試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬
【課題】ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬を提供する。
【解決手段】試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法、および細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物の免疫測定試薬。試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることにより、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制することができる。
【解決手段】試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法、および細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物の免疫測定試薬。試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることにより、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬、ならびに、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する方法、および、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液成分を免疫学的に測定する場合、全血から血球を除去した血清または血漿が試料として用いられるのが一般的である。しかし、血球を除去するためには遠心分離機等の専用の装置が必要であり、手間もかかるため、直接全血検体を測定する方法が提案されている（特許文献１参照）。全血を試料とする場合、溶血により検体に混入するヘモグロビン等の血球成分や血球の膜成分が、光学的な検出系に影響したり、免疫反応を阻害したり、測定対象物質を吸着することにより、測定に影響がでる問題がある。このような問題を回避するため、溶血をさせずに測定する全血を試料とする免疫測定方法が報告されている（特許文献２、３、４および５参照）。
【０００３】
細胞内蛋白質等の血球成分を測定する場合には、血球を溶解する必要があるため、上記の溶血をさせずに測定する方法を用いることができない。この場合には、フローサイトメトリーにより、対象の血球を分離してから、分離した細胞を溶解させて目的の血球成分を測定する方法がとられてきたが、フローサイトメトリーのための専用の装置が必要であり、手間がかかる。一方、細胞内蛋白質の簡便な測定法の例として、界面活性剤で全血中の血球を溶解させたものを測定試料とした、ＭｘＡタンパク質の免疫測定法が報告されている（非特許文献１参照）。この報告では特にヘモグロビン等の影響を抑制するための手段はとられていない。したがって全血等のヘモグロビンを含有する試料中の血球を溶解させて、簡便かつ高感度で、ヘモグロビン等の影響を抑制した測定方法については、未だ確立されているとは言えなかった。
【特許文献１】特開平１０−４８２１４号公報
【特許文献２】特開平６−２６５５５４号公報
【特許文献３】国際公開第９６／０４５５８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／７３２０３号パンフレット
【特許文献５】特開２００４−４５３９５号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（Journal of Interferon Research），（米国），１９９２年，第１２巻，第２号，ｐ．６７−７４
【非特許文献２】ペディアトリック・リサーチ（Pediatric Research），（米国）、１９９７年，第４１巻，第５号，ｐ．６４７−６５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることにより、ヘモグロビンの影響を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［２３］に関する。
［１］試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
［２］免疫測定方法が、サンドイッチ法または競合法である［１］に記載の方法。
［３］試料中の測定対象物と（ｉ）〜（iii）のいずれかとを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
（i）該測定対象物に結合する第１の抗体、および、該測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
［４］試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する方法。
【０００６】
［５］試料が、全血である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］全血が、血球を溶解させた全血である［５］に記載の方法。
［７］血球を溶解させた全血が、血球を界面活性剤により溶解させた全血である［６］に記載の方法。
［８］細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］動物細胞が、動物の株化細胞である［８］に記載の方法。
［１０］動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である［９］に記載の方法。
［１１］測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【０００７】
［１２］細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物と該測定対象物に結合する抗体との反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬。
［１３］細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物の免疫測定試薬。
［１４］さらに、（ｉ）〜（iii）のいずれかを含有する［１３］に記載の免疫測定試薬。
（ｉ）測定対象物に結合する第１の抗体、および、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体。
【０００８】
［１５］さらに、試料中の血球を溶解させるための試薬を含有する［１３］または［１４］に記載の免疫測定試薬。
［１６］血球を溶解させるための試薬が、界面活性剤である［１５］に記載の免疫測定試薬。
［１７］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である［１６］に記載の免疫測定試薬。
［１８］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系界面活性剤である［１７］に記載の免疫測定試薬。
［１９］ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである［１８］に記載の免疫測定試薬。
【０００９】
［２０］細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である［１２］〜［１９］のいずれかに記載の試薬。
［２１］動物細胞が、動物の株化細胞である［２０］に記載の試薬。
［２２］動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である［２１］に記載の試薬。
［２３］測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである［１２］〜［２２］のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（１）試料
本発明の免疫測定方法において試料として使用される試料としては、例えば、全血、全血から調製した赤血球を含む血球画分、溶血が疑われる血漿または血清、赤血球、任意の試料にヘモグロビンを添加した試料等、ヘモグロビンを含有する試料またはヘモグロビンの含有が疑われる試料があげられる。全血としては、被検者より採取した血液そのものでもよいが、採取した血液を処理したものでもよく、処理した血液が好ましい。当該処理としては、例えば抗凝固処理、溶血処理等があげられ、これらの処理を組み合わせてもよい。測定対象物が血球の細胞内成分である場合は、全血として、溶血処理した血液が好ましく、抗凝固処理と溶血処理の両処理を行った血液が特に好ましい。抗凝固処理としては、例えば採取した血液にＥＤＴＡ、ヘパリン等を添加する処理等があげられる。溶血処理としては、例えば界面活性剤またはサポニン類溶液の添加、低張液との混合、凍結融解、超音波処理等があげられる。界面活性剤としては、測定系に影響せず、細胞を溶解できるものであれば、どのような界面活性剤でも用いることができるが、本発明においては非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン界面活性剤としては、例えば後述の非イオン性界面活性剤があげられる。血球画分や赤血球を試料とする場合も上記に記載したような、抗凝固処理、溶血処理等を行ったものが好ましい。
【００１２】
（２）測定対象物
本発明の免疫測定方法で測定される測定対象物は、（１）であげた試料に含まれる物質であれば特に制限はなく、血球の成分、血漿中に含まれる例えば、抗体、インターロイキン、ホルモン等の蛋白質や生理活性物質、外部から投与された薬物等があげられる。具体的な測定対象物の例としては、白血球の成分であるＭｘＡタンパク質（Mol. Cell. Biol., 9, 5062-5072, 1989; J. Virol. 64, 1171-1181, 1990）、血漿中に含まれるパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテイン（Pancreatitis Associated Protein；以下、ＰＡＰと略す）（Digestion, 29, 242-249, 1984）等があげられる。
【００１３】
（３）細胞溶解物
本発明の免疫測定方法は、試料に由来しない細胞溶解物、すなわち、試料に含まれる細胞溶解物とは別の細胞溶解物の共存下で、測定対象物と測定対象物に結合する抗体とを反応させる点に特徴がある。本発明の方法で、共存させる細胞溶解物には、試料中の細胞を溶解して免疫測定を行う場合の、試料に含まれる細胞溶解物は含まれない。例えば、全血を試料とし、全血中の血球を溶解させて測定を行う場合、血球の溶解物が共存することになるが、この溶解物とは別に、細胞溶解物を添加して、抗原抗体反応を行う。
【００１４】
細胞溶解物は、細胞を溶解、すなわち細胞膜を破壊して得られる細胞質を含む液体を意味し、例えば細胞を溶解した後、遠心分離を行い上清として得ることができる。細胞の溶解は、例えば前述の溶血処理により行うことができるが、界面活性剤による溶血が好ましい。界面活性剤としては、免疫測定に影響せず、細胞を溶解できるものであれば特に制限はないが、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１５】
前述の溶血処理および細胞の溶解に使用される非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン系界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等があげられるが、ポリオキシエチレン系界面活性剤が好ましい。ポリオキシエチレン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等があげられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル等があげられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばノニデットＰ−４０（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）等があげられる。
【００１６】
細胞溶解物の原料となる細胞は、動物細胞、植物細胞、微生物等いかなる細胞でもよいが、動物の細胞が好ましく、動物の株化細胞がより好ましい。なお、動物細胞には、非ヒト動物の細胞だけでなく、ヒトの細胞も含まれる。動物の株化細胞としては、ヒト血球系細胞から樹立されたＲａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨＬ６０、ヒト神経細胞から樹立されたＴ９８Ｇ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、Ｈ４、ヒト子宮癌細胞から樹立されたＨｅＬａ、サル腎臓細胞から樹立されたＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ハムスター卵巣細胞から樹立されたＣＨＯ、ハムスター腎臓細胞から樹立されたＢＨＫ２１、マウス繊維芽細胞から樹立されたＮＩＨ／３Ｔ３、ラットミエローマ細胞から樹立されたＮＳ０、イヌ腎臓細胞から樹立されたＭＤＣＫ等があげられる。
【００１７】
細胞溶解物は、本発明の免疫測定方法における、試料中の測定対象物が関わる抗原抗体反応に共存される。すなわち、細胞溶解物は、サンドイッチ法における１次反応（測定対象物に結合する第１の抗体と試料中の測定対象物との反応）、競合法における競合反応に共存される。細胞溶解物は、あらかじめ試料に添加されていてもよいが、反応液に添加されてもよい。例えば、細胞溶解物を含む試料希釈液を調製しておき、試料を検体希釈液で希釈したものを試料として使用することができる。また、細胞溶解物を含む試料希釈液には、試料中の血球を溶解させるための前述の界面活性剤が含まれていてもよい。
【００１８】
細胞溶解物の添加量は、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する濃度であれば特に制限はないが、例えば測定対象物の反応液中、細胞溶解物の蛋白質濃度として、１μｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜５０μｇ／ｍＬの量添加する。容量としては、検体の０．１〜１０％の量が好ましい。
細胞溶解物は、前述の測定対象物を含有していないものが好ましく、また、測定対象物を含有する場合は、あらかじめ、測定対象物の濃度を決定したものが好ましい。
【００１９】
（４）抗体
本発明の測定方法において使用される抗体としては、測定対象物に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、抗体のみならず、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）2、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメントも使用できる。抗体フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2が特に好ましい。
【００２０】
本発明において使用する抗体は、測定対象物またはそのエピトープに相当するペプチドを抗原として用いて通常の方法により取得することができるが、市販品としても入手可能である。
【００２１】
測定対象物がＭｘＡタンパク質である場合、ＭｘＡタンパク質に特異的に結合する抗体としては、例えば、ＷＯ ９６／０５２３０に記載された、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２９）、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３０）、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３１）がそれぞれ産生する抗ヒトＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５等があげられる。測定対象物がＰＡＰである場合、ＰＡＰに特異的に結合する抗体としては、例えば６Ｆ３Ｅ４（ＷＯ９４／１５２１８）、１６Ｆ４Ｂ８（ＷＯ９４／１５２１８）等があげられる。
【００２２】
（５）競合物質
本発明において「競合物質」とは、本発明の免疫測定法において用いる「測定対象物に結合する抗体」に結合できる物質であって、かつその結合が、測定対象物と競合的であるような物質を意味し、測定対象物そのものも含まれる。「競合物質」は、試料中の測定対象物を競合法により測定する際に使用されるものである。したがって、競合法において用いる測定対象物に結合する抗体は、測定対象物および競合物質に結合する抗体であり、測定対象物と結合して免疫複合体を生成するとともに、競合物質とも結合して免疫複合体を生成する。競合物質としては、測定対象物に結合する抗体が認識するエピトープの構造と同じ構造を有している物質が好ましく、さらに測定対象物に結合する抗体に対する結合の強さが、該抗体に対する測定対象物の結合の強さと同程度であるものが好ましい。測定対象物そのものは競合物質として好適である。
【００２３】
（６）免疫測定方法
本発明の免疫測定方法は、試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする方法である。本発明の免疫測定方法としては、例えばサンドイッチ法、競合法等があげられる。例えば、試料中の測定対象物と、以下の（ｉ）〜（iii）のいずれかとを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする免疫測定方法があげられる。（ｉ）はサンドイッチ法、(ii)および（iii）は競合法である。
（i）該測定対象物に結合する第１の抗体、および、該測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
【００２４】
具体的には、例えば、以下の態様の方法があげられる。測定方法１および２はサンドイッチ法、測定方法３〜６は試料中の測定対象物と競合物質を競合させる競合法、測定方法７は、免疫複合体と免疫複合体に含まれない標識化抗体または標識化競合物質との分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わないホモジニアス法である。
【００２５】
測定方法１
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、測定対象物に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させて、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）（ａ）の工程で生成した免疫複合体と、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、測定対象物および標識化抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体と該免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離する工程；
（ｄ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｅ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の濃度を決定する工程。
【００２６】
第１の抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。工程（ａ）と工程（ｂ）は順次行っても、同時に行ってもよい。第１の抗体と結合した測定対象物に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する測定対象物中の部位と、第２の抗体が認識する測定対象物中の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【００２７】
測定方法２
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、測定対象物に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させて、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）（ａ）の工程で生成した免疫複合体と、測定対象物に結合する第２の抗体とを反応させ、第１の抗体、測定対象物および第２の抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体と、第２の抗体に結合する第３の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、標識化抗体を含む免疫複合体を生成させる工程；
（ｄ）（ｃ）の工程で生成した免疫複合体と、該免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離する工程；
（ｅ）（ｃ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および
（ｆ）（ｃ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の量を決定する工程。
【００２８】
第１の抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。工程（ａ）〜（ｃ）は順次行っても、同時に行ってもよい。第１の抗体と結合した測定対象物に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する測定対象物中の部位と、第２の抗体が認識する測定対象物中の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【００２９】
なお、試料中の測定対象物がある特定の抗原に対する抗体である場合は、測定方法１または２において、第１の抗体の代わりに該抗原を用いることにより、該測定対象物の測定を行うこともできる。
【００３０】
測定方法３
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体、および、該抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化競合物質から分離する工程；
（ｃ）該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｄ）該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の濃度を決定する工程。
抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。
【００３１】
測定方法４
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体および標識化抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化抗体、および、標識化抗体と測定対象物とからなる免疫複合体から分離する工程；
（ｃ）標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｄ）標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物濃度を決定する工程。
【００３２】
競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、競合物質が測定対象物と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。
【００３３】
測定方法５
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の第１の抗体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体から分離する工程；
（ｃ）第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体と、第１の抗体に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｄ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体と、未反応の標識化抗体とを分離する工程；
（ｅ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｆ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の濃度を決定する工程。
【００３４】
競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、競合物質が測定対象物と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。
【００３５】
測定方法６
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体と、第１の抗体に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体、および、第１の抗体、測定対象物および標識化抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体を、第１の抗体、測定対象物および標識化抗体とからなる免疫複合体、ならびに、未反応の標識化抗体から分離する工程；
（ｄ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｅ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物濃度を決定する工程。
【００３６】
競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、競合物質が測定対象物と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。
【００３７】
測定方法７
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を有する測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体を標識物質１で標識した標識化抗体１、および、測定対象物に特異的に結合する第２の抗体を標識物質１とは異なる標識物質２で標識した標識化抗体２とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、標識化抗体１、測定対象物および標識化抗体２からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）標識物質１と標識物質２の相互作用の変化量を測定する工程；および
（ｃ）相互作用の変化量から試料中の測定対象物の量を求める工程。
【００３８】
第１の抗体と結合した測定対象物に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する測定対象物中の部位と、第２の抗体が認識する測定対象物中の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【００３９】
上記の通り、測定方法１〜６は、Ｂ／Ｆ分離を伴う測定法（ヘテロジニアス法）である。測定方法１の工程（ｃ）、測定方法２の工程（ｄ）、測定方法３および４の工程（ｂ）、測定方法５の工程（ｂ）および（ｄ）、測定方法６の工程（ｃ）がＢ／Ｆ分離の工程である。このＢ／Ｆ分離は、抗体または競合物質が不溶性担体に固定化されている場合には、反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより容易に行うことができる。すなわち、抗原抗体反応後に反応溶液を除去し、不溶性担体を洗浄液により洗浄することにより、不溶性担体上に生成した免疫複合体と未反応の標識体（標識化抗体、標識化競合物質）とを分離することができる。洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５ ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液、ｐＨ ７．２、以下、ＰＢＳと記す）、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等をあげることができる。当該界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等があげられる。また、測定方法１または２において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されている場合には、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に不溶性担体を洗浄する工程を挿入することもできる。また、測定方法２において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されている場合には、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に不溶性担体を洗浄する工程を有することが好ましい。
【００４０】
測定方法３において、測定対象物に結合する抗体が不溶性担体に固定化されていない場合は、（ｃ）の工程で標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を添加して、免疫複合体を不溶性担体に結合させた後、反応溶液を除去し、さらに不溶性担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質とを分離することができる。また、標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で、（ａ）の工程の免疫複合体を生成させる反応を行い、免疫複合体の生成と免疫複合体の不溶性担体への固定化を同時に行った後、反応溶液を除去し、さらに不溶性担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質としては、例えば、該抗体の定常領域と結合する抗体等があげられる。また測定対象物がタンパク質でない場合は、（ｃ）の工程で、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等のタンパク質沈殿剤を添加して、免疫複合体のみを沈殿させた後、遠心分離することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。
【００４１】
測定方法１または２の方法において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されていない場合は、Ｂ／Ｆ分離の工程において、標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を添加するか、あるいは免疫複合体を生成させる工程を、標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で行い、それぞれ反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより、標識化抗体と免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離することができる。標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質としては、例えば、第１の抗体と標識化抗体の作製に用いた動物種が異なる場合には、第１の抗体の作製に用いた動物種の免疫グロブリンに対する抗体等があげられ、第１の抗体が定常領域を有する抗体で、標識化抗体がＦａｂやＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’等の定常領域を有しない抗体フラグメントである場合であれば、第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体等があげられる。
【００４２】
測定方法４〜６の方法において、競合物質が不溶性担体に固定化されていない場合は、測定対象物と競合物質が異なる構造を有する場合であれば、測定対象物に結合せず、競合物質に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を反応液中に添加するか、あるいは免疫複合体を生成させる工程を、測定対象物に結合せず、競合物質に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で行い、それぞれ反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより、競合物質を含有する免疫複合体（競合物質と標識化抗体とからなる免疫複合体、競合物質と第１の抗体とからなる免疫複合体、あるいは、競合物質、第１の抗体および標識化抗体からなる免疫複合体）のみを分離することができる。測定対象物に結合せず、競合物質に結合する結合性物質としては、例えば、測定対象物には存在せず、競合物質だけが有する部分構造と結合する抗体等があげられる。
【００４３】
これらの測定方法において、それぞれ（ａ）の工程を、（３）に記載した細胞溶解物の共存下で行うことにより、ヘモグロビンの影響を抑制することができ、より正確な測定を行うことができる。
【００４４】
（７）不溶性担体および、抗体または競合物質の不溶性担体への固定化
抗体または競合物質を固定化するための不溶性担体としては、抗体または競合物質を安定に保持できるものであればいかなるものも包含される。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等があげられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等があげられる。例えば、１枚に９６ウェルを有するポリスチレン製のマイクロタイタープレート等が好ましい。
【００４５】
抗体または競合物質の不溶性担体への固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等があげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等があげられる。例えば、ポリスチレン製免疫測定用マイクロタープレートを不溶性担体として使用する場合には、プレート内のウェルに抗体または競合物質の溶液を添加して、１時間から１日間、４℃〜３０℃でインキュベートすることにより、物理吸着させ固定化する方法をあげることができる。
【００４６】
抗体または競合物質は、直接、不溶性担体に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばアビジンを固定化した不溶性担体に、ビオチン化した抗体または競合物質を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、抗体または競合物質を不溶性担体に固定化する方法があげられる。また、不溶性担体に抗体に特異的に結合する抗体または競合物質に特異的に結合する抗体を固定化し、この抗体を介して抗体または競合物質を不溶性担体に固定化してもよい。あるいは、抗体または競合物質は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。リンカーとしては、例えば、抗体または測定対象物の官能基と不溶性担体の側鎖の官能基の両者と共有結合できる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、抗体または測定対象物が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体の側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基を同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。抗体または競合物質の官能基および不溶性担体がその表面に保持している官能基としては例えば、カルボキシ基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等があげられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン等の基があげられる。
【００４７】
（８）抗体または測定対象物の標識
抗体または測定対象物を標識する標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド等があげられる。
【００４８】
酵素としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等があげられる。
蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ−イソチオシアナート）等があげられる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質があげられる。
【００４９】
発光物質としては、例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等があげられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたものが好ましい。
放射性同位元素としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、125Ｉ、131Ｉ等があげられる。
【００５０】
タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、His His His His His His）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等があげられる。
【００５１】
抗体または測定対象物の標識化は、抗体または測定対象物と標識物質それぞれが有するの官能基の間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシ基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等があげられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。
【００５２】
リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ等のカルボジイミド化合物を用いる方法等があげられる。この場合、ＮＨＳまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
リンカーとしては、例えば、標識物質と抗体とをそれぞれの官能基を介して結合させうる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の側鎖の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子であり、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基であることが好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基があげられる。
【００５３】
放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990）記載の方法があげられる。
【００５４】
標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）にしたがって、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体および標識物質をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ等でクローニングし、それぞれのＤＮＡをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。
【００５５】
前述の（６）の測定方法７に記載のホモジニアス法に用いられる標識物質１と２としては、１つの測定対象物に結合して近接することにより相互作用を起こす標識物質があげられる。このような標識物質として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ:fluorescence resonance energy transfer）を起こす蛍光物質があげられる。ＦＲＥＴとは、第１の蛍光物質が励起光を受光することによって生じた蛍光エネルギーが、近接する第２の蛍光物質の蛍光エネルギーとして利用される現象であり、２種類の蛍光物質が１〜１０ｎｍまで近接することにより起こる。ＦＲＥＴを起こす蛍光物質の組み合わせとしては、一方の蛍光波長のスペクトルと、他方の励起波長のスペクトルとに重なりがある組合せがあげられる。蛍光物質としては、蛍光タンパク質、低分子有機蛍光色素、無機化合物等があげられる。ＦＲＥＴを起こす蛍光タンパク質の組み合わせとしては、例えばＣＦＰ［緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の黄色変異体］とＹＦＰ［緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のシアン色変異体］との組み合わせ等があげられる。低分子有機蛍光色素の組み合わせとしては、例えばＣｙ３とＣｙ５の組み合わせがあげられる。無機化合物としては例えばｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ（Science, 281,2016-2018, 1998）があげられる。
【００５６】
また、ホモジニアス法での該標識物質の組み合わせとして、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ：bioluminescence resonance energy transfer）を起こす、化学発光を生じる酵素と蛍光物質との組み合わせもあげることができる。ＢＲＥＴを起こす酵素と蛍光物質との組み合わせとしては、酵素が基質を分解して生じる発光波長のスペクトルと、蛍光物質の励起波長のスペクトルとに重なりがある組合せがあげられる。例えば酵素としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、基質として例えばディープブルーＣ［Deep Blue C、パッカードバイオサイエンス（Packard BioScience）社製］、蛍光物質としてＧＦＰを用いる組合せ等があげられる。この場合、Ｒｌｕｃによる基質の分解によって３９５ｎｍの波長の光が生じ、ＲｌｕｃにＧＦＰが近接することにより、ＧＦＰがこの光のエネルギーを受けて発する５１０ｎｍの波長の蛍光を検出することができる。
【００５７】
また、ホモジニアス法での該標識物質の組み合わせとして、標識物質１と標識物質２が近接して、ある配向性をもって結合したときに酵素活性を生じる物質の組み合わせがあげられる。例えば、標識物質の組み合わせとしては、標識物質１としてβ−ガラクトシダーゼのΔαサブユニット、標識物質２としてβ−ガラクトシダーゼのΔωサブユニットを用いる組合せ、標識物質１としてＲｌｕｃのＮ末端側ドメイン、標識物質２としてＲｌｕｃのＣ末端側ドメインを用いる組合せ等があげられる。
【００５８】
（９）反応条件
抗原抗体反応は水性媒体中で行われることが好ましい。反応温度としては、例えば０〜５０℃があげられ、４℃〜４０℃が好ましい。反応時間としては、５分間〜２０時間が好ましい。
【００５９】
（１０）標識の量の測定
免疫複合体の標識の量の測定方法は、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により測定することができる。
【００６０】
標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法等によりペルオキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等があげられる。
【００６１】
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等があげられる。
【００６２】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００６３】
蛍光法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等があげられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等があげられる。
【００６４】
発光法によるペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等があげられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等があげられる。
酵素がアルカリフォスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリフォスファターゼ量を測定することができる。発光法によりアルカリフォスファターゼ量を測定する方法としては、例えばアルカリフォスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。アルカリフォスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］カン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５）等があげられる。
【００６５】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法等によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばｏ−ニトロフェル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］またはその類似化合物等があげられる。蛍光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。
【００６６】
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ量を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ量を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等があげられる。
【００６７】
標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の場合は、当該標識物質に特異的に結合する物質を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識体と、免疫複合体中の標識化抗体または標識化競合物質を構成している当該標識物質とを結合させ、当該標識物質に特異的に結合する物質を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うことができる。標識物質に特異的に結合する物質としては、標識物質を特異的に結合する抗体、また標識物質がビオチンの場合は、アビジンやストレプトアビジン等があげられる。また、標識物質に特異的に結合する物質（標識物質に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジン等）は非標識のものを用いて、免疫複合体中の標識物質と結合させた後、標識物質に特異的に結合する物質に結合する抗体、例えば、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素で標識したものを結合させ、これらの抗体を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うこともできる。
【００６８】
これらの検出に用いる抗体、アビジンまたはストレプトアビジンや標識物質に特異的に結合する抗体、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、あるいはＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）2、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメントでもよい。
【００６９】
（１１）測定対象物の定量
測定対象物を定量するためには、標準物質、すなわち既知の濃度の測定対象物の溶液を用いる。好ましくは、既知濃度の測定対象物溶液を複数用いる。この既知濃度の測定対象物溶液を測定用試料として、実際の試料の測定と同じ方法により測定を行い、測定対象物濃度と測定値（標識由来の情報量）との間の関係を示す検量線を作成する。次いで、試料の測定により得られる測定値を先に作成した検量線に当てはめることにより、試料中の測定対象物の濃度を決定することができる。
【００７０】
（１２）水性媒体およびその他の共存物
本発明の免疫測定方法において、測定対象物の抗原抗体反応を行うための水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
【００７１】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等があげられる。
【００７２】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
本発明の免疫学的定量方法においては、測定対象物の抗原抗体反応に、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤等を共存させることができる。
【００７３】
金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等があげられる。
塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等があげられる。
糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等があげられる。
界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられ、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばツイーン２０、ノニデットＰ−４０等があげられる。 防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等があげられる。
【００７４】
タンパク質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等があげられる。
タンパク質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等があげられる。
【００７５】
（１３）免疫測定試薬
本発明の免疫測定試薬は、試料中の測定対象物をヘモグロビンの影響を抑制して免疫測定するための免疫測定試薬であり、上記（３）に記載した細胞溶解物を含有することを特徴とする。本発明の免疫測定試薬としては、例えば（３）に記載した細胞溶解物にさらに、（ｉ）〜（iii）のいずれかを含有する免疫測定試薬があげられる。
（ｉ）測定対象物に結合する第１の抗体、および、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体。
【００７６】
本発明の免疫測定試薬は、本発明の免疫測定方法に使用され得る。本発明の免疫測定試薬において使用される、細胞溶解物、測定対象物に結合する抗体、競合物質、測定対象物に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、標識化競合物質としては、例えば、それぞれ、前述の細胞溶解物、測定対象物に結合する抗体、競合物質、測定対象物に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、標識化競合物質をあげることができる。また、本発明の免疫測定試薬は、必要に応じて、前述の金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤等を含有する。
【００７７】
さらに、（１）に記載した試料中の血球を溶解させるための界面活性剤等の試薬、（１２）に記載した反応の水性媒体および共存物、（６）に記載した洗浄液、（１０）に記載した標識の量の測定に用いる試薬、および（１１）に記載した標準物質をそれぞれ含んでもよい。細胞溶解物、（１２）に記載した反応の水性媒体および共存物は、それぞれ別々の試薬としてもよいが、細胞溶解物と共存物を含む水性媒体を検体希釈液としてもよい。
【００７８】
また、上記（３）に記載した細胞溶解物を含有する試薬は、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬とすることができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
ＭｘＡタンパク質のサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定および細胞溶解物によるヘモグロビンの影響の抑制
［１］抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体の調製
以下のようにして、エピトープの異なる２種類の抗ヒトＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４（ＷＯ９６／０５２３０）およびＫＭ１１３５（ＷＯ９６／０５２３０）を調製した。なお、ＫＭ１１２４は、ヒトＭｘＡタンパク質のアミノ末端から２２０〜２９７残基中に存在するエピトープ、ＫＭ１１３５はヒトＭｘＡタンパク質のアミノ末端から１０〜２２０残基中に存在するエピトープとそれぞれ結合するマウスモノクローナル抗体である。
【００８０】
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb／c）に、モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２９）およびモノクローナル抗体ＫＭ１１３５を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３１）をそれぞれ５〜２０×１０6細胞／匹ずつ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマ株が腹水癌化し、腹水のたまったマウスから腹水を採取した。採取した腹水を３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して固形分を除去し、上清を回収した。この上清から、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）により精製したモノクローナル抗体を、ＭｘＡタンパク質の免疫測定方法に用いた。
【００８１】
［２］リコンビナントＭｘＡタンパク質の調製
ヒトＭｘＡタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ベクターｐＥＴ−１４ｂ［ノバジェン（Novagen）、ＥＭＤバイオサイエンシズ（EMD Biosciences）社製］のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入して作製したヒトＭｘＡタンパク質発現ベクターｐＥＴ１４ｂ−ＭｘＡ（Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004）でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。この形質転換体は、Ｎ末端にＨｉｓタグが付加したＭｘＡタンパク質を発現する。
【００８２】
得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）が０．５になるまで３７℃で振とう培養した。この培養液をアンピシリンを含むＬＢ培地２５０ｍＬに植菌し、６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５になるまで３７℃で振とう培養した。ここに、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、さらに３７℃で２時間振とう培養して培養を終了した。培養液を４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を回収した。菌体はＭｘＡタンパク質の調製まで−８０℃で保存した。
【００８３】
ＭｘＡタンパク質は菌体内に不溶体（inclusion body）の状態で存在していたので、菌体を氷上で融解させ、氷冷した結合緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）２０ｍＬを添加し、懸濁させた。菌体懸濁液に３０秒ずつ５回の超音波処理をして菌体を破砕した後、４℃で４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に氷冷した結合緩衝液２０ｍＬを添加して懸濁させ、再び同様に超音波処理と遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む結合緩衝液２０ｍＬを添加し、懸濁させた。同様に超音波処理を行った後、氷上で３０分間静置して不溶体を溶解させ、４℃で１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上清を回収して０．４５ｎｍミリポアフィルターでろ過した。
【００８４】
得られた溶液にＮｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄレジン（ノバジェン、ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）０．５ｍＬを添加し、４℃で２時間回転させながら混和させ、Ｈｉｓタグを介してレジンにＭｘＡタンパク質を結合させた。４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。レジンに氷冷した６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む結合緩衝液１０ｍＬを添加した後、４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。この洗浄操作を再度繰り返した後、さらにレジンに氷冷した洗浄緩衝液（６ｍｏｌ／Ｌ尿素、６０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）１０ｍＬを添加し、４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。
【００８５】
レジンに氷冷した溶出緩衝液（６ｍｏｌ／Ｌ尿素、１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）１０ｍＬを添加し、４℃で２時間回転させながら混和させ、レジンからＭｘＡタンパク質を溶出させた。４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を回収し、ＭｘＡタンパク質の測定において、標準となるＭｘＡタンパク質溶液として使用した。
【００８６】
［３］抗ＭｘＡタンパク質抗体固相化プレートの調製
［１］で調製した抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５を５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート［ナルジェンヌンクインターナショナル（Nalge Nunc International）社製］に５０μＬ／ウェルの量で分注した。一晩放置後、上清を吸引除去し、２５％ブロックエース（大日本製薬社製）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．２リン酸緩衝液２００μＬを分注し室温で２時間静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、ＰＢＳで洗浄した。真空乾燥機で一晩乾燥したものを、抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体固相化プレートとして使用した。
【００８７】
［４］ペルオキシダーゼ標識抗ＭｘＡタンパク質抗体の調製
［１］で調製した抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を以下のようにしてマレイミド法でペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）と結合させ、ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体を作製した。
【００８８】
まず、ＫＭ１１２４ ２ｍｇを含む溶液の溶媒を０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に置換し、０．０８６ｍｇの２−イミノチオラン塩酸塩［ピアース（Pierce）社製］を添加し、攪拌後、３０℃で３０分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ２５（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ）を用いて、反応溶液中の未反応の２−イミノチオランを除去し、スルフヒドリル化したＫＭ１１２４を回収した。
【００８９】
一方、ＫＭ１１２４に対しモル比で５倍量にあたるＰＯＤ（東洋紡績社製、ペルオキシダーゼＩ−Ｃ）２．５ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬに溶解させた。この溶液を３０℃で５分間加温した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に溶解させた０．７２ｍｇのＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所社製）を加えて攪拌し、３０℃で３０分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ２５カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応のＥＭＣＳを除去し、マレイミド化したＰＯＤを回収した。
【００９０】
上記で得られたスルフヒドリル化したＫＭ１１２４の溶液とマレイミド化したＰＯＤの溶液を混合し、３０℃で１時間反応させた。反応後、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００（ファルマシア製）カラム（直径３ｃｍ×６０ｃｍ）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応のＰＯＤを除去すると共に、標識化抗体を精製した。ゲルろ過の各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）および４０３ｎｍでの吸光度（Ａ４０３）を測定し、Ａ２８０からＫＭ１１２４のモル数、Ａ４０３からＰＯＤのモル数を計算し、ＰＯＤのモル数／ＫＭ１１２４のモル数が１．５以上のフラクションを、標識化抗体を含むフラクションとして回収した。得られた標識化抗体はＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２００倍に希釈し使用した。
【００９１】
［５］サンドイッチＥＬＩＳＡによるＭｘＡタンパク質測定系の構築
前記［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ（インタージェン（InterGen）社製）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２］で希釈し、ＭｘＡタンパク質の０（緩衝液のみ）、３．２、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の溶液を調製し、測定試料とした。
【００９２】
前記［３］で作製した抗ＭｘＡタンパク質抗体（ＫＭ１１３５）固定化プレートに１００μＬの測定試料を添加し、室温で１時間インキュベートし、抗体に測定試料中のＭｘＡタンパク質を結合させた。測定試料を除去した後、洗浄液［０．０５％ツイーン２０（関東化学社製）を含むＰＢＳ］を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。次いで、［４］で作製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡタンパク質抗体（ＫＭ１１２４）を１００μＬ添加して室温で３０分間反応させた。標識化抗体を除去し、洗浄液を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。暗所で、０．０５％テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含むＰＯＤの発色基質ＴＭＢｌｕｅ［セロロジカル（Serological）社製］を１００μＬ添加し、室温で１０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ添加して室温で１０分間インキュベーションして反応を停止させた。波長４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。その結果、測定試料中のＭｘＡタンパク質の濃度の上昇にしたがって、吸光度の上昇が見られ、高感度にＭｘＡタンパク質の測定ができることが示された。
【００９３】
［６］細胞溶解物の調製
浮遊性のヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（Lancet, 39, 238-240, 1964、大日本製薬株式会社製）を、１０％非働化ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ［インビトロジェン（Invitrogen）社製］、０．１％ゲンタマイシン（インビトロジェン社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地［シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）社製］１０ｍＬで、１×１０6細胞／ｍＬになるよう懸濁させた。細胞懸濁液を２５ｃｍ2Ｔフラスコに全量移し、炭酸ガス培養装置（５％ＣＯ2）で、３７℃で２〜３日浮遊培養した。その後、１５０ｃｍ2Ｔフラスコ、２２５ｃｍ2Ｔフラスコへと順次拡大培養を行った。２２５ｃｍ2Ｔフラスコ内で細胞がコンフルエントになったところで、細胞を含む培養液を滅菌された容器に回収し、２５℃で１４００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞数１０7個／ｍＬになるように低張緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）で懸濁して回収し、凍結保存した。
【００９４】
上記で得られた１０7個／ｍＬの培養細胞を含む溶液を５％の濃度で細胞溶解用緩衝液（１％ノニデットＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に添加して、３０分間インキュベートをして、細胞を溶解させた後に、室温で１４００ｒｐｍ、５分間遠心分離して、不溶解成分を沈殿させ上清を回収し、細胞溶解物を得た。
得られた細胞溶解物中のタンパク質含量を、ブラッドフォード法によるプロテインアッセイキット［バイオラッド（Bio-Rad）社製］を用いて測定した。タンパク質含量は１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを標準とし段階的希釈を行い、得られる吸光度とタンパク質濃度をプロットし、検量線を作成し、これを用いて濃度換算を行った。溶液は、−８０℃で保管した。
【００９５】
［７］細胞溶解物によるＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制
前記［６］で調製したＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を０、０．６３、１．２５、２．５、５％の各濃度（蛋白質濃度として、それぞれ０、４．３、９．３、１７．９、３５．８μｇ／ｍＬに相当した）で含む緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を調製し、検体希釈液とした。
【００９６】
ＭｘＡタンパク質陰性健常者１０名の血液に、４倍の容量のＰＢＳを添加して、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を除いた。沈殿の血球に４倍の容量のＰＢＳを添加して懸濁し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を除く洗浄操作を３回繰り返した。得られた洗浄血球を−３０℃で凍結した後、融解し、さらに蒸留水を添加して赤血球をバーストさせた。得られた溶液のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビン測定キットＨｂテストワコー（和光純薬工業社製）で測定し、蒸留水でヘモグロビン濃度を６０ｍｇ／ｍＬに調整したものをヘモグロビン溶液とした。
【００９７】
各濃度の細胞溶解物を含む検体希釈液にヘモグロビン溶液をヘモグロビン濃度が３０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬになるように添加した各溶液、およびヘモグロビン溶液を添加しない各検体希釈液で、［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を５０ｎｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したものを測定試料とし、［５］と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、吸光度を測定した。
【００９８】
ヘモグロビン溶液を添加した各測定試料の吸光度の値を、ヘモグロビン溶液を添加しない測定試料の吸光度の値と比較してヘモグロビンの影響を調べた。その結果、図１に示すように、ヘモグロビン溶液を添加した測定試料では、ヘモグロビン溶液を添加しない測定試料と比較して、ヘモグロビンの濃度が増えるにつれて、測定値の低下がみられ、ヘモグロビンは測定値を低下させる影響を与えることが示された。測定試料に細胞溶解物を添加しない場合と比較して、細胞溶解物を添加した測定試料では、添加した細胞溶解物の濃度が増加するにつれて、ヘモグロビンによる測定値の低下が抑制されており、細胞溶解物を添加することで、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【実施例２】
【００９９】
Ｔ９８Ｇ細胞の細胞溶解物によるヘモグロビンの影響の抑制
［１］Ｔ９８Ｇ細胞の細胞溶解物の調製
接着性のヒトグリア芽細胞種由来の細胞株Ｔ９８Ｇ（大日本製薬株式会社より購入、J. Cell. Physiol., 99, 43-54, 1979）を、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）、１ｍｍｏｌ／ｍＬピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地「ダイゴ」（日本製薬株式会社製）１０ｍＬを添加した細胞培養用の６ｃｍシャーレ内で、コンフルエントになるまで、炭酸ガス培養装置（５％ＣＯ２、３７℃）を用いて２〜３日間培養した。細胞がコンフルエントになったところで、細胞を１５ｃｍシャーレに移して同様に培養を行った。１５ｃｍシャーレ内で細胞がコンフルエントになったところで、培地を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄し、０．０２％ＥＤＴＡで洗浄した。細胞を０．２５％トリプシン溶液を添加して細胞をシャーレからはがした後、２５℃５分間遠心分離（１４００ｒｐｍ）した。上清を除去し、低張緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）を添加して細胞を懸濁し溶液を回収した。
【０１００】
上記で得られた培養細胞を含む溶液を５％の濃度で細胞溶解用緩衝液（１％ノニデットＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に添加して、３０分間インキュベートをして、細胞を溶解させた後に、室温で１４００ｒｐｍ、５分間遠心分離して、不溶解成分を沈殿させ上清を回収し、細胞溶解物として用いた。実施例１［６］と同様にして、細胞溶解物の蛋白質濃度を測定し、−８０℃で保管した。
【０１０１】
［２］Ｔ９８Ｇ細胞の細胞溶解物によるＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制
［１］で調製したＴ９８Ｇ細胞の細胞溶解物をタンパク質濃度０．２、０．４、０．７、１．４ｍｇ／ｍＬになるように、緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に添加したもの、および細胞溶解物を添加しない緩衝液を、検体希釈液とした。これらの検体希釈液に、実施例１［７］で調製した６０ｍｇ／ｍＬヘモグロビン溶液をヘモグロビン濃度が３．７５、７．５、１５、３０ｍｇ／ｍＬになるように添加した各溶液、およびヘモグロビン溶液を添加しない各検体希釈液で、実施例１［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を濃度になるように希釈したものを測定試料とし、実施例１［５］と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、吸光度を測定した。
【０１０２】
ヘモグロビン溶液を添加した各測定試料の吸光度の値を、ヘモグロビン溶液を添加しない測定試料の吸光度の値と比較してヘモグロビンの影響を調べた。図２に示すように、実施例１［７］と同様に、ヘモグロビンは測定値を低下させる影響を与えることが示された。実施例１［７］のＲａｊｉ細胞の細胞溶解物と同様に、測定試料にＴ９８Ｇの細胞溶解物を添加しない場合と比較して、Ｔ９８Ｇの細胞溶解物を添加した測定試料では、添加した細胞溶解物の濃度が増加するにつれて、ヘモグロビンによる測定値の低下が抑制されており、細胞の種類に関わらず、細胞溶解物を添加することで、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【実施例３】
【０１０３】
全血中のＭｘＡタンパク質の測定
健常者４例の血液を採取し、それぞれの血液を二つに分け、それぞれに血液と等量の１０％非働化ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、０．１％ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、一方はインターフェロンαを１０００Ｕ／ｍＬの濃度で添加し２４時間培養することにより白血球でのＭｘＡタンパク質の発現を誘発し、他方はインターフェロンαを添加せずに２４時間培養した。培養後の全血試料に４倍の容量の、血球溶解用緩衝液［１％ノニデットＰ４０を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）］を添加して試料中の血球を溶解させ、血球内のＭｘＡタンパク質を溶液中に放出させ、さらに、検体希釈液［実施例１［６］で調製したＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を５％の濃度で含む緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）］で２倍に希釈したものを測定試料とした。測定試料中のＭｘＡタンパク質を実施例１［５］と同様にして測定を行った。
【０１０４】
実施例１［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を、検体希釈液で希釈し、０（検体希釈液のみ）、３．２、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の溶液を調製し、同様に測定を行い、ＭｘＡタンパク質濃度および吸光度をプロットして検量線を作成した。検量線に基づいて、測定試料の吸光度から測定試料中のＭｘＡタンパク質濃度を求め、さらに希釈率［検体希釈液による希釈（２倍）×血球溶解用緩衝液による希釈（５倍）＝１０倍］を乗じて全血試料中のＭｘＡタンパク質濃度を定量した。図３に定量結果を示した。図３に示すように、インターフェロンαで刺激した健常人血液に含まれるＭｘＡタンパク質は１１７．１〜１７１．６ｎｇ／ｍＬ、インターフェロンα刺激しない健常人血液に含まれるＭｘＡタンパク質は０．８〜９．４ｎｇ／ｍＬと決定された。
【実施例４】
【０１０５】
全血検体の希釈試験
実施例３の方法に従って、ＭｘＡタンパク質陽性の臨床検体の希釈試験を行った。
ＭｘＡタンパク質陽性全血検体に、４倍の容量の血球溶解用緩衝液を添加して試料中の血球を溶解させ、血球内のＭｘＡタンパク質を溶液中に放出させた。これを２つに分け、一方はＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を５％の濃度で含む検体希釈液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で、もう一方は細胞溶解物を含まない検体希釈液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で、それぞれ２倍に希釈したものを測定試料として用いた。細胞溶解物を含む検体希釈液で希釈した試料をさらに、同じ細胞溶解物を含む検体希釈液で４／５、３／５、２／５、１／５と段階的に希釈した。他方の細胞溶解物を含まない検体希釈液で希釈した測定試料も、さらに同じ細胞溶解物を含まない検体希釈液で４／５、３／５、２／５、１／５と段階的に希釈した。段階的に希釈する前の測定試料および段階的に希釈した測定試料それぞれについて、実施例１［５］と同様にしてＭｘＡタンパク質の測定を行い、実施例３と同様にして作成した検量線に基づいてＭｘＡタンパク質の定量を行った。図４に細胞溶解物を含む検体希釈液で希釈した場合の測定結果、図５に細胞溶解物を含まない検体希釈液で希釈した場合の測定結果を、実際の測定値と理論値（段階的な希釈前の測定試料（５／５）の測定値に希釈率を乗じて求められる値）で示した。第１表に各試料のＭｘＡタンパク質濃度の理論値に対する実際の測定値の比（％）を示した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
図４、図５および第１表からわかるように、細胞溶解物を含まない検体希釈液による希釈では、希釈が進むにつれて理論値と測定値の乖離率が上昇し、希釈率１／５では乖離率＋２０％以上となった。これは、希釈率５／５の状態では、試料中のヘモグロビンにより測定が阻害されており、試料の希釈によりその阻害が弱まったためと考えられた。これに対し、細胞溶解物を含む検体希釈液では希釈直線性は良好で、乖離率±５％以内であり、細胞溶解物の共存下で測定を行うことにより、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【実施例５】
【０１０８】
ＭｘＡタンパク質測定キット
下記の各試薬からなるＭｘＡタンパク質の酵素免疫測定用の試薬キットを作製した。
（ａ）抗ＭｘＡタンパク質抗体固定化プレート １枚
実施例１［３］に記載の方法にしたがって、５μｇ／ｍＬの抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．５）を、５０μＬ／ウェルの量で分注して固定化後、２５％ブロックエースでブロッキングし、乾燥させた、９６ウェルマイクロタイタープレート。
（ｂ）血球溶解用緩衝液
組成：１％ノニデットＰ４０を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）
容量：１０ｍＬ／ボトル
（ｃ）検体希釈液
組成：５％ Ｒａｊｉ細胞の細胞溶解物（実施例１［２］に記載の方法に従って調製したもの）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
容量：３０ｍＬ／ボトル
（ｄ）標識抗ＭｘＡタンパク質抗体
実施例１［４］に記載の方法にしたがって調製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４。測定時に標識化抗体希釈液で希釈して使用。
（ｅ）標識化抗体希釈液
組成：ＰＢＳ（ｐＨ７．５）
容量：１１ｍＬ／ボトル
（ｆ）発色基質液
組成：ＴＭＢｌｕｅ（セロロジカル社製）
容量：１１ｍＬ／ボトル
（ｇ）反応停止液
組成：０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸
容量：１１ｍＬ／ボトル
（ｈ）洗浄液原液
組成：０．５％ツイーン２０、１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
容量：１００ｍＬ／ボトル
使用時に蒸留水で１０倍に希釈して使用する。
（ｉ）標準物質
実施例１［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を、緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２］で１μｇ／ｍＬに調製した溶液
【実施例６】
【０１０９】
ＰＡＰ測定における細胞溶解物によるヘモグロビンの影響の抑制
ＰＡＰの測定に対するヘモグロビンの影響を、細胞溶解物で抑制できるかどうかを、ＰＡＰのＥＬＩＳＡキットであるＰＡＰ測定キット［ディナビオ（Dynabio）社製］を用いて検討した。
実施例１［６］で調製したＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を蛋白質濃度０（検体希釈液のみ）、１７．９、３５．８μｇ／ｍＬになるよう、ＰＡＰ測定キットに含まれる検体希釈液に添加した。ついで、これらの検体希釈液に実施例１［７］で調製したヘモグロビン溶液をヘモグロビン濃度０．４６９、０．９３８、１．８８、３．７５、７．５、１５ｍｇ/ｍＬになるよう添加した。これらのヘモグロビン溶液を添加した各検体希釈液およびヘモグロビン溶液を添加しない検体希釈液それぞれに、ＰＡＰ測定キットに含まれるリコンビナント膵ＰＡＰ抗原を１ｎｇ／ｍＬになるように添加したものを測定試料とし、ＰＡＰ測定キットを用いて、測定試料中のＰＡＰの測定をおこなった。測定方法は、キットに添付されたマニュアルに従い、以下のように行った。
【０１１０】
キットの抗ＰＡＰ抗体固定化９６ウェルプレートのウェルに各測定試料および標準物質溶液をそれぞれ１００μＬ添加し、室温で３時間インキュベートして、抗体に試料中のＰＡＰを結合させた。ウェルの溶液を除去した後、洗浄液を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。次いで、ウェルにビオチン標識抗ＰＡＰ抗体を添加して、室温で３０分間インキュベーションした。ウェルの溶液を除去し、上記と同様に５回洗浄した。ウェルにアビジン−ＰＯＤ溶液を１００μＬ添加し、室温で１５分間インキュベーションした。ウェルの溶液を除去し、上記と同様に５回洗浄した。キットのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）溶液と過酸化水素溶液を混合して発色試薬を調製し、ウェルに１００μＬ添加した。暗所で１０〜１５分間インキュベーションした後、キットのオルトリン酸溶液を１００μＬ添加して発色反応を停止させた。波長４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。結果を図６に示した。
【０１１１】
実施例１のＭｘＡタンパク質のＥＬＩＳＡと同様に、ＰＡＰ測定においても、ヘモグロビンの濃度が増えるにつれて、測定値の低下がみられ、ヘモグロビンは測定値を低下させる影響を与えることが示された。測定試料に細胞溶解液を添加しない場合と比較して、細胞溶解液を添加した測定試料では、ヘモグロビンによる測定値の低下が抑制されており、ＰＡＰの免疫測定においても、細胞溶解液を添加することで、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により、臨床診断において有用な、ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の測定方法が提供される。該測定方法により、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象物を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】各蛋白質濃度のＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を添加した場合の、ＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制を示す。横軸はヘモグロビン添加濃度、縦軸はヘモグロビンを添加しない場合に対する吸光度の影響率を表す。
【図２】各蛋白質濃度のＴ９８Ｇ細胞の細胞溶解物を添加した場合の、ＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制を示す。横軸はヘモグロビン添加濃度、縦軸はヘモグロビンを添加しない場合に対する吸光度の影響率を表す。
【図３】４種類の全血の検体に対し、インターフェロンαで刺激した場合としなかった場合それぞれのＭｘＡタンパク質の濃度を測定した結果を示す。
【図４】ＭｘＡタンパク質陽性の全血の検体を、細胞溶解物を含む検体希釈液で希釈した場合のＭｘＡタンパク質の測定結果を示す。
【図５】ＭｘＡタンパク質陽性の全血の検体を細胞溶解物を含まない検体希釈液で希釈した場合のＭｘＡタンパクの測定結果を示す。
【図６】各蛋白質濃度のＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を添加した場合の、ＰＡＰ測定におけるヘモグロビンの影響の抑制を示す。横軸はヘモグロビン添加濃度、縦軸はヘモグロビンを添加しない場合に対する吸光度の影響率を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬、ならびに、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する方法、および、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液成分を免疫学的に測定する場合、全血から血球を除去した血清または血漿が試料として用いられるのが一般的である。しかし、血球を除去するためには遠心分離機等の専用の装置が必要であり、手間もかかるため、直接全血検体を測定する方法が提案されている（特許文献１参照）。全血を試料とする場合、溶血により検体に混入するヘモグロビン等の血球成分や血球の膜成分が、光学的な検出系に影響したり、免疫反応を阻害したり、測定対象物質を吸着することにより、測定に影響がでる問題がある。このような問題を回避するため、溶血をさせずに測定する全血を試料とする免疫測定方法が報告されている（特許文献２、３、４および５参照）。
【０００３】
細胞内蛋白質等の血球成分を測定する場合には、血球を溶解する必要があるため、上記の溶血をさせずに測定する方法を用いることができない。この場合には、フローサイトメトリーにより、対象の血球を分離してから、分離した細胞を溶解させて目的の血球成分を測定する方法がとられてきたが、フローサイトメトリーのための専用の装置が必要であり、手間がかかる。一方、細胞内蛋白質の簡便な測定法の例として、界面活性剤で全血中の血球を溶解させたものを測定試料とした、ＭｘＡタンパク質の免疫測定法が報告されている（非特許文献１参照）。この報告では特にヘモグロビン等の影響を抑制するための手段はとられていない。したがって全血等のヘモグロビンを含有する試料中の血球を溶解させて、簡便かつ高感度で、ヘモグロビン等の影響を抑制した測定方法については、未だ確立されているとは言えなかった。
【特許文献１】特開平１０−４８２１４号公報
【特許文献２】特開平６−２６５５５４号公報
【特許文献３】国際公開第９６／０４５５８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／７３２０３号パンフレット
【特許文献５】特開２００４−４５３９５号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（Journal of Interferon Research），（米国），１９９２年，第１２巻，第２号，ｐ．６７−７４
【非特許文献２】ペディアトリック・リサーチ（Pediatric Research），（米国）、１９９７年，第４１巻，第５号，ｐ．６４７−６５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることにより、ヘモグロビンの影響を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［２３］に関する。
［１］試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
［２］免疫測定方法が、サンドイッチ法または競合法である［１］に記載の方法。
［３］試料中の測定対象物と（ｉ）〜（iii）のいずれかとを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
（i）該測定対象物に結合する第１の抗体、および、該測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
［４］試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する方法。
【０００６】
［５］試料が、全血である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］全血が、血球を溶解させた全血である［５］に記載の方法。
［７］血球を溶解させた全血が、血球を界面活性剤により溶解させた全血である［６］に記載の方法。
［８］細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］動物細胞が、動物の株化細胞である［８］に記載の方法。
［１０］動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である［９］に記載の方法。
［１１］測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【０００７】
［１２］細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物と該測定対象物に結合する抗体との反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬。
［１３］細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物の免疫測定試薬。
［１４］さらに、（ｉ）〜（iii）のいずれかを含有する［１３］に記載の免疫測定試薬。
（ｉ）測定対象物に結合する第１の抗体、および、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体。
【０００８】
［１５］さらに、試料中の血球を溶解させるための試薬を含有する［１３］または［１４］に記載の免疫測定試薬。
［１６］血球を溶解させるための試薬が、界面活性剤である［１５］に記載の免疫測定試薬。
［１７］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である［１６］に記載の免疫測定試薬。
［１８］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系界面活性剤である［１７］に記載の免疫測定試薬。
［１９］ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである［１８］に記載の免疫測定試薬。
【０００９】
［２０］細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である［１２］〜［１９］のいずれかに記載の試薬。
［２１］動物細胞が、動物の株化細胞である［２０］に記載の試薬。
［２２］動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である［２１］に記載の試薬。
［２３］測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである［１２］〜［２２］のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の免疫測定方法および免疫測定試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（１）試料
本発明の免疫測定方法において試料として使用される試料としては、例えば、全血、全血から調製した赤血球を含む血球画分、溶血が疑われる血漿または血清、赤血球、任意の試料にヘモグロビンを添加した試料等、ヘモグロビンを含有する試料またはヘモグロビンの含有が疑われる試料があげられる。全血としては、被検者より採取した血液そのものでもよいが、採取した血液を処理したものでもよく、処理した血液が好ましい。当該処理としては、例えば抗凝固処理、溶血処理等があげられ、これらの処理を組み合わせてもよい。測定対象物が血球の細胞内成分である場合は、全血として、溶血処理した血液が好ましく、抗凝固処理と溶血処理の両処理を行った血液が特に好ましい。抗凝固処理としては、例えば採取した血液にＥＤＴＡ、ヘパリン等を添加する処理等があげられる。溶血処理としては、例えば界面活性剤またはサポニン類溶液の添加、低張液との混合、凍結融解、超音波処理等があげられる。界面活性剤としては、測定系に影響せず、細胞を溶解できるものであれば、どのような界面活性剤でも用いることができるが、本発明においては非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン界面活性剤としては、例えば後述の非イオン性界面活性剤があげられる。血球画分や赤血球を試料とする場合も上記に記載したような、抗凝固処理、溶血処理等を行ったものが好ましい。
【００１２】
（２）測定対象物
本発明の免疫測定方法で測定される測定対象物は、（１）であげた試料に含まれる物質であれば特に制限はなく、血球の成分、血漿中に含まれる例えば、抗体、インターロイキン、ホルモン等の蛋白質や生理活性物質、外部から投与された薬物等があげられる。具体的な測定対象物の例としては、白血球の成分であるＭｘＡタンパク質（Mol. Cell. Biol., 9, 5062-5072, 1989; J. Virol. 64, 1171-1181, 1990）、血漿中に含まれるパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテイン（Pancreatitis Associated Protein；以下、ＰＡＰと略す）（Digestion, 29, 242-249, 1984）等があげられる。
【００１３】
（３）細胞溶解物
本発明の免疫測定方法は、試料に由来しない細胞溶解物、すなわち、試料に含まれる細胞溶解物とは別の細胞溶解物の共存下で、測定対象物と測定対象物に結合する抗体とを反応させる点に特徴がある。本発明の方法で、共存させる細胞溶解物には、試料中の細胞を溶解して免疫測定を行う場合の、試料に含まれる細胞溶解物は含まれない。例えば、全血を試料とし、全血中の血球を溶解させて測定を行う場合、血球の溶解物が共存することになるが、この溶解物とは別に、細胞溶解物を添加して、抗原抗体反応を行う。
【００１４】
細胞溶解物は、細胞を溶解、すなわち細胞膜を破壊して得られる細胞質を含む液体を意味し、例えば細胞を溶解した後、遠心分離を行い上清として得ることができる。細胞の溶解は、例えば前述の溶血処理により行うことができるが、界面活性剤による溶血が好ましい。界面活性剤としては、免疫測定に影響せず、細胞を溶解できるものであれば特に制限はないが、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１５】
前述の溶血処理および細胞の溶解に使用される非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン系界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等があげられるが、ポリオキシエチレン系界面活性剤が好ましい。ポリオキシエチレン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等があげられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル等があげられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばノニデットＰ−４０（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）等があげられる。
【００１６】
細胞溶解物の原料となる細胞は、動物細胞、植物細胞、微生物等いかなる細胞でもよいが、動物の細胞が好ましく、動物の株化細胞がより好ましい。なお、動物細胞には、非ヒト動物の細胞だけでなく、ヒトの細胞も含まれる。動物の株化細胞としては、ヒト血球系細胞から樹立されたＲａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨＬ６０、ヒト神経細胞から樹立されたＴ９８Ｇ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、Ｈ４、ヒト子宮癌細胞から樹立されたＨｅＬａ、サル腎臓細胞から樹立されたＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ハムスター卵巣細胞から樹立されたＣＨＯ、ハムスター腎臓細胞から樹立されたＢＨＫ２１、マウス繊維芽細胞から樹立されたＮＩＨ／３Ｔ３、ラットミエローマ細胞から樹立されたＮＳ０、イヌ腎臓細胞から樹立されたＭＤＣＫ等があげられる。
【００１７】
細胞溶解物は、本発明の免疫測定方法における、試料中の測定対象物が関わる抗原抗体反応に共存される。すなわち、細胞溶解物は、サンドイッチ法における１次反応（測定対象物に結合する第１の抗体と試料中の測定対象物との反応）、競合法における競合反応に共存される。細胞溶解物は、あらかじめ試料に添加されていてもよいが、反応液に添加されてもよい。例えば、細胞溶解物を含む試料希釈液を調製しておき、試料を検体希釈液で希釈したものを試料として使用することができる。また、細胞溶解物を含む試料希釈液には、試料中の血球を溶解させるための前述の界面活性剤が含まれていてもよい。
【００１８】
細胞溶解物の添加量は、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する濃度であれば特に制限はないが、例えば測定対象物の反応液中、細胞溶解物の蛋白質濃度として、１μｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜５０μｇ／ｍＬの量添加する。容量としては、検体の０．１〜１０％の量が好ましい。
細胞溶解物は、前述の測定対象物を含有していないものが好ましく、また、測定対象物を含有する場合は、あらかじめ、測定対象物の濃度を決定したものが好ましい。
【００１９】
（４）抗体
本発明の測定方法において使用される抗体としては、測定対象物に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、抗体のみならず、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）2、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメントも使用できる。抗体フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2が特に好ましい。
【００２０】
本発明において使用する抗体は、測定対象物またはそのエピトープに相当するペプチドを抗原として用いて通常の方法により取得することができるが、市販品としても入手可能である。
【００２１】
測定対象物がＭｘＡタンパク質である場合、ＭｘＡタンパク質に特異的に結合する抗体としては、例えば、ＷＯ ９６／０５２３０に記載された、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２９）、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３０）、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３１）がそれぞれ産生する抗ヒトＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５等があげられる。測定対象物がＰＡＰである場合、ＰＡＰに特異的に結合する抗体としては、例えば６Ｆ３Ｅ４（ＷＯ９４／１５２１８）、１６Ｆ４Ｂ８（ＷＯ９４／１５２１８）等があげられる。
【００２２】
（５）競合物質
本発明において「競合物質」とは、本発明の免疫測定法において用いる「測定対象物に結合する抗体」に結合できる物質であって、かつその結合が、測定対象物と競合的であるような物質を意味し、測定対象物そのものも含まれる。「競合物質」は、試料中の測定対象物を競合法により測定する際に使用されるものである。したがって、競合法において用いる測定対象物に結合する抗体は、測定対象物および競合物質に結合する抗体であり、測定対象物と結合して免疫複合体を生成するとともに、競合物質とも結合して免疫複合体を生成する。競合物質としては、測定対象物に結合する抗体が認識するエピトープの構造と同じ構造を有している物質が好ましく、さらに測定対象物に結合する抗体に対する結合の強さが、該抗体に対する測定対象物の結合の強さと同程度であるものが好ましい。測定対象物そのものは競合物質として好適である。
【００２３】
（６）免疫測定方法
本発明の免疫測定方法は、試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする方法である。本発明の免疫測定方法としては、例えばサンドイッチ法、競合法等があげられる。例えば、試料中の測定対象物と、以下の（ｉ）〜（iii）のいずれかとを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする免疫測定方法があげられる。（ｉ）はサンドイッチ法、(ii)および（iii）は競合法である。
（i）該測定対象物に結合する第１の抗体、および、該測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
【００２４】
具体的には、例えば、以下の態様の方法があげられる。測定方法１および２はサンドイッチ法、測定方法３〜６は試料中の測定対象物と競合物質を競合させる競合法、測定方法７は、免疫複合体と免疫複合体に含まれない標識化抗体または標識化競合物質との分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わないホモジニアス法である。
【００２５】
測定方法１
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、測定対象物に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させて、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）（ａ）の工程で生成した免疫複合体と、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、測定対象物および標識化抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体と該免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離する工程；
（ｄ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｅ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の濃度を決定する工程。
【００２６】
第１の抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。工程（ａ）と工程（ｂ）は順次行っても、同時に行ってもよい。第１の抗体と結合した測定対象物に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する測定対象物中の部位と、第２の抗体が認識する測定対象物中の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【００２７】
測定方法２
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、測定対象物に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させて、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）（ａ）の工程で生成した免疫複合体と、測定対象物に結合する第２の抗体とを反応させ、第１の抗体、測定対象物および第２の抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）（ｂ）の工程で生成した免疫複合体と、第２の抗体に結合する第３の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、標識化抗体を含む免疫複合体を生成させる工程；
（ｄ）（ｃ）の工程で生成した免疫複合体と、該免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離する工程；
（ｅ）（ｃ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および
（ｆ）（ｃ）の工程で生成した免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の量を決定する工程。
【００２８】
第１の抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。工程（ａ）〜（ｃ）は順次行っても、同時に行ってもよい。第１の抗体と結合した測定対象物に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する測定対象物中の部位と、第２の抗体が認識する測定対象物中の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【００２９】
なお、試料中の測定対象物がある特定の抗原に対する抗体である場合は、測定方法１または２において、第１の抗体の代わりに該抗原を用いることにより、該測定対象物の測定を行うこともできる。
【００３０】
測定方法３
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体、および、該抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化競合物質から分離する工程；
（ｃ）該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｄ）該抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の濃度を決定する工程。
抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。
【００３１】
測定方法４
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体および標識化抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化抗体、および、標識化抗体と測定対象物とからなる免疫複合体から分離する工程；
（ｃ）標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｄ）標識化抗体と競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物濃度を決定する工程。
【００３２】
競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、競合物質が測定対象物と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。
【００３３】
測定方法５
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の第１の抗体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体から分離する工程；
（ｃ）第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体と、第１の抗体に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｄ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体と、未反応の標識化抗体とを分離する工程；
（ｅ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｆ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物の濃度を決定する工程。
【００３４】
競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、競合物質が測定対象物と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。
【００３５】
測定方法６
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する第１の抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）第１の抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、第１の抗体と測定対象物とからなる免疫複合体と、第１の抗体に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体、および、第１の抗体、測定対象物および標識化抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体を、第１の抗体、測定対象物および標識化抗体とからなる免疫複合体、ならびに、未反応の標識化抗体から分離する工程；
（ｄ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｅ）第１の抗体、競合物質および標識化抗体からなる免疫複合体中の標識の量から、試料中の測定対象物濃度を決定する工程。
【００３６】
競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、競合物質が測定対象物と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。
【００３７】
測定方法７
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を有する測定方法。
（ａ）試料中の測定対象物と、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体を標識物質１で標識した標識化抗体１、および、測定対象物に特異的に結合する第２の抗体を標識物質１とは異なる標識物質２で標識した標識化抗体２とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させ、標識化抗体１、測定対象物および標識化抗体２からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）標識物質１と標識物質２の相互作用の変化量を測定する工程；および
（ｃ）相互作用の変化量から試料中の測定対象物の量を求める工程。
【００３８】
第１の抗体と結合した測定対象物に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する測定対象物中の部位と、第２の抗体が認識する測定対象物中の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【００３９】
上記の通り、測定方法１〜６は、Ｂ／Ｆ分離を伴う測定法（ヘテロジニアス法）である。測定方法１の工程（ｃ）、測定方法２の工程（ｄ）、測定方法３および４の工程（ｂ）、測定方法５の工程（ｂ）および（ｄ）、測定方法６の工程（ｃ）がＢ／Ｆ分離の工程である。このＢ／Ｆ分離は、抗体または競合物質が不溶性担体に固定化されている場合には、反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより容易に行うことができる。すなわち、抗原抗体反応後に反応溶液を除去し、不溶性担体を洗浄液により洗浄することにより、不溶性担体上に生成した免疫複合体と未反応の標識体（標識化抗体、標識化競合物質）とを分離することができる。洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５ ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液、ｐＨ ７．２、以下、ＰＢＳと記す）、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等をあげることができる。当該界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等があげられる。また、測定方法１または２において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されている場合には、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に不溶性担体を洗浄する工程を挿入することもできる。また、測定方法２において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されている場合には、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に不溶性担体を洗浄する工程を有することが好ましい。
【００４０】
測定方法３において、測定対象物に結合する抗体が不溶性担体に固定化されていない場合は、（ｃ）の工程で標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を添加して、免疫複合体を不溶性担体に結合させた後、反応溶液を除去し、さらに不溶性担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質とを分離することができる。また、標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で、（ａ）の工程の免疫複合体を生成させる反応を行い、免疫複合体の生成と免疫複合体の不溶性担体への固定化を同時に行った後、反応溶液を除去し、さらに不溶性担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質としては、例えば、該抗体の定常領域と結合する抗体等があげられる。また測定対象物がタンパク質でない場合は、（ｃ）の工程で、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等のタンパク質沈殿剤を添加して、免疫複合体のみを沈殿させた後、遠心分離することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。
【００４１】
測定方法１または２の方法において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されていない場合は、Ｂ／Ｆ分離の工程において、標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を添加するか、あるいは免疫複合体を生成させる工程を、標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で行い、それぞれ反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより、標識化抗体と免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離することができる。標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質としては、例えば、第１の抗体と標識化抗体の作製に用いた動物種が異なる場合には、第１の抗体の作製に用いた動物種の免疫グロブリンに対する抗体等があげられ、第１の抗体が定常領域を有する抗体で、標識化抗体がＦａｂやＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’等の定常領域を有しない抗体フラグメントである場合であれば、第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体等があげられる。
【００４２】
測定方法４〜６の方法において、競合物質が不溶性担体に固定化されていない場合は、測定対象物と競合物質が異なる構造を有する場合であれば、測定対象物に結合せず、競合物質に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を反応液中に添加するか、あるいは免疫複合体を生成させる工程を、測定対象物に結合せず、競合物質に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で行い、それぞれ反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより、競合物質を含有する免疫複合体（競合物質と標識化抗体とからなる免疫複合体、競合物質と第１の抗体とからなる免疫複合体、あるいは、競合物質、第１の抗体および標識化抗体からなる免疫複合体）のみを分離することができる。測定対象物に結合せず、競合物質に結合する結合性物質としては、例えば、測定対象物には存在せず、競合物質だけが有する部分構造と結合する抗体等があげられる。
【００４３】
これらの測定方法において、それぞれ（ａ）の工程を、（３）に記載した細胞溶解物の共存下で行うことにより、ヘモグロビンの影響を抑制することができ、より正確な測定を行うことができる。
【００４４】
（７）不溶性担体および、抗体または競合物質の不溶性担体への固定化
抗体または競合物質を固定化するための不溶性担体としては、抗体または競合物質を安定に保持できるものであればいかなるものも包含される。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等があげられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等があげられる。例えば、１枚に９６ウェルを有するポリスチレン製のマイクロタイタープレート等が好ましい。
【００４５】
抗体または競合物質の不溶性担体への固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等があげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等があげられる。例えば、ポリスチレン製免疫測定用マイクロタープレートを不溶性担体として使用する場合には、プレート内のウェルに抗体または競合物質の溶液を添加して、１時間から１日間、４℃〜３０℃でインキュベートすることにより、物理吸着させ固定化する方法をあげることができる。
【００４６】
抗体または競合物質は、直接、不溶性担体に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばアビジンを固定化した不溶性担体に、ビオチン化した抗体または競合物質を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、抗体または競合物質を不溶性担体に固定化する方法があげられる。また、不溶性担体に抗体に特異的に結合する抗体または競合物質に特異的に結合する抗体を固定化し、この抗体を介して抗体または競合物質を不溶性担体に固定化してもよい。あるいは、抗体または競合物質は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。リンカーとしては、例えば、抗体または測定対象物の官能基と不溶性担体の側鎖の官能基の両者と共有結合できる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、抗体または測定対象物が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体の側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基を同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。抗体または競合物質の官能基および不溶性担体がその表面に保持している官能基としては例えば、カルボキシ基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等があげられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン等の基があげられる。
【００４７】
（８）抗体または測定対象物の標識
抗体または測定対象物を標識する標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド等があげられる。
【００４８】
酵素としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等があげられる。
蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ−イソチオシアナート）等があげられる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質があげられる。
【００４９】
発光物質としては、例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等があげられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたものが好ましい。
放射性同位元素としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、125Ｉ、131Ｉ等があげられる。
【００５０】
タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、His His His His His His）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等があげられる。
【００５１】
抗体または測定対象物の標識化は、抗体または測定対象物と標識物質それぞれが有するの官能基の間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシ基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等があげられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。
【００５２】
リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ等のカルボジイミド化合物を用いる方法等があげられる。この場合、ＮＨＳまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
リンカーとしては、例えば、標識物質と抗体とをそれぞれの官能基を介して結合させうる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の側鎖の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子であり、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基であることが好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基があげられる。
【００５３】
放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990）記載の方法があげられる。
【００５４】
標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）にしたがって、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体および標識物質をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ等でクローニングし、それぞれのＤＮＡをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。
【００５５】
前述の（６）の測定方法７に記載のホモジニアス法に用いられる標識物質１と２としては、１つの測定対象物に結合して近接することにより相互作用を起こす標識物質があげられる。このような標識物質として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ:fluorescence resonance energy transfer）を起こす蛍光物質があげられる。ＦＲＥＴとは、第１の蛍光物質が励起光を受光することによって生じた蛍光エネルギーが、近接する第２の蛍光物質の蛍光エネルギーとして利用される現象であり、２種類の蛍光物質が１〜１０ｎｍまで近接することにより起こる。ＦＲＥＴを起こす蛍光物質の組み合わせとしては、一方の蛍光波長のスペクトルと、他方の励起波長のスペクトルとに重なりがある組合せがあげられる。蛍光物質としては、蛍光タンパク質、低分子有機蛍光色素、無機化合物等があげられる。ＦＲＥＴを起こす蛍光タンパク質の組み合わせとしては、例えばＣＦＰ［緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の黄色変異体］とＹＦＰ［緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のシアン色変異体］との組み合わせ等があげられる。低分子有機蛍光色素の組み合わせとしては、例えばＣｙ３とＣｙ５の組み合わせがあげられる。無機化合物としては例えばｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ（Science, 281,2016-2018, 1998）があげられる。
【００５６】
また、ホモジニアス法での該標識物質の組み合わせとして、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ：bioluminescence resonance energy transfer）を起こす、化学発光を生じる酵素と蛍光物質との組み合わせもあげることができる。ＢＲＥＴを起こす酵素と蛍光物質との組み合わせとしては、酵素が基質を分解して生じる発光波長のスペクトルと、蛍光物質の励起波長のスペクトルとに重なりがある組合せがあげられる。例えば酵素としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、基質として例えばディープブルーＣ［Deep Blue C、パッカードバイオサイエンス（Packard BioScience）社製］、蛍光物質としてＧＦＰを用いる組合せ等があげられる。この場合、Ｒｌｕｃによる基質の分解によって３９５ｎｍの波長の光が生じ、ＲｌｕｃにＧＦＰが近接することにより、ＧＦＰがこの光のエネルギーを受けて発する５１０ｎｍの波長の蛍光を検出することができる。
【００５７】
また、ホモジニアス法での該標識物質の組み合わせとして、標識物質１と標識物質２が近接して、ある配向性をもって結合したときに酵素活性を生じる物質の組み合わせがあげられる。例えば、標識物質の組み合わせとしては、標識物質１としてβ−ガラクトシダーゼのΔαサブユニット、標識物質２としてβ−ガラクトシダーゼのΔωサブユニットを用いる組合せ、標識物質１としてＲｌｕｃのＮ末端側ドメイン、標識物質２としてＲｌｕｃのＣ末端側ドメインを用いる組合せ等があげられる。
【００５８】
（９）反応条件
抗原抗体反応は水性媒体中で行われることが好ましい。反応温度としては、例えば０〜５０℃があげられ、４℃〜４０℃が好ましい。反応時間としては、５分間〜２０時間が好ましい。
【００５９】
（１０）標識の量の測定
免疫複合体の標識の量の測定方法は、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により測定することができる。
【００６０】
標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法等によりペルオキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等があげられる。
【００６１】
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等があげられる。
【００６２】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００６３】
蛍光法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等があげられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等があげられる。
【００６４】
発光法によるペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等があげられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等があげられる。
酵素がアルカリフォスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリフォスファターゼ量を測定することができる。発光法によりアルカリフォスファターゼ量を測定する方法としては、例えばアルカリフォスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。アルカリフォスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］カン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５）等があげられる。
【００６５】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法等によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばｏ−ニトロフェル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］またはその類似化合物等があげられる。蛍光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。
【００６６】
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ量を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ量を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等があげられる。
【００６７】
標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の場合は、当該標識物質に特異的に結合する物質を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識体と、免疫複合体中の標識化抗体または標識化競合物質を構成している当該標識物質とを結合させ、当該標識物質に特異的に結合する物質を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うことができる。標識物質に特異的に結合する物質としては、標識物質を特異的に結合する抗体、また標識物質がビオチンの場合は、アビジンやストレプトアビジン等があげられる。また、標識物質に特異的に結合する物質（標識物質に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジン等）は非標識のものを用いて、免疫複合体中の標識物質と結合させた後、標識物質に特異的に結合する物質に結合する抗体、例えば、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素で標識したものを結合させ、これらの抗体を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うこともできる。
【００６８】
これらの検出に用いる抗体、アビジンまたはストレプトアビジンや標識物質に特異的に結合する抗体、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、あるいはＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）2、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメントでもよい。
【００６９】
（１１）測定対象物の定量
測定対象物を定量するためには、標準物質、すなわち既知の濃度の測定対象物の溶液を用いる。好ましくは、既知濃度の測定対象物溶液を複数用いる。この既知濃度の測定対象物溶液を測定用試料として、実際の試料の測定と同じ方法により測定を行い、測定対象物濃度と測定値（標識由来の情報量）との間の関係を示す検量線を作成する。次いで、試料の測定により得られる測定値を先に作成した検量線に当てはめることにより、試料中の測定対象物の濃度を決定することができる。
【００７０】
（１２）水性媒体およびその他の共存物
本発明の免疫測定方法において、測定対象物の抗原抗体反応を行うための水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
【００７１】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等があげられる。
【００７２】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
本発明の免疫学的定量方法においては、測定対象物の抗原抗体反応に、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤等を共存させることができる。
【００７３】
金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等があげられる。
塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等があげられる。
糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等があげられる。
界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられ、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばツイーン２０、ノニデットＰ−４０等があげられる。 防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等があげられる。
【００７４】
タンパク質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等があげられる。
タンパク質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等があげられる。
【００７５】
（１３）免疫測定試薬
本発明の免疫測定試薬は、試料中の測定対象物をヘモグロビンの影響を抑制して免疫測定するための免疫測定試薬であり、上記（３）に記載した細胞溶解物を含有することを特徴とする。本発明の免疫測定試薬としては、例えば（３）に記載した細胞溶解物にさらに、（ｉ）〜（iii）のいずれかを含有する免疫測定試薬があげられる。
（ｉ）測定対象物に結合する第１の抗体、および、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体。
【００７６】
本発明の免疫測定試薬は、本発明の免疫測定方法に使用され得る。本発明の免疫測定試薬において使用される、細胞溶解物、測定対象物に結合する抗体、競合物質、測定対象物に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、標識化競合物質としては、例えば、それぞれ、前述の細胞溶解物、測定対象物に結合する抗体、競合物質、測定対象物に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、標識化競合物質をあげることができる。また、本発明の免疫測定試薬は、必要に応じて、前述の金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤等を含有する。
【００７７】
さらに、（１）に記載した試料中の血球を溶解させるための界面活性剤等の試薬、（１２）に記載した反応の水性媒体および共存物、（６）に記載した洗浄液、（１０）に記載した標識の量の測定に用いる試薬、および（１１）に記載した標準物質をそれぞれ含んでもよい。細胞溶解物、（１２）に記載した反応の水性媒体および共存物は、それぞれ別々の試薬としてもよいが、細胞溶解物と共存物を含む水性媒体を検体希釈液としてもよい。
【００７８】
また、上記（３）に記載した細胞溶解物を含有する試薬は、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬とすることができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
ＭｘＡタンパク質のサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定および細胞溶解物によるヘモグロビンの影響の抑制
［１］抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体の調製
以下のようにして、エピトープの異なる２種類の抗ヒトＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４（ＷＯ９６／０５２３０）およびＫＭ１１３５（ＷＯ９６／０５２３０）を調製した。なお、ＫＭ１１２４は、ヒトＭｘＡタンパク質のアミノ末端から２２０〜２９７残基中に存在するエピトープ、ＫＭ１１３５はヒトＭｘＡタンパク質のアミノ末端から１０〜２２０残基中に存在するエピトープとそれぞれ結合するマウスモノクローナル抗体である。
【００８０】
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb／c）に、モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２９）およびモノクローナル抗体ＫＭ１１３５を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３１）をそれぞれ５〜２０×１０6細胞／匹ずつ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマ株が腹水癌化し、腹水のたまったマウスから腹水を採取した。採取した腹水を３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して固形分を除去し、上清を回収した。この上清から、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）により精製したモノクローナル抗体を、ＭｘＡタンパク質の免疫測定方法に用いた。
【００８１】
［２］リコンビナントＭｘＡタンパク質の調製
ヒトＭｘＡタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ベクターｐＥＴ−１４ｂ［ノバジェン（Novagen）、ＥＭＤバイオサイエンシズ（EMD Biosciences）社製］のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入して作製したヒトＭｘＡタンパク質発現ベクターｐＥＴ１４ｂ−ＭｘＡ（Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004）でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。この形質転換体は、Ｎ末端にＨｉｓタグが付加したＭｘＡタンパク質を発現する。
【００８２】
得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）が０．５になるまで３７℃で振とう培養した。この培養液をアンピシリンを含むＬＢ培地２５０ｍＬに植菌し、６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５になるまで３７℃で振とう培養した。ここに、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、さらに３７℃で２時間振とう培養して培養を終了した。培養液を４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を回収した。菌体はＭｘＡタンパク質の調製まで−８０℃で保存した。
【００８３】
ＭｘＡタンパク質は菌体内に不溶体（inclusion body）の状態で存在していたので、菌体を氷上で融解させ、氷冷した結合緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）２０ｍＬを添加し、懸濁させた。菌体懸濁液に３０秒ずつ５回の超音波処理をして菌体を破砕した後、４℃で４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に氷冷した結合緩衝液２０ｍＬを添加して懸濁させ、再び同様に超音波処理と遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む結合緩衝液２０ｍＬを添加し、懸濁させた。同様に超音波処理を行った後、氷上で３０分間静置して不溶体を溶解させ、４℃で１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上清を回収して０．４５ｎｍミリポアフィルターでろ過した。
【００８４】
得られた溶液にＮｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄレジン（ノバジェン、ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）０．５ｍＬを添加し、４℃で２時間回転させながら混和させ、Ｈｉｓタグを介してレジンにＭｘＡタンパク質を結合させた。４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。レジンに氷冷した６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む結合緩衝液１０ｍＬを添加した後、４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。この洗浄操作を再度繰り返した後、さらにレジンに氷冷した洗浄緩衝液（６ｍｏｌ／Ｌ尿素、６０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）１０ｍＬを添加し、４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。
【００８５】
レジンに氷冷した溶出緩衝液（６ｍｏｌ／Ｌ尿素、１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）１０ｍＬを添加し、４℃で２時間回転させながら混和させ、レジンからＭｘＡタンパク質を溶出させた。４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を回収し、ＭｘＡタンパク質の測定において、標準となるＭｘＡタンパク質溶液として使用した。
【００８６】
［３］抗ＭｘＡタンパク質抗体固相化プレートの調製
［１］で調製した抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５を５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート［ナルジェンヌンクインターナショナル（Nalge Nunc International）社製］に５０μＬ／ウェルの量で分注した。一晩放置後、上清を吸引除去し、２５％ブロックエース（大日本製薬社製）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．２リン酸緩衝液２００μＬを分注し室温で２時間静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、ＰＢＳで洗浄した。真空乾燥機で一晩乾燥したものを、抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体固相化プレートとして使用した。
【００８７】
［４］ペルオキシダーゼ標識抗ＭｘＡタンパク質抗体の調製
［１］で調製した抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を以下のようにしてマレイミド法でペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）と結合させ、ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体を作製した。
【００８８】
まず、ＫＭ１１２４ ２ｍｇを含む溶液の溶媒を０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に置換し、０．０８６ｍｇの２−イミノチオラン塩酸塩［ピアース（Pierce）社製］を添加し、攪拌後、３０℃で３０分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ２５（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ）を用いて、反応溶液中の未反応の２−イミノチオランを除去し、スルフヒドリル化したＫＭ１１２４を回収した。
【００８９】
一方、ＫＭ１１２４に対しモル比で５倍量にあたるＰＯＤ（東洋紡績社製、ペルオキシダーゼＩ−Ｃ）２．５ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬに溶解させた。この溶液を３０℃で５分間加温した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に溶解させた０．７２ｍｇのＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所社製）を加えて攪拌し、３０℃で３０分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ２５カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応のＥＭＣＳを除去し、マレイミド化したＰＯＤを回収した。
【００９０】
上記で得られたスルフヒドリル化したＫＭ１１２４の溶液とマレイミド化したＰＯＤの溶液を混合し、３０℃で１時間反応させた。反応後、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００（ファルマシア製）カラム（直径３ｃｍ×６０ｃｍ）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応のＰＯＤを除去すると共に、標識化抗体を精製した。ゲルろ過の各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）および４０３ｎｍでの吸光度（Ａ４０３）を測定し、Ａ２８０からＫＭ１１２４のモル数、Ａ４０３からＰＯＤのモル数を計算し、ＰＯＤのモル数／ＫＭ１１２４のモル数が１．５以上のフラクションを、標識化抗体を含むフラクションとして回収した。得られた標識化抗体はＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２００倍に希釈し使用した。
【００９１】
［５］サンドイッチＥＬＩＳＡによるＭｘＡタンパク質測定系の構築
前記［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ（インタージェン（InterGen）社製）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２］で希釈し、ＭｘＡタンパク質の０（緩衝液のみ）、３．２、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の溶液を調製し、測定試料とした。
【００９２】
前記［３］で作製した抗ＭｘＡタンパク質抗体（ＫＭ１１３５）固定化プレートに１００μＬの測定試料を添加し、室温で１時間インキュベートし、抗体に測定試料中のＭｘＡタンパク質を結合させた。測定試料を除去した後、洗浄液［０．０５％ツイーン２０（関東化学社製）を含むＰＢＳ］を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。次いで、［４］で作製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡタンパク質抗体（ＫＭ１１２４）を１００μＬ添加して室温で３０分間反応させた。標識化抗体を除去し、洗浄液を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。暗所で、０．０５％テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含むＰＯＤの発色基質ＴＭＢｌｕｅ［セロロジカル（Serological）社製］を１００μＬ添加し、室温で１０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ添加して室温で１０分間インキュベーションして反応を停止させた。波長４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。その結果、測定試料中のＭｘＡタンパク質の濃度の上昇にしたがって、吸光度の上昇が見られ、高感度にＭｘＡタンパク質の測定ができることが示された。
【００９３】
［６］細胞溶解物の調製
浮遊性のヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞（Lancet, 39, 238-240, 1964、大日本製薬株式会社製）を、１０％非働化ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ［インビトロジェン（Invitrogen）社製］、０．１％ゲンタマイシン（インビトロジェン社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地［シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）社製］１０ｍＬで、１×１０6細胞／ｍＬになるよう懸濁させた。細胞懸濁液を２５ｃｍ2Ｔフラスコに全量移し、炭酸ガス培養装置（５％ＣＯ2）で、３７℃で２〜３日浮遊培養した。その後、１５０ｃｍ2Ｔフラスコ、２２５ｃｍ2Ｔフラスコへと順次拡大培養を行った。２２５ｃｍ2Ｔフラスコ内で細胞がコンフルエントになったところで、細胞を含む培養液を滅菌された容器に回収し、２５℃で１４００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞数１０7個／ｍＬになるように低張緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）で懸濁して回収し、凍結保存した。
【００９４】
上記で得られた１０7個／ｍＬの培養細胞を含む溶液を５％の濃度で細胞溶解用緩衝液（１％ノニデットＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に添加して、３０分間インキュベートをして、細胞を溶解させた後に、室温で１４００ｒｐｍ、５分間遠心分離して、不溶解成分を沈殿させ上清を回収し、細胞溶解物を得た。
得られた細胞溶解物中のタンパク質含量を、ブラッドフォード法によるプロテインアッセイキット［バイオラッド（Bio-Rad）社製］を用いて測定した。タンパク質含量は１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを標準とし段階的希釈を行い、得られる吸光度とタンパク質濃度をプロットし、検量線を作成し、これを用いて濃度換算を行った。溶液は、−８０℃で保管した。
【００９５】
［７］細胞溶解物によるＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制
前記［６］で調製したＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を０、０．６３、１．２５、２．５、５％の各濃度（蛋白質濃度として、それぞれ０、４．３、９．３、１７．９、３５．８μｇ／ｍＬに相当した）で含む緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を調製し、検体希釈液とした。
【００９６】
ＭｘＡタンパク質陰性健常者１０名の血液に、４倍の容量のＰＢＳを添加して、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を除いた。沈殿の血球に４倍の容量のＰＢＳを添加して懸濁し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を除く洗浄操作を３回繰り返した。得られた洗浄血球を−３０℃で凍結した後、融解し、さらに蒸留水を添加して赤血球をバーストさせた。得られた溶液のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビン測定キットＨｂテストワコー（和光純薬工業社製）で測定し、蒸留水でヘモグロビン濃度を６０ｍｇ／ｍＬに調整したものをヘモグロビン溶液とした。
【００９７】
各濃度の細胞溶解物を含む検体希釈液にヘモグロビン溶液をヘモグロビン濃度が３０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬになるように添加した各溶液、およびヘモグロビン溶液を添加しない各検体希釈液で、［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を５０ｎｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したものを測定試料とし、［５］と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、吸光度を測定した。
【００９８】
ヘモグロビン溶液を添加した各測定試料の吸光度の値を、ヘモグロビン溶液を添加しない測定試料の吸光度の値と比較してヘモグロビンの影響を調べた。その結果、図１に示すように、ヘモグロビン溶液を添加した測定試料では、ヘモグロビン溶液を添加しない測定試料と比較して、ヘモグロビンの濃度が増えるにつれて、測定値の低下がみられ、ヘモグロビンは測定値を低下させる影響を与えることが示された。測定試料に細胞溶解物を添加しない場合と比較して、細胞溶解物を添加した測定試料では、添加した細胞溶解物の濃度が増加するにつれて、ヘモグロビンによる測定値の低下が抑制されており、細胞溶解物を添加することで、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【実施例２】
【００９９】
Ｔ９８Ｇ細胞の細胞溶解物によるヘモグロビンの影響の抑制
［１］Ｔ９８Ｇ細胞の細胞溶解物の調製
接着性のヒトグリア芽細胞種由来の細胞株Ｔ９８Ｇ（大日本製薬株式会社より購入、J. Cell. Physiol., 99, 43-54, 1979）を、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）、１ｍｍｏｌ／ｍＬピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地「ダイゴ」（日本製薬株式会社製）１０ｍＬを添加した細胞培養用の６ｃｍシャーレ内で、コンフルエントになるまで、炭酸ガス培養装置（５％ＣＯ２、３７℃）を用いて２〜３日間培養した。細胞がコンフルエントになったところで、細胞を１５ｃｍシャーレに移して同様に培養を行った。１５ｃｍシャーレ内で細胞がコンフルエントになったところで、培地を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄し、０．０２％ＥＤＴＡで洗浄した。細胞を０．２５％トリプシン溶液を添加して細胞をシャーレからはがした後、２５℃５分間遠心分離（１４００ｒｐｍ）した。上清を除去し、低張緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）を添加して細胞を懸濁し溶液を回収した。
【０１００】
上記で得られた培養細胞を含む溶液を５％の濃度で細胞溶解用緩衝液（１％ノニデットＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に添加して、３０分間インキュベートをして、細胞を溶解させた後に、室温で１４００ｒｐｍ、５分間遠心分離して、不溶解成分を沈殿させ上清を回収し、細胞溶解物として用いた。実施例１［６］と同様にして、細胞溶解物の蛋白質濃度を測定し、−８０℃で保管した。
【０１０１】
［２］Ｔ９８Ｇ細胞の細胞溶解物によるＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制
［１］で調製したＴ９８Ｇ細胞の細胞溶解物をタンパク質濃度０．２、０．４、０．７、１．４ｍｇ／ｍＬになるように、緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に添加したもの、および細胞溶解物を添加しない緩衝液を、検体希釈液とした。これらの検体希釈液に、実施例１［７］で調製した６０ｍｇ／ｍＬヘモグロビン溶液をヘモグロビン濃度が３．７５、７．５、１５、３０ｍｇ／ｍＬになるように添加した各溶液、およびヘモグロビン溶液を添加しない各検体希釈液で、実施例１［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を濃度になるように希釈したものを測定試料とし、実施例１［５］と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、吸光度を測定した。
【０１０２】
ヘモグロビン溶液を添加した各測定試料の吸光度の値を、ヘモグロビン溶液を添加しない測定試料の吸光度の値と比較してヘモグロビンの影響を調べた。図２に示すように、実施例１［７］と同様に、ヘモグロビンは測定値を低下させる影響を与えることが示された。実施例１［７］のＲａｊｉ細胞の細胞溶解物と同様に、測定試料にＴ９８Ｇの細胞溶解物を添加しない場合と比較して、Ｔ９８Ｇの細胞溶解物を添加した測定試料では、添加した細胞溶解物の濃度が増加するにつれて、ヘモグロビンによる測定値の低下が抑制されており、細胞の種類に関わらず、細胞溶解物を添加することで、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【実施例３】
【０１０３】
全血中のＭｘＡタンパク質の測定
健常者４例の血液を採取し、それぞれの血液を二つに分け、それぞれに血液と等量の１０％非働化ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、０．１％ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、一方はインターフェロンαを１０００Ｕ／ｍＬの濃度で添加し２４時間培養することにより白血球でのＭｘＡタンパク質の発現を誘発し、他方はインターフェロンαを添加せずに２４時間培養した。培養後の全血試料に４倍の容量の、血球溶解用緩衝液［１％ノニデットＰ４０を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）］を添加して試料中の血球を溶解させ、血球内のＭｘＡタンパク質を溶液中に放出させ、さらに、検体希釈液［実施例１［６］で調製したＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を５％の濃度で含む緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）］で２倍に希釈したものを測定試料とした。測定試料中のＭｘＡタンパク質を実施例１［５］と同様にして測定を行った。
【０１０４】
実施例１［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を、検体希釈液で希釈し、０（検体希釈液のみ）、３．２、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の溶液を調製し、同様に測定を行い、ＭｘＡタンパク質濃度および吸光度をプロットして検量線を作成した。検量線に基づいて、測定試料の吸光度から測定試料中のＭｘＡタンパク質濃度を求め、さらに希釈率［検体希釈液による希釈（２倍）×血球溶解用緩衝液による希釈（５倍）＝１０倍］を乗じて全血試料中のＭｘＡタンパク質濃度を定量した。図３に定量結果を示した。図３に示すように、インターフェロンαで刺激した健常人血液に含まれるＭｘＡタンパク質は１１７．１〜１７１．６ｎｇ／ｍＬ、インターフェロンα刺激しない健常人血液に含まれるＭｘＡタンパク質は０．８〜９．４ｎｇ／ｍＬと決定された。
【実施例４】
【０１０５】
全血検体の希釈試験
実施例３の方法に従って、ＭｘＡタンパク質陽性の臨床検体の希釈試験を行った。
ＭｘＡタンパク質陽性全血検体に、４倍の容量の血球溶解用緩衝液を添加して試料中の血球を溶解させ、血球内のＭｘＡタンパク質を溶液中に放出させた。これを２つに分け、一方はＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を５％の濃度で含む検体希釈液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で、もう一方は細胞溶解物を含まない検体希釈液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で、それぞれ２倍に希釈したものを測定試料として用いた。細胞溶解物を含む検体希釈液で希釈した試料をさらに、同じ細胞溶解物を含む検体希釈液で４／５、３／５、２／５、１／５と段階的に希釈した。他方の細胞溶解物を含まない検体希釈液で希釈した測定試料も、さらに同じ細胞溶解物を含まない検体希釈液で４／５、３／５、２／５、１／５と段階的に希釈した。段階的に希釈する前の測定試料および段階的に希釈した測定試料それぞれについて、実施例１［５］と同様にしてＭｘＡタンパク質の測定を行い、実施例３と同様にして作成した検量線に基づいてＭｘＡタンパク質の定量を行った。図４に細胞溶解物を含む検体希釈液で希釈した場合の測定結果、図５に細胞溶解物を含まない検体希釈液で希釈した場合の測定結果を、実際の測定値と理論値（段階的な希釈前の測定試料（５／５）の測定値に希釈率を乗じて求められる値）で示した。第１表に各試料のＭｘＡタンパク質濃度の理論値に対する実際の測定値の比（％）を示した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
図４、図５および第１表からわかるように、細胞溶解物を含まない検体希釈液による希釈では、希釈が進むにつれて理論値と測定値の乖離率が上昇し、希釈率１／５では乖離率＋２０％以上となった。これは、希釈率５／５の状態では、試料中のヘモグロビンにより測定が阻害されており、試料の希釈によりその阻害が弱まったためと考えられた。これに対し、細胞溶解物を含む検体希釈液では希釈直線性は良好で、乖離率±５％以内であり、細胞溶解物の共存下で測定を行うことにより、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【実施例５】
【０１０８】
ＭｘＡタンパク質測定キット
下記の各試薬からなるＭｘＡタンパク質の酵素免疫測定用の試薬キットを作製した。
（ａ）抗ＭｘＡタンパク質抗体固定化プレート １枚
実施例１［３］に記載の方法にしたがって、５μｇ／ｍＬの抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．５）を、５０μＬ／ウェルの量で分注して固定化後、２５％ブロックエースでブロッキングし、乾燥させた、９６ウェルマイクロタイタープレート。
（ｂ）血球溶解用緩衝液
組成：１％ノニデットＰ４０を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．２）
容量：１０ｍＬ／ボトル
（ｃ）検体希釈液
組成：５％ Ｒａｊｉ細胞の細胞溶解物（実施例１［２］に記載の方法に従って調製したもの）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
容量：３０ｍＬ／ボトル
（ｄ）標識抗ＭｘＡタンパク質抗体
実施例１［４］に記載の方法にしたがって調製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡタンパク質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４。測定時に標識化抗体希釈液で希釈して使用。
（ｅ）標識化抗体希釈液
組成：ＰＢＳ（ｐＨ７．５）
容量：１１ｍＬ／ボトル
（ｆ）発色基質液
組成：ＴＭＢｌｕｅ（セロロジカル社製）
容量：１１ｍＬ／ボトル
（ｇ）反応停止液
組成：０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸
容量：１１ｍＬ／ボトル
（ｈ）洗浄液原液
組成：０．５％ツイーン２０、１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
容量：１００ｍＬ／ボトル
使用時に蒸留水で１０倍に希釈して使用する。
（ｉ）標準物質
実施例１［２］で調製したＭｘＡタンパク質溶液を、緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２］で１μｇ／ｍＬに調製した溶液
【実施例６】
【０１０９】
ＰＡＰ測定における細胞溶解物によるヘモグロビンの影響の抑制
ＰＡＰの測定に対するヘモグロビンの影響を、細胞溶解物で抑制できるかどうかを、ＰＡＰのＥＬＩＳＡキットであるＰＡＰ測定キット［ディナビオ（Dynabio）社製］を用いて検討した。
実施例１［６］で調製したＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を蛋白質濃度０（検体希釈液のみ）、１７．９、３５．８μｇ／ｍＬになるよう、ＰＡＰ測定キットに含まれる検体希釈液に添加した。ついで、これらの検体希釈液に実施例１［７］で調製したヘモグロビン溶液をヘモグロビン濃度０．４６９、０．９３８、１．８８、３．７５、７．５、１５ｍｇ/ｍＬになるよう添加した。これらのヘモグロビン溶液を添加した各検体希釈液およびヘモグロビン溶液を添加しない検体希釈液それぞれに、ＰＡＰ測定キットに含まれるリコンビナント膵ＰＡＰ抗原を１ｎｇ／ｍＬになるように添加したものを測定試料とし、ＰＡＰ測定キットを用いて、測定試料中のＰＡＰの測定をおこなった。測定方法は、キットに添付されたマニュアルに従い、以下のように行った。
【０１１０】
キットの抗ＰＡＰ抗体固定化９６ウェルプレートのウェルに各測定試料および標準物質溶液をそれぞれ１００μＬ添加し、室温で３時間インキュベートして、抗体に試料中のＰＡＰを結合させた。ウェルの溶液を除去した後、洗浄液を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。次いで、ウェルにビオチン標識抗ＰＡＰ抗体を添加して、室温で３０分間インキュベーションした。ウェルの溶液を除去し、上記と同様に５回洗浄した。ウェルにアビジン−ＰＯＤ溶液を１００μＬ添加し、室温で１５分間インキュベーションした。ウェルの溶液を除去し、上記と同様に５回洗浄した。キットのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）溶液と過酸化水素溶液を混合して発色試薬を調製し、ウェルに１００μＬ添加した。暗所で１０〜１５分間インキュベーションした後、キットのオルトリン酸溶液を１００μＬ添加して発色反応を停止させた。波長４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。結果を図６に示した。
【０１１１】
実施例１のＭｘＡタンパク質のＥＬＩＳＡと同様に、ＰＡＰ測定においても、ヘモグロビンの濃度が増えるにつれて、測定値の低下がみられ、ヘモグロビンは測定値を低下させる影響を与えることが示された。測定試料に細胞溶解液を添加しない場合と比較して、細胞溶解液を添加した測定試料では、ヘモグロビンによる測定値の低下が抑制されており、ＰＡＰの免疫測定においても、細胞溶解液を添加することで、ヘモグロビンの影響を抑制できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により、臨床診断において有用な、ヘモグロビンの影響が抑制された、試料中の測定対象物の測定方法が提供される。該測定方法により、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象物を正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】各蛋白質濃度のＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を添加した場合の、ＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制を示す。横軸はヘモグロビン添加濃度、縦軸はヘモグロビンを添加しない場合に対する吸光度の影響率を表す。
【図２】各蛋白質濃度のＴ９８Ｇ細胞の細胞溶解物を添加した場合の、ＭｘＡタンパク質測定におけるヘモグロビンの影響の抑制を示す。横軸はヘモグロビン添加濃度、縦軸はヘモグロビンを添加しない場合に対する吸光度の影響率を表す。
【図３】４種類の全血の検体に対し、インターフェロンαで刺激した場合としなかった場合それぞれのＭｘＡタンパク質の濃度を測定した結果を示す。
【図４】ＭｘＡタンパク質陽性の全血の検体を、細胞溶解物を含む検体希釈液で希釈した場合のＭｘＡタンパク質の測定結果を示す。
【図５】ＭｘＡタンパク質陽性の全血の検体を細胞溶解物を含まない検体希釈液で希釈した場合のＭｘＡタンパクの測定結果を示す。
【図６】各蛋白質濃度のＲａｊｉ細胞の細胞溶解物を添加した場合の、ＰＡＰ測定におけるヘモグロビンの影響の抑制を示す。横軸はヘモグロビン添加濃度、縦軸はヘモグロビンを添加しない場合に対する吸光度の影響率を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
【請求項２】
免疫測定方法が、サンドイッチ法または競合法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の測定対象物と（ｉ）〜（iii）のいずれかとを、試料に 由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
（i）該測定対象物に結合する第１の抗体、および、該測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
【請求項４】
試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する方法。
【請求項５】
試料が、全血である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
全血が、血球を溶解させた全血である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血球を溶解させた全血が、血球を界面活性剤により溶解させた全血である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
動物細胞が、動物の株化細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物と該測定対象物に結合する抗体との反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬。
【請求項１３】
細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物の免疫測定試薬。
【請求項１４】
さらに、（ｉ）〜（iii）のいずれかを含有する請求項１３に記載の免疫測定試薬。
（ｉ）測定対象物に結合する第１の抗体、および、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体。
【請求項１５】
さらに、試料中の血球を溶解させるための試薬を含有する請求項１３または１４に記載の免疫測定試薬。
【請求項１６】
血球を溶解させるための試薬が、界面活性剤である請求項１５に記載の免疫測定試薬。
【請求項１７】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である請求項１６に記載の免疫測定試薬。
【請求項１８】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系界面活性剤である請求項１７に記載の免疫測定試薬。
【請求項１９】
ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである請求項１８に記載の免疫測定試薬。
【請求項２０】
細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である請求項１２〜１９のいずれかに記載の試薬。
【請求項２１】
動物細胞が、動物の株化細胞である請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である請求項２１に記載の試薬。
【請求項２３】
測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである請求項１２〜２２のいずれかに記載の試薬。
【請求項１】
試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを、試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
【請求項２】
免疫測定方法が、サンドイッチ法または競合法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の測定対象物と（ｉ）〜（iii）のいずれかとを、試料に 由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫測定方法。
（i）該測定対象物に結合する第１の抗体、および、該測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、該測定対象物および競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
【請求項４】
試料中の測定対象物と該測定対象物に結合する抗体とを試料に由来しない細胞溶解物の共存下で反応させることを特徴とする、測定対象物の免疫反応に及ぼすヘモグロビンの影響を抑制する方法。
【請求項５】
試料が、全血である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
全血が、血球を溶解させた全血である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血球を溶解させた全血が、血球を界面活性剤により溶解させた全血である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
動物細胞が、動物の株化細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物と該測定対象物に結合する抗体との反応に及ぼすヘモグロビンの影響の抑制試薬。
【請求項１３】
細胞溶解物を含有することを特徴とする、測定対象物の免疫測定試薬。
【請求項１４】
さらに、（ｉ）〜（iii）のいずれかを含有する請求項１３に記載の免疫測定試薬。
（ｉ）測定対象物に結合する第１の抗体、および、測定対象物に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体、
（ii）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体、
（iii）競合物質、ならびに、測定対象物および競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体。
【請求項１５】
さらに、試料中の血球を溶解させるための試薬を含有する請求項１３または１４に記載の免疫測定試薬。
【請求項１６】
血球を溶解させるための試薬が、界面活性剤である請求項１５に記載の免疫測定試薬。
【請求項１７】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である請求項１６に記載の免疫測定試薬。
【請求項１８】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系界面活性剤である請求項１７に記載の免疫測定試薬。
【請求項１９】
ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである請求項１８に記載の免疫測定試薬。
【請求項２０】
細胞溶解物が、動物細胞の細胞溶解物である請求項１２〜１９のいずれかに記載の試薬。
【請求項２１】
動物細胞が、動物の株化細胞である請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
動物の株化細胞が、Ｒａｊｉ細胞またはＴ９８Ｇ細胞である請求項２１に記載の試薬。
【請求項２３】
測定対象物が、ＭｘＡタンパク質またはパンクレアティティス・アソシエーテド・プロテインである請求項１２〜２２のいずれかに記載の試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−２２５６０３（Ｐ２００７−２２５６０３Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２４９７（Ｐ２００７−１２４９７）
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
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