｐｇ／ｍＬ、１５．６ｐｇ／ｍＬ、３１．２ｐｇ／ｍＬ、６２．５ｐｇ／ｍＬ、１２５ｐｇ／ｍＬ、２５０ｐｇ／ｍＬ及び５００ｐｇ／ｍＬである場合に検出される光電流は、それぞれ、０．０８９ｎＡ、０．０９２ｎＡ、０．０９５ｎＡ、０．１１ｎＡ、０．１４ｎＡ、０．２１ｎＡ及び０．３ｎＡであることがわかる。また、被検物質が存在しない場合に検出される光電流は、０．０８３ｎＡであることがわかる。したがって、これらの結果から、被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は被検物質の濃度に応じて増加しており、被検物質を定量的に検出することができることがわかる。
【０１６４】
以上の結果から、マウスＩｇＧ以外の被検物質に対しても、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、高感度で定量的に被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１６５】
（製造例７）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。上記した薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【０１６６】
つぎに、作用電極本体の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の本体表面にチオール基を付与した。
【０１６７】
また、捕捉物質である抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕、又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体〔バイオレジェンド社製〕を、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）固定ゲル〔ピアース社製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＣＥＰ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｌ〕と接触させて還元し、重鎖還元型抗ヒトインターロイキン−６抗体、又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体を作製した。得られた抗ヒトインターロイキン−６抗体又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳに添加し、抗ヒトインターロイキン−６抗体溶液又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体溶液を得た。
【０１６８】
作用電極上に、２つの開口部を有するシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を隔壁となるように配置した。その後、作用電極本体とシリコーンゴムとに囲まれた空間の一方に抗ヒトインターロイキン−６抗体溶液を入れ、もう一方に抗ヒトインターフェロン−γ抗体を入れた。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションし、抗ヒトインターロイキン−６抗体又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体と、作用電極本体上のチオール基とを反応させジチオール結合を形成した。これにより、抗ヒトインターロイキン−６抗体及び抗ヒトインターフェロン−γ抗体を作用電極本体上に固定した。作用電極本体からシリコーンゴムを外した、その後、前述した２つの開口部に相当する範囲を含む大きさの開口部を１つ有するシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を、隔壁となるように作用電極上に配置した。つぎに、作用電極本体上に、１ｍＭトリエチレングリコール モノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル〔シグマ社製〕を滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションして作用電極本体のブロッキングを行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【０１６９】
（実施例６）
多価標識ＤＮＡによるインターロイキン−６（ＩＬ−６）ならびにインターフェロン−γの同時検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例７で得られた作用電極基板の周囲に厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。つぎに、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。上記した空間内の液体の排出後、被検物質としてのヒトインターロイキン−６〔バイオレジェンド社製〕単独、被検物質としてのヒトインターフェロン−γ〔バイオレジェンド社製〕単独、又は、被検物質としてのヒトインターロイキン−６とヒトインターフェロン−γとの混合物を、２５％質量ウシ血清〔サーモサイエンティフィック社製〕と０．７５質量％ＢＳＡとを含むＴＢＳ−Ｔで希釈して得られた検出対象物溶液（検出対象物の濃度：２５０ｐｇ／ｍＬ）３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗ヒトインターロイキン−６抗体、抗ヒトインターフェロン−γ抗体〕に、被検物質〔インターロイキン−６、ヒトインターフェロン−γ〕を捕捉させた。
【０１７０】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕と抗ヒトインターフェロン−γ抗体〔バイオレジェンド社製〕とを、それぞれの濃度が１μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体及びビオチン標識抗ヒトインターフェロン−γ抗体を、捕捉物質に捕捉された被検物質に結合させた。なお、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体及びビオチン標識抗ヒトインターフェロン−γ抗体は、抗ヒトインターロイキン−６抗体及び抗ヒトインターフェロン−γ抗体それぞれをビオチンで標識したものである。
【０１７１】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕２ｍｇ／ｍＬを、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジンを、作用電極上のビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体に結合させた。
【０１７２】
（１−３）色素標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）１００μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、検出対象物としての被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１７３】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１７４】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。抗インターロイキン−６抗体固定部及び抗インターフェロン−γ抗体固定部の両方において電流の測定を行なった。なお、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった。
【０１７５】
実施例６において、検出対象物の種類と光電流との関係を調べた結果を図２１に示す。
【０１７６】
図２１に示された結果から、被検物質がインターロイキン−６である場合に検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．２０ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．０８ｎＡであるのに対して、被検物質非存在下で検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．０６ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．０７ｎＡであることがわかる。また、被検物質がインターフェロン−γである場合に検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．０９ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．１４ｎＡであることがわかる。これらの結果から、同一電極上において、固定された捕捉物質である抗体に特異的な被検物質の検出が可能であることが示唆される。
【０１７７】
一方、被検物質がインターロイキン−６とインターフェロン−γとの混合物である場合に検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．１７ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．１０ｎＡであることがわかる。これらの光電流は、被検物質非存在下での光電流よりも大きいが、被検物質がインターロイキン−６単独又はインターフェロン−γ単独である場合に検出される光電流よりも小さい。したがって、検出対象物が複数種類の被検物質の混合物である場合には、各被検物質の特異的検出は可能ではあるが、単独の被検物質を検出する場合と比べて、若干の検出感度低下が認められることがわかる。
【０１７８】
以上の結果から、被検物質を標識するために、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、同一電極上で多種類の被検物質を同時に検出することができることが示唆される。
【符号の説明】
【０１７９】
１ 検出装置
１１ チップ受入部
１２ ディスプレイ
１３ 光源
１４ 電流計
１５ 電源
１６ 変換部
１７ 制御部
２０ 検出チップ
２０ａ 空間
３０ 上基板
３０ａ 基板本体
３０ｂ 試料注入口
４０ 下基板
４０ａ 基板本体
５０ 間隔保持部材
６０ 作用電極
６１ 作用電極本体
６６ 対極
６９ 参照電極
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
８１ 捕捉物質
９０ 結合物質
９０ 標識結合物質
９０ａ 第１結合体
９０ｂ 第２結合体
９０ｃ 標識体
９１ 結合物質
９１ａ 第１結合物質
９１ｂ 第２結合物質
９２ 修飾物質
９３ 標識物質
９３ 標識体
１０１ 標識抗体
１０２ 抗体
１０３ 標識物質
１２１ 標識抗体
１３０ａ ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体
１３０ｂ ストレプトアビジン
１３０ｃ ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１３１ａ 抗マウスＩｇＧ抗体
１３１ｂ ビオチン
１３２ ＤＮＡ
１３３ 標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）
１４１ 標識抗体
１４２ 抗体
１４３ 標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）
１５１ ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体
１５２ ビオチン
１５３ 抗マウスＩｇＧ抗体
１６０ ストレプトアビジン
１７０ ビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体
１７１ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１７１ａ ＤＮＡ
１７１ｂ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１７２ ビオチン化ＤＮＡ
１７２ａ ＤＮＡ
１７２ｂ ビオチン
１９０ 標識結合物質
１９０ 結合物質
１９３ 標識物質
Ｓ 被検物質
【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
配列番号：１は、実施例１及び実施例２において、修飾物質として用いられたＤＮＡの配列である。
配列番号：２は、ビオチン化ＤＮＡの配列である。
配列番号：３は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の電気化学的検出方法に関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出及び定量等、並びに、これらを利用する疾病の臨床検査及び診断等に有用な、被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査及び診断は、生体試料中に含まれる疾病に関連する遺伝子又はタンパク質等を、遺伝子検出法及び免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査及び診断を行なうための方法として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる光電流を、核酸、タンパク質等の被検物質の検出に利用する光化学的検出方法が提案されている。ここで、臨床検査及び診断では、検体に含まれる微量な被検物質を検出する必要があるため、被検物質の検出感度の向上が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１の段落番号［００６９］〜［００７８］には、被検物質であるタンパク質を特異的に認識する捕捉物質である抗体が固定化された電極と、電気化学的に活性な標識物質により結合物質である抗体が標識された標識抗体とを用いる光電流による被検物質の特異的検出法が開示されている。特許文献１に記載の方法では、まず、被検物質と電極上の抗体とを接触させ、抗体によって被検物質を電極上に捕捉する。その後、電極上に捕捉された被検物質と、標識抗体とを接触させて、捕捉物質と被検物質と標識抗体とを含む複合体を形成させる。そして、複合体中の標識物質に基づく光電流を測定することにより、被検物質が検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０２４４４６号、段落番号［００６９］〜［００７８］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、電極上で形成された複合体が嵩高いため、複合体中に含まれる標識物質と電極との間の物理的距離が長くなり、標識物質と電極との間において、電子輸送が行なわれにくくなる。例えば、ＩｇＧ抗体は、１０ｎｍ程度の大きさを有している。したがって、特許文献１に記載の方法において、捕捉物質及び標識抗体を構成する抗体としてＩｇＧ抗体を用いる場合、被検物質の検出に際して、電極上に形成される複合体中の標識物質は、電子輸送が効率よく起こりうる電極表面から非常に離れた位置に存在することになる。このように、特許文献１に記載の方法では、被検物質の検出の際に形成される複合体の嵩高さが、高感度化を図る上で大きな制約となっている。
【０００６】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、高い検出感度で被検物質を検出することができる被検物質の電気化学的検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、被検物質の検出に際して、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質を介して、標識物質が抗体に固定された標識結合物質を用いることにより、検出感度が著しく向上するという知見を得て、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕 被検物質を電解液中で電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が作用電極本体上に固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、当該被検物質に結合する結合物質に修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程
を含み、
前記修飾物質は、電解液と、補足物質が結合している部位以外の作用電極部位と、に対して相互作用を生じる物質である、
被検物質の電気化学的検出方法、
〔２〕 前記電解液が、非プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が親水性を示す前記〔１〕に記載の方法、
〔３〕 前記修飾物質が、ＤＮＡである前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法、
〔４〕 前記電解液が、プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が疎水性を示す前記〔１〕に記載の方法、
〔５〕 前記工程（２）において、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、前記標識結合物質とを接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕 前記工程（２）において、前記被検物質に結合する第１結合物質を含む結合体と、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質とを接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体と、前記結合体に結合する第２結合物質に前記修飾物質を介して前記標識物質が結合した標識体とを接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる前記〔１〕に記載の方法、
〔７〕 前記工程（２）の後、作用電極を洗浄し、被検物質に結合していない標識結合物質を除去する前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
〔８〕 前記標識物質が、電気化学的又は光化学的に活性な物質である前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕 前記標識結合物質が、前記結合物質に、修飾物質を介して複数の標識物質が保持された多価標識結合物質である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕 前記工程（３）で得られた検出結果に基づいて、前記被検物質を定量する、〔９〕に記載の方法、並びに
〔１１〕 前記被検物質は複数種類である、請求項〔９〕又は〔１０〕のいずれかに記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。
【図２】図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図である。（Ｂ）は図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図である。（Ｃ）は図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図７】従来の被検物質の電気化学的検出方法における検出工程を示す概略説明図である。
【図８】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図９】本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１０】（Ａ）は試験例１において、実施例１で得られた標識結合物質を用いて被検物質を検出する場合（実験番号１）の検出工程を示す概略説明図である。（Ｂ）は、試験例１において、比較例１で得られた標識抗体を用いて被検物質を検出する場合（実験番号３）の検出工程を示す概略説明図である。
【図１１】試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】実施例２における実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法の処理手順の一部を示す工程説明図である。
【図１３】実施例２における実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法の処理手順の一部を示す工程説明図である。
【図１４】（Ａ）は実施例２における実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図である。（Ｂ）は実施例２における実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図である。
【図１５】実施例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１６】製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体の概略説明図である。
【図１７】実施例３における実験番号９の被検物質の電気化学的検出方法の処理手順の一部を示す工程説明図である。
【図１８】実施例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１９】実施例４において、被検物質（マウスＩｇＧ）の濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２０】実施例５において、被検物質（ヒトＩＬ−６）の濃度と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２１】実施例６において、検出対象物の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［検出装置の構成］
本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用いる検出方法に用いる検出装置である。
【００１２】
検出装置１は、検出チップ２０が挿入されるチップ受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
【００１３】
図２は、図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源１３と、電流計１４と、電源１５と、Ａ／Ｄ変換部１６と、制御部１７と、ディスプレイ１２とを備えている。
光源１３は、検出チップ２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。これらの光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザー又は太陽光が好ましく、レーザーが特に好ましい。光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるように構成されたものであってもよい。
電流計１４は、励起された標識物質から放出される電子に起因して検出チップ２０内を流れる電流を測定する。
電源１５は、検出チップ２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１６は、電流計１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１７は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等から構成されている。この制御部１７は、ディスプレイ１２、光源１３、電流計１４及び電源１５の動作を制御する。また、制御部１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１２は、制御部１７で概算された被検物質の量等の情報を表示する。
【００１４】
なお、標識物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１３を備えていなくてもよい（図示せず）。
標識物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光等を検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００１５】
［検出チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ２０の構成を説明する。
【００１６】
図３は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。図４（Ａ）は、図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図であり、図４（Ｂ）は、図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図であり、図４（Ｃ）は、図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【００１７】
検出チップ２０は、上基板３０と、上基板３０の下方に設けられた下基板４０と、上基板３０と下基板４０とに挟まれた間隔保持部材５０とを備えている。検出チップ２０では、上基板３０と下基板４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板３０と下基板４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１８】
上基板３０は、図４（Ｂ）に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６０とを備えている。この基板本体３０ａには、被検物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口３０ｂが設けられている。基板本体３０ａの表面には、作用電極６０と、作用電極６０に接続されている電極リード７１とが形成されている。上基板３０においては、作用電極６０は、基板本体３０ａの一側部〔図４（Ｂ）の左側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６０から基板本体３０ａの他側部〔図４（Ｂ）の右側〕に向けて延びている。試料注入口３０ｂは、基板本体３０ａにおいて、間隔保持部材５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００１９】
本実施の形態において、基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板本体３０ａの形状は、基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。
【００２０】
基板本体３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。基板本体３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００２１】
下基板４０は、図４（Ｃ）に示されるように、基板本体４０ａと、対極６６と、参照電極６９とを備えている。基板本体４０ａは、上基板３０の基板本体３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。基板本体４０ａ及び基板本体３０ａは、必ずしも、同寸法である必要はない。
【００２２】
基板本体４０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体４０ａの厚さ及び大きさは、上基板３０の基板本体３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２３】
基板本体４０ａの表面には、対極６６と、対極６６に接続された電極リード７２と、参照電極６９と、参照電極６９に接続された電極リード７３とが形成されている。下基板４０においては、対極６６は、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕に配置されている。参照電極６９は、基板本体４０ａ上において、対極６６と対向する位置に配置されている。対極６６の電極リード７２と参照電極６９の電極リード７３とは、それぞれ、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕から他側部〔図４（Ｃ）の左側〕へ向けて延びている。対極６６及び参照電極６９の各電極リード７２，７３は、基板本体４０ａの他側部〔図４（Ｃ）の左側〕において互いに並列するように配置されている。電極リード７２，７３は、上基板３０と下基板４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している〔図３及び図４（Ａ）参照〕。なお、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａは、当該基板本体を透過させるようにして光を照射する場合には、透過性を有する材料から構成された基板本体であることが望ましい。この場合、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａのうち、光を照射する側の基板本体が、透過性を有する材料から構成されていればよい。
【００２４】
つぎに、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９について、詳細に説明する。
図５は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。作用電極６０は、ほぼ四角形状に形成されている。作用電極６０は、図５に示されるように、基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体６１と、作用電極本体６１上に固定化された捕捉物質８１とから構成されている。作用電極本体６１には、電極リード７１が接続されている。
【００２５】
後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおいては、作用電極本体６１は、励起光が照射されることにより被検物質から生じた電子を受容する半導体からなる。この半導体は、導電体及び電子受容体として機能する。半導体は、光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、半導体は、後述の標識物質の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。かかる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。上記した半導体のなかでは、酸化物半導体が好ましい。酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）が好ましい。作用電極の厚さは、通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜２００ｎｍ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
【００２６】
本発明においては、後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極本体６１は、半導体層と導電層とから構成されていてもよい。この場合、作用電極本体６１の電極リード７１は、導電層に接続される。
半導体層を構成する半導体は、上記した半導体と同様である。この場合の半導体層の厚さは、好ましくは０．１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
導電層は、導電性材料からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等の炭素系材料等が挙げられる。導電層の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１００ｎｍである。導電層の厚さは、導電性が確保でき、かつ電極から生じる光電流（バックグランド電流）が最小となる膜厚が望ましい。なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等が挙げられる。導電層は、例えば、当該導電層を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。
【００２７】
一方、後述の酸化還元電流・電気化学発光検出方法に用いる検出チップにおいては、作用電極本体６１は、導電性材料からなる。
導電性材料は、光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極本体６１の導電層に用いられる導電性材料と同様である。
導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。
この場合、作用電極本体６１の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００２８】
作用電極本体６１の表面には、捕捉物質８１が固定化されている〔図５参照〕。捕捉物質８１は、被検物質を捕捉する物質である。これにより、被検物質を作用電極本体６１の近傍に存在させることができる。捕捉物質８１は、被検物質の種類に応じて、適宜選択することができる。捕捉物質８１としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
【００２９】
対極６６は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。対極６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。導電性材料からなる薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００３０】
参照電極６９は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。参照電極６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。導電性材料からなる薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。本実施の形態では、参照電極６９を設けているが、本発明においては、参照電極６９を設けなくてもよい。対極６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６６が参照電極６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６０に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６９を設けることが好ましい。
【００３１】
つぎに、間隔保持部材５０について、説明する。間隔保持部材５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。間隔保持部材５０は、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９を取り囲むように配置されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。上基板３０と下基板４０との間には間隔保持部材５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極（作用電極６０、対極６６及び参照電極６９）の間には試料や電解液を収容するための空間２０ａが形成されている〔図４（Ａ）、図５及び図６参照〕。間隔保持部材５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム等のプラスチック製両面テープ等を用いることもできる。
【００３２】
本発明においては、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極６０、対極６６及び参照電極６９は、同一の基板本体上に形成されていてもよい。本発明においては、対極６６及び参照電極６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。この場合、対極６６及び参照電極６９のうちの少なくともいずれかが間隔保持部材５０の部材本体に設けられていてもよい。そして、上基板３０及び下基板４０のいずれかに、間隔保持部材５０の部材本体に設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００３３】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、被検物質を電解液中で電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が作用電極本体上に固定された作用電極に接触させ、捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、当該被検物質に結合する結合物質に、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる工程、及び
（３） 工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程
を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質と、結合物質に修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる点に１つの大きな特徴がある。
【００３５】
本発明の方法では、標識物質として、光化学的又は電気化学的に活性な物質が用いられる。光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。一方、電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。したがって、本発明の方法は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出方法（図６及び図８参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出方法（図９参照）に大別することができる。
【００３６】
１．光電気化学検出方法
まず、光電気化学検出方法について説明する。光電気化学検出方法には、上述した図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いることができるが、これらに限定されるものではない。以下、図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いる場合を例としてあげて説明する。図６は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００３７】
光電気化学検出方法では、ユーザーは、被検物質Ｓを含む試料を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する〔図６（Ａ）試料供給工程を参照〕。これにより、試料中の被検物質が検出チップ２０を構成する上基板３０の作用電極本体６１上の捕捉物質８１によって捕捉される〔図６（Ｂ）被検物質捕捉工程を参照〕。このとき、試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ）は、捕捉物質８１に捕捉されない。
捕捉物質８１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質８１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質８１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００３８】
捕捉物質８１による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質８１が核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質８１が核酸に対する抗体、タンパク質に対する抗体又はペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうのに適した溶液中で行なうことができる。被検物質がリガンドであり、捕捉物質８１がリガンドに対するレセプターである場合、及び、被検物質がレセプターであり、捕捉物質８１がレセプターに対するリガンドである場合には、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプターとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
【００３９】
つぎに、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質９０を注入して、標識結合物質９０を、作用電極本体６１上の捕捉物質８１により捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図６（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識結合物質９０とを含む複合体が形成される。
【００４０】
標識結合物質９０は、被検物質Ｓに結合する結合物質９１と、修飾物質９２と、標識物質９３とから構成されている。標識結合物質９０では、標識物質９３が修飾物質９２を介して結合物質９１に固定化されている。
【００４１】
結合物質９１は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質８１とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。結合物質９１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、結合物質９１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、結合物質９１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００４２】
修飾物質９２は、結合物質９１と標識物質９３との間に介在している。修飾物質９２は、電解液と作用電極本体６１とに対する相互作用を生じる物質である。
【００４３】
修飾物質９２は、後述の検出工程に用いられる電解液及び作用電極の表面の極性に応じて、親水性を示す修飾物質及び疎水性を示す修飾物質のなかから選択することが好ましい。
本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、電解液が、非プロトン性溶媒を含有し、かつ作用電極の表面及び修飾物質が親水性を示すか、あるいは電解液が、プロトン性溶媒を含有し、かつ作用電極の表面及び修飾物質が疎水性を示すことが好ましい。
【００４４】
親水性を示す修飾物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；親水性高分子化合物であるポリエチレングリコール；親水性アミノ酸であるアスパラギン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、チロシン、システイン等から主に構成される親水性ポリペプチド等が挙げられる。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。親水性を示す作用電極としては、例えば、表面に親水性官能基を有する電極等が挙げられる。親水性官能基としては、例えば、水酸基を含む官能基（例えば、シラノール基等）、アミノ基、チオール基等が挙げられる。かかる親水性を示す作用電極は、例えば、作用電極本体を、アミノ基を付与するアミノプロピルトリエトキシシラン、チオール基を付与するメルカプトプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤で処理を施すこと等により得ることができる。また、本発明においては、表面に親水性官能基を有する電極に、ポリエチレングリコール、核酸等をさらに結合させて親水性処理を施してもよい。
【００４５】
一方、疎水性を示す修飾物質としては、例えば、疎水性アミノ酸であるグリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等から主に構成される疎水性ペプチド；疎水性を示す炭化水素から主に構成される高分子化合物（例えば、スチレンオリゴマー、アクリルオリゴマー等）が挙げられる。プロトン性溶媒としては、例えば、水；水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等が挙げられる。疎水性を示す作用電極としては、例えば、表面に疎水性官能基を有する電極等が挙げられる。かかる疎水性を示す作用電極は、例えば、シラノール基が導入された金属酸化物からなる作用電極本体に対して、当該作用電極本体の表面にメチル基やフェニル基を導入しうる化合物、例えば、メチルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン等で処理すること等により得ることができる。
【００４６】
修飾物質９２の長さは、作用電極上での複合体の形成反応、例えば、捕捉した被検物質への結合物質の結合反応を阻害しない範囲で適宜選択することができる。修飾物質９２の長さは、通常、１００ｎｍ以下が好ましい。なお、修飾物質９２の長さの下限値は、修飾物質９２の種類などにより異なるので、修飾物質９２の種類などに応じて適宜設定することが望ましい。
【００４７】
標識物質９３は、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質９３として、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ−８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報等を参照することができる。
【００４８】
修飾物質９２と結合物質９１との結合様式としては、共有結合、非共有結合等が挙げられる。
【００４９】
修飾物質９２を結合物質９１に共有結合により結合させる方法は、特に限定されるものではない。
【００５０】
結合物質９１において、修飾物質９２を共有結合させる部位は、特に限定されないが、結合物質９１と修飾物質９２との結合等の操作が簡便であることから、アミノ基及びスルフヒドリル基が好ましい。
【００５１】
アミノ基へ結合できる反応基としては、例えば、サクシンイミド基（ＮＨＳ）、イソチオシアノ基（ＩＴＣ）、クロロスルホニル基、クロロアシル基、オキシエチレン基、クロロアルキル基、アルデヒド基、カルボキシル基等が挙げられる。これらのなかでは、アミノ基を介して目的とする修飾物質９２を共有結合により結合させる場合には、水系での反応が必須であり、反応溶液のｐＨが中性〜弱アルカリ性領域にあること、氷冷下から３７℃程度の反応温度で短時間に反応が進むこと等のように反応化合物を使用できる条件が限られていることから、好ましくはＮＨＳ及びＩＴＣである。したがって、修飾物質９２として、ＮＨＳ及び／又はＩＴＣを有する修飾物質を用いることができる。
【００５２】
スルフヒドリル基に結合させることができる反応基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基等があげられる。スルホヒドリル基は、通常、ポリペプチド中ではジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成している。そのため、スルフヒドリル基を、修飾物質９２を結合させる部位として用いる場合、ポリペプチド中のジスルフィド構造を還元し、スルフヒドリル基として用いることになる。ジスルフィド結合の還元には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）等を用いることができる。したがって、修飾物質９２が、アミノ基及びスルフヒドリル基に対する反応性の高い官能基（例えば、サクシンイミド基、マレイミド基等）を有している場合には、結合物質９１と修飾物質９２とを混合するだけで、結合物質９１のアミノ基及びスルフヒドリル基に修飾物質９２を直接結合させることができる。かかる修飾物質９２としては、例えば、サクシンイミドエステル修飾したＤＮＡ等が挙げられる。
【００５３】
修飾物質９２が、アミノ基、スルフヒドリル基、アルデヒド基、カルボキシル基等を有している場合は、例えば、化学クロスリンカーを介して結合物質９１と修飾物質９２とを結合させること；結合物質９１がスルフヒドリル基を有する場合、結合物質９１と修飾物質９２との間にジチオール結合を形成させること；一般的な化学反応を行なうこと等により、結合物質９１と修飾物質９２とを容易に結合させることができる。
【００５４】
クロスリンカーは、一般的に直鎖状の構造を有しており、両末端にアミノ基やチオール基と反応するサクシンイミド基、マレイミド基等を有するスペーサーからなる。かかるクロスリンカーを用いることにより、結合物質９１と修飾物質９２とを連結させることが可能である。
【００５５】
例えば、修飾物質９２がチオール基を有する場合、この修飾物質９２を結合物質９１のアミノ基に結合させる際に、一方の末端にサクシンイミド基を有し、かつ他方の末端にマレイミド基を有するクロスリンカーを用いることができる。この場合、まず、結合物質９１中のアミノ基とクロスリンカー中のサクシンイミド基とを反応させ、クロスリンカーのマレイミド基を結合物質９１に導入する。そして、マレイミド基と修飾物質９２中のチオール基とを反応させることにより結合させることができる。ここで、クロスリンカーのスペーサーの長さは、特に限定されるものではない。クロスリンカーの具体例としては、Ｎ−［α−マレイミドアセトアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、（マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ＮＨＳ−ＰＥＧｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄ等が挙げられる。クロスリンカーは、両末端の官能基がアミノ基との反応性を有するグルタルアルデヒド、アミン反応性のＮＨＳエステル基と光反応性のジアジリン基の２つの官能基を末端に有するクロスリンカー等であってもよい。
【００５６】
結合物質９１及び修飾物質９２の両方がチオール基を有している場合、結合物質９１のチオール基と修飾物質９２のチオール基とを反応させることにより、ジチオール結合を形成することによっても結合可能である。修飾物質９２がカルボキシル基を有し、かつ結合物質９１がアミノ基を有する場合、カルボキシル基をＮＨＳで活性化して、結合物質９１のアミノ基と結合させることができる。修飾物質９２がアルデヒド基を有し、かつ結合物質９１がアミノ基を有する場合、修飾物質９２のアルデヒド基と結合物質９１のアミノ基との間でシッフ塩基を形成させた後、還元して安定な結合をつくることができる。
【００５７】
修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により結合させる方法は、特に限定されるものではない。
【００５８】
修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により結合させる方法としては、修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により直接結合させる方法、結合物質９１に共有結合により結合させた物質を介して修飾物質９２を非共有結合により結合させる方法等が考えられる。
【００５９】
修飾物質９２を結合物質９１に非共有結合により結合させる方法としては、例えば、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を利用する方法等が挙げられる。結合物質９１に共有結合により結合させた物質を介して修飾物質９２を非共有結合により結合させる方法としては、例えば、まず、末端にアミノ基等を有するＤＮＡを結合物質９１に共有結合させ、つぎに、上記したＤＮＡに、修飾物質９２を結合させた相補的なＤＮＡをハイブリダイゼーションにより非共有結合的に結合させる方法等が挙げられる。
【００６０】
修飾物質９２への標識物質９３の結合方法についても、修飾物質９２を結合物質９１に結合させるのと同様の方法により行なうことができる。
【００６１】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図６（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００６２】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２，７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、参照電極６９を基準として任意の電位が作用電極本体６１に印加される。電極に印加される電位は、被検物質に対する励起光が照射されていない場合の電流値（定常電流、暗電流）が小さく、被検物質から生じる光電流が最大となる電位が好ましい。電位は、対極６６に印加してもよく、作用電極本体６１に印加してもよい。
【００６３】
その後、検出装置１の光源１３により、作用電極６０上の標識物質９３に励起光が照射される。これにより、標識物質９３が励起し、電子を発生する。そして、発生した電子は、作用電極６０に移動する。その結果、作用電極６０と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６０と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質９３の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質Ｓを定量することができる。なお、励起光は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて得られる特定波長領域の光のみであってもよい。
【００６４】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された電流値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００６５】
電解液として、酸化された状態の標識物質９３に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性溶媒又はプロトン性極性溶媒と、を含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。電解液は、ゲル状であってもよく、固体であってもよい。
【００６６】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。
【００６７】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００６８】
標識物質９３への光の照射には、標識物質９３を光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質９３の種類等に応じて、適宜選択することができる。光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて得られる特定波長領域の光のみを標識物質９３に照射してもよい。
【００６９】
標識物質９３に由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコーダ、計算機等を備える測定装置を用いることができる。
かかる検出工程では、光電流を定量することにより、被検物質の量を調べることができる。
【００７０】
以上のように、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓの検出時には、結合物質９１と標識物質９３との間に修飾物質９２が介在した状態となっている〔図６（Ｄ）を参照〕。これに対して、従来の被検物質の電気化学的検出方法では、例えば、図７（Ａ）に示されるように、被検物質Ｓの標識には、結合物質としての抗体１０２が標識物質１０３により直接標識された標識抗体１０１が用いられている。そして、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識抗体１０１とを含む複合体を形成させ、電極上に形成された複合体中の標識物質１０３から生じる電流（光電流）に基づいて被検物質Ｓが検出される。そのため、図７に示される従来の方法では、被検物質Ｓの検出の際に形成される複合体の嵩高さが、高感度化を図る上で大きな制約となり、検出される光電流が小さくなる傾向にある。
【００７１】
ところが、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、作用電極６０上に形成される複合体は、図７に示される従来の方法での被検物質Ｓの標識の際に形成される複合体と比べ、より嵩高くなっているにもかかわらず、予想外にも、図７に示される従来の方法よりも、高い検出感度で被検物質を検出することができる。
【００７２】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００７３】
本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質１９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００７４】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質が予め結合されている標識結合物質を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、図８に示されるように、標識工程中において、標識結合物質が形成されるように操作を行なってもよい。図８は、本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程は、前述した図６に示される方法の（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程と同様である。一方、図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ｃ）標識工程において、まず、被検物質Ｓに結合体〔第１結合体９０ａ及び第２結合体９０ｂ〕を付加する〔図８（Ｃ−１）結合体付加工程を参照〕。この（Ｃ−１）結合体付加工程では、まず、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９１ａと、第２結合物質９１ｂとからなる第１結合体９０ａを、作用電極本体６１上の捕捉物質により捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図８（Ｃ−１−１）第１結合体付加工程を参照〕。つぎに、第１結合体９０ａに含まれる第２結合物質９１ｂに結合する第２結合体９０ｂを、第１結合体９０ａに結合させる〔図８（Ｃ−１−２）第２結合体付加工程を参照〕。その後、第２結合物質９１ｂに修飾物質９２を介して標識物質９３が固定された標識体９０ｃを、第２結合体９０ｂに結合させる〔図８（Ｃ−２）標識体付加工程を参照〕。なお、図８に示される方法では、第１結合体９０ａ及び標識体９０ｃは、同じ結合物質（第２結合物質９１ｂ）により、第２結合体９０ｂに結合するが、第１結合体９０ａ中において、第２結合体９０ｂと結合する結合物質と、標識体９０ｃ中において、第２結合体９０ｂと結合する結合物質とは、互いに異なる物質であってもよい。
【００７５】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出方法
つぎに、酸化還元電流・電気化学発光検出方法について説明する。図９は、本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００７６】
かかる酸化還元電流・電気化学発光検出方法は、標識工程〔図９（Ｃ）参照〕において、標識物質１９３として、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質を用いる点及び検出工程〔図９（Ｄ）参照〕において、電圧を作用電極６０に印加して標識物質１９３から生じた光を検出する点が光電気化学検出方法と大きく異なっている。したがって、試料供給工程〔図９（Ａ）参照〕及び被検物質捕捉工程〔図９（Ｂ）参照〕は、光電気化学検出方法と同様である。なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置１は、光源１３を備えず、標識物質から生じる光を検出するためのセンサをさらに備えている装置である。本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出チップ２０は、作用電極本体６１が導電性材料からなるものである。
【００７７】
標識工程においては、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質１９０を注入して、標識結合物質１９０を作用電極本体６１上の捕捉物質８１により捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図９（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識結合物質１９０とを含む複合体が形成される。
【００７８】
標識結合物質１９０は、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９１と、修飾物質９２と、標識物質１９３とから構成されている。標識結合物質１９０では、第１結合物質９１と、標識物質１９３とが修飾物質９２を介して連結されている。
【００７９】
標識物質１９３は、電圧を印加することにより発光する標識物質である。
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノール、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノール、クロロフェノールのようなフェノール類若しくはナフトール類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質１９３として、電圧を印加することにより発光する標識物質の代わりに、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質を用いてもよい。
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
【００８０】
なお、第１結合物質９１及び修飾物質９２は、光電気化学検出方法における第１結合物質９１及び修飾物質９２と同様である。
【００８１】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図９（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００８２】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２，７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、作用電極６０に電圧が印加される。これにより、標識物質１９３が励起され、光が生じる。標識物質１９３に基づく光の測定には、フォトンカウンタ等が用いられる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバーの先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバー電極を用いて光を間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【００８３】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された光量の値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された光量の値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００８４】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法においても、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００８５】
本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質１９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質１９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００８６】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質１９３が予め結合されている標識結合物質１９０を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、標識工程中において、作用電極本体６１上の捕捉物質８１と、被検物質Ｓと、標識結合物質１９０とを含む複合体が形成されるように操作を行なってもよい。
【００８７】
図９（Ｄ）では、光を測定する場合を例として挙げて示しているが、標識物質１９３が電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質である場合には、標識物質１９３が励起され、電子が発生する。そして、発生した電子は、作用電極６０に移動する。その結果、作用電極６０と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６０と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質を定量することができる。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８９】
（製造例１）
シランカップリング剤である３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ａを得た。
【００９０】
（製造例２）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。この薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【００９１】
つぎに、作用電極本体の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の本体表面にチオール基を付与した。
【００９２】
また、捕捉物質である抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〔ダコ社製〕を、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）固定ゲル〔ピアース製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＣＥＰ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｌ〕と接触させて還元し、抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体を作製した。得られた抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにトリス緩衝溶液〔ｐＨ７．２、以下、「ＴＢＳ」という〕に添加し、抗体溶液を得た。
【００９３】
つぎに、得られた抗体溶液を作用電極本体上に滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションし、抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体と作用電極本体上のチオール基とを反応させジチオール結合を形成した。これにより、抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体を作用電極本体上に固定した。つぎに、作用電極本体上に、１ｍＭトリエチレングリコール モノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル〔シグマ社製〕を滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションして作用電極本体のブロッキングを行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【００９４】
（製造例３）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性溶媒を得た。この非プロトン性溶媒に、電解質塩としてテトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、電解液を得た。
【００９５】
（製造例４）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜（導電層）からなる対極を形成し、対極基板を得た。この対極には電流計と接続するための対極リードを接続した。これにより、対極基板を得た。
【００９６】
（実施例１）
抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を、その濃度が７．３μＭとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に添加した。つぎに、得られた混合物に、クロスリンカー〔（株）同仁化学研究所製、Ｎ−(４−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド（ＧＭＢＳ）〕のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液〔クロスリンカーの濃度：２５ｍＭ〕を、クロスリンカーの濃度が２．５ｍＭになるように添加した。得られた混合物を室温で３０分間インキュベーションし、抗マウスＩｇＧ抗体とＧＭＢＳとを反応させた。得られた産物を脱塩カラム〔ピアース社製、商品名：Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ〕に供して未反応のＧＭＢＳを除去し、クロスリンカー結合抗体を得た。
【００９７】
つぎに、得られたクロスリンカー結合抗体と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡとを、スクシンイミド基導入抗体／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡ（モル比）が１／１４となるように混合した。得られた混合物を室温で４時間インキュベーションして、クロスリンカー結合抗体と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡとを反応させた。なお、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡは、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製5'-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3'（配列番号：１）〕の５’末端がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０で標識され、かつ３’末端がチオール基修飾されたＤＮＡである。
【００９８】
得られた産物を、限外ろ過カラム〔アミコン社製、商品名：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ １００Ｋ〕に４回通して未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識チオール化ＤＮＡを完全に除去し、標識結合物質を得た。得られた標識結合物質を、その濃度が１ｍｇ/ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、標識結合物質含有溶液を得た。
【００９９】
得られた標識結合物質について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の吸収波長７４９ｎｍにおける吸収を測定することにより、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数を調べた。その結果、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数は、９個であることが確認された。
【０１００】
（比較例１）
抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を、その濃度が１４．６μＭとなるように、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に添加した。つぎに、得られた混合物に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体〔商品名：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（インビトロジェン社製）〕のＤＭＳＯ溶液〔ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体の濃度：１５ｍＭ〕を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体の濃度が１．５ｍＭになるように添加した。得られた混合物を室温で１時間インキュベーションし、抗マウスＩｇＧ抗体とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体とを反応させた。得られた産物を脱塩カラム〔ピアース社製、商品名：Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ〕に供して未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０を除去し、標識抗体を得た。得られた標識抗体を、その濃度が２ｍｇ/ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、標識抗体含有溶液を得た。
【０１０１】
得られた標識抗体について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の吸収波長７４９ｎｍにおける吸収を測定することにより、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数を調べた。その結果、抗体１分子あたりの標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）の数は、１０個であることが確認された。
【０１０２】
（試験例１）
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、１質量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．０５質量％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ−Ｔ）を入れた。つぎに、上記した空間内の液体の排出後、１００ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ（被験物質）含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた〔図６（Ｂ）被検物質捕捉工程を参照〕。
【０１０３】
（１−２）標識
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、実施例１で得られた１ｍｇ／ｍＬ標識結合物質含有溶液を、標識結合物質の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションして、作用電極上の被検物質を標識した〔図６（Ｃ）参照〕（実験番号１）。
【０１０４】
一方、被検物質が存在しない場合の対照実験を以下のように行なった。まず、被検物質を捕捉させていない作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、実施例１で得られた１ｍｇ／ｍＬ標識結合物質含有溶液を、標識結合物質の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした（実験番号２）。
【０１０５】
（２）対照実験
（１−１）と同様の操作を行ない、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた。
【０１０６】
その後、（１−２）において、実施例１で得られた標識結合物質含有溶液の代わりに、比較例１で得られた標識抗体含有溶液を用いたことを除き、（１−２）と同様の操作を行ない、作用電極上の被検物質を標識した（実験番号３）。
【０１０７】
一方、被検物質が存在しない場合の対照実験を以下のように行なった。被検物質を捕捉させていない作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、比較例１で得られた２ｍｇ／ｍＬ標識抗体含有溶液を、標識結合物質の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした（実験番号４）。
【０１０８】
（３）光電流の測定
実験番号１〜４の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。つぎに、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。その後、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１０９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した〔図６（Ｄ）検出工程参照〕。
【０１１０】
試験例１において、実施例１で得られた標識結合物質を用いて被検物質を検出する場合（実験番号１）の検出工程を示す概略説明図を図１０（Ａ）に、試験例１において、比較例１で得られた標識抗体を用いて被検物質を検出する場合（実験番号３）の検出工程を示す概略説明図を図１０（Ｂ）に示す。また、試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１１に示す。
【０１１１】
実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法においては、実施例１で得られた標識結合物質〔図１０（Ａ）において、１１０を参照〕が用いられている。そのため、図１０（Ａ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体１分子あたり９個の標識物質から光電流が生じる。これに対して、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法においては、比較例１で得られた標識抗体〔図１０（Ｂ）中、１２１参照〕が用いられている。そのため、図１０（Ｂ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体１分子あたり１０個の標識物質から光電流が生じる。したがって、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と略同じであるか、若干小さいことが予想されうる。
【０１１２】
しかしながら、図１１に示された結果から、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は２０ｎＡであるのに対して、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は４．５ｎＡであることがわかる。これらの結果から、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、予想外にも、実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と比べ、はるかに大きいことがわかる。
【０１１３】
実施例１で得られた標識結合物質及び比較例１で得られた標識抗体では、結合物質として同一の抗体が用いられている。そのため、被検物質への実施例１で得られた標識結合物質及び比較例１で得られた標識抗体それぞれの結合効率は、略同じであると考えられる。また、被検物質がない場合では、いずれも、光電流は約０ｎＡである（図１１中、実験番号２及び実験番号４を参照）。そのため、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流との違いは、ノイズの影響ではないと考えられる。したがって、実験番号１の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と実験番号３の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流との違いは、標識物質と結合物質との間にＤＮＡが介在しているかどうかによると考えられる。
【０１１４】
（実施例２）
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔを入れた。上記した空間内の液体の排出後、１００ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ（被検物質）含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ３０μＬを、上記した空間内に添加した〔図１２（Ａ）を参照〕。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた〔図１２（Ｂ）を参照〕。
【０１１５】
（１−２）標識
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、２．１ｍｇ／ｍＬビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔シグマ社製〕を含む溶液を、濃度が４μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔図１２（Ｂ）において、１３０ａを参照〕を、捕捉物質〔図１２（Ｂ）において、８１を参照〕に捕捉された被検物質〔図１２（Ｂ）において、Ｓを参照〕に結合させた。なお、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体〔図１２（Ｂ）において、１３１ａを参照〕をビオチン〔図１２（Ｂ）において、１３１ｂを参照〕で標識したものである。
【０１１６】
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕を含む溶液〔第２結合体の濃度：２ｍｇ／ｍＬ〕を、第２結合体の濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジン〔図１２（Ｃ）において、１３０ｂを参照〕を、作用電極上のビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体に結合させた。
【０１１７】
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、標識体であるビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを含有する溶液〔標識体の濃度：１００μＭ〕を、標識体の濃度が１μＭとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた（実験番号５）。第１結合体と第２結合体とからなる複合体〔図１２（Ｄ）において、１３１を参照〕は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質〔図１２（Ｄ）において、１３１を参照〕に、修飾物質であるＤＮＡ〔図１２（Ｄ）において、１３２を参照〕を介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０〔図１２（Ｄ）において、１３３参照〕が結合している。
【０１１８】
なお、ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡは、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製、5'-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3'（配列番号：１）〕の５’末端がビオチン修飾され、かつ３’末端がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０で標識されたＤＮＡである。
【０１１９】
一方、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった（実験番号６）。
【０１２０】
（２）対照実験
第１結合体、第２結合体及び標識体を用いる代わりに、標識物質が抗体に直接結合した標識抗体〔比較例１で得られた標識抗体〕を用い、以下のように、対照実験を行なった。まず、（１−１）と同様の操作を行ない、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた〔図１３（Ｂ）を参照〕。
【０１２１】
作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、比較例１で得られた１ｍｇ／ｍＬ標識抗体含有溶液を、標識抗体の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションして、作用電極上の被検物質を標識した〔図１３（Ｂ）参照〕（実験番号７）。
【０１２２】
一方、被検物質が存在しない場合の対照実験を以下のように行なった。まず、被検物質を捕捉させていない作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、比較例１で得られた２ｍｇ／ｍＬ標識抗体含有溶液を、標識抗体の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した。得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした（実験番号８）。
【０１２３】
（３）光電流の測定
実験番号５〜８の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。つぎに、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。その後、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１２４】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０〔図１２（Ｄ）において、１３３参照〕が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１２５】
実施例２における実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図を図１４（Ａ）に、実施例２における実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法の検出工程を示す概略説明図を図１４（Ｂ）に示す。また、実施例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１５に示す。
【０１２６】
実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法においては、図１４（Ａ）に示されるように、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔図中、１３１ａを参照〕と、第２結合体であるストレプトアビジン〔図中、１３０ｂを参照〕と、標識体であるビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ〔図中、１３０ｃを参照〕とが用いられている。ここで、ストレプトアビジンの分子量は、５３ｋＤａ程度であり、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体のビオチンとストレプトアビジンが結合したときの立体障害を考慮すると、１分子のビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（分子量１５０ｋＤａ程度）に結合させることができるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数は、最大４分子程度であると考えられる。また、ストレプトアビジン中の４つのビオチン結合サイトのうちの３つに、ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを結合させることができる。そのため、図１４（Ａ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体１分子あたり９〜１２個の標識物質から光電流が生じる。これに対して、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法においては、標識抗体〔図１４（Ｂ）において、１４１を参照〕が用いられている。そのため、図１４（Ｂ）に示されるように、検出工程では、励起光の照射により、抗体〔図１４（Ｂ）において、１４２を参照〕１分子あたり１０個の標識物質〔ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、図１４（Ｂ）において、１４３を参照〕から光電流が生じる。したがって、ＤＮＡを考慮しなければ、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と同程度であることが予想されうる。
【０１２７】
しかしながら、図１５に示された結果から、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は１２ｎＡであるのに対して、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は４．５ｎＡであることがわかる。これらの結果から、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、予想外にも、実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と比べ、はるかに大きいことがわかる。したがって、実験番号５の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と実験番号７の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流との違いは、標識物質と結合物質との間にＤＮＡが介在しているかどうかによると考えられる。
【０１２８】
ＤＮＡは、親水性を示す。したがって、ＤＮＡは、非プロトン性溶媒を含有する電解液及び親水性のトリエチレングリコール（ＴＥＧ）鎖が導入された作用電極本体に対し、相互作用（親水性相互作用）を生じると考えられる。一方、電解液がプロトン性溶媒を含有し、かつ作用電極本体に疎水性の官能基が導入されている場合には、ＤＮＡの代わりに疎水性を有する物質を用いることにより、相互作用（疎水性相互作用）が生じると考えられる。
【０１２９】
以上の結果から、被検物質を標識するために、電解液と捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位とに対して相互作用を生じる修飾物質を介して標識物質が結合物質に少なくとも固定された標識結合物質を用いることにより、高感度で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１３０】
（製造例５）
ビオチン化ＤＮＡ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを、それぞれの濃度が１μＭ及び１０μＭとなるように１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液中に添加した。得られた混合物を８０℃で１分間加熱した後、当該混合物の温度を毎分１℃下降させながら４℃まで冷却した。これにより、ビオチン化ＤＮＡとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、ビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体（図１６中、１７０参照）を作製した。なお、ビオチン化ＤＮＡは、８４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製、5'-biotin-AAACCACGGCCCTAGGGACAACGACCACGGCCCTAGGGACAACGACCACGGCCCTAGGGACAACGACCACGGCCCTAGGGACAACGA-3'（配列番号：２）、図１６中、１７２ａ参照〕の５’末端がビオチン（図１６中、１７２ｂ参照）で修飾されたＤＮＡ（リン酸骨格の５’末端に(ＣＨ2)3リンカーを介してビオチンが結合しているＤＮＡ）である（図１６中、１７２参照）。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡは、２０ヌクレオチド長のＤＮＡ〔インビトロジェン社製、5'-CGTTGTCCCTAGGGCCGTGGGTATGCGCGCTGCTATGCCG-3'（配列番号：３）、図１６中、１７１ｂ参照〕の５’末端及び３’末端がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（図１６中、１７１ａ参照）で標識されたＤＮＡである（図１６中、１７１参照）。
【０１３１】
（実施例３）
多価標識ＤＮＡによるマウスＩｇＧの検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。つぎに、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、被検物質である１０ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ ３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、作用電極基板の作用電極本体（図１７中、６１参照）上に固定された捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体、図１７中、８１参照〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ、図１７中、Ｓ参照〕を捕捉させた〔図１７（Ａ）参照〕。
【０１３２】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〔ダコ社製〕を、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５１参照）を、捕捉物質（図１７中、８１参照）に捕捉された被検物質（図１７中、Ｓ参照）に結合させた〔図１７（Ｂ）参照〕。なお、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体は、抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５２参照）をビオチン（図１７中、１５３参照）で標識したものである。
【０１３３】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕を、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジン（図１７中、１６０参照）を、作用電極本体（図１７中、６１参照）上のビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５１参照）中のビオチン（図１７中、１５３）に結合させた〔図１７（Ｃ）参照〕。
【０１３４】
（１−３）色素標識
（１−２）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）３０μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極本体（図１７中、６１参照）上に、被検物質（図１７中、Ｓ参照）と第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体（図１７中、１５１参照）と第２結合体であるストレプトアビジン（図１７中、１６０参照）と標識体であるビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体（図１７中、１７０参照）とを含む複合体を形成させた〔図１７（Ｄ）参照〕。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１３５】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１３６】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した（実験番号９）。
【０１３７】
なお、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体の代わりに、実験番号５（ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ：配列番号１）で使用した複合体を用いて、上記と同様の操作を行なったものを対照実験とした（実験番号１０）。
【０１３８】
実施例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１８に示す。
【０１３９】
図１８に示された結果から、実験番号９の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は３．６ｎＡであるのに対して、実験番号１０の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は０．６８ｎＡであることがわかる。これらの結果から、実験番号９の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は、実験番号１０の被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流と比べて大きいことがわかる。
【０１４０】
以上の結果から、被検物質を標識するために、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、より高感度で被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１４１】
（実施例４）
多価標識ＤＮＡによるマウスＩｇＧの定量検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例２で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、被検物質である１０ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧ含有１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ ３０μＬを上記した空間内に添加した。その後、前記作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〕に、被検物質〔マウスＩｇＧ〕を捕捉させた。
【０１４２】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体〔ダコ社製〕を、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体を、捕捉物質に捕捉された被検物質に結合させた。なお、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体は、抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）2抗体をビオチンで標識したものである。
【０１４３】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕２ｍｇ／ｍＬを、濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジンを、作用電極上のビオチン標識抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗体に結合させた。
【０１４４】
（１−３）色素標識
（１−２）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）３０μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１４５】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１４６】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１４７】
なお、（１−１）において、被検物質として、１０ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧを用いる代わりに、１００ｐｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、１ｎｇ／ｍＬマウスＩｇＧを用いたことを除き、上記と同様の操作を行なって電流を測定した。また、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった。
【０１４８】
実施例４において、被検物質（マウスＩｇＧ）の濃度と光電流との関係を調べた結果を図１９に示す。
【０１４９】
図１９に示された結果から、被検物質の濃度が１００ｐｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬである場合に検出される光電流は、それぞれ、０．９５ｎＡ、２．８５ｎＡ及び１４．９ｎＡであることがわかる。また、被検物質が存在しない場合に検出される光電流は、０．４７ｎＡであることがわかる。したがって、これらの結果から、被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は被検物質の濃度に応じて増加していることがわかる。また、これらの結果から、被検物質の濃度が１００ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合、被検物質を定量的に検出することができることがわかる。
【０１５０】
以上の結果から、被検物質を標識するために、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、高感度で定量的に被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１５１】
（製造例６）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。上記した薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【０１５２】
つぎに、作用電極本体の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の本体表面にチオール基を付与した。
【０１５３】
また、捕捉物質である抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕を、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）固定ゲル〔ピアース社製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＣＥＰ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｌ〕と接触させて還元し、重鎖還元型抗ヒトインターロイキン−６抗体を作製した。得られた抗ヒトインターロイキン−６抗体を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳに添加し、抗体溶液を得た。
【０１５４】
つぎに、得られた抗体溶液を作用電極本体上に滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションし、抗ヒトインターロイキン−６抗体と作用電極本体上のチオール基とを反応させジチオール結合を形成した。これにより、抗ヒトインターロイキン−６抗体を作用電極本体上に固定した。つぎに、作用電極本体上に、１ｍＭトリエチレングリコール モノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル〔シグマ社製〕を滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションして作用電極本体のブロッキングを行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【０１５５】
（実施例５）
多価標識ＤＮＡによるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の定量検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例６で得られた作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。上記した空間内の液体の排出後、被検物質であるヒトインターロイキン−６を２５質量％ウシ血清〔サーモサイエンティフィック社製〕と０．７５質量％ＢＳＡとを含むＴＢＳ−Ｔで希釈して得られた被検物質溶液（被検物質の濃度：５００ｐｇ／ｍＬ）３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗ヒトインターロイキン−６抗体〕に、被検物質〔インターロイキン−６〕を捕捉させた。
【０１５６】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕をその濃度が１μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体を、捕捉物質に捕捉された被検物質に結合させた。なお、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体は、抗ヒトインターロイキン−６抗体をビオチンで標識したものである。
【０１５７】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕２ｍｇ／ｍＬを、濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジンを、作用電極上のビオチン標識ヒトインターロイキン−６抗体に結合させた。
【０１５８】
（１−３）色素標識
（１−２）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）１００μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１５９】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１６０】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１６１】
なお、（１−１）において、被検物質の濃度が５００ｐｇ／ｍＬである被検物質溶液を用いる代わりに、被検物質の濃度が７．８ｐｇ／ｍＬ、１５．６ｐｇ／ｍＬ、３１．２ｐｇ／ｍＬ、６２．５ｐｇ／ｍＬ、１２５ｐｇ／ｍＬ又は２５０ｐｇ／ｍＬである被検物質溶液を用いたことを除き、上記と同様の操作を行なって電流を測定した。また、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった。
【０１６２】
実施例５において、被検物質（ヒトＩＬ−６）の濃度と光電流との関係を調べた結果を図２０に示す。
【０１６３】
図２０に示された結果から被検物質の濃度が７．８ｐｇ／ｍＬ、１５．６ｐｇ／ｍＬ、３１．２ｐｇ／ｍＬ、６２．５ｐｇ／ｍＬ、１２５ｐｇ／ｍＬ、２５０ｐｇ／ｍＬ及び５００ｐｇ／ｍＬである場合に検出される光電流は、それぞれ、０．０８９ｎＡ、０．０９２ｎＡ、０．０９５ｎＡ、０．１１ｎＡ、０．１４ｎＡ、０．２１ｎＡ及び０．３ｎＡであることがわかる。また、被検物質が存在しない場合に検出される光電流は、０．０８３ｎＡであることがわかる。したがって、これらの結果から、被検物質の電気化学的検出方法で検出される光電流は被検物質の濃度に応じて増加しており、被検物質を定量的に検出することができることがわかる。
【０１６４】
以上の結果から、マウスＩｇＧ以外の被検物質に対しても、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、高感度で定量的に被検物質を検出することができることが示唆される。
【０１６５】
（製造例７）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。上記した薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【０１６６】
つぎに、作用電極本体の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の本体表面にチオール基を付与した。
【０１６７】
また、捕捉物質である抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕、又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体〔バイオレジェンド社製〕を、還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）固定ゲル〔ピアース社製、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＴＣＥＰ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｇｅｌ〕と接触させて還元し、重鎖還元型抗ヒトインターロイキン−６抗体、又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体を作製した。得られた抗ヒトインターロイキン−６抗体又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体を、その濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳに添加し、抗ヒトインターロイキン−６抗体溶液又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体溶液を得た。
【０１６８】
作用電極上に、２つの開口部を有するシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を隔壁となるように配置した。その後、作用電極本体とシリコーンゴムとに囲まれた空間の一方に抗ヒトインターロイキン−６抗体溶液を入れ、もう一方に抗ヒトインターフェロン−γ抗体を入れた。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションし、抗ヒトインターロイキン−６抗体又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体と、作用電極本体上のチオール基とを反応させジチオール結合を形成した。これにより、抗ヒトインターロイキン−６抗体及び抗ヒトインターフェロン−γ抗体を作用電極本体上に固定した。作用電極本体からシリコーンゴムを外した、その後、前述した２つの開口部に相当する範囲を含む大きさの開口部を１つ有するシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を、隔壁となるように作用電極上に配置した。つぎに、作用電極本体上に、１ｍＭトリエチレングリコール モノ−１１−メルカプトウンデシルエーテル〔シグマ社製〕を滴下した。そして、作用電極本体を４℃で一晩インキュベーションして作用電極本体のブロッキングを行なった。これにより、作用電極基板を得た。
【０１６９】
（実施例６）
多価標識ＤＮＡによるインターロイキン−６（ＩＬ−６）ならびにインターフェロン−γの同時検出
（１−１）被検物質の捕捉
製造例７で得られた作用電極基板の周囲に厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。つぎに、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、０．４質量％ブロックエース〔ＤＳファーマバイオメディカル社製〕を含むＴＢＳ−Ｔを入れた。上記した空間内の液体の排出後、被検物質としてのヒトインターロイキン−６〔バイオレジェンド社製〕単独、被検物質としてのヒトインターフェロン−γ〔バイオレジェンド社製〕単独、又は、被検物質としてのヒトインターロイキン−６とヒトインターフェロン−γとの混合物を、２５％質量ウシ血清〔サーモサイエンティフィック社製〕と０．７５質量％ＢＳＡとを含むＴＢＳ−Ｔで希釈して得られた検出対象物溶液（検出対象物の濃度：２５０ｐｇ／ｍＬ）３０μＬを、上記した空間内に添加した。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションし、捕捉物質〔抗ヒトインターロイキン−６抗体、抗ヒトインターフェロン−γ抗体〕に、被検物質〔インターロイキン−６、ヒトインターフェロン−γ〕を捕捉させた。
【０１７０】
（１−２）標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体〔バイオレジェンド社製〕と抗ヒトインターフェロン−γ抗体〔バイオレジェンド社製〕とを、それぞれの濃度が１μｇ／ｍＬとなるように１質量％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で１時間インキュベーションした。これにより、第１結合体であるビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体及びビオチン標識抗ヒトインターフェロン−γ抗体を、捕捉物質に捕捉された被検物質に結合させた。なお、ビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体及びビオチン標識抗ヒトインターフェロン−γ抗体は、抗ヒトインターロイキン−６抗体及び抗ヒトインターフェロン−γ抗体それぞれをビオチンで標識したものである。
【０１７１】
つぎに、作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、第２結合体であるストレプトアビジン〔ベクター社製〕２ｍｇ／ｍＬを、その濃度が４μｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳ−Ｔに添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、ストレプトアビジンを、作用電極上のビオチン標識抗ヒトインターロイキン−６抗体又は抗ヒトインターフェロン−γ抗体に結合させた。
【０１７２】
（１−３）色素標識
（１−１）を行なった後の作用電極基板をＴＢＳ−Ｔで洗浄した。つぎに、製造例５で得られたビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体を含有する溶液（複合体の濃度：９３μｇ／ｍＬ）１００μＬに当該溶液の１０倍容量のＴＢＳ−Ｔを添加した後、得られた混合物３０μＬを、上記した空間に入れた。その後、作用電極基板を２５℃で３０分間インキュベーションした。これにより、作用電極上に、検出対象物としての被検物質と第１結合体と第２結合体と標識体とを含む複合体を形成させた。第１結合体と第２結合体とからなる複合体は、実施例１で得られた標識結合物質中の結合物質に対応している。すなわち、作用電極上においては、被検物質に結合した結合物質に、修飾物質であるＤＮＡを介して、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が結合している。
【０１７３】
（２）光電流の測定
作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例３で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例４で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１７４】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から励起光を照射した。光照射により、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が励起され、電子を生じる。そして、生成した電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。抗インターロイキン−６抗体固定部及び抗インターフェロン−γ抗体固定部の両方において電流の測定を行なった。なお、被検物質を用いなかったことを除き、上記と同様に操作を行ない、被検物質が存在しない場合の対照実験を行なった。
【０１７５】
実施例６において、検出対象物の種類と光電流との関係を調べた結果を図２１に示す。
【０１７６】
図２１に示された結果から、被検物質がインターロイキン−６である場合に検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．２０ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．０８ｎＡであるのに対して、被検物質非存在下で検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．０６ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．０７ｎＡであることがわかる。また、被検物質がインターフェロン−γである場合に検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．０９ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．１４ｎＡであることがわかる。これらの結果から、同一電極上において、固定された捕捉物質である抗体に特異的な被検物質の検出が可能であることが示唆される。
【０１７７】
一方、被検物質がインターロイキン−６とインターフェロン−γとの混合物である場合に検出される光電流は、抗インターロイキン−６抗体固定部で０．１７ｎＡ及び抗インターフェロン−γ抗体固定部で０．１０ｎＡであることがわかる。これらの光電流は、被検物質非存在下での光電流よりも大きいが、被検物質がインターロイキン−６単独又はインターフェロン−γ単独である場合に検出される光電流よりも小さい。したがって、検出対象物が複数種類の被検物質の混合物である場合には、各被検物質の特異的検出は可能ではあるが、単独の被検物質を検出する場合と比べて、若干の検出感度低下が認められることがわかる。
【０１７８】
以上の結果から、被検物質を標識するために、修飾物質間の相互作用を介してより多くの標識物質が結合物質に固定された多価標識結合物質を用いることにより、同一電極上で多種類の被検物質を同時に検出することができることが示唆される。
【符号の説明】
【０１７９】
１ 検出装置
１１ チップ受入部
１２ ディスプレイ
１３ 光源
１４ 電流計
１５ 電源
１６ 変換部
１７ 制御部
２０ 検出チップ
２０ａ 空間
３０ 上基板
３０ａ 基板本体
３０ｂ 試料注入口
４０ 下基板
４０ａ 基板本体
５０ 間隔保持部材
６０ 作用電極
６１ 作用電極本体
６６ 対極
６９ 参照電極
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
８１ 捕捉物質
９０ 結合物質
９０ 標識結合物質
９０ａ 第１結合体
９０ｂ 第２結合体
９０ｃ 標識体
９１ 結合物質
９１ａ 第１結合物質
９１ｂ 第２結合物質
９２ 修飾物質
９３ 標識物質
９３ 標識体
１０１ 標識抗体
１０２ 抗体
１０３ 標識物質
１２１ 標識抗体
１３０ａ ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体
１３０ｂ ストレプトアビジン
１３０ｃ ビオチン化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１３１ａ 抗マウスＩｇＧ抗体
１３１ｂ ビオチン
１３２ ＤＮＡ
１３３ 標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）
１４１ 標識抗体
１４２ 抗体
１４３ 標識物質（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０）
１５１ ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体
１５２ ビオチン
１５３ 抗マウスＩｇＧ抗体
１６０ ストレプトアビジン
１７０ ビオチン化ＤＮＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ複合体
１７１ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１７１ａ ＤＮＡ
１７１ｂ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１７２ ビオチン化ＤＮＡ
１７２ａ ＤＮＡ
１７２ｂ ビオチン
１９０ 標識結合物質
１９０ 結合物質
１９３ 標識物質
Ｓ 被検物質
【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
配列番号：１は、実施例１及び実施例２において、修飾物質として用いられたＤＮＡの配列である。
配列番号：２は、ビオチン化ＤＮＡの配列である。
配列番号：３は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を電解液中で電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が作用電極本体上に固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、当該被検物質に結合する結合物質に修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程
を含み、
前記修飾物質は、電解液と、捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位と、に対して相互作用を生じる物質である、
被検物質の電気化学的検出方法。
【請求項２】
前記電解液が、非プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が親水性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾物質が、ＤＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記電解液が、プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が疎水性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（２）において、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、前記標識結合物質とを接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記工程（２）において、前記被検物質に結合する第１結合物質を含む結合体と、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、を接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体と、前記結合体に結合する第２結合物質に前記修飾物質を介して前記標識物質が結合した標識体と、を接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（２）の後、作用電極を洗浄し、被検物質に結合していない標識結合物質を除去する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記標識物質が、電気化学的又は光化学的に活性な物質である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記標識結合物質が、前記結合物質に、修飾物質を介して複数の標識物質が保持された多価標識結合物質である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（３）で得られた検出結果に基づいて、前記被検物質を定量する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検物質は複数種類である、請求項９又は１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
被検物質を電解液中で電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が作用電極本体上に固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、当該被検物質に結合する結合物質に修飾物質を介して標識物質が保持された標識結合物質と、を含む複合体を作用電極上に形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程
を含み、
前記修飾物質は、電解液と、捕捉物質が結合している部位以外の作用電極部位と、に対して相互作用を生じる物質である、
被検物質の電気化学的検出方法。
【請求項２】
前記電解液が、非プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が親水性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾物質が、ＤＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記電解液が、プロトン性溶媒を含有し、かつ前記作用電極の表面及び前記修飾物質が疎水性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（２）において、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、前記標識結合物質とを接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記工程（２）において、前記被検物質に結合する第１結合物質を含む結合体と、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、を接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体と、前記結合体に結合する第２結合物質に前記修飾物質を介して前記標識物質が結合した標識体と、を接触させることにより、前記複合体を作用電極上に形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（２）の後、作用電極を洗浄し、被検物質に結合していない標識結合物質を除去する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記標識物質が、電気化学的又は光化学的に活性な物質である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記標識結合物質が、前記結合物質に、修飾物質を介して複数の標識物質が保持された多価標識結合物質である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（３）で得られた検出結果に基づいて、前記被検物質を定量する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検物質は複数種類である、請求項９又は１０のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１２−２３３８７８（Ｐ２０１２−２３３８７８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７５９１４（Ｐ２０１２−７５９１４）
【出願日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
[ Back to top ]