試料分析方法
【課題】試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、より明確に弁別し、計数することができる試料測定方法を提供する。
【解決手段】カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程と前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程と、及び、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程を含む、試料分析方法。
【解決手段】カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程と前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程と、及び、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程を含む、試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された試料中の血球を分析するための試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野において、試料中の血球成分の分析は、被験者の循環器等における様々な疾患を診断する上で非常に有用である。疾患によっては、特定の血球数が増加又は減少したり、通常では存在しない血液細胞が末梢血に出現したりすることがある。
近年、フローサイトメトリの原理を応用した種々の自動血球計数装置が市販されている。これらの自動血球計数装置を用いると、試料中の血球の分類・計数を自動で行うことができる。
【０００３】
白血球は、通常、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種類に分類される。このうち好塩基球は、通常、血液試料に含まれる数が少ない。そのため、一度の測定で白血球を５種類に分類する方法で好塩基球を測定するよりも、血液試料に好塩基球測定専用の処理を行って好塩基球を測定する方が、より正確に分類を行うことができる。好塩基球には、酸性条件下では他の白血球に比べて破壊されにくいといった特性がある。特許文献１及び特許文献２には、その特性を利用した好塩基球測定専用の処理を行うことにより、好塩基球を他の白血球から弁別することが記載されている。
【０００４】
なお、白血球の測定において、しばしば問題になるのは有核赤血球の出現である。有核赤血球は、核を有する。このため、白血球の測定において赤血球を溶解する処理を行っても有核赤血球の核が残存し、それが白血球に近い信号を示し、これが白血球数の測定時にプラスの誤差を与える。この影響を排除するには、血液試料に有核赤血球測定専用の処理を行って有核赤血球数の測定を行い、別の方法で該血液試料の白血球数を測定し、得られた白血球数から有核赤血球を差し引くことで正確な白血球数を得ることができる。特許文献３には、血液試料に有核赤血球測定専用の処理を行うことにより、有核赤血球を白血球から弁別することが記載されている。
【０００５】
しかしながら、好塩基球や有核赤血球の分類を行うために、特許文献１〜３に記載されているような各々の血球専用の処理が必要になると、手間がかかる上に、装置が複雑化或いは大型化するおそれがある。また、各々の血球測定専用試薬を複数使用することにより、血液検査全体のコストが高くなる。このような観点から、血球専用の処理はできるだけ少ない方が好ましい。
【０００６】
ところで、好塩基球も有核赤血球も、血液試料を酸性条件下で処理することによって測定を行うことができる。従って、血液試料を酸性条件下で処理すれば、一回の測定で好塩基球と有核赤血球の両方を測定できる可能性がある。このような試みの１つとして、特許文献４には、白血球及び異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤とを含む水溶液を試料と混合し、蛍光色素を含む染色液を加えて染色し、フローサイトメータで測定して蛍光強度及び散乱光強度を測定することにより、好塩基球及び赤芽球（有核赤血球）を測定できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６１−８８８９６号公報
【特許文献２】特開平７−２９４５１８号公報
【特許文献３】特開平１０−３３９７２９号公報
【特許文献４】特開２００２−１４８２６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献４に記載の方法では、採血後時間が経過した試料などでは、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分離がよくないことがある。
本発明の目的は、試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、より明確に弁別し、計数することができる試料測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程と、染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程と、該散乱光情報及び該蛍光情報に基づいて、上記の試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程とを含む、試料分析方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、採血後時間が経過した試料であっても、有核赤血球と好塩基球を他の血球からより明確に弁別し、計数することが可能になり、疾患の検査・診断をより正確に行うことが可能になる。本発明では、一度の測定で有核赤血球と好塩基球を計数できるが、検査目的によっては、有核赤血球と好塩基球の何れか一方のみを測定すればよい場合もある。そのような場合でも、何れか一方のみを測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの模式図を示す。
【図２】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの模式図を示す。
【図３】実施例１の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図４】実施例１の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図５】実施例２の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図６】実施例２の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図７】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図８】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図９】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１０】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１１】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１２】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１３】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１４】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１５】実施例５の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１６】実施例５の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１７】実施例５の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１８】実施例６の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１９】実施例６の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２０】実施例６の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２１】実施例７の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２２】実施例７の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２３】実施例８の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２４】本発明の試薬キットの一例を示した図である。第１試薬はB、第２試薬はAである。
【図２５】実施例９の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの一例を示す。
【図２６】実施例９の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの一例を示す。
【図２７】実施例９の試料分析用試薬を用いて試料を分析した結果と、従来の試料分析方法により試料を分析した結果との相関関係を示すグラフである。（Ａ）全白血球数の相関関係；（Ｂ）好塩基球比率の相関関係；（Ｃ）有核赤血球比率の相関関係。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好塩基球は、塩基性色素により染色される大型の酸性顆粒を有する白血球の一種である。また、有核赤血球は、一般的に赤芽球とも呼ばれ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球及び正染性赤芽球を含む。
本明細書において、「試料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取された血液、骨髄液、尿、アフェレーシスなどで採取した試料などの体液試料をいう。
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬と核酸を染色可能な蛍光色素を含む第２試薬を用いることにより、有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、より明確に弁別することが可能であることを見出した。
【００１４】
本発明の一実施形態である試料分析用試薬キットは、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬と、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬とを含む試薬キットである。カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬で試料を処理することにより、試料中の赤血球を溶血させ、白血球及び有核赤血球の細胞膜に蛍光色素が通過できる程度の損傷を与えることができる。これにより、好塩基球以外の白血球及び有核赤血球は、細胞膜に損傷を受け、収縮又は裸核化する。一方、好塩基球は細胞膜に損傷を受けるものの、好塩基球以外の白血球及び有核赤血球に比べて損傷の程度が軽い。ゆえに、好塩基球は、好塩基球以外の白血球及び有核赤血球と比べて収縮の度合いが小さいと考えられる。ゆえに、細胞の大きさや形態の差から、好塩基球と、好塩基球以外の白血球や有核赤血球とを弁別することができる。さらに、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬で試料を処理することにより、蛍光色素の染色性の差から、有核赤血球と、好塩基球以外の白血球や好塩基球とを弁別することができる。
【００１５】
カチオン性界面活性剤は、赤血球を溶血させ、白血球及び有核赤血球の細胞膜に損傷を与えることができる。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型のものが好ましい。第四級アンモニウム塩の型のカチオン性界面活性剤としては、次の一般式（ＩＩＩ）で表される第四級アンモニウム塩がより好ましい。
【００１６】
【化１】
【００１７】
上記式（ＩＩＩ）中のＲ13、Ｒ14及びＲ15は同一又は異なっていてもよく、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜８のアラルキル基である。Ｒ16は、炭素数８〜１８のアルキル基、炭素数８〜１８のアルケニル基又は炭素数６〜１８のアラルキル基である。Ｘ-はアニオンである。
Ｒ13、Ｒ14及びＲ15としての炭素数１〜８のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどを挙げることができる。Ｒ13、Ｒ14及びＲ15としての炭素数６〜８のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどを挙げることができる。好ましくは、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15は、メチル、エチルなどの炭素数１〜８のアルキル基である。
Ｒ16としての炭素数８〜１８のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシルなどを挙げることができる。Ｒ16としての炭素数８〜１８のアルケニル基としては、オクテニル、デセニル、オレイルなどを挙げることができる。Ｒ16としての炭素数６〜１８のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどを挙げることができる。好ましくは、Ｒ16は、デシル、ドデシル、テトラデシルなどの炭素数１０〜１８の直鎖のアルキル基である。
アニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００１８】
ピリジニウム塩の型のカチオン性界面活性剤としては、次の式（ＩＶ）で表されるピリジニウム塩がより好ましい。
【００１９】
【化２】
【００２０】
上記式（ＩＶ）中のＲ17は、炭素数８〜１８のアルキル基である。Ｘ-はアニオンである。
なお、炭素数８〜１８のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシルなどの炭素数１０〜１８の直鎖のアルキル基を挙げることができる。アニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００２１】
上記のカチオン性界面活性剤の具体例としては、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルピリジニウムクロライドなどが挙げられる。
【００２２】
カチオン性界面活性剤は、赤血球を溶血し、白血球及び有核赤血球の細胞膜に損傷を与えるのに充分な濃度で使用される。この濃度は、例えば、通常の光学顕微鏡で細胞膜等の状態を観察することによって、好適な濃度が簡単に決定される。カチオン性界面活性剤の濃度としては、具体的には、３００〜９０００ｍｇ／Ｌが好ましく、４００〜８０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、５００〜７０００ｍｇ／Ｌが最も好ましいが、使用するカチオン性界面活性剤の種類により適宜調製することができる。
なお、カチオン性界面活性剤の濃度が低すぎると、好塩基球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなる場合がある。これは、カチオン性界面活性剤の濃度が低すぎると白血球に十分な損傷を与えることができず、その結果として、好塩基球と好塩基球以外の白血球との間の大きさや形態の差が小さくなってしまうためと考えられる。一方、カチオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなる場合がある。これは、カチオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、特に好塩基球以外の白血球及び有核赤血球の細胞膜に過度の損傷が与えられ、その結果として、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなるためと考えられる。従って、上記の範囲の濃度であれば、白血球や有核赤血球の細胞膜には過度の損傷を与えずに、赤血球を効率よく溶血させることができる。また、カチオン性界面活性剤の溶血力は、その主鎖の長さに依存している。主鎖の長いものは、溶血力が強く、従って主鎖の短いものに比べて少量で効果が得られる。
【００２３】
採血後時間が経過した試料では、白血球などの血球が形態変化などにより損傷を受けやすくなる。そして、カチオン性界面活性剤を使用すると、特に好塩基球以外の白血球や有核赤血球の細胞膜に過度の損傷が与えられてしまい、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができない場合がある。しかしながら、このような場合に、カチオン性界面活性剤と共にノニオン性界面活性剤を使用すると、白血球などへの過度の損傷が抑えられ、有核赤血球と好塩基球以外の白血球とをより正確に弁別することができる。ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、又はポリオキシエチレン水素添加ステロールが好ましい。
【００２４】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（Ｖ）で表されるものが好ましい。
【００２５】
【化３】
【００２６】
上記式中のＲ18は、炭素数１２〜２２のアルキル基又は炭素数１２〜２２のアルケニル基である。ｎは１０〜３０である。
【００２７】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＶＩ）で表されるものが好ましい。
【００２８】
【化４】
【００２９】
上記式中のＲ19は、炭素数１０〜３０のアルキル基又は炭素数〜アルケニル基である。ｍは１〜１０である。ｎは１０〜３０である。
【００３０】
ポリオキシエチレンヒマシ油の型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＶＩＩ）で表されるものが好ましい。
【００３１】
【化５】
【００３２】
上記式中のk、n、m、x、y及びzの合計は、１０〜６０である。
【００３３】
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油の型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＶＩＩＩ）で表されるものが好ましい。
【００３４】
【化６】
【００３５】
上記式中のｋ、n、m、x、y及びzの合計は、１０〜６０である。
【００３６】
ポリオキシエチレンステロールの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＩＸ）で表されるものが好ましい。
【００３７】
【化７】
【００３８】
上記式中のｎは、１０〜３０である。
【００３９】
ポリオキシエチレン水素添加ステロールの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（Ｘ）又は式（ＸＩ）で表されるものが好ましい。
【００４０】
【化８】
【００４１】
上記式中のｎは、２０〜３０である。
【００４２】
【化９】
【００４３】
上記式中のｎは、２０〜３０である。
【００４４】
なお、炭素数１２〜２２のアルキル基としては、ドデシル基、ヘキサデシル基などを挙げることができる。炭素数１２〜２２のアルケニル基としては、オレイル基などを挙げることができる。また、上記の式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＩＸ）〜式（ＸＩ）中のｎが小さすぎると血球の細胞膜に過度の損傷を与えてしまい、大きすぎると血球の細胞膜に十分な損傷を与えることができなくなる場合がある。同様に、上記の式（ＶＩＩ）及び式（ＶＩＩＩ）中のｋ、n、m、x、y及びzの合計が小さすぎると血球の細胞膜に過度の損傷を与えてしまい、大きすぎると血球の細胞膜に十分な損傷を与えることができなくなる場合がある。
【００４５】
ノニオン性界面活性剤としては、具体的には、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）ポリオキシプロピレン（６）デシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ヒマシ油、ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール、などが挙げられる。この中でも、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテルが特に好ましい。
【００４６】
ノニオン性界面活性剤の濃度としては、５００〜７０００ｍｇ／Ｌが好ましく、８００〜６０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、１０００〜５０００ｍｇ／Ｌが最も好ましいが、使用するノニオン性界面活性剤の種類により適宜調製することができる。
なお、ノニオン性界面活性剤の濃度が少なすぎると、例えば採血後時間が経過した試料を用いた場合に、カチオン性界面活性剤による白血球及び有核赤血球の細胞膜への過度の損傷が抑えられず、特に有核赤血球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。一方、ノニオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、カチオン性界面活性剤による白血球及び有核赤血球の細胞膜への損傷を阻害して、特に好塩基球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。従って、上記の範囲の濃度であれば、採血後時間が経過した試料を用いた場合であっても、有核赤血球と好塩基球以外の白血球を正確に弁別することができる。
【００４７】
第１試薬は、分子内に少なくとも一つの芳香環を有するカルボン酸(以下、「芳香族カルボン酸」という)又はその塩を少なくとも１種類含有することが好ましい。芳香族カルボン酸を使用することにより、より効率的に短時間で赤血球を溶血することができる。
なお、芳香族カルボン酸を含まない第１試薬を測定に用いた場合、血液試料によっては好塩基球の値が偽高値を示す場合がある。偽高値となる理由は明らかになっていないが、血液試料に含まれる好塩基球以外の血球又はその他の成分が、好塩基球と類似する大きさ、形態又は蛍光強度を示しているからであると考えられる。しかしながら、上記の血液試料を、芳香族カルボン酸を含む第１試薬を用いて測定することによって、偽高値を示す現象を抑えることができる。
【００４８】
使用する芳香族カルボン酸としては、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩であれば特に限定されない。好ましい芳香族カルボン酸としては、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、及びそれらの塩などが挙げられる。
第１試薬中の上記の芳香族カルボン酸又はその塩の濃度は、第１試薬中のｐＨが以下に示した範囲となる濃度であれば特に限定されないが、０．１〜１００ｍＭが好ましく、０．５〜５０ｍＭがより好ましい。
なお、芳香族カルボン酸の濃度が少なすぎると上述したような効果が十分に得られず、好塩基球を正確に弁別できない場合がある。一方、芳香族カルボン酸の濃度が高すぎると、有核赤血球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。従って、上記の範囲の濃度であれば、有核赤血球と好塩基球とを他の血球から正確に弁別することができる。
【００４９】
第１試薬で試料を処理する際には、有核赤血球や好塩基球との測定に障害となる赤血球を溶血させることが好ましい。赤血球は、通常、約１５０mOsm／kg以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、赤血球内部のヘモグロビンを溶出し光学的に透明になる（溶血する）。光学的に透明になった赤血球は、実質的にフローサイトメトリを用いる測定の障害とはならない。赤血球の溶血には、低い浸透圧条件及び低いpH条件が好ましい。この二つの条件を満足する浸透圧は、２０mOsm／kg〜１５０mOsm／kgである。上記第１試薬の浸透圧をこの範囲に設定することにより、有核赤血球や好塩基球との測定に障害となる赤血球を効率よく溶血させることができる。
【００５０】
好塩基球には、酸性条件下では他の白血球に比べて破壊されにくいといった特性がある。ゆえに、第１試薬のpHは、２．０〜４．５が好ましく、２．０〜３．５がより好ましい。pHがこの範囲内であれば、好塩基球の顆粒が安定する。また、pHがこの範囲内であれば、白血球、有核赤血球などには過度の影響を与えずに赤血球を効率よく溶血させることができる。これにより、無核の赤血球の散乱光や蛍光は極めて小さくなるので、赤血球が、有核赤血球や白血球の測定に実質的に悪影響をおよぼさない。
【００５１】
第１試薬のpHは、緩衝剤を用いて調整してもよい。好ましい緩衝剤は、所望のpH±２．０の付近にpKaを有する緩衝剤であり、例えば、リンゴ酸、酒石酸、マロン酸、コハク酸、クエン酸、ジグリコール酸などが挙げられる。第１試薬中の上記の緩衝剤の濃度は、pHを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
【００５２】
なお、上記の芳香族カルボン酸と上記の緩衝剤とを組み合わせると、有核赤血球の弁別の性能が向上するため、好適である。緩衝剤と芳香族カルボン酸との組み合わせとしては、例えば、リンゴ酸とサリチル酸又はサリチル酸塩、リンゴ酸とフタル酸又はフタル酸塩、クエン酸とサリチル酸又はサリチル酸塩、クエン酸とフタル酸又はフタル酸塩、リンゴ酸と安息香酸又は安息香酸塩、リンゴ酸、及びフタル酸又はフタル酸塩と安息香酸又は安息香酸塩、などが挙げられる。
【００５３】
第１試薬中の浸透圧を赤血球の溶血に適当な範囲とするために、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類などを用いることができる。また、上記の緩衝剤の濃度によっても浸透圧を調整することができる。
【００５４】
第１試薬は、上記の界面活性剤及び芳香族カルボン酸又はその塩と、所望により上記の緩衝剤とを、上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解し、所望によりＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整することにより得ることができる。上記の適切な溶媒としては、上記の成分を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、例えば、水、有機溶媒、これらの混合液などが挙げられる。有機溶媒としては、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という）などが挙げられる。
【００５５】
第２試薬は、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する。上記第１試薬で処理した試料中の血球を、核酸を染色可能な蛍光色素で染色した場合、白血球は強く染色され、強い蛍光を発する。一方、有核赤血球は弱く染色され、弱い蛍光を発する。蛍光色素の染色性の差から、有核赤血球と、好塩基球以外の白血球や好塩基球とを弁別することができる。このように白血球と有核赤血球の蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく有核赤血球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられる。
【００５６】
蛍光色素としては、核酸を染色するものであれば特に限定されず、一般的に当該分野において用いられるのであれば使用できる。第２試薬に含有される蛍光色素としては、以下の式（Ｉ）の蛍光色素及び式（ＩＩ）の蛍光色素が挙げられる。
【００５７】
【化１０】
【００５８】
上記式中のＲ1及びＲ2は、アルキル基である。なお、Ｒ1及びＲ2は、互いに同一又は異なっている。さらに、
【００５９】
【化１１】
である。また、
【００６０】
【化１２】
である。Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、水素原子又はアルキル基である。なお、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ
5及びＲ6は、互いに同一又は異なっている。Ｘ-はアニオンである。
【００６１】
【化１３】
【００６２】
上記式中のＲ7及びＲ8は、酸性基を有していてもよいアルキル基である。なお、Ｒ7及
びＲ8は、互いに同一又は異なっている。さらに、
【００６３】
【化１４】
である。また、
【００６４】
【化１５】
である。Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、水素原子又は酸性基である。Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、互いに同一又は異なっている。但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには、酸性基が存在する。Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は、塩を形成していてもよい。但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した基である。
【００６５】
本明細書において、上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）における「アルキル基」は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は、通常、１〜２０、好ましくは１〜１０であるが、蛍光色素の水溶性の観点から、炭素数１〜６がより好ましい。アルキル基の好ましい例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００６６】
式（Ｉ）におけるアニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００６７】
本明細書において、式（ＩＩ）において存在し得る「酸性基」とは、プロトンを放出し得る基及びプロトンを放出し得る基がプロトンを放出した基の両方を含む。プロトンを放出し得る基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などが挙げられ、スルホン酸基が好ましい。
【００６８】
上記の酸性基は塩を形成していてもよい。このような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩などが挙げられる。より好ましくは、ナトリウム塩である。
【００６９】
上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の蛍光色素は、１種又は２種以上を用いることができる。上記の蛍光色素は、株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。
【００７０】
本発明の試料分析用試薬中の色素の濃度は、色素の種類により適宜選択することができるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜６．０ｍｇ／Ｌである。
【００７１】
なお、第２試薬に含有される上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の蛍光色素は、有核赤血球に対する親和性よりも白血球に対する親和性が強いため、白血球を強く染色する。従って、これらの蛍光色素を用いて染色された細胞から発せられる蛍光の差異に基づいて、有核赤血球と好塩基球以外の白血球や好塩基球とを、より正確に弁別することができる。
【００７２】
第２試薬は、上記の蛍光色素を上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解することにより得ることができる。また、適切な溶媒としては、上記の蛍光色素を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、有機溶媒、これらの混合液などが挙げられる。有機溶媒としては、アルコール、エチレングリコール、ＤＭＳＯなどが挙げられる。なお、蛍光色素は水溶液中での長期保存安定性が低い場合があり、その場合は上記の有機溶媒中に溶解させるのが好ましい。
【００７３】
試料分析用試薬キットは、第１試薬：第２試薬：試料の容量比が、１０〜５００：１〜１０：１、より好ましくは２０〜１００：２〜５：１となる量で試料と混合するのが好ましい。このような比で第１試薬、第２試薬及び試料を混合して測定用試料とすることにより、赤血球の溶解が速やかに進行し、血球成分の染色を良好に行うことができる。また、試料の量は数μｌ〜１００μｌ程度あれば、測定を良好に行うことができる。
【００７４】
本発明の一実施形態である試料分析方法は、上記の第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、上記の第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程、染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程、及び得られた散乱光情報及び得られた蛍光情報に基づいて、試料中の好塩基球及び／又は有核赤血球を分類して計数する工程を含む。
【００７５】
染色工程では、第１試薬と第２試薬と試料とを混合する。この工程において、第１試薬に含まれるカチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸は、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える。ゆえに、第１試薬と第２試薬と試料とを混合することによって、測定対象の血球を効率的に蛍光染色することが可能となる。
【００７６】
染色工程において、第１試薬と第２試薬と試料とを混合する順序としては、特に限定されない。第１試薬と第２試薬とを先に混合し、この混合液と試料とを混合してもよい。また、第１試薬と試料とを先に混合し、この混合液と第２試薬とを混合してもよい。いずれの順序で混合しても同等の測定結果を得ることができる。
【００７７】
染色工程では、第１試薬と第２試薬と試料とを混合した後に、１５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で５〜１２０秒間、好ましくは５〜３０秒間反応させるのが好ましい。
【００７８】
染色工程において染色された血球は、フローサイトメータを用いることにより分析することができる。以下、フローサイトメータを用いた血球の分析について説明する。染色された血球がフローサイトメータのフローセルを通過する際に、血球に光を照射することにより、散乱光情報及び蛍光情報を得ることができる。散乱光情報としては、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光であれば特に限定されず、前方散乱光（例えば、受光角度０〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度９０度付近）などの散乱光のパルス幅、散乱光強度などが挙げられる。一般に、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。本実施形態の方法においては、散乱光情報として前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用いることが好ましい。
【００７９】
蛍光情報とは、適当な波長の光を測定用試料に照射して、励起された蛍光を測定して得られるものである。使用する蛍光色素に応じて、適当な受光波長を選択することができる。蛍光は、上記の蛍光色素によって染色された細胞内の核酸や顆粒などから発せられる。
【００８０】
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、赤半導体レーザ、青半導体レーザ、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。
【００８１】
上記のようにして測定した散乱光と蛍光とに基づいて、有核赤血球及び好塩基球を他の成分から弁別して計数することができる。この工程は、例えば、（１）蛍光情報と前方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、（２）前方散乱光情報と側方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、（３）得られた各スキャッタグラムを適当な解析ソフトで解析することを含むのが好ましい。
X軸に蛍光強度、Y軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば、図１に示すように、有核赤血球、好塩基球及び好塩基球以外の白血球は、それぞれ集団（クラスター）を形成して分布する。なお、図中で、ＮＲＢＣと示したのは有核赤血球の集団であり、ＢＡＳＯと示したのは好塩基球の集団であり、ＷＢＣ−ＢＡＳＯと示したのは好塩基球以外の白血球の集団であり、ＷＢＣと示したのは白血球の集団である。このようなスキャッタグラムにおいては、有核赤血球は白血球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、白血球と有核赤血球とを明確に弁別することができる。また、好塩基球は、好塩基球以外の白血球よりもサイズが大きく、蛍光強度が大きい領域に出現する。このことにより、好塩基球以外の白血球と弁別することができる。しかしながら、白血球数が多い試料や採血後時間が経過した試料を測定した場合、蛍光強度と前方散乱光強度とを利用したスキャッタグラムにおいて、好塩基球と好塩基球以外の白血球とを、正確に弁別できないことがある。その場合は、前方散乱光情報と側方散乱光情報とを利用することができる。X軸に側方散乱光強度、Y軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図２に示すように、好塩基球及び好塩基球以外の白血球は、それぞれ集団（クラスター）を形成して分布する。なお、図中で、ＢＡＳＯと示したのは好塩基球の集団であり、ＷＢＣ−ＢＡＳＯと示したのは好塩基球以外の白血球の集団である。このようなスキャッタグラムにおいては、好塩基球は、他の白血球よりも側方散乱光強度と前方散乱光強度が大きい領域に出現する。このことにより、好塩基球と他の白血球を弁別することができる。さらに、前述したように、図１から有核赤血球と他の白血球を弁別することができる。ゆえに、図１及び図２のどちらの領域にも含まれる細胞を好塩基球として算出することにより、より精度の高い好塩基球を求めることができる。
【００８２】
なお、スキャッタグラム上の各集団がどの血球に対応するかは、各血球のみを含む試料を本実施形態の試薬キットで処理した後、測定を行い、出現位置を確認することによって特定することができる。
【００８３】
スキャッタグラム上の集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、有核赤血球及び好塩基球の数と割合を算出することができる。具体的には、スキャッタグラムにおいて、ある所定の細胞が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、まずこの集団の中心を特定する。この中心から他の細胞集団の出現領域までの間で、所定の細胞集団の細胞が出現している部分までをこの細胞集団の境界とすることができる。設定された領域内に出現する細胞を、所定の細胞として計数することができる。また、好塩基球以外の白血球も計数することにより、全白血球に対する好塩基球の比率（好塩基球／全白血球：以下、「好塩基球比率」という）と、全白血球に対する有核赤血球の比率（有核赤血球／全白血球：以下、「有核赤血球比率」という）とを算出することができる。なお、有核赤血球比率は、通常１００個の白血球当たりに出現する有核赤血球の百分率で表され、単位は「個／１００ＷＢＣ」と表記される。
【００８４】
本実施形態の試料分析用試薬キット及び試料分析方法を用いると、有核赤血球が形成する集団及び好塩基球が形成する集団が、他の血球細胞が形成する集団からそれぞれ明確に分離されるので、より正確な計数を行うことができる。
【００８５】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例において用いたカチオン性界面活性剤は、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（以降、ＤＴＡＢとする）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＬＴＡＣ）である。
【００８７】
以下の実施例において用いたノニオン性界面活性剤は、以下のとおりである。
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１６）、
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ）、
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４）、
ポリオキシエチレン（３０）ポリオキシプロピレン（６）デシルテトラデシルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＰＥＮ−４６３０）、
ポリオキシエチレン（２０）ヒマシ油（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＣＯ−２０ＴＸ）、
ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＨＣＯ−２０）、
ポリオキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＨＣＯ−５０）、
ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５）。
いずれも日光ケミカルズ株式会社から購入することができる。
【００８８】
以下の実施例において用いた芳香族カルボン酸は、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸及びアミノ安息香酸である。
【００８９】
以下の実施例において用いた蛍光色素は、ＮＫ−５２９、ＮＫ−２６７０、ＮＫ−３７５０、ＮＫ−３３８３、ＮＫ−１８４０、ＮＫ−９００１、ＮＫ−９００３、ＮＫ−２９２９、ＮＫ−３３７５、ＮＫ−５０５６、ＮＫ−３２６６、ＮＫ−３６２０である。いずれも株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。これら色素の化学式を、表１に示した。
【００９０】
【表１】
【００９１】
比較例１
本例では、従来の方法を利用して、採血後約８時間経過した血液試料を測定した。
被験者３名からそれぞれ採取された血液試料を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００（シスメックス製：赤半導体レーザ（６３３ｎｍ）を搭載）を用いて測定し、全白血球数及び好塩基球を計数した。この計数結果に基づいて、好塩基球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザ−ＦＢＩＩ（シスメックス製）を用いた。また、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
測定の結果、これら試料の好塩基球の含有量は、正常値以上であることが認められた（以下、この試料をＢＡＳＯ試料１、ＢＡＳＯ試料２及びＢＡＳＯ試料３とする）。ＢＡＳＯ試料１の好塩基球比率は０．８％、ＢＡＳＯ試料２の好塩基球比率は３．４％、ＢＡＳＯ試料３の好塩基球比率は１．６％であった。これらの結果を実施例１又は２の対照とした。
【００９２】
次に、上記とは別の被験者３名からそれぞれ採取された血液試料に含まれる有核赤血球を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて測定し、全白血球数及び有核赤血球数を計数した。この計数結果に基づいて、有核赤血球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザ−ＮＲ（シスメックス製）を用いた。また、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
測定の結果、これらの試料は有核赤血球が出現していることが認められた（以下、この試料をＮＲＢＣ試料１、ＮＲＢＣ試料２及びＮＲＢＣ試料３とする）。ＮＲＢＣ試料１の有核赤血球比率は４．４個／１００ＷＢＣ、ＮＲＢＣ試料２の有核赤血球比率は１．９個／１００ＷＢＣ、ＮＲＢＣ試料３の有核赤血球比率は１．３個／１００ＷＢＣであった。これらの結果を実施例１又は２の対照とした。
【００９３】
実施例１
本実施例では、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製し、各試薬を用いて採血後約８時間経過した血液試料を測定した。
なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【００９４】
第１試薬Ａ
サリチル酸ナトリウム ０．５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
サリチル酸ナトリウム ０．５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ １５００ｐｐｍ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＬＴＡＣ １５００ｐｐｍ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
フタル酸水素カリウム ０．５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
フタル酸水素カリウム ２ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ １５００ｐｐｍ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
【００９５】
第２試薬
エチレングリコール １００ｍＬ中に、ＮＫ−３３８３ １５ｍｇを溶解したものである。
【００９６】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及び血液試料（ＢＡＳＯ試料１、２若しくは３、又はNRBC試料１、２若しくは３）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４０℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。測定用試料を６３３ｎｍの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射した。そして、該細胞から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。この測定は、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて行われた。
なお、測定には、採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料１及び２並びにＮＲＢＣ試料１及び２を用いた。
【００９７】
測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料１及び２を用いた測定により得られた第２スキャッタグラムを図３に、採血後約８時間経過したＮＲＢＣ試料１及び２を用いた測定により得られた第１スキャッタグラムを図４に示す。
さらに、これらスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。表２は、比較例１及び本実施例で算出された、採血後８時間経過したＢＡＳＯ試料１又は２の好塩基球比率を示したものである。表３は、比較例１及び本実施例で算出された、採血後８時間経過したＮＲＢＣ試料１又は２の有核赤血球比率を示したものである。
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【０１００】
図３に示すように、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。図４に示すように、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図３及び４に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることができた。
また、表２及び３より、実施例１で算出された比率と比較例１で算出された比率とは近似した値であった。従って、本実施例の試料分析用試薬を用いると、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
【０１０１】
実施例２
本実施例では、実施例１の第１試薬及び第２試薬を用いて採血後約５０時間経過した血液試料を測定した。測定方法は、血液試料以外は、実施例１と同じである。本例の測定には、採血後約５０時間経過したＢＡＳＯ試料２又は３並びにＮＲＢＣ試料２又は３を用いた。
なお、実施例１の第１試薬Ａ〜Ｆのうち、ＢＡＳＯ試料２及びＮＲＢＣ試料２の測定には第１試薬Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦを用い、ＢＡＳＯ試料３及びＮＲＢＣ試料３の測定には第１試薬Ｃ及びＤを用いた。
【０１０２】
実施例１と同様に、測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。採血後約５０時間経過したＢＡＳＯ試料２を用いた測定により得られた第１スキャッタグラム及び第２スキャッタグラム、並びに採血後約５０時間経過したＮＲＢＣ試料２を用いた測定により得られた第１スキャッタグラムを図５に示す。また、採血後約５０時間経過したＢＡＳＯ試料３を用いた測定により得られた第１スキャッタグラム及び第２スキャッタグラム、並びに採血後約５０時間経過したＮＲＢＣ試料３を用いた測定により得られた第１スキャッタグラムを図６に示す。
さらに、これらスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。表４は、本実施例で算出された、採血後５０時間経過したＢＡＳＯ試料２又は３の好塩基球比率を示したものである。なお、表４では、第１スキャッタグラム（前方散乱光強度及び蛍光強度）及び第２スキャッタグラム（前方散乱光強度及び側方散乱光強度）に基づいて算出されたそれぞれの好塩基球比率を示した。表５は、本実施例で算出された、採血後５０時間経過したＮＲＢＣ試料２又は３の有核赤血球比率を示したものである。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
図５及び図６に示すように、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、採血後約５０時間経過した試料中の好塩基球が、好塩基球以外の白血球から明確に分画されることがわかる。また、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、採血後約５０時間経過した試料中の有核赤血球が、好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に分画されることがわかる。このように、採血後に時間が経過した試料であっても、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図５及び６に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることができた。
比較例１の方法で測定した場合、採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料２の好塩基球比率は３．４％、採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料３の好塩基球比率は１．６％であった。さらに、採血後約８時間経過したＮＲＢＣ試料２の有核赤血球比率は１．９個／１００ＷＢＣ、採血後約８時間経過したＮＲＢＣ試料３の有核赤血球比率は１．３個／１００ＷＢＣであった。これら比較例１の結果並びに表４及び表５の結果から、実施例２で算出された比率と比較例１で算出された比率とは近似した値であった。従って、本実施例の試料分析用試薬を用いると、採血後に時間が経過した試料であっても、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
また、表２及び表４のＢＡＳＯ試料２の結果から、採血後約５０時間経過した試料において算出された好塩基球比率と、採血後約８時間経過した試料において算出された好塩基球比率とは近似した値であった。表３及び表５ＮＲＢＣ試料２の結果から、採血後約５０時間経過した試料において算出された有核赤血球比率と、採血後約８時間経過した試料において算出された有核赤血球比率とは近似した値であった。
以上のことから、本実施例の試料分析用試薬を用いると、採血後に時間が経過した試料であっても、高い精度で測定を行うことができることが確認された。
【０１０６】
実施例３
本実施例では、カチオン性界面活性剤であるＤＴＡＢと各種のノニオン性界面活性剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１０７】
第１試薬Ａ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ３０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｂ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｃ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｄ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｅ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ ２０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ３０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｆ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ ２０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｇ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｈ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｉ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ ５０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｊ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｋ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｌ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｍ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＣＯ−２０ＴＸ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｎ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＣＯ−２０ＴＸ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｏ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｐ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ ５０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
【０１０８】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１０９】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料４又はNRBC試料４）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１１０】
ＢＡＳＯ試料４から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料４から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図７、８、９及び１０に示した。
【０１１１】
図７〜１０に示すように、ＤＴＡＢとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、ＤＴＡＢとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料４中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図７〜１０に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１１２】
実施例４
本実施例では、カチオン性界面活性剤であるＬＴＡＣと各種のノニオン性界面活性剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１１３】
第１試薬Ａ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｂ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｃ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｄ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｅ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｆ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｇ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｈ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｉ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｊ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ ７０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｋ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｌ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ ７０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｍ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｎ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １８００ｐｐｍを含有した水溶液である。
【０１１４】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１１５】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料５又はNRBC試料５）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１１６】
ＢＡＳＯ試料５から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料５から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図１１、１２、１３及び１４に示した。
【０１１７】
図１１〜１４に示すように、ＬＴＡＣとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、ＬＴＡＣとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料５中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図１１〜１４に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
実施例３及び実施例４より、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いることにより、血液試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、明確に弁別し、計数できることが示された。
【０１１８】
実施例５
本実施例では、芳香族カルボン酸と緩衝剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１１９】
第１試薬Ａ
フタル酸水素カリウム １０ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ０ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
フタル酸水素カリウム ５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ５ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
フタル酸水素カリウム １ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
フタル酸水素カリウム ０．３ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９．７ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
サリチル酸ナトリウム ５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ５ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
サリチル酸ナトリウム １ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｇ
サリチル酸ナトリウム ０．２２ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｈ
サリチル酸ナトリウム ５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ５ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｉ
サリチル酸ナトリウム １ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｊ
サリチル酸ナトリウム ０．２４ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
【０１２０】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１２１】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料６又はNRBC試料６）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１２２】
ＢＡＳＯ試料６から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料６から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図１５、１６及び１７に示した。
【０１２３】
図１５〜１７に示すように、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料６中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図１５〜１７に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１２４】
また、図１５において、有核赤血球の集団の重心、好塩基球の集団の重心及び好塩基球以外の白血球の集団の重心を特定し、各重心に対応する蛍光強度の値を求め、各値を比較した（データには示していない）。なお、各集団の重心の求め方は、公知の方法を利用した（特開平５−１４９８６３号公報）。これにより、フタル酸のみを含む試料分析用試薬（第１試薬Ａ）よりも、フタル酸とリンゴ酸の両方を含む試料分析用試薬（第１試薬Ｂ〜Ｄ）を用いた方が、有核赤血球の蛍光強度と、好塩基球や好塩基球以外の白血球との蛍光強度の差が大きくなることがわかった。さらに、フタル酸とリンゴ酸の両方を含む試料分析用試薬（第１試薬Ｂ〜Ｄ）のうちリンゴ酸の濃度が高い方（第１試薬Ｃ及びＤ）が、有核赤血球の蛍光強度と、好塩基球や好塩基球以外の白血球との蛍光強度の差が大きくなることがわかった。
このことは、図１６及び図１７のサリチル酸とリンゴ酸を含む試料分析用試薬（第１試薬Ｅ〜Ｊ）においても、同様の傾向がみられた。以上のことから、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせることによって、特に有核赤血球の弁別の性能が向上することがわかった。
【０１２５】
実施例６
本実施例では、第２試薬の蛍光色素として種々の蛍光色素を用いた。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１２６】
第１試薬
０．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２０００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
【０１２７】
第２試薬Ａ
ＮＫ−５２９ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｂ
ＮＫ−２６７０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｃ
ＮＫ−３７５０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｄ
ＮＫ−３３８３ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｅ
ＮＫ−１８４０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｆ
ＮＫ−９００１ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｇ
ＮＫ−９００３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｈ
ＮＫ−２９２９ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｉ
ＮＫ−３３７５ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｊ
ＮＫ−５０５６ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｋ
ＮＫ−３２６６ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｌ
ＮＫ−３６２０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１２８】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料７又はNRBC試料７）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。
なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１２９】
ＢＡＳＯ試料７から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料７から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図１８、１９及び２０に示した。
【０１３０】
図１８〜２０に示すように、いずれの蛍光色素を含む試料分析用試薬を用いた場合でも、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、いずれの蛍光色素を含む試料分析用試薬を用いた場合でも、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料７中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図１８〜２０に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１３１】
実施例７
安息香酸類の検討
本実施例では、芳香族カルボン酸として、安息香酸カリウム、４−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、３−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、４−アミノ安息香酸カリウムを用いた。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１３２】
第１試薬Ａ
２ｍＭ 安息香酸カリウム、８ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
３ｍＭ 安息香酸カリウム、７ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
４ｍＭ 安息香酸カリウム、６ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
７ｍＭ ４−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、３ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
８ｍＭ ４−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、２ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
４ｍＭ ３−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、６ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｇ
５ｍＭ ３−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、５ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｈ
１ｍＭ 安息香酸カリウム、９ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、２０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２８００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｉ
２ｍＭ ４−アミノ安息香酸カリウム、８ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、２０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２８００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
【０１３３】
なお、第１試薬Ａ〜Ｇまでは、２ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液を対照とし、第１試薬Ｈ及びＩは、０．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、２０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２８００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液を対照とした。
【０１３４】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１３５】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料８及び９又はＮＲＢＣ試料８及び９）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で７秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１３６】
ＢＡＳＯ試料８及び９から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料８及び９から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図２１及び２２に示した。
【０１３７】
図２１及び２２に示すように、いずれの場合でも、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、いずれの場合でも、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料８及び９中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図２１及び２２に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１３８】
実施例８
フタル酸水素カリウムと安息香酸カリウムの組み合わせ
本実施例では、芳香族カルボン酸として、フタル酸水素カリウムと安息香酸カリウムの組み合わせを検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１３９】
第１試薬Ａ
２ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
１．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、０．５ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
１．３３ｍＭ フタル酸水素カリウム、０．６６ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
１ｍＭ フタル酸水素カリウム、１ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
０．６６ｍＭ フタル酸水素カリウム、１．３３ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
０．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、１．５ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｇ
２ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
【０１４０】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１４１】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料１０又はＮＲＢＣ試料１０）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で７秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１４２】
ＢＡＳＯ試料１０から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料１０から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図２３に示した。
【０１４３】
図２３に示すように、いずれの場合でも、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、いずれの場合でも、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料１０中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
【０１４４】
フタル酸水素カリウムを用いた場合は、ゴースト量が少なくなるという長所があり、安息香酸カリウムはＷＢＣ分画とＮＲＢＣ分画が明確に弁別され良好になるという長所がある。これらを混合して使用することにより、好塩基球及び有核赤血球が、それぞれより明確に弁別されるようになる。
【０１４５】
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図２３に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１４６】
実施例９
採血後あまり時間が経過していない血液試料の測定
本実施例では、Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムを用い、本発明の試薬で、採血後あまり時間が経過していない血液試料のＮＲＢＣ及びＢＡＳＯの両方を測定した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。
【０１４７】
第１試薬（溶血剤）：
２ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２０００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
第２試薬（染色液）：
ＮＫ−３３８３ ５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１４８】
なお、血液試料としては、
ＢＡＳＯの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料）・・・１２検体
ＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＮＲＢＣ試料）・・・１２検体
を用いた。いずれの血液試料も、採血後約２〜７時間経過したものである。
【０１４９】
第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及び血液試料（ＢＡＳＯ試料又はＮＲＢＣ試料）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で７秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。
ＢＡＳＯ試料又はＮＲＢＣ試料から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。ＢＡＳＯ試料の測定結果から得られたスキャッタグラムの一つを、図２５に示す。また、ＮＲＢＣ試料の測定結果から得られたスキャッタグラムの一つを、図２６に示す。
【０１５０】
図２５及び図２６から、本発明の試薬は、採血後あまり時間が経過していない血液試料についても同様に、ＮＲＢＣ及びＢＡＳＯの分別が可能なことが明らかとなった。
【０１５１】
上記のスキャッタグラムにおいて、所定の領域内に出現する細胞を全白血球、好塩基球、有核赤血球として、それらの数を求めた。また、得られた各細胞の数から、全白血球数に対する好塩基球又は有核赤血球の比率を求めた。
【０１５２】
さらに、同じ血液試料について、比較例１と同様の操作により、全白血球、好塩基球及び有核赤血球の数、並びに全白血球数に対する好塩基球又は有核赤血球の比率を、コントロールとして求めた。
【０１５３】
そして、上記試薬（第１試薬、第２試薬）を用いた測定により得られた結果と上記コントロールの、全白血球数、好塩基球比率、有核赤血球比率の相関を確認した結果を、図２７に示す。なお、図２７において、実施例９及びコントロールの全白血球数はＢＡＳＯ試料を測定した場合の結果である。
【０１５４】
図２７から、本発明の試薬を用いて測定した結果及びコントロールは、全白血球数、好塩基球比率及び有核赤血球比率のいずれにおいても、相関係数（ｒ）が０．９以上となり、高い相関関係があることが明らかとなった。このことから、本発明の試薬は、採血後あまり時間が経過していない血液試料についても同様に、ＮＲＢＣ及びＢＡＳＯの測定が可能であることが分かった。
【０１５５】
本出願は、２００７年９月２７日に出願された日本国特許出願特願２００７−２５２６６６号、及び２００８年３月２４日に出願された日本国特許出願特願２００８−７６６０６号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された試料中の血球を分析するための試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野において、試料中の血球成分の分析は、被験者の循環器等における様々な疾患を診断する上で非常に有用である。疾患によっては、特定の血球数が増加又は減少したり、通常では存在しない血液細胞が末梢血に出現したりすることがある。
近年、フローサイトメトリの原理を応用した種々の自動血球計数装置が市販されている。これらの自動血球計数装置を用いると、試料中の血球の分類・計数を自動で行うことができる。
【０００３】
白血球は、通常、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種類に分類される。このうち好塩基球は、通常、血液試料に含まれる数が少ない。そのため、一度の測定で白血球を５種類に分類する方法で好塩基球を測定するよりも、血液試料に好塩基球測定専用の処理を行って好塩基球を測定する方が、より正確に分類を行うことができる。好塩基球には、酸性条件下では他の白血球に比べて破壊されにくいといった特性がある。特許文献１及び特許文献２には、その特性を利用した好塩基球測定専用の処理を行うことにより、好塩基球を他の白血球から弁別することが記載されている。
【０００４】
なお、白血球の測定において、しばしば問題になるのは有核赤血球の出現である。有核赤血球は、核を有する。このため、白血球の測定において赤血球を溶解する処理を行っても有核赤血球の核が残存し、それが白血球に近い信号を示し、これが白血球数の測定時にプラスの誤差を与える。この影響を排除するには、血液試料に有核赤血球測定専用の処理を行って有核赤血球数の測定を行い、別の方法で該血液試料の白血球数を測定し、得られた白血球数から有核赤血球を差し引くことで正確な白血球数を得ることができる。特許文献３には、血液試料に有核赤血球測定専用の処理を行うことにより、有核赤血球を白血球から弁別することが記載されている。
【０００５】
しかしながら、好塩基球や有核赤血球の分類を行うために、特許文献１〜３に記載されているような各々の血球専用の処理が必要になると、手間がかかる上に、装置が複雑化或いは大型化するおそれがある。また、各々の血球測定専用試薬を複数使用することにより、血液検査全体のコストが高くなる。このような観点から、血球専用の処理はできるだけ少ない方が好ましい。
【０００６】
ところで、好塩基球も有核赤血球も、血液試料を酸性条件下で処理することによって測定を行うことができる。従って、血液試料を酸性条件下で処理すれば、一回の測定で好塩基球と有核赤血球の両方を測定できる可能性がある。このような試みの１つとして、特許文献４には、白血球及び異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤とを含む水溶液を試料と混合し、蛍光色素を含む染色液を加えて染色し、フローサイトメータで測定して蛍光強度及び散乱光強度を測定することにより、好塩基球及び赤芽球（有核赤血球）を測定できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６１−８８８９６号公報
【特許文献２】特開平７−２９４５１８号公報
【特許文献３】特開平１０−３３９７２９号公報
【特許文献４】特開２００２−１４８２６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献４に記載の方法では、採血後時間が経過した試料などでは、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分離がよくないことがある。
本発明の目的は、試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、より明確に弁別し、計数することができる試料測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程と、染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程と、該散乱光情報及び該蛍光情報に基づいて、上記の試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程とを含む、試料分析方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、採血後時間が経過した試料であっても、有核赤血球と好塩基球を他の血球からより明確に弁別し、計数することが可能になり、疾患の検査・診断をより正確に行うことが可能になる。本発明では、一度の測定で有核赤血球と好塩基球を計数できるが、検査目的によっては、有核赤血球と好塩基球の何れか一方のみを測定すればよい場合もある。そのような場合でも、何れか一方のみを測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの模式図を示す。
【図２】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの模式図を示す。
【図３】実施例１の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図４】実施例１の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図５】実施例２の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図６】実施例２の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図７】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図８】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図９】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１０】実施例３の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１１】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１２】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１３】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１４】実施例４の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１５】実施例５の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１６】実施例５の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１７】実施例５の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１８】実施例６の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図１９】実施例６の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２０】実施例６の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２１】実施例７の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２２】実施例７の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２３】実施例８の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す。
【図２４】本発明の試薬キットの一例を示した図である。第１試薬はB、第２試薬はAである。
【図２５】実施例９の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの一例を示す。
【図２６】実施例９の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの一例を示す。
【図２７】実施例９の試料分析用試薬を用いて試料を分析した結果と、従来の試料分析方法により試料を分析した結果との相関関係を示すグラフである。（Ａ）全白血球数の相関関係；（Ｂ）好塩基球比率の相関関係；（Ｃ）有核赤血球比率の相関関係。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好塩基球は、塩基性色素により染色される大型の酸性顆粒を有する白血球の一種である。また、有核赤血球は、一般的に赤芽球とも呼ばれ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球及び正染性赤芽球を含む。
本明細書において、「試料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取された血液、骨髄液、尿、アフェレーシスなどで採取した試料などの体液試料をいう。
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬と核酸を染色可能な蛍光色素を含む第２試薬を用いることにより、有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、より明確に弁別することが可能であることを見出した。
【００１４】
本発明の一実施形態である試料分析用試薬キットは、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬と、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬とを含む試薬キットである。カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬で試料を処理することにより、試料中の赤血球を溶血させ、白血球及び有核赤血球の細胞膜に蛍光色素が通過できる程度の損傷を与えることができる。これにより、好塩基球以外の白血球及び有核赤血球は、細胞膜に損傷を受け、収縮又は裸核化する。一方、好塩基球は細胞膜に損傷を受けるものの、好塩基球以外の白血球及び有核赤血球に比べて損傷の程度が軽い。ゆえに、好塩基球は、好塩基球以外の白血球及び有核赤血球と比べて収縮の度合いが小さいと考えられる。ゆえに、細胞の大きさや形態の差から、好塩基球と、好塩基球以外の白血球や有核赤血球とを弁別することができる。さらに、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬で試料を処理することにより、蛍光色素の染色性の差から、有核赤血球と、好塩基球以外の白血球や好塩基球とを弁別することができる。
【００１５】
カチオン性界面活性剤は、赤血球を溶血させ、白血球及び有核赤血球の細胞膜に損傷を与えることができる。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型のものが好ましい。第四級アンモニウム塩の型のカチオン性界面活性剤としては、次の一般式（ＩＩＩ）で表される第四級アンモニウム塩がより好ましい。
【００１６】
【化１】
【００１７】
上記式（ＩＩＩ）中のＲ13、Ｒ14及びＲ15は同一又は異なっていてもよく、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜８のアラルキル基である。Ｒ16は、炭素数８〜１８のアルキル基、炭素数８〜１８のアルケニル基又は炭素数６〜１８のアラルキル基である。Ｘ-はアニオンである。
Ｒ13、Ｒ14及びＲ15としての炭素数１〜８のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどを挙げることができる。Ｒ13、Ｒ14及びＲ15としての炭素数６〜８のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどを挙げることができる。好ましくは、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15は、メチル、エチルなどの炭素数１〜８のアルキル基である。
Ｒ16としての炭素数８〜１８のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシルなどを挙げることができる。Ｒ16としての炭素数８〜１８のアルケニル基としては、オクテニル、デセニル、オレイルなどを挙げることができる。Ｒ16としての炭素数６〜１８のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどを挙げることができる。好ましくは、Ｒ16は、デシル、ドデシル、テトラデシルなどの炭素数１０〜１８の直鎖のアルキル基である。
アニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００１８】
ピリジニウム塩の型のカチオン性界面活性剤としては、次の式（ＩＶ）で表されるピリジニウム塩がより好ましい。
【００１９】
【化２】
【００２０】
上記式（ＩＶ）中のＲ17は、炭素数８〜１８のアルキル基である。Ｘ-はアニオンである。
なお、炭素数８〜１８のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシルなどの炭素数１０〜１８の直鎖のアルキル基を挙げることができる。アニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００２１】
上記のカチオン性界面活性剤の具体例としては、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルピリジニウムクロライドなどが挙げられる。
【００２２】
カチオン性界面活性剤は、赤血球を溶血し、白血球及び有核赤血球の細胞膜に損傷を与えるのに充分な濃度で使用される。この濃度は、例えば、通常の光学顕微鏡で細胞膜等の状態を観察することによって、好適な濃度が簡単に決定される。カチオン性界面活性剤の濃度としては、具体的には、３００〜９０００ｍｇ／Ｌが好ましく、４００〜８０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、５００〜７０００ｍｇ／Ｌが最も好ましいが、使用するカチオン性界面活性剤の種類により適宜調製することができる。
なお、カチオン性界面活性剤の濃度が低すぎると、好塩基球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなる場合がある。これは、カチオン性界面活性剤の濃度が低すぎると白血球に十分な損傷を与えることができず、その結果として、好塩基球と好塩基球以外の白血球との間の大きさや形態の差が小さくなってしまうためと考えられる。一方、カチオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなる場合がある。これは、カチオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、特に好塩基球以外の白血球及び有核赤血球の細胞膜に過度の損傷が与えられ、その結果として、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなるためと考えられる。従って、上記の範囲の濃度であれば、白血球や有核赤血球の細胞膜には過度の損傷を与えずに、赤血球を効率よく溶血させることができる。また、カチオン性界面活性剤の溶血力は、その主鎖の長さに依存している。主鎖の長いものは、溶血力が強く、従って主鎖の短いものに比べて少量で効果が得られる。
【００２３】
採血後時間が経過した試料では、白血球などの血球が形態変化などにより損傷を受けやすくなる。そして、カチオン性界面活性剤を使用すると、特に好塩基球以外の白血球や有核赤血球の細胞膜に過度の損傷が与えられてしまい、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができない場合がある。しかしながら、このような場合に、カチオン性界面活性剤と共にノニオン性界面活性剤を使用すると、白血球などへの過度の損傷が抑えられ、有核赤血球と好塩基球以外の白血球とをより正確に弁別することができる。ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、又はポリオキシエチレン水素添加ステロールが好ましい。
【００２４】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（Ｖ）で表されるものが好ましい。
【００２５】
【化３】
【００２６】
上記式中のＲ18は、炭素数１２〜２２のアルキル基又は炭素数１２〜２２のアルケニル基である。ｎは１０〜３０である。
【００２７】
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＶＩ）で表されるものが好ましい。
【００２８】
【化４】
【００２９】
上記式中のＲ19は、炭素数１０〜３０のアルキル基又は炭素数〜アルケニル基である。ｍは１〜１０である。ｎは１０〜３０である。
【００３０】
ポリオキシエチレンヒマシ油の型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＶＩＩ）で表されるものが好ましい。
【００３１】
【化５】
【００３２】
上記式中のk、n、m、x、y及びzの合計は、１０〜６０である。
【００３３】
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油の型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＶＩＩＩ）で表されるものが好ましい。
【００３４】
【化６】
【００３５】
上記式中のｋ、n、m、x、y及びzの合計は、１０〜６０である。
【００３６】
ポリオキシエチレンステロールの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（ＩＸ）で表されるものが好ましい。
【００３７】
【化７】
【００３８】
上記式中のｎは、１０〜３０である。
【００３９】
ポリオキシエチレン水素添加ステロールの型のノニオン性界面活性剤としては、以下の式（Ｘ）又は式（ＸＩ）で表されるものが好ましい。
【００４０】
【化８】
【００４１】
上記式中のｎは、２０〜３０である。
【００４２】
【化９】
【００４３】
上記式中のｎは、２０〜３０である。
【００４４】
なお、炭素数１２〜２２のアルキル基としては、ドデシル基、ヘキサデシル基などを挙げることができる。炭素数１２〜２２のアルケニル基としては、オレイル基などを挙げることができる。また、上記の式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＩＸ）〜式（ＸＩ）中のｎが小さすぎると血球の細胞膜に過度の損傷を与えてしまい、大きすぎると血球の細胞膜に十分な損傷を与えることができなくなる場合がある。同様に、上記の式（ＶＩＩ）及び式（ＶＩＩＩ）中のｋ、n、m、x、y及びzの合計が小さすぎると血球の細胞膜に過度の損傷を与えてしまい、大きすぎると血球の細胞膜に十分な損傷を与えることができなくなる場合がある。
【００４５】
ノニオン性界面活性剤としては、具体的には、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（３０）ポリオキシプロピレン（６）デシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ヒマシ油、ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール、などが挙げられる。この中でも、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテルが特に好ましい。
【００４６】
ノニオン性界面活性剤の濃度としては、５００〜７０００ｍｇ／Ｌが好ましく、８００〜６０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、１０００〜５０００ｍｇ／Ｌが最も好ましいが、使用するノニオン性界面活性剤の種類により適宜調製することができる。
なお、ノニオン性界面活性剤の濃度が少なすぎると、例えば採血後時間が経過した試料を用いた場合に、カチオン性界面活性剤による白血球及び有核赤血球の細胞膜への過度の損傷が抑えられず、特に有核赤血球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。一方、ノニオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、カチオン性界面活性剤による白血球及び有核赤血球の細胞膜への損傷を阻害して、特に好塩基球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。従って、上記の範囲の濃度であれば、採血後時間が経過した試料を用いた場合であっても、有核赤血球と好塩基球以外の白血球を正確に弁別することができる。
【００４７】
第１試薬は、分子内に少なくとも一つの芳香環を有するカルボン酸(以下、「芳香族カルボン酸」という)又はその塩を少なくとも１種類含有することが好ましい。芳香族カルボン酸を使用することにより、より効率的に短時間で赤血球を溶血することができる。
なお、芳香族カルボン酸を含まない第１試薬を測定に用いた場合、血液試料によっては好塩基球の値が偽高値を示す場合がある。偽高値となる理由は明らかになっていないが、血液試料に含まれる好塩基球以外の血球又はその他の成分が、好塩基球と類似する大きさ、形態又は蛍光強度を示しているからであると考えられる。しかしながら、上記の血液試料を、芳香族カルボン酸を含む第１試薬を用いて測定することによって、偽高値を示す現象を抑えることができる。
【００４８】
使用する芳香族カルボン酸としては、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩であれば特に限定されない。好ましい芳香族カルボン酸としては、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、及びそれらの塩などが挙げられる。
第１試薬中の上記の芳香族カルボン酸又はその塩の濃度は、第１試薬中のｐＨが以下に示した範囲となる濃度であれば特に限定されないが、０．１〜１００ｍＭが好ましく、０．５〜５０ｍＭがより好ましい。
なお、芳香族カルボン酸の濃度が少なすぎると上述したような効果が十分に得られず、好塩基球を正確に弁別できない場合がある。一方、芳香族カルボン酸の濃度が高すぎると、有核赤血球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。従って、上記の範囲の濃度であれば、有核赤血球と好塩基球とを他の血球から正確に弁別することができる。
【００４９】
第１試薬で試料を処理する際には、有核赤血球や好塩基球との測定に障害となる赤血球を溶血させることが好ましい。赤血球は、通常、約１５０mOsm／kg以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、赤血球内部のヘモグロビンを溶出し光学的に透明になる（溶血する）。光学的に透明になった赤血球は、実質的にフローサイトメトリを用いる測定の障害とはならない。赤血球の溶血には、低い浸透圧条件及び低いpH条件が好ましい。この二つの条件を満足する浸透圧は、２０mOsm／kg〜１５０mOsm／kgである。上記第１試薬の浸透圧をこの範囲に設定することにより、有核赤血球や好塩基球との測定に障害となる赤血球を効率よく溶血させることができる。
【００５０】
好塩基球には、酸性条件下では他の白血球に比べて破壊されにくいといった特性がある。ゆえに、第１試薬のpHは、２．０〜４．５が好ましく、２．０〜３．５がより好ましい。pHがこの範囲内であれば、好塩基球の顆粒が安定する。また、pHがこの範囲内であれば、白血球、有核赤血球などには過度の影響を与えずに赤血球を効率よく溶血させることができる。これにより、無核の赤血球の散乱光や蛍光は極めて小さくなるので、赤血球が、有核赤血球や白血球の測定に実質的に悪影響をおよぼさない。
【００５１】
第１試薬のpHは、緩衝剤を用いて調整してもよい。好ましい緩衝剤は、所望のpH±２．０の付近にpKaを有する緩衝剤であり、例えば、リンゴ酸、酒石酸、マロン酸、コハク酸、クエン酸、ジグリコール酸などが挙げられる。第１試薬中の上記の緩衝剤の濃度は、pHを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
【００５２】
なお、上記の芳香族カルボン酸と上記の緩衝剤とを組み合わせると、有核赤血球の弁別の性能が向上するため、好適である。緩衝剤と芳香族カルボン酸との組み合わせとしては、例えば、リンゴ酸とサリチル酸又はサリチル酸塩、リンゴ酸とフタル酸又はフタル酸塩、クエン酸とサリチル酸又はサリチル酸塩、クエン酸とフタル酸又はフタル酸塩、リンゴ酸と安息香酸又は安息香酸塩、リンゴ酸、及びフタル酸又はフタル酸塩と安息香酸又は安息香酸塩、などが挙げられる。
【００５３】
第１試薬中の浸透圧を赤血球の溶血に適当な範囲とするために、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類などを用いることができる。また、上記の緩衝剤の濃度によっても浸透圧を調整することができる。
【００５４】
第１試薬は、上記の界面活性剤及び芳香族カルボン酸又はその塩と、所望により上記の緩衝剤とを、上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解し、所望によりＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整することにより得ることができる。上記の適切な溶媒としては、上記の成分を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、例えば、水、有機溶媒、これらの混合液などが挙げられる。有機溶媒としては、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という）などが挙げられる。
【００５５】
第２試薬は、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する。上記第１試薬で処理した試料中の血球を、核酸を染色可能な蛍光色素で染色した場合、白血球は強く染色され、強い蛍光を発する。一方、有核赤血球は弱く染色され、弱い蛍光を発する。蛍光色素の染色性の差から、有核赤血球と、好塩基球以外の白血球や好塩基球とを弁別することができる。このように白血球と有核赤血球の蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく有核赤血球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられる。
【００５６】
蛍光色素としては、核酸を染色するものであれば特に限定されず、一般的に当該分野において用いられるのであれば使用できる。第２試薬に含有される蛍光色素としては、以下の式（Ｉ）の蛍光色素及び式（ＩＩ）の蛍光色素が挙げられる。
【００５７】
【化１０】
【００５８】
上記式中のＲ1及びＲ2は、アルキル基である。なお、Ｒ1及びＲ2は、互いに同一又は異なっている。さらに、
【００５９】
【化１１】
である。また、
【００６０】
【化１２】
である。Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、水素原子又はアルキル基である。なお、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ
5及びＲ6は、互いに同一又は異なっている。Ｘ-はアニオンである。
【００６１】
【化１３】
【００６２】
上記式中のＲ7及びＲ8は、酸性基を有していてもよいアルキル基である。なお、Ｒ7及
びＲ8は、互いに同一又は異なっている。さらに、
【００６３】
【化１４】
である。また、
【００６４】
【化１５】
である。Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、水素原子又は酸性基である。Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、互いに同一又は異なっている。但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには、酸性基が存在する。Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は、塩を形成していてもよい。但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した基である。
【００６５】
本明細書において、上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）における「アルキル基」は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は、通常、１〜２０、好ましくは１〜１０であるが、蛍光色素の水溶性の観点から、炭素数１〜６がより好ましい。アルキル基の好ましい例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００６６】
式（Ｉ）におけるアニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００６７】
本明細書において、式（ＩＩ）において存在し得る「酸性基」とは、プロトンを放出し得る基及びプロトンを放出し得る基がプロトンを放出した基の両方を含む。プロトンを放出し得る基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などが挙げられ、スルホン酸基が好ましい。
【００６８】
上記の酸性基は塩を形成していてもよい。このような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩などが挙げられる。より好ましくは、ナトリウム塩である。
【００６９】
上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の蛍光色素は、１種又は２種以上を用いることができる。上記の蛍光色素は、株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。
【００７０】
本発明の試料分析用試薬中の色素の濃度は、色素の種類により適宜選択することができるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜６．０ｍｇ／Ｌである。
【００７１】
なお、第２試薬に含有される上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の蛍光色素は、有核赤血球に対する親和性よりも白血球に対する親和性が強いため、白血球を強く染色する。従って、これらの蛍光色素を用いて染色された細胞から発せられる蛍光の差異に基づいて、有核赤血球と好塩基球以外の白血球や好塩基球とを、より正確に弁別することができる。
【００７２】
第２試薬は、上記の蛍光色素を上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解することにより得ることができる。また、適切な溶媒としては、上記の蛍光色素を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、有機溶媒、これらの混合液などが挙げられる。有機溶媒としては、アルコール、エチレングリコール、ＤＭＳＯなどが挙げられる。なお、蛍光色素は水溶液中での長期保存安定性が低い場合があり、その場合は上記の有機溶媒中に溶解させるのが好ましい。
【００７３】
試料分析用試薬キットは、第１試薬：第２試薬：試料の容量比が、１０〜５００：１〜１０：１、より好ましくは２０〜１００：２〜５：１となる量で試料と混合するのが好ましい。このような比で第１試薬、第２試薬及び試料を混合して測定用試料とすることにより、赤血球の溶解が速やかに進行し、血球成分の染色を良好に行うことができる。また、試料の量は数μｌ〜１００μｌ程度あれば、測定を良好に行うことができる。
【００７４】
本発明の一実施形態である試料分析方法は、上記の第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、上記の第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程、染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程、及び得られた散乱光情報及び得られた蛍光情報に基づいて、試料中の好塩基球及び／又は有核赤血球を分類して計数する工程を含む。
【００７５】
染色工程では、第１試薬と第２試薬と試料とを混合する。この工程において、第１試薬に含まれるカチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸は、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える。ゆえに、第１試薬と第２試薬と試料とを混合することによって、測定対象の血球を効率的に蛍光染色することが可能となる。
【００７６】
染色工程において、第１試薬と第２試薬と試料とを混合する順序としては、特に限定されない。第１試薬と第２試薬とを先に混合し、この混合液と試料とを混合してもよい。また、第１試薬と試料とを先に混合し、この混合液と第２試薬とを混合してもよい。いずれの順序で混合しても同等の測定結果を得ることができる。
【００７７】
染色工程では、第１試薬と第２試薬と試料とを混合した後に、１５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で５〜１２０秒間、好ましくは５〜３０秒間反応させるのが好ましい。
【００７８】
染色工程において染色された血球は、フローサイトメータを用いることにより分析することができる。以下、フローサイトメータを用いた血球の分析について説明する。染色された血球がフローサイトメータのフローセルを通過する際に、血球に光を照射することにより、散乱光情報及び蛍光情報を得ることができる。散乱光情報としては、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光であれば特に限定されず、前方散乱光（例えば、受光角度０〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度９０度付近）などの散乱光のパルス幅、散乱光強度などが挙げられる。一般に、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。本実施形態の方法においては、散乱光情報として前方散乱光強度及び側方散乱光強度を用いることが好ましい。
【００７９】
蛍光情報とは、適当な波長の光を測定用試料に照射して、励起された蛍光を測定して得られるものである。使用する蛍光色素に応じて、適当な受光波長を選択することができる。蛍光は、上記の蛍光色素によって染色された細胞内の核酸や顆粒などから発せられる。
【００８０】
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、赤半導体レーザ、青半導体レーザ、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。
【００８１】
上記のようにして測定した散乱光と蛍光とに基づいて、有核赤血球及び好塩基球を他の成分から弁別して計数することができる。この工程は、例えば、（１）蛍光情報と前方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、（２）前方散乱光情報と側方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、（３）得られた各スキャッタグラムを適当な解析ソフトで解析することを含むのが好ましい。
X軸に蛍光強度、Y軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば、図１に示すように、有核赤血球、好塩基球及び好塩基球以外の白血球は、それぞれ集団（クラスター）を形成して分布する。なお、図中で、ＮＲＢＣと示したのは有核赤血球の集団であり、ＢＡＳＯと示したのは好塩基球の集団であり、ＷＢＣ−ＢＡＳＯと示したのは好塩基球以外の白血球の集団であり、ＷＢＣと示したのは白血球の集団である。このようなスキャッタグラムにおいては、有核赤血球は白血球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、白血球と有核赤血球とを明確に弁別することができる。また、好塩基球は、好塩基球以外の白血球よりもサイズが大きく、蛍光強度が大きい領域に出現する。このことにより、好塩基球以外の白血球と弁別することができる。しかしながら、白血球数が多い試料や採血後時間が経過した試料を測定した場合、蛍光強度と前方散乱光強度とを利用したスキャッタグラムにおいて、好塩基球と好塩基球以外の白血球とを、正確に弁別できないことがある。その場合は、前方散乱光情報と側方散乱光情報とを利用することができる。X軸に側方散乱光強度、Y軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図２に示すように、好塩基球及び好塩基球以外の白血球は、それぞれ集団（クラスター）を形成して分布する。なお、図中で、ＢＡＳＯと示したのは好塩基球の集団であり、ＷＢＣ−ＢＡＳＯと示したのは好塩基球以外の白血球の集団である。このようなスキャッタグラムにおいては、好塩基球は、他の白血球よりも側方散乱光強度と前方散乱光強度が大きい領域に出現する。このことにより、好塩基球と他の白血球を弁別することができる。さらに、前述したように、図１から有核赤血球と他の白血球を弁別することができる。ゆえに、図１及び図２のどちらの領域にも含まれる細胞を好塩基球として算出することにより、より精度の高い好塩基球を求めることができる。
【００８２】
なお、スキャッタグラム上の各集団がどの血球に対応するかは、各血球のみを含む試料を本実施形態の試薬キットで処理した後、測定を行い、出現位置を確認することによって特定することができる。
【００８３】
スキャッタグラム上の集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、有核赤血球及び好塩基球の数と割合を算出することができる。具体的には、スキャッタグラムにおいて、ある所定の細胞が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、まずこの集団の中心を特定する。この中心から他の細胞集団の出現領域までの間で、所定の細胞集団の細胞が出現している部分までをこの細胞集団の境界とすることができる。設定された領域内に出現する細胞を、所定の細胞として計数することができる。また、好塩基球以外の白血球も計数することにより、全白血球に対する好塩基球の比率（好塩基球／全白血球：以下、「好塩基球比率」という）と、全白血球に対する有核赤血球の比率（有核赤血球／全白血球：以下、「有核赤血球比率」という）とを算出することができる。なお、有核赤血球比率は、通常１００個の白血球当たりに出現する有核赤血球の百分率で表され、単位は「個／１００ＷＢＣ」と表記される。
【００８４】
本実施形態の試料分析用試薬キット及び試料分析方法を用いると、有核赤血球が形成する集団及び好塩基球が形成する集団が、他の血球細胞が形成する集団からそれぞれ明確に分離されるので、より正確な計数を行うことができる。
【００８５】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例において用いたカチオン性界面活性剤は、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（以降、ＤＴＡＢとする）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＬＴＡＣ）である。
【００８７】
以下の実施例において用いたノニオン性界面活性剤は、以下のとおりである。
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１６）、
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ）、
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４）、
ポリオキシエチレン（３０）ポリオキシプロピレン（６）デシルテトラデシルエーテル（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＰＥＮ−４６３０）、
ポリオキシエチレン（２０）ヒマシ油（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＣＯ−２０ＴＸ）、
ポリオキシエチレン（２０）硬化ヒマシ油（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＨＣＯ−２０）、
ポリオキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＨＣＯ−５０）、
ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール（製品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５）。
いずれも日光ケミカルズ株式会社から購入することができる。
【００８８】
以下の実施例において用いた芳香族カルボン酸は、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸及びアミノ安息香酸である。
【００８９】
以下の実施例において用いた蛍光色素は、ＮＫ−５２９、ＮＫ−２６７０、ＮＫ−３７５０、ＮＫ−３３８３、ＮＫ−１８４０、ＮＫ−９００１、ＮＫ−９００３、ＮＫ−２９２９、ＮＫ−３３７５、ＮＫ−５０５６、ＮＫ−３２６６、ＮＫ−３６２０である。いずれも株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。これら色素の化学式を、表１に示した。
【００９０】
【表１】
【００９１】
比較例１
本例では、従来の方法を利用して、採血後約８時間経過した血液試料を測定した。
被験者３名からそれぞれ採取された血液試料を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００（シスメックス製：赤半導体レーザ（６３３ｎｍ）を搭載）を用いて測定し、全白血球数及び好塩基球を計数した。この計数結果に基づいて、好塩基球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザ−ＦＢＩＩ（シスメックス製）を用いた。また、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
測定の結果、これら試料の好塩基球の含有量は、正常値以上であることが認められた（以下、この試料をＢＡＳＯ試料１、ＢＡＳＯ試料２及びＢＡＳＯ試料３とする）。ＢＡＳＯ試料１の好塩基球比率は０．８％、ＢＡＳＯ試料２の好塩基球比率は３．４％、ＢＡＳＯ試料３の好塩基球比率は１．６％であった。これらの結果を実施例１又は２の対照とした。
【００９２】
次に、上記とは別の被験者３名からそれぞれ採取された血液試料に含まれる有核赤血球を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて測定し、全白血球数及び有核赤血球数を計数した。この計数結果に基づいて、有核赤血球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザ−ＮＲ（シスメックス製）を用いた。また、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
測定の結果、これらの試料は有核赤血球が出現していることが認められた（以下、この試料をＮＲＢＣ試料１、ＮＲＢＣ試料２及びＮＲＢＣ試料３とする）。ＮＲＢＣ試料１の有核赤血球比率は４．４個／１００ＷＢＣ、ＮＲＢＣ試料２の有核赤血球比率は１．９個／１００ＷＢＣ、ＮＲＢＣ試料３の有核赤血球比率は１．３個／１００ＷＢＣであった。これらの結果を実施例１又は２の対照とした。
【００９３】
実施例１
本実施例では、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製し、各試薬を用いて採血後約８時間経過した血液試料を測定した。
なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【００９４】
第１試薬Ａ
サリチル酸ナトリウム ０．５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
サリチル酸ナトリウム ０．５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ １５００ｐｐｍ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＬＴＡＣ １５００ｐｐｍ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
フタル酸水素カリウム ０．５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
フタル酸水素カリウム ２ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＬＴＡＣ １５００ｐｐｍ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
【００９５】
第２試薬
エチレングリコール １００ｍＬ中に、ＮＫ−３３８３ １５ｍｇを溶解したものである。
【００９６】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及び血液試料（ＢＡＳＯ試料１、２若しくは３、又はNRBC試料１、２若しくは３）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４０℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。測定用試料を６３３ｎｍの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射した。そして、該細胞から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。この測定は、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて行われた。
なお、測定には、採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料１及び２並びにＮＲＢＣ試料１及び２を用いた。
【００９７】
測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料１及び２を用いた測定により得られた第２スキャッタグラムを図３に、採血後約８時間経過したＮＲＢＣ試料１及び２を用いた測定により得られた第１スキャッタグラムを図４に示す。
さらに、これらスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。表２は、比較例１及び本実施例で算出された、採血後８時間経過したＢＡＳＯ試料１又は２の好塩基球比率を示したものである。表３は、比較例１及び本実施例で算出された、採血後８時間経過したＮＲＢＣ試料１又は２の有核赤血球比率を示したものである。
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【０１００】
図３に示すように、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。図４に示すように、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図３及び４に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることができた。
また、表２及び３より、実施例１で算出された比率と比較例１で算出された比率とは近似した値であった。従って、本実施例の試料分析用試薬を用いると、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
【０１０１】
実施例２
本実施例では、実施例１の第１試薬及び第２試薬を用いて採血後約５０時間経過した血液試料を測定した。測定方法は、血液試料以外は、実施例１と同じである。本例の測定には、採血後約５０時間経過したＢＡＳＯ試料２又は３並びにＮＲＢＣ試料２又は３を用いた。
なお、実施例１の第１試薬Ａ〜Ｆのうち、ＢＡＳＯ試料２及びＮＲＢＣ試料２の測定には第１試薬Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦを用い、ＢＡＳＯ試料３及びＮＲＢＣ試料３の測定には第１試薬Ｃ及びＤを用いた。
【０１０２】
実施例１と同様に、測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。採血後約５０時間経過したＢＡＳＯ試料２を用いた測定により得られた第１スキャッタグラム及び第２スキャッタグラム、並びに採血後約５０時間経過したＮＲＢＣ試料２を用いた測定により得られた第１スキャッタグラムを図５に示す。また、採血後約５０時間経過したＢＡＳＯ試料３を用いた測定により得られた第１スキャッタグラム及び第２スキャッタグラム、並びに採血後約５０時間経過したＮＲＢＣ試料３を用いた測定により得られた第１スキャッタグラムを図６に示す。
さらに、これらスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。表４は、本実施例で算出された、採血後５０時間経過したＢＡＳＯ試料２又は３の好塩基球比率を示したものである。なお、表４では、第１スキャッタグラム（前方散乱光強度及び蛍光強度）及び第２スキャッタグラム（前方散乱光強度及び側方散乱光強度）に基づいて算出されたそれぞれの好塩基球比率を示した。表５は、本実施例で算出された、採血後５０時間経過したＮＲＢＣ試料２又は３の有核赤血球比率を示したものである。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
図５及び図６に示すように、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、採血後約５０時間経過した試料中の好塩基球が、好塩基球以外の白血球から明確に分画されることがわかる。また、本実施例の試料分析用試薬を用いた場合、採血後約５０時間経過した試料中の有核赤血球が、好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に分画されることがわかる。このように、採血後に時間が経過した試料であっても、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図５及び６に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることができた。
比較例１の方法で測定した場合、採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料２の好塩基球比率は３．４％、採血後約８時間経過したＢＡＳＯ試料３の好塩基球比率は１．６％であった。さらに、採血後約８時間経過したＮＲＢＣ試料２の有核赤血球比率は１．９個／１００ＷＢＣ、採血後約８時間経過したＮＲＢＣ試料３の有核赤血球比率は１．３個／１００ＷＢＣであった。これら比較例１の結果並びに表４及び表５の結果から、実施例２で算出された比率と比較例１で算出された比率とは近似した値であった。従って、本実施例の試料分析用試薬を用いると、採血後に時間が経過した試料であっても、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
また、表２及び表４のＢＡＳＯ試料２の結果から、採血後約５０時間経過した試料において算出された好塩基球比率と、採血後約８時間経過した試料において算出された好塩基球比率とは近似した値であった。表３及び表５ＮＲＢＣ試料２の結果から、採血後約５０時間経過した試料において算出された有核赤血球比率と、採血後約８時間経過した試料において算出された有核赤血球比率とは近似した値であった。
以上のことから、本実施例の試料分析用試薬を用いると、採血後に時間が経過した試料であっても、高い精度で測定を行うことができることが確認された。
【０１０６】
実施例３
本実施例では、カチオン性界面活性剤であるＤＴＡＢと各種のノニオン性界面活性剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１０７】
第１試薬Ａ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ３０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｂ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｃ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｄ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｅ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ ２０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ３０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｆ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ ２０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｇ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｈ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｉ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ ５０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｊ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｋ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｌ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｍ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＣＯ−２０ＴＸ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｎ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＣＯ−２０ＴＸ ７０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｏ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ ３０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ５０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｐ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ ５０００ｐｐｍ及びＤＴＡＢ ７０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
【０１０８】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１０９】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料４又はNRBC試料４）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１１０】
ＢＡＳＯ試料４から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料４から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図７、８、９及び１０に示した。
【０１１１】
図７〜１０に示すように、ＤＴＡＢとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、ＤＴＡＢとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料４中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図７〜１０に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１１２】
実施例４
本実施例では、カチオン性界面活性剤であるＬＴＡＣと各種のノニオン性界面活性剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１１３】
第１試薬Ａ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｂ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＯ−１６ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｃ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｄ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｅ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｆ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＣ−２０ＴＸ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｇ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｈ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＢＰＳＨ−２５ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｉ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｊ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−５０ ７０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｋ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｌ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＨＣＯ−２０ ７０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｍ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １０００ｐｐｍを含有した水溶液である。
第１試薬Ｎ
サリチル酸ナトリウム １０ｍＭ、ＰＥＮ−４６３０ ５０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １８００ｐｐｍを含有した水溶液である。
【０１１４】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１１５】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料５又はNRBC試料５）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１１６】
ＢＡＳＯ試料５から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料５から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図１１、１２、１３及び１４に示した。
【０１１７】
図１１〜１４に示すように、ＬＴＡＣとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、ＬＴＡＣとノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料５中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図１１〜１４に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
実施例３及び実施例４より、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いることにより、血液試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、明確に弁別し、計数できることが示された。
【０１１８】
実施例５
本実施例では、芳香族カルボン酸と緩衝剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１１９】
第１試薬Ａ
フタル酸水素カリウム １０ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ０ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
フタル酸水素カリウム ５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ５ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
フタル酸水素カリウム １ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
フタル酸水素カリウム ０．３ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９．７ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
サリチル酸ナトリウム ５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ５ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
サリチル酸ナトリウム １ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｇ
サリチル酸ナトリウム ０．２２ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＰＢＣ−４４ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ １５００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｈ
サリチル酸ナトリウム ５ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ５ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｉ
サリチル酸ナトリウム １ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 ９ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
第１試薬Ｊ
サリチル酸ナトリウム ０．２４ｍＭ、ＤＬ−リンゴ酸 １０ｍＭ、ＢＯ−１６ １０００ｐｐｍ及びＬＴＡＣ ２０００ｐｐｍを含有する水溶液である。
【０１２０】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１２１】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料６又はNRBC試料６）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１２２】
ＢＡＳＯ試料６から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料６から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図１５、１６及び１７に示した。
【０１２３】
図１５〜１７に示すように、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いた場合、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料６中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図１５〜１７に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１２４】
また、図１５において、有核赤血球の集団の重心、好塩基球の集団の重心及び好塩基球以外の白血球の集団の重心を特定し、各重心に対応する蛍光強度の値を求め、各値を比較した（データには示していない）。なお、各集団の重心の求め方は、公知の方法を利用した（特開平５−１４９８６３号公報）。これにより、フタル酸のみを含む試料分析用試薬（第１試薬Ａ）よりも、フタル酸とリンゴ酸の両方を含む試料分析用試薬（第１試薬Ｂ〜Ｄ）を用いた方が、有核赤血球の蛍光強度と、好塩基球や好塩基球以外の白血球との蛍光強度の差が大きくなることがわかった。さらに、フタル酸とリンゴ酸の両方を含む試料分析用試薬（第１試薬Ｂ〜Ｄ）のうちリンゴ酸の濃度が高い方（第１試薬Ｃ及びＤ）が、有核赤血球の蛍光強度と、好塩基球や好塩基球以外の白血球との蛍光強度の差が大きくなることがわかった。
このことは、図１６及び図１７のサリチル酸とリンゴ酸を含む試料分析用試薬（第１試薬Ｅ〜Ｊ）においても、同様の傾向がみられた。以上のことから、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせることによって、特に有核赤血球の弁別の性能が向上することがわかった。
【０１２５】
実施例６
本実施例では、第２試薬の蛍光色素として種々の蛍光色素を用いた。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１２６】
第１試薬
０．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２０００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
【０１２７】
第２試薬Ａ
ＮＫ−５２９ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｂ
ＮＫ−２６７０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｃ
ＮＫ−３７５０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｄ
ＮＫ−３３８３ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｅ
ＮＫ−１８４０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｆ
ＮＫ−９００１ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｇ
ＮＫ−９００３ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｈ
ＮＫ−２９２９ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｉ
ＮＫ−３３７５ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｊ
ＮＫ−５０５６ ３００ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｋ
ＮＫ−３２６６ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
第２試薬Ｌ
ＮＫ−３６２０ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１２８】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料７又はNRBC試料７）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で１０秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。
なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１２９】
ＢＡＳＯ試料７から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料７から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図１８、１９及び２０に示した。
【０１３０】
図１８〜２０に示すように、いずれの蛍光色素を含む試料分析用試薬を用いた場合でも、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、いずれの蛍光色素を含む試料分析用試薬を用いた場合でも、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料７中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図１８〜２０に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１３１】
実施例７
安息香酸類の検討
本実施例では、芳香族カルボン酸として、安息香酸カリウム、４−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、３−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、４−アミノ安息香酸カリウムを用いた。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１３２】
第１試薬Ａ
２ｍＭ 安息香酸カリウム、８ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
３ｍＭ 安息香酸カリウム、７ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
４ｍＭ 安息香酸カリウム、６ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
７ｍＭ ４−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、３ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
８ｍＭ ４−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、２ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
４ｍＭ ３−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、６ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｇ
５ｍＭ ３−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、５ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｈ
１ｍＭ 安息香酸カリウム、９ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、２０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２８００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｉ
２ｍＭ ４−アミノ安息香酸カリウム、８ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、２０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２８００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
【０１３３】
なお、第１試薬Ａ〜Ｇまでは、２ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液を対照とし、第１試薬Ｈ及びＩは、０．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、２０００ｐｐｍ ＢＯ−１６及び２８００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液を対照とした。
【０１３４】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１３５】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料８及び９又はＮＲＢＣ試料８及び９）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で７秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１３６】
ＢＡＳＯ試料８及び９から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料８及び９から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図２１及び２２に示した。
【０１３７】
図２１及び２２に示すように、いずれの場合でも、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、いずれの場合でも、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料８及び９中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図２１及び２２に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１３８】
実施例８
フタル酸水素カリウムと安息香酸カリウムの組み合わせ
本実施例では、芳香族カルボン酸として、フタル酸水素カリウムと安息香酸カリウムの組み合わせを検討した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
【０１３９】
第１試薬Ａ
２ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｂ
１．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、０．５ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｃ
１．３３ｍＭ フタル酸水素カリウム、０．６６ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｄ
１ｍＭ フタル酸水素カリウム、１ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｅ
０．６６ｍＭ フタル酸水素カリウム、１．３３ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｆ
０．５ｍＭ フタル酸水素カリウム、１．５ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
第１試薬Ｇ
２ｍＭ 安息香酸カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２５００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。
【０１４０】
第２試薬
ＮＫ−３３８３ １５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１４１】
上記の第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及びＢＡＳＯ又はＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料１０又はＮＲＢＣ試料１０）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で７秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。なお、測定には、採血後約８時間経過した血液試料を用いた。
【０１４２】
ＢＡＳＯ試料１０から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１のスキャッタグラム、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２のスキャッタグラムを作成した。ＮＲＢＣ試料１０から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。各スキャッタグラムは、図２３に示した。
【０１４３】
図２３に示すように、いずれの場合でも、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。さらに、いずれの場合でも、有核赤血球が好塩基球や好塩基球以外の白血球から明確に弁別されることがわかった。
また、本実施例で使用したＢＡＳＯ試料１０中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第２スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第１スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
【０１４４】
フタル酸水素カリウムを用いた場合は、ゴースト量が少なくなるという長所があり、安息香酸カリウムはＷＢＣ分画とＮＲＢＣ分画が明確に弁別され良好になるという長所がある。これらを混合して使用することにより、好塩基球及び有核赤血球が、それぞれより明確に弁別されるようになる。
【０１４５】
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図２３に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
【０１４６】
実施例９
採血後あまり時間が経過していない血液試料の測定
本実施例では、Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムを用い、本発明の試薬で、採血後あまり時間が経過していない血液試料のＮＲＢＣ及びＢＡＳＯの両方を測定した。ここでは、下記の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。
【０１４７】
第１試薬（溶血剤）：
２ｍＭ フタル酸水素カリウム、１０ｍＭ ＤＬ−リンゴ酸、１０００ｐｐｍ ＰＢＣ−４４及び２０００ｐｐｍ ＬＴＡＣを含有する水溶液である。なお、第１試薬のｐＨは３．０である。
第２試薬（染色液）：
ＮＫ−３３８３ ５０ｐｐｍを含有するエチレングリコールである。
【０１４８】
なお、血液試料としては、
ＢＡＳＯの含有が認められた血液試料（ＢＡＳＯ試料）・・・１２検体
ＮＲＢＣの含有が認められた血液試料（ＮＲＢＣ試料）・・・１２検体
を用いた。いずれの血液試料も、採血後約２〜７時間経過したものである。
【０１４９】
第１試薬１ｍＬ、第２試薬２０μＬ及び血液試料（ＢＡＳＯ試料又はＮＲＢＣ試料）２０μＬを十分に混和し、その混合液を４１℃で７秒間反応させて測定用試料を調製した。実施例１と同様に自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて、測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。
ＢＡＳＯ試料又はＮＲＢＣ試料から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。ＢＡＳＯ試料の測定結果から得られたスキャッタグラムの一つを、図２５に示す。また、ＮＲＢＣ試料の測定結果から得られたスキャッタグラムの一つを、図２６に示す。
【０１５０】
図２５及び図２６から、本発明の試薬は、採血後あまり時間が経過していない血液試料についても同様に、ＮＲＢＣ及びＢＡＳＯの分別が可能なことが明らかとなった。
【０１５１】
上記のスキャッタグラムにおいて、所定の領域内に出現する細胞を全白血球、好塩基球、有核赤血球として、それらの数を求めた。また、得られた各細胞の数から、全白血球数に対する好塩基球又は有核赤血球の比率を求めた。
【０１５２】
さらに、同じ血液試料について、比較例１と同様の操作により、全白血球、好塩基球及び有核赤血球の数、並びに全白血球数に対する好塩基球又は有核赤血球の比率を、コントロールとして求めた。
【０１５３】
そして、上記試薬（第１試薬、第２試薬）を用いた測定により得られた結果と上記コントロールの、全白血球数、好塩基球比率、有核赤血球比率の相関を確認した結果を、図２７に示す。なお、図２７において、実施例９及びコントロールの全白血球数はＢＡＳＯ試料を測定した場合の結果である。
【０１５４】
図２７から、本発明の試薬を用いて測定した結果及びコントロールは、全白血球数、好塩基球比率及び有核赤血球比率のいずれにおいても、相関係数（ｒ）が０．９以上となり、高い相関関係があることが明らかとなった。このことから、本発明の試薬は、採血後あまり時間が経過していない血液試料についても同様に、ＮＲＢＣ及びＢＡＳＯの測定が可能であることが分かった。
【０１５５】
本出願は、２００７年９月２７日に出願された日本国特許出願特願２００７−２５２６６６号、及び２００８年３月２４日に出願された日本国特許出願特願２００８−７６６０６号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程；
前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程
を含む、試料分析方法。
【請求項２】
前記蛍光色素が、一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに同一又は異なってアルキル基であり；
【化２】
であり、
【化３】
であり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり；
Ｘ-はアニオンである）
の蛍光色素、及び一般式（ＩＩ）：
【化４】
（式中、Ｒ7及びＲ8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり；
【化５】
であり；
【化６】
であり；
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには酸性基が存在し；
Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した基である）
の蛍光色素からなる群から選択される少なくとも１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基が、スルホン酸基である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る塩を形成している酸性基が、アルカリ金属塩の基である請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン界面活性剤が、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレン水素添加ステロールからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記芳香族カルボン酸が、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１試薬のｐＨが酸性である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１試薬が、ｐＨ２．０〜４．５の範囲にｐＫａを有する緩衝剤を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記緩衝剤が、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、ジグリコール酸、マロン酸、コハク酸からなる群より選択される少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の有核赤血球を計数する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球を計数する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報及び側方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記側方散乱光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球を計数する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記計数工程が、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、さらに前記試料中の白血球を分類して計数する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の白血球を分類して計数する請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第１試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第２試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程；
前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程
を含む、試料分析方法。
【請求項２】
前記蛍光色素が、一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに同一又は異なってアルキル基であり；
【化２】
であり、
【化３】
であり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり；
Ｘ-はアニオンである）
の蛍光色素、及び一般式（ＩＩ）：
【化４】
（式中、Ｒ7及びＲ8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり；
【化５】
であり；
【化６】
であり；
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには酸性基が存在し；
Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した基である）
の蛍光色素からなる群から選択される少なくとも１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基が、スルホン酸基である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る塩を形成している酸性基が、アルカリ金属塩の基である請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン界面活性剤が、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレン水素添加ステロールからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記芳香族カルボン酸が、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１試薬のｐＨが酸性である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１試薬が、ｐＨ２．０〜４．５の範囲にｐＫａを有する緩衝剤を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記緩衝剤が、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、ジグリコール酸、マロン酸、コハク酸からなる群より選択される少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の有核赤血球を計数する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球を計数する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報及び側方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記側方散乱光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球を計数する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記計数工程が、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、さらに前記試料中の白血球を分類して計数する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の白血球を分類して計数する請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７−１】
【図２７−２】
【公開番号】特開２０１３−７９９６８（Ｐ２０１３−７９９６８Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２６３３８７（Ｐ２０１２−２６３３８７）
【出願日】平成２４年１１月３０日（２０１２．１１．３０）
【分割の表示】特願２００９−５３４４２４（Ｐ２００９−５３４４２４）の分割
【原出願日】平成２０年９月２６日（２００８．９．２６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１１月３０日（２０１２．１１．３０）
【分割の表示】特願２００９−５３４４２４（Ｐ２００９−５３４４２４）の分割
【原出願日】平成２０年９月２６日（２００８．９．２６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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