餡粕抽出エキスの抗氷核活性剤
【課題】異物となる無機物、有機物等に特異的な活性を有することがなく、工業的な生産が可能であり、食品用途への応用等を期待できる抗氷核活性剤を提供する。
【解決手段】餡粕を、熱水によって２０〜４０分間抽出した抽出エキスの、オリゴペプチドを含む、分子量３５００以下の画分を含有する、抗氷核活性剤と、その製造方法。
【解決手段】餡粕を、熱水によって２０〜４０分間抽出した抽出エキスの、オリゴペプチドを含む、分子量３５００以下の画分を含有する、抗氷核活性剤と、その製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品加工廃棄物である餡粕から抽出されたエキスを含有する抗氷核活性剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
餡粕は、生餡（こしあん）を製造する際に生じる食品加工廃棄物であり、小豆等の豆類から生餡を製造する際に餡粕が生じ、その餡粕の量は、原料の豆の全重量の約２０％にも達する程に多いものである。しかし、従前では餡粕の有効な利用法がなく、一部が畜産農家に飼料として無償で提供されているにすぎないものであった。
【０００３】
このような点に鑑み、餡粕の有効利用を図るために、下記特許文献１乃至３のような特許出願がなされている。特許文献１は、調味料の製造法に関するものであり、特許請求の範囲にも記載されているように、「餡粕に麹菌を接種、増殖させ、これに加水して糖化を行い、ここに酵母を加えて増殖させ、その菌体を分解し、各種呈味成分を生成させる」ものである。
【０００４】
また特許文献２は、廃油処理剤及び廃油の処理方法に関するものであり、請求項２にも記載されているように、「畜糞、生ごみ、汚泥、もみがら、餡粕、バーク、紙、その他、放線菌又は／及び黴類培地材料の１以上を含む放線菌又は／及び黴類培地に放線菌又は黴類を接種、培養し、得られた放線菌又は黴類増殖培地と廃油又は廃油含有物と接触させる」ものである。さらに、特許文献３は、糸状菌の培養培地に関するものであり、請求項１に記載されているように、「餡粕を主たる原料とし、これに米糠などの有機栄養助剤、カリウムなどの無機栄養助剤、海綿などの培養助剤、ｐＨ調整剤を加えて水分を調整した」ものである。
【０００５】
特許文献１に係る発明は、餡粕に麹菌や酵母を加えるものであり、特許文献２に係る発明は、廃油又は廃油含有物と接触させる培地の一成分として含有させるものであり、特許文献３に係る発明は、糸状菌の培養培地の一成分として餡粕を用いるものであり、いずれも餡粕を菌の培養や増殖等の目的で使用するものである。
【０００６】
本発明者等は、上記特許文献１乃至３のような餡粕の利用法ではなく、餡粕に過冷却点を低下させる性質、すなわち抗氷核活性を有するのではないかとの知見に基づき、鋭意研究を行った。抗氷核活性を有する物質として、細菌が生産する抗氷核タンパク質（非特許文献１）や、抗氷核多糖（非特許文献２）、さらにはポリフェノール多糖（非特許文献３）等の報告がある。
【０００７】
しかし、従来の抗氷核活性物質は、異物となる無機物、有機物に特異的な活性を有していたり、工業的に生産が不可能であったり、或いは食品用途への応用が難しい等、多様な問題を有していた。
【０００８】
【特許文献１】特公平４−６９９８６号公報
【特許文献２】特開２００２−２４７９７６号公報
【特許文献３】特開２００２−２０４６８５号公報
【非特許文献１】H.Kawahara et al., Biocontrol Sci., 1, 11-17、1996
【非特許文献２】Y.Yamashita et al., Biosci.Biotechnol.Biochem., 66,948-954,2002
【非特許文献３】J.Kasuga et al., Plant Cell Environ., 31, 1335-1348, 2008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような問題を解決するためになされたもので、異物となる無機物、有機物等に特異的な活性を有することがなく、工業的な生産が可能であり、食品用途への応用等を期待できる抗氷核活性剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、餡粕抽出エキスに優れた抗氷核活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、餡粕の抽出エキスを含有することを特徴とする抗氷核活性剤を提供するものである。
【００１１】
餡粕の抽出エキスは、主として熱水によって抽出される。餡粕の抽出エキスは、優れた抗氷核活性値を示すことから、分子量３５００以下の画分を含むものであることが望ましい。また、同様に優れた抗氷核活性値を示すことから、上記抽出エキスの分子量３５００以下の画分は、オリゴペプチドを含むものであることが望ましい。
【００１２】
さらに、本発明は、餡粕を熱水によって抽出し、抽出されたエキスを含有させて製造することを特徴とする抗氷核活性剤の製造方法を提供するものである。この場合の抽出時間は特に限定されるものではないが、２０〜４０分であることが望ましく、２５〜３５分であることがより望ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、異物となる無機物、有機物等に特異的な活性を有することがなく、工業的な生産が可能であり、食品用途への応用等を期待できる抗氷核活性剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の抗氷核活性剤は、上述のように、餡粕の抽出エキスを含有するものである。本発明において、「抗氷核活性剤が餡粕の抽出エキスを含有する」とは、本発明の抗氷核活性剤が、餡粕の抽出エキスのみからなるものであってもよく、また餡粕の抽出エキスの他に、他の成分を含有していてもよいことを意味する。
【００１５】
餡粕は、上述のように、生餡の製造過程で生じるものであり、その原料は小豆等の豆類である。原料の小豆等の品種や産地は問うものではない。
【００１６】
本発明の抗氷核活性剤に含有される餡粕の抽出エキスの抽出方法は限定されるものではないが、熱水で抽出することが望ましい。抽出時間は特に限定されないが、２０〜４０分であることが望ましく、２５〜３５分であることがより望ましい。
【００１７】
上記のような抽出操作により得られた餡粕抽出物をそのまま抽出エキスとして使用してもよく、さらに精製して使用してもよい。本発明のエキスの精製には種々の手段、方法を用いることができ、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、セルロース膜や合成膜を用いる限外濾過法、逆浸透法、吸着法、有機溶媒分画等の分離法を用いることができる。
【００１８】
また必要に応じて、生じた沈殿を遠心分離してもよい。後述のように、本発明のエキス中の抗氷核活性の多くは分子量約３５００以下の画分に存在することから、分子量分画段階を精製工程中に含めることが好ましい。
【００１９】
本発明の餡粕の抽出エキスは、抗氷核活性剤中に有効成分として含有される。その場合、本発明の餡粕抽出エキスを適宜濃縮あるいは希釈して用いてもよく、液状あるいは固形（粉末・顆粒等）に処理加工して用いてもよい。餡粕抽出エキスの濃縮は、たとえばエバポレーターによる蒸発により行うことができ、餡粕抽出エキスの希釈は、たとえば水等で行うことができる。いずれにしても、餡粕抽出エキスの形態は、その用途に応じて種々のものとすることができる。
【００２０】
さらに、本発明の餡粕の抽出エキスを含有する抗氷核活性剤を製剤化する場合の剤形も特に限定されるものではなく、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、クリーム、軟膏、等、その種類は問わない。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００２２】
（実施例１）食品加工廃棄物からの抗氷核活性剤のスクリーニング
そば粕、ワイン粕、餡粕、カカオハカスを熱水等で抽出し、それぞれ１００μｌずつ準備した。これらの試料は、一般的な食品加工メーカーや酒造メーカーから入手したものである。これらの試料に濃度１ｍｇ／ｍｌのヨウ化銀１ｍｌを添加し、１４０ｒｐｍで２０分攪拌した。
【００２３】
次に、これらの試料の抗氷核活性を測定した。各試料の濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。抗氷核活性は、Ｖａｌｉの小滴凍結法によって測定した。Ｖａｌｉの小滴凍結法の原理は、銅版の上にアルミニウムのフィルムを置き、その表面に各試料及びブランクの試料を１０μｌずつ３０箇所に滴下し、毎分１．０℃の速度で温度を低下させて、３０個の小滴の５０％が凍結する温度をＴ50とする。
【００２４】
各試料の上記小滴凍結時の温度をＳａｍｐｌｅＴ50とし、ブランクの試料の上記小滴凍結時の温度をＢｌａｎｋＴ50とすると、抗氷核活性値ΔＴ50（℃）は、
ΔＴ50（℃）＝ＢｌａｎｋＴ50−ＳａｍｐｌｅＴ50
で求められる。各試料は、上記ワイン粕、餡粕、カカオハカスからの抽出エキスにヨウ化銀を添加してものであり、ブランクの試料はヨウ化銀のみからなるものである。
【００２５】
尚、上記のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって抗氷核活性を測定する前に、各試料をリン酸緩衝液で調製する必要があるが、本実施例では、リン酸緩衝液として、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００２６】
Ｖａｌｉの小滴凍結法の原理は上述のとおりであるが、実際には微水滴凍結測定装置が用いられる。本実施例では、微水滴凍結測定装置として、ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用いた。
【００２７】
上記抗氷核活性の測定の結果、そば粕、ワイン粕、カカオハカスの抗氷核活性値がそれぞれ０．８℃、０．５℃、０．５℃であったのに対し、餡粕の抗氷核活性値は１．２℃であり、そば粕、ワイン粕、カカオハカスに比べて餡粕の抗氷核活性値の方が大きいことがわかった。
【００２８】
（実施例２）濃度変化に伴う抗氷核活性値の変化
次に、濃度変化に伴う餡粕の抗氷核活性値の変化を確認した。抗氷核活性値の測定は、上記ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用い、上述のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって行った。その測定結果を図１のグラフに示す。図１からも明らかなように、乾燥重量濃度の増加に伴って抗氷核活性値が増加することが確認できた。具体的には、乾燥重量濃度０．５ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値０．８℃であり、乾燥重量濃度１．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値１．４℃であり、乾燥重量濃度２．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値２．０℃であり、乾燥重量濃度４．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値２．６℃であり、乾燥重量濃度８．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値３．０℃であった。
【００２９】
（実施例３）餡粕エキスの抽出及び試料の調製
次に、餡粕エキスの抽出を行った。具体的には、先ず餡粕１ｇを準備し、これに蒸留水５ｍｌを添加した後、その蒸留水を煮沸して餡粕エキスを抽出した。このような煮沸による抽出（熱水抽出）は３０分間行った。このような煮沸による抽出後、抽出された餡粕エキスを凍結乾燥し、後述の実施例で用いる餡粕抽出試料とした。
【００３０】
（実施例４）透析による分画
次に、上記実施例３で得た餡粕抽出試料を水に溶解して乾燥重量濃度１．０ｍｇ／ｍｌとし、その水溶液について透析による分画を行った。具体的には、上記餡粕抽出試料を限外濾過膜（分画分子量３５００：Advantec社製）によって、分子量３５００以上の画分と分子量３５００以下の画分とに分画した。
【００３１】
得られた分子量３５００以上の画分、及び分子量３５００以下の画分について、それぞれ抗氷核活性を測定した。抗氷核活性値の測定は、上記ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用い、上述のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって行った。
【００３２】
測定の結果、分子量３５００以上の画分の抗氷核活性値が０．４℃であったのに対して、分子量３５００以下の画分の抗氷核活性値は１．０℃であった。この結果から、餡粕抽出エキスのうち、抗氷核活性を示すものの多くが分子量３５００以下の画分にあることがわかり、抗氷核活性を示す物質は低分子量の物質である可能性が示唆された。
【００３３】
（実施例５）吸収スペクトルの測定
上記餡粕抽出エキスの分子量３５００以下の画分について、分光光度計を用いて紫外線吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトルのチャートを図２に示す。図２からも明らかなように、波長２００ｎｍの近辺に吸収を示した。この吸収スペクトルの測定の結果から、分子量３５００以下の画分に、タンパク質（ペプチド）が含有されていることが推測される。
【００３４】
（実施例６）成分分析
上記実施例５の結果に基づき、上記餡粕抽出エキスの分子量３５００以下の画分について、タンパク質、糖、ポリフェノールの定量分析を行った。定量分析の結果、タンパク質が２２３．７８μｇ／ｍｌ、糖が１４０．７８μｇ／ｍｌ、ポリフェノールが６４．９３μｇ／ｍｌで含有されていることがわかった。
【００３５】
タンパク質量の測定は、ＢＣＡ法によって行った。ＢＣＡ法には、Pierce社のBCA Protein Assay Kit を用いた。すなわち、上記の試料５０μｌと、試薬Ａ：試薬Ｂが５：０．１になるように混合した溶液１ｍｌを添加し、６０℃、３０分間処理を行った。ここで、試薬Ａ及び試薬Ｂとは、上記Pierce社のキットに、BCA ReagentＡ、BCA ReagentＢとして含まれている試薬である。その後、調製した溶液は、分光光度計を用いて波長５７０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、牛血清アルブミンを用いた。
【００３６】
また、糖の量の測定は、フェノール硫酸法によって行った。すなわち、上記の試料５００μｌと５％フェノール水溶液５００μｌを混合し、攪拌する。それに濃硫酸２．５ｍｌ添加し、すぐに１０分間激しく攪拌する。室温に２０分以上放置した後、分光光度計を用いて波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、グルコースを用いた。
【００３７】
さらに、ポリフェノール量の測定はFolin-Ciocalteauの方法によって行った。すなわち、試料２００μｌと水３．２ｍｌを試験管に入れて攪拌し、飽和炭酸ナトリウム溶液を４００μｌ加え３０分間放置した。その後、調製した溶液は、分光光度計を用いて波長７６０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、カテキンを用いた。
【００３８】
上記の成分分析の結果から、餡粕抽出エキスのうち、分子量３５００以下の画分は、タンパク質（ペプチド）を多く含むものであることがわかった。
【００３９】
（実施例７）ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画
上記餡粕抽出エキスの分子量３５００以下の画分について、さらにゲル濾過クロマトグラフィーによる分画を行った。担体にはセファデックスＬＨ−２０を用い、溶出液には５０容量％のメタノールを用いた。また、カラムのサイズは、１．０ｃｍ×１２０ｃｍのものを用い、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。ゲル濾過クロマトグラフィーとしては、フラッシュクロマトグラフＳＹＳ１６０２０（東京理科器械株式会社製）を用いた。
【００４０】
得られたチャートを図３に示す。図３において、横軸には溶出液量を示し、縦軸には２８５ｎｍにおける吸光度を示している。図３からも明らかなように、溶出液量の４箇所の位置（７５ｍｌ、１０５ｍｌ、１３０ｍｌ、１５０ｍｌ）にピークが認められた（図３において１、２、３、４の番号で示す）。ピークが認められた溶出液量の４種類のフラクション（図３の１、２、３、４の番号で示すもの）を採取し、それぞれのフラクションについて抗氷核活性値を測定した。
【００４１】
抗氷核活性値の測定は、上記ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用い、上述のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって行った。その結果、溶出液量が７５ｍｌのフラクションは０．４℃であり、溶出液量が１０５ｍｌのフラクションは０．６℃であり、溶出液量が１３０ｍｌのフラクションは２．２℃であり、溶出液量が１５０ｍｌのフラクションは２．６℃であった。
【００４２】
（実施例８）マススペクトルによる分子量分画
上記のようにゲル濾過クロマトグラフィーによる分画を行った後の試料について、液体クロマトグラフィーマススペクトル（ＬＣ−ＭＳ）を行った。ＬＣ−ＭＳの質量分析装置としては、アブライド株式会社製のＡＰＩ−３０００を用いた。また、ＬＣ−ＭＳのＨＰＬＣとしては、Agilent社製の1100seriesを用いた。ＨＰＬＣの移動相にはアセトニトリル/水を用い、カラムのサイズは４．６ｍｍ×１５０ｍｍのものを用い、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００４３】
得られたチャートを図４に示す。図４からも明らかなように、分子量が３６０のあたりに吸収が認められた。このことから、分子量３６０近辺の画分のものが多く含まれていることがわかった。
【００４４】
（実施例９）定性、定量試験
上記マススペクトルによる分子量分画を行った３６０近辺の画分のものについて、ニンヒドリン反応を行ったところ陽性を示した。また、上記３６０近辺の画分のものについて吸収スペクトルを測定したところ、２１５ｎｍと２８５ｎｍに吸収ピークが認められ、カルボン酸の存在が確認でき、上記３６０近辺の画分のものがペプチドであることが示唆された。さらに、ＢＣＡ法を行ったところ、ペプチドの存在を確認することができた。ＢＣＡ法は、上記実施例６と同様に行った。
【００４５】
これらの結果から、本実施例で確認できた物質がペプチドであると認められ、分子量が上述のように約３６０程度であることから、オリゴペプチドであると認められる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の餡粕抽出エキスを含有する抗氷核活性剤は、冷凍食品品質保持剤等の食品分野、霜害防除剤、霜付着阻害剤等の環境分野、細胞保存液、臓器保存液等の医療分野等に広く適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】乾燥重量濃度の変化に伴う抗氷核活性値の変化を示すグラフ。
【図２】分子量３５００以下の画分の吸収スペクトルを示すチャート。
【図３】分子量３５００以下の画分のゲル濾過クロマトグラフィーのチャート。
【図４】分子量３５００以下の画分のマススペクトルチャート。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品加工廃棄物である餡粕から抽出されたエキスを含有する抗氷核活性剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
餡粕は、生餡（こしあん）を製造する際に生じる食品加工廃棄物であり、小豆等の豆類から生餡を製造する際に餡粕が生じ、その餡粕の量は、原料の豆の全重量の約２０％にも達する程に多いものである。しかし、従前では餡粕の有効な利用法がなく、一部が畜産農家に飼料として無償で提供されているにすぎないものであった。
【０００３】
このような点に鑑み、餡粕の有効利用を図るために、下記特許文献１乃至３のような特許出願がなされている。特許文献１は、調味料の製造法に関するものであり、特許請求の範囲にも記載されているように、「餡粕に麹菌を接種、増殖させ、これに加水して糖化を行い、ここに酵母を加えて増殖させ、その菌体を分解し、各種呈味成分を生成させる」ものである。
【０００４】
また特許文献２は、廃油処理剤及び廃油の処理方法に関するものであり、請求項２にも記載されているように、「畜糞、生ごみ、汚泥、もみがら、餡粕、バーク、紙、その他、放線菌又は／及び黴類培地材料の１以上を含む放線菌又は／及び黴類培地に放線菌又は黴類を接種、培養し、得られた放線菌又は黴類増殖培地と廃油又は廃油含有物と接触させる」ものである。さらに、特許文献３は、糸状菌の培養培地に関するものであり、請求項１に記載されているように、「餡粕を主たる原料とし、これに米糠などの有機栄養助剤、カリウムなどの無機栄養助剤、海綿などの培養助剤、ｐＨ調整剤を加えて水分を調整した」ものである。
【０００５】
特許文献１に係る発明は、餡粕に麹菌や酵母を加えるものであり、特許文献２に係る発明は、廃油又は廃油含有物と接触させる培地の一成分として含有させるものであり、特許文献３に係る発明は、糸状菌の培養培地の一成分として餡粕を用いるものであり、いずれも餡粕を菌の培養や増殖等の目的で使用するものである。
【０００６】
本発明者等は、上記特許文献１乃至３のような餡粕の利用法ではなく、餡粕に過冷却点を低下させる性質、すなわち抗氷核活性を有するのではないかとの知見に基づき、鋭意研究を行った。抗氷核活性を有する物質として、細菌が生産する抗氷核タンパク質（非特許文献１）や、抗氷核多糖（非特許文献２）、さらにはポリフェノール多糖（非特許文献３）等の報告がある。
【０００７】
しかし、従来の抗氷核活性物質は、異物となる無機物、有機物に特異的な活性を有していたり、工業的に生産が不可能であったり、或いは食品用途への応用が難しい等、多様な問題を有していた。
【０００８】
【特許文献１】特公平４−６９９８６号公報
【特許文献２】特開２００２−２４７９７６号公報
【特許文献３】特開２００２−２０４６８５号公報
【非特許文献１】H.Kawahara et al., Biocontrol Sci., 1, 11-17、1996
【非特許文献２】Y.Yamashita et al., Biosci.Biotechnol.Biochem., 66,948-954,2002
【非特許文献３】J.Kasuga et al., Plant Cell Environ., 31, 1335-1348, 2008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような問題を解決するためになされたもので、異物となる無機物、有機物等に特異的な活性を有することがなく、工業的な生産が可能であり、食品用途への応用等を期待できる抗氷核活性剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、餡粕抽出エキスに優れた抗氷核活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、餡粕の抽出エキスを含有することを特徴とする抗氷核活性剤を提供するものである。
【００１１】
餡粕の抽出エキスは、主として熱水によって抽出される。餡粕の抽出エキスは、優れた抗氷核活性値を示すことから、分子量３５００以下の画分を含むものであることが望ましい。また、同様に優れた抗氷核活性値を示すことから、上記抽出エキスの分子量３５００以下の画分は、オリゴペプチドを含むものであることが望ましい。
【００１２】
さらに、本発明は、餡粕を熱水によって抽出し、抽出されたエキスを含有させて製造することを特徴とする抗氷核活性剤の製造方法を提供するものである。この場合の抽出時間は特に限定されるものではないが、２０〜４０分であることが望ましく、２５〜３５分であることがより望ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、異物となる無機物、有機物等に特異的な活性を有することがなく、工業的な生産が可能であり、食品用途への応用等を期待できる抗氷核活性剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の抗氷核活性剤は、上述のように、餡粕の抽出エキスを含有するものである。本発明において、「抗氷核活性剤が餡粕の抽出エキスを含有する」とは、本発明の抗氷核活性剤が、餡粕の抽出エキスのみからなるものであってもよく、また餡粕の抽出エキスの他に、他の成分を含有していてもよいことを意味する。
【００１５】
餡粕は、上述のように、生餡の製造過程で生じるものであり、その原料は小豆等の豆類である。原料の小豆等の品種や産地は問うものではない。
【００１６】
本発明の抗氷核活性剤に含有される餡粕の抽出エキスの抽出方法は限定されるものではないが、熱水で抽出することが望ましい。抽出時間は特に限定されないが、２０〜４０分であることが望ましく、２５〜３５分であることがより望ましい。
【００１７】
上記のような抽出操作により得られた餡粕抽出物をそのまま抽出エキスとして使用してもよく、さらに精製して使用してもよい。本発明のエキスの精製には種々の手段、方法を用いることができ、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、セルロース膜や合成膜を用いる限外濾過法、逆浸透法、吸着法、有機溶媒分画等の分離法を用いることができる。
【００１８】
また必要に応じて、生じた沈殿を遠心分離してもよい。後述のように、本発明のエキス中の抗氷核活性の多くは分子量約３５００以下の画分に存在することから、分子量分画段階を精製工程中に含めることが好ましい。
【００１９】
本発明の餡粕の抽出エキスは、抗氷核活性剤中に有効成分として含有される。その場合、本発明の餡粕抽出エキスを適宜濃縮あるいは希釈して用いてもよく、液状あるいは固形（粉末・顆粒等）に処理加工して用いてもよい。餡粕抽出エキスの濃縮は、たとえばエバポレーターによる蒸発により行うことができ、餡粕抽出エキスの希釈は、たとえば水等で行うことができる。いずれにしても、餡粕抽出エキスの形態は、その用途に応じて種々のものとすることができる。
【００２０】
さらに、本発明の餡粕の抽出エキスを含有する抗氷核活性剤を製剤化する場合の剤形も特に限定されるものではなく、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、クリーム、軟膏、等、その種類は問わない。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００２２】
（実施例１）食品加工廃棄物からの抗氷核活性剤のスクリーニング
そば粕、ワイン粕、餡粕、カカオハカスを熱水等で抽出し、それぞれ１００μｌずつ準備した。これらの試料は、一般的な食品加工メーカーや酒造メーカーから入手したものである。これらの試料に濃度１ｍｇ／ｍｌのヨウ化銀１ｍｌを添加し、１４０ｒｐｍで２０分攪拌した。
【００２３】
次に、これらの試料の抗氷核活性を測定した。各試料の濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。抗氷核活性は、Ｖａｌｉの小滴凍結法によって測定した。Ｖａｌｉの小滴凍結法の原理は、銅版の上にアルミニウムのフィルムを置き、その表面に各試料及びブランクの試料を１０μｌずつ３０箇所に滴下し、毎分１．０℃の速度で温度を低下させて、３０個の小滴の５０％が凍結する温度をＴ50とする。
【００２４】
各試料の上記小滴凍結時の温度をＳａｍｐｌｅＴ50とし、ブランクの試料の上記小滴凍結時の温度をＢｌａｎｋＴ50とすると、抗氷核活性値ΔＴ50（℃）は、
ΔＴ50（℃）＝ＢｌａｎｋＴ50−ＳａｍｐｌｅＴ50
で求められる。各試料は、上記ワイン粕、餡粕、カカオハカスからの抽出エキスにヨウ化銀を添加してものであり、ブランクの試料はヨウ化銀のみからなるものである。
【００２５】
尚、上記のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって抗氷核活性を測定する前に、各試料をリン酸緩衝液で調製する必要があるが、本実施例では、リン酸緩衝液として、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００２６】
Ｖａｌｉの小滴凍結法の原理は上述のとおりであるが、実際には微水滴凍結測定装置が用いられる。本実施例では、微水滴凍結測定装置として、ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用いた。
【００２７】
上記抗氷核活性の測定の結果、そば粕、ワイン粕、カカオハカスの抗氷核活性値がそれぞれ０．８℃、０．５℃、０．５℃であったのに対し、餡粕の抗氷核活性値は１．２℃であり、そば粕、ワイン粕、カカオハカスに比べて餡粕の抗氷核活性値の方が大きいことがわかった。
【００２８】
（実施例２）濃度変化に伴う抗氷核活性値の変化
次に、濃度変化に伴う餡粕の抗氷核活性値の変化を確認した。抗氷核活性値の測定は、上記ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用い、上述のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって行った。その測定結果を図１のグラフに示す。図１からも明らかなように、乾燥重量濃度の増加に伴って抗氷核活性値が増加することが確認できた。具体的には、乾燥重量濃度０．５ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値０．８℃であり、乾燥重量濃度１．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値１．４℃であり、乾燥重量濃度２．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値２．０℃であり、乾燥重量濃度４．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値２．６℃であり、乾燥重量濃度８．０ｍｇ／ｍｌで抗氷核活性値３．０℃であった。
【００２９】
（実施例３）餡粕エキスの抽出及び試料の調製
次に、餡粕エキスの抽出を行った。具体的には、先ず餡粕１ｇを準備し、これに蒸留水５ｍｌを添加した後、その蒸留水を煮沸して餡粕エキスを抽出した。このような煮沸による抽出（熱水抽出）は３０分間行った。このような煮沸による抽出後、抽出された餡粕エキスを凍結乾燥し、後述の実施例で用いる餡粕抽出試料とした。
【００３０】
（実施例４）透析による分画
次に、上記実施例３で得た餡粕抽出試料を水に溶解して乾燥重量濃度１．０ｍｇ／ｍｌとし、その水溶液について透析による分画を行った。具体的には、上記餡粕抽出試料を限外濾過膜（分画分子量３５００：Advantec社製）によって、分子量３５００以上の画分と分子量３５００以下の画分とに分画した。
【００３１】
得られた分子量３５００以上の画分、及び分子量３５００以下の画分について、それぞれ抗氷核活性を測定した。抗氷核活性値の測定は、上記ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用い、上述のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって行った。
【００３２】
測定の結果、分子量３５００以上の画分の抗氷核活性値が０．４℃であったのに対して、分子量３５００以下の画分の抗氷核活性値は１．０℃であった。この結果から、餡粕抽出エキスのうち、抗氷核活性を示すものの多くが分子量３５００以下の画分にあることがわかり、抗氷核活性を示す物質は低分子量の物質である可能性が示唆された。
【００３３】
（実施例５）吸収スペクトルの測定
上記餡粕抽出エキスの分子量３５００以下の画分について、分光光度計を用いて紫外線吸収スペクトルを測定した。吸収スペクトルのチャートを図２に示す。図２からも明らかなように、波長２００ｎｍの近辺に吸収を示した。この吸収スペクトルの測定の結果から、分子量３５００以下の画分に、タンパク質（ペプチド）が含有されていることが推測される。
【００３４】
（実施例６）成分分析
上記実施例５の結果に基づき、上記餡粕抽出エキスの分子量３５００以下の画分について、タンパク質、糖、ポリフェノールの定量分析を行った。定量分析の結果、タンパク質が２２３．７８μｇ／ｍｌ、糖が１４０．７８μｇ／ｍｌ、ポリフェノールが６４．９３μｇ／ｍｌで含有されていることがわかった。
【００３５】
タンパク質量の測定は、ＢＣＡ法によって行った。ＢＣＡ法には、Pierce社のBCA Protein Assay Kit を用いた。すなわち、上記の試料５０μｌと、試薬Ａ：試薬Ｂが５：０．１になるように混合した溶液１ｍｌを添加し、６０℃、３０分間処理を行った。ここで、試薬Ａ及び試薬Ｂとは、上記Pierce社のキットに、BCA ReagentＡ、BCA ReagentＢとして含まれている試薬である。その後、調製した溶液は、分光光度計を用いて波長５７０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、牛血清アルブミンを用いた。
【００３６】
また、糖の量の測定は、フェノール硫酸法によって行った。すなわち、上記の試料５００μｌと５％フェノール水溶液５００μｌを混合し、攪拌する。それに濃硫酸２．５ｍｌ添加し、すぐに１０分間激しく攪拌する。室温に２０分以上放置した後、分光光度計を用いて波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、グルコースを用いた。
【００３７】
さらに、ポリフェノール量の測定はFolin-Ciocalteauの方法によって行った。すなわち、試料２００μｌと水３．２ｍｌを試験管に入れて攪拌し、飽和炭酸ナトリウム溶液を４００μｌ加え３０分間放置した。その後、調製した溶液は、分光光度計を用いて波長７６０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、カテキンを用いた。
【００３８】
上記の成分分析の結果から、餡粕抽出エキスのうち、分子量３５００以下の画分は、タンパク質（ペプチド）を多く含むものであることがわかった。
【００３９】
（実施例７）ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画
上記餡粕抽出エキスの分子量３５００以下の画分について、さらにゲル濾過クロマトグラフィーによる分画を行った。担体にはセファデックスＬＨ−２０を用い、溶出液には５０容量％のメタノールを用いた。また、カラムのサイズは、１．０ｃｍ×１２０ｃｍのものを用い、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。ゲル濾過クロマトグラフィーとしては、フラッシュクロマトグラフＳＹＳ１６０２０（東京理科器械株式会社製）を用いた。
【００４０】
得られたチャートを図３に示す。図３において、横軸には溶出液量を示し、縦軸には２８５ｎｍにおける吸光度を示している。図３からも明らかなように、溶出液量の４箇所の位置（７５ｍｌ、１０５ｍｌ、１３０ｍｌ、１５０ｍｌ）にピークが認められた（図３において１、２、３、４の番号で示す）。ピークが認められた溶出液量の４種類のフラクション（図３の１、２、３、４の番号で示すもの）を採取し、それぞれのフラクションについて抗氷核活性値を測定した。
【００４１】
抗氷核活性値の測定は、上記ミツワモデルＫ−１（山本テクニカル株式会社製）を用い、上述のようなＶａｌｉの小滴凍結法によって行った。その結果、溶出液量が７５ｍｌのフラクションは０．４℃であり、溶出液量が１０５ｍｌのフラクションは０．６℃であり、溶出液量が１３０ｍｌのフラクションは２．２℃であり、溶出液量が１５０ｍｌのフラクションは２．６℃であった。
【００４２】
（実施例８）マススペクトルによる分子量分画
上記のようにゲル濾過クロマトグラフィーによる分画を行った後の試料について、液体クロマトグラフィーマススペクトル（ＬＣ−ＭＳ）を行った。ＬＣ−ＭＳの質量分析装置としては、アブライド株式会社製のＡＰＩ−３０００を用いた。また、ＬＣ−ＭＳのＨＰＬＣとしては、Agilent社製の1100seriesを用いた。ＨＰＬＣの移動相にはアセトニトリル/水を用い、カラムのサイズは４．６ｍｍ×１５０ｍｍのものを用い、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００４３】
得られたチャートを図４に示す。図４からも明らかなように、分子量が３６０のあたりに吸収が認められた。このことから、分子量３６０近辺の画分のものが多く含まれていることがわかった。
【００４４】
（実施例９）定性、定量試験
上記マススペクトルによる分子量分画を行った３６０近辺の画分のものについて、ニンヒドリン反応を行ったところ陽性を示した。また、上記３６０近辺の画分のものについて吸収スペクトルを測定したところ、２１５ｎｍと２８５ｎｍに吸収ピークが認められ、カルボン酸の存在が確認でき、上記３６０近辺の画分のものがペプチドであることが示唆された。さらに、ＢＣＡ法を行ったところ、ペプチドの存在を確認することができた。ＢＣＡ法は、上記実施例６と同様に行った。
【００４５】
これらの結果から、本実施例で確認できた物質がペプチドであると認められ、分子量が上述のように約３６０程度であることから、オリゴペプチドであると認められる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の餡粕抽出エキスを含有する抗氷核活性剤は、冷凍食品品質保持剤等の食品分野、霜害防除剤、霜付着阻害剤等の環境分野、細胞保存液、臓器保存液等の医療分野等に広く適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】乾燥重量濃度の変化に伴う抗氷核活性値の変化を示すグラフ。
【図２】分子量３５００以下の画分の吸収スペクトルを示すチャート。
【図３】分子量３５００以下の画分のゲル濾過クロマトグラフィーのチャート。
【図４】分子量３５００以下の画分のマススペクトルチャート。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
餡粕の抽出エキスを含有することを特徴とする抗氷核活性剤。
【請求項２】
餡粕の抽出エキスが、熱水によって抽出されたエキスである請求項１記載の抗氷核活性剤。
【請求項３】
餡粕の抽出エキスが、分子量３５００以下の画分を含む請求項１又は２記載の抗氷核活性剤。
【請求項４】
餡粕の抽出エキスの分子量３５００以下の画分が、オリゴペプチドを含む請求項３記載の抗氷核活性剤。
【請求項５】
餡粕を熱水によって抽出し、抽出されたエキスを含有させて製造することを特徴とする抗氷核活性剤の製造方法。
【請求項６】
餡粕の熱水による抽出時間が２０〜４０分である請求項５記載の抗氷核活性剤の製造方法。
【請求項１】
餡粕の抽出エキスを含有することを特徴とする抗氷核活性剤。
【請求項２】
餡粕の抽出エキスが、熱水によって抽出されたエキスである請求項１記載の抗氷核活性剤。
【請求項３】
餡粕の抽出エキスが、分子量３５００以下の画分を含む請求項１又は２記載の抗氷核活性剤。
【請求項４】
餡粕の抽出エキスの分子量３５００以下の画分が、オリゴペプチドを含む請求項３記載の抗氷核活性剤。
【請求項５】
餡粕を熱水によって抽出し、抽出されたエキスを含有させて製造することを特徴とする抗氷核活性剤の製造方法。
【請求項６】
餡粕の熱水による抽出時間が２０〜４０分である請求項５記載の抗氷核活性剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１２１０５２（Ｐ２０１０−１２１０５２Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９６５２３（Ｐ２００８−２９６５２３）
【出願日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【Ｆターム（参考）】
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