酵母におけるＨＰＶ５８Ｌ１の最適化発現
【課題】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染予防用ワクチンの製造に利用できる抗原タンパク質の提供。
【解決手段】５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子、特に酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド。該分子は、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造、ならびにＨＰＶ５８ ＶＬＰを含むワクチンの製造に使用できる。
【解決手段】５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子、特に酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド。該分子は、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造、ならびにＨＰＶ５８ ＶＬＰを含むワクチンの製造に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の予防および／または治療に関する。より詳しくは、本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび宿主に関する。本発明はまた、酵母細胞内で組換えＨＰＶ５８ Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２を発現させることにより製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにＨＰＶ感染の予防および治療のためのワクチンおよび医薬組成物におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
８０を超える型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が存在し、これらのうちの多くは良性増殖性疣贅から悪性癌に及ぶ多種多様な生物学的表現型に関連づけられている（概説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい。）。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、性器粘膜または呼吸器粘膜の良性疣贅、非悪性尖形コンジローマおよび／または低悪性異形成に最も一般的に関連している型である。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子宮頸部、膣、外陰部および肛門管のｉｎ ｓｉｔｕおよび浸潤性癌に最も頻繁に関連している高リスク型である。子宮頸癌の９０％以上はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８またはより稀な発癌性型ＨＰＶ３１、３３、４５、５２および５８に関連している（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。ＨＰＶ ＤＮＡが子宮頸癌の９０以上で検出されるという観察は、ＨＰＶが子宮頸癌を引き起こすという強力な疫学的証拠を提供している。
【０００３】
パピローマウイルスは、８個までの初期遺伝子および２個の後期遺伝子をコードする小型（５０〜６０ｎｍ）非外包性二十面体ＤＮＡウイルスである。そのウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７ならびにＬ１およびＬ２と称され、この場合の「Ｅ」は初期を意味し、「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１およびＬ２はウイルスカプシドタンパク質をコードし、一方、Ｅ遺伝子は、ウイルス複製および細胞トランスフォーメーションのような機能に関連している。
【０００４】
Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有する。Ｌ２タンパク質は副次的カプシドタンパク質である。免疫学的データは、Ｌ２タンパク質の大部分がウイルスカプシド内のＬ１タンパク質の内部に存在することを示唆している。Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質は共に、種々のパピローマウイルス間で高度に保存されている。
【０００５】
酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌におけるＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せ体の発現はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己集合を引き起こす（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６）を参照されたい。）。ＶＬＰは真正ビリオンに形態学的に類似しており、動物またはヒトに投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰは潜在的発癌性ウイルスゲノムを含有していないため、それは、ＨＰＶワクチンの開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい。）。この理由により、Ｌ１およびＬ２遺伝子はＨＰＶ感染および疾患に対する予防用および治療用ワクチンの開発のための免疫学的標的と目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３）
【非特許文献３】ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６）
【非特許文献４】ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
うまく形質転換された宿主生物における高い発現レベルのカプシドタンパク質の入手に伴う困難性、およびそれによる精製タンパク質の製造の制限のため、ＨＰＶワクチンの開発および商業化は妨げられている。したがって、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質のようなＨＰＶ Ｌ１タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が同定されているものの、意図される宿主細胞内での発現に関して最適化されたＨＰＶ５８ Ｌ１コード化ヌクレオチド配列を利用する容易に再生可能な粗ＨＰＶ Ｌ１タンパク質源を開発することが非常に望ましいであろう。また、ワクチン開発で使用する天然タンパク質の免疫付与特性を有する大量のＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰを製造することが有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、また酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、ＨＰＶ５８ Ｌ１をコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。本発明は更に、酵母細胞内で組換えＨＰＶ５８ Ｌ１またはＬ２を発現させることにより製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、ＨＰＶ関連癌の予防および／または治療用の医薬組成物およびワクチンにおけるＨＰＶ５８ ＶＬＰの使用を開示する。
【０００９】
本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。該合成分子のコドンは、酵母細胞にとって好ましいコドンが利用されるよう設計される。該合成分子は、ＶＬＰに自己集合しうるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の源として使用することが可能である。該ＶＬＰは、ＶＬＰに基づくワクチンにおいて使用することが可能である。
【００１０】
本発明の典型的な実施形態は、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成核酸分子を含み、該核酸分子は、酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化されたヌクレオチドの配列を含む。好ましい実施形態においては、該核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む（本明細書においては「５８ Ｌ１ Ｒ配列」と称される。）。
【００１１】
また、本明細書中の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞の両方）を提供する。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞である。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）該ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００１３】
本発明は更に、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸分子（該核酸分子は、酵母宿主細胞内での最適化発現に関してコドン最適化されている）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）該ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００１４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、該核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む。
【００１５】
本発明はまた、酵母細胞内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ５８ ＶＬＰの製造方法、およびＨＰＶ５８ ＶＬＰの使用方法に関する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、酵母細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１またはＨＰＶ５８ Ｌ１＋Ｌ２の組換え発現により製造されるＨＰＶ５８ ＶＬＰである。
【００１８】
本発明の更にもう１つの態様は、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子により製造されるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ５８ ＶＬＰである。本発明のこの態様の典型的な実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰはコドン最適化遺伝子により製造される。
【００２０】
本発明の更にもう１つの態様は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ関連子宮頸癌の予防または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰは酵母内で製造される。
【００２１】
本発明はまた、酵母内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンに関する。
【００２２】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、該ワクチンは更に、少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを含む。この少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、当技術分野において記載されている又は後に同定される任意のＨＰＶ型を含む、関心のある任意のＨＰＶ型でありうる。好ましい実施形態においては、該ＨＰＶ型は、疣贅または子宮頸癌のような臨床的表現型に関連した型である。もう１つの好ましい実施形態においては、この少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００２３】
本発明はまた、酵母内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰと少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰとを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、この少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００２４】
本明細書中の全体において及び添付する特許請求の範囲において用いる単数表現は、文脈から例外であることが明らかである場合を除き、複数物に対する言及を含む。
【００２５】
本明細書中の全体において及び添付する特許請求の範囲においては、以下の定義および略語が適用される。
【００２６】
「プロモーター」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成して、転写活性を始動し駆動する。該複合体は、「エンハンサー」もしくは「上流活性化配列」と称される配列を活性化することにより又は「サイレンサー」と称される配列を抑制することにより修飾されうる。
【００２７】
「ベクター」なる語は、宿主生物または宿主組織内へのＤＮＡ断片の導入をもたらしうる何らかの手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージおよびコスミドを含む種々のタイプのベクターが存在する。
【００２８】
「カセット」なる語は、ベクターから発現されるヌクレオチドまたは遺伝子配列、例えば、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチドまたは遺伝子配列を意味する。一般に、カセットは、いくつかの実施形態においては該ヌクレオチドまたは遺伝子配列の発現のための調節配列を提供するベクター内に挿入された遺伝子配列を含む。他の実施形態においては、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は、その発現のための調節配列を提供する。他の実施形態においては、該ベクターはいくつかの調節配列を提供し、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は他の調節配列を提供する。例えば、該ベクターは該ヌクレオチドまたは遺伝子配列の転写のためのプロモーターを提供することが可能であり、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は転写終結配列を提供する。該ベクターにより提供されうる調節配列は、エンハンサー、転写終結配列、スプライス受容および供与配列、イントロン、リボソーム結合配列ならびにポリ（Ａ）付加配列を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
「５８ Ｌ１野生型配列」および「５８ Ｌ１ ｗｔ配列」なる表現は、本明細書中に配列番号３として開示されているＨＰＶ５８ Ｌ１配列を意味する。ＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列は既に記載されているが、臨床分離体から得たＤＮＡ間に若干の配列変異を見出すことは珍しいことではない。したがって、代表的なＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列を、ＨＰＶ５８ ＤＮＡを含有することが既に示されている臨床サンプルから単離した（実施例１を参照されたい）。本明細書中に開示されているコドン最適化５８ Ｌ１配列を比較するための参照配列として該５８ Ｌ１野生型配列を使用した（図１を参照されたい。）。
【００３０】
「ＨＰＶ ５８ Ｌ１ Ｒ」および「５８ Ｌ１ Ｒ」なる表現は、酵母細胞による高レベル発現に好ましいコドンを含むように再構築された、本明細書中に開示されている典型的な合成ＨＰＶ ５８ Ｌ１ヌクレオチド配列（配列番号１）を意味する。
【００３１】
「有効量」なる語は、免疫応答が生じるよう、適度なレベルの該ポリペプチドの産生に十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。このレベルは様々なものとなりうると当業者に理解される。
【００３２】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ酸残基により置換されることを意味する。そのような保存的置換の例としては、疎水性残基同士（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）の置換、同じ電荷の極性残基同士（例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸）の置換が挙げられる。
【００３３】
「哺乳動物（哺乳類）」なる語は、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。
【００３４】
「ＶＬＰ」はウイルス様粒子を意味する。
【００３５】
「合成」は、示されている天然に存在する野生型ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（５８ Ｌ１ ｗｔ、配列番号３）内に存在するヌクレオチド配列と同じではないヌクレオチド配列をＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子が含有するよう、該遺伝子が作製されたことを意味する。前記のとおり、本発明において、酵母細胞による発現に好ましいコドンを含むヌクレオチドの配列を含む合成分子を提供する。本発明で提供する合成分子は、野生型ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号２）と同じアミノ酸配列をコードしている。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１は、本発明の合成ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号１；「５８ Ｌ１ Ｒ」として示されている。）において改変されたヌクレオチドを比較する配列アライメントである（実施例２を参照されたい。）。参照配列は５８ Ｌ１野生型配列（配列番号３；「５８ Ｌ１ ｗｔとして示されている」；実施例１を参照されたい。）である。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。５８ Ｌ１再構築配列における同一ヌクレオチドは点で示されている。
【図１Ｂ】図１は、本発明の合成ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号１；「５８ Ｌ１ Ｒ」として示されている。）において改変されたヌクレオチドを比較する配列アライメントである（実施例２を参照されたい。）。参照配列は５８ Ｌ１野生型配列（配列番号３；「５８ Ｌ１ ｗｔとして示されている」；実施例１を参照されたい。）である。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。５８ Ｌ１再構築配列における同一ヌクレオチドは点で示されている。
【図１Ｃ】図１は、本発明の合成ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号１；「５８ Ｌ１ Ｒ」として示されている。）において改変されたヌクレオチドを比較する配列アライメントである（実施例２を参照されたい。）。参照配列は５８ Ｌ１野生型配列（配列番号３；「５８ Ｌ１ ｗｔとして示されている。」；実施例１を参照されたい）である。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。５８ Ｌ１再構築配列における同一ヌクレオチドは点で示されている。
【図２Ａ】図２は、再構築合成ＨＰＶ５８ Ｌ１の二本鎖核酸および一文字記号アミノ酸配列（上）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。
【図２Ｂ】図２は、再構築合成ＨＰＶ５８ Ｌ１の二本鎖核酸および一文字記号アミノ酸配列（上）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。
【図２Ｃ】図２は、再構築合成ＨＰＶ５８ Ｌ１の二本鎖核酸および一文字記号アミノ酸配列（上）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。
【図３】図３は、ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ転写産物のノーザンブロットを示す（実施例４を参照されたい。）。該ブロットは、等量のＤＩＧ標識５８Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ ＤＮＡプローブの混合物でプローブした。レーン当たりの、電気泳動された全ＲＮＡの量が示されている。右側の矢印は、完全長５８ Ｌ１転写産物の推定サイズを示す。
【図４】図４は、ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔ（５８）および５８ Ｌ１ Ｒ（５８Ｒ）タンパク質のウエスタンブロットを示す。ＨＰＶ １６ Ｌ１を参照体（１６）として含めた。１０、５および２．５μｇの全酵母タンパク質抽出物を変性させ、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。５８ Ｌ１および１６ Ｌ１と交差反応する酵母吸収抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ３１ Ｌ１ヤギポリクローナル抗血清を使用して、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を検出した。左側に、分子量マーカーがｋＤａ単位で示されている。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡにおいて捕捉され検出された全酵母タンパク質１μｇ当たりの無傷ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰの量（ｎｇ）を示す（実施例７を参照されたい。）。二重に行った２つの実験の結果が含まれている。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔのＶＬＰ発現（黒および灰色の枠）は３６ｎｇ／μｇ全酵母タンパク質であった。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＲのＶＬＰ発現（白および線影付きの枠）（再構築酵母コドン最適化５８Ｌ１）はＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔ発現より２〜３倍高く、実験＃２においては９５ｎｇ／μｇ全酵母タンパク質に達した。
【図６】図６は、透過型電子顕微鏡検査により可視化された、本明細書に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒタンパク質分子から構成されるＨＰＶ５８ ＶＬＰの代表的サンプルを示す（実施例８を参照されたい。）。棒線は１００ｎｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
子宮頸癌のほとんどは、特定の発癌型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染に関連している。本発明は、発癌性ＨＰＶ型の遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強する組成物および方法に関する。特に、本発明は、酵母内での高レベル発現に関してコドン最適化されたＨＰＶ５８ Ｌ１をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、酵母内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、ＨＰＶ関連癌の予防および／または治療用の医薬組成物およびワクチンにおける該ポリヌクレオチドおよびＶＬＰの使用を開示する。
【００３８】
野生型ＨＰＶ５８ Ｌ１ヌクレオチド配列は既に報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４４３，Ｋｉｒｉｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５（１）：４２４−４２７（１９９１）を参照されたい。）。本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子は、高レベル発現のために酵母細胞にとって好ましいコドンを使用するようコドンの少なくとも幾つかが改変された、コドンの配列を含む。該合成分子は、ＶＬＰへと自己集合しうるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現のためのコード配列として使用することが可能である。該ＶＬＰは、中和抗体および細胞性免疫によりパピローマウイルス感染に対する有効な免疫予防をもたらすために、ＶＬＰに基づくワクチンにおいて使用することが可能である。ＶＬＰに基づくそのようなワクチンは、既に確立したＨＰＶ感染の治療にも有用である。
【００３９】
酵母細胞におけるＨＰＶ ＶＬＰの発現は、費用効果的であり発酵槽内での大規模増殖に容易に適合するという利点をもたらす。また、酵母ゲノムは、増強した増殖能および発現能を有する組換え形質転換酵母の選択が保証されるよう容易に改変されうる。しかし、ＨＰＶ５８ Ｌ１を含む多数のＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、商業的大規模化に望ましいものより低いレベルでしか酵母細胞内では発現されない。
【００４０】
したがって、本発明は、酵母細胞環境中での高レベル発現に関して「最適化」されたＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子配列に関する。
【００４１】
４つの可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６０を超える変異形態で存在しうる。これらのコドンは僅か２０個の異なるアミノ酸（ならびに転写開始および終結）のメッセージを与えるに過ぎないため、いくつかのアミノ酸は２以上のコドンによりコードされうる（コドン縮重として公知の現象である）。完全には理解されていない理由により、異なる細胞型の内因性ＤＮＡ内には代替的コドンは一様には存在しない。実際、或る細胞型においては或るコドンに関する可変的天然階層または「優先性」が存在するようである。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含む６つのＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内因性ＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＣＴＧを含有し、一方、酵母および粘菌のＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＴＴＡを含むことが、微生物についてのゲノムコドン使用頻度の詳細な分析から示されている。この階層を考慮すると、ロイシンに富むポリペプチドの高レベルの発現が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主により得られる可能性は、コドン使用頻度に或る程度は左右されると、一般に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では発現されにくいと考えられ、一方、ＣＴＧに富む遺伝子は、おそらく、この宿主内で高度に発現されるであろう。同様に、ロイシンに富むポリペプチドの酵母宿主細胞内での発現に好ましいコドンはＴＴＡであろう。
【００４２】
組換えＤＮＡ技術へのコドン優先性現象の関与は明白であり、該現象は、成功裏に形質転換された宿主生物において外因性遺伝子の高い発現レベルがこれまで多くの場合に達成されていないことを説明するのに役立ちうる。すなわち、該挿入遺伝子内には、それほど「好ましく」ないコドンが反復的に存在している可能性があり、発現用の宿主細胞装置が、それほど効率的には機能していない可能性があるのである。この現象は、意図される宿主細胞にとって好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えＤＮＡ技術の実施のための好ましい形態の外来遺伝物質の最適形態を与えることを示唆している。したがって、本発明の１つの態様は、酵母細胞内での発現に関してコドン最適化されたＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子である。本発明の好ましい実施形態において、同じタンパク質配列をコードする代替的コドンの使用は、酵母細胞によるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現に対する制約を除去しうることが判明した。
【００４３】
本発明においては、参照により本明細書に組み入れるＳｈａｒｐおよびＣｏｗｅ，Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ ７：６５７−６７８（１９９１）に記載されている、同一の翻訳配列を有するが代替的コドン使用頻度を伴う配列に、ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子セグメントを変換した。該方法は、一般には、高度に発現される酵母遺伝子に一般に関連していない野生型配列内のコドンを特定し、それらを、酵母細胞内での高発現のための最適コドンで置換することよりなる。ついでその新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換により生じた望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の非意図的生成、望ましくない制限酵素部位、高いＧＣ含量、酵母により認識される転写終結シグナルの存在など）に関して調べる。同一アミノ酸をコードする異なるコドンで既存コドンを置換することにより、望ましくない配列を除去する。ついで該合成遺伝子セグメントを発現の改善に関して試験する。
【００４４】
前記の方法を用いてＨＰＶ５８ Ｌ１の合成遺伝子セグメントを作製して、高レベル発現に関して最適化されたコドンを含む遺伝子を得た。前記方法は、ＨＰＶワクチンにおいて使用するコドン最適化遺伝子を設計するための本発明者らの方法の概要を説明するものであるが、該方法における若干の変更または該配列における若干の変更によっても、同様のワクチン効力または遺伝子発現の増強が達成されうると当業者に理解される。
【００４５】
したがって、本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の生物学的に活性な断片もしくは突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、酵母宿主内での発現に関して最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の突然変異体は、保存的アミノ酸置換、アミノ末端トランケート化、カルボキシ末端トランケート化、欠失または付加を含むが、これらに限定されるものではない。任意のそのような生物学的に活性な断片および／または突然変異体は、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模擬するタンパク質またはタンパク質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用ＨＰＶワクチンの開発において有用となるよう、機能的ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４６】
本発明の１つの態様は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子である。
【００４７】
本発明はまた、本明細書中の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞の両方）に関する。本発明の好ましい実施形態においては、該宿主細胞は酵母宿主細胞である。
【００４８】
本明細書に記載の方法により構築した合成ＨＰＶ５８ ＤＮＡまたはその断片を、適当なプロモーターと他の適当な転写調節要素とを含有する発現ベクター内への分子クローニングにより組換え的に発現させ、原核または真核宿主細胞内に導入して、組換えＨＰＶ５８ Ｌ１を得ることが可能である。このような操作のための技術はＳａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｏｓｅら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９０）（これらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）に十分に記載されている。
【００４９】
したがって、本発明は、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００５０】
したがって、本発明は更に、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸（該核酸分子は、酵母宿主細胞内での最適発現のためにコドン最適化されている。）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００５１】
本発明は更に、（ａ）配列番号１に記載の核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００５２】
本発明の合成遺伝子は、宿主細胞内でのＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の効率的発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットに集合させることが可能である。該カセットは、好ましくは、合成遺伝子を、それに機能しうる形で連結された関連転写および翻訳制御配列（例えば、プロモーターおよび終結配列）と共に含有する。好ましい実施形態においては、プロモーターはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１プロモーターであるが、多数の他の公知酵母プロモーター、例えばＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３もしくはＰＧＫプロモーターまたは他の真核生物遺伝子プロモーターのいずれかを使用しうると当業者は認識するであろう。好ましい転写ターミネーターはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１ターミネーターであるが、他の公知転写ターミネーターも使用することが可能である。ＧＡＬ１プロモーター−ＡＤＨ１ターミネーターの組合せが特に好ましい。
【００５３】
本発明は更に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む単離および精製されたＨＰＶ５８ Ｌ１ポリペプチドを提供する。
【００５４】
本発明のもう１つの態様は、ＨＰＶ５８ Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２遺伝子を酵母細胞内で組換え的に発現させることにより製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ５８ ＶＬＰの製造方法、およびＨＰＶ５８ ＶＬＰの使用方法である。ヒトおよび動物パピローマウイルスの主要カプシドタンパク質であるＬ１が酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌内で発現される場合には、ＶＬＰは自己集合しうる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６））。Ｌ１およびＬ２カプシドタンパク質の組合せを発現させることにより、形態学的に不明瞭なＨＰＶ ＶＬＰも製造されうる。ＶＬＰは、Ｔ＝７二十面体構造のＬ１の７２個の五量体から構成される（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（６）：１４４５−５６（１９９１））。
【００５５】
ＶＬＰは真正ビリオンと形態学的に類似しており、動物に投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰでのウサギ（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３９５９−６３（１９９５））およびイヌ（Ｓｕｚｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（２５）：１１５５３−５７（１９９５））の免疫化は中和抗体の誘導および実験パピローマウイルス感染に対する防御の両方をもたらすことが示された。しかし、ＶＬＰは、潜在的に発癌性のウイルスゲノムを含有せず、発現されると単一遺伝子から自己集合しうるため、これは、ＨＰＶワクチン開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい。）。
【００５６】
したがって、本発明は、ＨＰＶ５８の組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質（該組換えタンパク質は酵母細胞内で発現される）から構成されるウイルス様粒子に関する。
【００５７】
前記のとおり、本発明の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰは酵母内で製造される。もう１つの好ましい実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる。
【００５８】
本発明のもう１つの態様は、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子により製造されるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ５８ ＶＬＰである。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む。
【００５９】
本発明の更にもう１つの態様は、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５８ Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること、（ｂ）該組換えＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下、該形質転換酵母を培養して組換えＨＰＶ５８タンパク質を得ること、（ｃ）該組換えＨＰＶ５８タンパク質を単離してＨＰＶ５８ ＶＬＰを得ることを含む、ＨＰＶ５８ ＶＬＰの製造方法である。
【００６０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰを得るために、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子で酵母を形質転換する。特に好ましい実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰはコドン最適化遺伝子により製造される。
【００６２】
本発明の更にもう１つの態様は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ関連子宮頸癌の予防または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰは酵母内で製造される。
【００６３】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンに関する。
【００６４】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、該ワクチンは更に、少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを含む。好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００６５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ１６ ＶＬＰを含む。
【００６６】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ１６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ ＶＬＰを含む。
【００６７】
本発明の更にもう１つの好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ６ ＶＬＰ、ＨＰＶ１１ ＶＬＰ、ＨＰＶ１６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ ＶＬＰを含む。
【００６８】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰと少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰとを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００６９】
本発明のワクチン組成物は、最小の潜在的毒性でＨＰＶ５８感染の最適抑制を可能にする適当な量で単独で使用することが可能である。また、他の物質の共投与または連続的投与が望ましいであろう。
【００７０】
ワクチン被投与者に導入すべきウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性に左右される。一般に、ＶＬＰ約１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは約２０μｇ〜６０μｇの免疫学的または予防的に有効な量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および他の投与方法、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。また、ブースターワクチン接種を行いうると意図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時またはその後の、ミョウバンまたはメルク（Ｍｅｒｃｋ）アルミニウムアジュバントのようなアジュバントの非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段での投与も有利である。
【００７１】
本発明に関連して用いられうる方法および材料を記載し開示する目的で、本明細書に記載のすべての刊行物を、参照により本明細書に組み入れることとする。ここで、本発明が先行発明としてそのような開示に先行するものではないと自認するものと解釈されるべきではない。
【００７２】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの実施形態そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明には種々の変更および修飾が当業者によって施されうると理解されるべきである。
【００７３】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７４】
代表的ＨＰＶ５８ Ｌ１配列の決定
ＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列は既に記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４４３）。しかし、臨床分離体から得たＤＮＡ間に若干の配列変異を見出すことは珍しいことではない。代表的なＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列を決定するために、ＨＰＶ５８ ＤＮＡを含有することが既に示されている３つの臨床サンプルからＤＮＡを単離した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ＨＰＶ５８ Ｌ１配列を増幅した：ＨＰＶ ５８ ＬＩ Ｆ ５’−ＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＴ−３’（配列番号４）および５８ ３’ｌ１ ＢｇｌＩＩ ５’−ＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号５）。増幅産物をアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。〜１５００ｂｐのＬ１バンドを切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑ−Ｂｉｏ Ｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを精製した。ついで該ＤＮＡをＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を該連結混合物で形質転換し、アンピシリン＋ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌ（青／白コロニー選択用）を含有するＬＢ寒天上でプレーティングした。該プレートを反転させ、３７℃で１６時間インキュベートした。白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうしながら培養した。ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。
【００７５】
該プラスミド中のＬ１遺伝子の存在を示すために、制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。制限断片をアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により可視化した。これらの３つの臨床分離体のそれぞれからのクローン化Ｌ１インサートを含有するプラスミドに関してＤＮＡ配列決定を行った。後の最適化のための参照配列を作製するために、該クローンのそれぞれからのヌクレオチドおよび翻訳アミノ酸配列を、公開されているＨＰＶ ５８ Ｌ１配列と比較した。これらの３つの臨床分離体の配列分析は、どの配列も該Ｇｅｎｂａｎｋ配列と同一でないことを示した。代表的な５８ Ｌ１配列としてｐＣＲ２．１ ＨＰＶ５８ Ｌ１クローン＃４を選択した。これは本明細書中では互換的に「５８ Ｌ１野生型配列」または「５８ ｗｔ配列」（配列番号３；図１を参照されたい）と称される。５８ Ｌ１ ｗｔ配列は５つの点突然変異を含有し、このうちの２つはアミノ酸変化を引き起こすものであり、３つはサイレント点突然変異であった。Ｇｅｎｂａｎｋ ＨＰＶ ５８ Ｌ１配列に対してアミノ酸変化を引き起こす点突然変異はヌクレオチド３７２（Ａ→Ｔ）（これはアミノ酸１２４をロイシンからフェニルアラニンに変化させる）およびヌクレオチド８９７（Ａ→Ｇ）（これはアミノ酸２９９をイソロイシンからメチオニンに変化させる）に位置していた。前記の３つのサイレント点突然変異はヌクレオチド７７４（Ａ→Ｇ）、７９２（Ｔ→Ｃ）および９９９（Ｇ→Ａ）に位置していた。
【００７６】
Ｔａｑポリメラーゼおよび以下のプライマー（これはＢａｍＨＩ伸長を付加する）を使用して、５８ Ｌ１野生型配列を増幅した：５’５８ ＢａｍＨＩ ５’−ＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号６）および３’Ｂａｍ５８ ５’−ＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号７）。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動およびそれに続く臭化エチジウム染色により可視化した。〜１５００ｂｐのバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用してＤＮＡを精製した。ついでＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１に連結し、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞を該連結混合物で形質転換した。白色コロニーを選択し、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうすることにより培養した。ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。該ベクター配列からＨＰＶ ５８ Ｌ１遺伝子を遊離させるために、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。消化されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｌ１バンドを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用して精製し、脱リン酸化されＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０に連結した。ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を該連結混合物で形質転換した。正しい配向のＨＰＶ ５８ Ｌ１インサートに関してスクリーニングするために、コロニーからのプラスミドＤＮＡをＰＣＲ増幅した。該インサートの配列および配向を確認するために、ＤＮＡ配列決定を行った。単一クローンを選択し、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１＃１０と命名した。選択したクローンからマキシプレップ（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを調製した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を、グルスラーゼでスフェロプラスト化することによりコンピテントにし、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１＃１で形質転換した。該酵母形質転換混合物をＬｅｕ（−）ソルビトールプレート上のＬｅｕ（−）ソルビトール上層寒天内でプレーティングし、反転させて３０℃で３〜５日間インキュベートした。コロニーを拾い、Ｌｅｕ（−）ソルビトール寒天プレート上での単離のためにストリークした。ついで、５８ Ｌ１転写およびタンパク質発現を誘導するために、単離されたコロニーを、３０℃の回転チューブ培養において、１．６％グルコースおよび４％ガラクトースを含有する５ｍｌの５×Ｌｅｕ（−）Ａｄｅ（−）ソルビトール内で成長させた。
【実施例２】
【００７７】
酵母コドン最適化
酵母にとって好ましいコドンは既に記載されている（Ｓｈａｒｐ，Ｐａｕｌ ＭおよびＣｏｗｅ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ．Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＥＡＳＴ ７：６５７−６７８（１９９１））。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔタンパク質の発現は検出可能であったが、発現の増強を得るために、好ましい酵母コドンを使用してＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子を再構築した。酵母最適化コドン配列を含む再構築５８ Ｌ１配列は、５８ Ｌ１ ｗｔ配列と比較して４０４個のヌクレオチド変化を含有していた。得られた配列は本明細書中では「５８ Ｌ１ Ｒ」（Ｒ＝再構築；図１を参照されたい。）と称される。５８ Ｌ１ Ｒの翻訳アミノ酸配列は変化しなかった。ＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列を図２に示す。該再構築配列はＨＰＶ５８ Ｌ１発現の増強をもたらし、これは、ワクチン開発における使用のための、該野生型に対する有意な進歩である（実施例４を参照されたい。）。
【００７８】
最適化遺伝子の製造に用いた方法は、該アミノ酸配列を維持しながら酵母にとって好ましいコドン配列でヌクレオチドを置換する、該遺伝子に広がる長い重複するセンスおよびアンチセンスオリゴマーを設計するものであった。Ｐｆｕポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応において、鋳型ＤＮＡの代わりにこれらのオリゴマーを使用した。追加的な増幅プライマーを設計し、これらを使用して鋳型オリゴマーから再構築配列を増幅した。
【００７９】
増幅のための最適条件は部位特異的なものであったが、ほとんどの場合には、以下に類似した方法を用いた：９５℃で２分間（変性）、およびそれに続く９５℃で１分間（変性）、５５℃で１分間（アニーリング）、７２℃で３．５分間（伸長）の３５サイクル、およびそれに続く７２℃で１０分間の最終伸長、および４℃での維持。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検査した。適当なサイズのバンドを切り出し、ＤＮＡをゲル精製した。ついで該増幅断片を鋳型として使用して１４９７ヌクレオチドの再構築ＨＰＶ５８Ｌ１遺伝子を作製した。
【００８０】
再構築後、１４９７ヌクレオチドのバンドをゲル精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。連結後、ＴＯＰ１０細胞を該連結混合物で形質転換した。カナマイシンを含有するＬＢ内でコロニーを成長させ、ミニプレップ技術により該コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。所望の５８ Ｌ１再構築変化を確認するために、該プラスミドＤＮＡを配列決定した。両末端にＢａｍＨＩ伸長を付加するために、以下のプライマーを使用して５８ Ｌ１ Ｒ（再構築体）をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−５８ Ｌ１ Ｒから再増幅した：５’Ｂａｍ ５８Ｒｅｂｕｉｌｄ ５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣ−３’（配列番号８）および３’Ｂａｍ ５８Ｒｅｂｕｉｌｄ ５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号９）。
【００８１】
増幅されたＬ１産物を、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用してゲル精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＴＯＰ１０Ｆ’細胞を該ｐＣＲ２．１プラスミドで形質転換した。白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうすることにより培養した。ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。該ベクター配列からＨＰＶ ５８ Ｌ１遺伝子を遊離させるために、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。消化されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｌ１バンドを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用して精製し、脱リン酸化されＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０に連結した。ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を該連結混合物で形質転換した。
【００８２】
得られたコロニーを、正しい配向のＨＰＶ ５８ Ｌ１インサートに関してＰＣＲによりスクリーニングした。制限消化プロフィールおよびＤＮＡ配列決定により、配列および配向を確認した。選択したクローンをｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１Ｒ＃１７と命名した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を、グルスラーゼでスフェロプラスト化することによりコンピテントにし、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１Ｒ＃１７で形質転換した。該酵母形質転換物をＬｅｕ− ソルビトール寒天プレート上のＬｅｕ（−）ソルビトール上層寒天内でプレーティングし、反転させて３０℃で３〜５日間インキュベートした。コロニーを拾い、Ｌｅｕ（−）ソルビトール寒天プレート上でのクローン単離のためにストリークした。ついで、Ｌ１転写およびタンパク質発現を誘導するために、単離されたコロニーを、３０℃の回転チューブ培養において、１．６％グルコースおよび４％ガラクトースを含有する５ｍｌの５×Ｌｅｕ（−）Ａｄｅ（−）ソルビトール内で成長させた。４８時間後、ＯＤ６００＝１０の細胞量と同等の培養容量をペレット化し、上清を除去し、該ペレットを凍結し、−７０℃で保存した。
【実施例３】
【００８３】
ＲＮＡ調製
ガラクトース誘導によりＨＰＶ５８ Ｌ１またはＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒを発現するよう誘導された形質転換酵母細胞の細胞ペレットを氷上で解凍し、０．８ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。５分の１容量のクロロホルムを該バイアルに加えた。ついでそれを１５秒間、激しく振とうして混合し、室温で３分間インキュベートした。１３ｋｒｐｍでの５分間の遠心分離の後、上相を集め、新たなバイアルに移した。０．４ｍｌのイソプロパノールを加え、室温で１０分間インキュベートした。ＲＮＡをペレット化し、遠心分離を１３ｋｒｐｍで１０分間行った。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを７５％ ＥｔＯＨで洗浄し、遠心分離を繰返した。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを１５分間風乾させ、ついで、ＲＮアーゼを含有しない水に懸濁させた。Ａ２６０／２８０が１．７〜２．０である場合にＡ２６０測定値１＝４０μｇ／ｍｌ ＲＮＡという仮定により、サンプル中のＲＮＡの濃度を測定するために分光光度測定を行った。
【実施例４】
【００８４】
ノーザンブロット分析
１．１％ アガロースホルムアルデヒドゲルを成型した。５および１０μｇのＲＮＡを変性バッファー（最終濃度：６％ ホルムアルデヒド、５０％ ホルムアミドおよび０．１×ＭＯＰＳ）と一緒にし、６５℃で１０分間加熱した。１０分の１の容量のゲルローディングバッファーを加え、サンプルを該ゲル上にローディングした。１×ＭＯＰＳバッファー中、７５ボルトで〜３時間、電気泳動を行った。該ゲルを１０×ＳＳＣ中で６０分間洗浄した。
【００８５】
該ＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中、１６時間にわたり、毛管作用により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にトランスファーした。ついで該ＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ自動架橋機能（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用する架橋によりナイロン膜に固定した。固定後、該ナイロン膜を風乾させた。
【００８６】
ノーザンブロット上の５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ転写産物を検出するためのプローブ混合物として使用するＤＩＧで５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ ＤＮＡ配列を標識するために、Ｒｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ結合抗体を使用する免疫学的現像を、製造業者の推奨に従い行った。簡潔に説明すると、該ブロットを、穏やかに振とうしながら３７℃で３０分間プレハイブリダイズさせた。該プローブ混合物を、９５℃で５分間加熱することにより変性させ、氷上でクエンチした。該プローブ混合物をハイブリダイゼーション溶液に加え、穏やかに振とうしながら４４．６℃で４時間にわたり該膜に適用した。ついで該ハイブリダイゼーション溶液を除去し、該ブロットを、０．１％ ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中、室温で５分間の２回の洗浄に付し、ついで０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで６５℃で更に洗浄した。ついで該ブロットを３０分間ブロッキングし、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ結合抗体を１：５０００希釈で３０分間適用した。該ブロットを洗浄し、プローブ結合ＲＮＡの存在をアルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ結合抗体のＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質検出により測定した。
【００８７】
５８ Ｌ１ ｗｔを発現する酵母の初期分析は、機能的ＨＰＶ５８ Ｌ１完全長の転写および翻訳が生じることを示した。しかし、酵母にとって好ましいコドン配列で該配列が再構築された場合には、発現のレベルが増加しうるであろう。活発な転写が保証されるよう、いずれかの可能な未熟転写終結部位を除去するために再構築５８ Ｌ１配列を操作した。５８ Ｌ１ Ｒ転写産物のノーザンブロット分析は、５８ Ｌ１ ｗｔで見られた結果と比較して完全長転写産物の量の増加が生じることを示した（図３）。
【実施例５】
【００８８】
ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質発現
ＯＤ６００＝１０の細胞量と等価な、ガラクトースにより誘導された培養物の凍結酵母細胞ペレットを、氷上で解凍し、２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する３００μｌのＰＣバッファー（１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）に懸濁させた。酸で洗浄した０．５ｍｍガラスビーズを、〜０．５ｇ／チューブの濃度で加えた。該チューブを、１分間の間隔を伴う４℃で５分間の３サイクルにわたりボルテックスした。７．５μｌの２０％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加え、ボルテックス工程を４℃で５分間反復した。該チューブを氷上に１５分間配置し、ついで４℃で１５分間遠心分離した。上清を無菌微小遠心管に移し、全酵母タンパク質抽出物と表記し、日付を記入し、−７０℃で保存した。
【実施例６】
【００８９】
ウエスタンブロット分析
ガラクトース誘導後の５８ Ｌ１タンパク質の発現を確認するために、それぞれの５８ Ｌ１構築物についての２０個の単離された酵母コロニーからの全酵母タンパク質抽出物をウエスタンブロットにより分析した。
【００９０】
代表的な５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ単離物の１０、５および２．５μｇの全酵母タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと一緒にし、９５℃で１０分間加熱した。陰性対照としてのＨＰＶ Ｌ１非含有全酵母タンパク質抽出物と共に、約５５ｋＤである１６ Ｌ１タンパク質を陽性対照として含めた（データ非表示）。
【００９１】
該タンパク質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングし、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー中で電気泳動した。タンパク質の分離後、該タンパク質を該ゲルからニトロセルロースにウエスタントランスファーし、該ブロットを１×希釈バッファー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中、振とうしながら室温で１時間ブロッキングした。該ブロットを３回洗浄し、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質と交差反応する酵母吸収ヤギ抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ３１ Ｌ１血清と共に室温で１６時間インキュベートした。ついで該ブロットを３回洗浄し、抗ヤギＨＲＰ結合抗体の１：２５００希釈物と共に１時間インキュベートした。該ブロットを再び３回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用した。免疫反応性タンパク質が該ブロット上で紫色バンドとして検出された。
【００９２】
すべての場合において、５８ Ｌ１タンパク質は、ニトロセルロース上で、約５５ｋＤに対応する明瞭な免疫反応性バンドとして検出された（図４）。５８ Ｌ１ Ｒバンドの強度は、５８ Ｌ１ ｗｔで見られるものより大きいようであり、このことは、酵母コドン最適化により５８ Ｌ１発現の改善が達成されたことを示唆している。
【実施例７】
【００９３】
ＥＬＩＳＡアッセイ
５８ Ｌ１ ＶＬＰ発現を示すために、５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ全酵母タンパク質抽出物の一部をＥＬＩＳＡにより分析した。ＨＰＶ５８ Ｌ１およびＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒを発現する酵母細胞を、回転チューブ培養、振とうフラスコおよび発酵槽を含む種々の方法により増殖させた。全タンパク質１μｇ当たりに産生されたＨＰＶ５８ Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の量を測定するために、該酵母細胞を細胞溶解し、タンパク質抽出物を調製した。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰ発現を示すために、サンドイッチＥＬＩＳＡを計画した。
【００９４】
該酵母タンパク質抽出物中に見出される無傷５８ Ｌ１ ＶＬＰに結合させるために、プロテインＧ精製Ｈ５８２Ｃ３．Ｆ７（Ｆ７）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した。Ｆ７はＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰコンホメーションエピトープを特異的に認識する。未結合タンパク質を洗浄除去し、もう１つのＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰコンホメーション特異的ｍＡｂであるＨ５８６Ｅ１１．４Ｆ（Ｆ４）を検出抗体として適用した。コンホメーション的に正しい真正な５８ Ｌ１ ＶＬＰが結合し、検出は、抗マウスＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ結合抗体およびＴＭＢ基質の使用により促進された。
【００９５】
特に、４℃で一晩にわたりＩｍｍｕｌｏｎ ４ ＨＢＸ ９６ウェルプレートの底をコートするためにＦ７を使用した。該プレートをＰＢＳおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ついでブロッキング溶液（ＰＢＳ ＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ＋ １％ ＢＳＡ）でブロッキングした。該プレートを３回洗浄し、抗原（ブロッキング溶液中で１２．５μｇ／ｍｌに希釈された全酵母細胞ライセート）をＡ行に二重に適用した。精製されたＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰの参照標準物を、１２．５μｇ／ｍｌ全酵母タンパク質中の２０６ｎｇ／ｍｌで、Ａ行の３列および４列に適用した。ついで該参照体および試験サンプルを各行下方へ２倍系列希釈した。室温で３時間後、過剰の抗原を吸引により除去し、該プレートを３回洗浄した。Ｆ４コンホメーション特異的ｍＡｂをブロッキング溶液中で希釈し、各ウェルに室温で１時間適用した。該プレートを３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ結合抗体をブロッキング溶液中で希釈し、室温で１時間適用した。該プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗体複合体を検出するためにＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を５分間適用した。該検出反応を２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。プレートを４５０ｎｍの波長で読取り、参照標準物との比較によりＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰの濃度をｎｇ ＶＬＰ／μｇ全タンパク質の単位で測定した。
【００９６】
図５は、２つの別々の実験からのＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔおよびＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒを発現する酵母からの全タンパク質１μｇ当たりの検出ＶＬＰの量の比較を示す。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰ発現レベルは酵母コドン最適化により〜２〜３倍増加した。
【実施例８】
【００９７】
透過型電子顕微鏡検査
５８ Ｌ１タンパク質が実際に自己集合して五量体Ｌ１カプソマー（これは今度は、ウイルス様粒子に自己集合する）を形成したことを示すために、部分的に精製された５８ Ｌ１ Ｒタンパク質抽出物を透過型電子顕微鏡検査（ＥＭ）に付した。
【００９８】
酵母を小規模発酵で増殖させ、ペレット化した。得られたペレットを精製処理に付した。Ｌ１タンパク質の発現および精製操作における保持を示すために、ペレットおよび清澄化酵母を免疫ブロットにより分析した。ついで清澄化酵母抽出物を４５％ スクロースクッション上の遠心分離に付し、得られたペレットを透過型ＥＭによる分析のためにバッファーに懸濁させた。
【００９９】
産生された５８ Ｌ１ Ｒ ＶＬＰの代表的イメージを図６に示す。この粗サンプル中の球状粒子の直径は３０〜６０ｎｍであり、いくつかの粒子はカプソマーの規則的配置を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の予防および／または治療に関する。より詳しくは、本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび宿主に関する。本発明はまた、酵母細胞内で組換えＨＰＶ５８ Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２を発現させることにより製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにＨＰＶ感染の予防および治療のためのワクチンおよび医薬組成物におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
８０を超える型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が存在し、これらのうちの多くは良性増殖性疣贅から悪性癌に及ぶ多種多様な生物学的表現型に関連づけられている（概説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい。）。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、性器粘膜または呼吸器粘膜の良性疣贅、非悪性尖形コンジローマおよび／または低悪性異形成に最も一般的に関連している型である。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子宮頸部、膣、外陰部および肛門管のｉｎ ｓｉｔｕおよび浸潤性癌に最も頻繁に関連している高リスク型である。子宮頸癌の９０％以上はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８またはより稀な発癌性型ＨＰＶ３１、３３、４５、５２および５８に関連している（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。ＨＰＶ ＤＮＡが子宮頸癌の９０以上で検出されるという観察は、ＨＰＶが子宮頸癌を引き起こすという強力な疫学的証拠を提供している。
【０００３】
パピローマウイルスは、８個までの初期遺伝子および２個の後期遺伝子をコードする小型（５０〜６０ｎｍ）非外包性二十面体ＤＮＡウイルスである。そのウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７ならびにＬ１およびＬ２と称され、この場合の「Ｅ」は初期を意味し、「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１およびＬ２はウイルスカプシドタンパク質をコードし、一方、Ｅ遺伝子は、ウイルス複製および細胞トランスフォーメーションのような機能に関連している。
【０００４】
Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有する。Ｌ２タンパク質は副次的カプシドタンパク質である。免疫学的データは、Ｌ２タンパク質の大部分がウイルスカプシド内のＬ１タンパク質の内部に存在することを示唆している。Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質は共に、種々のパピローマウイルス間で高度に保存されている。
【０００５】
酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌におけるＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せ体の発現はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己集合を引き起こす（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６）を参照されたい。）。ＶＬＰは真正ビリオンに形態学的に類似しており、動物またはヒトに投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰは潜在的発癌性ウイルスゲノムを含有していないため、それは、ＨＰＶワクチンの開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい。）。この理由により、Ｌ１およびＬ２遺伝子はＨＰＶ感染および疾患に対する予防用および治療用ワクチンの開発のための免疫学的標的と目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３）
【非特許文献３】ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６）
【非特許文献４】ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
うまく形質転換された宿主生物における高い発現レベルのカプシドタンパク質の入手に伴う困難性、およびそれによる精製タンパク質の製造の制限のため、ＨＰＶワクチンの開発および商業化は妨げられている。したがって、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質のようなＨＰＶ Ｌ１タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が同定されているものの、意図される宿主細胞内での発現に関して最適化されたＨＰＶ５８ Ｌ１コード化ヌクレオチド配列を利用する容易に再生可能な粗ＨＰＶ Ｌ１タンパク質源を開発することが非常に望ましいであろう。また、ワクチン開発で使用する天然タンパク質の免疫付与特性を有する大量のＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰを製造することが有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、また酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、ＨＰＶ５８ Ｌ１をコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。本発明は更に、酵母細胞内で組換えＨＰＶ５８ Ｌ１またはＬ２を発現させることにより製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、ＨＰＶ関連癌の予防および／または治療用の医薬組成物およびワクチンにおけるＨＰＶ５８ ＶＬＰの使用を開示する。
【０００９】
本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。該合成分子のコドンは、酵母細胞にとって好ましいコドンが利用されるよう設計される。該合成分子は、ＶＬＰに自己集合しうるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の源として使用することが可能である。該ＶＬＰは、ＶＬＰに基づくワクチンにおいて使用することが可能である。
【００１０】
本発明の典型的な実施形態は、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成核酸分子を含み、該核酸分子は、酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化されたヌクレオチドの配列を含む。好ましい実施形態においては、該核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む（本明細書においては「５８ Ｌ１ Ｒ配列」と称される。）。
【００１１】
また、本明細書中の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞の両方）を提供する。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は酵母細胞である。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）該ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００１３】
本発明は更に、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸分子（該核酸分子は、酵母宿主細胞内での最適化発現に関してコドン最適化されている）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）該ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００１４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、該核酸は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む。
【００１５】
本発明はまた、酵母細胞内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ５８ ＶＬＰの製造方法、およびＨＰＶ５８ ＶＬＰの使用方法に関する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、酵母細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１またはＨＰＶ５８ Ｌ１＋Ｌ２の組換え発現により製造されるＨＰＶ５８ ＶＬＰである。
【００１８】
本発明の更にもう１つの態様は、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子により製造されるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ５８ ＶＬＰである。本発明のこの態様の典型的な実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰはコドン最適化遺伝子により製造される。
【００２０】
本発明の更にもう１つの態様は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ関連子宮頸癌の予防または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰは酵母内で製造される。
【００２１】
本発明はまた、酵母内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンに関する。
【００２２】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、該ワクチンは更に、少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを含む。この少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、当技術分野において記載されている又は後に同定される任意のＨＰＶ型を含む、関心のある任意のＨＰＶ型でありうる。好ましい実施形態においては、該ＨＰＶ型は、疣贅または子宮頸癌のような臨床的表現型に関連した型である。もう１つの好ましい実施形態においては、この少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００２３】
本発明はまた、酵母内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子と製薬上許容される担体とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰと少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰとを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、この少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００２４】
本明細書中の全体において及び添付する特許請求の範囲において用いる単数表現は、文脈から例外であることが明らかである場合を除き、複数物に対する言及を含む。
【００２５】
本明細書中の全体において及び添付する特許請求の範囲においては、以下の定義および略語が適用される。
【００２６】
「プロモーター」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成して、転写活性を始動し駆動する。該複合体は、「エンハンサー」もしくは「上流活性化配列」と称される配列を活性化することにより又は「サイレンサー」と称される配列を抑制することにより修飾されうる。
【００２７】
「ベクター」なる語は、宿主生物または宿主組織内へのＤＮＡ断片の導入をもたらしうる何らかの手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージおよびコスミドを含む種々のタイプのベクターが存在する。
【００２８】
「カセット」なる語は、ベクターから発現されるヌクレオチドまたは遺伝子配列、例えば、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチドまたは遺伝子配列を意味する。一般に、カセットは、いくつかの実施形態においては該ヌクレオチドまたは遺伝子配列の発現のための調節配列を提供するベクター内に挿入された遺伝子配列を含む。他の実施形態においては、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は、その発現のための調節配列を提供する。他の実施形態においては、該ベクターはいくつかの調節配列を提供し、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は他の調節配列を提供する。例えば、該ベクターは該ヌクレオチドまたは遺伝子配列の転写のためのプロモーターを提供することが可能であり、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は転写終結配列を提供する。該ベクターにより提供されうる調節配列は、エンハンサー、転写終結配列、スプライス受容および供与配列、イントロン、リボソーム結合配列ならびにポリ（Ａ）付加配列を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
「５８ Ｌ１野生型配列」および「５８ Ｌ１ ｗｔ配列」なる表現は、本明細書中に配列番号３として開示されているＨＰＶ５８ Ｌ１配列を意味する。ＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列は既に記載されているが、臨床分離体から得たＤＮＡ間に若干の配列変異を見出すことは珍しいことではない。したがって、代表的なＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列を、ＨＰＶ５８ ＤＮＡを含有することが既に示されている臨床サンプルから単離した（実施例１を参照されたい）。本明細書中に開示されているコドン最適化５８ Ｌ１配列を比較するための参照配列として該５８ Ｌ１野生型配列を使用した（図１を参照されたい。）。
【００３０】
「ＨＰＶ ５８ Ｌ１ Ｒ」および「５８ Ｌ１ Ｒ」なる表現は、酵母細胞による高レベル発現に好ましいコドンを含むように再構築された、本明細書中に開示されている典型的な合成ＨＰＶ ５８ Ｌ１ヌクレオチド配列（配列番号１）を意味する。
【００３１】
「有効量」なる語は、免疫応答が生じるよう、適度なレベルの該ポリペプチドの産生に十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。このレベルは様々なものとなりうると当業者に理解される。
【００３２】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ酸残基により置換されることを意味する。そのような保存的置換の例としては、疎水性残基同士（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）の置換、同じ電荷の極性残基同士（例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸）の置換が挙げられる。
【００３３】
「哺乳動物（哺乳類）」なる語は、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。
【００３４】
「ＶＬＰ」はウイルス様粒子を意味する。
【００３５】
「合成」は、示されている天然に存在する野生型ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（５８ Ｌ１ ｗｔ、配列番号３）内に存在するヌクレオチド配列と同じではないヌクレオチド配列をＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子が含有するよう、該遺伝子が作製されたことを意味する。前記のとおり、本発明において、酵母細胞による発現に好ましいコドンを含むヌクレオチドの配列を含む合成分子を提供する。本発明で提供する合成分子は、野生型ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号２）と同じアミノ酸配列をコードしている。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１は、本発明の合成ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号１；「５８ Ｌ１ Ｒ」として示されている。）において改変されたヌクレオチドを比較する配列アライメントである（実施例２を参照されたい。）。参照配列は５８ Ｌ１野生型配列（配列番号３；「５８ Ｌ１ ｗｔとして示されている」；実施例１を参照されたい。）である。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。５８ Ｌ１再構築配列における同一ヌクレオチドは点で示されている。
【図１Ｂ】図１は、本発明の合成ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号１；「５８ Ｌ１ Ｒ」として示されている。）において改変されたヌクレオチドを比較する配列アライメントである（実施例２を参照されたい。）。参照配列は５８ Ｌ１野生型配列（配列番号３；「５８ Ｌ１ ｗｔとして示されている」；実施例１を参照されたい。）である。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。５８ Ｌ１再構築配列における同一ヌクレオチドは点で示されている。
【図１Ｃ】図１は、本発明の合成ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子（配列番号１；「５８ Ｌ１ Ｒ」として示されている。）において改変されたヌクレオチドを比較する配列アライメントである（実施例２を参照されたい。）。参照配列は５８ Ｌ１野生型配列（配列番号３；「５８ Ｌ１ ｗｔとして示されている。」；実施例１を参照されたい）である。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。５８ Ｌ１再構築配列における同一ヌクレオチドは点で示されている。
【図２Ａ】図２は、再構築合成ＨＰＶ５８ Ｌ１の二本鎖核酸および一文字記号アミノ酸配列（上）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。
【図２Ｂ】図２は、再構築合成ＨＰＶ５８ Ｌ１の二本鎖核酸および一文字記号アミノ酸配列（上）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。
【図２Ｃ】図２は、再構築合成ＨＰＶ５８ Ｌ１の二本鎖核酸および一文字記号アミノ酸配列（上）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。
【図３】図３は、ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ転写産物のノーザンブロットを示す（実施例４を参照されたい。）。該ブロットは、等量のＤＩＧ標識５８Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ ＤＮＡプローブの混合物でプローブした。レーン当たりの、電気泳動された全ＲＮＡの量が示されている。右側の矢印は、完全長５８ Ｌ１転写産物の推定サイズを示す。
【図４】図４は、ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔ（５８）および５８ Ｌ１ Ｒ（５８Ｒ）タンパク質のウエスタンブロットを示す。ＨＰＶ １６ Ｌ１を参照体（１６）として含めた。１０、５および２．５μｇの全酵母タンパク質抽出物を変性させ、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。５８ Ｌ１および１６ Ｌ１と交差反応する酵母吸収抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ３１ Ｌ１ヤギポリクローナル抗血清を使用して、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を検出した。左側に、分子量マーカーがｋＤａ単位で示されている。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡにおいて捕捉され検出された全酵母タンパク質１μｇ当たりの無傷ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰの量（ｎｇ）を示す（実施例７を参照されたい。）。二重に行った２つの実験の結果が含まれている。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔのＶＬＰ発現（黒および灰色の枠）は３６ｎｇ／μｇ全酵母タンパク質であった。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＲのＶＬＰ発現（白および線影付きの枠）（再構築酵母コドン最適化５８Ｌ１）はＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔ発現より２〜３倍高く、実験＃２においては９５ｎｇ／μｇ全酵母タンパク質に達した。
【図６】図６は、透過型電子顕微鏡検査により可視化された、本明細書に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒタンパク質分子から構成されるＨＰＶ５８ ＶＬＰの代表的サンプルを示す（実施例８を参照されたい。）。棒線は１００ｎｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
子宮頸癌のほとんどは、特定の発癌型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染に関連している。本発明は、発癌性ＨＰＶ型の遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強する組成物および方法に関する。特に、本発明は、酵母内での高レベル発現に関してコドン最適化されたＨＰＶ５８ Ｌ１をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、酵母内で製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、ＨＰＶ関連癌の予防および／または治療用の医薬組成物およびワクチンにおける該ポリヌクレオチドおよびＶＬＰの使用を開示する。
【００３８】
野生型ＨＰＶ５８ Ｌ１ヌクレオチド配列は既に報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４４３，Ｋｉｒｉｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５（１）：４２４−４２７（１９９１）を参照されたい。）。本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子は、高レベル発現のために酵母細胞にとって好ましいコドンを使用するようコドンの少なくとも幾つかが改変された、コドンの配列を含む。該合成分子は、ＶＬＰへと自己集合しうるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現のためのコード配列として使用することが可能である。該ＶＬＰは、中和抗体および細胞性免疫によりパピローマウイルス感染に対する有効な免疫予防をもたらすために、ＶＬＰに基づくワクチンにおいて使用することが可能である。ＶＬＰに基づくそのようなワクチンは、既に確立したＨＰＶ感染の治療にも有用である。
【００３９】
酵母細胞におけるＨＰＶ ＶＬＰの発現は、費用効果的であり発酵槽内での大規模増殖に容易に適合するという利点をもたらす。また、酵母ゲノムは、増強した増殖能および発現能を有する組換え形質転換酵母の選択が保証されるよう容易に改変されうる。しかし、ＨＰＶ５８ Ｌ１を含む多数のＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、商業的大規模化に望ましいものより低いレベルでしか酵母細胞内では発現されない。
【００４０】
したがって、本発明は、酵母細胞環境中での高レベル発現に関して「最適化」されたＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子配列に関する。
【００４１】
４つの可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６０を超える変異形態で存在しうる。これらのコドンは僅か２０個の異なるアミノ酸（ならびに転写開始および終結）のメッセージを与えるに過ぎないため、いくつかのアミノ酸は２以上のコドンによりコードされうる（コドン縮重として公知の現象である）。完全には理解されていない理由により、異なる細胞型の内因性ＤＮＡ内には代替的コドンは一様には存在しない。実際、或る細胞型においては或るコドンに関する可変的天然階層または「優先性」が存在するようである。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含む６つのＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内因性ＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＣＴＧを含有し、一方、酵母および粘菌のＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＴＴＡを含むことが、微生物についてのゲノムコドン使用頻度の詳細な分析から示されている。この階層を考慮すると、ロイシンに富むポリペプチドの高レベルの発現が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主により得られる可能性は、コドン使用頻度に或る程度は左右されると、一般に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では発現されにくいと考えられ、一方、ＣＴＧに富む遺伝子は、おそらく、この宿主内で高度に発現されるであろう。同様に、ロイシンに富むポリペプチドの酵母宿主細胞内での発現に好ましいコドンはＴＴＡであろう。
【００４２】
組換えＤＮＡ技術へのコドン優先性現象の関与は明白であり、該現象は、成功裏に形質転換された宿主生物において外因性遺伝子の高い発現レベルがこれまで多くの場合に達成されていないことを説明するのに役立ちうる。すなわち、該挿入遺伝子内には、それほど「好ましく」ないコドンが反復的に存在している可能性があり、発現用の宿主細胞装置が、それほど効率的には機能していない可能性があるのである。この現象は、意図される宿主細胞にとって好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えＤＮＡ技術の実施のための好ましい形態の外来遺伝物質の最適形態を与えることを示唆している。したがって、本発明の１つの態様は、酵母細胞内での発現に関してコドン最適化されたＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子である。本発明の好ましい実施形態において、同じタンパク質配列をコードする代替的コドンの使用は、酵母細胞によるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現に対する制約を除去しうることが判明した。
【００４３】
本発明においては、参照により本明細書に組み入れるＳｈａｒｐおよびＣｏｗｅ，Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ ７：６５７−６７８（１９９１）に記載されている、同一の翻訳配列を有するが代替的コドン使用頻度を伴う配列に、ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子セグメントを変換した。該方法は、一般には、高度に発現される酵母遺伝子に一般に関連していない野生型配列内のコドンを特定し、それらを、酵母細胞内での高発現のための最適コドンで置換することよりなる。ついでその新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換により生じた望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の非意図的生成、望ましくない制限酵素部位、高いＧＣ含量、酵母により認識される転写終結シグナルの存在など）に関して調べる。同一アミノ酸をコードする異なるコドンで既存コドンを置換することにより、望ましくない配列を除去する。ついで該合成遺伝子セグメントを発現の改善に関して試験する。
【００４４】
前記の方法を用いてＨＰＶ５８ Ｌ１の合成遺伝子セグメントを作製して、高レベル発現に関して最適化されたコドンを含む遺伝子を得た。前記方法は、ＨＰＶワクチンにおいて使用するコドン最適化遺伝子を設計するための本発明者らの方法の概要を説明するものであるが、該方法における若干の変更または該配列における若干の変更によっても、同様のワクチン効力または遺伝子発現の増強が達成されうると当業者に理解される。
【００４５】
したがって、本発明は、ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の生物学的に活性な断片もしくは突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、酵母宿主内での発現に関して最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の突然変異体は、保存的アミノ酸置換、アミノ末端トランケート化、カルボキシ末端トランケート化、欠失または付加を含むが、これらに限定されるものではない。任意のそのような生物学的に活性な断片および／または突然変異体は、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模擬するタンパク質またはタンパク質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用ＨＰＶワクチンの開発において有用となるよう、機能的ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４６】
本発明の１つの態様は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子である。
【００４７】
本発明はまた、本明細書中の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞の両方）に関する。本発明の好ましい実施形態においては、該宿主細胞は酵母宿主細胞である。
【００４８】
本明細書に記載の方法により構築した合成ＨＰＶ５８ ＤＮＡまたはその断片を、適当なプロモーターと他の適当な転写調節要素とを含有する発現ベクター内への分子クローニングにより組換え的に発現させ、原核または真核宿主細胞内に導入して、組換えＨＰＶ５８ Ｌ１を得ることが可能である。このような操作のための技術はＳａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｏｓｅら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９０）（これらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）に十分に記載されている。
【００４９】
したがって、本発明は、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００５０】
したがって、本発明は更に、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードする核酸（該核酸分子は、酵母宿主細胞内での最適発現のためにコドン最適化されている。）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００５１】
本発明は更に、（ａ）配列番号１に記載の核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入すること、（ｂ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。
【００５２】
本発明の合成遺伝子は、宿主細胞内でのＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質の効率的発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットに集合させることが可能である。該カセットは、好ましくは、合成遺伝子を、それに機能しうる形で連結された関連転写および翻訳制御配列（例えば、プロモーターおよび終結配列）と共に含有する。好ましい実施形態においては、プロモーターはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１プロモーターであるが、多数の他の公知酵母プロモーター、例えばＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３もしくはＰＧＫプロモーターまたは他の真核生物遺伝子プロモーターのいずれかを使用しうると当業者は認識するであろう。好ましい転写ターミネーターはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１ターミネーターであるが、他の公知転写ターミネーターも使用することが可能である。ＧＡＬ１プロモーター−ＡＤＨ１ターミネーターの組合せが特に好ましい。
【００５３】
本発明は更に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む単離および精製されたＨＰＶ５８ Ｌ１ポリペプチドを提供する。
【００５４】
本発明のもう１つの態様は、ＨＰＶ５８ Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２遺伝子を酵母細胞内で組換え的に発現させることにより製造されるＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ５８ ＶＬＰの製造方法、およびＨＰＶ５８ ＶＬＰの使用方法である。ヒトおよび動物パピローマウイルスの主要カプシドタンパク質であるＬ１が酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌内で発現される場合には、ＶＬＰは自己集合しうる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ １０１−１２（１９９６））。Ｌ１およびＬ２カプシドタンパク質の組合せを発現させることにより、形態学的に不明瞭なＨＰＶ ＶＬＰも製造されうる。ＶＬＰは、Ｔ＝７二十面体構造のＬ１の７２個の五量体から構成される（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（６）：１４４５−５６（１９９１））。
【００５５】
ＶＬＰは真正ビリオンと形態学的に類似しており、動物に投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰでのウサギ（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３９５９−６３（１９９５））およびイヌ（Ｓｕｚｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（２５）：１１５５３−５７（１９９５））の免疫化は中和抗体の誘導および実験パピローマウイルス感染に対する防御の両方をもたらすことが示された。しかし、ＶＬＰは、潜在的に発癌性のウイルスゲノムを含有せず、発現されると単一遺伝子から自己集合しうるため、これは、ＨＰＶワクチン開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい。）。
【００５６】
したがって、本発明は、ＨＰＶ５８の組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質（該組換えタンパク質は酵母細胞内で発現される）から構成されるウイルス様粒子に関する。
【００５７】
前記のとおり、本発明の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰは酵母内で製造される。もう１つの好ましい実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる。
【００５８】
本発明のもう１つの態様は、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子により製造されるＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ５８ ＶＬＰである。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチドの配列を含む。
【００５９】
本発明の更にもう１つの態様は、（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５８ Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること、（ｂ）該組換えＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下、該形質転換酵母を培養して組換えＨＰＶ５８タンパク質を得ること、（ｃ）該組換えＨＰＶ５８タンパク質を単離してＨＰＶ５８ ＶＬＰを得ることを含む、ＨＰＶ５８ ＶＬＰの製造方法である。
【００６０】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰを得るために、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子で酵母を形質転換する。特に好ましい実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰはコドン最適化遺伝子により製造される。
【００６２】
本発明の更にもう１つの態様は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ関連子宮頸癌の予防または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ５８ ＶＬＰは酵母内で製造される。
【００６３】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンに関する。
【００６４】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、該ワクチンは更に、少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを含む。好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００６５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ１６ ＶＬＰを含む。
【００６６】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ１６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ ＶＬＰを含む。
【００６７】
本発明の更にもう１つの好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ６ ＶＬＰ、ＨＰＶ１１ ＶＬＰ、ＨＰＶ１６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ ＶＬＰを含む。
【００６８】
本発明はまた、ＨＰＶ５８ウイルス様粒子を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ＨＰＶ５８ ＶＬＰと少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰとを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。
【００６９】
本発明のワクチン組成物は、最小の潜在的毒性でＨＰＶ５８感染の最適抑制を可能にする適当な量で単独で使用することが可能である。また、他の物質の共投与または連続的投与が望ましいであろう。
【００７０】
ワクチン被投与者に導入すべきウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性に左右される。一般に、ＶＬＰ約１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは約２０μｇ〜６０μｇの免疫学的または予防的に有効な量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および他の投与方法、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。また、ブースターワクチン接種を行いうると意図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時またはその後の、ミョウバンまたはメルク（Ｍｅｒｃｋ）アルミニウムアジュバントのようなアジュバントの非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段での投与も有利である。
【００７１】
本発明に関連して用いられうる方法および材料を記載し開示する目的で、本明細書に記載のすべての刊行物を、参照により本明細書に組み入れることとする。ここで、本発明が先行発明としてそのような開示に先行するものではないと自認するものと解釈されるべきではない。
【００７２】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの実施形態そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明には種々の変更および修飾が当業者によって施されうると理解されるべきである。
【００７３】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７４】
代表的ＨＰＶ５８ Ｌ１配列の決定
ＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列は既に記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４４３）。しかし、臨床分離体から得たＤＮＡ間に若干の配列変異を見出すことは珍しいことではない。代表的なＨＰＶ５８ Ｌ１野生型配列を決定するために、ＨＰＶ５８ ＤＮＡを含有することが既に示されている３つの臨床サンプルからＤＮＡを単離した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ＨＰＶ５８ Ｌ１配列を増幅した：ＨＰＶ ５８ ＬＩ Ｆ ５’−ＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＴ−３’（配列番号４）および５８ ３’ｌ１ ＢｇｌＩＩ ５’−ＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号５）。増幅産物をアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。〜１５００ｂｐのＬ１バンドを切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑ−Ｂｉｏ Ｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを精製した。ついで該ＤＮＡをＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を該連結混合物で形質転換し、アンピシリン＋ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌ（青／白コロニー選択用）を含有するＬＢ寒天上でプレーティングした。該プレートを反転させ、３７℃で１６時間インキュベートした。白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうしながら培養した。ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。
【００７５】
該プラスミド中のＬ１遺伝子の存在を示すために、制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。制限断片をアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により可視化した。これらの３つの臨床分離体のそれぞれからのクローン化Ｌ１インサートを含有するプラスミドに関してＤＮＡ配列決定を行った。後の最適化のための参照配列を作製するために、該クローンのそれぞれからのヌクレオチドおよび翻訳アミノ酸配列を、公開されているＨＰＶ ５８ Ｌ１配列と比較した。これらの３つの臨床分離体の配列分析は、どの配列も該Ｇｅｎｂａｎｋ配列と同一でないことを示した。代表的な５８ Ｌ１配列としてｐＣＲ２．１ ＨＰＶ５８ Ｌ１クローン＃４を選択した。これは本明細書中では互換的に「５８ Ｌ１野生型配列」または「５８ ｗｔ配列」（配列番号３；図１を参照されたい）と称される。５８ Ｌ１ ｗｔ配列は５つの点突然変異を含有し、このうちの２つはアミノ酸変化を引き起こすものであり、３つはサイレント点突然変異であった。Ｇｅｎｂａｎｋ ＨＰＶ ５８ Ｌ１配列に対してアミノ酸変化を引き起こす点突然変異はヌクレオチド３７２（Ａ→Ｔ）（これはアミノ酸１２４をロイシンからフェニルアラニンに変化させる）およびヌクレオチド８９７（Ａ→Ｇ）（これはアミノ酸２９９をイソロイシンからメチオニンに変化させる）に位置していた。前記の３つのサイレント点突然変異はヌクレオチド７７４（Ａ→Ｇ）、７９２（Ｔ→Ｃ）および９９９（Ｇ→Ａ）に位置していた。
【００７６】
Ｔａｑポリメラーゼおよび以下のプライマー（これはＢａｍＨＩ伸長を付加する）を使用して、５８ Ｌ１野生型配列を増幅した：５’５８ ＢａｍＨＩ ５’−ＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号６）および３’Ｂａｍ５８ ５’−ＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号７）。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動およびそれに続く臭化エチジウム染色により可視化した。〜１５００ｂｐのバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用してＤＮＡを精製した。ついでＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１に連結し、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞を該連結混合物で形質転換した。白色コロニーを選択し、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうすることにより培養した。ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。該ベクター配列からＨＰＶ ５８ Ｌ１遺伝子を遊離させるために、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。消化されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｌ１バンドを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用して精製し、脱リン酸化されＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０に連結した。ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を該連結混合物で形質転換した。正しい配向のＨＰＶ ５８ Ｌ１インサートに関してスクリーニングするために、コロニーからのプラスミドＤＮＡをＰＣＲ増幅した。該インサートの配列および配向を確認するために、ＤＮＡ配列決定を行った。単一クローンを選択し、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１＃１０と命名した。選択したクローンからマキシプレップ（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを調製した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を、グルスラーゼでスフェロプラスト化することによりコンピテントにし、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１＃１で形質転換した。該酵母形質転換混合物をＬｅｕ（−）ソルビトールプレート上のＬｅｕ（−）ソルビトール上層寒天内でプレーティングし、反転させて３０℃で３〜５日間インキュベートした。コロニーを拾い、Ｌｅｕ（−）ソルビトール寒天プレート上での単離のためにストリークした。ついで、５８ Ｌ１転写およびタンパク質発現を誘導するために、単離されたコロニーを、３０℃の回転チューブ培養において、１．６％グルコースおよび４％ガラクトースを含有する５ｍｌの５×Ｌｅｕ（−）Ａｄｅ（−）ソルビトール内で成長させた。
【実施例２】
【００７７】
酵母コドン最適化
酵母にとって好ましいコドンは既に記載されている（Ｓｈａｒｐ，Ｐａｕｌ ＭおよびＣｏｗｅ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ．Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＥＡＳＴ ７：６５７−６７８（１９９１））。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔタンパク質の発現は検出可能であったが、発現の増強を得るために、好ましい酵母コドンを使用してＨＰＶ５８ Ｌ１遺伝子を再構築した。酵母最適化コドン配列を含む再構築５８ Ｌ１配列は、５８ Ｌ１ ｗｔ配列と比較して４０４個のヌクレオチド変化を含有していた。得られた配列は本明細書中では「５８ Ｌ１ Ｒ」（Ｒ＝再構築；図１を参照されたい。）と称される。５８ Ｌ１ Ｒの翻訳アミノ酸配列は変化しなかった。ＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列を図２に示す。該再構築配列はＨＰＶ５８ Ｌ１発現の増強をもたらし、これは、ワクチン開発における使用のための、該野生型に対する有意な進歩である（実施例４を参照されたい。）。
【００７８】
最適化遺伝子の製造に用いた方法は、該アミノ酸配列を維持しながら酵母にとって好ましいコドン配列でヌクレオチドを置換する、該遺伝子に広がる長い重複するセンスおよびアンチセンスオリゴマーを設計するものであった。Ｐｆｕポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応において、鋳型ＤＮＡの代わりにこれらのオリゴマーを使用した。追加的な増幅プライマーを設計し、これらを使用して鋳型オリゴマーから再構築配列を増幅した。
【００７９】
増幅のための最適条件は部位特異的なものであったが、ほとんどの場合には、以下に類似した方法を用いた：９５℃で２分間（変性）、およびそれに続く９５℃で１分間（変性）、５５℃で１分間（アニーリング）、７２℃で３．５分間（伸長）の３５サイクル、およびそれに続く７２℃で１０分間の最終伸長、および４℃での維持。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検査した。適当なサイズのバンドを切り出し、ＤＮＡをゲル精製した。ついで該増幅断片を鋳型として使用して１４９７ヌクレオチドの再構築ＨＰＶ５８Ｌ１遺伝子を作製した。
【００８０】
再構築後、１４９７ヌクレオチドのバンドをゲル精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。連結後、ＴＯＰ１０細胞を該連結混合物で形質転換した。カナマイシンを含有するＬＢ内でコロニーを成長させ、ミニプレップ技術により該コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。所望の５８ Ｌ１再構築変化を確認するために、該プラスミドＤＮＡを配列決定した。両末端にＢａｍＨＩ伸長を付加するために、以下のプライマーを使用して５８ Ｌ１ Ｒ（再構築体）をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−５８ Ｌ１ Ｒから再増幅した：５’Ｂａｍ ５８Ｒｅｂｕｉｌｄ ５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣ−３’（配列番号８）および３’Ｂａｍ ５８Ｒｅｂｕｉｌｄ ５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号９）。
【００８１】
増幅されたＬ１産物を、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用してゲル精製し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。ＴＯＰ１０Ｆ’細胞を該ｐＣＲ２．１プラスミドで形質転換した。白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうすることにより培養した。ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。該ベクター配列からＨＰＶ ５８ Ｌ１遺伝子を遊離させるために、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。消化されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｌ１バンドを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用して精製し、脱リン酸化されＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０に連結した。ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を該連結混合物で形質転換した。
【００８２】
得られたコロニーを、正しい配向のＨＰＶ ５８ Ｌ１インサートに関してＰＣＲによりスクリーニングした。制限消化プロフィールおよびＤＮＡ配列決定により、配列および配向を確認した。選択したクローンをｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１Ｒ＃１７と命名した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を、グルスラーゼでスフェロプラスト化することによりコンピテントにし、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ ５８Ｌ１Ｒ＃１７で形質転換した。該酵母形質転換物をＬｅｕ− ソルビトール寒天プレート上のＬｅｕ（−）ソルビトール上層寒天内でプレーティングし、反転させて３０℃で３〜５日間インキュベートした。コロニーを拾い、Ｌｅｕ（−）ソルビトール寒天プレート上でのクローン単離のためにストリークした。ついで、Ｌ１転写およびタンパク質発現を誘導するために、単離されたコロニーを、３０℃の回転チューブ培養において、１．６％グルコースおよび４％ガラクトースを含有する５ｍｌの５×Ｌｅｕ（−）Ａｄｅ（−）ソルビトール内で成長させた。４８時間後、ＯＤ６００＝１０の細胞量と同等の培養容量をペレット化し、上清を除去し、該ペレットを凍結し、−７０℃で保存した。
【実施例３】
【００８３】
ＲＮＡ調製
ガラクトース誘導によりＨＰＶ５８ Ｌ１またはＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒを発現するよう誘導された形質転換酵母細胞の細胞ペレットを氷上で解凍し、０．８ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。５分の１容量のクロロホルムを該バイアルに加えた。ついでそれを１５秒間、激しく振とうして混合し、室温で３分間インキュベートした。１３ｋｒｐｍでの５分間の遠心分離の後、上相を集め、新たなバイアルに移した。０．４ｍｌのイソプロパノールを加え、室温で１０分間インキュベートした。ＲＮＡをペレット化し、遠心分離を１３ｋｒｐｍで１０分間行った。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを７５％ ＥｔＯＨで洗浄し、遠心分離を繰返した。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを１５分間風乾させ、ついで、ＲＮアーゼを含有しない水に懸濁させた。Ａ２６０／２８０が１．７〜２．０である場合にＡ２６０測定値１＝４０μｇ／ｍｌ ＲＮＡという仮定により、サンプル中のＲＮＡの濃度を測定するために分光光度測定を行った。
【実施例４】
【００８４】
ノーザンブロット分析
１．１％ アガロースホルムアルデヒドゲルを成型した。５および１０μｇのＲＮＡを変性バッファー（最終濃度：６％ ホルムアルデヒド、５０％ ホルムアミドおよび０．１×ＭＯＰＳ）と一緒にし、６５℃で１０分間加熱した。１０分の１の容量のゲルローディングバッファーを加え、サンプルを該ゲル上にローディングした。１×ＭＯＰＳバッファー中、７５ボルトで〜３時間、電気泳動を行った。該ゲルを１０×ＳＳＣ中で６０分間洗浄した。
【００８５】
該ＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中、１６時間にわたり、毛管作用により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にトランスファーした。ついで該ＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ自動架橋機能（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用する架橋によりナイロン膜に固定した。固定後、該ナイロン膜を風乾させた。
【００８６】
ノーザンブロット上の５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ転写産物を検出するためのプローブ混合物として使用するＤＩＧで５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ ＤＮＡ配列を標識するために、Ｒｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ結合抗体を使用する免疫学的現像を、製造業者の推奨に従い行った。簡潔に説明すると、該ブロットを、穏やかに振とうしながら３７℃で３０分間プレハイブリダイズさせた。該プローブ混合物を、９５℃で５分間加熱することにより変性させ、氷上でクエンチした。該プローブ混合物をハイブリダイゼーション溶液に加え、穏やかに振とうしながら４４．６℃で４時間にわたり該膜に適用した。ついで該ハイブリダイゼーション溶液を除去し、該ブロットを、０．１％ ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中、室温で５分間の２回の洗浄に付し、ついで０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで６５℃で更に洗浄した。ついで該ブロットを３０分間ブロッキングし、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ結合抗体を１：５０００希釈で３０分間適用した。該ブロットを洗浄し、プローブ結合ＲＮＡの存在をアルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ結合抗体のＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質検出により測定した。
【００８７】
５８ Ｌ１ ｗｔを発現する酵母の初期分析は、機能的ＨＰＶ５８ Ｌ１完全長の転写および翻訳が生じることを示した。しかし、酵母にとって好ましいコドン配列で該配列が再構築された場合には、発現のレベルが増加しうるであろう。活発な転写が保証されるよう、いずれかの可能な未熟転写終結部位を除去するために再構築５８ Ｌ１配列を操作した。５８ Ｌ１ Ｒ転写産物のノーザンブロット分析は、５８ Ｌ１ ｗｔで見られた結果と比較して完全長転写産物の量の増加が生じることを示した（図３）。
【実施例５】
【００８８】
ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質発現
ＯＤ６００＝１０の細胞量と等価な、ガラクトースにより誘導された培養物の凍結酵母細胞ペレットを、氷上で解凍し、２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する３００μｌのＰＣバッファー（１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）に懸濁させた。酸で洗浄した０．５ｍｍガラスビーズを、〜０．５ｇ／チューブの濃度で加えた。該チューブを、１分間の間隔を伴う４℃で５分間の３サイクルにわたりボルテックスした。７．５μｌの２０％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加え、ボルテックス工程を４℃で５分間反復した。該チューブを氷上に１５分間配置し、ついで４℃で１５分間遠心分離した。上清を無菌微小遠心管に移し、全酵母タンパク質抽出物と表記し、日付を記入し、−７０℃で保存した。
【実施例６】
【００８９】
ウエスタンブロット分析
ガラクトース誘導後の５８ Ｌ１タンパク質の発現を確認するために、それぞれの５８ Ｌ１構築物についての２０個の単離された酵母コロニーからの全酵母タンパク質抽出物をウエスタンブロットにより分析した。
【００９０】
代表的な５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ単離物の１０、５および２．５μｇの全酵母タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと一緒にし、９５℃で１０分間加熱した。陰性対照としてのＨＰＶ Ｌ１非含有全酵母タンパク質抽出物と共に、約５５ｋＤである１６ Ｌ１タンパク質を陽性対照として含めた（データ非表示）。
【００９１】
該タンパク質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングし、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー中で電気泳動した。タンパク質の分離後、該タンパク質を該ゲルからニトロセルロースにウエスタントランスファーし、該ブロットを１×希釈バッファー（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中、振とうしながら室温で１時間ブロッキングした。該ブロットを３回洗浄し、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質と交差反応する酵母吸収ヤギ抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ３１ Ｌ１血清と共に室温で１６時間インキュベートした。ついで該ブロットを３回洗浄し、抗ヤギＨＲＰ結合抗体の１：２５００希釈物と共に１時間インキュベートした。該ブロットを再び３回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用した。免疫反応性タンパク質が該ブロット上で紫色バンドとして検出された。
【００９２】
すべての場合において、５８ Ｌ１タンパク質は、ニトロセルロース上で、約５５ｋＤに対応する明瞭な免疫反応性バンドとして検出された（図４）。５８ Ｌ１ Ｒバンドの強度は、５８ Ｌ１ ｗｔで見られるものより大きいようであり、このことは、酵母コドン最適化により５８ Ｌ１発現の改善が達成されたことを示唆している。
【実施例７】
【００９３】
ＥＬＩＳＡアッセイ
５８ Ｌ１ ＶＬＰ発現を示すために、５８ Ｌ１ ｗｔおよび５８ Ｌ１ Ｒ全酵母タンパク質抽出物の一部をＥＬＩＳＡにより分析した。ＨＰＶ５８ Ｌ１およびＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒを発現する酵母細胞を、回転チューブ培養、振とうフラスコおよび発酵槽を含む種々の方法により増殖させた。全タンパク質１μｇ当たりに産生されたＨＰＶ５８ Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の量を測定するために、該酵母細胞を細胞溶解し、タンパク質抽出物を調製した。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰ発現を示すために、サンドイッチＥＬＩＳＡを計画した。
【００９４】
該酵母タンパク質抽出物中に見出される無傷５８ Ｌ１ ＶＬＰに結合させるために、プロテインＧ精製Ｈ５８２Ｃ３．Ｆ７（Ｆ７）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した。Ｆ７はＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰコンホメーションエピトープを特異的に認識する。未結合タンパク質を洗浄除去し、もう１つのＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰコンホメーション特異的ｍＡｂであるＨ５８６Ｅ１１．４Ｆ（Ｆ４）を検出抗体として適用した。コンホメーション的に正しい真正な５８ Ｌ１ ＶＬＰが結合し、検出は、抗マウスＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ結合抗体およびＴＭＢ基質の使用により促進された。
【００９５】
特に、４℃で一晩にわたりＩｍｍｕｌｏｎ ４ ＨＢＸ ９６ウェルプレートの底をコートするためにＦ７を使用した。該プレートをＰＢＳおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ついでブロッキング溶液（ＰＢＳ ＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ＋ １％ ＢＳＡ）でブロッキングした。該プレートを３回洗浄し、抗原（ブロッキング溶液中で１２．５μｇ／ｍｌに希釈された全酵母細胞ライセート）をＡ行に二重に適用した。精製されたＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰの参照標準物を、１２．５μｇ／ｍｌ全酵母タンパク質中の２０６ｎｇ／ｍｌで、Ａ行の３列および４列に適用した。ついで該参照体および試験サンプルを各行下方へ２倍系列希釈した。室温で３時間後、過剰の抗原を吸引により除去し、該プレートを３回洗浄した。Ｆ４コンホメーション特異的ｍＡｂをブロッキング溶液中で希釈し、各ウェルに室温で１時間適用した。該プレートを３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ結合抗体をブロッキング溶液中で希釈し、室温で１時間適用した。該プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗体複合体を検出するためにＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を５分間適用した。該検出反応を２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。プレートを４５０ｎｍの波長で読取り、参照標準物との比較によりＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰの濃度をｎｇ ＶＬＰ／μｇ全タンパク質の単位で測定した。
【００９６】
図５は、２つの別々の実験からのＨＰＶ５８ Ｌ１ ｗｔおよびＨＰＶ５８ Ｌ１ Ｒを発現する酵母からの全タンパク質１μｇ当たりの検出ＶＬＰの量の比較を示す。ＨＰＶ５８ Ｌ１ ＶＬＰ発現レベルは酵母コドン最適化により〜２〜３倍増加した。
【実施例８】
【００９７】
透過型電子顕微鏡検査
５８ Ｌ１タンパク質が実際に自己集合して五量体Ｌ１カプソマー（これは今度は、ウイルス様粒子に自己集合する）を形成したことを示すために、部分的に精製された５８ Ｌ１ Ｒタンパク質抽出物を透過型電子顕微鏡検査（ＥＭ）に付した。
【００９８】
酵母を小規模発酵で増殖させ、ペレット化した。得られたペレットを精製処理に付した。Ｌ１タンパク質の発現および精製操作における保持を示すために、ペレットおよび清澄化酵母を免疫ブロットにより分析した。ついで清澄化酵母抽出物を４５％ スクロースクッション上の遠心分離に付し、得られたペレットを透過型ＥＭによる分析のためにバッファーに懸濁させた。
【００９９】
産生された５８ Ｌ１ Ｒ ＶＬＰの代表的イメージを図６に示す。この粗サンプル中の球状粒子の直径は３０〜６０ｎｍであり、いくつかの粒子はカプソマーの規則的配置を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項３記載の宿主細胞。
【請求項５】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる、請求項４記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１０】
ＨＰＶ５８の組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質（該組換えＬ１タンパク質または該組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質は酵母内で製造される。）から構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１１】
組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質がコドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１核酸分子によりコードされる、請求項１０記載のＶＬＰ。
【請求項１２】
該コドン最適化核酸分子が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載のＶＬＰ。
【請求項１３】
（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５８ Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること、
（ｂ）該コドン最適化ＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下、該形質転換酵母を培養して組換えパピローマウイルスタンパク質を得ること、
（ｃ）該組換えパピローマウイルスタンパク質を単離して請求項１１記載のＶＬＰを得ること
を含んでなる、請求項１１記載のＶＬＰの製造方法。
【請求項１４】
請求項１１記載のＶＬＰを含んでなるワクチン。
【請求項１５】
請求項１１記載のＶＬＰを含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含んでなる、ＨＰＶ感染の予防方法。
【請求項１７】
請求項１１記載のＶＬＰを動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法。
【請求項１８】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる、請求項１１記載のウイルス様粒子。
【請求項１９】
酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１８のウイルス様粒子。
【請求項２０】
少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを更に含む、請求項１４記載のワクチン。
【請求項２１】
少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型が、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる、請求項２０記載のワクチン。
【請求項２２】
少なくとも１つのＨＰＶ型がＨＰＶ１６を含む、請求項２１記載のワクチン。
【請求項２３】
ＨＰＶ１８ ＶＬＰを更に含む、請求項２２記載のワクチン。
【請求項２４】
ＨＰＶ６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１１ ＶＬＰを更に含む、請求項２３記載のワクチン。
【請求項２５】
ＨＰＶ３１ ＶＬＰを更に含む、請求項２４記載のワクチン。
【請求項２６】
ＨＰＶ３１ ＶＬＰを更に含む、請求項２３記載のワクチン。
【請求項２７】
ＨＰＶ４５ ＶＬＰを更に含む、請求項２５記載のワクチン。
【請求項２８】
ＨＰＶ４５ ＶＬＰを更に含む、請求項２６記載のワクチン。
【請求項２９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離および精製されたＨＰＶ５８ Ｌ１ポリペプチド。
【請求項１】
酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、配列番号２に記載のＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項３記載の宿主細胞。
【請求項５】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる、請求項４記載の宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１０】
ＨＰＶ５８の組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質（該組換えＬ１タンパク質または該組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質は酵母内で製造される。）から構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１１】
組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質がコドン最適化ＨＰＶ５８ Ｌ１核酸分子によりコードされる、請求項１０記載のＶＬＰ。
【請求項１２】
該コドン最適化核酸分子が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載のＶＬＰ。
【請求項１３】
（ａ）ＨＰＶ５８ Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ５８ Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子で酵母を形質転換すること、
（ｂ）該コドン最適化ＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下、該形質転換酵母を培養して組換えパピローマウイルスタンパク質を得ること、
（ｃ）該組換えパピローマウイルスタンパク質を単離して請求項１１記載のＶＬＰを得ること
を含んでなる、請求項１１記載のＶＬＰの製造方法。
【請求項１４】
請求項１１記載のＶＬＰを含んでなるワクチン。
【請求項１５】
請求項１１記載のＶＬＰを含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含んでなる、ＨＰＶ感染の予防方法。
【請求項１７】
請求項１１記載のＶＬＰを動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法。
【請求項１８】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる、請求項１１記載のウイルス様粒子。
【請求項１９】
酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１８のウイルス様粒子。
【請求項２０】
少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを更に含む、請求項１４記載のワクチン。
【請求項２１】
少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型が、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる、請求項２０記載のワクチン。
【請求項２２】
少なくとも１つのＨＰＶ型がＨＰＶ１６を含む、請求項２１記載のワクチン。
【請求項２３】
ＨＰＶ１８ ＶＬＰを更に含む、請求項２２記載のワクチン。
【請求項２４】
ＨＰＶ６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１１ ＶＬＰを更に含む、請求項２３記載のワクチン。
【請求項２５】
ＨＰＶ３１ ＶＬＰを更に含む、請求項２４記載のワクチン。
【請求項２６】
ＨＰＶ３１ ＶＬＰを更に含む、請求項２３記載のワクチン。
【請求項２７】
ＨＰＶ４５ ＶＬＰを更に含む、請求項２５記載のワクチン。
【請求項２８】
ＨＰＶ４５ ＶＬＰを更に含む、請求項２６記載のワクチン。
【請求項２９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離および精製されたＨＰＶ５８ Ｌ１ポリペプチド。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−９５６５２（Ｐ２０１２−９５６５２Ａ）
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２６８５９８（Ｐ２０１１−２６８５９８）
【出願日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【分割の表示】特願２００６−５３９７５１（Ｐ２００６−５３９７５１）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６８５９８（Ｐ２０１１−２６８５９８）
【出願日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【分割の表示】特願２００６−５３９７５１（Ｐ２００６−５３９７５１）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】
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